JP3900244B2 - 堅いリンカーを有するヌクレオチド化合物 - Google Patents

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Description

【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、ポリメラーゼ酵素に対する基質として有用なヌクレオシド／ヌクレオチド化合物、プライマー伸長反応においてこのような化合物を使用するための方法、およびこのようなヌクレオチド化合物を含むポリヌクレオチドに関する。
【０００２】
（発明の背景）
核酸配列決定は、近代生物学および生物工学におけるきわめて重要な技術となっており、基礎生物学的研究から治療薬用の薬剤開発におよぶ分野に関する情報を提供する。収集されるべきＤＮＡ配列データが莫大な量であるため、自動化技術が、情報処理量を増加し、核酸配列決定法の経費を減少するために、開発されてきた（例えば、米国特許第５，１７１，５３４号；Ｃｏｎｎｅｌｌら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、５（４）：３４２−３４８（１９８７）；およびＴｒａｉｎｏｒ、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、６２：４１８−４２６（１９９０））。
【０００３】
好ましい自動核酸配列決定法は、Ｓａｎｇｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、７４：５４６３−５４６７（１９７７））によって開発された酵素的複製技術に基づいている。Ｓａｎｇｅｒの技術では、一本鎖テンプレート核酸の配列を、１組のポリヌクレオチドフラグメントを合成するための核酸ポリメラーゼを使用して決定する。ここで、それらのフラグメントは、（ｉ）核酸配列に相補的な配列を有し、（ｉｉ）一つのヌクレオチドで長さが変化し、そして（ｉｉｉ）既知ヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴで終わる５’末端を有する。この方法では、オリゴヌクレオチドプライマーは、配列決定されるべきテンプレート核酸の３’末端にハイブリダイズされ、プライマーの３’末端は、相補的ポリヌクレオチドフラグメントのポリメラーゼ媒介重合のための開始部位として作用する。酵素的重合工程またはプライマー伸長反応は、テンプレート−プライマーハイブリッドを、４つの伸長可能なヌクレオチド（例えば、デオキシヌクレオチド「ｄＮＴＰ」）、核酸ポリメラーゼ酵素、およびヌクレオチド「ターミネーター」（例えば、２’，３’−ジデオキシヌクレオチドトリホスフェート（「ｄｄＮＴＰ」））と組合せて実施される。ターミネーターの組み込みは、３’末端にヒドロキシ基を欠き、従ってポリメラーゼによってさらに伸長され得ないプライマー伸長生成物を形成する。すなわち、その伸長生成物は「終結される」。組み込みに対するｄｄＮＴＰと対応するターミネーターとの間の競合は、異なる大きさの伸長生成物の分布をもたらし、各伸長生成物は、反応で使用される特定のターミネーターによって終結する。テンプレート核酸の完全な配列を決定するために、４つの並行反応が実施される。各反応は、異なるターミネーターを使用する。伸長生成物の大きさの分布を決定するために、この伸長生成物を電気泳動によって分離して、一つのヌクレオチドで大きさが異なる生成物を分離する。
【０００４】
従来のＳａｎｇｅｒ技術の最近の変法では、各ヌクレオチドターミネーターは蛍光色素で標識され（例えば、Ｐｒｏｂｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３８：３３６−３４１（１９８７）；および米国特許第５，１５１，５０７号）、および熱安定ＤＮＡポリメラーゼ酵素が使用されている（例えば、Ｍｕｒｒａｙ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１７（２１）：８８８９（１９８９））。いくつかの利点が、色素標識ターミネーターを利用してして実現され、例えば、（ｉ）放射性アイソトープの貯蔵、使用、および処分に関する問題が排除されている；（ｉｉ）色素標識プライマーを合成する必要性が排除されている；そして（ｉｉｉ）Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴターミネーターの各々に対して異なる色素標識を使用する場合、４つの全プライマー伸長反応が１つのチューブ中で同時に実施され得る。熱安定ポリメラーゼ酵素の使用は、幾つかのさらなる利点を提供する。例えば、（ｉ）高温で実施される重合反応を可能にし、それによってテンプレートの任意の二次構造を崩壊させ、その結果、より配列依存性の少ない人工物を生じ；そして、（ｉｉ）配列決定反応は温度変化が繰り返され得、それによって産生される伸長産物の量を直線的に増幅し、従って、信頼のおける配列を得るために必要とされるテンプレート核酸の量を減少するように作用する。
【０００５】
Ｓａｎｇｅｒ配列決定法に対する最近のこれらの変法が有効であることが証明されてきた一方、その性能および経済性の最適化に関するいくつかの問題が残存する。Ｓａｎｇｅｒ型核酸配列決定プロセスにおける熱安定ポリメラーゼ酵素と組み合わせられた現在入手可能な色素標識ターミネーターを使用する場合（特に、フルオレセイン型色素標識の場合）に生じる１つの問題は、非標識伸長ヌクレオチドに対して大過剰（例えば、比率５０：１まで）の色素標識ターミネーターが要求されることである。この大過剰の標識ターミネーターは、電気泳動分離工程を実施する前に、配列決定反応産物を精製することを必要にする。これは、組み込まれなかった標識ターミネーター種および真の標識配列決定フラグメントの同時移動により生じる妨害を除外するためである。代表的な洗浄法は、エタノール沈澱法またはクロマトグラフ分離法（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭTM Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ、ＰＥ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｒｅｖｉｓｉｏｎ Ａ、ｐ／ｎ４０２１１６（１９９５年８月）に記載される）を包含する。このような洗浄工程は、配列決定反応産物が直接的に電気泳動分離プロセスへ移される、全自動配列決定システムの開発作業を、非常に困難にする。
【０００６】
Ｓａｎｇｅｒ型核酸配列決定プロセスにおいて、熱安定ポリメラーゼと組み合わせた現在入手可能な色素標識ターミネーターを使用する場合に生じる第二の問題は、標識ターミネーターのプライマー伸長産物への組み込みの程度が変化し、従って、プライマー伸長産物が電気泳動によって分離され、そして蛍光検出を使用して検出される場合、ピーク高さの不均一な分布が生じることである。このような不均一なピーク高さは、それらが自動配列決定およびヘテロ接合体検出の信頼性を、実質的に低くしてしまうために、不利である。
【０００７】
従って、プライマー伸長反応において、非標識の伸長可能なヌクレオチドに対して大過剰を必要とせず、そしてＳａｎｇｅｒ型配列決定反応において、均一なピーク高さ分布を生成する標識ヌクレオチドターミネーター化合物に対する継続する必要が残る。
【０００８】
（要旨）
本発明は、堅いリンカー部分を含む新規なクラスのヌクレオシド／ヌクレオチド化合物、およびこのような化合物を使用する方法についての本発明者らの発見に関する。これらの化合物は、プライマー伸長反応（例えば、Ｓａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列反応、またはＰＣＲ反応）において標識ターミネータとして、および標識鎖伸長ヌクレオチドとして、特に有用である。
【０００９】
本発明の目的は、標識鎖終結または鎖伸長ヌクレオチドを形成するために使用され得る、ヌクレオチドを提供することである。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、標識鎖終結または鎖伸長ヌクレオチドを提供することである。
【００１１】
本発明のなおさらなる目的は、蛍光標識を含む鎖終結ヌクレオチドを提供することであり、ここで、このような標識鎖終結ヌクレオチドの、非標識鎖終結ヌクレオチドに対する減少された過剰濃度が、Ｓａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列プロセスにおいて要求される。
【００１２】
本発明の別の目的は、Ｓａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列決定プロセスにおいて、より均等なピーク高さの分布をもたらす、標識鎖終結ヌクレオチドを提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、標識ポリヌクレオチドを提供することである。
【００１４】
本発明のさらに別の目的は、本発明のヌクレオチド化合物を利用する、プライマー伸長反応を含む方法を提供することである。
【００１５】
第１の局面において、本発明の上記および他の目的は、以下の構造：
ＮＵＣ−Ｌ−Ｓ−ＬＢ／ＬＧ
を有するヌクレオシド／ヌクレオチド化合物によって達成され、ここで、ＮＵＣは、核酸塩基部分Ｂを有するヌクレオシド／ヌクレオチドであり、Ｌは、堅い結合であり、Ｓは、スペーサーであり、そしてＬＢ／ＬＧは、結合対または標識のメンバーである。ＮＵＣは、Ｂを介してＬに付加され、その結果、Ｂがプリンである場合、Ｌはプリンの８位に付加され、Ｂが７−デアザプリンである場合、Ｌは７−デアザプリンの７位に付加され、そしてＢがピリミジンである場合、Ｌはピリミジンの５位に付加される。本発明の重要な特徴において、Ｌは以下の構造：
【００１６】
【化１２】
Figure 0003900244
を有し、ここで、
ｎ、ｏおよびｐの各々が０〜３の範囲の整数であり、そしてｎ、ｏおよびｐの合計が少なくとも２であり；そしてＷ、Ｘ、ＹおよびＺの各々は、炭素または窒素のいずれかである。
【００１７】
第２の局面において、本発明は、上記のヌクレオシド／ヌクレオチド化合物を組み込むポリヌクレオチドを含有する。
【００１８】
第３の局面において、本発明は、テンプレート核酸を提供する工程、プライマーテンプレートハイブリッドを形成するために、このテンプレート核酸の部分にオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングする工程、およびプライマーを伸長するために、このプライマーテンプレートハイブリッドにプライマー伸長試薬を添加する工程を含むプライマー伸長反応を実施するための方法を含み、ここで、このプライマー伸長試薬は、上記のようなヌクレオシド／ヌクレオチド化合物を含む。
【００１９】
本発明のこれらおよび他の目的、特徴、および利点は、以下の説明、図面、および添付の特許請求の範囲を参考にして、よりよく理解されるようになる。
【００２０】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明の好ましい実施形態に対して、詳細に参照がなされ、その例は添付の図面に示される。本発明は好ましい実施形態に関して記載されるが、それらが、本発明をこれらの実施形態に限定することを意図しないことが理解される。反対に、本発明は、代替、改変、および等価物を包含することを意図し、それらは、添付の特許請求の範囲によって規定されるように、本発明の範囲内に包含され得る。
