JP3155279B2 - Dnaの塩基配列決定方法 - Google Patents
Dnaの塩基配列決定方法Info
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Description
しくは、PCR法を利用した、ダイレクト・トランスクリ
プトシークエンシング法によるDNAの塩基配列決定方法
に関する。
り、年々その利用範囲が広がっている〔Randall K.Saik
i et al.(1988)Science 239,487−491〕。PCR法で
は、1分子のDNA断片を増幅することもできる。PCR法で
増幅した生成物をシークエンスする方法(ダイレクト・
シークエンス法)も有用な手法である〔Corinne Wong e
t al.(1988)Nature,330,384−386〕。この方法はライ
ブラリー作製やそのスクリーニングなしに多くのサンプ
ルの配列情報を同時に得られる迅速な方法である。
の大きな問題点がある。
キシリボヌクレオシド5′トリフォスフェート(2′dN
TPs)が反応系中に残存し、これらがシークエンス反応
を妨げることである。従って、従来法では、これら残存
するプライマーと2′dNTPsは、シークエンシングの前
にPCR生成物から除去する必要があった。PCR生成物の精
製方法には種々の方法があり、例えば、電気泳動による
精製法、エタノール沈殿法、濾過法、HPLC精製法がある
〔例えば、Dorit R.L.et al.(1991)Current Protocol
s in Molecular Biology,Vol.II,John Wiley and Sons,
New York,15.2.1−15.2.11参照〕。しかし、いずれの方
法も煩雑である。
ion)である。PCR生成物が2本鎖DNAに再生してしまう
と、1本鎖のテンプレート(鋳型)ではなくなり、プラ
イマーと1本鎖テンプレート(鋳型)との間のアニーリ
ングを妨げる。再生を最小限にするための方法として、
例えば変性後の急冷、1つのプライマーのビオチレーシ
ョン(biotilation)とストレプトアビジン被覆物へのP
CR生成物の吸着、エキソヌクレアーゼの使用、非対象PC
R等が報告されている〔例えば、Barbara Bachmann et a
l.(1990)Nucleic Acid Res.Vol.18,1309参照〕。しか
し、これらの方法の殆どは、長い時間を必要とし、面倒
である。
応のプライマー及び2′デオキシリボヌクレオシド5′
トリフォスフェート(2′dNTPs)を除去することな
く、かつPCR生成物が迅速に再生する問題を回避する
為、変性自体を全く行わないで良い、全く新しいDNAの
塩基配列決定方法を提供することにある。
生成物の塩基配列を、プライマー及び/又は2′デオキ
シリボヌクレオシド5′トリフォスフェート及び/又は
その誘導体を除去することなく決定する方法であって、 RNAポリメラーゼ及び前記RNAポリメラーゼのためのプ
ロモーター配列を含む前記ポリメラーゼ連鎖反応により
増幅したDNA生成物の存在下、 ATP、GTP、CTP及びUTP又はそれらの誘導体からなるリ
ボヌクレオシド5′トリフォスフェート類並びに3′dA
TP、3′dGTP、3′dCTP、3′dUTP及びそれらの誘導体
からなる1種又は2種以上の3′デオキシリボヌクレオ
チド5′トリフォスフェート(3′dNTP誘導体)を反応
させて核酸転写生成物を得、得られる核酸転写生成物を
分離し、得られる分離分画から核酸の配列を読み取るこ
とを特徴とするDNAの塩基配列決定方法に関する。
題を解決したものであり、T7RNAポリメラーゼ等のRNAポ
リメラーゼ等とRNA転写反応のターミネーター(例え
ば、3′デオキシリボヌクレオシド5′トリフォスフェ
ート(3′dNTPs))を用いたダイレクト・トランスク
リプトシークエンス法に関する。
ンスクリプトシークエンス法によるオートラジオグラフ
ィーの結果を示す電気泳動写真である。
トランスクリプトシークエンス法によるエレクトロフェ
ログラムの結果を示す。
生成物の塩基配列を、ポリメラーゼ連鎖反応のためのプ
ライマー及び/又は2′デオキシリボヌクレオシド5′
トリフォスフェート及び/又はその誘導体を除去するこ
となく決定する方法である。
て広く用いられている方法をそのまま用いることができ
る。従って、増幅の対象であるDNA配列、プライマー、
増幅のための条件等には特に制限はない。
は1pgのクローン化されたDNA、10μMの各プライマー、
200μMの各2′デオキシリボヌクレオシド5′トリフ
ォスフェート(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)を含む20μl
容量中でDNAポリメラーゼとして、例えばTaqポリメラー
ゼ等を用いて行うことができる。
ずれか一方又は増幅された挿入(insert)DNAが、後述
するRNAポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む
必要がある。
るRNAポリメラーゼにより適宜選択することができる。
したDNA生成物からRNA転写物等の核酸転写物を合成す
る。前記のように、増幅して得られたDNA生成物は、RNA
ポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む。従っ
て、このプロモーター配列がRNA転写物等の核酸転写物
の合成の際に、RNAポリメラーゼを起動させる。
メラーゼとしては、例えばバクテリオファージRNAポリ
メラーゼ(T7、T3及びSP6等)を挙げることができる。
バクテリオファージRNAポリメラーゼは、クローン化さ
れたDNAテンプレートからRNA転写物のin vitroでの合成
に広く用いられている。これらのファージRNAポリメラ
ーゼは、それらのプロモーターから下流にDNA配列を特
異的に転写する〔P.A.Krieg et al.(1987)Methods in
Enzymology 155,397−415〕。
ーゼの存在下、ATP、GTP、CTP及びUTP又はそれらの誘導
体からなるリボヌクレオシド5′トリフォスフェート
(NTP)類、並びに1種又は2種以上の3′dNTP誘導体
を反応させる。尚、3′dNTP誘導体は、本明細書におい
ては、3′dATP、3′dGTP、3′dCTP、3′dUTP及びそ
れらの誘導体の総称として用いる。リボヌクレオシド
5′トリフォスフェート(NTP)類としては、その一部
がATP等の誘導体である場合も含めて、塩基が異なる少
なくとも4種類の化合物が転写物の合成に必要である。
但し、同じ塩基を含む2種以上の化合物を用いることは
できる。
NTP誘導体が取り込まれることにより、3′ヒドロキシ
基が欠落し、RNA又は核酸の合成が阻害される。その結
果、3′末端が3′dNTP誘導体である種々の長さのRNA
又は核酸断片が得られる。塩基の異なる4種類の3′dN
TP誘導体について、それぞれ、このようなリボヌクレオ
シド・アナログ体を得る。このリボヌクレオシド・アナ
ログ体を4通り用意することで、RNA又は核酸配列の決
定に用いることができる〔Vladimir D.Axelred er al.
(1985)Biochemistry Vol.24,5716−5723〕。
又は2種以上を用いることができる。1種のみの3′dN
TP誘導体を用いて1つの核酸転写反応を行う場合、核酸
転写反応を4回行うことで、3′末端の3′dNTP誘導体
の塩基の異なる4通りの転写生成物を得る。1回の核酸
転写反応で、3′末端の3′dNTP誘導体は同一で、分子
量の異なる種々のRNA又は核酸断片の混合物である転写
生成物が得られる。得られた4通りの転写生成物につい
て、独立に、後述する分離及び配列の読み取りに供する
ことができる。また、4通りの転写生成物の2種以上を
混合し、この混合物を分離及び配列の読み取りに供する
こともできる。
時に用いると、1つの反応生成物中に、3′末端の3′
dNTP誘導体の塩基の異なる2通り以上の転写生成物が含
まれることになる。これを後述する分離及び配列の読み
取りに供することができる。核酸転写反応に2種以上の
3′dNTP誘導体を同時に用いると、核酸転写反応操作の
回数を減らすことができるので好ましい。
トシークエンス法では、PCR法において、2種類のプラ
イマーのいずれか一方にファージプロモーター配列を持
っているプライマーを用いるか、又は増幅された挿入DN
A内にファージプロモーター配列を持たせることで、得
られるPCR生成物はそのプロモーターにより働くRNAポリ
メラーゼを用いるin vitro転写に付すことができる。
リボヌクレオシド5′トリフォスフェート類の存在下
で、RNAポリメラーゼにより行われ、かつ3′dNTP誘導
体によりターミネートされる。その結果、各塩基につい
て、RNA又は核酸ラダー(ladder)がシークエンスのた
めに生成される。
る。この分離は、転写生成物に含まれる分子量の異なる
複数の生成物分子を、分子量に応じて分離することがで
きる方法で適宜行うことができる。このような分離方法
としては、例えば電気泳動法を挙げることができる。そ
の他にHPLC等も用いることができる。
行うことができる。転写生成物を電気泳動法に付するこ
とにより得られるバンド(RNA又は核酸ラダー)からRNA
又は核酸の配列を読み取ることができる。
るリボヌクレオシド5′トリフォスフェート(NTP)類
を標識することにより行うことができる。また、RNA又
は核酸ラダーの読み取りは、転写物反応に用いる3′dN
TP誘導体を標識することにより行うこともできる。標識
としては、例えば、放射性若しくは安定同位元素又は蛍
光標識等を挙げることができる。放射性若しくは安定同
位元素で標識された3′dNTP誘導体は市販品として入手
可能である〔例えば、3′dATP(CORDYCEPIN5′−TRIPH
OSPHINE)は、SIGMA,ST.LOUIS,MO,USAからProduct No.C
9137として、BOEHRINGER MANNHEIM,Mannheim,Germanyか
らProduct No.814288として入手可能である。α−32P−
3′dATP(3′−[α−32P]−CORDYCEPIN 5′−TRIPH
OSPHINE)は、DU PONT/NEN Research Products,MA,USA
からProduct No.NEG−026として入手可能である。〕ま
た、蛍光標識された3′dNTP誘導体は、特開昭63−1523
64号、特開平7−5170号、特表平5−502371号等に記載
の方法を参照して製造することにより入手可能である。
り具体的には、標識された3′dATP、3′dGTP、3′dC
TP及び3′dUTPを用い、転写生成物を電気泳動に付して
得られるバンドの放射性若しくは安定同位元素又は蛍光
を検出することで、転写生成物の配列を読み取ることが
できる。このように3′dNTP誘導体を標識することで、
各バンド間の放射性強度又は蛍光強度にばらつきがな
く、測定が容易になる。さらに放射性若しくは安定同位
元素又は蛍光を発生するラダーの検出は、例えば、これ
までDNAシークエンシンクに用いている装置を適宜用い
て行うことができる。
たATP、GTP、CTP及びUTPを用い、電気泳動に付して得ら
れるバンドの放射性若しくは安定同位元素又は蛍光を検
出することでも転写生成物の配列を読み取ることができ
る。
P、3′dCTP及び3′dUTPを用い、末端が3′dATP、
3′dGTP、3′dCTP又は3′dUTPであり、異なる標識が
なされた種々の転写生成物断片の混合物を電気泳動に付
して得られるバンドの4種類の蛍光を検出することでRN
A又は核酸の配列を読み取ることもできる。
光で標識する。このようにして3′末端の異なる4種類
の転写生成物の混合物を電気泳動に付することで、4種
類の異なる(3′末端の3′dNTP)応じた蛍光を発する
バンドが得られ、この蛍光の違いを識別しながら、1度
に4種類のRNA又は核酸の配列を読み取ることができ
る。
写の鋳型として用いられたDNAの配列を決定することが
できる。各塩基について、それぞれラダーを形成した場
合には、4種類のラダーから得られたRNA又は核酸配列
情報を総合して、転写の鋳型として用いられらDNAの配
列を決定することができる。また、2種以上の塩基につ
いて同時にラダーを形成した場合(同一のラダー内に2
種以上の塩基のバンドが共存する場合)には、各ラダー
から得られたRNA又は核酸配列情報を総合して、転写の
鋳型として用いられたDNAの配列を決定することができ
る。特に、4種の塩基について同時にラダーを形成した
場合(同一のラダー内に4種の塩基のバンドが共存する
場合)には、1つのラダーから得られたRNA又は核酸配
列情報から、転写の鋳型として用いられたDNAの配列を
決定することができる。
く、そのままPCR生成物のDNAの塩基配列を決定すること
ができる。
クエンシングのための3′dNTPの存在下ではRNA転写反
応において試薬として消費されることがないという、RN
Aポリメラーゼの特徴によるものである。
るため、通常のDNAシークエンス法のように1本鎖テン
プレートDNAを使用する必要も、プライマーも必要がな
く、さらにシークエンシングプライマーのハイブリダイ
ズのための変性工程も必要としない。そのため、PCR生
成物の再生の影響も受けず、容易にDNAの塩基配列を決
定することができる。
クターに結合したヒトTSHβ鎖断片を用いた。このDNA断
片1pg、10μMの各プライマー〔T7プライマーとM13リバ
ースプライマー〕、200μMの各2′デオキシリボヌク
レオシド5′トリフォスフェート(dATP、dGTP、dCTP、
dTTP)を含む20μl容量中で行った。この系にTaqポリ
メラーゼ緩衝液〔50mMKCl,10mM Tris・HCl(pH8.3)、
1〜3mM MgCl2、0.01%ゼラチン〕と0.5ユニットのTaq
ポリメラーゼを添加した。
(アニーリング)で1分間、72℃(エクステンション)
で2分間とした。このサイクルに次いで、95℃で1分
間、55〜60℃で1分間、72℃で2分間のサイクルを25〜
30回おこなった。最後のエクステンションの工程は10分
間に延長した。
オキシリボヌクレオチド5′トリフォスフェートの1つ
である3′dATPの1つ、100μMの各リボヌクレオシド
5′トリフォスフェート(ATP、GTP、CTP、UTP)、0.5
μlのα−32P−UTP(3000Ci/mmol、10mCi/ml)〔Amerc
ham,Buckinghamshire,UK〕、40mM Tris・HCl(pH7.
5)、5〜10mM MgCl2、10mMジチオスレイトール、1〜
5ユニットのT7RNAポリメラーゼを含むサンプリングチ
ューブに添加し、全体量を10μlとした。
トが3′dCTP、3′dGTP又は3′dUTPの場合も同様に行
った。
た。次いで、各反応物は3μlのホルムアミドダイ(95
%ホルムアミド、10mM EDTA、0.05%ブロムフェノール
ブルー及び0.05%キシレンシアノール)と混合し、80℃
で5分間加熱し、即座に、6%シークエンスゲルにアプ
ライし、レーンに充填した。電気泳動を30Wの定電力で
2時間行った。ゲルは濾紙上で乾燥し、BAS2000イメー
ジアナライザー(FUJI)にて解析をおこなった。
前記のプロトコールにより生成した。
を得、このPCR反応生成物について以下のシークエンシ
ングを行なった。
質(テトラメチルローダミン)で標識した3′デオキシ
リボヌクレオチド5′トリフォスフェートの1つである
3′dUTPの1つ、100μMの各リボヌクレオシド5′ト
リフォスフェート(ATP、CTP、GTP、UTP)、40mM Tris
・HCl(pH7.5)、5〜10mM MgCl2、10mMジチオスレイ
トール、1〜5ユニットのT7RNAポリメラーゼを含むサ
ンプリングチューブに添加し、全体量を10μlとした。
尚、テトラメチルローダミンで標識した3′デオキシリ
ボヌクレオチド5′トリフォスフェートは後述の参考例
に示す方法により合成した。
た。次いで、フェノール/クロロホルム抽出、エタノー
ル沈殿等により過剰な蛍光標識3′dUTPを除去し、沈殿
物を3μlのホルムアミドダイ(95%ホルムアミド、10
mM EDTA)に溶解し、80℃で5分間加熱し、即座に、4
%シークエンスゲルにアプライし、ABI377蛍光自動シー
クエンサーによる泳動を7時間行った。その結果、図2
に示すように、Uのエレクトロフェログラムが前記のプ
ロトコールにより生成した。
スフェートが3′dCTP、3′dGTP又は3′dATPの場合も
同様に行うことができる。
リジン−5′−トリホスフェートの調製 1) 3′−デオキシ−5′−O−ジメトキシトリチル
ウリジン(3′−Deoxy−5′−O−dimethoxytritylur
idine)の合成 3′−デオキシウリジン(4g)、トリエチルアミン
(2.46ml)、N,N′−ジメチルアミノピリジン(0.76g)
をピリジン(100ml)に溶解し、4,4′−ジメトキシトリ
フェニルメチルクロリド(13.13g)の塩化メチレン(70
ml)溶液を加えた後室温で25時間反応させた。反応終了
後、反応液を減圧濃縮し、得られた残渣を酢酸エチルで
抽出し、抽出液を飽和食塩水で洗浄した。酢酸エチル層
を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、酢酸エチルを留去し
シリカゲルカラムクロマトグラフィ(溶出液;酢酸エチ
ル−n−ヘキサン混合溶媒)で精製して3′−デオキシ
−5′−O−ジメトキシトリチルウリジン9.04gを得た
(収率97.2%)。
−ジメトキシトリチルウリジン(2′−O−Acetyl−
3′−deoxy−5′−O−dimethoxytrityluridine)の
合成 3′−デオキシ−5′−O−ジメトキシトリチルウリ
ジン(9.02g)をピリジン(100ml)に溶解し、氷冷下無
水酢酸(30ml)を加え以後室温で一液反応させた。反応
終了後、反応液を減圧濃縮し、得られた残渣を酢酸エチ
ルで抽出し、抽出液を飽和食塩水で洗浄した。酢酸エチ
ル層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、酢酸エチルを留
去しシリカゲルカラムクロマトグラフィ(溶出液;酢酸
エチル−n−ヘキサン混合溶媒)で精製して2′−O−
アセチル−3′−デオキシ−5′−O−ジメトキシトリ
チルウリジン7.12gを得た(収率73.2%)。
(2′−O−Acetyl−3′−deoxyuridine)の合成 2′−O−アセチル−3′−デオキシ−5′−O−ジ
メトキシトリチルウリジン(7.12g)を80%酢酸に溶解
し室温で一液反応させた。反応終了後、反応液を減圧濃
縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ
ィ(溶出液;酢酸エチル−メタノール混合溶媒)で精製
し、酢酸エチル−n−ヘキサンより結晶化して2′−O
−アセチル−3′−デオキシウリジン2.58gを得た(収
率76.8%)。
3′−Ha),2.06(s,3H,CH3CO),2.17−2.23(m,1H,3′
−Hb),3.35(brs,1H,5′−OH),3.52,3.71(2dd,2H,J
=3.2,12.2;2.7,11.9,5′−Ha,b),4.20−4.30(m,1H,
4′−H),5.22−5.26(m,1H,2′−H),5.61(dd,1H,J
=2.2,8.1Hz,5−H),5.78(d,1H,J=2.7Hz,1′−H),
7.91(d,1H,J=8.1Hz,6−H),11.32(brs,1H,NH) 4) 2′−O−アセチル−3′−デオキシ−5−ヨー
ドウリジン(2′−O−Acetyl−3′deoxy−5−iodou
ridine)の合成 2′−O−アセチル−3′−デオキシウリジン(2.47
g)のアセトニトリル(150ml)溶液に硝酸二アンモニウ
ムセリウム(IV)(2.51g)とよう素(1.39g)を添加し
80℃で1時間反応させた。反応終了後、反応液を減圧濃
縮し、得られた残渣を酢酸エチルで抽出し5%亜硫酸水
素ナトリウム水と飽和食塩水で洗浄した。酢酸エチル層
を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を留去して2′
−O−アセチル−3′−デオキシ−5−ヨードウリジン
を得た(収率93.1%)。1 H−NMR(270MHZ,CDCl3)δppm:2.01−2.07(m,1H,3′
−Ha),2.12(s,1H,CH3CO),2.45−2.49(m,1H,3′−H
b),3.48−3.50(m,1H,5′−OH),3.75,4.09(2dd,2H,J
=2.7,12.7;2.0,12.4Hz,5′−Hab),4.40−4.50(m,1H,
2′−H),5.79(d,1H,J=1.9Hz,1′−H),8.28(s,1
H,6−H),9.50(brs,1H,NH) 5) 2′−O−アセチル−3′−デオキシ−5−
(3″−トリフルオロアセタミド−1″−プロピニル)
ウリジン(2′−O−Acetyl−3′−deoxy−5−
(3″−trifluoroacetamido−1″−propynyl)uridin
e)の合成 2′−O−アセチル−3′−デオキシ−5−ヨードウ
リジン(1.0g)のDMF(12.6ml)溶液に窒素気流下、N
−プロパギルトリフルオロアセタミド(0.88ml)、よう
化銅(I)(96mg)、塩化ビス(トリフェニルホスフィ
ン)パラジウム(II)(177mg)及びトリエチルアミン
(0.7ml)を加え室温で4時間反応させた。反応液を減
圧濃縮して得た残渣を塩化メチレン−メタノール混液
(40ml)に溶解しイオン交換樹脂AGlx8(Bio−Rad社
製、HCO3−型;2g)を加え30分間攪拌した。濾別後、濾
液を濃縮し得られた残渣を酢酸エチルで抽出し、飽和食
塩水で洗浄した。酢酸エチル層を無水硫酸マグネシウム
で乾燥後、溶媒を留去しシリカゲルカラムクロマトグラ
フィ(溶出液;酢酸エチル−n−ヘキサン混合溶液)で
精製して2′−O−アセチル−3′−デオキシ−5−
(3″−トリフルオロアセタミド−1″−プロピニル)
ウリジン405mgを得た(収率38.3%)。1 H−NMR(270MHZ,DMSO−d6)δppm:1.89−1.92(m,1H,
3′−Ha),2.06(s,3H,CH3CO),2.17−2.26(m,1H,3′
−Hb),3.40(brs,1H,5′−OH),3.53,3.76(2dd,2H,J
=3.1,11.9;2.7,12.1Hz,5′−Hab),4.22−4.30(m,3H,
4′−H,−CH2−),5.28−5.31(m,1H,2′−H),5.75
(d,1H,J=1.9Hz,1′−H),8.34(s,1H,6−H),10.06
(t,1H,J−5.4Hz,NHCOCF3),11.67(s,1H,NH) 6) 5−(3″−アミノ−1″−プロピニル)−3′
−デオキシウリジン−5′−トリホスフェート[5−
(3″−Amino−1″−propynyl)−3′−deoxyuridin
e−5′−triphosphate]の合成 2′−O−アセチル−3′−デオキシ−5−(3″−
トリフルオロアセタミド−1″−プロピニル)ウリジン
(42mg)を無水ピリジン(2ml)に溶解した後減圧濃縮
乾固し更に1時間デシケーター(P2O5)で乾燥した。窒
素気流下に無水ピリジン(100μl)と無水ジオキサン
(300μl)に溶解し1M−2−クロロ−4H−1,3,2−ベン
ゾジオキサフォスフォリン−4−オンのジオキサン溶液
(110μl)を加え10分間攪拌した。反応液に0.5M−ビ
ス(トリ−n−ブチルアンモニウム)ピロフォスフェー
トのDMF溶液(300μl)とトリ−n−ブチルアンモニウ
ム(100μl)を加え10分間攪拌した。次いで1%よう
素のピリジン−水(98/2,v/v)溶液を加え更に15分間攪
拌した。反応終了後5%亜硫酸水素ナトリウム水を添加
し反応液を減圧濃縮した。得られた残渣に水(10ml)を
加え30分間放置後、25%アンモニア水(20ml)を加え2
時間攪拌した。反応液を濃縮乾固して得た残渣をDEAE−
トヨパールイオン交換カラムクロマトグラフィー(東ソ
ー社製;1.2x30cm;溶出液:トリエチルアンモニウムカー
ボネート緩衝液(pH7.5)0.05M→0.5M直線濃度勾配(全
量2L))で精製して5−(3″−アミノ−1″−プロピ
ニル)−3′−デオキシウリジン−5′−トリホスフェ
ート51mgを得た(収率55%)。
ホスフェート(TMR−labeled3′−deoxyuridine−5′
−trihposhpate)の合成 5−(3″−アミノ−1″−プロピニル)−3′−デ
オキシウリジン−5′−トリホスフェート(10.5μmo
l)の1Mトリエチルアンモニウムカーボネート緩衝液(p
H9.05;1.2ml)に5−カルボキシテトラメチルローダミ
ンコハク酸イミドエステル(モレキュラープローブ社
製)(15mg)のDMF溶液(0.9ml)を加え室温で一液攪拌
した。反応液に水(30ml)を加え希釈した後、DEAE−ト
ヨパールイオン交換カラムクロマトグラフィー(1.2×3
0cm;溶出液:トリエチルアンモニウムカーボネート緩衝
液(pH7.5)0.05M→0.7M直線濃度勾配(全量2L))で精
製してTMR−標識3′−デオキシウルイジン−5′−ト
リホスフェート7.38μmolを得た(収率70.2%)。
Claims (11)
- 【請求項1】ポリメラーゼ連鎖反応により増幅したDNA
生成物の塩基配列を、プライマー及び/又は2′デオキ
シリボヌクレオシド5′トリフォスフェート及び/又は
その誘導体を除去することなく決定する方法であって、 RNAポリメラーゼ及び前記RNAポリメラーゼのためのプロ
モーター配列を含む前記ポリメラーゼ連鎖反応により増
幅したDNA生成物の存在下、 ATP、GTP、CTP及びUTP又はそれらの誘導体からなるリボ
ヌクレオシド5′トリフォスフェート類並びに3′dAT
P、3′dGTP、3′dCTP、3′dUTP及びそれらの誘導体
からなる1種又は2種以上の3′デオキシリボヌクレオ
シド2′トリフォスフェート(以下、3′dNTP誘導体と
いう)を反応させて核酸転写生成物を得、得られる核酸
転写生成物を分離し、得られる分離分画から核酸の配列
を読み取ることを特徴とするDNAの塩基配列決定方法。 - 【請求項2】リボヌクレオシド5′トリフォスフェート
類としてATP、GTP、CTP及びUTPを用いる請求項1記載の
方法。 - 【請求項3】3′デオキシリボヌクレオシド2′トリフ
ォスフェートとして3′dATP、3′dGTP、3′dCTP及び
3′dUTPを用いる請求項1記載の方法。 - 【請求項4】核酸転写反応は、異なる塩基を含む4種の
3′dNTP誘導体について、4回独立に行い、3′末端が
異なる塩基である4通りの核酸転写生成物を得る、請求
項1〜3のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項5】3′末端が異なる塩基である4通りの核酸
転写生成物を、それぞれ独立に分離するか、又は少なく
とも2通りの核酸転写生成物を混合した後に、分離す
る、請求項4記載の方法。 - 【請求項6】少なくとも1つの核酸転写反応は、異なる
塩基を含む4種の3′dNTP誘導体の内の2種以上の存在
下で行い、3′末端が異なる塩基である2通り以上の核
酸転写生成物を同時に混合状態で得る、請求項1〜3の
いずれか1項に記載の方法。 - 【請求項7】核酸転写反応は、異なる塩基を含む4種の
3′dNTP誘導体の存在下で1回行い、3′末端が異なる
塩基である4通りの核酸転写生成物を同時に混合状態で
得る、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項8】核酸転写生成物の分離を電気泳動法により
行う請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項9】リボヌクレオシド5′トリフォスフェート
類が標識されており、分離分画からの核酸の配列の読み
取りを、標識からのシグナルを検出することにより行う
請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項10】3′dNTP誘導体が標識され、分離分画か
らの核酸の配列の読み取りを、標識からのシグナルを検
出することにより行う請求項1〜8のいずれか1項に記
載の方法。 - 【請求項11】標識が放射性若しくは安定同位元素又は
蛍光標識である請求項9又は10記載の方法。
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