CN1325456A - 分析dna修复的方法和测定试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种分析通过DNA修复酶修复DNA修饰和如无嘌呤位点和无嘧啶位点的碱基错配的方法和测定试剂盒。按照所述方法,使通过与反应性方形酸反应共价偶联到固相基质上的DNA分子与含有DNA修复酶的组合物接触。该测定试剂盒含有所述分析需要的这些组分。
Description
本发明涉及一种分析通过DNA修复酶修复DNA修饰和碱基错配以及无嘌呤或无嘧啶位点的方法和测定试剂盒。因此,例如可以测定修复酶的修复能力,并由此测定从中回收用于本方法并含有修复酶的组合物的细胞或组织的修复能力。该修复能力例如与导致癌症发展的过程有关,但是在各种形式的癌症疗法中也是重要的。
A.前言
由于在细胞中与癌症相关的基因(原癌基因和抑癌基因)的突变逐渐积累,因此癌症发展分几个阶段。就突变的形成而言,例如存在于环境、食品、化妆品、药品和车间中的致癌因子(紫外线、电离辐射、粉尘、重金属和许多化学致癌物)起着很大作用,但是也可以内源地形成(例如,亚硝胺、反应性氮和氧化合物)。
尽管它们的物理和化学性质不同,但是所有致癌物的作用原理相同。它们与DNA的单个组分反应,并因此改变其结构和性质。
然而,在没有致癌物的影响下也可以发生DNA组分的改变。通过热水解DNA中的化学键可以获得这些结构变化。它们首先包括在碱基--胞嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤中的氨基被羟基替换(脱氨基),和(特别是)DNA的嘌呤碱基--鸟嘌呤和腺嘌呤与脱氧核糖部分之间的N-糖苷键的水解裂解(脱嘌呤)。
在DNA复制过程中,当太少或太多的核苷酸和/或错误核苷酸加入新合成的DNA链时可能发生碱基错配。后者发生时四个DNA碱基以其罕见的互变异构形式存在。例如,胞嘧啶为罕见的互变异构形式时,它与腺嘌呤形成碱基对,而不与鸟嘌呤形成碱基对,鸟嘌呤为罕见的互变异构形式时,它与胸腺嘧啶形成碱基对,而不与胞嘧啶形成碱基对,等等。如果这些或其它可能的碱基错配不及时修复的话,在另一轮复制之后,在基因组DNA中获得转换突变(例如C-G变为T-A,或者T-A变为C-G)。然后这些转换突变总是传递给子细胞。结构修饰可以产生各种可能的突变(转换、颠换、缺失、插入等)。在基因组中获得的突变类型和分布型经常具有致癌物的特征,它引起获得的结构修饰。在与癌症相关的基因(原癌基因、抑癌基因)中连续积累突变将最终导致细胞的恶性表型的表达。
然而,破坏DNA的试剂的影响可以直接导致相关细胞死亡。这在例如通过放射疗法或基因毒性化学治疗剂治疗肿瘤疾病中非常重要。
为了保护细胞,细胞具有许多有效的防御机制。这些机制一方面包括酶(例如谷胱甘肽合成酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶)和低分子量物质(例如半胱氨酸、谷胱甘肽、黄素和维生素C、E),另一方面包括特异性修复系统,该系统识别DNA修饰并从DNA中酶促除去这些修饰。然而,防御机制的有效性在不同个体之间以及相同个体内的不同细胞类型之间差异很大。它们的效率决定了个体对致癌因子的肿瘤敏感性。本发明特别涉及测定修复系统的活性(即修复能力)以及这些活性测定的应用。
B.现有技术
为了测定人细胞或组织对各种致癌-DNA修饰的修复能力,有许多方法可以使用。现将最常用的方法列于下。原则上,它们可以分成两种不同类型的方法。
Ⅰ.一种方法基于在体内用某种致癌物处理来自体内的细胞。然后测定产生致癌物的DNA修饰从细胞的DNA中酶促除去的速率。为此,在致癌物处理剩余量的相应DNA修饰之后的不同时间分析细胞的DNA。由此获得的数据用于计算细胞的修复能力。
Ⅰ.Ⅰ.为了测定所限定的DNA修饰的量,将该DNA从相应细胞样品中分离并分析DNA修饰的含量。可以对这些DNA修饰在个体DNA样品中的量进行定量:
a)在根据免疫-狭线印迹法使用所限定的DNA修饰的抗体的完整DNA分子中(Nehls等人,1984b)。
b)个体脱氧核糖核苷酸中的DNA酶促水解
·通过使用所限定的DNA修饰的抗体的竞争性放射免疫测定法(Nehls等人,1984a),
·通过用HPLC设备分离脱氧核糖核苷酸混合物的电化学检测器系统(Floyd等人,1986),
·通过气相色谱法分离脱氧核糖核苷酸混合物的质谱法(Dizdaroglu等人,1985)。
Ⅰ.Ⅱ.另一方面,已开发出可以直接在个体细胞中测定DNA修饰的方法。这些方法包括:
a)免疫细胞学测定法(Nehls等人,1997),和
b)Comet测定法(Ostling和Johnson,1984)。
Ⅱ.另一种类型的方法在于用含有所限定的DNA修饰(合成DNA分子)或者已用某些致癌物处理过的DNA分子培养细胞和组织的蛋白提取物。然后测定从所述DNA分子中除去相应DNA修饰的速率。这可以用以下方法实现:
Ⅱ.Ⅰ.用“DNA切口测定法(Castaing等人,1993)。
