KR20010103630A - Ｄｎａ 수복 분석 방법 및 테스트 키트 - Google Patents

Ｄｎａ 수복 분석 방법 및 테스트 키트 Download PDF

Info

Publication number
KR20010103630A
KR20010103630A KR1020017005444A KR20017005444A KR20010103630A KR 20010103630 A KR20010103630 A KR 20010103630A KR 1020017005444 A KR1020017005444 A KR 1020017005444A KR 20017005444 A KR20017005444 A KR 20017005444A KR 20010103630 A KR20010103630 A KR 20010103630A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
dna
depurine
depyrimidine
repair
sites
Prior art date
Application number
KR1020017005444A
Other languages
English (en)
Inventor
넬스페테르
글뤼젠캄프칼-하인츠
Original Assignee
넬스, 페테르
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 넬스, 페테르 filed Critical 넬스, 페테르
Publication of KR20010103630A publication Critical patent/KR20010103630A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 DNA 수복 효소에 의한 DNA 변형 및 염기 부정합은 물론, 탈푸린 및 탈피리미딘 부위의 수복을 분석하는 방법 및 테스트 키트에 관한 것이다. 상기 방법에 따르면, 반응성 스쿠아르산과의 반응에 의해 고체상 기질에 공유 결합된 DNA 분자를 DNA 수복 효소를 포함하는 조성물과 접촉시킨다. 이 테스트 키트는 상기 분석을 위해 필요한 성분들을 포함한다.