【００２１】
一般的に、本発明は、ポリメラーゼ酵素についての基質として有用な、新規の種類のヌクレオシド／ヌクレオシド化合物、このような化合物を含むポリヌクレオチド、およびプライマー伸長反応においてこのような化合物を使用するための方法を包含する。本発明の化合物は、Ｓａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列決定法において使用するための色素標識ヌクレオチド鎖終結剤の調製において、およびプライマー伸長反応（例えばＰＣＲ）を含む方法において使用するための色素標識ヌクレオチド鎖伸長剤の調製における特定の応用を見いだす。
【００２２】
本発明は、目的のヌクレオチドが、熱安定ＤＮＡポリメラーゼ酵素に対する、特に良好な基質であるという発見に一部基づく。すなわち、（ｉ）Ｓａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列決定反応おいて、現在入手可能な標識ターミネーターを使用する場合に必要とされる量と比較して、有意に減少されたモル過剰量が要求される、そして（ｉｉ）Ｓａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列決定プロセスにおいて、現在入手可能な標識ターミネーターを使用する場合に見られる分布と比較して、ピーク高さのより均一な分布が見られる、という発見に一部基づく。
【００２３】
（Ｉ．定義）
他に示さない限り、本明細書中で使用される以下の用語および句は、以下の意味を有することを意図する：
「Ｔａｑポリメラーゼ」は、生物Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ酵素を意味し、これは、その変異体および／または組換え形態を含む。
【００２４】
用語「標識」は、本発明のヌクレオシド／ヌクレオチドに結合される場合、このようなヌクレオシド／ヌクレオチド、およびこのようなヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが、公知の検出手段を使用して検出可能となる部位を指す。代表的な標識には、発蛍光団、発色団、放射性同位体、スピンラベル、酵素標識、化学ルミネセンス標識などが挙げられ、これらは標識抗体またはアビジンのような、検出可能な抗−リガンドに高い親和性で特異的に結合し得る、抗原またはビオチンのような適切なディテクターまたはリガンドによって、標識化合物の直接検出を可能にする。好ましくは、標識は、フルオレセイン型またはローダミン型色素のような、蛍光色素である。
【００２５】
「結合基」は、「相補的官能基」と反応して、「結合」を形成し得る部位を意味する。結合基またはその関係する相補的官能基は、本明細書中で「結合対」と称される。好ましい結合対には、イソチオシアネート、塩化スルホニル、４，６−ジクロロトリアジニル、スクシンイミジルエステル、または他の活性カルボキシレートの群から選択される第一のメンバー、およびアミンである第二のメンバーが含まれる。好ましくは、結合対の第二のメンバーが、スルフヒドリルである場合にはいつでも、結合対の第一のメンバーは、マレイミド、ハロアセチル、またはヨードアセトアミドである（Ｒ．Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（１９９２）を参照）。特定の好ましい実施形態において、結合対の第一のメンバーは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルであり、そして結合対の第二のメンバーはアミンであり、ここで、ＮＨＳエステルを形成するために、カルボキシレート部位は、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応される。
【００２６】
用語「ヌクレオシド」は、１’位でペントースに結合されるプリン、デアザプリンまたはピリミジン核酸塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、デアザアデニン、デアザグアノシンなど）からなる化合物をいう。ヌクレオシド塩基が、プリンまたは７−デアザプリンである場合、このペントースは、プリンまたはデアザプリンの９位で核酸塩基に結合され、そして、核酸塩基がピリミジンである場合には、ペントースは、ピリミジンの１位で核酸塩基に結合される（例えば、ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ、ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ 第２版（Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、１９９２））。本明細書中で使用されているように、用語「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドのホスフェートエステル（例えば、トリホスフェートエステル）を指し、ここで、エステル化の最も一般的な部位は、ペントースのＣ−５位に結合されたヒドロキシル基である。本明細書中で使用される、用語「ヌクレオシド／ヌクレオチド」は、ヌクレオシドおよびヌクレオチドの両方を包含する一連の化合物を指す。ヌクレオシド／ヌクレオチドに関する「アナログ」は、改変核酸塩基部分、改変ペントース部分、および／または改変ホスフェート部分を有する合成アナログ（例えば、Ｓｃｈｅｉｔ、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８０）に一般に記載される）を含む。一般に、ホスフェートアナログは、ホスフェートのアナログを含み、ここで、リン原子は＋５の酸化状態にあり、そして酸素原子の１つ以上が非酸素部位と置き換えられている（例えば、硫黄）。代表的なホスフェートアナログには、限定されないが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニリデート、ホスホラミデート、ボロノホスフェートが挙げられ、これらは、対イオンが存在するならば、会合した対イオン（例えば、Ｈ+、ＮＨ4 +、Ｎａ+）を含む。代表的な塩基アナログには、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、プソイドウリジン、Ｃ−５−プロピン、イソシトシン、イソグアニン、２−チオピリミジンなどのアナログが挙げられるが、これらに限定されない。代表的な糖アナログには、２’−または３’位が、水素、ヒドロキシ、アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、アリルオキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、およびフェノキシ）、アジド、アミノまたはアルキルアミノ、フルオロ、クロロならびにブロモである２’−または３’−改変体が挙げられるが、これらに限定されない。用語「標識ヌクレオシド／ヌクレオチド」は、結合を介して式Ｉの色素化合物に共有結合されたヌクレオシド／ヌクレオチドを指す。
【００２７】
用語「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドモノマーまたはそのアナログのポリマーを意味し、これは、２本鎖および１本鎖デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、それらのα−アノマー形態などを含む。通常、モノマーは、ホスホジエステル結合によって結合され、ここで、本明細書中で、用語「ホスホジエステル結合」は、ホスホジエステル結合またはそのホスフェートアナログを含む結合を指し、これらは、対イオンが存在するならば、付随の対イオン（例えば、Ｈ+、ＮＨ4 +、Ｎａ+）を含む。ポリヌクレオチドは、典型的に、数モノマー単位（例えば、５〜４０）〜数千モノマー単位のサイズの範囲である。ポリヌクレオチドが文字の配列によって表現される（例えば、「ＡＴＧＣＣＴＧ」）場合はいつでも、他に示されない限り、ヌクレオチドは、左から右へ５’→３’の順番であり、そして「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシチジンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを示し、そして「Ｔ」はデオキシチミジンを示すことが理解される。
【００２８】
用語「置換された」は、１つ以上の水素原子が１つ以上の非水素原子、官能基または部位で置き換えられた分子を意味する。例えば、非置換窒素は、−ＮＨ2であるが、一方、置換された窒素は、−ＮＨＣＨ3であり、そして非置換炭素は、−ＣＨ3であるが、一方、置換された炭素は、−ＣＨ2Ｃｌである。代表的な置換基には以下が挙げられるが、これらに限定されない：ハロ（例えば、フッ素および塩素）、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、スルフェート、スルホネート、スルホン、アミノ、アンモニウム、アミド、ニトリル、低級アルコキシ、フェノキシ、芳香族、フェニル、多環式芳香族、電子リッチ複素環水可溶化基、および結合基。
【００２９】
「多環式芳香族」は、複数の環構造（ビアリールおよび縮合ベンゼノイド炭化水素を含む）を有する芳香族炭化水素を意味する。ビアリールは、ベンゼノイド化合物であり、ここで、２つ以上の環が単結合によって一緒に結合されている。この種類の親系は、ビフェニルである。縮合ベンゼノイド化合物は、環の各対が２つの炭素を共有するような方法でオルト位で、一緒に縮合した２つ以上のベンゼン環によって特徴付けられる。この基の最も簡単なメンバーは、２つの環を有するナフタレン、それぞれ３つの環を有するアントラセンおよびフェナントレンである。
【００３０】
「電子リッチ複素環」は、１つ以上の環原子が炭素ではない、すなわちヘテロ原子である環状化合物を意味し、そしてこのヘテロ原子は、６π電子系に寄与する不対電子を有する。代表的な電子リッチ複素環には、ピロール、インドール、フラン、ベンゾフラン、チオフェン、ベンゾチオフェン、および他の類似の構造が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
「結合基」は、試薬またはエネルギー移動色素対のメンバーに結合された「相補的官能基」と反応し得る部位を意味し、このような反応は、色素を試薬またはエネルギー移動色素対のメンバーに接続する「結合」を形成する。好ましい結合基は、相補的官能基がアミンである場合にはいつでも、イソチオシアネート、塩化スルホニル、４，６−ジクロロトリアジニル、スクシンイミジルエステル、または他の活性カルボキシレートを含む。好ましくは、この結合基は、相補的官能基がスルフヒドリルである場合にはいつでも、マレイミド、ハロアセチル、またはヨードアセトアミドである。Ｒ．Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．（１９９２）を参照のこと。特に好ましい実施形態において、結合基はＮ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルであり、そして相補的官能基はアミンであり、ここで、ＮＨＳエステルを形成するために、カルボキシレート結合基を含む、本発明の色素が、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応される。
【００３２】