该方法用于证实通过酶切除从DNA中剔除DNA修饰。通过最特异性作用的核酸内切酶以一步或者通过识别和剔除某些修饰碱基的DNA糖基化酶以及从DNA中切除剩余无嘌呤和/或无嘧啶位点的AP核酸内切酶以两步切除DNA修饰。在这两种情况下,在DNA修饰的位点存在DNA切口,这些切口导致最初的DNA分子缩短。在该测定中,主要使用了一定长度的合成、放射性标记的DNA分子,该DNA分子在预定位置含有所限定的DNA修饰。通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离不同长度的DNA分子进行仍然完整的DNA分子和缩短的DNA分子的定量测定。
Ⅱ.Ⅱ.用滤膜结合试验(Nehls和Rajewsky,1990)。
该方法基于观测DNA-抗体复合体可以固定在硝基纤维素滤膜上,而无蛋白质的DNA不能保留。该方法的原理在于测定仍然能够结合抗体的DNA分子的量。为此,将每个DNA分子(理想地)含有一个DNA修饰的DNA用蛋白提取物培养,在不同反应时间之后与特异性结合抗体混合,并通过硝基纤维素滤膜过滤。由滤膜结合的DNA-抗体复合体的量减少的速率,可以测定细胞类型或组织对可以获得抗体的所限定的DNA修饰的修复能力。
Ⅱ.Ⅲ.通过切除修复剔除大多数DNA修饰。一个例外是通过烷基化致癌物(例如,O6-烷基鸟嘌呤、O4-甲基胸腺嘧啶)产生的某些DNA修饰。这些烷基化产物可以通过使烷基从DNA碱基传送至本身然后失活的酶(O6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶;AT)修复。在细胞和组织中定量测定该修复酶的重要方法列于下。
a)滤膜结合试验(参见Ⅱ.Ⅱ.)。
b)常用试验的原理在于在加入细胞和组织提取物之前和之后的不同时间测定用[3H]-标记的烷基化剂处理的DNA中放射性标记的O6-烷基鸟嘌呤的量。烷基化DNA经酸水解之后,通过色谱法(HPLC,SephadexG-10)将释放的嘌呤分离,测定含有O6-烷基鸟嘌呤的级分中的放射性(Foote等人,1983)。
c)另一常用方法基于这样的认识:烷基共价地转移到AT的胞嘧啶残基上。[3H]-烷基-DNA用蛋白提取物培养之后,通过测定提取物中蛋白组分的放射性来测定转移到AT上的烷基量。或者,测定保留在DNA中的放射性的量,并通过水解蛋白质测定形成的[3H]-烷基胞嘧啶分子的量(Pegg等人,1983;Waldstein等人,1982)。
Ⅲ.从WO 96/28571中得知一种测定DNA损伤的方法,其中通过将DNA吸附到聚阳离子上将其固定在支持体上。在该方法中,使包含具有修复活性和标记核苷酸的细胞提取物的组合物作用于具有损伤的吸附DNA上。然后证明修复时加入的标记核苷酸。
Ⅳ.从现有技术中已知有共价偶联生物分子于固体支持体上的方法,但是与分析DNA损伤的修复无关。
例如,从DE-A-4341524中已知一种使用方形酸衍生物将生物分子和亲和配体固定于聚合支持体上的方法。DE-C-4499550描述了使用方形酸衍生物的偶联反应,并提到了使生物分子共价连接到基质上的可能性。从DE-A-19624990中已知一种化学地控制修饰表面以及载有酰基和/或羟基的聚合物的方法。
特别是从现有技术中已知的测定修复能力的上述方法实施起来耗时、耗费人力且成本高。在一些方法中还存在加工过程中样品材料损失的问题。
本发明的目的是提供一种分析通过DNA修复酶修复DNA修饰、碱基错配以及无嘌呤和无嘧啶位点的方法。特别地,本方法实施时应简单、效率高且不昂贵,并避免上述缺陷。
根据本发明,由于提供了一种包括以下步骤的修复DNA修饰和碱基错配以及无嘌呤和无嘧啶位点的分析方法,因此本目的得以实现:
(a)提供单链或双链DNA分子,该DNA分子通过与反应性方形酸衍生物反应经在该DNA的5’-端或3’-端或至少一个脱氧核糖残基的2’-位置加入该DNA分子的伯或仲氨基共价偶联到载有伯或仲氨基的固相基质上,并具有修饰和/或碱基错配和/或无嘌呤或无嘧啶位点;
(b)使该DNA分子与含有DNA修复酶的组合物接触;
(c)测定DNA修饰和/或碱基错配和/或无嘌呤或无嘧啶位点的剔除。
本发明还提供了包含实施本发明方法所需组分的测定试剂盒。
从以下的说明、实施方案以及所附的权利要求书可以得知本发明的优选方面。
C.发明简述
本发明的原理在于使修复酶作用于DNA分子,该DNA分子共价地与固体支持体结合,并具有修饰和/或碱基错配和/或无嘌呤或无嘧啶位点(损伤),并观测该修饰和/或碱基错配和/或无嘌呤或无嘧啶位点的剔除。通过反应性方形酸衍生物进行DNA分子与支持体的共价连接。定性或定量测定该修饰和/或碱基错配和/或无嘌呤或无嘧啶位点的剔除的便利方法是使用该修饰和/或碱基错配和/或无嘌呤或无嘧啶位点的特异性抗体或抗体片段(或者在无嘌呤或无嘧啶位点的情况下也使用这些位点衍生物的特异性抗体或抗体片段)。测定这些特异性抗体的结合含量。当通过切除进行修复时,还可以通过观测适当加入的标记的失去进行定性或定量检测;由此已将该标记(或标记结合区)加入经切除不再与载体相连的DNA片段中。可以测定释放的标记量和/或保持连接的标记量。
通过本发明的方法,例如可以分析含有修复酶的组合物对预定DNA修饰或或碱基错配或无嘌呤或无嘧啶位点的修复能力。然而,另一方面,使用所限定的修复酶可以检测DNA修饰或碱基错配或无嘌呤或无嘧啶位点。而且,通过分析因试剂的影响(例如通过特异性作用的修复蛋白)引起的修饰以及其修复可以检验试剂对DNA的影响。因此可以对试剂的DNA损伤潜能进行陈述。最后,还可以分析反应条件,特别是反应物对修复过程的影响。
修复能力一般指明剔除DNA修饰或碱基错配或无嘌呤或无嘧啶位点期间的活性。特别地,修复能力在本文中应理解为对DNA修饰或碱基错配或无嘌呤或无嘧啶位点在样品中含量的减少的度量。在实施例中解释了定量分析,并且这里显示的数学关系通常可用于各类分析方法。
D.优选实施方案的详细说明
除了别的以外,本发明还涉及一种可以快速且精确地测定细胞或组织酶促修复所限定的DNA结构的修饰(也称之为DNA修饰、DNA损伤或DNA加合物)和DNA错配的能力的方法。而且,当使用所限定的DNA修复酶时,可以分析DNA结构修饰和碱基错配的性质。因此,本发明还提供了一种通过含有DNA修复酶的组合物(特别是溶液)测定DNA结构修饰、碱基错配和无嘌呤或无嘧啶位点的修复能力的方法,该方法还可用于检测DNA结构的修饰、碱基错配和无嘌呤或无嘧啶位点本身,包括下列步骤:
(a)单链或双链DNA分子或DNA类似物,它们经过修饰以便在DNA分子内部在DNA5’-端或3’-端或在至少一个脱氧核糖残基的2’-位置上载有伯或仲氨基,并且它们可以具有DNA结构修饰和/或碱基错配和/或无嘌呤或无嘧啶位点,经过载有伯或仲氨基的固相基质与方形酸酯反应而共价偶联到该基质上;
(b)使与固相基质结合的该DNA分子与含有修复酶的溶液接触;
(c)借助溶液中存在的修复酶定性和/或定量测定可能的结构修饰和/或碱基错配和/或无嘌呤或无嘧啶位点的修复。
在测定结构修饰和/或碱基错配和/或无嘌呤或无嘧啶位点时,使用能够修复特异性结构修饰和/或碱基错配和/或无嘌呤或无嘧啶位点的所限定的修复酶。
在相同个体内的不同细胞类型中以及不同个体中的修复能力会有很大的变化。
因此,下面参数是很重要的:
·个体肿瘤易感性,
·肿瘤患者对放射疗法或基因毒性化学疗法的敏感性,
·肿瘤细胞对放射疗法或基因毒性化学疗法的耐性。
个体肿瘤易感性与个体细胞修复DNA修饰和/或碱基错配和/或无嘌呤或无嘧啶位点的能力有关。通过本发明方法,使从细胞或组织样品中适当获得的组合物作用于具有修饰或碱基错配和/或无嘌呤或无嘧啶位点的DNA,并证明其剔除,可以测定个体的修复状态及因此的肿瘤易感性。当已知某种致癌物引起某类修饰和/或碱基错配和/或无嘌呤或无嘧啶位点时,可以在这方面测定修复状态,并由此可以建立该致癌物的肿瘤易感性。
就例如癌症的放射疗法而言,测定个体的放射敏感性非常重要,由于对肿瘤附近的健康的放射敏感性组织的损伤,甚至造成约2%的永久性损伤,因此约30%的该患者需要住院治疗。另一方面,为了最佳地控制肿瘤,有时希望使用比常规高的放射剂量。为了测定本发明的放射敏感性,收集经过放射疗法的健康组织或适宜替代组织的样品之后,为进一步分析(悬浮液或提取物)通过收集制备组合物。接着,分析DNA损伤修复的动力学。为此,使前述的组合物作用于在偶联之前或之后已加入了一个或多个适宜的修饰和/或碱基错配和/或无嘌呤或无嘧啶位点的DNA分子。于是可以测定放射敏感性:测定DNA修饰或碱基错配或无嘌呤或无嘧啶位点的量,特别是由活性氧类引起的修饰量,例如8-氧代鸟嘌呤的量随着时间而减少并使其与标准数据相关。因此可以单独地测定总的辐射剂量并测定在分级辐射情况下单一剂量随时间的分布。根据一特定实施方案,为了获得更精确测定的辐射剂量,还提供了将如上所述测定的数据(它代表了细胞对DNA损伤的修复能力)与描述细胞增殖的数据相结合。相应地,为了估计治疗所需的辐射剂量,可以测定肿瘤组织的辐射敏感性。
与测定肿瘤患者对辐射疗法的敏感性类似,还可以测定基因毒性化学疗法的敏感性。特别是测定对一个或多个适当选择的DNA修饰的修复能力。当已知化学治疗剂的作用模式时,可以在该机制的基础上选择DNA修饰。例如,就烷基化剂而言,可以分析相应烷基化碱基的修复。相同的考虑适用于测定肿瘤细胞对某种试剂的耐性。
分析该修复的方法的基础在于将经过修饰的DNA分子或具有碱基错配或无嘌呤或无嘧啶位点的DNA分子共价连接到如滤膜、金、珠、微量滴定板或玻璃表面的固相上。适宜的支持体特别是晶片(DNA-晶片技术)。将固定化的DNA用来自细胞或组织的蛋白提取物培养。测定通过提取物中所含的修复蛋白质除去所限定的DNA加合物或碱基错配或无嘌呤或无嘧啶位点的速率。
作为偶联剂,使用能够与氨基反应的反应性方形酸衍生物。优选使用方形酸二酯,特别是方形酸二烷基酯,例如特别是方形酸二乙酯,它可以分别使两个伯或仲氨基彼此连接。出人意料地,本发明中所用的方形酸衍生物仅与脂族氨基反应,而不与DNA碱基上的氮原子反应。这是优于其它偶联剂的无法估计的优点,其它偶联剂与DNA的反应基反应并因此能导致不希望的损伤(例如二醛)。通过在DNA分子内部的5’-端或3’-端或至少一个脱氧核糖残基的2’-位置上引入伯或仲氨基,由此发现了一种将单和双链低聚核苷酸区域专一性固定化到在表面载有氨基的固相上的温和、再现性高且便宜的方法。应优选将所述氨基引入5’-端。特别优选加入伯氨基(NH2基)。在为双链DNA分子的情况下,优选一个链与支持体共价地连接,例如通过其5’-端。
作为固相基质,可以使用本身已知的材料,例如由纤维素、聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚酰胺、玻璃或金表面组成的那些。固相基质可以本身已知的形式存在,例如以滤膜、微量滴定板、膜、柱、珠,例如磁性珠的形式存在。
根据本发明,术语DNA分子包括具有任意天然或合成序列的单链和双链分子。如果用于与修复酶相互作用的碱基数足够的话,可以选择DNA分子中的任意碱基数。在一些情况下,具有几个碱基的低聚核苷酸就已足够了。对一些修复酶而言,证明宜于使用具有三个完整缠绕且修饰或错配或无嘌呤或无嘧啶位点排布于中间缠绕中的低聚核苷酸。然而,本领域技术人员通过常规实验可以改变序列的长度和待修复的位点的排列。本领域技术人员同样可以分析序列中的变化。证明使用不允许重折叠的序列是有益的。通过改变序列,本领域技术人员还可以分析环境对待修复的位点的修复的影响。
已提到过,为了偶联到支持体上,已将氨基加入DNA分子中。此外,已加入可以被修复的修饰或碱基错配或无嘌呤或无嘧啶位点。而且,术语DNA分子还包括DNA类似物。
作为DNA类似物,例如可以使用在磷酸酯-糖主链上经过修饰的DNA分子。例子包括磷酸酯基团已被磷酸硫酯(硫代磷酸酯)替代或者磷酸二酯键已被肽键替代的分子。DNA类似的分子应被认为其中一部分或全部脱氧核糖核苷酸已被核糖核苷酸替代。
根据本发明,使DNA修复酶与含有据认为能通过这些酶修复的DNA修饰或碱基错配或无嘌呤或无嘧啶位点的DNA分子接触。通过致癌因子(包括辐射)可以直接或间接引起DNA的所述改变。该DNA修饰尤其包括碱基修饰。典型地,这些为与反应剂如致癌物的加合物。然而,本文中理解的DNA修饰不受某类DNA改变的限制。根据本发明,还尤其可以特异地分析合成DNA分子,特别是具有精确定义的修饰或碱基错配的低聚核苷酸。此外,通过作用于DNA的试剂也可以产生修饰。
DNA分子与固相的共价连接使得实验的所有实际步骤能快速且有效地在一个反应容器中进行。步骤,例如酶、核酸、抗体或生色底物的加入或除去、缓冲液的更换和洗涤操作等等,仅需要大量可自动化的吸移操作,即没有费时和费工的操作步骤,例如DNA的沉淀和反复离心以及DNA分子与其它组分的层析或电泳分离。此外,因对样品材料的大批加工造成的DNA损失可以避免。
本发明的另一优点在于固定的DNA分子在分子的精确定义点上共价连接到支持体上,而不是自由地存在于溶液中。因此DNA修饰、碱基错配和无嘌呤或无嘧啶位点可自由地利用修复酶。
由于使用不同的标记底物,因此可以在相同反应容器中第一次分析来自细胞或组织的蛋白提取物对不同DNA修饰和/或DNA错配和/或无嘌呤或无嘧啶位点的修复能力。这可以通过将经过不同修饰的低聚核苷酸结合到反应容器(或其它支持体)的表面上进行,具有相同修饰的低聚核苷酸典型地各自包括相同标记或用于标记的相同结合基团。
通过本方法,可以快速且精确地确定人的修复状态,由此可以可靠地评价该人对环境或车间中的致癌因子的易感性。本方法还可用于快速评价肿瘤患者(例如,骨髓中血液形成系统的细胞、肠细胞和粘膜细胞)对放射疗法或基因毒性细胞抑制剂的敏感性。最后,本方法能够快速且精确地测定肿瘤细胞的修复能力,它在抵抗DNA-反应性细胞抑制剂中起着重要作用。
本文所述的偶联方法基本上适宜温和且区域专一性地将低聚核苷酸固定化到固相上。
本文所述方法的优选实施方案包括:
·将经选择修饰的核酸固定化到固相上,和
·使用方形酸二乙酯将经过修饰的核酸分子共价结合到固相(例如滤膜、微量滴定板、膜、玻璃表面、金、珠和磁性珠)上。
作为共价地结合经过修饰的核酸分子的偶联剂,优选推荐方形酸二酯。
出人意料地,活性方形酸衍生物,例如尤其是方形酸二酯,不与DNA中嘌呤和嘧啶碱基上的氨基反应。然而,它们选择性地与伯和仲脂族氨基反应。与其它偶联剂比较,其决定性优点是:通过该偶联物质不会引起DNA分子的不需要的损伤或交联。
通过加入氨基,例如在5’-端,DNA分子可以区域专一性地与在其表面上同样存在氨基的固相相连。
E.通过合成引入某种致癌物特异性碱基修饰生产具有定义的DNA加合物的DNA基质以及生产具有某些碱基错配或无嘌呤或无嘧啶位点的DNA分子。
在本发明方法中,可以有利地使用具有固定的序列和定义的修饰或碱基错配或无嘌呤或无嘧啶位点的DNA分子。下面,通过实施例解释各种方法,但是,它们并不打算限制本发明。所需合成技术对本领域技术人员为已知并且可以从文献中得到。
Ⅰ.通过常用方法合成所限定序列的单链低聚核苷酸,它:
a)在碱基序列的预定点具有某一碱基修饰(例如8-氧代鸟嘌呤、O6-烷基鸟嘌呤),
b)在DNA分子的5’-端含有NH2基团,
c)在3’-端含有OH基团。
Ⅰ.Ⅰ.标记DNA分子的3’-端
使用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)通过加入例如荧光标记的三磷酸酯酶促延长3’-端。当不同修饰的低聚核苷酸与相同支持体结合时(同时分析蛋白提取物对不同DNA修饰的修复能力),使用各种荧光染料,具有相同修饰的低聚核苷酸各自含有相同的荧光染料。或者,可以加入另一标记或者可以结合标记的基团。而且,可以容易地看出,该标记不必须存在于3’-端,而只存在于经切除而不再与支持体相连的位置。
Ⅰ.Ⅱ.双链(ds-)低聚核苷酸的生产:
a)将经过修饰的低聚核苷酸与互补低聚核苷酸融合。(优选地,载有修饰的链因此与载体共价地连接。)
b)为了通过蛋白提取物分析DNA错配的修复(错配修复),将未经修饰或经过修饰的低聚核苷酸与在碱基序列的某一位置或在DNA加合物位置的对面含有不同的天然核苷酸的互补低聚核苷酸融合。
Ⅰ.Ⅲ.通过化学上稳定且可裂解的接头在ds-低聚核苷酸的5’-端将其偶联到固相上。一般说来,在本发明中可以提供与固体支持体的表面相连且在远离表面的末端载有氨基的接头(间隔区),经由该氨基通过方形酸衍生物可以偶联到DNA分子上。接头同样可以与该DNA分子相连,该接头又转过来载有便于方形酸偶联的氨基。在该接头内部,可以提供可裂解的基团,它通过用于进一步分析的适宜试剂使DNA分子与固相基质分离。
Ⅰ.Ⅳ.当仅使用均匀修饰的ds-低聚核苷酸时,DNA分子例如可以经过其5’NH2端首先与固相结合,接着使用以下物质在3’-端进行酶促标记
a)经过修饰的脱氧核苷酸(例如,生物素化dUTP),例如荧光染料的可检测的标记与其高亲和地结合(例如与链霉抗生物素偶联的TRITC),或者
b)与荧光染料偶联(或经放射性标记或以一些其它方式标记)的脱氧核苷酸。
Ⅱ.通过用致癌因子(反应性化学物质如苯并芘二醇环氧化物、甲基或乙基亚硝基脲、紫外线、电离辐射、过氧化氢、亚甲蓝与可见光结合)处理ds-低聚核苷酸或线性质粒DNA生产具有特异性DNA修饰的DNA基质。
Ⅱ.Ⅰ.如标题Ⅰ中所述生产在分子的5’-端具有NH2基并在3’-端具有OH基的ds-低聚核苷酸。用致癌物处理这些分子。经由该NH2基将这些分子结合到固相上(参见Ⅰ.Ⅳ.)并酶促标记这些结合分子,例如用荧光染料。
Ⅱ.Ⅱ.或者,可以首先将这些ds-低聚核苷酸结合到固相上。之后仅进行用反应性致癌物处理并酶促标记这些低聚核苷酸。
Ⅱ.Ⅲ.在质粒DNA的5’-端加入NH2基:
a)通过使用引物的PCR法,其中一种引物在其5’-端载有NH2基。
b)通过限制性核酸内切酶切割这些质粒,以便获得两个新的较短的DNA分子,每个在两个5’-端/DNA分子之一上只有一个NH2基。在质粒分子的3’-端酶促加入例如生物素化dUTP。用致癌物处理之后,将DNA基质结合到固相上。按照该实施方案,可以通过与生物素结合的链霉抗生物素染料共轭物进行检测反应。
Ⅲ.生产具有无嘌呤或无嘧啶位点的DNA分子:
例如可以合成加入了尿苷酸的DNA分子,该碱基仅酶促分离。还存在可除去修饰的碱基、留下无嘌呤或无嘧啶位点的已知酶。
F.修复测定的实际实施
当进行修复测定时,将假设含有修复酶的组合物与固定的DNA接触。该组合物可以为细胞提取物或组织提取物。在这种情况下,本发明的方法能够描述细胞或组织的修复活性。
可以两种方式检测通过酶促修复的某些DNA修饰或碱基错配或无嘌呤或无嘧啶位点的剔除:
Ⅰ.通过使用特异地结合到某些DNA修饰(例如8-氧代鸟嘌呤、O6-烷基鸟嘌呤、DNA的PAH-加合物、嘧啶二聚物等)上的单克隆或多克隆抗体。这些抗体在参考文献中有记载。它们可以通过本领域技术人员已知的方法生产。还可以使用具有适宜亲和力的抗体片段。
·该方法基本上适宜检测存在适宜抗体的每种DNA修饰。
·该步骤不需要标记DNA分子。
·为了定量分析细胞提取物的修复能力,必需知道在反应制剂中DNA加合物的数目;与单位DNA分子中的DNA加合物的数目无关。
为此,或者含有所限定的DNA修饰(所限定的DNA加合物)或者已用某种致癌物处理过的固定化DNA分子首先用待测定的细胞或组织提取物培养。接着,加入抗体,它特异地结合到该修饰上(一级抗体);为了定量结合抗体的量,然后典型地加入二级抗体,该二级抗体或者用荧光染料(TRITC、FITC、荧光素等)标记或者以例如放射性标记的一些其它方式标记,或者将一与适宜底物引起颜色反应的酶(例如磷酸酶、过氧化氢酶)偶联其上。在恒定条件下,抗体分子的结合与剩余DNA加合物的量成正比(Nehls和Rajewsky,1990);即,染料的强度可以度量加合物的量。
类似地,使用适宜的抗体也可以分析碱基错配或无嘌呤或无嘧啶位点。当分析无嘌呤或无嘧啶位点的修复时,还可以用适宜的化学试剂如甲氧胺、肼衍生物或取代的芳胺衍生这些位点,并使用这些衍生位点的抗体(或抗体片段)用于检测目的。方便地,通过修复酶的作用进行衍生。
Ⅱ.利用通过切除修复剔除DNA修饰和碱基错配时出现DNA切口的事实。
·本方法适宜检测导致DNA切口的修复过程。按照该机理进行大多数的已知修复过程。一个例外是通过AT修复例如O6-烷基鸟嘌呤(参见C.Ⅱ.Ⅲ.)。
·优选将ds-低聚核苷酸用于本方法。
为了实施该方法,必须确信:
a)仅一个DNA链(可能)含有定义的DNA加合物,
b)该DNA已被固定化,和
c)该DNA链已对DNA修饰进行了标记,以便一经切除该标记就不再与支持体相连。例如,当该DNA链经过其5’-端与支持体共价地连接时,可以在其3’-端提供一标记。在这种情况下,对在修复期间已将DNA切开的点,该标记通常应被置于3’位。可通过切除除去的经过结构修饰的核苷酸也可以被标记。在这种情况下,放射标记特别有用。还可以加入一附加标记,它在修复(切除)期间不带来损失,并且通过它可以在方法的每一阶段分析例如固定化DNA的量。为了分析DNA修饰、碱基错配或无嘌呤或无嘧啶位点的剔除,已如上所述,然而,这种可以附加提供的标记不适用。
为了定量细胞提取物的修复效率,必需知道单位反应制剂中DNA加合物的数目。