Description

ＤＮＡ 수복 분석 방법 및 테스트 키트{METHOD AND TEST KIT FOR ANALYZING DNA REPAIR}
본 발명은 DNA 수복 효소에 의한 DNA 변형 및 염기 부정합(mispairing)은 물론, 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위의 수복을 분석하기 위한 방법 및 테스트 키트에 관한 것이다. 이에 따라, 예컨대 수복 효소의 수복 능력 및 본 방법에 이용되는 수복 효소를 포함하는 조성물을 회수한 세포 또는 조직의 수복 능력을 측정하는 것이 가능하다. 수복 능력은, 예컨대 암의 발생을 초래하는 과정과 연루되어 의미가 있지만, 다양한 형태의 암 치료에 있어서도 중요하다.
A. 서론
암은 세포의 암 관련 유전자(원종양 유전자 및 종양 억제 유전자)에 발생하는 점진적인 돌연변이의 축적으로 인해 몇 단계로 발생한다. 돌연변이 발생의 경우, 특히 발암 인자들이 중요한 역할을 하는데, 이들은 예컨대 환경, 식품, 화장품, 약물 및 작업 환경(자외선, 이온화 방사능, 분진, 중금속 및 다수의 화학적 발암물질)에서 생기며, 내인적으로도 생성될 수 있다(예, 니트로사민, 반응성 질소 및 산소 화합물).
이들의 상이한 물리적 및 화학적 특성에도 불구하고, 모든 발암물질들은 동일한 원리에 따라 작용한다. 이들은 DNA의 개개의 구성요소와 반응함으로써, DNA의 구조 및 특성을 변화시킨다.
그러나, DNA 구성요소의 구조적 변화는 발암물질의 영향없이도 발생한다. 이러한 구조적 변화는 DNA에서 화학 결합의 열적 가수분해에 의해 일어난다. 이러한 구조적 변화에는, 특히 염기 시토신, 아데닌 또는 구아닌의 아미노기의 히드록시기에 의한 치환(탈아민화) 및 (특히) 푸린 염기인 구아닌 및 아데닌과 DNA의 디옥시리보오스 부분간의 N-글리코시드 결합의 가수분해적 절단(탈푸린화)이 있다.
염기 부정합은 DNA 복제 중에, 너무 적은 또는 너무 많은 뉴클레오티드 및/또는 부적당한 뉴클레오티드가 새롭게 합성되는 DNA 가닥에 삽입될 때 발생할 수 있다. 부적당한 뉴클레오티드가 삽입되는 것은 4개의 DNA 염기가 이들의 희귀 호변이성질체 형태로 존재할 경우 발생한다. 예컨대, 희귀 호변이성질체 형태의 시토신은 아데닌과 염기쌍을 형성하지만, 구아닌과는 형성하지 않으며, 희귀 호변이성질체 형태의 구아닌은 티민과 염기쌍을 형성하지만, 시토신과는 형성하지 않는다. 이러한 또는 다른 가능한 염기 부정합이 제때 수복되지 않으면, 또 다시 복제가 일어난 후에는 게놈 DNA에 염기전이 돌연변이가 발생한다(예컨대, C-G가 T-A로 또는 T-A가 C-G로 바뀜). 그 후, 이러한 전이 돌연변이는 통상 딸 세포로 전달된다. 구조적 변형은 가능한 모든 종류의 돌연변이(전이, 전환, 결실, 삽입 등)를 유발시킬 수 있다. 게놈에 발생된 돌연변이의 유형 및 분포 양상은 종종 발생된 구조적 변형의 원인이 되는 발암물질의 특성을 나타낸다. 암 관련 유전자(원종양 유전자, 종양 억제 유전자)내의 연속적인 돌연변이의 축적은 결국 세포가 악성 표현형질을 발현하도록 유도한다.
뿐만아니라, DNA를 손상시키는 제제의 영향은, 한편, 직접적으로 관련 세포를 사멸시킬 수도 있다. 이 사실은, 예컨대 방사능이나 유전자독성 화학 치료제를 이용하여 종양 질환을 치료하는 데 있어서 중요하다.
이를 막기 위해서, 세포는 많은 효과적인 방어 기작을 지닌다. 이러한 기작에는 한편으로는 효소(예, 글루타타이온 신테타아제, 수퍼옥시드 디스뮤타아제, 카탈라아제)와 저분자량 물질(예, 시스테인, 글루타타이온, 플라빈 및 비타민 C, E)이 있고, 다른 한편으로는 DNA 변형을 인식하고 DNA로부터 그 변형을 효소를 이용하여 제거하는 특이적 수복 시스템이 있다. 그러나, 방어 기작의 효율성은 개체별로, 한 개체내에서도 세포 유형별로 매우 다양할 수 있다. 이들의 능력이 발암 인자에 대한 개체의 종양 민감도를 결정한다. 본 발명은, 특히 수복 시스템의 활성(즉, 수복 능력) 측정 및 이러한 활성 측정의 응용에 관한 것이다.
B. 선행 기술
다양한 발암물질-DNA 변형에 대한 사람 세포 또는 조직의 수복 능력을 측정하기 위해 여러 방법들을 이용할 수 있다. 가장 널리 이용되는 방법을 아래에 열거한다. 원칙적으로, 이들을 두가지의 다른 유형의 방법으로 나눌 수 있다.
I. 한 유형의 방법은 생체외 세포를 생체내 특정 발암물질로 처리하는 것을 기초로 한다. 그런 다음, 발암물질에 의해 발생된 DNA 변형이 세포의 DNA로부터 효소에 의해 제거되는 속도를 측정한다. 이 목적을 위해, 발암물질 처리 후 해당하는 DNA 변형의 잔류량을 확인하기 위해 세포의 DNA를 다양한 시간대에 분석한다. 이렇게 얻은 데이타는 세포 수복 능력을 계산하는 데 이용한다.
I.I. 정해진 DNA 변형 양을 측정하기 위해, DNA를 해당하는 세포 샘플로부터분리하고, DNA 변형 양을 분석한다. 개개의 DNA 샘플내의 DNA 변형의 정량은,
(a) 정해진 DNA 변형에 대한 항체를 이용하여 면역-슬롯-블롯 방법에 따라 손상되지 않은 DNA 분자로 수행하는 방법(Nehls 등, 1984b), 및
(b) 개개의 디옥시리보뉴클레오티드내의 DNA를 효소로 가수분해한 후,
정해진 DNA 변형에 대한 항체를 이용하여 경쟁적 방사능면역분석법을 이용하는 방법(Nehls 등, 1984a),
디옥시리보뉴클레오시드 혼합물을 HPLC 장치를 이용하여 분리한 후, 전기화학적 검출 시스템을 이용하는 방법(Floyd 등, 1986),
디옥시리보뉴클레오시드 혼합물을 기체 크로마토그래피를 이용하여 분리한 후 질량 분광법을 이용하는 방법(Dizdaroglu 등, 1985)을 통해 수행할 수 있다.
I.II. 다른 한편으로는, DNA 변형을 개개의 세포내에서 직접 측정할 수 있는 방법을 개발하였다. 이러한 방법들에는
(a) 면역세포학적 분석법(Nehls 등, 1997), 및
(b) 카미트(Comet) 분석법(Ostling 및 Johnson, 1984)이 있다.
II. 또 다른 유형의 방법은 정해진 DNA 변형(합성 DNA 분자)을 포함하거나 특정 발암물질로 처리된 DNA 분자들과 함께 세포 및 조직으로부터 단백질 추출물을 항온처리하는 것으로 구성된다. 그런 다음, 개개의 DNA 변형이 DNA 분자로부터 제거되는 속도를 측정한다. 이 방법은 아래의 방법들을 이용하여 수행할 수 있다.
II.I. "DNA 절단(nicking) 분석법"을 이용하는 방법(Castaing 등, 1993).
이 방법은 DNA로부터 효소적 절제에 의한 DNA 변형 제거를 증명하는 데 이용된다. DNA 변형 절제는 거의 특이적으로 작용하는 엔도뉴클레아제에 의한 일 단계 또는 특정 변형 염기를 인식 및 제거하는 DNA 글리코실라아제와 DNA로부터 잔류 탈푸린 및/또는 탈피리미딘 부위를 절제하는 AP 엔도뉴클레아제에 의한 두 단계 중 어느 하나로 수행된다. 두 경우 모두에서 DNA 틈(nick)이 DNA 변형 부위에 발생하며, 이 틈은 원래의 DNA 분자를 짧게 만든다. 이 분석을 위해서는 특정 길이의 합성, 방사능 표지된 DNA 분자가 주로 이용되는데, 이것은 소정의 위치에서 정해진 DNA 변형을 포함한다. 여전히 손상되지 않은 DNA 분자 및 짧아진 DNA 분자의 정량적 측정은 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 이용하여 다른 길이의 DNA 분자를 분리한 후 수행한다.
II.II. 필터-결합 테스트를 이용하는 방법(Nehls 및 Rajewsky, 1990).
이 방법은, DNA-항체 복합체는 니트로셀룰로오스 필터 위에 고정화될 수 있는 반면, 단백질이 결합되지 않은 DNA는 보유되지 않는 관찰 결과를 기초로 한다. 이 방법의 원리는 항체에 여전히 결합할 수 있는 DNA 분자의 양을 측정하는 것으로 구성된다. 이 목적을 위해, DNA 분자당 한개의 DNA 변형을 (이상적으로) 포함하는 DNA를 단백질 추출물과 항온처리하고, 다양한 시간 동안 반응시킨 후에 특이적으로 결합하는 항체와 혼합한 다음, 니트로셀룰로오스 필터를 통해 여과시킨다. 필터-결합 DNA-항체 복합체의 양이 감소되는 속도로부터, 항체가 이용가능한 정해진 DNA 변형에 대한 세포 유형 또는 조직의 수복 능력을 측정할 수 있다.
II.III. DNA 변형의 대부분은 절제 수복에 의해 제거된다. 한가지 예외는 발암물질을 알킬화시켜(예, O6-알킬구아닌, O4-메틸티민) 생성되는 특정 DNA 변형이다. 이러한 알킬화 생성물은, DNA 염기로부터 알킬기를 자신에게 전달한 다음 불화성화되는 효소(O6-알킬구아닌-DNA-알킬트랜스퍼라아제)에 의해 수복될 수 있다. 세포 및 조직내의 이러한 수복 효소의 정량을 위한 중요한 방법은 다음과 같다.
(a) 필터-결합 테스트(II. II. 참조).
(b) 주로 이용되는 테스트의 원리는 세포 및 조직 추출물을 첨가하기 전과 첨가한 후 다양한 시간대에 [3H]-표지된 알킬화제로 처리된 DNA내의 방사능 표지된 O6-알킬구아닌의 양을 측정하는 것으로 구성된다. 알킬화된 DNA의 산 가수분해 후, 해리된 푸린을 크로마토그래피(HPLC, 세파덱스 G-10)를 통해 분리하고, O6-알킬구아닌을 포함하는 분획의 방사능을 측정한다(Foote 등, 1983).
(c) 주로 이용되는 또 다른 방법은 알킬기가 AT의 시스테인 잔기로 공유 결합에 의해 전달된다는 지식을 기초로 한다. [3H]-알킬-DNA를 단백질 추출물과 항온처리한 후, 추출물의 단백질 성분 중의 방사능을 측정함으로써 AT에 전달된 알킬기의 양을 측정한다. 대안으로, DNA에 잔류하는 방사능의 양을 측정하고, 단백질을 가수분해시킨 후, 형성된 [3H]-알킬시스테인 분자의 양을 측정한다(Pegg 등, 1993; Waldstein 등, 1982).
III. 국제 특허 공개 제96/28571호에는 DNA 손상을 측정하는 방법이 공지되어 있으며, 이 방법에서는 DNA를 다가양이온에 흡착시켜 지지물에 고정시킨다. 이방법에서는 수복 활성 지닌 세포 추출물 및 표지된 뉴클레오티드를 포함하는 조성물이 손상을 지닌 흡착된 DNA 상에 작용하도록 한다. 따라서, 수복의 경우 일어나는 표지된 뉴클레오티드의 삽입이 입증된다.
IV. 선행 기술에는 생체 분자를 고체 지지물에 공유 결합시키는 방법이 공지되어 있으나, DNA 손상의 수복을 분석하는 것과는 관련이 없다.
예컨대, DE-A-4341524호는 생체 분자 및 친화성 리간드를 스쿠아르산 유도체를 이용하여 중합체 지지물에 고정화하는 방법을 공지하고 있다. DE-C-4499550호는스쿠아르산 유도체를 이용한 결합 반응을 기술하고, 생체 분자를 기질에 공유 결합시킬 수 있는 가능성에 대해 설명하고 있다. DE-A-19624990호는 아실 및/또는 히드록시기를 지닌 표면 및 중합체의 화학적으로 조절된 변형 방법을 공지하고 있다.
선행 기술에 공지되어 있는 수복 능력을 측정하는 전술한 방법들은, 특히 시간이 많이 소요되며, 노동집약적이고, 수행 비용이 많이 든다. 이러한 방법들 중 일부의 경우에는 가공시에 샘플 재료를 유실할 우려도 있다.
