JP2002527447A - 堅いリンカーを有するヌクレオチド化合物 - Google Patents
堅いリンカーを有するヌクレオチド化合物Info
- Publication number
- JP2002527447A JP2002527447A JP2000575880A JP2000575880A JP2002527447A JP 2002527447 A JP2002527447 A JP 2002527447A JP 2000575880 A JP2000575880 A JP 2000575880A JP 2000575880 A JP2000575880 A JP 2000575880A JP 2002527447 A JP2002527447 A JP 2002527447A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- compound
- dideoxy
- nuc
- compound according
- nucleotide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/06—Pyrimidine radicals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/06—Pyrimidine radicals
- C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/14—Pyrrolo-pyrimidine radicals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/16—Purine radicals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/16—Purine radicals
- C07H19/20—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2535/00—Reactions characterised by the assay type for determining the identity of a nucleotide base or a sequence of oligonucleotides
- C12Q2535/101—Sanger sequencing method, i.e. oligonucleotide sequencing using primer elongation and dideoxynucleotides as chain terminators
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
構造：ＮＵＣ−Ｌ−Ｓ−ＬＢ／ＬＧを有するヌクレオシド／ヌクレオチド化合物が記載され、ここで、ＮＵＣは、核酸塩基部位Ｂを有するヌクレオシド／ヌクレオチドであり、Ｌは、堅い結合であり、Ｓは、スペーサーであり、そしてＬＢ／ＬＧは、結合対または標識のメンバーである。本発明の重要な局面において、Ｌは構造（ａ）を有し、ここで、ｎ、ｏおよびｐの各々が０〜３の範囲の整数であり、そしてｎ、ｏおよびｐの合計が少なくとも２であり、そしてＷ、Ｘ、ＹおよびＺの各々は、炭素および窒素からなる群から選択される。本発明は、さらに、ヌクレオシド／ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド化合物、そしてヌクレオシド／ヌクレオチドを利用するプライマー伸長法（特に、特定の変異体ポリメラーゼ酵素と組み合わせる場合）を含む。
Description
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、一般に、ポリメラーゼ酵素に対する基質として有用なヌクレオシド
／ヌクレオチド化合物、プライマー伸長反応においてこのような化合物を使用す
るための方法、およびこのようなヌクレオチド化合物を含むポリヌクレオチドに
関する。
／ヌクレオチド化合物、プライマー伸長反応においてこのような化合物を使用す
るための方法、およびこのようなヌクレオチド化合物を含むポリヌクレオチドに
関する。
【０００２】 （発明の背景） 核酸配列決定は、近代生物学および生物工学におけるきわめて重要な技術とな
っており、基礎生物学的研究から治療薬用の薬剤開発におよぶ分野に関する情報
を提供する。収集されるべきＤＮＡ配列データが莫大な量であるため、自動化技
術が、情報処理量を増加し、核酸配列決定法の経費を減少するために、開発され
てきた（例えば、米国特許第５，１７１，５３４号；Ｃｏｎｎｅｌｌら、Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、５（４）：３４２−３４８（１９８７）；およびＴｒａ
ｉｎｏｒ、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、６２：４１８−４２６（１９９０））。
っており、基礎生物学的研究から治療薬用の薬剤開発におよぶ分野に関する情報
を提供する。収集されるべきＤＮＡ配列データが莫大な量であるため、自動化技
術が、情報処理量を増加し、核酸配列決定法の経費を減少するために、開発され
てきた（例えば、米国特許第５，１７１，５３４号；Ｃｏｎｎｅｌｌら、Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、５（４）：３４２−３４８（１９８７）；およびＴｒａ
ｉｎｏｒ、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、６２：４１８−４２６（１９９０））。
【０００３】 好ましい自動核酸配列決定法は、Ｓａｎｇｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．、７４：５４６３−５４６７（１９７７））によって開発された
酵素的複製技術に基づいている。Ｓａｎｇｅｒの技術では、一本鎖テンプレート
核酸の配列を、１組のポリヌクレオチドフラグメントを合成するための核酸ポリ
メラーゼを使用して決定する。ここで、それらのフラグメントは、（ｉ）核酸配
列に相補的な配列を有し、（ｉｉ）一つのヌクレオチドで長さが変化し、そして
（ｉｉｉ）既知ヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴで終わる５’末端
を有する。この方法では、オリゴヌクレオチドプライマーは、配列決定されるべ
きテンプレート核酸の３’末端にハイブリダイズされ、プライマーの３’末端は
、相補的ポリヌクレオチドフラグメントのポリメラーゼ媒介重合のための開始部
位として作用する。酵素的重合工程またはプライマー伸長反応は、テンプレート
−プライマーハイブリッドを、４つの伸長可能なヌクレオチド（例えば、デオキ
シヌクレオチド「ｄＮＴＰ」）、核酸ポリメラーゼ酵素、およびヌクレオチド「
ターミネーター」（例えば、２’，３’−ジデオキシヌクレオチドトリホスフェ
ート（「ｄｄＮＴＰ」））と組合せて実施される。ターミネーターの組み込みは
、３’末端にヒドロキシ基を欠き、従ってポリメラーゼによってさらに伸長され
得ないプライマー伸長生成物を形成する。すなわち、その伸長生成物は「終結さ
れる」。組み込みに対するｄｄＮＴＰと対応するターミネーターとの間の競合は
、異なる大きさの伸長生成物の分布をもたらし、各伸長生成物は、反応で使用さ
れる特定のターミネーターによって終結する。テンプレート核酸の完全な配列を
決定するために、４つの並行反応が実施される。各反応は、異なるターミネータ
ーを使用する。伸長生成物の大きさの分布を決定するために、この伸長生成物を
電気泳動によって分離して、一つのヌクレオチドで大きさが異なる生成物を分離
する。
ａｄ．Ｓｃｉ．、７４：５４６３−５４６７（１９７７））によって開発された
酵素的複製技術に基づいている。Ｓａｎｇｅｒの技術では、一本鎖テンプレート
核酸の配列を、１組のポリヌクレオチドフラグメントを合成するための核酸ポリ
メラーゼを使用して決定する。ここで、それらのフラグメントは、（ｉ）核酸配
列に相補的な配列を有し、（ｉｉ）一つのヌクレオチドで長さが変化し、そして
（ｉｉｉ）既知ヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴで終わる５’末端
を有する。この方法では、オリゴヌクレオチドプライマーは、配列決定されるべ
きテンプレート核酸の３’末端にハイブリダイズされ、プライマーの３’末端は
、相補的ポリヌクレオチドフラグメントのポリメラーゼ媒介重合のための開始部
位として作用する。酵素的重合工程またはプライマー伸長反応は、テンプレート
−プライマーハイブリッドを、４つの伸長可能なヌクレオチド（例えば、デオキ
シヌクレオチド「ｄＮＴＰ」）、核酸ポリメラーゼ酵素、およびヌクレオチド「
ターミネーター」（例えば、２’，３’−ジデオキシヌクレオチドトリホスフェ
ート（「ｄｄＮＴＰ」））と組合せて実施される。ターミネーターの組み込みは
、３’末端にヒドロキシ基を欠き、従ってポリメラーゼによってさらに伸長され
得ないプライマー伸長生成物を形成する。すなわち、その伸長生成物は「終結さ
れる」。組み込みに対するｄｄＮＴＰと対応するターミネーターとの間の競合は
、異なる大きさの伸長生成物の分布をもたらし、各伸長生成物は、反応で使用さ
れる特定のターミネーターによって終結する。テンプレート核酸の完全な配列を
決定するために、４つの並行反応が実施される。各反応は、異なるターミネータ
ーを使用する。伸長生成物の大きさの分布を決定するために、この伸長生成物を
電気泳動によって分離して、一つのヌクレオチドで大きさが異なる生成物を分離
する。
【０００４】 従来のＳａｎｇｅｒ技術の最近の変法では、各ヌクレオチドターミネーターは
蛍光色素で標識され（例えば、Ｐｒｏｂｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３８：３３
６−３４１（１９８７）；および米国特許第５，１５１，５０７号）、および熱
安定ＤＮＡポリメラーゼ酵素が使用されている（例えば、Ｍｕｒｒａｙ、Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１７（２１）：８８８９（１９８９
））。いくつかの利点が、色素標識ターミネーターを利用してして実現され、例
えば、（ｉ）放射性アイソトープの貯蔵、使用、および処分に関する問題が排除
されている；（ｉｉ）色素標識プライマーを合成する必要性が排除されている；
そして（ｉｉｉ）Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴターミネーターの各々に対して異なる色
素標識を使用する場合、４つの全プライマー伸長反応が１つのチューブ中で同時
に実施され得る。熱安定ポリメラーゼ酵素の使用は、幾つかのさらなる利点を提
供する。例えば、（ｉ）高温で実施される重合反応を可能にし、それによってテ
ンプレートの任意の二次構造を崩壊させ、その結果、より配列依存性の少ない人
工物を生じ；そして、（ｉｉ）配列決定反応は温度変化が繰り返され得、それに
よって産生される伸長産物の量を直線的に増幅し、従って、信頼のおける配列を
得るために必要とされるテンプレート核酸の量を減少するように作用する。
蛍光色素で標識され（例えば、Ｐｒｏｂｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３８：３３
６−３４１（１９８７）；および米国特許第５，１５１，５０７号）、および熱
安定ＤＮＡポリメラーゼ酵素が使用されている（例えば、Ｍｕｒｒａｙ、Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１７（２１）：８８８９（１９８９
））。いくつかの利点が、色素標識ターミネーターを利用してして実現され、例
えば、（ｉ）放射性アイソトープの貯蔵、使用、および処分に関する問題が排除
されている；（ｉｉ）色素標識プライマーを合成する必要性が排除されている；
そして（ｉｉｉ）Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴターミネーターの各々に対して異なる色
素標識を使用する場合、４つの全プライマー伸長反応が１つのチューブ中で同時
に実施され得る。熱安定ポリメラーゼ酵素の使用は、幾つかのさらなる利点を提
供する。例えば、（ｉ）高温で実施される重合反応を可能にし、それによってテ
ンプレートの任意の二次構造を崩壊させ、その結果、より配列依存性の少ない人
工物を生じ；そして、（ｉｉ）配列決定反応は温度変化が繰り返され得、それに
よって産生される伸長産物の量を直線的に増幅し、従って、信頼のおける配列を
得るために必要とされるテンプレート核酸の量を減少するように作用する。
【０００５】 Ｓａｎｇｅｒ配列決定法に対する最近のこれらの変法が有効であることが証明
されてきた一方、その性能および経済性の最適化に関するいくつかの問題が残存
する。Ｓａｎｇｅｒ型核酸配列決定プロセスにおける熱安定ポリメラーゼ酵素と
組み合わせられた現在入手可能な色素標識ターミネーターを使用する場合（特に
、フルオレセイン型色素標識の場合）に生じる１つの問題は、非標識伸長ヌクレ
オチドに対して大過剰（例えば、比率５０：１まで）の色素標識ターミネーター
が要求されることである。この大過剰の標識ターミネーターは、電気泳動分離工
程を実施する前に、配列決定反応産物を精製することを必要にする。これは、組
み込まれなかった標識ターミネーター種および真の標識配列決定フラグメントの
同時移動により生じる妨害を除外するためである。代表的な洗浄法は、エタノー
ル沈澱法またはクロマトグラフ分離法（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭTM Ｄｙｅ Ｔｅｒ
ｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌ、ＰＥ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｒｅｖｉｓｉｏ
ｎ Ａ、ｐ／ｎ４０２１１６（１９９５年８月）に記載される）を包含する。こ
のような洗浄工程は、配列決定反応産物が直接的に電気泳動分離プロセスへ移さ
れる、全自動配列決定システムの開発作業を、非常に困難にする。
されてきた一方、その性能および経済性の最適化に関するいくつかの問題が残存
する。Ｓａｎｇｅｒ型核酸配列決定プロセスにおける熱安定ポリメラーゼ酵素と
組み合わせられた現在入手可能な色素標識ターミネーターを使用する場合（特に
、フルオレセイン型色素標識の場合）に生じる１つの問題は、非標識伸長ヌクレ
オチドに対して大過剰（例えば、比率５０：１まで）の色素標識ターミネーター
が要求されることである。この大過剰の標識ターミネーターは、電気泳動分離工
程を実施する前に、配列決定反応産物を精製することを必要にする。これは、組
み込まれなかった標識ターミネーター種および真の標識配列決定フラグメントの
同時移動により生じる妨害を除外するためである。代表的な洗浄法は、エタノー
ル沈澱法またはクロマトグラフ分離法（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭTM Ｄｙｅ Ｔｅｒ
ｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌ、ＰＥ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｒｅｖｉｓｉｏ
ｎ Ａ、ｐ／ｎ４０２１１６（１９９５年８月）に記載される）を包含する。こ
のような洗浄工程は、配列決定反応産物が直接的に電気泳動分離プロセスへ移さ
れる、全自動配列決定システムの開発作業を、非常に困難にする。
【０００６】 Ｓａｎｇｅｒ型核酸配列決定プロセスにおいて、熱安定ポリメラーゼと組み合
わせた現在入手可能な色素標識ターミネーターを使用する場合に生じる第二の問
題は、標識ターミネーターのプライマー伸長産物への組み込みの程度が変化し、
従って、プライマー伸長産物が電気泳動によって分離され、そして蛍光検出を使
用して検出される場合、ピーク高さの不均一な分布が生じることである。このよ
うな不均一なピーク高さは、それらが自動配列決定およびヘテロ接合体検出の信
頼性を、実質的に低くしてしまうために、不利である。
わせた現在入手可能な色素標識ターミネーターを使用する場合に生じる第二の問
題は、標識ターミネーターのプライマー伸長産物への組み込みの程度が変化し、
従って、プライマー伸長産物が電気泳動によって分離され、そして蛍光検出を使
用して検出される場合、ピーク高さの不均一な分布が生じることである。このよ
うな不均一なピーク高さは、それらが自動配列決定およびヘテロ接合体検出の信
頼性を、実質的に低くしてしまうために、不利である。
【０００７】 従って、プライマー伸長反応において、非標識の伸長可能なヌクレオチドに対
して大過剰を必要とせず、そしてＳａｎｇｅｒ型配列決定反応において、均一な
ピーク高さ分布を生成する標識ヌクレオチドターミネーター化合物に対する継続
する必要が残る。
して大過剰を必要とせず、そしてＳａｎｇｅｒ型配列決定反応において、均一な
ピーク高さ分布を生成する標識ヌクレオチドターミネーター化合物に対する継続
する必要が残る。
【０００８】 （要旨） 本発明は、堅いリンカー部分を含む新規なクラスのヌクレオシド／ヌクレオチ
ド化合物、およびこのような化合物を使用する方法についての本発明者らの発見
に関する。これらの化合物は、プライマー伸長反応（例えば、Ｓａｎｇｅｒ型Ｄ
ＮＡ配列反応、またはＰＣＲ反応）において標識ターミネータとして、および標
識鎖伸長ヌクレオチドとして、特に有用である。
ド化合物、およびこのような化合物を使用する方法についての本発明者らの発見
に関する。これらの化合物は、プライマー伸長反応（例えば、Ｓａｎｇｅｒ型Ｄ
ＮＡ配列反応、またはＰＣＲ反応）において標識ターミネータとして、および標
識鎖伸長ヌクレオチドとして、特に有用である。
【０００９】 本発明の目的は、標識鎖終結または鎖伸長ヌクレオチドを形成するために使用
され得る、ヌクレオチドを提供することである。
され得る、ヌクレオチドを提供することである。
【００１０】 本発明のさらなる目的は、標識鎖終結または鎖伸長ヌクレオチドを提供するこ
とである。
とである。
【００１１】 本発明のなおさらなる目的は、蛍光標識を含む鎖終結ヌクレオチドを提供する
ことであり、ここで、このような標識鎖終結ヌクレオチドの、非標識鎖終結ヌク
レオチドに対する減少された過剰濃度が、Ｓａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列プロセスに
おいて要求される。
ことであり、ここで、このような標識鎖終結ヌクレオチドの、非標識鎖終結ヌク
レオチドに対する減少された過剰濃度が、Ｓａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列プロセスに
おいて要求される。
【００１２】 本発明の別の目的は、Ｓａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列決定プロセスにおいて、より
均等なピーク高さの分布をもたらす、標識鎖終結ヌクレオチドを提供することで
ある。
均等なピーク高さの分布をもたらす、標識鎖終結ヌクレオチドを提供することで
ある。
【００１３】 本発明の別の目的は、標識ポリヌクレオチドを提供することである。
【００１４】 本発明のさらに別の目的は、本発明のヌクレオチド化合物を利用する、プライ
マー伸長反応を含む方法を提供することである。
マー伸長反応を含む方法を提供することである。
【００１５】 第１の局面において、本発明の上記および他の目的は、以下の構造： ＮＵＣ−Ｌ−Ｓ−ＬＢ／ＬＧ を有するヌクレオシド／ヌクレオチド化合物によって達成され、ここで、ＮＵＣ
は、核酸塩基部分Ｂを有するヌクレオシド／ヌクレオチドであり、Ｌは、堅い結
合であり、Ｓは、スペーサーであり、そしてＬＢ／ＬＧは、結合対または標識の
メンバーである。ＮＵＣは、Ｂを介してＬに付加され、その結果、Ｂがプリンで
ある場合、Ｌはプリンの８位に付加され、Ｂが７−デアザプリンである場合、Ｌ
は７−デアザプリンの７位に付加され、そしてＢがピリミジンである場合、Ｌは
ピリミジンの５位に付加される。本発明の重要な特徴において、Ｌは以下の構造
：
は、核酸塩基部分Ｂを有するヌクレオシド／ヌクレオチドであり、Ｌは、堅い結
合であり、Ｓは、スペーサーであり、そしてＬＢ／ＬＧは、結合対または標識の
メンバーである。ＮＵＣは、Ｂを介してＬに付加され、その結果、Ｂがプリンで
ある場合、Ｌはプリンの８位に付加され、Ｂが７−デアザプリンである場合、Ｌ
は７−デアザプリンの７位に付加され、そしてＢがピリミジンである場合、Ｌは
ピリミジンの５位に付加される。本発明の重要な特徴において、Ｌは以下の構造
：
【００１６】
【化１２】 を有し、ここで、 ｎ、ｏおよびｐの各々が０〜３の範囲の整数であり、そしてｎ、ｏおよびｐの
合計が少なくとも２であり；そしてＷ、Ｘ、ＹおよびＺの各々は、炭素または窒
素のいずれかである。
合計が少なくとも２であり；そしてＷ、Ｘ、ＹおよびＺの各々は、炭素または窒
素のいずれかである。
【００１７】 第２の局面において、本発明は、上記のヌクレオシド／ヌクレオチド化合物を
組み込むポリヌクレオチドを含有する。
組み込むポリヌクレオチドを含有する。
【００１８】 第３の局面において、本発明は、テンプレート核酸を提供する工程、プライマ
ーテンプレートハイブリッドを形成するために、このテンプレート核酸の部分に
オリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングする工程、およびプライマーを伸
長するために、このプライマーテンプレートハイブリッドにプライマー伸長試薬
を添加する工程を含むプライマー伸長反応を実施するための方法を含み、ここで
、このプライマー伸長試薬は、上記のようなヌクレオシド／ヌクレオチド化合物
を含む。
ーテンプレートハイブリッドを形成するために、このテンプレート核酸の部分に
オリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングする工程、およびプライマーを伸
長するために、このプライマーテンプレートハイブリッドにプライマー伸長試薬
を添加する工程を含むプライマー伸長反応を実施するための方法を含み、ここで
、このプライマー伸長試薬は、上記のようなヌクレオシド／ヌクレオチド化合物
を含む。
【００１９】 本発明のこれらおよび他の目的、特徴、および利点は、以下の説明、図面、お
よび添付の特許請求の範囲を参考にして、よりよく理解されるようになる。
よび添付の特許請求の範囲を参考にして、よりよく理解されるようになる。
【００２０】 （好ましい実施形態の詳細な説明） 本発明の好ましい実施形態に対して、詳細に参照がなされ、その例は添付の図
面に示される。本発明は好ましい実施形態に関して記載されるが、それらが、本
発明をこれらの実施形態に限定することを意図しないことが理解される。反対に
、本発明は、代替、改変、および等価物を包含することを意図し、それらは、添
付の特許請求の範囲によって規定されるように、本発明の範囲内に包含され得る
。
面に示される。本発明は好ましい実施形態に関して記載されるが、それらが、本
発明をこれらの実施形態に限定することを意図しないことが理解される。反対に
、本発明は、代替、改変、および等価物を包含することを意図し、それらは、添
付の特許請求の範囲によって規定されるように、本発明の範囲内に包含され得る
。
【００２１】 一般的に、本発明は、ポリメラーゼ酵素についての基質として有用な、新規の
種類のヌクレオシド／ヌクレオシド化合物、このような化合物を含むポリヌクレ
オチド、およびプライマー伸長反応においてこのような化合物を使用するための
方法を包含する。本発明の化合物は、Ｓａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列決定法において
使用するための色素標識ヌクレオチド鎖終結剤の調製において、およびプライマ
ー伸長反応（例えばＰＣＲ）を含む方法において使用するための色素標識ヌクレ
オチド鎖伸長剤の調製における特定の応用を見いだす。
種類のヌクレオシド／ヌクレオシド化合物、このような化合物を含むポリヌクレ
オチド、およびプライマー伸長反応においてこのような化合物を使用するための
方法を包含する。本発明の化合物は、Ｓａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列決定法において
使用するための色素標識ヌクレオチド鎖終結剤の調製において、およびプライマ
ー伸長反応（例えばＰＣＲ）を含む方法において使用するための色素標識ヌクレ
オチド鎖伸長剤の調製における特定の応用を見いだす。
【００２２】 本発明は、目的のヌクレオチドが、熱安定ＤＮＡポリメラーゼ酵素に対する、
特に良好な基質であるという発見に一部基づく。すなわち、（ｉ）Ｓａｎｇｅｒ
型ＤＮＡ配列決定反応おいて、現在入手可能な標識ターミネーターを使用する場
合に必要とされる量と比較して、有意に減少されたモル過剰量が要求される、そ
して（ｉｉ）Ｓａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列決定プロセスにおいて、現在入手可能な
標識ターミネーターを使用する場合に見られる分布と比較して、ピーク高さのよ
り均一な分布が見られる、という発見に一部基づく。
