DE102007046990A1

DE102007046990A1 - Verfahren zur Detektion kleiner Oligonukleotide

Info

Publication number: DE102007046990A1
Application number: DE102007046990A
Authority: DE
Inventors: Timothy W. Chagrin Falls Nilsen; Patricia A. Chagrin Falls Maroney; Sangpen Streetsboro Chamnongpol
Original assignee: Case Western Reserve University
Current assignee: Case Western Reserve University
Priority date: 2006-09-29
Filing date: 2007-10-01
Publication date: 2008-05-08
Anticipated expiration: 2027-10-02
Also published as: GB0718942D0; DE102007046990B4; CA2604664A1; FR2907794B1; FR2907794A1; US20080176233A1; US8232049B2; GB2442343B; GB2442343A

Abstract

Ein Verfahren zur Detektion von kleinen Oligonukleotiden schließt die Bereitstellung eines biologischen Isolats ein, welches mindestens ein kleines Oligonukleotid enthält. Das biologische Isolat kann mit mindestens einem Detektionsoligonukleotid, welches einen markierenden Rest aufweist, und mindestens einem Brückenoligonukleotid unter derartigen Bedingungen in Kontakt gebracht werden, dass das mindestens eine kleine Oligonukleotid und das mindestens eine Detektionsoligonukleotid vorzugsweise zu dem Brückenoligonukleotid hinzugefügt werden, um mindestens ein markiertes kleines Oligonukleotid hervorzubringen. Es kann mindestens ein ligierendes Reagenz zugegeben werden, um das mindestens eine kleine Oligonukleotid und das mindestens eine Detektionsoligonukleotid vorzugsweise miteinander zu verbinden. Das mindestens eine markierte kleine Oligonukleotid kann dann detektiert werden.