본 발명의 일 목적은 DNA 수복 효소에 의한 DNA 변형, 염기 부정합은 물론, 탈푸린 및 탈피리미딘 부위의 수복을 분석하는 개량된 방법을 제공하는 것이다. 특히, 본 방법은 수행이 간단하고, 효율적이며, 비용이 저렴하고, 전술한 단점들을 해소할 수 있어야 한다.
본 발명에 따르면, 이러한 과제는
(a) DNA의 5'-말단이나 3'-말단, 또는 하나 이상의 디옥시리보오스 잔기의 2'-위치에서 DNA 분자내에 삽입된 1차 또는 2차 아미노기를 매개로 반응성 스쿠아르산 유도체와의 반응에 의해 1차 또는 2차 아미노기를 지닌 고체상 기질에 공유 결합되어 있고, 변형 및/또는 염기 부정합 및/또는 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위를 지닌 한가닥 또는 두가닥 DNA 분자를 제공하는 단계;
(b) DNA 분자를 DNA 수복 효소를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및
(c) DNA 변형 및/또는 염기 부정합 및/또는 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위의 제거를 측정하는 단계를 포함하는, DNA 변형 및 염기 부정합은 물론, 탈푸린 및 탈피리미딘 부위의 수복을 분석하는 방법이 제공된다는 점에서 해결된다.
본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 방법을 수행하는 데 필요한 성분들을 포함하는 테스트 키트 또한 제공된다.
본 발명의 바람직한 양태는 후술하는 상세한 설명, 실시 형태는 물론, 첨부된 청구 범위를 통해 알 수 있다.
C. 발명의 개요
본 발명의 기본적 원리는 수복 효소가 고체 지지물에 공유 결합되어 있고 변형 및/또는 염기 부정합 및/또는 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위(손상)를 지닌 DNA 분자에 작용하게 하고, 변형 및/또는 염기 부정합 및/또는 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위의 제거를 관찰하는 것으로 구성된다. DNA 분자의 지지물에 대한 공유 결합은 반응성 스쿠아르산 유도체에 의해 이루어진다. 변형 및/또는 염기 부정합 및/또는 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위의 제거를 정성 및 정량하기 위한 편리한 방법은 변형 및/또는 염기 부정합 및/또는 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위에 대한 특이적 항체 또는 항체 단편들(또는 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위의 경우 이러한 부위의 유도체에대한 것도 포함)을 이용하는 것이다. 그런 다음, 이러한 특이적 항체의 결합 양을 측정한다. 수복이 절제에 의해 이루어질 경우, 적절히 삽입된 표지의 손실을 관찰함으로써 정성적 또는 정량적 검출 역시 수행할 수 있기 때문에, 이 표지(또는 표지에 대한 결합 영역)를 절제 후에는 더 이상 지지물에 결합되지 않는 DNA 단편에 삽입시켰다. 그런 다음, 해리된 표지 및/또는 결합된 상태로 있는 표지의 양을 측정할 수 있다.
본 발명의 방법을 이용하면, 예컨대 미리 결정된 DNA 변형 또는 염기 부정합 또는 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위에 대한 수복 효소를 포함하는 조성물의 수복 능력을 분석하는 것이 가능하다. 그러나, 다른 한편으로는 DNA 변형 또는 염기 부정합 또는 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위를 정해진 수복 효소를 이용하여 검출할 수 있다. 또한, DNA에 미치는 제제의 영향은, 제제의 영향에 의해 유발된 변형(예, 특이적으로 작용하는 수복 단백질을 이용함)은 물론, 이것의 수복을 분석함으로써 테스트할 수 있다. 이렇게 하여, 이러한 제제들의 DNA 손상 능력에 대해 설명할 수 있다. 마지막으로, 반응 조건, 특히 물질이 수복 과정에 미치는 영향을 분석하는 것도 가능하다.
수복 능력은 일반적으로 DNA 변형 또는 염기 부정합 또는 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위를 제거하는 동안의 활성을 나타낸다. 특히, 본 명세서에서 이해되는 수복 능력은, 샘플내의 DNA 변형 또는 염기 부정합 또는 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위의 양이 감소되는 정도이다. 정성 분석에 대해서는 실시예에서 설명할 것이며, 거기서 표현하는 수학적 관계는 개개의 유형의 분석법에 공통적으로 적용가능할 것이다.
D. 바람직한 양태의 상세한 설명
따라서, 본 발명은, 특히 DNA 구조의 정해진 변형(DNA 변형, DNA 손상 또는 DNA 부가물로도 칭함) 및 DNA 부정합의 효소적 수복에 대한 세포 또는 조직의 능력을 신속하고 정확하게 측정할 수 있는 방법에 관한 것이다. 또한, 정해진 DNA 수복 효소를 이용할 경우, DNA 구조의 변형 및 염기 부정합의 성질을 분석할 수 있다. 따라서, 본 발명은 DNA 구조 변형, 염기 부정합 및 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위의 수복 능력을 DNA 수복 효소를 포함하는 조성물(특히, 용액)을 이용하여 측정하는 방법 또한 제공하며, 이 방법은 DNA 구조의 변형, 염기 부정합 및 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위 그 자체를 검출하는 데 이용될 수도 있으며,
(a) DNA의 5'-말단이나 3'-말단, 또는 하나 이상의 디옥시리보오스 잔기의 2'-위치에서 이들이 DNA 분자내에 1차 또는 2차 아미노기를 지니도록 변형되어 있고, DNA 구조의 변형 및/또는 염기 부정합 및/또는 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위를 지닐 수 있는 한가닥 또는 두가닥 DNA 분자 또는 DNA 유사체를 1차 또는 2차 아미노기를 지닌 고체상 기질을 매개로 하여 스쿠아르산 에스테르와 반응시켜서 그 기질에 공유 결합시키는 단계;
(b) 고체상 기질에 결합된 DNA 분자를 DNA 수복 효소를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계;
(c) 용액내에 존재하는 수복 효소에 의한 가능한 구조적 변형 및/또는 염기 부정합 및/또는 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위의 수복을 정성적 및/또는 정량적으로측정하는 단계를 포함한다.
구조적 변형 및/또는 염기 부정합 및/또는 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위의 측정시에는 정해진 수복 효소가 사용되며, 이 효소는 특수한 구조적 변형 및/또는 염기 부정합 및/또는 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위를 수복할 수 있다.
수복 능력은 한 개체내에서도 세포 유형에 따라, 그리고 개체별로 매우 다양할 수 있다.
따라서, 수복 능력은
개체의 종양 감수성,
방사선 치료 또는 유전자독성 화학요법에 대한 종양 환자의 민감도,
방사선 치료 또는 유전자독성 화학요법에 대한 종양 세포의 저항성의 중요한 매개변수이다.
개체의 종양 감수성은 개체의 세포가 DNA 변형 및/또는 염기 부정합 및/또는 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위를 수복할 수 있는 능력과 관련이 있다. 본 발명의 방법을 이용하여, 세포 또는 조직 샘플로부터 적절히 얻은 조성물이 변형 및/또는 염기 부정합 및/또는 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위를 지닌 DNA에 작용하도록 하고, 이들의 제거를 증명함으로써 개체의 수복 상태 및 이에 따른 종양 감수성을 측정할 수 있다. 특정 발암물질이 특정 유형의 변형 및/또는 염기 부정합 및/또는 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위를 유발시킨다는 것이 알려진 경우, 이러한 점에 대해 수복 상태를 측정할 수 있으며, 이에 따라 발암물질에 대한 종양 감수성을 확립할 수 있다.
개체의 방사능 민감도 측정은, 예컨대 암과 같은 질병의 방사선 치료에서, 종양 근처의 건강한 방사능 민감성 조직이 손상되고, 영구적 손상도 약 2% 정도로 유발되기 때문에 환자의 약 30%는 입원 치료를 필요로 하고 있는 한 매우 중요하다. 반면에, 때로는 종양의 최적 통제를 위해 평상시보다 많은 양의 방사능을 이용하는 것이 바람직할 것이다. 치료하는 동안 방사능에 노출된 건강한 조직 샘플 또는 적절한 대용 조직을 모아서, 본 발명에 따른 방사능 민감도를 측정하기 위한 후속 분석용 조성물(현탁액 또는 추출물)을 제조한다. 이어서, DNA 손상 수복의 반응속도를 분석한다. 이 목적을 위해, 상기 조성물을 결합시키기 전 또는 후에 하나 이상의 적절한 변형 및/또는 염기 부정합 및/또는 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위가 삽입된 DNA 분자에 작용하도록 한다. 방사능 민감도는 시간에 따른 DNA 변형 또는 염기 부정합 또는 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위의 양, 특히 반응성 산소종에 의해 유발된 변형의 양, 예컨대 8-옥소구아닌의 양의 감소를 측정하고 표준 데이타와 서로 연관시킴으로써 측정할 수 있다. 이에 따라, 나뉘어진 방사능 조사의 경우 시간에 따른 총 방사능 양 및 단일 방사능 양의 분포를 개별적으로 측정하는 것이 가능하다. 특수한 양태에 따르면, 보다 더 정확한 방사능 양을 측정하기 위해 DNA 손상에 대해 세포의 수복 능력을 나타내는 전술한 바와 같이 측정한 데이타를 세포의 증식을 나타내는 데이타와 결합시키는 것도 제공된다. 이에 따라, 치료에 필요한 방사능 양을 평가하기 위해 종양 조직의 방사능 민감도를 측정할 수 있다.
종양 환자의 방사선 치료에 대한 민감도 측정과 유사하게, 유전자독성 화학 요법에 대한 민감도 역시 측정할 수 있다. 수복 능력은, 특히 하나 이상의 적절히선택된 DNA 변형에 대해 측정한다. 화학요법제의 작용 방식이 알려진 경우, 이 기작을 기초로 하여 DNA 변형을 선택할 수 있다. 예컨대, 알킬화제와 관련하여서는, 해당하는 알킬화된 염기의 수복을 분석할 수 있다. 상기 고려사항들은 특정 제제에 대한 종양 세포의 저항성을 측정하는 데에도 동일하게 적용된다.
