EP1127165A1 - Verfahren und testkit zur untersuchung der reparatur von dns - Google Patents

Verfahren und testkit zur untersuchung der reparatur von dns

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Publication number
EP1127165A1
EP1127165A1 EP99971463A EP99971463A EP1127165A1 EP 1127165 A1 EP1127165 A1 EP 1127165A1 EP 99971463 A EP99971463 A EP 99971463A EP 99971463 A EP99971463 A EP 99971463A EP 1127165 A1 EP1127165 A1 EP 1127165A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
dna
apurine
repair
modifications
apyrimidine
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP99971463A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Peter Nehls
Karl-Heinz GLÜSENKAMP
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
RUBIKON AG
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of EP1127165A1 publication Critical patent/EP1127165A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase

Definitions

  • the present invention relates to a method and a test kit for examining the repair of DNA modifications and base mismatches as well as apurine or apyrimidine sites by DNA repair enzymes.
  • this enables the determination of the repair capacity of the repair enzymes and thus also the repair capacity of cells or tissues from which compositions containing repair enzymes used in the method were obtained.
  • the repair capacity is important, for example, in connection with processes that lead to the development of cancer, but is also important in various forms of cancer therapy.
  • Cancer develops in several stages through the gradual accumulation of mutations in the cancer-relevant genes (proto-oncogenes and tumor suppressor genes) of a cell.
  • Carcinogenic factors play a role in the development of mutations. occur in the environment, in food, cosmetics, medication and at the workplace (UV light, ionizing radiation, dusts, heavy metals and the large number of chemical carcinogens), but also endogenously (e.g. nitrosamines, reactive nitrogen and oxygen compounds).
  • Base mismatches can occur during DNA replication if too few or too many nucleotides or if incorrect nucleotides are incorporated into the newly synthesized DNA strands. The latter happens when the four DNA bases are in their rare tautomeric form. For example, Cytosine in the rare tautomeric form a base pair with adenine instead of guanine, guanine in the rare tautomeric form a base pair with thymine instead of cytosine etc. If these or the other possible base mismatches are not repaired in time, transition mutations arise in the genomic DNA after a further round of replication (Exchange eg from CG to TA or from TA to CG). These are then always passed on to the daughter cells.
  • Structural modifications can create all kinds of mutations (transitions, transversions, deletions, insertions, etc.).
  • the type and distribution pattern of the mutations that arise in the genome are often characteristic of the carcinogen that is responsible for the structural modifications that have arisen.
  • the gradual accumulation of mutations in the cancer-relevant genes proto-oncogenes, tumor suppressor genes
  • the cell has a number of effective defense mechanisms. These include enzymes (eg glutathione synthetase, superoxidismutases, catalases) and low-molecular substances (including cysteine, glutathione, flavine and vitamins C, E) and specific repair systems that recognize DNA modifications and remove them enzymatically from the DNA.
  • enzymes eg glutathione synthetase, superoxidismutases, catalases
  • low-molecular substances including cysteine, glutathione, flavine and vitamins C, E
  • specific repair systems that recognize DNA modifications and remove them enzymatically from the DNA.
  • the effectiveness of the defense mechanisms can, however, vary considerably from individual to individual and from cell type to cell type within an individual. Their efficiency is crucial for an individual's sensitivity to cancer to carcinogenic factors.
  • the present invention is particularly concerned with the determination of the activity of repair systems (ie the repair capacity) and the use of such activity determinations.
  • One of the types of procedures is based on the treatment of cells ex vivo with a certain carcinogen in vitro.
  • the rate at which the carcinogenically generated DNA modifications are enzymatically removed from the DNA of the cells is then measured.
  • the DNA of the cells is examined at various times after the carcinogen treatment for the remaining amount of the corresponding DNA modifications.
  • the data obtained in this way are used to calculate the cellular repair capacity.
  • DNA is isolated from the corresponding cell samples and examined for the content of DNA modifications.
  • the DNA modifications in the individual DNA samples can be quantified:
  • Another type of procedure consists in the incubation of protein extracts from cells and tissues with DNA molecules that either contain defined DNA modifications (synthetic DNA molecules) or have been treated with certain carcinogens. The speed at which the respective DNA modifications are removed from the DNA molecules is then determined. This can be done using the following methods: II. I. With the "DNA Nicking Assay” (Castaing et al., 1993). With this method the elimination of DNA modifications by enzymatic excision from the DNA is proven.
  • the DNA modifications are cut out either in one step by mostly specific-acting endonucleases or in two steps by DNA glycosylases, which recognize and eliminate certain modified bases, and AP-endonucleases, which remove the remaining apurine or apyrimidine sites from the Cut out DNS. In both cases, DNA strand breaks occur at the sites of the DNA modifications, which lead to a shortening of the original DNA molecule.
  • This assay mainly uses synthetic, radio-labeled DNA molecules of a certain length that contain a defined DNA modification at a predetermined position. The quantitative determination of the intact and the shortened DNA molecules takes place after separation of the DNA molecules of different lengths by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis.
  • the principle of a frequently used test is to determine the amount of radioactively labeled O 6 -alkylguanine in a DNA treated with a [ 3 H] -labeled alkylan before and at different times after adding cell or tissue extracts. After acid hydrolysis of the alkylated DNA, the released purines separated by chromatography (HPLC, Sephadex G-10) and the radioactivity in the O s -alkylguanine-containing fraction is determined (Foote et al., 1983).
  • c) Another frequently used method is based on the knowledge that the alkyl group is covalently transferred to a cysteine residue of the AT. After incubation of a [ 3 H] -alkyl DNA with protein extracts, the amount of the alkyl groups transferred to the AT is determined by determining the radioactivity in the protein portion of the extract. Alternatively, the amount of radioactivity remaining in the DNA is measured and, after hydrolysis of the proteins, the amount of [ 3 H] -alkylcysteine molecules formed is determined (Pegg et al., 1983; Waldstein et al., 1982).
  • a method for determining DNA damage is known from WO 96/28571, in which DNA is fixed on a support by adsorption on a polycation.
  • the damage adsorbed on the adsorbed DNA has a composition that contains a cell extract with repair activity and labeled nucleotides. The incorporation of the labeled nucleotides in the case of repair is then verified.
  • DE-A-43 41 524 discloses a method for immobilizing biomolecules and affinity ligands on polymeric supports using a square acid derivative.
  • DE-C-44 99 550 describes coupling reactions using squaric acid derivatives and mentions the possibility of covalently linking biomolecules to a matrix.
  • DE-A-196 24 990 discloses a process for the chemically controlled modification of surfaces and of polymers bearing acyl and / or hydroxyl groups.
  • the method should be simple, efficient and inexpensive to carry out and avoid the disadvantages mentioned above.
  • test kits are also provided which comprise the components required for carrying out the method according to the invention.
  • repair enzymes are allowed to act on DNA molecules which are covalently bound to a solid support and which have a modification and / or a base mismatch and / or an apurine or apyrimidine site (damage) observed the removal of the modification or base mismatch or the apurine or apyrimidine site.
  • the covalent linkage of the DNA molecules with the carrier takes place with the help of a reactive square acid derivative.
  • a suitable method for the qualitative or quantitative determination of the removal of the modification or the base mismatch or the apurine or apyrimidine site uses specific antibodies or antibody fragments against the modification or the base mismatch or the apurine or apyrimidine site (or in the case of an apurine or or apyrimidine site also against a derivative of such a site). The binding level of such specific antibodies is determined. If the repair is carried out by excision, the qualitative or quantitative detection can also be carried out by observing the loss of a suitably introduced marker; the label (or a binding region for a label) is therefore inserted into a DNA section which is no longer connected to the carrier after the excision. The amount of released and / or bound label remaining can be determined.
  • the method according to the invention makes it possible, for example, to investigate the repair capacity of a composition containing repair enzymes for a given DNA modification or base mismatch or apurine or apyrimidine sites.
  • DNA modifications or base mismatches or apurine or apyrimidine sites can also be determined by using defined repair enzymes.
  • the influence of agents on DNS can be tested by examining modifications caused by the agent's action (e.g. by specific repair proteins) and their repair. This enables statements to be made about the DNA-damaging potential of the agents.
  • Repair capacity generally refers to activity in eliminating DNA modifications or base mismatches or apurine or apyrimidine sites.
  • the repair capacity in the sense understood here is a measure of the decrease in the content of DNA modifications or base mismatches or apurine or apyrimidine sites in a sample. Quantitative tests are explained in the examples, the mathematical relationships given there being generally applicable to the respective type of test method.
  • the invention thus relates inter alia to a method with which the ability of cells or tissues for the enzymatic repair of defined DNA structural modifications (also called DNA modifications, DNA damage or DNA adducts) and DNA mismatches can be determined quickly and precisely. Furthermore, when using defined DNA repair enzymes, the nature of the DNA structure modifications and base mismatches can also be examined. Accordingly, the invention also provides a method for determining the repair capacity of DNA structural modifications, base mismatches and apurine or apyrimidine sites by compositions containing DNA repair enzymes (in particular solutions), which is also for the detection of DNA structural modifications, base mismatches and apurine or apyrimidine sites ready with the following steps:
  • defined repair enzymes are used which are capable of repairing a specific structural modification and / or base mismatch and / or apurine or apyrimidine site.
  • the ability to repair can vary greatly from cell type to cell type within an individual as well as from individual to individual.
  • Individual tumor susceptibility is related to the ability of an individual's cells to repair DNA modifications and / or base mismatches and / or apurine or apyrimidine sites.
  • the repair status of an individual and thus the tumor susceptibility can be determined by allowing a composition obtained in a suitable manner from cells or tissue samples to act on a DNA which has modifications or base mismatches or apurine or apyrimidine sites and their elimination proves.
  • a particular carcinogen has a certain type of Modification and / or base mismatch and / or apurine or apyrimidine site causes, the repair status can be determined in relation to it and thus the tumor sensitivity to the carcinogen can be determined.
  • a composition for further investigation (a suspension or an extract) is produced from a sample of a healthy tissue that is exposed to radiation during the therapy or a suitable surrogate tissue after removal. The kinetics of the repair of DNA damage is then examined.
  • the above-mentioned composition is allowed to act on DNA molecules into which one or more suitable modifications and / or base mismatches and / or apurine or apyrimidine sites have been introduced before or after the coupling.
  • Radiation sensitivity can now be determined by measuring the temporal decrease in the amount of DNA modifications or base mismatches or apurine or apyrimidine sites, in particular the amount of modifications caused by reactive oxygen species, for example the amount of 8-oxoguanine, and using standard data is correlated. In this way it is possible to individually determine the total radiation dose and the distribution of the individual doses over time with fractional radiation.
  • the data determined as above which reflect the repair capacity of the cells with regard to DNA damage, with data which indicate the proliferation of the cells Describe cells in order to arrive at an even more precise determination of the radiation dose.
  • the radiation sensitivity of tumor tissue can also be determined in a corresponding manner in order to estimate the radiation dose required for treatment.
  • the sensitivity to genotoxic chemotherapy can also be determined.
  • the repair capacity is determined here in particular for one or more suitably chosen DNS modifications. If the mechanism of action of the chemotherapeutic agent is known, DNA modifications can be selected on the basis of this mechanism. For example, the repair of corresponding alkylated bases can be investigated in connection with an alkylating agent. The same considerations apply to the determination of the resistance of tumor cells to a specific agent.
  • the method for examining the repair is based on the covalent binding of modified DNA molecules or DNA molecules with base mismatches or apurine or apyrimidine sites to solid phases such as e.g. Filters, gold, beads, microtiter plates or glass surfaces. Suitable carriers are, in particular, chips (DNS chip technology).
  • the immobilized DNA is incubated with protein extracts from cells or tissues. The rate at which defined DNA adducts or base mismatches or apurine or apyrimidine sites are removed by the repair proteins contained in the extracts is measured.
  • a reactive square acid derivative which is capable of reacting with amino groups, serves as the coupling agent.
  • a squared acid diester in particular a squared acid dialkyl ester, such as especially squared acid diethyl ester, which can in each case link two primary or secondary amino groups to one another.
  • squaric acid derivatives used only with aliphatic amino groups, but not with the nitrogen atoms of the DNA bases. This is an invaluable advantage over other coupling agents that react with the reactive groups of the DNA and can thus lead to undesirable damage (eg dialdehydes).
  • a primary or secondary amino group at the 5 'end or at the 3' end or at the 2 'position of at least one deoxyribosyl residue within the DNA molecules By introducing a primary or secondary amino group at the 5 'end or at the 3' end or at the 2 'position of at least one deoxyribosyl residue within the DNA molecules, a gentle, highly reproducible and inexpensive method for the regiospecific immobilization of single- and double-stranded oligonucleotides discovered on solid phases that carry amino groups on their surface. It is preferred to introduce the amino group at the 5 'end.
  • the introduction of a primary amino group (NH 2 group) is particularly preferred.
  • one strand is preferably covalently linked to the support, for example via its 5 'end.
  • Solid phase matrix Materials known per se can be used as the solid phase matrix, for example those consisting of cellulose, polystyrene, polypropylene, polycarbonate, a polyamide, glass or gold surfaces.
