CN112263682A - 靶向pcsk9的反义寡聚体和缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及寡聚体化合物及其缀合物，它们靶向细胞中的9型蛋白原转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin(PCSK9)mRNA，导致PCSK9的表达减少。PCSK9表达的减少有益于一系列医学病症，例如高胆固醇血症及相关病症。

Description

靶向PCSK9的反义寡聚体和缀合物
本申请为2014年6月27日提交的，发明名称为“靶向PCSK9的反 义寡聚体和缀合物”的申请CN 201480036240.5的分案申请。
发明领域
本发明涉及寡聚体化合物及其缀合物，它们靶向细胞中的9型蛋白原 转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin(PCSK9)mRNA，导致PCSK9的表达减少。 PCSK9表达的减少有益于一系列医学病症，例如高胆固醇血症及相关病 症。
背景技术
9型蛋白原转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin(PCSK9)已经作为一种用于 降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的治疗靶而出现。PCSK9增加LDL受 体的降解，在具有高PCSK9活性的个体中导致高LDL-C。
Lindholm等人在Molecular Therapy(2012)；20 2,376–381中报道了 两种靶向PCSK9的LNA反义寡核苷酸，在一定的加载剂量(20mg/kg)和 四星期的维持剂量(5mg/kg)之后，它们在非人灵长类中产生了持续的 LDL-C降低。所用的化合物是一种十四聚体SPC5001(SEQ ID NO 1)和一 种十三聚体SPC4061。SPC5001同样被公开在WO2011/009697中。已经把这些PCSK9抑制剂的效力归结于它们短的长度(Krieg等人，Molecular Therapy NucleicAcids(2012)1,e6)。
WO2007/146511报道了短的双环(LNA)间隙体(gapmer)反义寡核苷 酸，与较长的化合物相比，它们明显地更强大，毒性更小。所例举的化合 物长度似乎是14个核苷酸。
根据van Poelgeest等人(American Journal of Kidney Disease,2013年10月；62(4):796-800),在人类临床试验中，施用LNA反义寡核苷酸 SPC5001可能导致急性肾损伤。
根据EP1984381B1、Seth等人的Nucleic Acids Symposium Series 2008No.52553–554和Swayze等人的Nucleic Acid Research 2007,vol 35, pp687-700,LNA寡核苷酸在动物中引起显著的肝毒性。根据 WO2007/146511,通过使用长度短至12-14个核苷酸的LNA间隙体来避免 LNA寡核苷酸的毒性。EP1984381B1推荐使用6’-取代的双环核苷酸来降低LNA寡核苷酸的毒性潜力。根据Hagedorn等人，Nucleic Acid Therapeutics 2013,可以从反义寡核苷酸的序列和修饰模式中预测它们肝 毒性潜力。
已经广泛地评估了寡核苷酸缀合物在siRNA中的用途，在siRNA中， 为了得到充足的体内效力，寡核苷酸缀合物被认为是必要的。例如， WO2004/044141涉及经由RNA干扰途径调控基因表达的修饰的寡聚体化 合物。这些寡聚体化合物包括一个或更多个能够改变或增强相连的寡聚体 化合物的药代动力学性能和药效效能的缀合体部分。
WO2012/083046报道了一种用于siRNA的半乳糖簇-药代动力学调节 剂靶向部分。
相比之下，单股的反义寡核苷酸典型地是在没有缀合或配制的情况下 被给药的。反义寡核苷酸的主要靶向组织是肝脏和肾，尽管如此，通过所 述的反义模式，也可以进入宽范围的其它组织，包括淋巴结、脾和骨髓。
WO 2005/086775涉及使用一种治疗剂的化学部分、一种可切除的接 头和一种标记结构域，将治疗剂靶向递送到特定的器官。所述可切除的接 头例如可以是二硫基、肽或限制酶可切除的寡核苷酸结构域。
WO 2011/126937涉及经由与小分子配体缀合对寡核苷酸进行靶向的 细胞内递送。
WO2009/025669涉及包含吡啶基二硫化物部分的聚合(聚乙二醇)接 头。也参见Zhao等人，Bioconjugate Chem.2005 16 758-766。
Chaltin等人，Bioconjugate Chem.2005 16 827-836报道了胆固醇修饰 的单体、二聚体和四聚体寡核苷酸，其用于把反义寡核苷酸掺入阳离子脂 质体中以产生一种树枝状聚体递送体系。使胆固醇经由一个赖氨酸接头与 所述的寡核苷酸缀合。
其它的不可切除的胆固醇缀合物已经被用于把siRNA和antagomirs 靶向肝脏——参见例如Soutscheck等人，Nature 2004vol.432 173-178以 及Krützfeldt等人，Nature 2005vol 438,685-689。对于部分硫代磷酸酯 化的siRNA和antagomirs，发现使用胆固醇作为靶向肝脏的实体对于体内 活性是必要的。
发明目的
因此，需要与SPC5001一样有效的但是具有降低的毒性风险，特别是 降低的肾毒性的靶向PCSK9的反义化合物。
根据本发明，这已经通过使用反义方法鉴定新的能够被特别有效地靶 向的人PCSK9序列(SEQ ID NO 33和SEQ ID NO 34)以及保留或改善了 SPC5001的显著效力而不引发毒性问题的所述SPC5001序列的更长变体 而实现。通过使用缀合物，可以进一步改善本发明的反义寡核苷酸，已经 发现这些缀合物极大地提高了LNA反义寡核苷酸的治疗指数。
本发明的化合物是PCSK9的强有力的并且无毒的抑制剂，可用于治 疗高胆固醇血症和相关的病症。
发明概述
本发明的寡聚体可以包含10-22，例如12-18个核苷酸长度，这些核苷 酸要么包含a)一个与SEQ ID NO 33或34或45的相应长度互补的10-16 个核苷酸的毗连序列，要么包含b)一个与SEQ ID NO 31的相应长度互补 的16个核苷酸的毗连序列。
本发明提供一种反义寡核苷酸缀合物，其包含根据本发明所述的寡聚 体和至少一个与所述寡聚体共价相连的非核苷酸或非多核苷酸部分。
本发明还提供一种反义寡核苷酸缀合物，其包含根据本发明所述的寡 聚体(A)和至少一个与所述寡聚体共价相连的非核苷酸或非多核苷酸部分 (C)，该非核苷酸或非多核苷酸部分任选地经由一个接头区(B和/或Y)位于 所述寡聚体的毗连序列和所述的缀合部分之间。
在一些实施方式中，本发明还提供一种反义寡核苷酸缀合物，其包含 长度为10-22个(例如12-18个核苷酸)的寡聚体，其中所述的寡聚体包含:a) 一个与SEQ ID NO 33或34或45的相应长度互补的10-16个核苷酸的毗 连序列，或b)一个与SEQ ID NO 31的相应长度互补的16个核苷酸的毗连 序列。
本发明还提供一种化合物，其选自由SEQ ID NO 2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15、17、16、18、19、20、21、22、23和24 组成的组。
本发明提供一种药物组合物，其包含根据本发明所述的寡聚体或缀合 物以及一种药学上可接受的稀释剂、载体、盐或佐剂。
本发明提供用作药物的根据本发明的寡聚体或缀合物或药物组合物， 例如用于治疗高胆固醇血症或相关病症，例如一种选自由下列组成的组的 病症:动脉粥样硬化症、高脂血症、高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症(例 如获PCSK9功能突变)、HDL/LDL胆固醇失衡、血脂异常(例如家族性高 脂血症(FCHL)或家族性高胆固醇血症(FHC)、获得性高脂血症、抑制素抗 性的高胆固醇血症、冠状动脉病(CAD)和冠心病(CHD)。
本发明提供本发明的寡聚体或缀合物或药物组合物用于生产治疗高 胆固醇血症或相关病症的药物的用途，所述病症例如选自由下列组成的组: 动脉粥样硬化症、高脂血症、高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症(例如获 PCSK9功能突变)、HDL/LDL胆固醇失衡、血脂异常(例如家族性高脂血 症(FCHL)或家族性高胆固醇血症(FHC)、获得性高脂血症、抑制素抗性的 高胆固醇血症、冠状动脉病(CAD)和冠心病(CHD)。
本发明提供治疗高胆固醇血症或相关病症的方法，该病症例如是一种 选自由下列组成的组的病症:动脉粥样硬化症、高脂血症、高胆固醇血症、 家族性高胆固醇血症(例如获PCSK9功能突变)、HDL/LDL胆固醇失衡、 血脂异常(例如家族性高脂血症(FCHL)或家族性高胆固醇血症(FHC)、获 得性高脂血症、抑制素抗性的高胆固醇血症、冠状动脉病(CAD)和冠心病 (CHD)，所说方法包括:向遭受或可能遭受高胆固醇血症或相关病症的患 者施用有效量的根据本发明的一种寡聚体或缀合物或药物组合物。
本发明提供一种在体内或在体外抑制表达PCSK9的细胞中PCSK9的 方法，所说方法包括向所述细胞施用根据本发明的一种寡聚体或缀合物或 药物组合物，从而抑制所说细胞中的PCSK9。
根据本发明，本发明还提供一种寡聚体，例如一种LNA寡聚体，其 包含一个具有10-22个，例如12-18个，例如13、14、15、16或17个硫 代磷酸酯连接的核苷的毗连区(即A区，它典型地与靶序列，例如SEQ ID NO 46的相应区互补),并且还包含与所述LNA寡聚体毗连的1-6个DNA 核苷酸，其中在所述DNA之间和/或与所述DNA核苷相邻的所述核苷间 的连接是生理学上不稳定的，例如是磷酸二酯连接。这样一种LNA寡聚 体可以呈一种本文所描述的缀合物形式，或者例如可以是一种将要被用于 后续的缀合步骤的中间体。当被缀合时，所述缀合物例如可以是或包含一 种甾醇例如胆固醇或生育酚，或者可以是或包含一种(非核苷酸的)碳水化 合物，例如一种GalNAc缀合物，或本文所描述的另一种缀合物。
本发明还提供一种间隙体寡聚体，它包含至少一个长度为10-22个， 例如12-18个，例如13、14、15、16或17个核苷酸的cET，例如(S)-cET 核苷酸，它靶向人PCSK9(即具有一段与人PCSK9的相应部分互补的序 列)。
附图简述
图1:可以使用的三-GalNAc缀合物的例子。缀合物1-4举例说明4种 合适的GalNAc缀合部分，而缀合物1a-4a涉及具有额外的接头部分(Y)的 同样的缀合物，该接头部分被用于将所述缀合物连接到所述寡聚体(A区或 连接到一个可生物切除的接头，例如B区)。波浪线代表共价连接到所述寡 聚体。
图2:胆固醇和生育酚缀合部分的例子。缀合物5a和6a涉及具有额 外的接头部分(Y)的同样的缀合物，该接头部分用于将所述缀合物连接到所 述寡聚体(A区或连接到一个可生物切除的接头，例如B区)。波浪线代表 连接到所述寡聚体的共价连接。
图3:特定的LNA化合物。通过字母后面的上标L来识别β-D-氧LNA， 下标S代表硫代磷酸酯连接，大写字母C前面的上标Me代表5-甲基胞嘧啶 LNA，非LNA核苷酸是DNA核苷酸(无上标L)。
图4:LNA化合物的胆固醇缀合物的例子。通过字母后面的上标L来 识别β-D-氧LNA，下标S代表硫代磷酸酯连接，下标o代表磷酸二酯连接， 大写字母C前面的上标Me代表5-甲基胞嘧啶LNA，非LNA核苷酸是DNA 核苷酸(无上标L)。
图5:LNA化合物的GalNAc缀合物的例子。所述缀合物基本上对应于 图中的Conj2a，在那里波浪线被LNA寡聚体所替代。通过字母后面的上 标L来识别β-D-氧LNA，下标S代表硫代磷酸酯连接，大写字母C前面 的上标Me代表5-甲基胞嘧啶LNA，非LNA核苷酸是DNA核苷酸(无上标 L)。
图5A:SEQ ID NO 18的详细结构。
图5B:SEQ ID NO 19的详细结构。
图6:FAM缀合基团的例子。
图7:含有以及不含有可切除的磷酸二酯连接的LNA-FAM缀合物。 通过字母后面的上标L来识别β-D-氧LNA，下标S代表一种硫代磷酸酯 连接，下标o代表磷酸二酯连接，大写字母C前面的上标Me代表5-甲基胞 嘧啶LNA，非LNA核苷酸是DNA核苷酸(无上标L)。
图8:按照体外效力分级的抗-PCSK9的间隙体。
图9:选取的按照体外效力分级的抗-PCSK9间隙体。
图10:选取的抗-PCSK9化合物的体外效力和IC50计算。
图11:选取的抗-PCSK9的缀合物的体内ALT数据。
图12:对本发明化合物的非限定性的说明。核苷间的连接L例如可 以是磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼烷基磷酸酯 (boranophosphate)或甲基膦酸酯，例如磷酸二酯。PO是一种磷酸二酯连 接。化合物a)具有一个带有一个单股DNA(或RNA)的B区，第一区和第 二区之间的连接是PO。化合物b)具有两个通过磷酸二酯连接而连接起来 的DNA/RNA(例如DNA)核苷。化合物c)具有三个通过磷酸二酯连接而连 接起来的DNA/RNA(例如DNA)核苷。在一些实施方式中，可以通过另外 的磷酸二酯DNA/RNA(例如DNA核苷)来进一步延长B区。在每一种化合 物的左边(例如胆固醇、GalNAc、缀合物1-4、1a-4a和5或6)阐明了缀合 基团(标记为X，除此之外标记为C区)，并且可以任选地经由磷核苷连接 基团，例如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼烷基磷酸酯或甲基 膦酸酯共价连接到B区的末端核苷上，或者可以经由备选连接，例如三唑 连接而连接(参见化合物d)、e)和f)中的L)。
图13.本发明化合物的非限定性的举例说明，其中所述化合物包括位 于第三(缀合物)区(X)和第二区(B区)之间的任选的接头(Y)。命名与图12 一样。这里公开了合适的接头，并且合适的接头包括例如烷基接头，例如 C6接头。在化合物a)、b)和c)中，经由磷核苷连接基团，例如磷酸二酯、 硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼烷基磷酸酯或甲基膦酸酯，或者可以经由 备选连接，例如三唑连接(Li)，把所述X和B区之间的接头连接到B区。 在这些化合物中，Lii代表所述第一区(A)和所述第二区(B)之间的核苷间连 接。化合物d)、e)和f)进一步包括一个位于B区和所述缀合基团之间的接 头(Y)，并且可以经由例如一个磷核苷连接基团，例如磷酸二酯、硫代 磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼烷基磷酸酯或甲基膦酸酯(或者在一些实施方式 中，可以经由一个三唑连接)，把Y区连接到B区。此外或者备选地，X 可以是一种活性基团或反应性基团。可以经由例如一种磷核苷连接基团， 例如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼烷基磷酸酯或甲基膦酸酯， 或者可以经由一种备选连接，例如三唑连接，把X共价连接到B区。
图14.采用胆固醇缀合物在体内沉默PCSK9 mRNA。给小鼠注射单 一剂量的10mg/kg没有缀合的LNA-反义寡核苷酸(#40)或等摩尔量的采用 不同接头与胆固醇缀合的LNA反义寡核苷酸，并且在定量给药后的第1、 3、7和10天杀死小鼠。从肝脏和肾中分离出RNA，使RNA接受PCSK9 特异性的RT-qPCR A。将来自肝脏样品的PCSK9 mRNA的定量测定归一 化到BACT，并且显示成占等同的盐水对照B的平均值的百分数。将来自 肾样品的PCSK9 mRNA的定量测定归一化到BACT，并且显示成占等同 的盐水对照的平均值的百分数。
图15:来自大鼠安全性研究的Kim-1表达(参见实施例5)。
图16：来自被注射了四次(一次注射/星期)，每次0.5或1.5mg/kg/星 期的SEQ IDNO 2和18的食蟹猴的样品中的血清PCSK9和LDL胆固醇。
图17.来自被注射了四次(一次注射/星期)，每次0.5或1.5mg/kg/星 期的SEQ IDNO 3和19的食蟹猴的样品中的血清PCSK9和LDL胆固醇。
发明详述
在下文中，在分开的标题下描述了本发明的不同成分。应该理解，可 以将来自一个成分的实施方式与来自其它成分的实施方式相结合来实现 本发明的化合物(例如如图12和13中所举例说明的那样)。
寡聚体(A区)
在本发明的上下文中，术语“寡聚体”或“寡核苷酸”是指由两个或多个 核苷酸的共价连接而形成的分子(即寡核苷酸)。在这里，单个的核苷酸(单 元)也可以被称为一个单体或单元。在一些实施方式中，术语“核苷”、“核 苷酸”、“单元”和“单体”能够被互换使用。将会认识到:当提到核苷酸或单 体的序列时，所指的是碱基例如A、T、G、C或U的序列。
本发明的寡聚体在长度方面可以包含10-22个，例如12-18个核苷酸。 所述的寡聚体要么包含a)与SEQ ID NO 33或34或45的相应长度互补的 10-16个核苷酸的毗连序列，要么包含b)与SEQ ID NO 31的相应长度互 补的16个核苷酸的毗连序列。
在一些实施方式中,本发明的寡聚体包含一个选自由SEQ ID NO 26、 27、28、29和44组成的组的毗连序列。
本发明的化合物(例如寡聚体或缀合物)靶向PCSK9，并且这样能够下 调PCSK9的表达或抑制PCSK9，例如人体中的或表达PCSK9的细胞中 的PCSK9。
在一些实施方式中,所述的与SEQ ID NO 33或34或45的相应长度互 补的10-16个核苷酸的毗连序列的核苷间连接可以是硫代磷酸酯连接。
在一些实施方式中,本发明的寡聚体包含一个毗连序列或由该序列组 成，该毗连序列选自由SEQ ID NO 2、3、4、5、6、7、8和40组成的组。 在一个实施方式中，所述的寡聚体包含一个选自下列的序列或由该序列组 成:a)SEQ ID NO 2或3，或b)SEQ ID NO 4、5或6，或c)SEQ ID NO 7 或8，或d)SEQ ID NO 40。
在一些实施方式中，所述的寡聚体包含10-16个硫代磷酸酯连接的核 苷。
在一些实施方式中，本发明的寡聚体包含一个与SEQ ID NO 33或34 或45的相应长度互补的至少10-16个核苷酸的毗连序列，或一个与SEQ ID NO 31的相应长度互补的16个核苷酸的毗连序列，其中所述的毗连序列包 含核苷酸类似物。优选地，所述的核苷酸类似物是增强亲和性的核苷酸类 似物。
在一些实施方式中，所述的核苷酸类似物是糖修饰的核苷酸，例如独 立地或依赖性地选自由下列组成的组的糖修饰的核苷酸:锁定的核酸 (LNA)单元、2’-O-烷基-RNA单元、2’-OMe-RNA单元、2’-氨基-DNA单 元和2’-氟-DNA单元。
在一些实施方式中，所述的核苷酸类似物包含或者是锁定的核酸(LNA) 单元。
在一些实施方式中，本发明的寡聚体包含或者是一种间隙体，例如一 种LNA间隙体寡核苷酸。
在一些实施方式中，所述的间隙体在其每一侧(5’和3’)包含一个具有 2-4个核苷酸类似物(优选LNA类似物)的翼。
在一些实施方式中，本发明的寡聚体包含一个与SEQ ID NO 33或34 或45的相应长度互补的13、14、15或16个核苷酸的毗连序列，或一个与 SEQ ID NO 31的相应长度互补的16个核苷酸的毗连序列，并且可以任选 地包含另外1-6个核苷酸，这1-6个核苷酸可以形成或包含一个可生物切 除的核苷酸区，例如磷酸核苷酸接头。合适地，所述可生物切除的核苷酸 区由一段短的生理学上不稳定的核苷酸序列(例如1、2、3、4、5或6个核 苷酸的序列)形成。这可以通过使用磷酸二酯连接与DNA/RNA核苷来实 现，或者如果能够保持生理学上的易感性，可以使用其它核苷。可以使用 肝脏提取物来测定生理学上的易感性，正如实施例6中所举例说明的那样。
因此，本发明的寡聚体可以包含一个与SEQ ID NO 33或34或45的 相应长度互补的长度为10-16个核苷酸的毗连的核苷酸序列，或包含一个 与SEQ ID NO 31(第一区或A区)的相应长度互补的16个核苷酸的毗连序 列。本发明的寡聚体可以包含另外的核苷酸区。在一些实施方式中，所述 另外的核苷酸区包含一个可生物切除的核苷酸区，例如磷酸核苷酸序列(第 二区，B区),该区可以把A区共价连接到非核苷酸部分，例如缀合基团(第三区或C区)上。在一些实施方式中，可以直接地把本发明的寡聚体的毗 连的核苷酸序列(A区)共价连接到C区上。在一些实施方式中，C区是可 生物切除的。
所述寡聚体由一个长度为12-22个，例如13、14、15、16、17、18、 19、20、21个核苷酸，例如长度为14-16个核苷酸，例如长度为15或16 个核苷酸的毗连的核苷酸序列组成或包含所述核苷酸序列。因此，所述寡 聚体可以指的是A区和B区的合并长度，例如A区10-16个核苷酸，而B 区1-6个核苷酸。
在各种实施方式中，本发明的化合物不包含RNA(单元)。在一些实施 方式中，根据本发明的化合物、第一区或者第一区和第二区一起(例如作为 一个单一的毗连序列)是线性的分子，或者被合成为线性的分子。因此，所 述的寡聚体可以是单链分子。在一些实施方式中，所述的寡聚体不包含与 所述同一个寡聚体内的等价区互补的短的(例如至少3、4或5个)毗连的核 苷酸区(即双链体)。在一些实施方式中，所述的寡聚体可以不(必)是双链的。在一些实施方式中，所述的寡聚体基本上不是双链的，例如不是一种 siRNA。
寡聚体序列
下表提供了本发明的寡聚体和寡聚体缀合物以及本发明的PCSK9靶 序列。
表1
Figure BDA0002614551260000111
Figure BDA0002614551260000121
SEQ ID NO 25-29和44是核碱基序列基序。
SEQ ID NO 30-34和45是存在于人PCSK9 mRNA中的RNA靶序列。
SEQ ID NO 1是SPC5001。
SEQ ID NO 1-24和40-43是包含核苷酸类似物的寡聚体，例如LNA 间隙体寡聚体，其中小写字母是DNA单元(核苷/核苷酸)，其中大写字母 是LNA单元。
在一些实施方式中，所有的LNA C都是5-甲基胞嘧啶。在一些实施 方式中，所有的LNA单元都是β－D-氧LNA。在一些实施方式中，SEQ ID NO 1-24和40-43的核苷之间的核苷间连接都是硫代磷酸酯连接。
SEQ ID NO 9-16和41-43包含所述的寡聚体(如该SEQ ID所指示的 那样)以及可以被共价连接(任选地经由一个可生物切除的接头，例如一个 磷酸核苷接头)到该寡聚体的5’或3’端的胆固醇缀合物。在一些实施方式 中，所述的胆固醇缀合物被连接在所述寡聚体的5’端。
SEQ ID NO 17-24包含所述的寡聚体(如该SEQ ID所指示的那样)以 及可以被共价连接(任选地经由一个可生物切除的接头，例如一个磷酸核苷 接头或可切除的肽接头)到该寡聚体的5’或3’端的GalNAc缀合物。在一些 实施方式中，所述的GalNAc缀合物被连接在所述寡聚体的5’端。
本文所用的特异性的寡聚体和缀合物被举例说明在图3(寡聚体)、图 4(胆固醇缀合物)、图5(GalNAc缀合物)中。可以与本发明的寡聚体一起使 用的缀合物的其它例子被举例说明在图1和2中,并且被描述在GalNAc缀 合部分那节中。
表2提供了寡聚体和缀合物的具体组合。
表2:寡聚体/缀合物组合
Figure BDA0002614551260000131
Figure BDA0002614551260000141
Figure BDA0002614551260000142
所有这些都能够通过用所述寡聚体的序列替换图1或2中的波浪线而 实现。图5显示了Conj2a与上面所示的SEQ ID NO的组合。图5A和5B 是图5中化合物的两个详细的实例。请注意:一个可生物切除的接头(B)可 以或不可以存在于缀合部分(C)和寡聚体(A)之间。对于Conj1–4和1a–4a， GalNAc缀合物本身是可生物切除的，在GalNAc簇中使用一种肽接头， 并且因此可以或不可以使用另外的可生物切除的接头(B)。然而，初步的数 据指示:纳入可生物切除的接头(B)，例如这里所公开的磷酸核苷酸接头可 以增强这样的GalNAc簇寡聚体缀合物的活性。图4显示具有上面所示 SEQ ID NO的Conj5a与一种可生物切除的接头(B)的组合，其由采用磷 酸二酯连接而连接起来的两个DNA单体C和A构成。为了与Conj 5和Conj 6一起使用，使用一种可生物切除的接头极大地增强纳入了可生物切 除的接头的化合物的活性，例如推荐这里所公开的磷酸核苷酸接头(B)。
术语“与......相对应”和“对应于”是指寡聚体的核苷酸序列(即核碱基或 碱基序列)或毗连的核苷酸序列(第一区/A区)和核酸靶的反向互补序列或 其亚区(例如SEQ IDNO 31、32、33、34或45)之间的比较。将核苷酸类 似物直接与它们的等价物或相应的核酸进行比较。在一种优选的实施方式 中，所述寡聚体(或其第一区)与所述的靶区或其亚区(例如SEQ ID NO 31、 32、33、34或45)是互补的，例如是完全互补的。
本文所用的术语“反向互补序列”、“反向互补的”和“反向互补性”可以 与术语“互补序列”、“互补的”和“互补性”互换使用。
术语“互补的”意味着当一个序列能够与另一个序列沿着反平行方式结 合时，两个序列是互补的，其中每一个序列的3’端与另一个序列的5’端结 合，并且一个序列的每一个A、T(U)、G和C然后分别与另一个序列的 T(U)、A、C和G对齐。通常，寡核苷酸的互补序列与一个确定的序列具 有至少90％，优选95％，最优选100％的互补性。
术语“相应的核苷酸类似物”和“相应的核苷酸”意指所述核苷酸类似物 中的核苷酸和天然存在的核苷酸是相同的。例如，当所述核苷酸的2-脱氧 核糖单元与腺嘌呤相连时，所述“相应的核苷酸类似物”包含一个与腺嘌啉 相连的戊糖单元(不同于2-脱氧核糖)。
术语“核碱基”是指一个核苷酸的碱基部分，并且覆盖天然存在的以及 非天然存在的变体。因此，“核碱基”不仅覆盖已知的嘌呤和嘧啶杂环，而 且也覆盖其杂环类似物和互变异构体。应该认识到，B区的DNA或RNA 核苷可以具有天然存在的和/或非天然存在的核碱基。
核碱基的例子包括,但不限于:腺嘌啉、鸟嘌啉、胞嘧啶、胸腺嘧啶、 尿嘧啶、黄嘌啉、次黄嘌啉、5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5- 溴代尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、二氨基嘌 呤和2-氯-6-氨基嘌呤。在一些实施方式中，所述的核碱基可以独立地选自 由下列组成的组:腺嘌啉、鸟嘌啉、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、5-甲基 胞嘧啶。在一些实施方式中，所述的核碱基可以独立地选自由下列组成的 组:腺嘌啉、鸟嘌啉、胞嘧啶、胸腺嘧啶和5-甲基胞嘧啶。
在一些实施方式中，至少一个存在于所述寡聚体中的所述核碱基是一 种修饰的核碱基，其选自由下列组成的组:5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假异 胞嘧啶、5-溴代尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、 二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。
靶
合适地，本发明的寡聚体能够调节PCSK9基因的表达。优选地，所 述寡聚体能够下调PCSK9基因的表达。在这个方面，本发明的寡聚体能 够影响，典型地，影响哺乳动物中例如人体细胞，例如肝细胞中PCSK9 的表达。在一些实施方式中，本发明的寡聚体与靶核酸结合，并且对表达 的影响是比正常的表达水平(例如用盐水处理的细胞、动物或人的表达水平) 降低至少10％或20％，更优选地，与正常的表达水平相比，对表达的影响 是至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的抑制。在一 些实施方式中，当使用0.04-25nM，例如0.8-20nM浓度的本发明化合物时， 看到了这样的调控。在一些实施方式中，当使用0.01-15mg/kg，例如 0.05-10mg/kg，例如0.1-7.5mg/kg，例如0.25-5mg/kg,例如0.5-2.5mg/kg 浓度的本发明化合物时，看到了这样的调控。在相同或不同的实施方式中， 对表达的抑制率小于100％，例如抑制率小于98％，抑制率小于95％，抑 制率小于90％。抑制率小于80％，例如抑制率小于70％。可以通过测定 蛋白质的水平，例如通过诸如SDS-PAGE的方法，然后采用抗所述靶蛋白 的合适抗体，通过蛋白质印迹法来确定表达水平的调控。备选地，通过测 定mRNA水平，例如通过RNA印迹法或定量RT-PCR，能够确定表达水 平的调控。在一些实施方式中，当经由mRNA水平进行测定时，当使用一 种合适的剂量，例如0.04-25nM,例如0.8-20nM的浓度时，下调的水平典 型地达到不存在本发明化合物时的正常水平的10-20％的水平。
因此，本发明提供一种下调或抑制在表达PCSK9蛋白质和/或mRNA 的细胞中PCSK9蛋白质和/或mRNA的表达的方法，所说方法包括向所述 细胞施用根据本发明的寡聚体或缀合物，从而下调或抑制所说细胞中 PCSK9蛋白质和/或mRNA的表达。合适地，所述细胞是哺乳动物细胞， 例如人体细胞。在一些实施方式中，所述的施用可以发生在体外。在一些 实施方式中，所述的施用可以发生在体内。
本文所用的术语“靶核酸”是指编码哺乳动物PCSK9多肽(例如人 PCSK9，例如NCBI检索号NM_174936SEQ ID NO:46)的DNA或RNA、 编码PCSK9的核酸或其天然存在的变体以及由它们衍生的RNA核酸，优 选mRNA，例如前mRNA，尽管如此，优选成熟的mRNA。在一些实施方式中，例如当在研究或诊断中使用时，所述的“靶核酸”可以是一种cDNA 或由上述DNA或RNA核酸靶衍生而来的合成的寡核苷酸。根据本发明的 寡聚体能够优选地能够与靶核酸杂交。将要认识到，SEQ ID NO:46是一 种cDNA序列，因此对应于成熟的mRNA靶序列，但是在该cDNA序列 中，尿嘧啶被胸腺嘧啶所替代。
术语“其天然存在的变体”是指天然存在于所定义的分类组(例如哺乳 动物，例如小鼠、猴子，优选人)内的核酸序列的PCSK9多肽的变体。典 型地，当提及一种多核苷酸的“天然存在的变体”时，该术语也可以包括编 码PCSK9的基因组DNA和RNA的任何等位基因变体，例如由其衍生得 到的mRNA，通过染色体易位或复制发现该DNA位于染色体4上，在4C7处。“天然存在的变体”也可以包括由PCSK9 mRNA的可变剪接而衍生得 到的变体。当提及一种特异性的多肽序列时，例如该术语也包括所述蛋白 质的天然存在形式，因此该形式可以被加工，例如通过伴同翻译的或翻译 后的修饰，例如通过信号肽切除、蛋白酶解剪切、糖基化等进行加工。
在一些实施方式中，所述的寡聚体(或其毗连的核苷酸部分)选自或包 含一种选自下列的序列:SEQ ID NO:28或29或44或其至少10个毗连核 苷酸的亚序列，其中所述的寡聚体(或其毗连的核苷酸部分)当其与所述序 列比较时，可以任选地包含一个、两个或三个错配。
在一些实施方式中，所述靶序列选自或者包含一个选自下列的序列或 者由其组成:SEQ ID NO:31、32、33、34或45或SEQ ID NO:33、34或 45的至少10个毗连核苷酸的亚序列。
在一些实施方式中，所述的亚序列可以由11、12、13、14、15或16 个毗连的核苷酸，例如12-16个核苷酸组成。合适地，在一些实施方式中， 所述的亚序列长度与本发明的寡聚体的毗连核苷酸序列相同(任选地，当B 区不与所述靶互补时，不包括B区)。
然而，将会认识到，在一些实施方式中，所述寡聚体的核苷酸序列可 以包含另外的5’或3’核苷酸，例如独立地包含1、2、3、4、5或6个不与 所述靶序列互补的另外的5’和/或3’核苷酸——这样的非互补的寡核苷酸 可以形成B区。在这个方面，在一些实施方式中，本发明的寡聚体可以包 含一个毗连的核苷酸序列，在该序列的5’和/或3’侧翼是另外的核苷酸。在 一些实施方式中，所述另外的5’或3’核苷酸是天然存在的核苷酸，例如 DNA或RNA。在一些实施方式中，所述另外的5’或3’核苷酸可以代表D 区，正如在这里的间隙体寡聚体的上下文中所提及的那样。
在一些实施方式中，根据本发明的寡聚体由根据SEQ ID NO:27的核 苷酸序列或其至少10或12个核苷酸的亚序列组成或包含所述核苷酸序列 或亚序列。
在一些实施方式中，根据本发明的寡聚体由根据SEQ ID NO:28的核 苷酸序列或其至少10或12个核苷酸的亚序列组成或包含所述核苷酸序列 或亚序列。在一种优选的实施方式中，根据本发明的寡聚体由根据SEQ ID NO:5或6的核苷酸序列组成或包含所述核苷酸序列或亚序列。在另一种 优选的实施方式中，根据本发明的寡聚体缀合物由根据SEQ IDNO:13或 14或21或22的核苷酸序列组成或包含所述核苷酸序列或亚序列。
在一些实施方式中，根据本发明的寡聚体由一个根据SEQ ID NO:29 的核苷酸序列或其至少10或12个核苷酸碱基的亚序列组成或包含所述核 苷酸序列或亚序列。在一种优选的实施方式中，根据本发明的寡聚体由一 个根据SEQ ID NO:7或8的核苷酸序列组成或包含所述核苷酸序列。在 另一种优选的实施方式中，根据本发明的寡聚体缀合物由一个根据SEQ ID NO:15或16或23或24的核苷酸序列组成或包含所述核苷酸序列。
在一些实施方式中，根据本发明的寡聚体由一个根据SEQ ID NO:44 的核苷酸序列或其至少10或12个核苷酸碱基的亚序列组成或包含所述核 苷酸序列或亚序列。在一种优选的实施方式中，根据本发明的寡聚体由一 个根据SEQ ID NO:40的核苷酸序列组成或包含所述核苷酸序列。在另一 种优选的实施方式中，根据本发明的寡聚体缀合物由一个根据SEQ ID NO: 41、42或43的核苷酸序列组成或包含所述核苷酸序列。
在一些实施方式中，根据本发明的寡聚体由一个根据SEQ ID NO:26 的核苷酸序列组成或包含所述核苷酸序列。在一种优选的实施方式中，根 据本发明的寡聚体由一个根据SEQ ID NO:2或3的核苷酸序列组成或包 含所述核苷酸序列。在另一种优选的实施方式中，根据本发明的寡聚体缀 合物由一个根据SEQ ID NO:10或11或18或19的核苷酸序列组成或包 含所述核苷酸序列。
长度
所述的寡聚体可以包含一个长度总共为10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21或22个毗连核苷酸的毗连的核苷酸序列或由它组成。 例如，长度可以包括A区或A区和B区。
在一些实施方式中，所述的寡聚体包含一个长度总共为10-22个，例 如12-18个，例如13-17个或12-16个，例如13、14、15、16个毗连核苷 酸的毗连的核苷酸序列或由它组成。优选地，A区的寡聚体包含长度为14 个毗连核苷酸(更优选地，长度为15个毗连核苷酸，最优选地，长度为16 个毗连核苷酸)的毗连的核苷酸序列或由它组成。
一些实施方式中，根据本发明的寡聚体由不超过22个核苷酸，例如不 超过20个核苷酸，例如不超过18个核苷酸，例如15、16或17个核苷酸 组成。在一些实施方式中，本发明的寡聚体包含少于20个核苷酸。
核苷酸类似物
本文所用的术语“核苷酸”是指包含一个糖部分、一个碱基部分和一个 共价连接的基团(例如磷酸酯或硫代磷酸酯核苷酸间连接基团)的糖苷，并 且覆盖天然存在的核苷酸(例如DNA或RNA)以及包含修饰的糖和/或碱基 部分的非天然存在的核苷酸(在这里也被称为“核苷酸类似物”)两者。在这 里，单个的核苷酸(单元)也被称为单体或核酸单元。
在生物化学领域，术语“核苷”通常被用来指包含一个糖部分和一个碱 基部分的糖苷。两个核苷之间的共价连接可以被称为核苷间连接。备选地， 可以使用术语核苷酸间连接来表征寡聚体的核苷酸之间的连接。
本领域技术人员将会认识到，寡核苷酸的5’核苷酸并不包含5’核苷酸 间的连接基团，但是可以或不可以包含5’末端基团，例如适于缀合接头(B 或Y或缀合部分)的磷酸二酯或硫代磷酸酯。
非天然存在的核苷酸包括具有修饰的糖部分的核苷酸，例如双环核苷 酸或2’修饰的核苷酸，例如2’-取代的核苷酸。
“核苷酸类似物”是由于糖和/或碱基部分的修饰而产生的天然核苷酸 (例如DNA或RNA核苷酸)的变体。类似物原则上可能仅仅是“沉默的”或 “等价”于寡核苷酸环境中的天然核苷酸，即对所述寡核苷酸用来抑制靶基 因表达的工作方式没有功能性的影响。尽管如此，这样“等价的”类似物可 以是有用的，如果，例如，它们被更容易或更廉价地生产或它们更稳定地 存在于储存或生产条件下，或者代表一种标记或标签。然而，优选地，所 述类似物将会对所述寡核苷酸用来抑制表达的工作方式具有功能性的影 响，例如通过产生增大的对所述靶的结合亲和性(亲合力增强)和/或增大 的对细胞内核酸酶的抗性和/或增大的转运到细胞中的容易程度。核苷酸类 似物的具体例子例如被Freier和Altmann的Nucl.Acid Res.,1997,25, 4429-4443以及Uhlmann的Curr.Opinion in DrugDevelopment,2000,3(2), 293-213所描述，并且被描述在方案1中:
方案1
Figure BDA0002614551260000211
因此，所述寡聚体可以包含天然存在的核苷酸的简单序列——优选2’- 脱氧核苷酸(在这里一般被称为“DNA”)，但也可能包含核糖核苷酸(在这里 一般被称为“RNA”)，或包含这样的天然存在的核苷酸与一种或多种非天然 存在的核苷酸(即核苷酸类似物)的组合，或由该序列或该组合组成。这样 的核苷酸类似物可以适当地增强所述寡聚体对所述靶序列的亲和性。 WO2007/031091提供或其中引用了合适的和优选的核苷酸类似物的例子。
在所述寡聚体中掺入增强亲和性的核苷酸类似物，例如LNA或2’-取 代的糖，能够允许减小特异性结合的寡聚体的尺寸，并且也可以在非特异 性的或反常的结合发生之前减小所述寡聚体尺寸的上限。
在一些实施方式中，所述寡聚体包含至少2个核苷酸类似物。在一些 实施方式中，所述寡聚体包含3-8个核苷酸类似物，例如6或7个核苷酸 类似物。
核苷酸类似物的例子包括修饰糖部分以提供一种2’-取代基或产生一 种双环结构，该双环结构增强结合亲和性并且也可以提供增大的核酸酶抗 性。
在一些实施方式中，存在于本发明的反义寡聚体内(例如在“间隙体设 计”那一节中提到的X’区和Y’区中)的核苷酸类似物独立地选自例如2’-O- 烷基-RNA单元、2’-O-甲基-RNA单元、2’-O-烷基-DNA单元、2’-氨基-DNA 单元、2’-氟-DNA单元、LNA单元、阿拉伯糖基核酸(ANA)单元、2’-氟-ANA 单元、HNA单元、INA(嵌入的核酸-Christensen,2002.Nucl.Acids.Res. 2002 30:4918-4925,在此通过引用并入)单元和2’-MOE单元。
在一些实施方式中，核苷酸类似物是2’-O-甲氧基乙基-RNA(2’MOE)、 2’-氟-DNA单体或LNA核苷酸类似物，并且本发明的这样一种反义寡核 苷酸可以包含独立地选自这三种类型的类似物的核苷酸类似物，或者可以 包含从这三种类型的类似物中选出的仅仅一种类型的类似物。在一些实施 方式中，至少一种所述核苷酸类似物是2’-MOE-RNA，例如是2、3、4、 5、6、7、8、9或10个2’-MOE-RNA核苷酸单元。在一些实施方式中， 至少一种所述核苷酸类似物是2’-氟-DNA，例如是2、3、4、5、6、7、8、 9或10个2’-氟-DNA核苷酸单元。
一种优选的核苷酸类似物是LNA，例如氧基-LNA(例如β-D-氧基 -LNA和α-L-氧基-LNA)和/或氨基-LNA(例如β-D-氨基-LNA和α-L-氨基 -LNA)和/或硫代-LNA(例如β-D-硫代-LNA和α-L-硫代-LNA)和/或 ENA(例如β-D-ENA和α-L-ENA)。最优选的是β-D-氧基-LNA。
在一些实施方式中，只有一种上述类型的核苷酸类似物存在于本发明 的一种反义寡核苷酸或其毗连的核苷酸序列中。
在一些实施方式中，本发明的一种反义寡核苷酸包含至少一个锁定核 酸(LNA)单元，例如1、2、3、4、5、6、7或8个LNA单元，例如3-7个 或4-8个LNA单元。在尤其最优选的实施方式中，所述核苷酸类似物中的 至少一种是一种锁定核酸(LNA)，例如至少3种或至少4种或至少5种或 至少6种或至少7种或至少8种所述的核苷酸类似物可以是LNA。在一些 实施方式中，所有的核苷酸类似物可以是LNA。
在一些实施方式中，本发明的一种反义寡核苷酸可以包含核苷酸类似 物(优选LNA)和DNA单元两者。优选地，核苷酸类似物(优选LNA)和DNA 单元加起来的总数是10-25，例如10-24，优选10-20，例如10-18，甚至更 优选12-16个。在一些实施方式中，本发明的一种反义寡核苷酸的核苷酸 序列，例如毗连的核苷酸序列，由至少一个核苷酸类似物(优选LNA)组成， 并且其余的核苷酸单元是DNA单元。在一些实施方式中，本发明的一种 反义寡核苷酸仅仅包含LNA核苷酸类似物和天然存在的核苷酸(例如RNA 或DNA，最优选DNA核苷酸),任选地带有修饰的核苷酸间连接例如硫代 磷酸酯。
将会认识到，当提及仅仅由核苷酸组成的优选的核苷酸序列基序或核 苷酸序列时，由该序列所确定的本发明的寡聚体可以包含一个相应的核苷 酸类似物，代替存在于该序列中的一个或多个核苷酸，例如LNA单元或 能提高双链体稳定性/所述寡聚体/靶双链体的Tm的其它核苷酸类似物(即 增强亲和性的核苷酸类似物)。
Tm试验:将寡核苷酸:寡核苷酸和RNA靶(PO)双链体在500ml 不含RNA酶的水中稀释到3mM，并且与500ml 2倍Tm-缓冲液(200mM NaCl,0.2mM EDTA,20mM磷酸钠,pH 7.0)混合。把溶液加热到95℃持续 3分钟，然后允许它在室温退火30分钟。使用PE Templab软件(Perkin Elmer),在一台装备有Peltier温度程序仪PTP6的Lambda 40UV/VIS光 谱仪上测定双链体的解链温度(Tm)。让温度按定速从20℃爬升到95℃， 然后按定速回落到25℃，记录在260nm处的吸光度。使用解链和退火两 者的一阶导数和局部最大值来估算双链体的Tm。
在一些实施方式中，在所述寡聚体的核苷酸序列与靶序列之间的任何 错配优选地是在增强亲和性的核苷酸类似物的外面区域中发现的，例如在 “间隙体设计”那一节中提到的Y’区，和/或在所述寡核苷酸中在具有非修 饰的，例如DNA核苷酸的位置处，和/或在作为所述毗连的核苷酸序列的5’或3’端的区域中。
LNA
术语“LNA”是指一种在核糖环的2’和4’位之间含有一个桥的双环核苷 类似物(2’-4’双环核苷酸类似物，也被叫做“锁定核酸”)。在文献中，LNA 有时被称作BNA(桥连的核酸或双环核酸)，并且这两个术语可以被互换使 用。术语LNA可以指一种LNA单体，或者当在“LNA寡核苷酸”的上下 文中使用时，LNA是指一种含有一个或多个这种双环核苷酸类似物的寡核 苷酸。在一些方面，双环核苷类似物是LNA核苷酸，并且这些术语因此 可以被互换使用，并且在这样的实施方式中，两者的特征都在于在核糖环 的C2’和C4’之间存在一个接头基团(例如一个桥基团)。
在一些实施方式中，本发明的反义寡核苷酸可以既包含β-D-氧基 -LNA，也包含一个或多个下列的LNA单元：硫代-LNA、氨基-LNA、氧 基-LNA、5’-甲基-LNA和/或β－D或α－L构型的ENA或其组合。在一 些实施方式中，所有的LNA胞嘧啶单元都是5’-甲基-胞嘧啶。在一些实施 方式中，至少一个存在于第一区(X’)中的核苷类似物是一种双环核苷类似 物，例如至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7 个，至少8个(除Y区的DNA和/或RNA核苷以外)是糖修饰的核苷类似物， 例如双环核苷类似物，例如LNA，例如β－D-X-LNA或α－L-X-LNA(其 中X是氧基、氨基或硫代)，或这里所公开的其它LNA，包括但不限于 (R/S)cET、cMOE或5’-Me-LNA。
在一些实施方式中，在本发明的寡核苷酸化合物中使用的LNA优选地 具有通式II的结构:
式II
Figure BDA0002614551260000241
其中Y选自由下列组成的组:-O-、-CH2O-、-S-、-NH-、N(Re)和/或-CH2-；Z和Z*独立地选自核苷酸连接、RH、末端基团或保护基团；B构成 一个天然或非天然的核苷酸碱基部分(核碱基)；而RH选自氢和C1-4-烷基； Ra、Rb、Rc、Rd和Re任选地独立地选自由下列组成的组:H、任选地取代 的C1-12-烷基、任选地取代的C2-12-链烯基、任选地取代的C2-12-炔基、羟基、C1-12-烷氧基、C2-12-烷氧基烷基、C2-12-链烯基氧基、羧基、C1-12-烷氧基羰 基、C1-12-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳氧基-羰基、芳氧基、芳基羰基、 杂芳基、杂芳氧基-羰基、杂芳氧基、杂芳基羰基、氨基、单-和二(C1-6-烷 基)氨基、氨基甲酰基、单-和二(C1-6-烷基)-氨基-羰基、氨基-C1-6-烷基-氨基 羰基、单-和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、C1-6-烷基-羰基氨基、 脲基、C1-6-烷酰氧基、磺酰基、C1-6-烷基磺酰氧基、硝基、叠氮基、硫烷 基、C1-6-烷硫基、卤素、DNA嵌入剂、光化学活性基团、热化学活性基团、 螯合基团、报道基团和配体，其中芳基和杂芳基可以任选地被取代并且其 中两个偕取代基Ra和Rb一起可以代表任选地被取代的亚甲基(＝CH2)； RH选自氢和C1-4-烷基。在一些实施方式中，Ra、Rb、Rc、Rd和Re任选 地独立地选自由氢和C1-6烷基，例如甲基组成的组。对于所有的手性中心， 可以发现不对称基团呈R取向或呈S取向，例如两种示例性的立体化学异 构体包括β－D和α－L异构体，可以将它们举例说明如下:
Figure BDA0002614551260000251
特定的示例性的LNA单元如下所示:
Figure BDA0002614551260000252
Figure BDA0002614551260000261
术语"硫代-LNA"包括一种锁定核苷酸，其中上述通式中的Y选自S 或-CH2-S-。硫代-LNA可以呈β-D和α-L-两种构型。
术语"氨基-LNA"包括一种锁定核苷酸，其中上述通式中的Y选自 -N(H)-、N(R)-、CH2-N(H)-和-CH2-N(R)-，其中R选自氢和C1-4-烷基。氨 基-LNA可以呈β-D和α-L-两种构型。
术语"氧基-LNA"包括一种锁定核苷酸，其中上述通式中的Y代表 –O-。氧基-LNA可以呈β-D和α-L-两种构型。
术语"ENA"包括一种锁定核苷酸，其中上述通式中的Y是-CH2-O-(其 中相对于碱基B，–CH2-O-的氧原子被连接到2’-位)。Re是氢或甲基。
在一些示例性的实施方式中，LNA选自β-D-氧基-LNA、α-L-氧基 -LNA,β-D-氨基-LNA和β-D-硫代-LNA,特别是β-D-氧基-LNA。
正如这里所使用的那样，"双环核苷"是指包含一个双环糖部分的修饰 的核苷。双环核苷的例子包括但是不限于在4'和2'核糖基环原子之间包 含一个桥的核苷。在一些实施方式中,这里所提供的化合物包括一个或多 个双环核苷，其中所述的桥包含一个4'-2'双环核苷。这样的4'-2'双环核 苷的例子包括但是不限于下式之一:4'-(CH2)-O-2'(LNA)；4'-(CH2)-S-2'； 4’-(CH2)2-O-2'(ENA)；4'-CH(CH3)-O-2'和4'-CH(CH2OCH3)-O-2*及其类似物(参见2008年7月15日颁证的美国专利7,399,845)； 4'-C(CH3)(CH3)-O-2及其类似物(参见公布的PCT国际专利申请WO2009/006478，2009年1月8日公布)；4'-CH2-N(OCH3)-2'及其类似物 (参见公布的PCT国际专利申请WO2008/150729,2008年12月11日公布)； 4'-CH2-O-N(CH3)-2'(参见公布的美国专利申请US2004/0171570,2004年9 月2日公布)；4'-CH2-N(R)-O-2',其中R是H、C1-C10烷基或保护基团(参 见2008年9月23日颁证的美国专利7,427,672)；4'-CH2-C(H)(CH3)-2'(参 见Chattopadhyaya等人,J.Org.Chem.,2009,74,118-134)；和 4'-CH2-C(＝CH2)-2'及其类似物(参见公布的PCT国际专利申请WO 2008/154401,2008年12月8日公布)。还参见例如:Singh等人,Chem. Commun.,1998,4,455-456；Koshkin等人,Tetrahedron,1998,54, 3607-3630；Wahlestedt等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97, 5633-5638；Kumar等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222； Singh等人,J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039；Srivastava等人,J.Am. Chem.Soc,129(26)8362-8379(Jul.4,2007)；Elayadi等人,Curr.Opinion Invens.Drugs,2001,2,558-561；Braasch等人,Chem.Biol,2001,8,1-7； Oram等人,Curr.Opinion Mol.Ther.,2001,3,239-243；美国专利号U.S. 6,670,461、7,053,207、6,268,490、6,770,748、6,794,499、7,034,133、6,525,191、 7,399,845；公布的PCT国际申请WO 2004/106356、WO 94/14226、WO 2005/021570和WO 2007/134181；美国专利公布号US2004/0171570、 US2007/0287831和US2008/0039618；以及美国专利系列号12/129,154、 60/989,574、61/026,995、61/026,998、61/056,564、61/086,231、61/097,787 和61/099,844；以及PCT国际申请号PCT/US2008/064591、 PCT/US2008/066154和PCT/US2008/068922。可以制备前述双环核苷中的 每一种，使其具有一个或多个立体化学糖构型，包括例如α－L-呋喃核糖 和β－D-呋喃核糖(参见PCT国际申请PCT DK98/00393,1999年3月25 日公布为WO 99/14226)。
在一些实施方式中,LNA核苷的双环糖部分包括但是不限于在呋喃戊 糖基的糖部分的4'和2'位之间具有至少一个桥的化合物，其中这样的桥 独立地包含1个或2至4个独立地选自下列的连接基团:-[C(Ra)(Rb)]n-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-C(＝NRa)-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-O-、-Si(Ra)2-、 -S(＝O)x-和-N(Ra)-；其中:x是0、1或2；n是1、2、3或4；Ra和Rb各自 独立地是H、保护基团、羟基、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12链烯基、取代的C2-C12链烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基、取代的杂 芳基、C5-C7脂环基、取代的C5-C7脂环基、卤素、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、CN、磺酰基(S(＝O)2-J1)或亚磺酰 基(S(＝O)-J1)；并且J1和J2各自独立地是H、C1-C6烷基、取代的C1-C12烷 基、C2-C12链烯基、取代的C2-C12链烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、 杂环基、取代的杂环基、C1-C12氨基烷基、取代的C1-C12氨基烷基或保 护基团。
在一些实施方式中,双环糖部分的桥是-[C(Ra)(Rb)]n-、-[C(Ra)(Rb)]n-O -、-C(RaRb)-N(R)-O-或-C(RaRb)-O-N(R)-。在一些实施方式中,所述的桥 是4'-CH2-2'、4'-(CH2)2-2'、4'-(CH2)3-2'、4'-CH2-O-2'、4’-(CH2)2-O-2'、 4'-CH2-O-N(R)-2'和4'-CH2-N(R)-O-2'-,其中每个R独立地是H、保护基 团或C1-C12烷基。
在一些实施方式中,进一步通过异构体的构型来定义所述的双环核 苷。例如包含一个4'-2'亚甲基氧基桥的核苷可以呈α-L构型或者呈β-D 构型。先前，α-L-亚甲基氧基(4'-CH2-O-2')BNA已经被掺入了显示反义 活性的反义寡核苷酸中(Frieden等人,NucleicAcids Research,2003,21, 6365-6372)。
在一些实施方式中,双环核苷包括但是不限于(A)α-L-亚甲基氧基 (4'-CH2-O-2')BNA,(B)β-D-亚甲基氧基(4'-CH2-O-2')BNA,(C)亚乙基氧 基(4'-(CH2)2-O-2')BNA,(D)氨基氧基(4'-CH2-O-N(R)-2')BNA,(E)氧基氨 基(4'-CH2-N(R)-O-2')BNA,(F)甲基(亚甲基氧基)(4'-CH(CH3)-O-2') BNA,(G)亚甲基-硫代(4'-CH2-S-2')BNA,(H)亚甲基-氨基 (4'-CH2-N(R)-2')BNA,(I)甲基碳环(4'-CH2-CH(CH3)-2')BNA,和(J)亚 丙基碳环(4'-(CH2)3-2')BNA，如下列所描绘的那样。
Figure BDA0002614551260000291
其中Bx是碱基部分，而R独立地是H、保护基团或C1-C2烷基。
在一些实施方式中,双环核苷由式I所定义:
Figure BDA0002614551260000292
其中:
Bx是杂环碱基部分；
-Qa-Qb-Qc-是–CH2-N(Rc)-CH2-、-C(＝O)-N(Rc)-CH2-、-CH2-O-N(Rc)-、 -CH2-N(Rc)-O-或-N(Rc)-O-CH2；
Rc是C1-C12烷基或氨基保护基团；而
Ta和Tb各自独立地是H、羟基保护基团、缀合基团、反应性的磷基团、 磷部分或与载体的共价连接。
在一些实施方式中,双环核苷由式II所定义:
Figure BDA0002614551260000301
其中:
Bx是杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地是H、羟基保护基团、缀合基团、反应性的磷基 团、磷部分或与一种载体的共价连接；Za是C1-C6烷基、C2-C6链烯基、 C2-C6炔基、取代的C1-C6烷基、取代的C2-C6链烯基、取代的C2-C6炔 基、酰基、取代的酰基、取代的酰胺、巯基或取代的硫代。
在一些实施方式中,每个所述的取代基团独立地被独立地选自下列的 取代基单取代或多取代:卤素、氧、羟基、OJc、NJd、SJC、N3、OC(＝X)Jc和NJeC(＝X)NJcJd,其中Jc、Jd和Je独立地是H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基，而X是O或NJC。
在一些实施方式中,双环核苷由式III所定义:
Figure BDA0002614551260000302
其中:
Bx是杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地是H、羟基保护基团、缀合基团、反应性的磷基 团、磷部分或与一种载体的共价连接；
Rd是C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、取代的C1-C6烷基、 取代的C2-C6链烯基、取代的C2-C6炔基或取代的酰基(C(＝O)-)。
在一些实施方式中,双环核苷由式IV所定义:
Figure BDA0002614551260000311
其中:
Bx是杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地是H、羟基保护基团、缀合基团、反应性的磷基团、 磷部分或与一种载体的共价连接；
Rd是C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6链烯基、取代的C2-C6链 烯基、C2-C6炔基、取代的C2-C6炔基；