수복 분석 방법의 기초는 변형된 DNA 분자, 또는 염기 부정합 또는 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위를 지닌 DNA 분자를 필터, 금, 비이드, 마이크로타이터 플레이트, 유리 표면과 같은 고체상에 공유 결합시키는 것이다. 적절한 지지물로는 특히 칩(DNA-칩 기술)이 있다. 고정화된 DNA를 세포 또는 조직으로부터의 단백질 추출물과 함께 항온처리한다. 그런 다음, 정해진 DNA 부가물 또는 염기 부정합 또는 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위가 추출물에 함유된 수복 단백질에 의해 제거되는 속도를 측정한다.
결합제로서 아미노기와 반응할 수 있는 반응성 스쿠아르산 유도체를 사용한다. 스쿠아르산 디에스테르를 사용하는 것이 바람직하며, 특히 두개의 1차 또는 2차 아미노기를 각각 서로 결합시킬 수 있는 스쿠아르산 디에틸 에스테르와 같은 스쿠아르산 디알킬 에스테르를 사용하는 것이 특히 바람직하다. 놀랍게도, 본 발명에 따라 사용되는 스쿠아르산 유도체는 지방족 아미노기하고만 반응을 하고, DNA 염기의 질소 원자와는 반응하지 않는다. 이것은 DNA의 반응기와 반응함으로써 원하지 않는 손상(예, 디알데히드)을 일으킬 수 있는 다른 결합제에 비해 중요한 이점이 된다. 5'-말단이나 3'-말단, 또는 DNA 분자 내부의 하나 이상의 디옥시리보오스 잔기의 2'-위치에 1차 또는 2차 아미노기를 도입함으로써, 한가닥 및 두가닥 올리고뉴클레오티드를 표면에 아미노기를 지닌 고체상에 부위 특이적으로 고정화시키기는 부드럽고, 재현성이 높고, 비용이 저렴한 방법을 발견하게 되었다. 아미노기는 바람직하게 5'-말단에 도입되어야 한다. 1차 아미노기(NH2기)의 도입이 특히 바람직하다. 두가닥 DNA 분자의 경우, 한가닥을, 예컨대 5'-말단을 매개로 지지물에 공유 결합시키는 것이 바람직하다.
고체상 기질로는, 예컨대 셀룰로오스, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트, 폴리아미드, 유리 또는 금 표면과 같은 그 자체로서 알려진 재료들을 이용할 수 있다. 고체상 기질은, 그 자체로서 알려진 형태, 예컨대 필터의 형태, 마이크로타이터 플레이트, 막, 컬럼, 비이드(예, 자성 비이드)의 형태로 존재할 수 있다.
본 발명에 따르면, DNA 분자란 용어는 임의의 천연 또는 합성 서열을 지닌 한가닥 및 두가닥 분자를 포함한다. 충분한 수의 염기가 수복 효소와의 상호 작용에 이용될 수 있다면 DNA 분자의 염기 수는 임의로 선택할 수 있다. 몇몇 경우에는, 염기 수가 적은 올리고뉴클레오티드도 충분할 수 있다. 몇몇 수복 효소의 경우, 3번의 완전한 꼬임을 지니고, 변형 또는 부정합 또는 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위가 중간 꼬임에 위치하는 올리고뉴클레오티드를 이용하는 것이 편리한 것으로 밝혀졌다. 그러나, 수복될 서열 길이 및 부위의 배열은 통상적인 실험을 통해 당업자들이 변화시킬 수 있다. 당업자는 서열의 변화 또한 분석할 수 있다. 재폴딩할 수 없는 서열을 이용하는 것이 유리한 것으로 밝혀졌다. 서열을 변화시킴으로써, 당업자는 환경이 수복하고자 하는 부위의 수복에 미치는 영향 또한 분석할 수 있다.
전술한 바와 같이, 지지물에 결합시키기 위해 DNA 분자에 아미노기를 삽입하였다. 또한, 변형 또는 염기 부정합 또는 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위를 삽입하였으며, 이들은 재수복될 수 있다. 또한, DNA 분자란 용어는 DNA 유사체도 포함한다.
DNA 유사체로서, 예컨대 포스페이트-당 골격에서 변형된 DNA 변형을 이용할 수 있다. 이것의 예로는 포스페이트기가 포스포티에이트(티오포스페이트)에 의해 치환되거나, 포스포디에스테르 결합이 펩티드 결합에 의해 치환되어진 분자들을 들 수 있다. 디옥시리보뉴클레오티드의 일부 또는 전부가 리보뉴클레오티드에 의해 치환된 것도 DNA 유사체 분자로서 간주된다.
본 발명에 따르면, DNA 수복 효소를 효소에 의해 수복될 수 있을 것으로 생각되는 DNA 변형 또는 염기 부정합 또는 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위를 포함하는 DNA 분자와 접촉시킨다. DNA의 상기 변경은 발암 인자(방사능 포함)에 의해 직접적 또는 간접적으로 유발될 수 있다. DNA 변형은, 특히 염기 변형을 포함한다. 일반적으로, 이들은 발암물질과 같은 반응성 제제와의 부가물이다. 그러나, 본 명세서에서 이해되는 DNA 변형은 특정 유형의 DNA 변경에 국한되는 것이 아니다. 본 발명에 따르면, 특히 정확히 정해진 변형 또는 염기 부정합을 지닌 합성된 DNA 분자, 특히 올리고뉴클레오티드를 구체적으로 분석하는 것 또한 가능하다. 또한, 변형은 DNA에 작용하는 제제에 의해서도 생성될 수 있다.
DNA 분자를 고체상에 공유 결합시키면 단일 반응기내에서 실험의 모든 실질적 단계를 신속하게 효율적으로 수행할 수 있다. 효소, 핵산, 항체 또는 발색 기질의 첨가 또는 제거, 완충액의 교환 및 세척 과정 등과 같은 절차는 거의자동화 피펫팅 작업만을 필요로 한다. 즉 DNA의 침전 및 반복적인 원심분리는 물론, DNA 분자를 다른 성분으로부터 크로마토그래피 또는 전기영동으로 분리하는 것과 같은 시간 및 노동집약적인 작업 단계가 없다는 것이다. 또한, 샘플 재료의 지나친 가공으로 인한 DNA 손실도 피할 수 있다.
본 발명의 또 다른 이점은, 그렇지 않으면 용액 중에서 자유롭게 존재할 고정된 DNA 분자가 분자의 정확히 정해진 지점에서 지지물에 공유 결합된다는 것이다. 따라서, DNA 변형, 염기 부정합 및 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위는 수복 효소에 자유롭게 접근이 가능하다.
다양한 표지된 기질을 이용하기 때문에, 단일 반응기내에서 다양한 DNA 변형 및/또는 DNA 부정합 및/또는 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위에 대한 수복 능력에 대해 세포 또는 조직으로부터의 단백질 추출물을 한번에 분석하는 것이 가능하다. 이것은 다양한 변형된 올리고뉴클레오티드를 반응기의 표면(또는 다른 지지물)에 결합시키고, 같은 변형을 지닌 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 각각 동일한 표지 또는 표지를 위한 동일한 결합기를 포함하게 함으로써 이루어진다.
본 발명의 방법을 이용하여, 한 개인의 수복 상태를 신속하고 정확하게 측정할 수 있으며, 이에 따라 이 사람의 환경 또는 작업장의 발암 인자에 대한 감수성을 신뢰성있게 평가할 수 있다. 이 방법은 종양 환자(예, 골수의 혈액 형성 시스템 세포, 장 세포 및 점막 세포)의 방사선 치료 또는 유전자독성 세포 증식 억제제에 대한 민감도를 신속히 평가하는 데 이용될 수도 있다. 마지막으로, 이 방법을 이용하면 DNA-반응성 세포 증식 억제제에 대한 저항에 중요한 역할을 하는 종양 세포의 수복 능력을 신속하고 정확하게 측정할 수 있다.
본 명세서에서 기술하는 결합 방법은 기본적으로 올리고뉴클레오티드를 고체상에 부드럽고 부위 특이적으로 고정하기에 적합하다.
본 명세서에서 기술하는 방법의 바람직한 실시 형태로는
선택적으로 변형된 핵산을 고체상에 고정시키는 방법, 및
변형된 핵산 분자를 고체상(예, 필터, 마이크로타이터 플레이트, 막, 유리 표면, 금, 비이드 및 자성 비이드)에 공유 결합시키기 위해 스쿠아르산 디에틸 에스테르를 이용하는 방법을 들 수 있다.
변형된 핵산 분자를 공유 결합시키기 위한 결합제로는 다른 어떤 물질보다도 스쿠아르산이 추천된다.
놀랍게도, 특히 스쿠아르산 디에스테르와 같이 활성화된 스쿠아르산 유도체는 DNA의 푸린 및 피리미딘 염기의 아미노기와 반응하지 않는다. 오히려, 이들은 1차 및 2차 지방족 아미노기와 선택적으로 반응한다. 다른 결합제와 비교하였을 때, 이것은 중대한 이점이 된다: 결합제에 의한 DNA 분자의 원하지 않는 손상 또는 교차 결합이 발생하지 않는다.
예컨대, 5'-말단에 아미노기를 도입함으로써 DNA 분자를 역시 표면에 아미노기가 존재하는 고체상에 부위 특이적으로 결합시킬 수 있다.
E. 특정 발암물질-특이적 염기 변형의 합성 삽입에 의한 정해진 DNA 부가물을 지닌 DNA 기질의 생산 및 특정 염기 부정합 또는 탈푸린 또는 탈피리미딘부위를 지닌 DNA 분자의 생산.
본 발명의 방법에서는 고정된 서열 및 정해진 변형 또는 염기 부정합 또는 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위를 지닌 DNA 분자를 유리하게 이용할 수 있다. 아래에서예를 통해 다양한 방법을 설명할 것이지만, 이는 본 발명을 제한하려는 의도는 아니다. 필요한 합성 기술은 당업자에게 공지되어 있으며, 문헌을 통해 입수할 수 있다.
I. (a) 염기 서열의 소정의 지점에서 특정 염기 변형(예, 8-옥소구아닌, O6-알킬구아닌)을 지니고,
(b) DNA 분자의 5'-말단에 NH2기를 포함하며,
(c) 3'-말단에 OH기를 포함하는
정해진 서열의 한가닥 올리고뉴클레오티드의 일반적으로 이용되는 방법을 통한 합성.
I.I. DNA 분자의 3'-말단을 표지하는 방법.
예컨대, 형광 표지된 트리포스페이트를 말단 디옥시뉴클레오티드 트랜스퍼라아제(TdT)를 이용하여 삽입함으로써 3'-말단을 효소를 이용하여 연장시키는 방법이다. 다양한 변형된 올리고뉴클레오티드가 동일한 지지물에 결합될 경우(다양한 DNA 변형에 대한 수복 능력 측정을 위해 단백질 추출물을 동시 분석함), 각종 형광 염료가 사용되는데, 이때 동일한 변형을 지닌 올리고뉴클레오티드는 각각 동일한 형광 염료를 함유한다. 대안으로, 또 다른 표지 또는 표지에 결합할 수 있는 기를 삽입할 수 있다. 또한, 표지는 3'-말단에 존재할 필요가 없고, 단지 절제된 후 지지물에 더 이상 결합되지 않는 위치에 존재하기만 하면 된다는 것을 쉽게 알 수 있다.
I.II. 두가닥(ds) 올리고뉴클레오티드의 생산:
(a) 변형된 올리고뉴클레오티드와 상보적 올리고뉴클레오티드와의 융합(바람직하게, 변형을 지닌 가닥을 지지물에 공유 결합시킨다),
(b) 단백질 추출물에 의한 DNA 부정합의 수복(미스매치 수복) 분석을 위해, 변형되지 않은 또는 변형된 올리고뉴클레오티드를 염기 서열의 특정 위치 또는 DNA 부가물 위치의 반대편에서 상이한 천연 올리고뉴클레오티드를 포함하는 상보적 올리고뉴클레오티드와 융합시킨다.