「水可溶化基」は、水溶液中で、本発明の化合物の溶解度を増加させる置換基を意味する。代表的な水可溶化基には、以下が挙げられるが、これらに限定されない：第四級アミン、スルフェート、スルホネート、カルボキシレート、ホスフェート、ポリエーテル、ポリヒドロキシル、およびボロネート。
【００３３】
用語「キサンテン型色素」は、以下の縮合３環系：
【００３４】
【化１３】
Figure 0003900244
を含む色素分子の種類を指す。
【００３５】
用語「フルオレセイン型色素」とは、以下の置換縮合３員環を含むキサンテン色素分子のクラスをいう：
【００３６】
【化１４】
Figure 0003900244
ここで各デオキシ環の位置で様々な置換が可能である。特に好ましいフルオレセイン型色素のサブセットには、４，７−ジクロロフルオレセイン（Ｍｅｎｃｈｅｎ）が挙げられる。ＤＮＡ配列決定法で蛍光標識として使用されるフルオレセイン型色素の例には、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、５または６−カルボキシ−４，７，２’，７’−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、５または６−カルボキシ−４，７，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、５または６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、および、５−カルボキシ−２’，４’，５’，７’−テトラクロロフルオレセイン（ＺＯＥ）が挙げられる。しばしば、−１または−２の標記は、例えば、ＨＥＸ−１のように、特定色素の略語の後に置かれる。「−１」および「−２」の標記は、使用されている特定の５または６の色素の異性体を示す。１および２の異性体は、Ｃ−８カラムおよび１５％アセトニトリル／８５％ ０．１ Ｍトリエチルアンモニウムアセテートから３５％アセトニトリル／６５％ ０．１ Ｍトリエチルアンモニウムアセテートの溶出勾配を使用する逆相クロマトグラフィー分離システムにおいて、遊離色素の溶出順序（１異性体は最初に溶出）によって定義される。
【００３７】
用語「ローダミン型色素」とは、以下の縮合３環系を含むキサンテン色素分子のクラスをいう：
【００３８】
【化１５】
Figure 0003900244
ここで、好ましくは、Ｙ1〜Ｙ4は個別に、水素または低級アルキルであり、または、一緒になる場合、Ｙ1およびＲ2がプロパノであり、そしてＹ2およびＲ1がプロパノであるか、あるいは一緒になる場合、Ｙ3およびＲ3がプロパノであり、Ｙ4およびＲ4がプロパノである。Ｒ1〜Ｒ4位を含む各デオキシ環の位置で、種々広範の置換が可能である。ヌクレオシド／チド標識として有用な代表的なローダミン型色素には、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、４，７−ジクロロテトラメチルローダミン（ＤＴＡＭＲＭ）、ローダミンＸ（ＲＯＸ）、ローダミン６Ｇ（Ｒ６Ｇ）、ローダミン１１０（Ｒ１１０）などが挙げられる（Ｂｅｒｇｏｔら、米国特許第５，３６６，８６０号（１９９４）；Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０（１０）：２４７１〜２４８３（１９９２））。
【００３９】
本明細書で使用されているように、用語「プライマー−伸長剤」とは、オリゴヌクレオチドプライマーの酵素的テンプレート媒介伸長を行うのに必要な成分を含有する試薬を意味する。プライマー伸長剤は、（ｉ）ポリメラーゼ酵素、例えば、Ｔａｑポリメラーゼのような熱安定ポリメラーゼ酵素；（ｉｉ）緩衝液；（ｉｉｉ）鎖伸長ヌクレオチド、例えば、デオキシヌクレオチドトリホスフェート、例えば、デオキシグアノシン５’−トリホスフェート、７−デアザデオキシグアノシン５’−トリホスフェート、デオキシアデノシン５’−トリホスフェート、デオキシチミジン５’−トリホスフェート、デオキシシチジン５’−トリホスフェート；および必要に応じて、Ｓａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列決定反応において、（ｉｖ）１つ以上の鎖終結ヌクレオチド、例えば、ジデオキシヌクレオチドトリホスフェート、例えば、ジデオキシグアノシン５’−トリホスフェート、７−デアザジデオキシグアノシン５’−トリホスフェート、ジデオキシアデノシン５’−トリホスフェート、ジデオキシチミジン５’−トリホスフェート、およびジデオキシシチジン５’−トリホスフェートを含む。
【００４０】
「テンプレート核酸」とは、一本鎖形態で存在し得、プライマーオリゴヌクレオチドとアニールし得る任意の核酸をいう。代表的なテンプレート核酸には、ＤＮＡ、ＲＮＡが挙げられ、ＤＮＡまたはＲＮＡは、一本鎖または二本鎖であり得る。より詳細には、テンプレート核酸は、ゲノムＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ反応からのＤＮＡ増幅産物などであり得る。テンプレートＤＮＡの調製方法は、他に見出され得る（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴM Ｄｙｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＡＮ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ＦＳ，Ｐｒｏｔｏｃｏｌ，Ｒｅｖｉｓｉｏｎ Ｃ，ｐ／ｎ ４０２１１４（１９９６））。
【００４１】
（ＩＩ．ヌクレオチド化合物）
（Ａ．構造）
第１の局面において、本発明は、例えば、Ｓａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列決定反応においてポリメラーゼ基質として有用な堅いリンカーを含むヌクレオシド／チド化合物の新規なクラスを包含する。これらの化合物はすぐ下の式Ｉに示される一般構造を有し、その置換形態を含む：
ＮＵＣ−Ｌ−Ｓ−ＬＢ／ＬＧ
式Ｉ
ここで、ＮＵＣは、核酸塩基部分Ｂを有するヌクレオシド／チドであり、Ｌは堅い結合であり、Ｓはスペーサーであり、そしてＬＢ／ＬＧは結合基または標識である。ＮＵＣは、Ｂを介してＬに結合され、その結果、Ｂがプリンの場合、Ｌはそのプリンの８位に結合され、Ｂが７−デアザプリンの場合、Ｌはその７−デアザプリンの７位に結合され、そして，Ｂがピリミジンの場合、Ｌはそのピリミジンの５位に結合される。本発明の化合物の重要な特徴において、Ｌは以下の構造を有する：
【００４２】
【化１６】
Figure 0003900244
ここで、ｎ、ｏおよびｐの各々は、０〜３の範囲の整数であり、ｎとｏとｐとの和は、少なくとも２であり、そしてＷ、Ｘ、ＹおよびＺの各々は、−ＣＨおよび窒素からなる群から選択され、その置換形態を含む。
【００４３】
ＮＵＣは任意の適切なヌクレオシド、ヌクレオチドまたはそれらのアナログであり得る。しかし、好ましい実施形態において、ＮＵＣの糖部分は、２’−デオキシリボヌクレオチド、３’−デオキシリボヌクレオチド、２’，３’−ジデオキシリボヌクレオチド、２’，３’−ジデオキシ−３’−フルオロ−リボヌクレオチド、２’，３’−ジデオキシ−２’−フルオロ−リボヌクレオチド、２’，３’−ジデオキシ−３’−アジド−リボヌクレオチド、２’，３’−ジデオキシ−２’−アジド−リボヌクレオチド、２，３’−ジデオキシ−２’−アミノ−リボヌクレオチド、２，３’−ジデオキシ−３’−アミノ−リボヌクレオチド、および２’，３’−デヒドロリボヌクレオチドからなる群から選択される。特に好ましい実施形態において、ＮＵＣは、２’，３’−ジデオキシリボヌクレオチド、２’，３’−ジデオキシ−３’−フルオロ−リボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドである。
【００４４】
好ましくは、式Ｉの化合物の堅い結合部分において、ＷおよびＸのうち一方が炭素であり、ＺおよびＹのうち一方が炭素である。堅い結合のさらに好ましい実施形態において、ｎは１または２であり、ｏは０、１または２であり、そして／またはｐは０または１である。より好ましくは、ｎは１または２であり、ｏは１または２であり、そしてｐは０または１である。いくつかの特に好ましい堅い結合構造をすぐ下に示す：
【００４５】
【化１７】
Figure 0003900244
Ｓは、堅い結合Ｌと結合ペアＬＢ／ＬＧの標識またはメンバーとを結合するのに役立つスペーサーである。Ｓは、ヌクレオシド／ヌクレオチド化合物、またはこのようなヌクレオチドを含む化合物に機能性（例えば、高められたヌクレアーゼ耐性、溶解性、輸送特性、ハイブリダイゼーション、変化した電気泳動易動度など）を加え得る。Ｓは、本発明の中心的な特徴ではなく、一般的な機能を提供するので、Ｓは様々な形態を有し得ることが理解される。好ましくは、Ｓは、低級アルキル、低級アルキレンオキシド、またはアミド、カルバメート、スルホンアミド、あるいはそれらの任意の組み合わせである。より好ましくは、Ｓは、低級アルキルまたは低級アルキレンオキシドである。最も好ましくは、Ｓは、例えば、以下の構造を有する低級アルケニルオキシドである：
【００４６】
【化１８】
Figure 0003900244
ここで、ｎは１〜８の範囲であるか、またはより好ましくは、ｎは１または２である。
【００４７】
ＬＢ／ＬＧは、結合ペアの任意の適切な標識またはメンバーであり得る。ＬＢ／ＬＧが結合ペアのメンバーである場合、好ましくは、このメンバーはアミノであり、そしてより好ましくは、アミンは第１級アミンである。ＬＢ／ＬＧが標識の場合、この標識は、標識をスペーサーＳに結合するための結合を含む。結合は、好ましくは、結合基と相補的官能基との反応によって形成される。好ましい実施形態において、ＬＢ／ＬＧは標識であり、好ましくはこの標識は、キサンテン型色素（例えば、ローダミまたはフルオレセイン型色素）である。
【００４８】
（Ｂ．合成）
３つの好ましい代替のストラテジーが、本発明のヌクレオチド／シドの合成に利用可能である。１つのアプローチ（本明細書中で「収束（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ）合成」と称される）において、堅い結合Ｌ、スペーサーＳおよび結合ペアまたは標識ＬＢ／ＬＧのサブ要素（まとめて「リンカーアーム部分」と称される）は、ヌクレオシドにそれらが結合する前に構築される。次いで、完全に構築されたリンカーアーム部分が単一反応工程でヌクレオシドに結合される。第２のアプローチ（本明細暑中で「逐次合成」と称される）において、リンカーアームの第１要素が、ヌクレオシドに結合され、引き続いてこの第１要素の活性化によって、リンカーアーム部分の第２要素の結合を行う。このプロセスは、リンカーアーム部分の全ての要素がヌクレオチド／シドに組み込まれるまで連続的に繰り返される。第３のアプローチは収束合成と逐次合成の両方のストラテジーを合わせる。すなわち、リンカーアーム部分のいくつかの要素は、多要素中間体に予め構築され、次いで、この中間体はすでにヌクレオシドに組み込まれた要素に結合される。特定のヌクレオシド／チオ生成物の調製に好ましいストラテジーは、個々のカップリング化学の利便性、およびヌクレオチド／シド上の官能基とのそれらの適合性に依存する。
【００４９】