qb、qc和qd各自独立地是H、卤素、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷 基、C2-C6链烯基、取代的C2-C6链烯基、C2-C6炔基、或取代的C2-C6炔 基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、酰基、取代的酰基、C1-C6氨 基烷基或取代的C1-C6氨基烷基；
在一些实施方式中,双环核苷由式V所定义:
Figure BDA0002614551260000312
其中:
Bx是杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地是H、羟基保护基团、缀合基团、反应性的磷基团、 磷部分或与一种载体的共价连接；qa、qb、qc和qd各自独立地是H、卤素、 C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12链烯基、取代的C2-C12链烯基、 C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C1-C12烷氧基、取代的C1-C12烷氧基、 OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(＝O)OJj、C(＝O)NJjJk、C(＝O)Jj、 O-C(＝O)NJjJk、N(H)C(＝NH)NJjJk、N(H)C(＝O)NJjJk或N(H)C(＝S)NJjJk； 或qe和qf一起是＝C(qg)(qh)；qg和qh各自独立地是H、卤素、C1-C12烷 基或取代的C1-C12烷基。
亚甲基氧基(4'-CH2-O-2')BNA单体腺嘌啉、胞嘧啶、鸟嘌啉、5-甲基 胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的合成和制备与它们的寡聚化一起以及核酸识 别性能已经被描述了(参见例如Koshkin等人,Tetrahedron,1998,54, 3607-3630)。BNA及其制备也被描述在WO 98/39352和WO 99/14226中。
亚甲基氧基(4'-CH2-O-2')BNA、亚甲基氧基(4'-CH2-O-2')BNA和2'- 硫基-BNA的类似物也已经被制备了(参见例如Kumar等人,Bioorg.Med. Chem.Lett.,1998,8,2219-2222)。包含寡脱氧核糖核苷酸双链体作为核酸 聚合酶的底物的锁定核苷类似物的制备也已经被描述了(参见例如Wengel 等人,WO 99/14226)。而且,2'-氨基-BNA——一种新的构象限制的高亲和 性寡核苷酸类似物的合成已经被描述在现有技术中(参见例如Singh等人, J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039)。另外，2'-氨基-和2'-甲基氨基-BNA 已经被制备并且它们与互补RNA和DNA链的双链体的稳定性先前已经被 报道了。
在一些实施方式中,双环核苷由式VI所定义:
Figure BDA0002614551260000321
其中:
Bx是杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地是H、羟基保护基团、缀合基团、反应性的磷基团、 磷部分或与一种载体的共价连接；qi、qj、qk和ql各自独立地是H、卤素、 C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12链烯基、取代的C2-C12链烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C1-C12烷氧基、取代的C2-C12烷氧基、 OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(＝O)OJj、C(＝O)NJjJk、C(＝O)Jj、 O-C(＝O)NJjJk、N(H)C(＝NH)NJjJk、N(H)C(＝O)NJjJk或(H)C(＝S)NJjJk；并 且qi和qj或者ql和qk一起是＝C(qg)(qh),其中qg和qh各自独立地是H、 卤素、C1-C12烷基或取代的C1-C6烷基。
一种具有一个4'-(CH2)3-2'桥的碳环双环核苷及其链烯基类似物桥 4'-CH＝CH-CH2-2'已经被描述了(参见例如Freier等人,Nucleic Acids Research,1997,25(22),4429-4443以及Albaek等人,J.Org.Chem.,2006, 71,7731-77'40)。碳环双环核苷的合成和制备与它们的寡聚化和生物化学 研究一起已经被研究了(参见例如Srivastava等人,J.Am.Chem.Soc.2007, 129(26),8362-8379)。
如本文所用，"4'-2'双环核苷"或"4'至2'双环核苷"是指包含呋喃 糖环的双环核苷，所述呋喃糖环包含连接2'碳原子和4'碳原子的桥。
如本文所用，"单环核苷"是指包含不是双环糖部分的经修饰的糖部分 的核苷。在一些实施方式中,核苷的糖部分或糖部分类似物可以在任何部 位被修饰或取代。
如本文所用，"2'-修饰的糖"是指在2'位被修饰的呋喃糖基糖。在一些 实施方式中,这样的修饰包括选自下列的取代基:卤化物，包括但是不限 于取代的和未取代的烷氧基、取代的和未取代的硫烷基、取代的和未取代 的氨基烷基、取代的和未取代的烷基、取代的和未取代的烯丙基以及取代 的和未取代的炔基。在一些实施方式中,2'修饰选自下列取代基:其包括 但是不限于：O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)，，NH2、O(CH2)，，CH3、 O(CH2)，，ONH2、OCH2C(＝O)N(H)CH3和O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2,其中n 和m为1至大约10。其它2'-取代基也可以选自:C1-C12烷基；取代的烷 基；链烯基；炔基；烷芳基；芳烷基；O-烷芳基或O-芳烷基；SH；SCH3； OCN；CI；Br；CN；CF3；OCF3；SOCH3；S02CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；杂 环烷基；杂环烷芳基；氨基烷基氨基；多烷基氨基；取代的甲硅烷基；R； 可切除基团；报道基团；嵌入剂；用于改善药代动力学性能的基团；和用于 改善反义化合物的药效学的基团以及其它具有类似性质的取代基。在一些 实施方式中,修饰的核苷包含2'-MOE侧链(参见例如Baker等人,J.Biol.Chem.,1997,272,1 1944-12000)。这样的2'-MOE取代已经被描述成与未 修饰的核苷和其它修饰的核苷相比具有改善的结合亲和性,例如2'-O-甲 基、O-丙基和O-氨基丙基。也已经显示具有2'-MOE取代基的寡核苷酸 是基因表达的反义抑制剂，对于体内使用具有有希望的特性(参见例如 Martin,P.,He/v.Chim.Acta,1995,78,486-504；Altmann等人,Chimia,1996,50,168-176；Altmann等人,Biochem.Soc.Trans.,1996,24,630-637； 和Altmann等人,Nucleosides核苷酸s,1997,16,917-926)。
如本文所用，"修饰的四氢吡喃核苷"或"修饰的THP核苷"是指具 有一个替代正常核苷中的呋喃戊糖基残基(糖替代物)的取代的6-员四氢吡 喃"糖"的核苷。修饰的THP核苷包括但是不限于现有技术中所称作的己 糖醇核酸(HNA)、anitol核酸(ANA)、甘露糖醇核酸(MNA)(参见Leumann, CJ.Bioorg.and Med.Chem.(2002)10:841-854)、氟代HNA(F-HNA)或式X 所定义的那些化合物:
式X
Figure BDA0002614551260000341
其中独立地对于每一个式X的所述至少一种四氢吡喃核苷类似物:
Bx是一个杂环碱基部分；
T3和T4各自独立地是把四氢吡喃核苷类似物连接到所述反义化合物 的核苷间连接基团,或者T3和T4中的一个是把四氢吡喃核苷类似物连接 到所述反义化合物的核苷间连接基团，而T3和T4中的另一个是H、羟基 保护基团、连接的缀合基团或5'或3'-末端基团；q1、q2、q3、q4、q5、q6和 q7各自独立地是H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6链烯基、取 代的C2-C6链烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；并且R1和R2中的 一个是氢，另一个选自卤素、取代的或未取代的烷氧基、NJ1J2、SJ1、N3、 OC(＝X)J1、OC(＝X)NJ1J2、NJ3C(＝X)NJ1J2和CN,其中X是O、S或NJ1并且J1、J2和J3各自独立地是H或C1-C6烷基。
在一些实施方式中,提供了式X的修饰的THP核苷，其中qm、qn、 qp、qr、qs、qt和qu每个都是H。在一些实施方式中,qm、qn、qp、qr、 qs、qt和qu中的至少一个不是H。在一些实施方式中,qm、qn、qp、qr、 qs、qt和qu中的至少一个是甲基。在一些实施方式中,提供了式X的THP 核苷，其中R1和R2中的一个是F。在一些实施方式中,R1是氟而R2是 H,R1是甲氧基而R2是H,以及R1是甲氧基乙氧基而R2是H。
如本文所用，"2'-修饰的"或"2'-取代的"是指包含一个在2'位具有一 个除H或OH以外的取代基的糖的核苷。2'-修饰的核苷包括但是不限于具 有非桥2'取代基(例如烯丙基、氨基、叠氮基、硫代、O-烯丙基、O-C1-C10烷基、-OCF3、O-(CH2)2-O-CH3、2'-O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn) 或O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn))的核苷，其中Rm和Rn各自独立地是H或取代的或未取代的C1-C10烷基。2'-修饰的核苷可以进一步包含其它修饰,例 如在糖和/或核酸碱基的其它位置的修饰。
如本文所用，"2'-F"是指在2'位包含一个氟基团的糖。
如本文所用，"2'-OMe"或"2'-OCH3"或"2'-O-甲基"每个是指包含 糖的核苷，所述糖在糖环的2'位包含一个-OCH3基团。
如本文所用，"寡核苷酸"是指包含多个连接的核苷的化合物。
在一些实施方式中,所述多个核苷中的一个或多个被修饰。在一些实 施方式中,寡核苷酸包含一个或多个核糖核苷(RNA)和/或脱氧核糖核苷 (DNA)。
许多其它的双环和三环糖替代物环体系也是本领域中已知的，其能够 被用来修饰用于掺入反义化合物中的核苷(参见例如综述文章:Leumann, J.C,Bioorganic andMedicinal Chemistry,2002,10,841-854)。这样的环体 系能够经历各种额外的取代以增强活性。制备修饰的糖的方法是本领域技 术人员熟知的。在具有修饰的糖部分的核苷中，保持了核酸碱基部分(天然 的、修饰的或其组合)，以便于与合适的核酸靶杂交。
在一些实施方式中,反义化合物包含一个或多个具有修饰的糖部分的 核苷酸。在一些实施方式中,所述修饰的糖部分是2'-MOE。在一些实施方 式中,2'-MOE修饰的核苷酸被安置在一个间隙体基序中。在一些实施方 式中,所述修饰的糖部分是cEt。在一些实施方式中,所述cEt修饰的核苷 酸被安置使其贯穿在一个间隙体基序的翼中。
在一些实施方式中,在LNA中,R4*和R2*一起代表R或S构型的双 基–O-CH(CH2OCH3)-(2’O-甲氧基乙基双环核酸-Seth等人,2010,J.Org. Chem)。
在一些实施方式中,在LNA中,R4*和R2*一起代表R或S构型的双基 –O-CH(CH2CH3)-(2’O-乙基双环核酸-Seth等人,2010,J.Org.Chem)。
在一些实施方式中,在LNA中,R4*和R2*一起代表R或S构型的双基 -O-CH(CH3)-。在一些实施方式中,R4*和R2*一起代表双基 -O-CH2-O-CH2--(Seth等人,2010,J.Org.Chem)。
在一些实施方式中,在LNA中,R4*和R2*一起代表双基 -O-NR-CH3--(Seth等人,2010,J.Org.Chem)。
在一些实施方式中,所述LNA单元具有选自下列基团的结构:
Figure BDA0002614551260000361
在所述寡聚体中掺入增强亲和性的核苷酸类似物，例如LNA或2’-取 代的糖能够允许减小特异性地结合的寡聚体的尺寸，并且也可以在发生非 特异性的或反常的结合之前减小寡聚体尺寸的上限。
我们已经评价了cET化合物的肾毒性(使用(S)-cET，用所述序列 (WO2009/12495的化合物识别号6/411847)和比较性β-D-氧基LNA化合物 (WO2009/12495的6/392063)，并且发现与所述的β-D-氧基LNA对照相比，cET化合物出人意料地引发高的肾毒性。该研究是一个单剂量研究，三天 后杀死(方法学参见EP1984381实施例41,但是我们使用了NMRI小鼠)。 通过组织分析证实了肾毒性。我们在低于记录到血清ALT时的那些剂量 的cET化合物剂量下看到的显著的肾毒性迹象，表明对于cET化合物,肾 毒性可能是一个特别的问题。因此，使用本发明的缀合物，例如三价的 GalNAc缀合物在减少LNA化合物，例如cET化合物的肾毒性方面是高 度有用的。
在一些实施方式中,所述的寡聚体包含至少一个核苷类似物。在一些实 施方式中，所述的寡聚体包含至少两个核苷类似物。在一些实施方式中,所 述的寡聚体包含3-8个核苷类似物,例如6或7个核苷酸类似物。在迄今 为止最优选的实施方式中，至少一个所述的核苷酸类似物是锁定核酸 (LNA)；例如至少3个或至少4个,或至少5个,或至少6个,或至少7个, 或8个所述的核苷酸类似物可以是LNA。在一些实施方式中，所有的核苷 酸类似物可以是LNA。
将会认识到，当提及只由核苷酸组成的优选的核苷酸序列基序或核苷 酸序列时，由该序列定义的本发明的寡聚体可以包含一个相应的核苷酸类 似物，代替存在于所说序列中的一个或多个核苷酸，例如LNA单元或其 它核苷酸类似物，该类似物提高所述寡聚体/靶双链体的双链体稳定性 /Tm(即增强亲和性的核苷酸类似物)。
一种优选的核苷酸类似物是LNA,例如氧基-LNA(例如β-D-氧基 -LNA和α-L-氧基-LNA),和/或氨基-LNA(例如β-D-氨基-LNA和α-L-氨 基-LNA)和/或硫代-LNA(例如β-D-硫代-LNA和α-L-硫代-LNA)和/或 ENA(例如β-D-ENA和α-L-ENA)。
在一些实施方式中,本发明的寡聚体,例如A区,可以包含LNA单元 和其它核苷酸类似物。存在于本发明的寡聚体中的另外的核苷酸类似物独 立地选自,例如:2’-O-烷基-RNA单元、2’-氨基-DNA单元、2’-氟-DNA单 元、LNA单元、阿拉伯糖核酸(ANA)单元、2’-氟-ANA单元、HNA单元、 INA(嵌入核酸-Christensen,2002.Nucl.Acids.Res.2002 30:4918-4925,在 此通过参考文献引入)单元和2’MOE单元。在一些实施方式中，只有一种 上述类型的核苷酸类似物存在于本发明的寡聚体中,例如第一区或其毗连 的核苷酸序列。
在一些实施方式中,根据本发明所述的寡聚体(A区)因此可以包含至 少一个锁定核酸(LNA)单元,例如1、2、3、4、5、6、7或8个LNA单元, 例如3–7个或4-8个LNA单元,或3、4、5、6或7个LNA单元。在一 些实施方式中,所有的核苷酸类似物都是LNA。在一些实施方式中,所述 的寡聚体既可以包含β-D-氧基-LNA，也可以包含一个或多个下列LNA单 元:硫代-LNA、氨基-LNA、氧基-LNA和/或ENA，呈β-D或α-L构型或 其组合。在一些实施方式中，所有的LNA的胞嘧啶单元都是5’甲基-胞嘧 啶。在本发明的一些实施方式中,所述的寡聚体(例如第一区和任选的第二 区)可以包含LNA和DNA单元两者。在一些实施方式中,合并的LNA和 DNA单元的总数是10-25个,例如10–24个,优选10-20个,例如10–18个, 例如12-16个。在本发明的一些实施方式中,所述寡聚体的核苷酸序列、或 其第一区(例如毗连的核苷酸序列)由至少一个LNA组成并且其余的核苷 酸单元是DNA单元。在一些实施方式中，所述的寡聚体或其第一区仅仅 包含LNA、核苷酸类似物和天然存在的核苷酸(例如RNA或DNA,最优 选DNA核苷酸),任选地带有修饰的核苷酸间连接例如硫代磷酸酯。
RNA酶募集
认识到一种寡聚体化合物可以经由非RNA酶介导的靶标mRNA的降 解,例如通过翻译的空间位阻或其它方法而发挥作用,在一些实施方式中, 本发明的寡聚体能够募集内切核糖核酸酶(RNA酶),例如RNA酶H。
优选这样的寡聚体,例如A区或毗连的核苷酸序列,由一个至少4个, 例如至少5个,例如至少6个,例如至少7个连续的核苷酸单元,例如至少 8或至少9个连续的核苷酸单元(残基),包括7、8、9、10、11、12、13、 14、15或16个连续的核苷酸的区构成,当使这些连续的核苷酸与一个互补 的靶RNA形成双链体时，能够募集RNA酶(例如DNA单元)。所述能够 募集RNA酶的毗连的序列可以是本文所述的在间隙体的上下文中被提及 的Y’区。在一些实施方式中，所述的能够募集RNA酶的毗连序列(例如Y’ 区)的尺寸可以更高,例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或 20个核苷酸单元。
EP 1 222 309提供了体外测定RNA酶H活性的方法,该方法可以被 用来测定募集RNA酶H的能力。如果一种寡聚体，当给它提供互补的 RNA靶时，(采用EP 1 222 309的实施例91-95所提供的方法)具有以 pmol/l/分钟测量的占使用具有相同的碱基序列但是仅仅含有DNA单体， 没有2’取代，在所述寡核苷酸中的所有单体之间具有硫代磷酸酯连接基团的只有DNA的寡核苷酸所测定的初始速率的至少1％,例如至少5％,例 如至少10％或高于20％的初始速率时，它被认为能够募集RNA酶H。
在一些实施方式中,如果一种寡聚体，当给它提供互补的RNA靶和 RNA酶H，采用EP1 222 309的实施例91-95所提供的方法，以pmol/l/ 分钟计量的RNA酶H初始速率，少于使用只有等价的DNA，没有2’取代， 在所述寡核苷酸中的所有核苷酸之间具有硫代磷酸酯连接基团的寡核苷 酸所测定的初始速率的1％,例如少于5％,例如少于10％或少于20％ 时，它被认为基本上不能募集RNA酶H。
在其它实施方式中,如果一种寡聚体，当给它提供互补的RNA靶和 RNA酶H，采用EP1 222 309的实施例91-95所提供的方法，以pmol/l/ 分钟计量的RNA酶H初始速率，占使用只有等价的DNA，没有2’取代， 在所述寡核苷酸中的所有核苷酸之间具有硫代磷酸酯连接基团的寡核苷 酸所测定的初始速率的至少20％,例如至少40％,例如至少60％,例如至 少80％时，它被认为能够募集RNA酶H。
典型地，形成所述连续的核苷酸单元的所述寡聚体区,当使该区与所 述互补的靶RNA形成双链体时，它能够募集由核苷酸单元组成的RNA酶， 这些核苷酸单元与所述RNA靶形成一种DNA/RNA样的双链体。本发明 的寡聚体,例如第一区,可以包含一个包含核苷酸和核苷酸类似物两者的 核苷酸序列，并且可以例如呈一种间隙体形式。
间隙体设计
在一些实施方式中,本发明的寡聚体,例如第一区包含或者是一种间 隙体。间隙体寡聚体是一种寡聚体，它包含一个能够募集RNA酶(例如 RNA酶H)的毗连的核苷酸序列,例如一个至少6或7个DNA核苷酸的区, 在此称为Y’区(Y’),其中Y’区的5’和3’侧翼是增强亲和性的核苷酸类似物 区，例如能够募集RNA酶的毗连的核苷酸序列的5’和3’端的1-6个核苷 酸的类似物–这些区分别被称为X’区(X’)和Z’区(Z’)。这些X’和Z’区也 可以被称为所述间隙体的翼。间隙体的例子被公开在WO2004/046160、 WO2008/113832和WO2007/146511中。
在一些实施方式中,所述的能够募集RNA酶的单体选自由下列组成 的组:DNA单体、α-L-LNA单体、C4’烷基化的DNA单体(参见 PCT/EP2009/050349和Vester等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.18(2008) 2296-2300,并入本文作为参考)和UNA(锁定核酸)核苷酸(参见Fluiter等 人,Mol.Biosyst.,2009,10,1039并入本文作为参考)。UNA是锁定核酸,典 型地，其中核糖的C2-C3的C-C键已经被除去了,形成一个开锁的“糖” 残基。优选地，所述间隙体包含一个下式的(多)核苷酸序列(5’-3’):X’-Y’-Z’, 其中X’区(X’)(5’区)组成为或包含:至少一个核苷酸类似物,例如至少一 个LNA单元,例如1-6个核苷酸类似物,例如LNA单元,并且Y’区(Y’) 由下列组成或包含:能够募集RNA酶的至少4个或至少5个连续的核苷酸, 例如DNA核苷酸(当这些核苷酸与一个互补的RNA分子(例如mRNA靶) 形成一个双链体时),而Z’区(Z’)(3’区)由下列组成或包含:至少一个核 苷酸类似物,例如至少一个LNA单元,例如1-6个核苷酸类似物,例如 LNA单元。
在一些实施方式中,X’区由下列组成:1、2、3、4、5或6个核苷酸类 似物,例如LNA单元,例如2-5个核苷酸类似物,例如2-5个LNA单元, 例如3或4个核苷酸类似物,例如3或4个LNA单元；和/或Z区由下列 组成:1、2、3、4、5或6个核苷酸类似物,例如LNA单元,例如2-5个核 苷酸类似物,例如2-5个LNA单元,例如3或4个核苷酸类似物,例如3 或4个LNA单元。
在一些实施方式中，Y’由下列组成或包含:能够募集RNA酶的4、5、 6、7、8、9、10、11或12个连续的核苷酸,或能够募集RNA酶的4-12 个或6-10个或7-9个,例如8个连续的核苷酸。在一些实施方式中，Y’区 组成为或包含至少一个DNA核苷酸单元,例如1-12个DNA单元,优选地， 4-12个DNA单元,更优选地，6-10个DNA单元,例如7-10个DNA单元, 最优选地，8、9或10个DNA单元。
在一些实施方式中，X’区由3或4个核苷酸类似物(例如LNA)组成,X’ 区由7、8、9或10个DNA单元组成,并且Z’区由3或4个核苷酸类似物 (例如LNA)组成。这样的设计包括(X’-Y’-Z’)3-10-3、3-10-4、4-10-3、3-9-3、 3-9-4、4-9-3、3-8-3、3-8-4、4-8-3、3-7-3、3-7-4、4-7-3。在一种优选的实 施方式中，所述的间隙体是一种3-9-4间隙体,甚至更优选地，它是一种 3-10-3间隙体。
在WO2004/046160中公开了另外的间隙体设计,在此并入本文作为参 考。WO2008/113832(它要求享受美国临时申请60/977,409的优先权，并 入本文作为参考)涉及‘短聚体’间隙体寡聚体。在一些实施方式中,这里呈 现的寡聚体可以是这样的短聚体间隙体。
在一些实施方式中，所述的寡聚体(例如X’区)由总共10、11、12、13 或14个核苷酸单元的毗连的核苷酸序列组成，其中所述毗连的核苷酸序列 包含或者具有下式(5’–3’):X’-Y’-Z’，其中X’由1、2或3个核苷酸类似物 单元(例如LNA单元)组成；Y’由7、8或9个毗连的核苷酸单元组成，当使 这些核苷酸单元与一个互补的RNA分子(例如一个mRNA靶)形成一个双 链体时，它们能够募集RNA酶；而Z’由1、2或3个核苷酸类似物单元(例 如LNA单元)组成。
在一些实施方式中，X’由1个LNA单元组成。在一些实施方式中， X’由2个LNA单元组成。在一些实施方式中，X’由3个LNA单元组成。 在一些实施方式中，Z’由1个LNA单元组成。在一些实施方式中，Z’由2 个LNA单元组成。在一些实施方式中，Z’由3个LNA单元组成。在一些 实施方式中，Y’由7个核苷酸单元组成。在一些实施方式中，Y’由8个核 苷酸单元组成。在一些实施方式中，Y’由9个核苷酸单元组成。在某些实 施方式中,Y’区由10个核苷单体组成。在某些实施方式中,Y’区由1-10个 DNA单体组成或构成。在一些实施方式中，Y’由1-9个DNA单元构成,例 如由2、3、4、5、6、7、8或9个DNA单元构成。在一些实施方式中，Y’ 由DNA单元组成。在一些实施方式中，Y’由至少一个呈α-L构型的LNA 单元构成，例如由2、3、4、5、6、7、8或9个呈α-L构型的LNA单元 构成。在一些实施方式中，Y’由至少一个α-L-氧基LNA单元构成或者其 中所有呈α-L-构型的LNA单元都是α-L-氧基LNA单元。在一些实施方式中，存在于X’-Y’-Z’中的核苷酸数目选自由下列组成的组(核苷酸类似物单 元-Y’区–核苷酸类似物单元):1-8-1、1-8-2、2-8-1、2-8-2、3-8-3、2-8-3、 3-8-2、4-8-1、4-8-2、1-8-4、2-8-4或1-9-1、1-9-2、2-9-1、2-9-2、2-9-3、 3-9-2、1-9-3、3-9-1、4-9-1、1-9-4或1-10-1、1-10-2、2-10-1、2-10-2、1-10-3、 3-10-1、2-10-3、3-10-2。在一些实施方式中，X’-Y’-Z’中的核苷酸数目选 自由下列组成的组:2-7-1、1-7-2、2-7-2、3-7-3、2-7-3、3-7-2、3-7-4和4-7-3。 在某些实施方式中,X’区和Y’区各自由3个LNA单体组成,并且Y’区由8 或9或10个核苷单体(优选地,DNA单体)组成。在一些实施方式中，X’和 Z’两者每个都由2个LNA单元组成,而Y’由8或9个核苷酸单元(优选地, DNA单元)组成。在多种实施方式中,其它间隙体设计包括其中X’区和/或 Z’区由3、4、5或6个核苷类似物(例如含有一个2’-O-甲氧基乙基-核糖(2’-MOE)的单体或含有一个2’-氟-脱氧核糖的单体)组成,并且Y’区由8、9、 10、11或12个核苷(例如DNA单体)组成,其中X’-Y’-Z’区具有3-9-3、 3-10-3、5-10-5或4-12-4个单体的那些间隙体设计。另外的间隙体设计被 公开在WO2007/146511A2中,将其并入本文作为参考。
LNA间隙体:LNA间隙体是一种包含至少一个LNA核苷酸的间隙 体寡聚体(A区)。SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8和40是LNA间 隙体寡聚体。所述具有一个与SEQ ID NO:33或34或45的相应长度互补 的10–16个寡聚体的毗连序列的寡聚体也可以是间隙体寡聚体，例如LNA 间隙体。
核苷酸间连接
本文所描述的所述寡聚体(例如第一和第二区)的核苷单体经由核苷间 连接基团被偶联在一起。合适地,经由一个连接基团把每个单体连接到3’ 端邻近的单体。
本领域技术人员将会懂得,在本发明的上下文中,在寡聚体末端的5’ 单体并不包含5’连接基团,但是它可以或不可以包含5’端基团或者用于缀 合的连接基团。
术语"连接基团"或“核苷酸间连接”意指能够把两个核苷酸共价偶 联在一起的基团。特定的并且优选的实例包括磷酸酯基团和硫代磷酸酯基 团。可以把核苷间连接与核苷酸间连接互换使用。
经由连接基团把本发明所述的寡聚体的核苷酸或其毗连的核苷酸序列 偶联在一起。合适地，经由一个连接基团把每个核苷酸连接到3’端邻近的 核苷酸。
合适的核苷酸间连接包括在WO2007/031091中列举的那些,例如在 WO2007/031091(并入本文作为参考)的第34页第一段中列举的核苷酸间连 接。在一些实施方式中,除了B区(当存在时)的磷酸二酯连接,优选把所述 的核苷酸间连接从它正常的磷酸二酯修饰成更能抵抗核酸酶进攻的核苷 酸间连接，例如硫代磷酸酯或硼烷基磷酸酯–这两种是能够被RNA酶H切 除的,在减少靶基因表达方面也允许那种反义抑制途径。
在一些实施方式中，本发明所述的寡聚体包含一个或多个选自由下列 组成的组的核苷连接:硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和硼烷基磷酸酯。
这里所提供的合适的含硫(S)的核苷酸间连接可以是优选的,例如硫代 磷酸酯或二硫代磷酸酯。硫代磷酸酯核苷酸间连接也是优选的,特别是对 于第一区来说,例如间隙体、混合体、antimirs剪接开关寡聚体和全聚体。
术语‘混合体’是指包含天然和非天然存在的核苷酸两者的寡聚体,与 间隙体、尾聚体和头聚体相对，在混合体中没有多于5个毗连的，并且在 一些实施方式中,没有多于4个连续的(例如没有多于3个连续的)天然存在 的核苷酸,例如DNA单元.
术语“全聚体”是指只包含非天然存在的核苷(例如糖修饰的核苷类似 物)的单链寡聚体。
对于间隙体来说,在所述寡聚体中的核苷酸间连接例如可以是硫代磷 酸酯或硼烷基磷酸酯，以便允许RNA酶H切割靶RNA。硫代磷酸酯是优 选的,因为其改善的抗核酸酶性和其它原因,例如易于生产。
在一个方面中,除了在所述第一和第二区之间的以及任选地在B区内 部的磷酸二酯连接以外，本发明所述寡聚体、核苷酸和/或核苷酸类似物的 其余核苷间连接彼此之间是借助于硫代磷酸酯基团连接的。在一些实施方 式中,在第一区中至少50％,例如至少70％,例如至少80％,例如至少 90％，例如所有的核苷间连接不是磷酸二酯(磷酸酯),例如选自由下列组成 的组:硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或硼烷基磷酸酯。在一些实施方式中,在第一区中至少50％,例如至少70％,例如至少80％,例如至少90％，例如 所有的核苷间连接是硫代磷酸酯。
WO09124238涉及寡聚体化合物，它们具有至少一个通过一种中性的 核苷间连接而连接到3'或5'端的双环核苷。因此，本发明的寡聚体可以具 有至少一个通过一种中性的核苷间连接(例如一个或更多个磷酸三酯、甲基 膦酸酯、MMI、酰胺-3、甲缩醛或硫代甲缩醛)连接到3'或5'端的双环核苷。 其余的连接可以是硫代磷酸酯。
寡聚体缀合物(C区)
本发明的另一个方面是一种包含本发明的寡聚体和至少一个与所述寡 聚体(A)共价连接的非核苷酸或非多核苷酸部分(C)的反义寡核苷酸缀合物, 所述共价连接任选地经由一个位于所述寡聚体的毗连序列和缀合部分(B 和/或Y)之间的接头区。
可以与寡核苷酸一起使用的代表性的缀合部分可以包括亲脂性的分子 (芳香和非芳香的)，包括甾族分子；蛋白质(例如抗体、酶、血清蛋白质)； 肽；维生素(水溶性的或脂溶性的)；聚合物(水溶性的或脂溶性的)；小分子， 包括药物、毒素、报道分子和受体配体；碳水化合物络合物；核酸切割络合 物；金属螯合剂(例如卟啉、得克萨菲啉(texaphyrins)、冠醚等)；嵌入剂， 包括光核酸酶/嵌入剂杂交体；交联剂(例如光活性的、氧化还原活性的)及 其组合和衍生物。例如在WO 93/07883和美国专利号6,395,492(将它们各 自完整并入本文作为参考)中提供了许许多多合适的缀合部分、它们的制备 以及与寡聚体化合物的连接。寡核苷酸缀合物及其合成也被报道在综合性 的综述中:Manoharan,Antisense DrugTechnology,Principles,Strategies, and Applications,S.T.Crooke,ed.,Ch.16,Marcel Dekker,Inc.,2001和 Manoharan,Antisense and Nucleic Acid DrugDevelopment,2002,12,103, 将它们各自完整并入本文作为参考。
在一些实施方式中，本发明所述的寡聚体被靶向肝脏-即在系统性给药 后，所述的化合物蓄积在肝脏细胞(例如肝细胞)中。通过添加一种缀合部 分(C)能够极大地增强靶向肝脏。然而，为了使所述寡聚体的效力最大化， 使所述缀合物(或靶向部分)经由一个可生物切除的接头(B)(例如一个核苷 酸磷酸酯接头)连接到所述寡聚体常常是理想的。因此，理想的是使用一种 增强肝细胞中的摄取和活性的缀合部分。活性的增强可能是由于增强的摄 取或者可能是由于所述化合物在肝细胞中增强的潜能。
在一些实施方式中,所述寡聚体化合物是一种LNA寡聚体,例如一种 间隙体,或者例如是一种LNA反义寡聚体(它在这里可以被称为A区)，它 包含反义寡聚体,任选地包含可生物切除的接头(例如B区)以及碳水化合物 缀合物(它可以被称为C区)。所述的LNA反义寡聚体长度可以是7–30个, 例如8–26个核苷并且它包含至少一个LNA单元(核苷)。
在一些实施方式中,所述的缀合物是或者可以包含碳水化合物或者包 含碳水化合物基团。在一些实施方式中,所述的碳水化合物选自由下列组 成的组:半乳糖、乳糖、N-乙酰基半乳糖胺、甘露糖和甘露糖-6-磷酸。在 一些实施方式中,所述的缀合基团是或者可以包含甘露糖或甘露糖-6-磷 酸。碳水化合物缀合物可以被用来增强在一系列组织(例如肝脏和/或肌肉) 中的输送或活性。参见例如EP1495769、WO99/65925、Yang等人,Bioconjug Chem(2009)20(2):213-21.Zatsepin&Oretskaya Chem Biodivers.(2004)1(10):1401-17。
在一些实施方式中，所述的碳水化合物部分不是一种线性的碳水化合 物聚合物。在一些实施方式中,所述的寡聚体化合物是一种LNA寡聚体, 例如一种LNA反义寡聚体(在这里它可以被称为A区)，它包含一个反义寡 聚体、如本文所定义的B区以及一个靶向脱唾液酸糖蛋白受体的部分—— 缀合部分，例如一个GalNAc部分(它可以被称为C区)。所述碳水化合物 部分可以是多价的,例如是2、3、4价的或者4个相同或不同的碳水化合 物部分可以被共价连接到所述的寡聚体,任选地经由一个接头或多个接头 (例如Y区)共价连接。
GalNAc缀合部分
在一些实施方式中，所述的碳水化合物部分不是一种线性的碳水化合 物聚合物。然而，所述的碳水化合物部分可以是多价的,例如2、3、4价 的或者4个相同或不同的碳水化合物部分可以被共价连接到所述的寡聚体, 任选地经由一个接头或多个接头共价连接。在一些实施方式中，本发明提 供一种缀合物，它包含本发明所述的寡聚体和一种碳水化合物缀合部分。 在一些实施方式中，本发明提供一种缀合物，它包含本发明所述的寡聚体 和一个靶向脱唾液酸糖蛋白受体的部分——缀合部分(例如一种GalNAc 部分，它可以形成另一个区的一部分(称为C区))。
本发明还提供与靶向脱唾液酸糖蛋白受体的部分缀合的LNA反义寡 核苷酸。在一些实施方式中,所述的缀合部分(例如第三区或C区)包含一 个靶向脱唾液酸糖蛋白受体的部分,例如半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰基-半 乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、N-丙酰基-半乳糖胺、N-正丁酰基-半乳糖胺 和N-异丁酰基半乳糖胺。在一些实施方式中，所述的缀合物包含一个半 乳糖簇,例如N-乙酰基半乳糖胺三聚体。在一些实施方式中,所述的缀合 部分包含GalNAc(N-乙酰基半乳糖胺),例如一价的、二价的、三价的或四 价的GalNAc。三价的GalNAc缀合物可以被用来将所述化合物靶向肝脏。 已经把GalNAc缀合物与甲基膦酸酯和PNA反义寡核苷酸(例如 US5,994517和Hangeland等人,Bioconjug Chem.1995 Nov-Dec；6(6):695-701)以及siRNA一起使用(例如WO2009/126933、 WO2012/089352和WO2012/083046)。将本文所用的这些GalNAc参考文 献以及其中使用的具体缀合物并入本文作为参考。WO2012/083046公开了 带有GalNAc缀合部分的siRNA，它们包含可切除的适用于本发明中的药 效学调节剂，优选的药效学调节剂是C16疏水基团，例如棕榈酰基、十六 碳-8-烯酰基、油酰基、(9E,12E)-十八碳-9,12-二烯酰基、二辛酰基和 C16-C20酰基。该’046的可切除的药效学调节剂也可以是胆固醇。
所述的靶向部分(缀合部分)可以选自由下列组成的组:半乳糖、半乳糖 胺、N-甲酰基-半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、N-丙酰基-半乳糖胺、N-正 丁酰基-半乳糖胺、N-异丁酰基半乳糖胺、半乳糖簇和N-乙酰基半乳糖胺 三聚体并且可以具有一种选自由下列组成的组的药效学调节剂:具有16 或更多个碳原子的疏水基团、具有16-20个碳原子的疏水基团、棕榈酰基、 十六碳-8-烯酰基、油酰基、(9E,12E)-十八碳-9,12-二烯酰基、二辛酰基和C16-C20酰基以及胆固醇。在’46中公开的某些GalNAc簇包括:(E)-十 六碳-8-烯酰基(C16)、油酰基(C18)、(9,E,12E)-十八碳-9,12-二烯酰基(C18)、 辛酰基(C8)、十二烷酰基(C12)、C-20酰基、C24酰基、二辛酰基(2xC8)。 可以经由一个生理学上不稳定的键或例如二硫键或PEG接头，把所述的 靶向部分-药效学调节剂靶向部分连接到所述的多核苷酸。本发明也涉及磷 酸二酯接头在所述寡聚体和所述缀合基团之间(在这里，这些接头被称作B区,并且合适地位于所述LNA寡聚体与所述碳水化合物缀合基团之间)的 用途。
为了靶向肝脏中的肝细胞,一种优选的靶向配体是半乳糖簇。
半乳糖簇包含一个具有(例如包含)2-4个末端半乳糖衍生物的分子。这 里使用的术语半乳糖衍生物包括半乳糖和半乳糖的衍生物两者，该半乳糖 的衍生物对脱唾液酸糖蛋白受体的亲和性等于或大于半乳糖对脱唾液酸 糖蛋白受体的亲和性。末端半乳糖衍生物是通过它的C-l碳原子被连接到 分子上的。所述的脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPr)最初在肝细胞上被表达并 且与支链半乳糖-末端的糖蛋白质结合。一种优选的半乳糖簇具有3个末端 半乳糖胺或半乳糖胺衍生物，每个对脱唾液酸糖蛋白受体都具有亲和性。 一种更优选的半乳糖簇具有3个末端N-乙酰基-半乳糖胺。本领域中常见 的其它术语包括三-天线半乳糖、三价的半乳糖和半乳糖三聚体。已知三- 天线半乳糖衍生物簇以比二-天线或单-天线半乳糖衍生物结构更大的亲和 性与所述的ASGPr结合(Baenziger和Fiete,1980,Cell,22,611-620； Connolly等人,1982,1.Biol.Chern.,257,939-945)。需要多价来达到nM 级的亲和性。根据WO2012/083046，连接对所述的脱唾液酸糖蛋白受体具 有亲和性的单个半乳糖衍生物并不能够使得当与所述的输送聚合物共同 给药时，将RNAi多核苷酸的功能输送到体内的肝细胞。
半乳糖簇可以包含2个或优选地3个半乳糖衍生物，每个都被连接到 一个中心分支点。通过所述糖的C-l碳原子将所述的半乳糖衍生物连接到 所述的中心分支点。优选地，经由接头或间隔区把所述的半乳糖衍生物连 接到所述的分支点。优选的间隔区是一种柔性的亲水性的间隔区(美国专利 5885968；Biessen等人.J.Med.Chem.1995Vol.39p.1538-1546)。一种优选 的柔性的亲水性的间隔区是PEG间隔区。优选的PEG间隔区是PEG3间 隔区。所述的分支点可以是允许连接所述3个半乳糖衍生物并且进一步允 许将所述分支点连接到所述寡聚体的任何小分子。一个示例性的分支点基 团是二赖氨酸。二赖氨酸分子包含3个胺基和一个羧基反应性基团，通过 这3个胺基可以连接3个半乳糖衍生物，通过该羧基反应性基团可以把所 述的二赖氨酸连接到所述的寡聚体。所述分支点与寡聚体的连接可以通过 一个接头或间隔区来发生。一种优选的间隔区是一种柔性的亲水性的间隔 区。一种优选的柔性的亲水性的间隔区是一种PEG间隔区。一种优选的 PEG间隔区是一种PEG3间隔区(3个亚乙基单元)。使用本领域中已知的 方法可以把所述的半乳糖簇连接到所述寡聚体的3'或5'端。
一种优选的半乳糖衍生物是N-乙酰基-半乳糖胺(GalNAc)。其它的对 脱唾液酸糖蛋白受体具有亲和性的糖可以选自包含下列的列表:半乳糖 胺、N-正丁酰基半乳糖胺和N-异丁酰基半乳糖胺。许许多多半乳糖衍生物 对脱唾液酸糖蛋白受体的亲和性已经被研究了(参见例如:Jobst,S.T.和Drickamer,K.JB.C.1996,271,6686)或者使用本领域中典型的方法很容易 被测定。
Figure BDA0002614551260000491
半乳糖簇的一个实施方案
Figure BDA0002614551260000492
在分支点和核酸之间具有PEG间隔区的半乳糖簇
下面举例说明了本发明所述的缀合物的另外的实例:
Figure BDA0002614551260000501
Figure BDA0002614551260000511
其中当使用LNA寡聚体(例如LNA反义寡核苷酸)时，在上述GalNAc 簇中，在疏水性的或亲脂的(或另外的缀合物)部分(即药效学调节剂)处，缀 合物是任选的。
参见关于在本研究中使用的具体GalNAc簇的图、Conj1、2、3、4以 及Conj1a、2a、3a和4a(显示它们任选地带有一个把所述GalNAc簇连接 到所述寡聚体的C6接头)。
在本发明的一种优选的实施方式中，所述的反义寡核苷酸缀合物的缀 合部分包含Conj1、2、3、4以及Conj1a、2a、3a和4a或由它们组成。 最优选地，所述的缀合部分包含Conj2a或由它组成。
在另一个优选的实施方式中，所述的反义寡核苷酸缀合物选自由下列 组成的组:SEQ ID NO:17、18、19、20、21、22、23和24。
因此，可以经由一个间隔区,例如(聚)乙二醇接头(PEG),例如一个二、 三、四、五、六-乙二醇接头，把GalNAc簇(例如GalNAc)的每个碳水化 合物部分连接到所述寡聚体。正如上面所示，所述PEG部分在所述半乳 糖的糖部分和一个肽(显示了三赖氨酸)接头之间形成一个间隔区。
在一些实施方式中,所述的GalNAc簇包含一个肽接头,例如 Tyr-Asp(Asp)三肽或Asp(Asp)二肽,该肽接头经由一个双基接头被连接 到所述寡聚体(或连接到Y区或B区),例如所述的GalNAc簇可以包含下 列双基接头:
Figure BDA0002614551260000521
R1是一种优选地选自下列的双基:-C2H4-、-C3H6-、-C4H8-、-C5H10-、 -C6H12-、1,4-环己基(-C6H10-)、1,4-苯基(-C6H4-)、-C2H4OC2H4-、 -C2H4(OC2H4)2-或-C2H4(OC2H4)3-、C(O)CH2-、-C(O)C2H4-、-C(O)C3H6-、 -C(O)C4H8-、-C(O)C5H10-、-C(O)C6H12-、1,4-环己基(-C(O)C6H10-)、1,4- 苯基(-C(O)C6H4-)、-C(O)C2H4OC2H4-、-C(O)C2H4(OC2H4)2-或 -C(O)C2H4(OC2H4)3-。
在一些实施方式中,R1是一种优选地选自下列的双基:-C2H4-、-C3H6-、 -C4H8-、-C5H10-、-C6H12-、1,4-环己基(-C6H10-)、1,4-苯基(-C6H4-)、 -C2H4OC2H4-、-C2H4(OC2H4)2-或-C2H4(OC2H4)3-。
可以经由一个分支点基团，例如一个氨基酸或肽，把所述的碳水化合 物缀合物(例如GalNAc)或碳水化合物-接头部分(例如碳水化合物-PEG部 分)共价连接到所述的寡聚体,所述的肽合适地包含两个或更多个氨基基 团(例如3、4或5个),例如赖氨酸、二赖氨酸或三赖氨酸或四赖氨酸。三 赖氨酸包含4个胺基和一个羧基反应性基团，通过这4个胺基可以把3个 碳水化合物缀合基团(例如半乳糖及其衍生物(例如GalNAc))和另外一个缀 合物(例如一个疏水性的或亲脂的部分/基团)连接起来，通过该羧基反应性 基团可以把所述的三赖氨酸连接到所述的寡聚体。可以把所述的另外的缀 合物(例如亲脂性/疏水性部分)连接到与所述寡聚体相连的赖氨酸残基上。
出人意料地，本发明人已经发现:与LNA寡聚体一起使用的GalNAc 缀合物并不需要药效学调节剂(如下所述)，因此,在一些实施方式中,所述 的GalNAc缀合物没有被连接到亲脂的或疏水性的部分(例如本文所描述 的那些部分)上，例如它们不包含C8–C36脂肪酸或甾醇。因此，本发明也 为LNA寡聚体提供了不包含亲脂的或疏水性的药效学调节剂或缀合部分/ 基团的GalNAc缀合物。
药效学调节剂
本发明的化合物可以进一步包含一个或多个额外的缀合部分,其中亲 脂的或疏水性的部分是特别有趣的,例如当所述缀合基团是一种碳水化合 物部分时。这样的亲脂的或疏水性的部分可以起到药效学调节剂的作用, 并且可以任选地经由一种接头(例如一个可生物切除的接头)，被共价连接 到所述的碳水化合物缀合物、将碳水化合物缀合物连接到所述寡聚体的接 头或将多重的碳水化合物缀合物(多价的)缀合物连接到所述寡聚体的接 头。
所述的寡聚体或缀合部分因此可以包含一种药效学调节剂,例如亲脂 的或疏水性的部分。在WO2012/082046中在siRNA缀合物的上下文中公 开了这样的部分。所述的疏水性的部分可以包含一个C8-C36脂肪酸,该脂 肪酸可以是饱和或不饱和的。在一些实施方式中,可以使用C10、C12、 C14、C16、C18、C20、C22、C24、C26、C28、C30、C32和C34脂肪 酸。所述的疏水基团可以具有16或更多个碳原子。示例性的合适的疏水基 团可以选自由下列组成的组:甾醇、胆固醇、棕榈酰基、十六碳-8-烯酰基、 油酰基、(9E,12E)-十八碳-9,12-二烯酰基、二辛酰基和C16-C20酰基。根 据WO’346,具有少于16个碳原子的疏水基团在增强多核苷酸的靶向方面 效力较低，但是可以以多拷贝(例如2倍,例如2倍的C8或C10、C12或 C14)使用它们以增强效力。可用作靶向多核苷酸的部分的药效学调节剂可 以选自由下列组成的组:胆固醇、烷基、链烯基、炔基、芳基、芳烷基、 芳基链烯基和芳基炔基,它们中的每一个都可以是直链的、支链的或环状 的。药效学调节剂优选地是只含有碳原子和氢原子的烃。然而，可以允许 保持疏水性的取代或杂原子。
亲脂的缀合物
在一些实施方式中,所述的缀合基团是或者可以包含一个亲脂的部分, 例如一种甾醇(例如胆固醇、胆固醇基、胆甾烷醇、豆甾醇、胆甾烷酸和麦 角甾醇)。在一些实施方式中，所述的缀合物是或者包含生育酚(例如在图2 中以Conj 6和Conj 6a示例的)。在一些实施方式中,所述的缀合物是或 者可以包含胆固醇(例如在图2中以Conj5和Conj 5a示例的那样)。
在一些实施方式中,所述的缀合物是或者可以包含一种脂质、一种磷 脂或一种亲脂的醇,例如一种阳离子脂质、一种中性的脂质、鞘脂和脂肪 酸，例如硬脂酸、油酸、反油酸、亚油酸、反亚油酸、亚麻酸和肉豆蔻酸。 在一些实施方式中，所述脂肪酸包含一个C4–C30饱和的或不饱和的烷基 链。该烷基可以是直链的或支链的。
例如可以使用亲脂的缀合部分来平衡一种寡聚体化合物的亲水性并且 增强细胞渗透性。
亲脂的部分包括例如甾醇、甾烷醇和类固醇以及相关的化合物，例如 胆固醇(美国专利号4,958,013和Letsinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1989,86,6553)、硫代胆固醇(Oberhauser等人,Nucl Acids Res.,1992,20, 533)、羊毛甾醇、粪甾醇、豆甾醇、麦角甾醇、钙化醇、胆汁酸、脱氧胆 汁酸、雌酮、雌二醇、雌三醇、孕酮、己烯雌酚、睾酮、雄酮、脱氧皮质 酮、可的松、17-羟基皮质酮、它们的衍生物及类似物。在一些实施方式中, 所述的缀合物可以选自由下列组成的组:胆固醇、硫代胆固醇、羊毛甾醇、 粪甾醇、豆甾醇、麦角甾醇、钙化醇、胆汁酸、脱氧胆汁酸、雌酮、雌二 醇、雌三醇、孕酮、己烯雌酚、睾酮、雄酮、脱氧皮质酮、可的松、17- 羟基皮质酮。其它亲脂的缀合部分包括脂族基团,例如直链的、支链的和 环状的烷基、链烯基和炔基。所述的脂族基团可以具有例如5至大约50、 6至大约50、8至大约50、或10至大约50个碳原子。脂族基团的例子包 括十一烷基、十二烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、萜 烯、冰片基、金刚烷基、其衍生物和类似物。在一些实施方式中,所述脂 族基团中的一个或更多个碳原子可以被一个杂原子(例如O、S或N)替换， 例如忙牛儿基氧基己基。另外的合适的亲脂的缀合部分包括甘油的脂族衍 生物，例如烷基甘油、二(烷基)甘油、三(烷基)甘油、甘油单酯、甘油二酯 和甘油三酯。在一些实施方式中,所述的亲脂的缀合物是二-己基癸基-外消 旋甘油或1,2-二-O-己基癸基-外消旋甘油(Manoharan等人,Tetrahedron Lett.,1995,36,3651；Shea,等人,Nuc.Acids Res.,1990,18,3777)或其膦酸 酯。饱和的和不饱和的脂肪官能团,例如脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯和脂肪胺也可以充当亲脂的缀合部分。在一些实施方式中,脂肪官能团可以包含 大约6个至大约30个碳原子或大约8个至大约22个碳原子。脂肪酸的例 子包括癸酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、 亚麻酸、花生四烯酸、二十碳烯酸及其类似物。
在另外的实施方式中，亲脂的缀合基团可以是具有6至大约50个、10 至大约50个或14至大约40个碳原子的多环芳族基团。多环芳族基团的例 子包括芘、嘌呤、吖啶、呫吨、芴、菲、蒽、喹啉、异喹啉、萘、其衍生 物和类似物。其它合适的亲脂的缀合部分包括薄荷醇、三苯甲基(例如二甲 氧基三苯甲基(DMT))、吩
Figure BDA0002614551260000551
嗪、硫辛酸、磷脂、醚、硫醚(例如己基-S-三 苯甲硫醇)、其衍生物和类似物。寡聚体化合物的亲脂性缀合物的制备被很 好地描述在现有技术中，例如被描述在Saison-Behmoaras等人,EMBO J., 1991,10,1111；Kabanov等人,FEBS Lett.,1990,259,327；Svinarchuk等 人,Biochimie,1993,75,49；Mishra等人,Biochim.Biophys.Acta,1995, 1264,229；和Manoharan等人,Tetrahedron Lett.,1995,36,3651中。
含有对低密度脂蛋白(LDL)具有亲和性的缀合部分的寡聚体化合物能 够帮助提供一种有效的靶向的输送体系。肿瘤细胞上LDL受体的高表达 水平使得LDL成为用于将药物选择性地输送到这些细胞的一种有吸引力 的载体(Rump,等人,Bioconjugate Chem.,1998,9,341；Firestone, Bioconjugate Chem.,1994,5,105；Mishra,等人,Biochim.Biophys.Acta, 1995,1264,229)。对LDL具有亲和性的部分包括许多亲脂的基团，例如类 固醇(例如胆固醇)、脂肪酸、其衍生物及其组合。在一些实施方式中,对LDL 具有亲和性的缀合部分可以是胆汁酸(例如鹅脱氧胆汁酸和石胆汁酸)的二 油酰基脂。
在一些实施方式中,所述亲脂的缀合物可以是或者可以包含生物素。 在一些实施方式中,所述亲脂的缀合物可以是或者可以包含一种甘油酯。
亲脂的缀合物,例如甾醇、甾烷醇和染色剂(例如胆固醇),或如这里所 公开的那样，可以被用来增强所述的寡核苷酸向例如肝脏(典型地肝细胞) 的输送。
在本发明的一种优选的实施方式中，所述反义寡核苷酸缀合物的缀合 部分包含或由Conj 5、5a、6或6a组成。最优选地，所述的缀合部分包 含Conj5a或由它组成。
在另一种优选的实施方式中，所述的反义寡核苷酸缀合物选自由下列 组成的组:SEQ ID NO:9、10、11、12、13、14、15、16、41、42和43。
下来参考文献也涉及亲脂的缀合物的用途:Kobylanska等人,Acta Biochim Pol.(1999)；46(3):679-91；Felber等人,.Biomaterials(2012)33(25): 599-65)；Grijalvo等人,J Org Chem(2010)75(20):6806-13；Koufaki等人, Curr Med Chem(2009)16(35):4728-42；Godeau等人，J.Med.Chem. (2008)51(15):4374-6。
接头(例如B区或Y区)
连接或接头是两个原子之间的一种联系，它经由一个或更多个共价键 把一个化学基团或目的片段连接到另一个化学基团或目的片段上。可以直 接地或通过一个连接部分(接头或系链)-接头，把缀合部分(或靶向部分或阻 断部分)连接到寡聚体化合物。接头是用于把第三区(例如一个缀合部分)共 价连接到寡聚体化合物(例如连接到A区)的双官能部分。在一些实施方式 中,所述接头包含一种链状结构或重复单元(例如乙二醇或氨基酸单元)的 一种寡聚体。所述接头可能具有至少两个官能团,一个用于与所述的寡聚 体化合物连接而另一个用于与所述的缀合部分连接。接头官能团的例子可 以是亲电子的，用于与所述寡聚体或缀合部分上的亲核基团反应，或者是 亲核的，用于与亲电子基团反应。在一些实施方式中,接头官能团包括氨 基、羟基、羧酸、硫醇、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、磷酸酯、亚磷酸酯、 不饱和键(例如双键或三键)以及类似物。一些接头的实例包括8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-l-羧酸琥珀酰亚胺基酯 (SMCC)、6-氨基己酸(AHEX或AHA)、6-氨基己基氧基、4-氨基丁酸、4- 氨基环己基羧酸、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-l-羧酸-(6-氨基-己酸琥珀 酰亚胺基酯)(LCSMCC)、间-马来酰亚胺基-苯甲酸琥珀酰亚胺基酯(MBS)、 N-e-马来酰亚胺基-己酰酸琥珀酰亚胺基酯(EMCS)、6-(β-马来酰亚胺基- 丙酰胺基)己酸琥珀酰亚胺基酯(SMPH)、N-(α-马来酰亚胺基乙酸琥珀酰 亚胺基酯)(AMAS)、4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸琥珀酰亚胺基酯 (SMPB)、β-丙氨酸(β-ALA)、苯甘氨酸(PHG)、4-氨基环己酸(ACHC)、 β-(环丙基)丙氨酸(β-CYPR)、氨基十二碳烷酸(ADC)、alylene diol、聚 乙二醇、氨基酸和类似物。
广泛种类的可用于将缀合部分连接到寡聚体化合物的另外的接头基团 是本领域已知的。关于许多有用的接头基团的综述可以在例如Antisense Research andApplications,S.T.Crooke和B.Lebleu,Eds.,CRC Press, Boca Raton,Fla.,1993,p.303-350中找到。一种二硫化物连接已经被用于 把寡核苷酸的3'端连接到肽(Corey等人,Science 1987,238,1401； Zuckermann,等人,J Am.Chem.Soc.1988,110,1614；和Corey等人,J Am.Chem.Soc.1989,111,8524)。Nelson等人在Nuc.Acids Res.1989,17, 7187中描述了一种用于把生物素连接到寡核苷酸的3'-端的连接试剂。该 试剂N-Fmoc-O-DMT-3-氨基-1,2-丙二醇可以以名称3'-胺从Clontech Laboratories(Palo Alto,加利福尼亚)商购获得。它也可以以名称3'-氨基-修 饰试剂从Glen Research Corporation(Sterling,Va.)商购获得。该试剂也被 用于将肽连接到寡核苷酸，如Judy等人在Tetrahedron Letters1991,32, 879中报道的那样。一种相似的用于连接到寡核苷酸的5'-端的可商购的试 剂是5'-氨基-修饰剂C6。这些试剂可从Glen Research Corporation (Sterling,Va.)商购获得。这些化合物或类似的化合物已经被Krieg等人利 用(Antisense Research andDevelopment 1991,1,161),用于把荧光素连接 到寡核苷酸的5'-端。已经经由聚亚甲基连接把其它化合物(例如吖啶)连接 到寡核苷酸的3'-端磷酸酯基团(Asseline等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1984,81,3297)。
可以把任何上述基团用作单一的接头或者与一个或更多个另外的接头 组合使用。
接头及其在制备寡聚体化合物的缀合物中的用途被提供在整个现有技 术中，例如被提供在WO 96/11205和WO 98/52614以及美国专利号 4,948,882；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,580,731；5,486,603； 5,608,046；4,587,044；4,667,025；5,254,469；5,245,022；5,112,963；5,391,723； 5,510475；5,512,667；5,574,142；5,684,142；5,770,716；6,096,875；6,335,432； 以及6,335,437；Wo2012/083046中，全文引入这些文献中的每一篇作为参 考文献。
如本文所用，生理学上不稳定的键是不稳定的键，它在正常遇到的或 类似于哺乳动物身体内遇到的那些条件的条件下是可切除的(也被称为可 切除的接头,例如图12和13中的B区中图解)。选择生理学上不稳定的连 接基团，使得当它们存在于某些生理条件中时，发生化学转变(例如切除)。 哺乳动物的细胞内条件包括化学条件，例如在哺乳动物细胞中发现的或者 类似于在哺乳动物细胞中遇到的pH、温度、氧化或还原条件或试剂以及盐浓度。哺乳动物细胞内条件还包括正常存在于哺乳动物中的酶活性(例如 来自蛋白水解酶或水解酶)的存在。在一些实施方式中,所述可切除的接头 易于受核酸酶的影响，该核酸酶例如可以在靶细胞中被表达–因此,正如 这里所详述的那样,所述接头可以是一个短区(例如1–10个)磷酸二酯连接 的核苷,例如DNA核苷。
可以通过向所述的细胞中添加一种药学上可以接受的试剂来引发化学 转变(不稳定键的切除)，或者当含有所述不稳定键的分子到达合适的细胞 内或细胞外环境时，化学转变可以自发地发生。例如，当所述分子进入酸 化的内体中时，pH不稳定的键可以被切除。因此，pH不稳定的键可以被 认为是一种内体可切除的键。当暴露于酶(例如存在于内体或溶酶体或细胞 质中的那些酶)时，酶可切除的键可以被切除。当所述分子进入所述细胞质 的更加还原的环境中时，二硫键可以被切除。因此,二硫键可以被认为是 一种细胞质可切除的键。如本文所用，pH-不稳定的键是在酸性条件下 (pH<7)选择性地断裂的不稳定键。这样的键也可以被称为内体不稳定的键, 因为细胞内体和溶酶体的pH小于7。
寡聚体连接的可生物切除的缀合物
所述的寡聚体化合物可以任选地包含一个位于所述寡聚体(被称为A 区)和所述的缀合物(被称为C区)之间的第二区(B区)，参见用于举例说明 的图12和13。B区可以是一个接头，例如一个可切除的接头(也被称为一 种生理学上不稳定的连接)。易受核酸酶影响的生理学上不稳定的连接:在 一些实施方式中,本发明所述的寡聚体(也被称为寡聚体化合物)(或缀合物) 包含三个区:
i)第一区(A区),它包含10-18个毗连的核苷酸；
ii)第二区(B区)，它包含一个可生物切除的接头
iii)第三区(C)，它包含一个缀合部分、一个靶向部分、一 个活化部分,其中所述第三区与所述第二区共价连接。
在一些实施方式中,B区可以是磷酸酯核苷酸接头。例如，当所述的缀 合物是一种亲脂的缀合物时,例如是脂质、脂肪酸、甾醇(例如胆固醇或生 育酚)时，可以使用这样的接头。磷酸酯核苷酸接头也可以被用于其它缀合 物，例如碳水化合物缀合物，例如GalNAc。
肽接头
在一些实施方式中,所述的可生物切除的接头(B区)是一种肽,例如一 种三赖氨酸肽接头，它可以被用在一种聚GalNAc缀合物(例如一种三 GalNAc缀合物)中。也参见本文所提到的肽双基。
本领域中已知的可以使用的其它接头包括二硫化物接头。
磷酸酯核苷酸接头
在一些实施方式中,B区包含1-6个核苷酸,它被共价连接(例如经由一 个核苷间连接基团，例如一个磷酸二酯连接)到所述第一区的5’或3’核苷酸, 其中:
a.在所述第一区和第二区之间的所述核苷间连接是一种磷酸 二酯连接，并且[例如紧接地]与所述第一区相邻的所述第二区的核 苷是DNA或RNA；和/或
b.所述第二区的至少一个核苷是磷酸二酯连接的DNA或 RNA核苷。
在一些实施方式中,A区和B区形成单一的长度为12–22个核苷酸的 毗连的核苷酸序列。
在一些方面中，在所述第一区和第二区之间的所述核苷间连接可以被 认为是所述第二区的一部分。
在一些实施方式中,在所述第一区和第二区之间有一个含磷的连接基 团。所述的含磷的连接基团例如可以是磷酸酯(磷酸二酯)、硫代磷酸酯、 二硫代磷酸酯或硼烷基磷酸酯基团。在一些实施方式中,这种含磷的连接 基团位于所述的第二区和一个与所述第三区相连的接头区之间。在一些实 施方式中,所述的磷酸酯基团是磷酸二酯。
因此,在一些方面中，所述的寡聚体化合物包含至少两个磷酸二酯基 团,其中至少一个符合上述本发明的声明,而另一个位于所述的第二区和 第三区之间,任选地位于接头基团和所述的第二区之间
在一些实施方式中,所述的第三区是活化基团,例如一种用于缀合的 活化基团。在这个方面中，本发明还提供活化的寡聚体，它包含A区和 B区以及一种活化基团,例如一种适用于随后连接到所述第三区(例如适 用于缀合)的中间体。
在一些实施方式中,所述第三区是一种反应性基团,例如适用于缀合 的反应性基团。在这个方面中,本发明还提供包含A区和B区以及一种 反应性基团的寡聚体,该反应性基团例如是一种适用于随后连接到所述第 三区(例如适用于缀合)的中间体。在一些实施方式中，所述的反应性基团 可以包含胺或醇基团,例如胺基团。
在一些实施方式中，A区包含至少一个,例如2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个不同于磷酸二 酯的核苷间连接,例如(任选地独立地)选自由下列组成的组的核苷间连接: 硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和硼烷基磷酸酯以及甲基膦酸酯,例如硫代磷 酸酯。在一些实施方式中，A区包含至少一个硫代磷酸酯连接。在一些实 施方式中，在A区中至少50％,例如至少75％,例如至少90％的核苷间连 接,例如所有的核苷间连接不同于磷酸二酯,例如是硫代磷酸酯连接。在一 些实施方式中,A区中所有的核苷间连接不同于磷酸二酯。
在一些实施方式中,所述的寡聚体化合物包含一种反义寡核苷酸,例 如一种反义寡核苷酸缀合物。所述的反义寡核苷酸可以是或者可以包含所 述的第一区,以及任选的所述第二区。在这个方面中,在一些实施方式中, B区可以形成一个与(核酸)靶互补的毗连的核碱基序列的一部分。在其它 实施方式中,B区可以缺乏与所述靶的互补性。
或者说,在一些实施方式中,本发明提供一种非磷酸二酯连接的(例如 一种硫代磷酸酯连接的)寡核苷酸(例如一种反义寡核苷酸)，它具有至少一 个经由一种磷酸二酯连接与所述寡核苷酸的相邻核苷相连的末端(5’和/或 3’)DNA或RNA核苷,其中所述的末端DNA或RNA核苷进一步被(任选 地经由接头部分)共价连接到一个缀合部分、一个靶向部分或一个阻断部 分。
在一些实施方式中,所述的寡聚体化合物包含一种反义寡核苷酸,例 如一种反义寡核苷酸缀合物。所述的反义寡核苷酸可以是或者可以包含所 述的第一区以及任选的第二区。在这个方面中,在一些实施方式中,B区可 以形成一个与(核酸)靶互补的毗连的核碱基序列的一部分。在其它实施方 式中,B区可以缺乏与所述靶的互补性。
在一些实施方式中,所述第二区的至少两个连续的核苷是DNA核苷 (例如至少3或4或5个连续的DNA核苷酸)。
在这样一种实施方式中,可以按照下式来描述本发明所述的寡核苷酸:
5’-A-PO-B[Y]X-3’或3’-A-PO-B[Y]X-5’
其中A是A区，PO是磷酸二酯连接,B是B区,Y是任选的连接基团, 而X是缀合基团、靶向基团、阻断基团或反应性基团或活化基团。
在一些实施方式中,B区包含3’–5’或5’-3’:i)连接到A区的5’或3’核 苷的磷酸二酯连接,ii)DNA或RNA核苷,例如DNA核苷,和iii)另外一个 磷酸二酯连接
5’-A-PO-B–PO-3’或3’-A-PO-B–PO-5’
另外的磷酸二酯连接把所述的B区核苷与一个或更多个另外的核苷 (例如一个或更多个DNA或RNA核苷)连接起来，或者所述的B区核苷可 以任选地经由一个连接基团(Y)连接到X(是缀合基团、靶向基团、阻断基 团或反应性基团或活化基团)。
在一些实施方式中,B区包含3’–5’或5’-3’:i)连接到A区的5’或3’ 核苷的磷酸二酯连接,ii)2–10个DNA或RNA磷酸二酯连接的核苷,例如 DNA核苷,以及任选地iii)另外一个磷酸二酯连接:
5’-A-[PO-B]n–[Y]-X 3’或3’-A-[PO-B]n–[Y]-X 5’
5’-A-[PO-B]n–PO-[Y]-X 3’或3’-A-[PO-B]n–PO-[Y]-X 5’
其中A代表A区,[PO-B]n代表B区,其中n是1-10,例如1、2、3、 4、5、6、7、8、9或10,PO是一个位于B区和X(或Y，如果存在的话) 之间的任选的磷酸二酯连接基团。
在一些实施方式中，本发明提供符合(或包含)下式之一的化合物:
5’[A区]-PO-[B区]3’-Y-X
5’[A区]-PO-[B区]-PO 3’-Y-X
5’[A区]-PO-[B区]3’-X
5’[A区]-PO-[B区]-PO 3’-X
3’[A区]-PO-[B区]5’-Y-X
3’[A区]-PO-[B区]-PO 5’-Y-X
3’[A区]-PO-[B区]5’-X
3’[A区]-PO-[B区]-PO 5’-X
B区例如可以包含下列或由其组成:
5’DNA3’
3’DNA 5’
5’DNA-PO-DNA-3’
3’DNA-PO-DNA-5’
5’DNA-PO-DNA-PO-DNA 3’
3’DNA-PO-DNA-PO-DNA 5’
5’DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA 3’
3’DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA 5’
5’DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA 3’
3’DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA 5’
应该认识到，磷酸酯连接的可生物切除的接头可以采用不同于DNA 和RNA的核苷。可以使用实施例6中的试验来鉴定可生物切除的核苷酸 接头。
在一些实施方式中,本发明的化合物包含一个可生物切除的接头(也被 称为生理学上不稳定的接头、易受核酸酶影响的生理学上不稳定的连接或 易受核酸酶影响的接头),例如所述的磷酸酯核苷酸接头(例如B区)或一个 肽接头,它把所述寡聚体(或毗连的核苷酸序列或A区)连接到一个缀合部 分(或C区)。
在实施例6中所示的试验中对切割的敏感性可以被用来确定接头是否 是可生物切除的或生理学上不稳定的。
根据本发明的可生物切除的接头是指在靶组织(例如肝脏和/或肾)中易 受切割影响的(即生理学上不稳定的)接头。优选在靶组织中看到的切除率 大于在血清中测得的切除率。适用于测定组织(例如肝脏或肾)和血清中切 除水平的方法见实施例6。在一些实施方式中,在实施例6的肝脏或肾匀 浆液试验中，本发明的化合物中的所述可生物切除的接头(也被称为生理学 上不稳定的接头或易受核酸酶影响的接头)(例如B区)至少大约20％被切 除,例如至少大约30％被切除,例如至少大约40％被切除,例如至少大约 50％被切除,例如至少大约60％被切除,例如至少大约70％被切除,例如 至少大约75％被切除。在一些实施方式中,正如实施例6的试验中所使用 的那样，在血清中的切除率(％)小于大约30％,小于大约20％,例如小于 大约10％,例如小于5％,例如小于大约1％。
在可以相同或不同的一些实施方式中,本发明的化合物中的所述可生 物切除的接头(也被称为生理学上不稳定的接头或易受核酸酶影响的接 头)(例如B区)易受S1核酸酶切割的影响。可以使用实施例6中所示的 S1核酸酶试验来评价对S1切割的敏感性。在一些实施方式中,根据实施 例6中所用的试验，在与S1核酸酶一起温育120分钟后，本发明化合物 中的可生物切除的接头(也被称为生理学上不稳定的接头或易受核酸酶影 响的接头)(例如B区)至少大约30％被切除,例如至少大约40％被切除,例 如至少大约50％被切除,例如至少大约60％被切除,例如至少大约70％被 切除,例如至少大约80％被切除,例如至少大约90％被切除,例如至少 95％被切除。
在所述第二区中序列的选择:
在一些实施方式中,当将所述寡核苷酸的A区和B与所述互补的靶序 列比对时，B区并不形成互补的序列。
在一些实施方式中,当将所述寡核苷酸的A区和B与互补的靶序列比 对时，B区确实形成互补的序列。在这个方面中，A区和B区一起可以形 成一个单一的与所述的靶序列互补的毗连序列。
在一些实施方式中,基于存在于靶组织或细胞或亚细胞区室中的主要 的核酸内切酶切割酶，选择B区中的碱基序列以提供一个最佳的核酸内切 酶切割位点。在这个方面中,通过分离来自靶组织和非靶组织的细胞提取 物，基于与一种非靶细胞(例如肾)相比，在目的靶细胞(例如肝脏/肝细胞) 中优先的切割活性，可以选择用于B区的核酸内切酶切割序列。在这个方 面中,可以针对目的组织/细胞来优化用于靶向下调的化合物的潜能。
在一些实施方式中，B区包含一种下列序列的二核苷酸:AA、AT、AC、 AG、TA、TT、TC、TG、CA、CT、CC、CG、GA、GT、GC或GG,其 中C可以是5-甲基胞嘧啶并且/或T可以被U替换。在一些实施方式中， B区包含一个下列序列的三核苷酸:AAA、AAT、AAC、AAG、ATA、ATT、 ATC、ATG、ACA、ACT、ACC、ACG、AGA、AGT、AGC、AGG、 TAA、TAT、TAC、TAG、TTA、TTT、TTC、TAG、TCA、TCT、TCC、TCG、TGA、TGT、TGC、TGG、CAA、CAT、CAC、CAG、CTA、CTG、CTC、CTT、CCA、CCT、CCC、CCG、CGA、CGT、CGC、 CGG、GAA、GAT、GAC、CAG、GTA、GTT、GTC、GTG、GCA、 GCT、GCC、GCG、GGA、GGT、GGC和GGG，其中，C可以是5- 甲基胞嘧啶并且/或T可以被U替换。在一些实施方式中，B区包含一个 下列序列的三核苷酸:AAAX、AATX、AACX、AAGX、ATAX、ATTX、 ATCX、ATGX、ACAX、ACTX、ACCX、ACGX、AGAX、AGTX、AGCX、 AGGX、TAAX、TATX、TACX、TAGX、TTAX、TTTX、TTCX、TAGX、 TCAX、TCTX、TCCX、TCGX、TGAX、TGTX、TGCX、TGGX、CAAX、 CATX、CACX、CAGX、CTAX、CTGX、CTCX、CTTX、CCAX、CCTX、CCCX、CCGX、CGAX、CGTX、CGCX、CGGX、GAAX、GATX、 GACX、CAGX、GTAX、GTTX、GTCX、GTGX、GCAX、GCTX、GCCX、 GCGX、GGAX、GGTX、GGCX和GGGX,其中X可以选自由下列组 成的组:A、T、U、G、C及其类似物,其中C可以是5-甲基胞嘧啶并且/ 或T可以被U替换。将会认识到:当提到(天然存在的)核碱基A、T、U、 G、C时，这些核碱基可以被作用与天然的核碱基等价(例如与所述互补的 核苷碱基配对)的核碱基类似物替代。在一些实施方式中，B区并不包含T 或U。
氨基烷基中间体
本发明进一步提供包含一种反义LNA寡聚体的所述LNA寡聚体中间 体，该反义LNA寡聚体包含(例如5’或3’端)氨基烷基接头,例如C2–C36 氨基烷基,例如C6-C12氨基烷基,包括例如C6和C12氨基烷基。所述的 氨基烷基可以作为标准寡核苷酸合成的一部分被加入到LNA寡聚体,例如 使用一种(例如被保护的)氨基烷基亚磷酰胺。在所述氨基烷基和所述LNA 寡聚体之间的连接基团例如可以是一种硫代磷酸酯或一种磷酸二酯或例 如本文所提到的一种其它核苷连接基团。可以把所述的氨基烷基共价连接 (例如通过所述的核苷连接基团,例如硫代磷酸酯或磷酸二酯连接)到例如 所述LNA寡聚体的5’或3’。
本发明还提供一种合成所述的LNA寡聚体的方法，包括所述的LNA 寡聚体的顺序合成，例如固相的寡核苷酸合成,包括把氨基烷基加入到所 述寡聚体的步骤,例如在第一轮或最后一轮寡核苷酸合成期间。所述的合 成方法可以进一步包括使所述的一种缀合物与所述的氨基烷基-LNA寡聚 体反应的步骤(所述的缀合步骤)。所述的缀合物可以包含合适的接头和/或 分支点基团,以及任选的另外的缀合基团,例如如本文所描述的疏水性基团或亲脂基团。所述的缀合步骤可以与将所述寡聚体结合到所述的固体载 体同时进行(例如在寡核苷酸合成之后,但是在把所述寡聚体从所述固体 载体洗脱下来之前),或者随后(即在洗脱之后)进行。本发明提供一种氨基 烷基接头在合成本发明所述的寡聚体中的用途。
生产/合成方法
本发明提供一种合成(或生产寡聚体化合物,例如本发明所述的寡聚体 化合物的方法,所述方法包括：:
a)提供一种[固相]寡核苷酸合成载体的步骤,下列之一与该 载体相连[第三区]:
i)一个接头基团(-Y-)
ii)一个选自由下列组成的组的基团:一种缀合基团、 一种靶向基团、一种阻断基团、一种反应性基团[例如胺或醇] 或一种活化基团(X-)
iii)一个-Y-X基团
和
b)[顺序的]B区然后A区的寡核苷酸合成的步骤，
和/或:
c)[顺序的]第一区(A)和第二区(B)的寡核苷酸合成的步骤,其 中所述的合成步骤之后是
d)加入第三区[亚磷酰胺，它包括下列]的步骤
i)一个接头基团(-Y-)
ii)一个选自由下列组成的组的基团:一种缀合基团、 一种靶向基团、一种阻断基团、一种反应性基团[例如胺或醇] 或一种活化基团(X-)
iii)一个-Y-X基团
随后是
e)把所述的寡聚体化合物从所述的[固相]载体上切除， 其中任选地，所述方法进一步包含另外一个选自下列的步骤:
f)其中所述的第三个基团是活化基团,活化所述的活化基团 以产生反应性基团的步骤,然后任选地经由接头基团(Y)，把缀合 基团、阻断或靶向基团加入到所述的反应性基团；
g)其中所述的第三区是反应性基团,经由接头基团(Y)，把缀 合基团、阻断或靶向基团加入到所述的反应性基团的步骤；
h)其中所述的第三区是接头基团(Y),把缀合基团、阻断或靶 向基团加入到所述的接头基团(Y)的步骤，
其中步骤f)、g)或h)是在把寡聚体化合物从所述的寡核苷酸合成载体 上切除之前或之后进行的。在一些实施方式中,可以使用标准的亚磷酰胺化 学法来实施所述方法,因此，可以在把所述的X区和/或X区或X区和Y 区掺入所述的寡聚体中之前,以亚磷酰胺形式提供所述的X区和/或X区或 X区和Y区。请参见图5-10，它们举例说明本发明方法的非限定性方面。
本发明提供一种合成(或生产)一种寡聚体化合物(例如本发明所述的寡 聚体化合物)的方法,所述方法包括:
一个顺序的合成第一区(A)和第二区(B)的寡核苷酸的步骤，其中在所 述的合成步骤之后，是一个加入包含X区(也被称为C区)或Y区的第三区 亚磷酰胺、随后从所述的[固相]载体上切除寡聚体化合物的步骤,该第三区 包含一个选自由下列组成的组的基团:一种缀合基团、一种靶向基团、一 种阻断基团、一种官能团、一种反应性基团(例如一种胺或一种醇)或一个 活化基团(X)或一个-Y–X基团。
然而认识到:可以在从所述的固体载体上切除之后加入所述的X区或X-Y。备选地，所述的合成方法可以包含所述的合成第一区(A)以及任选的 第二区(B)然后从所述的载体上切除所述寡聚体的步骤,以及随后的把第 三区(例如X或X-Y基团)加入到所述的寡聚体上的步骤。例如通过在寡聚 体合成的最后步骤中(在所述载体上)加入一个氨基亚磷酰胺单元，可以实 现第三区的加入,在从所述的载体上切除后,该单元可以被用来(任选地经由所述X或Y(当其存在时)上的一个活化基团)连接到所述的X或X-Y基 团。在所述的实施方式中，其中所述可切除的接头不是核苷酸区,B区可以 是一个非核苷酸的可切除的接头，例如肽接头,它可以形成X区(也被称为 C区)的一部分或者是Y区(或其一部分)。
在所述方法的一些实施方式中，X区(例如C)或(X-Y),例如所述的缀合 物(例如一种GalNAc缀合物)包含一个活化基团(一个活化的官能团)并且 在所述的合成方法中，所述活化的缀合物(或X区或X-Y)被加入到所述的 第一区和第二区,例如氨基连接的寡聚体。通过标准的亚磷酰胺化学法， 例如作为寡聚体合成的最后步骤(该步骤典型地将会在所述寡聚体5’端处 产生氨基)，可以把所述的氨基加入到所述的寡聚体。例如在所述寡核苷酸 合成的最后步骤期间，使用一种被保护的氨基－烷基亚磷酰胺,例如一种 TFA-氨基C6亚磷酰胺(6-(三氟乙酰基氨基)-己基-(2-氰基乙基)-(N,N-二异 丙基)-亚磷酰胺)。
经由NHS酯方法，可以活化X区(或这里所指的C区),例如所述的 缀合物(例如GalNAc缀合物)，然后加入所述的氨基连接的寡聚体。例如 可以使用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)作为X区(或C区,例如一种缀合物,例 如一种GalNAc缀合部分)的活化基团。
本发明提供一种通过本发明的方法制备的寡聚体。
在一些实施方式中,可以经由磷酸酯核苷连接(例如本文所描述的那些, 包括磷酸二酯或硫代磷酸酯)或者经由一种可替代的基团(例如一种三唑基 团)，把X区和/或X区或X区和Y区共价结合(连接)到B区。
在一些实施方式中,在所述第一区和第二区之间的核苷间连接是一种 与所述第二区的第一个(或唯一一个)DNA或RNA核苷相连的磷酸二酯, 或者B区包含至少一个磷酸二酯连接的DNA或RNA核苷。
在一些实施方式中,所述第二区可以包含另外的DNA或RNA核苷， 该核苷可以是磷酸二酯连接的。所述第二区进一步被共价连接到第三区， 该第三区例如可以是缀合基团、靶向基团、反应性基团和/或阻断基团。
在一些方面中,本发明基于一种不稳定区、连接所述第一区的所述第 二区(例如一种反义寡核苷酸)和一种缀合基团或官能团(例如一种靶向或阻 断基团)的提供。所述的不稳定区包含至少一个磷酸二酯连接的核苷,例如 DNA或RNA核苷,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个磷酸二酯 连接的核苷,例如DNA或RNA。在一些实施方式中,所述的寡聚体化合 物包含可切除的(不稳定的)接头。在这个方面中，所述可切除的接头优选 地存在于B区(或者在一些实施方式中,存在于A区和B区之间)。
或者说,在一些实施方式中,本发明提供一种非磷酸二酯连接的(例如 硫代磷酸酯连接的)寡核苷酸(例如一种反义寡核苷酸)，它具有至少一个经 由一种磷酸二酯连接与所述寡核苷酸的相邻核苷相连的末端(5’和/或 3’)DNA或RNA核苷,其中所述的末端DNA或RNA核苷(任选地经由一 个接头部分)被进一步共价连接到一个缀合部分、一个靶向部分或一个阻断 部分。
组合物
本发明所述的寡聚体或寡聚体缀合物可以被用在药物制剂和组合物 中。合适地,这样的组合物包含一种药学上可接受的稀释剂,载体、盐或佐 剂。WO2007/031091提供了合适的以及优选的药学上可接受的稀释剂、 载体和佐剂-将该文献并入本文作为参考。在WO2007/031091中还提供了 合适的剂量、制剂、给药途径、组合物、剂型、与其它治疗剂的组合、前 药制剂-将该文献并入本文作为参考。
应用
本发明所述的寡聚体或寡聚体缀合物可以被用作用于例如诊断学、治 疗学和预防学的研究试剂。
在研究中，这样的寡聚体可以被用来特异性地抑制细胞和实验动物中PCSK9蛋白的合成(典型地通过降解或抑制mRNA从而阻止蛋白质形成)， 因而方便对靶的功能分析或对它作为治疗介入的靶的可用性评价。
在诊断学中，所述寡聚体可以被用于通过RNA印迹法、原位杂交或 类似的技术来检测和定量细胞和组织中PCSK9的表达。
对于治疗学，通过施用根据本发明的寡聚体化合物来治疗被怀疑患有 一种能够通过调节PCSK9的表达而治疗的疾病或病症的动物或人。进一 步提供了通过施用治疗或预防有效量的本发明所述的一种或更多种寡聚 体或组合物来治疗被怀疑患有或倾向患一种与PCSK9的表达有关的疾病 或状况的哺乳动物(例如人)的方法。根据本发明所述的寡聚体、缀合物或 药物组合物典型地是以有效量被给药的。
本发明还提供所述的本发明的化合物或缀合物用于生产用于治疗本文 所提到的疾病的药物或用于治疗本文所提到的疾病的方法的用途。
本发明还提供一种用于治疗本文所提到的疾病的方法，所述方法包括 向需要治疗疾病的患者施用如本文所描述的根据本发明的化合物和/或根 据本发明的缀合物和/或根据本发明的药物组合物。
医学适应症
根据本发明所述的寡聚体、寡聚体缀合物和其它组合物能够被用于治 疗与PCSK9的突变形式的过度表达或表达有关的状况。
本发明还提供本发明的一种化合物在生产用于治疗本文所提到的疾 病、病症或状况的药物中的用途。
一般来说,本发明的一个方面涉及一种治疗患有与反常的PCSK9水 平和/或活性相关的状况或易受其影响的哺乳动物的方法,包括向所述的 哺乳动物施用治疗有效量的靶向PCSK9的包含一个或更多个LNA单元的 寡聚体或寡聚体缀合物。典型地，以有效量施用根据本发明所述的寡聚体、 缀合物或药物组合物。
正如本文所提到的,在一些实施方式中，所述的疾病或病症可能与所 述PCSK9基因或一种其蛋白产物与PCSK9相关或相互作用的基因中的突 变有关。因此,在一些实施方式中,所述的靶mRNA是所述PCSK9序列 的一种突变形式。
本发明的一个有趣的方面涉及本文所定义的寡聚体或本文所定义的缀 合物用于制备用于治疗本文所提到的疾病、病症或状况的药物的用途。
本发明所述的方法优选地被用于治疗或预防由反常的PCSK9水平和/ 或活性引起的疾病。
或者说,在一些实施方式中,本发明进一步涉及一种用于治疗反常的 PCSK9水平和/或活性的方法,所述方法包括向需要这种治疗的患者施用 本发明的寡聚体、本发明的缀合物或本发明的药物组合物。
本发明还涉及用作一种药物的本文所定义的寡聚体、组合物或缀合物。
本发明还涉及本文所定义的化合物、组合物或缀合物用于生产用于治 疗反常的PCSK9水平和/或活性或PCSK9的突变形式(例如等位基因变体, 例如与本文所提到的疾病相关的那些变体)的表达的药物的用途。
此外,本发明涉及一种治疗患有疾病或病症(例如本文所提到的那些疾 病)的受试者的方法。
需要治疗的患者是遭受或可能遭受所述疾病或病症的患者。
在一些实施方式中,本文所用的术语‘治疗’是指治疗存在的疾病(例如 本文所提到的疾病或病症)或防止疾病(即预防)。因此，将会认识到，在一 些实施方式中，本文所提到的治疗可以是预防性的。
在一个实施方式中,本发明涉及用于治疗高胆固醇血症和相关病症的 化合物或包含化合物的组合物,或使用这样的化合物或组合物用于治疗高 胆固醇血症和相关病症的方法,其中当提及高胆固醇血症时，术语“相关的 病症”是指一种或更多种选自由下列组成的组的病症:动脉粥样硬化症、高 脂血症、高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症(例如获得PCSK9功能突变)、 HDL/LDL胆固醇失衡、血脂异常(例如家族性高脂血症(FCHL)或家族性高 胆固醇血症(FHC)、获得性高脂血症、抑制素抗性的高胆固醇血症、冠状 动脉病(CAD)和冠心病(CHD)。
组合治疗
在一些实施方式中,本发明的化合物与另一种治疗剂一起用于组合治 疗中。例如HMG辅酶A还原酶的抑制剂(例如抑制素)例如被广泛地用于 代谢疾病的治疗中(关于组合治疗的实例参见WO2009/043354，并入本文 作为参考)。组合治疗可以是其它降低胆固醇的化合物,例如一种选自由 下列组成的组的化合物:螯合胆汁盐的树脂(例如胆酪胺、降胆宁和盐酸考 来维仑)、HMG辅酶A还原酶的抑制剂(例如洛伐他丁、西伐他丁、普伐 他丁、阿托伐他丁、辛伐他丁、罗素伐他丁和氟伐他丁)、烟酸、纤维酸衍 生物(例如氯贝丁酯、吉非贝齐、非诺贝特、苯札贝特和西普洛贝特)、丙 丁酚、新霉素、右旋甲状腺素、植物胆甾烷醇酯、胆固醇吸收抑制剂(例如 依泽替米贝)、英普他派、胆汁酸转运蛋白(顶端钠依赖性胆汁酸转运蛋白) 的抑制剂、肝CYP7a的调节剂、雌激素替代治疗剂(例如他莫昔芬)和消炎 药(例如糖皮质激素)。与抑制素的组合可以是特别优选的。
本发明的具体实施方式
1.一种反义寡核苷酸缀合物，包含:
a.长度为12–22个核苷酸的反义寡聚体(A),它包含一个与SEQ ID NO:30或31或32或33或34或45的相应长度互补的10–16个核 苷酸的毗连序列,和
b.至少一个与所述的寡聚体(A)共价连接的非核苷酸或非多核苷 酸缀合部分(C)。
2.根据实施方式1所述的寡核苷酸缀合物,其中所述的反义寡聚 体包含选自由下列组成的组的毗连序列:SEQ ID NO:25、26、27、28、 29和44。
3.根据实施方式1或2中任意一个所述的寡核苷酸缀合物,其中所 述的反义寡聚体靶向PCSK9。
4.根据实施方式1-3中任意一个所述的寡核苷酸缀合物,其中所述 的反义寡聚体包含增强亲和性的核苷酸类似物。
5.根据实施方式4所述的寡核苷酸缀合物,其中所述的核苷酸类 似物是糖修饰的核苷酸,例如独立地或依赖性地选自由下列组成的组 的糖修饰的核苷酸:锁定核酸(LNA)单元、2’-O-烷基-RNA单元、 2’-OMe-RNA单元、2’-氨基-DNA单元和2’-氟-DNA单元。
6.根据实施方式4或5所述的寡核苷酸缀合物,其中所述的核苷酸 类似物包含或是锁定核酸(LNA)单元。
7.根据实施方式1-6中任意一个所述的寡核苷酸缀合物,其中所述 的反义寡聚体是间隙体。
8.根据实施方式7所述的寡核苷酸缀合物,其中所述的间隙体在每 一侧(5’和3’)包含一个具有2-4个核苷酸类似物，优选LNA类似物的翼。
9.根据实施方式7或8所述的寡核苷酸缀合物,其中所述的间隙体 设计选自由下列组成的组:2-8-2、3-8-3、2-8-3、3-8-2、4-8-2、2-8-4、 2-9-2、2-9-3、3-9-2、3-9-3、3-9-4、4-9-3、2-10-2、2-10-3、3-10-2、3-10-3、 3-10-4、4-10-3、2-11-2、2-11-3、3-11-2、3-11-3、3-11-4、4-11-3和4-11-4。
10.根据实施方式7-9中任意一个所述的寡核苷酸缀合物,其中所 述的间隙体设计选自由下列组成的组:2-8-3、3-8-3、3-9-4、3-10-3、 2-11-2、2-11-3和3-11-2。
11.根据实施方式1-10中任意一个所述的寡核苷酸缀合物,其中 所述的寡聚体包含13、14、15或16个核苷酸的毗连序列。
12.根据实施方式1-11中任意一个所述的寡核苷酸缀合物,其中 所述的寡聚体包含一个或更多个选自由下列组成的组的核苷连接:硫 代磷酸酯、二硫代磷酸酯和硼烷基磷酸酯。
13.根据实施方式1-12中任意一个所述的寡核苷酸缀合物,其中 所述的寡聚体包含硫代磷酸酯核苷连接或者由其组成。
14.根据实施方式1-12中任意一个所述的寡核苷酸缀合物,其中 所述的寡聚体包含选自由下列组成的组的毗连序列:SEQ ID NO:1、2、 3、4、5、6、7和8。
15.根据实施方式1-14中任意一个所述的寡核苷酸缀合物,其中 所述的缀合部分(C)选自由下列组成的组:碳水化合物,例如GalNAc或GalNAc簇；亲脂性的基团,例如脂质、脂肪酸；甾醇,例如胆固醇或 生育酚；或抑制素。
16.根据实施方式1-15中任意一个所述的反义寡核苷酸缀合物, 其中所述的缀合部分(C)增强向肝脏细胞的输送和/或摄取。
17.根据实施方式1-16中任意一个所述的反义寡核苷酸缀合物, 其中所述的缀合部分(C)包含一种甾醇，例如生育酚、胆固醇,例如以 Conj5、Conj5、Conj6或Conj6a显示的那些。
18.根据实施方式1-16所述的反义寡核苷酸缀合物,其中所述的 缀合部分(C)包含一种碳水化合物，例如GalNAc或三价的GalNAc, 例如以Conj1、2、3或4或1a、2a、3a或4a显示的那些。
19.根据实施方式18所述的反义寡核苷酸缀合物,其中所述的缀 合部分(C)包含Conj2a。
20.根据实施方式1-19中任意一个所述的反义寡核苷酸缀合物, 它选自由下列组成的组:SEQ ID NO:9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23和24。
21.根据实施方式1-20中任意一个所述的反义寡核苷酸缀合物, 其中使所述的反义寡聚体(A)经由一个位于所述寡聚体的毗连序列与所 述的缀合部分(B和/或Y)之间的接头区与所述的缀合部分(C)缀合。
22.根据实施方式21所述的反义寡核苷酸缀合物,其中所述的接 头选自由下列组成的组:氨基烷基接头、磷酸酯核苷酸接头和肽接头。
23.根据实施方式21或22所述的反义寡核苷酸缀合物,其中所述 的接头选自C6至C12氨基烷基。
24.根据实施方式21或22所述的反义寡核苷酸缀合物,其中所述 的接头是一种包含1-6个核苷酸的可生物切除的磷酸酯核苷酸接头。
25.根据实施方式21-24中任意一个所述的反义寡核苷酸缀合物, 其中所述的接头(B)是一种磷酸二酯核苷酸连接,它包含一个或更多个 毗连的DNA磷酸二酯核苷酸，例如与所述寡聚体的毗连序列的5’或3’ 端毗连的并且可以或不可以与所述的PCSK9靶序列形成互补的碱基对 的1、2、3、4、5或6个DNA磷酸二酯核苷酸。
26.根据实施方式24或25所述的反义寡核苷酸缀合物,其中所述 的磷酸二酯核苷酸连接(或可生物切除的接头)包含1、2或3个DNA磷 酸二酯核苷酸,例如2个DNA磷酸二酯核苷酸,例如5’CA 3’二核苷 酸。
27.一种长度为12–22个核苷酸的寡聚体,其包含
a.与SEQ ID NO:31的相应长度互补的16个核苷酸的毗连序列, 或
b.与SEQ ID NO:33或34或45的相应长度互补的10–16个核苷 酸的毗连序列。
28.根据实施方式27所述的寡聚体,它包含一个选自由下列组成 的组的毗连序列:SEQ ID NO:26、27、28、29和44。
29.根据实施方式27或28中任意一个所述的寡聚体,其中所述的 寡聚体靶向PCSK9。
30.根据实施方式27-29中任意一个所述的寡聚体，其中所述的毗 连序列包含增强亲和性的核苷酸类似物。
31.根据实施方式30所述的寡聚体,其中所述的核苷酸类似物是 糖修饰的核苷酸,例如独立地或依赖性地选自由下列组成的组的糖修 饰的核苷酸:锁定核酸(LNA)单元、2’-O-烷基-RNA单元、2’-OMe-RNA 单元、2’-氨基-DNA单元和2’-氟-DNA单元。
32.根据实施方式30或31所述的寡聚体,其中所述的核苷酸类似 物包含或者是锁定核酸(LNA)单元。
33.根据实施方式27-32中任意一个所述的寡聚体,它是一种间隙 体,例如一种锁定核酸间隙体寡核苷酸.
34.根据实施方式33所述的寡核苷酸缀合物,其中所述的间隙体 在每一侧(5’和3’)包含一个翼，该翼具有2-4个核苷酸类似物,优选LNA 类似物。
35.根据实施方式33或34所述的寡核苷酸缀合物,其中所述的间 隙体设计选自由下列组成的组:2-8-2、3-8-3、2-8-3、3-8-2、4-8-2、2-8-4、 2-9-2、2-9-3、3-9-2、3-9-3、3-9-4、4-9-3、2-10-2、2-10-3、3-10-2、3-10-3、 3-10-4、4-10-3、2-11-2、2-11-3、3-11-2、3-11-3、3-11-4、4-11-3和4-11-4。
36.根据实施方式33-35中任意一个所述的寡核苷酸缀合物,其中 所述的间隙体设计选自由下列组成的组:2-8-3、3-8-3、3-9-4、3-10-3、 2-11-2、2-11-3和3-11-2。
37.根据实施方式27-36中任意一个所述的寡聚体,其中所述寡聚 体包含13、14、15或16个核苷酸的毗连序列。
38.根据实施方式27-37中任意一个所述的寡聚体,其中所述的寡 聚体包含一个或更多个选自由下列组成的组的核苷连接:硫代磷酸酯、 二硫代磷酸酯和硼烷基磷酸酯。
39.根据实施方式27-38中任意一个所述的寡聚体,其中所述的寡 聚体包含硫代磷酸酯核苷连接或由其组成。
40.根据实施方式27-38中任意一个所述的寡聚体,它包含一个选 自由下列组成的组的毗连序列:SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7和8。
41.一种药物组合物，它包含根据实施方式1-40中任意一个所述 的寡聚体或反义寡核苷酸缀合物和药学上可接受的稀释剂、载体、盐或 佐剂。
42.根据实施方式1-41中任意一个所述的寡聚体或反义寡核苷酸 缀合物或药物组合物，其用作药物,例如该药物用于治疗高胆固醇血症 或相关病症，例如一种选自由下列组成的组的病症:动脉粥样硬化症、 高脂血症、高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症，例如获得PCSK9中 的功能突变、HDL/LDL胆固醇失衡、血脂异常，例如家族性高脂血症 (FCHL)或家族性高胆固醇血症(FHC)、获得性高脂血症、抑制素抗性 的高胆固醇血症、冠状动脉病(CAD)和冠心病(CHD)。
43.根据实施方式1-41中任意一个所述的寡聚体或反义寡核苷酸 缀合物或药物组合物用于生产用于治疗高胆固醇血症或相关病症的药 物的用途,所述病症例如是一种选自由下列组成的组的病症:动脉粥样 硬化症、高脂血症、高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症，例如获得 PCSK9中的功能突变、HDL/LDL胆固醇失衡、血脂异常，例如家族 性高脂血症(FCHL)或家族性高胆固醇血症(FHC)、获得性高脂血症、 抑制素抗性的高胆固醇血症、冠状动脉病(CAD)和冠心病(CHD)。
44.一种治疗高胆固醇血症或相关病症的方法，所述的病症例如 是一种选自由下列组成的组的病症:动脉粥样硬化症、高脂血症、高胆 固醇血症、家族性高胆固醇血症，例如获得PCSK9中功能突变、 HDL/LDL胆固醇失衡、血脂异常，例如家族性高胆固醇血症(FHC)、 获得性高脂血症、抑制素抗性的高胆固醇血症、冠状动脉病(CAD)和冠 心病(CHD)，所述方法包括:向遭受或可能遭受高胆固醇血症或相关病 症的患者施用有效量的根据实施方式1-41中任意一个所述的寡聚体或 反义寡核苷酸缀合物或药物组合物。
一种用于在体内或在体外抑制表达PCSK9的细胞中的PCSK9的方 法，所述方法包括向所述的细胞施用根据实施方式1-41中任意一个所述的 寡聚体或反义寡核苷酸缀合物或药物组合物以便抑制所述细胞中PCSK9。
实施例
使用亚磷酰胺方法，在一台Expedite 8900/MOSS合成仪(多重寡核苷 酸合成系统)或Oligomaker 48上，分别以4或1μmol的规模，在尿嘧 啶通用载体上合成了寡核苷酸。在所述合成结束时,使用氨水在60℃持 续5-16小时，将所述的寡核苷酸从所述的固体载体上切除。通过反相 HPLC(RP-HPLC)或固相萃取纯化所述的寡核苷酸并且通过UPLC表征, 并且通过ESI-MS进一步证实其分子量。更多细节，请看下文。
所述寡核苷酸的延长
通过使用0.1M的5’-O-DMT-保护的amidite在乙腈中和作为活化剂 的DCI(4,5–二氰基咪唑)在乙腈(0.25M)中的溶液，来进行β-氰基乙基-亚 磷酰胺(DNA-A(Bz)、DNA-G(ibu)、DNA-C(Bz)、DNA-T、LNA-5-甲基-C(Bz)、LNA-A(Bz)、LNA-G(dmf)、LNA-T或C6-S-S-C6接头)的偶联。 对于最后的循环，使用一种0.1M在DCM中的可商购获得的C6-连接的胆 固醇亚磷酰胺。为了引入硫代磷酸酯连接，通过使用苍耳烷氢化物(0.01M 在9:1的乙腈/吡啶中)进行硫醇化。使用0.02M在7:2:1的THF/吡啶/水中 的碘来引入磷酸二酯连接。其余的试剂都是典型地用于寡核苷酸合成的试 剂。为了固相合成后的缀合，在所述固相合成的最后循环中以及在去保护 和从所述的固体载体上切除后，使用了一种可商购获得的C6氨基接头亚 磷酰胺，把所述的氨基连接的去保护的寡核苷酸分离出来。使用标准的合 成方法，经由所述官能团的活化，引入了所述的缀合物。
通过RP-HPLC纯化:
通过制备性的RP-HPLC在一个Phenomenex Jupiter C18 10μ150x10 mm柱子上纯化粗化合物。使用0.1M pH 8的乙酸铵和乙腈作为缓冲液， 流速为5mL/分钟。把收集的流分冷冻干燥而得到纯化的化合物，典型地 为白色固体。
缩写
DCI:4,5-二氰基咪唑
DCM:二氯甲烷
DMF:二甲基甲酰胺
DMT:4,4’-二甲氧基三苯甲基
THF:四氢呋喃
Bz:苯甲酰基
Ibu:异丁酰基
RP-HPLC:反相高效液相色谱
在表1中显示了所合成的化合物并且在附图中对它们进行图解。
实施例1新的PCSK9靶标基序的发现
设计并且合成了521种对人和灵长类PCSK9具有特异性的抗-PCSK9 的反义寡核苷酸–全部都是两侧带有三个锁定核酸的10DNA，即具有16 聚体的LNA间隙体设计。把人细胞系15PC3与靶向人PCSK9的模拟物 或所述的锁定核酸修饰的寡核苷酸以0.3μM的浓度一起温育3天。在3 个独立的实验中测试每一种抗-PCSK9的寡核苷酸。按照所述的那样，使 用实时PCR从提取的RNA中定量PCSK9 mRNA水平，并且在归一化到 β-肌动蛋白mRNA后，并且相对于在图8中的12个模拟物处理的样品中 的平均水平来呈现该PCSK9 mRNA水平，在图9中对一小组最有效的分 子有精细观察。
实施例2体外mRNA敲减
把人细胞系15PC3与模拟物或靶向人PCSK9的具有SEQ ID NO:1-8 的锁定核酸修饰的寡核苷酸以0.0012、0.06、0.3和1.5μM的浓度一起温 育3天。按照所述的那样，使用实时PCR从提取的RNA中定量PCSK9 mRNA水平，并且相对于在图10中在4个模拟物处理的样品中的平均水 平来呈现该PCSK9 mRNA水平。对于每一种寡核苷酸,通过对二参数逻辑 形式的希尔方程进行最小二乘法拟合，将下限固定在0％并且把上限固定 在100％，确定了以半最大有效浓度(EC50)形式定量的效力，EC50＝估计 值±标准差。
实施例3-体内ALT水平
在到达时体重大约为20g的4周龄雌性NMRI小鼠(Taconic,丹麦)， 以7.5和15mg/kg的剂量一次性地给它们静脉注射盐水或靶向人PCSK9 的具有SEQ ID NO:9-16的锁定核酸修饰的胆固醇-缀合的寡核苷酸。给药 7天后，杀死小鼠，使用一种酶测定法(Horiba ABXDiagnostics)测定丙氨 酸氨基转移酶(ALT)的血清水平。对于每个具有5只小鼠的治疗组，计算 平均值和标准差，并且相对于在盐水处理的小鼠中的平均水平，呈现在图 11中。对于一些但不是所有的胆固醇-缀合的分子，在这两种浓度下记录 到ALT升高。几种化合物(例如SEQ ID NO:9和10)并没有以临床上有意 义的方式增强小鼠中的ALT，甚至当使用胆固醇作为用于增强化合物在肝 脏中的摄取的缀合物时。
实施例4:非人灵长类研究
这个研究的主要目标是:在给食蟹猴单次缓慢推注抗-PCSK9的LNA 化合物后，7周内研究所选择的脂质标记物，并且评估化合物在猴子中的 潜在毒性。在这个研究中使用的化合物是以0.625和2.5mg/ml)的初始浓度 配制在无菌盐水(0.9％)中的SEQ ID NO:10、13、18、19、20和21。
使用了至少24月龄的雄性猴子，并且给予它们获取自来水的自由，并 且每日给每只动物分发180g MWM(E)SQC SHORT膨化饮食(Dietex法 国,SDS,Saint Gratien,法国)。根据那一天笼子中动物的个数，将会计算 出每个笼子中分发的食物总量。此外，每日给每只动物提供水果或蔬菜。 在所述的处理期开始之前，让所述的动物适应所述的研究条件至少14天的 时间。在该处理期期间，进行了预处理研究。以0.25、1.0或2.5mg/kg(SEQ ID NO:10、13、18和21)的单次剂量或以1.0或2.5mg/kg(SEQ ID NO:19 和20)的单次剂量，对动物静脉内给药。剂量体积是0.4mL/kg。每个组使 用2只动物。
在第1天施用剂量制剂。在处理后，观察动物7周的时间，并且在第 51天把动物从所述研究中释放。第1天对应于所述处理期的第一日。在所 述研究之前和期间，将会记录临床观察和体重以及食物摄取(每个组)。
在下列时间点采集血样并且进行分析:
Figure BDA0002614551260000801
RCP＝常规临床病理学,LSB＝肝脏安全性生物化学,PK＝药代动力 学,OA＝其它分析,L＝脂质。
在下列所指示的场合下，针对所有存活的动物，测定了下列参数:
全部生物化学组(下面的完全列表)-在第-8、15和50天,
肝脏安全性(仅仅ASAT、ALP、ALAT、TBIL和GGT)-在第4、8、 22和36天,
仅仅脂质分布图(总胆固醇、HDL-C、LDL-C和甘油三酯)和Apo-B- 在第-1、4、8、22、29、36和43天。
采集血液(大约1.0mL)放入肝素锂试管中(使用ADVIA 1650血液生 物化学分析仪):Apo-B、钠、钾、氯化物、钙、无机磷、葡萄糖、HDL-C、 LDL-C、尿素、肌酸酐、总胆红素(TBIL)、总胆固醇、甘油三酯、碱性磷 酸酶(ALP)、丙氨酸转氨酶(ALAT)、天冬氨酸转氨酶(ASAT)、肌酸激酶、 γ-谷氨酰基转移酶(GGT)、乳酸脱氢酶、总蛋白、白蛋白、白蛋白/球蛋白 比率。
血液中PCSK9的分析:在第-8、-1、4、8、15、22、29、36、43和 50天采集用于PCSK9分析的血液样品。从每只动物中的合适的静脉采集 静脉血液(大约2mL)放入血清分离管(SST)并且允许它在室温凝固至少60 ±30分钟。在冷藏条件下(设定为保持+4℃)，以1000g将血液离心10分 钟。血清将会被转移到3个单独试管中，并且被储存在-80℃下直到使用ELISA方法(Circulex Human PCSK9 ELISA试剂盒,CY-8079,对来自食 蟹猴的样品有效)在CitoxLAB France上进行分析。
其它分析:WO2011009697提供了用于下列分析的方法:qPCR、 PCSK9 mRNA分析。其它的分析包括PCSK9蛋白ELISA、采用ELISA 的血清Lp(a)分析(Mercodia序号10-1106-01)、组织和血浆寡核苷酸分析 (药物含量)、样品提取、标准样品和QC样品、通过ELISA测定寡核苷酸 含量。
关于靶向PCSK9的化合物的数据如下表中所示:
Figure BDA0002614551260000811
Figure BDA0002614551260000821
使用靶向PCSK9的所述化合物，没有肝毒性或肾毒性的指征。值得 注意的是，所述的PCSK9-GalNAc化合物提供了对PCSK9的迅速而且高 效的下调，这种下调被维持超过了一个延长的时期(所述研究的全部时间长 度)，阐明了与没有缀合的亲本化合物和使用替代缀合技术(例如胆固醇缀 合)的化合物相比，GalNAc缀合的化合物在快速初始敲减和长持续时间方 面均更有效，表明它们可以相对不频繁地并且以较低的剂量给药。在整个 所述研究持续期间，SEQ ID NO 18提供了对PCSK9和LDL-C迅速而且 一贯的下调(参见在第34天在2.5mg/kg剂量时,在使用单次2.5mg/kg剂量 48天后，看到了显著的PCSK9下调，其中血浆PCSK9蛋白水平是剂量 前的71％)。
实施例5:在大鼠中肝脏和肾毒性评估
可以对本发明化合物在啮齿类(例如在小鼠或大鼠)中的毒性分布进行 评估。可以使用下列方案:使用年龄大约为8周龄的Wistar Han Crl:WI(Han)。在这个年龄，雄性重量大约为250g。所有的动物自由获取 SSNIFF R/M-H丸状维持饮食(
Figure BDA0002614551260000831
GmbH,Soest,德国) 和盛放在瓶子中的自来水(采用0.22μm过滤器过滤)。使用了10和 40mg/kg/剂的剂量水平(皮下给药)并且在第1天和第8天定量给药。在第 15天对动物实施安乐死。在第7天和第14天，采集尿样和血样。在第14 天进行临床病理学评估。在所述研究前、在给药的第一天和在坏死前一星 期，测定体重。每日评估每个组的食物消耗量。在禁食6小时后，经由尾 静脉采集血样。进行了下列血清分析:红细胞计数、平均细胞体积、细胞 压积、血红蛋白、平均细胞血红蛋白浓度、血小板计数、白细胞计数、具有细胞形态的分化的白细胞计数、网状细胞计数、钠、钾、氯化物、钙、 无机磷、葡萄糖、尿素、肌酸酐、总胆红素、总胆固醇、甘油三酯、碱性 磷酸酶、丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、总蛋白、白蛋白、白蛋白/球蛋 白比率。进行了尿分析:α-GST、β-2微球蛋白、钙结合蛋白、簇蛋白、 抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C、KIM-1、骨桥蛋白、TIMP-1、VEGF和NGAL。 基于第一组(
Figure BDA0002614551260000832
MAP大鼠肾毒性磁性珠第一组, RKTX1MAG-37K)定量了7种分析物(钙结合蛋白、簇蛋白、GST-α、 KIM-1、骨桥蛋白、TIMP-1、VEGF)。基于第二组(
Figure BDA0002614551260000833
MAP大 鼠肾毒性磁性珠第二组,RKTX2MAG-37K)定量了3种分析物(β-2微球蛋 白、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C、脂笼蛋白-2/NGAL)。用于测定大鼠尿中这 些生物标记物浓度的测定法基于Luminex
Figure BDA0002614551260000834
技术。包被了抗-α -GST/β-2微球蛋白/钙结合蛋白/簇蛋白/抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/ KIM-1/骨桥蛋白/TIMP-1/VEGF/NGAL抗体的微球体用两种不同的荧光 染料进行颜色编码。测定了下列参数(尿，使用ADVIA 1650):尿蛋白、 尿肌酸酐。定量参数:体积、pH(使用10-Multistix SG测试带/Clinitek 500 尿分析仪)、比重(使用折光仪)。半定量参数(使用10-Multistix SG测试带 /Clinitek 500尿分析仪):蛋白质、葡萄糖、酮、胆红素、亚硝酸盐、血液、 尿胆素原、沉降细胞学(通过显微检查)。质量参数:外观、颜色。杀死后， 测定体重以及肾、肝脏和脾的重量，并且计算器官与体重的比率。采集肾 和肝脏样品并且冷冻或储存在福尔马林中。进行显微分析。在图15中显示 了Kim-1表达的数据,其中证明除SEQ ID NO 4以外的所有分子都具有比 SEQ ID NO 1更低的尿kim-1信号,这证明与原初的以及以前表征过的没 有缀合的分子相比改善的肾安全性。
实施例6对可切除的接头的分析
让带有不同的DNA/PO-接头的FAM-标记的反义寡聚体(ASOs)在S1 核酸酶提取物(下表)、肝脏或肾匀浆物或血浆中接受体外切除。
Figure BDA0002614551260000841
大写字母是LNA核苷(例如β-D-氧基LNA),小写字母是DNA核苷。 下标代表硫代磷酸酯核苷间连接。LNA胞嘧啶任选地是5-甲基胞嘧啶。所 述FAM缀合部分被显示在图6中，而所述的分子被显示在图7中。
使带有不同的DNA/PO-接头的100μM FAM-标记的ASOs在体外接 受在核酸酶缓冲液中的S1核酸酶(60U pr.100μL)切除20和120分钟(A)。 通过向缓冲液中添加EDTA来停止酶活性。然后使用Dionex DNApac p-100柱子和梯度范围在10mM-1M的pH为7.5的高氯酸钠，在Dionex Ultimate 3000上对所述溶液进行AIE HPLC分析。使用荧光检测仪(在615 nm处)和紫外检测仪(在260nm处)相对于标准品测定被切除的和没有被切 除的寡核苷酸的含量。
Figure BDA0002614551260000842
Figure BDA0002614551260000851
结论:所述的PO接头(或这里所指的B区)导致所述的缀合物(或C基 团)被切除,并且所述接头的长度和/或序列组成两者都能够被用来调节B 区对核酸降解切除的敏感性。所述的DNA/PO-接头序列能够调节切除速 率，如在核酸酶S1提取物中20分钟以后看到的那样。因此，也能够利用 针对B区(例如对于所述的DNA/PO-接头)的序列选择来调节在血清和靶组 织的细胞中的切除水平。
给肝脏和肾的匀浆物和血清掺杂SEQ ID NO 35的化合物达到200 μg/g组织的浓度。把从NMRI小鼠收集的肝脏和肾样品在匀浆缓冲液 (0,5％Igepal CA-630,25mM TrispH 8.0,100mM NaCl,pH 8.0(用1N NaOH调节)中匀浆。将匀浆物在37℃温育24小时，然后使用苯酚-氯仿 萃取匀浆物。使用上述HPLC方法相对于标准品测定来自肝脏和肾的提取 物中被切除的和没有被被切除的寡聚体的含量:
Figure BDA0002614551260000852
结论:所述的PO接头(或这里所指的B区)导致所述的缀合物(或C基 团)在肝脏或肾的匀浆物中被切除了,但是在血清中没有被切除。可以利用 在实施例6中所示的测定中对切除的敏感性来确定接头是否是可生物切除 的或生理学上不稳定的。请注意在上述测定中的切除是指对所述可切除的 接头的切除,所述的寡聚体或A区应当保持功能完整。
实施例7:在体内用胆固醇缀合物对PCSK9 mRNA的敲减
PCSK9-小鼠特异性化合物
# 序列(5’-3’)(A) 可切除的接头(B) 缀合物(C)
40 GTctgtggaaGCG 无 无
41 GTctgtggaaGCG 无 胆固醇
42 GTctgtggaaGCG 2PO-DNA(5’ca3’) 胆固醇
43 GTctgtggaaGCG 2PO-DNA(5’ct3’) 胆固醇
根据表5，给NMRI小鼠注射单次剂量的盐水或10mg/kg没有缀合的 LNA-反义寡核苷酸(SEQ ID NO 40)或等摩尔量的采用不同的接头与胆固 醇缀合的LNA反义寡核苷酸，并且在第1-10天杀死小鼠。
把RNA从肝脏和肾中分离出来，并且使用PCSK9特异性引物和探针 对其进行qPCR，以分析PCSK9 mRNA的敲减。结果如图14中所示。
结论:用由2个具有磷酸二酯骨架的DNA构成的接头与PCSK9 LNA 反义寡核苷酸缀合的胆固醇(SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43)与没有缀 合的化合物(SEQ ID NO:40)以及具有稳定接头的胆固醇缀合物(SEQ ID NO:41)相比，显示了增强的肝脏PCSK9敲减(图14)。
材料和方法:
实验设计:
Figure BDA0002614551260000861
Figure BDA0002614551260000871
Figure BDA0002614551260000881
Figure BDA0002614551260000891
剂量给药。根据上表，给在到达时大约20g的NMRI雌性动物在静脉 内定量给药10ml/kg体重(根据第0天的体重)在盐水中配制的所述化合物 或只给予盐水。
肝脏个肾组织的采样。根据表4，用70％CO2-30％O2将动物麻醉， 并且通过颈脱臼法将其杀死。将大肝叶的一半和一个肾切碎并且此后浸没 在RNA中。
根据生产商的说明书,使用MagNa纯96细胞RNA大体积试剂盒 (Roche目录号5467535001)，在MagNA纯LC RNA分离组织缓冲液 (Roche目录号03 604 721 001)存在下，从最多10mg通过玻珠研磨匀浆的 组织中提取总RNA。根据生产商的说明书，使用来自Ambion的逆转录酶 试剂进行第一链的合成。
对于每一个样品，用不含RNA酶的H2O把0.5μg总RNA调整到(10.8 μl)，并且与2μl随机十聚体(50μM)和4μl dNTP混合物(2.5mM每一 种dNTP)混合，并且加热到70℃持续3分钟，在此之后，迅速地在冰 上冷却样品。向每一个样品中添加2μl处在室温的10倍缓冲液、1μl MMLV逆转录酶(100U/μl)和0.25μl RNA酶抑制剂(10U/μl)，然后在 42℃温育60分钟，在95℃加热灭活所述的酶10分钟，然后把样品冷 却到4℃。把cDNA样品1:5稀释，使用2倍的Taqman快速通用PCR 大师混合物(Applied Biosystems目录号4364103)和Taqman基因表达测定 法(mPCSK9、Mn00463738_m1和mActin#4352341E)，遵照生产商的方 案对其进行RT-QPCR，并且在Applied Biosystems RT-qPCR仪器 (7500/7900或ViiA7)中以快速模式进行加工。
实施例8:非人灵长类研究；多重皮下注射
该项非人灵长类研究的目标是要评估当通过皮下注射(s.c.)施用化合物 时，在重复给药的设定中，抗-PCSK9化合物的效力和安全性。在这项研 究中所用的化合物是SEQID NO:2、3、18和19,它们被以0.625和2.5 mg/ml的初始浓度配制在无菌盐水(0.9％)中。
使用了至少24个月龄的雌性食蟹猴，并且给予它们自由获取自来水， 并且每日给每只动物分发180g OWM(E)SQC SHORT膨化食品(Dietex France,SDS,Saint Gratien,法国)。此外，每日给每只动物提供水果或蔬 菜。在所述的处理期开始之前，让所述的动物适应所述的研究条件至少14 天的时间。在该处理期期间，进行了预处理研究。以0.5mg/kg(SEQ ID NO: 2、3、18和19)或1.5mg/kg/注射(SEQ ID NO:18和19)的剂量，每周向所 述的动物皮下注射给药一次，持续4周，4次注射总共持续4周的时间。 剂量体积是0.4mL/kg/注射。每个组使用6只动物。在第四次而且是最后 的剂量后，观察动物1周，在此之后将一半的动物杀死，以便研究肝脏apoB 转录物调节、脂质参数、肝脏和肾组织学以及肝脏和肾组织分布。第1天 对应于所述处理期的第一日。在所述研究之前和期间，记录临床观察和体 重以及食物摄取(每个组)。
在下列时间点对血液和组织进行采样和分析:
Figure BDA0002614551260000911
RCP:常规临床病理学,LSB:肝脏安全性生物化学,PK:药代动力学, OA:其它分析,L:脂质
采集血液(大约1.0mL)放入肝素锂试管中(使用ADVIA 1650血液生 物化学分析仪)，分析钠、钾、氯化物、钙、无机磷、葡萄糖、HDL-C、 LDL-C、尿素、肌酸酐、总胆红素(TBIL)、总胆固醇、甘油三酯、碱性磷 酸酶(ALP)、丙氨酸转氨酶(ALAT)、天冬氨酸转氨酶(ASAT)、肌酸激酶、 γ-谷氨酰基转移酶(GGT)、乳酸脱氢酶、总蛋白、白蛋白、白蛋白/球蛋白 比率。
血液分析:在第-8、-1、4、8、15、22、29、36、43和50天从仅组1 －16动物(即，用抗ApoB化合物处理的动物)采集用于ApoB分析的血 液样品。从每只动物中的合适的静脉采集静脉血液(大约2mL)放入血清分 离管(SST)并且允许它在室温凝固至少60±30分钟。在冷藏条件下(设定以 保持+4℃)，以1000g将血液离心10分钟。将血清转移到3个单独的试 管中，并且储存在-80℃直到通过ELISA分析ApoB蛋白。
其它分析:WO2010142805提供了用于下列分析的方法:qPCR、ApoB mRNA分析。其它的分析包括采用ELISA的血清Lp(a)分析(Mercodia序 号10-1106-01)、组织和血清寡核苷酸分析(药物含量)、样品提取、标准样 品和QC样品、通过ELISA测定寡核苷酸含量。
抗-PCSK9的寡核苷酸的预期的药理学是由于循环中的PCSK9蛋白 (“血清PCSK9”)减少而导致LDL胆固醇减少。当研究血清PCSK9和 LDL胆固醇(图16和图17)时，与没有缀合的分子相比，所述GalNAc缀 合的分子展示了增强的效力。图16图解了4周注射(0.5mg/kg/注射)没有缀 合的SEQ ID NO 2对血清PCSK9和LDL胆固醇只有较小的影响,然而具 有相同LNA间隙体(SEQ ID 18)的GalNAc缀合物对血清PCSK9和LDL 胆固醇两者都具有强有力的减少效应。当比较多次注射SEQ ID NO:3和 SEQ ID NO:19(图17)的数据时，注意到相同的关系:没有缀合的分子只有 较小的效应，而相应的GalNAc缀合物(SEQ ID NO:19)对血清PCSK9和 LDL胆固醇具有强有力的下调。应该注意到:SEQ ID NO:18和19对血 清PCSK9和LDL胆固醇的效应是剂量依赖性的，并且具有长的作用持续 期,在最后一次注射后(最后一次注射在第22天,关于直到第71天为止的 恢复期阐明的数据)，其血清PCSK9和LDL胆固醇低于平均基线水平持 续了至少7周。
在最后一次注射1周之后，即在所述研究的第29天，分析了肝脏和肾 的寡核苷酸含量。使用杂交ELISA方法(基本上按照Lindholm等人在Mol Ther.2012Feb；20(2):376-81中所描述的方法)来分析寡核苷酸含量，在已 经控制使得如果使用所述的(缀合的)SEQ IDNO:18来制作标准曲线而结 果没有任何变化之后，使用SEQ ID NO:2为被SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:18处理的动物样品制作一条标准曲线。以同样的方式，在已经控制使 得如果使用SEQ ID NO:19来制作用于那些样品的ELISA分析的标准曲 线而结果没有任何差别之后，使用SEQ ID NO:3来为SEQ ID NO:3和 SEQ ID NO:19制作一条标准曲线。
Figure BDA0002614551260000931
正如上表中所阐明的那样，当给动物一周静脉内注射一次持续4周时， 在最后一次注射1周之后，SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的缀合导致所 缀合的分子(SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19)的肝脏/肾比率比相应的没 有缀合的分子的肝脏/肾比率高。考虑到采用其它没有缀合的抗-PCSK9的 分子(例如SEQ ID NO:1,如图15中所阐明的那样)已经展示了肾小管毒性 征兆，以及考虑到肝脏是抗-PCSK9治疗的靶器官,期望向更高肝脏/肾比 率的转变将要导致所述缀合的SEQ ID NO:18和19与所述没有缀合的 SEQ ID NO:2和3相比，具有增大的安全性。
正如图16中所图解的，以药理学相关的水平定量给药SEQ ID NO:18 和19。在所述处理期和恢复期期间，同样动物的临床化学分布图没有展示 出肝脏或肾安全性参数的相关增加。
序列表
<110> 罗氏创新中心哥本哈根有限公司
<120> 靶向PCSK9的反义寡聚体和缀合物
<130> 1141WO
<160> 46
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> LNA反义间隙体寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(14)
<223> 硫代磷酸酯核苷间连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> LNA核苷, LNA C是5-甲基C
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(14)
<223> LNA核苷, LNA C是5-甲基C
<400> 1
tgctacaaaa ccca 14
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> LNA反义间隙体寡核苷酸
<220>
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<222> (1)..(16)
<223> 硫代磷酸酯核苷间连接
<220>
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<222> (1)..(3)
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<220>
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<223> LNA核苷, LNA C是5-甲基C
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<212> DNA
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<223> 胆固醇-C6
<220>
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<222> (1)..(2)
<223> 磷酸二酯核苷间连接
<220>
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<222> (3)..(16)
<223> 硫代磷酸酯核苷间连接
<220>
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<222> (3)..(5)
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<210> 11
<211> 18
<212> DNA
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<220>
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<222> (1)..(1)
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<222> (3)..(5)
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<220>
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<220>
<223> LNA反义间隙体寡核苷酸缀合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
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<220>
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<222> (1)..(2)
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<220>
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<222> (3)..(17)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(4)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(17)
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<210> 13
<211> 18
<212> DNA
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<220>
<223> LNA反义间隙体寡核苷酸缀合物
<220>
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<222> (1)..(1)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 磷酸二酯核苷间连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(4)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(18)
<223> 硫代磷酸酯核苷间连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(18)
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catgctgtgt gagcttgg 18
<210> 14
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<222> (1)..(1)
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
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catgctgtgt gagcttgg 18
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
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<220>
<223> LNA反义间隙体寡核苷酸缀合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(18)
<223> 硫代磷酸酯核苷间连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(5)
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<220>
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<210> 16
<211> 18
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 胆固醇-C6
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 磷酸二酯核苷间连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(18)
<223> 硫代磷酸酯核苷间连接
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<400> 16
catcctggtc tgtgttcc 18
<210> 17
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<212> DNA
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
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<220>
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<222> (1)..(14)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
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<220>
<221> misc_feature
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tgctacaaaa ccca 14
<210> 18
<211> 16
<212> DNA
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<220>
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<220>
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<222> (1)..(1)
<223> GalNAc Conj2a
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> 硫代磷酸酯核苷间连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
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<222> (13)..(16)
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<212> DNA
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> GalNAc Conj2a
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> 硫代磷酸酯核苷间连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> LNA核苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> LNA核苷, LNA C是5-甲基C
<400> 19
aatgctacaa aaccca 16
<210> 20
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> LNA反义间隙体寡核苷酸缀合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> GalNAc Conj2a
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(15)
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<220>
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<222> (1)..(2)
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<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
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<211> 16
<212> DNA
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<220>
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<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> GalNAc Conj2a
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
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<222> (1)..(16)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
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tgctgtgtga gcttgg 16
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<212> DNA
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<220>
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<222> (14)..(16)
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tgctgtgtga gcttgg 16
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<211> 16
<212> DNA
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<220>
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<222> (1)..(1)
<223> GalNAc Conj2a
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> 硫代磷酸酯核苷间连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> LNA核苷, LNA C是5-甲基C
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
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<400> 23
tcctggtctg tgttcc 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> GalNAc Conj2a
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> 硫代磷酸酯核苷间连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> LNA核苷, LNA C是5-甲基C
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(16)
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<400> 24
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 核碱基基序
<400> 26
aatgctacaa aaccca 16
<210> 27
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 核碱基基序
<400> 27
gctgtgtgag cttgg 15
<210> 28
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 核碱基基序
<400> 28
tgctgtgtga gcttgg 16
<210> 29
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 核碱基基序
<400> 29
tcctggtctg tgttcc 16
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<211> 14
<212> RNA
<213> 智人
<400> 30
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<211> 16
<212> RNA
<213> 智人
<400> 31
uggguuuugu agcauu 16
<210> 32
<211> 15
<212> RNA
<213> 智人
<400> 32
ccaagcucac acagc 15
<210> 33
<211> 16
<212> RNA
<213> 智人
<400> 33
ccaagcucac acagca 16
<210> 34
<211> 16
<212> RNA
<213> 智人
<400> 34
ggaacacaga ccagga 16
<210> 35
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> LNA反义间隙体寡核苷酸缀合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> 磷酸二酯核苷间连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> FAM缀合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(16)
<223> 硫代磷酸酯核苷间连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(5)
<223> LNA核苷, LNA C是5-甲基C
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> LNA核苷, LNA C是5-甲基C
<400> 35
tcagcattgg tattca 16
<210> 36
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> LNA反义间隙体寡核苷酸缀合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 磷酸二酯核苷间连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> FAM缀合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(15)
<223> 硫代磷酸酯核苷间连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(4)
<223> LNA核苷, LNA C是5-甲基C
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(15)
<223> LNA核苷, LNA C是5-甲基C
<400> 36
cagcattggt attca 15
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<211> 14
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> LNA反义间隙体寡核苷酸缀合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 磷酸二酯核苷间连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> FAM缀合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(14)
<223> 硫代磷酸酯核苷间连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> LNA核苷, LNA C是5-甲基C
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(14)
<223> LNA核苷, LNA C是5-甲基C
<400> 37
agcattggta ttca 14
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> LNA反义间隙体寡核苷酸缀合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> 磷酸二酯核苷间连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> FAM缀合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(16)
<223> 硫代磷酸酯核苷间连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(5)
<223> LNA核苷, LNA C是5-甲基C
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> LNA核苷, LNA C是5-甲基C
<400> 38
gacgcattgg tattca 16
<210> 39
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> LNA反义间隙体寡核苷酸缀合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(13)
<223> 硫代磷酸酯核苷间连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> LNA核苷, LNA C是5-甲基C
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> FAM缀合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(13)
<223> LNA核苷, LNA C是5-甲基C
<400> 39
gcattggtat tca 13
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<211> 13
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> LNA反义间隙体寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(13)
<223> 硫代磷酸酯核苷间连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> LNA核苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(13)
<223> LNA核苷, LNA C是5-甲基C
<400> 40
gtctgtggaa gcg 13
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<211> 13
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> LNA反义间隙体寡核苷酸缀合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 胆固醇-C6
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(13)
<223> 硫代磷酸酯核苷间连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> LNA核苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(13)
<223> LNA核苷, LNA C是5-甲基C
<400> 41
gtctgtggaa gcg 13
<210> 42
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> LNA反义间隙体寡核苷酸缀合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 胆固醇-C6
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 磷酸二酯核苷间连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(4)
<223> LNA核苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(15)
<223> 硫代磷酸酯核苷间连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(15)
<223> LNA核苷, LNA C是5-甲基C
<400> 42
cagtctgtgg aagcg 15
<210> 43
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> LNA反义间隙体寡核苷酸缀合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 胆固醇-C6
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 磷酸二酯核苷间连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(4)
<223> LNA核苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(15)
<223> 硫代磷酸酯核苷间连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(15)
<223> LNA核苷, LNA C是5-甲基C
<400> 43
ctgtctgtgg aagcg 15
<210> 44
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 核碱基基序
<400> 44
gtctgtggaa gcg 13
<210> 45
<211> 13
<212> RNA
<213> 智人
<400> 45
cgcuuccaca gac 13
<210> 46
<211> 3731
<212> DNA
<213> 智人
<400> 46
gtccgatggg gctctggtgg cgtgatctgc gcgccccagg cgtcaagcac ccacacccta 60
gaaggtttcc gcagcgacgt cgaggcgctc atggttgcag gcgggcgccg ccgttcagtt 120
cagggtctga gcctggagga gtgagccagg cagtgagact ggctcgggcg ggccgggacg 180
cgtcgttgca gcagcggctc ccagctccca gccaggattc cgcgcgcccc ttcacgcgcc 240
ctgctcctga acttcagctc ctgcacagtc ctccccaccg caaggctcaa ggcgccgccg 300
gcgtggaccg cgcacggcct ctaggtctcc tcgccaggac agcaacctct cccctggccc 360
tcatgggcac cgtcagctcc aggcggtcct ggtggccgct gccactgctg ctgctgctgc 420
tgctgctcct gggtcccgcg ggcgcccgtg cgcaggagga cgaggacggc gactacgagg 480
agctggtgct agccttgcgt tccgaggagg acggcctggc cgaagcaccc gagcacggaa 540
ccacagccac cttccaccgc tgcgccaagg atccgtggag gttgcctggc acctacgtgg 600
tggtgctgaa ggaggagacc cacctctcgc agtcagagcg cactgcccgc cgcctgcagg 660
cccaggctgc ccgccgggga tacctcacca agatcctgca tgtcttccat ggccttcttc 720
ctggcttcct ggtgaagatg agtggcgacc tgctggagct ggccttgaag ttgccccatg 780
tcgactacat cgaggaggac tcctctgtct ttgcccagag catcccgtgg aacctggagc 840
ggattacccc tccacggtac cgggcggatg aataccagcc ccccgacgga ggcagcctgg 900
tggaggtgta tctcctagac accagcatac agagtgacca ccgggaaatc gagggcaggg 960
tcatggtcac cgacttcgag aatgtgcccg aggaggacgg gacccgcttc cacagacagg 1020
ccagcaagtg tgacagtcat ggcacccacc tggcaggggt ggtcagcggc cgggatgccg 1080
gcgtggccaa gggtgccagc atgcgcagcc tgcgcgtgct caactgccaa gggaagggca 1140
cggttagcgg caccctcata ggcctggagt ttattcggaa aagccagctg gtccagcctg 1200
tggggccact ggtggtgctg ctgcccctgg cgggtgggta cagccgcgtc ctcaacgccg 1260
cctgccagcg cctggcgagg gctggggtcg tgctggtcac cgctgccggc aacttccggg 1320
acgatgcctg cctctactcc ccagcctcag ctcccgaggt catcacagtt ggggccacca 1380
atgcccaaga ccagccggtg accctgggga ctttggggac caactttggc cgctgtgtgg 1440
acctctttgc cccaggggag gacatcattg gtgcctccag cgactgcagc acctgctttg 1500
tgtcacagag tgggacatca caggctgctg cccacgtggc tggcattgca gccatgatgc 1560
tgtctgccga gccggagctc accctggccg agttgaggca gagactgatc cacttctctg 1620
ccaaagatgt catcaatgag gcctggttcc ctgaggacca gcgggtactg acccccaacc 1680
tggtggccgc cctgcccccc agcacccatg gggcaggttg gcagctgttt tgcaggactg 1740
tatggtcagc acactcgggg cctacacgga tggccacagc cgtcgcccgc tgcgccccag 1800
atgaggagct gctgagctgc tccagtttct ccaggagtgg gaagcggcgg ggcgagcgca 1860
tggaggccca agggggcaag ctggtctgcc gggcccacaa cgcttttggg ggtgagggtg 1920
tctacgccat tgccaggtgc tgcctgctac cccaggccaa ctgcagcgtc cacacagctc 1980
caccagctga ggccagcatg gggacccgtg tccactgcca ccaacagggc cacgtcctca 2040
caggctgcag ctcccactgg gaggtggagg accttggcac ccacaagccg cctgtgctga 2100
ggccacgagg tcagcccaac cagtgcgtgg gccacaggga ggccagcatc cacgcttcct 2160
gctgccatgc cccaggtctg gaatgcaaag tcaaggagca tggaatcccg gcccctcagg 2220
agcaggtgac cgtggcctgc gaggagggct ggaccctgac tggctgcagt gccctccctg 2280
ggacctccca cgtcctgggg gcctacgccg tagacaacac gtgtgtagtc aggagccggg 2340
acgtcagcac tacaggcagc accagcgaag gggccgtgac agccgttgcc atctgctgcc 2400
ggagccggca cctggcgcag gcctcccagg agctccagtg acagccccat cccaggatgg 2460
gtgtctgggg agggtcaagg gctggggctg agctttaaaa tggttccgac ttgtccctct 2520
ctcagccctc catggcctgg cacgagggga tggggatgct tccgcctttc cggggctgct 2580
ggcctggccc ttgagtgggg cagcctcctt gcctggaact cactcactct gggtgcctcc 2640
tccccaggtg gaggtgccag gaagctccct ccctcactgt ggggcatttc accattcaaa 2700
caggtcgagc tgtgctcggg tgctgccagc tgctcccaat gtgccgatgt ccgtgggcag 2760
aatgactttt attgagctct tgttccgtgc caggcattca atcctcaggt ctccaccaag 2820
gaggcaggat tcttcccatg gataggggag ggggcggtag gggctgcagg gacaaacatc 2880
gttggggggt gagtgtgaaa ggtgctgatg gccctcatct ccagctaact gtggagaagc 2940
ccctgggggc tccctgatta atggaggctt agctttctgg atggcatcta gccagaggct 3000
ggagacaggt gcgcccctgg tggtcacagg ctgtgccttg gtttcctgag ccacctttac 3060
tctgctctat gccaggctgt gctagcaaca cccaaaggtg gcctgcgggg agccatcacc 3120
taggactgac tcggcagtgt gcagtggtgc atgcactgtc tcagccaacc cgctccacta 3180
cccggcaggg tacacattcg cacccctact tcacagagga agaaacctgg aaccagaggg 3240
ggcgtgcctg ccaagctcac acagcaggaa ctgagccaga aacgcagatt gggctggctc 3300
tgaagccaag cctcttctta cttcacccgg ctgggctcct catttttacg ggtaacagtg 3360
aggctgggaa ggggaacaca gaccaggaag ctcggtgagt gatggcagaa cgatgcctgc 3420
aggcatggaa ctttttccgt tatcacccag gcctgattca ctggcctggc ggagatgctt 3480
ctaaggcatg gtcgggggag agggccaaca actgtccctc cttgagcacc agccccaccc 3540
aagcaagcag acatttatct tttgggtctg tcctctctgt tgccttttta cagccaactt 3600
ttctagacct gttttgcttt tgtaacttga agatatttat tctgggtttt gtagcatttt 3660
tattaatatg gtgacttttt aaaataaaaa caaacaaacg ttgtcctaac aaaaaaaaaa 3720
aaaaaaaaaa a 3731

Claims (26)

1.一种反义寡核苷酸缀合物，其包含:
a.长度为12-22个核苷酸的反义寡聚体(A),它包含与SEQ ID NO 30或31或32或33或34或45的相应长度互补的10-16个核苷酸的毗连序列,和
b.至少一个与所述的寡聚体(A)共价连接的非核苷酸或非多核苷酸缀合部分(C)。
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸缀合物,其中所述的反义寡聚体包含一个选自由下列组成的组的毗连序列:SEQ ID NO 25、26、27、28、29和44。
3.根据权利要求1或2中任意一项所述的寡核苷酸缀合物,其中所述的反义寡聚体靶向PCSK9。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的寡核苷酸缀合物,其中所述的反义寡聚体包含一个选自由下列组成的组的毗连序列:SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7和8。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的寡核苷酸缀合物,其中所述的缀合部分(C)选自由下列组成的组:碳水化合物,例如GalNAc或GalNAc簇；亲脂性基团,例如脂质、脂肪酸；甾醇,例如胆固醇或生育酚；或抑制素。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的反义寡核苷酸缀合物,其中所述的缀合部分(C)增强向肝细胞的递送和/或摄取。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的反义寡核苷酸缀合物,其中所述的缀合部分(C)包含甾醇，例如生育酚、胆固醇,例如以Conj 5、Conj 5、Conj 6或Conj 6a显示的那些。
8.根据权利要求1-6的反义寡核苷酸缀合物,其中所述的缀合部分(C)包含碳水化合物，例如GalNAc或三价的GalNAc,例如以Conj 1、2、3或4或1a、2a、3a或4a显示的那些。
9.根据权利要求8所述的反义寡核苷酸缀合物,其中所述的缀合部分(C)包含Conj 2a。
10.根据权利要求1-9中任意一项所述的反义寡核苷酸缀合物,其选自由下列组成的组:SEQ ID NO 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23和24。
11.根据权利要求1-10中任意一项所述的反义寡核苷酸缀合物,其中所述的反义寡聚体(A)经由一个位于所述寡聚体的毗连序列与所述的缀合部分(C)之间的接头区(B和/或Y)与所述的缀合部分(C)缀合。
12.根据权利要求11所述的反义寡核苷酸缀合物,其中所述的接头选自C6至C12氨基烷基。
13.根据权利要求12所述的反义寡核苷酸缀合物,其中所述的接头是包含1-6个核苷酸的可生物切除的磷酸酯核苷酸接头。
14.一种长度为12-22个核苷酸的寡聚体,其包含
a.一个与SEQ ID NO 31的相应长度互补的16个核苷酸的毗连序列,或
b.一个与SEQ ID NO 33或34或45的相应长度互补的10-16个核苷酸的毗连序列。
15.根据权利要求14所述的寡聚体,其包含一个选自由下列组成的组的毗连序列:SEQID NO 26、27、28、29和44。
16.根据权利要求14或15中任意一项所述的寡聚体,其中所述的寡聚体靶向PCSK9。
17.根据权利要求14-16中任意一项所述的寡聚体，其中所述的毗连序列包含增强亲和性的核苷酸类似物。
18.根据权利要求14-17中任意一项所述的寡聚体,其是间隙体。
19.根据权利要求14-18中任意一项所述的寡聚体,其中所述的寡聚体包含一个13、14、15或16个核苷酸的毗连序列。
20.根据权利要求14-19中任意一项所述的寡聚体,其中所述的寡聚体包含一个或更多个选自由下列组成的组的核苷连接:硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和硼烷基磷酸酯。
21.根据权利要求14-20中任意一项所述的寡聚体,其包含选自由下列组成的组的毗连序列:SEQ ID NO 2、3、4、5、6、7和8。
22.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-21中任意一项所述的寡聚体或反义寡核苷酸缀合物和药学上可接受的稀释剂、载体、盐或佐剂。
23.根据权利要求1-22中任意一项所述的寡聚体或反义寡核苷酸缀合物或药物组合物，其用作药物，如用于治疗高胆固醇血症或相关病症,所述病症例如是一种选自由下列组成的组的病症:动脉粥样硬化症、高脂血症、高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症，例如获得PCSK9中的功能突变、HDL/LDL胆固醇失衡、血脂异常，例如家族性高脂血症(FCHL)或家族性高胆固醇血症(FHC)、获得性高脂血症、抑制素抗性的高胆固醇血症、冠状动脉病(CAD)和冠心病(CHD)。
24.根据权利要求1-22中任意一项所述的寡聚体或反义寡核苷酸缀合物或药物组合物用于生产用于治疗高胆固醇血症或相关病症的药物的用途,所述病症例如是一种选自由下列组成的组的病症:动脉粥样硬化症、高脂血症、高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症，例如获得PCSK9中的功能突变、HDL/LDL胆固醇失衡、血脂异常，例如家族性高脂血症(FCHL)或家族性高胆固醇血症(FHC)、获得性高脂血症、抑制素抗性的高胆固醇血症、冠状动脉病(CAD)和冠心病(CHD)。
25.一种治疗高胆固醇血症或相关病症的方法，所述的病症例如是一种选自由下列组成的组的病症:动脉粥样硬化症、高脂血症、高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症，例如获得PCSK9中的功能突变、HDL/LDL胆固醇失衡、血脂异常，例如家族性高胆固醇血症(FHC)、获得性高脂血症、抑制素抗性的高胆固醇血症、冠状动脉病(CAD)和冠心病(CHD)，所述方法包括向遭受或可能遭受高胆固醇血症或相关病症的患者施用有效量的根据权利要求1-22中任意一项所述的寡聚体或反义寡核苷酸缀合物或药物组合物。
26.一种用于在体内或在体外抑制表达PCSK9的细胞中的PCSK9的方法，所述方法包括向所述的细胞施用根据权利要求1-22中任意一项所述的寡聚体或反义寡核苷酸缀合物或药物组合物。
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Families Citing this family (88)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2744987C (en) 2008-12-02 2018-01-16 Chiralgen, Ltd. Method for the synthesis of phosphorus atom modified nucleic acids
BR112012000828A8 (pt) 2009-07-06 2017-10-10 Ontorii Inc Novas pró-drogas de ácido nucleico e métodos de uso das mesmas
WO2012039448A1 (ja) 2010-09-24 2012-03-29 株式会社キラルジェン 不斉補助基
US9605019B2 (en) 2011-07-19 2017-03-28 Wave Life Sciences Ltd. Methods for the synthesis of functionalized nucleic acids
KR20220139425A (ko) 2012-07-13 2022-10-14 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 키랄 제어
AU2013288048A1 (en) 2012-07-13 2015-01-22 Wave Life Sciences Ltd. Asymmetric auxiliary group
EP2992009B1 (en) 2013-05-01 2020-06-24 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating apolipoprotein (a) expression
DK3013959T3 (da) 2013-06-27 2020-02-17 Roche Innovation Ct Copenhagen As Antisense-oligomerer og konjugater målrettet pcsk9
EP3095461A4 (en) 2014-01-15 2017-08-23 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having immunity induction activity, and immunity induction activator
WO2015108048A1 (ja) 2014-01-15 2015-07-23 株式会社新日本科学 抗腫瘍作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗腫瘍剤
PT3094728T (pt) 2014-01-16 2022-05-19 Wave Life Sciences Ltd Desenho quiral
ES2745825T3 (es) 2014-05-01 2020-03-03 Ionis Pharmaceuticals Inc Composiciones y métodos para modular la expresión del factor B del complemento
WO2015168589A2 (en) 2014-05-01 2015-11-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating angiopoietin-like 3 expression
CN110903337A (zh) 2014-05-01 2020-03-24 Ionis制药公司 用于调节生长激素受体表达的组合物和方法
GB201408623D0 (en) 2014-05-15 2014-07-02 Santaris Pharma As Oligomers and oligomer conjugates
KR102579520B1 (ko) 2015-08-06 2023-09-15 에프. 호프만-라 로슈 아게 Galnac 산 유도체의 제조 방법
EP3353305A4 (en) * 2015-09-25 2019-09-18 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated antisense compounds and their use
EP3359523A4 (en) 2015-10-09 2019-07-24 Wave Life Sciences Ltd. OLIGONUCLEOTIDE COMPOSITIONS AND RELATED METHODS
WO2017068087A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotide detection method
WO2017079739A1 (en) 2015-11-06 2017-05-11 Ionis Pharmaceuticals, Inc. MODULATING APOLIPOPROTEIN (a) EXPRESSION
MX2018005733A (es) * 2015-11-16 2018-08-09 Hoffmann La Roche Fosforamidita de agrupacion de n-acetilgalactosamina (galnac).
AU2017235278C1 (en) 2016-03-14 2022-03-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Oligonucleotides for reduction of PD-L1 expression
MA45478A (fr) 2016-04-11 2019-02-20 Arbutus Biopharma Corp Compositions de conjugués d'acides nucléiques ciblés
WO2017216340A1 (en) * 2016-06-17 2017-12-21 F. Hoffmann-La Roche Ag In vitro nephrotoxicity screening assay
MA45496A (fr) 2016-06-17 2019-04-24 Hoffmann La Roche Molécules d'acide nucléique pour la réduction de l'arnm de padd5 ou pad7 pour le traitement d'une infection par l'hépatite b
EP3472347B1 (en) 2016-06-17 2023-01-04 F. Hoffmann-La Roche AG In vitro nephrotoxicity screening assay
AU2017281497B2 (en) 2016-06-22 2023-04-06 Proqr Therapeutics Ii B.V. Single-stranded RNA-editing oligonucleotides
AU2017324462B2 (en) * 2016-09-07 2024-03-21 Sangamo Therapeutics, Inc. Modulation of liver genes
US11400161B2 (en) 2016-10-06 2022-08-02 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Method of conjugating oligomeric compounds
EP3568481A1 (en) 2017-01-13 2019-11-20 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligonucleotides for modulating relb expression
EP3568479A1 (en) 2017-01-13 2019-11-20 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligonucleotides for modulating nfkb1 expression
US20190338286A1 (en) 2017-01-13 2019-11-07 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligonucleotides for modulating rel expression
US20200216845A1 (en) 2017-01-13 2020-07-09 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligonucleotides for modulating rela expression
EP3568480A1 (en) 2017-01-13 2019-11-20 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligonucleotides for modulating nfkb2 expression
EP3594346A4 (en) 2017-03-10 2020-12-16 National Center For Child Health And Development ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE AND COMPOSITION FOR THE PREVENTION OR TREATMENT OF GLYCOGEN STORAGE DISEASE TYPE IA
JOP20190215A1 (ar) * 2017-03-24 2019-09-19 Ionis Pharmaceuticals Inc مُعدّلات التعبير الوراثي عن pcsk9
CA3059426A1 (en) 2017-04-11 2018-10-18 Arbutus Biopharma Corporation Targeted compositions
CA3058567A1 (en) 2017-04-13 2018-10-18 Cadila Healthcare Limited Novel peptide based pcsk9 vaccine
WO2018215049A1 (en) 2017-05-23 2018-11-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Process for galnac oligonucleotide conjugates
WO2018216785A1 (ja) 2017-05-26 2018-11-29 国立研究開発法人国立循環器病研究センター Ｐｃｓｋ９を標的としたアンチセンス核酸
WO2019030313A2 (en) 2017-08-11 2019-02-14 Roche Innovation Center Copenhagen A/S OLIGONUCLEOTIDES FOR MODULATION OF UBE3C EXPRESSION
WO2019038228A1 (en) 2017-08-22 2019-02-28 Roche Innovation Center Copenhagen A/S OLIGONUCLEOTIDES FOR MODULATION OF TOM1 EXPRESSION
WO2019073018A1 (en) 2017-10-13 2019-04-18 Roche Innovation Center Copenhagen A/S METHODS OF IDENTIFYING ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE IMPROVED OLIGONUCLEOTIDE PHOSPHOROTHIOATE STEREODEFINIS VARIANTS USING PARTIALLY STEREODEFINIS OLIGONUCLEOTIDE SUB LIBRARIES
US10953034B2 (en) 2017-10-16 2021-03-23 Hoffmann-La Roche Inc. Nucleic acid molecule for reduction of PAPD5 and PAPD7 mRNA for treating hepatitis B infection
JP2021505175A (ja) 2017-12-11 2021-02-18 ロシュ イノベーション センター コペンハーゲン エーエス Ｆｎｄｃ３ｂの発現を調節するためのオリゴヌクレオチド
WO2019115417A2 (en) 2017-12-12 2019-06-20 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotides for modulating rb1 expression
CA3085211A1 (en) 2017-12-21 2019-06-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Companion diagnostic for htra1 rna antagonists
TW201929870A (zh) 2017-12-22 2019-08-01 丹麥商羅氏創新中心哥本哈根有限公司 包含二硫代磷酸酯核苷間連結之寡核苷酸
JP7476101B2 (ja) 2017-12-22 2024-04-30 ロシュ イノベーション センター コペンハーゲン エーエス ホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含むギャップマーオリゴヌクレオチド
JP2021508327A (ja) 2017-12-22 2021-03-04 ロシュ イノベーション センター コペンハーゲン エーエス 新規のチオホスホラミダイト
EP3737758A1 (en) 2018-01-10 2020-11-18 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotides for modulating pias4 expression
US20210095275A1 (en) 2018-01-12 2021-04-01 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotides for modulating gsk3b expression
CA3088112A1 (en) 2018-01-12 2019-07-18 Bristol-Myers Squibb Company Antisense oligonucleotides targeting alpha-synuclein and uses thereof
MX2020006973A (es) 2018-01-12 2020-09-09 Roche Innovation Ct Copenhagen As Oligonucleotidos antisentido para alfa-sinucleina y usos de los mismos.
AU2019208011A1 (en) 2018-01-12 2020-07-23 Bristol-Myers Squibb Company Antisense oligonucleotides targeting alpha-synuclein and uses thereof
EP3740574A1 (en) 2018-01-17 2020-11-25 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotides for modulating erc1 expression
WO2019145386A1 (en) 2018-01-26 2019-08-01 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotides for modulating csnk1d expression
SG11202007652UA (en) 2018-02-21 2020-09-29 Bristol Myers Squibb Co Camk2d antisense oligonucleotides and uses thereof
CN111868244A (zh) * 2018-03-20 2020-10-30 国立大学法人东京工业大学 降低了毒性的反义寡核苷酸
PE20211912A1 (es) 2018-04-05 2021-09-28 Centre Nat Rech Scient Uso de inhibidores de fubp1 para el tratamiento de infeccion de virus de hepatitis b
CR20210179A (es) 2018-07-03 2022-05-23 Hoffmann La Roche OLIGONUCLEÓTIDOS PARA MODULAR LA EXPRESIÓN DE TAU (Divisional 2021-0058)
MX2021000404A (es) 2018-07-13 2021-03-25 Hoffmann La Roche Oligonucleotidos para modular la expresion de rtel1.
EP3830101A1 (en) 2018-07-31 2021-06-09 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotides comprising a phosphorotrithioate internucleoside linkage
ES2924362T3 (es) 2018-07-31 2022-10-06 Roche Innovation Ct Copenhagen As Oligonucleótidos que comprenden un enlace internucleosídico fosforotritioato
TW202102516A (zh) 2019-02-20 2021-01-16 丹麥商羅氏創新中心哥本哈根有限公司 膦醯基乙酸酯間隙子寡核苷酸
CA3129646A1 (en) 2019-02-20 2020-08-27 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Novel phosphoramidites
JP7503072B2 (ja) 2019-02-26 2024-06-19 ロシュ イノベーション センター コペンハーゲン エーエス オリゴヌクレオチドの製剤化方法
EP3947678A1 (en) 2019-04-02 2022-02-09 ProQR Therapeutics II B.V. Antisense oligonucleotides for immunotherapy
EA202192733A1 (ru) 2019-04-03 2022-03-14 Бристол-Маерс Сквибб Компани Антисмысловые олигонуклеотиды angptl2 и их применения
JP2023506954A (ja) 2019-12-19 2023-02-20 エフ． ホフマン－ラ ロシュ エージー． Ｂ型肝炎ウイルス感染を処置するためのｓａｒａｆ阻害剤の使用
WO2021122735A1 (en) 2019-12-19 2021-06-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Use of sept9 inhibitors for treating hepatitis b virus infection
EP4077669A1 (en) 2019-12-19 2022-10-26 F. Hoffmann-La Roche AG Use of sbds inhibitors for treating hepatitis b virus infection
JP2023506547A (ja) 2019-12-19 2023-02-16 エフ． ホフマン－ラ ロシュ エージー． Ｂ型肝炎ウイルス感染を処置するためのｃｏｐｓ３阻害剤の使用
JP2023506540A (ja) 2019-12-19 2023-02-16 エフ． ホフマン－ラ ロシュ エージー． Ｂ型肝炎ウイルス感染を処置するためのｓｃａｍｐ３阻害剤の使用
MX2022007909A (es) 2019-12-24 2022-07-21 Hoffmann La Roche Combinacion farmaceutica de agentes antivirales que actuan sobre hbv y/o un inmunomodulador para el tratamiento de hbv.
EP4081639A1 (en) 2019-12-24 2022-11-02 F. Hoffmann-La Roche AG Pharmaceutical combination of a therapeutic oligonucleotide targeting hbv and a tlr7 agonist for treatment of hbv
MX2022010980A (es) 2020-03-04 2022-12-02 Verve Therapeutics Inc Composiciones y metodos para el suministro de arn dirigido.
EP4081642A1 (en) * 2020-03-16 2022-11-02 Argonaute Rna Limited Antagonist of pcsk9
AR122731A1 (es) 2020-06-26 2022-10-05 Hoffmann La Roche Oligonucleótidos mejorados para modular la expresión de fubp1
WO2022038211A2 (en) 2020-08-21 2022-02-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Use of a1cf inhibitors for treating hepatitis b virus infection
CR20230308A (es) * 2020-12-11 2023-09-08 Civi Biopharma Inc Entrega oral de conjugados antisentido que tienen por blanco a pcsk9
TW202246500A (zh) 2021-02-02 2022-12-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 用於抑制 ｒｔｅｌ１ 表現之增強型寡核苷酸
TW202305132A (zh) 2021-03-08 2023-02-01 法商施維雅藥廠 用於抑制α-突觸核蛋白表達之反義寡核苷酸
CA3232743A1 (en) * 2021-09-23 2023-03-30 Curt Bradshaw Polynucleic acid molecules targeting pcsk9 and uses thereof
WO2023111210A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination of oligonucleotides for modulating rtel1 and fubp1
US20240167040A1 (en) 2022-02-21 2024-05-23 Hoffmann-La Roche Inc. Antisense oligonucleotide
US20230372508A1 (en) * 2022-05-19 2023-11-23 Olix Us, Inc. Linkers coupling functional ligands to macromolecules
CN117563009A (zh) * 2023-09-01 2024-02-20 北京悦康科创医药科技股份有限公司 一种含有核糖环或其衍生结构的GalNAc化合物及其寡核苷酸缀合物

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1211923A (zh) * 1995-11-22 1999-03-24 约翰斯·霍普金斯大学 增强生物分子的细胞摄取的配体
WO2009134487A2 (en) * 2008-01-31 2009-11-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Optimized methods for delivery of dsrna targeting the pcsk9 gene
WO2011009697A1 (en) * 2009-07-21 2011-01-27 Santaris Pharma A/S Antisense oligomers targeting pcsk9
US20110123520A1 (en) * 2008-04-11 2011-05-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Site-specific delivery of nucleic acids by combining targeting ligands with endosomolytic components
CN102203255A (zh) * 2008-07-02 2011-09-28 桑塔里斯制药公司 靶向hsp27的rna拮抗剂
CN103492568A (zh) * 2010-12-17 2014-01-01 箭头研究公司 用于siRNA的半乳糖簇-药代动力学调节剂靶向部分
CN105358692B (zh) * 2013-06-27 2020-08-21 罗氏创新中心哥本哈根有限公司 靶向pcsk9的反义寡聚体和缀合物

Family Cites Families (139)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2699808A (en) 1944-10-06 1955-01-18 Mark W Lowe Apparatus for peeling tomatoes
US2699508A (en) 1951-12-21 1955-01-11 Selectronics Inc Method of mounting and construction of mounting for low frequency piezoelectric crystals
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4587044A (en) 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US4914210A (en) 1987-10-02 1990-04-03 Cetus Corporation Oligonucleotide functionalizing reagents
US4962029A (en) 1987-10-02 1990-10-09 Cetus Corporation Covalent oligonucleotide-horseradish peroxidase conjugate
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US6395492B1 (en) 1990-01-11 2002-05-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Derivatized oligonucleotides having improved uptake and other properties
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
WO1992008728A1 (en) 1990-11-08 1992-05-29 Hybridon, Inc. Incorporation of multiple reporter groups on synthetic oligonucleotides
JP2823959B2 (ja) 1991-10-24 1998-11-11 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド 改良された取り込みおよびその他の性質を持つ誘導化オリゴヌクレオチド
NL9201440A (nl) 1992-08-11 1994-03-01 Univ Leiden Triantennaire clusterglycosiden, hun bereiding en toepassing.
JPH06311885A (ja) 1992-08-25 1994-11-08 Mitsubishi Kasei Corp Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子に相補的なアンチセンス化合物
EP0662157B1 (en) 1992-09-10 2001-06-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treatment of hepatitis c virus-associated diseases
US6423489B1 (en) 1992-09-10 2002-07-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treatment of Hepatitis C virus-associated diseases
US6433159B1 (en) 1992-09-10 2002-08-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treatment of Hepatitis C virus associated diseases
EP0673559A1 (en) 1992-12-14 1995-09-27 Honeywell Inc. Motor system with individually controlled redundant windings
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
WO1995030746A1 (en) 1994-05-10 1995-11-16 The General Hospital Corporation Antisense inhibition of hepatitis c virus
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
WO1996011205A1 (en) 1994-10-06 1996-04-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acid conjugates
ATE233734T1 (de) 1995-06-07 2003-03-15 Pfizer Biphenyl-2-carbonsäure-tetrahydro-isochinolin-6 yl amid derivate, deren hestellung und deren verwendung als inhibitoren des mikrosomalen triglycerid-transfer-proteins und/oder der apolipoprotein b (apo b) sekretion
US5684142A (en) 1995-06-07 1997-11-04 Oncor, Inc. Modified nucleotides for nucleic acid labeling
US5656408A (en) 1996-04-29 1997-08-12 Xerox Corporation Coated carrier particles
SK65499A3 (en) 1996-11-27 2001-05-10 Pfizer Apo b-secretion/mtp inhibitory amides
EP0975809A4 (en) 1997-03-05 2002-10-30 Univ Washington EXAMINATION PROCEDURE FOR DETECTING AGENTS FOR SELECTIVE INHIBITION OF HCV REPLICATION
US6770748B2 (en) 1997-03-07 2004-08-03 Takeshi Imanishi Bicyclonucleoside and oligonucleotide analogue
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
US5770716A (en) 1997-04-10 1998-06-23 The Perkin-Elmer Corporation Substituted propargylethoxyamido nucleosides, oligonucleotides and methods for using same
JP2002502376A (ja) 1997-05-21 2002-01-22 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ 生物学的膜を横切る輸送を増強するための組成物および方法
EP2341058A3 (en) 1997-09-12 2011-11-23 Exiqon A/S Oligonucleotide Analogues
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US6096875A (en) 1998-05-29 2000-08-01 The Perlein-Elmer Corporation Nucleotide compounds including a rigid linker
US6300319B1 (en) 1998-06-16 2001-10-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Targeted oligonucleotide conjugates
US6335432B1 (en) 1998-08-07 2002-01-01 Bio-Red Laboratories, Inc. Structural analogs of amine bases and nucleosides
US6335437B1 (en) 1998-09-07 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for the preparation of conjugated oligomers
US6410323B1 (en) 1999-08-31 2002-06-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of human Rho family gene expression
CN1350542A (zh) 1999-03-18 2002-05-22 埃克西库恩公司 木－lna类似物
ATE332909T1 (de) 1999-03-24 2006-08-15 Exiqon As Verbesserte synthese für 2.2.1.öbicyclo- nukleoside
PT1178999E (pt) 1999-05-04 2007-06-26 Santaris Pharma As Análogos de l-ribo-lna
US6525191B1 (en) 1999-05-11 2003-02-25 Kanda S. Ramasamy Conformationally constrained L-nucleosides
US20040146516A1 (en) 1999-06-17 2004-07-29 Utah Ventures Ii L.P. Lumen-exposed molecules and methods for targeted delivery
US7029895B2 (en) 1999-09-27 2006-04-18 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 27411, a novel human PGP synthase
US6617442B1 (en) 1999-09-30 2003-09-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Human Rnase H1 and oligonucleotide compositions thereof
CA2385853A1 (en) 1999-10-04 2001-04-12 Exiqon A/S Design of high affinity rnase h recruiting oligonucleotide
IL139450A0 (en) 1999-11-10 2001-11-25 Pfizer Prod Inc Methods of administering apo b-secretion/mtp inhibitors
US20020068709A1 (en) 1999-12-23 2002-06-06 Henrik Orum Therapeutic uses of LNA-modified oligonucleotides
WO2001057081A2 (en) 2000-02-07 2001-08-09 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Narc-1, subtilase-like homologs
WO2002028875A2 (en) 2000-10-04 2002-04-11 Cureon A/S Improved synthesis of purine locked nucleic acid analogues
US20030125241A1 (en) 2001-05-18 2003-07-03 Margit Wissenbach Therapeutic uses of LNA-modified oligonucleotides in infectious diseases
US20070173473A1 (en) 2001-05-18 2007-07-26 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of proprotein convertase subtilisin Kexin 9 (PCSK9) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
DE60202681T2 (de) 2001-07-12 2006-01-12 Santaris Pharma A/S Verfahren zur herstellung des lna phosphoramidite
US7888324B2 (en) 2001-08-01 2011-02-15 Genzyme Corporation Antisense modulation of apolipoprotein B expression
US7407943B2 (en) 2001-08-01 2008-08-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of apolipoprotein B expression
DK2264172T3 (da) 2002-04-05 2017-11-27 Roche Innovation Ct Copenhagen As Oligomerforbindelser til modulering af HIF-1á-ekspression
ES2290448T3 (es) 2002-05-08 2008-02-16 Santaris Pharma A/S Sistesis de derivados de acidos nucleicos bloqueados.
WO2004014313A2 (en) 2002-08-12 2004-02-19 Bristol-Myers Squibb Company Combination pharmaceutical agents as inhibitors of hcv replication
UA79300C2 (en) 2002-08-12 2007-06-11 Janssen Pharmaceutica Nv N-aryl piperidine substituted biphenylcarboxamides as inhibitors of apolipoprotein b secretion
US7087229B2 (en) 2003-05-30 2006-08-08 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Releasable polymeric conjugates based on aliphatic biodegradable linkers
WO2004041889A2 (en) 2002-11-05 2004-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
WO2004044136A2 (en) 2002-11-05 2004-05-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising alternating 2’-modified nucleosides for use in gene modulation
WO2004044141A2 (en) 2002-11-05 2004-05-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated oligomeric compounds and their use in gene modulation
JP4986109B2 (ja) 2002-11-13 2012-07-25 ジェンザイム・コーポレーション アポリポタンパク質ｂ発現のアンチセンス調節
DK2284269T3 (en) 2002-11-18 2017-10-23 Roche Innovation Ct Copenhagen As Antisense design
FR2848572B1 (fr) 2002-12-12 2005-12-09 Univ Joseph Fourier Molecules inhibitrices de la synthese proteique du virus de l'hepatite c et procede de criblage desdites molecules inhibitrices
DK1592793T3 (da) 2003-02-10 2009-10-26 Santaris Pharma As Oligomeriske forbindelser for modulation af Survivin ekspression
EP1471152A1 (en) 2003-04-25 2004-10-27 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Mutations in the human PCSK9 gene associated to hypercholesterolemia
WO2004106356A1 (en) 2003-05-27 2004-12-09 Syddansk Universitet Functionalized nucleotide derivatives
ES2302898T3 (es) 2003-07-11 2008-08-01 Lbr Medbiotech B.V. Transferencia de genes a celulas musculares mediada por el receptor de manosa-6-fosfato.
US7683036B2 (en) 2003-07-31 2010-03-23 Regulus Therapeutics Inc. Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of small non-coding RNAs
ATE555118T1 (de) 2003-08-28 2012-05-15 Takeshi Imanishi Neue synthetische nukleidsäuren vom typ mit quervernetzter n-o-bindung
US20050053981A1 (en) 2003-09-09 2005-03-10 Swayze Eric E. Gapped oligomeric compounds having linked bicyclic sugar moieties at the termini
GB2442373B (en) 2003-11-26 2008-10-22 Univ Massachusetts Sequence -specific inhibition of small rna function
UA83510C2 (en) 2003-12-09 2008-07-25 Янссен Фармацевтика Н.В. N-aryl piperidine substituted biphenylcarboxamides as inhibitors of apolipoprotein b
US7622453B2 (en) 2003-12-23 2009-11-24 Santaris Pharma A/S Oligomeric compounds for the modulation of Bcl-2
US20080249039A1 (en) 2004-01-30 2008-10-09 Santaris Pharma A/S Modified Short Interfering Rna (Modified Sirna)
DK1735459T3 (da) 2004-04-07 2012-05-29 Exiqon As Fremgangsmåder til kvantificering af microRNA'er og små interfererende RNA'er
EP2338996A3 (en) 2004-05-04 2013-12-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for reducing viral genome amounts in a target cell
US20080213891A1 (en) 2004-07-21 2008-09-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. RNAi Agents Comprising Universal Nucleobases
WO2006093526A2 (en) 2004-07-21 2006-09-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising a modified or non-natural nucleobase
FR2873694B1 (fr) 2004-07-27 2006-12-08 Merck Sante Soc Par Actions Si Nouveaux aza-indoles inhibiteurs de la mtp et apob
AU2005330637B2 (en) 2004-08-04 2012-09-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising a ligand tethered to a modified or non-natural nucleobase
PT1786472E (pt) 2004-08-10 2013-03-06 Genzyme Corp Modulação anti-sentido de expressão de apolipoproteína
EP1791567B1 (en) 2004-08-10 2015-07-29 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Chemically modified oligonucleotides
NZ554214A (en) 2004-09-24 2009-10-30 Alnylam Pharmaceuticals Inc Rnai modulation of apob and uses thereof
AU2005306533B2 (en) 2004-11-17 2012-05-31 Arbutus Biopharma Corporation siRNA silencing of apolipoprotein B
US20060185027A1 (en) 2004-12-23 2006-08-17 David Bartel Systems and methods for identifying miRNA targets and for altering miRNA and target expression
EP1877369B1 (en) 2005-04-19 2013-07-10 Surface Logix, Inc. Inhibitors of microsomal triglyceride transfer protein and apo-b secretion
KR20080068019A (ko) 2005-09-15 2008-07-22 산타리스 팔마 에이/에스 아포지단백질-ｂ100 발현 억제용 ｒｎａ 길항제 화합물
WO2007031091A2 (en) 2005-09-15 2007-03-22 Santaris Pharma A/S Rna antagonist compounds for the modulation of p21 ras expression
JP5342881B2 (ja) 2006-01-27 2013-11-13 アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド ６−修飾された二環式核酸類似体
WO2007112754A2 (en) 2006-04-03 2007-10-11 Santaris Pharma A/S Pharmaceutical compositions comprising anti-mirna antisense oligonucleotides
CN103554205A (zh) 2006-05-05 2014-02-05 Isis制药公司 调节gccr的表达的化合物和方法
JP5570806B2 (ja) 2006-05-11 2014-08-13 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド Ｐｃｓｋ９遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法
AU2007249349B2 (en) 2006-05-11 2012-03-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5'-Modified bicyclic nucleic acid analogs
CA2658183A1 (en) 2006-07-17 2008-01-24 Sirna Therapeutics Inc. Rna interference mediated inhibition of proprotein convertase subtilisin kexin 9 (pcsk9) gene expression using short interfering nucleic acid (sina)
MX2009002859A (es) 2006-09-15 2009-03-30 Enzon Pharmaceuticals Inc Enlazadores biodegradables a base de ester impedido para suministro de oligonucleotidos.
MX2009002856A (es) 2006-09-15 2009-03-30 Enzon Pharmaceuticals Inc Conjugados polimericos que contienen porciones cargadas positivamente.
EP2076597A2 (en) 2006-10-09 2009-07-08 Santaris Pharma A/S Rna antagonist compounds for the modulation of pcsk9
WO2008061537A2 (en) 2006-11-23 2008-05-29 Querdenker Aps Oligonucleotides for modulating target rna activity
US8093222B2 (en) 2006-11-27 2012-01-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia
MX2009005527A (es) 2006-11-27 2009-06-08 Isis Pharmaceuticals Inc Metodos para el tratamiento de hipercolesterolemia.
WO2008089767A1 (en) 2007-01-26 2008-07-31 Diramo A/S Stacking of optic sensor and microfluidic-chips with optically communication through windows
WO2008109369A2 (en) 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting tnf gene expression and uses thereof
DK2149605T3 (da) 2007-03-22 2013-09-30 Santaris Pharma As Korte RNA antagonist forbindelser til modulering af det ønskede mRNA
WO2008124384A2 (en) 2007-04-03 2008-10-16 Aegerion Pharmaceuticals, Inc. Combinations of mtp inhibitors with cholesterol absorption inhibitors or interferon for treating hepatitis c
US8278425B2 (en) 2007-05-30 2012-10-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs
EP2173760B2 (en) 2007-06-08 2015-11-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbocyclic bicyclic nucleic acid analogs
CN101796062B (zh) 2007-07-05 2014-07-30 Isis制药公司 6-双取代双环核酸类似物
US20090140837A1 (en) 2007-07-19 2009-06-04 Glen Eric Jennings RF Token and Receptacle System and Method
WO2009025669A1 (en) 2007-08-20 2009-02-26 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Polymeric linkers containing pyridyl disulfide moieties
US8440637B2 (en) 2007-10-04 2013-05-14 Santaris Pharma A/S Combination treatment for the treatment of hepatitis C virus infection
WO2009067647A1 (en) 2007-11-21 2009-05-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbocyclic alpha-l-bicyclic nucleic acid analogs
CA2910760C (en) 2007-12-04 2019-07-09 Muthiah Manoharan Targeting lipids
WO2009090182A1 (en) 2008-01-14 2009-07-23 Santaris Pharma A/S C4'-substituted - dna nucleotide gapmer oligonucleotides
EP2285819B1 (en) 2008-04-04 2013-10-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising neutrally linked terminal bicyclic nucleosides
US20110224280A1 (en) 2008-04-16 2011-09-15 Niels Fisker Nielsen Pharmaceutical Composition Comprising Anti PCSK9 Oligomers
WO2009148605A2 (en) * 2008-06-04 2009-12-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia
AT507215B1 (de) 2009-01-14 2010-03-15 Boehler Edelstahl Gmbh & Co Kg Verschleissbeständiger werkstoff
EP2424521A4 (en) * 2009-04-29 2015-03-04 Amarin Pharmaceuticals Ie Ltd PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS COMPRISING EPA AND CARDIOVASCULAR AGENT AND METHODS OF USE
ES2555057T3 (es) 2009-06-12 2015-12-28 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Nuevos potentes compuestos antisentido anti-ApoB
WO2011126937A1 (en) 2010-04-06 2011-10-13 The University Of North Carolina At Chapel Hill Targeted intracellular delivery of oligonucleotides via conjugation with small molecule ligands
JP2013545736A (ja) 2010-10-29 2013-12-26 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド Ｐｃｓｋ９遺伝子の阻害のための組成物および方法
BR112013013247A2 (pt) 2010-12-13 2016-09-13 Ericsson Telefon Ab L M troca de parâmetros relativos a períodos de medição
ES2605990T3 (es) 2010-12-29 2017-03-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Conjugados de molécula pequeña para la administración intracelular de ácidos nucleicos
EP2742136B1 (en) * 2011-08-11 2017-09-27 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligomeric compounds comprising 5'-modified deoxyribonucleosides in the gap and uses thereof
US9984408B1 (en) 2012-05-30 2018-05-29 Amazon Technologies, Inc. Method, medium, and system for live video cooperative shopping
CN104955952A (zh) 2013-01-30 2015-09-30 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 Lna寡核苷酸碳水化合物缀合物
EP2992009B1 (en) 2013-05-01 2020-06-24 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating apolipoprotein (a) expression
US9778708B1 (en) 2016-07-18 2017-10-03 Lenovo Enterprise Solutions (Singapore) Pte. Ltd. Dual sided latching retainer for computer modules

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1211923A (zh) * 1995-11-22 1999-03-24 约翰斯·霍普金斯大学 增强生物分子的细胞摄取的配体
WO2009134487A2 (en) * 2008-01-31 2009-11-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Optimized methods for delivery of dsrna targeting the pcsk9 gene
US20100010066A1 (en) * 2008-01-31 2010-01-14 Kevin Fitzgerald Optimized Methods For Delivery Of DSRNA Targeting The PCSK9 Gene
US20110123520A1 (en) * 2008-04-11 2011-05-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Site-specific delivery of nucleic acids by combining targeting ligands with endosomolytic components
CN102203255A (zh) * 2008-07-02 2011-09-28 桑塔里斯制药公司 靶向hsp27的rna拮抗剂
WO2011009697A1 (en) * 2009-07-21 2011-01-27 Santaris Pharma A/S Antisense oligomers targeting pcsk9
US20120122954A1 (en) * 2009-07-21 2012-05-17 Ellen Marie Straarup Antisense Oligomers Targeting PCSK9
CN103492568A (zh) * 2010-12-17 2014-01-01 箭头研究公司 用于siRNA的半乳糖簇-药代动力学调节剂靶向部分
CN105358692B (zh) * 2013-06-27 2020-08-21 罗氏创新中心哥本哈根有限公司 靶向pcsk9的反义寡聚体和缀合物

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