I.III. 화학적으로 안정한 또는 절단가능한 링커를 이용하여 5'-말단에서 ds-올리고뉴클레오티드를 고체상과 결합시키는 방법. 일반적으로, 본 발명에서는 고체 지지물의 표면에 결합되고, 표면에서 떨어진 쪽의 말단에서 스쿠아르산에 의해 DNA 분자를 결합시킬 수 있는 아미노기를 지닌 링커(스페이서)를 제공하는 것이 가능하다. 링커 역시 DNA 분자에 결합될 수 있으며, 아미노기를 지닌 이 링커는 다시 스쿠아르산 결합을 제공한다. 링커 내부에는, 절단가능한 기가 제공될 수 있으며, 이것은 후속 분석을 위해 적절한 시약을 이용하여 DNA 분자를 고체상 기질로부터 분리하는 것을 가능하게 한다.
I.IV. 균일하게 변형된 ds-올리고뉴클레오티드만을 이용할 경우, DNA 분자를, 예컨대 먼저 5'-NH2말단을 매개로 고체상에 결합시킬 수 있고, 이어서 3'-말단에
(a) 형광 염료와 같은 검출가능한 표지가 고친화력으로 결합하는(예, 스트렙타비딘에 결합된 TRITC) 변형된 디옥시뉴클레오티드(예, 비오티닐화된 dUTP)를 이용하거나,
(b) 형광 염료에 결합된 디옥시뉴클레오티드(또는 방사능 표지된 것이나, 몇몇 다른 방식으로 표지된 것)를 이용하여 효소적으로 표지할 수 있다.
II. ds-올리고뉴클레오티드 또는 선형 플라스미드 DNA를 발암 인자(벤조(a)피렌디올에폭시드, 메틸 또는 에틸 니트로소우레아와 같은 반응성 화학 물질, 자외선, 이온화 방사능, 과산화수소, 가시광선에 결합된 메틸렌 블루)로 처리함으로써 특수한 DNA 변형을 지닌 DNA 기질을 생산하는 방법.
II.I. 아이템 I에서 기술한 바와 같이 분자의 5'-말단에 NH2기를, 3'-말단에 OH기를 지닌 ds-올리고뉴클레오티드를 생산한다. 그런 다음, 발암물질로 분자를 처리한다. NH2기를 매개로 고체상에 분자를 결합시키고(I. IV. 참조), 예컨대 형광 염료로 결합된 분자를 효소적으로 표지한다.
II.II. 대안으로, ds-올리고뉴클레오티드를 먼저 고체상에 결합시킬 수 있다. 그런 다음, 올리고뉴클레오티드를 반응성 발암물질 처리하고, 효소적으로 표지한다.
II.III. 플라스미드 DNA의 5'-말단에 NH2기를 도입하는 방법:
(a) 어느 하나의 프라이머는 5'-말단에 NH2기를 보유하는, 프라이머를 이용한 PCR 방법.
(b) 제한 엔도뉴클레아제를 이용하여 플라스미드를 절단하여, 두개의 새로운 더 짧은 DNA 분자를 얻는데, 이들 각각은 두개의 5'-말단/DNA 분자 중 어느 하나에 오직 한개의 NH2기를 지니도록 하는 방법. 예컨대, 비오티닐화된 dUTP를 플라스미드 분자의 3'-말단에 효소를 이용하여 삽입한다. 그 후, 발암물질로 처리하면, DNA 기질이 고체상에 결합된다. 이러한 실시 형태에 따르면, 비오틴에 대한 스트렙타비딘-염료 접합 결합을 통해 검출 반응이 이루어질 수 있다.
III. 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위를 지닌 DNA 분자의 생산:
예컨대, 염기가 효소에 의해서만 분리될 수 있도록 하면서, 우리딘 모노포스페이트가 삽입된 DNA 분자를 합성하는 것이 가능하다. 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위는 남겨두면서 변형된 염기를 제거하는 효소도 알려져 있다.
F. 수복 테스트의 실제 수행
수복 테스트를 수행할 때, 수복 효소를 포함한다고 추측되는 조성물을 고정화된 DNA와 접촉시킨다. 이 조성물은 세포 추출물 또는 조직 추출물일 수 있다. 이러한 경우, 본 발명의 방법을 통해 세포 또는 조직의 수복 활성에 대해 설명할 수 있다.
효소적 수복에 의한 특정 DNA 변형 또는 염기 부정합 또는 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위의 제거를 검출하는 것은 아래의 두가지 방법으로 수행할 수 있다:
I. 특정 DNA 변형(예, 8-옥소구아닌, O6-알킬구아닌, DNA의 PAH-부가물, 피리미딘 2량체 등)에 특이적으로 결합하는 모노- 또는 폴리클로널 항체를 이용하는 방법. 이러한 항체들은 문헌에 기술되어 있으며, 당업자들에게 공지된 방법을 통해 생산할 수 있다. 적절한 친화력을 지닌 항체 단편들을 이용할 수 도 있다.
이 방법은 기본적으로 적절한 항체가 존재하는 모든 DNA 변형을 검출하는 데 적합하다.
이 절차에서는 DNA 분자의 표지화는 필요하지 않다.
세포 추출물의 수복 능력을 정량 분석하기 위해, 반응물 중의 DNA 부가물의 수를 알아야 한다; DNA 분자당 DNA 부가물의 수는 무의미하다.
이 목적을 위해, 먼저 정해진 DNA 변형(정해진 DNA 부가물)을 포함하거나 특정 발암물질로 처리된 고정화된 DNA 분자를 관찰할 세포 또는 조직 추출물과 항온처리한다. 이어서, 변형체에 특이적으로 결합하는 항체(1차 항체)를 첨가하고; 그 다음에는 일반적으로 결합된 항체의 양을 정량하기 위해 2차 항체를 첨가하는데, 이 2차 항체는 형광 염료(TRITC, FITC, 플루오레세인 등)로 표지되어 있거나, 다른 몇가지 방식, 예컨대 방사능이나, 발색 반응을 일으키는 적절한 기질에 결합되어 있는 효소(예, 포스파타아제, 카탈라아제)로 표지되어 있다. 일정한 조건하에서의 항체 분자의 결합은 남아있는 DNA 부가물의 양에 직접적으로 비례하는데(Nehls 및 Rajewsky, 1990); 즉, 염료의 강도는 부가물 양에 대한 척도이다.
유사하게, 염기 부정합 또는 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위 역시 적절한 항체로 분석할 수 있다. 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위의 수복을 분석할 경우, 적절한 화학물질, 예컨대 메톡시아민, 히드라진 유도체 또는 치환된 방향족 아민으로 이러한 위치를 유도하고, 검출 목적을 위해 유도된 위치에 대한 항체(또는 항체 단편들)를 이용하는 것 또한 가능하다. 편의상, 수복 효소 작용시에 유도한다.
II. 절제 수복을 통해 DNA 변형 및 염기 부정합을 제거할 경우 DNA 틈이 생긴다는 사실을 이용하는 방법.
이 방법은 DNA 틈을 유발시키는 수복 과정을 검출하는 데 적합하다. 공지된 수복 과정의 대부분은 이 기작에 따라 일어난다. 한가지 예외는, 예컨대 AT에 의한 O6-알킬구아닌의 수복이다(C. II. III 참조).
이 방법의 경우, ds-올리고뉴클레오티드를 이용하는 것이 바람직하다.
이 방법을 수행하기 위해,
(a) 단 하나의 DNA 가닥만이 정해진 DNA 부가물을 포함할 수 있다는 점,
(b) 이 DNA 가닥은 고정화되어 있다는 점, 및
(c) 이 DNA 가닥은 절제 후 표지가 더 이상 지지물에 결합되지 않도록 DNA 변형에 대해 표지되어 있다는 점을 확실히 해야 한다. 예컨대, DNA 가닥이 5'-말단을 매개로 지지물에 공유 결합될 경우, 3'-말단을 표지할 수 있다. 이러한 경우, 표지는 일반적으로 수복시 DNA가 절제되어진 위치에 대해 3' 위치에 배치되어야 한다. 절제에 의해 제거되는 구조적으로 변형된 뉴클레오티드를 표지할 수도 있다. 이러한 경우, 방사능 표지가 특히 유용하다. 수복(절제)시 손실되지 않는 추가의 표지를 삽입하는 것도 가능한데, 이를 통해, 예컨대 고정화된 DNA의 양을 이 방법의 매 단계에서 분석할 수 있다. 그러나, DNA 변형, 염기 부정합 또는 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위의 제거를 분석하기 위해서는 전술한 바와 같은 추가적으로 제공될수도 있는 표지는 적합하지 않다.
세포 추출물의 수복 효율을 정량하기 위해, 반응물당 DNA 부가물의 수를 알아야 한다.
고정화된 DNA 분자를 분석할 세포 또는 조직 추출물과 항온처리한다. DNA 부가물을 효소적 절제에 통해 제거할 경우, 공유 결합된 가닥들은 두개의 단편으로 분리되고, 이들 단편들 중 표지를 지닌 것은 더 이상 고체상에 공유 결합되지 않는다. 이 DNA 분자들을 적절한 완충 혼합물에서 가열함으로써, 두 DNA 가닥 사이의 수소 결합을 해체시킨다. 이렇게 하여, 결합되지 않은 단편들은 상보적(비표지된) 대응 가닥으로부터 분리되며, 예컨대 이들을 흡입하여 쉽게 제거할 수 있다. DNA 부가물을 보유하는 DNA 분자들은 여전히 표지를 지니기 때문에 쉽게 정량할 수 있다. 염기 부정합은 물론, 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위도 같은 방법으로 분석할 수 있다.
G. 도면의 간단한 설명
첨부된 도면에서,
도 1은 세포 추출물에 의한 ds-올리고뉴클레오티드로부터의 8-옥소구아닌 제거 반응속도를 보여준다.
도 2는 세포 추출물에 의한 O6-에틸구아닌의 수복 반응속도를 보여준다.
H. 실시예
변형된 올리고디옥시뉴클레오티드의 제조
각각 34개의 뉴클레오티드로 구성된 3가지의 상이한 올리고뉴클레오티드를제조하였으며, 이들은 5'-말단에 NH2기를 포함하였다. 16번째 위치를 제외하면, 3개의 올리고뉴클레오티드의 염기 서열은 동일하였고, 다음과 같았다: 5'-GGC TTC ATC GTT ATT X ATG ACC TGG TGG ATA CCG-3', 여기서 16번째 위치의 X는 8-옥소구아닌 또는 O6-에틸구아닌 또는 구아닌일 수 있다. 16번째 위치의 염기로서, 제1 올리고뉴클레오티드는 산화 생성물인 8-옥소구아닌, 제2 올리고뉴클레오티드는 알킬화 생성물인 O6-에틸구아닌, 제3 올리고뉴클레오티드는 천연 염기 구아닌을 포함하였다. 제3 올리고뉴클레오티드를 대조군으로 이용하였다. 또한, 상보적 DNA 대응-가닥을 합성하였는데, 이것은 4개의 천연 염기만으로 이루어졌으며, 변형된 올리고뉴클레오티드의 3'-말단보다 2개의 염기만큼 돌출되어 있다. 반대편 X는 C였다. 이것을 통해 변형된 올리고뉴클레오티드 또는 대조군 올리고뉴클레오티드의 3'-말단에 비오티닐화된 dUTP 또는 형광 표지된 뉴클레오티드를 효소적으로 삽입할 수 있었다.
올리고뉴클레오티드는 포스포아미디티드 방법을 이용하여 완전 자동화 방식으로 제조하였다. 여느 때처럼, 고체상(CPG)에서 3'-말단을 매개로 합성하였다. 지지물에서 분리하고, 보호기를 절단한 후(농축 암모니아 중의 2-머캡토에탄올 0.25 M, 55℃, 20 시간), 올리고뉴클레오티드를 겔 여과를 통해 암모니아로부터 분리하였고, 이어서 예제성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 HPLC를 통해 정제하였다. 또 다른 정제 단계를 수행한 후, 올리고뉴클레오티드를 동결건조시켜서 -20℃에서 보관하였다.
두가닥(ds) 기질의 제조
2차 증류수에 용해시킨 올리고뉴클레오티드(100 pmol DNA 분자/ml)를 1.2배의 양의 상보적 DNA 가닥(120 pmol/ml)과 혼합하였다. 이 샘플을 90℃에서 5분 동안 수조에서 가열하였다; 수조의 온도가 실온으로 냉각되는데 걸리는 몇시간 동안 한가닥 분자들의 두가닥(ds) 올리고뉴클레오티드로의 융합이 일어났다.
활성 마이크로타이터 플레이트의 제조