  • the solid phase matrix can be in forms known per se, for example in the form of a filter, in the form of microtiter plates, membranes, columns, beads, for example magnetic beads.
  • DNA molecules encompasses single-stranded and double-stranded molecules with any natural or synthetic sequence.
  • the number of bases in the DNA molecule can be chosen as long as a sufficient number of bases is available for the interaction with the repair enzyme. In some cases, oligonucleotides with just a few bases can be sufficient.
  • it has proven advantageous to use oligonucleotides with three complete turns, the modification or mismatch or apurine or apyrimidine site being in the middle turn. Length of The sequence and arrangement of the location to be repaired can, however, be varied by the person skilled in the art in routine experiments. The person skilled in the art can also examine variations in the sequence. It has proven advantageous to use sequences that do not allow refolding. The person skilled in the art can also examine the influence of the environment on the repair of the location to be repaired by varying the sequence.
  • DNA molecules also includes DNA analogs.
  • Modified DNA molecules on the phosphate-sugar framework can be used as DNA analogues. Examples of this are molecules in which the phosphate groups are replaced by phosphothiates (thiophosphates) or the phosphodiester bond is replaced by a peptide bond. Molecules in which some or all of the deoxyribonucleotides have been replaced by ribonucleotides are also suitable as DNA analogs.
  • DNA molecules are contacted with the DNA repair enzymes which contain DNA modifications or base mismatches or apurine or apyrimidine sites which are believed to be repairable by the enzymes.
  • the changes in DNA mentioned can be caused directly or indirectly by carcinogenic factors (including radiation).
  • the DNS modifications include in particular base modifications. They are typically adducts with reactive agents, such as carcinogens.
  • a DNA modification in the sense understood here is not limited to a specific type of change in the DNA.
  • modifications can also be created by the action of agents on DNS.
  • Another advantage of the invention is that the fixed DNA molecules are covalently linked to the support at a precisely defined point on the molecule, but are otherwise freely in solution. DNA modifications, base mismatches and apurine or apyrimidine sites are thus freely accessible for repair enzymes.
  • the method can also be used to quickly assess the sensitivity of tumor patients (eg cells of the hematopoietic system in the bone marrow, intestine and mucosal epithelium) to radiotherapy or genotoxic cytostatics. Finally, this method can quickly and accurately determine the repair capacity of tumor cells, which plays an important role in resistance to DNA-reactive cytostatics.
  • tumor patients eg cells of the hematopoietic system in the bone marrow, intestine and mucosal epithelium
  • this method can quickly and accurately determine the repair capacity of tumor cells, which plays an important role in resistance to DNA-reactive cytostatics.
  • the coupling method described here is suitable in principle for gentle and region-specific immobilization of oligonucleotides on solid phases.
  • diethyl squarate for the covalent binding of modified nucleic acid molecules to solid phases (such as filters, microtiter plates, membranes, glass surfaces, gold, beads and magnetobeads).
  • square acid diesters are suitable before all other agents.
  • activated squaric acid derivatives such as in particular squaric acid diesters, do not react with the amino groups of the purine and pyrimidine bases of the DNA. Rather, they react selectively with primary and secondary aliphatic amino groups. Compared to other coupling agents
  • DNA molecules By introducing amino groups e.g. at the 5 'end, DNA molecules can be linked region-specifically with solid phases, on the surfaces of which there are also amino groups.
  • DNA molecules with a defined sequence and defined modifications or base mismatches or apurine or apyrimidine sites can advantageously be used.
  • Various approaches are explained below by way of example, but are not intended to limit the invention.
  • the necessary synthetic techniques are known to the person skilled in the art and can be found in the literature.
  • a) have a certain base modification (eg 8-oxoguanine, 0 S - alkylguanine) at a predetermined position in the base sequence, b) contain an NH 2 group at the 5 'terminus of the DNA molecules, c) have one at the 3' terminus OH group included.
  • a certain base modification eg 8-oxoguanine, 0 S - alkylguanine
  • Enzymatic extension of the 3 'termini by incorporating, for example, fluorescence-labeled triphosphates with the terminals Deoxynucleotide transferase (TdT).
  • TdT Deoxynucleotide transferase
  • different fluorescent dyes are used, whereby oligonucleotides with the same modification each contain the same fluorescent dye.
  • another marking or a grouping that can bind a marking can also be installed.
  • the marking does not have to be at the 3 'end, but only in such a position that it is no longer connected to the carrier after the excision.
  • the DNA molecules can for example first be bound to a solid phase via the 5 '-NH 2 termini and then at the 3' end
  • a) with a modified deoxynucleotide e.g. biotinylated dUTP
  • a detectable label such as a fluorescent dye
  • a detectable label such as a fluorescent dye
  • the ds-oligonucleotides can first be bound to a solid phase. The treatment with a reactive carcinogen and the enzymatic labeling of the oligonucleotides is only then carried out.
  • a detection reaction can be carried out using a steptavidin-dye conjugate that binds to biotin.
  • composition that is believed to contain repair enzymes is contacted with fixed DNA.
  • the composition can be a cell extract or tissue extract. In this case, statements about the repair activity of the
  • This method is suitable in principle for the detection of any DNA modification against which a suitable antibody is available.
  • immobilized DNA molecules that either contain a defined DNA modification (a defined DNA adduct) or have been treated with a specific carcinogen are first incubated with a cell or tissue extract to be examined. Then an antibody is added which specifically binds to the modification (first antibody); a second antibody is then typically added to quantify the bound amount of antibody, either with a fluorescent dye (TRITC, FITC, fluorescein etc.) or in some other way, such as radioactive is active, labeled or to which an enzyme (eg phosphatase, catalase) is coupled which leads to a color reaction with suitable substrates.
  • a fluorescent dye TRITC, FITC, fluorescein etc.
  • an enzyme eg phosphatase, catalase
  • base mismatches or apurine or apyrimidine sites can also be examined with suitable antibodies.
  • suitable chemical agents such as methoxyamines, hydrazine derivatives or substituted aromatic amines, and to use antibodies (or antibody fragments) against the derivatized sites for detection.
  • the derivatization expediently takes place after the action of the repair enzymes.
  • Ds-oligonucleotides are preferably suitable for this method.
  • this DNA strand is marked in relation to the DNA modification in such a way that the marking is no longer connected to the carrier after the excision.
  • a label can be attached to the 3' end.
  • the mark must be in a position 3 'with respect to the point at which the DNA was cut during the repair.
  • a structure-modified nucleotide that is removed by the excision can also be labeled.
  • radioactive labeling is particularly suitable. It is also possible to insert an additional marking that is not lost during the repair (excision) and with which e.g. the amount of immobilized DNA can be examined at any stage of the process.
  • Such a label which may be additionally provided, is not suitable for examining the elimination of DNA modifications, base mismatches or apurine or apyrimidine sites, as described above.
  • Immobilized DNA molecules are incubated with a cell or tissue extract to be examined. If DNA adducts are removed by enzymatic excision, the covalently bound strands disintegrate into two fragments, of which the fragments with the label are no longer covalently linked to the solid phase. By heating the DNA molecules in a suitable buffer mixture, the hydrogen bonds between the two DNA strands are released. The unbound fragments thus separate from the complementary (unmarked) counter-strands and can easily be replaced by e.g. Suction can be removed. DNA molecules that are their DNA adducts
  • EL26 have the markings and can be easily quantified. Base mismatches as well as apurine or apyrimidine sites can be examined in the same way.
  • Fig. 2 shows the kinetics of the repair of O ⁇ - ethyl guanine by cell extracts.
  • oligodeoxynucleotides consisting of 34 nucleotides, which contained an NH 2 group at the 5 'end. With the exception of position 16, the base sequence of the three oligonucleotides was identical and was as follows:
  • the first oligonucleotide thus contained the oxidation product 8-oxoguanine, the second the alkylation product O ⁇ - ethyl guanine and the third the natural base guanine.
  • the third oligonucleotide served as a control.
  • the complementary DNA counter strand was synthesized, which consisted exclusively of the four natural bases and which protruded by two bases beyond the 3 'end of the modified oligonucleotides. Compared to X was C. This enabled the enzymatic incorporation of biotinylated dUTP or fluorescence-labeled nucleotides on
  • the oligonucleotides were produced fully automatically using the phosphoramidite method. As usual, the synthesis was carried out from the 3 'end on solid phases (CPG). After the separation from the support material and the splitting off of the protective groups (0.25 M 2 mercaptoethanol in concentrated ammonia, 55 ° C., 20 hours), the oligonucleotides were freed from ammonia by gel filtration and then purified by preparative polyacrylamide gel electrophoresis or HPLC. After a further purification step, the oligonucleotides were lyophilized and stored at -20 ° C.
  • Microtiter plates were used for the tests, the wells of which contained flat bottoms and NH 2 groups on the surface (10 nmol NH 2 groups / well). 25 ⁇ l of a solution of diethyl squarate (0.1 mM) and triethylamine (0.01 M) in methanol (> 99%) were pipetted into the wells of the MP. The MPs were covered and incubated for 10 minutes at room temperature. After removing the solution, the wells were washed with methanol and dried.
  • the remaining reactive groups of the squaric acid were inactivated with 30 ⁇ l of an aqueous ethanolamine solution (100 mM, pH 8.5). After 10 minutes, the MP wells were bidistilled. Washed water and dried.
  • DNA modifications, post-replicative base mismatches, and apurine or apyrimidine sites are removed from the DNA by excision repair (an enzymatic process).
  • the DNA oxidation product 8-oxoguanine (8-OxoGua) is repaired according to the same mechanistic principle. In humans, there are at least two different repair systems that eliminate this base modification from the DNA. Only one of the two repair systems was detected in the mouse.
  • MP were used for the test, in whose wells were immobilized ds-oligonucleotides (30 x 10 "15 mol dsDNA molecules / well) with flat bottoms, the oxidation product 8-OxoGua at position 16 and biotinylated at positions 35 and 36 Uracil contained.
  • the cell extract to be examined was produced from mouse myeloma cells of the Zeil line P3-X63-Ag.
  • the cells were washed twice in ice-cold PBS and at a concentration of 5 ⁇ 10 7 cells / ml in buffer mixture A (50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 100 mM KCl, 0, 1% BSA) resuspended.
  • the cells were disintegrated by sonication and the solid components were removed by
  • the supernatant was stored in portions at -80 ° C.
  • the MP was incubated at 37 ° C for 45 minutes. After the solution had been taken off, the wells of the MP were rinsed three times with buffer B and then 25 ⁇ l of the same buffer were added.
  • the intensity of the fluorescent dye in the individual wells was quantified using an image analysis device consisting of a fluorescence microscope, a CCD camera and a computer-assisted analysis program.
  • a sensitive UV-ELISA reader can be used to measure the fluorescence intensities.
  • R is the amount of 8-OxoGuanine molecules repaired in fMol (10 "1S Mol),
  • Ko is the fluorescence intensity in the wells of the control field and p is the fluorescence intensity in the wells of the sample field.
  • Figure 1 shows the 8-OxoGuanine repair by a defined cell extract (extract of 6 x 10 s cells of a mouse myeloma cell line) as a function of the incubation time. From the initial slope of the curve, the maximum number of 8-oxoguanine molecules per hour can be removed from the oligonucleotides under standard conditions (total amount of 8-oxoguanine, 30 fMol; extract of 6 x 10 5 cells). In the present case it was 13.7 f ol / h.
  • the O s -ethylguanine (0 6 -EtGua) formed by alkylating carcinogens is repaired in one step by a 0 6 -alkylguanine-DNA-alkyl transferase (AT).
  • the AT transfers an alkyl group from the 0 6 position of guanine to a cysteine in the active center of the protein.
  • the AT is deactivated by the takeover of the alkyl group.
  • Each AT molecule can therefore only repair one O s EtGua molecule. The repair is therefore carried out in a bimolecular reaction.
  • Monoclonal or polyclonal antibodies can be used.
  • Monoclonal antibodies can be produced, for example, as follows:
  • Hybridoma cells that produce antibodies against O s -ethyldeoxyguanosine are cloned and put into culture.
  • the antibodies are separated from other proteins in two purification steps (ammonium sulfate precipitation, 50% saturation, and ion exchange chromatography with DE-52 column material).
  • the purified antibodies will be described in detail below.
  • MP were used for the test, in whose wells ds-oligonucleotides (1.2 x 10 "15 mol dsDNA molecules / well) were immobilized, which contained a 0 6 -EtGua at position 16. The 3 'ends were not In some of the wells, ds-oligonucleotides were immobilized which contained only one guanine at position 16 (control field 2).
  • the cell extract to be examined was prepared by washing L929 mouse fibroblasts after treatment with trypsin-EDTA once in culture medium (DMEM, supplemented with 10% fetal calf serum) and twice in ice-cold PBS. The cells were then resuspended in extraction buffer (500 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.8, 1 mM dithiothreitol, 1 M EDTA and 5% glycerol) at a concentration of 6 ⁇ 10 7 cells / ml and disintegrated by ultrasound treatment. The insoluble matter was removed by centrifugation (10,000 g, 4 ° C, 10 min) and the clear supernatant was stored in portions at -80 ° C.
