JP2001510332A

JP2001510332A - アポトーシス細胞の検出試験

Info

Publication number: JP2001510332A
Application number: JP52474298A
Authority: JP
Inventors: ディデンコ、ウラジミール; ホルンスビー、ピーター
Original assignee: バイラー・カレッジ・オブ・メディスン
Priority date: 1996-11-27
Filing date: 1997-11-26
Publication date: 2001-07-31
Also published as: EP0944740A2; WO1998023777A3; AU7410898A; US6013438A; WO1998023777A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、アポトーシス細胞を選択的に標識するin situでのＤＮＡ断片のライゲーションを用いる新規な試験法を用いた、アポトーシス細胞の検出に関する。この試験法は、アポトーシス細胞およびアポトーシス細胞に存在する特定の生体分子を同時に検出するために、公知のin situ法と組み合わせて使用してもよい。

Description

【発明の詳細な説明】アポトーシス細胞の検出試験〔発明の分野〕本発明は、一般には分子生物学および細胞生物学に関し、より詳細にはアポトーシス、および生物学的サンプル中でアポトーシスを検出する方法に関する。〔発明の背景〕アポトーシスは、これにより多細胞生物が細胞を選択的に消滅させるプログラムされた細胞死のプロセスである。ネクローシスの用語は、アポトーシス以外のプロセスで死滅する細胞の形態学的変化を記述するために用いられる。アポトーシスは、核膜の内面への染色体の漸進的濃縮、隣接細胞との膜接触の喪失を伴う細胞の収縮、および膜に結合した好酸性小球体（アポトーシス体）の形成を伴う細胞の分断化を特徴とする。アポトーシスを受けた細胞のＤＮＡは、略180塩基対の倍数である多くの断片に切断される。これらの断片は、アガロースゲル電気泳動後の特徴的な「梯子状パターン」の形成として見ることができる。ネクローシス細胞のＤＮＡはランダムに分解され、梯子状パターンを生じないので、この梯子状パターンは、アポトーシス細胞死をネクローシス細胞死から区別するための生化学的マーカーとして広く用いられている。梯子状パターンは、ヌクレオソーム間のリンカー領域内での核ＤＮＡ開裂の結果として生じるものである。二本鎖の開裂は、両ＤＮＡ鎖にある多くのニックから生じる。アポトーシス細胞内で同定されたエンドヌクレアーゼは、その性質において、一般に膵臓DNase Ｉに類似している。即ち、これらのエンドヌクレアーゼは以下の特徴を共有している。 (i) DNase Ｉ開裂によって生じたＤＮＡ末端（5’-リン酸基および3’-ヒドコキシル基）は、アポトーシス核に見られるものと同じである。 (ii) DNase ＩをトランスフェクトしたCoS細胞は、アポトーシスで見られるのと同様の染色体変化を示す。 (iii) 染色体のDNase Ｉ開裂は、アポトーシス細胞から単離できるのと同じ特徴的なヌクレオソームＤＮＡ断片を生じる。 DNase Ｉはアポトーシスを受けている細胞中で検出され、またDNase Ｉの組織分布はアポトーシスにおける役割と一致しているが、アポトーシス細胞から部分的に精製されたエンドヌクレアーゼはDNase Ｉとは異なることが示された。DNas e IIおよび他のエンドヌクレアーゼがアポトーシスに関与している証拠は殆どない。現在のところ、組織切片におけるアポトーシス細胞を検出するために、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）に媒介されたビオチン化dUTPニック末端標識(TUNEL)法が使用されている。このTUNEL法はTdTを利用して、3’-ヒドロキシル基を含むＤＮＡ断片の中に、ビオチン化デオキシウリジンラベルを組み込む。この標識は、アビジン／ストレプトアビジンに基づく種々の方法を用いて検出することができる。3’-ヒドロキシル基はアポトーシス細胞内の二本鎖ＤＮＡ断片中に存在するが、これはネクローシス細胞死を受けた細胞のＤＮＡ中にも存在する。従って、この方法は、ネクローシス細胞死とアポトーシス細胞死とを区別するために適切ではない。加えて、この方法は、3’-ヒドロキシル基と他の生物学的関連物質、例えばＲＮＡおよびタンパク質との同時検出を可能にするものではない。現在、当該技術分野において、アポトーシス細胞を特異的に検出する方法が必要とされている。ネクローシス細胞を同時に検出せずに、アポトーシス細胞死を特異的に検出することを可能にする方法は、現在のところ存在しない。ここで報告する実験において、我々は、エンドヌクレアーゼ様DNase Ｉによって生じた特徴的な二本鎖ＤＮＡ断片が、アポトーシス細胞内においてin situで検出できるかどうかを決定した。ＤＮＡがヒストンまたは他のクロマチンタンパク質に結合すると、それは、略 10-bp間隔、即ちＤＮＡ螺旋の１回転でＤＮＡを切断できるエンドヌクレアーゼの作用から、部分的に保護される。ＤＮＡの螺旋捻れにより、エンドヌクレアーゼは二本の鎖にアクセスすることができ、付着末端ならびに幾つかの平滑末端を生じる。こうして、ヌクレオソームに結合したＤＮＡのDNase Ｉ開裂によって、１塩基、２塩基または３塩基の3’-オーバーハングを伴った二本鎖切断が生じる。これとは対照的に、クロマチン中のＤＮＡのDNase II開裂は、もっと長い平均４塩基の3’-オーバーハングを生じる。〔発明の概要〕アポトーシス核において二本鎖ＤＮＡ末端をin situで検出するために、我々は、パラフィン包埋組織切片中の細胞核に存在するＤＮＡ末端にライゲートされた、幾つかのタイプの二本鎖標識ＤＮＡ断片を用いた。１塩基の3’-オーバーハングを検出するために、我々は、Taq DNAポリメラーゼによるポリメラーゼ連鎖反応で合成された二本鎖ＤＮＡ断片が、3’側で鋳型配列を越える１塩基延出部を有するという事実を利用した。これは、本来的にはTaqポリメラーゼが二本鎖ＤＮＡの3’-末端にデオキシアデノシンのみを付加することを示すものであったが、その後の研究によって、鋳型内で合成された最後の3’-ヌクレオシドがデオキシシチジンである場合には、Taqポリメラーゼはデオキシアデノシンまたはデオキシシチジンを追加し、平滑末端のＤＮＡを残さないこと、従って、ランダムなＤＮＡ配列における多くの１塩基3’-オーバーハングの引っ込んだ5’-塩基に対して、潜在的にライゲートさせることが可能な断片を与えることが明らかになった。ライゲーションプローブとして使用するためのＤＮＡ断片を調製する別の方法は、ライゲートさせ得る末端を形成しているオリゴヌクレオチドを合成することである。オリゴヌクレオチドリンカーの製造に通常用いられる方法において二つの相補鎖を用いるのではなく、オリゴヌクレオチドの3’-末端順域が5’-末端の領域に対して相補的であるように、一つのオリゴヌクレオチドを合成してもよい。このオリゴヌクレオチドの相補的領域がアニールすると、ステムアンドループをもったヘアピン構造が自然に形成される。この形成されたステム構造は、適合性末端にライゲートされ得る二本鎖末端を有している。相補性領域が最も外側の5’-末端および最も外側の3’-末端を有していれば、形成されたステムは平滑末端である。この3’-末端および5’- 末端の何れか一方にヌクレオチドを追加し、他方に相補的なヌクレオチドを追加しないことによって、オーバーハングを形成することができる。所望の末端に適切な数のヌクレオチドを含めることによって、如何なる長さの3’オーバーハングも、または5’-オーバーハングも形成することができる。更に、如何なる所望の配列でも、オリゴヌクレオチドのオーバーハング部分に組み込むことができる。我々は、記載したライゲーション方法およびプローブを使用することにより、アポトーシス核は、１塩基の3’-オーバーハングをもった標識ＤＮＡ断片にライゲートできるＤＮＡ末端を有するが、ネクローシス組織または他の非アポトーシスＤＮＡ損傷を有する組織における核はこのようなＤＮＡ末端を有していないことを決定した。更に、我々はアポトーシスに特徴的な末端を有するＤＮＡが、平滑末端のＤＮＡプローブ並びに２塩基および３塩基の3’-オーバーハングを有するプローブを用いて検出できることを見出した。これとは対照的に、全ての形態のＤＮＡ損傷を有する核は、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）の基質である高濃度の3’-ヒドロキシルＤＮＡ末端を有する。TdTは一本鎖ＤＮＡの3’塩基、並びに二本鎖ＤＮＡのオーバーハング末端、平滑末端および凹部末端の3’塩基を延長することができるので、TdTに基づく方法は、アポトーシス細胞をネクローシス細胞から区別するのに適切ではない。対照的に、ライゲーションに基づく方法は、この極めて望ましい目的を達成のに適している。本発明は、組織切片において、アポトーシス細胞の存在を特異的に検出する方法を提供する。本発明は、アポトーシス細胞の特徴を示すＤＮＡ断片を検出する新規なライゲーション法を用いることによって、従来技術の制限を克服するものである。本発明の一つの側面には、組織切片においてアポトーシス細胞を検出する方法が含まれる。この方法は、アポトーシス細胞の特徴であるオーバーハング末端をもった二本鎖ＤＮＡ断片を標識する、新規なin situライゲーション法を使用する。本発明のもう一つの側面は、固相捕獲試験を使用して、定義された末端をもったＤＮＡ断片を検出および単離する方法を提供することである。本発明のもう一つの側面には、ここに提示するライゲーション法をＤＮＡブロットフォーマットに使用して、組織サンプルにおけるアポトーシス細胞の存在を検出する方法が含まれる。ＤＮＡをサンプルから単離し、アガロースゲル電気泳動を用いてサイズ毎に分画する。次いで、ＤＮＡを固相支持体に移し、当該ライゲーション法を用いてプロービングする。この方法は、現在利用可能な技術よりも感度が良く、アポトーシス細胞が組織サンプルの小部分を形成するに過ぎないときでも、少数のアポトーシス細胞の検出を可能にする。本発明のもう一つの側面は、アポトーシスを受けている細胞において生物学的に重要なマクロ分子の存在を検出する方法を提供することである。これらのマクロ分子には、タンパク質およびＲＮＡが含まれる。この方法は、アポトーシス細胞の検出と、該アポトーシス細胞内における特定のマクロ分子の存在の検出とを同時に達成することを可能にする。本発明のもう一つの側面は、ＤＮＡを分析して、該ＤＮＡに対してヌクレアーゼが作用したかどうかを決定し、もしヌクレアーゼが作用していたときには、如何なるタイプのヌクレアーゼが該ＤＮＡに作用したかを決定するための方法を提供することである。本発明のもう一つの側面は、ＤＮＡに対するヌクレアーゼの作用によって生じたＤＮＡ損傷と、該ＤＮＡ損傷に関連した特定のＲＮＡ合成の性質を決定することを可能にする方法を提供することである。〔図面の簡単な説明〕図１．ラット胸腺におけるアポトーシス細胞内の異なるタイプのＤＮＡ末端の検出。図２．対照胸腺およびグルココルチコイド処理した胸腺において、異なるタイプのＤＮＡ末端の存在によって検出された、アポトーシス細胞パターンの比較。図３．三つの標識法を用いた、ウィルムス腫瘍のネクローシス細胞内におけるＤＮＡ末端の検出。図４．種々の量のジゴキシゲニン標識ＤＮＡを用いた、スポットの相対的発色。