테스트를 위해, 웰 바닥이 평평하고, 표면에 NH2기가 고정화되어 있는(10 nmol NH2기/웰) 마이크로타이터 플레이트(MP)를 이용하였다. MP의 각 웰에 메탄올(> 99%) 중의 스쿠아르산 디에틸 에스테르(0.1 mM) 및 트리에틸아민(0.01 mM) 용액 25 ㎕를 피펫으로 분주하였다. MP의 두껑을 닫고 실온에서 10분 동안 항온처리하였다. 용액을 제거한 후, 웰을 메탄올로 세척하고 건조시켰다.
활성화된 MP에 대한 ds-올리고뉴클레오티드의 공유 결합
ds-올리고뉴클레오디드를 활성화된 MP 웰의 표면에 결합시키기 위해, 50 mM 나트륨 보레이트 수용액 중의 DNA 용액(50 pmol 8-OxoGua-ds-올리고뉴클레오티드/ml, 2.5 pmol O6-EtGua-ds-올리고뉴클레오티드/ml, pH 9.0) 10 ㎕를 각 웰에 피펫으로 분주하고, MP의 두껑을 닫았다. 실온에서 20분이 경과한 후, DNA 용액을 제거하고, 웰을 2차 증류수로 세척하였다.
잔류하는 스쿠아르산의 반응기를 에탄올아민 수용액(100 mM, pH 8.5) 30 ㎕로 불활성화시켰다. 10분 후, MP 웰을 2차 증류수로 세척하고 건조시켰다.
실시예 A: ds-올리고뉴클레오티드로부터의 8-옥소디옥시구아노신의 제거
수복 유형
대부분의 DNA 변형, 복제 후 염기 부정합 및 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위 는 절제 수복에 의해 DNA로부터 제거된다(효소적 가공). DNA 산화 생성물인 8-옥소구아닌(8-OxoGua)은 동일한 기작 원리에 따라 수복된다. 사람의 경우, DNA로부터 이러한 염기 변형을 제거하는 두가지 이상의 상이한 수복 시스템이 존재한다. 마우스의 경우에는 이 두가지의 수복 시스템 중 한가지만이 확인되었다.
8-OxoGua-절제 기작과는 독립적으로, 뉴클레오티드 크기의 갭이 DNA 사이에 형성된다.
테스트의 실제 수행
테스트를 위해서, 웰 바닥이 평평하고, 표면에 ds-올리고뉴클레오티드(30 x 10-15mol dsDNA-분자/웰)가 고정화된 MP를 사용하였으며, 이 올리고뉴클레오티드는 16번째 위치에 산화 생성물인 8-OxoGua를, 35번째 및 36번째 위치에 비오티닐화된 우라실을 포함하였다.
마우스 골수종 세포인 세포주 P3-X63-Ag로부터 분석할 세포 추출물을 준비하였다. 이 목적을 위해, 세포를 빙냉 PBS로 2회 세척하고, 5 x 107개 세포/ml 농도의 완충 혼합물 A(50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 100 mM KCl, 0.1% BSA)에 재현탁시켰다. 이 세포를 초음파처리로 분해한 다음, 고체 구성물을 원심분리(10,000 g, 4℃, 10분)를 통해 제거하였다. 맑은 상청액을 -80℃에서 분할하여 보관하였다.
MP의 10개 웰에 완충 혼합물 A 및 6 x 105개의 마우스 골수종 세포의 단백질 추출물을 포함하는 용액 25 ㎕를 피펫으로 분주하였다(샘플 영역).
4개의 영역에 단백질 추출물이 없는 샘플 완충액 25 ㎕를 피펫으로 분주하였다(대조군 영역). MP를 37℃에서 항온처리하였다.
5, 30, 60, 90 및 120분 후, 정확히 매 시점마다 각각 2개의 웰에 1 ㎕의 프로테이나제 K(1 mg/ml)를 첨가하여 반응을 종료시켰다. 대조군 영역의 웰에는 120분 후 역시 1 ㎕의 프로테이나제 K를 첨가하였다. MP를 90℃에서 5분 동안 가열한 다음, 재빨리 얼음물 혼합물에서 냉각시켰다. 이 용액을 웰에서 제거하고, 웰을 30 ㎕의 완충액 B(50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 1 mM EDTA, 0.1% BSA)로 3회 세척하였다.
완충액 B 중에 스트렙타비딘-Cy3 접합체를 포함하는 용액(2.5 ㎍/ml; 시그마사에서 구입) 25 ㎕를 첨가한 후, MP를 37℃에서 45분 동안 항온처리하였다. 용액을 제거한 후, MP의 웰을 완충액 B로 3회 헹군 다음, 마지막에는 동일한 완충액 25 ㎕를 첨가하였다.
개개의 웰의 형광 염료의 강도를 형광 현미경, CCD 카메라 및 컴퓨터 보조 분석 프로그램을 구비한 영상 분석기를 이용하여 정량하였다. 대안으로, 고감도 UV-ELISA 판독 장치를 이용하여 형광 강도를 측정할 수 있다.
샘플의 계산은 하기 수학식 1에 따라 수행하였다.
상기 식 중,
R은 fmol(10-15mol) 단위의 수복된 8-옥소구아닌 분자의 양이고,
M은 각 MP 웰에 존재하는 8-옥소구아닌 분자의 총 양이고,
K0는 대조군 영역의 웰의 형광 강도이며,
P는 샘플 영역의 웰의 형광 강도이다.
도 1은 반응 시간에 따른 정해진 세포 추출물(마우스 골수종 세포주의 6 x 105개의 세포로 이루어진 추출물)에 의한 8-옥소구아닌의 수복을 보여준다. 곡선의 최초 기울기로부터 표준 조건(8-옥소구아닌 총 양은 30 fmol; 6 x 105개 세포의 추출물)하에서 시간당 얼마나 많은 8-옥소구아닌 분자가 올리고뉴클레오티드로부터 최대한으로 제거되는지를 계산할 수 있다. 이 경우, 시간당 13.7 fmol로 제거되었다.
실시예 B: ds-올리고뉴클레오티드내의 O 6 -에틸구아닌의 탈알킬화
수복 유형
알킬화 발암물질에 의해 형성된 O6-에틸구아닌(O6-EtGua)은 O6-알킬구아닌-DNA-알킬트랜스퍼라아제(AT)에 의한 일 단계로 수복된다. AT는 구아닌의 O6-위치로부터 알킬기를 단백질의 활성 중심에 있는 시스테인으로 전달한다. 알킬기의 전달을 의해 AT는 불활성화된다. 따라서, 각 AT 분자는 항상 한개의 O6-EtGua 분자만을수복할 수 있다. 그러므로, 수복은 2분자 반응으로 수행된다.
수복은 O6-에틸디옥시구아노신에 대한 항체를 이용하여 분석할 수 있다. 모노클로널 또는 폴리클로널 항체를 이용할 수 있다. 모노클로널 항체는, 예컨대 다음과 같이 제조할 수 있다.
먼저, O6-에틸리보구아노신의 합성 및 알킬화 생성물의 KLH(키홀 림펫 헤모시아닌)로의 결합을 R. 뮐러(R. Muller) 및 M.F. 라쥬스키(M.F. Rajewsky)가 기술하는 방법[Z. Naturforsch., 33c, 897-901, 1978]대로 수행한다. 항체의 생산을 위해, 항원을 BALB/c 마우스에게 3개월에 걸쳐 5차례 복강 주사한다. 면역화된 마우스의 비장 세포를 골수종 세포(P3-X63-Ag8)와 융합시켰다. 이렇게 얻은 하이브리도마를 BALB/c 마우스의 복강 대식세포를 포함하는 마이크로타이트 플레이트에서 배양하였다. O6-에틸디옥시구아노신에 대한 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 재클로닝하고 배양하였다. 두 단계의 정제(암모늄 설페이트 침전, 50% 포화 및 DE-52 컬럼 재료를 이용한 이온 교환 크로마토그래피)를 통해 항체를 다른 단백질로부터 분리하였다. 정제된 항체를 농축시켜서 -80℃에서 분할하여 보관하였다.
테스트의 실제 수행
테스트를 위해, 웰에 16번째 위치에 O6-EtGua를 포함하는 ds-올리고뉴클레오티드가 고정화되어 있는 MP(1.2 x 10-15mol dsDNA 분자/웰)를 사용하였다. 3'-말단은 충전하지 않았다. 웰의 일부에는 16번째 위치에 구아닌만을 포함하는 ds-올리고뉴클레오티드를 고정화하였다(대조군 영역 2).
L929 마우스 섬유아 세포를 배양 배지(10% 태아 송아지 혈청이 첨가된 DMEM)중의 트립신 EDTA로 한번 처리하고, 빙냉 PBS로 두번 처리한 후 세척함으로써 분석할 세포 추출물을 준비하였다. 그런 다음, 세포를 6 x 107개 세포/ml 농도의 추출 완충액(500 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.8, 1 mM 디티오트레이톨, 1 mM EDTA 및 5% 글리세롤)에 재현탁시키고, 초음파처리로 분해하였다. 불용성 구성물을 원심분리(10,000 g, 4℃, 10분)를 통해 제거하고, 맑은 상청액을 -80℃에서 분할하여 보관하였다.
MP의 14개 웰에, 반응 완충액(50 mM HEPES, pH 7.8, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 5% 글리세롤 및 0.05% 트리톤 X-100) 및 L929 마우스 섬유아 세포로부터의 단백질 추출물 3 ㎕를 포함하는 용액 50 ㎕를 피펫으로 분주하였다(샘플 영역).
4개의 웰에, 단백질 추출물이 없는 반응 완충액 25 ㎕를 피펫으로 분주하였다(대조군 영역 1). 항체의 비특이적 결합을 측정하기 위해 비변형된 ds-올리고뉴클레오티드를 포함하는 대조군 영역 2의 4개의 웰에 반응 완충액 및 단백질 추출물을 피펫으로 분주하였다.
반응한 지 5, 10, 15, 20, 30, 45, 60분 경과 후, 정확히 매 시점마다 각각 두개의 웰에 프로테이나제 K(1 mg/ml) 1 ㎕를 첨가함으로써 반응을 종료시켰다. 대조군 영역 1 및 2의 웰에는 60분 후에 역시 프로테아나제 K 1 ㎕를 첨가하였다.
37℃에서 15분간 더 항온처리 한 후, 웰에서 용액을 제거하고, 완충액 C(100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA 및 0.1% BSA) 30 ㎕로 3회 세척하였다.
그 후, 완충액 C 중에 항-(O6-EtGua) 항체 2 ㎍를 포함하는 용액 15 ㎕를 각 웰에 피펫으로 분주하였다. 실온에서 45분 경과 후, 항체 용액을 제거하였다. 이어서, 웰을 완충액 C로 3회 세척하여 결합하지 않은 항체 분자를 제거하였다.
특이적으로 결합된 항체 분자를 검출하기 위해, 완충액 C 중의 TRITC-표지된 항-(IgG)F(ab)2단편들(5 ㎍/ml) 20 ㎕를 웰에 첨가하였다. 실온에서 45분 경과 후, 항체 용액을 제거하였다. 결합하지 않은 항체는 완충액 C 25 ㎕으로 3회 세척함으로써 제거하였다. 이어서, 완충액 C 25 ㎕를 피펫으로 웰에 분주하였다. 개개의 웰의 형광 강도는 전술한 바와 같이 측정하였다.
개개의 샘플 값은 하기 수학식 2에 따라 계산하였다.
상기 식 중,
R은 fmol(10-15mol) 단위의 수복된 O6-EtGua 분자의 양이고,
M은 각 웰에 존재하는 fmol 단위의 O6-EtGua 분자의 총 양이고,
K1은 단백질 추출물이 없는 웰의 총 형광 강도이고,
K2는 항체의 비특이적 결합이 없는 웰의 형광 강도이며,
P는 샘플 영역의 웰의 형광 강도이다.
도 2에서는, 시간에 따른 정해진 세포 추출물(L929 마우스 섬유아세포로부터의 단백질 추출물 3 ㎍)에 의한 O6-EtGua의 수복이 도시된다. O6-EtGua의 수복은 2분자 반응(2차 반응)으로 일어나기 때문에, 테스트 제제내의 AT 분자의 농도(AT) 및 수복 반응의 속도 상수 K는 하기 수학식 3에 따라 계산할 수 있다.
상기 식 중, A0, B0및 P는 각각 수복 반응 시간 t에서의 O6-EtGua 분자의 초기 농도(A0), AT 분자의 초기 농도(B0) 및 탈알킬화된 O6-EtGua 분자의 농도(P)에 해당된다. AT 및 K의 계산을 위한 컴퓨터 프로그램이 개발되었다. 이에 따르면, 세포 추출물은 0.7 fmol AT 분자를 포함하였고, K는 4 x 107l/mol x 초였다.
문헌