代表的な収束合成は、以下のように実施される。２つのアセチレン基が、２つの別々に活性化可能な脱離基を含む芳香族前駆体を使用して、２つの別個の工程で芳香族基に結合される。第１の工程において，ｐ−ハロフェノールは、低原子価のパラジウム触媒の存在下で第１の一置換アセチレンと結合され、ハロゲン原子の置換によってアセチレン置換フェノールが得られる（例えば、図２の化合物１〜１１を参照のこと）。第２の工程において、トリフラート無水物を用いて、フェノールヒドロキシルをそのトリフラートとして活性化し、続いて低原子価のパラジウム触媒の存在下で第２の一置換アセチレン部分をカップリングすることによって、所望の構造的特徴が得られる（例えば、図２の化合物１１〜１４を参照のこと）。第１のアセチレン置換基がシリル保護基を含む場合、これはフッ化物イオンを用いて除去され得る（例えば、図２の化合物１４〜１５を参照のこと）。次いで、得られる一置換中間体は、低原子価のパラジウム触媒の存在下で、活性化ヌクレオシド（例えば、５−ハロピリミジン、８−ハロプリン、または７−ハロ−７−デアザ−プリン）と結合されて、保護されたリンカーヌクレオシドを形成する（例えば、図１０の化合物１５〜３７を参照のこと）。
【００５０】
芳香族基へのアセチレン基の段階的な置換はまた、２個の脱離基を含む芳香族環を使用して達成され得る。ここで第１位置の脱離基は、第２位置の脱離基より置換活性（ｌａｂｉｌｅ）である。従って、例えば、２，５−ジブロモピリジンにおいて、低原子価のパラジウム触媒を用いる２位におけるアセチレン置換は、５位における置換を行うことなく起こる。例えば、図５の化合物２２〜２５を参照のこと。
【００５１】
本発明のヌクレオシド／チドを合成するための第２の方法において、逐次合成技術が用いられる。例えば、複数のアセチレンユニットを含むリンカーアーム部分の場合、第１の一置換アセチレン基の活性化ヌクレオシドへの付加は、上記に記載されるように行われる（例えば、図１５の化合物３３〜４２を参照のこと）。次に、第１のアセチレン基の脱保護の後、さらなる一置換アセチレン基が、塩化銅（Ｉ）および酸素を使用して第１アセチレンに結合される（例えば、図１５の化合物４２〜４４を参照のこと）。あるいは、上記のような低原子価のパラジウム触媒を使用して、芳香族環が付加され得る。さらなるアセチレン基または芳香族環が、これらの合成工程の繰り返しによって付加され得る。
【００５２】
本発明のヌクレオシド／チドを合成するための第３の方法において、生成物は、逐次合成技術と収束合成技術との組み合わせを使用して調製される。例えば、脱離基を含む芳香族環、およびその脱離基に対してパラ位にあるアセチレン基は、第１の方法に記載されるように、パラ−ハロフェノールおよび一置換アセチレン基を使用して調製され得る。一置換アセチレンヌクレオチド／シドは、第２の方法に記載されるように調製され得る。次いで、このアセチレンは、上記のように、低原子価のパラジウム触媒を使用して、この中間体に結合されて、所望の生成物が生成する。
【００５３】
（ＩＩＩ．ヌクレオチド化合物の使用方法）
本明細書中で「フラグメント分析」または「遺伝子分析」法と称される好ましいカテゴリーの方法において、標識ポリヌクレオチドフラグメントは、テンプレート指向性（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）酵素的合成（例えば、ポリメラーゼ指向性プレイマー伸長反応）によって生成される。詳細には、本発明は、このようなプレイマー伸長反応を実施するための方法を含み、このプライマー伸長反応は、（１）テンプレート核酸を提供する工程、（２）プライマー−テンプレートハイブリッドを形成するために、オリゴヌクレオチドプレイマーをテンプレート核酸の一部分にアニーリングする工程および（３）プライマーを伸長するために、プライマー伸長試薬をプライマー−テンプレートハイブリッドに添加する工程であって、このプライマー伸長試薬は、式Ｉのヌクレオチド化合物の構造を有するヌクレオチド化合物を含む、工程を包含する。
【００５４】
好ましくは、本発明のプレイマー伸長方法において、プライマー伸長試薬は、熱安定性のポリメラーゼ（例えば、ｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、ＢＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼまたはＴａｑポリメラーゼ酵素（例えば、ＰＣＲプライマー：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒ編、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）））を含む。より好ましくは、熱安定性ポリメラーゼは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、またはＦ６６７位に変異を有する変異体Ｔａｑポリメラーゼ酵素（例えば、ＴａｂｏｒおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ，ＥＰ ０ ６５５ ５０６）である。より好ましくは、変異は、Ｆ６６７Ｙである。本発明のプライマー伸長反応のさらに好ましい実施形態において、Ｔａｑ ポリメラーゼ酵素は、Ｆ６６７Ｙ変異に加えて、６６０、６６４、６６５および／または６８１位に変異を含む変異体である。米国出願番号０９／０４１，８７８（１９９８年３月１２日出願）を参照のこと。これらの位置における好ましい変異は、Ｒ６６０Ｄ、Ｒ６６０Ｅ、Ｒ６６０Ｃ、Ｒ６６０Ｓ、Ｒ６６０ＰおよびＥ６８１Ｇを含む。特に好ましい実施形態において、変異体Ｔａｑポリメラーゼ酵素は、変異Ｒ６６０ＣまたはＲ６６０Ｓ、Ｒ６６０ＰおよびＦ６６７Ｙを含む。
【００５５】
プライマー伸長反応に続いて、フラグメントはサイズ依存分離プロセス（例えば、電気泳動もしくはクロマトグラフィー）、または配列依存様式でフラグメントに結合するポリヌクレオチドプローブのセットへのハイブリダイゼーションに供され得る（例えば、Ｄｒｍａｎａｃら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６：５４〜５８（１９９８）、Ｒａｍｓａｙ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６：４０〜４４（１９９８）、および米国特許第５，２０２，２３１号）。好ましい実施形態において、分離またはハイブリダイゼーションに続いて、例えば、レーザー誘発蛍光によって、フラグメントが検出される。特に好ましい実施形態において、複数のクラスのポリヌクレオチドが同時に分離またはハイブリダイズされ、異なるクラスがスペクトル的に分解可能な標識によって区別される。
【００５６】
特に好ましいフラグメント分析法において、本発明に従って同定されたクラスは、末端ヌクレオチドに関して定義され、その結果、４つの可能な末端塩基と、区別して検出可能な標識のセットのメンバーとの間で、対応が確立される。例えば、スペクトル分解可能な蛍光標識が使用される場合、このようなセットは、市販の分光光度計を用いて発光および吸収のバンド幅を測定することによって、容易に構築される。より好ましくは、ＤＮＡ配列決定の化学的または鎖終結法の状況において、クラスが生じ、最も好ましくは、鎖終結法（すなわち、ジデオキシＤＮＡ配列決定、またはＳａｎｇｅｒ型配列決定）の状況において、クラスが生じる。
【００５７】
Ｓａｎｇｅｒ型配列決定は、配列が決定されるべき単鎖または二本鎖ＤＮＡテンプレートを使用する、インビトロでのＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ鎖の合成を含む。合成は、規定された部位（この部位に基づいて、オリゴヌクレオチドプライマーがテンプレートにアニールする）で開始される。この合成反応は、連続したＤＮＡ伸長を支持しないヌクレオチドアナログの組み込みによって終結される。代表的な鎖終結ヌクレオチドアナログには、２’，３’−ジデオキシヌクレオシド５’−トリホスフェート（ｄｄＮＴＰ）が挙げられ、これは３’から５’のＤＮＡ鎖伸長に必要な３’−ＯＨを欠く。適切な割合のｄＮＴＰ（２’−デオキシヌクレオシド５’トリホスフェート）、および４個のｄｄＮＴＰのうちの１個が使用される場合、酵素触媒重合は、ｄｄＮＴＰが組み込まれる各部位における鎖のわずかな群において終結する。蛍光標識したプライマーまたは標識ｄｄＮＴＰが各反応に使用される場合、配列情報は、高分解能電気泳動による分離の後の蛍光によって検出され得る。鎖終結法において、本発明のヌクレオチドは標識ジデオキシヌクレオチドを形成するために使用され得る。
【００５８】
プライマー伸長フラグメントがサイズ依存分離プロセスに供される場合、好ましくは、これらは電気泳動手順によって分離される（例えば、上記のＧｏｕｌｄおよびＭａｔｔｈｅｗｓ；ＲｉｃｋｗｏｏｄおよびＨａｍｅｓ編、Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８１；Ｏｓｔｅｒｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｎｅｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第１巻 Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，１９８４；または米国特許第５，３７４，５２７号、同第５，６２４，８００号、および／または同第５，５５２，０２８号）。好ましくは、このタイプの電気泳動マトリクスは、約２〜２０重量％の間の濃度（重量対容量）を有する架橋されたまたは架橋されていないポリアクリルアミドである。より好ましくは、ポリアクリルアミドの濃度は、約４〜８％の間である。好ましくは、特に、ＤＮＡ配列決定の状況において、電気泳動マトリクスは変性剤（例えば、ウレア、ホルムアミドなど）を含む。このようなマトリクスを構築するための詳細な手順は、Ｍａｎｉａｔｉｓら、「Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｏｗ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ ｉｎ Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ Ｇｅｌｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ８９％ Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ ｏｒ ７Ｍ Ｕｒｅａ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５：２９９〜３０５（１９８０）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、「Ｃｈａｉｎ Ｌｅｎｇｔｈ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｍａｌｌ Ｄｏｕｂｌｅ− ａｎｄ Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｂｙ Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１４：３７８７〜３７９４（１９７５）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１７９〜１８５頁（１９８２）；およびＡＢＩＰＲＩＳＭTM３７７ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｍａｎｕａｌ，Ｒｅｖ．Ａ，１９９５年１月，第２章（ｐ／ｎ ９０３４３３，Ｔｈｅ Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）に示される。特定の分離に用いられる最適な電気泳動条件（例えば、ポリマー濃度、ｐＨ、温度、変性剤の濃度）は、これらが単鎖であろう二本鎖であろうと、多くの因子（分離されるべき核酸のサイズ範囲、それらの塩基組成、および情報が電気泳動によって調査されるクラスの特徴を含む）に依存する。従って、本発明の適用は、標準予備試験が特定の分離のための条件を最適化することを必要とし得る。
【００５９】
電気泳動分離に続いて、標識ポリヌクレオチドフラグメントが、例えば、蛍光発光を測定することによって検出される。代表的な蛍光ベースの電気泳動検出システムは、他で、例えば、米国特許第５，５４３，０２６号；同第５，２７４，２４０号；同第４，８７９，０１２号；同第５，０９１，６５２号および同第４，８１１，２１８号に記載される。
【００６０】
（ＩＶ．実施例）
本発明は以下の実施例の考察によってさらに明らかになり、これらの実施例は本発明の純粋な例であることを意図し、本発明の範囲をいずれの方法でも制限することを意図しない。
【００６１】
（材料および方法）
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を、シリカゲル６０−Ｆ254の２５０μｍの層でプレコーティングしたガラスプレート上で実施した：この化合物を、蛍光をクエンチするか、および／または５％硫酸を用いて焦がすことにより位置決めした。他に示されない限り、全ての精製は、ＳＩＰブランドのシリカゲル６０Å（２３０〜４００メッシュ ＡＳＴＭ）で実施されるフラッシュカラムクロマトグラフィーにより行った。1Ｈ ＮＭＲスペクトルは、室温で、ＣＤＣｌ3（内部Ｍｅ4Ｓｉ、δ ０）またはＤ2Ｏ（外部Ｍｅ4Ｓｉ、δ ０）に溶解した溶液を、３００ＭＨｚで記録した。ＣＤＣｌ3またはＤ2Ｏに溶解した溶液を、13Ｃ ＮＭＲスペクトルは７５．５ＭＨｚで記録し、19Ｆ ＮＭＲスペクトルは２８２．２３ＭＨｚで記録し、そして31Ｐ ＮＭＲスペクトルは、Ｄ2Ｏに溶解した溶液を１２１．４４ＭＨｚで記録した。全ての場合において、観測されるＮＭＲデータは示された構造と一致した。生成物の純度は分析用ＨＰＬＣにより分析した。他に示されない限り、全ての反応は周囲温度で行い、後処理において、有機溶媒の溶液を、等量の水溶液で洗浄した。４０〜５０℃のバス温で、水アスピレーターの真空下で、ロータリーエバポレーターで濃縮する前に、有機溶液を乾燥した（無水Ｎａ2ＳＯ4）。
【００６２】
陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＡＥ−ＨＰＬＣ）を以下のように行った。カラム：ＡｑｕａｐｏｒｅＴＭ ＡＸ−３００、７μｍの粒子サイズ、２２０×４．６ｍｍ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；勾配：２０分にわたって１．５ｍｌ／分で、４０％アセトニトリル：６０％重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ、０．１Ｍ）〜４０％アセトニトリル：６０％ＴＥＡＢ（１．５Ｍ）、続いてアイソクラチック溶出；検出：２６０ｎｍにおけるＵＶ吸光度。
【００６３】
逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を以下のように行った。カラム：Ｓｐｈｅｒｉ−５ ＲＰ−Ｃ１８、５μｍの粒子サイズ、２２０×４．６ｍｍ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；勾配：２０分にわたって１．５ｍｌ／分で、１００％トリエチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡＡ、０．１Ｍ）〜４０％アセトニトリル：６０％ＴＥＡＡ、続いて、５分間にわたって１．５ｍＬ／分で、４０％〜１００％アセトニトリル。
【００６４】
（実施例１）
（ヌクレオシド保護リンカー化合物３４の合成（図１および８を参照のこと））
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の１（１当量）の撹拌溶液に、ＮａＨ（１．２当量、８０％）を滴下した。ＮａＨ添加を完了した後、室温で０．５時間撹拌を続け、次いでこの反応溶液を０℃に冷却した。ブロミド２（２当量）を添加し、０℃で０．５時間撹拌を続け、続いて室温で２時間撹拌した。過剰のＮａＨを分解するためにメタノールを慎重に添加した後、溶媒をエバポレートし、この粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、固形物として３を得た。
【００６５】
ピリジン（１５ｍｌ）中の３（１当量）の溶液に、塩化メタンスルホニル（２当量）を加え、０℃で１時間撹拌し、次いで、室温で１２時間撹拌した。次いで、この混合物を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、４を得た。
【００６６】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の４（１当量）の溶液に、フタルアミドカリウム５（１．５当量）を加えた。７０℃で１２時間撹拌後、この混合物を濃縮し、次いでジクロロメタン（１００ｍＬ）で希釈した。濾過によって固形物を除去した後、有機層を水で洗浄し、乾燥し、そして濃縮した。この残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、６を得た。
【００６７】
エタノール（４ｍＬ）中の６（１当量）およびエチレンジアミン（９．６当量）の混合物を８０℃で１時間加熱した。次いで、この反応混合物をエバポレートして乾燥し、この残渣をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）に溶解し、メチルトリフルオロ酢酸（６．５ｍＬ）を加えた。１時間８０℃で撹拌した後、溶媒をエバポレートし、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、７を得た。
【００６８】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で、化合物７（１当量）をヨウ化第一銅（０．２当量）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．２当量）およびトリエチルアミン（２当量）の存在下で、アルゴン下で、室温で１２時間（トリエチルシリル）アセチレン８（５当量）と反応させた。次いで、この反応溶液を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、９を得た。
【００６９】
無水オキソラン（９ｍＬ）中の９（０．６モル）の溶液に、オキソラン（４．５ｍＬ）中の１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオライドを添加し、この混合物を０℃で２時間撹拌した。濃縮後、この残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、１０を得た。
【００７０】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で、３’フルオロ−５−ヨード−２’，３’−ジデオキシシチジン３３（１当量）を、ヨウ化第一銅（０．２当量）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．２当量）およびトリエチルアミン（２当量）の存在下で、アルゴン下にて、室温で１２時間リンカー１０（４当量）と反応させた。この反応溶液を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、３４を得た。
【００７１】
（実施例２）
（ヌクレオシド−保護−リンカー化合物３６の合成（図９を参照のこと））
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で、３’フルオロ−７−デアザ−７−ヨード−２’，３’−ジデオキシアデノシン３５（１当量）を、ヨウ化第一銅（０．２当量）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．２当量）およびトリエチルアミン（２当量）の存在下で、アルゴン下で室温１２時間、リンカー１０（４当量）と反応させた。次いで、この反応溶液を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、３６を得た。
【００７２】
（実施例３）
（ヌクレオシド−保護−リンカー化合物３７の合成（図２および１０を参照のこと））
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で、４−ヨードフェノール１（１当量）を、ヨウ化第一銅（０．２当量）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．２当量）およびトリエチルアミン（２当量）の存在下で、アルゴン下で室温１２時間、（トリエチルシリル）アセチレン８（４当量）と反応させた。次いで、この反応溶液を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、１１を得た。
【００７３】
−４０℃のジクロロメタン（５０ｍＬ）中の１１（１当量）の撹拌溶液に、トリフルオロメタンスルホン酸無水物（１．２当量）、続いて、トリエチルアミン（１．２当量）をアルゴン下で加えた。−４０℃でさらに１時間撹拌を続けた後、次いでこの反応混合物を室温まで加温し、５時間撹拌した。この反応混合物をジクロロメタンで希釈し、連続して希Ｈ2ＳＯ4水溶液、飽和ＮａＨＣＯ3溶液、ブライン、および水で洗浄し、乾燥し、濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、１２を得た。
【００７４】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で、化合物１２（１当量）をヨウ化第一銅（０．２当量）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．２当量）およびトリエチルアミン（２当量）の存在下で、室温１２時間、アルゴン下で、リンカー１３（４当量）と反応させた。次いで、この反応溶液を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、１４を得た。
【００７５】
無水オキソラン（５ｍＬ）中の１４（０．４６ｍｍｏｌ）の溶液に、オキソラン（１．５ｍＬ）中の１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオライドを加え、この混合物を０℃で２時間撹拌した。濃縮後、この残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、１５を得た。
【００７６】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で、３’−フルオロ−５−ヨード−２’，３’−ジデオキシシチジン３３（１当量）を、ヨウ化第一銅（０．２当量）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．２当量）およびトリエチルアミン（２当量）の存在下で、室温１２時間、アルゴン下で、リンカー１５（４当量）と反応させた。この反応溶液を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、３７を得た。
【００７７】
（実施例４）
（ヌクレオシド−保護−リンカー化合物３８の合成（図３、４および９を参照のこと））
オキソラン中のＮａＨ（１．０５当量、９５％）の撹拌溶液に、０℃で１７（１当量）を滴下した。添加を完了した後、撹拌を０℃で１時間継続し、次いで、ブロミド１６（１．０５当量）を２時間にわたって添加し、撹拌を０℃で２時間継続し、続いて、室温で２４時間撹拌した。過剰のＮａＨを分解するために、メタノールを慎重に添加した後、溶媒をエバポレートし、粗生成物を分留によって精製し、１８を得た。
【００７８】
化合物１８を室温で１２時間大過剰のメチルトリフルオロ酢酸と反応させた。溶媒をエバポレートし、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、１９を得た。
【００７９】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で、化合物１２（１当量）をヨウ化第一銅（０．２当量）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．２当量）およびトリエチルアミン（２当量）の存在下で、室温で１２時間アルゴン下でリンカー１９（４当量）と反応させた。次いで、この反応溶液を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、２０を得た。
【００８０】
無水オキソラン（２０ｍＬ）中の２０（３．３５ｍｍｏｌ）の溶液に、オキソラン（１０ｍＬ）中の１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオライドを加え、この混合物を室温で３時間撹拌した。濃縮後、この残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、２１を得た。
【００８１】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で、３’−フルオロ−５−ヨード−２’，３’−ジデオキシシチジン３３（１当量）を、ヨウ化第一銅（０．２当量）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．２当量）およびトリエチルアミン（２当量）の存在下で、室温１２時間、アルゴン下でリンカー２１（４当量）と反応させた。次いで、この反応溶液を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、３８を得た。
【００８２】
（実施例５）
（ヌクレオシド−保護−リンカー化合物３９の合成（図５および１２を参照のこと））
トリエチルアミン（３０ｍＬ）中で、２，５−ジブロモピリジン２２（１当量）を、ヨウ化第一銅（０．０２当量）、およびビス（トリフェニルホスフィニル）パラジウムジクロリド（０．０２当量）の存在下で、室温１２時間、アルゴン下で、リンカー１３（１．０５当量）と反応させた。次いで、この反応溶液をジクロロメタンで希釈し、ブライン溶液で洗浄し、乾燥し、濾過し、そして濃縮した。この濃縮物をフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、２３を得た。
【００８３】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で、化合物２３（１当量）を、ヨウ化第一銅（０．０５当量）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．０５当量）およびトリエチルアミン（１０当量）の存在下で、室温１２時間、アルゴン下で、（トリエチルシリル）アセチレン８（２当量）と反応させた。次いで、この反応溶液を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、２４を得た。
【００８４】
無水オキソラン（１０ｍＬ）中の２４（０．５ｍｍｏｌ）の溶液に、オキソラン（１．５ｍＬ）中の１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオライドを加え、この混合物を２時間０℃で撹拌した。濃縮後、この残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、２５を得た。
【００８５】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で、３’−フルオロ−５−ヨード−２’，３’−ジデオキシシチジン３３（１当量）を、ヨウ化第一銅（０．２当量）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．２当量）およびトリエチルアミン（２当量）の存在下で、室温１２時間、アルゴン下で、リンカー２５（４当量）と反応させた。次いで、この反応溶液を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、３９を得た。
【００８６】
（実施例６）
（ヌクレオシド−保護−リンカー化合物４０の合成（図６および１３を参照のこと））
トリエチルアミン（７５ｍＬ）中で、２，５−ジブロモピリジン２２（１当量）を、ヨウ化第一銅（０．０２当量）、およびビス（トリフェニルホスフィニル）パラジウムジクロリド（０．０２当量）の存在下で、０℃で１時間（トリエチルシリル）アセチレン８（１．０５当量）と反応させ、次いで、この反応混合物を室温まで加温し、室温で１２時間アルゴン下で撹拌した。次いで、この反応溶液をジクロロメタンで希釈し、ブライン溶液で洗浄し、乾燥し、濾過し、そして濃縮した。この濃縮物をフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、２６を得た。
【００８７】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で、化合物２６（１当量）を、ヨウ化第一銅（０．０５当量）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．０５当量）およびトリエチルアミン（１０当量）の存在下で、室温で１２時間、アルゴン下で、リンカー１３（２当量）と反応させた。次いで、この反応溶液を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、２７を得た。
【００８８】
無水オキソラン（１０ｍＬ）中の２７（０．５ｍｍｏｌ）の溶液に、オキソラン（１．５ｍＬ）中の１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオライドを加え、そしてこの混合物を０℃で２時間撹拌した。濃縮後、この残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、２８を得た。
【００８９】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で、３’−フルオロ−５−ヨード−２’，３’−ジデオキシシチジン３３（１当量）を、ヨウ化第一銅（０．０５当量）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．０５当量）およびトリエチルアミン（２当量）の存在下で、室温で１２時間、アルゴン下で、リンカー２８（３当量）と反応させた。次いで、この反応溶液を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、４０を得た。
【００９０】
（実施例７）
（ヌクレオシド−保護−リンカー化合物４１の合成（図７および１４を参照））
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で、４，４’−ジヨードビフェニル２９（１当量）を、ヨウ化第一銅（０．２当量）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．２当量）およびトリエチルアミン（２当量）の存在下で、室温で１２時間、アルゴン下で、（トリエチルシリル）アセチレン８（２当量）と反応させた。次いで、この反応混合物を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、３０を得た。
【００９１】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で、化合物３０（１当量）を、ヨウ化第一銅（０．２当量）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．２当量）およびトリエチルアミン（２当量）の存在下で、室温で１２時間、アルゴン下で、リンカー１３（３当量）と反応させた。次いで、この反応物を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、３１を得た。
【００９２】
無水オキソラン（１０ｍＬ）中の３１（０．３ｍｍｏｌ）の溶液に、オキソラン（３ｍＬ）中の１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオライドを加え、そしてこの混合物を０℃で２時間撹拌した。濃縮後、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、３２を得た。
【００９３】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で、３’−フルオロ−５−ヨード−２’，３’−ジデオキシシチジン３３（１当量）を、ヨウ化第一銅（０．２当量）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．２当量）およびトリエチルアミン（２当量）の存在下で、室温で１２時間、アルゴン下で、リンカー３２（３当量）と反応させた。この反応溶液を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、４１を得た。
【００９４】
（実施例８）
（ヌクレオシド−保護−リンカー化合物４４の合成（図１５を参照））
３’−フルオロ−５−ヨード−２’，３’−ジデオキシシチジン３３（１当量）を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中でヨウ化銅（Ｉ）（０．２当量）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．２当量）およびトリエチルアミン（２当量)存在下、アルゴン下室温で１２時間、（トリエチルシリル）アセチレン８（４当量）と反応させた。次いでこの反応物を濃縮してフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、４２を得た。
【００９５】
無水オキソラン（１０ｍＬ）中の４２（１．８６ｍｍｏｌ）の溶液へ、オキソラン（３ｍＬ）中の１Ｍのテトラブチルアンモニウムフルオリドを加え、この混合物を０℃で２時間撹拌した。濃縮した後、この混合物をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、４３を得た。
【００９６】
最後に、ピリジン中のヌクレオシド４３（１当量）とリンカー１３（８当量）の溶液を２時間３５℃でＯ2存在下でＣｕＣｌ（２当量）と伴に撹拌し、酢酸エチルで希釈し、そして飽和ＮＨ4Ｃｌ水溶液、ブラインおよび水で連続的に洗浄し、乾燥し、濃縮して、フラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、４４を得た。
【００９７】
（実施例９）
（脱保護ヌクレオチドトリホスフェート４９の合成（図１６および１７を参照））
新たに蒸留したオキシ塩化リン（４当量）を、−３０℃でトリメチルホスフェート中のヌクレオシド３４（１当量）へ加え、対応するジクロロモノホスフェート４５を形成した。この反応混合物を６０〜９０分かけて０℃へ温めさせ、次いで冷却浴を除去し、そして撹拌を室温で１〜２時間続けた。反応物をｐＨ８．０の２ＭのＴＥＡＢ緩衝液でクエンチし、ＨＰＬＣ（Ｃ−１８逆相）で精製した。生成物に相当するフラクションを濃縮し、モノホスフェート４６を得た。
【００９８】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解したモノホスフェート４６（１当量）を、室温で１時間カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）（１．８当量）と伴に撹拌した。過剰のＣＤＩを乾燥したメタノールの添加でクエンチした。活性化したモノホスフェート４７を室温で１２〜２４時間ｎ−トリブチルアミン（５当量）を含むＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中のトリブチルアンモニウムピロホスフェート（１０当量）の溶液と伴に撹拌した。この反応物を２Ｍ、ｐＨ８．０のＴＥＡＢでクエンチし、ＨＰＬＣ（Ｃ−１８逆相）で精製した。生成物に相当するフラクションを濃縮し、保護ヌクレオチドトリホスフェート４８を得た。
【００９９】
精製された保護トリホスフェート４８を濃ＮＨ4ＯＨ水溶液（２〜５ｍＬ）に溶解し、室温で３時間撹拌した。反応混合物を濃縮して４９を得、これを５〜３０ｍＭの濃度へ０．１Ｍ、ｐＨ７．０のＴＥＡＢで処方した。処方されたバルクの濃度および純度を、ＵＶ／Ｖｉｓ分光器およびＣ−１８逆相ＨＰＣＬでそれぞれ確認した。
【０１００】
（実施例１０）
（ヌクレオシド−保護−リンカー化合物の脱保護ヌクレオチドトリホスフェートへの転換（図１８および１９を参照））
ヌクレオシド−保護−リンカー化合物３６、３７、３８、３９、４０、４１および４４（総称して「ＮＰＬ」化合物）は３４から４９への転換に関して実施例９で述べたように、脱保護ヌクレオチドトリホスフェート化合物５０、５１、５２、５３、５４、５５および５６へ転換された。
【０１０１】
（実施例１１）
（色素−標識ヌクレオチドトリホスフェートの合成）
実施例９および１０からの脱保護ヌクレオチドトリホスフェート化合物４９，５０，５１，５２，５３，５４，５５および５６を次のとおり色素標識で標識した。１００ｍＭのＴＥＡ−ビカルボネート（ｐＨ７．０）中の脱保護ヌクレオチドトリホスフェート化合物をエバポレートし、乾燥した。次いで、２５０ｍＭのビカルボネート緩衝液（ｐＨ９．０）で再度懸濁した。色素−ＮＨＳの溶液（ＤＭＳＯ中）（例えば、Ｊｅｂ−ＮＨＳ）を加え、４〜１２時間室温暗所で撹拌した。この反応混合物をＨＰＬＣ（ＡＸ−３００ アニオン交換）で精製した。生成物に相当するフラクションを濃縮し、ＨＰＬＣ（Ｃ−１８逆相）で精製した。最終生成物を真空で乾燥し、２５０ｍＭ、ｐＨ９．６のＣＡＰＳＯで所望濃度へ希釈した。処方したバルクの濃度はＵＶ／Ｖｉｓ分光器で確認した。
【０１０２】
（実施例１２）
（ターミネーター滴定アッセイを用いた結合の機能としてのピーク高さ均等性の比較）
ターミネーター滴定アッセイを全配列決定ラダー（すなわち約２０から約６００までの間のヌクレオチドの長さを有する特定の塩基で終結しているすべてのフラグメントを含む配列決定ラダー）を作製するために要求される最小量の色素ターミネーターを決定するために独自に発展させた。このアッセイの鍵となる構成要素は（ｉ）第１の色素で標識されたプライマー、および(ｉｉ）第１の色素からスペクトル的に分析できる第２の色素で標識されたターミネーターであった。このアッセイにおいて、色素ターミネーターの不十分な濃度を配列決定の反応へ加えた場合、ジデオキシ終結したフラグメントは形成されず、そして配列決定のゲルで見られる全ての生成物が最初の色素だけで標識された「偽終結物（ｆａｌｓｅ ｓｔｏｐ）」で形成される生成物であった。本明細書で使われる場合「偽終結物」という用語はジデオキシターミネーターで終結しないプライマーの伸長産物を言い、おそらくそのような生成物はポリメラーゼ酵素が自発的にテンプレート鎖から解離するとき、形成される。余りにも過剰のターミネーターが使用される場合、短ターミネーター産物（すなわち約５０未満のヌクレオチド長）だけが形成される。この生成物は第１と第２の色素を両方含んでいる。適切な量のターミネーターが使用されると場合、全配列決定ラダーが生成し、このラダーのフラグメント各々は第１と第２の両方の色素で標識される。
【０１０３】
このアッセイの改変を異なる色素−ターミネーターでポリメラーゼを変化する効果を定量的に比較するために使った。前記で述べられたアッセイは最初、ＡｍｐｌｉＴａｑのＤＮＡポリミラーゼＦＳで配列決定するために必要とされる最少量の色素ターミネーターを決定するために使われていた。（ＦＳ酵素は２つの点変異−−Ｇ４６ＤとＦ６６７Ｙを有する組換えＴｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼである）。次いで、この色素ターミネーターの濃度を異なって変異したＴｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼと伴に使用し、ここでＦＳ変異体中に存在する２つの点変異に加えて、さらなる点変異が導入されている。色素−標識プライマーは使用しなかった。
【０１０４】
色素−ターミネーター反応をＡＢＩ ＰＲＩＳＭTM 色素ターミネーターサイクル配列決定コアキットマニュアル（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ ４０２１１６）で提供されているプロトコルに従う付加的点変異でＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＦＳまたはＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼを使用して実施した。緩衝液、非標識のプライマー、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＦＳ（使用されたとき）を含む試薬はＡＢＩ ＰＲＩＳＭTM 色素ターミネーターコアキット（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ ４０２１１７）からの試薬あった。ｄＮＴＰ混合物は各々２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰから成っていた。ピロホスファターゼ（１単位）をＦＳとは異なるＤＮＡポリメラーゼと伴に反応へ加えた。このＤＮＡポリメラーゼはすでにピロホスファターゼを含んでいる市販調製品である。色素ターミネーターは本明細書に記載されたものであった。反応の構成要素のプレ混合物は以下の表で示されているように調製された。ここですべての定量性は反応基底化毎に与えられている。
Figure 0003900244
反応をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ４８０ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ Ｎ８０１−１００）で適合した０．５ｍｌチューブで組立てた。反応体積２０μＬであり、これは上記反応プレ混合物の１５μＬ、様々な量の色素標識ターミネーターおよび合計の反応体積を２０μＬにするのに十分な体積の水を含む。色素ターミネーターの１〜２５０ｐｍｏｌを、各々の反応へ加えた。３０μＬの鉱油をエバポレーションを妨げるため各々の反応物の上部へ加えた。反応は次のように熱的循環した（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｄ）：２５サイクルについて、３０秒間９６℃、１５秒間５０℃および４分間６０℃；続いて４℃維持サイクル。
【０１０５】
すべての反応を製造業者の使用説明書（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｐ／ｎ ＣＳ−９０１）に従って、Ｃｅｎｔｒｉ−Ｓｅｐスピンカラムでスピンカラム精製によって精製した。カラム中のゲル物質を室温で少なくとも３０分間０．８ｍＬの脱イオン化水で水和した。このカラムを水和した後、気泡をゲル物質中で捕集しなかったと決定し、このカラムの上方部および下方部の端のキャップを除去し、そしてカラムを重力で流出した。次いで、このカラムをキットで提供されている洗浄チューブへ挿入し、２分間１３００ｘｇで可変スピードのマイクロ遠心分離機で遠心分離し、洗浄チューブから除去し、そして試料収集チューブへ挿入した。この反応混合物を注意深く油の下から除去し、ゲル物質の上へロードした。カラムは２分間１３００ｘｇで可変スピードのマイクロ遠心分離機で遠心分離した。次いで、溶出した試料は真空遠心分離機で乾燥した。
【０１０６】
配列決定ゲルの上へロードするより先に、乾燥された試料をテンプレート抑制試薬（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ ４０１６７４）２５μＬで再懸濁し、ボルテックスし、２分間９５℃に熱し、氷で冷やし、再びボルテックスし、そして遠心分離した（１３，０００ｘｇ）。この再懸濁した試料１０μＬをＰＥ ＡＢＩ ＰＲＩＳＭTM３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ３１０−００−１００／１２０）で適用されたサンプル瓶（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ ４０１９５７）へアリコートした。３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒでの電気泳動をＤＮＡ配列決定分析に特別に適合した網目（ｓｉｅｖｉｎｇ）ポリマーとキャピラリー（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ ４０２８３７（ポリマー）およびｐ／ｎ４０２８４０（キャピラリー））で実施した。各々の場合において、網目ポリマーは核酸変性物を含んでいた。試料を２．５ｋＶ３０秒間キャピラリーの上へ動電気的に注入し、５０℃で保持したキャピラリーの外側の壁で１０〜１２．２ｋＶ２時間泳動させた。
【０１０７】
ｐＧＥＭ配列の最初の２２０塩基に存在するＣピークをコンピュータープログラム、Ｓｔａｔ Ｔｏｏｌで評価し、平均ピークの高さおよび平均ピークの高さの標準偏差を決定した。相対誤差は平均ピークの高さの標準偏差を平均ピークの高さで割った比で計算した。この値はピークの相対的な均等性の尺度である。ピークが均等になればなるほど相対誤差は低くなる。
【０１０８】
表１は配列決定反応のピークの均等性を比較している実験結果を示し、３つの異なった結合を有する３つのターミネーターを使用した；この３つのターミネーターは２つの従来の結合と本発明による１つの結合である。３つの結合の構造は以下；
【０１０９】
【化１９】
Figure 0003900244
である。
【０１１０】
ターミネーター（ｄｄＣＴＰ）と色素（ＨＥＸ−１）はこの実験において同じであった。さらに、本発明者らはＡｍｐｌｉＴａｑ ＦＳとさらにＲ６６０Ｓ変異体を含む変異ポリメラーゼを使用した。これらのデータはこれらの堅いリンカーに対する最良のピーク均等性について変異酵素を使用するのが好ましいことおよび変異酵素と堅いリンカーを組み合わせるとそれ以外で達成することができるよりもさらによいピーク均等性を得るという結果になることを示している。
（ＥＯリンカーを用いたＡｍｐｌｉＴａｑ ＦＳ：０．３４２対ＰＨ−ＥＯリンカーを用いたＲ６６０Ｓ：０．２２４）。
【０１１１】
表１
【０１１２】
【表１】
Figure 0003900244
各々個々の出版物または特許出願が参考として援用するために具体的かつ個々に示されるように、すべての出版物と特許出願は本明細書中で同じ程度まで参考として援用されている。
【０１１３】
ほんの少しの具体例しか上記で詳細に記載していないが、化学および分子生物学の分野における当業者は明かに多くの改変がこれらの教示から離れることなしに好ましい実施形態において可能であると理解する。すべてのそのような改変は先の特許請求の範囲に含まれることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、本発明の化合物１０の合成を示す。
【図２】 図２は、本発明の化合物１５の合成を示す。
【図３】 図３は、本発明の化合物１９の合成を示す。
【図４】 図４は、本発明の化合物２１の合成を示す。
【図５】 図５は、本発明の化合物２５の合成を示す。
【図６】 図６は、本発明の化合物２８の合成を示す。
【図７】 図７は、本発明の化合物３２の合成を示す。
【図８】 図８は、本発明の化合物３４の合成を示す。
【図９】 図９は、本発明の化合物３６の合成を示す。
【図１０】 図１０は、本発明の化合物３７の合成を示す。
【図１１】 図１１は、本発明の化合物３８の合成を示す。
【図１２】 図１２は、本発明の化合物３９の合成を示す。
【図１３】 図１３は、本発明の化合物４０の合成を示す。
【図１４】 図１４は、本発明の化合物４１の合成を示す。
【図１５】 図１５は、本発明の化合物４４の合成を示す。
【図１６】 図１６は、本発明の化合物４６の合成を示す。
【図１７】 図１７は、本発明の化合物４９の合成を示す。
【図１８】 図１８は、本発明の化合物４９〜５２の構造を示す。
【図１９】 図１９は、本発明の化合物５３〜５６の構造を示す。

Claims (37)

  1. 以下の構造：
    ＮＵＣ−Ｌ−Ｓ−ＬＢ／ＬＧ
    を有するヌクレオシド／ヌクレオチド化合物であって、ここで：
    ＮＵＣは、核酸塩基部分Ｂを有するヌクレオシド／ヌクレオチドであり；
    Ｌは、堅い結合であり；
    Ｓは、スペーサーであり；
    ＬＢ／ＬＧは、発蛍光団であり；ここで、
    ＮＵＣは、Ｂを介してＬに付加され、その結果、Ｂがプリンである場合、Ｌはプリンの８位に付加され、Ｂが７−デアザプリンである場合、Ｌは７−デアザプリンの７位に付加され、そしてＢがピリミジンである場合、Ｌはピリミジンの５位に付加され；そして
    Ｌは、以下の構造：
    Figure 0003900244
    を有し、ここで、
    ｎ、ｏおよびｐの各々が０〜３の範囲の整数であり、そしてｎ、ｏおよびｐの合計が少なくとも３であり；そして
    Ｗ、Ｘ、ＹおよびＺの各々は、−ＣＨおよびＮからなる群から選択され、そしてその置換形態を含む、
    ヌクレオシド／ヌクレオチド化合物。
  2. 請求項１に記載の化合物であって、ここで、ＮＵＣが、２’−デオキシリボヌクレオチド、３’−デオキシリボヌクレオチド、２’，３’−ジデオキシリボヌクレオチド、２’，３’−ジデオキシ−３’−フルオロ−リボヌクレオチド、２’，３’−ジデオキシ−２’−フルオロ−リボヌクレオチド、２’，３’−ジデオキシ−３’−アジド−リボヌクレオチド、２’，３’−ジデオキシ−２’−アジド−リボヌクレオチド、２’，３’−ジデオキシ−２’−アミノ−リボヌクレオチド、２’，３’−ジデオキシ−３’−アミノ−リボヌクレオチド、２’，３’−ジデオキシ−２’，３’−ジデヒドロリボヌクレオチド、およびリボヌクレオチドからなる群から選択される、化合物。
  3. 請求項２に記載の化合物であって、ＮＵＣが、２’，３’−ジデオキシリボヌクレオチドおよび２’，３’−ジデオキシ−３’−フルオロ−リボヌクレオチドからなる群から選択される、化合物。
  4. ＷおよびＸの１つが、−ＣＨであり、ＺおよびＹの１つが、−ＣＨであり、そしてその置換形態を含む、請求項１に記載の化合物。
  5. ｎが１または２である、請求項１に記載の化合物。
  6. ｏが１または２である、請求項１に記載の化合物。
  7. ｐが０または１である、請求項１に記載の化合物。
  8. ｎが１または２であり、ｏが１または２であり、そしてｐが０または１である、請求項１に記載の化合物。
  9. Ｓが以下の構造：
    Figure 0003900244
    を有し、ここで、ｎが１〜８の範囲である、請求項１に記載の化合物。
  10. ｎが１または２である、請求項９に記載の化合物。
  11. 前記発蛍光団がキサンテン型色素である、請求項１に記載の化合物。
  12. 前記キサンテン型色素がローダミンまたはフルオレセイン色素である、請求項１１に記載の化合物。
  13. −Ｌ−が以下の構造：
    Figure 0003900244
    を有する、請求項１に記載の化合物。
  14. −Ｌ−が以下の構造：
    Figure 0003900244
    を有する、請求項１に記載の化合物。
  15. −Ｌ−が以下の構造：
    Figure 0003900244
    を有する、請求項１に記載の化合物。
  16. −Ｌ−が以下の構造：
    Figure 0003900244
    を有する、請求項１に記載の化合物。
  17. 以下の構造：
    ＮＵＣ−Ｌ−Ｓ−ＬＢ／ＬＧ
    を有するヌクレオチド化合物を含むポリヌクレオチドであって、ここで：
    ＮＵＣは、核酸塩基部分Ｂを有するヌクレオチドであり；
    Ｌは、堅い結合であり；
    Ｓは、スペーサーであり；そして
    ＬＢ／ＬＧは、発蛍光団であり；ここで、
    ＮＵＣは、Ｂを介してＬに付加され、その結果、Ｂがプリンである場合、Ｌはプリンの８位に付加され、Ｂが７−デアザプリンである場合、Ｌは７−デアザプリンの７位に付加され、そしてＢがピリミジンである場合、Ｌはピリミジンの５位に付加され；そして
    Ｌは、以下の構造：
    Figure 0003900244
    を有し、ここで、
    ｎ、ｏおよびｐの各々が０〜３の範囲の整数であり、そしてｎ、ｏおよびｐの合計が少なくとも３であり；そして
    Ｗ、Ｘ、ＹおよびＺの各々は、−ＣＨおよびＮからなる群から選択され、そしてその置換形態を含む、ポリヌクレオチド。
  18. 請求項１７に記載のヌクレオチド化合物であって、ここで、ＮＵＣが、２’−デオキシリボヌクレオチド、３’−デオキシリボヌクレオチド、２’，３’−ジデオキシリボヌクレオチド、２’，３’−ジデオキシ−３’−フルオロ−リボヌクレオチド、２’，３’−ジデオキシ−２’−フルオロ−リボヌクレオチド、２’，３’−ジデオキシ−３’−アジド−リボヌクレオチド、２’，３’−ジデオキシ−２’−アジド−リボヌクレオチド、２’，３’−ジデオキシ−２’−アミノ−リボヌクレオチド、２’，３’−ジデオキシ−３’−アミノ−リボヌクレオチド、２’，３’−ジデオキシ−２’，３’−ジデヒドロリボヌクレオチド、およびリボヌクレオチドからなる群から選択される、ヌクレオチド化合物。
  19. 請求項１７に記載のヌクレオチド化合物であって、ＮＵＣが、２’，３’−ジデオキシリボヌクレオチドおよび２’，３’−ジデオキシ−３’−フルオロ−リボヌクレオチドからなる群から選択される、化合物。
  20. ＷおよびＸの１つが、−ＣＨであり、ＺおよびＹの１つが、−ＣＨであり、そしてその置換形態を含む、請求項１７に記載のヌクレオチド化合物。
  21. ｎが１または２である、請求項１７に記載のヌクレオチド化合物。
  22. ｏが１または２である、請求項１７に記載のヌクレオチド化合物。
  23. ｐが０または１である、請求項１７に記載のヌクレオチド化合物。
  24. ｎが１または２であり、ｏが１または２であり、そしてｐが０または１である、請求項１７に記載のヌクレオチド化合物。
  25. Ｓが以下の構造：
    Figure 0003900244
    を有し、ここで、ｎが１〜８の範囲である、請求項１７に記載のヌクレオチド化合物。
  26. ｎが１または２である、請求項２５に記載のヌクレオチド化合物。
  27. 前記発蛍光団がキサンテン型色素である、請求項１７に記載のヌクレオチド化合物。
  28. 前記キサンテン型色素がローダミンまたはフルオレセイン色素である、請求項２７に記載のヌクレオチド化合物。
  29. プライマー伸長反応を実施するための方法であって、該方法は、以下の工程：
    テンプレート核酸を提供する工程；
    プライマーテンプレートハイブリッドを形成するために、該テンプレート核酸の部分にオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングする工程；および
    プライマーを伸長するために、該プライマーテンプレートハイブリッドにプライマー伸長試薬を添加する工程であって、該プライマー伸長試薬は、以下の構造：
    ＮＵＣ−Ｌ−Ｓ−ＬＢ／ＬＧ
    を有するヌクレオチド化合物を含み、ここで：
    ＮＵＣは、核酸塩基部分Ｂを有するヌクレオシド／ヌクレオチドであり；
    Ｌは、堅い結合であり；
    Ｓは、スペーサーであり；そして
    ＬＢ／ＬＧは、発蛍光団であり；ここで、
    ＮＵＣは、Ｂを介してＬに付加され、その結果、Ｂがプリンである場合、Ｌはプリンの８位に付加され、Ｂが７−デアザプリンである場合、Ｌは７−デアザプリンの７位に付加され、そしてＢがピリミジンである場合、Ｌはピリミジンの５位に付加され；そして
    Ｌは、以下の構造：
    Figure 0003900244
    を有し、ここで、
    ｎ、ｏおよびｐの各々が０〜３の範囲の整数であり、そしてｎ、ｏおよびｐの合計が少なくとも３であり；そして
    Ｗ、Ｘ、ＹおよびＺの各々は、−ＣＨおよびＮからなる群から選択され、そしてその置換形態を含む、工程を含む、方法。
  30. 前記プライマー伸長試薬が熱安定性のＤＮＡポリメラーゼを含有する、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記熱安定性ポリメラーゼがＴａｑポリメラーゼである、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記Ｔａｑポリメラーゼが、Ｆ６６７位に変異を有する変異Ｔａｑポリメラーゼである、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記変異がＦ６６７Ｙである、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記Ｔａｑポリメラーゼが、Ｒ６６０位に変異を有する変異Ｔａｑポリメラーゼである、請求項３１の方法。
  35. 前記変異が、Ｒ６６０Ｃ、Ｒ６６０ＤおよびＲ６６０Ｓからなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記発蛍光団が、キサンテン型色素である、請求項２９に記載の方法。
  37. 前記キサンテン型色素が、ローダミンまたはフルオレセイン色素である、請求項３６に記載の方法。
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