  • DMEM culture medium
  • fetal calf serum fetal calf serum
  • reaction buffer without protein extract 25 ⁇ l were pipetted into four fields (control field 1).
  • the reaction buffer and protein extract were pipetted into four wells of control field 2, which contained unmodified DS oligonucleotides for determining the non-specific binding of the antibodies.
  • control field 1 25 ⁇ l of the reaction buffer without protein extract
  • control field 2 which contained unmodified DS oligonucleotides for determining the non-specific binding of the antibodies.
  • control field 2 25 ⁇ l of the reaction buffer without protein extract were pipetted into four wells of control field 2, which contained unmodified DS oligonucleotides for determining the non-specific binding of the antibodies.
  • control field 2 25 ⁇ l of the reaction buffer without protein extract were pipetted into four wells of control field 2, which contained unmodified DS oligonucleotides for determining the non-specific binding of the antibodies.
  • the reaction was stopped by adding 1 ⁇ l Proteinase K (1 mg / ml) in two well
  • M is the total amount of 0 s EtGua molecules in each
  • K 2 is the fluorescence intensity for the non-specific
  • Figure 2 shows the repair of O s -EtGua by a defined cell extract (3 ug protein extract of L929 mouse fibroblasts) is shown as a function of time. Since the repair of O ⁇ -EtGua takes place in a bimolecular reaction (second-order reaction), the concentration of the AT molecules (AT) in the test mixture and the rate constant K of the repair reaction can be calculated according to the formula
  • K xt l / (Ao-B 0 ) In (B 0 (Ao-P) / A 0 (B 0 -P))

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Testkit zur Untersuchung der Reparatur von DNS-Modifikationen und Basenfehlpaarungen sowie Apurin- und Apyrimidinstellen durch DNS-Reparaturenzyme. Bei dem Verfahren werden DNS-Moleküle, die durch Umsetzung mit einem reaktiven Quadratsäurederivat kovalent mit einer Festphasenmatrix gekoppelt sind, mit einer DNS-Reparaturenzyme enthaltenden Zusammensetzung in Kontakt gebracht. Das Testkit umfaßt die dafür erforderlichen Komponenten.

Description

Verfahren und Testkit zur Untersuchung der Reparatur von DNS
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Testkit zur Untersuchung der Reparatur von DNS-Modifikationen und Basenfehlpaarungen sowie Apurin- oder Apyrimidinstellen durch DNS-Reparaturenzyme. Dies ermöglicht u.a. die Bestimmung der Reparaturkapazität der Reparaturenzyme und damit auch der Reparaturkapazität von Zellen oder Geweben, aus denen bei dem Verfahren eingesetzte, Reparaturenzyme enthaltende Zusammensetzungen gewonnen wurden. Die Reparaturkapazität ist beispielsweise im Zusammenhang mit Vorgängen von Bedeutung, die zur Krebsentstehung führen, ist aber auch bei verschiedenen Formen der Krebstherapie wichtig.
A. Einleitung
Krebs entsteht in mehreren Stufen durch die allmähliche Akkumulation von Mutationen in den krebsrelevanten Genen (Protoonkogene und Tumorsuppressorgene) einer Zelle. Bei der Entstehung von Mutationen spielen besonders kanzerogene Faktoren eine Rolle, die u.a. in der Umwelt, in Nahrungsmitteln, Kosmetika, Medikamenten und am Arbeitsplatz vorkommen (UV-Licht, ionisierende Strahlen, Stäube, Schwermetalle und die Vielzahl der chemischen Kanzerogene) , aber auch endogen (z.B. Nitrosamine, reaktive Stickstoff- und SauerstoffVerbindungen) entstehen können.
Trotz ihrer unterschiedlichen physikalischen und chemischen Eigenschaften wirken alle Kanzerogene nach dem gleichen Prinzip. Sie reagieren mit den einzelnen Bausteinen der DNS und verändern auf diese Weise deren Struktur und Eigenschaften.
Aber auch ohne die Einwirkung von Kanzerogenen kommt es zu Strukturveränderungen der DNS-Komponenten. Diese entstehen durch thermische Hydrolyse chemischer Bindungen in der DNS.
26 Dazu zählen vor allem der Ersatz der Aminogruppen in den Basen Cytosin, Adenin oder Guanin durch Hydroxylgruppen (Deaminierung) und die hydrolytische Spaltung der N-glykosi- dischen Bindung zwischen (insbesondere) den Purinbasen Guanin und Adenin und dem Desoxyriboseanteil der DNS (Depurinie- rung) .
Zu Basenfehlpaarungen kann es während der DNS-Replikation kommen, wenn zu wenige oder zu viele Nukleotide bzw. wenn falsche Nukleotide in die neu synthetisierten DNS-Stränge inkorporiert werden. Letzteres passiert, wenn die vier DNS- Basen in ihrer seltenen tautomeren Form vorliegen. So bildet z.B. Cytosin in der seltenen tautomeren Form ein Basenpaar mit Adenin anstatt mit Guanin, Guanin in der seltenen tautomeren Form ein Basenpaar mit Thymin anstatt mit Cytosin etc. Werden diese oder die anderen möglichen Basenfehlpaarungen nicht rechtzeitig repariert, entstehen in der genomischen DNS nach einer weiteren Replikationsrunde Transitionsmutationen (Austausch z.B. von C-G durch T-A oder von T-A durch C-G) . Diese werden dann stets auf die Tochterzellen weitervererbt. Sturkturmodifikationen können alle möglichen Mutationsarten erzeugen (Transitionen, Transversionen, Deletionen, Insertio- nen etc.). Art und Verteilungsmuster der im Genom entstandenen Mutationen sind dabei oft für das Kanzerogen charakteristisch, das für die entstandenen Strukturmodifikationen verantwortlich ist. Die sukzessive Akkumulation von Mutationen in den krebsrelevanten Genen (Protoonkogene, Tu or- suppressorgene) führt dann schließlich zur Ausprägung des malignen Phänotyps einer Zelle.
Darüber hinaus kann die Einwirkung von Agentien, die die DNS schädigen, aber auch unmittelbar zur Folge haben, daß eine betroffene Zelle abstirbt. Dies ist z.B. bei der Therapie von Tumorerkrankungen mit Strahlen oder gentoxischen Chemothera- peutika von Bedeutung.
Die Zelle besitzt zu ihrem Schutz eine Reihe wirksamer Ab- wehrmechanismen. Diese umfassen zum einen Enzyme (z.B. Glu- tathionsynthetase, Superoxidismutasen, Katalasen) und niedermolekulare Substanzen (u.a. Cystein, Glutathion, Flavine und die Vitamine C, E) und zum anderen spezifische Reparatursysteme, die DNS-Modifikationen erkennen und enzymatisch aus der DNS entfernen. Die Wirksamkeit der Abwehrmechanismen kann allerdings von Individuum zu Individuum und von Zelltyp zu Zelltyp innerhalb eines Individuums erheblich variieren. Ihre Effizienz ist mitentscheidend für die Tumorempfindlichkeit eines Individuums gegenüber kanzerogenen Faktoren. Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich speziell auch mit der Bestimmung der Aktivität von Reparatursystemen (d.h. der Reparaturkapazität) sowie Anwendungen solcher Aktivitätsbestimmungen.
B. Stand der Technik
Zur Bestimmung der Reparaturkapazität menschlicher Zellen oder Gewebe für verschiedene Kanzerogen-DNS-Modifikätionen gibt es eine Vielzahl von Verfahren. Nachfolgend sind die gebräuchlichsten zusammengef ßt. Sie lassen sich prinzipiell in zwei verschiedene Verfahrensarten unterteilen.
I. Eine der Verfahrensarten beruht auf der Behandlung von Zellen ex vivo mit einem bestimmten Kanzerogen in vitro. Gemessen wird dann die Geschwindigkeit, mit der die kanzerogenerzeugten DNS-Modifikationen enzymatisch aus der DNS der Zellen entfernt werden. Zu diesem Zweck wird die DNS der Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Kanzerogenbehandlung auf die jeweils noch verbliebene Menge der entsprechenden DNS-Modifikationen untersucht. Die so erhaltenen Daten werden zur Berechnung der zellulären Reparaturkapazität herangezogen.
I.I. Zur Bestimmung der Menge an definierten DNS-Modifikationen wird die DNS aus den entsprechenden Zellproben isoliert und auf den Gehalt an DNS-Modifikationen untersucht. Die Quantifizierung der DNS-Modifikationen in den einzelnen DNS- Proben kann erfolgen:
a) In intakten DNS-Molekülen mit der Immuno-Slot-Blot- Methode unter der Verwendung von Antikörpern gegen definierte DNS-Modifikationen (Nehls et al . , 1984b).
b) Nach enzymatischer Hydrolyse der DNS in die einzelnen Desoxyribonukleotide
• mit dem kompetitiven Radioimmunoassay unter der Verwendung von Antikörpern gegen definierte DNS-Modifikationen (Nehls et al . , 1984a),
• mit einem elektrochemischen Detektorsystem nach Trennung des Desoxyribonukleosidgemisches mit einem HPLC- Gerät (Floyd et al . , 1986),
• massenspektroskopisch nach Trennung des Desoxyribonukleosidgemisches mittels Gaschromatographie (Dizdaroglu et al. , 1985) .
I.II. Zum anderen sind Verfahren entwickelt worden, mit denen DNS-Modifikationen direkt in einzelnen Zellen gemessen werden können. Dazu zählen
a) der Immuncytologische Assay (Nehls et al . , 1997) und b) der Comet Assay (Ostling und Johnson, 1984) .
II. Eine weitere Verfahrensart besteht in der Inkubation von Proteinextrakten aus Zellen und Geweben mit DNS-Molekülen, die entweder definierte DNS-Modifikationen (synthetische DNS- Moleküle) enthalten oder mit bestimmten Kanzerogenen behandelt worden sind. Bestimmt wird dann die Geschwindigkeit, mit der die jeweiligen DNS-Modifikationen aus den DNS-Molekülen entfernt werden. Dies kann mit folgenden Verfahren praktiziert werden: II. I.Mit dem "DNA Nicking Assay" (Castaing et al . , 1993). Mit diesem Verfahren wird die Elimination von DNS-Modifikationen durch enzymatische Exzision aus der DNS nachgewiesen. Das Herausschneiden der DNS-Modifikationen geschieht entweder in einem Schritt durch meistens spezifisch wirkende Endonu- kleasen oder in zwei Schritten durch DNS-Glykosylasen, die bestimmte modifizierte Basen erkennen und eliminieren, und AP-Endonukleasen, die die verbliebenen Apurin- bzw. Apyrimidinstellen aus der DNS herausschneiden. In beiden Fällen entstehen an den Stellen der DNS-Modifikationen DNS-Strangbrüche, die zu einer Verkürzung des ursprünglichen DNS-Moleküls führen. Für diesen Assay werden hauptsächlich synthetische, radioaktiv markierte DNS-Moleküle bestimmter Länge verwendet, die an einer vorher bestimmten Position eine definierte DNS-Modifikation enthalten. Die quantitative Bestimmung der noch intakten und der verkürzten DNS-Moleküle erfolgt nach Trennung der unterschiedlich langen DNS-Moleküle durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese.
II. II. Mit dem Filterbindungstest (Nehls und Rajewsky, 1990). Dieses Verfahren basiert auf der Beobachtung, daß DNS-Antikörper-Komplexe auf Nitrozellulosefiltern immobilisiert werden können, während proteinfreie DNS nicht retiniert wird. Das Prinzip des Verfahrens besteht in der Bestimmung der Menge der DNS-Moleküle, die noch zur Antikörperbindung fähig sind. Zu diesem Zweck wird DNS, die (idealerweise) eine DNS- Modifikation pro DNS-Molekül enthält, mit Proteinextrakten inkubiert, nach verschiedenen Reaktionszeiten mit einem spezifisch bindenden Antikörper versetzt und durch Nitrozellulosefilter filtriert. Aus der Geschwindigkeit, mit der die Menge der filtergebundenen DNS-Antikörperkomplexe abnimmt, läßt sich die Reparaturkapazität eines Zelltyps oder Gewebes für definierte DNS-Modifikationen bestimmen, gegen die Antikörper verfügbar sind.