特に良好な基質であるという発見に一部基づく。すなわち、（ｉ）Ｓａｎｇｅｒ
型ＤＮＡ配列決定反応おいて、現在入手可能な標識ターミネーターを使用する場
合に必要とされる量と比較して、有意に減少されたモル過剰量が要求される、そ
して（ｉｉ）Ｓａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列決定プロセスにおいて、現在入手可能な
標識ターミネーターを使用する場合に見られる分布と比較して、ピーク高さのよ
り均一な分布が見られる、という発見に一部基づく。
【００２３】 （Ｉ．定義） 他に示さない限り、本明細書中で使用される以下の用語および句は、以下の意
味を有することを意図する： 「Ｔａｑポリメラーゼ」は、生物Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来の
ＤＮＡポリメラーゼ酵素を意味し、これは、その変異体および／または組換え形
態を含む。
味を有することを意図する： 「Ｔａｑポリメラーゼ」は、生物Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来の
ＤＮＡポリメラーゼ酵素を意味し、これは、その変異体および／または組換え形
態を含む。
【００２４】 用語「標識」は、本発明のヌクレオシド／ヌクレオチドに結合される場合、こ
のようなヌクレオシド／ヌクレオチド、およびこのようなヌクレオチドを含むポ
リヌクレオチドが、公知の検出手段を使用して検出可能となる部位を指す。代表
的な標識には、発蛍光団、発色団、放射性同位体、スピンラベル、酵素標識、化
学ルミネセンス標識などが挙げられ、これらは標識抗体またはアビジンのような
、検出可能な抗−リガンドに高い親和性で特異的に結合し得る、抗原またはビオ
チンのような適切なディテクターまたはリガンドによって、標識化合物の直接検
出を可能にする。好ましくは、標識は、フルオレセイン型またはローダミン型色
素のような、蛍光色素である。
のようなヌクレオシド／ヌクレオチド、およびこのようなヌクレオチドを含むポ
リヌクレオチドが、公知の検出手段を使用して検出可能となる部位を指す。代表
的な標識には、発蛍光団、発色団、放射性同位体、スピンラベル、酵素標識、化
学ルミネセンス標識などが挙げられ、これらは標識抗体またはアビジンのような
、検出可能な抗−リガンドに高い親和性で特異的に結合し得る、抗原またはビオ
チンのような適切なディテクターまたはリガンドによって、標識化合物の直接検
出を可能にする。好ましくは、標識は、フルオレセイン型またはローダミン型色
素のような、蛍光色素である。
【００２５】 「結合基」は、「相補的官能基」と反応して、「結合」を形成し得る部位を意
味する。結合基またはその関係する相補的官能基は、本明細書中で「結合対」と
称される。好ましい結合対には、イソチオシアネート、塩化スルホニル、４，６
−ジクロロトリアジニル、スクシンイミジルエステル、または他の活性カルボキ
シレートの群から選択される第一のメンバー、およびアミンである第二のメンバ
ーが含まれる。好ましくは、結合対の第二のメンバーが、スルフヒドリルである
場合にはいつでも、結合対の第一のメンバーは、マレイミド、ハロアセチル、ま
たはヨードアセトアミドである（Ｒ．Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅ
ｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐ
ｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（１９９２）を参照）。特定の好ましい実施形態において
、結合対の第一のメンバーは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エス
テルであり、そして結合対の第二のメンバーはアミンであり、ここで、ＮＨＳエ
ステルを形成するために、カルボキシレート部位は、ジシクロヘキシルカルボジ
イミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応される。
味する。結合基またはその関係する相補的官能基は、本明細書中で「結合対」と
称される。好ましい結合対には、イソチオシアネート、塩化スルホニル、４，６
−ジクロロトリアジニル、スクシンイミジルエステル、または他の活性カルボキ
シレートの群から選択される第一のメンバー、およびアミンである第二のメンバ
ーが含まれる。好ましくは、結合対の第二のメンバーが、スルフヒドリルである
場合にはいつでも、結合対の第一のメンバーは、マレイミド、ハロアセチル、ま
たはヨードアセトアミドである（Ｒ．Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅ
ｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐ
ｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（１９９２）を参照）。特定の好ましい実施形態において
、結合対の第一のメンバーは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エス
テルであり、そして結合対の第二のメンバーはアミンであり、ここで、ＮＨＳエ
ステルを形成するために、カルボキシレート部位は、ジシクロヘキシルカルボジ
イミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応される。
【００２６】 用語「ヌクレオシド」は、１’位でペントースに結合されるプリン、デアザプ
リンまたはピリミジン核酸塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、ウラ
シル、チミン、デアザアデニン、デアザグアノシンなど）からなる化合物をいう
。ヌクレオシド塩基が、プリンまたは７−デアザプリンである場合、このペント
ースは、プリンまたはデアザプリンの９位で核酸塩基に結合され、そして、核酸
塩基がピリミジンである場合には、ペントースは、ピリミジンの１位で核酸塩基
に結合される（例えば、ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ、ＤＮＡ Ｒｅｐｌ
ｉｃａｔｉｏｎ 第２版（Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、１９
９２））。本明細書中で使用されているように、用語「ヌクレオチド」は、ヌク
レオシドのホスフェートエステル（例えば、トリホスフェートエステル）を指し
、ここで、エステル化の最も一般的な部位は、ペントースのＣ−５位に結合され
たヒドロキシル基である。本明細書中で使用される、用語「ヌクレオシド／ヌク
レオチド」は、ヌクレオシドおよびヌクレオチドの両方を包含する一連の化合物
を指す。ヌクレオシド／ヌクレオチドに関する「アナログ」は、改変核酸塩基部
分、改変ペントース部分、および／または改変ホスフェート部分を有する合成ア
ナログ（例えば、Ｓｃｈｅｉｔ、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ（Ｊｏ
ｈｎ Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８０）に一般に記載される）を含む
。一般に、ホスフェートアナログは、ホスフェートのアナログを含み、ここで、
リン原子は＋５の酸化状態にあり、そして酸素原子の１つ以上が非酸素部位と置
き換えられている（例えば、硫黄）。代表的なホスフェートアナログには、限定
されないが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエー
ト、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニリデート
、ホスホラミデート、ボロノホスフェートが挙げられ、これらは、対イオンが存
在するならば、会合した対イオン（例えば、Ｈ+、ＮＨ4 +、Ｎａ+）を含む。代表
的な塩基アナログには、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、プソイドウ
リジン、Ｃ−５−プロピン、イソシトシン、イソグアニン、２−チオピリミジン
などのアナログが挙げられるが、これらに限定されない。代表的な糖アナログに
は、２’−または３’位が、水素、ヒドロキシ、アルコキシ（例えば、メトキシ
、エトキシ、アリルオキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、および
フェノキシ）、アジド、アミノまたはアルキルアミノ、フルオロ、クロロならび
にブロモである２’−または３’−改変体が挙げられるが、これらに限定されな
い。用語「標識ヌクレオシド／ヌクレオチド」は、結合を介して式Ｉの色素化合
物に共有結合されたヌクレオシド／ヌクレオチドを指す。
リンまたはピリミジン核酸塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、ウラ
シル、チミン、デアザアデニン、デアザグアノシンなど）からなる化合物をいう
。ヌクレオシド塩基が、プリンまたは７−デアザプリンである場合、このペント
ースは、プリンまたはデアザプリンの９位で核酸塩基に結合され、そして、核酸
塩基がピリミジンである場合には、ペントースは、ピリミジンの１位で核酸塩基
に結合される（例えば、ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ、ＤＮＡ Ｒｅｐｌ
ｉｃａｔｉｏｎ 第２版（Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、１９
９２））。本明細書中で使用されているように、用語「ヌクレオチド」は、ヌク
レオシドのホスフェートエステル（例えば、トリホスフェートエステル）を指し
、ここで、エステル化の最も一般的な部位は、ペントースのＣ−５位に結合され
たヒドロキシル基である。本明細書中で使用される、用語「ヌクレオシド／ヌク
レオチド」は、ヌクレオシドおよびヌクレオチドの両方を包含する一連の化合物
を指す。ヌクレオシド／ヌクレオチドに関する「アナログ」は、改変核酸塩基部
分、改変ペントース部分、および／または改変ホスフェート部分を有する合成ア
ナログ（例えば、Ｓｃｈｅｉｔ、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ（Ｊｏ
ｈｎ Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８０）に一般に記載される）を含む
。一般に、ホスフェートアナログは、ホスフェートのアナログを含み、ここで、
リン原子は＋５の酸化状態にあり、そして酸素原子の１つ以上が非酸素部位と置
き換えられている（例えば、硫黄）。代表的なホスフェートアナログには、限定
されないが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエー
ト、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニリデート
、ホスホラミデート、ボロノホスフェートが挙げられ、これらは、対イオンが存
在するならば、会合した対イオン（例えば、Ｈ+、ＮＨ4 +、Ｎａ+）を含む。代表
的な塩基アナログには、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、プソイドウ
リジン、Ｃ−５−プロピン、イソシトシン、イソグアニン、２−チオピリミジン
などのアナログが挙げられるが、これらに限定されない。代表的な糖アナログに
は、２’−または３’位が、水素、ヒドロキシ、アルコキシ（例えば、メトキシ
、エトキシ、アリルオキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、および
フェノキシ）、アジド、アミノまたはアルキルアミノ、フルオロ、クロロならび
にブロモである２’−または３’−改変体が挙げられるが、これらに限定されな
い。用語「標識ヌクレオシド／ヌクレオチド」は、結合を介して式Ｉの色素化合
物に共有結合されたヌクレオシド／ヌクレオチドを指す。
【００２７】 用語「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドモ
ノマーまたはそのアナログのポリマーを意味し、これは、２本鎖および１本鎖デ
オキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、それらのα−アノマー形態などを
含む。通常、モノマーは、ホスホジエステル結合によって結合され、ここで、本
明細書中で、用語「ホスホジエステル結合」は、ホスホジエステル結合またはそ
のホスフェートアナログを含む結合を指し、これらは、対イオンが存在するなら
ば、付随の対イオン（例えば、Ｈ+、ＮＨ4 +、Ｎａ+）を含む。ポリヌクレオチド
は、典型的に、数モノマー単位（例えば、５〜４０）〜数千モノマー単位のサイ
ズの範囲である。ポリヌクレオチドが文字の配列によって表現される（例えば、
「ＡＴＧＣＣＴＧ」）場合はいつでも、他に示されない限り、ヌクレオチドは、
左から右へ５’→３’の順番であり、そして「Ａ」はデオキシアデノシンを示し
、「Ｃ」はデオキシシチジンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを示し、そし
て「Ｔ」はデオキシチミジンを示すことが理解される。
ノマーまたはそのアナログのポリマーを意味し、これは、２本鎖および１本鎖デ
オキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、それらのα−アノマー形態などを
含む。通常、モノマーは、ホスホジエステル結合によって結合され、ここで、本
明細書中で、用語「ホスホジエステル結合」は、ホスホジエステル結合またはそ
のホスフェートアナログを含む結合を指し、これらは、対イオンが存在するなら
ば、付随の対イオン（例えば、Ｈ+、ＮＨ4 +、Ｎａ+）を含む。ポリヌクレオチド
は、典型的に、数モノマー単位（例えば、５〜４０）〜数千モノマー単位のサイ
ズの範囲である。ポリヌクレオチドが文字の配列によって表現される（例えば、
「ＡＴＧＣＣＴＧ」）場合はいつでも、他に示されない限り、ヌクレオチドは、
左から右へ５’→３’の順番であり、そして「Ａ」はデオキシアデノシンを示し
、「Ｃ」はデオキシシチジンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを示し、そし
て「Ｔ」はデオキシチミジンを示すことが理解される。
【００２８】 用語「置換された」は、１つ以上の水素原子が１つ以上の非水素原子、官能基
または部位で置き換えられた分子を意味する。例えば、非置換窒素は、−ＮＨ2
であるが、一方、置換された窒素は、−ＮＨＣＨ3であり、そして非置換炭素は
、−ＣＨ3であるが、一方、置換された炭素は、−ＣＨ2Ｃｌである。代表的な置
換基には以下が挙げられるが、これらに限定されない：ハロ（例えば、フッ素お
よび塩素）、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、スルフェート、スル
ホネート、スルホン、アミノ、アンモニウム、アミド、ニトリル、低級アルコキ
シ、フェノキシ、芳香族、フェニル、多環式芳香族、電子リッチ複素環水可溶化
基、および結合基。
または部位で置き換えられた分子を意味する。例えば、非置換窒素は、−ＮＨ2
であるが、一方、置換された窒素は、−ＮＨＣＨ3であり、そして非置換炭素は
、−ＣＨ3であるが、一方、置換された炭素は、−ＣＨ2Ｃｌである。代表的な置
換基には以下が挙げられるが、これらに限定されない：ハロ（例えば、フッ素お
よび塩素）、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、スルフェート、スル
ホネート、スルホン、アミノ、アンモニウム、アミド、ニトリル、低級アルコキ
シ、フェノキシ、芳香族、フェニル、多環式芳香族、電子リッチ複素環水可溶化
基、および結合基。
【００２９】 「多環式芳香族」は、複数の環構造（ビアリールおよび縮合ベンゼノイド炭化
水素を含む）を有する芳香族炭化水素を意味する。ビアリールは、ベンゼノイド
化合物であり、ここで、２つ以上の環が単結合によって一緒に結合されている。
この種類の親系は、ビフェニルである。縮合ベンゼノイド化合物は、環の各対が
２つの炭素を共有するような方法でオルト位で、一緒に縮合した２つ以上のベン
ゼン環によって特徴付けられる。この基の最も簡単なメンバーは、２つの環を有
するナフタレン、それぞれ３つの環を有するアントラセンおよびフェナントレン
である。
水素を含む）を有する芳香族炭化水素を意味する。ビアリールは、ベンゼノイド
化合物であり、ここで、２つ以上の環が単結合によって一緒に結合されている。
この種類の親系は、ビフェニルである。縮合ベンゼノイド化合物は、環の各対が
２つの炭素を共有するような方法でオルト位で、一緒に縮合した２つ以上のベン
ゼン環によって特徴付けられる。この基の最も簡単なメンバーは、２つの環を有
するナフタレン、それぞれ３つの環を有するアントラセンおよびフェナントレン
である。
【００３０】 「電子リッチ複素環」は、１つ以上の環原子が炭素ではない、すなわちヘテロ
原子である環状化合物を意味し、そしてこのヘテロ原子は、６π電子系に寄与す
る不対電子を有する。代表的な電子リッチ複素環には、ピロール、インドール、
フラン、ベンゾフラン、チオフェン、ベンゾチオフェン、および他の類似の構造
が挙げられるが、これらに限定されない。
原子である環状化合物を意味し、そしてこのヘテロ原子は、６π電子系に寄与す
る不対電子を有する。代表的な電子リッチ複素環には、ピロール、インドール、
フラン、ベンゾフラン、チオフェン、ベンゾチオフェン、および他の類似の構造
が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】 「結合基」は、試薬またはエネルギー移動色素対のメンバーに結合された「相
補的官能基」と反応し得る部位を意味し、このような反応は、色素を試薬または
エネルギー移動色素対のメンバーに接続する「結合」を形成する。好ましい結合
基は、相補的官能基がアミンである場合にはいつでも、イソチオシアネート、塩
化スルホニル、４，６−ジクロロトリアジニル、スクシンイミジルエステル、ま
たは他の活性カルボキシレートを含む。好ましくは、この結合基は、相補的官能
基がスルフヒドリルである場合にはいつでも、マレイミド、ハロアセチル、また
はヨードアセトアミドである。Ｒ．Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐ
ｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ
ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒ
ｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．（１９９２）を参照のこと。特に好ましい実施形態において
、結合基はＮ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルであり、そして
相補的官能基はアミンであり、ここで、ＮＨＳエステルを形成するために、カル
ボキシレート結合基を含む、本発明の色素が、ジシクロヘキシルカルボジイミド
およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応される。
補的官能基」と反応し得る部位を意味し、このような反応は、色素を試薬または
エネルギー移動色素対のメンバーに接続する「結合」を形成する。好ましい結合
基は、相補的官能基がアミンである場合にはいつでも、イソチオシアネート、塩
化スルホニル、４，６−ジクロロトリアジニル、スクシンイミジルエステル、ま
たは他の活性カルボキシレートを含む。好ましくは、この結合基は、相補的官能
基がスルフヒドリルである場合にはいつでも、マレイミド、ハロアセチル、また
はヨードアセトアミドである。Ｒ．Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐ
ｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ
ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒ
ｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．（１９９２）を参照のこと。特に好ましい実施形態において
、結合基はＮ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルであり、そして
相補的官能基はアミンであり、ここで、ＮＨＳエステルを形成するために、カル
ボキシレート結合基を含む、本発明の色素が、ジシクロヘキシルカルボジイミド
およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応される。
【００３２】 「水可溶化基」は、水溶液中で、本発明の化合物の溶解度を増加させる置換基
を意味する。代表的な水可溶化基には、以下が挙げられるが、これらに限定され
ない：第四級アミン、スルフェート、スルホネート、カルボキシレート、ホスフ
ェート、ポリエーテル、ポリヒドロキシル、およびボロネート。
を意味する。代表的な水可溶化基には、以下が挙げられるが、これらに限定され
ない：第四級アミン、スルフェート、スルホネート、カルボキシレート、ホスフ
ェート、ポリエーテル、ポリヒドロキシル、およびボロネート。
【００３３】 用語「キサンテン型色素」は、以下の縮合３環系：
【００３４】
【化１３】 を含む色素分子の種類を指す。
【００３５】 用語「フルオレセイン型色素」とは、以下の置換縮合３員環を含むキサンテン
色素分子のクラスをいう：
色素分子のクラスをいう：
【００３６】
【化１４】 ここで各デオキシ環の位置で様々な置換が可能である。特に好ましいフルオレセ
イン型色素のサブセットには、４，７−ジクロロフルオレセイン（Ｍｅｎｃｈｅ
ｎ）が挙げられる。ＤＮＡ配列決定法で蛍光標識として使用されるフルオレセイ
ン型色素の例には、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、５−カルボ
キシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、５または６−カルボキシ−４，７，２’，
７’−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、５または６−カルボキシ−４，
７，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、５また
は６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセ
イン（ＪＯＥ）、および、５−カルボキシ−２’，４’，５’，７’−テトラク
ロロフルオレセイン（ＺＯＥ）が挙げられる。しばしば、−１または−２の標記
は、例えば、ＨＥＸ−１のように、特定色素の略語の後に置かれる。「−１」お
よび「−２」の標記は、使用されている特定の５または６の色素の異性体を示す
。１および２の異性体は、Ｃ−８カラムおよび１５％アセトニトリル／８５％
０．１ Ｍトリエチルアンモニウムアセテートから３５％アセトニトリル／６５
％ ０．１ Ｍトリエチルアンモニウムアセテートの溶出勾配を使用する逆相ク
ロマトグラフィー分離システムにおいて、遊離色素の溶出順序（１異性体は最初
に溶出）によって定義される。
イン型色素のサブセットには、４，７−ジクロロフルオレセイン（Ｍｅｎｃｈｅ
ｎ）が挙げられる。ＤＮＡ配列決定法で蛍光標識として使用されるフルオレセイ
ン型色素の例には、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、５−カルボ
キシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、５または６−カルボキシ−４，７，２’，
７’−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、５または６−カルボキシ−４，
７，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、５また
は６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセ
イン（ＪＯＥ）、および、５−カルボキシ−２’，４’，５’，７’−テトラク
ロロフルオレセイン（ＺＯＥ）が挙げられる。しばしば、−１または−２の標記
は、例えば、ＨＥＸ−１のように、特定色素の略語の後に置かれる。「−１」お
よび「−２」の標記は、使用されている特定の５または６の色素の異性体を示す
。１および２の異性体は、Ｃ−８カラムおよび１５％アセトニトリル／８５％
０．１ Ｍトリエチルアンモニウムアセテートから３５％アセトニトリル／６５
％ ０．１ Ｍトリエチルアンモニウムアセテートの溶出勾配を使用する逆相ク
ロマトグラフィー分離システムにおいて、遊離色素の溶出順序（１異性体は最初
に溶出）によって定義される。
【００３７】 用語「ローダミン型色素」とは、以下の縮合３環系を含むキサンテン色素分子
のクラスをいう：
のクラスをいう：
【００３８】