Claims (12)

  1. (a) DNA의 5'-말단이나 3'-말단, 또는 하나 이상의 디옥시리보오스 잔기의 2'-위치에서 DNA 분자내에 삽입된 1차 또는 2차 아미노기를 매개로 반응성 스쿠아르산 유도체와의 반응에 의해 1차 또는 2차 아미노기를 지닌 고체상 기질에 공유 결합되어 있고, 변형 및/또는 염기 부정합 및/또는 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위를 지닌 한가닥 또는 두가닥 DNA 분자를 제공하는 단계;
    (b) DNA 분자를 DNA 수복 효소를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및
    (c) DNA 변형 및/또는 염기 부정합 및/또는 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위의 제거를 측정하는 단계
    를 포함하는 DNA 수복 효소에 의한 DNA 변형 및 염기 부정합은 물론, 탈푸린 및 탈피리미딘 부위의 수복 분석 방법.
  2. 제1항에 있어서, 반응성 스쿠아르산 유도체가 스쿠아르산 디에스테르, 특히 스쿠아르산 디에틸 에스테르인 것이 특징인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 고체상 기질에 결합된 DNA 분자로부터의 DNA 변형 및/또는 염기 부정합 및/또는 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위의 제거는 변형 및/또는 염기 부정합 및/또는 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위 및/또는 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위의 유도체에 대한 항체 또는 해당하는 항체 단편들을 이용하여 측정하는 것이 특징인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 고체상 기질에 결합된 DNA 분자로부터의 DNA 변형 및/또는 염기 부정합 및/또는 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위의 제거는, 변형 및/또는 염기 부정합 및/또는 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위가 절제된 후 고체상 기질과 더 이상 결합하지 않는 DNA 분절의 손실을 검측하는 절제 수복을 통해 측정하는 것이 특징인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 절제 수복에 의해 손실된 DNA 분절이 발색 분자, 형광 분자, 방사능 원자와 같은 표지 또는 기 결합 표지를 포함하는 것이 특징인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 표지 또는 기 결합 표지는 DNA 분자를 고체상 기질에 결합한 후 삽입하는 것이 특징인 방법.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 다양한 변형 또는 염기 부정합 또는 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위를 지닌 각 DNA 분자는, 다양한 DNA 변형 또는 염기 부정합 또는 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위의 수복을 동시에 분석하기 위해 다양한 표지 또는 기 결합 표지와 함께 제공하는 것이 특징인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 변형제가 고체상 기질에 결합된 DNA 분자에 작용하여 변형이 DNA 분자에 삽입되는 것이 특징인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 수복 효소를 포함하는 조성물의 수복 능력은 하나 이상의 DNA 변형 또는 염기 부정합 또는 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위에 대해 측정하는 것이 특징인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 수복 효소를 포함하는 조성물은 세포 또는 조직 샘플에서 회수하고, 수복 능력은 개체의 종양 감수성, 개체의 방사능 민감도 또는 개체의 유전자독성 화학요법에 대한 민감도 혹은 종양 세포의 방사능 또는 화학치료제에 대한 내성을 측정하는데 이용하는 것이 특징인 방법.
  11. (a) 1차 또는 2차 아미노기를 지닌 고체상 기질;
    (b) DNA의 5'-말단이나 3'-말단, 또는 하나 이상의 디옥시리보오스 잔기의 2'-위치에서 DNA 분자내에 삽입된 1차 또는 2차 아미노기를 지닌 DNA 분자;
    (c) 가능하다면, DNA 변형 또는 염기 부정합 또는 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위 또는 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위의 유도체에 대한 항체 또는 항체 단편들; 및
    (d) 반응성 스쿠아르산 유도체
    를 포함하는 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항의 방법을 수행하기 위한 테스트 키트.
  12. (a) DNA의 5'-말단이나 3'-말단, 또는 하나 이상의 디옥시리보오스 잔기의 2'-위치에서 DNA 분자에 삽입된 1차 또는 2차 아미노기를 매개로 반응성 스쿠아르산 유도체와의 반응에 의해 1차 또는 2차 아미노기를 지닌 고체상 기질에 공유 결합되어있고, 변형 및/또는 염기 부정합 및/또는 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위를 지닐 수 있으며, 표지 또는 기 결합 표지를 지닐 수 있는 한가닥 또는 두가닥 DNA 분자; 및
    (b) 선택적으로 DNA 변형 또는 염기 부정합 또는 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위 또는 탈푸린 또는 탈피리미딘 부위의 유도체에 대해 특이적으로 유도된 항체 또는 항체 단편들
    을 포함하는 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 따른 방법을 수행하기 위한 테스트 키트.
KR1020017005444A 1998-11-03 1999-11-02 Ｄｎａ 수복 분석 방법 및 테스트 키트 KR20010103630A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19850680.5 1998-11-03
DE19850680A DE19850680A1 (de) 1998-11-03 1998-11-03 Verfahren zur Bestimmung der Reparaturkapazität von DNS-Reparaturenzyme enthaltenden Lösungen und zum Nachweis von DNS-Strukturmodifikationen und Basenfehlpaarungen
PCT/EP1999/008365 WO2000026402A1 (de) 1998-11-03 1999-11-02 Verfahren und testkit zur untersuchung der reparatur von dns