II. III. Die meisten DNS-Modifikationen werden durch Exzisionsreparatur eliminiert. Eine Ausnahme bilden bestimmte DNS-Modifikationen, die durch alkylierende Kanzerogene erzeugt werden (z.B. Os-Alkylguanin, O4-Methylthymin) . Diese Alkylierungsprodukte können von einem Enzym (Os-Alkylguanin- DNS-Alkyltransferase; AT) repariert werden, das die Alkylgruppe von den DNS-Basen auf sich selbst überträgt und danach inaktiv ist. Die wichtigen Verfahren zur quantitativen Bestimmung dieses Reparaturenzyms in Zellen und Geweben sind nachfolgend aufgeführt .
a) Filterbindungstest (siehe II. II.).
b) Das Prinzip eines häufig verwendeten Tests besteht in der Bestimmung der Menge an radioaktiv markiertem O6- Alkylguanin in einer mit einem [3H] -markierten Alkylans behandelten DNS vor und zu verschiedenen Zeiten nach Zugabe von Zeil- oder Gewebeextrakten. Nach saurer Hydrolyse der alkylierten DNS werden die freigesetzten Purine chromatographisch getrennt (HPLC, Sephadex G-10) und die Radioaktivität in der Os-Alkylguanin enthaltenden Fraktion bestimmt (Foote et al., 1983).
c) Ein weiteres oft benutztes Verfahren beruht auf der Erkenntnis, daß die Alkylgruppe auf einen Cysteinrest der AT kovalent übertragen wird. Nach Inkubation einer [3H] -Alkyl-DNS mit Proteinextrakten wird die Menge der auf die AT übertragenen Alkylgruppen durch Bestimmung der Radioaktivität im Proteinanteil des Extrakts bestimmt. Alternativ wird die Menge der in der DNS verbliebenen Radioaktivität gemessen und nach Hydrolyse der Proteine die Menge an gebildeten [3H] - Alkylcystein-Molekülen ermittelt (Pegg et al . , 1983; Waldstein et al., 1982) .
III. Aus der WO 96/28571 ist ein Verfahren zur Bestimmung von DNS-Schäden bekannt, bei dem DNS durch Adsorption an ein Polykation auf einem Träger fixiert wird. Bei diesem Verfahren läßt man auf die adsorbierte DNS, die Schäden aufweist, eine Zusammensetzung einwirken, die einen Zellextrakt mit Reparaturaktivität und markierte Nukleotide enthält . Der im Fall der Reparatur erfolgende Einbau der markierten Nukleotide wird dann nachgewiesen.
IV. Aus dem Stand der Technik sind Verfahren zur kovalenten Kopplung von Biomolekülen an feste Träger bekannt, allerdings nicht im Zusammenhang mit der Untersuchung der Reparatur von DNS-Schäden.
So ist aus der DE-A-43 41 524 ein Verfahren zur Immobilisierung von Biomolekülen und Affinitätsliganden an polymere Träger unter Verwendung eines Quadratsäurederiva es bekannt. Die DE-C-44 99 550 beschreibt Kopplungsreaktionen unter Verwendung von Quadratsäurederivaten und erwähnt die Möglichkeit, Biomoleküle kovalent mit einer Matrix zu verknüpfen. Aus der DE-A-196 24 990 ist ein Verfahren zur chemisch kontrollierten Modifizierung von Oberflächen sowie von Acyl- und/oder Hydroxylgruppen tragenden Polymeren bekannt .
Die oben beschriebenen, aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren zur Bestimmung der Reparaturkapazität sind insbesondere zeitraubend, arbeitsintensiv und kostspielig durchführbar. Bei manchen der Verfahren besteht auch das Problem des Verlustes von Probenmaterial während der Aufarbeitung.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Verfahren zur Untersuchung der Reparatur von DNS- Modifikationen, Basenfehlpaarungen sowie Apurin- und Apyrimidinstellen durch DNS-Reparaturenzyme bereitzustellen. Insbesondere soll das Verfahren einfach, effizient und kostengünstig durchführbar sein und die oben genannten Nachteile vermeiden.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß ein Verfahren zur Untersuchung der Reparatur von DNS-Modifikationen und Basenfehlpaarungen sowie Apurin- und Apyrimidinstel- len bereitgestellt wird, das folgende Schritte umfaßt:
(a) Bereitstellung von einzelsträngigen oder doppelsträngigen DNS-Molekülen, die über eine am 5 ' -Ende oder am 3 ' -Ende der DNS oder an der 2' -Position zumindest eines Desoxy- ribosylrestes innerhalb des DNS-Moleküls eingebrachte primäre oder sekundäre Aminogruppe mit einer primäre oder sekundäre Aminogruppen tragenden Festphasenmatrix durch Umsetzung mit einem reaktiven Quadratsäurederivat kovalent gekoppelt wurden und die Modifikationen und/oder Basenfehlpaarungen und/oder Apurin- oder Apyrimidinstellen aufweisen;
(b) Inkontaktbringen der DNS-Moleküle mit einer DNS-Reparaturenzyme enthaltenden Zusammensetzung;
(c) Bestimmung der Eliminierung der DNS-Modifikationen und/oder Basenfehlpaarungen und/oder Apurin- oder Apyrimidinstellen.
Erfindungsgemäß werden auch Testkits bereitgestellt, die die für die Ausführung der Verfahren nach der Erfindung benötigten Komponenten umfassen.
Bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung, den Ausführungsbeispielen sowie die anliegenden Patentansprüchen.
C. Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Das der Erfindung zugrundeliegende Prinzip besteht darin, daß man Reparaturenzyme auf DNS-Moleküle, die kovalent an einen festen Träger gebunden sind und eine Modifikation und/oder eine Basenfehlpaarung und/oder eine Apurin- oder Apyrimidin- stelle (Schädigung) aufweisen, einwirken läßt und die Beseitigung der Modifikation bzw. der Basenfehlpaarung bzw. der Apurin- oder Apyrimidinstelle beobachtet. Die kovalente Verknüpfung der DNS-Moleküle mit dem Träger erfolgt mit Hilfe eines reaktiven Quadratsäurederivats . Ein zweckmäßiges Verfahren zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung der Beseitigung der Modifikation bzw. der Basenfehlpaarung bzw. der Apurin- oder Apyrimidinstelle bedient sich spezifischer Antikörper oder Antikörperfragmente gegen die Modifikation bzw. die Basenfehlpaarung bzw. die Apurin- oder Apyrimidinstelle (oder im Fall einer Apurin- oder Apyrimidinstelle auch gegen ein Derivat einer solchen Stelle) . Der Bindungsanteil solcher spezifischen Antikörper wird bestimmt . Erfolgt die Reparatur durch Exzision, so kann der qualitative oder quantitative Nachweis auch durch Beobachtung des Verlusts einer geeignet eingebrachten Markierung erfolgen; die Markierung (oder eine Bindungsregion für eine Markierung) ist also in einen DNS-Abschnitt eingebracht, der nach der Exzision nicht mehr mit dem Träger verbunden ist. Es kann die Menge freigesetzter und/oder gebunden verbleibender Markierung bestimmt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es beispielsweise, die Reparaturkapazität einer Reparaturenzyme enthaltenden Zusammensetzung für eine vorgegebene DNS-Modifikation oder Basenfehlpaarung oder Apurin- oder Apyrimidinstellen zu untersuchen. Andererseits können aber auch DNS-Modifikationen oder Basenfehlpaarungen oder Apurin- oder Apyrimidinstelle festgestellt werden, indem definierte Reparaturenzyme zum Einsatz kommen. Weiterhin kann auch der Einfluß von Agentien auf DNS getestet werden, indem durch die Einwirkung der Agentien hervorgerufene Modifikationen (z.B. durch spezifisch wirkende Reparaturproteine) sowie deren Reparatur untersucht werden. Dies ermöglicht Aussagen über das DNS-schädigende Potential der Agentien. Schließlich ist es auch möglich, den Einfluß von Reaktionsbedingungen und insbesondere von Substanzen auf den Ablauf der Reparatur zu untersuchen.
Die Reparaturkapazität bezeichnet allgemein eine Aktivität bei der Eliminierung von DNS-Modifikationen oder Basenfehlpaarungen oder Apurin- oder Apyrimidinstellen. Insbesondere ist die Reparaturkapazität im hier verstandenen Sinn ein Maß für die Abnahme des Gehalts an DNS-Modifikationen oder Basenfehlpaarungen oder Apurin- oder Apyrimidinstellen in einer Probe. Quantitative Untersuchungen werden in den Beispielen erläutert, wobei die dort angegebenen mathematischen Beziehungen allgemein bei der jeweiligen Art von Untersuchungsverfahren anwendbar sind.
D. Ausführliche Darstellung bevorzugter Ausführungsformen
Die Erfindung betrifft somit u.a. ein Verfahren, mit dem die Fähigkeit von Zellen oder Geweben zur enzymatischen Reparatur definierter DNS-Strukturmodifikationen (auch DNS-Modifikationen, DNS-Schäden oder DNS-Addukte genannt) und DNS-Fehlpaarungen schnell und präzise bestimmt werden kann. Weiterhin kann, bei Einsatz definierter DNS-Reparaturenzyme, auch die Natur der DNS-Strukturmodifikationen und Basenfehlpaarungen untersucht werden. Dementsprechend stellt die Erfindung auch ein Verfahren zur Bestimmung der Reparaturkapazität von DNS- Strukturmodifikationen, Basenfehlpaarungen und Apurin- oder Apyrimidinstellen durch DNS-Reparaturenzyme enthaltende Zusammensetzungen (insbesondere Lösungen) , das sich auch zum Nachweis von DNS-Strukturmodifikationen, Basenfehlpaarungen und Apurin- oder Apyrimidinstellen selbst eignet, mit den nachfolgenden Schritten bereit :
(a) Einzelsträngige oder doppelsträngige DNS-Moleküle oder DNS-Analoga, die so modifiziert wurden, daß sie am 5 ' -Ende oder am 3 ' -Ende der DNS oder an der 2 '-Position zumindest eines Desoxyribosylrestes innerhalb des DNS-Moleküls eine primäre oder sekundäre Aminogruppe tragen und die DNS- Strukturmodifikationen und/oder Basenfehlpaarungen und/oder Apurin- oder Apyrimidinstellen aufweisen können, werden durch Umsetzung mit einem Quadratsäureester über eine primäre oder sekundäre Aminogruppen tragende Festphasenmatrix kovalent an die Matrix gekoppelt; (b) Inkontaktbringen der an die Festphasenmatrix gebundenen DNS-Moleküle mit einer Reparaturenzyme enthaltenden Lösung;
(c) qualitative und/oder quantitative Bestimmung der Reparatur möglicher Strukturmodifikationen und/oder Basenfehlpaarungen und/oder Apurin- oder Apyrimidinstellen durch die in der Lösung vorhandenen Reparaturenzyme.
Im Falle der Bestimmung einer Strukturmodifikation und/oder Basenfehlpaarung und/oder Apurin- oder Apyrimidinstelle werden definierte Reparaturenzyme eingesetzt, die zur Reparatur einer spezifischen Strukturmodifikation und/oder Basenfehlpaarung und/oder Apurin- oder Apyrimidinstelle befähigt sind.
Die Reparaturfähigkeit kann sowohl von Zelltyp zu Zelltyp innerhalb eines Individuums wie auch von Individuum zu Individuum stark variieren.
Sie ist demnach ein wichtiger Parameter für
• die individuelle Tumorsuszeptibilitat,
• die Empfindlichkeit von Tumorpatienten gegenüber einer Strahlentherapie oder genotoxischen Chemotherapie,
• die Resistenz von Tumorzellen gegenüber einer Strahlentherapie oder genotoxischen Chemotherapie.
Die individuelle Tumorsuszeptibilitat hängt mit der Fähigkeit von Zellen eines Individuums zusammen, DNS-Modifikationen und/oder Basenfehlpaarungen und/oder Apurin- oder Apyrimidinstellen zu reparieren. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können der Reparaturstatus eines Individuums und damit die Tumorsuszeptibilitat bestimmt werden, indem man eine in geeigneter Weise aus Zellen oder Gewebeproben gewonnene Zusammensetzung auf eine DNS einwirken läßt, die Modifikationen bzw. Basenfehlpaarungen bzw. Apurin- oder Apyrimidinstellen aufweist, und deren Beseitigung nachweist. Ist bekannt, daß ein bestimmtes Kanzerogen eine bestimmte Art von Modifikation und/oder Basenfehlpaarung und/oder Apurin- oder Apyrimidinstelle hervorruft, so kann der Reparaturstatus in bezug darauf bestimmt werden und somit auch die Tumorsuszeptibilitat für das Kanzerogen festgestellt werden.
Die Bestimmung der individuellen Strahlenempfindlichkeit ist insofern von großer Bedeutung, als bei einer Strahlentherapie, z.B. von Krebserkrankungen, bei etwa 30 % der Patienten wegen Schädigung von dem Tumor benachbarten gesunden strahlenempfindlichen Geweben eine stationäre Behandlung erforderlich ist, wobei bei etwa 2 % sogar bleibende Schäden hervorgerufen werden. Andererseits wäre es für eine optimale Bekämpfung des Tumors gelegentlich wünschenswert, höhere als die üblichen Strahlendosen anzuwenden. Um nun erfindungsgemäß die Strahlenempfindlichkeit zu bestimmen, wird aus einer Probe eines gesunden Gewebes, das bei der Therapie Strahlung ausgesetzt wird, oder eines geeigneten Surrogatgewebes nach der Entnahme eine Zusammensetzung für die weitere Untersuchung (eine Suspension oder ein Extrakt) hergestellt. Anschließend wird die Kinetik der Reparatur von DNS-Schäden untersucht . Dazu läßt man die vorstehend genannte Zusammensetzung auf DNS-Moleküle einwirken, in die vor oder nach der Kopplung eine oder mehrere geeignete Modifikationen und/oder Basenfehlpaarungen und/oder Apurin- oder Apyrimidinstellen eingebracht wurden. Die Strahlenempfindlichkeit kann nun bestimmt werden, indem die zeitliche Abnahme der Menge an DNS-Modifikationen oder Basenfehlpaarungen oder Apurin- oder Apyrimidinstellen, insbesondere der Menge an Modifikationen, die durch reaktive Sauerstoffspezies hervorgerufen werden, z.B. der Menge an 8-Oxoguanin, gemessen und mit Standarddaten korrelliert wird. Auf diese Weise ist es möglich, die gesamte Strahlendosis und die Verteilung der Einzeldosen über die Zeit bei fraktionierter Bestrahlung individuell festzulegen. Gemäß einer speziellen Ausführungsform ist es außerdem vorgesehen, die wie vorstehend ermittelten Daten, die die Reparaturkapazität der Zellen in bezug auf DNS-Schäden widerspiegeln, mit Daten zu kombinieren, die die Proliferation der Zellen beschreiben, um zu einer noch präziseren Festlegung der Strahlendosis zu gelangen. Auf entsprechende Weise kann auch die Strahlenempfindlichkeit von Tumorgewebe bestimmt werden, um die für eine Behandlung erforderliche Strahlendosis abzuschätzen.
Analog zur Bestimmung der Empfindlichkeit von Tumorpatienten gegenüber einer Strahlentherapie kann auch die Bestimmung der Empfindlichkeit gegenüber einer genotoxischen Chemotherapie erfolgen. Die Reparaturkapazität wird hier insbesondere für eine oder mehrere geeignet gewählte DNS-Modifikationen bestimmt. Bei bekanntem Wirkungsmechanismus des chemotherapeutischen Mittels können DNS-Modifikationen auf Basis dieses Mechanismus gewählt werden. Z.B. kann im Zusammenhang mit einem alkylierenden Mittel die Reparatur von entsprechenden alkylierten Basen untersucht werden. Die gleichen Überlegungen gelten auch für die Bestimmung der Resistenz von Tumorzellen gegenüber einem bestimmten Mittel.
Grundlage des Verfahrens zur Untersuchung der Reparatur ist die kovalente Bindung von modifizierten DNS-Molekülen oder DNS-Molekülen mit Basenfehlpaarungen oder Apurin- oder Apyrimidinstellen an feste Phasen wie z.B. Filter, Gold, Beads, Mikrotiterplatten oder Glasoberflächen. Geeignete Träger sind insbesondere auch Chips (DNS-Chiptechnologie) . Die immobilisierte DNS wird mit Proteinextrakten aus Zellen oder Geweben inkubiert. Gemessen wird die Geschwindigkeit, mit der definierte DNS-Addukte oder Basenfehlpaarungen oder Apurin- oder Apyrimidinstellen durch die in den Extrakten enthaltenen Reparaturproteine entfernt werden.
Als Kopplungsagens dient ein reaktives Quadratsäurederivat, das zur Reaktion mit Aminogruppen imstande ist. Bevorzugt ist ein Quadratsäuredies er, insbesondere ein Quadratsäuredi- alkylester, wie speziell Quadratsäurediethylester, der jeweils zwei primäre oder sekundäre Aminogruppen miteinander verknüpfen kann. Überraschenderweise reagieren die erfin- dungsgemäß verwendeten Quadratsäurederivate nur mit aliphati- schen Aminogruppen, nicht aber mit den Stickstoffatomen der DNS-Basen. Dies ist ein unschätzbarer Vorteil gegenüber anderen Kopplungsagentien, die mit den reaktiven Gruppen der DNS reagieren und auf diese Weise zu unerwünschten Schädigungen führen können (z.B. Dialdehyde) . Durch die Einführung einer primären oder sekundären Aminogruppe am 5 ' -Ende oder am 3 ' -Ende oder an der 2 ' -Position zumindest eines Desoxyribo- sylrestes innerhalb der DNS-Moleküle wurde somit ein schonendes, hochreproduzierbares und kostengünstiges Verfahren für die regiospezifische Immobilisierung von einzel- und doppel- strängigen Oligonukleotiden an feste Phasen entdeckt, die an ihrer Oberfläche Aminogruppen tragen. Bevorzugt ist, die Aminogruppe am 5 ' -Ende einzuführen. Die Einführung einer primären Aminogruppe (NH2-Gruppe) ist besonders bevorzugt. Bei doppelsträngigen DNS-Molekülen wird vorzugsweise ein Strang, z.B. über dessen 5 '-Ende, mit dem Träger kovalent verknüpft.
Als Festphasenmatrix können an sich bekannte Materialien eingesetzt werden, beispielsweise solche, die aus Zellulose, Polystyrol, Polypropylen, Polycarbonat , einem Polyamid, Glas oder Goldoberflächen bestehen. Die Festphasenmatrix kann in an sich bekannten Formen vorliegen, beispielsweise in Form eines Filters, in Form von Mikrotiterplatten, Membranen, Säulen, Kügelchen, beispielsweise Magnetkügelchen.
Erfindungsgemäß umfaßt der Ausdruck DNS-Moleküle einzelsträngige und doppelsträngige Moleküle mit beliebiger natürlicher oder synthetischer Sequenz. Die Zahl der Basen in dem DNS- Molekül kann beliebig gewählt werden, sofern eine ausreichende Zahl von Basen für die Wechselwirkung mit dem Reparaturenzym zur Verfügung steht. In einigen Fällen können bereits Oligonukleotide mit wenigen Basen ausreichen. Für einige Reparaturenzyme hat es sich als zweckmäßig erwiesen, Oligonukleotide mit drei vollständigen Windungen einzusetzen, wobei sich die Modifikation oder Fehlpaarung oder Apurin- oder Apyrimidinstelle in der mittleren Windung befindet. Länge der Sequenz und Anordnung der zu reparierenden Stelle können jedoch vom Fachmann in Routineversuchen variiert werden. Ebenso kann der Fachmann Variationen in der Sequenz untersuchen. Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, Sequenzen einzusetzen, die keine Rückfaltung erlauben. Der Fachmann kann auch durch Variationen der Sequenz den Einfluß der Umgebung auf die Reparatur der zu reparierenden Stelle untersuchen.
Wie bereits erwähnt, ist in die DNS-Moleküle eine Aminogruppe zur Kopplung mit dem Träger eingeführt. Ferner sind Modifikationen oder Basenfehlpaarungen oder Apurin- doer Apyrimidinstellen eingebracht, die repariert werden können. Darüber hinaus schließt der Ausdruck DNS-Moleküle auch DNS-Analoga ein.
Als DNS-Analoga können beispielsweise am Phosphat-Zucker- Gerüst modifizierte DNS-Moleküle eingesetzt werden. Beispiele hierfür sind Moleküle, bei denen die Phosphatgruppen durch Phosphothiate (Thiophosphate) ersetzt sind oder die Phospho- diesterbindung durch eine Peptidbindung ersetzt ist. Als DNS- Analoga kommen auch Moleküle in Betracht, bei denen einige oder alle Desoxyribonukleotide durch Ribonukleotide ersetzt sind.
Erfindungsgemäß werden mit den DNS-Reparaturenzymen DNS- Moleküle in Kontakt gebracht, die DNS-Modifikationen oder Basenfehlpaarungen oder Apurin- oder Apyrimidinstellen enthalten, von denen angenommen wird, daß sie durch die Enzyme repariert werden können. Die genannten Veränderungen der DNS können unmittelbar oder mittelbar durch kanzerogene Faktoren (einschließlich Strahlung) hervorgerufen werden. Die DNS- Modifikationen umfassen insbesondere Basenmodifikationen. Typischerweise handelt es sich um Addukte mit reaktiven Agentien, wie Kanzerogenen. Eine DNS-Modifikation in dem hier verstandenen Sinn ist aber nicht auf eine bestimmte Art der Veränderung der DNS beschränkt. Erfindungsgemäß ist es insbesondere auch möglich, gezielt synthetisierte DNS-Moleküle, insbesondere Oligonukleotide, mit genau definierten Modifikationen oder Basenfehlpaarungen zu untersuchen. Ferner können Modifikationen auch durch Einwirkung von Agentien auf DNS erzeugt werden.
Die kovalente Bindung der DNS-Moleküle an Festphasen erlaubt es, alle praktischen Schritte eines Experiments schnell und effizient in einem einzigen Reaktionsgefäß durchzuführen. Für Arbeitsgänge wie die Zugabe oder das Entfernen von Enzymen, Nukleinsäuren, Antikörpern oder farbgebenden Substraten, für den Wechsel von Pufferlösungen und für Waschvorgänge etc. sind nur noch weitgehend automatisierbare Pipettiervorgänge nötig, d.h., zeit- und personalintensive Arbeitsschritte wie z.B. Fällen und wiederholtes Zentrifugieren der DNS sowie die chromatographische oder elektrophoretische Trennung der DNS- Moleküle von anderen Komponenten entfallen. Außerdem können Verluste von DNS durch aufwendige Aufarbeitung von Probenmaterial vermieden werden.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, daß die fixierten DNS-Moleküle kovalent mit dem Träger an einer genau definierten Stelle des Moleküls verbunden, sich aber ansonsten frei in Lösung befinden. DNS-Modifikationen, Basenfehlpaarungen und Apurin- oder Apyrimidinstellen sind damit für Reparaturenzyme frei zugänglich.
Durch den Einsatz verschiedener markierter Substrate ist es erstmalig möglich, Proteinextrakte aus Zellen oder Geweben im gleichen Reaktionsgefäß auf ihre Reparaturfähigkeit für verschiedene DNS-Modifikationen und/oder DNS-Fehlpaarungen und/oder Apurin- oder Apyrimidinstellen zu untersuchen. Dies geschieht, indem verschiedene modifizierte Oligonukleotide an die Oberfläche der Reaktionsgefäße (oder anderer Träger) gebunden werden, wobei Oligonukleotide mit gleicher Modifikation typischerweise jeweils die gleiche Markierung oder die gleiche Bindungsgruppe für eine Markierung enthalten. Mit dem Verfahren kann der Reparaturstatus einer Person schnell und präzise bestimmt und somit deren Suszeptibilität gegenüber kanzerogenen Faktoren in der Umwelt oder am Arbeitsplatz zuverlässig abgeschätzt werden. Das Verfahren kann außerdem zur schnellen Abschätzung der Empfindlichkeit von Tumorpatienten (z.B. Zellen des blutbildenden Systems im Knochenmark, des Darms und des Schleimhautepithels) gegenüber einer Radiotherapie oder genotoxischen Cytostatika eingesetzt werden. Schließlich kann mit dieser Methode die Reparaturkapazität von Tumorzellen rasch und genau bestimmt werden, die eine wichtige Rolle bei der Resistenz gegenüber DNS-reaktiven Cytostatika einnimmt .
Das hier beschriebene Kopplungsverfahren eignet sich prinzipiell für schonende und regiospezifische Immobilisierung von Oligonukleotiden an feste Phasen.
Eine bevorzugte Ausführungsform des hier beschriebenen Verfahrens beinhaltet
• die Immobilisierung selektiv modifizierter Nukleinsäuren an feste Phasen und
• die Verwendung von Quadratsäurediethylester für die kovalente Bindung modifizierter Nukleinsäuremoleküle an feste Phasen (wie z.B. Filter, Mikrotiterplatten, Membranen, Glasoberflächen, Gold, Beads und Magnetobeads) .
Als Kopplungsagens für die kovalente Bindung modifizierter Nukleinsäuremoleküle bieten sich vor allen anderen Agentien Quadratsäurediester an.
Überraschenderweise reagieren aktivierte Quadratsäurederivate, wie insbesondere Quadratsäurediester, nicht mit den Aminogruppen der Purin- und Pyrimidinbasen der DNS . Vielmehr reagieren sie selektiv mit primären und sekundären aliphati- schen Aminogruppen. Im Vergleich zu anderen Kopplungsagentien
GEL 26 ist dies ein entscheidender Vorteil : Eine unerwünschte Schädigung oder Vernetzung der DNS-Moleküle durch die Kopplungssubstanz findet nicht statt .
Durch das Einführen von Aminogruppen z.B. am 5 ' -Ende können DNS-Moleküle regiospezifisch mit Festphasen verknüpft werden, an deren Oberflächen sich ebenfalls Aminogruppen befinden.
E. Herstellung von DNS-Matrizen mit definierten DNS-Addukten durch den synthetischen Einbau bestimmter, kanzerogenspezifischer Basemnodifikationen sowie Herstellung von DNS-Molekülen mit bestimmten Basenfehlpaarungen oder Apurin- oder Apyrimidinstellen.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können vorteilhaft DNS- Moleküle mit festgelegter Sequenz und definierten Modifikationen oder Basenfehlpaarungen oder Apurin- oder Apyrimidinstellen eingesetzt werden. Nachstehend werden beispielhaft verschiedene Ansätze erläutert, die jedoch die Erfindung nicht beschränken sollen. Die erforderlichen Synthesetechniken sind dem Fachmann bekannt und können der Literatur entnommen werden.