【化１５】 ここで、好ましくは、Ｙ1〜Ｙ4は個別に、水素または低級アルキルであり、また
は、一緒になる場合、Ｙ1およびＲ2がプロパノであり、そしてＹ2およびＲ1がプ
ロパノであるか、あるいは一緒になる場合、Ｙ3およびＲ3がプロパノであり、Ｙ 4 およびＲ4がプロパノである。Ｒ1〜Ｒ4位を含む各デオキシ環の位置で、種々広
範の置換が可能である。ヌクレオシド／チド標識として有用な代表的なローダミ
ン型色素には、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、４，７−ジクロロテト
ラメチルローダミン（ＤＴＡＭＲＭ）、ローダミンＸ（ＲＯＸ）、ローダミン６
Ｇ（Ｒ６Ｇ）、ローダミン１１０（Ｒ１１０）などが挙げられる（Ｂｅｒｇｏｔ
ら、米国特許第５，３６６，８６０号（１９９４）；Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０（１０）：２４７１〜２４８３（１９９
２））。
は、一緒になる場合、Ｙ1およびＲ2がプロパノであり、そしてＹ2およびＲ1がプ
ロパノであるか、あるいは一緒になる場合、Ｙ3およびＲ3がプロパノであり、Ｙ 4 およびＲ4がプロパノである。Ｒ1〜Ｒ4位を含む各デオキシ環の位置で、種々広
範の置換が可能である。ヌクレオシド／チド標識として有用な代表的なローダミ
ン型色素には、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、４，７−ジクロロテト
ラメチルローダミン（ＤＴＡＭＲＭ）、ローダミンＸ（ＲＯＸ）、ローダミン６
Ｇ（Ｒ６Ｇ）、ローダミン１１０（Ｒ１１０）などが挙げられる（Ｂｅｒｇｏｔ
ら、米国特許第５，３６６，８６０号（１９９４）；Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０（１０）：２４７１〜２４８３（１９９
２））。
【００３９】 本明細書で使用されているように、用語「プライマー−伸長剤」とは、オリゴ
ヌクレオチドプライマーの酵素的テンプレート媒介伸長を行うのに必要な成分を
含有する試薬を意味する。プライマー伸長剤は、（ｉ）ポリメラーゼ酵素、例え
ば、Ｔａｑポリメラーゼのような熱安定ポリメラーゼ酵素；（ｉｉ）緩衝液；（
ｉｉｉ）鎖伸長ヌクレオチド、例えば、デオキシヌクレオチドトリホスフェート
、例えば、デオキシグアノシン５’−トリホスフェート、７−デアザデオキシグ
アノシン５’−トリホスフェート、デオキシアデノシン５’−トリホスフェート
、デオキシチミジン５’−トリホスフェート、デオキシシチジン５’−トリホス
フェート；および必要に応じて、Ｓａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列決定反応において、
（ｉｖ）１つ以上の鎖終結ヌクレオチド、例えば、ジデオキシヌクレオチドトリ
ホスフェート、例えば、ジデオキシグアノシン５’−トリホスフェート、７−デ
アザジデオキシグアノシン５’−トリホスフェート、ジデオキシアデノシン５’
−トリホスフェート、ジデオキシチミジン５’−トリホスフェート、およびジデ
オキシシチジン５’−トリホスフェートを含む。
ヌクレオチドプライマーの酵素的テンプレート媒介伸長を行うのに必要な成分を
含有する試薬を意味する。プライマー伸長剤は、（ｉ）ポリメラーゼ酵素、例え
ば、Ｔａｑポリメラーゼのような熱安定ポリメラーゼ酵素；（ｉｉ）緩衝液；（
ｉｉｉ）鎖伸長ヌクレオチド、例えば、デオキシヌクレオチドトリホスフェート
、例えば、デオキシグアノシン５’−トリホスフェート、７−デアザデオキシグ
アノシン５’−トリホスフェート、デオキシアデノシン５’−トリホスフェート
、デオキシチミジン５’−トリホスフェート、デオキシシチジン５’−トリホス
フェート；および必要に応じて、Ｓａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列決定反応において、
（ｉｖ）１つ以上の鎖終結ヌクレオチド、例えば、ジデオキシヌクレオチドトリ
ホスフェート、例えば、ジデオキシグアノシン５’−トリホスフェート、７−デ
アザジデオキシグアノシン５’−トリホスフェート、ジデオキシアデノシン５’
−トリホスフェート、ジデオキシチミジン５’−トリホスフェート、およびジデ
オキシシチジン５’−トリホスフェートを含む。
【００４０】 「テンプレート核酸」とは、一本鎖形態で存在し得、プライマーオリゴヌクレ
オチドとアニールし得る任意の核酸をいう。代表的なテンプレート核酸には、Ｄ
ＮＡ、ＲＮＡが挙げられ、ＤＮＡまたはＲＮＡは、一本鎖または二本鎖であり得
る。より詳細には、テンプレート核酸は、ゲノムＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ
、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ反応からのＤＮＡ増幅産物などであり得る。テンプレートＤ
ＮＡの調製方法は、他に見出され得る（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴM Ｄｙｅ Ｐｒ
ｉｍｅｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ
ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＡＮ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ＦＳ，Ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌ，Ｒｅｖｉｓｉｏｎ Ｃ，ｐ／ｎ ４０２１１４（１９９６））。
オチドとアニールし得る任意の核酸をいう。代表的なテンプレート核酸には、Ｄ
ＮＡ、ＲＮＡが挙げられ、ＤＮＡまたはＲＮＡは、一本鎖または二本鎖であり得
る。より詳細には、テンプレート核酸は、ゲノムＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ
、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ反応からのＤＮＡ増幅産物などであり得る。テンプレートＤ
ＮＡの調製方法は、他に見出され得る（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴM Ｄｙｅ Ｐｒ
ｉｍｅｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ
ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＡＮ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ＦＳ，Ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌ，Ｒｅｖｉｓｉｏｎ Ｃ，ｐ／ｎ ４０２１１４（１９９６））。
【００４１】 （ＩＩ．ヌクレオチド化合物） （Ａ．構造） 第１の局面において、本発明は、例えば、Ｓａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列決定反応
においてポリメラーゼ基質として有用な堅いリンカーを含むヌクレオシド／チド
化合物の新規なクラスを包含する。これらの化合物はすぐ下の式Ｉに示される一
般構造を有し、その置換形態を含む： ＮＵＣ−Ｌ−Ｓ−ＬＢ／ＬＧ 式Ｉ ここで、ＮＵＣは、核酸塩基部分Ｂを有するヌクレオシド／チドであり、Ｌは堅
い結合であり、Ｓはスペーサーであり、そしてＬＢ／ＬＧは結合基または標識で
ある。ＮＵＣは、Ｂを介してＬに結合され、その結果、Ｂがプリンの場合、Ｌは
そのプリンの８位に結合され、Ｂが７−デアザプリンの場合、Ｌはその７−デア
ザプリンの７位に結合され、そして，Ｂがピリミジンの場合、Ｌはそのピリミジ
ンの５位に結合される。本発明の化合物の重要な特徴において、Ｌは以下の構造
を有する：
においてポリメラーゼ基質として有用な堅いリンカーを含むヌクレオシド／チド
化合物の新規なクラスを包含する。これらの化合物はすぐ下の式Ｉに示される一
般構造を有し、その置換形態を含む： ＮＵＣ−Ｌ−Ｓ−ＬＢ／ＬＧ 式Ｉ ここで、ＮＵＣは、核酸塩基部分Ｂを有するヌクレオシド／チドであり、Ｌは堅
い結合であり、Ｓはスペーサーであり、そしてＬＢ／ＬＧは結合基または標識で
ある。ＮＵＣは、Ｂを介してＬに結合され、その結果、Ｂがプリンの場合、Ｌは
そのプリンの８位に結合され、Ｂが７−デアザプリンの場合、Ｌはその７−デア
ザプリンの７位に結合され、そして，Ｂがピリミジンの場合、Ｌはそのピリミジ
ンの５位に結合される。本発明の化合物の重要な特徴において、Ｌは以下の構造
を有する：
【００４２】
【化１６】 ここで、ｎ、ｏおよびｐの各々は、０〜３の範囲の整数であり、ｎとｏとｐとの
和は、少なくとも２であり、そしてＷ、Ｘ、ＹおよびＺの各々は、−ＣＨおよび
窒素からなる群から選択され、その置換形態を含む。
和は、少なくとも２であり、そしてＷ、Ｘ、ＹおよびＺの各々は、−ＣＨおよび
窒素からなる群から選択され、その置換形態を含む。
【００４３】 ＮＵＣは任意の適切なヌクレオシド、ヌクレオチドまたはそれらのアナログで
あり得る。しかし、好ましい実施形態において、ＮＵＣの糖部分は、２’−デオ
キシリボヌクレオチド、３’−デオキシリボヌクレオチド、２’，３’−ジデオ
キシリボヌクレオチド、２’，３’−ジデオキシ−３’−フルオロ−リボヌクレ
オチド、２’，３’−ジデオキシ−２’−フルオロ−リボヌクレオチド、２’，
３’−ジデオキシ−３’−アジド−リボヌクレオチド、２’，３’−ジデオキシ
−２’−アジド−リボヌクレオチド、２，３’−ジデオキシ−２’−アミノ−リ
ボヌクレオチド、２，３’−ジデオキシ−３’−アミノ−リボヌクレオチド、お
よび２’，３’−デヒドロリボヌクレオチドからなる群から選択される。特に好
ましい実施形態において、ＮＵＣは、２’，３’−ジデオキシリボヌクレオチド
、２’，３’−ジデオキシ−３’−フルオロ−リボヌクレオチドまたはリボヌク
レオチドである。
あり得る。しかし、好ましい実施形態において、ＮＵＣの糖部分は、２’−デオ
キシリボヌクレオチド、３’−デオキシリボヌクレオチド、２’，３’−ジデオ
キシリボヌクレオチド、２’，３’−ジデオキシ−３’−フルオロ−リボヌクレ
オチド、２’，３’−ジデオキシ−２’−フルオロ−リボヌクレオチド、２’，
３’−ジデオキシ−３’−アジド−リボヌクレオチド、２’，３’−ジデオキシ
−２’−アジド−リボヌクレオチド、２，３’−ジデオキシ−２’−アミノ−リ
ボヌクレオチド、２，３’−ジデオキシ−３’−アミノ−リボヌクレオチド、お
よび２’，３’−デヒドロリボヌクレオチドからなる群から選択される。特に好
ましい実施形態において、ＮＵＣは、２’，３’−ジデオキシリボヌクレオチド
、２’，３’−ジデオキシ−３’−フルオロ−リボヌクレオチドまたはリボヌク
レオチドである。
【００４４】 好ましくは、式Ｉの化合物の堅い結合部分において、ＷおよびＸのうち一方が
炭素であり、ＺおよびＹのうち一方が炭素である。堅い結合のさらに好ましい実
施形態において、ｎは１または２であり、ｏは０、１または２であり、そして／
またはｐは０または１である。より好ましくは、ｎは１または２であり、ｏは１
または２であり、そしてｐは０または１である。いくつかの特に好ましい堅い結
合構造をすぐ下に示す：
炭素であり、ＺおよびＹのうち一方が炭素である。堅い結合のさらに好ましい実
施形態において、ｎは１または２であり、ｏは０、１または２であり、そして／
またはｐは０または１である。より好ましくは、ｎは１または２であり、ｏは１
または２であり、そしてｐは０または１である。いくつかの特に好ましい堅い結
合構造をすぐ下に示す：
【００４５】
【化１７】 Ｓは、堅い結合Ｌと結合ペアＬＢ／ＬＧの標識またはメンバーとを結合するの
に役立つスペーサーである。Ｓは、ヌクレオシド／ヌクレオチド化合物、または
このようなヌクレオチドを含む化合物に機能性（例えば、高められたヌクレアー
ゼ耐性、溶解性、輸送特性、ハイブリダイゼーション、変化した電気泳動易動度
など）を加え得る。Ｓは、本発明の中心的な特徴ではなく、一般的な機能を提供
するので、Ｓは様々な形態を有し得ることが理解される。好ましくは、Ｓは、低
級アルキル、低級アルキレンオキシド、またはアミド、カルバメート、スルホン
アミド、あるいはそれらの任意の組み合わせである。より好ましくは、Ｓは、低
級アルキルまたは低級アルキレンオキシドである。最も好ましくは、Ｓは、例え
ば、以下の構造を有する低級アルケニルオキシドである：
に役立つスペーサーである。Ｓは、ヌクレオシド／ヌクレオチド化合物、または
このようなヌクレオチドを含む化合物に機能性（例えば、高められたヌクレアー
ゼ耐性、溶解性、輸送特性、ハイブリダイゼーション、変化した電気泳動易動度
など）を加え得る。Ｓは、本発明の中心的な特徴ではなく、一般的な機能を提供
するので、Ｓは様々な形態を有し得ることが理解される。好ましくは、Ｓは、低
級アルキル、低級アルキレンオキシド、またはアミド、カルバメート、スルホン
アミド、あるいはそれらの任意の組み合わせである。より好ましくは、Ｓは、低
級アルキルまたは低級アルキレンオキシドである。最も好ましくは、Ｓは、例え
ば、以下の構造を有する低級アルケニルオキシドである：
【００４６】
【化１８】 ここで、ｎは１〜８の範囲であるか、またはより好ましくは、ｎは１または２で
ある。
ある。
【００４７】 ＬＢ／ＬＧは、結合ペアの任意の適切な標識またはメンバーであり得る。ＬＢ
／ＬＧが結合ペアのメンバーである場合、好ましくは、このメンバーはアミノで
あり、そしてより好ましくは、アミンは第１級アミンである。ＬＢ／ＬＧが標識
の場合、この標識は、標識をスペーサーＳに結合するための結合を含む。結合は
、好ましくは、結合基と相補的官能基との反応によって形成される。好ましい実
施形態において、ＬＢ／ＬＧは標識であり、好ましくはこの標識は、キサンテン
型色素（例えば、ローダミまたはフルオレセイン型色素）である。
／ＬＧが結合ペアのメンバーである場合、好ましくは、このメンバーはアミノで
あり、そしてより好ましくは、アミンは第１級アミンである。ＬＢ／ＬＧが標識
の場合、この標識は、標識をスペーサーＳに結合するための結合を含む。結合は
、好ましくは、結合基と相補的官能基との反応によって形成される。好ましい実
施形態において、ＬＢ／ＬＧは標識であり、好ましくはこの標識は、キサンテン
型色素（例えば、ローダミまたはフルオレセイン型色素）である。
【００４８】 （Ｂ．合成） ３つの好ましい代替のストラテジーが、本発明のヌクレオチド／シドの合成に
利用可能である。１つのアプローチ（本明細書中で「収束（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎ
ｔ）合成」と称される）において、堅い結合Ｌ、スペーサーＳおよび結合ペアま
たは標識ＬＢ／ＬＧのサブ要素（まとめて「リンカーアーム部分」と称される）
は、ヌクレオシドにそれらが結合する前に構築される。次いで、完全に構築され
たリンカーアーム部分が単一反応工程でヌクレオシドに結合される。第２のアプ
ローチ（本明細暑中で「逐次合成」と称される）において、リンカーアームの第
１要素が、ヌクレオシドに結合され、引き続いてこの第１要素の活性化によって
、リンカーアーム部分の第２要素の結合を行う。このプロセスは、リンカーアー
ム部分の全ての要素がヌクレオチド／シドに組み込まれるまで連続的に繰り返さ
れる。第３のアプローチは収束合成と逐次合成の両方のストラテジーを合わせる
。すなわち、リンカーアーム部分のいくつかの要素は、多要素中間体に予め構築
され、次いで、この中間体はすでにヌクレオシドに組み込まれた要素に結合され
る。特定のヌクレオシド／チオ生成物の調製に好ましいストラテジーは、個々の
カップリング化学の利便性、およびヌクレオチド／シド上の官能基とのそれらの
適合性に依存する。
利用可能である。１つのアプローチ（本明細書中で「収束（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎ
ｔ）合成」と称される）において、堅い結合Ｌ、スペーサーＳおよび結合ペアま
たは標識ＬＢ／ＬＧのサブ要素（まとめて「リンカーアーム部分」と称される）
は、ヌクレオシドにそれらが結合する前に構築される。次いで、完全に構築され
たリンカーアーム部分が単一反応工程でヌクレオシドに結合される。第２のアプ
ローチ（本明細暑中で「逐次合成」と称される）において、リンカーアームの第
１要素が、ヌクレオシドに結合され、引き続いてこの第１要素の活性化によって
、リンカーアーム部分の第２要素の結合を行う。このプロセスは、リンカーアー
ム部分の全ての要素がヌクレオチド／シドに組み込まれるまで連続的に繰り返さ
れる。第３のアプローチは収束合成と逐次合成の両方のストラテジーを合わせる
。すなわち、リンカーアーム部分のいくつかの要素は、多要素中間体に予め構築
され、次いで、この中間体はすでにヌクレオシドに組み込まれた要素に結合され
る。特定のヌクレオシド／チオ生成物の調製に好ましいストラテジーは、個々の
カップリング化学の利便性、およびヌクレオチド／シド上の官能基とのそれらの
適合性に依存する。
【００４９】 代表的な収束合成は、以下のように実施される。２つのアセチレン基が、２つ
の別々に活性化可能な脱離基を含む芳香族前駆体を使用して、２つの別個の工程
で芳香族基に結合される。第１の工程において，ｐ−ハロフェノールは、低原子
価のパラジウム触媒の存在下で第１の一置換アセチレンと結合され、ハロゲン原
子の置換によってアセチレン置換フェノールが得られる（例えば、図２の化合物
１〜１１を参照のこと）。第２の工程において、トリフラート無水物を用いて、
フェノールヒドロキシルをそのトリフラートとして活性化し、続いて低原子価の
パラジウム触媒の存在下で第２の一置換アセチレン部分をカップリングすること
によって、所望の構造的特徴が得られる（例えば、図２の化合物１１〜１４を参
照のこと）。第１のアセチレン置換基がシリル保護基を含む場合、これはフッ化
物イオンを用いて除去され得る（例えば、図２の化合物１４〜１５を参照のこと
）。次いで、得られる一置換中間体は、低原子価のパラジウム触媒の存在下で、
活性化ヌクレオシド（例えば、５−ハロピリミジン、８−ハロプリン、または７
−ハロ−７−デアザ−プリン）と結合されて、保護されたリンカーヌクレオシド
を形成する（例えば、図１０の化合物１５〜３７を参照のこと）。
の別々に活性化可能な脱離基を含む芳香族前駆体を使用して、２つの別個の工程
で芳香族基に結合される。第１の工程において，ｐ−ハロフェノールは、低原子
価のパラジウム触媒の存在下で第１の一置換アセチレンと結合され、ハロゲン原
子の置換によってアセチレン置換フェノールが得られる（例えば、図２の化合物
１〜１１を参照のこと）。第２の工程において、トリフラート無水物を用いて、
フェノールヒドロキシルをそのトリフラートとして活性化し、続いて低原子価の
パラジウム触媒の存在下で第２の一置換アセチレン部分をカップリングすること
によって、所望の構造的特徴が得られる（例えば、図２の化合物１１〜１４を参
照のこと）。第１のアセチレン置換基がシリル保護基を含む場合、これはフッ化
物イオンを用いて除去され得る（例えば、図２の化合物１４〜１５を参照のこと
）。次いで、得られる一置換中間体は、低原子価のパラジウム触媒の存在下で、
活性化ヌクレオシド（例えば、５−ハロピリミジン、８−ハロプリン、または７
−ハロ−７−デアザ−プリン）と結合されて、保護されたリンカーヌクレオシド
を形成する（例えば、図１０の化合物１５〜３７を参照のこと）。
【００５０】 芳香族基へのアセチレン基の段階的な置換はまた、２個の脱離基を含む芳香族
環を使用して達成され得る。ここで第１位置の脱離基は、第２位置の脱離基より
置換活性（ｌａｂｉｌｅ）である。従って、例えば、２，５−ジブロモピリジン
において、低原子価のパラジウム触媒を用いる２位におけるアセチレン置換は、
５位における置換を行うことなく起こる。例えば、図５の化合物２２〜２５を参
照のこと。
環を使用して達成され得る。ここで第１位置の脱離基は、第２位置の脱離基より
置換活性（ｌａｂｉｌｅ）である。従って、例えば、２，５−ジブロモピリジン
において、低原子価のパラジウム触媒を用いる２位におけるアセチレン置換は、
５位における置換を行うことなく起こる。例えば、図５の化合物２２〜２５を参
照のこと。
【００５１】 本発明のヌクレオシド／チドを合成するための第２の方法において、逐次合成
技術が用いられる。例えば、複数のアセチレンユニットを含むリンカーアーム部
分の場合、第１の一置換アセチレン基の活性化ヌクレオシドへの付加は、上記に
記載されるように行われる（例えば、図１５の化合物３３〜４２を参照のこと）
。次に、第１のアセチレン基の脱保護の後、さらなる一置換アセチレン基が、塩
化銅（Ｉ）および酸素を使用して第１アセチレンに結合される（例えば、図１５
の化合物４２〜４４を参照のこと）。あるいは、上記のような低原子価のパラジ
ウム触媒を使用して、芳香族環が付加され得る。さらなるアセチレン基または芳
香族環が、これらの合成工程の繰り返しによって付加され得る。
技術が用いられる。例えば、複数のアセチレンユニットを含むリンカーアーム部
分の場合、第１の一置換アセチレン基の活性化ヌクレオシドへの付加は、上記に
記載されるように行われる（例えば、図１５の化合物３３〜４２を参照のこと）
。次に、第１のアセチレン基の脱保護の後、さらなる一置換アセチレン基が、塩
化銅（Ｉ）および酸素を使用して第１アセチレンに結合される（例えば、図１５
の化合物４２〜４４を参照のこと）。あるいは、上記のような低原子価のパラジ
ウム触媒を使用して、芳香族環が付加され得る。さらなるアセチレン基または芳
香族環が、これらの合成工程の繰り返しによって付加され得る。
【００５２】 本発明のヌクレオシド／チドを合成するための第３の方法において、生成物は
、逐次合成技術と収束合成技術との組み合わせを使用して調製される。例えば、
脱離基を含む芳香族環、およびその脱離基に対してパラ位にあるアセチレン基は
、第１の方法に記載されるように、パラ−ハロフェノールおよび一置換アセチレ
ン基を使用して調製され得る。一置換アセチレンヌクレオチド／シドは、第２の
方法に記載されるように調製され得る。次いで、このアセチレンは、上記のよう
に、低原子価のパラジウム触媒を使用して、この中間体に結合されて、所望の生
成物が生成する。
、逐次合成技術と収束合成技術との組み合わせを使用して調製される。例えば、
脱離基を含む芳香族環、およびその脱離基に対してパラ位にあるアセチレン基は
、第１の方法に記載されるように、パラ−ハロフェノールおよび一置換アセチレ
ン基を使用して調製され得る。一置換アセチレンヌクレオチド／シドは、第２の
方法に記載されるように調製され得る。次いで、このアセチレンは、上記のよう
に、低原子価のパラジウム触媒を使用して、この中間体に結合されて、所望の生
成物が生成する。
【００５３】 （ＩＩＩ．ヌクレオチド化合物の使用方法） 本明細書中で「フラグメント分析」または「遺伝子分析」法と称される好まし
いカテゴリーの方法において、標識ポリヌクレオチドフラグメントは、テンプレ
ート指向性（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）酵素的合成（例えば、ポリメラーゼ指向性プレ
イマー伸長反応）によって生成される。詳細には、本発明は、このようなプレイ
マー伸長反応を実施するための方法を含み、このプライマー伸長反応は、（１）
テンプレート核酸を提供する工程、（２）プライマー−テンプレートハイブリッ
ドを形成するために、オリゴヌクレオチドプレイマーをテンプレート核酸の一部
分にアニーリングする工程および（３）プライマーを伸長するために、プライマ
ー伸長試薬をプライマー−テンプレートハイブリッドに添加する工程であって、
このプライマー伸長試薬は、式Ｉのヌクレオチド化合物の構造を有するヌクレオ
チド化合物を含む、工程を包含する。
いカテゴリーの方法において、標識ポリヌクレオチドフラグメントは、テンプレ
ート指向性（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）酵素的合成（例えば、ポリメラーゼ指向性プレ
イマー伸長反応）によって生成される。詳細には、本発明は、このようなプレイ
マー伸長反応を実施するための方法を含み、このプライマー伸長反応は、（１）
テンプレート核酸を提供する工程、（２）プライマー−テンプレートハイブリッ
ドを形成するために、オリゴヌクレオチドプレイマーをテンプレート核酸の一部
分にアニーリングする工程および（３）プライマーを伸長するために、プライマ
ー伸長試薬をプライマー−テンプレートハイブリッドに添加する工程であって、
このプライマー伸長試薬は、式Ｉのヌクレオチド化合物の構造を有するヌクレオ
チド化合物を含む、工程を包含する。
【００５４】 好ましくは、本発明のプレイマー伸長方法において、プライマー伸長試薬は、
熱安定性のポリメラーゼ（例えば、ｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、ＢＳＴ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラー
ゼまたはＴａｑポリメラーゼ酵素（例えば、ＰＣＲプライマー：Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒ編
、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）））を含む。より好ましくは、熱安定性ポ
リメラーゼは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、またはＦ６６７位に変異を有する
変異体Ｔａｑポリメラーゼ酵素（例えば、ＴａｂｏｒおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏ
ｎ，ＥＰ ０ ６５５ ５０６）である。より好ましくは、変異は、Ｆ６６７Ｙ
である。本発明のプライマー伸長反応のさらに好ましい実施形態において、Ｔａ
ｑ ポリメラーゼ酵素は、Ｆ６６７Ｙ変異に加えて、６６０、６６４、６６５お
よび／または６８１位に変異を含む変異体である。米国出願番号０９／０４１，
８７８（１９９８年３月１２日出願）を参照のこと。これらの位置における好ま
しい変異は、Ｒ６６０Ｄ、Ｒ６６０Ｅ、Ｒ６６０Ｃ、Ｒ６６０Ｓ、Ｒ６６０Ｐお
よびＥ６８１Ｇを含む。特に好ましい実施形態において、変異体Ｔａｑポリメラ
ーゼ酵素は、変異Ｒ６６０ＣまたはＲ６６０Ｓ、Ｒ６６０ＰおよびＦ６６７Ｙを
含む。
熱安定性のポリメラーゼ（例えば、ｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、ＢＳＴ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラー
ゼまたはＴａｑポリメラーゼ酵素（例えば、ＰＣＲプライマー：Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒ編
、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）））を含む。より好ましくは、熱安定性ポ
リメラーゼは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、またはＦ６６７位に変異を有する
変異体Ｔａｑポリメラーゼ酵素（例えば、ＴａｂｏｒおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏ
ｎ，ＥＰ ０ ６５５ ５０６）である。より好ましくは、変異は、Ｆ６６７Ｙ
である。本発明のプライマー伸長反応のさらに好ましい実施形態において、Ｔａ
ｑ ポリメラーゼ酵素は、Ｆ６６７Ｙ変異に加えて、６６０、６６４、６６５お
よび／または６８１位に変異を含む変異体である。米国出願番号０９／０４１，
８７８（１９９８年３月１２日出願）を参照のこと。これらの位置における好ま
しい変異は、Ｒ６６０Ｄ、Ｒ６６０Ｅ、Ｒ６６０Ｃ、Ｒ６６０Ｓ、Ｒ６６０Ｐお
よびＥ６８１Ｇを含む。特に好ましい実施形態において、変異体Ｔａｑポリメラ
ーゼ酵素は、変異Ｒ６６０ＣまたはＲ６６０Ｓ、Ｒ６６０ＰおよびＦ６６７Ｙを
含む。
【００５５】 プライマー伸長反応に続いて、フラグメントはサイズ依存分離プロセス（例え
ば、電気泳動もしくはクロマトグラフィー）、または配列依存様式でフラグメン
トに結合するポリヌクレオチドプローブのセットへのハイブリダイゼーションに
供され得る（例えば、Ｄｒｍａｎａｃら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ，１６：５４〜５８（１９９８）、Ｒａｍｓａｙ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６：４０〜４４（１９９８）、および米国特許第５，
２０２，２３１号）。好ましい実施形態において、分離またはハイブリダイゼー
ションに続いて、例えば、レーザー誘発蛍光によって、フラグメントが検出され
る。特に好ましい実施形態において、複数のクラスのポリヌクレオチドが同時に
分離またはハイブリダイズされ、異なるクラスがスペクトル的に分解可能な標識
によって区別される。
ば、電気泳動もしくはクロマトグラフィー）、または配列依存様式でフラグメン
トに結合するポリヌクレオチドプローブのセットへのハイブリダイゼーションに
供され得る（例えば、Ｄｒｍａｎａｃら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ，１６：５４〜５８（１９９８）、Ｒａｍｓａｙ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６：４０〜４４（１９９８）、および米国特許第５，
２０２，２３１号）。好ましい実施形態において、分離またはハイブリダイゼー
ションに続いて、例えば、レーザー誘発蛍光によって、フラグメントが検出され
る。特に好ましい実施形態において、複数のクラスのポリヌクレオチドが同時に
分離またはハイブリダイズされ、異なるクラスがスペクトル的に分解可能な標識
によって区別される。
【００５６】 特に好ましいフラグメント分析法において、本発明に従って同定されたクラス
は、末端ヌクレオチドに関して定義され、その結果、４つの可能な末端塩基と、
区別して検出可能な標識のセットのメンバーとの間で、対応が確立される。例え
ば、スペクトル分解可能な蛍光標識が使用される場合、このようなセットは、市
販の分光光度計を用いて発光および吸収のバンド幅を測定することによって、容
易に構築される。より好ましくは、ＤＮＡ配列決定の化学的または鎖終結法の状
況において、クラスが生じ、最も好ましくは、鎖終結法（すなわち、ジデオキシ
ＤＮＡ配列決定、またはＳａｎｇｅｒ型配列決定）の状況において、クラスが生
じる。
は、末端ヌクレオチドに関して定義され、その結果、４つの可能な末端塩基と、
区別して検出可能な標識のセットのメンバーとの間で、対応が確立される。例え
ば、スペクトル分解可能な蛍光標識が使用される場合、このようなセットは、市
販の分光光度計を用いて発光および吸収のバンド幅を測定することによって、容
易に構築される。より好ましくは、ＤＮＡ配列決定の化学的または鎖終結法の状
況において、クラスが生じ、最も好ましくは、鎖終結法（すなわち、ジデオキシ
ＤＮＡ配列決定、またはＳａｎｇｅｒ型配列決定）の状況において、クラスが生
じる。
【００５７】 Ｓａｎｇｅｒ型配列決定は、配列が決定されるべき単鎖または二本鎖ＤＮＡテ
ンプレートを使用する、インビトロでのＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ鎖の合
成を含む。合成は、規定された部位（この部位に基づいて、オリゴヌクレオチド
プライマーがテンプレートにアニールする）で開始される。この合成反応は、連
続したＤＮＡ伸長を支持しないヌクレオチドアナログの組み込みによって終結さ
れる。代表的な鎖終結ヌクレオチドアナログには、２’，３’−ジデオキシヌク
レオシド５’−トリホスフェート（ｄｄＮＴＰ）が挙げられ、これは３’から５
’のＤＮＡ鎖伸長に必要な３’−ＯＨを欠く。適切な割合のｄＮＴＰ（２’−デ
オキシヌクレオシド５’トリホスフェート）、および４個のｄｄＮＴＰのうちの
１個が使用される場合、酵素触媒重合は、ｄｄＮＴＰが組み込まれる各部位にお
ける鎖のわずかな群において終結する。蛍光標識したプライマーまたは標識ｄｄ
ＮＴＰが各反応に使用される場合、配列情報は、高分解能電気泳動による分離の
後の蛍光によって検出され得る。鎖終結法において、本発明のヌクレオチドは標
識ジデオキシヌクレオチドを形成するために使用され得る。
ンプレートを使用する、インビトロでのＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ鎖の合
成を含む。合成は、規定された部位（この部位に基づいて、オリゴヌクレオチド
プライマーがテンプレートにアニールする）で開始される。この合成反応は、連
続したＤＮＡ伸長を支持しないヌクレオチドアナログの組み込みによって終結さ
れる。代表的な鎖終結ヌクレオチドアナログには、２’，３’−ジデオキシヌク
レオシド５’−トリホスフェート（ｄｄＮＴＰ）が挙げられ、これは３’から５
’のＤＮＡ鎖伸長に必要な３’−ＯＨを欠く。適切な割合のｄＮＴＰ（２’−デ
オキシヌクレオシド５’トリホスフェート）、および４個のｄｄＮＴＰのうちの
１個が使用される場合、酵素触媒重合は、ｄｄＮＴＰが組み込まれる各部位にお
ける鎖のわずかな群において終結する。蛍光標識したプライマーまたは標識ｄｄ
ＮＴＰが各反応に使用される場合、配列情報は、高分解能電気泳動による分離の
後の蛍光によって検出され得る。鎖終結法において、本発明のヌクレオチドは標
識ジデオキシヌクレオチドを形成するために使用され得る。
【００５８】 プライマー伸長フラグメントがサイズ依存分離プロセスに供される場合、好ま
しくは、これらは電気泳動手順によって分離される（例えば、上記のＧｏｕｌｄ
およびＭａｔｔｈｅｗｓ；ＲｉｃｋｗｏｏｄおよびＨａｍｅｓ編、Ｇｅｌ Ｅｌ
ｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ：Ａ Ｐｒａ
ｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｌｏ
ｎｄｏｎ，１９８１；Ｏｓｔｅｒｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ ａｎｄ Ｎｅｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第１巻 Ｓｐｒｉ
ｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，１９８４；または米国特許第５，３７
４，５２７号、同第５，６２４，８００号、および／または同第５，５５２，０
２８号）。好ましくは、このタイプの電気泳動マトリクスは、約２〜２０重量％
の間の濃度（重量対容量）を有する架橋されたまたは架橋されていないポリアク
リルアミドである。より好ましくは、ポリアクリルアミドの濃度は、約４〜８％
の間である。好ましくは、特に、ＤＮＡ配列決定の状況において、電気泳動マト
リクスは変性剤（例えば、ウレア、ホルムアミドなど）を含む。このようなマト
リクスを構築するための詳細な手順は、Ｍａｎｉａｔｉｓら、「Ｆｒａｃｔｉｏ
ｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｏｗ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ ＤＮＡ ａ
ｎｄ ＲＮＡ ｉｎ Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ Ｇｅｌｓ Ｃｏｎｔａｉ
ｎｉｎｇ ８９％ Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ ｏｒ ７Ｍ Ｕｒｅａ」、Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５：２９９〜３０５（１９８０）；Ｍａ
ｎｉａｔｉｓら、「Ｃｈａｉｎ Ｌｅｎｇｔｈ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
ｏｆ Ｓｍａｌｌ Ｄｏｕｂｌｅ− ａｎｄ Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ
ＤＮＡ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｂｙ Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ Ｇｅｌ
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１４：３７
８７〜３７９４（１９７５）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１７９〜１８５
頁（１９８２）；およびＡＢＩＰＲＩＳＭTM３７７ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ
Ｕｓｅｒ’ｓ Ｍａｎｕａｌ，Ｒｅｖ．Ａ，１９９５年１月，第２章（ｐ／ｎ
９０３４３３，Ｔｈｅ Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）に示される。特定の分離に用いられる最適な
電気泳動条件（例えば、ポリマー濃度、ｐＨ、温度、変性剤の濃度）は、これら
が単鎖であろう二本鎖であろうと、多くの因子（分離されるべき核酸のサイズ範
囲、それらの塩基組成、および情報が電気泳動によって調査されるクラスの特徴
を含む）に依存する。従って、本発明の適用は、標準予備試験が特定の分離のた
めの条件を最適化することを必要とし得る。
しくは、これらは電気泳動手順によって分離される（例えば、上記のＧｏｕｌｄ
およびＭａｔｔｈｅｗｓ；ＲｉｃｋｗｏｏｄおよびＨａｍｅｓ編、Ｇｅｌ Ｅｌ
ｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ：Ａ Ｐｒａ
ｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｌｏ
ｎｄｏｎ，１９８１；Ｏｓｔｅｒｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ ａｎｄ Ｎｅｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第１巻 Ｓｐｒｉ
ｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，１９８４；または米国特許第５，３７
４，５２７号、同第５，６２４，８００号、および／または同第５，５５２，０
２８号）。好ましくは、このタイプの電気泳動マトリクスは、約２〜２０重量％
の間の濃度（重量対容量）を有する架橋されたまたは架橋されていないポリアク
リルアミドである。より好ましくは、ポリアクリルアミドの濃度は、約４〜８％
の間である。好ましくは、特に、ＤＮＡ配列決定の状況において、電気泳動マト
リクスは変性剤（例えば、ウレア、ホルムアミドなど）を含む。このようなマト
リクスを構築するための詳細な手順は、Ｍａｎｉａｔｉｓら、「Ｆｒａｃｔｉｏ
ｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｏｗ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ ＤＮＡ ａ
ｎｄ ＲＮＡ ｉｎ Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ Ｇｅｌｓ Ｃｏｎｔａｉ
ｎｉｎｇ ８９％ Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ ｏｒ ７Ｍ Ｕｒｅａ」、Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５：２９９〜３０５（１９８０）；Ｍａ
ｎｉａｔｉｓら、「Ｃｈａｉｎ Ｌｅｎｇｔｈ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
ｏｆ Ｓｍａｌｌ Ｄｏｕｂｌｅ− ａｎｄ Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ
ＤＮＡ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｂｙ Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ Ｇｅｌ
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１４：３７
８７〜３７９４（１９７５）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１７９〜１８５
頁（１９８２）；およびＡＢＩＰＲＩＳＭTM３７７ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ
Ｕｓｅｒ’ｓ Ｍａｎｕａｌ，Ｒｅｖ．Ａ，１９９５年１月，第２章（ｐ／ｎ
９０３４３３，Ｔｈｅ Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）に示される。特定の分離に用いられる最適な
電気泳動条件（例えば、ポリマー濃度、ｐＨ、温度、変性剤の濃度）は、これら
が単鎖であろう二本鎖であろうと、多くの因子（分離されるべき核酸のサイズ範
囲、それらの塩基組成、および情報が電気泳動によって調査されるクラスの特徴
を含む）に依存する。従って、本発明の適用は、標準予備試験が特定の分離のた
めの条件を最適化することを必要とし得る。
【００５９】 電気泳動分離に続いて、標識ポリヌクレオチドフラグメントが、例えば、蛍光
発光を測定することによって検出される。代表的な蛍光ベースの電気泳動検出シ
ステムは、他で、例えば、米国特許第５，５４３，０２６号；同第５，２７４，
２４０号；同第４，８７９，０１２号；同第５，０９１，６５２号および同第４
，８１１，２１８号に記載される。
発光を測定することによって検出される。代表的な蛍光ベースの電気泳動検出シ
ステムは、他で、例えば、米国特許第５，５４３，０２６号；同第５，２７４，
２４０号；同第４，８７９，０１２号；同第５，０９１，６５２号および同第４
，８１１，２１８号に記載される。
【００６０】 （ＩＶ．実施例） 本発明は以下の実施例の考察によってさらに明らかになり、これらの実施例は
本発明の純粋な例であることを意図し、本発明の範囲をいずれの方法でも制限す
ることを意図しない。
本発明の純粋な例であることを意図し、本発明の範囲をいずれの方法でも制限す
ることを意図しない。
【００６１】 （材料および方法） 薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を、シリカゲル６０−Ｆ254の２５０μｍ
の層でプレコーティングしたガラスプレート上で実施した：この化合物を、蛍光
をクエンチするか、および／または５％硫酸を用いて焦がすことにより位置決め
した。他に示されない限り、全ての精製は、ＳＩＰブランドのシリカゲル６０Å
（２３０〜４００メッシュ ＡＳＴＭ）で実施されるフラッシュカラムクロマト
グラフィーにより行った。1Ｈ ＮＭＲスペクトルは、室温で、ＣＤＣｌ3（内部
Ｍｅ4Ｓｉ、δ ０）またはＤ2Ｏ（外部Ｍｅ4Ｓｉ、δ ０）に溶解した溶液を
、３００ＭＨｚで記録した。ＣＤＣｌ3またはＤ2Ｏに溶解した溶液を、13Ｃ Ｎ
ＭＲスペクトルは７５．５ＭＨｚで記録し、19Ｆ ＮＭＲスペクトルは２８２．
２３ＭＨｚで記録し、そして31Ｐ ＮＭＲスペクトルは、Ｄ2Ｏに溶解した溶液
を１２１．４４ＭＨｚで記録した。全ての場合において、観測されるＮＭＲデー
タは示された構造と一致した。生成物の純度は分析用ＨＰＬＣにより分析した。
他に示されない限り、全ての反応は周囲温度で行い、後処理において、有機溶媒
の溶液を、等量の水溶液で洗浄した。４０〜５０℃のバス温で、水アスピレータ
ーの真空下で、ロータリーエバポレーターで濃縮する前に、有機溶液を乾燥した
（無水Ｎａ2ＳＯ4）。
の層でプレコーティングしたガラスプレート上で実施した：この化合物を、蛍光
をクエンチするか、および／または５％硫酸を用いて焦がすことにより位置決め
した。他に示されない限り、全ての精製は、ＳＩＰブランドのシリカゲル６０Å
（２３０〜４００メッシュ ＡＳＴＭ）で実施されるフラッシュカラムクロマト
グラフィーにより行った。1Ｈ ＮＭＲスペクトルは、室温で、ＣＤＣｌ3（内部
Ｍｅ4Ｓｉ、δ ０）またはＤ2Ｏ（外部Ｍｅ4Ｓｉ、δ ０）に溶解した溶液を
、３００ＭＨｚで記録した。ＣＤＣｌ3またはＤ2Ｏに溶解した溶液を、13Ｃ Ｎ
ＭＲスペクトルは７５．５ＭＨｚで記録し、19Ｆ ＮＭＲスペクトルは２８２．
２３ＭＨｚで記録し、そして31Ｐ ＮＭＲスペクトルは、Ｄ2Ｏに溶解した溶液
を１２１．４４ＭＨｚで記録した。全ての場合において、観測されるＮＭＲデー
タは示された構造と一致した。生成物の純度は分析用ＨＰＬＣにより分析した。
他に示されない限り、全ての反応は周囲温度で行い、後処理において、有機溶媒
の溶液を、等量の水溶液で洗浄した。４０〜５０℃のバス温で、水アスピレータ
ーの真空下で、ロータリーエバポレーターで濃縮する前に、有機溶液を乾燥した
（無水Ｎａ2ＳＯ4）。
【００６２】 陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＡＥ−ＨＰＬＣ）を以下のように
行った。カラム：ＡｑｕａｐｏｒｅＴＭ ＡＸ−３００、７μｍの粒子サイズ、
２２０×４．６ｍｍ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；勾配：
２０分にわたって１．５ｍｌ／分で、４０％アセトニトリル：６０％重炭酸トリ
エチルアンモニウム（ＴＥＡＢ、０．１Ｍ）〜４０％アセトニトリル：６０％Ｔ
ＥＡＢ（１．５Ｍ）、続いてアイソクラチック溶出；検出：２６０ｎｍにおける
ＵＶ吸光度。
行った。カラム：ＡｑｕａｐｏｒｅＴＭ ＡＸ−３００、７μｍの粒子サイズ、
２２０×４．６ｍｍ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；勾配：
２０分にわたって１．５ｍｌ／分で、４０％アセトニトリル：６０％重炭酸トリ
エチルアンモニウム（ＴＥＡＢ、０．１Ｍ）〜４０％アセトニトリル：６０％Ｔ
ＥＡＢ（１．５Ｍ）、続いてアイソクラチック溶出；検出：２６０ｎｍにおける
ＵＶ吸光度。
【００６３】 逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を以下のように行った。
カラム：Ｓｐｈｅｒｉ−５ ＲＰ−Ｃ１８、５μｍの粒子サイズ、２２０×４．
６ｍｍ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；勾配：２０分にわた
って１．５ｍｌ／分で、１００％トリエチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡＡ
、０．１Ｍ）〜４０％アセトニトリル：６０％ＴＥＡＡ、続いて、５分間にわた
って１．５ｍＬ／分で、４０％〜１００％アセトニトリル。
カラム：Ｓｐｈｅｒｉ−５ ＲＰ−Ｃ１８、５μｍの粒子サイズ、２２０×４．
６ｍｍ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；勾配：２０分にわた
って１．５ｍｌ／分で、１００％トリエチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡＡ
、０．１Ｍ）〜４０％アセトニトリル：６０％ＴＥＡＡ、続いて、５分間にわた
って１．５ｍＬ／分で、４０％〜１００％アセトニトリル。
【００６４】 （実施例１） （ヌクレオシド保護リンカー化合物３４の合成（図１および８を参照のこと）
） Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の１（１当量）の撹拌溶液に、ＮａＨ（１．
２当量、８０％）を滴下した。ＮａＨ添加を完了した後、室温で０．５時間撹拌
を続け、次いでこの反応溶液を０℃に冷却した。ブロミド２（２当量）を添加し
、０℃で０．５時間撹拌を続け、続いて室温で２時間撹拌した。過剰のＮａＨを
分解するためにメタノールを慎重に添加した後、溶媒をエバポレートし、この粗
生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、固形物として３
を得た。
） Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の１（１当量）の撹拌溶液に、ＮａＨ（１．
２当量、８０％）を滴下した。ＮａＨ添加を完了した後、室温で０．５時間撹拌
を続け、次いでこの反応溶液を０℃に冷却した。ブロミド２（２当量）を添加し
、０℃で０．５時間撹拌を続け、続いて室温で２時間撹拌した。過剰のＮａＨを
分解するためにメタノールを慎重に添加した後、溶媒をエバポレートし、この粗
生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、固形物として３
を得た。
【００６５】 ピリジン（１５ｍｌ）中の３（１当量）の溶液に、塩化メタンスルホニル（２
当量）を加え、０℃で１時間撹拌し、次いで、室温で１２時間撹拌した。次いで
、この混合物を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、
４を得た。
当量）を加え、０℃で１時間撹拌し、次いで、室温で１２時間撹拌した。次いで
、この混合物を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、
４を得た。
【００６６】 Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の４（１当量）の溶液に、フタルアミドカリ
ウム５（１．５当量）を加えた。７０℃で１２時間撹拌後、この混合物を濃縮し
、次いでジクロロメタン（１００ｍＬ）で希釈した。濾過によって固形物を除去
した後、有機層を水で洗浄し、乾燥し、そして濃縮した。この残渣をフラッシュ
カラムクロマトグラフィーによって精製し、６を得た。
ウム５（１．５当量）を加えた。７０℃で１２時間撹拌後、この混合物を濃縮し
、次いでジクロロメタン（１００ｍＬ）で希釈した。濾過によって固形物を除去
した後、有機層を水で洗浄し、乾燥し、そして濃縮した。この残渣をフラッシュ
カラムクロマトグラフィーによって精製し、６を得た。
【００６７】 エタノール（４ｍＬ）中の６（１当量）およびエチレンジアミン（９．６当量
）の混合物を８０℃で１時間加熱した。次いで、この反応混合物をエバポレート
して乾燥し、この残渣をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）に溶解し、メ
チルトリフルオロ酢酸（６．５ｍＬ）を加えた。１時間８０℃で撹拌した後、溶
媒をエバポレートし、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製
し、７を得た。
）の混合物を８０℃で１時間加熱した。次いで、この反応混合物をエバポレート
して乾燥し、この残渣をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）に溶解し、メ
チルトリフルオロ酢酸（６．５ｍＬ）を加えた。１時間８０℃で撹拌した後、溶
媒をエバポレートし、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製
し、７を得た。
【００６８】 Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で、化合物７（１当量）をヨウ化第一銅（０
．２当量）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．２当量）
およびトリエチルアミン（２当量）の存在下で、アルゴン下で、室温で１２時間
（トリエチルシリル）アセチレン８（５当量）と反応させた。次いで、この反応
溶液を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、９を得た
。
．２当量）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．２当量）
およびトリエチルアミン（２当量）の存在下で、アルゴン下で、室温で１２時間
（トリエチルシリル）アセチレン８（５当量）と反応させた。次いで、この反応
溶液を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、９を得た
。
【００６９】 無水オキソラン（９ｍＬ）中の９（０．６モル）の溶液に、オキソラン（４．
５ｍＬ）中の１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオライドを添加し、この混合物
を０℃で２時間撹拌した。濃縮後、この残渣をフラッシュカラムクロマトグラフ
ィーによって精製し、１０を得た。
５ｍＬ）中の１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオライドを添加し、この混合物
を０℃で２時間撹拌した。濃縮後、この残渣をフラッシュカラムクロマトグラフ
ィーによって精製し、１０を得た。
【００７０】 Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で、３’フルオロ−５−ヨード−２’，３’
−ジデオキシシチジン３３（１当量）を、ヨウ化第一銅（０．２当量）、テトラ
キス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．２当量）およびトリエチルア
ミン（２当量）の存在下で、アルゴン下にて、室温で１２時間リンカー１０（４
当量）と反応させた。この反応溶液を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフ
ィーによって精製し、３４を得た。
−ジデオキシシチジン３３（１当量）を、ヨウ化第一銅（０．２当量）、テトラ
キス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．２当量）およびトリエチルア
ミン（２当量）の存在下で、アルゴン下にて、室温で１２時間リンカー１０（４
当量）と反応させた。この反応溶液を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフ
ィーによって精製し、３４を得た。
【００７１】 （実施例２） （ヌクレオシド−保護−リンカー化合物３６の合成（図９を参照のこと）） Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で、３’フルオロ−７−デアザ−７−ヨード
−２’，３’−ジデオキシアデノシン３５（１当量）を、ヨウ化第一銅（０．２
当量）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．２当量）およ
びトリエチルアミン（２当量）の存在下で、アルゴン下で室温１２時間、リンカ
ー１０（４当量）と反応させた。次いで、この反応溶液を濃縮し、フラッシュカ
ラムクロマトグラフィーによって精製し、３６を得た。
−２’，３’−ジデオキシアデノシン３５（１当量）を、ヨウ化第一銅（０．２
当量）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．２当量）およ
びトリエチルアミン（２当量）の存在下で、アルゴン下で室温１２時間、リンカ
ー１０（４当量）と反応させた。次いで、この反応溶液を濃縮し、フラッシュカ
ラムクロマトグラフィーによって精製し、３６を得た。
【００７２】 （実施例３） （ヌクレオシド−保護−リンカー化合物３７の合成（図２および１０を参照の
こと）） Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で、４−ヨードフェノール１（１当量）を、
ヨウ化第一銅（０．２当量）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウ
ム（０．２当量）およびトリエチルアミン（２当量）の存在下で、アルゴン下で
室温１２時間、（トリエチルシリル）アセチレン８（４当量）と反応させた。次
いで、この反応溶液を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精
製し、１１を得た。
こと）） Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で、４−ヨードフェノール１（１当量）を、
ヨウ化第一銅（０．２当量）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウ
ム（０．２当量）およびトリエチルアミン（２当量）の存在下で、アルゴン下で
室温１２時間、（トリエチルシリル）アセチレン８（４当量）と反応させた。次
いで、この反応溶液を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精
製し、１１を得た。
【００７３】 −４０℃のジクロロメタン（５０ｍＬ）中の１１（１当量）の撹拌溶液に、ト
リフルオロメタンスルホン酸無水物（１．２当量）、続いて、トリエチルアミン
（１．２当量）をアルゴン下で加えた。−４０℃でさらに１時間撹拌を続けた後
、次いでこの反応混合物を室温まで加温し、５時間撹拌した。この反応混合物を
ジクロロメタンで希釈し、連続して希Ｈ2ＳＯ4水溶液、飽和ＮａＨＣＯ3溶液、
ブライン、および水で洗浄し、乾燥し、濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラ
フィーによって精製し、１２を得た。
リフルオロメタンスルホン酸無水物（１．２当量）、続いて、トリエチルアミン
（１．２当量）をアルゴン下で加えた。−４０℃でさらに１時間撹拌を続けた後
、次いでこの反応混合物を室温まで加温し、５時間撹拌した。この反応混合物を
ジクロロメタンで希釈し、連続して希Ｈ2ＳＯ4水溶液、飽和ＮａＨＣＯ3溶液、
ブライン、および水で洗浄し、乾燥し、濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラ
フィーによって精製し、１２を得た。
【００７４】 Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で、化合物１２（１当量）をヨウ化第一銅（
０．２当量）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．２当量
）およびトリエチルアミン（２当量）の存在下で、室温１２時間、アルゴン下で
、リンカー１３（４当量）と反応させた。次いで、この反応溶液を濃縮し、フラ
ッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、１４を得た。
０．２当量）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．２当量
）およびトリエチルアミン（２当量）の存在下で、室温１２時間、アルゴン下で
、リンカー１３（４当量）と反応させた。次いで、この反応溶液を濃縮し、フラ
ッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、１４を得た。
【００７５】 無水オキソラン（５ｍＬ）中の１４（０．４６ｍｍｏｌ）の溶液に、オキソラ
ン（１．５ｍＬ）中の１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオライドを加え、この
混合物を０℃で２時間撹拌した。濃縮後、この残渣をフラッシュカラムクロマト
グラフィーによって精製し、１５を得た。
ン（１．５ｍＬ）中の１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオライドを加え、この
混合物を０℃で２時間撹拌した。濃縮後、この残渣をフラッシュカラムクロマト
グラフィーによって精製し、１５を得た。
【００７６】 Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で、３’−フルオロ−５−ヨード−２’，３
’−ジデオキシシチジン３３（１当量）を、ヨウ化第一銅（０．２当量）、テト
ラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．２当量）およびトリエチル
アミン（２当量）の存在下で、室温１２時間、アルゴン下で、リンカー１５（４
当量）と反応させた。この反応溶液を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフ
ィーによって精製し、３７を得た。
’−ジデオキシシチジン３３（１当量）を、ヨウ化第一銅（０．２当量）、テト
ラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．２当量）およびトリエチル
アミン（２当量）の存在下で、室温１２時間、アルゴン下で、リンカー１５（４
当量）と反応させた。この反応溶液を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフ
ィーによって精製し、３７を得た。
【００７７】 （実施例４） （ヌクレオシド−保護−リンカー化合物３８の合成（図３、４および９を参照
のこと）） オキソラン中のＮａＨ（１．０５当量、９５％）の撹拌溶液に、０℃で１７（
１当量）を滴下した。添加を完了した後、撹拌を０℃で１時間継続し、次いで、
ブロミド１６（１．０５当量）を２時間にわたって添加し、撹拌を０℃で２時間
継続し、続いて、室温で２４時間撹拌した。過剰のＮａＨを分解するために、メ
タノールを慎重に添加した後、溶媒をエバポレートし、粗生成物を分留によって
精製し、１８を得た。
のこと）） オキソラン中のＮａＨ（１．０５当量、９５％）の撹拌溶液に、０℃で１７（
１当量）を滴下した。添加を完了した後、撹拌を０℃で１時間継続し、次いで、
ブロミド１６（１．０５当量）を２時間にわたって添加し、撹拌を０℃で２時間
継続し、続いて、室温で２４時間撹拌した。過剰のＮａＨを分解するために、メ
タノールを慎重に添加した後、溶媒をエバポレートし、粗生成物を分留によって
精製し、１８を得た。
【００７８】 化合物１８を室温で１２時間大過剰のメチルトリフルオロ酢酸と反応させた。
溶媒をエバポレートし、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精
製し、１９を得た。
溶媒をエバポレートし、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精
製し、１９を得た。
【００７９】 Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で、化合物１２（１当量）をヨウ化第一銅（
０．２当量）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．２当量
）およびトリエチルアミン（２当量）の存在下で、室温で１２時間アルゴン下で
リンカー１９（４当量）と反応させた。次いで、この反応溶液を濃縮し、フラッ
シュカラムクロマトグラフィーによって精製し、２０を得た。
０．２当量）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．２当量
）およびトリエチルアミン（２当量）の存在下で、室温で１２時間アルゴン下で
リンカー１９（４当量）と反応させた。次いで、この反応溶液を濃縮し、フラッ
シュカラムクロマトグラフィーによって精製し、２０を得た。
【００８０】 無水オキソラン（２０ｍＬ）中の２０（３．３５ｍｍｏｌ）の溶液に、オキソ
ラン（１０ｍＬ）中の１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオライドを加え、この
混合物を室温で３時間撹拌した。濃縮後、この残渣をフラッシュカラムクロマト
グラフィーによって精製し、２１を得た。
ラン（１０ｍＬ）中の１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオライドを加え、この
混合物を室温で３時間撹拌した。濃縮後、この残渣をフラッシュカラムクロマト
グラフィーによって精製し、２１を得た。
【００８１】 Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で、３’−フルオロ−５−ヨード−２’，３
’−ジデオキシシチジン３３（１当量）を、ヨウ化第一銅（０．２当量）、テト
ラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．２当量）およびトリエチル
アミン（２当量）の存在下で、室温１２時間、アルゴン下でリンカー２１（４当
量）と反応させた。次いで、この反応溶液を濃縮し、フラッシュカラムクロマト
グラフィーによって精製し、３８を得た。
’−ジデオキシシチジン３３（１当量）を、ヨウ化第一銅（０．２当量）、テト
ラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．２当量）およびトリエチル
アミン（２当量）の存在下で、室温１２時間、アルゴン下でリンカー２１（４当
量）と反応させた。次いで、この反応溶液を濃縮し、フラッシュカラムクロマト
グラフィーによって精製し、３８を得た。
【００８２】 （実施例５） （ヌクレオシド−保護−リンカー化合物３９の合成（図５および１２を参照の
こと）） トリエチルアミン（３０ｍＬ）中で、２，５−ジブロモピリジン２２（１当量
）を、ヨウ化第一銅（０．０２当量）、およびビス（トリフェニルホスフィニル
）パラジウムジクロリド（０．０２当量）の存在下で、室温１２時間、アルゴン
下で、リンカー１３（１．０５当量）と反応させた。次いで、この反応溶液をジ
クロロメタンで希釈し、ブライン溶液で洗浄し、乾燥し、濾過し、そして濃縮し
た。この濃縮物をフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、２３を
得た。
こと）） トリエチルアミン（３０ｍＬ）中で、２，５−ジブロモピリジン２２（１当量
）を、ヨウ化第一銅（０．０２当量）、およびビス（トリフェニルホスフィニル
）パラジウムジクロリド（０．０２当量）の存在下で、室温１２時間、アルゴン
下で、リンカー１３（１．０５当量）と反応させた。次いで、この反応溶液をジ
クロロメタンで希釈し、ブライン溶液で洗浄し、乾燥し、濾過し、そして濃縮し
た。この濃縮物をフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、２３を
得た。
【００８３】 Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で、化合物２３（１当量）を、ヨウ化第一銅
（０．０５当量）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．０
５当量）およびトリエチルアミン（１０当量）の存在下で、室温１２時間、アル
ゴン下で、（トリエチルシリル）アセチレン８（２当量）と反応させた。次いで
、この反応溶液を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し
、２４を得た。
（０．０５当量）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．０
５当量）およびトリエチルアミン（１０当量）の存在下で、室温１２時間、アル
ゴン下で、（トリエチルシリル）アセチレン８（２当量）と反応させた。次いで
、この反応溶液を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し
、２４を得た。
【００８４】 無水オキソラン（１０ｍＬ）中の２４（０．５ｍｍｏｌ）の溶液に、オキソラ
ン（１．５ｍＬ）中の１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオライドを加え、この
混合物を２時間０℃で撹拌した。濃縮後、この残渣をフラッシュカラムクロマト
グラフィーによって精製し、２５を得た。
ン（１．５ｍＬ）中の１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオライドを加え、この
混合物を２時間０℃で撹拌した。濃縮後、この残渣をフラッシュカラムクロマト
グラフィーによって精製し、２５を得た。
【００８５】 Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で、３’−フルオロ−５−ヨード−２’，３
’−ジデオキシシチジン３３（１当量）を、ヨウ化第一銅（０．２当量）、テト
ラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．２当量）およびトリエチル
アミン（２当量）の存在下で、室温１２時間、アルゴン下で、リンカー２５（４
当量）と反応させた。次いで、この反応溶液を濃縮し、フラッシュカラムクロマ
トグラフィーによって精製し、３９を得た。
’−ジデオキシシチジン３３（１当量）を、ヨウ化第一銅（０．２当量）、テト
ラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．２当量）およびトリエチル
アミン（２当量）の存在下で、室温１２時間、アルゴン下で、リンカー２５（４
当量）と反応させた。次いで、この反応溶液を濃縮し、フラッシュカラムクロマ
トグラフィーによって精製し、３９を得た。
【００８６】 （実施例６） （ヌクレオシド−保護−リンカー化合物４０の合成（図６および１３を参照の
こと）） トリエチルアミン（７５ｍＬ）中で、２，５−ジブロモピリジン２２（１当量
）を、ヨウ化第一銅（０．０２当量）、およびビス（トリフェニルホスフィニル
）パラジウムジクロリド（０．０２当量）の存在下で、０℃で１時間（トリエチ
ルシリル）アセチレン８（１．０５当量）と反応させ、次いで、この反応混合物
を室温まで加温し、室温で１２時間アルゴン下で撹拌した。次いで、この反応溶
液をジクロロメタンで希釈し、ブライン溶液で洗浄し、乾燥し、濾過し、そして
濃縮した。この濃縮物をフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、
２６を得た。
こと）） トリエチルアミン（７５ｍＬ）中で、２，５−ジブロモピリジン２２（１当量
）を、ヨウ化第一銅（０．０２当量）、およびビス（トリフェニルホスフィニル
）パラジウムジクロリド（０．０２当量）の存在下で、０℃で１時間（トリエチ
ルシリル）アセチレン８（１．０５当量）と反応させ、次いで、この反応混合物
を室温まで加温し、室温で１２時間アルゴン下で撹拌した。次いで、この反応溶
液をジクロロメタンで希釈し、ブライン溶液で洗浄し、乾燥し、濾過し、そして
濃縮した。この濃縮物をフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、
２６を得た。
【００８７】 Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で、化合物２６（１当量）を、ヨウ化第一銅
（０．０５当量）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．０
５当量）およびトリエチルアミン（１０当量）の存在下で、室温で１２時間、ア
ルゴン下で、リンカー１３（２当量）と反応させた。次いで、この反応溶液を濃
縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、２７を得た。
（０．０５当量）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．０
５当量）およびトリエチルアミン（１０当量）の存在下で、室温で１２時間、ア
ルゴン下で、リンカー１３（２当量）と反応させた。次いで、この反応溶液を濃
縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、２７を得た。
【００８８】 無水オキソラン（１０ｍＬ）中の２７（０．５ｍｍｏｌ）の溶液に、オキソラ
ン（１．５ｍＬ）中の１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオライドを加え、そし
てこの混合物を０℃で２時間撹拌した。濃縮後、この残渣をフラッシュカラムク
ロマトグラフィーによって精製し、２８を得た。
ン（１．５ｍＬ）中の１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオライドを加え、そし
てこの混合物を０℃で２時間撹拌した。濃縮後、この残渣をフラッシュカラムク
ロマトグラフィーによって精製し、２８を得た。
【００８９】 Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で、３’−フルオロ−５−ヨード−２’，３
’−ジデオキシシチジン３３（１当量）を、ヨウ化第一銅（０．０５当量）、テ
トラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．０５当量）およびトリエ
チルアミン（２当量）の存在下で、室温で１２時間、アルゴン下で、リンカー２
８（３当量）と反応させた。次いで、この反応溶液を濃縮し、フラッシュカラム
クロマトグラフィーによって精製し、４０を得た。
’−ジデオキシシチジン３３（１当量）を、ヨウ化第一銅（０．０５当量）、テ
トラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．０５当量）およびトリエ
チルアミン（２当量）の存在下で、室温で１２時間、アルゴン下で、リンカー２
８（３当量）と反応させた。次いで、この反応溶液を濃縮し、フラッシュカラム
クロマトグラフィーによって精製し、４０を得た。
【００９０】 （実施例７） （ヌクレオシド−保護−リンカー化合物４１の合成（図７および１４を参照）
） Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で、４，４’−ジヨードビフェニル２９（１
当量）を、ヨウ化第一銅（０．２当量）、テトラキス（トリフェニルホスフィン
）パラジウム（０．２当量）およびトリエチルアミン（２当量）の存在下で、室
温で１２時間、アルゴン下で、（トリエチルシリル）アセチレン８（２当量）と
反応させた。次いで、この反応混合物を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラ
フィーによって精製し、３０を得た。
） Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で、４，４’−ジヨードビフェニル２９（１
当量）を、ヨウ化第一銅（０．２当量）、テトラキス（トリフェニルホスフィン
）パラジウム（０．２当量）およびトリエチルアミン（２当量）の存在下で、室
温で１２時間、アルゴン下で、（トリエチルシリル）アセチレン８（２当量）と
反応させた。次いで、この反応混合物を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラ
フィーによって精製し、３０を得た。
【００９１】 Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で、化合物３０（１当量）を、ヨウ化第一銅
（０．２当量）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．２当
量）およびトリエチルアミン（２当量）の存在下で、室温で１２時間、アルゴン
下で、リンカー１３（３当量）と反応させた。次いで、この反応物を濃縮し、フ
ラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、３１を得た。
（０．２当量）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．２当
量）およびトリエチルアミン（２当量）の存在下で、室温で１２時間、アルゴン
下で、リンカー１３（３当量）と反応させた。次いで、この反応物を濃縮し、フ
ラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、３１を得た。
【００９２】 無水オキソラン（１０ｍＬ）中の３１（０．３ｍｍｏｌ）の溶液に、オキソラ
ン（３ｍＬ）中の１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオライドを加え、そしてこ
の混合物を０℃で２時間撹拌した。濃縮後、残渣をフラッシュカラムクロマトグ
ラフィーによって精製し、３２を得た。
ン（３ｍＬ）中の１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオライドを加え、そしてこ
の混合物を０℃で２時間撹拌した。濃縮後、残渣をフラッシュカラムクロマトグ
ラフィーによって精製し、３２を得た。
【００９３】 Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で、３’−フルオロ−５−ヨード−２’，３
’−ジデオキシシチジン３３（１当量）を、ヨウ化第一銅（０．２当量）、テト
ラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．２当量）およびトリエチル
アミン（２当量）の存在下で、室温で１２時間、アルゴン下で、リンカー３２（
３当量）と反応させた。この反応溶液を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラ
フィーによって精製し、４１を得た。
’−ジデオキシシチジン３３（１当量）を、ヨウ化第一銅（０．２当量）、テト
ラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．２当量）およびトリエチル
アミン（２当量）の存在下で、室温で１２時間、アルゴン下で、リンカー３２（
３当量）と反応させた。この反応溶液を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラ
フィーによって精製し、４１を得た。
【００９４】 （実施例８） （ヌクレオシド−保護−リンカー化合物４４の合成（図１５を参照）） ３’−フルオロ−５−ヨード−２’，３’−ジデオキシシチジン３３（１当量
）を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中でヨウ化銅（Ｉ）（０．２当量）、テト
ラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．２当量）およびトリエチル
アミン（２当量)存在下、アルゴン下室温で１２時間、（トリエチルシリル）ア
セチレン８（４当量）と反応させた。次いでこの反応物を濃縮してフラッシュカ
ラムクロマトグラフィーで精製し、４２を得た。
）を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中でヨウ化銅（Ｉ）（０．２当量）、テト
ラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．２当量）およびトリエチル
アミン（２当量)存在下、アルゴン下室温で１２時間、（トリエチルシリル）ア
セチレン８（４当量）と反応させた。次いでこの反応物を濃縮してフラッシュカ
ラムクロマトグラフィーで精製し、４２を得た。
【００９５】 無水オキソラン（１０ｍＬ）中の４２（１．８６ｍｍｏｌ）の溶液へ、オキソ
ラン（３ｍＬ）中の１Ｍのテトラブチルアンモニウムフルオリドを加え、この混
合物を０℃で２時間撹拌した。濃縮した後、この混合物をフラッシュカラムクロ
マトグラフィーで精製し、４３を得た。
ラン（３ｍＬ）中の１Ｍのテトラブチルアンモニウムフルオリドを加え、この混
合物を０℃で２時間撹拌した。濃縮した後、この混合物をフラッシュカラムクロ
マトグラフィーで精製し、４３を得た。
【００９６】 最後に、ピリジン中のヌクレオシド４３（１当量）とリンカー１３（８当量）
の溶液を２時間３５℃でＯ2存在下でＣｕＣｌ（２当量）と伴に撹拌し、酢酸エ
チルで希釈し、そして飽和ＮＨ4Ｃｌ水溶液、ブラインおよび水で連続的に洗浄
し、乾燥し、濃縮して、フラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、４４を
得た。
の溶液を２時間３５℃でＯ2存在下でＣｕＣｌ（２当量）と伴に撹拌し、酢酸エ
チルで希釈し、そして飽和ＮＨ4Ｃｌ水溶液、ブラインおよび水で連続的に洗浄
し、乾燥し、濃縮して、フラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、４４を
得た。
【００９７】 （実施例９） （脱保護ヌクレオチドトリホスフェート４９の合成（図１６および１７を参照）
） 新たに蒸留したオキシ塩化リン（４当量）を、−３０℃でトリメチルホスフェ
ート中のヌクレオシド３４（１当量）へ加え、対応するジクロロモノホスフェー
ト４５を形成した。この反応混合物を６０〜９０分かけて０℃へ温めさせ、次い
で冷却浴を除去し、そして撹拌を室温で１〜２時間続けた。反応物をｐＨ８．０
の２ＭのＴＥＡＢ緩衝液でクエンチし、ＨＰＬＣ（Ｃ−１８逆相）で精製した。
生成物に相当するフラクションを濃縮し、モノホスフェート４６を得た。
） 新たに蒸留したオキシ塩化リン（４当量）を、−３０℃でトリメチルホスフェ
ート中のヌクレオシド３４（１当量）へ加え、対応するジクロロモノホスフェー
ト４５を形成した。この反応混合物を６０〜９０分かけて０℃へ温めさせ、次い
で冷却浴を除去し、そして撹拌を室温で１〜２時間続けた。反応物をｐＨ８．０
の２ＭのＴＥＡＢ緩衝液でクエンチし、ＨＰＬＣ（Ｃ−１８逆相）で精製した。
生成物に相当するフラクションを濃縮し、モノホスフェート４６を得た。
【００９８】 Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解したモノホスフェート４６（１当量）を
、室温で１時間カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）（１．８当量）と伴に撹拌
した。過剰のＣＤＩを乾燥したメタノールの添加でクエンチした。活性化したモ
ノホスフェート４７を室温で１２〜２４時間ｎ−トリブチルアミン（５当量）を
含むＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中のトリブチルアンモニウムピロホスフェー
ト（１０当量）の溶液と伴に撹拌した。この反応物を２Ｍ、ｐＨ８．０のＴＥＡ
Ｂでクエンチし、ＨＰＬＣ（Ｃ−１８逆相）で精製した。生成物に相当するフラ
クションを濃縮し、保護ヌクレオチドトリホスフェート４８を得た。
、室温で１時間カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）（１．８当量）と伴に撹拌
した。過剰のＣＤＩを乾燥したメタノールの添加でクエンチした。活性化したモ
ノホスフェート４７を室温で１２〜２４時間ｎ−トリブチルアミン（５当量）を
含むＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中のトリブチルアンモニウムピロホスフェー
ト（１０当量）の溶液と伴に撹拌した。この反応物を２Ｍ、ｐＨ８．０のＴＥＡ
Ｂでクエンチし、ＨＰＬＣ（Ｃ−１８逆相）で精製した。生成物に相当するフラ
クションを濃縮し、保護ヌクレオチドトリホスフェート４８を得た。
【００９９】 精製された保護トリホスフェート４８を濃ＮＨ4ＯＨ水溶液（２〜５ｍＬ）に
溶解し、室温で３時間撹拌した。反応混合物を濃縮して４９を得、これを５〜３
０ｍＭの濃度へ０．１Ｍ、ｐＨ７．０のＴＥＡＢで処方した。処方されたバルク
の濃度および純度を、ＵＶ／Ｖｉｓ分光器およびＣ−１８逆相ＨＰＣＬでそれぞ
れ確認した。
溶解し、室温で３時間撹拌した。反応混合物を濃縮して４９を得、これを５〜３
０ｍＭの濃度へ０．１Ｍ、ｐＨ７．０のＴＥＡＢで処方した。処方されたバルク
の濃度および純度を、ＵＶ／Ｖｉｓ分光器およびＣ−１８逆相ＨＰＣＬでそれぞ
れ確認した。
【０１００】 （実施例１０） （ヌクレオシド−保護−リンカー化合物の脱保護ヌクレオチドトリホスフェー
トへの転換（図１８および１９を参照）） ヌクレオシド−保護−リンカー化合物３６、３７、３８、３９、４０、４１お
よび４４（総称して「ＮＰＬ」化合物）は３４から４９への転換に関して実施例９
で述べたように、脱保護ヌクレオチドトリホスフェート化合物５０、５１、５２
、５３、５４、５５および５６へ転換された。
トへの転換（図１８および１９を参照）） ヌクレオシド−保護−リンカー化合物３６、３７、３８、３９、４０、４１お
よび４４（総称して「ＮＰＬ」化合物）は３４から４９への転換に関して実施例９
で述べたように、脱保護ヌクレオチドトリホスフェート化合物５０、５１、５２
、５３、５４、５５および５６へ転換された。
【０１０１】 （実施例１１） （色素−標識ヌクレオチドトリホスフェートの合成） 実施例９および１０からの脱保護ヌクレオチドトリホスフェート化合物４９，
５０，５１，５２，５３，５４，５５および５６を次のとおり色素標識で標識し
た。１００ｍＭのＴＥＡ−ビカルボネート（ｐＨ７．０）中の脱保護ヌクレオチ
ドトリホスフェート化合物をエバポレートし、乾燥した。次いで、２５０ｍＭの
ビカルボネート緩衝液（ｐＨ９．０）で再度懸濁した。色素−ＮＨＳの溶液（Ｄ
ＭＳＯ中）（例えば、Ｊｅｂ−ＮＨＳ）を加え、４〜１２時間室温暗所で撹拌し
た。この反応混合物をＨＰＬＣ（ＡＸ−３００ アニオン交換）で精製した。生
成物に相当するフラクションを濃縮し、ＨＰＬＣ（Ｃ−１８逆相）で精製した。
最終生成物を真空で乾燥し、２５０ｍＭ、ｐＨ９．６のＣＡＰＳＯで所望濃度へ
希釈した。処方したバルクの濃度はＵＶ／Ｖｉｓ分光器で確認した。
５０，５１，５２，５３，５４，５５および５６を次のとおり色素標識で標識し
た。１００ｍＭのＴＥＡ−ビカルボネート（ｐＨ７．０）中の脱保護ヌクレオチ
ドトリホスフェート化合物をエバポレートし、乾燥した。次いで、２５０ｍＭの
ビカルボネート緩衝液（ｐＨ９．０）で再度懸濁した。色素−ＮＨＳの溶液（Ｄ
ＭＳＯ中）（例えば、Ｊｅｂ−ＮＨＳ）を加え、４〜１２時間室温暗所で撹拌し
た。この反応混合物をＨＰＬＣ（ＡＸ−３００ アニオン交換）で精製した。生
成物に相当するフラクションを濃縮し、ＨＰＬＣ（Ｃ−１８逆相）で精製した。
最終生成物を真空で乾燥し、２５０ｍＭ、ｐＨ９．６のＣＡＰＳＯで所望濃度へ
希釈した。処方したバルクの濃度はＵＶ／Ｖｉｓ分光器で確認した。
【０１０２】 （実施例１２） （ターミネーター滴定アッセイを用いた結合の機能としてのピーク高さ均等性
の比較） ターミネーター滴定アッセイを全配列決定ラダー（すなわち約２０から約６０
０までの間のヌクレオチドの長さを有する特定の塩基で終結しているすべてのフ
ラグメントを含む配列決定ラダー）を作製するために要求される最小量の色素タ
ーミネーターを決定するために独自に発展させた。このアッセイの鍵となる構成
要素は（ｉ）第１の色素で標識されたプライマー、および(ｉｉ）第１の色素か
らスペクトル的に分析できる第２の色素で標識されたターミネーターであった。
このアッセイにおいて、色素ターミネーターの不十分な濃度を配列決定の反応へ
加えた場合、ジデオキシ終結したフラグメントは形成されず、そして配列決定の
ゲルで見られる全ての生成物が最初の色素だけで標識された「偽終結物（ｆａｌ
ｓｅ ｓｔｏｐ）」で形成される生成物であった。本明細書で使われる場合「偽終
結物」という用語はジデオキシターミネーターで終結しないプライマーの伸長産
物を言い、おそらくそのような生成物はポリメラーゼ酵素が自発的にテンプレー
ト鎖から解離するとき、形成される。余りにも過剰のターミネーターが使用され
る場合、短ターミネーター産物（すなわち約５０未満のヌクレオチド長）だけが
形成される。この生成物は第１と第２の色素を両方含んでいる。適切な量のター
ミネーターが使用されると場合、全配列決定ラダーが生成し、このラダーのフラ
グメント各々は第１と第２の両方の色素で標識される。
の比較） ターミネーター滴定アッセイを全配列決定ラダー（すなわち約２０から約６０
０までの間のヌクレオチドの長さを有する特定の塩基で終結しているすべてのフ
ラグメントを含む配列決定ラダー）を作製するために要求される最小量の色素タ
ーミネーターを決定するために独自に発展させた。このアッセイの鍵となる構成
要素は（ｉ）第１の色素で標識されたプライマー、および(ｉｉ）第１の色素か
らスペクトル的に分析できる第２の色素で標識されたターミネーターであった。
このアッセイにおいて、色素ターミネーターの不十分な濃度を配列決定の反応へ
加えた場合、ジデオキシ終結したフラグメントは形成されず、そして配列決定の
ゲルで見られる全ての生成物が最初の色素だけで標識された「偽終結物（ｆａｌ
ｓｅ ｓｔｏｐ）」で形成される生成物であった。本明細書で使われる場合「偽終
結物」という用語はジデオキシターミネーターで終結しないプライマーの伸長産
物を言い、おそらくそのような生成物はポリメラーゼ酵素が自発的にテンプレー
ト鎖から解離するとき、形成される。余りにも過剰のターミネーターが使用され
る場合、短ターミネーター産物（すなわち約５０未満のヌクレオチド長）だけが
形成される。この生成物は第１と第２の色素を両方含んでいる。適切な量のター
ミネーターが使用されると場合、全配列決定ラダーが生成し、このラダーのフラ
グメント各々は第１と第２の両方の色素で標識される。
【０１０３】 このアッセイの改変を異なる色素−ターミネーターでポリメラーゼを変化する
効果を定量的に比較するために使った。前記で述べられたアッセイは最初、Ａｍ
ｐｌｉＴａｑのＤＮＡポリミラーゼＦＳで配列決定するために必要とされる最少
量の色素ターミネーターを決定するために使われていた。（ＦＳ酵素は２つの点
変異−−Ｇ４６ＤとＦ６６７Ｙを有する組換えＴｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕ
ｓ ＤＮＡポリメラーゼである）。次いで、この色素ターミネーターの濃度を異
なって変異したＴｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼと伴に
使用し、ここでＦＳ変異体中に存在する２つの点変異に加えて、さらなる点変異
が導入されている。色素−標識プライマーは使用しなかった。
効果を定量的に比較するために使った。前記で述べられたアッセイは最初、Ａｍ
ｐｌｉＴａｑのＤＮＡポリミラーゼＦＳで配列決定するために必要とされる最少
量の色素ターミネーターを決定するために使われていた。（ＦＳ酵素は２つの点
変異−−Ｇ４６ＤとＦ６６７Ｙを有する組換えＴｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕ
ｓ ＤＮＡポリメラーゼである）。次いで、この色素ターミネーターの濃度を異
なって変異したＴｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼと伴に
使用し、ここでＦＳ変異体中に存在する２つの点変異に加えて、さらなる点変異
が導入されている。色素−標識プライマーは使用しなかった。
【０１０４】 色素−ターミネーター反応をＡＢＩ ＰＲＩＳＭTM 色素ターミネーターサイ
クル配列決定コアキットマニュアル（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ ｐ／ｎ ４０２１１６）で提供されているプロトコルに従う付加的点変異
でＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＦＳまたはＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕ
ａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼを使用して実施した。緩衝液、非標識のプラ
イマー、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＦＳ（使用されたとき）を含
む試薬はＡＢＩ ＰＲＩＳＭTM 色素ターミネーターコアキット（ＰＥ Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ ４０２１１７）からの試薬あった。ｄ
ＮＴＰ混合物は各々２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰから
成っていた。ピロホスファターゼ（１単位）をＦＳとは異なるＤＮＡポリメラー
ゼと伴に反応へ加えた。このＤＮＡポリメラーゼはすでにピロホスファターゼを
含んでいる市販調製品である。色素ターミネーターは本明細書に記載されたもの
であった。反応の構成要素のプレ混合物は以下の表で示されているように調製さ
れた。ここですべての定量性は反応基底化毎に与えられている。 ５Ｘ緩衝液 ４．０μＬ ｄＮＴＰ混合物 １．０μＬ テンプレート：ｐＧＥＭ（登録商標）−３Ｚｆ（＋） ０．２μｇ／μＬ ５．０μＬ プライマー：−２１Ｍ１３（順方向） ０．８ｐｍｏｌ／μＬ ４．０μＬ ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＦＳ ０．５μＬ Ｈ2Ｏ ０．５μＬ 反応をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ４８０ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅ
ｒ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ Ｎ８０１−１００
）で適合した０．５ｍｌチューブで組立てた。反応体積２０μＬであり、これは
上記反応プレ混合物の１５μＬ、様々な量の色素標識ターミネーターおよび合計
の反応体積を２０μＬにするのに十分な体積の水を含む。色素ターミネーターの
１〜２５０ｐｍｏｌを、各々の反応へ加えた。３０μＬの鉱油をエバポレーショ
ンを妨げるため各々の反応物の上部へ加えた。反応は次のように熱的循環した（
ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｄ）：２５サイクルについて、３０秒間９６℃、１５秒
間５０℃および４分間６０℃；続いて４℃維持サイクル。
クル配列決定コアキットマニュアル（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ ｐ／ｎ ４０２１１６）で提供されているプロトコルに従う付加的点変異
でＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＦＳまたはＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕ
ａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼを使用して実施した。緩衝液、非標識のプラ
イマー、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＦＳ（使用されたとき）を含
む試薬はＡＢＩ ＰＲＩＳＭTM 色素ターミネーターコアキット（ＰＥ Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ ４０２１１７）からの試薬あった。ｄ
ＮＴＰ混合物は各々２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰから
成っていた。ピロホスファターゼ（１単位）をＦＳとは異なるＤＮＡポリメラー
ゼと伴に反応へ加えた。このＤＮＡポリメラーゼはすでにピロホスファターゼを
含んでいる市販調製品である。色素ターミネーターは本明細書に記載されたもの
であった。反応の構成要素のプレ混合物は以下の表で示されているように調製さ
れた。ここですべての定量性は反応基底化毎に与えられている。 ５Ｘ緩衝液 ４．０μＬ ｄＮＴＰ混合物 １．０μＬ テンプレート：ｐＧＥＭ（登録商標）−３Ｚｆ（＋） ０．２μｇ／μＬ ５．０μＬ プライマー：−２１Ｍ１３（順方向） ０．８ｐｍｏｌ／μＬ ４．０μＬ ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＦＳ ０．５μＬ Ｈ2Ｏ ０．５μＬ 反応をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ４８０ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅ
ｒ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ Ｎ８０１−１００
）で適合した０．５ｍｌチューブで組立てた。反応体積２０μＬであり、これは
上記反応プレ混合物の１５μＬ、様々な量の色素標識ターミネーターおよび合計
の反応体積を２０μＬにするのに十分な体積の水を含む。色素ターミネーターの
１〜２５０ｐｍｏｌを、各々の反応へ加えた。３０μＬの鉱油をエバポレーショ
ンを妨げるため各々の反応物の上部へ加えた。反応は次のように熱的循環した（
ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｄ）：２５サイクルについて、３０秒間９６℃、１５秒
間５０℃および４分間６０℃；続いて４℃維持サイクル。
【０１０５】 すべての反応を製造業者の使用説明書（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｓｅｐａｒａｔ
ｉｏｎｓ ｐ／ｎ ＣＳ−９０１）に従って、Ｃｅｎｔｒｉ−Ｓｅｐスピンカラ
ムでスピンカラム精製によって精製した。カラム中のゲル物質を室温で少なくと
も３０分間０．８ｍＬの脱イオン化水で水和した。このカラムを水和した後、気
泡をゲル物質中で捕集しなかったと決定し、このカラムの上方部および下方部の
端のキャップを除去し、そしてカラムを重力で流出した。次いで、このカラムを
キットで提供されている洗浄チューブへ挿入し、２分間１３００ｘｇで可変スピ
ードのマイクロ遠心分離機で遠心分離し、洗浄チューブから除去し、そして試料
収集チューブへ挿入した。この反応混合物を注意深く油の下から除去し、ゲル物
質の上へロードした。カラムは２分間１３００ｘｇで可変スピードのマイクロ遠
心分離機で遠心分離した。次いで、溶出した試料は真空遠心分離機で乾燥した。
ｉｏｎｓ ｐ／ｎ ＣＳ−９０１）に従って、Ｃｅｎｔｒｉ−Ｓｅｐスピンカラ
ムでスピンカラム精製によって精製した。カラム中のゲル物質を室温で少なくと
も３０分間０．８ｍＬの脱イオン化水で水和した。このカラムを水和した後、気
泡をゲル物質中で捕集しなかったと決定し、このカラムの上方部および下方部の
端のキャップを除去し、そしてカラムを重力で流出した。次いで、このカラムを
キットで提供されている洗浄チューブへ挿入し、２分間１３００ｘｇで可変スピ
ードのマイクロ遠心分離機で遠心分離し、洗浄チューブから除去し、そして試料
収集チューブへ挿入した。この反応混合物を注意深く油の下から除去し、ゲル物
質の上へロードした。カラムは２分間１３００ｘｇで可変スピードのマイクロ遠
心分離機で遠心分離した。次いで、溶出した試料は真空遠心分離機で乾燥した。
【０１０６】 配列決定ゲルの上へロードするより先に、乾燥された試料をテンプレート抑制
試薬（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ ４０１６７４）
２５μＬで再懸濁し、ボルテックスし、２分間９５℃に熱し、氷で冷やし、再び
ボルテックスし、そして遠心分離した（１３，０００ｘｇ）。この再懸濁した試
料１０μＬをＰＥ ＡＢＩ ＰＲＩＳＭTM３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙ
ｚｅｒ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ３１０−００−
１００／１２０）で適用されたサンプル瓶（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ ４０１９５７）へアリコートした。３１０ Ｇｅｎｅｔｉ
ｃ Ａｎａｌｙｚｅｒでの電気泳動をＤＮＡ配列決定分析に特別に適合した網目
（ｓｉｅｖｉｎｇ）ポリマーとキャピラリー（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ ４０２８３７（ポリマー）およびｐ／ｎ４０２８４０（
キャピラリー））で実施した。各々の場合において、網目ポリマーは核酸変性物
を含んでいた。試料を２．５ｋＶ３０秒間キャピラリーの上へ動電気的に注入し
、５０℃で保持したキャピラリーの外側の壁で１０〜１２．２ｋＶ２時間泳動さ
せた。
試薬（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ ４０１６７４）
２５μＬで再懸濁し、ボルテックスし、２分間９５℃に熱し、氷で冷やし、再び
ボルテックスし、そして遠心分離した（１３，０００ｘｇ）。この再懸濁した試
料１０μＬをＰＥ ＡＢＩ ＰＲＩＳＭTM３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙ
ｚｅｒ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ３１０−００−