Description

Verwandte Anmeldungen
Die vorliegende Anmeldung beansprucht die Priorität der US Provisional Patent Application mit der Seriennummer 60/848,236, eingereicht am 29. September 2006, welcher hierin in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme eingeschlossen wird.
Interessen der Regierung
Die vorliegende Erfindung wurde seitens der Regierung der Vereinigten Staaten unter den NIH-Bewilligungsnummern GM31528 und AI28799 gefördert, zuerkannt vom Nationalen Gesundheitsinstitut (NIH, National Institute of Health). Es ist möglich, dass die Regierung der Vereinigten Staaten gewisse Rechte an der vorliegenden Erfindung hat.
Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen Verfahren zur Detektion von Nukleinsäuren und im Speziellen Verfahren zur Detektion von kleinen Oligonukleotiden so wie kleinen regulatorischen RNAs, Mikro-RNA sowie kleiner interferierender RNA.
Hintergrund der Erfindung
Bei den kleinen regulatorischen RNAs, so wie Mikro-RNAs (miRNAs), handelt es sich um eine Familie von 21–25 Nukleotiden nicht kodierender RNAs, welche die Genexpression auf der posttranskriptionellen Ebene regulieren. Eine Interaktion zwischen der miRNA und deren mRNA-Ziel resultiert oftmals in einer Inhibition der Proteinsynthese. Bis zum jetzigen Zeitpunkt wurden dem miRNA-Register zufolge mehr als 1.000 miRNAs in Tieren und Pflanzen identifiziert. Es gibt zunehmend mehr Beweise, welche nahe legen, dass es sich bei den miRNAs um wichtige Regulatoren der Teilung und Differenzierung von Zellen sowie der humanen Krebsgene handelt. Vor kurzer Zeit führte die Entdeckung der regulatorischen Wirkung auf die Genexpression zur Durchführung zahlreicher Studien über die Charakterisierung der Funktion der miRNA in molekularen Abläufen sowie als potentielle Werkzeuge bei der Entdeckung von Wirkstoffen.
Aufgrund des Interesses an kleinen regulatorischen RNAs so wie miRNAs entstand ein Bedarf an neuen Werkzeugen zur Erforschung der Expression. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt handelt es sich beim Northern Blot um die Standardtechnik zur Analyse der Expression von kleiner RNA. Der hauptsächliche Vorteil des Northern Blotting liegt darin, dass es keinen Amplifikationsschritt erfordert, welcher künstlich falsche Positive erzeugen könnte. Ein großer Nachteil des Northern Blotting ist jedoch seine mangelhafte Sensitivität, vor allem bei der Überwachung der Expression von kurzen Nukleotidsequenzen so wie miRNAs. Des Weiteren wird oftmals eine große Menge an Gesamt-RNA für Northern Blots benötigt. Trotz Verbesserungen bei der Detektion, so wie der Verwendung von Locked-Nukleinsäuresonden, sind die für ein Northern Blot Assay erforderlichen Vorgänge noch immer äußerst arbeits- und zeitaufwendig.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion einer Vielzahl von verschiedenen kleinen Oligonukleotiden. Das Verfahren schließt die Bereitstellung eines biologischen Isolats ein, welches mindestens ein kleines Oligonukleotid enthält. Das biologische Isolat kann mit mindestens einem Detektionsoligonukleotid, welches einen markierenden Rest aufweist, und mindestens einem Brückenoligonukleotid unter Bedingungen in Kontakt gebracht werden, unter denen das mindestens eine kleine Oligonukleotid und das mindestens eine Detektionsoligonukleotid vorzugsweise zu dem Brückenoligonukleotid hinzugefügt werden, um mindestens ein markiertes kleines Oligonukleotid zu produzieren. Es kann mindestens ein ligierendes Reagens zugegeben werden, um vorzugsweise das mindestens eine kleine Oligonukleotid und das mindestens eine Detektionsoligonukleotid zu verbinden. Das mindestens eine markierte kleine Oligonukleotid kann dann detektiert werden.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Kit zur Detektion einer Vielzahl von kleinen Oligonukleotiden in einem biologischen Isolat bereitgestellt. Das Kit schließt ein Detektionsoligonukleotid ein, welches etwa 5 bis etwa 500 Oligonukleotide (z. B. etwa 5 bis etwa 50 Oligonukleotide) umfasst und ein 5'-Ende sowie ein 3'-Ende aufweist. Das Detektionsoligonukleotid ligiert vorzugsweise an das kleine Oligonukleotid. Das Kit kann ebenfalls einen markierenden Rest einschließen, welcher vorzugsweise zur Markierung des Detektionsoligonukleotids dient. Der markierende Rest kann mit dem Detektionsoligonukleotid verknüpft sein. Das Kit kann des Weiteren Reagenzien zur Ligation des kleinen Oligonukleotids an das Detektionsoligonukleotid einschließen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die vorangegangenen und weitere Merkmale der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann auf dem die Erfindung betreffenden Gebiet bei der Lektüre der nachfolgenden Beschreibung unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen deutlich werden, in welchen:
1 ein Flussdiagramm ist, welches einen Vorgang zur Detektion einer Vielzahl von kleinen Oligonukleotiden gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung darstellt;
2A–C die quantitative Expression von miR-21 unter Verwendung der vorliegenden Erfindung. (2A, oberer Teil) und des Northern Blot (2A, unterer Teil) zeigen. Die in 2A dargestellten Assays wurden unter Verwendung von Gesamt-RNA aus HeLa-Zellen mit den angezeigten Mengen parallel durchgeführt. Die Aufnahmen wurden unter Verwendung einer Phosphorimageranalyse quantifiziert (2B). Bei 2C handelt es sich um eine Tabelle, welche die experimentellen Parameter und die sich daraus ergebenden Sensitivitäten eines jeden Assays zeigt;
3A–B Expressionsprofile von miRNA unter Verwendung der vorliegenden Erfindung in Muskelgewebe (3A, oberer Teil), Hirngewebe (3A, mittlerer Teil) und HeLa-Zellen (3A, unterer Teil) zeigen. Bei 3B handelt es sich um eine Tabelle, welche die experimentellen Parameter der vorliegenden Erfindung und eines Northern Blot Assay miteinander vergleicht; und
4A–C ein vergleichendes Beispiel der vorliegenden Erfindung und eines Lösungshybridisierungs-/Ribonuklease-Protektionsassays illustrieren. 4A–B zeigen die Detektion von miR-124a und miR-133a-1 durch die vorliegende Erfindung (4A) und durch einen Lösungshybridisierungs-/Ribonuklease-Protektionsassay (4B). Beide Assays wurden unter Verwendung von Gesamt-RNA mit den angezeigten Mengen parallel durchgeführt. Die Aufnahme wurde nach einer 2-stündigen Röntgenbelichtung bei –80°C entwickelt. Bei 4C handelt es sich um eine Tabelle, welche die experimentellen Parameter und die sich daraus ergebenden Sensitivitäten der vorliegenden Erfindung und des Lösungshybridisierungs-/Ribonuklease-Protektionsassays miteinander vergleicht.
Detaillierte Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen Verfahren zur Detektion von Nukleinsäuren und insbesondere Verfahren zur Detektion von kleinen Oligonukleotiden so wie kleine regulatorische RNAs (z. B. Mikro-RNA (miRNA) und kleine interferierende RNA (siRNA)). Es wurde gefunden, dass ein markiertes Detektionsoligonukleotid in Kombination mit einem Brückenoligonukleotid dazu verwendet werden kann, kleine Oligonukleotide, so wie kleine regulatorische RNAs (z. B. miRNAs und siRNAs) zu detektieren. Auf der Grundlage dieser Entdeckung stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Detektion multipler kleiner Oligonukleotide in beispielsweise 50 ng oder weniger Gesamt-RNA bereit, ohne dass dabei ein Amplifikationsschritt erforderlich ist. Vorteilhafterweise ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung schnell (z. B. Einfangen und Markieren von kleinen Oligonukleotiden in etwas mehr als 2 Stunden) und weist einen linearen Detektionsbereich von etwa 0,1 bis etwa 10 Femtomol auf.
Die vorliegende Erfindung gestattet ebenfalls die simultane Detektion von mehreren kleinen Oligonukleotiden. Da mehrere kleine Oligonukleotide simultan detektiert werden können, kann die Vielfalt an kleinen Oligonukleotiden, welche in einer Zelle oder in einem Organismus vorhanden sind, in einem klinischen oder Forschungsszenario unter Verwendung der vorliegenden Erfindung einfach ausgewertet werden.
Wie hierin verwendet, soll der Begriff „kleines Oligonukleotid" eine Nukleinsäure bezeichnen, welche eine Länge von etwa 5 bis etwa 500 Nukleotiden (z. B. von etwa 5 bis etwa 50 Nukleotiden, etwa 5 bis etwa 30 Nukleotiden oder etwa 10 bis etwa 30 Nukleotiden) aufweist und mit einem 5'-Phosphat und/oder einem 3'-Hydroxyl endet. Unter einem 5'-Phosphat wird ein (PO₄)^2–(PO₄H)^–- oder ein (PO₄H₂)-Rest verstanden, welcher kovalent über eines der Sauerstoffatome an dem 5'-Kohlenstoff der Ribose befestigt ist. Unter einem 3'-Hydroxyl wird ein OH- oder ein O-Rest verstanden, welcher kovalent über den Sauerstoff an dem 3'-Kohlenstoff der Ribose befestigt ist. Der Fachmann wird erkennen, dass es sich bei der An- oder Abwesenheit von Wasserstoff in den wie oben aufgeführten Phosphat- oder Hydroxylresten um eine Funktion ihrer pKa-Werte und des pH-Wertes ihrer Umgebung handelt.
Kleine Oligonukleotide können aufgrund ihrer Funktion in einer Zelle identifiziert werden, einschließend z. B. das Vorhandensein einer nicht kodierenden Sequenz (d.h. sie werden nicht in Protein translatiert) (z. B. nicht kodierende RNA) sowie die Fähigkeit, die Expression von mindestens einem Gen zu regulieren (d.h. kleine regulatorische RNA). Kleine Oligonukleotide können ebenfalls aufgrund ihrer Biosynthese identifiziert werden. So wird z. B. eine Art von kleinen Oligonukleotiden, siRNA, typischerweise aus endogenen oder exogenen doppelsträngigen RNA(dsRNA)-Molekülen mit Haarnadelstrukturen synthetisiert und derart verarbeitet, dass aus beiden Strängen der Haarnadel eine Vielzahl an siRNA-Molekülen produziert wird. Im Gegensatz dazu werden miRNA-Moleküle typischerweise aus endogenen dsRNA-Molekülen mit einer oder mehreren Haarnadelstrukturen produziert, so dass aus jeder Haarnadelstruktur ein einzelnes miRNA-Molekül produziert wird. Es ist beabsichtigt, dass die Begriffe „siRNA" und „miRNA" deren Verwendung im Stand der Technik entsprechen, wie z. B. beschrieben in Ambros et al., RNA 9:277-279 (2003).
In Fällen, in denen ein kleines Oligonukleotid kleine regulatorische RNA, so wie siRNA oder miRNA, umfasst, kann das kleine Oligonukleotid auf der Grundlage des Vorhandenseins einer 5'-Cap-Struktur in der mRNA und der Abwesenheit der Cap-Struktur in dem kleinen Oligonukleotid von mRNA unterschieden werden. Bei der typischerweise in eukaryotischer mRNA vorzufindenden 5'-Cap-Struktur handelt es sich um ein 7-Methylguanylat mit einer 5'-zu-5'-Triphosphatverbindung an das terminale Nukleotid. Kleine interferierende RNA-Moleküle oder miRNAs können ebenfalls auf der Grundlage des Vorhandenseins einer terminalen Polyadenylatsequenz am 3'-Ende der mRNA, welche in siRNAs und miRNAs nicht vorhanden ist, von mRNA unterschieden werden.
Wie hierin verwendet, soll der Begriff „biologisches Isolat" eine oder mehrere Substanzen bezeichnen, welche aus mindestens einem ebenfalls vorhandenen Molekül eines Organismus entfernt wurden. Eine isolierte Nukleinsäure kann z. B. im Wesentlichen frei von anderen Nukleinsäuren sein, so dass sie zu einer wesentlich höheren Fraktion der gesamten in dem biologischen Isolat vorhandenen Nukleinsäure anwächst als in den Zellen, aus denen sie entnommen wurde. So kann z. B. eine isolierte Nukleinsäure im Vergleich zu der Zelle, welcher sie entnommen wurde, in dem biologischen Isolat mindestens um das 2-, 5-, 10-, 50-, 100- oder 1.000-fache oder mehr angereichert werden. Ein biologisches Isolat kann aus einem intakten Organismus, einem intakten Gewebe oder einer intakten Zelle erhalten werden. Beispiele für Eukaryote, von denen in einem erfindungsgemäßen Verfahren biologische Isolate abgeleitet werden können, schließen ohne Einschränkung ein: einen Säuger so wie ein Nagetier, Maus, Ratte, Kaninchen, Meerschweinchen, Huftier, Pferd, Schaf, Schwein, Ziege, Kuh, Katze, Hund, einen Primaten, einen humanen oder nicht humanen Primaten; eine Pflanze so wie Arabidopsis thaliana, Mais (Zea mays), Hirse, Hafer (Oryza sativa), Weizen, Reis, Raps oder Sojabohne; eine Alge so wie Chlamydomonas reinhardtii; einen Nematoden so wie Caenorhabditis elegans; ein Insekt so wie Drosophila melanogaster, Moskito, Fruchtfliege, Honigbiene oder Spinne; einen Fisch so wie einen Zebrabärbling (Danio rerio); ein Reptil; eine Amphibie so wie einen Frosch oder Xenopus laevis; ein Dictyostelium discoideum; einen Pilz so wie Pneumocystis carinii, Takifugu rubripes, Hefe, Saccharomyces cerevisiae oder Schizosaccharomyces pombe; oder Plasmodium falciparum. Zusätzlich zu tierischen und pflanzlichen Systemen kann die vorliegende Erfindung mit einem prokaryotischen System verwendet werden, einschließend z. B. ein Bakterium so wie Escherichia coli, Staphylokokken oder Mycoplasma pneumoniae; ein Archae-Bakterium; ein Virus so wie das Hepatitis C-Virus oder das humane Immundefizienzvirus; oder ein Viroid. Endogene kleine Oligonukleotide können aus einem biologischen System isoliert werden, aus welchem sie synthetisiert wurden. Exogene kleine Oligonukleotide können aus einem biologischen System isoliert werden, aus welchem sie übertragen wurden, z. B. durch virale Infektion oder durch Behandlung mit einem Vorläufer eines kleinen Oligonukleotids. Beispielhafte Vorläufer kleiner Oligonukleotide schließen dsRNAs so wie nachfolgend detaillierter beschriebenen ein.
Wie hierin verwendet, soll der Begriff „Detektionsoligonukleotid" eine Nukleotidsequenz bezeichnen, welche etwa 5 bis etwa 500 Nukleotide (z. B. etwa 5 bis etwa 200 Nukleotide, etwa 5 bis etwa 100 Nukleotide oder etwa 5 bis etwa 50 Nukleotide) umfasst und in einem 5'-Ende und einem 3'-Ende terminiert. In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung kann das Detektionsoligonukleotid ein 5'-Phosphat und ein modifiziertes 3'-Ende einschließen. Bei einem 5'-Phosphat handelt es sich um einen (PO₄)^2–(PO₄H)^–- oder einen (PO₄H₂)-Rest, welcher über eines der Sauerstoffatome kovalent an dem 5'-Kohlenstoff der Ribose befestigt ist. In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung kann das Detektionsoligonukleotid ein 3'-Hydroxyl und ein modifiziertes 5'-Ende einschließen. Bei einem 3'-Hydroxyl handelt es sich um einen OH- oder O-Rest, welcher über den Sauerstoff kovalent an dem 3'-Kohlenstoff der Ribose befestigt ist. Der Fachmann wird erkennen, dass es sich bei der An- oder Abwesenheit von Wasserstoff in den wie oben aufgeführten Phosphat- oder Hydroxylresten um eine Funktion ihrer pKa-Werte und des pH-Wertes ihrer Umgebung handelt.
Ein modifiziertes 5'- oder 3'-Ende kann eine beliebige chemische oder strukturelle Modifikation von wenigstens einem Nukleotid einschließen, welche die Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen zwei Nukleotiden verhindern, inhibieren und/oder reduzieren kann. Beispiele für solche Modifikationen schließen ohne Einschränkung C-3-Spacer, Aminomodifikatoren, invertierte dTs und Didesoxy-Cs ein. Durch das Einschließen eines modifizierten 5'- oder 3'-Endes kann die Bildung von unerwünschten Nebenprodukten der Ligation reduziert oder verhindert werden.
Das Detektionsoligonukleotid kann sich aus natürlich vorkommender oder synthetischer RNA, DNA oder aus anderen Oligonukleotiden so wie einem Analogon einer natürlich vorkommenden Nukleinsäure zusammensetzen. Es kann auch mindestens ein Locked-Nukleinsäure (LNA)-Molekül in dem Detektionsoligonukleotid eingeschlossen sein. Eine LNA kann z. B. ein modifiziertes RNA-Nukleotid einschließen, in welchem der Riboserest der LNA durch eine zusätzliche Brücke modifiziert ist, welche die 2'- und 4'-Kohlenstoffe miteinander verbindet. Die Brücke kann die Ribose in einer 3'-Endostruktur-Konformation arretieren, wodurch die Basenstabilität und der Voraufbau des Rückgrats gefördert werden.
Ein Nukleinsäureanalogon kann ein wechselndes Rückgrat aufweisen, einschließend ohne Einschränkung Phosphoramid (siehe z. B. Beaucage et al., Tetrahedron 49:1925 (1993); Letsinger, J. Org. Chem. 35:3800 (1970); Sprinzl et al., Eur. J. Biochem. 81:579 (1977); Letsinger et al., Nucl. Acids Res. 14:3487 (1986); Sawai et al., Chem. Lett. 805 (1984), Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110:4470 (1988); und Pauwels et al., Chemica Scripta 26:141 (1986)), Phosphorthioat (siehe z. B. Mag et al., Nucleic Acids Res. 19:1437 (1991); sowie US-Patent Nr. 5,644,048 ), Phosphordithioat (siehe z. B. Briu et al., J. Am. Chem. Soc. 111:2321 (1989)), O-Methylphosphoramiditverbindungen (siehe z. B. Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press), sowie Rückgrate und Verbindungen von Peptidnukleinsäuren (siehe z. B. Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114:1895 (1992); Meier et al., Chem. Int. Ed. Engl. 31:1008 (1992); Nielsen, Nature 365:566 (1993); Carlsson et al., Nature 380:207 (1996)). Andere Analogstrukturen schließen ein: die mit positiven Rückgraten (siehe z. B. Dempcy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6097 (1995); nichtionischen Rückgraten (siehe z. B. US-Patente Nrs. 5,386,023 ; 5,637,684 ; 5,602,240 ; 5,216,141 und 4,469,863 ; Kiedrowshi et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English 30:423 (1991); Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110.:4470 (1988); Letsinger et al., Nucleoside & Nucleotide 13:1597 (1994); Kapitel 2 und 3, ASC Symposium Series 580, „Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Hrsg. Y. S. Sanghui und P. Dan Cook; Mesmaeker et al., Bioorganic & Medical Chem. Left. 4:395 (1994); Jeffs et al., J. Biomolecular NMR 34:17 (1994); Tetrahedron Lett. 37:743 (1996) sowie nicht-Ribose Rückgrate, einschließend z. B. die in den US-Patenten Nrs. 5,235,033 und 5,034,506 , sowie in den Kapiteln 6 und 7, ASC Symposium Series 580, „Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Hrsg. Y. S. Sanghui und P. Dan Cook beschriebenen. Analogstrukturen enthaltend einen oder mehrere carbozyklische Zucker sind ebenfalls nützlich in den Verfahren und sind z. B. beschrieben in Jenkins et al., Chem. Soc. Rev. (1995) Seiten 169–176. Einige weitere Analogstrukturen, welche erfindungsgemäß nützlich sind, sind beschrieben in Rawls, C & E News 2. Jun. 1997, Seite 35. Ähnliche Analoga können in einer erfindungsgemäßen Sonde oder in einer anderen erfindungsgemäßen Nukleinsäure verwendet werden.
Eine in der vorliegenden Erfindung verwendete Nukleinsäure oder ein in der vorliegenden Erfindung verwendetes Nukleinsäureanalogon kann native oder nicht native Basen oder beides einschließen. Native Desoxyribonukleinsäurebasen schließen ein: Adenin, Thymin, Cytosin oder Guanin und native Ribonukleinsäurebasen schließen ein: Uracil, Adenin, Cytosin oder Guanin. Beispielhafte nicht native Basen, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen ohne Einschränkung ein: Inosin, Xanthin (engl. orig. xathanine), Hypoxanthin (engl. orig. hypoxathanine), Isocytosin, Isoguanin, 5-Methylcytosin, 5-Hydroxymethylcytosin, 2-Aminoadenin, 6-Methyladenin, 6-Methylguanin, 2-Propylguanin, 2-Propyladenin, 2-Thiouracil, 2-Thiothymin, 2-Thiocytosin, 15-Halouracil, 15-Halocytosin, 5-Propynyluracil, 5-Propynylcytosin, 6-Azouracil, 6-Azocytosin, 6-Azothymin, 5-Uracil, 4-Thiouracil, 8-Haloadenin oder -guanin, 8-Aminoadenin oder -guanin, 8-Thioladenin oder -guanin, 8-Thioalkyladenin oder -guanin, 8-Hydroxyladenin oder -guanin, 5-Halo-substituiertes Uracil oder Cytosin, 7-Methylguanin, 7-Methyladenin, 8-Azaguanin, 8-Azaadenin, 7-Deazaguanin, 7-Deazaadenin, 3-Deazaguanin, 3-Deazaadenin oder dergleichen.
Wie hierin verwendet, soll der Begriff „Brückenoligonukleotid" eine Nukleotidsequenz bezeichnen, welche etwa 10 bis 100 Nukleotide oder mehr in der Länge umfasst und in einem 5'-Ende und einem 3'-Ende terminiert. Das Brückenoligonukleotid kann natürlich vorkommende oder synthetische RNA, DNA oder andere Oligonukleotide, so wie ein Analogon einer natürlich vorkommenden Nukleinsäure (zuvor detailliert beschrieben), einschließen. Sowohl das 5'- als auch das 3'-Ende des Brückenoligonukleotids können eine Modifikation einschließen, so wie einen C-3-Spacer, invertiertes dT, einen Aminomodifikator, Dideoxy-C oder ein anderes Agens, um die Bildung von nicht erwünschten Nebenprodukten der Ligation zu reduzieren oder zu verhindern. Alternativ dazu können das 5'- bzw. das 3'-Ende jeweils ein 5'-Phosphat und ein 3'-Hydroxyl einschließen; solche Endgruppen sind jedoch nicht bevorzugt, da so eine höhere Wahrscheinlichkeit für die Erzeugung eines Ligationsnebenprodukts gegeben sein kann. Das Brückenoligonukleotid kann sowohl zu dem Detektionsoligonukleotid als auch zu einem kleinen Oligonukleotid am 5'- bzw. 3'-Ende komplementär sein. Alternativ dazu kann das Brückenoligonukleotid sowohl zu dem Detektionsoligonukleotid als auch zu einem kleinen Oligonukleotid am 3'- bzw. 5'-Ende komplementär sein. Des Weiteren kann ein Abschnitt des Brückenoligonukleotids zwischen dem 5'- und dem 3'-Ende zu dem kleinen Oligonukleotid komplementär sein, während das 5'- und das 3'-Ende zu einer Vielzahl an Detektionsoligonukleotiden komplementär sein können.
Wie hierin verwendet, soll der Begriff „markierender Rest" eines oder mehrere Atome bezeichnen, welche spezifisch detektiert werden können, um eine Substanz so wie eine Nukleinsäure zu identifizieren, an welcher das eine oder die mehreren Atome befestigt sind. Bei einem markierenden Rest kann es sich um eine primäre Markierung handeln, welche direkt detektiert werden kann, oder um eine sekundäre Markierung, welche indirekt detektiert werden kann, z. B. über die Interaktion mit einer primären Markierung. Beispielhafte primäre Markierungen schließen ohne Einschränkung ein: eine isotopische Markierung, so wie ein nicht häufig natürlich vorkommendes schweres Isotop oder ein radioaktives Isotop. Beispiele hierfür schließen ¹⁴C, ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹³¹I, ³²P, ³³P, ³⁵S oder ³H; optisch detektierbare Reste so wie ein Chromophor, ein Luminophor, ein Fluorophor, eine Licht streuende Quantenpunkt- oder Nanopartikelmarkierung; eine elektromagnetische Spin-Markierung; ein kalorimetrisches Agens; eine magnetische Substanz; ein elektronenreiches Material so wie ein Metall; eine elektrochemilumineszente Markierung so wie Ru(bpy)³²⁺; einen Rest, welcher auf der Grundlage eines nuklearmagnetischen, paramagnetischen, elektrischen, Ladungzu-Masse- oder eines thermischen Merkmals detektiert werden kann; oder Licht streuende oder plasmonresonante Materialien so wie Gold- oder Silberpartikeln. Fluorophore, welche erfindungsgemäß verwendet werden können, schließen z. B. ein: fluoreszierende Lanthanidkomplexe, einschließend die von Europium und Terbium, Fluoreszein, Fluoreszeinisothiocyanat, Dichlortriazinylaminfluoreszein, Rhodamin, Tetramethylrhodamin, Umbelliferon, Eosin, Erythrosin, Kumarin, Methylkumarine, Pyren, Malachitgrün, Cy3, Cy5, Stilben, Lucifer Yellow, CASCADE BLUE, Texas Red, Alexa-Farbstoffe, Dansylchloride, Phycoerythin, grün fluoreszierendes Protein und seine wellenlängenverschobenen Varianten, Bodipy und andere im Stand der Technik bekannte, so wie die in Haugland, Molecular Probes Handbook, (Eugene, Oreg., USA), 6. Auflage; The Synthegen Catalog (Houston, Tex., USA), Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2. Auflage, Plenum Press New York (1999) oder WO 98/59066 beschriebenen.