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20010103630A true KR20010103630A (ko) 2001-11-23

Family

ID=7886561

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020017005444A KR20010103630A (ko) 1998-11-03 1999-11-02 Ｄｎａ 수복 분석 방법 및 테스트 키트

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20020022228A1 (ko)
EP (1) EP1127165A1 (ko)
JP (1) JP2002528134A (ko)
KR (1) KR20010103630A (ko)
CN (1) CN1325456A (ko)
AU (1) AU1378300A (ko)
BR (1) BR9914952A (ko)
CA (1) CA2348937A1 (ko)
DE (1) DE19850680A1 (ko)
WO (1) WO2000026402A1 (ko)
ZA (1) ZA200103497B (ko)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2809417B1 (fr) * 2000-05-24 2004-07-30 Commissariat Energie Atomique Detection et caracterisation de l'activite de proteines impliquees dans la reparation de lesions de l'adn
WO2002065889A1 (de) * 2001-02-21 2002-08-29 Rubikon Ag Verfahren zur untersuchung von zell- und gewebeproben
WO2002101095A1 (en) * 2001-06-08 2002-12-19 U.S. Genomics, Inc. Methods and products for analyzing nucleic acids using nick translation
EP1476753B1 (en) * 2001-11-14 2013-08-14 Luminex Corporation Functionalized compositions for improved immobilization
FR2849058B1 (fr) * 2002-12-20 2005-02-25 Commissariat Energie Atomique Procede d'evaluation quantitative des capacites globales et specifiques de reparation de l'adn d'au moins un milieu biologique, ainsi que ses applications
FR2887261B1 (fr) * 2005-06-20 2007-09-14 Commissariat Energie Atomique Procede d'immobilisation de l'adn superenroule et utilisation pour analyser la reparation de l'adn
CN102031285B (zh) * 2009-09-28 2016-12-21 复旦大学 一种基于双核微核的dna修复能力检测方法
CN114507722A (zh) * 2020-11-16 2022-05-17 深圳市真迈生物科技有限公司 化合物修饰的芯片及其制备方法和应用
WO2022184907A1 (en) * 2021-03-04 2022-09-09 Lxrepair Multiplex quantitative assay for dna double-strand break repair activities in a biological medium and its applications

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4341524C2 (de) * 1993-12-06 1997-01-16 Gluesenkamp Karl Heinz Dr Verfahren zur Immobilisierung von Biomolekülen und Affinitätsliganden an polymere Träger
FR2731711B1 (fr) * 1995-03-15 1997-06-06 Rech Investissements Sfri Soc Procede de detection qualitative et quantitative de lesions de l'adn
DE19624990A1 (de) * 1996-06-22 1998-01-08 Gluesenkamp Karl Heinz Dr Verfahren zur chemischen kontrollierten Modifizierung von Oberflächen sowie von Acyl- und/oder Hydroxyl-Gruppen tragenden Polymeren

Also Published As

Publication number Publication date
CA2348937A1 (en) 2000-05-11
WO2000026402A1 (de) 2000-05-11
DE19850680A1 (de) 2000-05-04
JP2002528134A (ja) 2002-09-03
BR9914952A (pt) 2001-07-10
US20020022228A1 (en) 2002-02-21
CN1325456A (zh) 2001-12-05
ZA200103497B (en) 2002-07-30
EP1127165A1 (de) 2001-08-29
AU1378300A (en) 2000-05-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Fraga et al. DNA methylation: a profile of methods and applications
EP0128332B1 (en) Assay method utilizing polynucleotide sequences
US20100317005A1 (en) Modified Nucleotides and Methods for Making and Use Same
US20060160125A1 (en) Compositions and methods for nonenzymatic ligation of oligonucleotides and detection of genetic polymorphisms
Wu et al. Measurement of O 6-alkylguanine-DNA alkyltransferase activity in human cells and tumor tissues by restriction endonuclease inhibition
CN112154216A (zh) 生物分子探针以及检测基因和蛋白表达的方法
JP2003230394A (ja) マススペクトロメトリーによるｄｎａ配列決定法
CA2143428A1 (en) Method of nucleic acid-differentiation and assay kit for nucleic acid-differentiation
EP2272975B1 (en) Method for determination of dna methylation
EP3507382A1 (en) Analysis of chromatin using a nicking enzyme
KR20010103630A (ko) Ｄｎａ 수복 분석 방법 및 테스트 키트
JP2001510332A (ja) アポトーシス細胞の検出試験
US5616465A (en) Detection and isolation of nucleic acid sequences using competitive hybridization probes
US20110086356A1 (en) Method for measuring dna methylation
EP2143806B1 (en) Method of measuring dna methylation
US6027879A (en) Detection and isolation of nucleic acid sequences using a bifunctional hybridization probe
US20100009376A1 (en) Method for measuring dna methylation
US5783387A (en) Method for identifying and quantifying nucleic acid sequence aberrations
CA2331742C (en) Methods for quantitating low level modifications of nucleotide sequences
Riehl et al. Crosslinking of N‐Acetyl‐phenylalanyl [s4U] tRNAPhe to Protein S10 in the Ribosomal P Site
JP5303981B2 (ja) Ｄｎａメチル化測定方法
US6864058B2 (en) Vaccinia topoisomerases I-based assays for detection of specific DNA breaks
Weiss et al. End-group labeling of nucleic acids by enzymatic phosphorylation
US20100105058A1 (en) Method for Measuring DNA Methylation
EP4174189A1 (en) Enzyme directed biomolecule labeling

Legal Events

Date Code Title Description
N231 Notification of change of applicant
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid