JP2003230394A - マススペクトロメトリーによるｄｎａ配列決定法 - Google Patents

マススペクトロメトリーによるｄｎａ配列決定法

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JP2003230394A JP2002372188A JP2002372188A JP2003230394A JP 2003230394 A JP2003230394 A JP 2003230394A JP 2002372188 A JP2002372188 A JP 2002372188A JP 2002372188 A JP2002372188 A JP 2002372188A JP 2003230394 A JP2003230394 A JP 2003230394A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＤＮＡ配列決定法は分子生物学およびライフ
サイエンスにおいて一般的に最も基本的な技術の１つで
ある。ＤＮＡ配列が容易かつ速く得られることは、組換
えＤＮＡ法を通して新規治療剤ならびに新規かつ有用な
様々な植物および微生物を開発および生成するような関
連技術に大きな影響を及ぼすことができる。 【解決手段】 オリゴヌクレオチドプライマー中にマス
修飾を取り入れることにより処理量を増大することがで
きる、固体支持体、イオン化質量修飾核酸分子、質量変
異標識プローブ、および質量修飾標識プローブを提供す
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】遺伝情報は４つのＤＮＡ構造ブロック、デ
オキシアデノシン−（ｄｐＡ）、デオキシグアノシン−
（ｄｐＧ）、デオキシシチジン−（ｄｐＣ）およびデオ
キシチミジン−５’−リン酸（ｄｐＴ）の配列により表
されるので、ＤＮＡ配列決定法は分子生物学およびライ
フサイエンスにおいて一般的に最も基本的な技術の１つ
である。ＤＮＡ配列が容易かつ速く得られることは、組
換えＤＮＡ法を通して新規治療剤ならびに新規かつ有用
な様々な植物および微生物を開発および生成するような
関連技術に大きな影響を及ぼすことができる。特にＤＮ
Ａ配列を解明することは遺伝疾患、ガンおよびＡＩＤＳ
を含むヒトの病理症状を理解するのに役立つ。
【０００２】場合によっては１ヌクレオチド削除、付加
または置換のような極めて微妙な差異が深刻な、致命的
な結果を生むこともある。最近、ＤＮＡの配列決定法が
ヒトゲノム配列決定プロジェクトの核となる技術になっ
た（例えばJ.E.BishopおよびM.Waldholz,1991,ゲノム：
現代の最も目覚ましい科学的冒険話−ヒト生体のすべて
の遺伝子地図の試み（Genome:The Story of the Most A
stonishing Scientific Advance of Our Time.The Atte
mpt to Map All the Gene in Human Body.Simaon & Sch
uster、ニューヨーク）。完全なヒトゲノムＤＮＡ配列
の知識は確実にヒト疾患を理解、診断、防御するために
役立つだろう。約３０億塩基対のヒトゲノムの決定に、
合理的な時間枠で、そして経済的に、迅速に、信頼性の
ある、高感度にそして低価な方法で、成功裏に取り組む
ことができるようになるためには、全自動化の可能性を
提供できるように開発される必要もある。本発明はその
ような技術を提供する。
【０００３】将来の方向性および動向と共に今日の方法
に関する最近の総説はBarrell（TheFASEB Journal 5,40
-45(1991)およびTrainor(Anal Chem.62,418-26(1990)）
に記載されている。
【０００４】現在ＤＮＡの配列決定はMaxamおよびGilbe
rt（Methods in Enzymology 65,499-560(1980)）の化学
的分解法、またはSangerら（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 7
4,5463-67(1979)）の酵素ジデオキシヌクレオチド停止
法のいずれかで行われている。化学法では塩基特異的修
飾により放射活性の、または放射線標識されたＤＮＡ断
片の塩基特異的開裂を生じる。４つの別個の塩基特異的
開裂反応で、４組のネスティッド［枝分れ(nested)］断
片が生成され、これらはポリアクリルアミドゲル電気泳
動（ＰＡＧＥ）で長さにより分離される。オートラジオ
グラフィーの後、ゲル中の各バンド（断片）は塩基特異
的開裂により生じているため配列を直接的に読むことが
できる。すなわち４つの“ラダー（ladders）”の断片
長は直接ＤＮＡ配列の特定位置を翻訳する。
【０００５】酵素的鎖停止法では塩基特異的なＤＮＡ断
片の４組が、プライマー／鋳型システムを開始すること
により形成される。このシステムはプライマーを未知の
ＤＮＡ配列領域中で伸長させ、それによって鋳型を複製
し、そして相補鎖を鎖停止化試薬中のＤＮＡポリメラー
ゼ（大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメン
ト、Thermus aquaticsのＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ
ＤＮＡポリメラーゼまたは修飾Ｔ７ ＤＮＡポリメラー
ゼ、シークエナーゼ（Taborら、Proc.Natl.Acad.Sci.US
A 84,4767-4771(1987)のような）により合成する。ここ
で鎖停止は４つの別個の反応混合物に４つの通常のデオ
キシヌクレオシド三リン酸、dATP、dGTP、dTTP、dCTPに
加えて、唯一の鎖停止ジデオキシヌクレオシド三リン酸
（ddATP、ddGTP、ddTTP、ddCTP）を限定された小濃度で
それぞれ取り込む。生成する断片の４組は、ＤＮＡ配列
を決定できる４つの塩基特異的ラダーを電気泳動後に形
成する。
【０００６】サンガー配列決定法の最近の応用には、Ｄ
ＮＡポリメラーゼ媒介プライマー伸長反応中に通常使用
されるddＮＴＰｓに変えてアルファ−チオｄＮＴＰを使
用することにより得られるホスホルチオエート−含有Ｄ
ＮＡ断片の分解が関与する（Labeitら、DNA 5,173-177
(1986)；アマシャム、ＰＣＴ−出願第GB86/00349号；Ec
ksteinら、Nucleic Acids Res,16,9947(1988)）。ここ
では４組の塩基−特異的配列決定ラダーがエキソヌクレ
アーゼIIIまたはへビ毒ホスホジエステラーゼでの限定
消化により得られ、続いてＰＡＧＥにより分離し、そし
てプライマーまたは１つのｄＮＴＰのいずれかを放射線
標識して視覚化する。さらなる修飾では、塩基−特異的
開裂が修飾ホスホジエステル結合中の硫黄原子をアルキ
ル化し、その後熱処理することにより達成される（Max-
Plank-Gesellschaft、独国特許出願公開第3930312A1号
明細書）。両方法ともポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
を介してＤＮＡの増幅と組み合わせることができる。
【０００７】まず最初に配列決定されるＤＮＡは現在シ
ークエンシングできるわずか５００−１０００ヌクレオ
チド片に断片化されなければならない。ゲノムから出発
して、これは種々の、および適当なクローニングベクタ
ー（ＹＡＣ）コスミド、プラスミドおよびＭ１３ベクタ
ーのような：Sambrookら、モレキュラークローニング：
ア ラボラトリーマニュアル（Molecular Cloning；A La
boratory Manual）、コールドスプリングハーバーラボ
ラトリー出版、1989）を使用するクローニングおよびサ
ブクローニング法が関与する多工程である。最終的にサ
ンガー配列決定法については約５００−１０００塩基対
をＭ１３バクテリオファージ誘導体の複製的型Ｉ（repl
icative formI:RFI）の特定の制限部位中に組こみ（Vie
riaおよびMessing,Gene 19:259(1982)）、そして次に二
本鎖状態を一本鎖の環状に転換し、未知のDNA断片が挿
入された制限部位の上流に化学的ＤＮＡ合成により得た
ユニバーサルプライマーの結合部位を有するサンガー配
列決定法の鋳型として使用する（Shinha,Biernat,McMan
usおよびKoster、Nucleic Acids Res.12.4539-57(198
4):米国特許第4725677号明細書。特別な条件下で、スー
パーコイル状の二本鎖プラスミドＤＮＡ中に組み込まれ
た未知のＤＮＡ配列はサンガー法により直接シークエン
シングできる（ChenおよびSeeburg,DNA 4、165-170(198
5)およびLimら、Gene Anal,Techn.5,32-39(1988)、そし
てポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（ＰＣＲ法：方法お
よび応用のガイド（PCR Methods:A Guide to Methods a
nd Application,Innisら、編集、アカデミック出版、サ
ンディエゴ、(1990)）、ＰＣＲにより始めにDNAセグメ
ントを増幅し、そしてサンガー配列決定法に適用するこ
とにより染色体DNAを直接シークエンシングしてクロー
ニングおよびサブクローニング工程が省略できた（Inni
sら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,9436-9440(1988)）。
【０００８】しかしこの場合、目的領域中の知り得るＤ
ＮＡ配列は多くても配列決定プライマーに結合する程度
である。
【０００９】ＰＡＧＥから配列を読むことができるよう
にするためには、検出用標識がプライマー（最も多くは
５’−末端）または１つのデオキシヌクレオシド三リン
酸（ｄＮＴＰ）のいずれかに使用されなければならな
い。この方法に最も頻繁に使用されるのは32Ｐ、33Ｐ、
または35Ｓのような放射性同位体である。ＰＡＧＥ後、
ゲルをＸ−線フィルムに暴露し、銀粒子の露光を分析す
る。
【００１０】放射性同位体標識の使用には幾つかの問題
がある。配列決定された断片のオートラジオグラフィー
検出に有用なほとんどの標識は比較的半減期が短く、こ
れは標識の有効性の限界である。高エネルギーベーター
照射の放出は（特に32Ｐから）、放射線分解により生成
物の分解を引き起こすので、試料は極めて短時間に使用
されなければならない。さらに、高エネルギー照射はス
クリーニングによるバンドの鋭さを無くす。これらの問
題はより低いエネルギーの同位体（33Ｐまたは 35Ｓのよ
うな、Ornsteinら、Biotechniques 3,476(1985)）を使
用することにより無くなる場合もある。しかしこれでは
より長時間の暴露時間に耐えなければならない。
【００１１】さらにその上、放射性同位は実験者の健康
に危険であり、そして大きな配列決定プロジェクトでは
除汚染および放射性廃棄物の取り扱いが他の深刻な問題
および限界となる。放射線活性標識にかかわる上記の問
題で、非−放射線標識法が探査され、そして最近、部分
的に自動化されたＤＮＡシークエンシング法に組み込ま
れた。すべてのこれらの改良はサンガー配列決定法を使
用する。蛍光標識をプライマーに（Smithら、Nature 32
1、674-679(1986)および欧州特許出願公開第87300988.9
号明細書;デュ ポン デ ノモア（Du pon t De Nemour
s）の欧州特許出願公開第0359225号明細書;Ansorgeら、
J.Biochem Biopys.Methods 13:325-32(1986)）または鎖
停止ジデオキシヌクレオシド三リン酸（Proberら、Scie
nce 238:336-41(1987);アプライドバイオシステムズ（A
pplied Biosystems）の国際公開第91/05060号）に付け
ることができる。
【００１２】プライマーまたはｄｄＮＴＰのいずれかの
標識に基づき、システムがアプライドバイオシステムズ
（Smithら、Science 235,G89(1987);米国特許第570973
号および689013号明細書）、デュ ポン デノモア（Prob
erら、Science 238,336-341(1987)、米国特許第881372
号および57566号明細書）、ファルマシア（Pharmacia）
-LKB（Ansorgeら、Nucleic Acids Res.15,4593-4602(19
87)およびEMBL特許出願公開第DE P3724442号およびP380
5808.1号明細書）ならびに日立（Hitachi）（特開平1-9
0844号公報およびDE401191 A1号）により開発された。
ほぼ同様な方法がBrumbaughら、（Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 85,5610-14(1988)および米国特許第4,729,947号明
細書）により開発された。レーン毎に２つの異なる特定
標識を有する２つの電気泳動レーンを使用するデュポン
システムの改良法が記載されている（PCT出願国際公開
第92/02635号）。異なる方法では蛍光的に標識したアビ
シンおよびビオチン標識プライマーを使用する。
【００１３】ここではビオチンで終わる配列決定ラダー
が標識アビシンと電気泳動中に反応し、これにより個々
の配列決定バンドの検出が行われる（Brumbaughら、米
国特許第594676号明細書）。
【００１４】さらに最近では、酵素による化学発光誘導
性および増幅性を使用して、より高感度のＤＮＡ非−放
射性標識法が開発された（Beck,OKeefe,CoullおよびKos
ter,Nucleic Acids Res.17,5115-5123(1989)ならびにBe
ckおよびKoster、Anal.Chem.62,2258-2270(1990)）。こ
れらの標識法は多様なＤＮＡ配列決定法（Churchら、Sc
ience 240,185-188(1988)）と組み合わせて、高処理量
のＤＮＡ配列決定法を目的とした方法を提供する（Kost
erら、Nucleic Acids Res Symopsium Ser No.24,318-32
1(1991)、ユタ大学、PCT特許出願国際公開第90/15883
号）；この方法は大変繁雑で自動化が困難であるという
欠点がある。
【００１５】ＤＮＡ配列決定を簡単にする試みでは、固
体支持体が導入された。これまで多くの場合、配列決定
（ＰＣＲ増幅を用いて、あるいは用いずに）のための鋳
型の鎖は、固体支持体に多くは強力なビオチン−アビジ
ン／ストレプトアビジン相互作用で固定化される（Orio
n-Yhtyma Oy、米国特許第277643号明細書:M.Uhelnら、N
ucleic Acids Res.16:3025-38（1988）;Cemu Biotekni
k、PCT出願国際公開第89/09282号明細書および英国、医
学研究協会、PCT出願国際公開第WO92/03575号）。
【００１６】固定化された鋳型の鎖上で合成されたプラ
イマー伸長生成物を酵素、他の配列決定試薬および副生
物から洗浄工程により精製し、そして次に変性条件下で
ワトソン−クリック塩基対間の水素結合を失うことによ
り遊離し、そしてＰＡＧＥ分離に供する。異なる方法で
は、ＤＮＡ配列決定反応のプライマー伸長生成物（鋳型
ではない）をビオチン／およびアビジンを介して支持体
に結合させる（デュポン デ ノモア、PCT出願国際公開
第91/11533号）。上述の方法とは対照的に、これはビオ
チンおよびアビジン間の結合が使用する変性条件（ホル
ムアミド／ＥＤＴＡ）に耐え、シークエンシング反応の
プライマー伸長生成物を固体から遊離し、そしてＰＡＧ
Ｅ分離に供される。固体支持体として、ビーズ（例えば
磁気ビーズ(Dynabeads)）およびSepharose Besds）、フ
ィルター、毛細管、プラスチック計深棒（例えばポリス
チレン製棒）およびマイクロタイターウェルが薦められ
る。
【００１７】これまで述べたすべての方法には共通の核
となる工程があり、それはポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＰＡＧＥ）である。多くの場合、これはこれらの
各々の方法の主要な欠点および制限を表す。重合による
均一なゲルの調製、試料の添加、電気泳動自体、配列決
定パターンの検出（例えばオートラジオグラフィーによ
り）、ゲルの取り出しおよび他のゾルを作成するための
ガラスプレートの洗浄は大変繁雑で、時間がかかる方法
である。さらに全工程で誤りが起こりがちであり、自動
化することが困難で、そして再現性および信頼性を向上
するために高度に訓練された技術者が必要である。
【００１８】放射性標識の場合は、オートラジオグラフ
ィーそれ自体が数時間から数日を必要とする。蛍光標識
の場合には、すくなくとも配列決定バンドは、市販され
ているＤＮＡシークエンサーに組み込まれたレーザース
キャンニングデバイスを使用して自動的に行なわれる。
蛍光標識に関連した１つの問題は、断片の電気泳動の移
動度に対する４つの異なる塩基−特異的蛍光タグの影
響、そして４つの異なる染料がバンド幅で重なる可能性
から隣接バンド間の識別力を減少させ、したがって配列
があいまいになる可能性が増す。ポリアクリルアミドゲ
ルとの塩基−特異的な相互作用によりアーティファクト
も生じ（Frankお よびKoster,Nucleic Acids Res.6,206
9(1979)）、“バンドの圧縮”を起こす第二構造物の形
成により、配列を読むことができない。この問題は部分
的には７−デアザデオキシグアノシン三リン酸を使用す
ることにより克服された（Barrら、Biotechniques 4,42
8(1986)）。しかし幾つかのアーティファクトおよび顕
著なバンドの理由は未だに調査されており、さらにゲル
電気泳動法の改良が必要である。
【００１９】最近の電気泳動における革新はキャピラリ
ーゾーン電気泳動法（ＣＺＥ）（Jorgensonら、J.Chrom
otography 352,337(1986):Gestelandら、Nucleic Acids
Res18 1415-1419(1990)）であり、これはスラブゲル電
気泳動（ＰＡＧＥ）と比較すると、分離の解像度が有意
に上昇し、電気泳動時間を短縮し、そして極めて少量の
試料の分析が可能である。しかし全体の系の縮小化ゆえ
に、壁の影響（walleffect）および高感度な連続的検出
法の必要性というような別の問題が生じる。ＰＡＧＥに
較べて、もう１つの欠点は、ＣＺＥが“１レーン”法で
あるという事実であり、一方ＰＡＧＥは同時に多くのレ
ーンを電気泳動する。
【００２０】ＰＡＧＥをＤＮＡ配列決定法に絶対に必要
な、そして中心的部分として行うことに関連する深刻な
限界および問題から、幾つかの方法では電気泳動工程を
行わずにＤＮＡ配列決定を行うことが提案されている。
１つの方法はハイブリダイゼーションまたは断片化シー
クエンシング（Bains,Biotechnology 10,757-58(1992)
およびMirzabekovら、FEBS Letters 256,118-122(198
9)）と呼び、既知の短いオリゴヌクレオチド（例えば6
5,536種類の配列を与えるオクタデオキシヌクレオチ
ド）の相補的ＤＮＡ配列に対する特異的なハイブリダイ
ゼーションを利用する。陽性のハイブリダイゼーション
は未知の配列の短い広がりを明らかにする。すべての可
能なオクタデオキシヌクレオチドでハイブリダイゼーシ
ョンを行うことによりこの方法を反復すると、理論的に
は配列を決定できるはずである。全く異なる方法は、１
つの一本鎖、固定ＤＮＡ断片をエキソヌクレアーゼによ
り流動蒸気中で一方向に分解し、そして開裂ヌクレオチ
ドをレーザー励起を介してそれらの特異的な蛍光タグを
検出する、迅速なＤＮＡ配列決定がある（Jettら、J.Bi
ol.Chem.Biomolecular Structure & Dynamics 7,301-30
9(1989);米国エネルギー省、PCT出願国際公開第89/0343
2号）。
【００２１】Hyman（Anal.Biochem.174,423-436(1988)
により別のシステムも推薦され、プライマー-鋳型系で
正しいヌクレオチドが伸長している鎖に付加したとき、
生成したピロリン酸をＤＮＡ配列を決定するために使用
する。使用する酵素およびＤＮＡは固体（DEAE-Sepharo
seおよびSepharose）にイオン的相互作用または共有結
合により位置を固定されている。連続的な流動系ではピ
ロリン酸の量が生物発光（ルシフェラーゼ）を介して測
定される。ＤＮＡ配列の合成的方法もTsienら（PCT出願
国際公開第91/06678号）に使用されている。これでは入
って来るｄＮＴＰを3'-末端でアセチルまたはリン酸基
のような種々のブロッキング基により保護し、そして次
の伸長が起こる前に除去するが、これはこの方法を他の
標準的手法と比較すると大変遅くする。鋳型ＤＮＡはポ
リマー支持体に固定化する。取り込みを検出するため
に、蛍光または放射活性標識を付加的に修飾ｄＮＴＰに
取り込む。同特許出願はこの方法を自動化する装置も記
載している。
【００２２】一般的にマススペクトルメトリーは分子を
真空中でイオン化し、そして揮発させることにより“飛
ばし”て個々の分子の“質量を計る”。電場および磁場
の組み合わせの影響下で、イオンがその個々の質量
（ｍ）および荷電（ｚ）に依存した軌道を流れる。低分
子量をもつ分子の範囲ではマススペクトルメトリーは長
い間、親の分子イオンの質量を測定することにより有機
分子を分析および特性決定するための日常的な物理−有
機分野のレパートリーであった。さらにこの親の分子イ
オンを他の粒子（例えばアルゴン原子）に衝突させるこ
とにより、分子イオンが断片化し、いわゆる衝突誘導解
離（collision induced dissociation:ＣＩＤ）により
第二イオンを生成する。断片化パターン／経路は、しば
しば詳細な構造の情報を与える。マススペクトルメトリ
ー法の多くの応用は当該技術分野で周知でありMethods
in Enzymology、第193巻、“マススペクトルメトリー”
（J.A.McCloskey、編集）、1990、アカデミック出版、
ニューヨーク）に要約されている。
【００２３】高検出感度、マス分析の正確さ、ＣＩＤと
ＭＳ／ＭＳ配置を組み合わせることによる詳細な構造的
情報、ならびにコンピューターへのデーター移動のオン
ライン化を提供するマススペクトルメトリーの明らかな
分析的利点から、マススペクトルメトリーの核酸の構造
分析への使用はかなり興味深い。この分野を含む最近の
総説はK.H.Schram"核酸成分のマススペクトルメトリ
ー、マススペクトルメトリーの医学への応用、（Mass S
pectrometry of Nucleic Acid Components,Biochemical
Application of Mass Spectrometry）”34 203-287(19
90);およびP.F.Crain,"核酸研究でのマススペクトルメ
トリー法（Mass Spectrometric TechniquesinNucleic A
cid Research）”Mass Spectrometry Review 9,505-554
(1990)である。マススペクトルメトリーを核酸に応用す
るための最大の障害はこれらの極めて極性の生体高分子
を揮発させる難しさである。
【００２４】したがって“配列決定法”は、親分子イオ
ンの質量を測定することによる低分子量のオリゴヌクレ
オチドに限られ、これを通してすでに既知の配列の確認
し、または既知の配列を第二イオンの生成を通して（断
片イオン）（特にイオン化および揮発のために高速原子
爆発（ＦＡＢマススペクトルメトリ）またはプラズマ脱
着（ＰＤマススペクトルメトリー）法を使用するＭＳ／
ＭＳ配置でのＣＩＤを介して）確認する。化学合成オリ
ゴデオキシヌクレオチドについて保護された二量体ブロ
ックを分析するためのＦＡＢの応用は記載されている
（Kosterら、Biomedical Environmental Mass Spectrom
etry 14、111-116(1987)）。
【００２５】さらに２つのイオン化／脱着法は電気スプ
レー／イオンスプレー（ＥＳ）およびマトリックス−補
助レーザー脱着／イオン化（ＭＡＬＤＩ）である。ＥＳ
マススペクトルメトリーはFennら（J.Phys,Chem.88,445
1-59(1984);PCT出願国際公開90/14148号）に紹介され、
現在の応用は最新の総説（R.D.Smithら、Anal.Chem.62,
882-89(1990)およびB.Ardrey、電気スプレーマススペク
トルメトリー、Spectroscopy Europe 4，10-18(1992)）
に要約されている。２１-merのｄ（ＡＡＡＴＴＧＴＧＣ
ＡＣＡＴＣＣＴＧＣＡＧＣ）（配列番号２）のテトラデ
カンヌクレオチドｄ（ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＣＡＴＧ）
（配列番号１）（Coveyら、“イオンスプレーマススペ
クトルメトリーによるタンパク質、オリゴヌクレオチド
およびペプチドの分子量決定（The Determination of P
rotein,Oligonucleotide and Peptide Molecular Weigt
h by Ionspray Mass Spectrometry）”Rapid Communica
tions in Mass Spectrometry,2,249-256(1988)）の分子
量、および詳細ではないが７６ヌクレオチドのｔＲＮＡ
（Methods in Enzymology,193,"マススペクトルメトリ
ー”（McCloskey、編集）、第425頁、1990、アカデミッ
ク出版、ニューヨーク）の分子量は報告されている。マ
ス分析機は四重極がもっともよく使用されている。フェ
ントモル量の試料の分子量決定はすべてを質量の計算に
使用できる多イオンピークの存在により極めて正確であ
る。
【００２６】対照的にＭＡＬＤＩマススペクトルメトリ
ーは、飛行時間（time of flight(TOF)）配置がマス分
析機に使用されたとき、大変魅力的となる。このＭＡＬ
ＤＩ-ＴＯＦマススペクトルメトリーはHillenkampら
（“マトリックス補助ＵＶ-レーザー脱着／イオン化：
巨大生体分子への新しいマススペクトルメトリー法（Ma
trix Assisted UV-Laser Deposition/ionization;A New
Approach to Mass Spectrometry of Large Biomolecul
es）”Biological Mass Spectrometry（Burlingameおよ
びMacCloskey、編集）、Elsevir Science出版、アムス
テルダム、第44-60頁、1990）。
【００２７】ほとんどの場合、この方法では多イオンピ
ークを生成しないので、マススペクトルは特に、ＥＳマ
ススペクトルメトリーと比較すると単純に見える。しか
し分子量が最高410,000ダルトンまでのＤＮＡ分子は、
脱着および揮発することができたが（Williamsら、“凍
結水溶液のパルスフィールドレーザーアブレーションに
よる高分子量DNAの揮発（Volatilization of High Mole
cular Weight DNA byPlused Field Laser Ablation of
Frozen Aqueous Solution）”Science 246,1585-87(198
9)、この技術はこれまで既知の比較的小さな（例えば最
高１８ヌクレオチドのオリゴチミジル酸）オリゴヌクレ
オチド（Huth-Fehrｅら、“オリゴデオキシシミジル酸
のマトリックス補助レーザー脱着マススペクトルメトリ
ー（Matrix Assisted Laser Deposition Mass Spectrom
etry of OligodeoxythymidilicAcids）”Rapid Communi
cations in Mass Spectrometry,6,209-13(1992)）、お
よび２８塩基対の二本鎖（Williamsら、凍結水性マトリ
ックスからのレーザーアブレーションおよびイオン化に
よる核酸の飛行時間マススペクトルメトリー（Time-of-
Flight Mass Spectrometry of Nucleic Acids by Laser
Ablation and Ionization fromａFrozen AqueouｓMatr
ix）”Rapid Communications in Mass Spectrometry,4,
348-351(1999)）の分子量を決定するために使用された
だけであった。１つの報告（Huth-Fehreら、1992、同
上）では、ｎ＝１２からｎ＝１８のすべてのオリゴチミ
ジル酸混合物が解析できた。
【００２８】米国特許第5、064、754号明細書では、Ｄ
ＮＡにより伸長したＲＮＡ転写物（両方がシークエンシ
ングされるDNAに相補的である）が、ＮＴＰ、ｄＮＴＰ
および停止ヌクレオチドとしてddNTP（これは糖部分の
5'位が12Ｃ、13Ｃ、14Ｃ、1Ｈ、2Ｈ、3Ｈ、16Ｏ、17Ｏ
および18Ｏの１つまたは組み合わせにより置換されてい
る）を取り込むことにより調製される。得られたポリヌ
クレオチドは3'-ヌクレオチドを分解し、N-グリコシル
結合を開裂し、そして過ヨウ素酸塩酸化により放射線標
識5'-の官能基を除去し、生成したホルムアルデヒド種
をマススペクトルメトリーで決定する。特別な放射性同
位体の組み合わせは、NTPおよびdNTPの取り込みから生
じる内部ヌクレオチドと、ポリヌクレオチド鎖の末端に
ｄｄＮＴＰを結合することにより生じた末端ヌクレオチ
ドとのヌクレオチド間を塩基−特異的に識別するのに役
立つ。一連のＲＮＡ／ＤＮＡ断片が生成され、そして１
つの態様では電気泳動で分離され、そしていわゆるマト
リックス法で配列が推定される。
【００２９】特開昭59-131909号公報では電気泳動、液
体クロマトグラフィーまたは高速ゲル濾過により分離さ
れた核酸断片を検出する装置を記載している。マススペ
クトルメトリーの検出は通常天然にはＤＮＡ中に検出さ
れないＳ、Ｂｒ、ＩまたはＡｇ、Ａｕ、Ｐｔ、Ｏｓ、Ｈ
ｇを核酸に取り込むことにより達成される。しかしこの
方法はサンガー法によりＤＮＡをシークエンシングする
方法には応用されない。特にそのような元素と個々のｄ
ｄＮＴＰとの塩基−特異的相互関係を提案していない。
【００３０】ＰＣＴ出願国際公開第89/12694号（Brenna
nら、Proc.SPIE-Int.SOc.Pot.Eng.1296(New Technol.Cy
tom.Mol.Biol.),pp60-77(1990):およびBrennan、米国特
許第5,003,059号明細書）は、32Ｓ、33Ｓ、34Ｓ、36Ｓ
または、35Ｃｌ、37Ｃｌ、79Ｂｒ、81Ｂｒのいずれかの
４つの安定な同位体の組み合わせを使用することにより
鎖停止ｄｄＮＴＰを特別に標識して、ＤＮＡ配列決定に
サンガー法を使用する。硫黄同位体は塩基または三リン
酸部分のアルファ−位に、一方ハロゲン同位体は塩基ま
たは糖環の3'-位に位置している。配列決定反応混合物
はＣＺＥのような電気泳動により分離され、燃焼ユニッ
トに移され、その中で取り込まれたｄｄＮＴＰ中の硫黄
同位体は酸素環境下で約９００℃に転換される。
【００３１】６４、６５、６６または６８の質量で生成
したＳＯ2は、例えばイオン電流を検出するための１つ
のイオン−マルチプライヤー（ion-multiplier）を装備
した四重極のマス分析機を使用してマススペクトロメト
リーによりオンライン決定される。
【００３２】同様な方法が米国特許第5,002,868号明細
書（Jacobsonら、Proc．SPIE-Int.Soc.Opt.Eng.1435（O
pt.Method Ultrasensitive Detect,Anal.Tech.Appl.,26
-35(1991)）中に記載され、これは特別に三リン酸部分
のアルファ−位を上記のような４つの安定な硫黄同位体
で置換したｄｄＮＴＰを用いたサンガー配列決定法を使
用し、引き続き４つのネスティッド配列を試験管ゲル電
気泳動により分離する。
【００３３】唯一異なるのは共鳴イオン化分光法（ＲＩ
Ｓ）を磁気セクターマス分析機と組み合わせ（米国特許
第4、442、354号明細書のように）、特別なヌクレオチ
ド停止に対応する硫黄同位体を検出し、これによりＤＮ
Ａ配列の評価を可能にする。
【００３４】欧州特許出願公開第0360676号および同036
0677号明細書も，ｄｄＮＴＰ中の安定な同位体置換
（Ｄ、13Ｃ、15Ｎ、17Ｏ、18Ｏ、32Ｓ、33Ｓ、34Ｓ、36
Ｓ、19Ｆ、35Ｃｌ、37Ｃｌ、79Ｂｒおよび127Ｉ）なら
びにＣＦ3またはSi（ＣＨ3）3のような官能基を化学的
官能性に基づき塩基、糖または三リン酸部分のアルファ
位を利用するサンガー法を記載する。サンガー配列決定
反応混合物は試験管ゲル電気泳動により分離する。流出
物を電機スプレー／熱スプレー噴霧法によりエアゾール
とし、そして次にプラズマ（7000-8000°Ｋ）により原
子化およびイオン化し、そして簡単なマス分析機で分析
する。このサンガー反応混合物の分析を自動化できると
して提案された装置は試験管電気泳動、噴霧器およひき
マス分析機から成る。
【００３５】ハイブリダイゼーション／断片化法（上
記）によりＤＮＡ配列決定を行うマススペクトロメトリ
ーの応用が最近提案された（Brains,"マススペクトロメ
トリーによるDNAの配列決定:将来的に可能性のある応用
の概要“Chimicaoggi 9,13-16(1991)。
【００３６】発明の要約 本発明はＤＮＡを配列決定するための新規方法に関す
る。現存するＤＮＡ配列決定法に較べて改良された点
は、高速、高処理量、電気泳動の必要性が無く（そして
すなわち、電気泳動工程が全く無いのでゲルのアーティ
ファクトを読む事が無い）、ならびに安定な同位体で種
々の置換を行うので高価な試薬が必要ない。
【００３７】本発明はサンガー配列決定法、ならびにマ
ススペクトロメトリーを使用して（例えばＭＡＬＤＩま
たはＥＳマススペクトロメトリー）種々の分子の質量を
介する塩基−特異的な鎖停止法により得られるネスティ
ッド断片の分析による配列情報の集積を使用する。さら
にこのオリゴヌクレオチドプライマー中にマス修飾を取
り入れることにより処理量を増大することができ、鎖−
停止ヌクレオシド三リン酸および／または鎖伸長ヌクレ
オシド三リン酸ならびに組み込みタグ配列を使用して、
分子量を変えた質量をもつタグ特異的プローブのハイブ
リダイゼーションにより多重化を可能とする。
【００３８】図面の簡単な説明 第１図はマススペクトロメトリーにより分析される試料
の生成法を示している。この方法は未知の配列のＤＮＡ
断片を、Ｍ１３誘導体、ｐＵＣまたはファゲミド（phag
emid）のようなクーニングベクター中へ挿入し、二本鎖
状態を一本鎖状態に転換し、４つサンガーの配列決定反
応を行い、塩基-特異的停止ネスティッド断片の一族を
一時的に固体支持体に結合し、洗浄工程によりすべての
副生物を除去し、ネスティッドＤＮＡまたはＲＮＡ断片
を例えば陽-イオン交換または修飾試薬によりコンディ
ショニングし、そして固定化したネスティッド断片を直
接的にマススペクトロメトリー分析に与えるか、または
生成した断片族を支持体から開裂させて開裂試薬を蒸発
させることを必要とする。
【００３９】第２Ａ図は５０ヌクレオチド長（配列番号
３）の仮想のＤＮＡ断片の停止デオキシヌクレオシド三
リン酸としてｄｄＴＴＰを約等量的に平衡化した塩基組
成物と一緒に使用するサンガー配列決定生成物を示す。
様々な鎖停止断片の分子の質量を与える。第２Ｂ図はそ
のようなＤＮＡ断片混合物の理想的なマススペクトルを
表す。
【００４０】第３Ａおよび３Ｂ図は第２Ａおよび２Ｂと
同様に、ｄｄＡＴＰを鎖停止剤として使用した同じモデ
ル配列（配列番号３）のデータを表す。第４Ａおよび４
Ｂ図は第２Ａおよび２Ｂと同様にｄｄＧＴＰを鎖停止剤
として使用したときの同じモデル配列（配列番号３）の
データを表す。
【００４１】第５Ａおよび５Ｂ図は第２Ａおよび２Ｂと
同様に、鎖停止がｄｄＣＴＰを鎖停止剤として使用した
ときの同じモデル配列（配列番号３）のデータを表す。
第６図は第２Ａから５Ｂの結果を要約し、４つのネステ
ィッド断片族とＤＮＡ配列（配列番号３）との間の分子
量の相関を示す。
【００４２】第７Ａおよび７ＢはサンガーＤＮＡまたは
サンガーＲＮＡ配列決定のいずれかのための、質量−修
飾配列決定核酸プライマーまたはタグ配列決定プローブ
の一般的構造を説明する。第８Ａおよび８Ｂ図はサンガ
ーＤＮＡまたはサンガーＲＮＡ配列決定のいずれかのた
めの、質量−修飾三リン酸の一般的構造物を表す。鎖−
伸長および鎖−停止ヌクレオシド三リン酸を示してい
る。
【００４３】第９図は様々な結合化学（Ｘ）を、ポリエ
チレングリコールまたは三級モノアルキル化ポリエチレ
ングリコール（Ｒ）を例として説明する。第１０図は第
８Ａおよび８Ｂ図に示すような同様な結合化学を説明
し、そして種々のマス修飾部分（Ｒ）を表す。
【００４４】第１１図は多重マススペクトロメトリー配
列決定法がどのようにして作用するかを質量−修飾核酸
プライマー（ＵＰ）を使用して概説する。第１２図は質
量−修飾鎖−伸長および／または停止ヌクレオシド三リ
ン酸を使用して多重マススペクトロメトリー配列決定法
の工程を表す。
【００４５】第１３図は質量−修飾タグ配列特異的プロ
ーブのハイブリダイゼーションが関与する多重マススペ
クトロメトリー配列決定法を表す。第１４図はオリゴチ
ミジル酸、ｄ（ｐＴ）12-18混合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯ
Ｅスペクトルを表す。第１５図は５０−ｍｅｒの（配列
番号３）（５００ｆｍｏｌ）
【化１】 およびｄＴ（ｐｄＴ）９９（５００ｆｍｏｌ）のＭＡＬ
ＤＩ−ＴＯＥスペクトルの重複を示す。
【００４６】第１６Ａ−１６Ｍ図はすべての１３ＤＮＡ
配列のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを表し、第２図の
サンガーＤＮＡ配列決定模擬実験のネスティッドｄＴ−
停止断片を表す。それぞれ５００ｆｍｏｌの以下のもの
を表す。１６Ａは７−ｍｅｒ；１６Ｂは１０−ｍｅｒ；
１６Ｃは１１−ｍｅｒ；１６Ｄは１９−ｍｅｒ；１６Ｅ
は２０−ｍｅｒ；１６Ｆは２４−ｍｅｒ；１６Ｇは２６
−ｍｅｒ；１６Ｈは３３−ｍｅｒ；１６Ｉは３７−ｍｅ
ｒ；１６Ｊは３８−ｍｅｒ；１６Ｋは４２−ｍｅｒ；１
６Ｌは４６−ｍｅｒそて１６Ｍは５０−ｍｅｒである。
【００４７】第１７Ａおよび１７Ｂ図は第１６図のスペ
クトルの重複を表す。２つのパネルは２つの異なるスケ
ールおよびそのスケールで分析したスペクトルを表す。
第１７Ａ図は１６Ａ−１６Ｆのスペクトルの重複を表
す。各ピーク上の文字は第１６図の断片のもとのスペク
トルに対応する。例えばピークＢは第１６Ｂ図、ピーク
Ｃは第１６Ｃ図、等である。
【００４８】第１８図は実施例２１に記載した質量−修
飾オリゴヌクレオチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析からの
重複ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを表す。第１９図は
強力な静電的相互作用を介する固体支持体（Ｐ）と核酸
プライマー（ＮＡ）間の種々の結合化学を説明する。第
２０Ａおよび２０Ｂ図は電荷移動受容体（Ａ）および電
荷移動供与体（Ｄ）間の電荷移動複合体を介する固体支
持体（Ｐ）と核酸プライマー（ＮＡ）間の種々の結合化
学を説明する。第２１図は安定な有機基を介する固体支
持体（Ｐ）と核酸プライマー（ＮＡ）間の種々の結合化
学を説明する。
【００４９】第２２図はワトソン−クリック塩基対を介
する固体支持体（Ｐ）と核酸プライマー（ＮＡ）間の可
能な結合化学を説明する。第２３図は光分解的（photol
ytically）開裂性結合を介する固体支持体（Ｐ）と核酸
プライマー（ＮＡ）間の可能な結合化学を説明する。
【００５０】発明の詳細な説明 本発明はＤＮＡの改良された配列決定法を記載する。特
に、本発明はマトリックス−補助レーザー脱着／イオン
化（ＭＡＬＤＩ）またはエレクトロスプレー（ＥＳ）マ
ススペクトロメトリー（ＭＳ）のようなマススペクトロ
メトリーを使用してサンガー反応混合液を分析する。
【００５１】サンガー配列決定法は、４つの鎖−停止断
片族が得られる。このヌクレオチド付加あたりのマス差
はそれぞれｄｐＣは289.19、ｄｐＡは313.21、ｄｐＧａ
329.21そしてｄｐＴは304.2である。１つの態様では、
４つの塩基−特異的停止断片族の別個の分子量測定を通
して、ＤＮＡ配列を４つの別個の実験の分子量ピークの
重複（例えば補間）により行うことができる。別の態様
では４つの特異的停止断片族の分子量を、少なくとも２
つの別個の反応容器中で反応したすべての４つの反応を
混合するか（すなわち、すべてを別個に行う、または２
つを一緒に行う、あるいは３つを一緒に行う）、あるい
はすべての４つの鎖−停止ヌクレオチド（例えばｄＴＴ
Ｐ、ｄｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ
ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄｄＧＴＰを含んで成る反応混合
物）を有する反応を１つの反応容器中で行うかのいずれ
かにより、ＭＳで決定できる。
【００５２】すべての４つ塩基−特異的停止反応生成物
を同時に分析することにより、その結果、分子量値は補
完される。測定された断片間の質量差を鎖−停止ヌクレ
オチド中の既知のマスと比較して、配列の評価を行うこ
とができる。場合によっては質量を上記のように修飾し
て、鎖−停止ヌクレオチドの各ヌクレオチド間の分子量
に差をつけることもできる。当業者には鎖−停止ヌクレ
オチドの質量−修飾が望ましく、かつ例えば使用される
特定のスペクトロメーターの解像能に依存しうることが
明らかである。例として、使用する特定のスペクトロメ
ーターによりお互いが分解され得る分子量を有するよう
に、ｄｄＣＴＰ1、ｄｄＡＴＰ2およびｄｄＧＴＰ3がマ
ス−修飾された４つの鎖停止ヌクレオチド、ｄｄＴＴ
Ｐ、ｄｄＣＴＰ1、ｄｄＡＴＰ2およびｄｄＧＴＰ3を生
成するのが望ましいかもしれない。
【００５３】鎖−伸長ヌクレオチドおよび鎖−停止ヌク
レオチドという用語は当該技術分野で周知である。ＤＮ
Ａについては、鎖−伸長ヌクレオチドは2'-デオキシリ
ボヌクレオチドを含み、そして鎖−停止ヌクレオチドは
2',3'-ジデオキシリボヌクレオチドを含む。ＲＮＡにつ
いては、鎖−伸長ヌクレオチドはリボヌクレオチドを含
み、そして鎖−停止ヌクレオチドは3'-デオキシリボヌ
クレオチドを含む。ヌクレオチドという用語も当該技術
分野で周知である。本発明の目的のために、ヌクレオチ
ドはヌクレオシド モノ−、ジ−およびトリホスフェイ
トを含む。ヌクレオチドはホスホロチオエートヌクレオ
チドのような修飾ヌクレオチドも含む。
【００５４】現在使用されている数種の試料を平行して
処理できるスラブゲル気泳動とは対照的にマススペクト
ルメトリーは連続的な方法なので、別の態様では１以上
のＤＮＡまたはＲＮＡ断片を同時に配列決定するために
多マススペクトルメトリーＤＮＡ配列決定によりさらに
改良することができる。さらに詳細に以下に記載するよ
うに、あらかじめ定めた様式で配列決定される特定のＤ
ＮＡまたはＲＮＡ種の塩基−特異的停止断片の分子量を
シフトさせるように、質量−修飾核酸配列決定プライマ
ーまたは鎖−伸長および／または停止ヌクレオシド三リ
ン酸を採用して１ヌクレオチド付加毎に約３００質量単
位の範囲を使用することができる。
【００５５】初めてで、数種の配列決定反応を平行して
マススペクトロメトリー分析すことができる。本発明の
別の態様では、多重マススペクトルメトリ−ＤＮＡ配列
決定を、各断片族内の特別なタグ配列とハイブリダイズ
する特異的なオリゴヌクレオチド（タグプローブ）を介
して断片族の質量を修飾することにより行うことができ
る。別の態様ではプローブはマススペクトルメトリーの
前に別々の、そして特別なタグ配列に共有的に結合させ
ることができる。
【００５６】本発明の１つの態様では、少なくとも２つ
の塩基−特異的停止化断片の分子量値が現在使用されて
いるマススペクトルメトリーを使用して決定される。好
ましい分子量値は少なくとも５、そしてより好ましくは
少なくとも１０塩基−特異的停止化断片をマススペクト
ルメトリーにより決定できる。本発明は少なくとも２０
塩基−特異的停止化断片および少なくとも３０塩基−特
異的停止化断片の分子量値の決定も含む。さらに特別な
組のネスティッド塩基−特異的停止化断片はすべての反
応物および副生物から精製できるが、互いに分離しな
い。ネスティッド塩基−特異的停止化断片の全部の組を
同時に分析し、そして分子量値を決定する。少なくとも
２つの塩基−特異的停止化断片は断片が同じ試料中に含
まれればマススペクトルメトリーにより同時に分析され
る。
【００５７】一般的にマススペクトルメトリーのＤＮＡ
配列決定法の全体は、第一に無作為または特異的にゲノ
ムＤＮＡを大きな片に切断して次に数回のサブクローン
化工程でサイズを小さくして得た小さいゲノム断片のラ
イブラリーから始まり、そしてこれらをＭ１３またはｐ
ＵＣ（例えばＭ１３ｍｐ１８またはＭ１３ｍｐ１９）誘
導体のようなベクター中に挿入することになるだろう
（第１図参照のこと）。
【００５８】異なる方法では、Ｍ１３のようなベクター
中に挿入された断片は、ｃＤＮＡライブラリーから出発
するサブクロー化により得られる。さらに別の方法で
は、配列決定されるＤＮＡ断片はポリメラーゼ連鎖反応
（例えばHiguchiら、“ＤＮＡ断片のインビトロ調製お
よび突然変異誘発法の一般的方法:タンパク質およびＤ
ＮＡ相互作用の研究（A General Method of invitro Pr
eparation and Mutsgenesis of DNA Fragment:Study of
Protein and DNA Interactions"Nucleic AcidsRes.16,
7351-67(1988)）で生成される。当該技術で周知である
ように、サンガー配列決定法は、プラス−鎖に結合する
１つの核酸プライマー（ＵＰ）、または反対のマイナス
−鎖に結合する別の核酸プライマーから出発できる。し
たがって与えられた未知のＤＮＡ配列の両鎖の相補的配
列を得ることができる（配列決定のあいまいさが減るこ
とになる）か、あるいは未知のベクター−挿入ＤＮＡ断
片の両末端からの配列情報が得られるため、１つのクロ
ーンから得られる配列情報の長さが伸びる。
【００５９】核酸配列プライマーは好ましくは５’末端
に結合官能基（Ｌ）を持っており、固体支持体上の適当
な官能基（Ｌ’）と相互反応できる十分な長さのスペー
サーを含むことができ、これは光分解性結合のような可
逆的連結を形成する。各々の４つのサンガー配列決定族
は核酸プライマー（Ｌ−ＵＰ；第１図）から出発するの
で、この族は固体支持体の表面の官能基Ｌ’と反応する
ことにより固体に結合し、そして次にすべての緩衝塩、
三リン酸、酵素、反応副生物等を徹底的に洗浄する。さ
らにマススペクトロメトリー分析のためには、ヌクレオ
チド単位ごとに結合している陽イオンの異質性によりピ
ークの幅が広くなることを排除するために、この段階で
はＤＮＡ断片のリン酸骨格で陽イオンを交換することが
極めて重要である。Ｌ−Ｌ’結合はネスティッドＤＮＡ
またはＲＮＡ断片を捕らえる目的の一時的な性質のもの
であるので、それらをマススペクトロメトリー分析に適
当な条件にコンディショニングするために、この目的を
補助する異なる化学がある。マススペクトロメトリー分
析のためにネスティッド断片を共有結合的に支持体に固
定し、洗浄し、そして支持体から開裂するために与えた
例に加えて、一時的な結合はマススペクトロメトリーの
条件下（すなわち電荷移動複合体または安定な有機ラジ
カルのような光開裂性結合）で開裂するようにできるよ
うなものである。
【００６０】さらに、結合は四級アンモニウム基である
Ｌ’（第１９図にいくつかの例がある）で形成できる。
この場合は好ましくは固体支持体の表面が陰性の荷電を
もち、これは陰性に荷電した核酸骨格と反発し、そして
脱着させる。脱着はレーザーパルスによる加熱により、
および／またはＬ’に応じてＬ’クロモフォア共鳴中の
特別なレーザーエネルギーの吸収のいずれかにより起こ
る（例えば第１９図にある例を参照にされたい）。官能
基ＬおよびＬ’は電荷移動複合体も形成することがで
き、そしてこれにより一時的なＬ−Ｌ’結合を形成す
る。受容体または供与体特性のいずれかを持つ様々な適
当な官能基の例は、限定するわけではないが第２０Ａお
よび２０Ｂ図に表されている。多くの場合“電荷−移動
バンド”はＵＶ／ｖｉｓスペクトロメトリーで測定でき
る（R.Foster,Organic Change Transfer Comp1exes,ア
カデミック出版、1969）ので、レーザーエネルギーは対
応する電荷−移動波長のエネルギーに向けられ、すなわ
ち固体支持体からの特別な脱着を始めることができる。
当業者は幾つかの組み合わせがこの目的を補助し、そし
て供与体の官能基が固体支持体の上にあることができる
か、あるいはネスティッドＤＮＡ／ＲＮＡ断片と結合す
るか、またはその逆になるかを認識するだろう。
【００６１】さらに別の方法は一時的なＬ−Ｌ’結合は
実施例２１に例示される比較的安定な基をホモリシス的
に形成することにより生成できる。第２１図の４では電
荷−移動複合体と安定な有機基との組み合わせを表して
いる。ここではネスティッドサンガーＤＮＡ／ＲＮＡ断
片が電荷移動複合体に補足される。レーザーパルスの影
響下で、脱着（上記）ならびにイオン化はラジカル位で
起こる。第２１図の他の例ではレーザーパルスの影響下
で、Ｌ−Ｌ’結合は開裂し、そしてネスティッドサンガ
ーＤＮＡ／ＲＮＡ断片は脱着し、そして続いて形成され
たラジカル位でイオン化される。当業者は他の有機基を
選択してホモリシス的な結合開裂に必要な解離エネルギ
ーに関連して、対応するレーザー波長を選択できること
認識するだろう（例えば、Wentrup.John Wiley & Sons,
1984による反応性分子（ReactiveMoleculesを参照にさ
れたい）。
【００６２】さらに別の方法ではネスティッドサンガー
ＤＮＡ／ＲＮＡ断片はワトソン-クリック塩基対を介し
て核酸配列プライマーまたはタグオリゴメクレオチド配
列のいずれかの配列に相補的固体支持体−結合オリゴヌ
クレオチドに補足される（第２２図を参照にされた
い）。形成された二重鎖はレーザーパルスの影響下で開
裂し、そして脱着を始まることができる。固体支持体−
結合塩基配列は天然のオリゴリボ−またはオリゴデオキ
シリボヌクレオチドならびに類似体（例えばチオ−修飾
ホスホジエステルまたはホスホロチオエステル骨格）を
介して与えられるか、あるいはＰＮＡ類似体（例えばNi
elsenら、Science 254,1497(1991)を参照にされたい）
のようなオリゴヌクレオチド擬態を使用することによ
り、塩基配列を酵素分解に対する感受性をより低くし、
したがって固体支持体−結合補足塩基配列の全体の安定
性を増す。適切な結合（Ｌ−Ｌ’）で、レーザーを結合
開裂に必要なエネルギーに変えて直接的に開裂を得るこ
とができる。したがって固定化ネスティッドサンガー断
片はマススペクトルメトリー分析中に直接変化する。
【００６３】マススペクトルメトリーの性能を上げるた
めに、ホスホジエステル結合骨格をＭＳ分析前に修飾す
る必要があるかもしれない。これは例えばアルファ−チ
オ修飾オリゴヌクレオチドを鎖伸長および停止に使用す
ることにより達成できる。アルキルオジド、イオドアセ
トアミド、β−イオドエタノール、2,3-エポキシ-1-プ
ロパノール（第１０図を参照にされたい）のようなアル
キル化剤を使用して、ネスティッドサンガー断片のモノ
チオホスホジエステル結合をホスホロチオエステル結合
に転移させる。この場合のマス修飾による多重化は、核
酸プライマー（ＵＰ）またはヌクレオシド三リン酸を糖
または塩基部分で質量−修飾することにより得られる。
当業者はネスティッドサンガー断片の他の修飾を構想す
ることができる。
【００６４】本発明の１つの態様では、結合化学はその
ように精製されたネスティッドＤＮＡを酵素的、化学的
または物理的にに開裂させる。例として、Ｌ−Ｌ’化学
はジスルフィド結合（例えばメルカプトエタノールまた
はジチオスレイトールにより化学的に開裂可能）、ビオ
チン／ストレプトアビジンシステム、緩和な酸性条件下
で開裂するこができるチトリチルエーテル基のヘテロ官
能性誘導体（Kosterら、“合成生体分子の修飾用の汎用
性酸-不安定性リンカー（A Laboratory ManualVersatil
e Acid-Labile Linker for Modification of Synthetic
Biomolecules）”Tetrahedron Letters 31 7095(199
0)）、ほぼ中性の条件下でヒドラジニウム／酢酸緩衝液
により開裂可能なレブリニル基、エンドペプチダーゼ様
トリプシンにより開裂可能なアルギニン−アルギニンま
たはリシン−リシン結合、あるいはピロホスファターゼ
により開裂可能なピロリン酸塩結合、例えば物理的に開
裂できる光開裂性結合などがあり（第２３図を参照にさ
れたい）、あるいは別の陽イオン交換をマススペクトロ
メトリー分析前に行うことができる。この場合は、ネス
ティッド断片を固定化するために酵素−開裂性結合が使
用され、結合を開裂に使用する酵素はＭＳ分析中に内部
質量標準として役立つ。
【００６５】精製工程および／またはイオン交換工程は
固体支持体上への固定化の変わりに、または固定化に加
えて多くの他の方法で行うことができる。例えば塩基−
特異的停止化生成物を反応物から透析、濾過（限外濾過
を含む）およびクロマトグラフィーにより分離できる。
同様にこれらの技術はリン酸骨格の陽イオンを、ピーク
の幅広化を減らす対−イオンに交換するために使用でき
る。
【００６６】塩基−特異的停止化断片族は、大腸菌ポリ
メラーゼＩの巨大クレノウフラグメント、シークエナー
ゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよびこの目的に適す
る（すなわちネスティッドＤＮＡ断片をマススペクトロ
メトリー分析に使用する）他のＤＮＡポリメラーゼを使
用して標準的なサンガー配列決定法により生成すること
ができる。しかし、配列決定されるＤＮＡ断片の塩基−
特異的停止化ＲＮＡ転写物もマススペクトロメトリーの
配列決定に使用できることは本発明の一部である。この
場合、ＳＰ６またはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのような
種々のＲＮＡポリメラーゼをＳＰ６またはＴ７プロモー
ター（例えばAxelrodら、“3'-デオキシリボヌクレオシ
ド5'-三リン酸鎖停止剤の存在下でのバクテリオファー
ジT7およびSP6 RNAポリメラーゼプロモーターの転写（T
ranscription from BacteriｏphageT7 and SP6 RNA Pol
ymerase Promoter in the presence of 3'-deoxyribonu
cleoside5'-triphosphate Chain Terminaters）”Bioch
emistry 24,571-23(1985)を含む適当なベクターに使用
できる。この場合、未知のＤＮＡ配列断片をそのような
プロモーターの下流に挿入する。
【００６７】転写も核酸プライマーにより開始され得る
（Pitu1lら、““化学的および酵素的ＲＮＡ合成の組み
合わせのための開始剤オリゴヌクレオチド（Initiator
Oligonucleotides for the Comibation of Chemical an
d Enzymatic RNA Synthesis）”Gene 112,101-105(199
2)）。この核酸プライマーは本発明の１つの態様とし
て、マススペクトロメトリー分析前に精製および／また
は適当な修飾および／またはコンディショニングのため
に、上記のようにネスティッドＲＮＡ断片を固定化する
官能基Ｌを持つ。
【００６８】マススペクトロメトリー分析のため、ＤＮ
Ａ／ＲＮＡ配列決定生成物の固定化工程用に、様々な固
体支持体が使用でき、例えばビーズ（シリカゲル、調節
孔ガラス、磁気ビーズ、Sephadex/Sepharoseビーズ、セ
ルロースビーズ等）、毛細管、ガラスファイバーフィル
ター、ガラス表面、金属表面またはプラスティック材料
がある。有用なプラスティック材料の例には、フィルタ
ー膜またはマイクロプレート形態、後者はマイクロタイ
タープレートを使用して精製工程の全自動化を可能と
し、マイクロタイタープレートは本発明の１つの態様と
して、ウェルの底がＬ’で官能化されている透明な膜を
もつ。膜はポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミ
ド、ポリビニリデンフルオリド等を基本とする。適当な
金属表面の例には鋼、金、銀、アルミニウムおよび銅を
含む。
【００６９】精製、陽イオン交換および／または、ネス
ティッドサンガー断片に結合したＬ−Ｌ’のホスホジエ
ステル骨格の修飾後、化学的、酵素的または物理的にそ
れらを固体支持体から開裂することができる。またＬ−
Ｌ’結合断片は上記ならびに第１９−２３図に記載した
適当に選択したＬ−Ｌ’結合および対応するレーザーエ
ネルギー／強度を使用してマススペクトルメトリーに供
される時は、支持体から開裂させることができる。
【００７０】高度に精製された４つの塩基−特異的停止
化ＤＮＡまたはＲＮＡ断片族は、次に断片長に基づきＭ
ＡＬＤＩまたはＥＳマススペクトルメトリーによりそれ
ぞれの分子量決定を通して分析される。
【００７１】ＥＳについては、水または揮発性緩衝液に
溶解した試料を連続的また断続的に大気圧イオン化イン
ターフェイス（ＡＰＩ）に注入し、そして次に四重極に
より分析する。コンピュータープログラムの補助によ
り、分子量ピークが既知の核酸プライマー（ＵＰ）につ
いて調査され、ＵＰに付加された４つの鎖−停止ヌクレ
オチドのいずれかが決定される。これは未知配列の初め
のヌクレオチドを表す。
【００７２】次に第二、第三、第ｎ伸長生成物が同様に
同定され、そしてヌクレオチド配列が評価される。ＥＳ
マススペクトルメトリーを使用して得られる多イオンピ
ークは質量測定の正確さを増すことができる。
【００７３】ＭＡＬＤＩマススペクトルメトリーでは、
種々のマス分析機を使用でき、例えば１つまたは３つの
四重極モードの磁気セクター／磁気デフレクション装置
がある（ＭＳ／ＭＳ）。フーリエ変換および飛行時間
（ＴＯＦ）配置はマススペクトルメトリーの技術分野で
周知である。第２から６図にかけて、５０ヌクレオチド
長（配列番号３）で分子量が15,344.02ダルトンの仮想
のＤＮＡ断片を配列決定して得られたデータを示す。ｄ
ｄＴ（第２Ａおよび２Ｂ図）、ｄｄＡ（第３Ａおよび３
Ｂ図）、ｄｄＧ（第４Ａおよび４Ｂ図）ならびにｄｄＣ
（第５Ａおよび５Ｂ図）停止生成物について計算された
分子量が与えられ（配列番号３の断片に対応する）、そ
して理想化された４つのＭＡＬＤＩマススペクトルを表
す。
【００７４】すべての４つのスペクトルが重ねられ、そ
してこれからこのＤＮＡ配列を作成できた。これを第６
図に要約して表し、いかに分子量がＤＮＡ配列と相関し
ているかを実証する。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルは
第２図に対応するｄｄＴ停止生成物（第１６Ａ−１６Ｍ
図）について作成され、これらのスペクトルは重ねられ
た（第１７Ａおよび１７Ｂ図）。ｄｄＴ断片の計算され
た分子量とそれらの実験的に確認された重量との相関を
表Ｉに表す。同様に、４つのすべての鎖−停止反応が組
合わされ、そしてマススペクトルメトリーで分析されれ
ば、２つの隣接ピーク間の分子量差を配列決定に使用で
きる。脱着／イオン化法については、多くのマトリック
ス/レーザ一組み合わせを使用できる。
【表１】
【００７５】高容量のゲノムおよびｃＤＮＡ配列決定プ
ロジェクトに必要なレベルに処理量を増加させるため
に、さらに本発明の態様では１つ以上の配列を同時に決
定する多重マススペクトルメトリーを使用する。これは
数種の、しかし異なる方法を使用することにより達成さ
れ、基本的な原理は核酸プライマー（ＵＰ）の質量修
飾、鎖−伸長および／または停止ヌクレオシド三リン酸
であるか、または特別なタグ配列にハイブリダイズ可能
な質量−差別化タグプローブの使用による。本明細書で
使用する“核酸プライマー”という用語は、ＤＮＡおよ
びＲＮＡサンガー配列決定法の両方のプライマーを包含
する。
【００７６】実施例のように、第７Ａ図は核酸プライマ
ー（ＵＰ）およびタグプローブ（ＴＰ）の一般式を表
す。質量修飾部分は、例えばオリゴヌクレオチド
（Ｍ1）の5'−末端、ヌクレオベース（または塩基）
（Ｍ2、Ｍ7）、リン酸骨格（Ｍ3）およびヌクレオシド
（１つまたは複数）の2'-位（Ｍ4、Ｍ6）あるいは／お
よび3'-末端位（Ｍ5）のいずれかに付加することができ
る。プライマー長は１から５０ヌクレオチド長の範囲で
可変である。ＤＮＡサンガー配列決定のプライミング
（priming）のためには、プライマーは好ましくは約１
５から３０ヌクレオチド長である。ＲＮＡポリメラーゼ
ー媒介サンガー配列決定反応で、人工的に転写をプライ
ミングするためには、プライマー長は好ましくは約２か
ら６ヌクレオチド長である。タグプローブ（ＴＰ）を鎖
−停止断片族に組み込まれたタグ配列にハイブリダイズ
させるならば、その好適な長さは約２０ヌクレオチドで
ある。
【００７７】第７Ｂ図の表はＤＮＡおよびＲＮＡ、サン
ガー配列決定の質量−修飾プライマー／タグプローブ配
置の例を描いたものである。しかしオリゴヌクレオチド
分子中の質量−修飾機能および位置について多くの他の
組み合わせが可能であり、それらは本発明の一部である
と見なすので、この一覧に限定されることを意味しな
い。質量−修飾官能基は、例えばハロゲン、アジド、ま
たはＸＲ種（ここでＸは結合基であり、そしてＲは質量
−修飾官能基である）であることができる。したがって
質量−修飾官能基はオリゴヌクレオチド分子に定めた増
分を導入するために使用できる。
【００７８】別の態様では、鎖−伸長および／または停
止に使用されるヌクレオチドが質量−修飾される。その
ような修飾オリゴヌクレオチドを第８Ａおよび８Ｂ図に
示す。ここでは質量−修飾部分ＭをヌクレオベースＭ2
（ｃ7-デアザヌクレオシドの場合はC-7、Ｍ7も）に、ア
ルファーリン酸の三リン酸Ｍ3に、またはヌクレオシド
三リン酸Ｍ4およびＭ6の糖環の2'-位のいずれかに付加
することができる。さらに質量−修飾官能基は、それを
ヌクレオシド三リン酸Ｍ5中の糖環の3'一位に付加する
ことなどにより鎖停止に影響するように付加することが
できる。第８Ｂ図の一覧はＲＮＡまたはＤＮＡサンガ一
配列決定法に関し、鎖−停止ヌクレオシド三リン酸を生
成するための配置について可能な例を表す。しかし当業
者には他の多くの組み合わせも本発明の目的に同様に良
く役立つことが明らかである。このように当業者は鎖−
伸長ヌクレオシド三リン酸も同様に多くの変種および組
み合わせを使用して官能基および付加位置を質量−修飾
することができると認識するだろう。
【００７９】本発明の範囲を制限することなく、第９図
はどのように質量−修飾ＭをＸＲ中のＸに導入し、そし
てＲにオリゴー／ポリエチレングリコール誘導体を使用
するかをより詳細に記載している。この場合質量−修飾
増分は４４であり、すなわち５つの異なる質量−修飾種
がｍを０から４に変化するだけで生成でき、このように
質量単位４５（ｍ＝０）、８９（ｍ＝１）、１３３（ｍ
＝２）、１７７（ｍ＝３）および２２１（ｍ＝４）のを
核酸プライマー（ＵＰ）、タグプローブ（ＴＰ）あるい
はヌクレオシド三リン酸にそれぞれ付加する。オリゴ−
／ポリエチレングリコールは、低級アルキル（メチル、
エチル、プロピル、イソプロピル、ｔ−ブチル等のよう
な）によりモノアルキル化されることもできる。結合官
能基Ｘの選択も説明されている。他の化学も質量−修飾
化化合物に使用でき、例えば最近、オリゴヌクレオチド
および類似体。実験法（oligonucleotides and Anslogu
es.A Practical Approach.）F.Eckstein編集、IＲＬ出
版、オックスフォード、1991に記載されたものがある。
【００８０】さらに別の態様では、オリゴー／ポリエチ
レングリコール以外の種々の質量−修飾化官能基Ｒを選
択し、そして適当な結合化学を介してＸに付加すること
ができる。限定することを意味するわけではないが、幾
つかの例を第１０図に表す。
【００８１】単純な質量−修飾はＨをＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、
および／またはＩのようなハロゲンに、あるいはＳＣ
Ｎ、ＮＣＳのような擬ハロゲンに置換することにより達
成でき、あるいはメチル、エチル、プロピル、イソプロ
ピル、ｔ−ブチル、ヘキシル、フェニル、置換フェニ
ル、ベンジルのような種々のアルキル、アリールまたは
アラルキル部分を使用することにより、あるいはCH2F、
CHF2、CF3、Si(CH3)3、Si(CH3)2(C2H5)、Si(CH3)(C2H5)
2、Si(C2H5)3を使用することにより達成できる。さらに
別の質量−修飾はホモ−またはヘテロペプチドをＸを介
してＵＴ，ＴＰまたはヌクレオシド三リン酸にそれぞれ
付加することにより得られる。マス増分が５７の質量−
修飾種を生成する有用な例はオリゴグリシン類の付加で
ある。その結果、増分７４（ｒ＝１、ｍ＝０）、１３１
（ｒ＝１、ｍ＝２）、１８８（ｒ＝１、ｍ＝３）、２４
５（ｒ＝１、ｍ＝４）が得られる。単純なオリゴアミド
も使用できる。例えばその例は７４（ｒ＝１、ｍ＝
０）、８８（ｒ＝２、ｍ＝０）、１０２（ｒ＝３、ｍ＝
０）、１１６（ｒ＝４、ｍ＝０）等を得ることができ
る。当業者には、あらかじめ定めた方法によりＤＮＡお
よびＲＮＡサンガー配列決定法に許容できる多くの様々
な質量−修飾官能基を、ＵＰ、ＴＰおよびヌクレオシド
三リン酸に導入するにために、様々な可能性が第１０図
および上記文献（オリゴヌクレオチド類似体、F.Eckste
in,1991）に加えて明らかである。
【００８２】本明細書で使用するように、上つき文字０
−ｉはｉ＋ｌ質量−変化ヌクレオチド、プライマーまた
はタグを言う。上つき文字０（例えばＮＴＰ0、ＵＰ0）
は特定反応物の非修飾種を呼び、そして上つき文字ｉ
（例えばＮＴＰi、ＮＴＰ1、ＮＴＰ2等）はｉ回修飾さ
れた反応種を言うことができる。例えば１つ以上の核酸
（例えばＤＮＡクローン）を同時に多重ＤＮＡ配列決定
で配列決定し、次にｉ＋ｌの異なる質量−修飾核酸プラ
イマー（ＵＰ0、ＵＰ1．．．．ＵＰi）を各々の塩基−
特異的停止断片組を識別するために使用することがで
き、ここで質量−修飾化ＵＰiの各種は残りのものから
マススペクトロメトリーにより識別できる。
【００８３】本発明の説明的な実施例として、記載され
た質量−修飾試薬を使用する多重マススペクトロメトリ
ーＤＮＡ配列決定法の３つの異なる基本的工程を以下に
記載する：
【００８４】Ａ）サンガーＤＮＡまたはＲＮＡ配列決定
のために、質量−修飾核酸プライマー（ＵＰ）を使用す
ることによる多重化（第１１図）； Ｂ）サンガーＤＮＡまたはＲＮＡ配列決定のために質量
−修飾リボヌクレオシド三リン酸を鎖伸長剤および／停
止剤として使用することによる多重化（第１２図）；お
よび Ｃ）４つのサンガーＤＮＡ／ＲＮＡ塩基特異的停止化断
片族の一部に組み込まれたタグ配列に特異的にハイブリ
ダイズするタグプローブの使用による多重化。
【００８５】この質量−修飾は第７Ａ、７Ｂ、９および
１０図に記載されるように行うか、あるいは同じ、また
は異なる長さを持つ様々なオリゴヌクレオチド配列を非
修飾ヌクレオチド（これは予め定めた方法で適当に識別
化された分子量を生成する）で設計することにより行う
（第３図）。
【００８６】４つの異なるＤＮＡクローンを同時にマス
分析するための質量−修飾核酸プライマー（ＵＰ）によ
る多重化の方法は、第１１図に例として説明されてい
る。第一の反応混合物は、適当なベクター（例えばＭ１
３ｍｐ１８）に組み込まれた未知ＤＮＡ断片１（クロー
ン１）を有する標準的なサンガーＤＮＡ配列決定法によ
り得られ、非修飾核酸プライマーＵＰ0および標準的な
４つの非修飾デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ
0）、ならびに１／１０倍の４つのジデオキシヌクレオ
シド三リン酸（ｄｄＮＴＰ0）の１つを使用する。ＤＮ
Ａ断片２（クローン２）のための第二反応混合物は、質
量−修飾核酸プライマー（ＵＰ1）、および上記のよう
に４つの非修飾デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴ
Ｐ0）を使用することにより得られ、それぞれの別個の
サンガー反応に１／１０倍の鎖−停止修飾ジデオキシヌ
クレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ0）を含有する前記の
４つの非修飾ヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ0）を使
用する。他の２つの実験では、４つのサンガー反応は以
下の組成である：ＤＮＡ断片３（クローン３）、Ｕ
Ｐ 2、ｄＮＴＰ0、ｄｄＮＴＰ0およびＤＮＡ断片４（ク
ローン４）、ＵＰ3、ｄＮＴＰ0、ｄｄＮＴＰ0。マスス
ペクトロメトリーのＤＮＡ配列決定法について、４つの
クローンのすべての塩基−特異的停止反応物はプールさ
れ、そして分析される。４つのジデオキシ−停止（例え
ばｄｄＴ−停止）化断片族に属する種々のマスピーク
は、特異的に伸長し、そしてｄｄＴ−停止断片が、４つ
のうちの１つのジデオキシヌクレオシド三リン酸（ＵＰ
0−ｄｄＮ0、ＵＰ1−ｄｄＮ0、ＵＰ2−ｄｄＮ0およびＵ
Ｐ3−ｄｄＮ0）により伸長した既知のＵＰ0、ＵＰ1、Ｕ
Ｐ2およびＵＰ3分子イオンピークを調査（コンピーター
プログラムによる）することにより評価される。
【００８７】このように、クローン１から４の４つの未
知ＤＮＡ配列の第一ヌクレオチドが測定される。４つの
配列が評価されるまで４つの特別な第一伸長生成物の分
子マスを記憶させながら、この工程を繰り返す。４つの
質量−修飾核酸プライマーが同じジデオキシヌクレオシ
ド三リン酸により伸長するような最悪の場合でも、伸長
生成物は例えばＵＰ0−ｄｄＴ、ＵＰ1−ｄｄＴ、ＵＰ2
−ｄｄＴおよびＵＰ3−ｄｄＴであり、それらは４つの
核酸プライマーを差別する既知のマス増分により識別さ
れるので明確な質量／配列評価が可能である。
【００８８】本発明の別の態様では例えばＳＰ６および
／またはＴ７プロモーター配列を含有するような種々の
ベクターを使用して、核酸プライマーＵＰ0、ＵＰ1、Ｕ
Ｐ2およびＵＰ3で転写するか、ならびにＲＮＡポリメラ
ーゼ（例えばＳＰ６またはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ）
と鎖−伸長および停止化非修飾ヌクレオシド三リン酸Ｎ
ＴＰ0および3'-ｄＮＴＰ0を使用して、類似技術が行わ
れる。これもＤＮＡ配列はサンガーＲＮＡ配列決定法に
より決定される。
【００８９】第１２図は、３つの異なるＤＮＡ断片（３
クローン）を中に含む質量−修飾鎖−伸長または／およ
び停止化ヌクレオシド三リン酸による多重化工程が同時
に分析されることを説明している。第一のＤＮＡサンガ
ー配列決定反応（ＤＮＡ断片１、クローン１）は非修飾
核酸プライマー（ＵＰ0、ｄＮＴＰ0）、および４つの各
反応に４つのｄｄＮＴＰ0の１つを使用する標準的混合
物である。第二（ＤＮＡ断片２、クローン２）および第
三（ＤＮＡ断片３、クローン３）は次のような組成であ
る：それぞれＵＰ0、ｄＮＴＰ0、ｄｄＮＴＰ1およびＵ
Ｐ0、ｄＮＴＰ0、ｄｄＮＴＰ2。
【００９０】この工程の変法で、質量−修飾伸長ＤＮＡ
断片中の質量−増分の増幅は、等しく質量−修飾された
デオキシヌクレオシド三リン酸（すなわちｄＮＴＰ1、
ｄＮＴＰ2)のみを鎖伸長に使用するか、あるいはホモロ
ガスな等しく質量−修飾されたジデオキシヌクレオシド
三リン酸とを組み合わせるかのいずれかを使用して達成
できる。上記３つのクローンに関し、反応混合物の内容
は以下の通り：ＵＰ0／ｄＮＴＰ0／ｄｄＮＴＰ0、ＵＰ0
／ｄＮＴＰ1／ｄｄＮＴＰ0およびＵＰ0／ｄＮＴＰ2／ｄ
ｄＮＴＰ0あるいはＵＰ0／ｄＮＴＰ0／ｄｄＮＴＰ0、Ｕ
Ｐ0／ｄＮＴＰ 1／ｄｄＮＴＰ1およびＵＰ0／ｄＮＴＰ2
／ｄｄＮＴＰ2。
【００９１】上記のように、ＤＮＡ配列決定はサンガー
ＲＮＡ配列決定により、非修飾核酸プライマー（Ｕ
Ｐ0）および適当量の鎖−伸長および停止ヌクレオシド
三リン酸を使用することにより行い得る。質量−修飾は
再度、鎖−停止化ヌクレオシド三リン酸のみ、または鎖
−伸長ヌクレオシド三リン酸と組み合わせるかのいずれ
かであり得る。多重化は３つの塩基−特異的停止化配列
決定反応（例えばｄｄＴＴＰ停止生成物）をプールし、
そして同時にプールした生成物をマススペクトルメトリ
ーで分析することにより行う。再度、既知の核酸プライ
マー配列の第一伸長生成物を評価（例えばコンピュータ
ープログラムによる）する。質量／配列評価は、３つの
すべてのクローンで同じヌクレオチド（例えばｄｄＴ）
により核酸プライマーが伸長／停止しているような最悪
の場合でも可能である。このようにして得た以下の配置
はそれらの異なる質量−修飾により良好に識別できる：
ＵＰ0−ｄｄＴ0、ＵＰ0−ｄｄＴ1、ＵＰ0-ｄｄＴ2。
【００９２】本発明の別の態様では、多重マススペクト
ルメトリーによるＤＮＡ配列決定は配列決定するＤＮＡ
断片を、特別な“タグ配列”を含有する“plexベクタ
ー”中にクローニングし（Kosterら、“化学発光検出を
使用するオリゴヌクレオチド合成および多重ＤＮＡ配列
決定（Oligonucleotide Synthesis and Multiplex DNAS
equencing Using Chemiluminescent Detection)"Nuclei
c Acids Res.シンポジウム、第24回、318-321(1991)）;
次にＤＮＡ調製および標準的なｄＮＴＰ0／ｄｄＮＴＰ0
および核酸プライマーＵＰ0を使用する４つの別個のサ
ンガー配列決定反応のために、種々plex-ベクターから
のクローンをプールし；結合基（Ｌ）により固体支持体
にＵＰの５’末端で結合している４つの多重断片を族を
精製し；すべての副生物を洗浄し、そして精製した多重
ＤＮＡ断片を支持体から開裂するか、あるいはＬ−Ｌ’
結合ネスティッドサンガー断片を使用して（上記のよう
なマススペクトルメトリー分析用の）；特別な“タグプ
ローブ”の個々のハイブリダイゼーションによりデマル
チプレキシング（demultiplexing）を行い；そして引き
続きマススペクトルメトリーで分析する、ことにより行
われる（例えば第１３図を参照にされたい）。
【００９３】参考点として、４つの塩基−特異的停止化
多重ＤＮＡ断片族はマススペクトルメトリーで処理さ
れ、そしてすべてのｄｄＴ0−、ｄｄＡ0−、ｄｄＣ
0−、ｄｄＧ0−停止分子イオンピークがそれぞれ検出さ
れ、そして記憶される。例えば特別な断片族に対するｄ
ｄＴ0−停止化ＤＮＡ断片の評価は、特別なタグプロー
ブ（ＴＰ）の対応するタグ配列（こ特別な断片族中に含
まれている）へのハイブリダイゼーション後に別のマス
スペクトルメトリーで行われる。特別なタグプローブに
ハイブリダイズすることができる分子イオンピークだけ
が同じ既知の質量増分（例えばタグプローブの）によ
り、より高い分子質量にシフトする。これらのシフトし
たイオンピークは特別なタグプローブへのすべてのハイ
ブリダイズにより、同じ断片族に属する。所定の断片族
に関して、残りの鎖停止断片族族を同じタグプローブで
反復し、完全なＤＮＡ配列を評価する。この工程はｉ−
ｌ回、ｉクローンの数に対応して反復する（第ｉ番目の
クローンは欠如により同定）。
【００９４】様々な多重クローンに関しタグプローブの
識別は、ＤＮＡ配列およびそのタグに対するワトソン−
クリック塩基対を形成する能力だけで得ることができ
る。当該技術分野では、所定のタグプローブが所定のタ
グ配列と特異的にハイブリダイズするためのストリンジ
ェンシー条件をどのように算出するかは周知である（例
えばモレキュラークローニング：アラボラトリーマニュ
アル、第二版、Sambrook,FritschおよびManiatis（コー
ルドスプリングハーバーラボラトリー出版、ニューヨー
ク、第11章を参照にされたい）。さらに識別化は、各pl
exベクターsl組成物の長さまたは塩基を変更するだけ
で、または第７Ａ、７Ｂ、９および１０による質量−修
飾で独自となるような十分な質量差異を有するように、
タグ配列を設計することにより得ることができる。
【００９５】マススペクトロメトリー中にタグ配列とタ
グプローブとの間の二重鎖を完全に保つために、本発明
の別の態様は例えばプソラレンおよびエリプチシンのよ
うな光反応性基および他の当該技術分野に周知な方法
（例えば、Heleneら、Nature 344,358(1990)およびThuo
ngら、“内部添加剤に付加したオリゴヌクレオチド。光
反応性および開裂剤（Oligonucleotides Attached to I
ntercalator.Photoreactive and Cleavage Agent）”F.
Eckstein、オリゴヌクレオチドおよび類似体：実験的手
法（Oligonucleotides and Anslogues:Practical Appro
ach）、ＩＲＬ出版、オックスフォード1991、283-396）
により媒介される共有結合を提供する。
【００９６】ＤＮＡ配列は既知のＵＰ0-タグ配列／タグ
プローブ分子量に対応する最小分子量イオンピークに加
えて、第一伸長物（例えばｄｄＴ0）、次に第二、第三
等を調査することにより再度、解明される。
【００９７】後者の手法をすでに記載した多重化工程と
組み合わせると、タグプローブ／タグ配列相互作用、質
量−修飾核酸プライマー（第７Ａおよび７Ｂ図）および
／または質量−修飾デオキシヌクレオシド（ｄＮＴＰ
0-i）および／またはジデオキシヌクレオシド三リン酸
（ｄｄＮＴＰ0-i）を使用してさらに多重化のが増加が
達成できる。当業者はタグ配列／タグプローブ多重化法
は、ネスティッドＤＮＡ断片をＤＮＡポリメラーゼで生
成するサンガーＤＮＡ配列決定法には限定されないこと
を認識するだろう。ＤＮＡ配列は適当なプロモーター含
有ベクター（上記）由来の未知のＤＮＡ配列を、様々な
ＲＮＡポリメラーゼおよびＮＴＰ0-i／3'-ｄＮＴＰ0-i
で転写することにより決定することもでき、すなわちネ
スティッドＲＮＡ断片を生成する。
【００９８】さらに本発明の別の態様では、質量−修飾
官能基を２つ、または多重工程により導入できる。この
場合、核酸プライマー、鎖−伸長または停止ヌクレオシ
ド三リン酸および／またはタグプローブは第一工程にあ
り、アジド、−Ｎ3のような前駆体官能基により修飾さ
れるか、またはＸＲ（第７Ａ、７Ｂ、９図）中のＲがＨ
である官能基で修飾され、これにより一時的な官能基
（例えば限定するわけではないが、-0H、-NH2、-NHR、-
SH、-NCS、-OCO(CH2)rCOOH(r=1-20)、-NHCO(CH2)rCOOH
(r=1-20)、-OSO2OH、-OCO(CH2)rl(r=1-20)、-OP(O-Alky
l)N(Alkyl)2）を提供する。これらの嵩の低い官能基
は、ＤＮＡ配列決定法の酵素的ＤＮＡまたはＲＮＡ合成
によりよい基質特性をもたらす。適当な質量−修飾官能
基は次にネスティッド塩基−特異的停止化ＤＮＡまたは
ＲＮＡ断片の生成後、マススペクトルメトリー前に導入
される。質量−修飾官能基として役立ついくつかの例を
第９および１０図に示すが、これは本発明を制限するも
のではない。
【００９９】本発明の範囲はマススペクトロメトリーに
よる核酸の配列決定のためのキットにも関するが、それ
は上記配列決定反応物を含む。例えば１つの態様では、
このキットは幾つかの異なる核酸種の多重マススペクト
ロメトリー配列決定のための反応物を含む。キットは結
合官能基（Ｌ1）を塩基−特異的停止生成物の固定化の
ために有する固体支持体；プライマーと固体支持体間を
可逆的または一時的に結合する結合基（Ｌ）を有する少
なくとも１つ核酸プライマー、例えば光開裂性結合；鎖
−伸長ヌクレオチドの組（例えばｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、
ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰまたはＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ
およびＴＴＰ）；鎖−停止ヌクレオチドの組（ＤＮＡ合
成のための２'，３'-ジデオキシヌクレオチドまたはＲ
ＮＡ合成のための3'-デオキシヌクレオチド）；そして
相補的ヌクレオチドを合成するための適当なポリメラー
ゼを含むことができる。プライマーおよび／または停止
化ヌクレオチドを、配列決定される核酸種の１つから生
成した塩基−特異的停止断片がマススペクトロメトリー
により他のすべてから識別できるように質量−修飾する
ことができる。質量−修飾合成反応物を使用する代わり
に、１組のタグプローブ（上記）をキットに含めること
ができる。このキットは適当な緩衝液ならびに同時に多
種の核酸を配列決定するための多重マススペクトロメト
リーを行うための指導書も含むことができる。
【０１００】別の態様では核酸配列決定キットは上記の
固体支持体、相補的核酸断片の合成を始めるためのプラ
イマー、１組の鎖−伸長ヌクレオチドおよび適当なポリ
メラーゼを含んで成ることができる。この質量−修飾鎖
停止化ヌクレオチドは１つの鎖停止化剤を伸長している
相補的核酸に付加することによりマススペクトロメトリ
ーで識別できるように選択される。
【０１０１】実施例１ ジスルフィド結合を介するマススペクトル分析のためサ
ンガーのＤＮＡ配列決定用反応のプライマー伸長産物の
固定化 イソチオシアン酸フェニル基を有する固体支持体として
のセクエロン（Ｓｅｑｕｅｌｏｎ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏ
ｒｅ Ｃｏｒｐ．社、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を出発物
質として使用する。直径８ｍｍであるこの膜ディスクを
Ｎ−メチルモルホリン／水／２−プロパノールの溶液
（ＮＭＭ溶液）（２／４９／４９／ ｖ／ｖ／ｖ）で湿
らせ、余分な液体を濾紙で除去し、そして５５℃に設定
した加熱用ブロック（ｈｅａｔｉｎｇ ｂｌｏｃｋ）に
設置してあるプラスチックフィルムもしくはアルミホイ
ルの細片上に乗せる。ディスク当たり、ＮＭＭ中の１ｍ
Ｍの２−メルカプトエチルアミン（システアミン）もし
くは２，２’−ジチオービス（エチルアミン）（システ
アミン）もしくはＳ−（２−チオピリジル）−２−チオ
−エチルアミン（１０μｌ、１０ｎモル）の溶液を添加
し、そして５５℃で加熱する。
【０１０２】１５分後に、ディスク当たり１０μｌのＮ
ＭＭ溶液を添加し、そして更に５分間加熱する。余剰の
イソチオシアネート基を、１０μｌのＮＭＭ溶液中のグ
リシンの１０ｍＭ溶液での処理により除去することがで
きる。システアミンに関しては、これらのディスクを１
０μｌのジチオスレイトール（ＤＴＴ）／２−プロパノ
ール（１：１ ｖ／ｖ）の１Ｍ水溶液での、室温で１５
分間の処理により除去する。その後にこれらのディスク
を、各１ｍｌのＮＭＭ溶液の５アリコート、次いで１ｍ
ｌのアセトニトリル／水（１／１ ｖ／ｖ）の５アリコ
ートを用いる濾過用多岐管（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｍ
ａｎｉｆｏｌｄ）内で完全に洗浄し、そしてその後に乾
燥させる。直ぐに使用しない場合にはこれらのディスク
をチオール基を遊離にさせた状態で1Ｍのジチオスレイ
トール／２−プロパノール（１：１ ｖ／ｖ）水溶液中
に保存し、そして使用前には各１ｍｌのＮＭＭ溶液で３
回洗浄することによりＤＴＴを除去する。５’−ＳＨの
官能基を有するプライマーオリゴヌクレオチドは種々の
方法により調製することができる（例えば、Ｂ．Ｃ．
Ｆ．Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．、１４、５５９１−５６０３（１９８６）、Ｓ
ｐｒｏａｔ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．、１５、４８３７−４８（１９８７）、および
Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏ
ｇｕｅｓ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ
（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、ｅｄｉｔｏｒ）、ＩＲＬ Ｐ
ｒｅｓｓＯｘｆｏｒｄ、１９９１）。
【０１０３】サンガーの実験法に従う配列決定用反応は
標準法において実施する（例えば、Ｈ．Ｓｗｅｄｌｏｗ
ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
１８、１４１５−１９（１９９０））。約７−１０ｍＭ
のＤＴＴの存在下では遊離の５’−チオールプライマー
を使用することができ、他の場合ではＳＨ官能基を、サ
ンガーの配列決定用反応中に例えばトリチル基により保
護し、そして支持体に固定化させる前に以下に示す方法
でそれを除去することができる。４つの配列決定用反応
（エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）管内で各１５
０μｌ）をＤＮＡポリメラーゼ（クレノウ（Ｋｌｅｎｏ
ｗ）フラグメント、シークエナーゼのようなもの）を変
性させるための７０℃での１０分間のインキュベーショ
ンにより停止させ、そしてこの反応混合物をエタノール
で沈殿させる。上清を除去し、そしてペレットを２５μ
ｌの１Ｍ硝酸銀水溶液と共にボルテックスミキサーにか
けて混合させ、そして室温で１時間置いた後に、５０μ
ｌの１Ｍ ＤＴＴ水溶液を添加し、そしてボルテックス
ミキサーにより混合させる。１５分後にこの混合物を遠
心し、そしてペレットを２回、１０μｌの酢酸エチルで
ボルテックスミキサーによる混合および遠心により洗浄
して余剰のＤＴＴを除去する。５’−チオールが遊離の
状態になっているプライマー伸長産物を今度は緩和な酸
化条件下でチオール化膜支持体に結合させる。
【０１０４】一般的には１０μｌの１０ｍＭの脱気させ
た酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ＴＥＡＡ）ｐＨ
７．２中に溶かした５’−チオール化プライマー伸長産
物をチオール化膜支持体に添加することで十分である。
結合は、冷風送風機を用いて膜ディスク上で試料を乾燥
させることにより実施する。この過程は、この膜を１０
μｌの１０ｍＭ ＴＥＡＡ緩衝液ｐＨ７．２で湿らせ、
そして前述のように乾燥させることにより繰り返すこと
ができる。２−チオピリジル誘導体化合物を使用する場
合には固定化を、３４３ｎｍにおけるピリジン−２−チ
オンの放出により分光測光法的にモニターすることがで
きる。
【０１０５】この方法の他の変法においては、オリゴヌ
クレオチドプライマーは、自動ＤＮＡ合成中に標準法に
より導入される５’−端のアミノ基で官能基付加させる
（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅ）。プライマー伸長後、
サンガーの配列決定用法中に、この一次アミノ基を３−
（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸のＮ−ヒドロキシ
スクシンイミドエステル（ＳＰＤＰ）と反応させ、そし
てその後にチオール化支持体に結合させ、そして前述の
要領でピリジル−２−チオンの放出によりモニターす
る。ＤＮＡポリメラーゼの変性および配列決定用産物の
エタノール沈殿の後、上清を除去し、そしてペレットを
１０μｌの１０ｍＭ ＴＥＡＡ緩衝液ｐＨ７．２中に溶
かし、そして１０ｍＭ ＴＥＡＡ中の１０μｌの２ｍＭ
ＳＰＤＰ溶液を添加する。この反応混合物をボルテック
スミキサーにより混合し、そして２５℃下で３０分間イ
ンキュベートする。その後に余剰のＳＰＤＰを各５０μ
ｌのエタノールでの３回の抽出（ボルテックスミキサー
による混合、遠心）により除去し、そして得られるペレ
ットを１０μｌの１０ｍＭ ＴＥＡＡ緩衝液ｐＨ７．２
中に溶かし、そしてチオール化支持体（上述）に結合さ
せる。
【０１０６】プライマー伸長産物は、各１００μｌのＮ
ＭＭ溶液で３回、次いで各１００μｌの１０ｍＭ ＴＥ
ＡＡ緩衝液ｐＨ７．２で３回の膜ディスクの洗浄により
精製する。精製したプライマー伸長産物を、１０ｍＭの
ＴＥＡＡ緩衝液ｐＨ７．２中の１０μｌの１０ｍＭ ２
−メルカプトエタノールでの３回連続の処理により放出
させ、凍結乾燥させ、そしてＥＳもしくはＭＡＬＤＩの
いずれかのマススペクトロメトリーにより分析する。
【０１０７】この方法は、質量修飾核酸プライマーＵＰ
0-iについても、質量修飾用官能基の化学特性を考慮に
入れて、類似の適切な方法で使用することもできる。
【０１０８】実施例２ レブリニル基を介するマススペクトル分析のためサンガ
ーのＤＮＡ配列決定用反応のプライマー伸長産物の固定
化 ５−アミノレブリン酸はその一次アミノ基を、炭酸９−
フルオニルメチル−Ｎ−スクシンイミジルを用いてＦｍ
ｏｃ基で保護し、そしてその後に標準条件下でＮ−ヒド
ロキシスクシイミドおよびジシクロヘキシルカルボジイ
ミドを用いてＮ−ヒドロキシスクシニミドエステル（Ｎ
ＨＳエステル）へと変換させる。サンガーの配列決定用
反応のためには核酸プライマーであるＵＰ0-iを用いる
が、これは、最終合成段階としてアミノリンカーである
ホスホアミデートを用いる自動ＤＮＡ合成中に標準法に
より導入される５’−末端の一次アミノ基で官能基付加
させる（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅ）。サンガーの配
列決定法は標準条件下（既述）で実施する。
【０１０９】４つの反応混合物（エッペンドルフ（Ｅｐ
ｐｅｎｄｏｒｆ）管内で各１５０μｌ）を７０℃に１０
分間加熱してＤＮＡポリメラーゼを不活化させ、エタノ
ール沈殿を行い、遠心し、そして１０μｌの１０ｍＭ
ＴＥＡＡ緩衝液ｐＨ７．２中に再懸濁させる。１０ｍＭ
のＴＥＡＡ緩衝液中の１０μｌの２ｍＭ Ｆｍｏｃ−５
−アミノレブリニル−ＮＨＳエステル溶液を添加し、ボ
ルテックスミキサーによる混合を行い、そして２５℃下
で３０分間インキュベートする。余剰の試薬をエタノー
ル沈殿および遠心により除去する。Ｆｍｏｃ基は、Ｎ，
Ｎ−ジメチルホルムアミド／水（１：１ ｖ／ｖ）中の
１０μｌの２０％ピペリジン溶液中にペレットを再懸濁
させることにより開裂させて除去する。２５℃に１５分
間置いた後にピペリジンを各１００μｌのエタノールを
用いる３回の沈殿／遠心により完全に除去し、このペレ
ットを１０μｌのＮ−メチルモルホリン、２−プロパノ
ール、および水（２／１０／８８ ｖ／ｖ／ｖ）の溶液
中に再懸濁させ、そしてこれをイソチオシアネート基を
保持する固体支持体に結合させる。ＤＩＴＣ−セクエロ
ン（Ｓｅｑｕｅｌｏｎ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏ
ｒｐ．社、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）の場合には、この膜
を実施例１に記載する要領で調製し、そして結合は既述
の要領で５５℃の加熱用ブロック上で実施する。ＲＮＡ
伸長産物は類似する方法で固定化させる。この方法を、
類似する様式でイソチオシアネート基を有する他の固体
支持体に適用することができる。固定化させたプライマ
ー伸長産物を各１００μｌのＮＭＭ溶液で３回、次いで
各１００μｌの１０ｍＭ ＴＥＡＡ緩衝液ｐＨ７．２で
３回、充分に洗浄する。精製したプライマー伸長産物
を、１０μｌの１００ｍＭ酢酸ヒドラジニウム緩衝液ｐ
Ｈ６．５での３回の連続処理により放出させ、凍結乾燥
し、そしてＥＳもしくはＭＡＬＤＩのいずれかのマスス
ペクトロメトリーにより分析する。
【０１１０】実施例３ トリプシン感受性結合を介するマススペクトル分析のた
めサンガーのＤＮＡ配列決定用反応のプライマー伸長産
物の固定化 ８ｍｍ直径のセクエロン（Ｓｅｑｕｅｌｏｎ）ＤＩＴＣ
膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．社、Ｂｅｄｆｏｒ
ｄ、ＭＡ）を１０μｌのＮＭＭ溶液（Ｎ−メチルモルホ
リン／プロパノール−２／水；２／４９／４９ ｖ／ｖ
／ｖ）で湿らせ、そしてリンカーアームをＮＭＭ中の１
０μｌの１０ｍＭ １，６−ジアミノヘキサン溶液との
反応により導入する。余剰のジアミンを、１００μｌの
ＮＭＭ溶液での３回の洗浄段階により除去する。標準的
なペプチド合成法を用いて２つのＬ−リシン残基を、Ｎ
−Ｆｍｏｃ−Ｎ−ｔＢｏｃ−Ｌ−リシンのペンタフルオ
ロフェニルエステルとの２回の連続的な縮合により結合
させ、末端のＦｍｏｃ基をＮＭＭ中のピペリジンで除去
し、そして遊離のα−アミノ基をジイソチオシアン酸
１，４−フェニレン（ＤＩＴＣ）に結合させる。余剰の
ＤＩＴＣを１００μｌの２−プロパノールでの３回の洗
浄段階により除去し、そしてＮ−ｔＢｏｃ基を標準的な
ペプチド合成法に従ってトリフルオロ酢酸を用いて除去
する。
【０１１１】核酸プライマー伸長産物は、５’−末端に
一次アミノ基を保持するオリゴヌクレオチドから調製す
る。４つのサンガーのＤＮＡ配列決定用反応混合物（エ
ッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）管内で各１５０μ
ｌ）を１０分間７０℃に加熱してＤＮＡポリメラーゼを
不活化させ、エタノール沈殿させ、そしてペレットを１
０μｌのＮ−メチルモルホリン、２−プロパノール、お
よび水（２／１０／８８ ｖ／ｖ／ｖ）の溶液中に再懸
濁させる。この溶液をＬｙｓ−Ｌｙｓ−ＤＩＴＣ膜ディ
スクに移し、そして５５℃に設定してある加熱用ブロッ
ク上で結合させる。乾燥後に、１０μｌのＮＭＭ溶液を
添加し、そして乾燥過程を繰り返す。
【０１１２】固定化プライマー伸長産物を、各１００μ
ｌのＮＭＭ溶液で３回、次いで各１００μｌの１０ｍＭ
ＴＥＡＡ緩衝液ｐＨ７．２で充分に洗浄する。マスス
ペクトル分析については、一次伸長産物と固定支持体と
の間の結合を標準条件下でのトリプシンでの処理により
開裂させ、そして放出された産物を、トリプシンを内部
質量標準として用いるＥＳもしくはＭＡＬＤＩのいずれ
かのマススペクトロメトリーにより分析する。
【０１１３】実施例４ ピロリン酸結合を介するマススペクトル分析のためサン
ガーのＤＮＡ配列決定用反応のプライマー伸長産物の固
定化 ＤＩＴＣセクエロン（Ｓｅｑｕｅｌｏｎ）膜（８ｍｍ直
径のディスク）は実施例３に記載される要領で調製し、
そしてＮＭＭ溶液中の１０μｌの１０ｍＭ ３−アミノ
ピリジンアデニンジヌクレオチド（ＡＰＡＤ）（Ｓｉｇ
ｍａ社）溶液を添加する。余剰のＡＰＡＤを一回の１０
μｌのＮＭＭ溶液での洗浄により除去し、そしてこのデ
ィスクをＮＭＭ溶液中の１０μｌの１０ｍＭ過ヨウ素酸
ナトリウム溶液で処理する（１５分、２５℃）。余剰の
過ヨウ素酸を除去し、そして５’一端に一次アミノ基を
有する核酸プライマーを利用する４つのサンガーのＤＮ
Ａ配列決定用反応（エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒ
ｆ）管内で各１５０μｌ）のプライマー伸長産物をエタ
ノール沈殿させ、１０μｌのＮ−メチルモルホリン／２
−プロパノール／水（２／１０／８８ ｖ／ｖ／ｖ）の
溶液中に溶かし、そして固定化ＮＡＤアナログの２’，
３’−ジアルデヒド基に結合させる。
【０１１４】このプライマー伸長産物をＮＭＭ溶液（各
１００μｌで３回）および１０ｍＭのＴＥＡＡ緩衝液ｐ
Ｈ７．２（各１００μｌで３回）で充分に洗浄し、そし
て精製されたプライマー伸長産物を、ｐＨ７．２の１０
ｍＭのＴＥＡＡ緩衝液中のＮＡＤアーゼもしくはピロホ
スファターゼのいずれかでの３７℃下、１５分間の処理
により放出させ、凍結乾燥し、そしてこれらの酵素を内
部質量標準として用いるＥＳもしくはＭＡＬＤＩのいず
れかのマススペクトロメトリーにより分析する。
【０１１５】実施例５ 末端ヌクレオシドの糖部分の５’−位をグリシン残基に
より質量修飾させた核酸プライマーの合成 オリゴヌクレオチドはβ−シアノエチルホスホアミデー
トを用いる標準的な自働ＤＮＡ合成(H. Koester et al.
Nucleic Acids Res. 12、4539(1984)）により合成し、そ
して５’−アミノ基を固相ＤＮＡ合成の最後に導入する
（例えば、Ａｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１４、６２２７−４５（１９
８６）、もしくはＳｐｒｏａｔｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５、６１８１−９６
（１９８７））。０．２５μモルのＣＰＧ−結合化ヌク
レオシドから開始するオリゴヌクレオチド合成物の総量
を濃厚なアンモニア水溶液で脱保護化させ、Ｏｌｉｇｏ
ＰＡＫ（商標）カートリッジ（Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ）
（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．社、Ｂｅｄｆｏｒ
ｄ、ＭＡ）を介して精製し、そして凍結乾燥する。５’
−末端アミノ基を有するこの物質を１００μｌの無水
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶かし、
そして１０μモルのＮ−Ｆｍｏｃ−グシリンのペンタフ
ルオロフェニルエステルと、６０分間２５℃で縮合させ
る。エタノール沈殿および遠心の後に、このＦｍｏｃ基
をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の１００μｌの２０
％ピペリジン溶液での１０分間の処理により開裂して除
去する。余剰のペピリジン、ＤＭＦ、およびＦｍｏｃ基
からの開裂産物をエタノール沈殿により除去し、そして
この沈殿物を１０ｍＭのＴＥＡＡ緩衝液ｐＨ７．２から
凍結乾燥させる。
【０１１６】この物質を今度は、サンガーのＤＮＡ配列
決定用反応用のプライマーとして用いるか、あるいは一
つもしくは複数のグリシン残基（もしくは他の適切な保
護化アミノ酸活性エステル）を添加してサンガーのＤＮ
ＡもしくはＲＮＡ配列決定に適する一連の質量修飾プラ
イマーオリゴヌクレオチドを作製する。プライマー伸長
後、配列決定法中にこれらの質量修飾核酸プライマーＵ
Ｐ0-iの固定化を、例えば実施例１−４に記載される要
領で実施することができる。
【０１１７】実施例６ ピリミジンヌクレオシドの複素環塩基のＣ−５をグリシ
ン残基で質量修飾させた核酸プライマーの合成 出発物質は、刊行物による方法（Ｈａｒａｌａｍｂｉｄ
ｉｓ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ． １５、４８５７−７６（１９８７））に従って製
造した５−（３−アミノプロピニル−１）−３’，５’
−ジ−ｐ−トリルデオキシウリジンであり、そしてそれ
を３’，５’−ジ−Ｏ−アシル化した。０．２８１ｇ
（１．０ｍモル）の５−（３−アミノプロピニル−１）
−２’−デオキシウリジンを、５ｍｌの無水Ｎ，Ｎ−ジ
メチルホルムアミド中の０．９２７ｇ（２．０ｍモル）
のＮ−Ｆｍｏｃ−グリシンのペンタフルオロフェニルエ
ステルと、０．１２９ｇ（１ｍモル；１７４μｌ）の
Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンの存在下、６０分
間、室温で反応させた。溶媒をロータリー式蒸発機によ
り除去し、そしてこの生成物をシリカゲルクロマトグラ
フィー（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０、Ｍｅｒｃｋ社；カ
ラム；２．５×５０ｃｍ、クロロホルム／メタノール混
合物による溶出）により精製した。収率は０．４４ｇ
（０．７８ｍモル、７８％）であった。別のグリシン残
基を添加する目的で、Ｆｍｏｃ基をＤＭＦ中の２０％の
ピペリジン溶液での２０分間の処理で除去し、吸引下で
蒸発させ、そして残存する固形物質を２０ｍｌの酢酸エ
チルで３回抽出した。残存する酢酸エチルを除去させた
後に、Ｎ−Ｆｍｏｃ−グリシンのペンタフルオロフェニ
ルエステルを既述の要領で結合させる。５−（３−（Ｎ
−Ｆｍｏｃ−グリシル）−アミドプロピニル−１）−
２’−デオキシウリジンを５’−Ｏ−ジメトキシトリチ
ル化させたヌクレオシド−３’−Ｏ−β−シアノエチル
−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルホスホアミデートに変換
さ、そして標準法による自働オリゴヌクレオチド合成
(H. Koester et al.,Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ． １２、２２６１（１９８４））内に取り込ませ
る。化学的ＤＮＡ合成用のこのグリシン修飾チミジンア
ナログ構築用ブロックを使用して核酸プライマー配列中
の一つもしくは複数のチミジン／ウリジンヌクレオチド
を置換することができる。Ｆｍｏｃ基は、室温における
ＤＭＦ中の２０％のピペリジン溶液での２０分間の処理
を用いて固相合成の最後に除去する。ＤＭＦはアセトニ
トリルでの洗浄段階により除去し、そしてこのオリゴヌ
クレオチドの脱保護化を行い、そして標準法での精製を
行う。
【０１１８】実施例７ ピリミジンヌクレオシドの複素環塩基のＣ−５をβ−ア
ラニン残基で質量修飾させた核酸プライマーの合成 出発物質は実施例６におけるものと同一であった。０．
２８１ｇ（１．０ｍモル）の５−（３−アミノプロピニ
ル−１）−２’−デオキシウリジンを５ｍｌのＮ，Ｎ−
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中のＮ−Ｆｍｏｃ−β
−アラニンのペンタフルオロフェニルエステル（０．９
５５ｇ、２．０ｍモル）と、０．１２９ｇ（１７４μ
ｌ；１．０ｍモル）のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルア
ミンの存在下、室温で６０分間反応させた。溶媒を除去
し、そして生成物を実施例６に記載される要領でシリカ
ゲルクロマトグラフィーにより精製した。収率は０．４
２５ｇ（０．７４ｍモル、７４％）であった。別のβ−
アラニン部分は、Ｆｍｏｃ基の除去後に全く同じ方法で
添加することができる。５−（３−（Ｎ−Ｆｍｏｃ−β
−アラニル）−アミドプロピニル−１）−２’−デオキ
シウリジンからの５’−Ｏ−ジメトキシトリチル化させ
たヌクレオシド−３’−Ｏ−β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ
−ジイソプロピルホスホアミデートの製造および自動オ
リゴヌクレオチド合成内への取り込みは標準条件下で実
施する。この構築用ブロックを、核酸プライマー配列内
のいずれかのチミジン／ウリジン残基と置換することが
できる。質量修飾ヌクレオチドをたった一つのみ取り込
ませてある場合には、実施例６および７に従って製造さ
れる核酸プライマー分子は１４ダルトンの質量差を有す
るであろう。
【０１１９】実施例８ ピリミジンヌクレオシドの複素環塩基のＣ−５をエチレ
ングリコールモノメチルエーテルで質量修飾させた核酸
プライマーの合成 この実施例ではヌクレオシド構成成分として５−（３−
アミノプロピニル−１）−２’−デオキシウリジンを用
いる（実施例６および７を参照せよ）。この質量修飾用
官能基は以下に示す要領で取得した。５０ｍｌの無水ピ
リジン中に溶解してある７．６１ｇ（１００．０ｍモ
ル）の新たに蒸留したばかりのグリコールモノメチルエ
ーテルを、１０．０１ｇ（１００．０ｍモル）の再結晶
化無水コハク酸と、１．２２ｇ（１０．０ｍモル）の４
−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンの存在下で、室温で
一晩反応させた。この反応を水（５．０ｍｌ）の添加に
より停止させ、この反応混合物を減圧下で蒸発させ、脱
水トルエン（各２０ｍｌ）と共に２回共蒸発（ｃｏ−ｅ
ｖａｐｏｒａｔｅｄ）させ、そしてその残渣を１００ｍ
ｌのジクロロメタン中に再溶解した。この溶液を、１０
％のクエン酸水溶液（２×２０ｍｌ）で２回、次いで水
（２０ｍｌ）で一回連続的に抽出し、そして有機相を無
水硫酸ナトリウムに通して脱水させた。この有機相を減
圧下で蒸発させ、その残渣を５０ｍｌのジクロロメタン
中に再溶解し、そして５００ｍｌのペンタン内に沈殿さ
せ、そしてその沈殿物を減圧下で乾燥させた。収率は１
３．１２ｇ（７４．０ｍモル；７４％）であった。８．
８６ｇ（５０．０ｍモル）のスクシニル化エチレングリ
コールモノメチルエーテルを、５％の脱水ピリジン（５
ｍｌ）を含む１００ｍｌのジオキサン中に溶解し、そし
て６．９６ｇ（５０．０ｍモル）の４−ニトロフェノー
ルおよび１０．３２ｇ（５０．０ｍモル）のジシクロヘ
キシルカルボジイミドを添加し、そしてこの反応を室温
で４時間行わせた。ジシクロヘキシル尿素を濾過により
除去し、この濾液を減圧下で蒸発させ、そしてその残渣
を５０ｍｌの無水ＤＭＦ中に再溶解した。１２．５ｍｌ
（約１２．５ｍモルの４−ニトロフェニルエステル）の
この溶液を用いて２．８１ｇ（１０．０ｍモル）の５−
（３−アミノプロピニル−１）−２’−デオキシウリジ
ンを溶かした。この反応は、１．０１ｇ（１０．０ｍモ
ル；１．４ｍｌ）のトリエチルアミンの存在下、室温で
一晩実施した。この反応混合物を減圧下で蒸発させ、ト
ルエンと共に共蒸発させ、ジクロロメタン中に再溶解
し、そしてジクロロメタン／メタノール混合物を用いる
シリカゲル（ＳＩ６０、Ｍｅｒｃｋ社、カラム４×５０
ｃｍ）上でのクロマトグラフにかけた。所望の化合物を
含む分画を合わせ、蒸発させ、２５ｍｌのジクロロメタ
ン中に再溶解し、そして２５０ｍｌのペンタン中に沈殿
させた。５−（３−Ｎ−（Ｏ−スクシニルエチレングリ
コールモノメチルエーテル））−アミドプロピニル−
１）−２’−デオキシウリジンの乾燥化沈殿物（収率：
６５％）を５’−Ｏ−ジメトキシトリチル化し、そして
ヌクレオシド−３’−Ｏ−β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−
ジイソプロピルホスホアミデートに変換させ、そして構
築用ブロックとして標準法に従う自動オリゴヌクレオチ
ド合成内に取り込ませる。この質量修飾ヌクレオチド
を、核酸プライマー配列中の一つもしくは複数のチミジ
ン／ウリジン残基と置換することができる。プライマー
オリゴヌクレオチドの脱保護化および精製も標準法に従
う。
【０１２０】実施例９ ピリミジンヌクレオシドの複素環塩基のＣ−５をジエチ
レングリコールモノメチルエーテルで質量修飾させた核
酸プライマーの合成 ヌクレオシド出発物質は以前の実施例におけるものと同
一であり、５−（３−アミノプロピニル−１）−２’−
デオキシウリジンであった。この質量修飾用官能基は実
施例８に類似する要領で取得した。５０ｍｌの無水ピリ
ジン中に溶解させた１２．０２ｇ（１００．０ｍモル）
の新たに蒸留したばかりのジエチレングリコールモノメ
チルエーテルを、１０．０１ｇ（１００．０ｍモル）の
再結晶化無水コハク酸と、１．２２ｇ（１０．０ｍモ
ル）の４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡ
Ｐ）の存在下、室温で一晩反応させた。処理の詳細は実
施例８に記載されるものと同一であった。収率は１８．
３５ｇ（８２．３ｍモル、８２．３％）。１１．０６ｇ
（５０．０ｍモル）のスクシニル化させたジエチレング
リコールモノメチルエーテルを４−ニトロフェニルエス
テルに変換させ、そしてその後に１２．５ｍモルを２．
８１ｇ（１０．０ｍモル）の５−（３−アミノプロピニ
ル−１）−２’−デオキシウリジンと、実施例８に記載
される要領で反応させた。シリカゲルカラムクロマトグ
ラフィーおよびペンタン内への沈殿後の収率は３．３４
ｇ（６．９ｍモル、６９％）であった。ジメトキシトリ
チル化およびヌクレオシド−β−シアノエチルホスホア
ミデートへの変換後、この質量修飾構築用ブロックを標
準法に従って自動の化学的ＤＮＡ合成内に取り込ませ
る。核酸プライマ−ＵＰ0-iの配列内に含まれる一つも
しくは複数のチミジン／ウリジン残基をこの質量修飾ヌ
クレオチドで置換することができる。たった一つのみの
質量修飾ヌクレオチドが取り込まれる場合には、実施例
８および９の核酸プライマーは４４．０５ダルトンの質
量差を有するであろう。
【０１２１】実施例１０ デオキシアデノシンの複素環塩基のＣ−８をグリシンで
質量修飾させた核酸プライマーの合成 出発物質は、刊行物（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ． １８、３３３９−４５
（１９９０））に従って製造したＮ6−ベンゾイル−８
−ブロモ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチ
ル）−２’−デオキシアデノシンであった。６３２．５
ｍｇ（１．０ｍモル）のこの８−ブロモ−デオキシアデ
ノシン誘導体を５ｍｌの無水エタノール中に懸濁させ、
そして２５１．２ｍｇ（２．０ｍモル）のグリシンメチ
ルエステル（塩酸塩）と、２４１．４ｍｇ（２．ｌｍモ
ル；３６６μｌ）のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミ
ンの存在下で反応させ、そして薄層クロマトグラフィー
（ＴＣＬ）により検査する際に出発用のヌクレオシド物
質が消失するまで（４−６時間）還流させた。溶媒を蒸
発させ、そしてその残渣を０．１％のピリジンを含むク
ロロホルム／メタノールの溶媒混合物を用いるシルカゲ
ルクロマトグラフィー（カラム２．５×５０ｃｍ）によ
り精製した。生成物の分画を合わせ、そして溶媒を蒸発
させ、これらの分画を５ｍｌのジクロロメタン中に溶解
し、そして１００ｍｌのペンタン中に沈殿させた。収率
は４８７ｍｇ（０．７６ｍモル、７６％）であった。対
応するヌクレオシド−β−シアノエチルホスホアミデー
トへの変換および自動の化学的ＤＮＡ合成内への組込み
は標準条件下で実施する。濃厚なアンモニア水溶液での
最終脱保護化の間にメチル基をグリシン部分から除去す
る。この質量修飾構築用ブロックを、その核酸プライマ
ー配列内の一つもしくは複数のデオキシアデノシン／ア
デノシン残基と置換することができる。
【０１２２】実施例１１ デオキシアデノシンの複素環塩基のＣ−８をグリシルグ
リシンで質量修飾させた核酸プライマーの合成 この誘導体は、実施例１０のグリシン誘導体に類似する
要領で製造した。６３２．５ｍｇ（１．０ｍモル）のＮ
6−ベンゾイル−８−ブロモ−５’−Ｏ−（４，４’−
ジメトキシトリチル）−２’−デオキシアデノシンを５
ｍｌの無水エタノール中に懸濁させ、そして３２４．３
ｍｇ（２．０ｍモル）のグリシル−グリシンメチルエス
テルと、２４１．４ｍｇ（２．１ｍモル、３６６μ）の
Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンの存在下で反応さ
せた。この混合物を還流させ、そして反応の完了をＴＬ
Ｃにより検査した。詳細な操作法および精製法は実施例
１０に記載されるものに類似していた。シリカゲルカラ
ムクロマトグラフィーおよびペンタン内への沈殿後の収
率は４６４ｍｇ（０．６５ｍモル、６５％）であった。
ヌクレオシド−β−シアノエチルホスホスアミデートへ
の変換および合成オリゴヌクレオチドへの組込みは標準
法に従って実施する。核酸プライマー内中のたった一つ
のデオキシアデノシン／アデノシン残基がこの質量修飾
ヌクレオチドで置換される場合には、実施例１０および
１１の核酸プライマー間の質量差は５７．０３ダルトン
である。
【０１２３】実施例１２ ２’−アミノ−２’−デオキシチミジンの糖部分のＣ−
２’をエチレングリコールモノメチルエーテル残基で質
量修飾させた核酸プライマーの合成 出発物質は、公表されている方法（例えば、Ｖｅｒｈｅ
ｙｄｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ． ３
６、２５０−２５４（１９７１）；Ｓａｓａｋｉｅｔ
ａｌ．、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ． ４１、３１３８−３
１４（１９７６）；Ｉｍａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．
Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ． ４４、２０３９−２０４１（１９
７９）；Ｈｏｂｂｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅ
ｍ． ４２、７１４−７１９（１９７６）；Ｉｋｅｈａ
ｒａ ｅｔ ａｌ．、Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌ
ｌ．Ｊａｐａｎ ２６、２４０−２４４（１９７８）；
ＰＣＴ出願国際公開第８８／００２０１号も参照せよ）
に従って合成された５’−Ｏ−（４，４−ジメトキシト
リチル）−２’−アミノ−２’−デオキシチミジンであ
った。５’−Ｏ−（４，４−ジメトキシトリチル）−
２’−アミノ−２’−デオキシチミジン（５５９．６２
ｍｇ；１．０ｍモル）を、１０ｍｌの脱水ＤＭＦ中の
２．０ｍモルのスクシニル化エチレングリコールモノメ
チルエーテルの４−ニトロフェニルエステル（実施例８
を参照せよ）と、１．０ｍモル（１４０μｌ）のトリエ
チルアミンの存在下、室温で１８時間反応させた。この
反応混合物を減圧下で蒸発させ、トルエンと共蒸発さ
せ、ジクロロメタン中に再溶解させ、そしてシリカゲル
クロマトグラフィー（Ｓｉ６０、Ｍｅｒｃｋ社；カラ
ム：２．５×５０ｃｍ；溶出液：０．１％のトリエチル
アミンを含むクロロホルム／メタノールの混合物）によ
り精製した。生成物を含有する分画を合わせ、蒸発さ
せ、そしてペンタン中に沈殿させる。収率は５２４ｍｇ
（０．７３ｍモル；７３％）であった。ヌクレオシド−
β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホアミ
デートへの変換および自動の化学的ＤＮＡ合成内への組
込みは標準法により実施する。質量修飾デオキシチミジ
ン誘導体を、核酸プライマー内の一つもしくは複数のチ
ミジン残基と置換することができる。
【０１２４】類似する方法で、スクシニル化ジエチレン
グリコールモノメチルエーテル（実施例９を参照せよ）
およびトリエチレングリコールモノメチルエーテルの４
−ニトロフェニルエステルを利用することにより対応す
る質量修飾オリゴヌクレオチドを調製する。たった一つ
のみの質量修飾ヌクレオシドがこの配列内に取り込まれ
る場合には、エチレン、ジエチレン、およびトリエチレ
ングリコール誘導体間の質量差はそれぞれ４４．０５、
８８．１、および１３２．１５ダルトンになる。
【０１２５】実施例１３ ホスホロチオエート基のアルキル化を介してヌクレオチ
ド間連結を質量修飾させた核酸プライマーの合成 ホスホロチオエート含有性オリゴヌクレオチドは標準法
（例えば、Ｇａｉｔｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９ １１８３（１９９１）、を参照
せよ）に従って製造した。一つの、幾つかの、あるいは
全てのヌクレオチド間連結をこの方法で修飾することが
できる。（−）−Ｍ１３核酸プライマー配列（１７量
体）
【化２】 をＤＮＡ合成機で０．２５μモルのスケールで合成し、
そして最終合成周期（Ｇ−Ｔ結合）の後に一つのホスホ
ロチオエート基を導入させた。硫化、脱保護化、および
精製は標準法に従った。収率は３１．４ｎモル（総収率
１２．６％）であり、これは３１．４ｎモルのホスホロ
チオエート基に相当する。アルキル化はこの残渣を３
１．４μｌのＴＥ緩衝液（０．０１Ｍのトリス ｐＨ
８．０、０．００１ＭのＥＤＴＡ）に溶解し、そして
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の１６μｌ
の２０ｍＭ ２−ヨードエタノールの溶液（３２０ｎモ
ル、すなわちホスホロチオエートジエステルに関して１
０倍過剰）を添加することにより実施した。アルキル化
オリゴヌクレオチドを標準的な逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−１
８Ｕｌｔｒａｐｈｅｒｅ、Ｂｅｃｋｍａｎ社；カラム：
４．５×２５０ｍｍ；１０ｍＭの酢酸トリエチルアンモ
ニウム、ｐＨ７．０および５−４０％のアセトニトリル
の濃度勾配液）により精製した。
【０１２６】この方法の変法においては、一つもしくは
複数のホスホロチオエートホスホジエステル結合を含む
核酸プライマーをサンガーの配列決定用反応に用いる。
４つの配列決定用反応のプライマー伸長産物を実施例１
−４に例示する要領で精製し、開裂により固体支持体か
ら取り外し、凍結乾燥させ、そして各４μｌのＴＥ緩衝
液ｐＨ８．０中に溶かし、そしてＤＭＦ中の２μｌの２
０ｍＭ ２−ヨードエタノール溶液の添加によりアルキ
ル化させる。その後にこれをＥＳおよび／またはＭＡＬ
ＤＩマススペクトロメトリーにより分析する。
【０１２７】類似する方法においては、２−ヨードメタ
ノールの代わりに例えば３−ヨードプロパノール、４−
ヨードブタノールを利用して、未修飾ホスホロチオエー
トホスホジエステル含有性オリゴヌクレオチドと比較し
てそれぞれ質量差が１４．０３、２８．０６、および４
２．０３ダルトンとなる質量修飾核酸プライマーを取得
する。
【０１２８】実施例１４ ２’−もしくは３’−アミノ官能基をグリシンもしくは
β−アラニン残基で質量修飾させた２’−アミノ−２’
−デオキシウリジン−５’−三リン酸および３’−アミ
ノ−２’，３’−ジデオキシチミジン−５’−三リン酸
の合成 出発物質は、刊行物（Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎ ｅｔ ａ
ｌ．、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ． ３６、２５０（１９７
１））に従って調製された２’−アジド−２’−デオキ
シウリジンであり、これを、標準条件を用いる一つの容
器で行う反応（ｏｎｅ−ｐｏｔ ｒｅａｃｔｉｏｎ）で
ピリジン中の塩化４，４−ジメトキシトリチルで５'−
ＯＨを４，４−ジメトキシトリチル化し、そして無水酢
酸で３’−ＯＨをアセチル化した。出発物質として１９
１ｍｇ（０．７１ｍモル）の２’−アジド−２’−デオ
キシウリジンを用いて、３９６ｍｇ（０．６５ｍモル、
９０．８％）の５’−Ｏ−（４，４−ジメトキシトリチ
ル）−３’−Ｏ−アセチル−２’−アジド−２’−デオ
キシウリジンを、シリカゲルクロマトグラフィーを介す
る精製後に取得した。アジド基の還元は、公表されてい
る条件（Ｂａｒｔａ ｅｔ ａｌ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ
ｏｎ ４６、５８７−５９４（１９９０））を用いて実
施した。シリカゲルクロマトグラフィー後の５’−Ｏ−
（４，４−ジメトキシトリチル）−３’−Ｏ−アセチル
−２’−アミノ−２’−デオキシウリジンの収率は２８
８ｍｇ（０．４９ｍモル；７６％）であった。保護化し
てあるこの２’−アミノ−２’−デオキシウリジン誘導
体（５８８ｍｇ、１．０ｍモル）を、１０ｍｌの脱水Ｄ
ＭＦ中の２等量（９２７ｍｇ、２．０ｍモル）のＮ−Ｆ
ｍｏｃ−グリシンペンタフルオロフェニルエステルと、
室温で一晩、１．０ｍモル（１７４μｌ）のＮ，Ｎ−ジ
イソプロピルエチルアミンの存在下で反応させた。溶媒
を減圧下での蒸発により除去し、そしてこの残渣をシリ
カゲルクロマトグラフィーにより精製した。収率は７１
１ｍｇ（０．７１ｍモル、８２％）であった。脱トリチ
ル化は、室温での８０％の酢酸水溶液を用いる１時間の
処理により実施した。この残渣を乾燥するまで蒸発さ
せ、トルエンと共に２度共蒸発させ、１ｍｌの脱水アセ
トニトリル中に懸濁させ、そして刊行物（Ｙｏｓｈｉｋ
ａｗａｅｔ ａｌ．、Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊ
ａｐａｎ ４２、３５０５（１９６９）、およびＳｏｗ
ａ ｅｔ ａｌ．、Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊａｐ
ａｎ ４８、２０８４（１９７５））に従いＰＯＣｌ3で
５’−リン酸化させ、そして刊行物（例えば、Ｓｅｅｌ
ａ ｅｔ ａｌ．、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ
Ａｃｔａ．、７４、１０４８（１９９１））に従い、Ｄ
ＭＦ中の３ｍｌの０．５Ｍ（１．５ｍモル）テトラ（ト
リ−ｎ−ブチルアンモニウム）ピロリン酸を用いて直接
一つの容器内での反応で５’−三リン酸へと変換させ
た。Ｆｍｏｃおよび３’−Ｏ−アセチル基を、室温にお
ける濃厚なアンモニア水溶液での１時間の処理により除
去し、そしてこの反応混合物を蒸発させ、そして凍結乾
燥させた。精製法も、重炭酸トリエチルアンモニウムの
直線濃度勾配液（０．１Ｍ−１．０Ｍ）を用いるＤＥＡ
Ｅ−セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）上での陰イオ
ン交換クロマトグラフィーを用いることにより標準法に
従った。
【０１２９】三リン酸含有性分画（ポリエチレンイミン
セスロースプレート上での薄層クロマトグラフィーによ
り検査する）を回収し、蒸発させ、そして凍結乾燥させ
た。収率（ウラシル部分のＵＶ−吸収による）は６８％
（０．４８ｍモル）であった。
【０１３０】グリシル−グリシン修飾化２’−アミノ−
２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸を、室温にお
けるＤＭＦ中の２０％ピペリジン溶液での１時間の処
理、溶媒の蒸発、トルエンとの２回の共蒸発、およびＮ
−Ｆｍｏｃ−グリシンペンタフルオロフェニルエステル
との後続の縮合により５’−Ｏ−（４，４−ジメトキシ
トリチル）−３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｎ−（Ｎ−９
−フルオレニルメトキシカルボニル−グリシル）−２’
−アミノ−２’−デオキシウリジンからＦｍｏｃを除去
することにより取得した。１．０ｍモルの２’−Ｎ−グ
リシル−２’−アミノ−２’−デオキシウリジン誘導体
で出発し、そして既述の方法に従って、０．７２ｍモル
（７２％）の対応する２’−（Ｎ−グリシル−グリシ
ル）−２’−アミノ−２’−デオキシウリジン−５’−
三リン酸を取得した。
【０１３１】５’−Ｏ−（４，４−ジメトキシトリチ
ル）−３’−Ｏ−アセチル−２’−アミノ−２’−デオ
キシウリジンで出発し、そしてＮ−Ｆｍｏｃ−β−アラ
ニンペンタフルオフロフェニルエステルと共有結合させ
て、対応する２’−（Ｎ−β−アラニル）−２’−アミ
ノ−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸を合成す
ることができる。これらの修飾化ヌクレオシド三リン酸
を、サンガーのＤＮＡ配列決定法中にプライマー伸長産
物内に組み込ませる。グリシン、β−アラニン、および
グリシル−グリシン質量修飾ヌクレオチド間の質量差
は、取り込ませたヌクレオチド当たりそれぞれ５８．０
６、７２．０９、および１１５．１ダルトンである。
【０１３２】５’−Ｏ−（４，４−ジメトキシトリチ
ル）−３’−アミノ−２’，３’−ジデオキシチミジン
（公表されている方法により取得する、実施例１２を参
照せよ）で出発する場合には、対応する３’−（Ｎ−グ
リシル）−３’−アミノ−／３’−（−Ｎ−グリシル−
グリシル）−３’−アミノ／および３’−（Ｎ−β−ア
ラニル）−３’−アミノ−２’，３’−ジデオキシチミ
ジン−５’−三リン酸を取得することができる。これら
の質量間変化ヌクレオシド三リン酸はサンガーのＤＮＡ
配列決定用反応における停止用ヌクレオチド単位として
役立ち、多重配列決定用モードにおいて用いる際には停
止化フラグメント当たり、それぞれ５８．０６、７２．
０９、および１１５．１ダルトンの質量差を生じる。そ
の後にこの質量修飾フラグメントをＥＳおよび／または
ＭＡＬＤＩマススペクトロメトリーにより分析すること
ができる。
【０１３３】実施例１５ 複素環塩基のＣ−５をグリシン、グリシル−グリシン、
およびβ−アラニン残基で質量修飾させたデオキシウリ
ジン−５’−三リン酸の合成 ０．２８１ｇ（１．０ｍモル）の５−（３−アミノプロ
ピニル−１）−２’−デオキシウリジン（実施例６を参
照せよ）を、５ｍｌの脱水ＤＭＦ中の０．９２７ｇ
（２．０ｍモル）のＮ−Ｆｍｏｃ−グリシンペンタフル
オロフェニルエステルもしくは０．９５５ｇ（２．０ｍ
モル）のＮ−Ｆｍｏｃ−β−アラニンペンタフルオロフ
ェニルエステルのいずれかと、０．１２９ｇのＮ，Ｎ−
ジイソプロピルエチルアミン（１７４μｌ、１．０ｍモ
ル）の存在下で室温で一晩反応させた。溶媒を減圧下で
の蒸発により除去し、そしてこの縮合生成物をシリカゲ
ル上でのフラッシュクロマトグラフィー（Ｓｔｉｌｌ
ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ． ４３、２９２３
−２９２５（１９７８））により精製した。
【０１３４】収率は、グリシンについては４７６ｍｇ
（０．８５ｍモル：８５％）、そしてβ−アラニン誘導
体については４３６ｍｇ（０．７６ｍモル；７６％）で
あった。
【０１３５】グリシル−グリシン誘導体の合成について
は、１．０ｍモルのＦｍｏｃ−グリシン−デオキシウリ
ジン誘導体のＦｍｏｃ基を、室温下、ＤＭＦ中の２０％
のピペリジンでの１時間の処理により除去した。溶媒を
減圧下での蒸発により除去し、この残渣をトルエンと２
回共蒸発させ、そして０．９２７ｇ（２．０ｍモル）の
Ｎ−Ｆｍｏｃ−グリシンペンタフルオロフェニルエステ
ルと縮合させ、そして既述の要領で精製した。収率は４
４５ｍｇ（０．７２ｍモル；７２％）であった。Ｆｍｏ
ｃ基でＮ−保護化させてあるグリシル−、グリシル−グ
リシル−、およびβ−アラニル−２’−デオキシウリジ
ン誘導体を、一つの容器内での反応でピリジン中の塩化
４，４−ジメトキシトリチルでのトリチル化およびピリ
ジン中の無水酢酸でのアセチル化により３’−Ｏ−アセ
チル誘導体に変換させ、そしてその後に標準法に従う８
０％酢酸水溶液での１時間の処理により脱トリチル化さ
せた。溶媒を除去し、この残渣を１００ｍｌのクロロホ
ルム中に溶かし、そして５０ｍｌの１０％重炭酸ナトリ
ウムで２回、次いで５０ｍｌの水で１回抽出し、そして
硫酸ナトリウムで脱水させ、溶媒を蒸発させ、そしてこ
の残渣をシリカゲル上でのフラッシュクロマトグンラフ
ィーにより精製した。収率はそれぞれ、グリシル−につ
いては３６１ｍｇ（０．６０ｍモル；７１％）、β−ア
ラニル−については３５１ｍｇ（０．５７ｍモル；７５
％）、そしてグリシル−グリシル−３−Ｏ’−アセチル
−２’−デオキシウリジン誘導体については３２３ｍｇ
（０．４９ｍモル；６８％）であった。
【０１３６】ＰＯＣｌ3を用いる５’−ＯＨのリン酸
化、ＤＭＦ中のテトラ（トリ−ｎ−ブチルアンモニウ
ム）ピロリン酸でのインサイチュー反応による５’−三
リン酸への変換、３’−脱−Ｏ−アセチル化、Ｆｍｏｃ
基の開裂、およびＤＥＡＥ−セファデックス（Ｓｅｐｈ
ａｄｅｘ）上での陰イオン交換クロマトグラフィーによ
る最終精製は、実施例１４に記載される要領で実施し
た。ウラシル部分のＵＶ−吸収による収率は、０．４１
ｍモルの５−（３−（Ｎ−グリシル）−アミドプロピニ
ル−１）−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸
（８４％）、０．４３ｍモルの５−（３−（Ｎ−β−ア
ラニル）−アミドプロピニル−１）−２’−デオキシウ
リジン−５’−三リン酸（７５％）、および０．３８ｍ
モルの５−（３−（Ｎ−グリシル−グリシル）−アミド
プロピニル−１）−２’−デオキシウリジン−５’−三
リン酸（７８％）であった。
【０１３７】これらの質量修飾ヌクレオシド三リン酸
を、サンガーのＤＮＡ配列決定用プライマー伸長反応中
に取り込ませた。
【０１３８】出発物質として５−（３−アミノプロピニ
ル−１）−２’，３’−ジデオキシウリジンを使用し、
そして類似の反応配列に従う場合には、対応するグリシ
ル−、グリシル−グリシル−、およびβ−アラニル−
２’，３’−ジデオキシウリジン−５’−三リン酸を、
それぞれ６９、６３、および７１％の収率で取得した。
これらの質量修飾ヌクレオシド三リン酸は、サンガーの
ＤＮＡ配列決定用反応中の鎖停止用ヌクレオチドとして
役立つ。質量修飾配列決定用ラダーをＥＳもしくはＭＡ
ＬＤＩのいずれかのマススペクトロメトリーにより分析
する。
【０１３９】実施例１６ ８−グリシル−、および８−グリシル−グリシル−２’
−デオキシアデノシン−５’−三リン酸の合成 実施例１０および１１、ならびに刊行物（Ｋｏｅｓｔｅ
ｒ et al、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３７、３６２（１
９８１））に従って製造した７２７ｍｇ（１．０ｍモ
ル）のＮ6−（４−第三級−ブチルフェノキシアセチ
ル）−８−グリシル−５’−（４，４−ジメトキシトリ
チル）−２’−デオキシアデノシンもしくは８００ｍｇ
（１．０ｍモル）のＮ6−（４−第三級−ブチルフェノ
キシアセチル）−８−グリシル−グリシル−５’−
（４，４−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシアデ
ノシンを、実施例１４に記載される要領で、一つの容器
内での反応で、３’−ＯＨをピリジン中の無水酢酸でア
セチル化させ、８０％の酢酸で５’−位を脱トリチル化
させ、そしてＰＯＣｌ3を用いるリン酸化およびテトラ
（トリ−ｎ−ブチルアンモニウム）ピロリン酸を用いる
インサイチューでの反応を介して５’−三リン酸へと変
換させた。グリシン残基におけるＮ6−第三級−ブチル
フェノキシアセチル、３’−Ｏ−アセチル、およびＯ−
メチル基の脱保護化は、室温下で９０分間、濃厚なアン
モニア水溶液を用いて実施した。アンモニアを凍結乾燥
により除去し、そして残渣をジクロロメタンで洗浄し、
溶媒を減圧下で除去して、そして残存する固形物質を、
０．１−１．０Ｍの重炭酸トリエチルアンモニウムの直
線濃度勾配液を用いるＤＥＡＥ−セファデックス（Ｓｅ
ｐｈａｅｘ）上での陰イオン交換クロマトグラフィーに
より精製した。ヌクレオシド三リン酸含有性分画（ポリ
エチレンイミンセルロースプレート上でのＴＬＣにより
検査する）を合わせ、そして凍結乾燥させた。８−グリ
シル−２’−デオキシアデノシン−５’−三リン酸（ア
デニン部分のＵＶ−吸収により決定する）の収率は５７
％（０．５７ｍモル）であった。８−グリシル−グリシ
ル−２’−デオキシアデノシン−５’−三リン酸の収率
は５１％（０．５１ｍモル）であった。
【０１４０】これらの質量修飾ヌクレオシド三リン酸
は、サンガーのＤＮＡ配列決定用反応の際のプライマー
伸長中に取り込ませた。
【０１４１】出発物質として標準法（例えば、２’，
３’−官能基の導入については、Ｓｅｅｌａ ｅｔ ａ
ｌ．、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ
７４、１０４８−１０５８（１９９１）、を参照せよ）
に従って製造した対応するＮ6−（４−第三級−ブチル
フェノキシアセチル）−８−グリシル−もしくはグリシ
ル−グリシル−５’−Ｏ−（４，４−ジメトキシトリチ
ル）−２’，３’−ジデオキシアデノシン誘導体を用
い、そして既述の要領で類似する反応配列を用いる場
合、鎖停止用の質量修飾ヌクレオシド三リン酸８−グリ
シル−および８−グリシル−グリシル−２’，３’−ジ
デオキシアデノシン−５’−三リン酸を、各々５３およ
び４７％の収率で取得した。この質量修飾配列決定用フ
ラグメントラダーは、ＥＳもしくはＭＡＬＤＩのいずれ
かのマススペクトロメトーにより分析する。
【０１４２】実施例１７ 鎖伸長用の２’−デオキシ−および鎖停止用の２’，
３’−ジデオキシチミジン−５’−（アルファー−Ｓ
−）−三リン酸の取り込み、ならびに２−ヨードエタノ
ールおよび３−ヨードプロパノールでの後続のアルキル
化によるサンガーのＤＮＡ配列決定用フラグメントラダ
ーの質量修飾 ２’，３’−ジデオキシチミジン−５’−（アルファー
−Ｓ−）−三リン酸は、公表されている方法（例えば、
アルファー−Ｓ−三リン酸部分については：Ｅｃｋｓｔ
ｅｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １
５、１６８５（１９７６）およびＡｃｃｏｕｎｔｓ Ｃ
ｈｅｍ．Ｒｅｓ． １２、２０４（１９７８）、ならび
に２’，３’−ジデオキシ部分については：Ｓｅｅｌａ
ｅｔ ａｌ．、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａ
ｃｔａ、７４、１０４８−１０５８（１９９１）、を参
照せよ）に従って製造した。２’−デオキシチミジン−
５’−（アルファー−Ｓ）−三リン酸を利用するサンガ
ーのＤＮＡ配列決定用反応は、標準法（例えば、Ｅｃｋ
ｓｔｅｉｎ）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５
４、３６７（１９８５））に従って実施する。２’，
３’−ジデオキシチミジン−５’−（アルファー−Ｓ）
−三リン酸を用いる場合には、標準的なサンガーのＤＮ
Ａ配列決定法（例えば、Ｓｗｅｒｄｌｏｗ ｅｔ ａ
ｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８、１
４１５−１４１９（１９９０）、を参照せよ）における
未修飾の２’，３’−ジデオキシチミジン−５’−三リ
ン酸の代わりにこれを用いる。鋳型（２ｐモル）および
実施例１に従って修飾させたＭ１３配列決定用プライマ
ー（４ｐモル）を、１００μｌの１０ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ ｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、５０ｍＭのＮａ
Ｃｌ、７ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）中で６５
℃に５分間加熱し、そして１時間の期間をかけてゆっく
りと３７℃に戻すことによりアニールさせる。この配列
決定用反応混合物は、Ｔ−特異的停止反応を例にする
と、１５０μｌの最終容量中に、各２００μＭの（最終
濃度）ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、３００ｐＭのｃ
７−デアザ−ｄＧＴＰ、５μＭの２’，３’−ジデオキ
シチミジン−５’−（アルファー−Ｓ）−三リン酸およ
び４０単位のセクアナーゼ（Ｓｅｑｕａｎａｓｅ）（Ｕ
ｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ
社）を含む。重合を３７℃下で１０分間実施し、この反
応混合物を７０℃に加熱してセクアナーゼ（Ｓｅｑｕａ
ｎａｓｅ）を不活化させ、エタノール沈殿を行い、そし
て実施例１に記載する要領でチオール化セクエロン（Ｓ
ｅｑｕｅｌｏｎ）膜ディスク（直径８ｍｍ）に結合させ
る。アルキル化は、実施例１に記載される要領で、ＮＭ
Ｍ（Ｎ−メチルモルホリン／水／２−プロパノール、２
／４９／４９ ｖ／ｖ／ｖ）中の１０μｌの１０ｍＭ２
−ヨードエタノールもしくは３−ヨードプロパノールの
いずれかの溶液でそのディスクを処理すること（３
回）、１０μｌのＮＭＭでの洗浄（３回）、およびＤＴ
Ｔでの処理による支持体からのアルキル化Ｔ−停止化プ
ライマー伸長産物を開裂させることにより実施する。質
量修飾フラグメントファミリーの分析は、ＥＳもしくは
ＭＡＬＤＩのいずれかのマススペクトロメトリーを用い
て実施する。
【０１４３】実施例１８ オリゴチミジン酸の混合物の分析 オリゴチミジン酸であるオリゴｐ（ｄＴ）12-18は市販
品として入手することができる（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａ
ｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｃｌｅｖｅｌａｎ
ｄ、ＯＨ）。一般的には、エタノール中の０．５Ｍのマ
トリックス溶液を調製する。３，５−ジヒドロキシ安息
香酸、シナピン酸、３−ヒドロキシピコリン酸、２，
４，６−トリヒドロキシアセトフェノンのような様々な
マトリックスをこの実施例および実施例１９−２１用に
用いる。オリゴヌクレオチドはＨＰＣＬによる精製後に
凍結乾燥させ、そして保存溶液としての１０ｐモル／μ
ｌの濃度を取得するための量を用いて超純水（Ｍｉｌｌ
ｉＱ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）中に溶かす。この濃度の
アリコート（１μｌ）もしくは超純水中の希釈物を、プ
ローブチップ（ｐｒｏｂｅ ｔｉｐ）として役立つ平ら
な金属表面上で１μｌのマトリックス溶液と混合させ、
そして冷空気を用いて送風機で乾燥させた。幾つかの実
験においては、酸形態をとる陽イオン−イオン交換ビー
ズをマトリックスと試料溶液との混合物に添加する。
【０１４４】この実施例および実施例１９−２１につい
ては、Ｖｉｓｉｏｎ ２０００（Ｆｉｎｎｉｇａｎ−Ｍ
ＡＴ社）、ＶＧ ＴｏｆＳｐｅｃ（Ｆｉｓｏｎｓ Ｉｎｓ
ｔｒｕｍｅｎｔｓ社）、Ｌａｓｅｒ Ｔｅｃ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ（Ｖｅｓｔｅｃ社）のような様々な市販の装置で
のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを取得した。この実施
例についての条件は、２５ｋＶの加速電圧を用いる直線
陰イオンモードであった。得られるＭＡＬＤＥ−ＴＯＦ
スペクトルを図１４に示す。質量検量は外部標準を用い
て行うが、これは一般的には、インシュリン、グラミシ
ジンＳ、トリプシノゲン、ウシ血清アルブミン、および
チトクロームＣのような適切な質量範囲の特定されたペ
プチドを用いることにより達成した。全てのスペクトル
とも、３３７ｎｍの波長での５ｎ秒パルスを用いる窒素
レーザーを利用して取得した。レーザーエネルギーは１
０6および１０7Ｗ／ｃｍ2の間で変化した。シグナル−
対−ノイズ比を改善するためには一般的に１０−３０の
レーザーショットの強度を累積した。
【０１４５】実施例１９ ５０量体および９９量体のマススペクトロメトリー分析 ２つの大きなオリゴヌクレオチドをマススペクトロメト
リーにより分析した。５０量体である
【化３】 およびｄＴ（ｐｄＴ）９９を用いた。これらのオリゴヌ
クレオチドは、β−シアノエチルホスホアミデートを使
用して合成し、そして公表されている方法（例えば、
Ｎ．Ｄ．Ｓｉｎｈａ、Ｊ．Ｂｉｅｒｎａｔ、Ｊ．ＭｃＭ
ａｎｕａｓ ａｎｄＫｏｅｓｔｅｒ， Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， １２， ４５３９（１９８
４））を利用し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社（Ｆｏｓｔｅｒ
Ｃｉｔｙ、ＣＡ）もしくはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ社（Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）のいずれかから
市販品として入手することができるＤＮＡ合成機、およ
びＷａｔｅｒｓ社（Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）からのＲＰ
１８逆相カラムを利用して精製した。マススペクトロメ
トリー分析用の試料は実施例１８に記載される要領で調
製した。各オリゴヌクレオチドのＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析
用に用いた条件は、５００ｆモルの各オリゴヌクレオチ
ド、５ｋＶの加速を用いる反射陽イオンモード、および
２０ｋＶの後段加速であった。得られるＭＡＬＤＩ−Ｔ
ＯＦスペクトルを積層し、そして図１５に示す。
【０１４６】実施例２０ 図２のＤＮＡ配列決定結果のシミュレーション 実施例１９に記載される５０量体（配列番号３）につい
てのサンガーのＤＮＡ配列決定法のｄＴ−停止化ネステ
ットフラグメントを代表する１３のＤＮＡ配列を実施例
１９に記載する要領で合成した。これらの試料の処理を
行い、そして５００ｆモルの各フラグメントを実施例１
８に記載される要領でＭＡＬＤＩ−ＭＳにより分析し
た。得られるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを図１６Ａ
−１６Ｍに示す。条件は、５ｋＶの加速を用いる反射陽
イオンモードおよび２０ｋＶの後段加速であった。算出
された分子量および実験的分子量を表１に示す。ＭＡＬ
ＤＩ−ＴＯＦスペトルを積層し（図１７Ａおよび１７
Ｂ）、個々のピークが１０量体と１１量体（上部パネ
ル）、ならびに３７量体と３８量体（下部パネル）との
間でさえも解像可能であることを証明した。これらの２
つのパネルは、２つの異なるスケールおよびそれぞれの
スケールで分析したスペクトルを示す。
【０１４７】実施例２１ 質量修飾オリゴヌクレオチドのＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析 １７量体を一つもしくは二つのデオキシウリジン部分の
Ｃ−５で質量修飾させた。５−［１３−（２−メトキシ
エトキシ）−トリデシネ−１−イル］−５’−Ｏ−
（４，４−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシウリ
ジン−３’−β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピ
ルホスホアミデートを使用して、実施例１９に記載され
る方法を用いて修飾１７量体を合成した。修飾１７量体
は、
【化４】 ［式中、Ｘ＝−Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ2）11−ＯＨ である］ （未修飾１７量体：分子量：５２７３） であった。
【０１４８】試料を調製し、そして５００ｆモルの各修
飾１７量体を実施例１８に記載される要領でＭＡＬＤＩ
−ＭＳを用いて分析した。用いた条件は、５ｋＶの加速
を用いる反射陽イオンモードおよび２０ｋＶの後段加速
であった。得られるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを積
層し、そして図１８に示す。
【０１４９】先に引用する引用文献および刊行物は全
て、引用することにより本明細書に取り込まれる。
【０１５０】等価物 当業者は、本明細書に記載される具体的な方法の数々の
等価物に気が付くであろうし、あるいは通常の実験程度
のものを用いてそれらを立証することができるであろ
う。このような等価物は本発明の範囲内に含まれ、そし
て以下に示す請求の範囲により保護されるものとみな
す。
【０１５１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【図面の簡単な説明】
【図１】 第１図はマススペクトロメトリーにより分析
される試料の生成法を示している。
【図２】 第２Ａ図は５０ヌクレオチド長（配列番号
３）の仮想のＤＮＡ断片の停止デオキシヌクレオシド三
リン酸としてｄｄＴＴＰを約等量的に平衡化した塩基組
成物と一緒に使用するサンガー配列決定生成物を示す。
第２Ｂ図はそのようなＤＮＡ断片混合物の理想的なマス
スペクトルを表す。
【図３】 第３ＡおよびＢ図は第２Ａおよび２Ｂと同様
に、ｄｄＡＴＰを鎖停止剤として使用した同じモデル配
列（配列番号３）のデータを表す。
【図４】 第４ＡおよびＢ図は第２Ａおよび２Ｂと同様
にｄｄＧＴＰを鎖停止剤として使用したときの同じモデ
ル配列（配列番号３）のデータを表す。
【図５】 第５ＡおよびＢ図は第２Ａおよび２Ｂと同様
に、鎖停止がｄｄＣＴＰを鎖停止剤として使用したとき
の同じモデル配列（配列番号３）のデータを表す。
【図６】 第６図は第２Ａから５Ｂの結果を要約し、４
つのネスティッド断片族とＤＮＡ配列（配列番号３）と
の間の分子量の相関を示す。
【図７】 第７ＡおよびＢ図はサンガーＤＮＡまたはサ
ンガーＲＮＡ配列決定のいずれかのための、質量−修飾
配列決定核酸プライマーまたはタグ配列決定プローブの
一般的構造を説明する。
【図８】 第８ＡおよびＢ図はサンガーＤＮＡまたはサ
ンガーＲＮＡ配列決定のいずれかのための、質量−修飾
三リン酸の一般的構造物を表す。鎖−伸長および鎖−停
止ヌクレオシド三リン酸を示している。
【図９】 第９図は様々な結合化学（Ｘ）を、ポリエチ
レングリコールまたは三級モノアルキル化ポリエチレン
グリコール（Ｒ）を例として説明する。
【図１０】 第１０図は第８Ａおよび８Ｂ図に示すよう
な同様な結合化学を説明し、そして種々のマス修飾部分
（Ｒ）を表す。
【図１１】 第１１図は多重マススペクトロメトリー配
列決定法がどのようにして作用するかを質量−修飾核酸
プライマー（ＵＰ）を使用して概説する。
【図１２】 第１２図は質量−修飾鎖−伸長および／ま
たは停止ヌクレオシド三リン酸を使用して多重マススペ
クトロメトリー配列決定法の工程を表す。
【図１３】 第１３図は質量−修飾タグ配列特異的プロ
ーブのハイブリダイゼーションが関与する多重マススペ
クトロメトリー配列決定法を表す。
【図１４】 第１４図はオリゴチミジル酸、ｄ（ｐＴ）
12-18混合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＥスペクトルを表す。
【図１５】 第１５図は５０−ｍｅｒの（配列番号３）
（５００ｆｍｏｌ）およびｄＴ（ｐｄＴ）９９（５００
ｆｍｏｌ）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＥスペクトルの重複を示
す。
【図１６】 第１６Ａ−Ｍ図は１３ＤＮＡ配列のＭＡＬ
ＤＩ−ＴＯＦスペクトルを表す。
【図１７】 第１７ＡおよびＢ図は第１６図のスペクト
ルの重複を表す。
【図１８】 第１８図は実施例２１に記載した質量−修
飾オリゴヌクレオチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析からの
重複ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを表す。
【図１９】 第１９図は強力な静電的相互作用を介する
固体支持体（Ｐ）と核酸プライマー（ＮＡ）間の種々の
結合化学を説明する。
【図２０】 第２０ＡおよびＢ図は電荷移動受容体
（Ａ）および電荷移動供与体（Ｄ）間の電荷移動複合体
を介する固体支持体（Ｐ）と核酸プライマー（ＮＡ）間
の種々の結合化学を説明する。
【図２１】 第２１図は安定な有機基を介する固体支持
体（Ｐ）と核酸プライマー（ＮＡ）間の種々の結合化学
を説明する。
【図２２】 第２２図はワトソン−クリック塩基対を介
する固体支持体（Ｐ）と核酸プライマー（ＮＡ）間の可
能な結合化学を説明する。
【図２３】 第２３図は光分解的（photolytically）開
裂性結合を介する固体支持体（Ｐ）と核酸プライマー
（ＮＡ）間の可能な結合化学を説明する。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１５年２月１９日（２００３．２．１
９）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】 第１図はマススペクトロメトリーにより分析
される試料の生成法を示している。
【図２Ａ】 第２Ａ図は５０ヌクレオチド長（配列番号
３）の仮想のＤＮＡ断片の停止デオキシヌクレオシド三
リン酸としてｄｄＴＴＰを約等量的に平衡化した塩基組
成物と一緒に使用するサンガー配列決定生成物を示す。
【図２Ｂ】 第２Ｂ図はそのようなＤＮＡ断片混合物の
理想的なマススペクトルを表す。
【図３Ａ】 第３Ａは第２Ａと同様に、ｄｄＡＴＰを鎖
停止剤として使用した同じモデル配列（配列番号３）の
データを表す。
【図３Ｂ】 第３Ｂ図は第２Ｂと同様に、ｄｄＡＴＰを
鎖停止剤として使用した同じモデル配列（配列番号３）
のデータを表す。
【図４Ａ】 第４Ａ図は第２Ａと同様にｄｄＧＴＰを鎖
停止剤として使用したときの同じモデル配列（配列番号
３）のデータを表す。
【図４Ｂ】 第４Ｂ図は第２Ｂと同様にｄｄＧＴＰを鎖
停止剤として使用したときの同じモデル配列（配列番号
３）のデータを表す。
【図５Ａ】 第５Ａ図は第２Ａと同様に、鎖停止がｄｄ
ＣＴＰを鎖停止剤として使用したときの同じモデル配列
（配列番号３）のデータを表す。
【図５Ｂ】 第５Ｂ図は第２Ｂと同様に、鎖停止がｄｄ
ＣＴＰを鎖停止剤として使用したときの同じモデル配列
（配列番号３）のデータを表す。
【図６】 第６図は第２Ａから５Ｂの結果を要約し、４
つのネスティッド断片族とＤＮＡ配列（配列番号３）と
の間の分子量の相関を示す。
【図７Ａ】 第７Ａ図はサンガーＤＮＡまたはサンガー
ＲＮＡ配列決定のいずれかのための、質量−修飾配列決
定核酸プライマーまたはタグ配列決定プローブの一般的
構造を説明する。
【図７Ｂ】 第７Ｂ図はサンガーＤＮＡまたはサンガー
ＲＮＡ配列決定のいずれかのための、質量−修飾配列決
定核酸プライマーまたはタグ配列決定プローブの一般的
構造を説明する。
【図８Ａ】 第８Ａ図はサンガーＤＮＡまたはサンガー
ＲＮＡ配列決定のいずれかのための、質量−修飾三リン
酸の一般的構造物を表す。鎖−伸長および鎖−停止ヌク
レオシド三リン酸を示している。
【図８Ｂ】 第８Ｂ図はサンガーＤＮＡまたはサンガー
ＲＮＡ配列決定のいずれかのための、質量−修飾三リン
酸の一般的構造物を表す。鎖−伸長および鎖−停止ヌク
レオシド三リン酸を示している。
【図９】 第９図は様々な結合化学（Ｘ）を、ポリエチ
レングリコールまたは三級モノアルキル化ポリエチレン
グリコール（Ｒ）を例として説明する。
【図１０】 第１０図は第８Ａおよび８Ｂ図に示すよう
な同様な結合化学を説明し、そして種々のマス修飾部分
（Ｒ）を表す。
【図１１】 第１１図は多重マススペクトロメトリー配
列決定法がどのようにして作用するかを質量−修飾核酸
プライマー（ＵＰ）を使用して概説する。
【図１２】 第１２図は質量−修飾鎖−伸長および／ま
たは停止ヌクレオシド三リン酸を使用して多重マススペ
クトロメトリー配列決定法の工程を表す。
【図１３】 第１３図は質量−修飾タグ配列特異的プロ
ーブのハイブリダイゼーションが関与する多重マススペ
クトロメトリー配列決定法を表す。
【図１４】 第１４図はオリゴチミジル酸、ｄ（ｐＴ）
12-18混合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＥスペクトルを表す。
【図１５】 第１５図は５０−ｍｅｒの（配列番号３）
（５００ｆｍｏｌ）およびｄＴ（ｐｄＴ）９９（５００
ｆｍｏｌ）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＥスペクトルの重複を示
す。
【図１６Ａ】 第１６Ａ図はＤＮＡ配列のＭＡＬＤＩ−
ＴＯＦスペクトルを表す。
【図１６Ｂ】 第１６Ｂ図はＤＮＡ配列のＭＡＬＤＩ−
ＴＯＦスペクトルを表す。
【図１６Ｃ】 第１６Ｃ図はＤＮＡ配列のＭＡＬＤＩ−
ＴＯＦスペクトルを表す。
【図１６Ｄ】 第１６Ｄ図はＤＮＡ配列のＭＡＬＤＩ−
ＴＯＦスペクトルを表す。
【図１６Ｅ】 第１６Ｅ図はＤＮＡ配列のＭＡＬＤＩ−
ＴＯＦスペクトルを表す。
【図１６Ｆ】 第１６Ｆ図はＤＮＡ配列のＭＡＬＤＩ−
ＴＯＦスペクトルを表す。
【図１６Ｇ】 第１６Ｇ図はＤＮＡ配列のＭＡＬＤＩ−
ＴＯＦスペクトルを表す。
【図１６Ｈ】 第１６Ｈ図はＤＮＡ配列のＭＡＬＤＩ−
ＴＯＦスペクトルを表す。
【図１６Ｉ】 第１６Ｉ図はＤＮＡ配列のＭＡＬＤＩ−
ＴＯＦスペクトルを表す。
【図１６Ｊ】 第１６Ｊ図はＤＮＡ配列のＭＡＬＤＩ−
ＴＯＦスペクトルを表す。
【図１６Ｋ】 第１６Ｋ図はＤＮＡ配列のＭＡＬＤＩ−
ＴＯＦスペクトルを表す。
【図１６Ｌ】 第１６Ｌ図はＤＮＡ配列のＭＡＬＤＩ−
ＴＯＦスペクトルを表す。
【図１６Ｍ】 第１６Ｍ図はＤＮＡ配列のＭＡＬＤＩ−
ＴＯＦスペクトルを表す。
【図１７Ａ】 第１７Ａ図は第１６図のスペクトルの重
複を表す。
【図１７Ｂ】 第１７Ｂ図は第１６図のスペクトルの重
複を表す。
【図１８】 第１８図は実施例２１に記載した質量−修
飾オリゴヌクレオチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析からの
重複ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを表す。
【図１９】 第１９図は強力な静電的相互作用を介する
固体支持体（Ｐ）と核酸プライマー（ＮＡ）間の種々の
結合化学を説明する。
【図２０Ａ】 第２０Ａ図は電荷移動受容体（Ａ）およ
び電荷移動供与体（Ｄ）間の電荷移動複合体を介する固
体支持体（Ｐ）と核酸プライマー（ＮＡ）間の種々の結
合化学を説明する。
【図２０Ｂ】 第２０Ｂ図は電荷移動受容体（Ａ）およ
び電荷移動供与体（Ｄ）間の電荷移動複合体を介する固
体支持体（Ｐ）と核酸プライマー（ＮＡ）間の種々の結
合化学を説明する。
【図２１】 第２１図は安定な有機基を介する固体支持
体（Ｐ）と核酸プライマー（ＮＡ）間の種々の結合化学
を説明する。
【図２２】 第２２図はワトソン−クリック塩基対を介
する固体支持体（Ｐ）と核酸プライマー（ＮＡ）間の可
能な結合化学を説明する。
【図２３】 第２３図は光分解的（photolytically）開
裂性結合を介する固体支持体（Ｐ）と核酸プライマー
（ＮＡ）間の可能な結合化学を説明する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図６】
【図１６Ａ】
【図２３】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図１６Ｂ】
【図１６Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ｂ】
【図８Ａ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１４】
【図１３】
【図１５】
【図１６Ｄ】
【図１６Ｅ】
【図１６Ｆ】
【図１６Ｇ】
【図１６Ｈ】
【図１６Ｉ】
【図１６Ｊ】
【図１６Ｋ】
【図１６Ｌ】
【図１６Ｍ】
【図１８】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１９】
【図２０Ａ】
【図２２】
【図２０Ｂ】
【図２１】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA01 CA11 EA04 HA19 4B063 QA13 QQ42 QQ52 QR08 QR33 QR42 QR56 QR63 QR82 QS25 QS32 QS36 QX10

Claims (41)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 磁気ビーズ、セルロースビーズ、ポリス
    チレンビーズ、調製孔ガラス(Controlled Pore Glass)
    (ＣＰＧ)、シリカゲルビーズ、セファロース(ＳＥＰＨ
    ＡＲＯＳＥ)ビーズ、セファデックス(ＳＥＰＨＡＤＥ
    Ｘ)ビーズ、毛細管、ポリエチレンの重合シート、ポリ
    プロピレンの重合シート、ポリアミドの重合シート、ポ
    リエステルの重合シート、二フッ化ポリビニリデンの重
    合シート、ガラス製プレート、および金属表面からなる
    群より選択される固体支持体であって、該固体支持体
    が、プライマーの連結基Ｌと相互作用することが可能で
    あり、、該プライマーを該固体支持体に可逆的に連結さ
    せ、そして酵素的、化学的、もしくは物理的に開裂可能
    である、連結用官能基Ｌ'を有する、固体支持体。
  2. 【請求項２】 連結Ｌ−Ｌ'が、光開裂可能な結合、強
    力な静電相互作用に基づく結合、トリチルエーテル結
    合、β−ベンゾイルプロピオニル基、レブリニル基、ジ
    スルフィド結合、アルギニン／アルギニン結合、リシン
    ／リシン結合、ピロリン酸結合、およびワトソン−クリ
    ック(Watson-Crick)塩基対からなる群より選択される、
    請求項１に記載の固体支持体。
  3. 【請求項３】 あるプライマーを可逆的に結合させるた
    めに各ウェル内に請求項１の固体支持体を含む、官能基
    付加させた膜で改造してあるマイクロタイタープレート
    を含む固体支持体。
  4. 【請求項４】 少なくとも二つの質量修飾ヌクレオチド
    を含む、イオン化および揮発させた質量修飾核酸分子で
    あり、この場合、分子は陽性に荷電しているものであ
    る、分子。
  5. 【請求項５】 分子が陽性に荷電している、少なくとも
    一つの質量修飾ヌクレオチドを含む、イオン化される質
    量修飾された核酸分子であって、該分子が、陽性に荷電
    しており、そして質量修飾ユニバーサルプライマーおよ
    び質量修飾イニシエーターオリゴヌクレオチドからなる
    群から選択されるメンバーを含む、イオン化される質量
    修飾された核酸分子。
  6. 【請求項６】 ヌクレオチドの複素環塩基に結合した質
    量修飾官能基(Ｍ)を含む少なくとも一つの質量修飾ヌク
    レオチドを含む、請求項４に記載のイオン化質量修飾核
    酸分子。
  7. 【請求項７】 Ｃ−５を修飾させたシトシン部分、Ｃ−
    ５を修飾させたチミン部分、Ｃ−５メチル基を修飾させ
    たチミン部分、Ｃ−５を修飾させたウラシル部分、Ｃ−
    ８を修飾させたアデニン部分、Ｃ−８を修飾させたｃ7
    −デアザアデニン部分、Ｃ−７を修飾させたｃ7−デア
    ザアデニン部分、Ｃ−８を修飾させたグアニン部分、Ｃ
    −８を修飾させたｃ7−デアザグアニン部分、Ｃ−７を
    修飾させたｃ7−デアザグアニン部分、Ｃ−８を修飾さ
    せたヒポキサンチン部分、Ｃ−８を修飾させたｃ7−デ
    アザヒポキサンチン部分、およびＣ−７を修飾させたｃ
    7−デアザヒポキサンチン部分からなる群より選択され
    る、修飾複素環塩基を含む少なくとも１つの質量修飾さ
    れたヌクレオチドを含む、陽性荷電イオン化質量修飾核
    酸分子。
  8. 【請求項８】 ヌクレオチドの少なくとも一つのリンに
    結合した質量修飾官能基(Ｍ)を含む少なくとも一つの質
    量修飾ヌクレオチドを含む、請求項４に記載のイオン化
    質量修飾核酸分子。
  9. 【請求項９】 ヌクレオチドの少なくとも一つの糖部分
    に結合した質量修飾官能基(Ｍ)を含む少なくとも一つの
    質量修飾ヌクレオチドを含む、陽性荷電イオン化質量修
    飾核酸分子。
  10. 【請求項１０】 核酸分子の少なくとも一つの糖部分に
    結合した質量修飾官能基(Ｍ)を含む陽性荷電イオン化質
    量修飾核酸分子であって、ここで、該糖が内部Ｃ−２'
    位、外部Ｃ−２'位、および外部Ｃ−５'位からなる群よ
    り選択される位置で修飾されている、陽性荷電イオン化
    質量修飾核酸分子。
  11. 【請求項１１】 質量修飾官能基(Ｍ)がプライマーの
    ５'−末端ヌクレオチドの少なくとも一つの糖部分に結
    合しており、該質量修飾官能基（Ｍ）が連結用官能基
    (Ｌ)である、請求項５に記載のイオン化質量修飾核酸分
    子。
  12. 【請求項１２】 分子に包含された質量修飾官能基(Ｍ)
    を含む少なくとも一つの質量修飾ヌクレオチドを含むイ
    オン化質量修飾核酸分子であって、ここで、質量修飾用
    官能基(Ｍ)が、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｓｉ(ＣＨ3)3、Ｓ
    ｉ(ＣＨ3)2(Ｃ2Ｈ5)、Ｓｉ(ＣＨ3)(Ｃ2Ｈ5)2、Ｓｉ(Ｃ2
    Ｈ5)3、ＣＨ2Ｆ、ＣＨＦ2、およびＣＦ3からなる群より
    選択される、イオン化質量修飾核酸分子。
  13. 【請求項１３】 組中の各標識プローブが少なくとも一
    組の塩基特異的停止化フラグメント内に存在する標識配
    列にワトソン−クリック(Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ)の
    塩基対形成により相補的となるヌクレオチドの配列を含
    む；各標識プローブが相補的である標識配列が各標識プ
    ローブに関して異なる；組中の各標識プローブが少なく
    とも一つの質量修飾ヌクレオチドを含む；そして質量修
    飾ヌクレオチドは放射性同位体標識されておらず、各標
    識プローブにおいて異なる質量修飾を有する、一組の質
    量変異(mass-differentiated)標識プローブ。
  14. 【請求項１４】 少なくとも一つの質量修飾ヌクレオチ
    ドが複素環塩基に連結した質量修飾官能基(Ｍ)を含む、
    請求項１３に記載の前記の組の質量変異標識プローブ。
  15. 【請求項１５】 質量修飾複素環塩基が、Ｃ−５を修飾
    させたシトシン部分、Ｃ−５を修飾させたチミン部分、
    Ｃ−５のメチル基を修飾させたチミン部分、Ｃ−５を修
    飾させたウラシル部分、Ｃ−８を修飾させたアデニン部
    分、Ｃ−８を修飾させたｃ7−デアザアデニン部分、Ｃ
    −７を修飾させたｃ7−デアザアデニン部分、Ｃ−８を
    修飾させたグアニン部分、Ｃ−８を修飾させたｃ7−デ
    アザグアニン部分、Ｃ−７を修飾させたｃ7−グアニン
    部分、Ｃ−８を修飾させたヒポキサンチン部分、Ｃ−８
    を修飾させたｃ7−デアザヒポキサンチン部分、および
    Ｃ−７を修飾させたｃ7−デアザヒポキサンチン部分か
    らなる群より選択される、請求項１４に記載の前記の組
    の質量変異標識プローブ。
  16. 【請求項１６】 少なくとも一つの質量修飾ヌクレオチ
    ドが、標識プローブのヌクレオチド間連結を形成するリ
    ン原子に連結した質量修飾官能基(Ｍ)を含む、請求項１
    ３に記載の前記の組の質量変異標識プローブ。
  17. 【請求項１７】 少なくとも一つの質量修飾ヌクレオチ
    ドが、糖部分に連結した質量修飾官能基(Ｍ)を含む、請
    求項１３に記載の前記の組の質量変異標識プローブ。
  18. 【請求項１８】 少なくとも一つの標識プローブが、更
    に、対応する相補的標識配列への共有結合を可能にする
    架橋結合用の基(ＣＬ)を含む、請求項１３に記載の前記
    の組の質量変異標識プローブ。
  19. 【請求項１９】 架橋連結用の基(ＣＬ)を、光化学的に
    活性化させ、そしてプソラレンおよびエリプティシンか
    らなる群より選択される少なくとも一つの光活性化可能
    な基から取得する、請求項１８に記載の前記の組の質量
    変異標識プローブ。
  20. 【請求項２０】 少なくとも一つの標識プローブが、Ｘ
    Ｒ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｓｉ(ＣＨ3)3、Ｓｉ(ＣＨ3)2
    (Ｃ2Ｈ5)、Ｓｉ(ＣＨ3)(Ｃ2Ｈ5)2、Ｓｉ(Ｃ2Ｈ5)3、Ｃ
    Ｈ2Ｆ、ＣＨＦ2、およびＣＦ3からなる群より選択され
    る質量修飾用官能基(Ｍ)で質量修飾され、先の式中、Ｘ
    は、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−ＮＨＣ(Ｓ)−、−Ｏ
    ＣＯ(ＣＨ2)rＣＯＯ−(この場合、ｒ＝１−２０)、−Ｎ
    ＨＣＯ(ＣＨ2)rＣＯＯ−(この場合、ｒ＝１−２０)、−
    ＯＳＯ2Ｏ−からなる群より選択され、そしてＲは、
    Ｈ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔ−ブ
    チル、ヘキシル、ベンジル、ベンズヒドリル、ハロゲ
    ン、トリチル、置換トリチル、アリール、置換アリー
    ル、ポリオキシメチレン、モノアルキル化ポリオキシメ
    チレン、ポリエチレンイミン、−(ＮＨ(ＣＨ2)rＮＨＣ
    Ｏ(ＣＨ2)rＣＯ−)m−ＮＨ(ＣＨ2)r−ＮＨ−ＣＯ−(Ｃ
    Ｈ2)r−ＣＯＯＨ、−(ＮＨ(ＣＨ2)rＣＯ−)m−ＮＨ−
    (ＣＨ2)r−ＣＯＯＨ、−(Ｏ(ＣＨ2)rＣＯ−)m−Ｏ−(Ｃ
    Ｈ2)r−ＣＯＯＨ、−Ｓｉ(Ｙ)3、−(ＮＨＣＨａａＣＯ
    ＯＨ)、−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)m−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ、および−
    (ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)m−ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−Ｙからなる群より選
    択され、これらの式中、ｍは０−２００の範囲に含ま
    れ、Ｙは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、
    ｔ−ブチル、ヘキシルからなる群より選択される低級ア
    ルキル基であり、ｒは１−２０の範囲に含まれ、そして
    ａａは天然のアミノ酸のアミノ酸側鎖を表す、請求項１
    ３に記載の前記の組の質量変異標識プローブ。
  21. 【請求項２１】 プローブに包含された１またはより多
    い質量変異官能基(Ｍ)を質量変異標識プライマーに結合
    させた１またはより多い前駆体官能基(ＰＦ)から作製
    し、その前駆体官能基(ＰＦ)は、−Ｎ3、−ＮＨ2、−Ｓ
    Ｈ、−ＮＣＳ、−ＯＣＯ(ＣＨ2)rＣＯＯＨ(この場合、
    ｒ＝１−２０)、−ＮＨＣＯ(ＣＨ2)rＣＯＯＨ(この場
    合、ｒ＝１−２０)、−ＯＳＯ2ＯＨ、−ＯＣＯ(ＣＨ2)r
    Ｉ(この場合、ｒ＝１−２０)、および−ＯＰ(Ｏ−アル
    キル)Ｎ(アルキル)2からなる群より選択される、請求項
    １３に記載の前記の組の質量変異標識プローブ。
  22. 【請求項２２】 質量修飾２'−デオキシヌクレオチ
    ド、質量修飾２',３'−ジデオキシヌクレオチド、質量
    修飾ヌクレオチド、および質量修飾３'−デオキシヌク
    レオチドからなる群より選択される２またはより多い質
    量修飾ヌクレオチドを含み、２またはより多い質量修飾
    ヌクレオチドは互いに異なる、陽性荷電イオン化質量修
    飾核酸分子。
  23. 【請求項２３】 質量修飾２'−デオキシヌクレオチ
    ド、質量修飾２',３'−ジデオキシヌクレオチド、質量
    修飾ヌクレオチド、および質量修飾３'−デオキシヌク
    レオチドからなる群より選択される少なくとも一つの質
    量修飾ヌクレオチドを含み、該質量修飾核酸分子がＣ−
    ８を修飾させたｃ7−デアザアデニン部分、Ｃ−７を修
    飾させたｃ7−デアザアデニン部分、Ｃ−８を修飾させ
    たｃ7−デアザグアニン部分、Ｃ−７を修飾させたｃ7−
    デアザグアニン部分、Ｃ−８を修飾させたヒポキサンチ
    ン部分、Ｃ−８を修飾させたｃ7−デアザヒポキサンチ
    ン部分、およびＣ−７を修飾させたｃ7−デアザヒポキ
    サンチン部分からなる群より選択される修飾複素環塩基
    を含む、イオン化質量修飾核酸分子。
  24. 【請求項２４】 塩基特異的停止化核酸フラグメント内
    に存在する標識配列に結合する質量修飾標識プローブを
    含み、該質量修飾標識プローブは少なくとも一つの質量
    修飾ヌクレオチドを含む、イオン化陽性荷電二本鎖。
  25. 【請求項２５】 塩基特異的停止化核酸フラグメント内
    に存在する標識配列に結合する質量修飾標識プローブを
    含み、該質量修飾標識プローブが少なくとも一つの質量
    修飾ヌクレオチドを含み、ここで少なくとも一つの質量
    修飾ヌクレオチドは複素環塩基に連結した質量修飾官能
    基(Ｍ)を含む、イオン化二本鎖。
  26. 【請求項２６】 質量修飾標識プローブが少なくとも一
    つの質量修飾ヌクレオチドを含む；そして標識プローブ
    に包含された質量修飾官能基(Ｍ)が標識プローブのヌク
    レオチド間連結を形成するリン原子に連結している、塩
    基特異的停止化核酸フラグメント内に存在する標識配列
    に結合する質量修飾標識プローブを含む、イオン化二本
    鎖。
  27. 【請求項２７】 質量修飾標識プローブが少なくとも一
    つの質量修飾ヌクレオチドを含む；そして少なくとも一
    つの質量修飾ヌクレオチドが、糖部分に連結した質量修
    飾官能基(Ｍ)を含む、塩基特異的停止化核酸フラグメン
    ト内に存在する標識配列に結合する質量修飾標識プロー
    ブを含む、イオン化二本鎖。
  28. 【請求項２８】 質量修飾標識プローブが少なくとも一
    つの質量修飾ヌクレオチドを含む；そして標識プローブ
    が更に標識配列への共有結合を可能にする架橋結合用の
    基(ＣＬ)を含む、塩基特異的停止化核酸フラグメント内
    に存在する標識配列に結合する質量修飾標識プローブを
    含む、イオン化二本鎖。
  29. 【請求項２９】 分子に包含された質量修飾官能基(Ｍ)
    が、１またはより多い核酸プライマー、鎖伸長用ヌクレ
    オシド三リン酸または鎖停止化用ヌクレオシド三リン酸
    に連結された前駆体官能基(ＰＦ)から作製され、ここで
    その前駆体(ＰＦ)は、−Ｎ3、−ＮＨ2、−ＳＨ、−ＮＣ
    Ｓ、−ＯＣＯ(ＣＨ2)rＣＯＯＨ(この場合、ｒ＝１−２
    ０)、−ＮＨＣＯ(ＣＨ2)rＣＯＯＨ(この場合、ｒ＝１−
    ２０)、−ＯＳＯ2ＯＨ、−ＯＣＯ(ＣＨ2)rＩ(この場
    合、ｒ＝１−２０)、−ＣＯＮＨ ２、−ＮＨ−Ｃ(Ｓ)−
    ＮＨ２、ＯＰ(Ｏ−アルキル)ＯＨおよびＯ−ＣＯ−ＣＨ
    ２−ＳＨからなる群より選択される、少なくとも一つの
    質量修飾ヌクレオチドを含む、イオン化質量修飾核酸分
    子。
  30. 【請求項３０】 プローブに包含された１またはより多
    い質量修飾官能基が質量変異標識プローブに連結させた
    前駆体官能基(ＰＦ)から作製され、その前駆体は、−Ｎ
    3、−ＮＨ2、−ＳＨ、−ＮＣＳ、−ＯＣＯ(ＣＨ2)rＣＯ
    ＯＨ(この場合、ｒ＝１−２０)、−ＮＨＣＯ(ＣＨ2)rＣ
    ＯＯＨ(この場合、ｒ＝１−２０)、−ＯＳＯ2ＯＨ、−
    ＯＣＯ(ＣＨ2)rＩ(この場合、ｒ＝１−２０)、−ＣＯＮ
    Ｈ２、ーＮＨ−Ｃ(Ｓ)−ＮＨ２、ＯＰ(Ｏ−アルキル)Ｏ
    ＨおよびＯ−ＣＯ−ＣＨ２−ＳＨからなる群より選択さ
    れる、請求項１３に記載の前記の組の質量変異標識プロ
    ーブ。
  31. 【請求項３１】 標識プローブが、ＸＲ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂ
    ｒ、Ｉ、Ｓｉ(ＣＨ3)3、Ｓｉ(ＣＨ3)2(Ｃ2Ｈ5)、Ｓｉ
    (ＣＨ3)(Ｃ2Ｈ5)2、Ｓｉ(Ｃ2Ｈ5)3、ＣＨ2Ｆ、ＣＨ
    Ｆ2、およびＣＦ3からなる群より選択される質量修飾用
    官能基(Ｍ)で質量修飾され、先の式中、Ｘは、−Ｏ−、
    −ＮＨ−、−Ｓ−、−ＮＨＣ(Ｓ)−、−ＯＣＯ(ＣＨ2)r
    ＣＯＯ−(この場合、ｒ＝１−２０)、−ＮＨＣＯ(Ｃ
    Ｈ2)rＣＯＯ−(この場合、ｒ＝１−２０)、−ＯＳＯ2Ｏ
    −および−ＯＰ(Ｏ−アルキル)Ｏ−からなる群より選択
    され、そしてＲは、Ｈ、Ｎ３、メチル、エチル、プロピ
    ル、イソプロピル、ｔ−ブチル、ヘキシル、ベンジル、
    ベンズヒドリル、ハロゲン、トリチル、置換トリチル、
    アリール、置換アリール、(−ＮＨ(ＣＨ2)rＮＨＣＯ(Ｃ
    Ｈ 2)rＣＯ−)m−ＮＨ(ＣＨ２)ｒ−ＮＨ−ＣＯ−(Ｃ
    Ｈ２)ｒ−ＣＯＯＨ、(−ＮＨ(ＣＨ2)rＣＯ−)m−ＮＨ−
    (ＣＨ２)ｒ−ＣＯＯＨ、(−Ｏ(ＣＨ2)rＣＯ−)m−Ｏ−
    (ＣＨ２)ｒ−ＣＯＯＨ、−Ｓｉ(Ｙ)3、−(ＮＨＣＨａａ
    ＣＯ−)m−ＮＨＣＨａａＣＯＯＨ、−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)m
    −ＣＨ2ＣＨ2ＯＨおよび−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)m−ＣＨ 2ＣＨ
    2Ｏ−Ｙからなる群より選択され、これらの式中、ｍは
    ０−２００の範囲に含まれ、Ｙは、メチル、エチル、プ
    ロピル、イソプロピル、ｔ−ブチル、ヘキシルからなる
    群より選択される低級アルキル基であり、ｒは１−２０
    の範囲に含まれ、そしてａａは天然のアミノ酸のアミノ
    酸側鎖を表す、請求項１３に記載の前記の組の質量変異
    標識プローブ。
  32. 【請求項３２】 標識プローブが、ＸＲ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂ
    ｒ、Ｉ、Ｓｉ(ＣＨ3)3、Ｓｉ(ＣＨ3)2(Ｃ2Ｈ5)、Ｓｉ
    (ＣＨ3)(Ｃ2Ｈ5)2、Ｓｉ(Ｃ2Ｈ5)3、ＣＨ2Ｆ、ＣＨ
    Ｆ2、およびＣＦ3からなる群より選択される質量修飾用
    官能基(Ｍ)で質量修飾され、先の式中、Ｘは、−Ｏ−、
    −ＮＨ−、−Ｓ−、−ＮＨＣ(Ｓ)−、−ＯＣＯ(ＣＨ2)r
    ＣＯＯ−(この場合、ｒ＝１−２０)、−ＮＨＣ(Ｏ)、−
    ＣＯＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ(Ｓ)−ＮＨ−、−ＮＨＣＯ(Ｃ
    Ｈ2)rＣＯＯ−(この場合、ｒ＝１−２０)、−ＯＳＯ2Ｏ
    −、−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｓ−および−ＯＰ(Ｏ−アル
    キル)Ｏ−からなる群より選択され、そしてＲは、Ｈ、
    Ｎ３、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔ−
    ブチル、ヘキシル、ベンジル、ベンズヒドリル、ハロゲ
    ン、トリチル、置換トリチル、アリール、置換アリー
    ル、(ＣＨ２)ｍ−ＣＨ２−ＯＨ、(ＣＨ２)ｍ−ＣＨ２−
    Ｏ−Ｙ、(ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ)ｍ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ
    ２、−(ＮＨ(ＣＨ２)ｒＮＨＣＯ(ＣＨ２)ｒＣＯ−)ｍ−
    ＮＨ−(ＣＨ２)ｒ−ＮＨ−ＣＯ−(ＣＨ２)ｒ−ＣＯＯ
    Ｈ、−(ＮＨ(ＣＨ2)rＣＯ−)m−ＮＨ(ＣＨ２)ｒ−ＮＨ
    −ＣＯＯＨ、−(ＮＨ−ＣＨＹ−ＣＯ)m−ＮＨ−ＣＨＹ
    −ＣＯＯＨ、(−Ｏ(ＣＨ2)rＣＯ−)m−Ｏ−(ＣＨ２)ｒ
    −ＣＯＯＨ、−Ｓｉ(Ｙ)3、−(ＮＨＣＨａａＣＯ−)m−
    ＮＨＣＨａａＣＯＯＨ、ＣＨ２Ｆ、ＣＨＦ２、ＣＦ３、
    −(ＣＨ2ＣＨ 2Ｏ)m−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨおよび−(ＣＨ2Ｃ
    Ｈ2Ｏ)m−ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−Ｙからなる群より選択され、
    これらの式中、ｍは０−２００の範囲に含まれ、Ｙは、
    メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔ−ブチ
    ル、ヘキシルからなる群より選択される低級アルキル基
    であり、ｒは１−２０の範囲に含まれ、そしてａａは天
    然のアミノ酸のアミノ酸側鎖を表す、請求項１３に記載
    の前記の組の質量変異標識プローブ。
  33. 【請求項３３】 質量修飾２'−デオキシヌクレオチ
    ド、質量修飾２',３'−ジデオキシヌクレオチドおよび
    質量修飾３'−デオキシヌクレオチドからなる群からか
    らなる群から選択される少なくともひとつの質量修飾ヌ
    クレオチドを含む、陽性荷電されイオン化され、かつ揮
    発された質量修飾核酸分子。
  34. 【請求項３４】 少なくとも２の質量修飾ヌクレオチド
    を含む、イオン化され、かつ揮発された質量修飾核酸分
    子。
  35. 【請求項３５】 連結Ｌ−Ｌ'の光開裂可能な結合が、
    電荷移動錯体もしくは安定な有機性の基からなる群より
    選択される、請求項２に記載の固体支持体。
  36. 【請求項３６】 プライマーにプライマーの連結用の基
    Ｌを介して連結された連結Ｌ−Ｌ'を形成する、連結用
    官能基Ｌ'を含む固体支持体であって、ここで、ＬとＬ'
    の間の相互作用は酵素的、化学的、もしくは物理的に開
    裂可能である固体支持体、および直接プライマーに連結
    した質量修飾官能基(Ｍ)を含む、プライマー、または質
    量修飾官能基(Ｍ)を伴うヌクレオチドを含む開始核酸鎖
    を含むプライマーであって、ここで、連結Ｌ−Ｌ'は、
    光開裂可能な結合、強力な静電相互作用に基づく結合、
    トリチルエーテル結合、β−ベンゾイルプロピオニル基
    およびレブリニル基からなる群から選択されるプライマ
    ーを含む、固体支持体。
  37. 【請求項３７】 連結Ｌ−Ｌ'の光開裂可能な結合が、
    開裂により安定な有機基を形成する電荷移動複合体およ
    び部分からなる群から選択される、請求項３６に記載の
    固体支持体。
  38. 【請求項３８】 固体支持体がビーズ、毛細管、重合シ
    ート、ガラスプレートおよび金属表面からなる群から選
    択される、請求項３６に記載の固体支持体。
  39. 【請求項３９】 プライマーの連結基Ｌを介してプライ
    マーに結合し、連結Ｌ−Ｌ'を形成する連結官能基(Ｌ')
    を含み、ここでＬとＬ'の間の相互作用は酵素的、化学
    的、もしくは物理的に開裂可能である；そしてプライマ
    ーはプライマーに直接連結する質量修飾官能基(Ｍ)を含
    むか、プライマーは質量修飾官能基(Ｍ)を伴うヌクレオ
    チドを含む開始核酸鎖を含み、ここで連結Ｌ−Ｌ'は光
    開裂可能な結合または強力な静電相互作用に基づく結合
    である、固体支持体。
  40. 【請求項４０】 官能基付加させた膜で改造され、複数
    のウェルを有し、固体支持体および可逆的に連結した核
    酸プライマーを各ウェルに含む、マイクロタイタープレ
    ート。
  41. 【請求項４１】 連結基Ｌを介してプライマーに結合
    し、光開裂可能な結合Ｌ−Ｌ'を形成する連結官能基Ｌ'
    を有し、光開裂可能な結合が紫外線レーザーエネルギー
    により選択的に開裂されるように選択される、固体支持
    体。
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