１００／１２０）で適用されたサンプル瓶（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ ４０１９５７）へアリコートした。３１０ Ｇｅｎｅｔｉ
ｃ Ａｎａｌｙｚｅｒでの電気泳動をＤＮＡ配列決定分析に特別に適合した網目
（ｓｉｅｖｉｎｇ）ポリマーとキャピラリー（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ ４０２８３７（ポリマー）およびｐ／ｎ４０２８４０（
キャピラリー））で実施した。各々の場合において、網目ポリマーは核酸変性物
を含んでいた。試料を２．５ｋＶ３０秒間キャピラリーの上へ動電気的に注入し
、５０℃で保持したキャピラリーの外側の壁で１０〜１２．２ｋＶ２時間泳動さ
せた。
【０１０７】 ｐＧＥＭ配列の最初の２２０塩基に存在するＣピークをコンピュータープログ
ラム、Ｓｔａｔ Ｔｏｏｌで評価し、平均ピークの高さおよび平均ピークの高さ
の標準偏差を決定した。相対誤差は平均ピークの高さの標準偏差を平均ピークの
高さで割った比で計算した。この値はピークの相対的な均等性の尺度である。ピ
ークが均等になればなるほど相対誤差は低くなる。
ラム、Ｓｔａｔ Ｔｏｏｌで評価し、平均ピークの高さおよび平均ピークの高さ
の標準偏差を決定した。相対誤差は平均ピークの高さの標準偏差を平均ピークの
高さで割った比で計算した。この値はピークの相対的な均等性の尺度である。ピ
ークが均等になればなるほど相対誤差は低くなる。
【０１０８】 表１は配列決定反応のピークの均等性を比較している実験結果を示し、３つの
異なった結合を有する３つのターミネーターを使用した；この３つのターミネー
ターは２つの従来の結合と本発明による１つの結合である。３つの結合の構造は
以下；
異なった結合を有する３つのターミネーターを使用した；この３つのターミネー
ターは２つの従来の結合と本発明による１つの結合である。３つの結合の構造は
以下；
【０１０９】
【化１９】 である。
【０１１０】 ターミネーター（ｄｄＣＴＰ）と色素（ＨＥＸ−１）はこの実験において同じ
であった。さらに、本発明者らはＡｍｐｌｉＴａｑ ＦＳとさらにＲ６６０Ｓ変
異体を含む変異ポリメラーゼを使用した。これらのデータはこれらの堅いリンカ
ーに対する最良のピーク均等性について変異酵素を使用するのが好ましいことお
よび変異酵素と堅いリンカーを組み合わせるとそれ以外で達成することができる
よりもさらによいピーク均等性を得るという結果になることを示している。 （ＥＯリンカーを用いたＡｍｐｌｉＴａｑ ＦＳ：０．３４２対ＰＨ−ＥＯリン
カーを用いたＲ６６０Ｓ：０．２２４）。
であった。さらに、本発明者らはＡｍｐｌｉＴａｑ ＦＳとさらにＲ６６０Ｓ変
異体を含む変異ポリメラーゼを使用した。これらのデータはこれらの堅いリンカ
ーに対する最良のピーク均等性について変異酵素を使用するのが好ましいことお
よび変異酵素と堅いリンカーを組み合わせるとそれ以外で達成することができる
よりもさらによいピーク均等性を得るという結果になることを示している。 （ＥＯリンカーを用いたＡｍｐｌｉＴａｑ ＦＳ：０．３４２対ＰＨ−ＥＯリン
カーを用いたＲ６６０Ｓ：０．２２４）。
【０１１１】 表１
【０１１２】
【表１】 各々個々の出版物または特許出願が参考として援用するために具体的かつ個々
に示されるように、すべての出版物と特許出願は本明細書中で同じ程度まで参考
として援用されている。
に示されるように、すべての出版物と特許出願は本明細書中で同じ程度まで参考
として援用されている。
【０１１３】 ほんの少しの具体例しか上記で詳細に記載していないが、化学および分子生物
学の分野における当業者は明かに多くの改変がこれらの教示から離れることなし
に好ましい実施形態において可能であると理解する。すべてのそのような改変は
先の特許請求の範囲に含まれることを意図する。
学の分野における当業者は明かに多くの改変がこれらの教示から離れることなし
に好ましい実施形態において可能であると理解する。すべてのそのような改変は
先の特許請求の範囲に含まれることを意図する。
【図１】 図１は、本発明の化合物１０の合成を示す。
【図２】 図２は、本発明の化合物１５の合成を示す。
【図３】 図３は、本発明の化合物１９の合成を示す。
【図４】 図４は、本発明の化合物２１の合成を示す。
【図５】 図５は、本発明の化合物２５の合成を示す。
【図６】 図６は、本発明の化合物２８の合成を示す。
【図７】 図７は、本発明の化合物３２の合成を示す。
【図８】 図８は、本発明の化合物３４の合成を示す。
【図９】 図９は、本発明の化合物３６の合成を示す。
【図１０】 図１０は、本発明の化合物３７の合成を示す。
【図１１】 図１１は、本発明の化合物３８の合成を示す。
【図１２】 図１２は、本発明の化合物３９の合成を示す。
【図１３】 図１３は、本発明の化合物４０の合成を示す。
【図１４】 図１４は、本発明の化合物４１の合成を示す。
【図１５】 図１５は、本発明の化合物４４の合成を示す。
【図１６】 図１６は、本発明の化合物４６の合成を示す。
【図１７】 図１７は、本発明の化合物４９の合成を示す。
【図１８】 図１８は、本発明の化合物４９〜５２の構造を示す。
【図１９】 図１９は、本発明の化合物５３〜５６の構造を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 ローズンブラム， バーネット ビー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 95118， サン ノゼ， エステレ アベニュー 1521 (72)発明者 ゼン， ウェイグォ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94404， フォスター シティ， フォアーフェイ ル コート 350 (72)発明者 メンチェン， スティーブン エム． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94536， フレモント， バンダ ウェイ 768 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA01 CA11 HA08 HA19 4B063 QA13 QQ41 QR32 QR62 QR66 QS16 QS25 QS36 QX02 4C057 LL17 LL19 LL21 4H050 AA01 AB20 AB81
Claims (45)
- 【請求項１】 以下の構造： ＮＵＣ−Ｌ−Ｓ−ＬＢ／ＬＧ を有するヌクレオシド／ヌクレオチド化合物であって、ここで： ＮＵＣは、核酸塩基部分Ｂを有するヌクレオシド／ヌクレオチドであり； Ｌは、堅い結合であり； Ｓは、スペーサーであり； ＬＢ／ＬＧは、結合対または標識のメンバーであり；ここで、 ＮＵＣは、Ｂを介してＬに付加され、その結果、Ｂがプリンである場合、Ｌは
プリンの８位に付加され、Ｂが７−デアザプリンである場合、Ｌは７−デアザプ
リンの７位に付加され、そしてＢがピリミジンである場合、Ｌはピリミジンの５
位に付加され；そして Ｌは、以下の構造： 【化１】 を有し、ここで、 ｎ、ｏおよびｐの各々が０〜３の範囲の整数であり、そしてｎ、ｏおよびｐの
合計が少なくとも２であり；そして Ｗ、Ｘ、ＹおよびＺの各々は、−ＣＨおよびＮからなる群から選択され、そし
てその置換形態を含む、 ヌクレオシド／ヌクレオチド化合物。 - 【請求項２】 請求項１に記載の化合物であって、ここで、ＮＵＣが、２’
−デオキシリボヌクレオチド、３’−デオキシリボヌクレオチド、２’，３’−
ジデオキシリボヌクレオチド、２’，３’−ジデオキシ−３’−フルオロ−リボ
ヌクレオチド、２’，３’−ジデオキシ−２’−フルオロ−リボヌクレオチド、
２’，３’−ジデオキシ−３’−アジド−リボヌクレオチド、２’，３’−ジデ
オキシ−２’−アジド−リボヌクレオチド、２’，３’−ジデオキシ−２’−ア
ミノ−リボヌクレオチド、２’，３’−ジデオキシ−３’−アミノ−リボヌクレ
オチド、２’，３’−ジデオキシ−２’，３’−ジデヒドロリボヌクレオチド、
およびリボヌクレオチド由来の置換ラジカルからなる群から選択される、化合物
。 - 【請求項３】 請求項２に記載の化合物であって、ＮＵＣが、２’，３’−
ジデオキシリボヌクレオチドおよび２’，３’−ジデオキシ−３’−フルオロ−
リボヌクレオチド由来の置換ラジカルからなる群から選択される、化合物。 - 【請求項４】 ＷおよびＸの１つが、−ＣＨであり、ＺおよびＹの１つが、
−ＣＨであり、そしてその置換形態を含む、請求項１に記載の化合物。 - 【請求項５】 ｎが１または２である、請求項１に記載の化合物。
- 【請求項６】 ｏが１または２である、請求項１に記載の化合物。
- 【請求項７】 ｐが０または１である、請求項１に記載の化合物。
- 【請求項８】 ｎが１または２であり、ｏが１または２であり、そしてｐが
０または１である、請求項１に記載の化合物。 - 【請求項９】 Ｓが以下の構造： 【化２】 を有し、ここで、ｎが１〜８の範囲である、請求項１に記載の化合物。
- 【請求項１０】 ｎが１または２である、請求項９に記載の化合物。
- 【請求項１１】 ＬＢ／ＬＧが結合対のメンバーである、請求項１に記載の
化合物。 - 【請求項１２】 前記結合対のメンバーがアミンである、請求項１１に記載
の化合物。 - 【請求項１３】 前記アミンが１級アミンである、請求項１２に記載の化合
物。 - 【請求項１４】 ＬＢ／ＬＧが標識である、請求項１に記載の化合物。
- 【請求項１５】 前記標識がキサンテン型色素である、請求項１４に記載の
化合物。 - 【請求項１６】 前記キサンテン型色素がローダミンまたはフルオレセイン
色素である、請求項１５に記載の化合物。 - 【請求項１７】 −Ｌ−が以下の構造： 【化３】 を有する、請求項１に記載の化合物。
- 【請求項１８】 −Ｌ−が以下の構造： 【化４】 を有する、請求項１に記載の化合物。
- 【請求項１９】 −Ｌ−が以下の構造： 【化５】 を有する、請求項１に記載の化合物。
- 【請求項２０】 −Ｌ−が以下の構造： 【化６】 を有する、請求項１に記載の化合物。
- 【請求項２１】 −Ｌ−が以下の構造： 【化７】 を有する、請求項１に記載の化合物。
- 【請求項２２】 −Ｌ−が以下の構造： 【化８】 を有する、請求項１に記載の化合物。
- 【請求項２３】 以下の構造： ＮＵＣ−Ｌ−Ｓ−ＬＢ／ＬＧ を有するヌクレオチド化合物を含むポリヌクレオチドであって、ここで： ＮＵＣは、核酸塩基部分Ｂを有するヌクレオチドであり； Ｌは、堅い結合であり； Ｓは、スペーサーであり；そして ＬＢ／ＬＧは、結合対または標識のメンバーであり；ここで、 ＮＵＣは、Ｂを介してＬに付加され、その結果、Ｂがプリンである場合、Ｌは
プリンの８位に付加され、Ｂが７−デアザプリンである場合、Ｌは７−デアザプ
リンの７位に付加され、そしてＢがピリミジンである場合、Ｌはピリミジンの５
位に付加され；そして Ｌは、以下の構造： 【化９】 を有し、ここで、 ｎ、ｏおよびｐの各々が０〜３の範囲の整数であり、そしてｎ、ｏおよびｐの
合計が少なくとも２であり；そして Ｗ、Ｘ、ＹおよびＺの各々は、−ＣＨおよびＮからなる群から選択され、そし
てその置換形態を含む、ポリヌクレオチド。 - 【請求項２４】 請求項２３に記載の化合物であって、ここで、ＮＵＣが、
２’−デオキシリボヌクレオチド、３’−デオキシリボヌクレオチド、２’，３
’−ジデオキシリボヌクレオチド、２’，３’−ジデオキシ−３’−フルオロ−
リボヌクレオチド、２’，３’−ジデオキシ−２’−フルオロ−リボヌクレオチ
ド、２’，３’−ジデオキシ−３’−アジド−リボヌクレオチド、２’，３’−
ジデオキシ−２’−アジド−リボヌクレオチド、２’，３’−ジデオキシ−２’
−アミノ−リボヌクレオチド、２’，３’−ジデオキシ−３’−アミノ−リボヌ
クレオチド、２’，３’−ジデオキシ−２’，３’−ジデヒドロリボヌクレオチ
ド、およびリボヌクレオチド由来の置換ラジカルからなる群から選択される、化
合物。 - 【請求項２５】 請求項２３に記載の化合物であって、ＮＵＣが、２’，３
’−ジデオキシリボヌクレオチドおよび２’，３’−ジデオキシ−３’−フルオ
ロ−リボヌクレオチド由来の置換ラジカルからなる群から選択される、化合物。 - 【請求項２６】 ＷおよびＸの１つが、−ＣＨであり、ＺおよびＹの１つが
、−ＣＨであり、そしてその置換形態を含む、請求項２３に記載の化合物。 - 【請求項２７】 ｎが１または２である、請求項２３に記載の化合物。
- 【請求項２８】 ｏが１または２である、請求項２３に記載の化合物。
- 【請求項２９】 ｐが０または１である、請求項２３に記載の化合物。
- 【請求項３０】 ｎが１または２であり、ｏが１または２であり、そしてｐ
が０または１である、請求項２３に記載の化合物。 - 【請求項３１】 Ｓが以下の構造： 【化１０】 を有し、ここで、ｎが１〜８の範囲である、請求項２３に記載の化合物。
- 【請求項３２】 ｎが１または２である、請求項３１に記載の化合物。
- 【請求項３３】 ＬＢ／ＬＧが結合対のメンバーである、請求項２３に記載
の化合物。 - 【請求項３４】 前記結合対のメンバーがアミノである、請求項３３に記載
の化合物。 - 【請求項３５】 前記アミノが１級アミンである、請求項３４に記載の化合
物。 - 【請求項３６】 ＬＢ／ＬＧが標識である、請求項２３に記載の化合物。
- 【請求項３７】 前記標識がキサンテン型色素である、請求項３６に記載の
化合物。 - 【請求項３８】 前記キサンテン型色素がローダミンまたはフルオレセイン
色素である、請求項３７に記載の化合物。 - 【請求項３９】 プライマー伸長反応を実施するための方法であって、該方
法は、以下の工程： テンプレート核酸を提供する工程； プライマーテンプレートハイブリッドを形成するために、該テンプレート核酸
の部分にオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングする工程；および プライマーを伸長するために、該プライマーテンプレートハイブリッドにプラ
イマー伸長試薬を添加する工程であって、該プライマー伸長試薬は、以下の構造
： ＮＵＣ−Ｌ−Ｓ−ＬＢ／ＬＧ を有するヌクレオチド化合物を含み、ここで： ＮＵＣは、核酸塩基部分Ｂを有するヌクレオシド／ヌクレオチドであり； Ｌは、堅い結合であり； Ｓは、スペーサーであり；そして ＬＢ／ＬＧは、結合対または標識のメンバーであり；ここで、 ＮＵＣは、Ｂを介してＬに付加され、その結果、Ｂがプリンである場合、Ｌは
プリンの８位に付加され、Ｂが７−デアザプリンである場合、Ｌは７−デアザプ
リンの７位に付加され、そしてＢがピリミジンである場合、Ｌはピリミジンの５
位に付加され；そして Ｌは、以下の構造： 【化１１】 を有し、ここで、 ｎ、ｏおよびｐの各々が０〜３の範囲の整数であり、そしてｎ、ｏおよびｐの
合計が少なくとも２であり；そして Ｗ、Ｘ、ＹおよびＺの各々は、−ＣＨおよびＮからなる群から選択され、そし
てその置換形態を含有する工程を含む、方法。 - 【請求項４０】 前記プライマー伸長試薬が熱安定性のＤＮＡポリメラーゼ
を含有する、請求項３９に記載の方法。 - 【請求項４１】 前記熱安定性ポリメラーゼがＴａｑポリメラーゼである、
請求項４０に記載の方法。 - 【請求項４２】 前記Ｔａｑポリメラーゼが、Ｆ６６７位に変異を有する変
異Ｔａｑポリメラーゼである、請求項４１に記載の方法。 - 【請求項４３】 前記変異がＦ６６７Ｙである、請求項４２に記載の方法。
- 【請求項４４】 前記Ｔａｑポリメラーゼが、Ｒ６６０位に変異を有する変
異Ｔａｑポリメラーゼである、請求項４１の方法。 - 【請求項４５】 前記変異が、Ｒ６６０Ｃ、Ｒ６６０ＤおよびＲ６６０Ｓか
らなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/172,789 | 1998-10-14 | ||
| US09/172,789 US6096875A (en) | 1998-05-29 | 1998-10-14 | Nucleotide compounds including a rigid linker |
| PCT/US1999/012323 WO2000021974A1 (en) | 1998-10-14 | 1999-06-02 | Nucleotide compounds including a rigid linker |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2006196282A Division JP2006306888A (ja) | 1998-10-14 | 2006-07-18 | 堅いリンカーを有するヌクレオチド化合物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002527447A true JP2002527447A (ja) | 2002-08-27 |
| JP3900244B2 JP3900244B2 (ja) | 2007-04-04 |
Family
ID=22629250
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000575880A Expired - Fee Related JP3900244B2 (ja) | 1998-10-14 | 1999-06-02 | 堅いリンカーを有するヌクレオチド化合物 |
| JP2006196282A Ceased JP2006306888A (ja) | 1998-10-14 | 2006-07-18 | 堅いリンカーを有するヌクレオチド化合物 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2006196282A Ceased JP2006306888A (ja) | 1998-10-14 | 2006-07-18 | 堅いリンカーを有するヌクレオチド化合物 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6096875A (ja) |
| EP (2) | EP2202238A1 (ja) |
| JP (2) | JP3900244B2 (ja) |
| AT (1) | ATE432284T1 (ja) |
| AU (1) | AU744719B2 (ja) |
| CA (1) | CA2344643C (ja) |
| DE (1) | DE69940926D1 (ja) |
| WO (1) | WO2000021974A1 (ja) |
Families Citing this family (59)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7812149B2 (en) | 1996-06-06 | 2010-10-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 2′-Fluoro substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations |
| US5898031A (en) | 1996-06-06 | 1999-04-27 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligoribonucleotides for cleaving RNA |
| US9096636B2 (en) | 1996-06-06 | 2015-08-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation |
| AU743025B2 (en) * | 1997-03-12 | 2002-01-17 | Applera Corporation | DNA polymerases having improved labeled nucleotide incorporation properties |
| US6583168B1 (en) | 1997-11-25 | 2003-06-24 | Applera Corporation | Sulfonated diarylrhodamine dyes |
| US6653462B2 (en) | 1998-05-29 | 2003-11-25 | Applera Corporation | Nucleotide compounds including a rigid linker |
| WO2002029003A2 (en) | 2000-10-06 | 2002-04-11 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Massive parallel method for decoding dna and rna |
| US9708358B2 (en) | 2000-10-06 | 2017-07-18 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Massive parallel method for decoding DNA and RNA |
| EP1317464B1 (en) * | 2000-10-11 | 2009-05-13 | Applera Corporation | Fluorescent nucleobase conjugates having anionic linkers |
| US20060234231A1 (en) * | 2001-06-20 | 2006-10-19 | Nuevolution A/S | Microarrays displaying encoded molecules |
| WO2002102820A1 (en) | 2001-06-20 | 2002-12-27 | Nuevolution A/S | Nucleoside derivatives for library preparation |
| US6887690B2 (en) * | 2001-06-22 | 2005-05-03 | Pe Corporation | Dye-labeled ribonucleotide triphosphates |
| US20050042629A1 (en) | 2002-09-13 | 2005-02-24 | Applera Corporation | Thermus scotoductus nucleic acid polymerases |
| WO2003048308A2 (en) | 2001-11-30 | 2003-06-12 | Applera Corporation | Thermus brockianus nucleic acid polymerases |
| GB0129012D0 (en) | 2001-12-04 | 2002-01-23 | Solexa Ltd | Labelled nucleotides |
| US7057026B2 (en) | 2001-12-04 | 2006-06-06 | Solexa Limited | Labelled nucleotides |
| DE20200926U1 (de) * | 2002-01-23 | 2002-04-18 | Hegenscheidt Mfd Gmbh & Co Kg | Festwalzgerät einer Festwalzmaschine für Kurbelwellen |
| IL163822A0 (en) * | 2002-03-15 | 2005-12-18 | Nuevolution As | An improved method for synthesising templated molecules |
| AU2003218630A1 (en) * | 2002-03-15 | 2003-09-29 | Nuevolution A/S | A building block capable of functional entity transfer to nucleophil |
| WO2004013070A2 (en) * | 2002-08-01 | 2004-02-12 | Nuevolution A/S | Multi-step synthesis of templated molecules |
| US11008359B2 (en) | 2002-08-23 | 2021-05-18 | Illumina Cambridge Limited | Labelled nucleotides |
| EP3795577A1 (en) | 2002-08-23 | 2021-03-24 | Illumina Cambridge Limited | Modified nucleotides |
| US7414116B2 (en) | 2002-08-23 | 2008-08-19 | Illumina Cambridge Limited | Labelled nucleotides |
| WO2004028682A2 (en) * | 2002-09-27 | 2004-04-08 | Carlsberg A/S | Spatially encoded polymer matrix |
| PT1558744E (pt) | 2002-10-30 | 2011-09-22 | Nuevolution As | Codificação enzimática |
| AU2003290598A1 (en) | 2002-11-05 | 2004-06-03 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modified oligonucleotides for use in rna interference |