I. Synthese von einzelsträngigen Oligonukleotiden definierter Sequenz mit den gängigen Verfahren, die
a) eine bestimmte Basenmodifikation (z.B. 8-Oxoguanin, 0S- Alkylguanin) an einer vorbestimmten Stelle der Basensequenz haben, b) am 5 ' -Terminus der DNS-Moleküle eine NH2-Gruppe enthalten, c) am 3 ' -Terminus eine OH-Gruppe enthalten.
I.I. Markierung der 3 ' -Termini der DNS-Moleküle
Enzymatisehe Verlängerung der 3 ' -Termini durch den Einbau von z.B. fluoreszenzmarkierten Triphosphaten mit der Terminalen Desoxynukleotidtransferase (TdT) . Wenn verschiedene modifizierte Oligonukleotide an den gleichen Träger gebunden werden (gleichzeitige Überprüfung von Proteinextrakten auf ihre Reparaturfähigkeit für verschiedene DNS-Modifikationen) , werden verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe eingesetzt, wobei Oligonukleotide mit gleicher Modifikation jeweils den gleichen Fluoreszenzfarbstoff enthalten. Alternativ kann auch eine andere Markierung oder eine Gruppierung, die eine Markierung binden kann, eingebaut werden. Darüber hinaus ist ohne weiteres ersichtlich, daß sich die Markierung nicht am 3 ' -Ende befinden muß, sondern lediglich in einer solchen Position, daß sie nach der Exzision nicht mehr mit dem Träger in Verbindung steht .
I.II. Herstellung von doppelsträngigen (ds-) Oligonukleotiden:
a) Verschmelzung der modifizierten Oligonukleotide mit den komplementären Oligonukleotiden. (Vorzugsweise ist also der die Modifikation tragende Strang kovalent mit dem Träger verknüpft . )
b) Für Untersuchungen zur Reparatur von DNS-Fehlpaarungen (Mismatch-Reparatur) durch Proteinextrakte werden unmo- difizierte oder modifizierte Oligonukleotide mit komplementären Oligonukleotiden verschmolzen, die an einer bestimmten Position der Basensequenz bzw. gegenüber der Position des DNS-Adduktes unterschiedliche natürliche Nukleotide enthalten.
I.III. Kopplung der ds-Oligonukleotide am 5 ' -Ende an eine feste Phase mittels eines chemisch stabilen oder eines spaltbaren Linkers. Allgemein ist es in der vorliegenden Erfindung möglich, Linker (Abstandshalter) vorzusehen, die mit der Oberfläche des festen Trägers verknüpft sind und an dem von der Oberfläche abgewandten Ende Aminogruppen tragen, über die die Kopplung mit DNS-Molekülen mit Hilfe von Quadratsäurederivaten möglich ist. Ebenso kann ein Linker mit dem DNS-Molekül verbunden sein, wobei der Linker wiederum eine Aminogruppe trägt, die die Quadratsäurekopplung ermöglicht. Innerhalb des Linkers kann eine spaltbare Gruppe vorgesehen sein, die die Trennung des DNS-Moleküls von der Festphasenmatrix mit Hilfe geeigneter Reagentien für weitere Untersuchungen erlaubt .
I.IV. Wenn ausschließlich einheitlich modifizierte ds- Oligonukleotide verwendet werden, können die DNS-Moleküle beispielsweise zuerst über die 5 ' -NH2-Termini an eine feste Phase gebunden werden und anschließend am 3 ' -Ende
a) mit einem modifizierten Desoxynukleotid (z.B. biotiny- liertes dUTP) , an das eine nachweisbare Markierung, wie ein Fluroeszenzfarbstoff , hochaffin bindet (z.B. TRITC an Streptavidin gekoppelt) , oder
b) mit einem fluoreszenzfarbstoffgekoppelten (oder radioaktiv oder auf andere Weise markierten) Desoxynukleotid enzymatisch markiert werden.
II. Herstellung von DNS-Matrizen mit spezifischen DNS- Modifikationen durch die Behandlung von ds-Oligonukleotiden oder linearer Plasmid-DNS mit kanzerogenen Faktoren (reaktive chemische Substanzen wie z.B. Benzo (a) pyrendiolepoxid, Methyl- oder Ethylnitrosoharnstoff , UV-Licht, ionisierende Strahlen, Wasserstoffperoxid, Methylenblau in Verbindung mit sichtbarem Licht) .
II. I. Herstellung von ds-Oligonukleotiden mit NH2-Gruppen am 5 ' -Ende und OH-Gruppen am 3 ' -Ende der Moleküle wie unter I. beschrieben. Behandlung der Moleküle mit Kanzerogenen. Bindung der Moleküle über die NH2-Gruppen an eine feste Phase (siehe I.IV.) und enzymatische Markierung der gebundenen Moleküle, beispielsweise mit einem Fluoreszenzfarbstoff. II. II. Alternativ können die ds-Oligonukleotide zuerst an eine feste Phase gebunden werden. Die Behandlung mit einem reaktiven Kanzerogen und die enzymatische Markierung der Oligonukleotide erfolgt dann erst danach.
II. III. Einführung von NH2-Gruppen am 5 ' -Ende der Plasmid-DNS :
a) Mit Hilfe der PCR-Methode unter der Verwendung von Primern, von denen einer am 5 ' -Ende eine NH2-Gruppe trägt.
b) Spaltung der Plasmide mit einer Restriktase, so daß zwei neue, kürzere DNS-Moleküle mit jeweils nur noch einer NH2- Gruppe an einem der beiden 5 ' -Termini/DNS-Molekül entstehen. Enzymatischer Einbau von z.B. biotinyliertem dUTP an den 3'- Enden der Plasmid-Moleküle. Nach Behandlung mit einem Kanzerogen erfolgt die Bindung der DNS-Matritzen an eine feste Phase. Gemäß dieser Ausführungsform kann eine Nachweisreaktion mit Hilfe eines Steptavidin-Farbstoff-Konjugats erfolgen, das an Biotin bindet.
III. Herstellung von DNS-Molekülen mit Apurin- oder Apyrimidinstellen:
Es ist beispielsweise möglich, ein DNS-Molekül zu synthetisieren, in das ein Uridinmonophosphat eingebaut wird, wobei die Base ausschließlich enzymatisch abgetrennt wird. Außerdem sind Enzyme bekannt, die modifizierte Basen entfernen, wobei eine Apurin- oder Apyrimidinstelle zurückbleibt.
F. Praktische Druchführung des Reparaturtests
Bei der Durchführung von Reparaturtesus bringt man eine Zusammensetzung, von der angenommen wird, daß sie Reparaturenzyme enthält, mit fixierter DNS in Kontakt. Bei der Zusammensetzung kann es sich um einen Zellextrakt oder Gewebeextrakt handeln. In diesem Fall sind mit dem erfindungs- gemäßen Verfahren Aussagen über die Reparaturaktivität der
L 26 Zellen bzw. des Gewebes möglich.
Der Nachweis der Elimination von bestimmten DNS-Modifikationen oder Basenfehlpaarungen oder Apurin- oder Apyrimidinstellen durch enzymatische Reparatur kann auf zweierlei Weise erfolgen:
I . Durch die Verwendung mono- oder polyklonaler Antikörper, die spezifisch an bestimmte DNS-Modifikation binden (z.B. 8- Oxoguanin, 06-Alkylguanin, PAH-Addukte der DNS, Pyrimidindi- mere etc.). Derartige Antikörper sind in der Literatur beschrieben. Ihre Herstellung kann nach dem Fachmann bekannten Verfahren erfolgen. Es können auch Antikörperfragmente mit geeigneter Affinität eingesetzt werden.
• Dieses Verfahren eignet sich prinzipiell zum Nachweis einer jeden DNS-Modifikation, gegen die ein geeigneter Antikörper vorhanden ist.
• Eine Markierung der DNS-Moleküle ist bei dieser Verfahrensweise nicht nötig.
• Für eine quantitative Analyse der Reparaturkapazität eines Zellextrakts muß die Anzahl der DNS-Addukte im Reaktionsansatz bekannt sein; die Anzahl der DNS-Addukte pro DNS-Molekül ist unerheblich.
Es werden hierzu immobilisierte DNS-Moleküle, die entweder eine definierte DNS-Modifikation (ein definiertes DNS-Addukt) enthalten oder mit einem bestimmten Kanzerogen behandelt wurden, zunächst mit einem zu untersuchenden Zeil- oder Gewebeextrakt inkubiert. Anschließend gibt man einen Antikörper hinzu, der spezifisch an die Modifikation bindet (Erst- antikörper) ; zur Quantifizierung der gebundenen Antikörpermenge wird dann typischerweise ein Zweitantikörper hinzugegeben, der entweder mit einem Fluoreszenzfarbstoff (TRITC, FITC, Fluorescein etc.) oder auf sonstige Weise, etwa radio- aktiv, markiert ist oder an den ein Enzym (z.B. Phosphatase, Katalase) gekoppelt ist, das mit geeigneten Substraten zu einer Farbreaktion führt. Unter konstanten Bedingungen ist die Bindung der AK-Moleküle direkt proportional zu der Menge der verbliebenen DNS-Addukte (Nehls und Rajewsky, 1990) ; d.h., die Intensität des Farbstoffs ist ein Maß für die Adduktmenge.
Analog können mit geeigneten Antikörpern auch Basenfehlpaarungen oder Apurin- oder Apyrimidinstellen untersucht werden. Bei der Untersuchung der Reparatur von Apurin- oder Apyrimidinstellen ist es auch möglich, diese Stellen mit geeigneten chemischen Mitteln, wie Methoxyaminen, Hydrazinderivaten oder substituierten aromatischen Aminen, zu derivatisieren und zum Nachweis Antikörper (oder Antikδrperfragmente) gegen die derivatisierten Stellen zu verwenden. Zweckmäßigerweise erfolgt die Derivatisierung nach der Einwirkung der Reparaturenzyme .
II. Durch das Ausnützen der Tatsache, daß bei der Elimination von DNS-Modifikationen und Basenfehlpaarungen durch Exzisionsreparatur DNS-Strangbrüche erfolgen.
• Dieses Verfahren eignet sich zum Nachweis von Reparaturprozessen, die zu DNS-Strangbrüchen führen. Die meisten bekannten Reparaturvorgänge erfolgen nach diesem Mechanismus. Eine Ausnahme bildet die Reparatur von z.B. Os-Alkylguanin durch die AT (siehe C. II. III.) .
• Für dieses Verfahren eignen sich bevorzugt ds-Oligonukleotide.
Für die Durchführung des Verfahrens muß gewährleistet sein,
a) daß nur ein DNS-Strang (möglichst) ein definiertes DNS- Addukt enthält, b) daß dieser DNS-Strang immobilisiert ist
c) und daß dieser DNS-Strang so in bezug auf die DNS-Modifikation markiert ist, daß die Markierung nach der Exzision nicht mehr mit dem Träger verbunden ist. Wenn beispielsweise der DNS-Strang über das 5 ' -Ende kovalent mit dem Träger verknpüft ist, kann eine Markierung am 3 ' -Ende angebracht sein. Allgemein muß sich in diesem Fall die Markierung in einer Position 3' in bezug auf die Stelle, an der die DNS bei der Reparatur geschnitten wurde, befinden. Es kann auch ein strukturmodifiziertes Nukleotid, das durch die Exzision enfernt wird, markiert sein. Besonders geeignet ist in diesem Fall eine radioaktive Markierung. Es ist auch möglich, eine zusätzliche Markierung einzubringen, die bei der Reparatur (Exzision) nicht verlorengeht und mit der z.B. in jedem Stadium des Verfahrens die Menge der immobilisierten DNS untersucht werden kann. Für eine Untersuchung der Eliminierung von DNS-Modifikationen, Basenfehlpaarungen oder Apurin- oder Apyrimidinstellen, wie sie vorstehend beschrieben wurde, eignet sich eine derartige, ggf. zusätzlich vorgesehene Markierung aber nicht.
Für die Quantifizierung der Reparaturleistung eines Zellextraktes muß die Anzahl der DNS-Addukte pro Reaktionsansatz bekannt sein.
Immobilisierte DNS-Moleküle werden mit einem zu untersuchenden Zeil- oder Gewebeextrakt inkubiert. Werden DNS-Addukte durch enzymatische Exzision entfernt, zerfallen die kovalent gebundenen Stränge in zwei Bruchstücke, von denen die Fragmente mit der Markierung nicht mehr kovalent mit der festen Phase verbunden sind. Durch Erhitzen der DNS-Moleküle in einem geeigneten Puffergemisch lösen sich die Wasserstoffbrücken zwischen den beiden DNS-Strängen. Die ungebundenen Fragmente trennen sich somit von den komplementären (nicht markierten) Gegensträngen ab und können problemlos durch z.B. Absaugen entfernt werden. DNS-Moleküle, die ihre DNS-Addukte
EL26 behalten haben, besitzen noch die Markierungen und können so leicht quantifiziert werden. Auf die gleiche Weise können auch Basenfehlpaarungen sowie Apurin- oder Apyrimidinstellen untersucht werden.
G. Kurze Beschreibung der Zeichnungen
In den beigefügten Zeichnungen zeigt
Fig. 1 die Kinetik der Entfernung von 8-Oxoguanin aus ds- Oligonukleotiden durch Zellextrakte;
Fig. 2 die Kinetik der Reparatur von Oε-Ethylguanin durch Zellextrakte .
H. Applikationsbeispiele
Herstellung modifizierter Oligodesoxynukleotide.
Es wurden drei verschiedene Oligodesoxynukleotide, jeweils aus 34 Nukleotiden bestehend, hergestellt, die am 5 ' -Ende eine NH2-Gruppe enthielten. Die Basenfolge der drei Oligonukleotide war mit Ausnahme der Position 16 identisch und lautete:
5"-GGC TTC ATC GTT ATT X ATG ACC TGG TGG ATA CCG-3" wobei X in der Position 16 sein kann:
8-Oxoguanin oder Os-Ethylguanin oder Guanin. Als Base an Position 16 enthielt das erste Oligonukleotid also das Oxidationsprodukt 8-Oxoguanin, das zweite das Alkylierungsprodukt Oδ-Ethylguanin und das dritte die natürliche Base Guanin. Das dritte Oligonukleotid diente als Kontrolle. Außerdem wurde der komplementäre DNS-Gegenstrang synthetisiert, der ausschließlich aus den vier natürlichen Basen bestand und der um zwei Basen über das 3 ' -Ende der modifizierten Oligonukleotide hinausragte. Gegenüber X befand sich C. Dies ermöglichte den enzymatischen Einbau von biotinyliertem dUTP oder fluoreszenzmarkierten Nukleotiden am
2 3 ' -Ende der modifizierten Oligonukleotide bzw. des Kontroll- Oligonukleotids .
Die Oligonukleotide wurden nach dem Phosphoramidit-Verfahren vollautomatisch hergestellt. Wie üblich, erfolgte die Synthese vom 3 ' -Ende her an Festphasen (CPG) . Nach der Abtrennung vom Trägermaterial und der Abspaltung der Schutzgruppen (0,25 M 2 -Mercaptoäthanol in konz. Ammoniak, 55°C, 20 Std.) wurden die Oligonukleotide durch Gelfiltration vom Ammoniak befreit und anschließend durch präparative Polyacrylamid-Gelelektrophorese oder HPLC gereinigt . Nach einem weiteren Reinigungsschritt wurden die Oligonukleotide lyophilisiert und bei -20°C aufbewahrt.
Herstellung doppeisträngiger (ds) Substrate:
In bidest. Wasser gelöste Oligonukleotide (100 pMol DNS-Moleküle/ml) wurden mit der 1,2 -fachen Menge des komplementären DNS-Stranges (120 pMol/ml) versetzt. Die Proben wurden in einem Wasserbad 5 min bei 90°C erhitzt; die Verschmelzung der einzelsträngigen Moleküle zu doppelsträngigen (ds) Oligonukleotiden erfolgte während der mehrstündigen Abkühlungsphase des Wasserbades auf Raumtemperatur.
Herstellung aktiver Mikrotiterplatten:
Für die Tests wurden Mikrotiterplatten (MP) verwendet, deren Vertiefungen flache Böden und NH2-Gruppen an der Oberfläche (10 nMol NH2-Gruppen/Well) enthielten. In die Vertiefungen der MP wurden jeweils 25 μl einer Lösung aus Quadratsäurediethylester (0,1 mM) und Triethylamin (0,01 M) in Methanol (> 99%) pipettiert. Die MP wurden abgedeckt und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Entfernung der Lösung wurden die Vertiefungen mit Methanol gewaschen und getrocknet .
EGEL 26 Kovalente Bindung von ds-Oligonukleotiden an aktivierte MP:
Zur Kopplung der ds-Oligonukleotide an die Oberfläche der aktivierten MP-Vertiefungen wurden jeweils 10 μl der DNS- Lösungen (50 pMol 8-OxoGua-ds-Oligonukleotide/ml, 2,5 pMol 06- EtGua-ds-Oligonukleotide/ml) in 50 mM wäßriger Natriumboratlδsung, pH 9,5 in die Vertiefungen pipettiert und die MP abgedeckt. Nach 20 Minuten bei Raumtemperatur wurden die DNS-Lösungen entfernt und die Vertiefungen mit bidest. Wasser gewaschen.
Die restlichen reaktiven Gruppen der Quadratsäure wurden mit 30 μl einer wäßrigen Ethanolaminlösung (100 mM, pH 8,5) inaktiviert. Nach 10 Minuten wurden die MP-Vertiefungen mit bidest . Wasser gewaschen und getrocknet .
Beispiel A:
Entfernung von 8-Oxodesoxyguanosin aus ds-Oligonukleotiden.
Art der Reparatur:
Die meisten DNS-Modifikationen, postreplikativen Basenfehlpaarungen und Apurin- oder Apyrimidinstellen werden durch Exzisionsreparatur (ein enzymatischer Prozeß) aus der DNS entfernt. Das DNS-Oxidationsprodukt 8-Oxoguanin (8- OxoGua) wird nach dem gleichen mechanistischen Prinzip repariert . Beim Menschen gibt es mindestens zwei verschiedene ReparaturSysteme, die diese Basen-Modifikation aus der DNS eliminieren. Bei der Maus wurde nur eines der beiden Reparatursysteme nachgewiesen.
Unabhängig vom Mechanismus der 8 -OxoGua-Exzision entsteht in der DNS intermediär eine Lücke von der Größe eines Nukleotids .
EGEL 26 Praktische Durchführung des Tests:
Für den Test wurden MP verwendet, in deren Vertiefungen mit flachen Böden ds-Oligonukleotide (30 x 10"15 Mol dsDNS- Moleküle/Vertiefung) immobilisiert waren, die an der Position 16 das Oxidationsprodukt 8-OxoGua und an den Positionen 35 und 36 biotinyliertes Uracil enthielten.
Der zu untersuchende Zellextrakt wurde aus Mausmyelom-Zellen der Zeil-Linie P3-X63-Ag hergestellt. Dazu wurden die Zellen zweimal in eiskalter PBS gewaschen und in einer Konzentration von 5 x 107 Zellen/ml in Puffergemisch A (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 100 mM KCl, 0,1 % BSA) resuspendiert. Die Zellen wurden durch Ultraschallbehandlung desintegriert, und die festen Bestandteile wurden durch
Zentrifugation (10 000 g, 4°C, 10 min) enfernt. Der klare
Überstand wurde in Portionen bei -80°C aufbewahrt.
In zehn Vertiefungen einer MP wurden 25 μl einer Lösung pipettiert, die das Puffergemisch A und den Proteinextrakt von 6xl05 Mausmyelom-Zellen enthielt (Probenfeld) .
In vier Felder wurden 25 μl des gleichen Puffers, aber ohne Proteinextrakt , pipettiert (Kontrollfeld) . Die MP wurde bei
37°C inkubiert.
Nach 5, 30, 60, 90 und 120 Minuten wurde die Reaktion durch die Zugabe von 1 μl Proteinase K (1 mg/ml) in jeweils zwei Vertiefungen pro Zeitpunkt gestoppt. In die Vertiefungen des Kontrollfeldes wurden nach 120 Minuten ebenfalls 1 μl Proteinase K zugegeben. Die MP wurde 5 Minuten lang auf 90°C erwärmt und anschließend schnell in einem Eis-Wasser-Gemisch abgekühlt. Die Lösungen wurden aus den Vertiefungen entfernt und die Vertiefungen dreimal mit 30 μl des Puffers B (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,1 % BSA) gewaschen.
EGEL 26 Nach der Zugabe von 25 μl einer Lösung, die ein Streptavidin- Cy3-Konjugat (2,5 μg/ml ,- bezogen von der Fa. Sigma) in Puffer
B enthielt, wurde die MP 45 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach der Abnahme der Lösung wurden die Vertiefungen der MP dreimal mit Puffer B gespült und abschließend mit 25 μl des gleichen Puffers versetzt.
Die Intensität des Fluoreszenzfarbstoffs in den einzelnen Vertiefungen wurde mit einem Bildanalysegerät bestehend aus einem Fluoreszenzmikroskop, einer CCD-Kamera und einem computergestützten Analyseprogramm quantitativ bestimmt. Alternativ kann ein empfindliches UV-ELISA-Leseger t zur Messung der Fluoreszenzintensitäten verwendet werden.
Die Berechnung der Proben erfolgte nach der Formel
R = M (1 - P/Ko) wobei
R die Menge der reparierten 8-OxoGuanin-Moleküle in fMol (10"1S Mol) ,
M die Gesamtmenge der 8-OxoGuanin-Moleküle in jeder MP- Vertiefung,
Ko die Fluoreszenzintensität in den Vertiefungen des Kontrollfeldes und p die Fluoreszenzintensität in den Vertiefungen des Probenfeldes ist.
In Abbildung 1 ist die 8-OxoGuanin-Reparatur durch einen definierten Zellextrakt (Extrakt von 6 x 10s Zellen einer Mausmyelom-Zellinie) als Funktion der Inkubationszeit dargestellt . Aus der AnfangsSteigung der Kurve läßt sich berechnen, wieviele 8-OxoGuanin-Moleküle pro Stunde maximal aus den Oligonukleotiden unter Standardbedingungen (Gesamtmenga an 8-Oxoguanin, 30 fMol; Extrakt von 6 x 105 Zellen) entfernt werden. In dem vorliegenden Fall waren es 13,7 f ol/h.
EGE 26 Beispiel B :
Dealkylierung von 06-Ethylguanin in ds-Oligonukleotiden.
Art der Reparatur:
Das durch alkylierende Kanzerogene gebildete Os-Ethylguanin (06-EtGua) wird durch eine 06-Alkylguanin-DNS-Alkyltransferase (AT) in einem Schritt repariert . Dabei überträgt die AT eine Alkylgruppe von der 06-Position des Guanins auf ein Cystein im aktiven Zentrum des Proteins. Durch die Übernahme der Alkylgruppe wird die AT inaktiviert . Jedes AT-Molekül kann somit immer nur ein Os-EtGua-Molekül reparieren. Die Reparatur erfolgt demnach in einer bimolekularen Reaktion.
Die Reparatur kann mit Hilfe von Antikörpern gegen Os- Ethyldesoxyguanosin untersucht werden. Es können monoklonale oder polyklonale Antikörper eingesetzt werden. Monoklonale Antikörper können beispielsweise wie folgt hergestellt werden:
Zunächst erfolgt die Synthese von Os-Ethylriboguanosin und die Kopplung des Alkylierungsproduktes an KLH (keyhole limpet haemocyanin) nach der Beschreibung von R. Müller und M.F. Rajewsky (Z. Naturforsch., 33c, 897-901, 1978). Zur Herstellung von Antikörpern wird das Antigen BALB/c Mäusen über einen Zeitraum von drei Monaten fünfmal i.p. injiziert. Milzzellen der immunisierten Mäuse werden mit Myelomzellen (P3-X63-Ag8) fusioniert. Die so erhaltenen Hybridome werden auf Mikrotiterplatten ausgesät, die Peritonealmakrophagen von BALB/c Mäusen enthalten. Hybridomzellen, die Antikörper gegen Os-Ethyldesoxyguanosin produzieren, werden rekloniert und in Kultur genommen. Die Antikörper werden in zwei Reinigungsschritten von anderen Proteinen abgetrennt (Ammoniumsulfat- fällung, 50 % Sättigung, und Ionenaustauschchromatographie mit DE-52 Säulenmaterial) . Die gereinigten Antikörper werden
6 konzentriert und in Portionen bei -80°C aufbewahrt.
Praktische Durchführung des Tests:
Für den Test wurden MP verwendet, in deren Vertiefungen ds- Oligonukleotide (1,2 x 10"15 Mol dsDNS-Moleküle/Vertiefung) immobilisiert waren, die an der Position 16 ein 06-EtGua enthielten. Die 3 ' -Enden wurden nicht aufgefüllt. In einem Teil der Vertiefungen waren ds-Oligonukleotide immobilisiert, die an der Position 16 lediglich ein Guanin enthielten (Kontrollfeld 2) .
Der zu untersuchende Zellextrakt wurde hergestellt, indem L929 Mausfibroblasten nach Behandlung mit Trypsin-EDTA einmal in Kulturmedium (DMEM, supplementiert mit 10 % fötalem Kälberserum) und zweimal in eiskalter PBS gewaschen wurden. Die Zellen wurden dann in Extraktionspuffer (500 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 1 mM Dithiothreit , 1 M EDTA und 5 % Glyzerin) in einer Konzentration von 6xl07 Zellen/ml resuspendiert und durch Ultraschallbehandlung desintegriert . Die unlöslichen Bestandteile wurden durch Zentrifugation entfernt (10 000 g, 4°C, 10 min) , und der klare Überstand wurde in Portionen bei -80°C aufbewahrt.
In 14 Vertiefungen einer MP wurden 50 μl einer Lösung pipettiert, die einen Reaktionspuffer (50 mM HEPES, pH 7,8, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 5% Glyzerin und 0,05 % Triton X-100) und 3 μg Proteinextrakt aus L929 Mausfibroblasten enthielt (Probenfeld) .
In vier Felder wurden 25 μl des Reaktionspuffers ohne Proteinextrakt pipettiert (Kontrollfeld 1) . In vier Vertiefungen des Kontrollfeldes 2, das unmodifizierte ds- Oligonukleotide zur Bestimmung der unspezifischen Bindung der Antikörper enthielt, wurde Reaktionspuffer und Proteinextrakt pipettiert . Nach 5, 10, 15, 20, 30, 45, 60 Minuten wurde die Reaktion durch die Zugabe von 1 μl Proteinase K (1 mg/ml) in jeweils zwei Vertiefungen pro Zeitpunkt gestoppt . In die Vertiefung der Kontrollfelder 1 und 2 wurde nach 60 Minuten ebenfalls 1 μl Proteinase K zugegeben.
Nach weiteren 15 Minuten bei 37°C wurden die Lösungen aus den Vertiefungen entfernt und die Vertiefungen dreimal mit 30 μl Puffer C (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA und 0,1 % BSA) gewasche .
In die Vertiefungen wurden dann jeweils 15 μl einer Lösung pipettiert, die 2 μg eines anti- (06-EtGua) -Antikörpers in Puffer C enthielten. Nach 45 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Antikörperlösung entfernt. Anschließend wurden die Vertiefungen zur Entfernung ungebundener Antikörper-Moleküle dreimal mit Puffer C gewaschen.
Zum Nachweis der spezifisch gebundenen Antikörper-Moleküle wurden 20 μl TRITC-markierte anti- (IgG) F (ab) 2-Fragmente in Puffer C (5 μg/ml) in die Vertiefungen gegeben. Nach 45 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Antikörperlösung entfernt. Ungebundener Antikörper wurde durch dreimaliges Waschen mit 25 μl Puffer C entfernt. Abschließend wurden 25 μl Puffer C in die Vertiefungen pipettiert. Die Bestimmung der Fluoreszenzintensität in den einzelnen Vertiefungen erfolgte wie zuvor.
Die Berechnung der einzelnen Probenwerte erfolgte nach der Formel
R = M (1- (P-K2) / (K1-K2) ) wobei
R die Menge der reparierten O6- EtGua -Moleküle in fMol
(10~15 Mol) , M die Gesamtmenge der 0s-EtGua-Moleküle in j eder
LAπ REGEL 26 Vertiefung in fMol,
Ki die gesamte Fluoreszenzintensität in den Vertiefungen ohne Proteinextrakt,
K2 die Fluoreszenzintensität für die unspezifische
Antikörperbindung,
P die Fluoreszenzintensität in den Vertiefungen des
Probenfeldes .
In Abbildung 2 ist die Reparatur von Os-EtGua durch einen definierten Zellextrakt (3 μg Proteinextrakt aus L929 Mausfibroblasten) als Funktion der Zeit dargestellt. Da die Reparatur von Oδ-EtGua in einer bimolekularen Reaktion (Reaktion zweiter Ordnung) erfolgt, läßt sich die Konzentration der AT-Moleküle (AT) im Testansatz und die Geschwindigkeitskonstante K der Reparaturreaktion nach der Formel
K x t = l/(Ao-B0) In (B0(Ao-P) / A0(B0-P))
berechnen, wobei die Ausdrücke A0, B0 und P der initialen Konzentration der O6- EtGua-Moleküle (Ao) , der AT-Moleküle (B0) und der Konzentration der dealkylierten Os-EtGua-Moleküle (P) zum Zeitpunkt t der Reparaturreaktion entsprechen. Für die Berechnung von AT und K wurde ein Computerprogramm entwickelt. Demnach enthielt der Zellextrakt 0,7 fMol AT- Moleküle, und K betrug 4 x 107 1/Mol x sec. Literatur:
Castaing, B., Geiger, A. , Seliger, H. , Nehls, P., Laval, J. , Zelwer, C. und Boiteux, S. (1993) Nucleic Acids Res. 21, 2899-2905.
Dizdaroglu M. (1985) Biochemistry 24, 4476-4481.
Floyd, R.A. , Watson, J.J., Harris, J. und Wong, P.K. (1986) Biochem. Biophys. Res. Commun. 137, 841-846.
Foote, R.S., Pal, B.C. und Mitra, S. (1983) Mutat . Res. 119, 221-228.
Nehls, P., Rajewsky, M.F., Spiess, E. und Werner, D. (1984a) EMBO J. 3, 327-332.
Nehls, P., Adamkiewicz, J. und Rajewsky, M.F. (1984b) J. Cancer Res. Clin. Oncol. 108, 23-29.
Nehls, P. und Rajewsky, M.F. (1990) Carcinogenesis 11, 81-87.
Nehls, P., Seiler, F., Renn, B., Greferath, R. und Bruch, J. (1997) Environ. Health Perspect . , 105 (Suppl. 5) 1291-1296.
Ostling, 0. und Johanson, K.J. (1984) Biochem. Biophys. Res. Commun. 123, 291-298.
Pegg, A.E., Wiest, L., Foote, R.S., Mitra, S. und Perry, W. (1983) J. Biol. Chem. 258, 2327-2333.
Waldstein E.A., Cao, E.-H. und Setlow, R.B. (1982) Anal. Biochem. 126, 268-272.
6

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Untersuchung der Reparatur von DNS- Modifikationen und Basenfehlpaarungen sowie Apurin- und Apyrimidinstellen durch DNS-Reparaturenzyme, das folgende Schritte umfaßt :
(a) Bereitstellung von einzelsträngigen oder doppelsträngigen DNS-Molekülen, die über eine am 5 ' -Ende oder am 3 ' -Ende der DNS oder an der 2 ' -Position zumindest eines Desoxy- ribosylrestes innerhalb des DNS-Moleküls eingebrachte primäre oder sekundäre Aminogruppe mit einer primäre oder sekundäre Aminogruppen tragenden Festphasenmatrix durch Umsetzung mit einem reaktiven Quadratsaurederivat kovalent gekoppelt wurden und die Modifikationen und/oder Basenfehlpaarungen und/oder Apurin- oder Apyrimidinstellen aufweisen;
(b) Inkontaktbringen der DNS-Moleküle mit einer DNS-Reparaturenzyme enthaltenden Zusammensetzung;
(c) Bestimmung der Eliminierung der DNS-Modifikationen und/oder Basenfehlpaarungen und/oder Apurin- oder Apyrimidinstellen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem reaktiven Quadratsäurederivat um einen Quadratsäurediester, insbesondere Quadratsäurediethylester, handelt.
3. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Eliminierung der DNS-Modifikationen und/oder Basenfehlpaarungen und/oder Apurin- oder Apyrimidinstellen aus den an die Festphasenmatrix gekoppelten DNS-Molekülen mit Hilfe von Antikörpern gegen die Modifikationen und/oder Basenfehlpaarungen und/oder Apurin- oder Apyrimidinstellen und/oder Derivate von Apurin- oder Apyrimidinstellen oder entsprechenden Antikörperfragmenten bestimmt wird.
EGEL 26
4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Eliminierung der DNS-Modifikationen und/oder Basenfehlpaarungen und/oder Apurin- oder Apyrimidinstellen aus den an die Festphasenmatrix gekoppelten DNS-Molekülen durch Exzisionsreparatur bestimmt wird, indem der Verlust eines DNS-Abschnitts nachgewiesen wird, der nach Exzision der Modifikationen und/oder Basenfehlpaarungen und/oder Apurin- oder Apyrimidinstellen nicht mehr mit der Festphasenmatrix verbunden ist .
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der DNS-Abschnitt , der durch Exzisionsreparatur verlorengeht, Markierungen, wie farbgebende Moleküle, fluoreszierende Moleküle, radioaktive Atome, oder Markierungen bindende Gruppen enthält.
6. Verfahren nach Anspruch 5 , wobei die Markierungen oder die Markierungen bindenden Gruppen nach Kopplung der DNS- Moleküle mit der Festphasenmatrix eingebracht werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei verschiedene Modifikationen oder Basenfehlpaarungen oder Apurin- oder Apyrimidinstellen aufweisende DNS-Moleküle jeweils mit verschiedenen Markierungen oder Markierungen bindenden Gruppen versehen sind, um eine gleichzeitige Untersuchung der Reparatur verschiedener DNS-Modifikationen oder Basenfehlpaarungen oder Apurin- oder Apyrimidinstellen zu ermöglichen.
8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei Modifikationen in die DNS-Moleküle eingebracht werden, indem man ein modifizierendes Agens auf die an die Festphasenmatrix gekoppelten DNS-Moleküle einwirken läßt.
9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Reparaturkapazität der Reparaturenzyme enthaltenden Zusammensetzung für eine oder mehrere DNS-Modifikationen oder Basenfehlpaarungen oder Apurin- oder Apyrimidinstellen bestimmt wird.
26
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Reparaturenzyme enthaltende Zusammensetzung aus Zellen oder Gewebeproben gewonnen wird und die Reparaturkapazität herangezogen wird, um die individuelle Tumorsuszeptibilitat, die individuelle Strahlenempfindlichkeit oder die individuelle Empfindlichkeit gegenüber einer genotoxischen Chemotherapie oder die Resistenz von Tumorzellen gegenüber Strahlen oder Chemotherapeutika festzustellen.
11. Testkit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorstehenden Ansprüche, umfassend:
(a) eine Festphasenmatrix, die primäre oder sekundäre Aminogruppen trägt;
(b) DNS-Moleküle, die eine am 5 ' -Ende oder am 3 ' -Ende der DNS oder an der 2 ' -Position zumindest eines Desoxyribo- sylrestes innerhalb des DNS-Moleküls eingebrachte primäre oder sekundäre Aminogruppe aufweisen und die eine Markierung bindende Gruppe enthalten;
(c) ggf- Antikörper oder Antikörperfragmente gegen eine DNS- Modifikation oder eine Basenfehlpaarung oder eine Apurin- oder Apyrimidinstelle oder ein Derivat einer Apurin- oder Apyrimidinstelle ,-
(d) ein reaktives Quadratsaurederivat .
12. Testkit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorstehenden Ansprüche, umfassend:
(a) einzelsträngige oder doppelsträngige DNS-Moleküle, die über eine am 5 ' -Ende oder am 3 ' -Ende der DNS oder an der 2 ' - Position zumindest eines Desoxyribosylrestes innerhalb des DNS-Moleküls eingebrachte primäre oder sekundäre Aminogruppe mit einer primäre oder sekundäre Aminogruppen tragenden Festphasenmatrix durch Umsetzung mit einem reaktiven Quadra saurederivat kovalent gekoppelt wurden, die Modifikationen und/oder Basenfehlpaarungen und/oder Apurin- oder Apyrimidinstellen aufweisen können und die eine Markierung oder eine Markierungen bindende Gruppe tragen können;
(b) wahlweise Antikörper oder Antikörperfragmente, die spezifisch gegen eine DNS-Modifikation oder eine Basenfehlpaarung oder eine Apurin- oder Apyrimidinstelle oder ein Derivat einer Apurin- oder Apyrimidinstelle gerichtet sind.
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2809417B1 (fr) * 2000-05-24 2004-07-30 Commissariat Energie Atomique Detection et caracterisation de l'activite de proteines impliquees dans la reparation de lesions de l'adn
WO2002065889A1 (de) * 2001-02-21 2002-08-29 Rubikon Ag Verfahren zur untersuchung von zell- und gewebeproben
WO2002101095A1 (en) * 2001-06-08 2002-12-19 U.S. Genomics, Inc. Methods and products for analyzing nucleic acids using nick translation
US7241883B2 (en) * 2001-11-14 2007-07-10 Luminex Corporation Functionalized compositions for improved immobilization
FR2849058B1 (fr) 2002-12-20 2005-02-25 Commissariat Energie Atomique Procede d'evaluation quantitative des capacites globales et specifiques de reparation de l'adn d'au moins un milieu biologique, ainsi que ses applications
FR2887261B1 (fr) * 2005-06-20 2007-09-14 Commissariat Energie Atomique Procede d'immobilisation de l'adn superenroule et utilisation pour analyser la reparation de l'adn
CN102031285B (zh) * 2009-09-28 2016-12-21 复旦大学 一种基于双核微核的dna修复能力检测方法
CN114507722A (zh) * 2020-11-16 2022-05-17 深圳市真迈生物科技有限公司 化合物修饰的芯片及其制备方法和应用
WO2022184907A1 (en) * 2021-03-04 2022-09-09 Lxrepair Multiplex quantitative assay for dna double-strand break repair activities in a biological medium and its applications

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4341524C2 (de) * 1993-12-06 1997-01-16 Gluesenkamp Karl Heinz Dr Verfahren zur Immobilisierung von Biomolekülen und Affinitätsliganden an polymere Träger
FR2731711B1 (fr) * 1995-03-15 1997-06-06 Rech Investissements Sfri Soc Procede de detection qualitative et quantitative de lesions de l'adn
DE19624990A1 (de) * 1996-06-22 1998-01-08 Gluesenkamp Karl Heinz Dr Verfahren zur chemischen kontrollierten Modifizierung von Oberflächen sowie von Acyl- und/oder Hydroxyl-Gruppen tragenden Polymeren

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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