図５．二つの標識法による、過酸化水素処理した肝臓内でのＤＮＡ末端の検出。図６．自己消化性ウシ副腎皮質組織内でのＤＮＡ末端の検出。図７．二つの標識法による、加熱組織切片内でのＤＮＡ末端の検出。図８．ライゲーションに適した一つの末端を含むヘアピンオリゴヌクレオチドの図式的表現。〔発明の詳細な説明〕定義この出願において、サンプルの用語は、ＤＮＡを含む如何なる生物学的材料をも意味するものである。サンプルの用語には、多細胞生物から単離された細胞、細胞培養において増殖した細胞、正常組織、悪性組織、ネクローシス組織および何れかの生物学的起源に由来する組織が含まれるが、これらに限定されるものではない。生物学的起源には、植物起源および動物起源が含まれる。この出願において、「アポトーシスの特徴的な末端を有するＤＮＡ」の語句は、サンプル中に含まれるか、またはサンプルから得られるライゲート可能な一つの末端を有する如何なるＤＮＡ分子をも意味するものである。アポトーシス細胞のＤＮＡは、そのＤＮＡの末端がライゲート可能である点において、ネックローシスまたは他の形態の細胞死を経た細胞のＤＮＡから区別することができる。これとは対照的に、他の形態の細胞死を経た細胞のＤＮＡ末端はライゲート可能ではない。アポトーシスを受けた細胞のＤＮＡに生じた末端には、ライゲート可能な平滑末端、ライゲート可能な3’-オーバーハング末端およびライゲート可能な 5’-オーバーハング末端が含まれるが、これに限定されるものではない。好ましい実施例において、アポトーシスの特徴的な末端を有するＤＮＡは、オーバーハングが１〜３ヌクレオチド延出しているライゲート可能な3’-末端であろう。この出願において、「検出可能部分」の語句は、その存在または不存在を決定できる如何なる化学構造をも意味するものである。この検出可能部分の存在または不存在を決定するために使用できる方法には、放射線的方法、蛍光的方法および酵素活性に基づく方法が含まれるが、これらに限定されるものではない。当業者は、「検出可能部分」に、酵素、小分子、色素団、蛍光団、または放射線標識された分子が含まれるが、これらに限定されないことを理解するであろう。小分子には、ビオチン、ジゴキシゲニン、および臭素のような単一原子が含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましい実施例では、臭化デオキシウリジンの形態で臭素が使用されるであろう。放射線標識された分子には、放射性ヨウ素のような単一原子、並びに大分子が含まれる。この出願において、「検出可能部分を検出するための試薬」の語句は、検出可能部分の存在または不存在を決定するために使用できる、如何なる化学薬品をも意味するものである。「検出可能部分を検出するための試薬」の例には、酵素のための発色性基質、酵素のための蛍光を生じる基質、酵素、および結合性分子に結合した酵素が含まれるが、これらに限定されるものではない。結合性分子には、アビジン、ストレプトアビジン、レクチン、プロテインＡ、プロテインＧ、抗体および抗体断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。また、検出可能部分を検出するための試薬には、補酵素(enzime cofactors)、ＡＴＰ、緩衝剤、放射能を検出するための蛍光体、コロイド金およびポリマー被覆磁性粒子のような固体粒子も含まれる。典型的には、固体粒子は結合性分子に結合されるであろう。好ましい実施例において、「検出可能部分を検出するための試薬」には、酵素に結合した結合性分子が含まれるであろう。他の好ましい実施例において、検出可能部分を検出するための試薬には、蛍光性分子に結合した結合性分子が含まれるであろう。本件出願において、「アポトーシス細胞のタンパク質」の語句は、アポトーシスを受ける細胞によって発現される如何なるタンパク質またはタンパク質断片をも意味するものである。これには、細胞内に位置するタンパク質、並びに細胞の表面に位置するタンパク質、または細胞により分泌されるタンパク質が含まれる。この出願において、「アポトーシス細胞のＲＮＡ」の語句は、アポトーシスを受けている細胞内に存在する如何なるＲＮＡをも意味するものである。これには、アポトーシスの開始前に細胞内に存在するＲＮＡ分子、並びにアポトーシスの間に産生されるＲＮＡが含まれる。この出願において、ヌクレオチドプローブとは、異なった核酸分子を検出するために使用できる如何なる核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡをも意味するものである。この出願において、「アポトーシスを受けた細胞のＤＮＡに特異的にライゲートする」とは、アポトーシスを受けていない細胞のＤＮＡにライゲートされるよりも、アポトーシスを受けた細胞のＤＮＡの方にライゲートされ易いことを意味する。実施例本発明は、以下の非限定的な例を参照することによって、より容易に理解されるであろう。一般的な方法 in situ ・ライゲーション用の二本鎖核酸断片の調製以下の実施例では、本発明はDNAプローブ分子の点から記載される。本発明においては、RNAプローブ分子がDNAプローブ分子と等価であり、単にDNAリガーゼ酵素の代わりにRNAリガーゼ酵素を利用することによって、本発明の方法及びキットで代用し得ることは、当業者には容易に理解できよう。それ故、本明細書、特に請求の範囲で用いる「核酸」という語には、RNAとDNA分子の両者が含まれる。ブラスミドpBluescript-bSDIIと相補的なプライマーを用いて、226bpの二本鎖DNA断片を調製した。我々はここに示したデータを得るために該配列を用いたが、60〜450bpの長さの無関係な配列を用いても同様の結果が得られたので、用いる断片の実際の配列は重要でない。Taqポリメラーゼを用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって断片を調製するために、我々は、100μＬの50ｍＭ Tris-HCl，ｐＨ8.3、10ｍＭ KC l、1.5ｍＭ MgCl₂、16.6μＭジゴキシゲニン-11-dUTP(ベーリンガー・マンハイム)、16.6μＭ TTP、50μＭ dATP、50μＭ dCTP、50μＭ dGTP(他のヌクレオチドはシグマから)、100pmolの各プライマー、及び10pgのプラスミドを具備する反応をセットアップする。これらの試薬の濃度は、多くの使用に対して適切である。ある例では、プローブ中へのラベルの取り込みを増加することによって、反応混合物からTTPを省くことによりアッセイの感度を増大することが望ましいかもしれない。反応混合物が80℃に加熱されたときに、各チューブにTaqポリメラーゼ（2.5ユニット、ベーリンガー・マンハイム）を添加した。95℃で20秒、61℃ で20秒、及び74℃で120秒を35サイクル行い、最後のサイクルでは4〜10分の延長した時間を用いた。同一のプロトコールであるが、200ｍＭ Tris-HCl pH8.8、10 0ｍＭ KCl、100ｍＭ硫酸アンモニウム、20ｍＭ MgSO₄、1％Triton X-100、及び1 mg/mL BSAの組成を有する緩衝液を用いるプロトコールにより、クローニングされたPfuポリメラーゼ（ストラタジーン）を用いて断片を調製した。該反応の分取試料のアガロースゲル電気泳動は、両酵素で単一の産物を示した。断片を沈殿させるために、2.5μＭになるように酢酸アンモニウムを添加し、該溶液を10,000gで５分間遠心して、上清を２倍量のエタノールと混合し、25分問遠心した。上清を捨て、70％のエタノールで、続いて100％のエタノールで沈殿を洗浄した。20分間真空乾燥した後、沈殿を水に溶かして、ヘキスト色素3325 8蛍光によって濃度を測定した。別のプロトコールでは、PCR反応混合物をシリカガラスカラムを用いるカラム精製にかけた（High Pure、ベーリンガーマンハイム）。使用するまで、該断片を-20℃で保存した。様々な態様において、DNAプローブ分子は、種々の検出部分（detectable moiety）を取り込み得る。これらの検出部分は、酵素、小分子、発色団、蛍光団、又は放射性分子であり得る。小分子には、ビオチン、ジゴキシゲニン、及び臭素のような単原子が含まれるが、これらに限定されない。好ましい態様では、臭素は、臭化デオキシウリジンの形態で用いられる。放射性分子には、放射性ヨードのような単原子、及びより大きな分子が含まれることが理解されよう。ヘアピンオリゴヌクレオチドの調製我々は、ライゲーションをベースとした手法を用いて、DNA中の二本鎖の切断を検出することができるオリゴヌクレオチドプローブをデザインした。これらのオリゴヌクレオチドは、３つの部分：1)自発的にアニールするオリゴヌクレオチド3’及び5’領域中の相補的な配列によって形成されるステム；2)検出部分が付着し得るループ領域；及び、必要に応じて3)オリゴヌクレオチドの3’又は5’末端の何れかに存在する１以上の対を成していないヌクレオチドからなるオーバーハング部分を有する。これらのプローブは、アポトーシス細胞中の二本鎖の切断を特異的且つ好感度で検出する。これらのプローブの分布は、アポトーシスに特徴的なクロマチンの領域に限局しているのに対して、ターミナルトランスフェラーゼによって全ての利用可能な3’-DNA末端をラベルすると、ずっと広がったラベルが得られた。本明細書に開示した原理を用いると、検出すべき任意の二本鎖 DNAの末端に対して相補的な任意のタイプの3’又は5’オーバーハングを有するヘアピンオリゴヌクレオチドプローブをデザインすることができる。オーバーハング部分を除いて、オリゴヌクレオチドの実際の配列は、本発明の機能には不可欠ではない。該オリゴヌクレオチドに不可欠な特徴は、適合するDN A末端に連結され得るステム構造を自発的に形成し、このようなDNA末端に連結したときに検出可能であるということである。これらの特徴を有する配列の一例が、図８、配列番号３に示されている。明記された二本鎖末端を有するヘアピンを形成する10bpのステム領域を有するオリゴヌクレオチドをデザインした(図８)。ステムの末端は、特徴的な構造を有している。図８に示した例では、特徴的な構造は、一個の3’-Aオーバーハングである。一個のＴオーバーハングを有する組織切片上に存在する二本鎖切断部の陥凹5’ホスフェートは、プローブ上の3’-Aオーバーハングに連結することができる。該オリゴヌクレオチドは、5’ホスフェートを欠如しているので、該切片の3’オーバーハングは、プローブ上の陥凹した5’-ヒドロキシルには連結しない。この特徴により、プローブが一本鎖DNA断片の末端に存在する3’ヒドロキシルに連結する可能性が回避される。該領域中で塩基の対合を起こさずに、検出可能なラベルを収容するために、20ヌクレオチドのループをデザインした。ループのサイズは、僅か１塩基から所望の数の塩基まで変化させ得る。あるいは、完全にループをなくして、一以上の非ヌクレオチド部分に置き換えてもよい。これらの非ヌクレオチド部分には、塩基又は他の化学構造を持たない検出可能なラベルを取り込み得る糖残基が含まれ得る。図８に例示したループは、ビオチン（Ｂ）でラベルされた５つのデオキシウリジン誘導体を含有する。ループ中の５つの場所で、オリゴヌクレオチドは、アミノ修飾因子でめるC6デオキシウリジン（グレンリサーチ、スターリング(Glen Re search,Sterling)、VA）を用いて合成した。オリゴヌクレオチドを合成した後、ビオチンビスアミノヘキサノイルN-ヒドロキシスクイシンイミドエステル（グレンリサーチ）を用いる反応によって、検出部分であるビオチンをアミノ基に共有結合した。合成及び合成後のビオチン化は、シンセティック・ジェネティックス社（Synthetic Genetics Corp.San Diego，CA）によって行われた。あるいは、予め形成されたビオチンラベルしたチミジン類縁体（グレンリサーチ）の置換によって、ヘアピンを合成した。さらにヘアピンオリゴヌクレオチド中にヌクレオチドの被連結能を阻害しない検出可能なラベルを取り込むという他の任意の手段を用いてもよい。これには、C6デオキシウリジン以外のヌクレオチドを用いる共有結合、及びオリゴヌクレオチド中への非ヌクレオチド部分の取り込みが含まれるが、これらに限定されない。ステム及び何れのオーバーハング構造も崩壊されない限り、いかなる形態の検出可能なラベルの取り込みも使用し得る。ここに示した具体例では、検出可能なラベルとして、ビオチンを用いた。当業者であれば、ビオチンの代わりに、従来用いられてきた他の検出可能なラベルを使用し得ることを容易に理解することができよう。ループ中の検出部分をヘアピンのステムから離して置くことによって、巨大な検出部分がリガーゼによるプローブの切片への酵素的連結を妨害する可能性を回避でき、これによって、酵素及び他のタンパク質のような巨大な検出部分を含む極めて多様な検出部分を使用し得るようになる。本例は、各オリゴヌクレオチド中での５つの検出可能なラベルの使用を示しているが、当業者であれば、各オリゴヌクレオチド中に取り込まれるラベルの数を変更し得ることは理解できよう。数を増加すれば、存在する各DNA末端に対してより大きなシグナルが見られるようになろう。これは、相対的に少ない数の連結可能なDNA末端を含有しているサンプルでは望ましいかもしれない。逆に、各オリゴヌクレオチド中に存在する検出可能なラベルの数を減らせば、各連結された DNA末端によって生じるシグナルは減少するであろう。当業者であれば、任意の使用法及び組織源に対してシグナル／バックグラウンド比を至適化するために、各オリゴヌクレオチド中に取り込むラベルの最適な数を経験的に決定することが望ましいことを認めるであろう。これらの実験では、平滑末端化された一個の3’-Aオーバーハング、及びランダム配列、二個のヌクレオチド3’オーバーハング(3’-NN)という３つの異なるタイプの末端を有するプローブを用いた。オリゴヌクレオチドの配列を修飾することによって、明らかに、3’又は5’オーバーハングの何れでも、より長いオーバーハングを作成し得るであろう。ヌクレアーゼによるDNA切断の検出のような一定の末端を作出する幾つかの使用法では、一定の長さ及び配列のオーバーハングが産生されるようにオリゴヌクレオチドを合成することが望ましいであろう。テストされた3’-NNオリゴヌクレオチドのような他の例では、オーバーハングの配列がランダム化された所定の長さのオーバーハングを有するオリゴヌクレオチドを形成してもよい。これによって、(4)ⁿの異なる配列のオリゴヌクレオチドを含有する混合物が得られるであろう(ここで、n=オーバーハング中のヌクレオチド数)。例示した２塩基オーバーハングでは、オリゴヌクレオチド混合物は、16の異なるヌクレオチド配列を含有していた。該混合物は、オーバーハングの全ての可能な場所に全ての可能な塩基を有するオリゴヌクレオチドを含有しているので、該混合物は、全ての２塩基3’オーバーハングを検出した。このようなオリゴヌクレオチドの混合物の合成は、合成中、ランダム化したい場所に、全てのヌクレオチドを含有する試薬混合物を用いることによって容易に達成し得る。あるいは、各個別の配列を各別に合成した後、別個の配列を混合してもよい。後者の技術は、全切断物のサブセットを検出するために、全ての場所に対して可能な全ての塩基よりも少ない塩基を有するオリゴヌクレオチドを含有する混合物を形成するために使用し得る。本発明の他の態様では、オーバーハングの他の幾つかの場所を一定に保ちながら、オーバーハング中の幾つかの場所をランダム化することも望ましいかもしれない。ある使用では、オリゴヌクレオチドプローブと必要な試薬をキットとしてパッケージングすることが望ましいかもしれない。該キットは、様々な末端を有するオリゴヌクレオチドを含有し得る。例えば、該キットは、オーバーハングが3’ 又は5’又は両者であり得る1、2、及び3塩基オーバーハングオリゴヌクレオチドに加えて、平滑末端化されたオリゴヌクレオチドを含有してもよい。オリゴヌクレオチドは、各々別個のオリゴヌクレオチドとして、又はオリゴヌクレオチドの混合物として、提供し得る。該混合物は、一定の長さと種類（すなわち、3’又は5’）のオーバーハングを含有する全てのオリゴヌクレオチドの混合物であり得る。あるいは、混合物は、一定の長さと種類のオーバーハングを有する可能なオリゴヌクレオチドのうちの幾つかのみを含有してもよい。他の態様では、１以上の長さ及び/又はタイプのオーバーハングを含有する混合物としてオリゴヌクレオチドを提供することも望ましいかもしれない。例えば、可能性としては、3 ’と5’両タイプの全ての２塩基オーバーハングを含有することがあり得；又は、可能性としては、ある特定のタイプ（3’又は5’）の1、2、及び3塩基オーバーハングを含有することがあり得る。オリゴヌクレオチド混合物の内容は、目的のDNA中に存在すると思われるDNA末端のタイプに依存して、変動し得る。本発明のキットは、本明細書に示したDNA末端の分析方法を行うのに有用な試薬も含有し得る。これらの試薬には、DNAリガーゼ酵素、緩衝液、並びにプロテアーゼ及びグルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ等のシグナル発生酵素を含む他の酵素が含まれ得る。本発明のキットに含まれ得る他の試薬には、シグナル発生酵素の基質、検出部分を認識する抗体、及び検出部分の同定を可能とする他の試薬が含まれる。ラベルされたDNA断片の連結 T4DNAリガーゼを用いて、組織切片中のDNAに、in situでジゴキシゲニンラベルされたプローブ断片を連結した。以下のプロトコールにより、様々な組織（例に記載されている）を用いた。調製直後のパラホルムアルデヒド又は緩衝化したホルムアルデヒドの何れかで組織断片を固定し(同様の結果が得られる)、従来の方法で脱水し、。パラフィンの中に置いた。パラフィンを除去するために、6μ ｍの切片をキシレンで処理し、段階的に濃度の異なるアルコール中で再水和せしめた。キシレン中で５分間サンプルをインキュベートした後、該キシレンを新しいキシレンと置換し、さらに５分の間隔でインキュベートすることによって、再水和を行った。キシレンを除去して、100％エタノール中でサンプルを５分間インキュベートした。続いて、該エタノールを除去し、新しい100％エタノールを加えた。100％エタノール中で、さらに５分間サンプルをインキュベートした。続いて、該エタノールを96％エタノールに置換して、該サンプルを30秒インキュベートした。次に、96％エタノールを80％エタノールに置換して、該サンプルを 30秒インキュベートした。続いて、80％エタノールを除去して、該サンプルを水で洗浄した。以下のプロトコールに従って、ジゴキシゲニンラベルした二本鎖DNA断片を含む連結を行った。以下の操作は全て、室温(23℃)で行った。パラフィン処理した切片をPBS中の50μg/ｍＬプロテイナーゼＫとともに30分間インキュベートした後、水で完全にリンスした。50ｍＭ Tris-HCl，ｐＨ7.8、10ｍＭ MgCl₂、10ｍＭ DTT、1ｍＭ ATP、25μg/ｍＬ BSA、15％ポリエチレングリコール（8000m.w.、シグマ）と１μg/ｍＬのジゴキシゲニンラベルしたDNA断片、及び25〜100ユニット/ｍＬのDNA T4リガーゼ（ベーリンガーマンハイム）の混合物を添加した(20μL/切片)。カバーガラスで切片を被覆して、1〜1 6時間、湿気のある箱の中に置いた。水で切片を完全に洗浄した後、ブロッキング溶液（ベーリンガーマンハイム）でプレブロックし、製造者の推奨に従って、 15分間再構成した。過剰なバックグラウンド染色が見られたら、内在性のアルカリホスファターゼを不活化するために、70℃の湯を用いてさらに洗浄してもよい。該ブロッキング溶液を除去し、ブロッキング緩衝液で100倍希釈したヒツジ抗ジゴキシゲニンFab断片−アルカリホスファターゼ抱合体（ベーリンガーマンハイム）を10分間加えた後、、各回10分間で２回、0.1Ｍ Tris-HCl,ｐＨ7.5、0.1 Ｍ NaClの中で洗浄した。発色させるために、続いて、製造者が推奨する溶液(0. 1Ｍ Tris,ｐＨ9.5;0.1Ｍ NaCl;167μg/ｍＬ 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート;330μg/ｍＬニトロブルーテトラゾリウム）の中に切片を置いて、顕微鏡下で、発色をモニターした。切片を水で洗浄することによって、反応を停止させた。カウンター染色を行わずに、該濡れた切片の写真を撮った。以下のプロトコールに従って、室温（23℃）でヘアピンオリゴヌクレオチドを含む連結を行った。PBS中の25μg/ｍＬプロテイナーゼＫ（オンコール(Oncor)、ガイサーズバーグ(Gaithersburg)、MD）とともに、切片を５分間インキュベートした。当業者であれば、異なる組織のシグナルとバックグラウンドを至適化するために、インキュベーション時間を減少又は増加させ得ることを認識できよう。次に、切片を水で完全にリンスした。50ｍＭ Tris-HCl,ｐＨ7.8、10ｍＭ MgCl₂ 、10ｍＭ DTT、1ｍＭ ATP、15％ポリエチレングリコール（8000m.w.、シグマ）と35μg/ｍＬのヘアピンオリゴヌクレオチド、及び250ユニット/ｍＬのＤＮＡ T 4リガーゼ（ベーリンガーマンハイム、インディアナポリス、IN）の混合物を添加した(20μＬ/切片)。カバーガラスで切片を被覆して、16時間、湿気のある箱の中に置いた。続いて、水を数回変えながら、該切片を２時間以上洗浄した。50 ｍＭ炭酸水素ナトリウム、15ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ8.2の中に、４μg/ｍＬフルオレセイン−アビジン抱合体（ベクターラボラトリーズ、バーリンゲーム（Burlingame)、CA）を45分間添加した。30分以上、同緩衝液中で切片を３回洗浄した後、水で20分間洗浄した。アガロースゲル上でサイズ分画した単離されたDNAに対して、連結反応を行ってもよい。まず、任意の従来的手段、すなわち、毛細管作用、真空ブロッティング、又は電気ブロッティングによって、該DNAを固相支持体に転写する。次に、固相支持体をブロックし、上述の連結反応を行う。末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)反応従来のアポトーシス細胞同定法と比較するために、TdT反応を用いて、類似する組織サンプルを分析した。利用可能なDNA3’-ヒドロキシルとTdTを反応させるために、ビオチンではなくジゴキシゲニン又はテキサスレッドをラベルとして使用し得るように、公表されている操作を用いた。ラベルとしてジゴキシゲニンを用いた場合には、上記のリガーゼ混合物を添加する代わりに、湿気を帯びたインキュベートの中で、30ｍＭ Tris-HCl，ｐＨ7.2、140ｍＭカコジル酸ナトリウム、1ｍＭ塩化コバルト、0.1ｍＭ DTT、50μｍジゴキシゲニン-dUTP、及び300ユニット/ｍＬ TdT（プロメガ）を具備する混合物を(切片について20μＬ)、37℃で１時間添加した。取り込まれたジゴキシゲニンの洗浄及び可視化は、上述の通りである。ラベルとしてテキサスレッドを用いた場合には、湿気を帯びたインキュベートの中で、30ｍＭ Tris.HCl,pH7.2、140ｍＭカコジル酸ナトリウム、0.1ｍＭ DTT 、８μＭテキサスレッドX dUTP（モルキュラープローブス、ユージーン、OR）、及び800ユニット/ｍＬターミナルトランスフェラーゼ（ベーリンガーマンハイム）を具備する混合物を(切片について20μＬ)、37℃で１時間添加した。水で洗浄した後(20分以上、２回交換)、DNA結合色素4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI)(1μg/ｍＬ)で切片をカウンター染色し、ベクターシールド(Vectash ield)（ベクターラボラトリーズ）に載せて、蛍光顕微鏡によって観察した。組織胸腺：アポトーシス細胞を多数含有する組織を調製するために、水中の 30％ジメチルスルフォキシドに溶かした6mg/kgデキサメタゾン（シグマ）をSD(S prague-Dawley)ラット(150g)の皮下に投与した。24時間後に動物を屠殺し、4％パラホルムアルデヒド中で胸腺を固定した。対照動物から胸腺を得て、同様に固定した。パラホルムアルデヒドの中に入れて18時間後に、該組織断片を70％エタノール中に置き、100％エタノールまで段階的にアルコールを通して、一晩クロロホルム中に置いた後、パラフィン中に載置した。壊死組織：多数の壊死細胞を有する切片を作成するために、５才の男性患者のウィルムス腫瘍から得られた、このような腫瘍にしばしば見られるような広範な領域が壊死した切片を用いた。過酸化水素処理した肝臓：過酸化水素の投与によって、ランダムなDNAの損傷を引き起こした。SDラットを麻酔し、数箇所の肝臓の表面付近に、100μＬの30 ％過酸化水素を投与した。20秒後、動物から肝臓を切り出し、残存する過酸化水素を全て取り除くために、溶液を複数回交換しながら、4％のパラホルムアルデヒドの中で、過酸化水素処理した肝臓のセグメントを固定した。肝臓の遠位領域から得た組織のセグメントを対照として固定した。次に、胸腺のところで記載したように、組織に処理を施した。腎臓：カプセルを差し込み、実質から離れるようにカプセルを緩めることによって、腎臓に軽い外傷を与えた。これによって、24時間後に、外傷に近接した部位にアポトシース細胞のゾーンができた。腎臓に軽い外傷を与えると、尿細管の退化を伴って、上皮細胞のアポトーシスがもたらされる。インビトロ自己分解用の組織：37℃のインキュベーター中の培地の中に、5ｍｍ断片のウシ副腎を16時間置いた。次に、胸腺のところで記載したように、それらを固定し、処理を施した。加熱した組織切片：対照ウシ副腎から得た切片のパラフィンを除去し、段階的濃度のアルコールの中を通して再水和させ、0.01Ｍクエン酸ナトリウム、pH6.0 の中に置き、100℃で５分間加熱した。ジゴキシゲニンラベルしたDNAのナイロン上へのスポッティング以前記載したように、様々な量のジゴキシゲニンラベルしたDNA（ランダムプライマー法によって合成、ベーリンガーマンハイム）をハイボンド-Ｎメンブレン（アマシャム）上に滴下した。該メンブレンに固定したジゴキシゲニンは、抗ジゴキシゲニン−アルカリフォスファターゼ抱合体を5000倍希釈して使用した点を除いて、組織切片のところで上述したプロトコールと同じプロトコールを用いて検出した。様々なオーバーハングを有するプローブ断片の調製制限酵素の認識部位として機能するDNA配列を含むDNAテンプレートに対してPC Rを行う。標準的な手段によって、PCR産物を精製し、単離する。少量のジデオキシヌクレオチドの存在下で、PCRを行う。これによって、ジデオキシヌクレオチドで終了する断片が得られる。これらの断片は3’ヒドロキシル基を含有せず、標的DNA中に連結することができない。次に、導入された部位を認識する制限酵素で、PCR産物を消化する。制限エンドヌクレアーゼを用いた切断によって、切断部位に3’-OHが作られろ。このようにして、切断された断片を標的DNA中に連結することができる。消化された断片の末端の特性は、選択した制限酵素によって決定されるであろう。DNAテンプレート中に、適切に間隔をあけた２つの同一の認識部位を取り込むことによって、所定の末端を有する断片を作成することができる。あるいは、相補的な領域及びオーバーハング領域を有する２つのオリゴヌクレオチドを合成することもできる。該オリゴヌクレオチドは、標準的な手法によって、アニールすることができる。制限酵素認識部位に関する情報、適切な消化条件及び生じた末端の特性は、サンブルックらの分子クローニング：ラボラトリーマニュアル第二版、コールドスプリングハーバー出版（本明細書に参照文献として特に取り込まれる）のような標準的なテキストを参照することによって、当業者であれば、容易に得ることができよう。存在する末端のタイプを決定するためのDNA分祈様々なヌクレアーゼ酵素によって作られる末端が、以前に決定されている。DN Aサンプル中に存在する末端のタイプを決定することによって、DNAに作用したヌクレアーゼ酵素に関する情報を得ることが可能となる。あるサンプル中のDNAが、ヌクレアーゼによる作用を受けたかどうかを決定するために、様々な核酸断片でDNAをプローブする。。プローブとして用いた各核酸断片は、特定のタイプのヌクレアーゼによって作られた末端に連結し得る末端を有するであろう。何れの断片がDNAサンプルに連結し得るかを決定することによって、どのヌクレアーゼが、サンプルに作用したかを決定することができる。このプロセスは、サンプルをアリコットに分け、各アリコットを異なる断片でプローブすることによって行い得る。あるいは、複数の断片を同一のサンプルに対して同時にテストしてもよい。本ケースでは、異なる検出部分を取り込むことによって、断片を互いに区別し得る。これらの検出部分は、酵素、小分子、発色団、蛍光団、又は放射性分子であり得る。当業者であれば、各部分を同時に検出できるように、適切な検出部分を容易に選択できるであろう。好ましい態様では、DNA又はRNA又は両者の混合物の何れかである、多数の二本鎖核酸プローブ分子を固相支持体の様々な領域に固定することができる。適切なリガーゼ酵素及び補因子（金属イオン、ATP、緩衝液等）の存在下で、１以上のヌクレアーゼの作用によって作り出された末端を含有すると思われるDNAサンプルを固定された核酸プローブ分子と接触させてもよい。約10〜37℃の適温で、約30分〜16時間の適切な時間、該DNAサンプルを核酸プローブ分子とインキュベートする。インキュベーション後、該固相支持体を洗浄して、連結されなかったDNAを全て除去し、プローブ分子に連結されたDNAの存在を検出する。別の態様では、例えばUV処理のような本分野で知られている任意の手段を用いて、１以上のヌクレアーゼ酵素の作用によって作り出された末端を含有すると思われるDNAのアリコットを固相支持体に固定し得る。続いて、DNA、RNA又は両者の混合物である１以上の核酸プローブ分子、及び適切なリガーゼ酵素を含有する溶液に、該固定されたDNAを接触させることができる。検出部分を含有するプローブ分子を選択する。検出部分は、他の核酸プローブ分子上に存在する検出部分の存在下で各部分が検出されるように、理想的には全ての部分が同時に検出されるように選択する。アリコット中に存在するDNA末端にプローブ分子が連結できるように適切な時間をおいた後、該固相支持体を洗浄し、核酸プローブ分子の存在を検出し得る。核酸プローブ分子の検出は、本分野で知られている方法を用いて行う。例えば、核酸プローブ分子には、直接検出できる検出部分を取り込ませ得る。本態様では、検出部分は、発色団、蛍光団、又は酵素であり得る。別の態様では、核酸プローブ分子には、結合部分及びシグナル部分を有する分子を具備する試薬が結合し得る検出部分が含まれるであろう。適切な結合部分の例には、アビジン、ストレプトアビジン、抗体、及び抗体断片が含まれるが、これらに限定されない。好ましい態様には、核酸プローブ分子中に取り込まれた臭素原子である検出部分、及び抗臭素抗体を具備する結合部分が含まれる。他の好ましい態様には、ビオチン又はビオチン類縁体である検出部分、及びアビジン又はストレプトアビジンを具備する結合部分が含まれる。他の好ましい態様は、検出部分としてジゴキシゲニン、及び抗ジゴキシゲニン抗体又は抗体断片を具備する結合部分を利用する。検出部分に結合する分子を具備する試薬を利用する態様では、分子は、試薬の存在の検出を可能とするシグナル部分を具備してもよい。例えば、試薬は、検出部分に結合する結合部分を有する分子を具備してもよく、分子は、さらに分子の検出を可能とするシグナル部分を具備してもよい。シグナル部分の例には、酵素、発色団、蛍光団、及び放射性ラベルした物質が含まれる。このように、分子は、シグナル部分に共有結合した結合部分を具備し得る。例として、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、及びホスファターゼのような酵素に共有結合したアビジン又はストレプトアビジンが含まれるが、これらに限定されない。好ましい態様は、西洋ワサビベルオキシダーゼに共有結合したストレプトアビジンの使用である。他の好ましい例には、酵素に直接結合した抗体が含まれる。当業者であれば、イリノイ州ロックフォードのピアースケミカル社から発売されているような様々なカップリング試薬を用いてこのようなカップリングをなし得ることに気づくであろう。例には、酵素に結合された抗臭素抗体が含まれる。好ましい例には、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合された抗臭素抗体が含まれる。本発明の幾つかの態様では、検出部分の検出は、検出部分に結合する第１の部分を具備する試薬に、該検出部分を接触させた後、続いて第１の分子に結合する第２の分子を具備する試薬を適用することによって達成される。例えば、検出分子が臭素の場合には、抗臭素抗体又は抗体断片を具備する試薬にサンプルを接触させ得る。次に、抗臭素抗体又は抗体断片に結合する第２の分子を具備する試薬に、サンプルを接触させ得る。例には、プロテインＡ、レクチン、及びシグナル部分に連結された抗臭素抗体に結合する抗体を具備する試薬が含まれるが、これらに限定されない。第２の分子は、シグナル部分を含有し得る。シグナル部分は、酵素、発色団、蛍光団、又は放射性ラベルされた物質を含有し得る。このような第２の分子の調製及び利用は、当業者に周知である。（例えば、サンブルックらの18章を参照）他の例には、検出部分としてビオチン又はビオチン類縁体、第１の分子としてストレプトアビジン又はアビジン、第２の分子としてシグナル部分に連結された抗ストレプトアビジン又は抗アビジン抗体又は抗体断片を使用することが含まれる。他の好ましい態様では、検出却分としてジゴキシゲニン、第１の分子として抗ジゴキシゲニン抗体、及び第２の分子としてシグナル部分に連結された抗ジゴキシゲニン抗体に対して誘導された抗体を利用する。検出部分を結合する第１の結合分子、及び第１の分子を結合する第２の分子を利用する態様では、第２の分子はシグナル部分を含有してもよい。シグナル部分は、本分野で公知の任意のシグナル部分であり得る。本発明のシグナル部分は、発色団、蛍光団、酵素、及び放射性ラベルされた物質を含有し得るが、これらに限定されない。シグナル部分が、発色団又は蛍光団の場合には、シグナル部分の存在は、視覚的に、又は光学密度を測定する装置の使用によって検出し得る。光学密度リーダーを利用する場合には、発色団が吸収する波長で、又は蛍光団の励起及び発光が起こる波長で透明な固相支持体上又は固相支持体中にサンプルを置くことが望ましいと思われる。該方法は、特定のヌクレアーゼによって作られた末端の存在を定量するのに有用であり得る。透明な固相支持体には、透明なテストストリップ、及び微量定量プレートが含まれるが、これらに限定されない。シグナル部分が酵素の場合には、該方法には、酵素に基質を加えるステップが含まれる。該基質は、第２の分子を具備する試薬の一部として提供し得る。あるいは、第２の分子を具備する試薬の後に、基質を与えてもよい。酵素を基質と反応させる場合には、測定可能な変化が起こらなければならない。例えば、酵素は、無色の基質分子を色の付いた産物分子に変化させ得る。あるいは、色の付いた基質分子を無色の産物分子に変えてもよい。幾つかの例では、酵素反応の産物の１つは、光のフォトンであり得る。これらの例では、生じた光のフォトンの量を測定することが可能である。利用可能な酵素及び適切な基質及び定量法は、当業者に周知である。例１アポトーシス細胞における、１塩基3’-オーバーハング、並びに平滑末端ＤＮＡおよび遊離3’-ヒドロキシ基を有する高濃度の二本鎖ＤＮＡの検出一般的方法の項で説明したようにして、ラットの胸腺を固定し、三つの標識法によって処理した。図１は、（ａ）15分のアルカリホスファターゼ発色を用いた、Taqポリメラーゼにより調製された１塩基3’-オーバーハング二本鎖ＤＮＡ断片のライゲーション；(ｂ)15分のアルカリホスファターゼ発色を用いた、Pfuポリメラーゼにより調製された平滑末端ＤＮＡ断片のライゲーション；(ｃ)７分のアルカリホスファターゼ発色を用いた、TdTでの3’-ヒドロキシル基の延長、から生じた反応生成物を示している。a’、b’およびc’は、６倍長い時間（夫々9 2分および42分）のアルカリホスファターゼ発色を使用した三つの標識法の反応生成物である。多くのアポトーシス細胞を含む組織を得るために、我々は当初、グルココルチコイド投与後24時間のラット胸腺、即ち、以前の研究により充分に確立されたアポトーシスモデルを使用した。しかし、約１％の胸腺細胞が出生の地の動物の細胞死の特徴を示すという観察に一致して、対照ラット胸腺もまた、少数ではあるが有用な数のアポトーシス細胞を有していた。対照胸腺組織切片は、グルココルチコイド処理胸腺に見られる幾つかの萎縮に影響されなかったので、我々は、対照胸腺における萎縮細胞をＤＮＡ末端の研究の標準として使用したが、比較のために、デキサメタゾン処理動物由来の胸腺中での結果も示す。同じ濃度の断片を使用し、またリガーゼとの同じインキュベーション時間を使用して、連続的な６μｍ切片を、１塩基3’-オーバーハングＤＮＡ断片および平滑末端ＤＮＡ断片で標識した。また、連続的な切片をTdTでも標識した。全ての場合に、リガーゼまたはTdTの作用によって当該切片に固定されたジゴキシゲニンが、抗ジゴキシゲニン／アルカリホスファターゼ複合体を用いて検出された。我々は、アポトーシス細胞の可視化を正に可能にするアルカリホスファターゼ反応における、発色時間の長さを評価した。TdTの場合には７分の反応時間およびリガーゼについては15分の反応時間(3’-オーバーハングＤＮＡ断片または平滑末端ＤＮＡ断片の何れかを用いる)が、胸腺切片中のアポトーシス細胞をラベルするためには充分である。６倍長い発色時間を用いたときは、全ての三つの技術を用いて同じ数の核が標識され、非常に少ないバックグラウンド染色しかなかった。例２対照胸腺およびグルココルチコイド処理した胸腺において、異なったタイプのＤＮＡ末端の存在によって検出される、アポトーシス細胞のパターンの比較我々は、対照胸腺およびグルココルチコイド処理胸腺の両者において、3’-オーバーハング断片のライゲーションによる細胞の標識と、TdTを用いたアクセス可能な3’-ヒドロキシ基の反応による細胞の標識とを比較した(図２)。対照動物およびグルココルチコイド処理動物の胸腺皮質において、両方法によって染色された細胞の数およびパターンは、対照動物およびグルココルチコイド投与の24時間後の動物において先に報告されたアポトーシス細胞の数およびパターンと一致した。対照ラットからの胸腺（ａ，ｂ）およびグルココルチコイド処理ラットがらのラット（ｃ，ｄ）を、例１に記載したようにして固定および処置した。図２は、（ａ，ｃ）Taqポリメラーゼ断片のライゲーション、15分のアルカリホスファターゼ反応；(ｂ，ｄ)TdT反応、７分のアルカリホスファターゼ反応による反応生成物を夫々示している。例３ウィルムス腫瘍のネクローシス細胞内における、三つの標識法による、ＤＮＡ末端の検出。アポトーシス細胞およびネクローシス細胞において、１塩基3’-オーバーハング、平滑末端、および全てのアクセス可能な3’-ヒドロキシル基の発生を比較するために、我々は、アポトーシス組織およびネクローシス組織の両方の同時染色を行った。使用した方法は、例１に記載した通りであった。大面積のネクローシスを含むウィルムス腫瘍の切片を、多くのネクローシス細胞を含む組織の基準として使用した。この異種組織内の種々の領域に対する異なった方法の反応の比較を可能にするために、連続的な切片を使用した。胸腺におけるアポトーシス細胞の検出で使用したように、二つの異なった時点、即ち、アポトーシス細胞を可視化するために充分な時間（7分または15分）および６倍長い時間で、染色反応で行った。これらの時間が適切であることを保証するために、ラット胸腺の切片をネクローシス組織と一緒にスライド上に載せ、同じ標識溶液中で処理した。一連の切片を使用して、同じ領域が三つの標識法により示され、図３に提示された。図３ａおよび３ｄは、3’-オーバーハングTaqポリメラーゼ断片、15分のアルカリホスファターゼ反応を示し；図３ｂおよび３ｅは、平滑末端Pfuポリメラーゼ断片のライゲーション、15分のアルカリホスファターゼ反応を示し；図３ｃおよび３ｆは、TdT反応、７分のアルカリホスファターゼ反応を示している。a ’、b’、c’、d’、e’およびf’は、アルカリホスファターゼとの６倍長い時間（夫々92分および42分）を用いた三つの標識法の反応生成物である。検体のネクローシス領域において、TdT反応は、７分のアルカリホスファターゼはっショックで強い標識を生じた(図３ｃおよび３ｆ)。純粋なネクローシス領域（図３ａ〜ｃ）において、3’-オーバーハング断片および平滑末端断片の両者のライゲーションは、アポトーシス細胞の可視化に必要とされるより６倍も長い発色でさえも、非常に少しの染色しか生じなかった。或る組織構造が保存された腫瘍の隣接領域において(図３ｄ〜ｆ)、TdTでの核の広範な染色が再度観察された。平滑末端断片の場合は、６倍の過剰発色反応で核の異なった標識も観察されたが、3’-オーバーハング断片では殆ど全く観察されなかった。 3’-オーバーハング断片がネクローシス領域で信号を生じず(図３ａ)、アポトーシス領域（図３ｄ）では強い信号を発生した（図３ｄ）という事実は、１塩基の3’-オーバーハングがアポトーシス細胞に特異的であるとの結論を導く。例４種々の量のジゴキシゲニン標識ＤＮＡを用いたスポットの相対的発色指示された量のジゴキシゲニン標識ＤＮＡを、方法の項で説明したようにしてナイロン膜上にスポットし、次いで、ジゴキシゲニンの検出のためにアルカリホスファターゼ反応により処理した。15分および90分での発色の程度が示されている。アポトーシス組織v.s.ネクローシス組織において、１塩基の3’-オーバーハングの相対的な量の見積りを与えるために、ナイロン上のジゴキシゲニン標識ＤＮＡの一連のスポットを、組織切片について使用した２倍の同じ量を使用して、アルカリホスファターゼ発色によって染色した(図４)。この実験は、90分v.s.15分の発色が、殆ど100倍未満のジゴキシゲニンの可視化を可能にすることを示した。胸腺におけるアポトーシス核は、15分の発色を用いた3’-オーバーハング断片のライゲーションによって容易に検出されるが、ネクローシス組織における核は、90分の発色では殆ど染色されず、アポトーシス核は、ネクローシス核の少なくとも100倍以上の１塩基3’-オーバーハングを有すると結論することができる。例５ＤＮＡ損傷を伴う細胞における3’-オーバーハングの試験この方法の特異性を試験するために、我々は3’-オーバーハングＤＮＡ断片にライゲートできるＤＮＡ末端が、in vivoで生じるかも知れない他のタイプのＤＮＡ損傷(例えば、酸素遊離ラジカルＤＮＡ鎖破断)、または死後自己消化、もしくはＤＮＡを損傷するin vitro処置（例えば、抗原回復処置に用いられる加熱）によるＤＮＡ損傷を伴った細胞内に存在するかどうかを試験した。これを評価するために、二つの標識法によって、過酸化水素で処理した肝臓内のＤＮＡ末端の検出を行った。使用した方法は、例１に記載した通りである。図５は、（ａ）Taqポリメラーゼ断片のライゲーション、90分のアルカリホスファターゼ反応；(ｂ)TdT反応、4 2分のアルカリホスファターゼ反応、を使用した一連の切片を示している。酸素ラジカルによる迅速な損傷を与えるために、アポトーシス細胞死が起きないような短時間で、過酸化水素を麻酔したラットの肝臓に注射し、20秒後に肝臓の切片を固定した。この組織は、TdTがアクセス可能な3’-末端を伴う多くの核領域を示したが、3’-オーバーハングは示さなかった(図５)。例６自己消化ウシ副腎皮質組織内におけるＤＮＡ末端の検出使用した方法は、一般的方法の項に記載した通りである。一連の切片を使用し、同じ領域を三つの標識法によって示す。図６は、（ａ）Taqポリメラーゼ断片のライゲーション、15分のアルカリホスファターゼ反応；(ｂ)Pfuポリメラーゼ断片のライゲーション、15分のアルカリホスファターゼ反応；（ｃ）TdT反応、７分のアルカリホスファターゼ反応を夫々示している。a’、b’およびc’は、アルカリホスファターゼによる６倍長い反応（夫々90分および42分）を使用した三つの標識法の反応生成物である。培地中において37℃で16時間インキュベートしたウシ副腎皮質断片の中央に、自己消化が生じた。再度、ラット胸腺内でのアポトーシス細胞の検出に適したアルカリホスファターゼ発色の倍数を使用したところ、細胞は、3’-オーバーハング断片のライゲーションによって染色されずに、平滑末端断片ライゲーションで軽く染色され、3’-末端のTdT延出によって顕著に染色された(図６ａ〜ｃ)。６倍の過剰発色反応では、3’-オーバーハングライゲーションを伴う切片において軽い染色が見られた一方、平滑末端断片およびTdTでの染色はもっと強かった。例７加熱した組織切片内での二つの標識法によるＤＮＡ末端の検出ウシ副腎の切片を、方法の項で説明したようにして処理した。図７は、（ａ） Taqポリメラーゼ断片、15分のアルカリホスファターゼ反応；(ｂ)TdT反応、７分のアルカリホスファターゼ反応を使用した一連の切片を示している。熱の影響を試験する耐えに、対照ウシ副腎の６μｍの切片を100℃で５分間加熱し、続いて、3’-オーバーハング断片のライゲーションまたはアクセス可能な 3’-末端の検出を行った(図７)。3’-オーバーハングのライゲーションを伴う切片において幾つかの非特異的染色が認められたが、核は染色されなかった。対照的に、加熱切片においては核のTdT標識がかなりの程度見られた。例８組織サンプルにおけるアポトーシス細胞の存在の検出サンプル中に存在するＤＮＡを、標準的な方法（Sambrook et al.を参照のこと）に従って単離する。このＤＮＡを、アガロース上でサイズ分画し、次いで固相支持体に移す。この固相支持体は、一般的には膜の形態である。該膜は、例えばナイロン、PVDFまたはニトロセルロースのような、通常利用される如何なる材料で構成されていてもよい。転写は、通常利用される如何なる方法で行ってもよい。これらの方法には、毛管作用、真空ブロッティングおよび電気ブロッティングが含まれる。団を固相支持体に転写した後に、該固相支持体は公知のブロック溶液を使用してブロックされる。ブロッキングに続いて、この固相支持体を、標的ＤＮＡに特異的なＤＮＡプローブ分子、ＤＮＡリガーゼ酵素および必要な共因子を含有する溶液に接触させる。該リガーゼ反応は、約４℃〜約37℃の温度で行えばよい。好ましくは、このライゲーション反応は約10℃〜約37℃ の温度、最も好ましくは約15℃〜約37℃の温度で行えばよい。当業者は、ライゲーション反応のプロセスの間、固相支持体が完全に乾燥するのを防止する必要があることを容易に理解するであろう。これを達成するためには、例えば、密封されたプラスチックバッグ若しくはローラボトルまたは当業者に公知の通常使用される装置のような密封容器の中で、ライゲーション反応を行えばよい。ライゲーション反応を完了した後に、上記のようにして固相支持体を洗浄し、ＤＮＡプローブ分子を検出する。例９同一のアポトーシス細胞における 3 ’オーバーハングとタンパク質の同時検出本発明は、以下のことを同時に検出することが可能である：１）アポトーシス細胞のDNA分子特性；及び２）同一のアポトーシス細胞において発現されるタンパク質分子。これにより、アポトーシスを受ける細胞におけるタンパク質発現の特徴を示すことが可能になる。上述の通り、組織サンプルを固定し、パラフィン中に包埋する。続いて、上述の通りに濃度勾配アルコールに通し、該サンプルを脱パラフィンし、且つ再水化する。基本プロトコールにおいて記述したプロテイナーゼＫのステップは削除する。その代わりに、該サンプルを緩衝液中に位置し、加熱する。該サンプルは、シールされた容器内に位置し、更にシールされた容器を沸騰水に入れることにより加熱すること、或いはその代わりに、緩衝液中に該サンプルを位置し、更に該緩衝溶液を高周波オーブンで加熱することにより加熱することが可能である。該サンプルは、70℃よりも高い温度にまで加熱し、その温度を少なくとも15分間維持する。使用する緩衝液は、一般的に入手可能な何れの緩衝液でもよい。好ましい態様において、該緩衝液はｐＨ6の0.01Ｍのクエン酸塩溶液である。加熱後、該サンプルを冷却し、DNAプローブと、DNAリガーゼ酵素と、該リガーゼ反応の進行に必須の補因子と、更に問題のタンパク質に特異的な抗体とを含有する溶液に接触させる。標準的な方法を用いて該抗体を検出し、上述の通りに該 DNAプローブ分子を検出する。同一細胞における該抗体及び該DNA分子の存在により、該抗体が特異的に結合するタンパク質が、アポトーシス細胞に存在することが示される。好ましい態様において、加熱後、第１の抗体を該サンプルに適用し、適切な時間（例えば、約５分間から約４８分間）に亘って、適切な温度（例えば、約4℃ から約37℃）でインキュベートすることが可能である。適切な時間と温度の選択は、該抗体−タンパク質相互作用の性質に依存するものであり、このことは当業者には明らかである。次に、該サンプルをｐＨ7.5の0.1Ｍ Tris-NaClを用いて、10分間ずつ、２度洗浄する。次に、該サンプルを、検出可能なモイエティと複合する第２の抗体とを含有する溶液に接触させる。種々の態様において、検出可能なモイエティは、酵素、小型分子、フルオロフォア(fluorophore)、クロモフォア、又は放射能で標識した分子であってもよい。好ましい態様では、該酵素はアルカリホスファターゼであろう。該サンプルを、該第２の抗体と、適切な時間（例えば、約５分間から約24分間）で、且つ適切な温度（例えば、約4℃から37℃）でインキュベートする。好ましい態様において、該第２の抗体を、該サンプルと室温で30分間インキュベートする。続いて、該サンプルをｐＨ7.5のTris-NaCl等の緩衝溶液中で洗浄する。該検出可能なモイエティが酵素である場合には、該サンプルを、検出用試薬を含有する溶液と接触する。該検出用試薬は、一般的に、該第２の抗体と複合した該酵素の基質として働く分子であってもよい。該酵素の反応産物及び検出用試薬は検出可能である。該酵素がアルカリホスファターゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼである場合には、該反応産物はクロモフォアであってもよい。該酵素がルシフェラーゼである場合には、該反応産物はライトフォトンであってもよい。当業者に公知の他の酵素を、検出可能なモイエティとして使用することも可能である。そのような酵素は当業者に公知であり、本発明の意図から逸脱せずに代用することが可能である。その代わりの態様［ここで、該検出可能なモイエティは、直接的に該第１の抗体に結合する］は、本発明の範囲内である。第１の抗体の存在を検出した後に、該リガーゼ反応及びDNAプローブ分子の検出を上述の通り行う。は、蛍光色素で標識されてもよく、該抗体分子は、異なる蛍光色素で標識されてもよい。該色素は、それらにより同時検出が可能となるように選択してもよい。該DNAプローブと該抗体分子とを含有する溶液は、任意に、ブロッキング剤を含有してもよい。ブロッキング剤として使用されるブロッキング剤は、BSA、乾燥ミルク、洗剤等を含む。該反応が完了した後で、該組織サンプルを緩衝溶液で洗浄し、蛍光顕微鏡下で検査する。１以上のタンパク質分子を同時に検出することが可能である。これは、問題の各タンパク質に特異的な抗体を使用することにより達成され、同時に視覚化可能な蛍光色素の数によってのみ制限される。例１０ 3 ’オーバーハング及びRNA分子の同時検出本願は、アポトーシスを受ける細胞におけるRNA分子の検出を可能にする。組織サンプルを、上述の通りにライゲーション用に調製する。該サンプルを、問題のRNA分子の配列に相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションの厳密な条件は、問題の配列と該オリゴヌクレオチドプローブの長さとに依存する。ハイブリダイゼーション条件を選択するための適切な方法論は、サンブロックら(Sambrook,et al)の文献に含まれる。ハイブリダイゼーションは、略室温から約74℃までの温度で、約15分から48時間までの期間で処理することが可能である。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、約４時間から約 16時間の期間で、約40℃から約65℃までの温度で処理することが可能である。ハイブリダイゼーションの後で、該サンプルを洗浄することも可能である。洗浄条件のストリンジェンシー、即ち、イオン強度と温度は、該プローブの長さと該プローブのヌクレオチド配列とに応じて調整される。適切な時間に亘る洗浄の後に、3’オーバーハングに対してライゲーションされ得るDNA分子と、DNAライゲーション酵素と、更に適切な補因子を含有する溶液に対して、該サンプルを接触させる。ライゲーション反応を室温で約１時間行う。次に、該サンプルを洗浄し、該オリゴヌクレオチドと該DNA分子の存在を検出する。同一細胞におけるオリゴヌクレオチド及びDNA分子の存在は、問題のRNA分子がアポトーシス細胞において存在することを示す。上記のアッセイは、多様な方法において構成され得る。使用されるオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ分子であっても、又はＤＮＡ分子であってもよい。検出可能なモイエティは、該オリゴヌクレオチドに組み込まれていてもよい。これらのモイエティは、酵素、小型分子、クロモフォア類、フルオロフォア類又は放射能標識された分子であってもよい。好ましい態様では、該検出可能なモイエティはFI TCである。当業者に公知の他のフルオロフォア類も本願の範囲内である。検出可能なモイエティは、ライゲーションされるべきDNA分子に組み込むことが可能である。例えば、検出可能な分子は、酵素、小型分子、フルオロフォア類、クロモフォア類、又は放射能で標識された分子であってもよい。好ましい態様において、ライゲーションされるべきオリゴヌクレオチド及びDNA分子は、共に、フルオロフォア類を組み込む。この態様において、該オリゴヌクレオチドに組み込まれたフルオロフォアは、該DNAに組み込まれたフルオロフォアが発する蛍光とは、異なる波長の蛍光を発する。これにより、オリゴヌクレオチドとDNA分子の同時検出が可能になる。アポトーシス細胞のDNAにおける3’オーバーハングに対してライゲーションされるDNA分子は、ビオチン、ブロミン又はジゴキシゲニン等の小型分子を含有できる。該小型分子がビオチン、又は抗ジゴキシゲンン抗体若しくは抗体断片である場合には、ライゲーションの後で、該サンプルを、アビジン又はストレプトアビジン等の小型分子と結合する分子に接触させる。該小型分子に結合する分子は、検出可能なモイエティと複合する。該検出可能なモイエティは、酵素、フルオロフォア、クロモフォア又は放射能で標識された分子であってもよい。例１１固体支持体捕獲アッセイ本発明を使用し、定義されたオーバーハング末端を有するDNA標的分子を検出及び／又は単離することが可能である。これは、定義された末端を有する核酸プローブ分子を、固体支持体に結合することにより達成される。該固体支持体は、膜類、マイクロタイタープレート類、アガロースビーズ類、合成樹脂製ビーズ類（しかし、これらに限定されるものではない）及び当業者に公知の他の固体支持体等を含み、当業者に公知の何れの固体支持体であってもよい。好ましい態様では、該固体支持体は合成樹脂でコートされた常磁性粒子でめる。本態様は、該ビーズを反応溶液から容易に分離することを可能にする。該固体支持体に結合した核酸プローブ分子は、捕獲断片と称される。該捕獲断片は、DNA標的分子の定義されたオーバーハング末端に対して相補的な末端を有するように選択される。該断片は、当業者に公知の何れの手段を用いて製造されてもよい。例えば、該断片は、大きいDNA分子に対して所望するオーバーハング末端を生ずるようなヌクレアーゼを処理することにより、該大きいDNA分子から製造することが可能である。次に、当業者に公知の何れかの方法論を使用し、所望するオーバーハング末端を有するDNA断片を単離し、続いて該固体支持体に固定する。例えば、該固体支持体は、捕獲断片に存在する官能基と反応することが可能な反応官能性を提供されてもよい。或いは、捕獲断片を、該固体支持体と反応可能な反応官能性を具備するように修飾することも可能である。他の態様では、該捕獲断片は、固体支持体上に存在する官能基により結合され得る小型分子を提供される。例えば、該捕獲断片は、ビオチンモイエティ又はジゴキシゲニンを提供されてもよく、該固体支持体は、ストレプトアビジン又は抗ジゴキシゲニン抗体うを提供されてもよい。当業者には、該捕獲断片のオーバーハング末端に影響を与えない何れかの方法を使用することと、該捕獲断片を該固体支持層に固定することが可能であると容易に認識されるであろう。該捕獲断片は、オーバーハング末端以外の更なる所望の構造的特徴を具備するように設計することが可能である。例えば、該捕獲断片は、制限酵素部位を含んでもよい。該捕獲断片を使用し、対応するヌクレアーゼ切断DNAを単離した後に、該捕獲断片を制限エンドヌクレアーゼを使用して切断し、それによって、該ヌクレアーゼ切断断片に加えて該捕獲断片の一部分を含むDNA分子を遊離することが可能である。 DNA標的分子は、当業者に周知の方法を使用することによりクローニング及びシーケンシングされてもよい。例えば、該ヌクレアーゼ切断DNAを、該捕獲断片に対してリゲーションすることが可能である。続いて、該固体支持体を、Pfuポリメラーゼで処理し、該固体支持体に結合した平滑末端断片を生成することが可能である。次に、該固体支持体を制限酵素で処理し、平滑末端断片を該固体支持体から切断することが可能である。次に、該断片を、処理されたベクター中に、平滑末端と該制限酵素により生じた末端に一致する末端とを有するようにクローニングすることも可能である。当業者は、他の相当するクローニング戦略を容易に想像することもできるであろう。或いは、該捕獲断片に、PCRプライマーが結合するであろう配列を含ませることも可能である。ヌクレアーゼ切断DNAと反応した後で、その反応混合物に必要な試薬を提供し、捕獲されたヌクレアーゼ切断断片におけるPCRを実施することも可能である。該捕獲断片中に１以上の所望する機能的特徴を組み込めることが、当業者には容易に理解されるだろう。例えば、制限酵素切断部位と、PCRプライマー結合部位とを共に、同一の捕獲断片中に組み込むことが可能である。該捕獲断片は、検出可能なモイエティを提供されてもよい。ヌクレアーゼ切断 DNAを、該捕獲断片にライゲーションした後に、その捕獲断片を該固体支持体から切断し、該検出可能なモイエティの存在を試験してもよい。ヌクレアーゼ切断 DNAに結合する捕獲断片を、結合していない捕獲断片から単離するステップを実施する必要があるかもしれない。２種類の断片をサイズの違いに基いた公知の方法を使用することにより、当業者には容易に達成することができる。ヌクレアーゼ切断末端を含むことが疑われるDNAを、何れの源からも単離することが可能である。該DNAは、当業者に容易に知られる方法を使用して単離される。ヌクレアーゼ切断末端を含むことが疑われるDNAが単離された後に、それを、DNAリガーゼ、及び必要な補因子（二価の金属イオン類やATP等）の存在下において、捕獲断片と結合する。適切な長さのインキュベートの後に、該ライゲーション溶液を、洗浄により除去し、ヌクレアーゼ切断DNAの有無を検出することが可能である。上述した基本的なアッセイは、種々の方法において構成することが可能である。例えば、該捕獲断片を、溶液中でフリーの断片として、ライゲーション溶液に対して提供することも可能である。この種の態様において、該捕獲断片には、ビオチン又はジゴキシゲニン等の結合モイエティが提供されるであろう。適切な反応時間の後に、アビジン、ストレプトアビジン又は抗ジゴキシゲニン等の結合モイエティに対する結合が可能な分子を含有する固体支持体を、該溶液に混合する。該結合モイエティが該固体支持体に対して結合できるだけの期間のインキュベートの後に、該固体支持体を洗浄して非結合物質を除去し、続いて、所望する何れかの様式に処理することが可能である。或いは、該捕獲断片を、既に固体支持体に添加したライゲーション混合物に対して提供することも可能である。該ライゲーション反応が進行可能になった後で、続いて、該固体支持体を前述の通りに洗浄することができる。本発明は、DNAサンプルに存在する特定のオーバーハングの末端を検出するためのアッセイとしても使用することが可能である。上述の通りに、ライゲーションと、固体支持体に対する結合との後で、該サンプルは洗浄され、続いて既知量の相補的末端を提供される。これらの相補的末端を有した断片は、ある方法で、例えば、放射能標識、又はフルオロフォア若しくはクロモフォアの含有により検出されるであろう。第２のライゲーション反応は、該ライゲーション反応から免れた、ヌクレアーゼ処理DNAに結合していない何れのオーバーハング末端に対しても、放射能標識された断片を結合するように実施し得る。結合する放射能標識物質が増えれば増えるほど、オリジナルサンプルにおいて存在する正しいオーバーハング末端は少なくなる。例１２ヘアピンオリゴヌクレオチドとターミナルトランスフェラーゼとを有するDNA鎖断片の二重標識アポトーシス細胞の核における二本鎖断片のラベリングにおけるオリゴヌクレオチドヘアピンプローブの感度及び特異性を試験するために、我々は、その切片においてアポトーシス細胞が存在する組織切片［前記切片は、ネクローシスを受ける細胞も含んでいてよく、一本鎖断片を有していてもよい］から得た部分に、プローブを適用した。使用した組織は：デキサメタゾンで処理したラットからの胸腺；その被膜(capsul)を穿刺することによりアポトーシスを惹起したマウスの腎臓；及び広い領域のネクローシスを含むウィルムス腫(Wilms tum or)である。二重染色方法を使用し、ヘアピンオリゴヌクレオチドプローブの連続したライゲーションを可能にし、続いてターミナルトランスフェラーゼによる二本鎖断片及び一本鎖断片において利用可能な全ての3’-水酸基DNA末端をラベリングした。該オリゴヌクレオチドプローブにおける検出可能なモイエティ、即ち、ビオチンは、フルオレセイン-アビジン複合体により視覚化され、且つ3’- 水酸基末端はテキサスレッド-dUTP(Texas red-dUTP)の添加により視覚化された。以下の試験では、シングル3’-Aオーバーハングを有するヘアピンプローブを使用した(図８)。両者のラベリングの形態は、酵素(ライゲース又はターミナルトランスフェラーゼ)の存在に依存した；酵素が、該切片に対して添加された反応混合物から除かれた場合には、何れの核シグナルも観察されなかった。アポトーシス細胞は、両技術により同等の強度で特異的に標識された。アポトーシス細胞核及びネクローシス細胞核における鎖断片をラベリングする技術の相対的な特異性を、デキサメタゾン処理ラット胸腺と、アポトーシス細胞を多数含む組織と、及び広範囲のネクローシスを含むウィルムス腫のサンプルとからのサンプルを比較することにより試験した。少数は、ターミナルトランスフェラーゼにより、又はヘアピンプローブのライゲーションにより選択的に標識されるようであるが、胸腺においては、アポトーシスを受ける殆どの細胞が両技術により標識された。該腫瘍のネクローシス領域では、幾つかの細胞がヘアピンプローブのライゲーションにより標識された。しかしながら、これらの細胞は、ターミナルトランスフェラーゼによって、可変的な程度に標識された非常に多くの細胞によって囲まれていた。該腫瘍のこれらの領域を従来の組織学によって検査したところ、これらの細胞はネクローシスを受けていようであった。該胸腺とウィルムス腫瘍標本との相違点は、両者の蛍光色素を二波長フィルターで同時に観察した場合において、最も顕著であった。但し、該胸腺の大部分の細胞は、両技術により均等にラベリングされいることを示すような黄色を呈し、該腫瘍のほんの少しの細胞は、ヘアピンプローブのライゲーションに比べてターミナルトランスフェラーゼの方がより高度にラベリングされることを示すような黄色を呈した。興味深いことに、共焦点顕微鏡による二重染色アポトーシス細胞の観察により、ヘアピンプローブによるラベリングの核内パターンが明らかになった。幾つかの細胞は、ヘアピンプローブ及びターミナルトランスフェラーゼにより等しく標識されるクロマチンの凝縮及び辺縁趨向を示していた；しかしながら、胸腺の多くの細胞が、核周縁部の周囲にラベリングされたより強度の強い二重染色断片の順域を示したのに対し、ターミナルトランスフェラーゼはこれらの核をより一律に標識した。例１３異なる種類のプローブ平滑(blunt)、１ヌクレオチド及び２ヌクレオチドのオーバーハングの３種類のプローブについて、それらの特異性及び感度を比較した。３種類のプローブのラベリングパーターンは一般的に同じであった。しかしながら、NNオーバーハングプローブは、他のプローブに比較して、より強い強度のシグナルを生じたものの、同時により高いバックグランド（即ち、酵素不在下でのシグナル）も示した。更に、該腫瘍のネクローシス領域は、一本鎖Ａオーバーハングよりも、NN及び平滑末端プローブの両者によって、より高い強度で標識された。一本鎖Ａオーバーハングプローブが、アポトーシス細胞のラベリングに対して最高の特異性を有しているようである。アポトーシス細胞における3’-オーバーハングを有する二本鎖断片の産生に対する適切なメカニズムが、これまでに論じられてきている。２ヌクレオチドのオーバーハングを有する断片は頻繁に見られるが、２つ、恐らくはより多くの数のヌクレオチドのオーバーハングを有する断片を高い信頼性で検出するためには、２ヌクレオチドのオーバーハングを有するプローブの非特異的な結合を抑制するよりよい方法が必要とされるであろう。該方法論は、5’-オーバーハング鎖断片を検出することを可能にする5’-オーバーハングを有するヘアピンを設計することにより拡大できた。しかしながら、この場合、該オリゴヌクレオチドにおける陥凹した3’-水酸基が、その切片における5’-リン酸に対して結合する［これは5’-オーバーハングを有する一本鎖DN A断片及び二本鎖断片の末端で同様に生じ得る］であろうことから、一本鎖DNA断片に対する結合が起るのであろう。従って、5’-オーバーハングの検出は、ライゲーション及び5’リン酸化オリゴヌクレオチドの使用の前に、該組織切片の脱リン酸化が必要であろう。ヘアピンオリゴヌクレオチドプローブの合成の容易さ、及び二本鎖断片を検出するためのシンプルな方法は、本方法論が、瀕死細胞での二本鎖断片の異なる種類の検出に対する潜在的な拡大を伴なう、アポトーシス細胞の染色における広汎な適用［メカニズム的な有効性と診断上の有効性があるかもしれない］を持つことを可能にするであろう。例１４ライゲーションと慣用法による同時標識本発明の１つの態様において、サンプルを、本出願において開示した方法論を基礎にしたライゲーションと、アポトーシス細胞を検出するために使用される従来の方法論とを組み合わせて使用し、同時に厳密に調査した。好ましい従来の方法は、ビオチン化dUTPニック末端ラベリング(TUNEL)を介在したターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)を使用することを基礎としたアッセイと、DNAにおけるギャップを塞ぐためのクレノウ断片(Klenow fragment)を使用することを基礎としたアッセイである。該ライゲーション反応は、TdT又はクレノウ反応と同時に行ってもよい。他の態様では、該反応を、第１に行われる該ライゲーション反応、又は第１に行われる従来の反応の何れかと逐次的に行うことが可能である。本発明の本態様により、従来の方法により検出される遊離水酸基と、本発明の方法により検出されるライゲーション可能なオーバーハング構造とを同時検出することが可能になる。本発明は、詳細に示された明確な態様により記載されてきたが、これらの記載は説明のためだけに記載されたものであり、また、本発明が特に列記された態様に制限されるものではないことは理解されるべきである。修飾及び改変は、当業者に容易に理解され、且つこれらの修飾及び改変は本発明の範囲内である。従って、開示された発明のこれらの修飾及び改変は、本発明及び以下の請求項の範囲内にあると見なされる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．サンプル中におけるアポトーシス細胞を検出する方法であって：アポトーシスに特徴的な末端を有するＤＮＡを含んだサンプルを固定する工程と；該サンプルを、アポトーシスに特徴的なＤＮＡ末端にライゲートすることが可能な核酸分子および核酸リガーゼ酵素を含有する溶液に接触させる工程と；前記核酸分子を検出する工程とを具備し、該核酸分子の検出がアポトーシス細胞の存在に関連している方法。２．請求項１に記載の方法であって、前記サンプルが組織サンプルである方法。３．請求項１に記載の方法であって、前記核酸分子が検出可能部分を具備する方法。４．請求項３に記載の方法であって、前記検出可能部分が、酵素、小分子、発色団、蛍光団および放射線標識された物質からなる郡から選択される方法。５．請求項１に記載の方法であって：更に、前記組織サンプルをプロテアーゼ含有溶液に接触させる工程と；前記組織サンプルを洗浄して前記プロテアーゼを除去する工程とを具備する方法。６．請求項３に記載の方法であって、前記検出工程は、酵素を含有する試薬を用いて行われる方法。７．請求項３に記載の方法であって、前記検出工程は、前記検出可能部分に結合する抗体またはその断片を含む試薬を用いて行われる方法。８．請求項３に記載の方法であって：更に、前記組織サンプルを、前記検出可能部分に結合する第一の分子を含む試薬に接触させる工程と；続いて、前記組織を、前記第一の分子に結合する第二の分子を含む試薬に接触させる工程とを具備する方法。９．請求項８に記載の方法であって、前記第一の分子は、抗体、抗体の断片、アビジンおよびストレプトアビジンからなる郡から選択される方法。１０．請求項３に記載の方法であって：更に、前記組織サンプルを、前記検出可能部分に結合する第一の部分と酵素を含む第二の部分とを有する分子を含んだ試薬に接触させる工程を具備する方法。１１．請求項１０に記載の方法であって、前記第一の部分は、抗体、抗体の断片、アビジンおよびストレプトアビジンからなる郡から選択される方法。１２．請求項１０に記載の方法であって、前記第二の部分はホスファターゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、ペルオキシダーゼおよびルシフェラーゼからなる郡から選択される酵素を含む方法。１３．請求項１０に記載の方法であって、前記第一の部分はストレプトアビジンを含み、前記第二の部分はホスファターゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、ペルオキシダーゼおよびルシフェラーゼからなる郡から選択される酵素を含む方法。１４.請求項１に記載の方法であって、前記核酸は平滑末端を有する方法。１５．請求項１に記載の方法であって、前記核酸は3’-オーバーハングを有する方法。１６．サンプル中のアポトーシス細胞を検出する方法であって：サンプルから、アポトーシスに特徴的な末端を有するＤＮＡを単離する工程と；該ＤＮＡを固相支持体に移す工程と；前記固相支持体を、アポトーシスに特徴的なＤＮＡ末端にライゲートされ得る核酸プローブ分子および核酸リガーゼ酵素を含有する溶液に接触させる工程と；前記核酸プローブ分子を検出する工程とを具備し、該核酸プローブ分子の検出がアポトーシス細胞の存在に相関する方法。１７．請求項１６に記載の方法であって、前記核酸プローブ分子は検出可能部分を具備する方法。１８．請求項１７に記載の方法であって、前記検出可能部分は、酵素、小分子、発色団、蛍光団および放射線標識物質からなる郡から選択される方法。１９．アポトーシス細胞の検出のためのキットであって；アポトーシスを受けた細胞のＤＮＡに特異的にライゲートし、且つ検出可能部分を有する核酸プローブと；前記核酸プローブをライゲートするための酵素と；前記検出可能部分を検出するための試薬とを具備するキット。２０．請求項１９に記載のキットであって、前記核酸プローブは平滑末端を有するキット。２１．請求項１９に記載のキットであって、前記核酸プローブは、3’-オーバーハングを有するキット。２２．請求項２０に記載のキットであって、前記核酸プローブは固相支持体に結合されるキット。２３．請求項２１に記載のキットであって、前記核酸プローブは固相支持体に結合されるキット。２４．アポトーシス細胞およびアポトーシス細胞のタンパク質を同時に検出するためのキットであって：アポトーシスに特徴的な末端を有するＤＮＡ分子にライゲートさせることができる、第一の検出可能部分を含む核酸分子と；アポトーシス細胞のタンパクに対して特異的で、且つ第二の検出可能部分を有する抗体と；核酸リガーゼ酵素と；前記第一の検出可能部分を検出するための試薬と；前記第二の検出可能部分を検出するための試薬とを具備するキット。２５．アポトーシス細胞およびアポトーシス細胞のＲＮＡ分子を同時に検出するためのキットであって：アポトーシスに特徴的な末端を有するＤＮＡ分子にライゲートすることができ、且つ第一の検出可能部分を有する第一の核酸分子と；アポトーシス細胞のＲＮＡ分子にハイブリダイズすることができ、且つ第二の検出可能部分を有する第二の核酸分子と；核酸リガーゼ酵素と；前記第一の検出可能部分を検出するための試薬と；前記第二の検出可能部分を検出するための試薬とを具備するキット。２６．アポトーシス細胞のタンパク質を検出する方法であって：アポトーシス細胞を含むサンプルを固定する工程と；該サンプルを加熱する工程と；前記サンプルを、アポトーシス細胞のタンパク質との複合体を形成する第一の分子を含有する溶液に接触させる工程と；前記サンプルを、第一の検出可能部分を有し且つ前記第一の分子との特異的複合体を形成する第二の分子を含有する溶液に接触させる工程と；前記サンプルを、第二の検出可能部分を有し且つアポトーシスに特徴的な末端を有するＤＮＡ分子にライゲートすることが可能な核酸分子および核酸リガーゼ酵素を含有する溶液に接触させる工程と；前記特異的複合体および前記核酸分子を検出する工程とを具備し、前記核酸分子と同じ細胞内での前記複合体の検出は、アポトーシス細胞における前記タンパク質の存在と相関する方法。２７．請求項２６に記載の方法であって、前記第一の分子は抗体である方法。２８．請求項２６に記載の方法であって、前記第二の分子は、酵素、小分子、発色団、蛍光団および放射線標識物質からなる郡から選択された第一の検出可能部分を有する方法。２９．請求項２６に記載の方法であって、前記第一の検出可能部分は、ホスファターゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、ペルオキシダーゼおよびルシフェラーゼからなる郡から選択された酵素である方法。３０．請求項２６に記載の方法であって、前記核酸は平滑末端を有する方法。３１．請求項２６に記載の方法であって、前記核酸が3’-オーバーハングを有する方法。３２．サンプル中においてアポトーシス細胞のＲＮＡ分子を検出する方法であって：アポトーシスに特徴的な末端を有するＤＮＡを含有するアポトーシス細胞を含んだサンプルを固定する工程と；前記サンプルを、アポトーシス細胞内に存在するＲＮＡ分子とハイブリダイズでき且つ第一の検出可能部分を含んだ第一の核酸分子を含有する溶液に接触させる工程と；前記サンプルを、第二の検出可能部分を有し且つＤＮＡにライゲートできる第二の核酸分子および核酸リガーゼ酵素を含有する溶液に接触させる工程と；前記第一の核酸分子および前記第二の核酸分子を検出する工程とを具備し、前記第二の核酸分子と同じ細胞内における前記第一の核酸分子の検出が、アポトーシス細胞のＲＮＡ分子の存在と相関する方法。３３.請求項３２に記載の方法であって、前記第一の検出可能部分は酵素、小分子、発色団、蛍光団および放射線標識分子からなる郡から選択される方法。３４.請求項３２に記載の方法であって、前記第二の検出可能部分は酵素、小分子、発色団、蛍光団および放射線標識分子からなる郡から選択される方法。３５．請求項３２に記載の方法であって、前記第一の検出可能部分および前記第二の検出可能部分が蛍光団である方法。３６．請求項３２に記載の方法であって、前記第二の核酸分子が平滑末端を有する方法。３７．請求項３２に記載の方法であって、前記第二の核酸分子が3’-オーバーハングを有する方法。３８．サンプル中においてアポトーシス細胞の存在を検出する方法であって：サンプルから、アポトーシスに特徴的な末端を有するＤＮＡを単離する工程と；前記ＤＮＡにライゲートできる核酸分子を固相支持体に固定する工程と；前記ＤＮＡを前記核酸分子にライゲートさせる工程と；前記核酸への前記ＤＮＡのライゲーションを検出する工程とを具備し、この核酸へのＤＮＡのライゲーションが、前記サンプル中におけるアポトーシス細胞の存在と相関する方法。３９．請求項３８に記載の方法であって、前記核酸分子は制限エンドヌクレアーゼの認識部位として作用するヌクレオチド配列を含んでいる方法。４０．請求項３８に記載の方法であって、前記核酸分子は前記固相支持体に開裂可能に固定される方法。４１．請求項３８に記載の方法であって、前記核酸分子は平滑末端を有する方法。４２．請求項３８に記載の方法であって、前記核酸分子は3’-オーバーハングを有する方法。４３．サンプル中においてアポトーシス細胞を検出する方法であって：アポトーシスに特徴的な末端を有するＤＮＡをサンプルから単離する工程と；前記ＤＮＡを固相支持体に固定することと；前記固相支持体を、前記ＤＮＡにライゲート可能な核酸分子および核酸リガーゼ酵素を含有する溶液に接触させる工程と；前記核酸分子の存在を検出する工程とを具備し、前記核酸分子の存在が、前記サンプル中におけるアポトーシス細胞の存在と相関する方法。４４．請求項４３に記載の方法であって、前記核酸分子は平滑末端を有する方法。４５．請求項４３に記載の方法であって、前記核酸分子は3’-オーバーハングを有する方法。４６．サンプル中において、アポトーシスに特徴的な末端を有するＤＮＡおよび3’-ヒドロキシル基を有するＤＮＡとを同時に検出する方法であって：アポトーシスに特徴的な末端を有し且つ3’-ヒドロキシル基を有するＤＮＡを含有するサンプルを固定する工程と；前記組織サンプルを、アポトーシスに特徴的な前記ＤＮＡ末端にライゲート可能な核酸分子および核酸リガーゼ酵素を含有する溶液に接触させる工程と；前記組織サンプルを、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素および該ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素の基質を含有する溶液に接触させる工程と；前記核酸分子および前記基質を検出する工程とを具備し、前記核酸分子および前記基質の検出は、前記サンプル中におけるアポトーシスに特徴的な末端を有するＤＮＡの存在に相関し、前記基質の検出は、前記サンプル中における3 ’-ヒドロキシル基の存在に相関する方法。４７．請求項４６に記載の方法であって、前記核酸分子は平滑末端を有する方法。４８．請求項４６に記載の方法であって、前記核酸分子は3’-オーバーハングを有する方法。４９．サンプル中においてアポトーシス細胞を検出する方法であって：ＤＮＡを含有するサンプルを固定する工程と；該サンプルを、アポトーシスを受けた細胞のＤＮＡに特異的にライゲートし且つ検出可能な部分を有する核酸プローブを含有し、更に該核酸プローブをライゲートするための酵素を含む溶液に接触させる工程と；前記核酸プローブを検出する工程とを具備し、該核酸プローブの検出はアポトーシス細胞の存在と相関する方法。５０．サンプル中におけるアポトーシス細胞を検出する方法であって：サンプルからＤＮＡを単離する工程と；該ＤＮＡを大きさにより分画する工程と；該ＤＮＡを、アポトーシスを受けた細胞のＤＮＡに特異的にライゲートし且つ検出可能な部分を有する核酸プローブを含有し、更に前記核酸プローブをライゲートさせる酵素を含んだ溶液に接触させる工程と；前記核酸プローブ分子を検出する工程とを具備し、該核酸プローブ分子の検出がアポトーシス細胞の存在と相関する方法。