JP3486660B2

JP3486660B2 - プロパルギルエトキシアミノヌクレオチド

Info

Publication number: JP3486660B2
Application number: JP50970198A
Authority: JP
Inventors: エイチ．カン，シャヒール; エム．メンチェン，スティーブン; ビー．ローゼンブルム，バーネット
Original assignee: アプレラコーポレイション
Priority date: 1996-08-13
Filing date: 1997-08-13
Publication date: 2004-01-13
Anticipated expiration: 2017-08-13
Also published as: DE69703298T2; US20060286561A1; AU703281B2; WO1998006732A1; US5821356A; EP0915901B1; US7019128B2; ATE196912T1; EP0915901A1; DE69703298D1; CA2230059C; AU4039097A; CA2230059A1; US20020045180A1; US6504024B2; US20030148470A1; JPH11513044A; US6248568B1

Description

【発明の詳細な説明】発明の分野本発明は、一般に、ポリメラーゼ酵素に対する基質と
して有用なヌクレオチド化合物およびそれらから得られ
るポリヌクレオチドに関する。より詳細には、本発明
は、プロパルギルエトキシアミノクレオチド、および、
熱安定ポリメラーゼに対する基質として有用な蛍光標識
ヌクレオチドの調製におけるそれらの使用、特に、蛍光
に基づくDNA配列決定法での鎖終結基質としての蛍光標
識ヌクレオチドの調製におけるそれらの使用に関する。

参考文献［Ｆ］dNTP Reagents Protocol,PE Applied Biosyste
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きわめて重要な技術となっており、基礎生物学的研究か
ら治療薬用の薬剤開発におよぶ分野に関する情報を提供
する。収集されるべきDNA配列データが莫大な量である
ため、自動化技術が、情報処理量を増加し、DNA配列決
定法の経費を減少するために、開発されてきた（Smith;
Connell;Trainor）。

好ましい自動DNA配列決定法は、Sangerによって開発
された酵素的複製技術に基づいている（Sanger）。Sang
erの技術では、一本鎖テンプレートDNAのDNA配列を、１
セットのポリヌクレオチドフラグメントを合成するため
のDNAポリメラーゼを使用して決定する。ここで、それ
らのフラグメントは、（ｉ）テンプレート配列に相補的
な配列を有し、（ii）一つのヌクレオチドで長さが変化
し、そして（iii）既知ヌクレオチド、例えば、Ａ、
Ｃ、Ｇ、またはＴで終わる5'末端を有する。この方法で
は、オリゴヌクレオチドプライマーは、配列決定される
べきテンプレートDNAの3'末端にアニールされ、プライ
マーの3'末端は、相補的ポリヌクレオチドフラグメント
のポリメラーゼ媒介ポリマー化のための開始部位として
作用する。酵素的ポリマー化工程は、テンプレート−プ
ライマーハイブリッドを、４つの天然デオキシヌクレオ
チド（「dNTP」）、DNAポリメラーゼ酵素、および2',3'
−ジデオキシヌクレオチドトリホスフェート（「ddNT
P」）「ターミネーター」と混合させて実施される。タ
ーミネーターの組み込みは、3'末端にヒドロキシ基を欠
き、従ってさらに伸長され得ないフラグメントを形成す
る。すなわち、そのフラグメントは「終結される」。組
み込みについてのddNTPと対応のdNTPとの競合は、異な
る大きさのフラグメントの分布をもたらし、各フラグメ
ントは、反応で使用される特定のターミネーターによっ
て終結する。テンプレートの全DNA配列を決定するため
に、４つの並行反応を実施する。各反応は、異なるddNT
Pターミネーターを使用する。フラグメントの大きさの
分布を決定するために、それらのフラグメントを電気泳
動によって分離して、一つのヌクレオチドで大きさが異
なるフラグメントを分離する。

従来のSanger技術の最近の変法では、ヌクレオチドタ
ーミネーターは蛍光色素で標識され（Prober;Hobbs）、
熱安定DNAポリメラーゼ酵素が使用されている（Murra
y）。いくつかの利点が、色素標識ターミネーターを使
用して確認されている：（ｉ）放射性アイソトープの貯
蔵、使用、および処分に関する問題が排除されている；
（ii）色素標識プライマーを合成する必要性が排除され
ている；および（iii）Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴヌクレオ
チドの各々に対する個別色素標識を使用する場合、４つ
の全反応が１つのチューブ中で同時に実施され得る。熱
安定ポリメラーゼ酵素の使用は、（ｉ）より配列依存性
の少ない人工物に起因するテンプレートの二次構造を崩
壊する上昇された温度で実施される重合反応を可能に
し；および、（ii）産生される伸長産物を直線的に増幅
し、配列を得るために必要とされるDNAテンプレート量
を減少するように作用する、温度変化が繰り返される配
列決定反応を可能にする。

Sanger配列決定法の最近のこれらの変法が有効に提供
されてきた一方、その性能および経済性の最適化に関す
るいくつかの問題が残存する。色素標識ターミネーター
と熱安定ポリメラーゼ酵素との組み合わせ、特にフルオ
レセイン型色素標識との組み合わせでの使用で生じる１
つの問題は、非標識dNTPに対して大過剰（最大比率50:
1）の色素標識ターミネーターが要求されることであ
る。この大過剰色素標識ターミネーターは、電気泳動分
離工程を実施する前に、配列決定反応産物を精製する必
要がある。この除去工程は、組み込まれなかった標識タ
ーミネーター種および真の配列決定フラグメントの同時
移動により生じる妨害を除外するために要求される。代
表的な除去法は、エタノール沈澱法またはクロマトグラ
フ分離法（ABI PRISM^TM Dye Terminator Cycle Sequenc
ing Core Kit Protocol）を包含する。このような除去
工程は、配列決定反応産物が、直接に電気泳動分離プロ
セスへ移される、全自動配列決定システムの開発作業
を、非常に困難にする。熱安定ポリメラーゼと組み合わ
せた現在入手可能な色素標識ターミネーターを使用する
場合に生じる第二の問題は、Sanger型DNA配列決定にお
いて、不均等な分布のピークの高さが得られることであ
る。

発明の要旨本発明は、プライマー伸長反応、例えば、Sanger型DN
A配列決定またはPCR反応における、鎖終結ジデオキシヌ
クレオチドとして、および鎖伸長デオキシヌクレオチド
として有用な、新規クラスのプロパルギルエトキシアミ
ノヌクレオチドの我々の発見に向けられている。

本発明の目的は、標識鎖終結ヌクレオチドを形成する
のに使用され得るヌクレオチドを提供することである。

本発明のさらなる目的は、標識を含む鎖終結ヌクレオ
チドを提供することである。

本発明のさらなる目的は、蛍光標識を含む鎖終結ヌク
レオチドを提供することであり、ここで、このような標
識鎖終結ヌクレオチドの、非標識鎖終結ヌクレオチドに
対する減少された過剰濃度が、Sanger型DNA配列プロセ
スにおいて要求される。

本発明の別の目的は、Sanger型DNA配列決定プロセス
において、より均等なピーク高さの分布をもたらす、標
識鎖終結ヌクレオチドを提供することである。

本発明の目的は、標識鎖伸長デオキシヌクレオチドを
形成するのに使用され得る、ヌクレオチドを提供するこ
とである。

本発明のさらなる目的は、標識を含む鎖伸長デオキシ
ヌクレオチドを提供することである。

本発明のさらなる目的は、本発明のプロパルギルエト
キシアミノヌクレオチドを使用する、プライマー伸長反
応を包含する方法を提供することである。

第一の局面では、前述およびその他の本発明の目的
が、下記の構造を有するヌクレオシド化合物によって達
成される：ここで、可変置換基R₁−R₂およびW₁−W₂は、以下のよう
に定義される。R₁およびR₂は個別に、−Ｈ、低級アルキ
ル、保護基、または標識である。好ましい実施態様で
は、R₁およびR₂の１つは標識であり、その標識は、好ま
しくはフルオレセイン型色素、またはローダミン型色素
である。Ｂは、７−デアザプリン、プリン、またはピリ
ミジンヌクレオシド塩基；好ましくはウラシル、シトシ
ン、７−デアザアデニン、または７−デアザグアノシン
である。Ｂが、プリンまたは７−デアザプリンであると
きは、糖部分は、プリンまたはデアザプリンのN⁹位で結
合され、そして、Ｂがピリミジンであるときは、糖部分
は、ピリミジンのN¹位で結合される。Ｂがプリンである
ときは、隣接する三重結合炭素はプリンの８位に結合さ
れ、Ｂが７−デアザプリンであるときは、隣接する三重
結合炭素は７−デアザプリンの７位に結合され、そして
Ｂがピリミジンのときは、隣接する三重結合炭素はピリ
ミジンの５位に結合される。W₁は、−Ｈおよび−OHであ
る。W₂は、−OHまたは3'位でホスホジエステルを形成し
得ないヌクレオシドを表す部分である。W₃は、−PO₄、
−P₂O₇、−P₃O₁₀、ホスフェートアナログ、または−OH
である。

第二の局面では、本発明は、以下の工程を包含するプ
ライマー伸長反応を実施するための方法を包含する：テ
ンプレート核酸を提供する工程；オリゴヌクレオチドプ
ライマーをテンプレート核酸部分へアニーリングする工
程；および、プライマー伸長剤を、プライマーを伸長す
るためのプライマー−テンプレートハイブリッドへ添加
する工程。本発明の重要な局面では、プライマー伸長剤
は、上記の構造を有するプロパルギルエトキシアミノヌ
クレオシド化合物を含有する。

図面の簡単な説明図1A−1Cは、種々の濃度の色素標識ターミネーターを
使用した、ターミネーター滴定アッセイ（Terminator T
itration Assay）の結果を示す。

図２は、従来の色素標識ターミネーターおよび本発明
の色素標識ターミネーターを使用して得られた、配列決
定パターンの比較を示す。

図３は、本発明の色素標識ターミネーターを特徴づけ
るために使用された、１つのヌクレオチド組み込みアッ
セイ（Single Nucleotide Incorporation Assay）の図
を示す。

図４は、非標識および色素標識ターミネーターの組み
込み比率を比較した、１つのヌクレオチド組み込みアッ
セイの結果を示す。

図５は、２−フタルイミドエタノール（３）および３
−（２−フタルイミドエトキシ）プロピン（５）の合成
を示す。

図６は、５−｛３−（２−フタルアミドエトキシ）−
プロピン−１−イル｝−2',3'−ジデオキシシチジン
（７）、および５−｛３−（２−トリフルオロアセトア
ミドエトキシ）プロピン−１−イル｝2',3'−ジデオキ
シシチジン（８）の合成を示す。

図７は、５−｛３−（2'−トリフルオロアセトアミド
エトキシ）−プロピン−１−イル｝−2',3'−ジデオキ
シシチジンモノホスフェート（10）の合成を示す。

図８は、５−｛３−（２−トリフルオロアセトアミド
エトキシ）−プロピン−１−イル｝−2',3'−ジデオキ
シシチジントリホスフェート（12）、および５−｛３−
（２−アミノエトキシ）プロピン−１−イル｝−2',3'
−ジデオキシシチジントリホスフェート（13）の合成を
示す。

図９は、２−（２−フタルイミドエトキシ）エタノー
ル（15）、および３−［２−（２−フタルイミドエトキ
シ）エトキシ］プロピン（16）の合成を示す。

図10は、５−［３−｛２−（２−フタルアミドエトキ
シ）エトキシ｝プロピン−１−イル］−2',3'−ジデオ
キシシチジン（17）、および５−［３−｛２−（２−ト
リフルオロアセトアミドエトキシ）エトキシ｝プロピン
−１−イル］−2',3'−ジデオキシシチジン（18）の合
成を示す。

図11は、５−［３−｛２−（２−トリフルオロアセト
アミドエトキシ）エトキシ｝プロピン−１−イル］−
2',3'−ジデオキシシチジンモノホスフェート（20）の
合成を示す。

図12は、５−［３−｛２−（２−トリフルオロアセト
アミドエトキシ）エトキシ｝プロピン−１−イル］−
2',3'−ジデオキシシチジントリホスフェート（22）、
および５−［３−｛２−（２−アミノエトキシ）エトキ
シ｝プロピン−１−イル］−2',3'−ジデオキシシチジ
ントリホスフェート（23）の合成を示す。

図13は、プロパルギルアミドリンカーを含むDTAMRA−
１−標識ターミネーター（上段）、およびプロパルギル
−１−エトキシアミドリンカーを含むDTAMRA−２−標識
ターミネーター（下段）を使用した、単色配列決定反応
の結果を示す。

好ましい実施態様の詳細な説明文献は本発明の好ましい実施態様を詳述し、その例は
添付の図面で示される。本発明は好ましい実施態様に関
して記載されるが、それらが、本発明を実施態様に限定
することを意図しないことが理解される。反対に、本発
明は、代替、改変、および等価物を包含することを意図
し、それらは、添付の請求の範囲によって定義されるよ
うに、本発明の範囲内に包含され得る。

一般的に、本発明は、ポリメラーゼ酵素についての基
質として有用な、新規クラスのプロパルギルエトキシア
ミノヌクレオシド化合物を包含する。本発明の化合物
は、Sanger型DNA配列決定法での使用のための標識ジデ
オキシヌクレオチド鎖終結剤、およびプライマー伸長反
応、例えばPCRを含む方法での使用のための標識デオキ
シヌクレオチド鎖伸長剤としての特定の応用を見いだ
す。

本発明は、目的の色素標識ヌクレオチドが、熱安定DN
Aポリメラーゼ酵素に対する、特に良好な基質である、
例えば、Sanger型DNA配列決定反応おいて、現在入手可
能な色素標識ターミネーターを使用する場合に必要とさ
れる量について、有意に減少されたモル過剰量が要求さ
れるという発見に一部基づく。

I.定義他に示さない限り、本明細書で使用されている以下の
用語および句は、以下の意味を有することを意図する：用語「低級アルキル」は、１から８の炭素原子を含
む、直鎖および分枝の炭化水素部分、すなわち、メチ
ル、エチル、プロピル、イソプロピル、tert−ブチル、
イソブチル、sec−ブチル、ネオペンチル、tert−ペン
チルなどを示す。

用語「標識」とは、本発明のヌクレオシドに結合され
るときに、このようなヌクレオシドおよびこのようなヌ
クレオチドを含有するポリヌクレオチドを、公知検出方
法によって検出可能にする部分のことを示す。標識の例
は、蛍光団、発色団、ラジオアイソトープ、スピン標
識、酵素標識、化学発光標識などを包含し、これらは標
識抗体またはアビジンのような、検出抗体−リガンドに
高度に親和性を有する特異的に結合し得る、抗原または
ビオチンのような適切なディテクターまたはリガンドに
よって、標識化合物の直接検出を可能にする。好ましく
は、標識は、フルオレセイン型またはローダミン型色素
のような、蛍光色素である（Lee;Menchen）。

用語「ヌクレオシド」は、プリン、デアザプリンまた
はピリミジンヌクレオシド塩基、例えば、アデニン、グ
アニン、シトシン、ウラシル、チミジン、デアザアデニ
ン、デアザグアノシンなどからなる化合物をいい、これ
らは1'位でペントースに結合され、2'−デオキシおよび
2'−ヒドロキシル型を含む（Stryer）。本明細書で使用
されているように、用語「ヌクレオチド」は、ヌクレオ
シドのホスフェートエステル、例えば、トリホスフェー
トエステルをいい、ここで、エステル化の最も一般的な
部位は、ペントースのＣ−５位で結合されたヒドロキシ
ル基である。本開示において多くの場合、用語「ヌクレ
オシド」は、ヌクレオシドおよびヌクレオチドの両方を
包含することを意図する。ヌクレオシドに関する「アナ
ログ」は、修飾塩基部分、修飾糖部分、および／または
修飾ホスフェートエステル部分を有する合成アナログ、
例えば、他に記載されているもの（Scheit;Eckstein 19
91）を、包含する。

本明細書で使用されているように、用語「ポリヌクレ
オチド」または「オリゴヌクレオチド」は、二本鎖およ
び一本鎖デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチ
ド、それらのα−アノマー型などを含む、天然ヌクレオ
チドモノマーまたはそのアナログの直鎖状ポリマーをい
う。通常、ヌクレオシドモノマーは、ホスホジエステル
結合によって結合され、ここで、本明細書で使用されて
いるように、用語「ホスホジエステル結合」は、ホスホ
ジエステル結合、または会合カウンターイオン（このよ
うなカウンターイオンが存在するときには）、例えば、
Ｈ、NH₄、Naなどを含む、それらのホスフェートアナロ
グを含む結合をいう。ポリヌクレオチドは、代表的に、
少数モノマーユニット（例えば、８〜40）から数千のモ
ノマーユニットの大きさの範囲である。ポリヌクレオチ
ドが、「ATGCCTG」のような文字の配列によって示され
るときは、他に示されない限り、ヌクレオチドは、5'−
＞3'で左から右の順で、「Ａ」は、デオキシアデノシン
を示し、「Ｃ」は、デオキシチジンを示し、「Ｇ」は、
デオキシグアノシンを示し、そして「Ｔ」は、チミジン
を示す。

用語「ホスフェートアナログ」は、リン原子が＋５酸
化状態で１つ以上の酸素原子が非酸素部分と置換されて
いるホスフェートアナログを示し、アナログの例は、会
合カウンターイオン（もしこのようなカウンターイオン
が存在するときには）、例えば、Ｈ、NH₄、Naなどを含
む、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホス
ホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロ
アニロチオエート、ホスホルアニリデート、ホスホルア
ミデート、ボロノホスフェートなどを包含する。

本明細書で使用されているように、用語「プロパルギ
ルアミドリンカー」は、以下の構造を有するリンカーを
いうべきであり； −Ｃ≡Ｃ−CH₂−NH− 用語「プロパルギル−１−エトキシアミドリンカー」
は、以下の構造を有するリンカーをいうべきであり； −Ｃ≡Ｃ−CH₂−Ｏ−CH₂−CH₂−NH− そして、用語「プロパルギル−２−エトキシアミドリン
カー」は、以下の構造を有するリンカーをいうべきであ
り、 −Ｃ≡Ｃ−CH₂−（Ｏ−CH₂−CH₂）_２−NH− ここで、上記構造の各々について、アセチレン末端は、
ヌクレオチド塩基に結合され、アミド窒素は、都合のよ
い結合を介して標識に結合される。

用語「フルオレセイン型色素」は、以下の融合三員環
系を含む、キサンテン色素分子のクラスをいう：ここで、各デオキシ環の位置で広範囲の置換が可能であ
る。特に好ましいフルオレセイン型色素のサブセット
は、4,7−ジクロロフルオレセインを包含する（Menche
n）。DNA配列決定法で蛍光標識として使用されるフルオ
レセイン型色素の例は、６−カルボキシフルオレセイン
（６−FAM）、５−カルボキシフルオレセイン（５−FA
M）、６−カルボキシ−4,7,2',7'−テトラクロロフルオ
レセイン（TET）、６−カルボキシ−4,7,2',4',5',7'−
ヘキサクロロフルオレセイン（HEX）、５−（および
６）カルボキシ−4',5'−ジクロロ−2',7'−ジメトキシ
フルオレセイン（JOE）、および、５−カルボキシ−2',
4',5',7'−テトラクロロフルオレセイン（ZOE）を包含
する。一般的に、−１または−２の標記は、例えば、HE
X−１のように、特定色素の略語の後に置かれる。「−
１」および「−２」の標記は、使用されている特定色素
の異性体を示す。１および２の異性体は、Ｃ−８カラム
および15％アセトニトリル/85％0.1Mトリエチルアンモ
ニウムアセテートから35％アセトニトリル/65％0.1Mト
リエチルアンモニウムアセテートの溶出勾配による逆相
クロマトグラフィー分離において、遊離色素の溶出順序
（１異性体は最初に溶出）によって定義される。

用語「ローダミン型色素」は、以下の融合三員環系を
含むキサンテン色素分子のクラスをいう：ここで、好ましいY₁−Y₄は個別に、水素または低級アル
キル、または、同時に、Y₁およびR₂がプロパノであり、
Y₂およびR₁がプロパノであるか、あるいは同時に、Y₃お
よびR₃がプロパノであり、Y₄およびR₄がプロパノであ
る。R₁−R₄位を含む各デオキシ環の位置で、種々広範の
置換が可能である。ヌクレオシド標識として有用なロー
ダミン型色素の例は、テトラメチルローダミン（TAMR
A）、4,7−ジクロロテトラメチルローダミン（DTAMR
M）、ローダミンＸ（ROX）、ローダミン6G（R6G）、ロ
ーダミン110（R110）などを包含する（Bergot;Lee）。

本明細書で使用されているように、用語「FLAN色素」
は、以下の式を有する非対称ベンゾキサンテン色素化合
物をいう：ここで、Y₁およびY₂は個別に、ヒドロキシル、酸素、イ
ミニウム、またはアミンである。R₁−R₈は個別に、水
素、フッ素、塩素、低級アルキル、低級アルケン、低級
アルキン、スルホネート、アミノ、アンモニウム、アミ
ド、ニトリル、アルコキシ、結合基、またはそれらの組
み合わせである。そして、R₉は、アセチレン、アルカ
ン、アルケン、シアノ、置換フェニル、またはそれらの
組み合わせであり、置換フェニルは以下の構造を有す
る：ここで、X₁は、カルボン酸またはスルホン酸であり;X₂
およびX₅は個別に、水素、塩素、フッ素、または低級ア
ルキルであり；そしてX₃およびX₄は個別に、水素、塩
素、フッ素、低級アルキル、カルボン酸、スルホン酸、
または結合基である（Benson）。

本明細書で使用されているように、用語「プライマー
−伸長剤」は、オリゴヌクレオチドプライマーの酵素的
テンプレート媒介伸長に作用するのに必要な成分を含有
する試薬である。プライマー伸長剤は、（ｉ）ポリメラ
ーゼ酵素、例えば、Taqポリメラーゼのような熱安定ポ
リメラーゼ酵素；（ii）緩衝液；（iii）デオキシヌク
レオチドトリホスフェート、例えば、デオキシグアノシ
ン5'−トリホスフェート、７−デアザデオキシグアノシ
ン5'−トリホスフェート、デオキシアデノシン5'−トリ
ホスフェート、デオキシチミジン5'−トリホスフェー
ト、デオキシシチジン5'−トリホスフェート；および必
要に応じて、DNA配列決定反応において、（iv）ジデオ
キシヌクレオチドトリホスフェート、例えば、ジデオキ
シグアノシン5'−トリホスフェート、７−デアザジデオ
キシグアノシン5'−トリホスフェート、ジデオキシアデ
ノシン5'−トリホスフェート、ジデオキシチミジン5'−
トリホスフェート、およびジデオキシシチジン5'−トリ
ホスフェートを包含する。

「テンプレート核酸」は、一本鎖形態で存在し、プラ
イマーオリゴヌクレオチドとアニールし得る任意の核酸
をいい、そしてプライマーオリゴヌクレオチドとアニー
リングし得る。テンプレート核酸の例は、DNA、RNAを包
含し、DNAまたはRNAは、一本鎖または二本鎖であり得
る。特に、テンプレート核酸は、ゲノムDNA、メッセン
ジャーRNA、cDNA、PCR反応からのDNA増幅産物などであ
り得る。テンプレートDNAの調製方法は、他に見出され
得る（ABI PRISMT^M Dye Primer Cycle Sequencing Core
Kit）。

II.プロオパギルエトキシアミノヌクレオチド化合物第一局面では、本発明は、式Ｉとして下記に示されて
いる一般式を有する、新規クラスのプロパルギルエトキ
シアミノヌクレオシド化合物を包含する。（この開示を
通して提供される全分子構造は、存在する実際の電子構
造のみならず、遷移構造およびそれらのプロトン化状態
をも包含することを注目のこと）。

式Ｉに関して、R₁およびR₂は、−Ｈ、低級アルキル、
保護基、または標識の中から選択される。好ましくは、
標識は蛍光色素である。より好ましくは、標識は、フル
オレセイン型蛍光色素またはローダミン型蛍光色素であ
る。好ましくは、R₁およびR₂の１つが、標識であるとき
は、他方は、−Ｈまたは低級アルキルのいずれかであ
る。好ましい保護基は、アシル、アルコキシカルボニ
ル、またはスルホニルを包含する。より好ましくは、保
護基は、トリフルオロアセチルである。

標識は、プロパルギルエトキシアミノヌクレオシドの
一級または二級アミノ部分の、標識に存在する「相補的
官能基」との反応によって形成される「結合」を介し
て、ヌクレオシドに結合される。好ましくは、相補的官
能基は、イソチオシアネート、イソシアネート、アシル
アジド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）エステ
ル、塩化スルホニル、アルデヒドまたはグリオキサル、
エポキシド、カーボネート、アリルハライド、イミドエ
ステル、カルボジイミド、無水物、4,6−ジクロロトリ
アジニルアミン、またはその他の活性カルボキシレート
である（Hermanson）。特に好ましい実施態様では、相
補的官能基は、本発明のプロパルギルエトキシアミノヌ
クレオシドのアミンと反応する活性化NHSエステルであ
り、ここで活性化NHSエステルを形成するために、カル
ボキシレート相補的官能基を含む標識は、ジシクロヘキ
シルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ドと反応して、NHSエステルを形成する（Khanna;Kasa
i）。下記の表１は、代表的な相補的官能基、および相
補的官能基のプロパルギルエトキシアミノヌクレオシド
のアミンとの反応によって形成される得られた結合の例
を示す。

再度式Ｉに関して、Ｂは、７−デアザプリン、プリ
ン、またはピリミジンヌクレオチド塩基であり、好まし
い実施態様では、Ｂは、ウラシル、シトシン、７−デア
ザアデニン、および７−デアザグアノシンよりなる群か
ら選択されるが。Ｂが、プリンまたは７−デアザプリン
であるとき、ヌクレオチドの糖部分は、プリンまたはデ
アザプリンのN⁹位で結合され、Ｂが、ピリミジンのとき
は、糖部分は、ピリミジンのN¹位で結合される。Ｂが、
プリンのときは、隣接する三重結合炭素は、プリンの８
位に結合され、Ｂが、７−デアザプリンであるときは、
隣接する三重結合炭素は、７−デアザプリンの７位に結
合され、そしてＢが、ピリミジンのときは、隣接する三
重結合炭素は、ピリミジンの５位に結合される。

W₁は、−Ｈおよび−OHから選択される。W₁が、−OHで
あるときは、ヌクレオシドは、リボヌクレオチドであ
り、W₁が、−Ｈであるときは、ヌクレオシドは、デオキ
シリボヌクレオチドである。

W₂は、−OHまたは3'−位でホスホジエスエル結合を形
成し得ないヌクレオシドを担う部分である。この官能基
に有用な好ましい部分は、−Ｈ、アジド、アミノ、フル
オロ（fluro）、メトキシなどを包含する。

W₃は、−PO₄、−P₂O₇、−P₃O₁₀、ホスフェートアナロ
グ、および−OHよりなる群から選択される。ポリヌクレ
オチドの酵素的合成に有用な好ましい実施態様では、W₃
は、−P₃O₁₀である。

一般的に、本発明のプロパルギルエトキシアミノヌク
レオシドは、以下のように調製される。ブロモエタノー
ルをフタルイミドカリウムと反応させ、フタルイミド誘
導体を生成する。次に、そのフタルイミド誘導体を、Na
H存在下に、プロパルギルブロミドによってＯ−アルキ
ル化し、保護３−（２−フタルイミドエトキシ）プロピ
ン結合アームを得る。そして、ヨード−ヌクレオシド
を、ジメチルホルムアミド中に、ヨウ化銅、テトラキス
（トリフェニルホスフィン）パラジウム、およびトリエ
チルアミンの存在下に、約12時間周囲温度で、または、
TLCによって決定されるように、その反応が完了される
まで、保護結合アームと反応する。次に、溶液を減圧濃
縮し、生成物を、シリカゲルフラッシュクロマトグラフ
ィーによって精製し、そして、同定および精製のため
に、プロトンNMRおよび分析逆相HPLC（Ｃ−18カラム）
で分析する。エチレンジアミンでの処理、その後のエチ
ルトリフルオロ酢酸によるアセチル化で、ヌクレオシド
−結合アーム化合物を得る。新鮮な蒸留リン酸塩化物
を、−30℃でトリメチルホスフェート中のヌクレオシド
−結合アーム化合物に添加し、対応のジクロロノモホス
フェートを形成する。反応混合物を、2Mテトラエチルア
ンモニウムバイカーボネート（TEAB）（pH8.0）で除去
してモノホスフェートを得、そして、調製逆相（Ｃ−18
カラム）で精製する。モノホスフェートを、カルボニル
ジイミダゾール（CDI）で活性化し、過剰のCDIをMeOHで
排除した。活性化モノホスフェートを、室温で、トリブ
チルアンモニウムピロホスフェートと反応させる。完了
時に、反応物を0.2M TEABで除去し、逆相HPLC（Ｃ−18
カラム）で精製する。精製保護トリホスフェートを蒸発
乾燥し、濃NH₄OH水に再懸濁して、TFA基を除去する。脱
保護トリホスフェート溶液を蒸発乾燥させ、0.1M TEAB
（pH7.0）で所望濃度に調製する。調製部分の濃度およ
び純度を、それぞれ、UV/Vis分光分析およびイオン対HP
LCで確認する。

一般的に、好ましい方法では、本発明の色素標識プロ
パルギルエトキシアミノヌクレオシドは、以下のように
調製される。プロパルギルエトキシアミノヌクレオシド
を、100mM TEAB（pH7.0）に溶解し、その溶液を蒸発乾
燥し、そしてヌクレオシドを、250mM炭酸水素ナトリウ
ム緩衝液（pH9.0）に再懸濁する。色素−NHS（DMSO中）
を添加し、撹拌しながら一晩反応させる。完了時に、反
応混合物を、イオン交換および逆相HPLC（Ｃ−18カラ
ム）で精製する。色素標識トリホスフェートヌクレオチ
ド溶液を蒸発乾燥させ、50mM 3−［シクロヘキシルアミ
ノ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（CAPS
O）pH9.6で、所望濃度に調製する。調製部分の濃度およ
び純度を、それぞれ、UV/Vis分光分析およびイオン対HP
LCで確認する。

III.プロパルギルエトキシアミノ化合物を使用する方法本発明のプロパルギルエトキシアミノ化合物は、以下
の工程を包含するタイプのテンプレート媒介プライマー
伸長反応を含む方法での使用に特に適合される：（ｉ）
テンプレート核酸を提供する工程；（ii）オリゴヌクレ
オチドプライマーのテンプレート核酸部分へのアニーリ
ングによりテンプレートハイブリッドを形成する工程；
および、（iii）プライマー−伸長剤を、プライマーを
伸長するために、プライマー−テンプレートハイブリッ
ドへ添加する工程。特に、本発明の化合物は、標識を、
プライマー伸長産物へ直接組み込むための方法を提供す
る。

プライマー伸長反応を使用する第一の好ましいクラス
の方法では、伸長産物は、本発明の標識デオキシヌクレ
オチドトリホスフェートまたはデオキシリボヌクレオシ
ドトリホスフェートをプライマー伸長反応に組み込むこ
とにより、伸長産物を通してランダムに標識を組み込む
ことによって標識される（［Ｆ］dNTP Reagents Protoc
ol）。このような方法は、PCRアンプリコンおよび一本
鎖プライマー誘導性伸長産物を標識するために使用され
得る。この方法で伸長産物を標識するために、プライマ
ー伸長反応は、確立されたプロトコルによって実施され
るが、標識デオキシヌクレオチドトリホスフェートが、
反応に加えられる。一般的に、PCRの情況においてプラ
イマー伸長反応を実施するために、テンプレート核酸
を、20pmol各プライマー、および、20mM緩衝液（pH
8）、1.5mM MgCl₂、50mM各デオキシヌクレオチドトリホ
スフェート（dNTP）、および２ユニットのTaqポリメラ
ーゼまたはその他の適した熱安定ポリメラーゼを含有す
る、プライマー−伸長剤と混合する。次に、反応混合物
を温度循環させる。代表的な温度循環プロフィールは、
変性工程（例えば、96℃、15秒）、プライマーアニーリ
ング工程（例えば、55℃、30秒）、およびプライマー伸
長工程（例えば、72℃、90秒）を包含する。代表的に
は、温度循環は、約10から40サイクル繰り返される。PC
R増幅では、標識デオキシヌクレオチドトリホスフェー
トの非標識デオキシヌクレオチドトリホスフェートに対
する代表的な割合は、所望のシグナル量に依存して、10
0:1から1000:1の間である。増幅効率に有害な影響を与
ずにPCR反応混合物中で使用され得る、標識デオキシヌ
クレオチドトリホスフェートの非標識デオキシヌクレオ
チドトリホスフェートに対する最大の割合は、1:4であ
る。

プライマー伸長反応を使用する第二の好ましいクラス
の方法では、伸長産物は、本発明の標識ジデオキシヌク
レオチドトリホスフェートまたはジデオキシリボヌクレ
オシドトリホスフェートをプライマー伸長反応へ組み込
むことによって3'−末端ヌクレオチドに検出標識をラン
ダムに組み込むことによって標識される（例えば、Sang
er型DNA配列決定）。一般的に、本発明の標識ジデオキ
シヌクレオチドトリホスフェートを使用するSanger型DN
A配列決定の情況において、プライマー伸長反応を実施
するために、１μｌテンプレート溶液（5mlの水で希釈
した1mlのPCR反応物）、および２μｌプライマー（0.4p
mol/μｌ）を、２μｌ緩衝液（400mM Tris−HCl、10mM
MgCl₂、（pH9.0））、２μｌデオキシヌクレオチド／標
識ジデオキシヌクレオチド混合物（Ｔ終結反応物、1250
μM ddTTP、250μM dATP、250μM dCTP、180μM 7−デ
アザ−dGTP、および250μM dTTP）、および２μｌポリ
メラーゼ酵素（５ユニット／μl:1ユニットはLawyerで
のように定義される）を含有するプライマー−伸長剤と
混合する。次に、反応を、以下の例示プログラムに従っ
て、温度循環させる:98℃、５秒変性、その後96℃、５
秒;55℃、40秒;68℃、１分の繰り返しサイクル、ここ
で、このサイクルは約15回繰り返される。

本発明のプロパルギルエトキシアミノ化合物はまた、
プライマー伸長産物の塩基特異的切断に依存する種々の
Sanger型配列決定法、例えば、不安定なヌクレオチドを
使用する方法（Eckstein 1988;Shaw）の情況において使
用され得る。

IV.実施例本発明は、以下の実施例を考慮することにより、さら
に明白にされ、この実施例は、本発明を単に例示するこ
とを意図し、いかなる方法においてもその範囲を限定す
ることは意図しない。

実施例１配列決定反応において必要なターミネーター過剰量を決
定するためのターミネーター滴定アッセイターミネーター滴定アッセイを、全配列決定ラダー、
すなわち、長さ約20から約600ヌクレオチドを有する特
定の塩基で終結する全フラグメントを包含する配列決定
ラダーを作製するために要求される、色素ターミネター
の最少量を決定するために使用した。アッセイの主要成
分は、（ｉ）第一色素で標識されたプライマー、および
（ii）第一色素から分光学的に分離可能な第二色素で標
識されたターミネーターである。このアッセイでは、不
十分な濃度の色素ターミネーターが、配列決定反応に添
加されたときは、ジデオキシ−終結フラグメントは形成
されず、配列決定ゲル上に認められる全てが、第一色素
のみで標識された「偽終結物（false stops）」によっ
て形成された産物であった。本明細書で使用されている
ように、用語「偽終結物」は、ジデオキシテーミネータ
ーで終結しないプライマー伸長産物を示し、このような
産物は、おそらく、ポリメラーゼ酵素が、自発的にテン
プレート鎖によって解離するときに形成される。過剰の
ターミネーターが使用されたときには、短ターミネータ
ー産物（すなわち、長さ約50ヌクレオチド未満）のみが
形成され、このような産物は、第一および第二色素の両
方を含む。適量のターミネーターが使用されたときに
は、全配列決定ラダーが産生され、ラダーの各フラグメ
ントは、第一および第二色素の両方で標識された。

色素−ターミネーター反応を、ABI PRISMT^M Dye Term
inator Cycle Sequencing Core Kit Manual（PE Applie
d Biosystems p/n 402116）に提供されているプロトコ
ルに従って、AmpliTaq DNAポリメラーゼ、FSを用いて実
施した。（FS酵素は、２つの点変異を有する組換えTher
mus aquaticus DNAポリメラーゼ（G46DおよびF667Y）で
ある。）,dNTP混合物、色素標識プライマー、および色
素標識ターミネーター以外の全試薬は、ABI PRISM^TM Dy
e Terminator Core Kit（PE Applied Biosystems p/n 4
02117）からであった。dNTP混合物は、各2mMのdATP、dC
TP、dGTP、およびdTTPから構成された。反応成分の予備
混合物を、下記の表に示されるように調製した。ここ
で、全ての量は、反応塩基あたりに基づいて与えられて
いる。

5X緩衝液 4.0μＬ dNTP混合物 10μＬテンプレート:pGEM^R−3Zf（＋）、0.2μg/μL 5.0μＬプライマー：−21M13（前方）、0.8pmol/μL 4.0μＬ AmpliTaq DNAポリメラーゼ、FS 0.5μＬ H₂O 0.5μＬ反応を、Perkin−Elmer 480 DNA Thermal Cycler（PE
Applied Biosystems p/n N801−100）に適用される0.5
mlチューブ中に集合させた。反応容量は20μＬであり、
15μＬの上記反応予備混合物、種々の量の色素標識ター
ミネーター、および全反応容量を20μＬにするのに十分
な容量の水を含有する。１から1000pmolの色素ターミネ
ーターを、各反応に添加した。30μＬのミネラルオイル
を、各反応の上層に加えて蒸発を防いだ。反応を以下の
ように温度循環させた:96℃、30秒;50℃、15秒；および
60℃、４分を25サイクル；その後、４℃維持サイクル。

全反応物を、製造者の指示に従って、Centri−Sepス
ピンカラムでのスピン−カラム精製によって精製した
（Princeton Separations p/n CS−901）。カラム中の
ゲル材料を、0.8mL脱イオン水で、少なくとも30分間、
室温にて水和した。カラムを水和し、気泡がゲル材料中
に閉じ込められていないことを確かめた後に、カラムの
上方および下方のキャップを取りはずし、カラムを重力
により流出させた。次に、カラムを、キットで提供され
る洗浄チューブに挿入し、1300 x gで２分間、可変速度
マイクロ遠心分離機で遠心し、洗浄チューブから取り出
し、そして、試料回収チューブに挿入した。反応混合物
を、オイルの下から注意深く取り出し、ゲル材料にロー
ドした。カラムを、1300 x gで２分間、可変速度マイク
ロ遠心分離機で遠心した。次に、溶出した試料を、減圧
遠心分離で乾燥した。

配列決定ゲルにロードする前に、乾燥試料を、テンプ
レート抑制試薬（PE Applied Biosystems p/n 401674）
25μＬ中に再懸濁させ、撹拌し、２分間95℃に加熱し、
氷上で冷却し、再度撹拌して。遠心分離した（13,000 x
g）。10μＬの再懸濁試料を一部、PE ABIPRISMTM310 G
enetic Analyzer（PE Applied Biosystems p/n 310−00
−100/120）に装着された試料バイアル（PE Applied Bi
osystems p/n 401957）中にわけた。310 Genetic Analy
zerでの電気泳動を、DNA配列決定機（PE Applied Biosy
stems p/n 402837（ポリマー）およびp/n 402840（キャ
ピラリー）、またはp/n 402091（ポリマー）およびp/n
401821（キャピラリー））に特に装着されたキャピラリ
ーによって、実施した。各場合に、分離ポリマーは、核
酸変性物を含んデータ。試料を、2.5kVで30秒間、キャ
ピラリーへ動電学的に注入し、キャピラリーの外壁を42
℃に維持して、10から12.2kVで２時間操作した。

図1A−Ｃは、310分析機で集められたターミネーター
滴定アッセイからの代表的な結果を示す。各場合に、色
素標識ターミネーターは、従来のプロパルギルアミドリ
ンカーを利用する。トレースは、ヌクレオチド71〜175
について流した電気泳動中の時間の関数としての、所定
の波長での蛍光強度を示す。プライマー伸長反応へ添加
された色素−ターミネーター量を変え、図1Aでは、1pmo
lターミネーターを使用し、図1Bでは、4pmolターミネー
ターを使用し、そして、図1Cでは、150pmolターミネー
ターを使用した。各パネルの上方トレースは、色素−標
識ターミネーターから放射され、535〜545nmで集められ
た蛍光であり、各パネルの下方トレースは、色素−標識
プライマーから放射され、575〜585nmで集められた蛍光
である。色素プライマーのトレース（下方）は、偽終結
物、すなわち、色素−標識ターミネーターで終結しない
フラグメント、ならびに適切に終結されたフラグメント
を示す。偽終結物は、十分なターミネーターが存在しな
いとき、またはテーミネーターが不良なポリメラーゼ基
質であるときに生じる。色素ターミネータートレース
（上方）は、色素−標識ターミネーターの特異的取り込
みを示す。実験条件は以下の通りであった：ターミネーター：種々の濃度での６−FAMによって標識
されたddATP プライマー:TAMRA標識−21M13（正方向）テンプレート:pGEM−3Zf（＋） DNAポリメラーゼ:AmpliTaqDNAポリメラーゼ、FS 図1Aは、1pmol 6−FAM−ddATPを使用する反応につい
てのデータを示す。色素ターミネータートレースの小さ
なピークによって証明されるように、特異的取り込みは
ほとんど検出されなかった。下方の色素−プライマート
レースに示されている偽終結物は、特異的に終結された
任意のピークと、本質的に同じ大きさであった。このパ
ターンは、色素−ターミネーター濃度が、低すぎること
を示す。図1Bは、4pmol 6−FAM−ddATPを使用する反応
についてのデータを示す。良好な特異的ターミネーター
取り込みが、配列決定ラダーを通して比較的均等なピー
クの高さで観察された。色素プライマートレースでは、
偽終結物ノイズを超える容易に識別し得るピークが存在
し、このピークは、色素ターミネータートレースのピー
クと共に移動する。このパターンは、色素ターミネータ
ー濃度が、使用可能範囲であることを示す。図1Cは、15
0pmol 6−FAM−ddATPを使用する反応についてのデータ
を示す。「トップヘビー」パターンが観察され、非常に
高いレベルの色素ターミネーター取り込みを示す初期の
ピーク、および非常に低いレベルの取り込みを示す後者
のピークを伴った。このパターンは、色素−ターミネー
ター濃度が高すぎることを示す。

図２は、250pmol濃度でプロパルギルアミドリンカー
を使用した、６−FAM−ddCTPターミネーターについて
（上方トレース）、および50pmol濃度で本発明のプロパ
ルギル−１−エトキシアミドリンカーを使用した、６−
FAM−ddCTPターミネーターについて（下方トレース）得
られた、配列決定パターンの比較を示す。これらの濃度
は、各型のターミネーターについての最適濃度であるよ
うに決定した。プロパルギルアミドリンカーを使用し
た、６−FAM−ddCTPターミネーターについては、平均の
ピークの高さは1800であり、標準偏差は959であって、
相対誤差は0.533であった。本発明のプロパルギル−１
−エトキシアミドリンカーを使用した、６−FAM−ddCTP
ターミネーターについては、平均のピークの高さは504
であり、標準偏差は220であって、相対誤差は0.436であ
った。プロパルギル−１−エトキシアミドリンカーを使
用したときに得られたより低い相対誤差は、より均等な
ピークの高さの分布を示し、これは、自動DNA配列決定
システムでの基底化を促進する。

実施例２リンカー型の関数としての全配列決定ラダーを形成する
ために要求されるFAM標識Ｃ−ターミネーター量下記の表は、上記実施例１に記載されているように、
ターミネーター滴定アッセイに従って、全配列決定ラダ
ーを形成するために必要とされる、色素−標識Ｃ−ター
ミネーターの相対モル過剰を示す。相対モル過剰は、全
配列決定ラダーを形成するために必要とされる非標識ジ
デオキシターミネーターの量が、１価になるように定義
される。各場合に、Ｃ−ターミネーターを６−FAM色素
に結合した。表から認められ得るように、プロパルギル
−１−エトキシアミドリンカーを使用するＣ−ターミネ
ーターは、従来のプロパルギルアミドリンカーを使用す
るターミネーターに比較して、６倍少ない（9:55）モル
過剰を、そして、プロパルギル−２−エトキシアミドリ
ンカーを使用するターミネーターに比較して、５倍少な
い（9:45）モル過剰必要とする。

実施例３リンカー型および色素の関数としての全配列決定ラダー
を形成するために必要とされるFAM−標識Ｃ−ターミネ
ーターの相対モル過剰下記の表は、種々の組合せの色素およびリンカーにつ
いて、上記実施例１に記載されているように、ターミネ
ーター滴定アッセイに従って全配列決定ラダーを形成す
るために必要とされる色素−標識Ｃ−ターミネーターの
相対モル過剰を比較する。相対モル過剰は、上記のよう
に定義する。表から認められ得るように、プロパルギル
−１−エトキシアミドリンカーを利用するＣ−ターミネ
ーターは、既存のプロパルギルアミドリンカーを含むタ
ーミネーターに比較して、使用した特定の色素に依存し
て、モル過剰の６倍から２倍の減少をもたらす。

実施例４相対酵素選択性を測定するための一本鎖ヌクレオチド組
み込みアッセイ A.アッセイの一般的な説明実施例に記載されているアッセイは、ターミネーター
取り込みに対する、異なるターミネーター−色素リンカ
ーアーム構造の効果を定量する目的で、DNAポリメラー
ゼが、非色素標識ターミネーターについて示す色素標識
ターミネーターに対する優先性を測定する。このアッセ
イでは、非標識ターミネーターおよびその同系色素−標
識ターミネーターが等濃度存在し、そして酵素限定（定
常状態）条件下で、同じポリメラーゼ−基質結合部位に
対して競合させた。

図３を参照して、このアッセイ成分は、36ヌクレオチ
ドテンプレート（５）；テンプレートおよび5'−末端の
第一蛍光標識（15）に相補的な配列を有する、25ヌクレ
オチドプライマー（10）；非標識ターミネーター（2
0）；第一蛍光標識から分光学的に分離し得る、結合さ
れた第二蛍光標識（30）を有する色素標識ターミネータ
ー（25）；および、ポリメラーゼ酵素を包含する。この
実施例では、非標識ターミネーターは2',3'−ddCTPであ
り、色素標識ターミネーターは６−（FAM）−ddCTPであ
り、ここで、異なるリンカーアームは、色素をヌクレオ
チドに結合させるために使用された。テンプレートDNA
は、プライマー末端後のテンプレート位置に単一のＧ
（35）を含んでいた。非標識ターミネーター（20）の取
り込みは、ddCで終わる長さ26−塩基のプライマー−産
物（40）の形成をもたらし、一方、色素−標識ターミネ
ーターの取り込みは、（FAM）−ddCで終わる長さ26−塩
基のプライマー−産物（45）の形成をもたらした。

産物（40）および（45）は、電気泳動での分離、およ
びABI PRISM^TM 373 DNAシークエンサー（PE Applied Bi
osystems）を用いて得られたバンドの検出によって検出
した。代表的なバンドパターンは、標識プライマー（1
0）に対応する25量体バンド、産物（40）に対応する26
量体バンド、および産物（45）に対応した「見かけの27
量体」からなった。産物（45）に認められる見かけの余
分塩基は、フラグメントの電気泳動移動度に対する、色
素−標識ターミネーターの効果の結果である。反応混合
物からの試料採取、および25量体、26量体、および見か
けの27量体バンド中のDNAの相対量の時間の関数として
の測定によって、反応における非標識および色素標識タ
ーミネーターの相対的な取り込み速度の測定が可能であ
った。色素エネルギー転移の補正後に（下記を参照のこ
と）、取り込み速度比が、非標識ターミネーターの色素
標識ターミネーターに対する酵素の優先性の直接測定で
あることが見出された。この様式で、色素−ターミネー
ター取り込みに対するリンカー構造の効果を測定するこ
とが可能であった。

B.エネルギー転移補正産物（45）の場合については、産物（45）の5'−末端
に位置する第一蛍光標識（15）（この実施例におけるTA
MRA）と、産物（45）の3'−末端に位置するターミネー
ターに位置する第二蛍光標識（30）（この実施例におけ
るFAM）との間に生じる蛍光エネルギー転移に対する蛍
光シグナルを補正する必要がある。検出に使用される条
件下で、3'−FAM標識の存在は、TAMRA標識から得られる
シグナルを促進するように作用する。エネルギー転移補
正は、産物（45）と同じ構造を有する二重標識内部標準
分子を合成し、等モルの5'−TAMRA標識プライマー（1
0）および二重標識内部標準分子を含有するコントロー
ル試料を調製し、そして、アッセイ産物（40）および
（45）と同じゲル上のコントロールレーンでコントロー
ル試料を流すことによって達成される。プライマー（1
0）と二重標識内部標準との間のいかなるTAMRA蛍光の差
も、アッセイ産物（45）中の色素部分間のエネルギー転
移の程度の定量的測定である。例えば、等モルのプライ
マー（10）および二重標識内部標準については、内部標
準からのTAMRA蛍光は、代表的にはプライマー（10）か
らのTAMRA蛍光より1.6倍から1.7倍高く、このことは、F
AM部分が内部標準のTAMRA色素へエネルギーを転移し、
人工的に高いTAMRA蛍光をもたらすことを示す。この測
定法は、テスト試料の各レーンの産物（45）からのTAMR
A蛍光を補正するのに使用した。

C.反応条件 Taq DNAポリメラーゼの変異型（「AmpliTaq FS」）
が、FAM−ddCTPに対するddCTPについて示す、偏りの測
定に使用される反応条件は、下記の表に提供されてい
る。（特定成分の次の括弧内の数は、図３の要素をい
う。）成分最終濃度 TRIS・Cl、pH9.0、20℃ 80mM 5'TAMRA−標識プライマー（10） 1000nM テンプレート（５） 1000nM MgCl₂ 2.4mM ddCTP（20） 200μＭ FAM−ddCTP（25） 200μＭ AmpliTaq FSポリメラーゼ 8nM 反応温度 60℃ アッセイ反応は、以下のように調製した。２つの２倍
濃縮の「半反応混合物」を調製し、氷上で維持した。第
一溶液、「２×Enz・DNA」混合物は、80mM TRIS緩衝液
中に、2000nMテンプレート／プライマーDNA、および16n
M AmpliTaq FSを含有した。第二溶液、「２×Mg・Nuc」
混合物は、80mM TRIS緩衝液中に、4.8mM MgCl₂、および
400μＭの各核酸を含有した。「０時間コントロール」
試料は、25μｌの「STOP溶液」（0.5M EDTA、℃）へ１
μｌの２×Enz・DNA混合物を添加し、そして混合後、１
μｌの２×Mg・Nuc混合物を添加して調製した。０時間
コントロール試料を、調節された試料の残りもまたさら
なる処理用に回収するまで氷上で保持した。

各半反応混合物の残りを、60℃で５分間プレインキュ
ベートし、そして等容量の２×Mg・Nuc混合物を２×Enz
・DNA混合物へ添加して、アッセイ反応を開始した。適
当な時点（この実施例では、20秒間隔）で、試料を取り
出し（各２μｌ）、そして25μｌ氷冷STOP溶液で迅速に
停止した。全10試料を、経過時間約200秒にわたって回
収した。

373型DNAシークエンサーの検出機の過剰ローディング
を防ぐために、試料をさらに処理して、過剰の非組み込
みFAM−ddCTPを除去した。これは、キャリアとしてtRNA
を使用して塩化リチウム−エタノール沈澱によって完了
した。５μｌの反応停止試料を、250μｌ「PPT溶液」
（0.8M LiClおよび0.2μg/ml E.coli tRNAからなる）に
加えた。混合の後に、750μｌの95％エタノールを添加
した。各試料を混合して、30から60分間氷上に保持し
て、プライマー／テンプレートDNAを沈澱させた。

373にロードするために試料を調製するために、微量
遠心分離機で10,000×ｇにて５分間ペレット化して、Li
Cl/エタノール沈澱物をペレットにし、上清液体を減圧
吸引して除去した。５分間空気乾燥させた後に、50μｌ
の「ゲル試料溶液」（50％ホルムアミドおよび３％デキ
ストランブルー）を添加した。ペレットを激しく混合し
て溶解し、95℃に３分間加熱し、その後、各試料３μｌ
を16％変性ポリアクリルアミド配列決定ゲルの別々のレ
ーンにロードした（ABI PRISM^TM373 DNA配列決定システ
ムユーザーズマニュアル）。電気泳動の泳動条件は、26
00V、50mA、100mWであった。各バンドの蛍光シグナルの
検出は、GeneScan^TMソフトウエアー（PE Applied Biosy
stems,p/n 672−30）を使用して達成した。

D.データの定量「コントロールレーン」に、10fmol TAMRA−標識プラ
イマーおよび10fmol二重色素標識内部標準を含有する３
μｌのゲル試料溶液をロードした。TAMRA蛍光量を、25
量体バンドについて測定し、内部標準バンドのTAMRAシ
グナルと比較した。この場合には、上記のように、内部
標準からのTAMRAシグナルは、プライマーバンドからのT
AMRAシグナルより1.6倍高かった。従って、各アッセイ
産物（45）バンドのTAMRAシグナルには、補正ファクタ
ー1/1.6を乗じた。

所定のレーンについての各バンド中のDNA相対量は、
そのレーンについての全ユニット数で各バンドの蛍光ユ
ニットを割り、その数に、反応中のDNAプライマー／テ
ンプレート濃度を乗じて計算した。これは、各レーン中
のシグナルを、反応中の全DNA濃度に規格化し、ゲルに
ロードする際に生じるアーチファクトに原因するレーン
ごとの変化を補正した。

各ヌクレオチドの組み込み速度を測定するために、各
バンド中のDNA量を、時間に対してプロットし、各曲線
の直線部分を線形最小二乗フィッティングプログラムを
用いてフィッティングを行った。組み込み速度を、26量
体アッセイ産物（40）の出現速度として非標識ddCにつ
いて計算し、一方FAM−ddCの組み込み速度は、見かけの
27量体アッセイ産物（45）の出現速度として計算した。
これらの速度比は、DNAポリメラーゼがddCTPについて示
したFAM−ddCTPに対する優先性を示した。

E.結果図４は、非標識および色素標識ターミネーターの組み
込み速度を比較する、代表的なデータを示す。図中のデ
ータは、先に考察されたエネルギー転移効果に対して補
正された。使用したリンカーは、プロパルギルアミドリ
ンカーであった。

下記の表中のデータは、使用された特定の色素または
リンカーに関係なく、試験された任意の色素標識誘導体
に対する非標識ddCTPについての優先性が存在すること
を示す。しかし、この優先性の大きさは、色素の塩基へ
の結合に使用されたリンカーアーム型に強く依存する。
従来のプロパルギルアミドリンカーの場合には、ddCTP
は、FAM−ddCTPより65倍、そしてHEX−ddCTPより800倍
を超えて優先される。リンカーアームは、３原子分（１
エーテル酸素および２メチレン炭素、すなわち、プロパ
ルギル−１−エトキシアミドリンカー）のみ伸長される
場合、FAM−ddCTPについての偏りは65倍から19倍に、そ
してHEX−ddCTPについては800倍からたった約４倍に減
少され、200を超えるファクターによる減少である。し
かし、プロパルギルリンカーと色素ユニットとの間の２
つのエーテルユニットの挿入（すなわち、プロパルギル
−２−エトキシアミドリンカー）は、有害な影響を有
し、FAM−ddCTPに対する偏りを約２倍増加する（65倍か
ら110倍）。

（色素）−リンカー ddCTP/（色素）−ddCTP （６−FAM）−プロパルギルアミド−Ｃ 65× （６−FAM）−プロパルギル−１−エトキシアミド−Ｃ 19× （６−FAM）−プロパルギル−２−エトキシアミド−Ｃ 110× （HEX）−プロパルギルアミド−Ｃ＞800× （HEX）−プロパルギル−１−エトキシアミド−Ｃ４× 実施例５５−｛３−（２−アミノエトキシ）プロピン−１−イ
ル｝−2',3'−ジデオキシシチジントリホスフェート（1
3）の合成 A.材料および方法薄層クロマトグラフィー（TLC）を、シリカゲル60−F
₂₅₄の250μｍ層を予め被覆したガラスプレート上で実施
した。蛍光停止および／または５％硫酸で焼付けること
により現像した後に、化合物をTLCプレート上に置い
た。フラッシュカラムクロマトグラフィーを、SIPブラ
ンドシリカゲル60Å、230−400メッシュASTM（Baxter S
cientific p/n C4582−87）で実施した。NMRスペクトル
を、以下のように得た:¹H NMRスペクトルは、周囲温度
にて、CDCl₃（内部Me₄Si、δ０）またはD₂O（外部Me₄S
i、δ０）中の溶液に関して300MHzで記録し;¹³C NMRス
ペクトルは、CDCl₃（内部Me₄Si、δ０）中の溶液に関し
て75.5MHzで記録し;¹⁹F NMRスペクトルは、CDCl₃または
D₂O（外部CFCl₃、δ０）中の溶液に関して282.23MHzで
記録し；そして、³¹P NMRスペクトルは、D₂O中溶液で12
1.44MHzで記録した。全ての場合に、NMRデータは、予想
された構造に一致した。他に示されていなければ、全反
応は周囲温度で実施し、ワークアップにおいて、有機溶
媒中の溶液を等容量の水溶液で洗浄した。有機溶媒は、
通常、バス温度40〜50℃、減圧下でのロータリーエバポ
レーターによる濃縮前に、無水Na₂SO₄で乾燥した。分析
および調製目的に使用したHPLCシステムは以下のようで
あった：分析逆相HPLC:カラム:Spheri−5 RP−C18、粒径５μ
ｍ、220×4.6mm（PE Applied Biosystems p/n 0711−00
17）；濃度勾配:20分間にわたり1.5ml/分で０から50％
アセトニトリル、その後、10分間にわたり1.5ml/分で50
％アセトニトリルから100％アセトニトリル。

分析用イオン対HPLC:カラム:Aquapore^TM OD−300、粒
径７μｍ、220×4.6mm（PE Applied Biosystems p/n 07
11−0331）；濃度勾配:30分間にわたり1.5ml/分で０か
ら40％アセトニトリル、その後、５分間にわたり1.5ml/
分で40％アセトニトリルから60％アセトニトリル。

調製用アニオン交換HPLC:カラム:Aquapore^TMAnion、
粒径20μｍ、250×10mm（PE Applied Biosystems p/n 0
711−0172）；濃度勾配:20分間にわたり4.5ml/分で、40
％アセトニトリル:60％100mM TEAB、pH7.0から40％アセ
トニトリル:60％1.5mM TEAB pH8、その後、イソクラチ
ック溶出。

調製用逆相HPLC:カラム:Prep Nova Pak HR−C18、粒
径６μｍ、孔の大きさ60Å、300×40mm（Waters Divisi
on of Millipore Corporation p/n WAT037704）；濃度
勾配（モノおよびトリホスフェート）:30分間にわたり5
0ml/分で、100％100mM TEAB pH7から20％アセトニトリ
ル:80％100mM TEAB pH7、その後、10分間にわたり、20
％アセトニトリル:80％100mM TEAB pH7から50％アセト
ニトリル:50％100mM TEAB pH7;濃度勾配（色素−標識ト
リホスフェート）:100％100mM TEAB pH7から10％100mM
TEAB pH7:90％アセトニトリル。

B.2−フタルイミドエタノール（３）の合成カリウムフタルイミド２（2.7g、14.6mmol）を、N,N
−ジメチルホルムアミド中のブロモエタノール溶液１
（12mL、14.1mmol）へ添加した。70℃で12時間撹拌した
後に、混合物を濃縮し、次いでジクロロメタン（100m
L）で希釈した。濾過によって固形物を除去した後、有
機層を水で洗浄して、乾燥し、そして濃縮した。濃縮物
を、フラッシュカラムクロマトグラフィー（3:2から2:3
ヘキサン−酢酸エチル）によって精製し、0.22のR_F（3:
2ヘキサン−酢酸エチル）を有する白色固形物（1.19g,4
4.12％）として化合物３を得た。図５を参照のこと。

C.3−（２−フタルイミドエトキシ）プロピン（５）の
合成撹拌しながら、N,N−ジメチルホルムアミド（20mL）
中の化合物３の溶液（1.14g,5.96mmol）へ、NaH（0.36
g、80％）を滴下して加えた。NaH添加完了後に、室温に
て0.5時間撹拌を継続し、次いで、反応物を０℃に冷却
した。プロパルギルブロミド４（1.5mL、13.47mmol）を
添加し、さらに０℃にて0.5時間、次いで室温にて２時
間撹拌を継続した。注意深くメタノーを添加して過剰の
NaHを分解した後に、溶媒を蒸発させ、粗生成物を、フ
ラッシュカラムクロマトグラフィー（3:2から1:1から2:
3のヘキサン−酢酸エチル）によって精製し、0.22のR_F
（3:2ヘキサン−酢酸エチル）を有する固形物（495mg、
36.2％）として化合物５を得た。図５を参照のこと。

D.5−｛３−（２−フタルアミドエトキシ）−プロピン
−１−イル｝−2',3'−ジデオキシシチジン（７）の合
成５−ヨード−2',3'−ジデオキシシチジン６（100mg、
0.3mmol）を、アルゴン雰囲気下で、室温にて、N,N−ジ
メチルホルムアミド（1mL）中で、ヨウ化銅（11.4mg、
0.06mmol）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パ
ラジウム（69mg、0.06mmol）、およびトリエチルアミン
（84μＬ、0.6mmol）の存在下に、化合物５（158mg、0.
69mmol）と12時間反応させた。次いで、反応を、メタノ
ール中2gの炭酸水素塩形態のDowex−１アニオン交換樹
脂で希釈した。室温にて１時間撹拌した後に、反応混合
物を濾過し、濃縮した。生成物を、フラッシュカラムク
ロマトグラフィー（13:1ジクロロメタン−メタノール）
で精製し、R_F 0.23（溶媒9:1ジクロロメタン−メタノー
ル）を有する化合物７（75mg、57.66％）を得た。図６
を参照のこと。

E.5−｛３−（２−トリフルオロアセトアミドエトキ
シ）プロピン−１−イル｝−2',3'−ジデオキシシチジ
ン（８）の合成化合物７（73mg、0.17mmol）およびエチレンジアミン
（400μＬ）の混合物を、エタノール（4mL）中で１時
間、80℃に加熱した。次いで、反応物を蒸発させて乾燥
し、残渣を、N,N−ジメチルホルムアミド（2mL）に溶解
し、メチルトリフルオロ酢酸（6.5mL）を加えた。80℃
で１時間撹拌した後に、溶媒を蒸発させ、残渣をフラッ
シュカラムクロマトグラフィー（9:1ジクロロメタン−
メタノール）で精製し、R_F 0.24（溶媒9:1ジクロロメタ
ン−メタノール）を有する化合物８（36mg、50.7％）を
得た。図６を参照のこと。

F.5−｛３−（2'−トリフルオロアセトアミドエトキ
シ）プロピン−１−イル｝−2',3'−ジデオキシシチジ
ンモノホスフェート（10）の合成新たに蒸留したリン酸オキシクロライド（16.2μＬ、
0.17mmol）を、−30℃で、トリメチルホスフェート（15
0μＬ）中のヌクレオシド８（18.8mg、0.046mmol）に添
加し、対応するジクロロモノホスフェート９を生成し
た。反応混合物を、80分間にわたり−５℃まで暖め、室
温でさらに１時間撹拌を続けた。反応を2M TEAB緩衝液
（pH8.0）でクエンチし、上記のように調製用逆相HPLで
精製した。生成物に対応する画分を濃縮して、モノホス
フェート10（12.3mg、54.56％）を得た。図７を参照の
こと。

G.5−｛３−（２−トリフルオロアセトアミドエトキ
シ）プロピン−１−イル｝−2',3'−ジデオキシシチジ
ントリホスフェート（12）の合成 N,N−ジメチルホルムアミド（200μｌ）に溶解したモ
ノホスフェート10（7.4mg、15.3mmol）を、カルボニル
ジイミダゾール（CDI）（4.2mg、25,9mmol）と、１時間
室温にて撹拌した。過剰のCDIを、乾燥メタノール（40
μＬ）の添加によってクエンチした。活性化モノホスフ
ェート11を、ｎ−トリブチルアミン（16μＬ）を含有す
るN,N−ジメチルホルムアミド（160μＬ）中のトリブチ
ルアンモニウムピロホスフェート溶液とともに、室温に
て24時間撹拌した。反応を2M TEAB pH8.0でクエンチ
し、上記のように、調製用逆相HPLCで精製した。生成物
に対応する画分を濃縮してトリホスフェート12を得た。
図８を参照のこと。

H.5−｛３−（２−アミノエトキシ）プロピン−１−イ
ル｝−2',3'−ジデオキシシチジントリホスフェート（1
3）の合成精製された保護トリホスフェート12を、濃アンモニア
水（4mL）に取入れ、室温にて2.5時間撹拌した。反応混
合物を濃縮して、化合物13を得て、0.1M TEAB（pH7.0）
で処方して濃度2.6mMにした。処方されたバルクの濃度
および純度は、上記のように、それぞれ、UV/Vis分光計
および分析イオン対HPLCによって確認した。図８を参照
のこと。

実施例６５−［３−｛２−（２−アミノエトキシ）エトキシ｝プ
ロピン−１−イル］−2',3'−ジデオキシシチジントリ
ホスフェート（23）の合成 A.材料および方法材料および方法は、実施例５に関して先に記載したも
のと本質的に同じであった。

B.2−（２−フタルイミドエトキシ）エタノール（15）
の合成 N,N−ジメチルホルムアミド（35mL）中の２−（２−
クロロエトキシ）エタノール14（5mL、47.4mmol）溶液
に、カリウムフタルイミド２（8.8g、47.51mmol）を添
加し、反応混合物を、70℃で20時間撹拌した。混合物を
濃縮し、次いでジクロロメタン（300mL）で希釈し、そ
して有機層を水で洗浄し、乾燥し、そして濃縮した。残
渣を、フラッシュカラムクロマトグラフィー（3:2から
2:3のヘキサン−酢酸エチル）で精製して、R_F 0.12（溶
媒3:2ヘキサン−酢酸エチル）を有する白色固形物（7.1
5g、64.17％）として化合物15を得た。図９を参照のこ
と。

C.3−［２−（２−フタルイミドエトキシ）エトキシ］
プロピン（16）の合成 N,N−ジメチルホルムアミド（25mL）中の化合物（1
5）（1.39g、5.91mmol）撹拌されている溶液に、NaH
（0.33g、80％）を滴下して加えた。NaH添加の完了後
に、撹拌を室温にて0.5時間継続し、次いで０℃に冷却
した。プロパルギルブロミド４（1.24mL、11.13mmol）
を添加し、撹拌を、０℃で0.5時間、次いで室温にて２
時間継続した。メタノールを注意深く添加して、過剰の
NaHを分解した後、溶媒を蒸発させ、粗生成物を、フラ
ッシュカラムクロマトグラフィー（3:2から1:1から2:3
のヘキサン−酢酸エチル）で精製して、R_F 0.41（溶媒
3:2ヘキサン−酢酸エチル）を有する固形物（591mg、3
6.6％）として化合物16を得た。図９を参照のこと。

D.5−［３−｛２−（２−フタルアミドエトキシ）エト
キシ｝プロピン−１−イル］−2',3'−ジデオキシシチ
ジン（17）の合成５−ヨード−2',3'−ジデオキシシチジン６（240mg、
0.71mmol）を、アルゴン雰囲気下で、室温にて、N,N−
ジメチルホルムアミド（4mL）中の、ヨウ化銅（33mg、
0.173mmol）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）
パラジウム（164mg、0.142mmol）、およびトリエチルア
ミン（198μＬ、1.42mmol）の存在下に、化合物16（810
mg、2.96mmol）と12時間反応させた。次いで、反応物
を、メタノール中の4gの炭酸水素塩形態のDowex−１ア
ニオン交換樹脂で希釈した。室温にて１時間撹拌した後
に、反応混合物を濾過し、濃縮した。生成物を、フラッ
シュカラムクロマトグラフィー（13:1ジクロロメタン−
メタノール）で精製し、R_F 0.35（溶媒9:1ジクロロメタ
ン−メタノール）を有する化合物17（245mg、71.3％）
を得た。図10を参照のこと。

E.5−［３−｛２−（２−トリフルオロアセトアミドエ
トキシ）エトキシ｝プロピン−１−イル］−2',3'−ジ
デオキシシチジン（18）の合成化合物17（230mg、0.48mmol）およびエチレンジアミ
ン（1mL）の混合物を80℃にてエタノール（10mL）中で
１時間加熱した。次いで、反応混合物を乾燥するまで蒸
発させ、その残渣をN,N−ジメチルホルムアミド（5mL）
中に溶解し、そしてメチルトリフルオロアセテート（15
mL）を添加した。80℃にて１時間撹拌した後、溶媒を蒸
発させ、そして残渣をフラッシュカラムクロマトグラフ
ィー（13:1ジクロロメタンメタノール）によって精製
し、0.37のR_F（溶媒9:1ジクロロメタン−メタノール）
を有する化合物18（72mg、33.7％）を得た。図10を参照
のこと。

F.5−［３−｛２−（２−トリフルオロアセトアミドエ
トキシ）エトキシ｝プロピン−１−イル］−2',3'−ジ
デオキシシチジンモノホスフェート（20）の合成新たに蒸留したリン酸オキシクロライド（34.8μＬ、
369μmol）を、−30℃で、トリメチルホスフェート（35
0μＬ）中のヌクレオシド18（41.4mg、92μmol）に添加
し、対応のジクロロモノホスフェート19を生成した。反
応混合物を、80分間で−５℃まで暖め、室温で１時間撹
拌を続けた。反応を2M TEAB緩衝液pH8.0でクエンチし、
上記のように調製用逆相HPLCで精製した。生成物に対応
する画分を濃縮して、モノホスフェート20（14.8mg、2
7.6％）を得た。図11を参照のこと。

G.5−［３−｛２−（２−トリフルオロオセトアミドエ
トキシ）エトキシ｝プロピン−１−イル］−2',3'−ジ
デオキシシチジントリホスフェート（22）の合成 N,N−ジメチルホルムアミド（300μＬ）に溶解したモ
ノホスフェート20（14.8mg、28μmol）を、カルボニル
ジイミダゾール（CDI）（13.5mg、83.26μmol）と、１
時間室温にて撹拌した。過剰のCDIを、乾燥メタノール
（80μＬ）の添加によってクエンチした。活性化モノホ
スフェート21を、ｎ−トリブチルアミン（32μＬ）を含
有するN,N−ジメチルホルムアミド（300μＬ）中のトリ
ブチルアンモニウムピロホスフェート溶液（160mg）と
室温にて24時間撹拌した。反応を2M TEAB pH8.0でクエ
ンチし、上記のように、調製用逆相HPLCで精製した。生
成物に対応する画分を濃縮して、トリホスフェート22
（0.9mg、4.7％）を得た。図12を参照のこと。

H.5−［３−｛２−（２−アミノエトキシ）エトキシ｝
プロピン−１−イル］−2',3'−ジデオキシシチジント
リホスフェート（23）の合成精製された保護トリホスフェート22を、濃アンモニア
水（2mL）に取入れ、約48℃にて３時間撹拌した。反応
混合物を濃縮して、化合物23を得て、0.1M TEAB（pH7.
0）で処方して濃度3.5mMにした。処方されたバルクの濃
度および純度は、上記のように、それぞれ、UV/Vis分光
計および分析イオン対HPLCによって確認した。図12を参
照のこと。

実施例７５−｛３−（２−アミノエトキシ）プロピン−１−イ
ル｝−2',3'−ヌクレオチドへの色素の結合 100mM TEA−炭酸水素塩（pH7.0）中のヌクレオシドア
ミノトリホスフェートを、蒸発させて乾燥した。次い
で、250mM炭酸水素塩緩衝液（pH9.0）に再懸濁させた。
色素−NHS溶液（DMSO中）を添加し、室温にて暗所で一
晩撹拌した。反応混合物を、上記のように、調製用アニ
オン交換HPLCで精製した。生成物に対応する画分を濃縮
し、上記のように、調製用逆相HPLCによって再度精製し
た。最終生成物を減圧乾燥し、50mM CAPSO（pH9.6）で
希釈して濃度1mMにした。処方されたバルクの濃度およ
び純度は、上記のように、それぞれ、UV/Vis分光計およ
び分析用イオン対HPLCによって確認した。

実施例８本発明のプロパルギルエトキシアミノジデオキシヌクレ
オチドを使用して改善されたピーク高さの均等性図13は、ターミネーターとして色素−標識ddCTPを使
用した単色配列決定反応を示す。上段のパネルは、プロ
パギルアミドリンカーを使用してのDTAMRA−１−標識タ
ーミネーターを使用した結果を示し、一方、下段のパネ
ルは、本発明のプロパギル−１−エトキシアミドリンカ
ーを使用してのDTAMRA−２−標識ターミネーターを使用
した結果を示す。異なる色素異性体を、最適結果を得る
ために使用した:1異性体はプロパギルアミドリンカーと
の使用に好ましい化合物であり、２異性体は、プロパギ
ル−１−エトキシアミドリンカーとの使用に好ましい化
合物である。図13に示されている配列決定ラダー部分
は、塩基495位および496位の１対のＣから開始し、−21
M13プライマー（正方向）を使用してpGEM−3Zf（＋）
配列中の553位、557位、および560位で単一のＣで終結
する。上段パネルで、6Cグループの最初のＣは、別のピ
ークではなく、リーディングショルダーとしてのみ存在
し、一方下段パネルでは、全6Cは鮮明に分離された。下
段パネルの6Cの分離は、ローダミン型色素と組み合わせ
た本発明のプロパギル−１−エトキシアミドリンカーを
使用して可能な、より均一なピーク高さになされ得る。
隣接ピークのこの増進された分離は、自動DNA配列決定
システムで使用される、自動基底化手順を容易にする。

全刊行物および特許出願は、各個別の刊行物または特
許出願が、特定的におよび個別に、本明細書に参考とし
て援用されているように、同じ範囲で本明細書に参考と
して援用されている。

上記に極わずかの実施態様が詳述されたが、化学の分
野における当業者は、この教示から逸脱することなく、
好ましい実施態様において多数の改変が可能であること
を明確に理解する。このような改変の全ては、以下の請
求の範囲に包含されることが意図される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者ローゼンブルム，バーネットビー. アメリカ合衆国カリフォルニア 95118，サンノゼ，エステルアベニュー 1521 (56)参考文献特開昭63−152364（ＪＰ，Ａ) 特表平11−513388（ＪＰ，Ａ) 国際公開94／17092（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C17H 19/00 - 19/24 C17H 21/00 - 21/04 C12Q 1/68 C12N 15/00 - 15/90 ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の構造を有するヌクレオシド化合物：ここで、R₁およびR₂は、−Ｈ、低級アルキル、保護基、
および標識よりなる群から独立して選択され；Ｂは、７−デアザプリン、プリン、またはピリミジンヌ
クレオシド塩基であり；ここで、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンである場
合、糖部分はプリンまたはデアザプリンのN⁹位で結合さ
れ、そしてＢがピリミジンである場合、糖部分は、ピリ
ミジンのN¹位で結合され；そして、ここで、Ｂがプリンである場合、隣接する三重結合炭素
はプリンの８位に結合され、Ｂが７−デアザプリンであ
る場合、隣接する三重結合炭素は７−デアザプリンの７
位に結合され、そして、Ｂがピリミジンである場合、隣
接する三重結合炭素はピリミジンの５位に結合され； W₁は、−Ｈおよび−OHよりなる群から選択され； W₂は、−OH、または3'位でホスホジエステル結合を形成
し得ないヌクレオシドを担う部分であり；そして、 W₃は、−PO₄、−P₂O₇、−P₃O₁₀、ホスフェートアナロ
グ、および−OHよりなる群から選択される、ただし、W₃が−OHである場合、R₁およびR₂の少なくとも
１つは標識である、ヌクレオシド化合物。
【請求項２】R₁およびR₂の１つが標識である、請求項１
に記載のヌクレオシド化合物。
【請求項３】前記標識が、フルオレセイン型色素であ
る、請求項２に記載のヌクレオシド化合物。
【請求項４】前記標識が、ローダミン型色素である、請
求項２に記載のヌクレオシド化合物。
【請求項５】W₁が−Ｈであり、W₂が−OHまたは前記部分
であり、そしてW₃が−P₃O₁₀である、請求項１に記載の
ヌクレオシド化合物。
【請求項６】W₂が、−OH、または、−Ｈ、アジド、アミ
ノ、フルロ、およびメトキシよりなる群から選択される
部分である、請求項１に記載のヌクレオシド化合物。
【請求項７】Ｂが、ウラシル、シトシン、７−デアザア
デニン、および７−デアザグアノシンよりなる群から選
択される、請求項１に記載のヌクレオシド。
【請求項８】プライマー伸長反応を実施するための方法
であって、以下の工程：テンプレート核酸を提供する工程；オリゴヌクレオチドプライマーを、該テンプレート核酸
の部分にアニーリングさせる工程；および、プライマーを伸長するために、プライマー伸長剤を、プ
ライマー−テンプレートハイブリッドへ添加する工程で
あって、該プライマー伸長剤が下記の構造を有するヌク
レオシド化合物を含む、工程：を包含し、ここで： R₁およびR₂は、−Ｈ、低級アルキル、保護基、および標
識よりなる群から独立して選択され；Ｂは、７−デアザプリン、プリン、またはピリミジンヌ
クレオシド塩基であり；ここで、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンである場
合、糖部分はプリンまたはデアザプリンのN⁹位で結合さ
れ、そしてＢがピリミジンである場合、糖部分はピリミ
ジンのN¹位で結合され；そして、ここで、Ｂがプリンである場合、隣接する三重結合炭素
はプリンの８位に結合され、Ｂが７−デアザプリンであ
る場合、隣接する三重結合炭素は７−デアザプリンの７
位に結合され、そしてＢがピリミジンである場合、隣接
する三重結合炭素はピリミジンの５位に結合され； W₁は、−Ｈおよび−OHよりなる群から選択され； W₂は、−OH、または3'位でホスホジエステル結合を形成
し得ないヌクレオシドを担う部分であり；および、 W₃は、−PO₄、−P₂O₇、−P₃O₁₀、ホスフェートアナロ
グ、および−OHよりなる群から選択される、方法。
【請求項９】R₁およびR₂の一方が標識であり、他方が−
Ｈである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】下記の構造を有するヌクレオシド化合物
を含むプライマー伸長反応のための試薬：ここで、R₁およびR₂は、−Ｈ、低級アルキル、保護基、
および標識よりなる群から独立して選択され；Ｂは、７−デアザプリン、プリン、またはピリミジンヌ
クレオシド塩基であり；ここで、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンである場
合、糖部分はプリンまたはデアザプリンのN⁹位で結合さ
れ、そしてＢがピリミジンである場合、糖部分は、ピリ
ミジンのN¹位で結合され；そして、ここで、Ｂがプリンである場合、隣接する三重結合炭素
はプリンの８位に結合され、Ｂが７−デアザプリンであ
る場合、隣接する三重結合炭素は７−デアザプリンの７
位に結合され、そして、Ｂがピリミジンである場合、隣
接する三重結合炭素はピリミジンの５位に結合され； W₁は、−Ｈおよび−OHよりなる群から選択され； W₂は、−OH、または3'位でホスホジエステル結合を形成
し得ないヌクレオシドを担う部分であり；そして、 W₃は、−PO₄、−P₂O₇、−P₃O₁₀、ホスフェートアナロ
グ、および−OHよりなる群から選択される、化合物を含む、プライマー伸長反応のための試薬。