Beispiele für sekundäre Markierungen sind bindende Reste so wie ein Rezeptor, ein Ligand oder ein anderes Mitglied eines Paares von Molekülen, welche eine Bindungsspezifität füreinander aufweisen. Beispielhafte bindende Reste mit einer Spezifität füreinander schließen ohne Einschränkung ein: Streptavidin/Biotin, Avidin/Biotin oder einen Antigen-/Antikörperkomplex so wie Kaninchen-IgG und anti-Kaninchen-IgG. Mit einer spezifischen Affinität zwischen zwei Bindungspartnern bezeichnet man die präferentielle Bindung des einen Partners an den anderen im Vergleich zu der Bindung des Partners an andere Komponenten oder Kontaminanten in dem System. Spezifisch gebundene Bindungspartner bleiben unter den hierin beschriebenen Detektions- oder Separationsbedingungen, einschließend Waschschritte zur Entfernung nicht spezifischer Bindungen, typischerweise aneinander gebunden. Je nach den verwendeten spezifischen Bindungsbedingungen kann die Dissoziationskonstante des Paares z. B. weniger als 10^–4, 10^–5, 10^–6, 10^–7, 10^–8, 10^–9, 10^–10, 10^–11 oder 10^–12 M^–1 betragen. Sekundäre Markierungen schließen ebenfalls Enzyme ein, welche ein detektierbares Produkt produzieren, so wie Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase, β-Galaktosidase oder Acetylcholinesterase.
Wie hierin verwendet, soll der Begriff „Ligand" ein Molekül bezeichnen, welches dazu in der Lage ist, selektiv an ein anderes Molekül zu binden.
Bei 1 handelt es sich um ein Flussdiagramm, welches ein Verfahren 10 zur Detektion von kleinen Oligonukleotiden in Übereinstimmung mit einem Aspekt der Erfindung illustriert. In dem Verfahren 10, in Schritt 20, wird ein biologisches Isolat bereitgestellt, welches mindestens ein kleines Oligonukleotid umfasst. Das biologische Isolat kann aus einem beliebigen einer Vielzahl von Organismen stammen, einschließend ohne Einschränkung die zuvor genannten. In vielen Fällen können biologische Isolate aus kommerziellen Quellen oder von Banken und Hinterlegungsstellen erhältlich sein, welche von öffentlichen oder privaten Institutionen verwaltet werden, so wie die American Type Culture Collection (ATCC). Für viele Anwendungen ist es wünschenswert, dass von kommerziellen Quellen verwendete Isolationsprotokolle den Rückbehalt kleiner Oligonukleotide berücksichtigen, welche für eine spezifische Anwendung der vorliegenden Erfindung von Interesse sind. Ein biologisches Isolat kann aus einer oder mehreren Zellen, Körperflüssigkeiten oder aus einem oder mehreren Geweben stammen. Zur Gewinnung einer Körperflüssigkeit so wie Blut, Schweiß, Tränen, Lymphe, Urin, Speichel, Sperma, Zerebrospinalflüssigkeit, Fäkalien oder amniotischer Flüssigkeit können bekannte Verfahren verwendet werden. In ähnlicher Weise können bekannte Biopsieverfahren verwendet werden, um Zellen oder Gewebe zu erhalten, so wie ein Abstrich der Mundschleimhaut, eine Mundspülung, eine operative Entfernung, eine Aspirationsbiopsie oder dergleichen. Ein biologisches Isolat aus einer oder mehreren Zellen oder aus einem oder mehreren Geweben kann ebenfalls in einer Primärkultur, in einer propagierten Zelllinie, in einer fixierten archivalischen, forensischen oder archäologischen Probe erhalten werden.
Beispielhafte Zellarten, aus welchen in dem Verfahren 10 der vorliegenden Erfindung ein Nukleinsäure enthaltendes Isolat erhalten werden kann, können ohne Einschränkung einschließen: eine Blutzelle so wie einen B-Lymphozyten, einen T-Lymphozyten, einen Leukozyten, einen Erythrozyten, einen Makrophagen oder einen Neutrophilen; eine Muskelzelle so wie eine Skelettmuskelzelle, eine glatte Muskelzelle oder eine Herzmuskelzelle; eine Keimzelle so wie eine Spermien- oder Eizelle; eine Epithelzelle; eine Bindegewebszelle so wie einen Adipozyten, einen Fibroblasten oder einen Osteoblasten; ein Neuron; einen Astrozyten; eine Stromazelle; eine Nierenzelle; eine Bauchspeicheldrüsenzelle; eine Leberzelle; oder einen Keratinozyten. Eine Zelle, aus welcher ein Isolat erhalten wird, kann sich in einem spezifischen Entwicklungsstadium befinden, einschließend z. B. eine hämatopoetische Stammzelle oder eine Zelle, welche aus einer hämatopoetischen Stammzelle hervorgeht, so wie ein rotes Blutkörperchen, ein B-Lymphozyt, ein T-Lymphozyt, eine natürliche Killerzelle, ein Neutrophil, ein Basophil, ein Eosinophil, ein Monozyt, ein Makrophage oder ein Blutplättchen. Andere Zellen schließen ein: eine Knochenmarkstromazelle (mesenchymale Stammzelle) oder eine Zelle, welche sich daraus entwickelt, so wie eine Knochenzelle (Osteozyt), Knorpelzellen (Chondrozyten), eine Fettzelle (Adipozyt) oder andere Arten von Bindegewebszellen so wie eine in Sehnen vorzufindende Zelle; eine Nervenstammzelle oder eine Zelle, welche aus dieser hervorgeht, einschließend z. B. eine Nervenzelle (Neuron), einen Astrozyten oder einen Oligodendrozyten; eine Epithelstammzelle oder eine Zelle, welche aus einer Epithelstammzelle hervorgeht, so wie eine absorptive Zelle, eine Becherzelle, eine Paneth-Zelle oder eine enteroendokrine Zelle; eine Hautstammzelle; oder eine Follikelstammzelle. Im Allgemeinen kann jede beliebige Art von Stammzellen verwendet werden, einschließend ohne Einschränkung eine embryonale Stammzelle, eine adulte Stammzelle oder eine pluripotente Stammzelle.
Bei einer Zelle, aus welcher ein biologisches Isolat zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung erhalten wird, kann es sich um eine normale Zelle handeln oder um eine Zelle, welche eines oder mehrere Symptome einer spezifischen Krankheit oder Verfassung zeigt. Folglich kann ein in einem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendetes biologisches Isolat erhalten werden aus einer Krebszelle, einer neoplastischen Zelle, einer nekrotischen Zelle oder aus einer Zelle, welche eine wie zuvor erwähnte Krankheit oder Verfassung durchläuft. Der Fachmann wird Verfahren zur Isolation von Proben aus einer Zelle, einem Fluid oder einem Gewebe unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren, so wie den in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, 3. Auflage, Cold Spring Harbor Laborstory, New York, USA (2001) oder in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley und Söhne, Baltimore, Md., USA (1998) beschriebenen, kennen oder ohne weiteres dazu in der Lage sein, solche Verfahren zu bestimmen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung kann des Weiteren Schritte zur Isolation einer spezifischen Zell- oder Gewebeart einschließen. Beispielhafte Verfahren, welche dazu verwendet werden können, eine spezifische Zelle von anderen Zellen in einer Population zu isolieren, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf: Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS, Fluorescence Activated Cell Sorting), wie z. B. beschrieben in Shapiro, Practical Flow Cytometry, 3. Auflage, Wiley-Liss (1995), Dichte-Gradienten-Zentrifugation oder manuelle Trennung unter Verwendung von mikromanipulativen Verfahren mit Hilfe eines Mikroskops. Beispielhafte Vorrichtungen zur Zellseparation, welche in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, schließen ohne Einschränkung ein: ein Beckman JE-6 zentrifugales Elutriationssystem, einen Beckman Coulter EPICS ALTRA computergesteuerten Flusszytometer-Zellsortierer, ein Modular Flusszytometer von Cytomation, Inc., ein Coulter Zähler- und Kanalisiersystem, eine Dichte-Gradienten-Vorrichtung, eine Zytozentrifuge Beckman J-6, einen EPICS V dualen Laser-Zellsortierer oder ein EPICS PROFILE Flusszytometer. Ein Gewebe oder eine Population von Zellen kann ebenfalls durch operative Verfahren entfernt werden. So kann z. B. ein Tumor oder Zellen aus einem Tumor mittels operativer Verfahren aus einem Gewebe entfernt werden oder es können umgekehrt nicht kanzeröse Zellen aus der Umgebung eines Tumors entfernt werden.
Ein biologisches Isolat kann durch Lysis einer Zelle, welche eine oder mehrere erwünschte Nukleinsäuren enthält, zur Verwendung in dem Verfahren 10 der vorliegenden Erfindung präpariert werden. Typischerweise wird eine Zelle unter Bedingungen lysiert, welche die Integrität der gewünschten Nukleinsäure im Wesentlichen konservieren. So können z. B. Zellen lysiert oder Subfraktionen erhalten werden unter Bedingungen, welche die Integrität der RNA stabilisieren. Solche Bedingungen schließen z. B. ein: die Zelllysis in starken Denaturierungsmitteln, einschließend chaotropische Salze so wie Guanidinthiocyanat, in ionischen Reinigungsmitteln so wie Natriumdodecylsulfat, in organischen Lösungsmitteln so wie Phenol, in hohen Lithiumchloridkonzentrationen oder unter anderen Bedingungen, von denen gemäß dem Stand der Technik bekannt ist, dass sie bei der Limitierung der Aktivität von endogenen RNasen während der Aufreinigung von RNA effektiv sind, so wie z. B. beschrieben in Sambrook et al., supra (2001) oder in Ausubel et al., supra (1998). Zusätzlich können verhältnismäßig unbeschädigte Nukleinsäuren so wie RNA aus einer Zelle erhalten werden, welche durch ein Enzym lysiert wird, das die Zellwand degradiert. Zellen, welche entweder von Natur aus oder aufgrund enzymatischer Entfernung keine Zellwand besitzen, können auch dadurch lysiert werden, dass man sie osmotischem Stress aussetzt. Andere Bedingungen, welche zur Lysis einer Zelle verwendet werden können, schließen solche ein, in denen die Zellen Reinigungsmitteln, einer mechanischen Spaltung, einer Ultraschallbehandlung, Hitze, einem Druckunterschied, so wie bei einer French Press, oder einer Dounce-Homogenisierung ausgesetzt werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung kann Gesamt-RNA unter Verwendung von Guanidinisothiocyanat, Phenol: Chloroform und einem inerten Träger, so wie Glykogen oder lineares Polyacrylamid, hergestellt werden. So können z. B. während der Alkoholpräzipitation 20 ng Glykogen pro 1 ml (Reaktionsvolumen) zugegeben werden, um die Gewinnung von Gesamt-RNA zu steigern. Es können dann mittels kommerziell erhältlicher auf Säulen basierender Aufreinigungsverfahren, so wie dem miRACLE miRNA Purification Kit von STRATAGENE (La Jolla, CA, USA), Proben hergestellt werden. Isolierte RNA kann z. B. in TE-Puffer oder RNase-freiem Wasser verdünnt und in geeigneter Art und Weise aufbewahrt werden.
Agenzien, welche die Nukleinsäuren stabilisieren, können in einem Zelllysat oder einem anderen biologischen Lysat, einschließend z. B. Nukleaseinhibitoren so wie Ribonukleaseinhibitoren oder Desoxyribonukleaseinhibitoren, Chelatbildner, Salzpuffer und dergleichen, eingeschlossen sein. Verfahren zur Lysis einer Zelle zum Erhalt von Nukleinsäuren können unter im Stand der Technik bekannten Bedingungen durchgeführt werden, so wie z. B. beschrieben in Sambrook et al., supra (2001) oder in Ausubel et al., supra (1998).
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung kann es sich bei einem biologischen Isolat um ein Rohlysat aus Zellen handeln, welches ohne weitere Isolation von Nukleinsäuren erhalten wurde. Alternativ dazu kann eine Nukleinsäure von Interesse gemäß der vorliegenden Erfindung aus anderen zellulären Komponenten weiter isoliert werden. Das erfindungsgemäße Verfahren 10 kann mit aufgereinigter oder teilweise aufgereinigter RNA durchgeführt werden. RNA kann unter Verwendung bekannter Separationsverfahren isoliert werden, einschließend z. B. Flüssigphasenextraktion, Präzipitation oder Festphasenextraktion. Solche Verfahren sind z. B. beschrieben in Sambrook et al., supra (2001) oder in Ausubel et al., supra (1998) oder können von verschiedenen kommerziellen Anbietern bezogen werden, einschließend z. B. Qiagen (Valencia, Calif., USA) oder Promega (Madison, Wis., USA).
Sofern dies erwünscht ist, können Nukleinsäuren basierend auf Eigenschaften wie der Masse, des Ladungs-zu-Masse-Verhältnisses oder dem Vorhandensein einer spezifischen Sequenz getrennt werden. Verfahren zur Separation von Nukleinsäuren schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf: Elektrophorese unter Verwendung eines Agarose- oder Polyacrylamidgels, Kapillarelektrophorese, konventionelle Chromatographieverfahren so wie die Größenausschlusschromatographie, die Reversed-Phase-Chromatographie oder die Ionenaustauschchromatographie oder Affinitätsverfahren so wie die Affinitätschromatographie oder die Präzipitation unter Verwendung von Festphasenpoly-dT-Oligonukleotiden. Dem Fachmann wird ein geeignetes Separationsverfahren oder eine Kombination von Separationsverfahren zum Erhalt eines biologischen Isolats mit einer erwünschten Nukleinsäurezusammensetzung sowie einer erwünschten Reinheit bekannt sein, oder er wird dazu in der Lage sein, ein solches zu bestimmen. Proteine oder große genomische DNA können z. B. unter Verwendung von Präzipitations- und Zentrifugationsverfahren, welche sich die Tatsache zu Nutze machen, dass genomische DNA und Proteine größer sind, aus RNA entfernt werden. Messenger-RNA kann z. B. unter Verwendung von Präzipitation mit Poly-dT-Oligonukleotidbeads oder mittels Größenausschlusschromatographie aus anderen RNA-Spezies entfernt werden. Solche Verfahren können in Kombination mit selektiven Modifikationen des 5'-Phosphats von kleinen Oligonukleotiden verwendet werden, um kleine Oligonukleotide von den anderen Zellkomponenten zu unterscheiden.
In Schritt 30 wird das biologische Isolat mit einem markierten Detektionsoligonukleotid und einem Brückenoligonukleotid in Kontakt gebracht, um ein kleines Oligonukleotid aus dem biologischen Isolat einzufangen. Unter „einfangen" ist zu verstehen, dass eine Nukleinsäure, so wie ein kleines Oligonukleotid, an eine komplementäre Nukleinsäure, so wie das Brückenoligonukleotid, hybridisiert.
Das Detektionsoligonukleotid kann unter derartigen Bedingungen hergestellt werden, dass das 5'-Phosphat und/oder das 3'-Hydroxyl des Detektionsoligonukleotids vorzugsweise so modifiziert wird/werden, dass es/sie einen markierenden Rest einschließt/einschließen. Optional oder zusätzlich dazu kann der markierende Rest in das Innere des Detektionsoligonukleotids eingebaut sein. Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung kann ein phosphatreaktives Reagens, welches einen markierenden Rest oder einen Vorläufer davon umfasst, derart verwendet werden, dass die 5'-Phosphatmodifikation ein den markierenden Rest enthaltendes Detektionsoligonukleotid hervorbringt. Das Detektionsoligonukleotid kann ebenfalls derart hergestellt werden, dass das 5'-Ende oder das 3'-Ende eine Modifikation einschließt (z. B. invertierte dTs), welche die Bildung von Nebenprodukten der Ligation verhindert oder reduziert.
In beispielhafter Art und Weise kann das Detektionsoligonukleotid erzeugt werden, indem man ein DNA-Oligonukleotid am 5'-Ende mit [γ-³²P]-ATP markiert, einschließend ein invertiertes dT am 3'-Ende, und dann ein nicht eingebautes Isotop entfernt. Kurz gesagt können die Reagenzien (d.h. das Detektionsoligonukleotid, RNase-freies Wasser, 10 X OPTIKINASE Reaktionspuffer, [γ-³²P]-ATP und OPTIKINASE) auf Eis aufgetaut, gründlich vermischt, kurz geschleudert und dann bei Raumtemperatur miteinander vermischt werden. Das Gemisch kann dann für etwa 30 bis 60 Minuten inkubiert werden. Im Anschluss an die Inkubation können Aliquots des Gemischs derart behandelt werden, dass nicht eingebautes [γ-³²P]-ATP entfernt wird. Daraufhin kann eine Population markierter Detektionsoligonukleotide erzeugt und wie im Nachfolgenden beschrieben verwendet werden.
Es versteht sich, dass im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Vielzahl von phosphatreaktiven Reagenzien verwendet werden kann. Im Allgemeinen kann das phosphatreaktive Reagens in einem Reaktionsgemisch vorzugsweise einen Rest zu einem Phosphat hinzufügen. So kann z. B. ein phosphatreaktives Agens derart zu einer Population von Detektionsoligonukleotiden hinzugegeben werden, so dass es vorzugsweise mit dem 5'-Phosphat des Detektionsoligonukleotids reagiert. Phosphatreaktive Reagenzien können solche einschließen, welche dem 3'-Ende von Nukleinsäuren gegenüber unreaktiv sind.
Bei einem phosphatreaktiven Reagens kann es sich um ein einzelnes Molekül oder um eine Kombination von Molekülen handeln. So kann z. B. ein einzelnes Molekül einen mit einem markierenden Rest verbundenen reaktiven Rest enthalten, so dass eine Reaktion zwischen dem reaktiven Rest und dem 5'-Phosphat des Detektionsoligonukleotids ein mit dem markierenden Rest verbundenes Detektionsoligonukleotid hervorbringt.
Alternativ dazu kann eine Kombination von Molekülen als ein phosphatreaktives Reagens verwendet werden. So kann z. B. ein erstes markierendes Molekül mit einem Detektionsoligonukleotid und einem zweiten Molekül, welches das 5'-Phosphat oder das erste markierende Molekül aktiviert, in Kontakt gebracht werden, wodurch ein Detektionsoligonukleotid mit einer daran befestigen Markierung entsteht. Das phosphatreaktive Reagens kann zusätzlich oder alternativ dazu einen markierenden Rest mit einer daran gebundenen Aminogruppe sowie ein zweites Molekül einschließen, bei welchem es sich um ein Carbodiimid-Molekül handelt, welches das 5'-Phosphat derart aktiviert, dass es mit der Aminogruppe reagiert, um ein Detektionsoligonukleotid mit einer Phosphoramiditbindung zu dem markierenden Rest hervorzubringen. Weitere beispielhafte phosphatreaktive Reagenzien schließen ohne Einschränkung ein: ε-(6-(Biotinoyl)-Amino)-Hexanoyl-L-Lysin, Hydrazid; DSB-X Biotin-Hydrazid; DSB-X Desthiobiocytin(-Desthiobiotinoyl-L-Lysin); DSB-X Biotinethylendiamin (Desthiobiotin-X-Ethylendiamin, Hydrochlorid); Biotin-X Cadaverin; Alexa Fluor Cadaverin; 5-(Aminoacetamido)Fluoreszein (Fluoreszeinylglycinamid); 4'-(Aminomethyl)Fluoreszein, Hydrochlorid; 5-(((2-(Carbohydrazino)Methyl) Thio) Acetyl)Aminofluoreszein; Fluoreszein-5-Thiosemicarbazid; N-Methyl-4-Hydrazinn-7-Nitrobenzofurazan; Oregon Green 488 Cadaverin; 5-((5-Aminopentyl)Thioureidyl) Eosin, Hydrochlorid; Texas Red Cadaverin; Texas Red Hydrazid; Bimanamin; Poly(Ethylenglykol)Methylether, aminoterminiert; sowie Lissamin-Rhodamin-B-Ethylendiamin. Der Fachmann wird erkennen, dass ein beliebiger aus einer Vielzahl von markierenden Resten durch die in dieser Liste aufgeführten ersetzt werden kann. So kann z. B. Fluoreszein durch andere hierin beschriebene Fluorophore ersetzt werden.
Bei dem Brückenoligonukleotid kann es sich um ein DNA-Oligonukleotid handeln, welches sowohl zu dem Detektionsoligonukleotid als auch zu einem spezifischen kleinen Oligonukleotid am 5'- bzw. 3'-Ende des Brückenoligonukleotids komplementär ist. Alternativ dazu kann das Brückenoligonukleotid sowohl zu dem Detektionsoligonukleotid als auch zu einem kleinen Oligonukleotid am 3'- bzw. 5'-Ende komplementär sein. Der phosphatmarkierte Rest sollte in solchen Fällen, in denen z. B. der markierende Rest an der Phosphatgruppe am 5'-Ende des Detektionsoligonukleotids befestigt ist und das Brückenoligonukleotid so gestaltet ist, dass es das Detektionsoligonukleotid mit der 3'-Hydroxylgruppe des kleinen Oligonukleotids verbindet, keine Eigenschaften aufweisen, welche eine Ligationsreaktion verhindern.
In beispielhafter Art und Weise kann ein kleines Oligonukleotid dadurch eingefangen werden, dass man ein biologisches Isolat mit einem markierten Detektionsoligonukleotid und einem Brückenoligonukleotid kombiniert. Es können ebenfalls eine positive Kontrolle, welche ein kleines Oligonukleotid von Interesse enthält, sowie eine negative Kontrolle (d.h. keine RNA enthaltend) hergestellt werden. Das Reaktionsgemisch kann dann vermischt, kurz geschleudert und für einen gewünschten Zeitraum bei einer geeigneten Temperatur inkubiert werden. Ein kleines Oligonukleotid kann durch das Brückenoligonukleotid mittels Hybridisierung an das 3'-Ende des Brückenoligonukleotids eingefangen werden. Das markierte Detektionsoligonukleotid kann ebenfalls an das 5'-Ende des Brückenoligonukleotids hybridisieren, und zwar entweder vor, zeitgleich mit oder nach dem Einfangen des kleinen Oligonukleotids. Alternativ dazu kann ein kleines Oligonukleotid dadurch von dem Brückenoligonukleotid eingefangen werden, dass es an das 5'-Ende des Brückenoligonukleotids hybridisiert. In diesem Fall kann das markierte Detektionsoligonukleotid an das 3'-Ende des Brückenoligonukleotids hybridisieren, und zwar entweder vor, zeitgleich mit oder nach dem Einfangen des kleinen Oligonukleotids.
Nach der Inkubation des Reaktionsgemischs kann in Schritt 40 mindestens ein ligierendes Reagens zu dem Reaktionsgemisch hinzugegeben werden. Wie hierin verwendet, bezeichnet ein „ligierendes Reagens" ein Molekül, typischerweise ein Enzym, welches dazu in der Lage ist, die Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen zwei Nukleotiden zu fördern. Beispiele für ligierende Reagenzien schließen DNA-Ligasen so wie T4-DNA-Ligase ein, welche kovalente Phosphodiesterbindungen zwischen dem 3'-Hydroxylende eines Nukleotids und dem 5'-Phosphatende eines weiteren Nukleotids bilden können. Weitere Beispiele für ligierende Reagenzien schließen ein: RNA-Ligase, DNA-Ligasen I–IV ebenso wie im Stand der Technik bekannte chemische Vernetzungsmittel.
Im Anschluss an das Einfangen des kleinen Oligonukleotids werden in Schritt 40 das eingefangene kleine Oligonukleotid und das markierte Detektionsoligonukleotid zu einem markierten kleinen Oligonukleotid ligiert. Das eingefangene kleine Oligonukleotid und das markierte Detektionsoligonukleotid können durch Kombination des eingefangenen kleinen Oligonukleotids und des markierten Detektionsoligonukleotids mit mindestens einem ligierenden Reagens ligiert werden. Das mindestens eine ligierende Reagens kann z. B. eine Zusammensetzung einschließen, welche T4-DNA-Ligase umfasst. Das ligierende Reagens kann dem Reaktionsgemisch zugegeben werden und das daraus resultierende Reaktionsgemisch kann kurz geschleudert und für einen gewünschten Zeitraum bei einer angemessenen Temperatur inkubiert werden. Durch die Zugabe des ligierenden Reagens zu dem Reaktionsgemisch bilden das 5'-Phosphat des Detektionsoligonukleotids und das 3'-Hydroxyl des kleinen Oligonukleotids eine kovalente Phosphodiesterbindung, so dass jeweils die 5'- und 3'-Enden des Detektionsoligonukleotids und des kleinen Oligonukleotids miteinander ligiert sind. Alternativ dazu können in Fällen, in denen das Detektionsoligonukleotid und das kleine Oligonukleotid jeweils an die 3'- und 5'-Enden des Brückenoligonukleotids hybridisiert sind, das 3'-Hydroxyl des Detektionsoligonukleotids und das 5'-Phosphat des kleinen Oligonukleotids eine kovalente Phosphodiesterbindung bilden, so dass jeweils die 3'- und 5'-Enden des Detektionsoligonukleotids und des kleinen Oligonukleotids miteinander ligiert sind.
In einem Beispiel kann die Größe des ligierten kleinen Oligonukleotids und des Detektionsoligonukleotids etwa 35 bis etwa 39 Nukleotide betragen (z. B. etwa 21 bis etwa 25 Nukleotide des kleinen Oligonukleotids plus etwa 14 Nukleotide des markierten Detektionsoligonukleotids). Es versteht sich, dass die Größe des ligierten kleinen Oligonukleotids und des Detektionsoligonukleotids je nach der Größe des kleinen Oligonukleotids und des Detektionsoligonukleotids kleiner oder größer ausfallen kann.
Im Anschluss an die Ligation des eingefangenen kleinen Oligonukleotids und des markierten Detektionsoligonukleotids können überschüssige Detektionsoligonukleotide und/oder markierte Reste aus jeglichen nicht ligierten Detektionsoligonukleotiden des Reaktionsgemischs entfernt werden. Die überschüssigen markierten Reste können z. B. unter Verwendung eines Reinigungsmittels entfernt werden, welches eine Phosphatase umfasst. Die Phosphatase ist dazu in der Lage, Phosphatgruppen von den 5'-Enden von kleinen Oligonukleotiden zu entfernen, welche phosphatmarkierte Reste enthalten. Das Entfernen von markierten Phosphatgruppen kann eine Interferenz mit der Detektion und der Analyse von kleinen Oligonukleotiden verhindern. Es versteht sich, dass je nach den Eigenschaften des markierenden Rests und/oder in Fällen, in denen der markierende Rest eingebaut ist, Reinigungsmittel nicht erforderlich sein können. Beim Entfernen von beliebigen nicht ligierten Detektionsoligonukleotiden aus dem Reaktionsgemisch wird eine Vielzahl von markierten kleinen Oligonukleotiden erzeugt, welche im Anschluss detektiert werden können.
Im Anschluss an die Ligation können die markierten kleinen Oligonukleotide in Schritt 50 detektiert werden. Die markierten kleinen Oligonukleotide können unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren detektiert und von anderen Molekülen, welche keine Markierung aufweisen, unterschieden werden. Beispielhafte Eigenschaften, auf denen die Detektion basieren kann, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf: Masse, elektrische Leitfähigkeit oder optische Signale so wie ein Fluoreszenzsignal, ein Absorptionssignal, ein lumineszentes Signal, ein chemilumineszentes Signal oder dergleichen. Die Detektion kann ebenfalls auf der Abwesenheit oder einem reduzierten Niveau eines oder mehrerer Signale basieren, z. B. aufgrund des Vorhandenseins eines signallöschenden Restes oder der Degradation eines markierenden Restes.
Es können verschiedene Detektionsverfahren, so wie Lösungsphasen- und Festphasenassays, zur Detektion von markierten kleinen Oligonukleotiden verwendet werden. Flüssigphasen-Detektionsverfahren können auf der Ladung, der Masse, dem Ladungs-zu-Masse-Verhältnis oder anderen Unterscheidungsmerkmalen basieren. Solche Unterscheidungsmerkmale können z. B. in einem Chromatographiesystem, so wie Kapillarelektrophorese, Acrylamidgel, Agarosegel oder dergleichen, oder in einem Spektroskopiesystem so wie Massenspektroskopie detektiert werden. So kann z. B. die Detektion von Fluoreszenz durchgeführt werden, indem man ein markiertes kleines Oligonukleotid mit einer anregenden Strahlungswellenlänge bestrahlt und die von einem darin befindlichen Fluorophor emittierte Strahlung mittels Verfahren detektiert, welche im Stand der Technik bekannt und in Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2. Auflage, Plenum Press New York (1999) beschrieben sind. Ein Fluorophor kann basierend auf einem beliebigen aus einer Vielzahl von Fluoreszenzphänomenen detektiert werden, einschließend z. B. Emissionswellenlänge, Anregungswellenlänge, Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer(FREI)-Intensität, Löschung, Anisotropie oder Lebensdauer. FREI kann dazu verwendet werden, die Hybridisierung zwischen einem ersten Oligonukleotid, welches an einem Donorfluorophor befestigt ist, und einem zweiten Oligonukleotid, welches an einem Akzeptorfluorophor befestigt ist, aufgrund des Energietransfers von dem angeregten Donor hin zum Akzeptor zu identifizieren. Folglich kann die Hybridisierung als eine Verschiebung der Wellenlänge detektiert werden, welche durch eine Reduktion der Donoremission und das Auftreten einer Akzeptoremission für das Hybrid verursacht wird.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung kann das markierte kleine Oligonukleotid unter Verwendung von Gelelektrophorese detektiert werden. Kurz gesagt, es kann ein Harnstoff-Polyacrylamidgel von etwa 12% bis 15% hergestellt und dann mit Proben eines Reaktionsgemischs beladen werden, welches markierte kleine Oligonukleotide enthält. Das Gel kann unter Verwendung einer geeigneten Stromstärke so lange laufen gelassen werden, bis jede Probe einen geeigneten Endpunkt auf dem Gel erreicht hat. Das daraus resultierende Gel kann auf eine Platte aus einem nicht diffusionsfähigem Trägermaterial, so wie einer prozessierten Folie, transferiert und dann mittels Belichtung durch Röntgenstrahlung oder durch die Folie eines Phosphorimagers für einen geeigneten Zeitraum entwickelt werden. Nach der Entwicklung des Gels kann das Vorhandensein dunkler Banden an bekannten Positionen auf dem Gel das Vorhandensein von kleinen Oligonukleotiden in dem biologischen Isolat anzeigen.
Die vorliegende Erfindung stellt ein gegenüber dem Standardverfahren zur Expressionsanalyse kleiner Oligonukleotide, nämlich dem Northern Blotting, schnelles und effizientes Verfahren zur Detektion kleiner Oligonukleotide bereit. Das Northern Blotting verfügt über eine mangelhafte Sensitivität, erfordert große Mengen an Gesamt-RNA und ist sowohl arbeits- als auch zeitaufwändig. Wie in den 2A–C gezeigt ist, stellt die vorliegende Erfindung eine um das 50-fache bessere Detektionssensitivität bereit als das Northern Blotting. Des Weiteren verringert die vorliegende Erfindung sowohl die gesamte Reaktionszeit als auch die Menge der zur Durchführung des Assays erforderlichen Menge an Gesamt-RNA um ein Wesentliches. Unter Bezugnahme auf die 3A–B beträgt z. B. die im Rahmen der vorliegenden Erfindung erforderliche Menge an Gesamt-RNA lediglich 18 μg, wohingegen für das Northern Blotting 180 μg Gesamt-RNA benötigt werden. In ähnlicher Weise beträgt die im Rahmen der vorliegenden Erfindung benötigte Reaktionszeit nur 2–4 Stunden, wohingegen die für das Northern Blotting erforderliche Reaktionszeit 2–3 Tage beträgt.
Wie bereits erwähnt können andere Detektionsverfahren, so wie Festphasenassays, zur Detektion von kleinen Oligonukleotiden verwendet werden. So können z. B. verschiedene Arten von Arrays verwendet werden. Ein „Array" bezeichnet eine Population von unterschiedlichen Sondenmolekülen, welche derart an einem oder mehreren Substraten befestigt sind, dass die unterschiedlichen Sondenmoleküle gemäß ihrer relativen Position voneinander unterschieden werden können. Ein Array kann verschiedene Sondenmoleküle einschließen, welche jeweils an unterschiedlichen adressierbaren Positionen auf einem Substrat liegen. Alternativ dazu kann ein Array separate Substrate einschließen, von denen jedes ein unterschiedliches Sondenmolekül trägt. An separaten Substraten befestigte Sonden können gemäß der Positionen des Substrats auf einer Oberfläche, mit welcher die Substrate assoziiert werden, oder gemäß der Positionen der Substrate in einer Flüssigkeit identifiziert werden. Beispielhafte Arrays, in welchen separate Substrate auf einer Oberfläche positioniert sind, schließen ohne Einschränkung solche Arrays ein, welche Beads in Wells einschließen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung kann ein Kit zur Detektion einer Vielzahl von verschiedenen kleinen Oligonukleotiden einschließen. Das Kit kann einschließen: ein Detektionsoligonukleotid, einen markierenden Rest, vorzugsweise zur Markierung des Detektionsoligonukleotids, sowie Reagenzien zur Ligation des 3'-Endes des kleinen Oligonukleotids an das 5'-Ende des Detektionsoligonukleotids.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung kann das Kit zusätzliche Komponenten einschließen, z. B. einschließend Reagenzien zur Entfernung nicht gebundener markierender Reste, Reagenzien zur Entfernung nicht ligierter Detektionsoligonukleotide, Reagenzien zur Detektion von markierten kleinen Oligonukleotiden, eine positive Kontrolle sowie eine negative Kontrolle. Die positive Kontrolle kann dazu verwendet werden, die Komponenten des Kits und die Vorgehensweise zu beurteilen, während die negative Kontrolle dazu verwendet werden kann, das/die Hintergrundsignal(e) in getesteten Proben zu beurteilen.
Kommerziell erhältliche Kits zur Detektion von kleinen Oligonukleotiden schließen ein: Lösungshybridisierungs-/Ribonuklease-Protektionsassays, so wie das mirVANA miRNA Isolationskit, zu beziehen von Ambion (Austin, TX). Die vorliegende Erfindung weist gegenüber solchen kommerziellen Assays etliche Vorteile auf. So bietet die vorliegende Erfindung z. B. im Vergleich zu dem mirVANA miRNA Isolationskit eine höhere mi-RNA-Detektionssensitivität innerhalb einer kürzeren Reaktionszeit. Wie in den 4A–C gezeigt ist, weist das mirVANA miRNA Isolationskit nicht nur eine schlechtere Sensitivität innerhalb einer längeren Reaktionszeit auf, sondern erfordert auch noch die separate Anschaffung eines Markierungskits sowie die Optimierung der Menge an markierter Sonde, der Hybridisierungsbedingungen und der Menge an Ribonuklease.
Im Rahmen der vorliegenden Anmeldung wurde auf verschiedene Veröffentlichungen, Patente und Patentanmeldungen Bezug genommen. Der Offenbarungsgehalt dieser Veröffentlichungen wird hiermit in seiner Gesamtheit durch Bezugnahme in diese Anmeldung aufgenommen, um den die vorliegende Erfindung betreffenden Stand der Technik umfassender zu beschreiben.
Die nachfolgenden Beispiele dienen lediglich dem Zweck der Veranschaulichung und sollen den Umfang der angehängten Ansprüche nicht einschränken.
Beispiel 1
Herstellung von Detektionsoligos und Aufreinigung
Der erste Schritt besteht darin, das Detektionsoligo am 5'-Ende mit [γ-³²P]-ATP zu markieren und nicht eingebaute Isotope zu entfernen.

1. Auftauen der gefrorenen Reagenzien auf Eis, gründliches Mischen gefolgt von kurzem Schleudern, dann Platzieren auf Eis.
2. Herstellung von mit [³²P] markiertem Detektionsoligo durch Kombination der folgenden Komponenten bei Raumtemperatur:

Komponenten	Detektionsoligo	Kappenfarbe der Komponenten
Detektionsoligo	2 μl	Blau
RNase-freies Wasser	12 μl	Weiß
10 X OPTIKINASE Reaktionspuffer	2 μl	Blau
[γ-³²P]-ATP (6000 Ci/mMol, 150 mCi/ml)	2 μl	Nicht geliefert
OPTIKINASE	2 μl	Blau
Gesamtvolumen	20 μl

3. Gründliches Vermischen, gefolgt von kurzem Schleudern in einer Mikrozentrifuge. Inkubation für 30–60 mm bei 37°C.
4. Während der Inkubation der Reaktionen Vorbereitung der Aufreinigungssäule wie folgt: a. Zentrifugation der Aufreinigungssäule für 30 sec mit 750 × g, um das trockene Harz am Boden der Säule zu sammeln. b. Hydratisieren des Harzes durch Zugabe von 600 μl RNase-freien Wassers und Vortexen. Entfernen der Luftblasen durch Vortexen oder Klopfen an der Säule. Inkubation für mindestens 30 mm bei Raumtemperatur. c. Resuspendieren des abgelagerten Harzes durch mehrmaliges Umkehren der Säule. Dabei ist darauf zu achten, dass keine Luftblasen sichtbar sein dürfen. Entfernen des Bodenstöpsels und Platzieren in einem 2,0 ml Sammelgefäß. d. Zentrifugation für 2 mm mit 750 × g, um das verbleibende Wasser zu entfernen. Verwerfen des Durchflusses.
5. Nach 30 mm Inkubation Verdünnen der Markierungsreaktionen auf 100 μl durch Zugabe von 80 μl RNase-freien Wassers.
6. Platzieren der Säule aus Schritt 4d in ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugengefäß. Ohne Zerstörung des Gelbetts vorsichtiges Auftragen der verdünnten Probe direkt auf die Oberfläche des Gelbetts.
7. Nach dem Beladen mit der Probe Zentrifugation der Säule für 4–6 mm mit 750 × g. Verwerten der gebrauchten Säule in einen Behälter für radioaktive Abfälle.
8. Radiomarkiertes Detektionsoligo und Marker sind nun gebrauchsfertig.

Beispiel 2
Einfangen von miRNA, Ligation und Aufreinigung
Ist das Detektionsoligo radiomarkiert, wird mit dem miRNA-Detektionsassay fortgefahren.
Design und Herstellung auf Seite 12. Das Brückenoligonukleotid sollte mit dem bereitgestellten 1OX-Capture-Puffer auf 0,1 pmol/μl verdünnt werden.

1. Auftauen der gefrorenen Reagenzien auf Eis, gründliches Vermischen gefolgt von kurzem Schleudern, dann Platzieren auf Eis.
2. Aufbau der Einfangreaktion auf Eis gemäß der nachfolgenden Tabelle:

Komponenten	Positive Kontrolle	Kontrolle ohne RNA	Probe	Kappenfarbe der Komponenten
Gesamt-RNA-Probe	0 μl	0 μl	Bis 8 μl	Nicht geliefert
Positive Kontrolle	1 μl	0 μl	0 μl	Rot
Anpassen auf 8 μl mir RNase-freiem Wasser				Weiß
0,1 pmol/μl Brückenoligo in 10 X Capture-Puffer (engl. orig. Butter)	1 μl	1 μl	1 μl	Nicht geliefert
Radiomarkiertes Detektionsoligo	1 μl	1 μl	1 μl	N/A
Gesamtvolumen	10 μl	10 μl	10 μl

• Herstellung eines Brückenoligonukleotid-Detektionsoligo-Master-Mix zum Ansatz des Assays. Pro Probe sind zu kombinieren: 1 μl Brückenoligonukleotid in 10 X Capture-Puffer + 1 μl radiomarkiertes Detektionsoligo.
• Verdünnen aller Testproben auf 8 μl mit RNase-freiem Wasser, dann Zugabe von 2 μl des Brückenoligonukleotid-Detektionsoligo-Master-Mix.
3. Gründliches Vermischen, gefolgt von kurzem Schleudern in einer Mikrozentrifuge. Inkubation des Gemischs bei 94°C für 1 min, bei 65°C für 2 min und bei 37°C für 10 min. Zweckmäßigerweise kann ein Thermalcycler verwendet werden.
4. Zugabe von 5 μl 3 X Ligate-IT^TM Premix (rote Kappe) zu jeder Reaktion.
5. Gründliches Mischen, gefolgt von kurzem Schleudern. Inkubation für 1 h bei 30°C. Optional: Wird nicht unmittelbar zum nächsten Schritt übergegangen, so inaktiviere man die Reaktion durch Inkubation für 10 min bei 75°C und lagere sie bei –20°C für den späteren Gebrauch.
6. Zugabe von 1 μl Clean-Up-Mix (rote Kappe) zu jeder Reaktion.
7. Gründliches Mischen, gefolgt von kurzem Schleudern. Inkubation für 15 mm bei 37°C. Optional: Wird nicht unmittelbar zum nächsten Schritt übergegangen, so inaktiviere man die Reaktion durch Inkubation für 10 min bei 75°C und lagere sie bei –20°C für den späteren Gebrauch.
8. Die ligierte mRNA ist nun gebrauchsfertig für die Gelelektrophorese.

Beispiel 3
Elektrophoretische Analyse

1. Herstellung eines 12% oder 15% Harnstoff-Polyacrylamidgels mit 1 X Laufpuffer. (Siehe ergänzende Informationen zur Herstellung von Harnstoff-Polyacrylamidgel) Optional: Vorlauf und Erwärmen des Gels für 30 Minuten.
2. Übertragen eines 3–15 p1 Aliquots der Reaktion in ein frisches Gefäß. Zugabe eines identischen Volumens an Auftragspuffer (Gel Loading Dye).
3. Übertragen eines Aliquots der mit [³²P] markierten Niedrigmolekulargewichtsmarker in ein frisches Gefäß. Zugabe eines identischen Volumens an Auftragspuffer (Gel Loading Dye).
4. Gründliches Mischen, gefolgt von kurzem Schleudern in einer Mikrozentrifuge. Inkubation für 3 min bei 95°C. Unmittelbares Kühlen auf Eis.
5. Ausspülen des Gels aus den Wells zur Entfernung von Acrylamidablagerungen, Harnstoff und Luftblasen.
6. Beladen und Auftrennen der denaturierten Reaktionen. Einschließen des mit [³²P] markierten Niedrigmolekulargewichtsmarkers auf jedem Gel.
• Die erwartete Größe der ligierten miRNA beträgt 35–39 Nukleotide (21–25 Nukleotide reifer miRNA-Sequenz plus 14 Nukleotide des markierten Detektionsoligo).
• In 12% und 15% Gels liegen die ungefähren Bandenpositionen von Bromphenolblau und Xylencyanol (Auftragspuffer) jeweils bei 10 und 30 Nukleotiden.
• Für ein 13 cm × 15 cm Gel, Laufenlassen bei 20–30 mA und Anhalten, sobald die Farbfront des Bromphenolblaus bis zur Mitte des Gels migriert ist. Für ein 36 cm × 43 cm Gel, Laufenlassen bei 60 mA und Anhalten, sobald die Farbfront des Bromphenolblaus bis zur Mitte des Gels migriert ist.
7. Am Ende der Auftrennung Übertragen des Gels auf eine Platte aus nicht diffusionsfähigem Trägermaterial, so wie einer prozessierten Folie. Einwickeln mit Saran Wrap und Belichtung mittels Röntgenfilm oder einer Phosphorimagerfolie.
• Bei der Verwendung von [³²P]-Isotop ist ein Trocknen des Gels nicht erforderlich. Belichtung des Gels mit einem Röntgenfilm mit einer Verstärkerfolie. Lagern für 2 h bis über Nacht bei –80°C. Das Gel kann mehrere Male erneut belichtet werden, falls dies erforderlich ist.
• Es wird empfohlen, das Gel bei der Verwendung einer Phosphorimagerfolie zu trocknen, um eine Beschädigung der Folie zu vermeiden. Bearbeiten der Phosphorimagerfolie gemäß den Angaben des Herstellers.

Aus der vorstehenden Beschreibung der Erfindung wird der Fachmann mögliche Verbesserungen, Veränderungen und Modifikationen erkennen. Solche im Rahmen des Standes der Technik liegenden Verbesserungen, Veränderungen und Modifikationen sollen von den angehängten Ansprüchen abgedeckt werden. Sämtliche hierin zitierten Referenzen, Patente und Veröffentlichungen werden durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen.

Claims

Ein Verfahren zur Detektion von mindestens einem kleinen Oligonukleotid, umfassend: Bereitstellen eines biologischen Isolats umfassend mindestens ein kleines Oligonukleotid; in Kontakt bringen des biologischen Isolats mit mindestens einem Detektionsoligonukleotid, welches einen markierenden Rest aufweist, sowie mit mindestens einem Brückenoligonukleotid unter solchen Bedingungen, dass das mindestens eine kleine Oligonukleotid und das mindestens eine Detektionsoligonukleotid vorzugsweise zu dem Brückenoligonukleotid hinzugefügt werden, um mindestens ein markiertes kleines Oligonukleotid zu ergeben; Zugabe von mindestens einem ligierenden Reagens, um das mindestens eine kleine Oligonukleotid und das mindestens eine Detektionsoligonukleotid vorzugsweise miteinander zu verbinden; und Detektion des mindestens einen markierten kleinen Oligonukleotids.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das mindestens eine kleine Oligonukleotid DNA, kleine regulatorische RNA, nicht kodierende RNA, Mikro-RNA oder kleine interferierende RNA umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das mindestens eine Detektionsoligonukleotid und/oder das mindestens eine Brückenoligonukleotid DNA, RNA, modifizierte Nukleotide oder eine Kombination aus DNA, RNA und modifizierten Nukleotiden umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das mindestens eine Detektionsoligonukleotid etwa 5 bis etwa 500 Nukleotide umfasst.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das mindestens eine Detektionsoligonukleotid ein 5'-Ende, ein 3'-Ende und einen markierenden Rest aufweist, wobei der markierende Rest mit dem 5'-Ende, dem 3'-Ende oder einem inneren Abschnitt des Detektionsoligonukleotids verbunden ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das 5'-Ende des Detektionsoligonukleotids ein Phosphat einschließt und über eine Phosphoramidbindung mit dem markierenden Rest verbunden ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das 5'-Ende und/oder das 3'-Ende mindestens ein Element der Gruppe bestehend aus einem C-3-Spacer, einem Aminomodifikator, einem invertierten dT, einem Dideoxy-C oder einem Agens, welches eine Ligationsnebenreaktion verhindert, einschließt.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das 5'-Ende des Detektionsoligonukleotids durch das mindestens eine ligierende Reagens an ein 3'-Ende des mindestens einen kleinen Oligonukleotids gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das 3'-Ende des Detektionsoligonukleotids durch das mindestens eine ligierende Reagens an ein 5'-Ende des mindestens einen kleinen Oligonukleotids gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der markierende Rest einen optisch detektierbaren Rest umfasst, welcher ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Chromophor, einem Luminophor, einem Fluorophor, einer Licht streuenden Quantenpunkt- oder Nanopartikelmarkierung, einer elektromagnetischen Spinmarkierung, einem kalorimetrischen Agens, einer magnetischen Substanz, einem elektronenreichen Material, einer elektrochemilumineszenten Markierung, einer Markierung, welche detektiert werden kann basierend auf nuklearmagnetischen, paramagnetischen, elektrischen, Ladungs-zu-Masse- oder thermischen Eigenschaften, sowie aus Licht streuenden oder plasmonresonanten Materialien.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der markierende Rest eine isotopische Markierung umfasst, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 14C, 123I, 124I, 125I, 131I, 32P, 33P, 35S sowie 3H.
Verfahren zur Detektion von mindestens einem kleinen Oligonukleotid, umfassend: Bereitstellen eines biologischen Isolats umfassend mindestens ein kleines Oligonukleotid; in Kontakt bringen des biologischen Isolats mit mindestens einem Detektionsoligonukleotid und mindestens einem Brückenoligonukleotid unter solchen Bedingungen, dass das mindestens eine kleine Oligonukleotid und das mindestens eine Detektionsoligonukleotid vorzugsweise zu dem Brückenoligonukleotid hinzugefügt werden, um mindestens ein markiertes kleines Oligonukleotid hervorzubringen, wobei das mindestens eine Detektionsoligonukleotid ein 5'-Ende, ein 3'-Ende sowie einen markierenden Rest aufweist, wobei der markierende Rest mit dem 5'-Ende, dem 3'-Ende oder einem inneren Abschnitt des Detektionsoligonukleotids verbunden ist; Zugabe von mindestens einem ligierenden Reagens, um das mindestens eine kleine Oligonukleotid und das mindestens eine Detektionsoligonukleotid vorzugsweise miteinander zu verbinden; und Detektion des mindestens einen markierten kleinen Oligonukleotids.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das mindestens eine kleine Oligonukleotid DNA, kleine regulatorische RNA, nicht kodierende RNA, Mikro-RNA oder kleine interferierende RNA umfasst.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das mindestens eine Detektionsoligonukleotid etwa 5 bis etwa 500 Nukleotide umfasst.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das 5'-Ende des Detektionsoligonukleotids ein Phosphat einschließt und über eine Phosphoramidbindung mit dem markierenden Rest verbunden ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das 5'-Ende und/oder das 3'-Ende mindestens ein Element der Gruppe bestehend aus einem C-3-Spacer, einem Aminomodifikator, einem invertierten dT, einem Dideoxy-C oder einem Agens, welches eine Ligationsnebenreaktion verhindert, einschließt.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das 5'-Ende des Detektionsoligonukleotids durch das mindestens eine ligierende Reagens an ein 3'-Ende des mindestens einen kleinen Oligonukleotids gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das 3'-Ende des Detektionsoligonukleotids durch das mindestens eine ligierende Reagens an ein 5'-Ende des mindestens einen kleinen Oligonukleotids gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei der markierende Rest einen optisch detektierbaren Rest umfasst, welcher ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Chromophor, einem Luminophor, einem Fluorophor, einer Licht streuenden Quantenpunkt- oder Nanopartikelmarkierung, einer elektromagnetischen Spinmarkierung, einem kalorimetrischen Agens, einer magnetischen Substanz, einem elektronenreichen Material, einer elektrochemilumineszenten Markierung, einer Markierung, welche detektiert werden kann basierend auf nuklearmagnetischen, paramagnetischen, elektrischen, Ladungs-zu-Masse- oder thermischen Eigenschaften, sowie aus Licht streuenden oder plasmonresonanten Materialien.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei der markierende Rest eine isotopische Markierung umfasst, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus ¹⁴C, ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹³¹I, ³²P, ³³P, ³⁵S sowie ³H.
Kit zur Detektion von mindestens einem kleinen Oligonukleotid in einem biologischen Isolat, umfassend: ein Detektionsoligonukleotid, welches etwa 5 bis 500 Nukleotide umfasst und ein 5'-Ende und ein 3'-Ende aufweist, wobei das Detektionsoligonukleotid vorzugsweise an ein kleines Oligonukleotid bindet; einen markierenden Rest zur vorzugsweisen Markierung des Detektionsoligonukleotids, wobei der markierende Rest an das Detektionsoligonukleotid gebunden ist; und Reagenzien zur Ligation des kleinen Oligonukleotids an das Detektionsoligonukleotid.
Kit nach Anspruch 21, umfassend: Reagenzien zur Entfernung von ungebundenen markierenden Resten; Reagenzien zur Entfernung von nicht ligierten Detektionsoligonukleotiden; Reagenzien zur Detektion von markierten kleinen Oligonukleotiden; eine positive Kontrolle; und eine negative Kontrolle.
Kit nach Anspruch 21, wobei der markierende Rest einen optisch detektierbaren Rest umfasst, welcher ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Chromophor, einem Luminophor, einem Fluorophor, einer Licht streuenden Quantenpunkt- oder Nanopartikelmarkierung, einer elektromagnetischen Spinmarkierung, einem kalorimetrischen Agens, einer magnetischen Substanz, einem elektronenreichen Material, einer elektrochemilumineszenten Markierung, einer Markierung, welche detektiert werden kann basierend auf nuklearmagnetischen, paramagnetischen, elektrischen, Ladungs-zu-Masse- oder thermischen Eigenschaften, sowie aus Licht streuenden oder plasmonresonanten Materialien.
Kit nach Anspruch 21, wobei das mindestens eine Detektionsoligonukleotid ein 5'-Phosphat und ein modifiziertes 3'-Ende aufweist, wobei das 5'-Phosphat an den markierenden Rest gebunden ist.
Kit nach Anspruch 21, wobei das mindestens eine Detektionsoligonukleotid ein 3'-Hydroxyl und ein modifiziertes 5'-Ende aufweist, wobei das 3'-Hydroxyl an den markierenden Rest gebunden ist.