将固定化DNA分子用待分析的细胞或组织提取物培养。当通过酶促切除除去DNA加合物时,共价结合的链分裂成两个片段,其中带有标记的片段不再与固相共价地结合。通过在适宜的缓冲剂混合物中加热这些DNA分子,将两个DNA链之间的氢键溶解。因此未结合的片段与互补(未标记的)反链分离并且可以通过例如吸掉它们容易地除去。保留了DNA加合物的DNA分子仍然具有标记,因此可以容易地定量。可以同样的方式分析碱基错配以及无嘌呤或无嘧啶位点。
G.附图简述
附图中,
图1显示了通过细胞提取物从ds-低聚核苷酸除去8-氧代鸟嘌呤的动力学;
图2显示了通过细胞提取物修复O6-乙基鸟嘌呤的动力学。
H.应用实施例
经过修饰的低聚脱氧核苷酸的制备:
制备三个不同的低聚脱氧核苷酸,每个由34个核苷酸组成,并在5’-端含有NH2基。除了第16位之外,这三个低聚核苷酸的碱基序列相同且读取如下:
5’-GGC TTC ATC GTT ATT X ATG ACC TGG TGG ATA CCG-3’
其中在16位的X可以是:
8-氧代鸟嘌呤或O6-乙基鸟嘌呤或鸟嘌呤。作为16位的碱基,因此第一个低聚核苷酸含有氧化产物8-氧代鸟嘌呤,第二个低聚核苷酸含有烷基化产物O6-乙基鸟嘌呤,第三个低聚核苷酸含有天然碱基鸟嘌呤。第三个低聚核苷酸用作对照。此外,合成其互补DNA反链,它仅由四个天然碱基组成,并在经过修饰的低聚核苷酸的3’-端伸出2个碱基。在X的对面是C。这使得能够在经过修饰的低聚核苷酸或对照低聚核苷酸的3’-端酶促加入生物素化dUTP或荧光标记的核苷酸。
这些低聚核苷酸是用磷酰胺酸法全自动地制备的。通常,经固相上的3’-端(CPG)进行合成。与支持体材料分离并裂解保护基(0.25M 2-巯基乙醇的浓缩氨,55℃,20小时)之后,这些低聚核苷酸通过凝胶过滤从氨中释放,之后通过制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC提纯。在另一提纯步骤之后,将这些低聚核苷酸冻干并在-20℃下贮藏。
双链(ds)底物的制备:
将溶于双蒸水的低聚核苷酸(100pmolDNA分子/ml)与1.2倍量的互补DNA链(120pmol/ml)混合。这些样品在水浴中于90℃下加热5分钟;在将水浴冷却到室温的几小时过程中将这些单链分子融合获得双链(ds)低聚核苷酸。
活性微量滴定板的制备:
在这些测定中使用微量滴定板(MP),板孔为平底并在其表面含有NH2基(10nmolNH2基/孔)。向MP的每个孔中吸移25微升在甲醇(>99%)中的方形酸二乙酯(0.1mM)和三乙胺(0.01mM)的溶液。将这些MP覆盖并在室温下培养10分钟。将溶液除去之后,将这些孔用甲醇冲洗并干燥。
ds-低聚核苷酸共价结合到活性MP上:
为了将ds-低聚核苷酸偶联到活性MP孔的表面上,向每个孔中吸移pH为9.5的10微升于50mM硼酸钠水溶液中的DNA溶液(50pmol8-氧代鸟嘌呤-ds-低聚核苷酸/ml,2.5pmolO6-乙基鸟嘌呤-ds-低聚核苷酸/ml),将该MP覆盖。在室温下20分钟之后,移走DNA溶液并用双蒸水冲洗这些孔。
方形酸中剩余的反应基用30微升乙醇胺水溶液(100mM,pH8.5)灭活。10分钟之后,将MP孔用双蒸水冲洗并干燥。
实施例A:
从ds-低聚核苷酸中除去8-氧代鸟嘌呤
修复类型:
通过切除修复(酶促法)从DNA中除去大多数DNA修饰、复制后的碱基错配和无嘌呤或无嘧啶位点。按照相同机理修复DNA氧化产物8-氧代鸟嘌呤(8-OxoGua)。在人体内存在至少两个不同的从DNA中剔除该碱基修饰的修复系统。在小鼠中,仅检测出这两个修复系统中的一个。
不依赖该8-OxoGua-切除机制,在DNA中中间地形成具有核苷酸大小的间隙。
实际实施该测定:
在该测定中使用MP,在其平底孔中固定化在16位含有氧化产物8-OxoGua并在35和36位含有生物素化尿嘧啶的ds-低聚核苷酸(30×10-15moldsDNA-分子/孔)。
用细胞系P3-X63-Ag的小鼠骨髓瘤细胞制备待分析的细胞提取物。为此,将这些细胞在冰冷PBS中冲洗2次,再以5×107个细胞/ml的浓度悬浮于缓冲剂混合物A(50mM Tris-HCl、pH7.6、1mM EDTA、1mM DTT、100mM KCl、0.1%BSA)中。将这些细胞经声波破碎,并经离心除去固体成分(100,000g,4℃,10分钟)。将清澈的上清液分成几份贮藏在-80℃下。
向MP的10个孔中吸移25μl含有缓冲剂混合物A和6×105个小鼠骨髓瘤细胞的蛋白提取物的溶液(样品区)。
向4个区域吸移25μl相同缓冲剂,但没有蛋白提取物(对照区)。将该MP在37℃下培养。
5、30、60、90和120分钟之后,在每个点及时在两个孔中各加入1μl蛋白酶K(1mg/μl),使反应停止。在120分钟之后同样向对照区的孔中加入1μl蛋白酶K。将这些MP加热到90℃持续5分钟,接着在冰水混合物中快速冷却。将这些溶液从孔中移出,孔用30μl缓冲剂B(50mM Tris-HCl,pH7.6,1mM EDTA,0.1%BSA)冲洗液3次。
加入25μl含链霉抗生物素-Cy3共轭物(2.5μg/ml;从Sigma公司获得)的缓冲剂B溶液之后,将该MP在37℃下培养45分钟。移出溶液之后,用缓冲剂B将这些MP的孔冲洗3次,最后加入25μl相同缓冲剂。
通过包括荧光显微镜、CCD照相机和计算机辅助的分析程序的图像分析仪定量测定各个孔中荧光染料的强度。或者,使用灵敏的UV-ELISA读数设备测定荧光强度。
按照下式计算样品:
R=M(1-P/K0)
其中
R为以fmol(1015mol)表示的修复的8-氧代鸟嘌呤分子的量,
M为每个MP孔中8-氧代鸟嘌呤分子的总量,
K0为对照区的孔中的荧光强度,和
P为样品区的孔中的荧光强度。
图1表示通过所限定的细胞提取物(6×105个小鼠骨髓瘤细胞系的细胞的提取物)修复的8-氧代鸟嘌呤随培养时间的变化曲线。由曲线开始的斜率可以计算在标准条件(8-氧代鸟嘌呤的总量,30fmol;6×105个细胞的提取物)下每小时从低聚核苷酸中最多除去多少8-氧代鸟嘌呤分子。在本例中,每小时除去13.7fmol。
实施例B:
ds-低聚核苷酸中O6-乙基鸟嘌呤的脱烷基化
修复类型:
由O6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AT)以一步修复通过烷基化致癌物形成的O6-乙基鸟嘌呤(O6-EtGua)。AT将烷基从鸟嘌呤的O6-位置转移到蛋白质活性中心中的半胱氨酸上。转移该烷基之后,AT失活。这样,每个AT分子总是仅能修复一个O6-EtGua分子。因此,以双分子反应进行修复。
通过O6-乙基脱氧鸟苷的抗体分析该修复。可以使用单克隆或多克隆抗体。例如,如下产生单克隆抗体:
首先,如R.Muller和M.F.Rajewsky(Z.Naturforsch.,33c,897-901,1978)所述进行O6-乙基核糖鸟苷的合成和烷基化产物与KLH(匙孔血蓝蛋白)的偶联。为了产生抗体,在3个月内5次将抗原BALB/c经腹膜注射到小鼠中。将经过免疫的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(P3-X63-Ag8)融合。将由此获得的杂交瘤散布在含有BALB/c小鼠的腹膜巨噬细胞的微量滴定板上。将产生O6-乙基脱氧鸟苷的抗体的杂交瘤细胞再克隆并培养。用两步提纯(硫酸铵沉淀,50%饱和液,以及用DE-52柱材料的离子交换层析)将这些抗体与其它蛋白质分离。将提纯的抗体浓缩并将它们分成几份贮藏在-80℃下。
实际实施该测定:
在该测定中使用MP,其孔中固定化在16位含有O6-EtGua的ds-低聚核苷酸(1.2×10-15mol dsDNA分子/孔)。其3’-端未补平。在一部分孔中,固定化仅在16位含有鸟嘌呤的ds-低聚核苷酸(对照区2)。
通过在培养基(DMEM,补充有10%胎牛血清)中用胰蛋白酶EDTA处理一次并在冰冷PBS中处理2次,洗涤L929小鼠成纤维细胞制备待分析的细胞提取物。然后将这些细胞以6×107个细胞/ml的浓度再悬浮于萃取缓冲液(500mM NaCl、50mM Tris-HCl、pH7.8、1mM二硫苏糖醇、1mM EDTA和5%甘油)中,并通过声波破碎。通过离心(10,000g,4℃,10分钟)除去不溶性成分,将清澈的上清液分成几份贮藏在-80℃下。
向MP的14个孔中吸移50μl含有反应缓冲剂(50mMHEPES,pH7.8,1mMDTT,1mM EDTA,5%甘油和0.05%Triton X-100)和3μg来自L929小鼠成纤维细胞的蛋白提取物的溶液(样品区)。
向4个孔中吸移25μl反应缓冲剂,但没有蛋白提取物(对照区1)。向含有用于测定抗体的非特异性结合的未经修饰的ds-低聚核苷酸的对照区2的4个孔中吸移反应缓冲剂和蛋白提取物。
5、10、15、20、30、45、60分钟之后,在每个点及时在两个孔中各加入1μl蛋白酶K(1mg/μl),使反应停止。在60分钟之后同样向对照区1和2的孔中加入1μl蛋白酶K。
在37℃下另外15分钟之后,从孔中移出溶液,这些孔用30μl缓冲剂C(100mM NaCl,10mM Tris-HCl,pH7.5,1mM EDTA和0.1%BSA)冲洗3次。
然后,向每个孔中吸移15μl含有2μg抗-(O6-EtGua)抗体的缓冲剂C溶液。室温下45分钟之后,将这些抗体溶液移出。接着,用缓冲剂C将这些孔冲洗3次,以除去未结合的抗体分子。
为了检测特异性结合的抗体分子,向这些孔中加入20μl在缓冲剂C中的TRITC标记的抗-(IgG)F(ab)2片段(5μg/ml)。室温下45分钟之后,将该抗体溶液移出。用25μl缓冲剂C冲洗3次除去未结合的抗体。接着,向这些孔中吸移25μl缓冲剂C。如前述确定各个孔中的荧光强度。
按照下式计算各个样品值:
R=M(1-(P-K2)/(K1-K2))
其中
R为以fmol(10-15mol)表示的修复的O6-EtGua分子的量,
M为以fmol表示的每个孔中O6-EtGua分子的总量,
K1为没有蛋白提取物的孔中的总荧光强度,
K2为抗体的非特异性结合的荧光强度,
P为样品区的孔中的荧光强度。
在图2中,表示了通过所限定的细胞提取物(3μg来自L929小鼠成纤维细胞的蛋白提取物)修复的O6-EtGua作为时间的函数曲线。由于以双分子反应(二级反应)进行O6-EtGua的修复,因此可以根据下式计算测定制品中AT分子(AT)的浓度和修复反应的速率常数K:
K×t=1/(A0-B0)ln(B0(A0-P)/A0(B0-P))
其中
术语A0、B0和P相应于O6-EtGua分子的最初浓度(A0)、AT分子的最初浓度(B0)以及在修复反应的时间t时脱烷基O6-EtGua分子的浓度(P)。为了计算AT和K,开发了一计算机程序。因此,细胞提取物含有0.7fmolAT分子,并且K为4×107l/mol×sec。
参考文献Castaing,B.、Geiger,A.、Seliger,H.、Nehls,P.、Laval,J.、Zelwer,C.和Boiteux,S.(1993)《核酸研究》21,2899-2905。Dizdaroglu M.(1985)《生物化学》24,4476-4481。Floyd,R.A.、Watson,J.J.、Harris,J.和Wong,P.K.(1986)《生物化学生物物理研究通讯》137,841-846。Foote,R.S.、Pal,B.C.和Mitra,S.(1983)《突变研究》119,221-228。Nehls,P.、Rajewsky,M.F.、Spiess,E.和Werner,D.(1984a)《EMBO杂志》3,327-332。Nehls,P.、Adamkiewicz,J.和Rajewsky,M.F.(1984b)《癌症研究临床肿瘤学杂志》198,23-29。Nehls,P.和Rajewsky,M.F.(1990)《致癌作用》11,81-87。Nehls,P.、Seiler,F.、Rehn,B.、Greferath,R.和Bruch,J.(1997)《环境卫生展望》105(增刊5)1291-1296。Ostling,O.和Johanson,K.J.(1984)《生物化学生物物理研究通讯》123,291-298。Pegg,A.E.、Wiest,L.、Foote,R.S.、Mitra,S.和Perry,W.(1983)《生物化学杂志》258,2327-2333。Waldstein,E.A.、Cao,E.-H.和Setlow,R.B.(1982)《分析生物化学》126,268-272。
Claims (12)
1.一种分析通过DNA修复酶修复DNA修饰和碱基错配以及无嘌呤和无嘧啶位点的方法,包括下列步骤:
(a)提供单链或双链DNA分子,该DNA分子通过与反应性方形酸衍生物反应经在该DNA的5’-端或3’-端或至少一个脱氧核糖残基的2’-位置加入该DNA分子的伯或仲氨基共价偶联到载有伯或仲氨基的固相基质上,并具有修饰和/或碱基错配和/或无嘌呤或无嘧啶位点;
(b)使该DNA分子与含有DNA修复酶的组合物接触;
(c)测定DNA修饰和/或碱基错配和/或无嘌呤或无嘧啶位点的剔除。
2.如权利要求1所述的方法,其中反应性方形酸衍生物为方形酸二酯,尤其是方形酸二乙酯。
3.如前面任意权利要求所述的方法,其中通过该修饰和/或碱基错配和/或无嘌呤或无嘧啶位点的抗体或相应抗体片段测定DNA修饰和/或碱基错配和/或无嘌呤或无嘧啶位点从偶联到固相基质上的DNA分子中的剔除。
4.如前面任意权利要求所述的方法,其中通过切除修复测定DNA修饰和/或碱基错配和/或无嘌呤或无嘧啶位点从偶联到固相基质上的DNA分子中的剔除,其中检测失去的DNA片段,该修饰和/或碱基错配和/或无嘌呤或无嘧啶位点一经切除就不再与固相基质相连。
5.如权利要求4所述的方法,其中通过切除修复失去的DNA片段含有诸如发色分子、荧光分子、放射性原子或基团结合标记的标记。
6.如权利要求5所述的方法,其中所述标记或基团结合标记是通过将DNA分子偶联到固相基质上加入的。
7.如权利要求4-6任意所述的方法,其中具有不同修饰或碱基错配或无嘌呤或无嘧啶位点的DNA分子各自带有不同标记或基团结合标记,以便同时分析不同DNA修饰或碱基错配或无嘌呤或无嘧啶位点的修复。
8.如前面任意权利要求所述的方法,其中在允许修饰剂作用于偶联到固相基质上的DNA分子的情况下将修饰加入DNA分子。
9.如前面任意权利要求所述的方法,其中测定含有修复酶的组合物对一个或多个DNA修饰或碱基错配或无嘌呤或无嘧啶位点的修复能力。
10.如权利要求9所述的方法,其中从细胞或组织样品中回收含有修复酶的组合物,并使用该修复能力确定个体的肿瘤易感性、个体的辐射敏感性或个体的对基因素性化学治疗的敏感性或肿瘤细胞对辐射或化学治疗剂的抗性。
11.用于实施前面任意权利要求所述方法的测定试剂盒,包括:
(a)载有伯或仲氨基的固相基质;
(b)DNA分子,其具有在该DNA的5’-端或3’-端或至少一个脱氧核糖残基的2’-位置加入该DNA分子的伯或仲氨基;
(c)可能的DNA修饰或碱基错配或无嘌呤或无嘧啶位点或无嘌呤或无嘧啶位点衍生物的抗体或抗体片段;
(d)反应性方形酸衍生物。
12.用于实施前面任意权利要求所述方法的测定试剂盒,包括:
(a)单链或双链DNA分子,这些DNA分子通过与反应性方形酸衍生物反应经在该DNA的5’-端或3’-端或至少一个脱氧核糖残基的2’-位置加入该DNA分子的伯或仲氨基共价偶联到载有伯或仲氨基的固相基质上,并且这些DNA分子可以具有修饰和/或碱基错配和/或无嘌呤或无嘧啶位点,可以载有标记或基团结合标记;
(b)选择性的抗体或抗体片段,它们特异性地针对DNA修饰或碱基错配或无嘌呤或无嘧啶位点或无嘌呤或无嘧啶位点衍生物。
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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