| ATE450609T1 (de) | 2002-12-19 | 2009-12-15 | Nuevolution As | Durch quasizufallsstrukturen und funktionen geführte synthesemethode |
| EP1597395A2 (en) | 2003-02-21 | 2005-11-23 | Nuevolution A/S | Method for producing second-generation library |
| EP1670939B1 (en) | 2003-09-18 | 2009-11-04 | Nuevolution A/S | A method for obtaining structural information concerning an encoded molecule and method for selecting compounds |
| JP4127204B2 (ja) * | 2003-12-17 | 2008-07-30 | セイコーエプソン株式会社 | 液晶表示装置の製造方法 |
| WO2005078122A2 (en) * | 2004-02-17 | 2005-08-25 | Nuevolution A/S | Method for enrichment involving elimination by mismatch hybridisation |
| US8569474B2 (en) | 2004-03-09 | 2013-10-29 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Double stranded constructs comprising one or more short strands hybridized to a longer strand |
| US8394947B2 (en) | 2004-06-03 | 2013-03-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Positionally modified siRNA constructs |
| US7884086B2 (en) | 2004-09-08 | 2011-02-08 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Conjugates for use in hepatocyte free uptake assays |
| US7378260B2 (en) * | 2005-04-01 | 2008-05-27 | Applera Corporation | Products and methods for reducing dye artifacts |
| GB0517097D0 (en) | 2005-08-19 | 2005-09-28 | Solexa Ltd | Modified nucleosides and nucleotides and uses thereof |
| DE602006018648D1 (de) | 2005-12-01 | 2011-01-13 | Nuevolution As | Enzymvermittelnde kodierungsmethoden für eine effiziente synthese von grossen bibliotheken |
| WO2008042067A2 (en) | 2006-09-28 | 2008-04-10 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for nucleotide sequencing |
| GB2457402B (en) | 2006-12-01 | 2011-10-19 | Univ Columbia | Four-color DNA sequencing by synthesis using cleavable fluorescent nucleotide reversible terminators |
| WO2009045536A2 (en) * | 2007-10-05 | 2009-04-09 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Receptor targeted oligonucleotides |
| EP4310194A2 (en) | 2007-10-19 | 2024-01-24 | The Trustees of Columbia University in the City of New York | Design and synthesis of cleavable fluorescent nucleotides as reversible terminators for dna sequencing by synthesis |
| US9115163B2 (en) | 2007-10-19 | 2015-08-25 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | DNA sequence with non-fluorescent nucleotide reversible terminators and cleavable label modified nucleotide terminators |
| AU2009293658A1 (en) | 2008-09-22 | 2010-03-25 | James Cardia | Reduced size self-delivering RNAi compounds |
| US9745574B2 (en) | 2009-02-04 | 2017-08-29 | Rxi Pharmaceuticals Corporation | RNA duplexes with single stranded phosphorothioate nucleotide regions for additional functionality |
| WO2011119852A1 (en) | 2010-03-24 | 2011-09-29 | Rxi Pharmaceuticals Corporation | Reduced size self-delivering rnai compounds |
| ES2713873T3 (es) | 2010-04-16 | 2019-05-24 | Nuevolution As | Complejos bifuncionales y métodos para hacer y utilizar tales complejos |
| WO2012044992A2 (en) | 2010-09-30 | 2012-04-05 | Agency For Science, Technology And Research (A*Star) | Methods and reagents for detection and treatment of esophageal metaplasia |
| WO2012162429A2 (en) | 2011-05-23 | 2012-11-29 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Dna sequencing by synthesis using raman and infrared spectroscopy detection |
| MY173826A (en) | 2012-11-15 | 2020-02-24 | Roche Innovation Ct Copenhagen As | Oligonucleotide conjugates |
| BR112015018161A2 (pt) | 2013-01-30 | 2017-08-22 | Hoffmann La Roche | Conjugado de oligômeros antisense de lna, composição farmacêutica e uso de um conjugado de oligômeros antisense de lna |
| WO2014118272A1 (en) | 2013-01-30 | 2014-08-07 | Santaris Pharma A/S | Antimir-122 oligonucleotide carbohydrate conjugates |
| US10648026B2 (en) | 2013-03-15 | 2020-05-12 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Raman cluster tagged molecules for biological imaging |
| KR101874680B1 (ko) | 2013-03-15 | 2018-07-04 | 일루미나 케임브리지 리미티드 | 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드 |
| CN112263682A (zh) | 2013-06-27 | 2021-01-26 | 罗氏创新中心哥本哈根有限公司 | 靶向pcsk9的反义寡聚体和缀合物 |
| GB201408623D0 (en) | 2014-05-15 | 2014-07-02 | Santaris Pharma As | Oligomers and oligomer conjugates |
| AU2017235278C1 (en) | 2016-03-14 | 2022-03-10 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Oligonucleotides for reduction of PD-L1 expression |
| JP2023504074A (ja) | 2019-11-27 | 2023-02-01 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニヴァーシティ オブ イリノイ | ペンタペプチドおよびその使用方法 |
| EP4153209A1 (en) | 2020-05-20 | 2023-03-29 | The Board of Trustees of the University of Illinois | Method for treating lysosomal storage diseases with histatin peptides |
| CN112724133B (zh) * | 2021-01-12 | 2022-03-25 | 湖南复瑞生物医药技术有限责任公司 | 6-溴吡唑并[1,5-a]吡啶的制备方法 |
Family Cites Families (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU676379A1 (ru) | 1977-03-03 | 1979-07-30 | Научно-производственное объединение "Тулачермет" | Дорн дл отливки полых заготовок |
| US4318846A (en) | 1979-09-07 | 1982-03-09 | Syva Company | Novel ether substituted fluorescein polyamino acid compounds as fluorescers and quenchers |
| US5171534A (en) | 1984-01-16 | 1992-12-15 | California Institute Of Technology | Automated DNA sequencing technique |
| US4811218A (en) | 1986-06-02 | 1989-03-07 | Applied Biosystems, Inc. | Real time scanning electrophoresis apparatus for DNA sequencing |
| US5151507A (en) * | 1986-07-02 | 1992-09-29 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Alkynylamino-nucleotides |
| US5047519A (en) * | 1986-07-02 | 1991-09-10 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Alkynylamino-nucleotides |
| US5202231A (en) | 1987-04-01 | 1993-04-13 | Drmanac Radoje T | Method of sequencing of genomes by hybridization of oligonucleotide probes |
| JPS641949A (en) | 1987-06-24 | 1989-01-06 | Hitachi Ltd | Regeneration of electrophoretic gel |
| US5366860A (en) | 1989-09-29 | 1994-11-22 | Applied Biosystems, Inc. | Spectrally resolvable rhodamine dyes for nucleic acid sequence determination |
| US5188934A (en) | 1989-11-14 | 1993-02-23 | Applied Biosystems, Inc. | 4,7-dichlorofluorescein dyes as molecular probes |
| US5091652A (en) | 1990-01-12 | 1992-02-25 | The Regents Of The University Of California | Laser excited confocal microscope fluorescence scanner and method |
| US5274240A (en) | 1990-01-12 | 1993-12-28 | The Regents Of The University Of California | Capillary array confocal fluorescence scanner and method |
| DE69322266T2 (de) | 1992-04-03 | 1999-06-02 | Perkin Elmer Corp | Proben zusammensetzung und verfahren |
| US5374527A (en) | 1993-01-21 | 1994-12-20 | Applied Biosystems, Inc. | High resolution DNA sequencing method using low viscosity medium |
| WO1995016910A1 (en) | 1993-12-17 | 1995-06-22 | Perkin-Elmer Corporation | Uncharged polymers for separation of biomolecules by capillary electrophoresis |
| US5543026A (en) | 1994-02-07 | 1996-08-06 | The Perkin-Elmer Corporation | Real-time scanning fluorescence electrophoresis apparatus for the analysis of polynucleotide fragments |
| EP0655506B1 (en) | 1994-10-17 | 1996-09-18 | President And Fellows Of Harvard College | DNA polymerases having modified nucleotide binding site for DNA sequencing |
| DE4438918A1 (de) * | 1994-11-04 | 1996-05-09 | Hoechst Ag | Modifizierte Oligonukleotide, deren Herstellung sowie deren Verwendung |
| US5770716A (en) * | 1997-04-10 | 1998-06-23 | The Perkin-Elmer Corporation | Substituted propargylethoxyamido nucleosides, oligonucleotides and methods for using same |
| US5948648A (en) * | 1998-05-29 | 1999-09-07 | Khan; Shaheer H. | Nucleotide compounds including a rigid linker |
-
1998
- 1998-10-14 US US09/172,789 patent/US6096875A/en not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-06-02 EP EP09006976A patent/EP2202238A1/en not_active Withdrawn
- 1999-06-02 EP EP99930140A patent/EP1121371B8/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-02 JP JP2000575880A patent/JP3900244B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-06-02 CA CA002344643A patent/CA2344643C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-06-02 AT AT99930140T patent/ATE432284T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-06-02 AU AU46740/99A patent/AU744719B2/en not_active Ceased
- 1999-06-02 DE DE69940926T patent/DE69940926D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-02 WO PCT/US1999/012323 patent/WO2000021974A1/en active IP Right Grant
- 1999-12-14 US US09/461,510 patent/US6197555B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2006
- 2006-07-18 JP JP2006196282A patent/JP2006306888A/ja not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1121371B8 (en) | 2009-09-02 |
| JP3900244B2 (ja) | 2007-04-04 |
| DE69940926D1 (de) | 2009-07-09 |
| US6197555B1 (en) | 2001-03-06 |
| EP1121371B1 (en) | 2009-05-27 |
| CA2344643C (en) | 2007-09-11 |
| AU4674099A (en) | 2000-05-01 |
| WO2000021974A1 (en) | 2000-04-20 |
| ATE432284T1 (de) | 2009-06-15 |
| CA2344643A1 (en) | 2000-04-20 |
| EP1121371A1 (en) | 2001-08-08 |
| US6096875A (en) | 2000-08-01 |
| EP2202238A1 (en) | 2010-06-30 |
| AU744719B2 (en) | 2002-02-28 |
| JP2006306888A (ja) | 2006-11-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3900244B2 (ja) | 堅いリンカーを有するヌクレオチド化合物 | |
| US5948648A (en) | Nucleotide compounds including a rigid linker | |
| US5770716A (en) | Substituted propargylethoxyamido nucleosides, oligonucleotides and methods for using same | |
| US5821356A (en) | Propargylethoxyamino nucleotides | |
| JP4140976B2 (ja) | ４，７―ジクロロローダミン色素 | |
| EP1386946B1 (en) | Method for analyzing the sequence of a nucleic acid using 4,7-dichlororhodamine dyes | |
| JP2649102B2 (ja) | 核酸配列決定のためのスペクトル分析できるローダミン染料 | |
| US6653462B2 (en) | Nucleotide compounds including a rigid linker |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20041213 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20050310 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20050317 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050613 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20060322 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060718 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20060802 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20061013 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20061114 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20061207 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20061219 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100112 Year of fee payment: 3 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100112 Year of fee payment: 3 |
|
| R360 | Written notification for declining of transfer of rights |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100112 Year of fee payment: 3 |
|
| R370 | Written measure of declining of transfer procedure |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R370 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110112 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110112 Year of fee payment: 4 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110112 Year of fee payment: 4 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110112 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120112 Year of fee payment: 5 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |