CN105358692A - 靶向pcsk9的反义寡聚体和缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及寡聚体化合物及其缀合物，它们靶向细胞中的9型蛋白原转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin(PCSK9)mRNA，导致PCSK9的表达减少。PCSK9表达的减少有益于一系列医学病症，例如高胆固醇血症及相关病症。

Description

靶向PCSK9的反义寡聚体和缀合物
发明领域
本发明涉及寡聚体化合物及其缀合物，它们靶向细胞中的9型蛋白原转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin(PCSK9)mRNA，导致PCSK9的表达减少。PCSK9表达的减少有益于一系列医学病症，例如高胆固醇血症及相关病症。
背景技术
9型蛋白原转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin(PCSK9)已经作为一种用于降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的治疗靶而出现。PCSK9增加LDL受体的降解，在具有高PCSK9活性的个体中导致高LDL-C。
Lindholm等人在MolecularTherapy(2012)；202,376–381中报道了两种靶向PCSK9的LNA反义寡核苷酸，在一定的加载剂量(20mg/kg)和四星期的维持剂量(5mg/kg)之后，它们在非人灵长类中产生了持续的LDL-C降低。所用的化合物是一种十四聚体SPC5001(SEQIDNO1)和一种十三聚体SPC4061。SPC5001同样被公开在WO2011/009697中。已经把这些PCSK9抑制剂的效力归结于它们短的长度(Krieg等人，MolecularTherapyNucleicAcids(2012)1,e6)。
WO2007/146511报道了短的双环(LNA)间隙体(gapmer)反义寡核苷酸，与较长的化合物相比，它们明显地更强大，毒性更小。所例举的化合物长度似乎是14个核苷酸。
根据vanPoelgeest等人(AmericanJournalofKidneyDisease,2013年10月；62(4):796-800),在人类临床试验中，施用LNA反义寡核苷酸SPC5001可能导致急性肾损伤。
根据EP1984381B1、Seth等人的NucleicAcidsSymposiumSeries2008No.52553–554和Swayze等人的NucleicAcidResearch2007,vol35,pp687-700,LNA寡核苷酸在动物中引起显著的肝毒性。根据WO2007/146511,通过使用长度短至12-14个核苷酸的LNA间隙体来避免LNA寡核苷酸的毒性。EP1984381B1推荐使用6’-取代的双环核苷酸来降低LNA寡核苷酸的毒性潜力。根据Hagedorn等人，NucleicAcidTherapeutics2013,可以从反义寡核苷酸的序列和修饰模式中预测它们肝毒性潜力。
已经广泛地评估了寡核苷酸缀合物在siRNA中的用途，在siRNA中，为了得到充足的体内效力，寡核苷酸缀合物被认为是必要的。例如，WO2004/044141涉及经由RNA干扰途径调控基因表达的修饰的寡聚体化合物。这些寡聚体化合物包括一个或更多个能够改变或增强相连的寡聚体化合物的药代动力学性能和药效效能的缀合体部分。
WO2012/083046报道了一种用于siRNA的半乳糖簇-药代动力学调节剂靶向部分。
相比之下，单股的反义寡核苷酸典型地是在没有缀合或配制的情况下被给药的。反义寡核苷酸的主要靶向组织是肝脏和肾，尽管如此，通过所述的反义模式，也可以进入宽范围的其它组织，包括淋巴结、脾和骨髓。
WO2005/086775涉及使用一种治疗剂的化学部分、一种可切除的接头和一种标记结构域，将治疗剂靶向递送到特定的器官。所述可切除的接头例如可以是二硫基、肽或限制酶可切除的寡核苷酸结构域。
WO2011/126937涉及经由与小分子配体缀合对寡核苷酸进行靶向的细胞内递送。
WO2009/025669涉及包含吡啶基二硫化物部分的聚合(聚乙二醇)接头。也参见Zhao等人，BioconjugateChem.200516758-766。
Chaltin等人，BioconjugateChem.200516827-836报道了胆固醇修饰的单体、二聚体和四聚体寡核苷酸，其用于把反义寡核苷酸掺入阳离子脂质体中以产生一种树枝状聚体递送体系。使胆固醇经由一个赖氨酸接头与所述的寡核苷酸缀合。
其它的不可切除的胆固醇缀合物已经被用于把siRNA和antagomirs靶向肝脏——参见例如Soutscheck等人，Nature2004vol.432173-178以及Krützfeldt等人，Nature2005vol438,685-689。对于部分硫代磷酸酯化的siRNA和antagomirs，发现使用胆固醇作为靶向肝脏的实体对于体内活性是必要的。
发明目的
因此，需要与SPC5001一样有效的但是具有降低的毒性风险，特别是降低的肾毒性的靶向PCSK9的反义化合物。
根据本发明，这已经通过使用反义方法鉴定新的能够被特别有效地靶向的人PCSK9序列(SEQIDNO33和SEQIDNO34)以及保留或改善了SPC5001的显著效力而不引发毒性问题的所述SPC5001序列的更长变体而实现。通过使用缀合物，可以进一步改善本发明的反义寡核苷酸，已经发现这些缀合物极大地提高了LNA反义寡核苷酸的治疗指数。
本发明的化合物是PCSK9的强有力的并且无毒的抑制剂，可用于治疗高胆固醇血症和相关的病症。
发明概述
本发明的寡聚体可以包含10-22，例如12-18个核苷酸长度，这些核苷酸要么包含a)一个与SEQIDNO33或34或45的相应长度互补的10-16个核苷酸的毗连序列，要么包含b)一个与SEQIDNO31的相应长度互补的16个核苷酸的毗连序列。
本发明提供一种反义寡核苷酸缀合物，其包含根据本发明所述的寡聚体和至少一个与所述寡聚体共价相连的非核苷酸或非多核苷酸部分。
本发明还提供一种反义寡核苷酸缀合物，其包含根据本发明所述的寡聚体(A)和至少一个与所述寡聚体共价相连的非核苷酸或非多核苷酸部分(C)，该非核苷酸或非多核苷酸部分任选地经由一个接头区(B和/或Y)位于所述寡聚体的毗连序列和所述的缀合部分之间。
在一些实施方式中，本发明还提供一种反义寡核苷酸缀合物，其包含长度为10-22个(例如12-18个核苷酸)的寡聚体，其中所述的寡聚体包含:a)一个与SEQIDNO33或34或45的相应长度互补的10-16个核苷酸的毗连序列，或b)一个与SEQIDNO31的相应长度互补的16个核苷酸的毗连序列。
本发明还提供一种化合物，其选自由SEQIDNO2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、16、18、19、20、21、22、23和24组成的组。
本发明提供一种药物组合物，其包含根据本发明所述的寡聚体或缀合物以及一种药学上可接受的稀释剂、载体、盐或佐剂。
本发明提供用作药物的根据本发明的寡聚体或缀合物或药物组合物，例如用于治疗高胆固醇血症或相关病症，例如一种选自由下列组成的组的病症:动脉粥样硬化症、高脂血症、高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症(例如获PCSK9功能突变)、HDL/LDL胆固醇失衡、血脂异常(例如家族性高脂血症(FCHL)或家族性高胆固醇血症(FHC)、获得性高脂血症、抑制素抗性的高胆固醇血症、冠状动脉病(CAD)和冠心病(CHD)。
本发明提供本发明的寡聚体或缀合物或药物组合物用于生产治疗高胆固醇血症或相关病症的药物的用途，所述病症例如选自由下列组成的组:动脉粥样硬化症、高脂血症、高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症(例如获PCSK9功能突变)、HDL/LDL胆固醇失衡、血脂异常(例如家族性高脂血症(FCHL)或家族性高胆固醇血症(FHC)、获得性高脂血症、抑制素抗性的高胆固醇血症、冠状动脉病(CAD)和冠心病(CHD)。
本发明提供治疗高胆固醇血症或相关病症的方法，该病症例如是一种选自由下列组成的组的病症:动脉粥样硬化症、高脂血症、高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症(例如获PCSK9功能突变)、HDL/LDL胆固醇失衡、血脂异常(例如家族性高脂血症(FCHL)或家族性高胆固醇血症(FHC)、获得性高脂血症、抑制素抗性的高胆固醇血症、冠状动脉病(CAD)和冠心病(CHD)，所说方法包括:向遭受或可能遭受高胆固醇血症或相关病症的患者施用有效量的根据本发明的一种寡聚体或缀合物或药物组合物。
本发明提供一种在体内或在体外抑制表达PCSK9的细胞中PCSK9的方法，所说方法包括向所述细胞施用根据本发明的一种寡聚体或缀合物或药物组合物，从而抑制所说细胞中的PCSK9。
根据本发明，本发明还提供一种寡聚体，例如一种LNA寡聚体，其包含一个具有10-22个，例如12-18个，例如13、14、15、16或17个硫代磷酸酯连接的核苷的毗连区(即A区，它典型地与靶序列，例如SEQIDNO46的相应区互补),并且还包含与所述LNA寡聚体毗连的1-6个DNA核苷酸，其中在所述DNA之间和/或与所述DNA核苷相邻的所述核苷间的连接是生理学上不稳定的，例如是磷酸二酯连接。这样一种LNA寡聚体可以呈一种本文所描述的缀合物形式，或者例如可以是一种将要被用于后续的缀合步骤的中间体。当被缀合时，所述缀合物例如可以是或包含一种甾醇例如胆固醇或生育酚，或者可以是或包含一种(非核苷酸的)碳水化合物，例如一种GalNAc缀合物，或本文所描述的另一种缀合物。
本发明还提供一种间隙体寡聚体，它包含至少一个长度为10-22个，例如12-18个，例如13、14、15、16或17个核苷酸的cET，例如(S)-cET核苷酸，它靶向人PCSK9(即具有一段与人PCSK9的相应部分互补的序列)。
附图简述
图1:可以使用的三-GalNAc缀合物的例子。缀合物1-4举例说明4种合适的GalNAc缀合部分，而缀合物1a-4a涉及具有额外的接头部分(Y)的同样的缀合物，该接头部分被用于将所述缀合物连接到所述寡聚体(A区或连接到一个可生物切除的接头，例如B区)。波浪线代表共价连接到所述寡聚体。
图2:胆固醇和生育酚缀合部分的例子。缀合物5a和6a涉及具有额外的接头部分(Y)的同样的缀合物，该接头部分用于将所述缀合物连接到所述寡聚体(A区或连接到一个可生物切除的接头，例如B区)。波浪线代表连接到所述寡聚体的共价连接。
图3:特定的LNA化合物。通过字母后面的上标L来识别β-D-氧LNA，下标S代表硫代磷酸酯连接，大写字母C前面的上标Me代表5-甲基胞嘧啶LNA，非LNA核苷酸是DNA核苷酸(无上标L)。
图4:LNA化合物的胆固醇缀合物的例子。通过字母后面的上标L来识别β-D-氧LNA，下标S代表硫代磷酸酯连接，下标o代表磷酸二酯连接，大写字母C前面的上标Me代表5-甲基胞嘧啶LNA，非LNA核苷酸是DNA核苷酸(无上标L)。
图5:LNA化合物的GalNAc缀合物的例子。所述缀合物基本上对应于图中的Conj2a，在那里波浪线被LNA寡聚体所替代。通过字母后面的上标L来识别β-D-氧LNA，下标S代表硫代磷酸酯连接，大写字母C前面的上标Me代表5-甲基胞嘧啶LNA，非LNA核苷酸是DNA核苷酸(无上标L)。
图5A:SEQIDNO18的详细结构。
图5B:SEQIDNO19的详细结构。
图6:FAM缀合基团的例子。
图7:含有以及不含有可切除的磷酸二酯连接的LNA-FAM缀合物。通过字母后面的上标L来识别β-D-氧LNA，下标S代表一种硫代磷酸酯连接，下标o代表磷酸二酯连接，大写字母C前面的上标Me代表5-甲基胞嘧啶LNA，非LNA核苷酸是DNA核苷酸(无上标L)。
图8:按照体外效力分级的抗-PCSK9的间隙体。
图9:选取的按照体外效力分级的抗-PCSK9间隙体。
图10:选取的抗-PCSK9化合物的体外效力和IC50计算。
图11:选取的抗-PCSK9的缀合物的体内ALT数据。
图12:对本发明化合物的非限定性的说明。核苷间的连接L例如可以是磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼烷基磷酸酯(boranophosphate)或甲基膦酸酯，例如磷酸二酯。PO是一种磷酸二酯连接。化合物a)具有一个带有一个单股DNA(或RNA)的B区，第一区和第二区之间的连接是PO。化合物b)具有两个通过磷酸二酯连接而连接起来的DNA/RNA(例如DNA)核苷。化合物c)具有三个通过磷酸二酯连接而连接起来的DNA/RNA(例如DNA)核苷。在一些实施方式中，可以通过另外的磷酸二酯DNA/RNA(例如DNA核苷)来进一步延长B区。在每一种化合物的左边(例如胆固醇、GalNAc、缀合物1-4、1a-4a和5或6)阐明了缀合基团(标记为X，除此之外标记为C区)，并且可以任选地经由磷核苷连接基团，例如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼烷基磷酸酯或甲基膦酸酯共价连接到B区的末端核苷上，或者可以经由备选连接，例如三唑连接而连接(参见化合物d)、e)和f)中的L)。
图13.本发明化合物的非限定性的举例说明，其中所述化合物包括位于第三(缀合物)区(X)和第二区(B区)之间的任选的接头(Y)。命名与图12一样。这里公开了合适的接头，并且合适的接头包括例如烷基接头，例如C6接头。在化合物a)、b)和c)中，经由磷核苷连接基团，例如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼烷基磷酸酯或甲基膦酸酯，或者可以经由备选连接，例如三唑连接(Li)，把所述X和B区之间的接头连接到B区。在这些化合物中，Lii代表所述第一区(A)和所述第二区(B)之间的核苷间连接。化合物d)、e)和f)进一步包括一个位于B区和所述缀合基团之间的接头(Y)，并且可以经由例如一个磷核苷连接基团，例如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼烷基磷酸酯或甲基膦酸酯(或者在一些实施方式中，可以经由一个三唑连接)，把Y区连接到B区。此外或者备选地，X可以是一种活性基团或反应性基团。可以经由例如一种磷核苷连接基团，例如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼烷基磷酸酯或甲基膦酸酯，或者可以经由一种备选连接，例如三唑连接，把X共价连接到B区。
图14.采用胆固醇缀合物在体内沉默PCSK9mRNA。给小鼠注射单一剂量的10mg/kg没有缀合的LNA-反义寡核苷酸(#40)或等摩尔量的采用不同接头与胆固醇缀合的LNA反义寡核苷酸，并且在定量给药后的第1、3、7和10天杀死小鼠。从肝脏和肾中分离出RNA，使RNA接受PCSK9特异性的RT-qPCRA。将来自肝脏样品的PCSK9mRNA的定量测定归一化到BACT，并且显示成占等同的盐水对照B的平均值的百分数。将来自肾样品的PCSK9mRNA的定量测定归一化到BACT，并且显示成占等同的盐水对照的平均值的百分数。
图15:来自大鼠安全性研究的Kim-1表达(参见实施例5)。
图16：来自被注射了四次(一次注射/星期)，每次0.5或1.5mg/kg/星期的SEQIDNO2和18的食蟹猴的样品中的血清PCSK9和LDL胆固醇。
图17.来自被注射了四次(一次注射/星期)，每次0.5或1.5mg/kg/星期的SEQIDNO3和19的食蟹猴的样品中的血清PCSK9和LDL胆固醇。
发明详述
在下文中，在分开的标题下描述了本发明的不同成分。应该理解，可以将来自一个成分的实施方式与来自其它成分的实施方式相结合来实现本发明的化合物(例如如图12和13中所举例说明的那样)。
寡聚体(A区)
在本发明的上下文中，术语“寡聚体”或“寡核苷酸”是指由两个或多个核苷酸的共价连接而形成的分子(即寡核苷酸)。在这里，单个的核苷酸(单元)也可以被称为一个单体或单元。在一些实施方式中，术语“核苷”、“核苷酸”、“单元”和“单体”能够被互换使用。将会认识到:当提到核苷酸或单体的序列时，所指的是碱基例如A、T、G、C或U的序列。
本发明的寡聚体在长度方面可以包含10-22个，例如12-18个核苷酸。所述的寡聚体要么包含a)与SEQIDNO33或34或45的相应长度互补的10-16个核苷酸的毗连序列，要么包含b)与SEQIDNO31的相应长度互补的16个核苷酸的毗连序列。
在一些实施方式中,本发明的寡聚体包含一个选自由SEQIDNO26、27、28、29和44组成的组的毗连序列。
本发明的化合物(例如寡聚体或缀合物)靶向PCSK9，并且这样能够下调PCSK9的表达或抑制PCSK9，例如人体中的或表达PCSK9的细胞中的PCSK9。
在一些实施方式中,所述的与SEQIDNO33或34或45的相应长度互补的10-16个核苷酸的毗连序列的核苷间连接可以是硫代磷酸酯连接。
在一些实施方式中,本发明的寡聚体包含一个毗连序列或由该序列组成，该毗连序列选自由SEQIDNO2、3、4、5、6、7、8和40组成的组。在一个实施方式中，所述的寡聚体包含一个选自下列的序列或由该序列组成:a)SEQIDNO2或3，或b)SEQIDNO4、5或6，或c)SEQIDNO7或8，或d)SEQIDNO40。
在一些实施方式中，所述的寡聚体包含10-16个硫代磷酸酯连接的核苷。
在一些实施方式中，本发明的寡聚体包含一个与SEQIDNO33或34或45的相应长度互补的至少10-16个核苷酸的毗连序列，或一个与SEQIDNO31的相应长度互补的16个核苷酸的毗连序列，其中所述的毗连序列包含核苷酸类似物。优选地，所述的核苷酸类似物是增强亲和性的核苷酸类似物。
在一些实施方式中，所述的核苷酸类似物是糖修饰的核苷酸，例如独立地或依赖性地选自由下列组成的组的糖修饰的核苷酸:锁定的核酸(LNA)单元、2’-O-烷基-RNA单元、2’-OMe-RNA单元、2’-氨基-DNA单元和2’-氟-DNA单元。
在一些实施方式中，所述的核苷酸类似物包含或者是锁定的核酸(LNA)单元。
在一些实施方式中，本发明的寡聚体包含或者是一种间隙体，例如一种LNA间隙体寡核苷酸。
在一些实施方式中，所述的间隙体在其每一侧(5’和3’)包含一个具有2-4个核苷酸类似物(优选LNA类似物)的翼。
在一些实施方式中，本发明的寡聚体包含一个与SEQIDNO33或34或45的相应长度互补的13、14、15或16个核苷酸的毗连序列，或一个与SEQIDNO31的相应长度互补的16个核苷酸的毗连序列，并且可以任选地包含另外1-6个核苷酸，这1-6个核苷酸可以形成或包含一个可生物切除的核苷酸区，例如磷酸核苷酸接头。合适地，所述可生物切除的核苷酸区由一段短的生理学上不稳定的核苷酸序列(例如1、2、3、4、5或6个核苷酸的序列)形成。这可以通过使用磷酸二酯连接与DNA/RNA核苷来实现，或者如果能够保持生理学上的易感性，可以使用其它核苷。可以使用肝脏提取物来测定生理学上的易感性，正如实施例6中所举例说明的那样。
因此，本发明的寡聚体可以包含一个与SEQIDNO33或34或45的相应长度互补的长度为10-16个核苷酸的毗连的核苷酸序列，或包含一个与SEQIDNO31(第一区或A区)的相应长度互补的16个核苷酸的毗连序列。本发明的寡聚体可以包含另外的核苷酸区。在一些实施方式中，所述另外的核苷酸区包含一个可生物切除的核苷酸区，例如磷酸核苷酸序列(第二区，B区),该区可以把A区共价连接到非核苷酸部分，例如缀合基团(第三区或C区)上。在一些实施方式中，可以直接地把本发明的寡聚体的毗连的核苷酸序列(A区)共价连接到C区上。在一些实施方式中，C区是可生物切除的。
所述寡聚体由一个长度为12-22个，例如13、14、15、16、17、18、19、20、21个核苷酸，例如长度为14-16个核苷酸，例如长度为15或16个核苷酸的毗连的核苷酸序列组成或包含所述核苷酸序列。因此，所述寡聚体可以指的是A区和B区的合并长度，例如A区10-16个核苷酸，而B区1-6个核苷酸。
在各种实施方式中，本发明的化合物不包含RNA(单元)。在一些实施方式中，根据本发明的化合物、第一区或者第一区和第二区一起(例如作为一个单一的毗连序列)是线性的分子，或者被合成为线性的分子。因此，所述的寡聚体可以是单链分子。在一些实施方式中，所述的寡聚体不包含与所述同一个寡聚体内的等价区互补的短的(例如至少3、4或5个)毗连的核苷酸区(即双链体)。在一些实施方式中，所述的寡聚体可以不(必)是双链的。在一些实施方式中，所述的寡聚体基本上不是双链的，例如不是一种siRNA。
寡聚体序列
下表提供了本发明的寡聚体和寡聚体缀合物以及本发明的PCSK9靶序列。
表1
SEQIDNO25-29和44是核碱基序列基序。
SEQIDNO30-34和45是存在于人PCSK9mRNA中的RNA靶序列。
SEQIDNO1是SPC5001。
SEQIDNO1-24和40-43是包含核苷酸类似物的寡聚体，例如LNA间隙体寡聚体，其中小写字母是DNA单元(核苷/核苷酸)，其中大写字母是LNA单元。
在一些实施方式中，所有的LNAC都是5-甲基胞嘧啶。在一些实施方式中，所有的LNA单元都是β－D-氧LNA。在一些实施方式中，SEQIDNO1-24和40-43的核苷之间的核苷间连接都是硫代磷酸酯连接。
SEQIDNO9-16和41-43包含所述的寡聚体(如该SEQID所指示的那样)以及可以被共价连接(任选地经由一个可生物切除的接头，例如一个磷酸核苷接头)到该寡聚体的5’或3’端的胆固醇缀合物。在一些实施方式中，所述的胆固醇缀合物被连接在所述寡聚体的5’端。
SEQIDNO17-24包含所述的寡聚体(如该SEQID所指示的那样)以及可以被共价连接(任选地经由一个可生物切除的接头，例如一个磷酸核苷接头或可切除的肽接头)到该寡聚体的5’或3’端的GalNAc缀合物。在一些实施方式中，所述的GalNAc缀合物被连接在所述寡聚体的5’端。
本文所用的特异性的寡聚体和缀合物被举例说明在图3(寡聚体)、图4(胆固醇缀合物)、图5(GalNAc缀合物)中。可以与本发明的寡聚体一起使用的缀合物的其它例子被举例说明在图1和2中,并且被描述在GalNAc缀合部分那节中。
表2提供了寡聚体和缀合物的具体组合。
表2:寡聚体/缀合物组合
所有这些都能够通过用所述寡聚体的序列替换图1或2中的波浪线而实现。图5显示了Conj2a与上面所示的SEQIDNO的组合。图5A和5B是图5中化合物的两个详细的实例。请注意:一个可生物切除的接头(B)可以或不可以存在于缀合部分(C)和寡聚体(A)之间。对于Conj1–4和1a–4a，GalNAc缀合物本身是可生物切除的，在GalNAc簇中使用一种肽接头，并且因此可以或不可以使用另外的可生物切除的接头(B)。然而，初步的数据指示:纳入可生物切除的接头(B)，例如这里所公开的磷酸核苷酸接头可以增强这样的GalNAc簇寡聚体缀合物的活性。图4显示具有上面所示SEQIDNO的Conj5a与一种可生物切除的接头(B)的组合，其由采用磷酸二酯连接而连接起来的两个DNA单体C和A构成。为了与Conj5和Conj6一起使用，使用一种可生物切除的接头极大地增强纳入了可生物切除的接头的化合物的活性，例如推荐这里所公开的磷酸核苷酸接头(B)。
术语“与......相对应”和“对应于”是指寡聚体的核苷酸序列(即核碱基或碱基序列)或毗连的核苷酸序列(第一区/A区)和核酸靶的反向互补序列或其亚区(例如SEQIDNO31、32、33、34或45)之间的比较。将核苷酸类似物直接与它们的等价物或相应的核酸进行比较。在一种优选的实施方式中，所述寡聚体(或其第一区)与所述的靶区或其亚区(例如SEQIDNO31、32、33、34或45)是互补的，例如是完全互补的。
本文所用的术语“反向互补序列”、“反向互补的”和“反向互补性”可以与术语“互补序列”、“互补的”和“互补性”互换使用。
术语“互补的”意味着当一个序列能够与另一个序列沿着反平行方式结合时，两个序列是互补的，其中每一个序列的3’端与另一个序列的5’端结合，并且一个序列的每一个A、T(U)、G和C然后分别与另一个序列的T(U)、A、C和G对齐。通常，寡核苷酸的互补序列与一个确定的序列具有至少90％，优选95％，最优选100％的互补性。
术语“相应的核苷酸类似物”和“相应的核苷酸”意指所述核苷酸类似物中的核苷酸和天然存在的核苷酸是相同的。例如，当所述核苷酸的2-脱氧核糖单元与腺嘌呤相连时，所述“相应的核苷酸类似物”包含一个与腺嘌啉相连的戊糖单元(不同于2-脱氧核糖)。
术语“核碱基”是指一个核苷酸的碱基部分，并且覆盖天然存在的以及非天然存在的变体。因此，“核碱基”不仅覆盖已知的嘌呤和嘧啶杂环，而且也覆盖其杂环类似物和互变异构体。应该认识到，B区的DNA或RNA核苷可以具有天然存在的和/或非天然存在的核碱基。
核碱基的例子包括,但不限于:腺嘌啉、鸟嘌啉、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、黄嘌啉、次黄嘌啉、5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴代尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。在一些实施方式中，所述的核碱基可以独立地选自由下列组成的组:腺嘌啉、鸟嘌啉、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶。在一些实施方式中，所述的核碱基可以独立地选自由下列组成的组:腺嘌啉、鸟嘌啉、胞嘧啶、胸腺嘧啶和5-甲基胞嘧啶。
在一些实施方式中，至少一个存在于所述寡聚体中的所述核碱基是一种修饰的核碱基，其选自由下列组成的组:5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴代尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。
靶
合适地，本发明的寡聚体能够调节PCSK9基因的表达。优选地，所述寡聚体能够下调PCSK9基因的表达。在这个方面，本发明的寡聚体能够影响，典型地，影响哺乳动物中例如人体细胞，例如肝细胞中PCSK9的表达。在一些实施方式中，本发明的寡聚体与靶核酸结合，并且对表达的影响是比正常的表达水平(例如用盐水处理的细胞、动物或人的表达水平)降低至少10％或20％，更优选地，与正常的表达水平相比，对表达的影响是至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的抑制。在一些实施方式中，当使用0.04-25nM，例如0.8-20nM浓度的本发明化合物时，看到了这样的调控。在一些实施方式中，当使用0.01-15mg/kg，例如0.05-10mg/kg，例如0.1-7.5mg/kg，例如0.25-5mg/kg,例如0.5-2.5mg/kg浓度的本发明化合物时，看到了这样的调控。在相同或不同的实施方式中，对表达的抑制率小于100％，例如抑制率小于98％，抑制率小于95％，抑制率小于90％。抑制率小于80％，例如抑制率小于70％。可以通过测定蛋白质的水平，例如通过诸如SDS-PAGE的方法，然后采用抗所述靶蛋白的合适抗体，通过蛋白质印迹法来确定表达水平的调控。备选地，通过测定mRNA水平，例如通过RNA印迹法或定量RT-PCR，能够确定表达水平的调控。在一些实施方式中，当经由mRNA水平进行测定时，当使用一种合适的剂量，例如0.04-25nM,例如0.8-20nM的浓度时，下调的水平典型地达到不存在本发明化合物时的正常水平的10-20％的水平。
因此，本发明提供一种下调或抑制在表达PCSK9蛋白质和/或mRNA的细胞中PCSK9蛋白质和/或mRNA的表达的方法，所说方法包括向所述细胞施用根据本发明的寡聚体或缀合物，从而下调或抑制所说细胞中PCSK9蛋白质和/或mRNA的表达。合适地，所述细胞是哺乳动物细胞，例如人体细胞。在一些实施方式中，所述的施用可以发生在体外。在一些实施方式中，所述的施用可以发生在体内。
本文所用的术语“靶核酸”是指编码哺乳动物PCSK9多肽(例如人PCSK9，例如NCBI检索号NM_174936SEQIDNO:46)的DNA或RNA、编码PCSK9的核酸或其天然存在的变体以及由它们衍生的RNA核酸，优选mRNA，例如前mRNA，尽管如此，优选成熟的mRNA。在一些实施方式中，例如当在研究或诊断中使用时，所述的“靶核酸”可以是一种cDNA或由上述DNA或RNA核酸靶衍生而来的合成的寡核苷酸。根据本发明的寡聚体能够优选地能够与靶核酸杂交。将要认识到，SEQIDNO:46是一种cDNA序列，因此对应于成熟的mRNA靶序列，但是在该cDNA序列中，尿嘧啶被胸腺嘧啶所替代。
术语“其天然存在的变体”是指天然存在于所定义的分类组(例如哺乳动物，例如小鼠、猴子，优选人)内的核酸序列的PCSK9多肽的变体。典型地，当提及一种多核苷酸的“天然存在的变体”时，该术语也可以包括编码PCSK9的基因组DNA和RNA的任何等位基因变体，例如由其衍生得到的mRNA，通过染色体易位或复制发现该DNA位于染色体4上，在4C7处。“天然存在的变体”也可以包括由PCSK9mRNA的可变剪接而衍生得到的变体。当提及一种特异性的多肽序列时，例如该术语也包括所述蛋白质的天然存在形式，因此该形式可以被加工，例如通过伴同翻译的或翻译后的修饰，例如通过信号肽切除、蛋白酶解剪切、糖基化等进行加工。
在一些实施方式中，所述的寡聚体(或其毗连的核苷酸部分)选自或包含一种选自下列的序列:SEQIDNO:28或29或44或其至少10个毗连核苷酸的亚序列，其中所述的寡聚体(或其毗连的核苷酸部分)当其与所述序列比较时，可以任选地包含一个、两个或三个错配。
在一些实施方式中，所述靶序列选自或者包含一个选自下列的序列或者由其组成:SEQIDNO:31、32、33、34或45或SEQIDNO:33、34或45的至少10个毗连核苷酸的亚序列。
在一些实施方式中，所述的亚序列可以由11、12、13、14、15或16个毗连的核苷酸，例如12-16个核苷酸组成。合适地，在一些实施方式中，所述的亚序列长度与本发明的寡聚体的毗连核苷酸序列相同(任选地，当B区不与所述靶互补时，不包括B区)。
然而，将会认识到，在一些实施方式中，所述寡聚体的核苷酸序列可以包含另外的5’或3’核苷酸，例如独立地包含1、2、3、4、5或6个不与所述靶序列互补的另外的5’和/或3’核苷酸——这样的非互补的寡核苷酸可以形成B区。在这个方面，在一些实施方式中，本发明的寡聚体可以包含一个毗连的核苷酸序列，在该序列的5’和/或3’侧翼是另外的核苷酸。在一些实施方式中，所述另外的5’或3’核苷酸是天然存在的核苷酸，例如DNA或RNA。在一些实施方式中，所述另外的5’或3’核苷酸可以代表D区，正如在这里的间隙体寡聚体的上下文中所提及的那样。
在一些实施方式中，根据本发明的寡聚体由根据SEQIDNO:27的核苷酸序列或其至少10或12个核苷酸的亚序列组成或包含所述核苷酸序列或亚序列。
在一些实施方式中，根据本发明的寡聚体由根据SEQIDNO:28的核苷酸序列或其至少10或12个核苷酸的亚序列组成或包含所述核苷酸序列或亚序列。在一种优选的实施方式中，根据本发明的寡聚体由根据SEQIDNO:5或6的核苷酸序列组成或包含所述核苷酸序列或亚序列。在另一种优选的实施方式中，根据本发明的寡聚体缀合物由根据SEQIDNO:13或14或21或22的核苷酸序列组成或包含所述核苷酸序列或亚序列。
在一些实施方式中，根据本发明的寡聚体由一个根据SEQIDNO:29的核苷酸序列或其至少10或12个核苷酸碱基的亚序列组成或包含所述核苷酸序列或亚序列。在一种优选的实施方式中，根据本发明的寡聚体由一个根据SEQIDNO:7或8的核苷酸序列组成或包含所述核苷酸序列。在另一种优选的实施方式中，根据本发明的寡聚体缀合物由一个根据SEQIDNO:15或16或23或24的核苷酸序列组成或包含所述核苷酸序列。
在一些实施方式中，根据本发明的寡聚体由一个根据SEQIDNO:44的核苷酸序列或其至少10或12个核苷酸碱基的亚序列组成或包含所述核苷酸序列或亚序列。在一种优选的实施方式中，根据本发明的寡聚体由一个根据SEQIDNO:40的核苷酸序列组成或包含所述核苷酸序列。在另一种优选的实施方式中，根据本发明的寡聚体缀合物由一个根据SEQIDNO:41、42或43的核苷酸序列组成或包含所述核苷酸序列。
在一些实施方式中，根据本发明的寡聚体由一个根据SEQIDNO:26的核苷酸序列组成或包含所述核苷酸序列。在一种优选的实施方式中，根据本发明的寡聚体由一个根据SEQIDNO:2或3的核苷酸序列组成或包含所述核苷酸序列。在另一种优选的实施方式中，根据本发明的寡聚体缀合物由一个根据SEQIDNO:10或11或18或19的核苷酸序列组成或包含所述核苷酸序列。
长度
所述的寡聚体可以包含一个长度总共为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个毗连核苷酸的毗连的核苷酸序列或由它组成。例如，长度可以包括A区或A区和B区。
在一些实施方式中，所述的寡聚体包含一个长度总共为10-22个，例如12-18个，例如13-17个或12-16个，例如13、14、15、16个毗连核苷酸的毗连的核苷酸序列或由它组成。优选地，A区的寡聚体包含长度为14个毗连核苷酸(更优选地，长度为15个毗连核苷酸，最优选地，长度为16个毗连核苷酸)的毗连的核苷酸序列或由它组成。
一些实施方式中，根据本发明的寡聚体由不超过22个核苷酸，例如不超过20个核苷酸，例如不超过18个核苷酸，例如15、16或17个核苷酸组成。在一些实施方式中，本发明的寡聚体包含少于20个核苷酸。
核苷酸类似物
本文所用的术语“核苷酸”是指包含一个糖部分、一个碱基部分和一个共价连接的基团(例如磷酸酯或硫代磷酸酯核苷酸间连接基团)的糖苷，并且覆盖天然存在的核苷酸(例如DNA或RNA)以及包含修饰的糖和/或碱基部分的非天然存在的核苷酸(在这里也被称为“核苷酸类似物”)两者。在这里，单个的核苷酸(单元)也被称为单体或核酸单元。
在生物化学领域，术语“核苷”通常被用来指包含一个糖部分和一个碱基部分的糖苷。两个核苷之间的共价连接可以被称为核苷间连接。备选地，可以使用术语核苷酸间连接来表征寡聚体的核苷酸之间的连接。
本领域技术人员将会认识到，寡核苷酸的5’核苷酸并不包含5’核苷酸间的连接基团，但是可以或不可以包含5’末端基团，例如适于缀合接头(B或Y或缀合部分)的磷酸二酯或硫代磷酸酯。
非天然存在的核苷酸包括具有修饰的糖部分的核苷酸，例如双环核苷酸或2’修饰的核苷酸，例如2’-取代的核苷酸。
“核苷酸类似物”是由于糖和/或碱基部分的修饰而产生的天然核苷酸(例如DNA或RNA核苷酸)的变体。类似物原则上可能仅仅是“沉默的”或“等价”于寡核苷酸环境中的天然核苷酸，即对所述寡核苷酸用来抑制靶基因表达的工作方式没有功能性的影响。尽管如此，这样“等价的”类似物可以是有用的，如果，例如，它们被更容易或更廉价地生产或它们更稳定地存在于储存或生产条件下，或者代表一种标记或标签。然而，优选地，所述类似物将会对所述寡核苷酸用来抑制表达的工作方式具有功能性的影响，例如通过产生增大的对所述靶的结合亲和性(亲合力增强)和/或增大的对细胞内核酸酶的抗性和/或增大的转运到细胞中的容易程度。核苷酸类似物的具体例子例如被Freier和Altmann的Nucl.AcidRes.,1997,25,4429-4443以及Uhlmann的Curr.OpinioninDrugDevelopment,2000,3(2),293-213所描述，并且被描述在方案1中:
方案1
因此，所述寡聚体可以包含天然存在的核苷酸的简单序列——优选2’-脱氧核苷酸(在这里一般被称为“DNA”)，但也可能包含核糖核苷酸(在这里一般被称为“RNA”)，或包含这样的天然存在的核苷酸与一种或多种非天然存在的核苷酸(即核苷酸类似物)的组合，或由该序列或该组合组成。这样的核苷酸类似物可以适当地增强所述寡聚体对所述靶序列的亲和性。WO2007/031091提供或其中引用了合适的和优选的核苷酸类似物的例子。
在所述寡聚体中掺入增强亲和性的核苷酸类似物，例如LNA或2’-取代的糖，能够允许减小特异性结合的寡聚体的尺寸，并且也可以在非特异性的或反常的结合发生之前减小所述寡聚体尺寸的上限。
在一些实施方式中，所述寡聚体包含至少2个核苷酸类似物。在一些实施方式中，所述寡聚体包含3-8个核苷酸类似物，例如6或7个核苷酸类似物。
核苷酸类似物的例子包括修饰糖部分以提供一种2’-取代基或产生一种双环结构，该双环结构增强结合亲和性并且也可以提供增大的核酸酶抗性。
在一些实施方式中，存在于本发明的反义寡聚体内(例如在“间隙体设计”那一节中提到的X’区和Y’区中)的核苷酸类似物独立地选自例如2’-O-烷基-RNA单元、2’-O-甲基-RNA单元、2’-O-烷基-DNA单元、2’-氨基-DNA单元、2’-氟-DNA单元、LNA单元、阿拉伯糖基核酸(ANA)单元、2’-氟-ANA单元、HNA单元、INA(嵌入的核酸-Christensen,2002.Nucl.Acids.Res.200230:4918-4925,在此通过引用并入)单元和2’-MOE单元。
在一些实施方式中，核苷酸类似物是2’-O-甲氧基乙基-RNA(2’MOE)、2’-氟-DNA单体或LNA核苷酸类似物，并且本发明的这样一种反义寡核苷酸可以包含独立地选自这三种类型的类似物的核苷酸类似物，或者可以包含从这三种类型的类似物中选出的仅仅一种类型的类似物。在一些实施方式中，至少一种所述核苷酸类似物是2’-MOE-RNA，例如是2、3、4、5、6、7、8、9或10个2’-MOE-RNA核苷酸单元。在一些实施方式中，至少一种所述核苷酸类似物是2’-氟-DNA，例如是2、3、4、5、6、7、8、9或10个2’-氟-DNA核苷酸单元。
一种优选的核苷酸类似物是LNA，例如氧基-LNA(例如β-D-氧基-LNA和α-L-氧基-LNA)和/或氨基-LNA(例如β-D-氨基-LNA和α-L-氨基-LNA)和/或硫代-LNA(例如β-D-硫代-LNA和α-L-硫代-LNA)和/或ENA(例如β-D-ENA和α-L-ENA)。最优选的是β-D-氧基-LNA。
在一些实施方式中，只有一种上述类型的核苷酸类似物存在于本发明的一种反义寡核苷酸或其毗连的核苷酸序列中。
在一些实施方式中，本发明的一种反义寡核苷酸包含至少一个锁定核酸(LNA)单元，例如1、2、3、4、5、6、7或8个LNA单元，例如3-7个或4-8个LNA单元。在尤其最优选的实施方式中，所述核苷酸类似物中的至少一种是一种锁定核酸(LNA)，例如至少3种或至少4种或至少5种或至少6种或至少7种或至少8种所述的核苷酸类似物可以是LNA。在一些实施方式中，所有的核苷酸类似物可以是LNA。
在一些实施方式中，本发明的一种反义寡核苷酸可以包含核苷酸类似物(优选LNA)和DNA单元两者。优选地，核苷酸类似物(优选LNA)和DNA单元加起来的总数是10-25，例如10-24，优选10-20，例如10-18，甚至更优选12-16个。在一些实施方式中，本发明的一种反义寡核苷酸的核苷酸序列，例如毗连的核苷酸序列，由至少一个核苷酸类似物(优选LNA)组成，并且其余的核苷酸单元是DNA单元。在一些实施方式中，本发明的一种反义寡核苷酸仅仅包含LNA核苷酸类似物和天然存在的核苷酸(例如RNA或DNA，最优选DNA核苷酸),任选地带有修饰的核苷酸间连接例如硫代磷酸酯。
将会认识到，当提及仅仅由核苷酸组成的优选的核苷酸序列基序或核苷酸序列时，由该序列所确定的本发明的寡聚体可以包含一个相应的核苷酸类似物，代替存在于该序列中的一个或多个核苷酸，例如LNA单元或能提高双链体稳定性/所述寡聚体/靶双链体的Tm的其它核苷酸类似物(即增强亲和性的核苷酸类似物)。
Tm试验:将寡核苷酸:寡核苷酸和RNA靶(PO)双链体在500ml不含RNA酶的水中稀释到3mM，并且与500ml2倍Tm-缓冲液(200mMNaCl,0.2mMEDTA,20mM磷酸钠,pH7.0)混合。把溶液加热到95℃持续3分钟，然后允许它在室温退火30分钟。使用PETemplab软件(PerkinElmer),在一台装备有Peltier温度程序仪PTP6的Lambda40UV/VIS光谱仪上测定双链体的解链温度(Tm)。让温度按定速从20℃爬升到95℃，然后按定速回落到25℃，记录在260nm处的吸光度。使用解链和退火两者的一阶导数和局部最大值来估算双链体的Tm。
在一些实施方式中，在所述寡聚体的核苷酸序列与靶序列之间的任何错配优选地是在增强亲和性的核苷酸类似物的外面区域中发现的，例如在“间隙体设计”那一节中提到的Y’区，和/或在所述寡核苷酸中在具有非修饰的，例如DNA核苷酸的位置处，和/或在作为所述毗连的核苷酸序列的5’或3’端的区域中。
LNA
术语“LNA”是指一种在核糖环的2’和4’位之间含有一个桥的双环核苷类似物(2’-4’双环核苷酸类似物，也被叫做“锁定核酸”)。在文献中，LNA有时被称作BNA(桥连的核酸或双环核酸)，并且这两个术语可以被互换使用。术语LNA可以指一种LNA单体，或者当在“LNA寡核苷酸”的上下文中使用时，LNA是指一种含有一个或多个这种双环核苷酸类似物的寡核苷酸。在一些方面，双环核苷类似物是LNA核苷酸，并且这些术语因此可以被互换使用，并且在这样的实施方式中，两者的特征都在于在核糖环的C2’和C4’之间存在一个接头基团(例如一个桥基团)。
在一些实施方式中，本发明的反义寡核苷酸可以既包含β-D-氧基-LNA，也包含一个或多个下列的LNA单元：硫代-LNA、氨基-LNA、氧基-LNA、5’-甲基-LNA和/或β－D或α－L构型的ENA或其组合。在一些实施方式中，所有的LNA胞嘧啶单元都是5’-甲基-胞嘧啶。在一些实施方式中，至少一个存在于第一区(X’)中的核苷类似物是一种双环核苷类似物，例如至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个(除Y区的DNA和/或RNA核苷以外)是糖修饰的核苷类似物，例如双环核苷类似物，例如LNA，例如β－D-X-LNA或α－L-X-LNA(其中X是氧基、氨基或硫代)，或这里所公开的其它LNA，包括但不限于(R/S)cET、cMOE或5’-Me-LNA。
在一些实施方式中，在本发明的寡核苷酸化合物中使用的LNA优选地具有通式II的结构:
其中Y选自由下列组成的组:-O-、-CH2O-、-S-、-NH-、N(Re)和/或-CH2-；Z和Z*独立地选自核苷酸连接、RH、末端基团或保护基团；B构成一个天然或非天然的核苷酸碱基部分(核碱基)；而RH选自氢和C1-4-烷基；Ra、Rb、Rc、Rd和Re任选地独立地选自由下列组成的组:H、任选地取代的C1-12-烷基、任选地取代的C2-12-链烯基、任选地取代的C2-12-炔基、羟基、C1-12-烷氧基、C2-12-烷氧基烷基、C2-12-链烯基氧基、羧基、C1-12-烷氧基羰基、C1-12-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳氧基-羰基、芳氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳氧基-羰基、杂芳氧基、杂芳基羰基、氨基、单-和二(C1-6-烷基)氨基、氨基甲酰基、单-和二(C1-6-烷基)-氨基-羰基、氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、单-和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、C1-6-烷基-羰基氨基、脲基、C1-6-烷酰氧基、磺酰基、C1-6-烷基磺酰氧基、硝基、叠氮基、硫烷基、C1-6-烷硫基、卤素、DNA嵌入剂、光化学活性基团、热化学活性基团、螯合基团、报道基团和配体，其中芳基和杂芳基可以任选地被取代并且其中两个偕取代基Ra和Rb一起可以代表任选地被取代的亚甲基(＝CH2)；RH选自氢和C1-4-烷基。在一些实施方式中，Ra、Rb、Rc、Rd和Re任选地独立地选自由氢和C1-6烷基，例如甲基组成的组。对于所有的手性中心，可以发现不对称基团呈R取向或呈S取向，例如两种示例性的立体化学异构体包括β－D和α－L异构体，可以将它们举例说明如下:
特定的示例性的LNA单元如下所示:
术语"硫代-LNA"包括一种锁定核苷酸，其中上述通式中的Y选自S或-CH2-S-。硫代-LNA可以呈β-D和α-L-两种构型。
术语"氨基-LNA"包括一种锁定核苷酸，其中上述通式中的Y选自-N(H)-、N(R)-、CH2-N(H)-和-CH2-N(R)-，其中R选自氢和C1-4-烷基。氨基-LNA可以呈β-D和α-L-两种构型。
术语"氧基-LNA"包括一种锁定核苷酸，其中上述通式中的Y代表–O-。氧基-LNA可以呈β-D和α-L-两种构型。
术语"ENA"包括一种锁定核苷酸，其中上述通式中的Y是-CH2-O-(其中相对于碱基B，–CH2-O-的氧原子被连接到2’-位)。Re是氢或甲基。
在一些示例性的实施方式中，LNA选自β-D-氧基-LNA、α-L-氧基-LNA,β-D-氨基-LNA和β-D-硫代-LNA,特别是β-D-氧基-LNA。
正如这里所使用的那样，"双环核苷"是指包含一个双环糖部分的修饰的核苷。双环核苷的例子包括但是不限于在4'和2'核糖基环原子之间包含一个桥的核苷。在一些实施方式中,这里所提供的化合物包括一个或多个双环核苷，其中所述的桥包含一个4'-2'双环核苷。这样的4'-2'双环核苷的例子包括但是不限于下式之一:4'-(CH2)-O-2'(LNA)；4'-(CH2)-S-2'；4,-(CH2)2-O-2'(ENA)；4'-CH(CH3)-O-2'和4'-CH(CH2OCH3)-O-2*及其类似物(参见2008年7月15日颁证的美国专利7,399,845)；4'-C(CH3)(CH3)-O-2及其类似物(参见公布的PCT国际专利申请WO2009/006478，2009年1月8日公布)；4'-CH2-N(OCH3)-2'及其类似物(参见公布的PCT国际专利申请WO2008/150729,2008年12月11日公布)；4'-CH2-O-N(CH3)-2'(参见公布的美国专利申请US2004/0171570,2004年9月2日公布)；4'-CH2-N(R)-O-2',其中R是H、C1-C10烷基或保护基团(参见2008年9月23日颁证的美国专利7,427,672)；4'-CH2-C(H)(CH3)-2'(参见Chattopadhyaya等人,J.Org.Chem.,2009,74,118-134)；和4'-CH2-C(＝CH2)-2'及其类似物(参见公布的PCT国际专利申请WO2008/154401,2008年12月8日公布)。还参见例如:Singh等人,Chem.Commun.,1998,4,455-456；Koshkin等人,Tetrahedron,1998,54,3607-3630；Wahlestedt等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97,5633-5638；Kumar等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222；Singh等人,J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039；Srivastava等人,J.Am.Chem.Soc,129(26)8362-8379(Jul.4,2007)；Elayadi等人,Curr.OpinionInvens.Drugs,2001,2,558-561；Braasch等人,Chem.Biol,2001,8,1-7；Oram等人,Curr.OpinionMol.Ther.,2001,3,239-243；美国专利号U.S.6,670,461、7,053,207、6,268,490、6,770,748、6,794,499、7,034,133、6,525,191、7,399,845；公布的PCT国际申请WO2004/106356、WO94/14226、WO2005/021570和WO2007/134181；美国专利公布号US2004/0171570、US2007/0287831和US2008/0039618；以及美国专利系列号12/129,154、60/989,574、61/026,995、61/026,998、61/056,564、61/086,231、61/097,787和61/099,844；以及PCT国际申请号PCT/US2008/064591、PCT/US2008/066154和PCT/US2008/068922。可以制备前述双环核苷中的每一种，使其具有一个或多个立体化学糖构型，包括例如α－L-呋喃核糖和β－D-呋喃核糖(参见PCT国际申请PCTDK98/00393,1999年3月25日公布为WO99/14226)。
在一些实施方式中,LNA核苷的双环糖部分包括但是不限于在呋喃戊糖基的糖部分的4'和2'位之间具有至少一个桥的化合物，其中这样的桥独立地包含1个或2至4个独立地选自下列的连接基团:-[C(Ra)(Rb)]n-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-C(＝NRa)-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-O-、-Si(Ra)2-、-S(＝O)x-和-N(Ra)-；其中:x是0、1或2；n是1、2、3或4；Ra和Rb各自独立地是H、保护基团、羟基、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12链烯基、取代的C2-C12链烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、C5-C7脂环基、取代的C5-C7脂环基、卤素、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、CN、磺酰基(S(＝O)2-J1)或亚磺酰基(S(＝O)-J1)；并且J1和J2各自独立地是H、C1-C6烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12链烯基、取代的C2-C12链烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、杂环基、取代的杂环基、C1-C12氨基烷基、取代的C1-C12氨基烷基或保护基团。
在一些实施方式中,双环糖部分的桥是-[C(Ra)(Rb)]n-、-[C(Ra)(Rb)]n-O-、-C(RaRb)-N(R)-O-或-C(RaRb)-O-N(R)-。在一些实施方式中,所述的桥是4'-CH2-2'、4'-(CH2)2-2'、4'-(CH2)3-2'、4'-CH2-O-2'、4’-(CH2)2-O-2'、4'-CH2-O-N(R)-2'和4'-CH2-N(R)-O-2'-,其中每个R独立地是H、保护基团或C1-C12烷基。
在一些实施方式中,进一步通过异构体的构型来定义所述的双环核苷。例如包含一个4'-2'亚甲基氧基桥的核苷可以呈α-L构型或者呈β-D构型。先前，α-L-亚甲基氧基(4'-CH2-O-2')BNA已经被掺入了显示反义活性的反义寡核苷酸中(Frieden等人,NucleicAcidsResearch,2003,21,6365-6372)。
在一些实施方式中,双环核苷包括但是不限于(A)α-L-亚甲基氧基(4'-CH2-O-2')BNA,(B)β-D-亚甲基氧基(4'-CH2-O-2')BNA,(C)亚乙基氧基(4'-(CH2)2-O-2')BNA,(D)氨基氧基(4'-CH2-O-N(R)-2')BNA,(E)氧基氨基(4'-CH2-N(R)-O-2')BNA,(F)甲基(亚甲基氧基)(4'-CH(CH3)-O-2')BNA,(G)亚甲基-硫代(4'-CH2-S-2')BNA,(H)亚甲基-氨基(4'-CH2-N(R)-2')BNA,(I)甲基碳环(4'-CH2-CH(CH3)-2')BNA,和(J)亚丙基碳环(4'-(CH2)3-2')BNA，如下列所描绘的那样。
其中Bx是碱基部分，而R独立地是H、保护基团或C1-C2烷基。
在一些实施方式中,双环核苷由式I所定义:
其中:
Bx是杂环碱基部分；
-Qa-Qb-Qc-是–CH2-N(Rc)-CH2-、-C(＝O)-N(Rc)-CH2-、-CH2-O-N(Rc)-、-CH2-N(Rc)-O-或-N(Rc)-O-CH2；
Rc是C1-C12烷基或氨基保护基团；而
Ta和Tb各自独立地是H、羟基保护基团、缀合基团、反应性的磷基团、磷部分或与载体的共价连接。
在一些实施方式中,双环核苷由式II所定义:
其中:
Bx是杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地是H、羟基保护基团、缀合基团、反应性的磷基团、磷部分或与一种载体的共价连接；Za是C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、取代的C1-C6烷基、取代的C2-C6链烯基、取代的C2-C6炔基、酰基、取代的酰基、取代的酰胺、巯基或取代的硫代。
在一些实施方式中,每个所述的取代基团独立地被独立地选自下列的取代基单取代或多取代:卤素、氧、羟基、OJc、NJd、SJC、N3、OC(＝X)Jc和NJeC(＝X)NJcJd,其中Jc、Jd和Je独立地是H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基，而X是O或NJC。
在一些实施方式中,双环核苷由式III所定义:
其中:
Bx是杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地是H、羟基保护基团、缀合基团、反应性的磷基团、磷部分或与一种载体的共价连接；
Rd是C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、取代的C1-C6烷基、取代的C2-C6链烯基、取代的C2-C6炔基或取代的酰基(C(＝O)-)。
在一些实施方式中,双环核苷由式IV所定义:
其中:
Bx是杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地是H、羟基保护基团、缀合基团、反应性的磷基团、磷部分或与一种载体的共价连接；
Rd是C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6链烯基、取代的C2-C6链烯基、C2-C6炔基、取代的C2-C6炔基；
qb、qc和qd各自独立地是H、卤素、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6链烯基、取代的C2-C6链烯基、C2-C6炔基、或取代的C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、酰基、取代的酰基、C1-C6氨基烷基或取代的C1-C6氨基烷基；
在一些实施方式中,双环核苷由式V所定义:
其中:
Bx是杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地是H、羟基保护基团、缀合基团、反应性的磷基团、磷部分或与一种载体的共价连接；qa、qb、qc和qd各自独立地是H、卤素、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12链烯基、取代的C2-C12链烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C1-C12烷氧基、取代的C1-C12烷氧基、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(＝O)OJj、C(＝O)NJjJk、C(＝O)Jj、O-C(＝O)NJjJk、N(H)C(＝NH)NJjJk、N(H)C(＝O)NJjJk或N(H)C(＝S)NJjJk；或qe和qf一起是＝C(qg)(qh)；qg和qh各自独立地是H、卤素、C1-C12烷基或取代的C1-C12烷基。
亚甲基氧基(4'-CH2-O-2')BNA单体腺嘌啉、胞嘧啶、鸟嘌啉、5-甲基胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的合成和制备与它们的寡聚化一起以及核酸识别性能已经被描述了(参见例如Koshkin等人,Tetrahedron,1998,54,3607-3630)。BNA及其制备也被描述在WO98/39352和WO99/14226中。
亚甲基氧基(4'-CH2-O-2')BNA、亚甲基氧基(4'-CH2-O-2')BNA和2'-硫基-BNA的类似物也已经被制备了(参见例如Kumar等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222)。包含寡脱氧核糖核苷酸双链体作为核酸聚合酶的底物的锁定核苷类似物的制备也已经被描述了(参见例如Wengel等人,WO99/14226)。而且,2'-氨基-BNA——一种新的构象限制的高亲和性寡核苷酸类似物的合成已经被描述在现有技术中(参见例如Singh等人,J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039)。另外，2'-氨基-和2'-甲基氨基-BNA已经被制备并且它们与互补RNA和DNA链的双链体的稳定性先前已经被报道了。
在一些实施方式中,双环核苷由式VI所定义:
其中:
Bx是杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地是H、羟基保护基团、缀合基团、反应性的磷基团、磷部分或与一种载体的共价连接；qi、qj、qk和ql各自独立地是H、卤素、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12链烯基、取代的C2-C12链烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C1-C12烷氧基、取代的C2-C12烷氧基、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(＝O)OJj、C(＝O)NJjJk、C(＝O)Jj、O-C(＝O)NJjJk、N(H)C(＝NH)NJjJk、N(H)C(＝O)NJjJk或(H)C(＝S)NJjJk；并且qi和qj或者ql和qk一起是＝C(qg)(qh),其中qg和qh各自独立地是H、卤素、C1-C12烷基或取代的C1-C6烷基。
一种具有一个4'-(CH2)3-2'桥的碳环双环核苷及其链烯基类似物桥4'-CH＝CH-CH2-2'已经被描述了(参见例如Freier等人,NucleicAcidsResearch,1997,25(22),4429-4443以及Albaek等人,J.Org.Chem.,2006,71,7731-77'40)。碳环双环核苷的合成和制备与它们的寡聚化和生物化学研究一起已经被研究了(参见例如Srivastava等人,J.Am.Chem.Soc.2007,129(26),8362-8379)。
如本文所用，"4'-2'双环核苷"或"4'至2'双环核苷"是指包含呋喃糖环的双环核苷，所述呋喃糖环包含连接2'碳原子和4'碳原子的桥。
如本文所用，"单环核苷"是指包含不是双环糖部分的经修饰的糖部分的核苷。在一些实施方式中,核苷的糖部分或糖部分类似物可以在任何部位被修饰或取代。
如本文所用，"2'-修饰的糖"是指在2'位被修饰的呋喃糖基糖。在一些实施方式中,这样的修饰包括选自下列的取代基:卤化物，包括但是不限于取代的和未取代的烷氧基、取代的和未取代的硫烷基、取代的和未取代的氨基烷基、取代的和未取代的烷基、取代的和未取代的烯丙基以及取代的和未取代的炔基。在一些实施方式中,2'修饰选自下列取代基:其包括但是不限于：O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)”NH2、O(CH2)”CH3、O(CH2)”ONH2、OCH2C(＝O)N(H)CH3和O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2,其中n和m为1至大约10。其它2'-取代基也可以选自:C1-C12烷基；取代的烷基；链烯基；炔基；烷芳基；芳烷基；O-烷芳基或O-芳烷基；SH；SCH3；OCN；CI；Br；CN；CF3；OCF3；SOCH3；S02CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；杂环烷基；杂环烷芳基；氨基烷基氨基；多烷基氨基；取代的甲硅烷基；R；可切除基团；报道基团；嵌入剂；用于改善药代动力学性能的基团；和用于改善反义化合物的药效学的基团以及其它具有类似性质的取代基。在一些实施方式中,修饰的核苷包含2'-MOE侧链(参见例如Baker等人,J.Biol.Chem.,1997,272,11944-12000)。这样的2'-MOE取代已经被描述成与未修饰的核苷和其它修饰的核苷相比具有改善的结合亲和性,例如2'-O-甲基、O-丙基和O-氨基丙基。也已经显示具有2'-MOE取代基的寡核苷酸是基因表达的反义抑制剂，对于体内使用具有有希望的特性(参见例如Martin,P.,He/v.Chim.Acta,1995,78,486-504；Altmann等人,Chimia,1996,50,168-176；Altmann等人,Biochem.Soc.Trans.,1996,24,630-637；和Altmann等人,Nucleosides核苷酸s,1997,16,917-926)。
如本文所用，"修饰的四氢吡喃核苷"或"修饰的THP核苷"是指具有一个替代正常核苷中的呋喃戊糖基残基(糖替代物)的取代的6-员四氢吡喃"糖"的核苷。修饰的THP核苷包括但是不限于现有技术中所称作的己糖醇核酸(HNA)、anitol核酸(ANA)、甘露糖醇核酸(MNA)(参见Leumann,CJ.Bioorg.andMed.Chem.(2002)10:841-854)、氟代HNA(F-HNA)或式X所定义的那些化合物:
其中独立地对于每一个式X的所述至少一种四氢吡喃核苷类似物:
Bx是一个杂环碱基部分；
T3和T4各自独立地是把四氢吡喃核苷类似物连接到所述反义化合物的核苷间连接基团,或者T3和T4中的一个是把四氢吡喃核苷类似物连接到所述反义化合物的核苷间连接基团，而T3和T4中的另一个是H、羟基保护基团、连接的缀合基团或5'或3'-末端基团；q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自独立地是H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6链烯基、取代的C2-C6链烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；并且R1和R2中的一个是氢，另一个选自卤素、取代的或未取代的烷氧基、NJ1J2、SJ1、N3、OC(＝X)J1、OC(＝X)NJ1J2、NJ3C(＝X)NJ1J2和CN,其中X是O、S或NJ1并且J1、J2和J3各自独立地是H或C1-C6烷基。
在一些实施方式中,提供了式X的修饰的THP核苷，其中qm、qn、qp、qr、qs、qt和qu每个都是H。在一些实施方式中,qm、qn、qp、qr、qs、qt和qu中的至少一个不是H。在一些实施方式中,qm、qn、qp、qr、qs、qt和qu中的至少一个是甲基。在一些实施方式中,提供了式X的THP核苷，其中R1和R2中的一个是F。在一些实施方式中,R1是氟而R2是H,R1是甲氧基而R2是H,以及R1是甲氧基乙氧基而R2是H。
如本文所用，"2'-修饰的"或"2'-取代的"是指包含一个在2'位具有一个除H或OH以外的取代基的糖的核苷。2'-修饰的核苷包括但是不限于具有非桥2'取代基(例如烯丙基、氨基、叠氮基、硫代、O-烯丙基、O-C1-C10烷基、-OCF3、O-(CH2)2-O-CH3、2'-O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)或O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn))的核苷，其中Rm和Rn各自独立地是H或取代的或未取代的C1-C10烷基。2'-修饰的核苷可以进一步包含其它修饰,例如在糖和/或核酸碱基的其它位置的修饰。
如本文所用，"2'-F"是指在2'位包含一个氟基团的糖。
如本文所用，"2'-OMe"或"2'-OCH3"或"2'-O-甲基"每个是指包含糖的核苷，所述糖在糖环的2'位包含一个-OCH3基团。
如本文所用，"寡核苷酸"是指包含多个连接的核苷的化合物。
在一些实施方式中,所述多个核苷中的一个或多个被修饰。在一些实施方式中,寡核苷酸包含一个或多个核糖核苷(RNA)和/或脱氧核糖核苷(DNA)。
许多其它的双环和三环糖替代物环体系也是本领域中已知的，其能够被用来修饰用于掺入反义化合物中的核苷(参见例如综述文章:Leumann,J.C,BioorganicandMedicinalChemistry,2002,10,841-854)。这样的环体系能够经历各种额外的取代以增强活性。制备修饰的糖的方法是本领域技术人员熟知的。在具有修饰的糖部分的核苷中，保持了核酸碱基部分(天然的、修饰的或其组合)，以便于与合适的核酸靶杂交。
在一些实施方式中,反义化合物包含一个或多个具有修饰的糖部分的核苷酸。在一些实施方式中,所述修饰的糖部分是2'-MOE。在一些实施方式中,2'-MOE修饰的核苷酸被安置在一个间隙体基序中。在一些实施方式中,所述修饰的糖部分是cEt。在一些实施方式中,所述cEt修饰的核苷酸被安置使其贯穿在一个间隙体基序的翼中。
在一些实施方式中,在LNA中,R4＊和R2＊一起代表R或S构型的双基–O-CH(CH2OCH3)-(2’O-甲氧基乙基双环核酸-Seth等人,2010,J.Org.Chem)。
在一些实施方式中,在LNA中,R4＊和R2＊一起代表R或S构型的双基–O-CH(CH2CH3)-(2’O-乙基双环核酸-Seth等人,2010,J.Org.Chem)。
在一些实施方式中,在LNA中,R4＊和R2＊一起代表R或S构型的双基-O-CH(CH3)-。在一些实施方式中,R4＊和R2＊一起代表双基-O-CH2-O-CH2--(Seth等人,2010,J.Org.Chem)。
在一些实施方式中,在LNA中,R4＊和R2＊一起代表双基-O-NR-CH3--(Seth等人,2010,J.Org.Chem)。
在一些实施方式中,所述LNA单元具有选自下列基团的结构:
在所述寡聚体中掺入增强亲和性的核苷酸类似物，例如LNA或2’-取代的糖能够允许减小特异性地结合的寡聚体的尺寸，并且也可以在发生非特异性的或反常的结合之前减小寡聚体尺寸的上限。
我们已经评价了cET化合物的肾毒性(使用(S)-cET，用所述序列(WO2009/12495的化合物识别号6/411847)和比较性β-D-氧基LNA化合物(WO2009/12495的6/392063)，并且发现与所述的β-D-氧基LNA对照相比，cET化合物出人意料地引发高的肾毒性。该研究是一个单剂量研究，三天后杀死(方法学参见EP1984381实施例41,但是我们使用了NMRI小鼠)。通过组织分析证实了肾毒性。我们在低于记录到血清ALT时的那些剂量的cET化合物剂量下看到的显著的肾毒性迹象，表明对于cET化合物,肾毒性可能是一个特别的问题。因此，使用本发明的缀合物，例如三价的GalNAc缀合物在减少LNA化合物，例如cET化合物的肾毒性方面是高度有用的。
在一些实施方式中,所述的寡聚体包含至少一个核苷类似物。在一些实施方式中，所述的寡聚体包含至少两个核苷类似物。在一些实施方式中,所述的寡聚体包含3-8个核苷类似物,例如6或7个核苷酸类似物。在迄今为止最优选的实施方式中，至少一个所述的核苷酸类似物是锁定核酸(LNA)；例如至少3个或至少4个,或至少5个,或至少6个,或至少7个,或8个所述的核苷酸类似物可以是LNA。在一些实施方式中，所有的核苷酸类似物可以是LNA。
将会认识到，当提及只由核苷酸组成的优选的核苷酸序列基序或核苷酸序列时，由该序列定义的本发明的寡聚体可以包含一个相应的核苷酸类似物，代替存在于所说序列中的一个或多个核苷酸，例如LNA单元或其它核苷酸类似物，该类似物提高所述寡聚体/靶双链体的双链体稳定性/Tm(即增强亲和性的核苷酸类似物)。
一种优选的核苷酸类似物是LNA,例如氧基-LNA(例如β-D-氧基-LNA和α-L-氧基-LNA),和/或氨基-LNA(例如β-D-氨基-LNA和α-L-氨基-LNA)和/或硫代-LNA(例如β-D-硫代-LNA和α-L-硫代-LNA)和/或ENA(例如β-D-ENA和α-L-ENA)。
在一些实施方式中,本发明的寡聚体,例如A区,可以包含LNA单元和其它核苷酸类似物。存在于本发明的寡聚体中的另外的核苷酸类似物独立地选自,例如:2’-O-烷基-RNA单元、2’-氨基-DNA单元、2’-氟-DNA单元、LNA单元、阿拉伯糖核酸(ANA)单元、2’-氟-ANA单元、HNA单元、INA(嵌入核酸-Christensen,2002.Nucl.Acids.Res.200230:4918-4925,在此通过参考文献引入)单元和2’MOE单元。在一些实施方式中，只有一种上述类型的核苷酸类似物存在于本发明的寡聚体中,例如第一区或其毗连的核苷酸序列。
在一些实施方式中,根据本发明所述的寡聚体(A区)因此可以包含至少一个锁定核酸(LNA)单元,例如1、2、3、4、5、6、7或8个LNA单元,例如3–7个或4-8个LNA单元,或3、4、5、6或7个LNA单元。在一些实施方式中,所有的核苷酸类似物都是LNA。在一些实施方式中,所述的寡聚体既可以包含β-D-氧基-LNA，也可以包含一个或多个下列LNA单元:硫代-LNA、氨基-LNA、氧基-LNA和/或ENA，呈β-D或α-L构型或其组合。在一些实施方式中，所有的LNA的胞嘧啶单元都是5’甲基-胞嘧啶。在本发明的一些实施方式中,所述的寡聚体(例如第一区和任选的第二区)可以包含LNA和DNA单元两者。在一些实施方式中,合并的LNA和DNA单元的总数是10-25个,例如10–24个,优选10-20个,例如10–18个,例如12-16个。在本发明的一些实施方式中,所述寡聚体的核苷酸序列、或其第一区(例如毗连的核苷酸序列)由至少一个LNA组成并且其余的核苷酸单元是DNA单元。在一些实施方式中，所述的寡聚体或其第一区仅仅包含LNA、核苷酸类似物和天然存在的核苷酸(例如RNA或DNA,最优选DNA核苷酸),任选地带有修饰的核苷酸间连接例如硫代磷酸酯。
RNA酶募集
认识到一种寡聚体化合物可以经由非RNA酶介导的靶标mRNA的降解,例如通过翻译的空间位阻或其它方法而发挥作用,在一些实施方式中,本发明的寡聚体能够募集内切核糖核酸酶(RNA酶),例如RNA酶H。
优选这样的寡聚体,例如A区或毗连的核苷酸序列,由一个至少4个,例如至少5个,例如至少6个,例如至少7个连续的核苷酸单元,例如至少8或至少9个连续的核苷酸单元(残基),包括7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个连续的核苷酸的区构成,当使这些连续的核苷酸与一个互补的靶RNA形成双链体时，能够募集RNA酶(例如DNA单元)。所述能够募集RNA酶的毗连的序列可以是本文所述的在间隙体的上下文中被提及的Y’区。在一些实施方式中，所述的能够募集RNA酶的毗连序列(例如Y’区)的尺寸可以更高,例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸单元。
EP1222309提供了体外测定RNA酶H活性的方法,该方法可以被用来测定募集RNA酶H的能力。如果一种寡聚体，当给它提供互补的RNA靶时，(采用EP1222309的实施例91-95所提供的方法)具有以pmol/l/分钟测量的占使用具有相同的碱基序列但是仅仅含有DNA单体，没有2’取代，在所述寡核苷酸中的所有单体之间具有硫代磷酸酯连接基团的只有DNA的寡核苷酸所测定的初始速率的至少1％,例如至少5％,例如至少10％或高于20％的初始速率时，它被认为能够募集RNA酶H。
在一些实施方式中,如果一种寡聚体，当给它提供互补的RNA靶和RNA酶H，采用EP1222309的实施例91-95所提供的方法，以pmol/l/分钟计量的RNA酶H初始速率，少于使用只有等价的DNA，没有2’取代，在所述寡核苷酸中的所有核苷酸之间具有硫代磷酸酯连接基团的寡核苷酸所测定的初始速率的1％,例如少于5％,例如少于10％或少于20％时，它被认为基本上不能募集RNA酶H。
在其它实施方式中,如果一种寡聚体，当给它提供互补的RNA靶和RNA酶H，采用EP1222309的实施例91-95所提供的方法，以pmol/l/分钟计量的RNA酶H初始速率，占使用只有等价的DNA，没有2’取代，在所述寡核苷酸中的所有核苷酸之间具有硫代磷酸酯连接基团的寡核苷酸所测定的初始速率的至少20％,例如至少40％,例如至少60％,例如至少80％时，它被认为能够募集RNA酶H。
典型地，形成所述连续的核苷酸单元的所述寡聚体区,当使该区与所述互补的靶RNA形成双链体时，它能够募集由核苷酸单元组成的RNA酶，这些核苷酸单元与所述RNA靶形成一种DNA/RNA样的双链体。本发明的寡聚体,例如第一区,可以包含一个包含核苷酸和核苷酸类似物两者的核苷酸序列，并且可以例如呈一种间隙体形式。
间隙体设计
在一些实施方式中,本发明的寡聚体,例如第一区包含或者是一种间隙体。间隙体寡聚体是一种寡聚体，它包含一个能够募集RNA酶(例如RNA酶H)的毗连的核苷酸序列,例如一个至少6或7个DNA核苷酸的区,在此称为Y’区(Y’),其中Y’区的5’和3’侧翼是增强亲和性的核苷酸类似物区，例如能够募集RNA酶的毗连的核苷酸序列的5’和3’端的1-6个核苷酸的类似物–这些区分别被称为X’区(X’)和Z’区(Z’)。这些X’和Z’区也可以被称为所述间隙体的翼。间隙体的例子被公开在WO2004/046160、WO2008/113832和WO2007/146511中。
在一些实施方式中,所述的能够募集RNA酶的单体选自由下列组成的组:DNA单体、α-L-LNA单体、C4’烷基化的DNA单体(参见PCT/EP2009/050349和Vester等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.18(2008)2296-2300,并入本文作为参考)和UNA(锁定核酸)核苷酸(参见Fluiter等人,Mol.Biosyst.,2009,10,1039并入本文作为参考)。UNA是锁定核酸,典型地，其中核糖的C2-C3的C-C键已经被除去了,形成一个开锁的“糖”残基。优选地，所述间隙体包含一个下式的(多)核苷酸序列(5’-3’):X’-Y’-Z’,其中X’区(X’)(5’区)组成为或包含:至少一个核苷酸类似物,例如至少一个LNA单元,例如1-6个核苷酸类似物,例如LNA单元,并且Y’区(Y’)由下列组成或包含:能够募集RNA酶的至少4个或至少5个连续的核苷酸,例如DNA核苷酸(当这些核苷酸与一个互补的RNA分子(例如mRNA靶)形成一个双链体时),而Z’区(Z’)(3’区)由下列组成或包含:至少一个核苷酸类似物,例如至少一个LNA单元,例如1-6个核苷酸类似物,例如LNA单元。
在一些实施方式中,X’区由下列组成:1、2、3、4、5或6个核苷酸类似物,例如LNA单元,例如2-5个核苷酸类似物,例如2-5个LNA单元,例如3或4个核苷酸类似物,例如3或4个LNA单元；和/或Z区由下列组成:1、2、3、4、5或6个核苷酸类似物,例如LNA单元,例如2-5个核苷酸类似物,例如2-5个LNA单元,例如3或4个核苷酸类似物,例如3或4个LNA单元。
在一些实施方式中，Y’由下列组成或包含:能够募集RNA酶的4、5、6、7、8、9、10、11或12个连续的核苷酸,或能够募集RNA酶的4-12个或6-10个或7-9个,例如8个连续的核苷酸。在一些实施方式中，Y’区组成为或包含至少一个DNA核苷酸单元,例如1-12个DNA单元,优选地，4-12个DNA单元,更优选地，6-10个DNA单元,例如7-10个DNA单元,最优选地，8、9或10个DNA单元。
在一些实施方式中，X’区由3或4个核苷酸类似物(例如LNA)组成,X’区由7、8、9或10个DNA单元组成,并且Z’区由3或4个核苷酸类似物(例如LNA)组成。这样的设计包括(X’-Y’-Z’)3-10-3、3-10-4、4-10-3、3-9-3、3-9-4、4-9-3、3-8-3、3-8-4、4-8-3、3-7-3、3-7-4、4-7-3。在一种优选的实施方式中，所述的间隙体是一种3-9-4间隙体,甚至更优选地，它是一种3-10-3间隙体。
在WO2004/046160中公开了另外的间隙体设计,在此并入本文作为参考。WO2008/113832(它要求享受美国临时申请60/977,409的优先权，并入本文作为参考)涉及‘短聚体’间隙体寡聚体。在一些实施方式中,这里呈现的寡聚体可以是这样的短聚体间隙体。
在一些实施方式中，所述的寡聚体(例如X’区)由总共10、11、12、13或14个核苷酸单元的毗连的核苷酸序列组成，其中所述毗连的核苷酸序列包含或者具有下式(5’–3’):X’-Y’-Z’，其中X’由1、2或3个核苷酸类似物单元(例如LNA单元)组成；Y’由7、8或9个毗连的核苷酸单元组成，当使这些核苷酸单元与一个互补的RNA分子(例如一个mRNA靶)形成一个双链体时，它们能够募集RNA酶；而Z’由1、2或3个核苷酸类似物单元(例如LNA单元)组成。
在一些实施方式中，X’由1个LNA单元组成。在一些实施方式中，X’由2个LNA单元组成。在一些实施方式中，X’由3个LNA单元组成。在一些实施方式中，Z’由1个LNA单元组成。在一些实施方式中，Z’由2个LNA单元组成。在一些实施方式中，Z’由3个LNA单元组成。在一些实施方式中，Y’由7个核苷酸单元组成。在一些实施方式中，Y’由8个核苷酸单元组成。在一些实施方式中，Y’由9个核苷酸单元组成。在某些实施方式中,Y’区由10个核苷单体组成。在某些实施方式中,Y’区由1-10个DNA单体组成或构成。在一些实施方式中，Y’由1-9个DNA单元构成,例如由2、3、4、5、6、7、8或9个DNA单元构成。在一些实施方式中，Y’由DNA单元组成。在一些实施方式中，Y’由至少一个呈α-L构型的LNA单元构成，例如由2、3、4、5、6、7、8或9个呈α-L构型的LNA单元构成。在一些实施方式中，Y’由至少一个α-L-氧基LNA单元构成或者其中所有呈α-L-构型的LNA单元都是α-L-氧基LNA单元。在一些实施方式中，存在于X’-Y’-Z’中的核苷酸数目选自由下列组成的组(核苷酸类似物单元-Y’区–核苷酸类似物单元):1-8-1、1-8-2、2-8-1、2-8-2、3-8-3、2-8-3、3-8-2、4-8-1、4-8-2、1-8-4、2-8-4或1-9-1、1-9-2、2-9-1、2-9-2、2-9-3、3-9-2、1-9-3、3-9-1、4-9-1、1-9-4或1-10-1、1-10-2、2-10-1、2-10-2、1-10-3、3-10-1、2-10-3、3-10-2。在一些实施方式中，X’-Y’-Z’中的核苷酸数目选自由下列组成的组:2-7-1、1-7-2、2-7-2、3-7-3、2-7-3、3-7-2、3-7-4和4-7-3。在某些实施方式中,X’区和Y’区各自由3个LNA单体组成,并且Y’区由8或9或10个核苷单体(优选地,DNA单体)组成。在一些实施方式中，X’和Z’两者每个都由2个LNA单元组成,而Y’由8或9个核苷酸单元(优选地,DNA单元)组成。在多种实施方式中,其它间隙体设计包括其中X’区和/或Z’区由3、4、5或6个核苷类似物(例如含有一个2’-O-甲氧基乙基-核糖(2’-MOE)的单体或含有一个2’-氟-脱氧核糖的单体)组成,并且Y’区由8、9、10、11或12个核苷(例如DNA单体)组成,其中X’-Y’-Z’区具有3-9-3、3-10-3、5-10-5或4-12-4个单体的那些间隙体设计。另外的间隙体设计被公开在WO2007/146511A2中,将其并入本文作为参考。
LNA间隙体:LNA间隙体是一种包含至少一个LNA核苷酸的间隙体寡聚体(A区)。SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7、8和40是LNA间隙体寡聚体。所述具有一个与SEQIDNO:33或34或45的相应长度互补的10–16个寡聚体的毗连序列的寡聚体也可以是间隙体寡聚体，例如LNA间隙体。
核苷酸间连接
本文所描述的所述寡聚体(例如第一和第二区)的核苷单体经由核苷间连接基团被偶联在一起。合适地,经由一个连接基团把每个单体连接到3’端邻近的单体。
本领域技术人员将会懂得,在本发明的上下文中,在寡聚体末端的5’单体并不包含5’连接基团,但是它可以或不可以包含5’端基团或者用于缀合的连接基团。
术语"连接基团"或“核苷酸间连接”意指能够把两个核苷酸共价偶联在一起的基团。特定的并且优选的实例包括磷酸酯基团和硫代磷酸酯基团。可以把核苷间连接与核苷酸间连接互换使用。
经由连接基团把本发明所述的寡聚体的核苷酸或其毗连的核苷酸序列偶联在一起。合适地，经由一个连接基团把每个核苷酸连接到3’端邻近的核苷酸。
合适的核苷酸间连接包括在WO2007/031091中列举的那些,例如在WO2007/031091(并入本文作为参考)的第34页第一段中列举的核苷酸间连接。在一些实施方式中,除了B区(当存在时)的磷酸二酯连接,优选把所述的核苷酸间连接从它正常的磷酸二酯修饰成更能抵抗核酸酶进攻的核苷酸间连接，例如硫代磷酸酯或硼烷基磷酸酯–这两种是能够被RNA酶H切除的,在减少靶基因表达方面也允许那种反义抑制途径。
在一些实施方式中，本发明所述的寡聚体包含一个或多个选自由下列组成的组的核苷连接:硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和硼烷基磷酸酯。
这里所提供的合适的含硫(S)的核苷酸间连接可以是优选的,例如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯。硫代磷酸酯核苷酸间连接也是优选的,特别是对于第一区来说,例如间隙体、混合体、antimirs剪接开关寡聚体和全聚体。
术语‘混合体’是指包含天然和非天然存在的核苷酸两者的寡聚体,与间隙体、尾聚体和头聚体相对，在混合体中没有多于5个毗连的，并且在一些实施方式中,没有多于4个连续的(例如没有多于3个连续的)天然存在的核苷酸,例如DNA单元.
术语“全聚体”是指只包含非天然存在的核苷(例如糖修饰的核苷类似物)的单链寡聚体。
对于间隙体来说,在所述寡聚体中的核苷酸间连接例如可以是硫代磷酸酯或硼烷基磷酸酯，以便允许RNA酶H切割靶RNA。硫代磷酸酯是优选的,因为其改善的抗核酸酶性和其它原因,例如易于生产。
在一个方面中,除了在所述第一和第二区之间的以及任选地在B区内部的磷酸二酯连接以外，本发明所述寡聚体、核苷酸和/或核苷酸类似物的其余核苷间连接彼此之间是借助于硫代磷酸酯基团连接的。在一些实施方式中,在第一区中至少50％,例如至少70％,例如至少80％,例如至少90％，例如所有的核苷间连接不是磷酸二酯(磷酸酯),例如选自由下列组成的组:硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或硼烷基磷酸酯。在一些实施方式中,在第一区中至少50％,例如至少70％,例如至少80％,例如至少90％，例如所有的核苷间连接是硫代磷酸酯。
WO09124238涉及寡聚体化合物，它们具有至少一个通过一种中性的核苷间连接而连接到3'或5'端的双环核苷。因此，本发明的寡聚体可以具有至少一个通过一种中性的核苷间连接(例如一个或更多个磷酸三酯、甲基膦酸酯、MMI、酰胺-3、甲缩醛或硫代甲缩醛)连接到3'或5'端的双环核苷。其余的连接可以是硫代磷酸酯。
寡聚体缀合物(C区)
本发明的另一个方面是一种包含本发明的寡聚体和至少一个与所述寡聚体(A)共价连接的非核苷酸或非多核苷酸部分(C)的反义寡核苷酸缀合物,所述共价连接任选地经由一个位于所述寡聚体的毗连序列和缀合部分(B和/或Y)之间的接头区。
可以与寡核苷酸一起使用的代表性的缀合部分可以包括亲脂性的分子(芳香和非芳香的)，包括甾族分子；蛋白质(例如抗体、酶、血清蛋白质)；肽；维生素(水溶性的或脂溶性的)；聚合物(水溶性的或脂溶性的)；小分子，包括药物、毒素、报道分子和受体配体；碳水化合物络合物；核酸切割络合物；金属螯合剂(例如卟啉、得克萨菲啉(texaphyrins)、冠醚等)；嵌入剂，包括光核酸酶/嵌入剂杂交体；交联剂(例如光活性的、氧化还原活性的)及其组合和衍生物。例如在WO93/07883和美国专利号6,395,492(将它们各自完整并入本文作为参考)中提供了许许多多合适的缀合部分、它们的制备以及与寡聚体化合物的连接。寡核苷酸缀合物及其合成也被报道在综合性的综述中:Manoharan,AntisenseDrugTechnology,Principles,Strategies,andApplications,S.T.Crooke,ed.,Ch.16,MarcelDekker,Inc.,2001和Manoharan,AntisenseandNucleicAcidDrugDevelopment,2002,12,103,将它们各自完整并入本文作为参考。
在一些实施方式中，本发明所述的寡聚体被靶向肝脏-即在系统性给药后，所述的化合物蓄积在肝脏细胞(例如肝细胞)中。通过添加一种缀合部分(C)能够极大地增强靶向肝脏。然而，为了使所述寡聚体的效力最大化，使所述缀合物(或靶向部分)经由一个可生物切除的接头(B)(例如一个核苷酸磷酸酯接头)连接到所述寡聚体常常是理想的。因此，理想的是使用一种增强肝细胞中的摄取和活性的缀合部分。活性的增强可能是由于增强的摄取或者可能是由于所述化合物在肝细胞中增强的潜能。
在一些实施方式中,所述寡聚体化合物是一种LNA寡聚体,例如一种间隙体,或者例如是一种LNA反义寡聚体(它在这里可以被称为A区)，它包含反义寡聚体,任选地包含可生物切除的接头(例如B区)以及碳水化合物缀合物(它可以被称为C区)。所述的LNA反义寡聚体长度可以是7–30个,例如8–26个核苷并且它包含至少一个LNA单元(核苷)。
在一些实施方式中,所述的缀合物是或者可以包含碳水化合物或者包含碳水化合物基团。在一些实施方式中,所述的碳水化合物选自由下列组成的组:半乳糖、乳糖、N-乙酰基半乳糖胺、甘露糖和甘露糖-6-磷酸。在一些实施方式中,所述的缀合基团是或者可以包含甘露糖或甘露糖-6-磷酸。碳水化合物缀合物可以被用来增强在一系列组织(例如肝脏和/或肌肉)中的输送或活性。参见例如EP1495769、WO99/65925、Yang等人,BioconjugChem(2009)20(2):213-21.Zatsepin&OretskayaChemBiodivers.(2004)1(10):1401-17。
在一些实施方式中，所述的碳水化合物部分不是一种线性的碳水化合物聚合物。在一些实施方式中,所述的寡聚体化合物是一种LNA寡聚体,例如一种LNA反义寡聚体(在这里它可以被称为A区)，它包含一个反义寡聚体、如本文所定义的B区以及一个靶向脱唾液酸糖蛋白受体的部分——缀合部分，例如一个GalNAc部分(它可以被称为C区)。所述碳水化合物部分可以是多价的,例如是2、3、4价的或者4个相同或不同的碳水化合物部分可以被共价连接到所述的寡聚体,任选地经由一个接头或多个接头(例如Y区)共价连接。
GalNAc缀合部分
在一些实施方式中，所述的碳水化合物部分不是一种线性的碳水化合物聚合物。然而，所述的碳水化合物部分可以是多价的,例如2、3、4价的或者4个相同或不同的碳水化合物部分可以被共价连接到所述的寡聚体,任选地经由一个接头或多个接头共价连接。在一些实施方式中，本发明提供一种缀合物，它包含本发明所述的寡聚体和一种碳水化合物缀合部分。在一些实施方式中，本发明提供一种缀合物，它包含本发明所述的寡聚体和一个靶向脱唾液酸糖蛋白受体的部分——缀合部分(例如一种GalNAc部分，它可以形成另一个区的一部分(称为C区))。
本发明还提供与靶向脱唾液酸糖蛋白受体的部分缀合的LNA反义寡核苷酸。在一些实施方式中,所述的缀合部分(例如第三区或C区)包含一个靶向脱唾液酸糖蛋白受体的部分,例如半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰基-半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、N-丙酰基-半乳糖胺、N-正丁酰基-半乳糖胺和N-异丁酰基半乳糖胺。在一些实施方式中，所述的缀合物包含一个半乳糖簇,例如N-乙酰基半乳糖胺三聚体。在一些实施方式中,所述的缀合部分包含GalNAc(N-乙酰基半乳糖胺),例如一价的、二价的、三价的或四价的GalNAc。三价的GalNAc缀合物可以被用来将所述化合物靶向肝脏。已经把GalNAc缀合物与甲基膦酸酯和PNA反义寡核苷酸(例如US5,994517和Hangeland等人,BioconjugChem.1995Nov-Dec；6(6):695-701)以及siRNA一起使用(例如WO2009/126933、WO2012/089352和WO2012/083046)。将本文所用的这些GalNAc参考文献以及其中使用的具体缀合物并入本文作为参考。WO2012/083046公开了带有GalNAc缀合部分的siRNA，它们包含可切除的适用于本发明中的药效学调节剂，优选的药效学调节剂是C16疏水基团，例如棕榈酰基、十六碳-8-烯酰基、油酰基、(9E,12E)-十八碳-9,12-二烯酰基、二辛酰基和C16-C20酰基。该’046的可切除的药效学调节剂也可以是胆固醇。
所述的靶向部分(缀合部分)可以选自由下列组成的组:半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰基-半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、N-丙酰基-半乳糖胺、N-正丁酰基-半乳糖胺、N-异丁酰基半乳糖胺、半乳糖簇和N-乙酰基半乳糖胺三聚体并且可以具有一种选自由下列组成的组的药效学调节剂:具有16或更多个碳原子的疏水基团、具有16-20个碳原子的疏水基团、棕榈酰基、十六碳-8-烯酰基、油酰基、(9E,12E)-十八碳-9,12-二烯酰基、二辛酰基和C16-C20酰基以及胆固醇。在’46中公开的某些GalNAc簇包括:(E)-十六碳-8-烯酰基(C16)、油酰基(C18)、(9,E,12E)-十八碳-9,12-二烯酰基(C18)、辛酰基(C8)、十二烷酰基(C12)、C-20酰基、C24酰基、二辛酰基(2xC8)。可以经由一个生理学上不稳定的键或例如二硫键或PEG接头，把所述的靶向部分-药效学调节剂靶向部分连接到所述的多核苷酸。本发明也涉及磷酸二酯接头在所述寡聚体和所述缀合基团之间(在这里，这些接头被称作B区,并且合适地位于所述LNA寡聚体与所述碳水化合物缀合基团之间)的用途。
为了靶向肝脏中的肝细胞,一种优选的靶向配体是半乳糖簇。
半乳糖簇包含一个具有(例如包含)2-4个末端半乳糖衍生物的分子。这里使用的术语半乳糖衍生物包括半乳糖和半乳糖的衍生物两者，该半乳糖的衍生物对脱唾液酸糖蛋白受体的亲和性等于或大于半乳糖对脱唾液酸糖蛋白受体的亲和性。末端半乳糖衍生物是通过它的C-l碳原子被连接到分子上的。所述的脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPr)最初在肝细胞上被表达并且与支链半乳糖-末端的糖蛋白质结合。一种优选的半乳糖簇具有3个末端半乳糖胺或半乳糖胺衍生物，每个对脱唾液酸糖蛋白受体都具有亲和性。一种更优选的半乳糖簇具有3个末端N-乙酰基-半乳糖胺。本领域中常见的其它术语包括三-天线半乳糖、三价的半乳糖和半乳糖三聚体。已知三-天线半乳糖衍生物簇以比二-天线或单-天线半乳糖衍生物结构更大的亲和性与所述的ASGPr结合(Baenziger和Fiete,1980,Cell,22,611-620；Connolly等人,1982,1.Biol.Chern.,257,939-945)。需要多价来达到nM级的亲和性。根据WO2012/083046，连接对所述的脱唾液酸糖蛋白受体具有亲和性的单个半乳糖衍生物并不能够使得当与所述的输送聚合物共同给药时，将RNAi多核苷酸的功能输送到体内的肝细胞。
半乳糖簇可以包含2个或优选地3个半乳糖衍生物，每个都被连接到一个中心分支点。通过所述糖的C-l碳原子将所述的半乳糖衍生物连接到所述的中心分支点。优选地，经由接头或间隔区把所述的半乳糖衍生物连接到所述的分支点。优选的间隔区是一种柔性的亲水性的间隔区(美国专利5885968；Biessen等人.J.Med.Chem.1995Vol.39p.1538-1546)。一种优选的柔性的亲水性的间隔区是PEG间隔区。优选的PEG间隔区是PEG3间隔区。所述的分支点可以是允许连接所述3个半乳糖衍生物并且进一步允许将所述分支点连接到所述寡聚体的任何小分子。一个示例性的分支点基团是二赖氨酸。二赖氨酸分子包含3个胺基和一个羧基反应性基团，通过这3个胺基可以连接3个半乳糖衍生物，通过该羧基反应性基团可以把所述的二赖氨酸连接到所述的寡聚体。所述分支点与寡聚体的连接可以通过一个接头或间隔区来发生。一种优选的间隔区是一种柔性的亲水性的间隔区。一种优选的柔性的亲水性的间隔区是一种PEG间隔区。一种优选的PEG间隔区是一种PEG3间隔区(3个亚乙基单元)。使用本领域中已知的方法可以把所述的半乳糖簇连接到所述寡聚体的3'或5'端。
一种优选的半乳糖衍生物是N-乙酰基-半乳糖胺(GalNAc)。其它的对脱唾液酸糖蛋白受体具有亲和性的糖可以选自包含下列的列表:半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺和N-异丁酰基半乳糖胺。许许多多半乳糖衍生物对脱唾液酸糖蛋白受体的亲和性已经被研究了(参见例如:Jobst,S.T.和Drickamer,K.JB.C.1996,271,6686)或者使用本领域中典型的方法很容易被测定。
半乳糖簇的一个实施方案
在分支点和核酸之间具有PEG间隔区的半乳糖簇
下面举例说明了本发明所述的缀合物的另外的实例:
其中当使用LNA寡聚体(例如LNA反义寡核苷酸)时，在上述GalNAc簇中，在疏水性的或亲脂的(或另外的缀合物)部分(即药效学调节剂)处，缀合物是任选的。
参见关于在本研究中使用的具体GalNAc簇的图、Conj1、2、3、4以及Conj1a、2a、3a和4a(显示它们任选地带有一个把所述GalNAc簇连接到所述寡聚体的C6接头)。
在本发明的一种优选的实施方式中，所述的反义寡核苷酸缀合物的缀合部分包含Conj1、2、3、4以及Conj1a、2a、3a和4a或由它们组成。最优选地，所述的缀合部分包含Conj2a或由它组成。
在另一个优选的实施方式中，所述的反义寡核苷酸缀合物选自由下列组成的组:SEQIDNO:17、18、19、20、21、22、23和24。
因此，可以经由一个间隔区,例如(聚)乙二醇接头(PEG),例如一个二、三、四、五、六-乙二醇接头，把GalNAc簇(例如GalNAc)的每个碳水化合物部分连接到所述寡聚体。正如上面所示，所述PEG部分在所述半乳糖的糖部分和一个肽(显示了三赖氨酸)接头之间形成一个间隔区。
在一些实施方式中,所述的GalNAc簇包含一个肽接头,例如Tyr-Asp(Asp)三肽或Asp(Asp)二肽,该肽接头经由一个双基接头被连接到所述寡聚体(或连接到Y区或B区),例如所述的GalNAc簇可以包含下列双基接头:
R1是一种优选地选自下列的双基:-C2H4-、-C3H6-、-C4H8-、-C5H10-、-C6H12-、1,4-环己基(-C6H10-)、1,4-苯基(-C6H4-)、-C2H4OC2H4-、-C2H4(OC2H4)2-或-C2H4(OC2H4)3-、C(O)CH2-、-C(O)C2H4-、-C(O)C3H6-、-C(O)C4H8-、-C(O)C5H10-、-C(O)C6H12-、1,4-环己基(-C(O)C6H10-)、1,4-苯基(-C(O)C6H4-)、-C(O)C2H4OC2H4-、-C(O)C2H4(OC2H4)2-或-C(O)C2H4(OC2H4)3-。
在一些实施方式中,R1是一种优选地选自下列的双基:-C2H4-、-C3H6-、-C4H8-、-C5H10-、-C6H12-、1,4-环己基(-C6H10-)、1,4-苯基(-C6H4-)、-C2H4OC2H4-、-C2H4(OC2H4)2-或-C2H4(OC2H4)3-。
可以经由一个分支点基团，例如一个氨基酸或肽，把所述的碳水化合物缀合物(例如GalNAc)或碳水化合物-接头部分(例如碳水化合物-PEG部分)共价连接到所述的寡聚体,所述的肽合适地包含两个或更多个氨基基团(例如3、4或5个),例如赖氨酸、二赖氨酸或三赖氨酸或四赖氨酸。三赖氨酸包含4个胺基和一个羧基反应性基团，通过这4个胺基可以把3个碳水化合物缀合基团(例如半乳糖及其衍生物(例如GalNAc))和另外一个缀合物(例如一个疏水性的或亲脂的部分/基团)连接起来，通过该羧基反应性基团可以把所述的三赖氨酸连接到所述的寡聚体。可以把所述的另外的缀合物(例如亲脂性/疏水性部分)连接到与所述寡聚体相连的赖氨酸残基上。
出人意料地，本发明人已经发现:与LNA寡聚体一起使用的GalNAc缀合物并不需要药效学调节剂(如下所述)，因此,在一些实施方式中,所述的GalNAc缀合物没有被连接到亲脂的或疏水性的部分(例如本文所描述的那些部分)上，例如它们不包含C8–C36脂肪酸或甾醇。因此，本发明也为LNA寡聚体提供了不包含亲脂的或疏水性的药效学调节剂或缀合部分/基团的GalNAc缀合物。
药效学调节剂
本发明的化合物可以进一步包含一个或多个额外的缀合部分,其中亲脂的或疏水性的部分是特别有趣的,例如当所述缀合基团是一种碳水化合物部分时。这样的亲脂的或疏水性的部分可以起到药效学调节剂的作用,并且可以任选地经由一种接头(例如一个可生物切除的接头)，被共价连接到所述的碳水化合物缀合物、将碳水化合物缀合物连接到所述寡聚体的接头或将多重的碳水化合物缀合物(多价的)缀合物连接到所述寡聚体的接头。
所述的寡聚体或缀合部分因此可以包含一种药效学调节剂,例如亲脂的或疏水性的部分。在WO2012/082046中在siRNA缀合物的上下文中公开了这样的部分。所述的疏水性的部分可以包含一个C8-C36脂肪酸,该脂肪酸可以是饱和或不饱和的。在一些实施方式中,可以使用C10、C12、C14、C16、C18、C20、C22、C24、C26、C28、C30、C32和C34脂肪酸。所述的疏水基团可以具有16或更多个碳原子。示例性的合适的疏水基团可以选自由下列组成的组:甾醇、胆固醇、棕榈酰基、十六碳-8-烯酰基、油酰基、(9E,12E)-十八碳-9,12-二烯酰基、二辛酰基和C16-C20酰基。根据WO’346,具有少于16个碳原子的疏水基团在增强多核苷酸的靶向方面效力较低，但是可以以多拷贝(例如2倍,例如2倍的C8或C10、C12或C14)使用它们以增强效力。可用作靶向多核苷酸的部分的药效学调节剂可以选自由下列组成的组:胆固醇、烷基、链烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳基链烯基和芳基炔基,它们中的每一个都可以是直链的、支链的或环状的。药效学调节剂优选地是只含有碳原子和氢原子的烃。然而，可以允许保持疏水性的取代或杂原子。
亲脂的缀合物
在一些实施方式中,所述的缀合基团是或者可以包含一个亲脂的部分,例如一种甾醇(例如胆固醇、胆固醇基、胆甾烷醇、豆甾醇、胆甾烷酸和麦角甾醇)。在一些实施方式中，所述的缀合物是或者包含生育酚(例如在图2中以Conj6和Conj6a示例的)。在一些实施方式中,所述的缀合物是或者可以包含胆固醇(例如在图2中以Conj5和Conj5a示例的那样)。
在一些实施方式中,所述的缀合物是或者可以包含一种脂质、一种磷脂或一种亲脂的醇,例如一种阳离子脂质、一种中性的脂质、鞘脂和脂肪酸，例如硬脂酸、油酸、反油酸、亚油酸、反亚油酸、亚麻酸和肉豆蔻酸。在一些实施方式中，所述脂肪酸包含一个C4–C30饱和的或不饱和的烷基链。该烷基可以是直链的或支链的。
例如可以使用亲脂的缀合部分来平衡一种寡聚体化合物的亲水性并且增强细胞渗透性。
亲脂的部分包括例如甾醇、甾烷醇和类固醇以及相关的化合物，例如胆固醇(美国专利号4,958,013和Letsinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86,6553)、硫代胆固醇(Oberhauser等人,NuclAcidsRes.,1992,20,533)、羊毛甾醇、粪甾醇、豆甾醇、麦角甾醇、钙化醇、胆汁酸、脱氧胆汁酸、雌酮、雌二醇、雌三醇、孕酮、己烯雌酚、睾酮、雄酮、脱氧皮质酮、可的松、17-羟基皮质酮、它们的衍生物及类似物。在一些实施方式中,所述的缀合物可以选自由下列组成的组:胆固醇、硫代胆固醇、羊毛甾醇、粪甾醇、豆甾醇、麦角甾醇、钙化醇、胆汁酸、脱氧胆汁酸、雌酮、雌二醇、雌三醇、孕酮、己烯雌酚、睾酮、雄酮、脱氧皮质酮、可的松、17-羟基皮质酮。其它亲脂的缀合部分包括脂族基团,例如直链的、支链的和环状的烷基、链烯基和炔基。所述的脂族基团可以具有例如5至大约50、6至大约50、8至大约50、或10至大约50个碳原子。脂族基团的例子包括十一烷基、十二烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、萜烯、冰片基、金刚烷基、其衍生物和类似物。在一些实施方式中,所述脂族基团中的一个或更多个碳原子可以被一个杂原子(例如O、S或N)替换，例如忙牛儿基氧基己基。另外的合适的亲脂的缀合部分包括甘油的脂族衍生物，例如烷基甘油、二(烷基)甘油、三(烷基)甘油、甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯。在一些实施方式中,所述的亲脂的缀合物是二-己基癸基-外消旋甘油或1,2-二-O-己基癸基-外消旋甘油(Manoharan等人,TetrahedronLett.,1995,36,3651；Shea,等人,Nuc.AcidsRes.,1990,18,3777)或其膦酸酯。饱和的和不饱和的脂肪官能团,例如脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯和脂肪胺也可以充当亲脂的缀合部分。在一些实施方式中,脂肪官能团可以包含大约6个至大约30个碳原子或大约8个至大约22个碳原子。脂肪酸的例子包括癸酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、二十碳烯酸及其类似物。
在另外的实施方式中，亲脂的缀合基团可以是具有6至大约50个、10至大约50个或14至大约40个碳原子的多环芳族基团。多环芳族基团的例子包括芘、嘌呤、吖啶、呫吨、芴、菲、蒽、喹啉、异喹啉、萘、其衍生物和类似物。其它合适的亲脂的缀合部分包括薄荷醇、三苯甲基(例如二甲氧基三苯甲基(DMT))、吩嗪、硫辛酸、磷脂、醚、硫醚(例如己基-S-三苯甲硫醇)、其衍生物和类似物。寡聚体化合物的亲脂性缀合物的制备被很好地描述在现有技术中，例如被描述在Saison-Behmoaras等人,EMBOJ.,1991,10,1111；Kabanov等人,FEBSLett.,1990,259,327；Svinarchuk等人,Biochimie,1993,75,49；Mishra等人,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264,229；和Manoharan等人,TetrahedronLett.,1995,36,3651中。
含有对低密度脂蛋白(LDL)具有亲和性的缀合部分的寡聚体化合物能够帮助提供一种有效的靶向的输送体系。肿瘤细胞上LDL受体的高表达水平使得LDL成为用于将药物选择性地输送到这些细胞的一种有吸引力的载体(Rump,等人,BioconjugateChem.,1998,9,341；Firestone,BioconjugateChem.,1994,5,105；Mishra,等人,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264,229)。对LDL具有亲和性的部分包括许多亲脂的基团，例如类固醇(例如胆固醇)、脂肪酸、其衍生物及其组合。在一些实施方式中,对LDL具有亲和性的缀合部分可以是胆汁酸(例如鹅脱氧胆汁酸和石胆汁酸)的二油酰基脂。
在一些实施方式中,所述亲脂的缀合物可以是或者可以包含生物素。在一些实施方式中,所述亲脂的缀合物可以是或者可以包含一种甘油酯。
亲脂的缀合物,例如甾醇、甾烷醇和染色剂(例如胆固醇),或如这里所公开的那样，可以被用来增强所述的寡核苷酸向例如肝脏(典型地肝细胞)的输送。
在本发明的一种优选的实施方式中，所述反义寡核苷酸缀合物的缀合部分包含或由Conj5、5a、6或6a组成。最优选地，所述的缀合部分包含Conj5a或由它组成。
在另一种优选的实施方式中，所述的反义寡核苷酸缀合物选自由下列组成的组:SEQIDNO:9、10、11、12、13、14、15、16、41、42和43。
下来参考文献也涉及亲脂的缀合物的用途:Kobylanska等人,ActaBiochimPol.(1999)；46(3):679-91；Felber等人,.Biomaterials(2012)33(25):599-65)；Grijalvo等人,JOrgChem(2010)75(20):6806-13；Koufaki等人,CurrMedChem(2009)16(35):4728-42；Godeau等人，J.Med.Chem.(2008)51(15):4374-6。
接头(例如B区或Y区)
连接或接头是两个原子之间的一种联系，它经由一个或更多个共价键把一个化学基团或目的片段连接到另一个化学基团或目的片段上。可以直接地或通过一个连接部分(接头或系链)-接头，把缀合部分(或靶向部分或阻断部分)连接到寡聚体化合物。接头是用于把第三区(例如一个缀合部分)共价连接到寡聚体化合物(例如连接到A区)的双官能部分。在一些实施方式中,所述接头包含一种链状结构或重复单元(例如乙二醇或氨基酸单元)的一种寡聚体。所述接头可能具有至少两个官能团,一个用于与所述的寡聚体化合物连接而另一个用于与所述的缀合部分连接。接头官能团的例子可以是亲电子的，用于与所述寡聚体或缀合部分上的亲核基团反应，或者是亲核的，用于与亲电子基团反应。在一些实施方式中,接头官能团包括氨基、羟基、羧酸、硫醇、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、磷酸酯、亚磷酸酯、不饱和键(例如双键或三键)以及类似物。一些接头的实例包括8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-l-羧酸琥珀酰亚胺基酯(SMCC)、6-氨基己酸(AHEX或AHA)、6-氨基己基氧基、4-氨基丁酸、4-氨基环己基羧酸、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-l-羧酸-(6-氨基-己酸琥珀酰亚胺基酯)(LCSMCC)、间-马来酰亚胺基-苯甲酸琥珀酰亚胺基酯(MBS)、N-e-马来酰亚胺基-己酰酸琥珀酰亚胺基酯(EMCS)、6-(β-马来酰亚胺基-丙酰胺基)己酸琥珀酰亚胺基酯(SMPH)、N-(α-马来酰亚胺基乙酸琥珀酰亚胺基酯)(AMAS)、4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸琥珀酰亚胺基酯(SMPB)、β-丙氨酸(β-ALA)、苯甘氨酸(PHG)、4-氨基环己酸(ACHC)、β-(环丙基)丙氨酸(β-CYPR)、氨基十二碳烷酸(ADC)、alylenediol、聚乙二醇、氨基酸和类似物。
广泛种类的可用于将缀合部分连接到寡聚体化合物的另外的接头基团是本领域已知的。关于许多有用的接头基团的综述可以在例如AntisenseResearchandApplications,S.T.Crooke和B.Lebleu,Eds.,CRCPress,BocaRaton,Fla.,1993,p.303-350中找到。一种二硫化物连接已经被用于把寡核苷酸的3'端连接到肽(Corey等人,Science1987,238,1401；Zuckermann,等人,JAm.Chem.Soc.1988,110,1614；和Corey等人,JAm.Chem.Soc.1989,111,8524)。Nelson等人在Nuc.AcidsRes.1989,17,7187中描述了一种用于把生物素连接到寡核苷酸的3'-端的连接试剂。该试剂N-Fmoc-O-DMT-3-氨基-1,2-丙二醇可以以名称3'-胺从ClontechLaboratories(PaloAlto,加利福尼亚)商购获得。它也可以以名称3'-氨基-修饰试剂从GlenResearchCorporation(Sterling,Va.)商购获得。该试剂也被用于将肽连接到寡核苷酸，如Judy等人在TetrahedronLetters1991,32,879中报道的那样。一种相似的用于连接到寡核苷酸的5'-端的可商购的试剂是5'-氨基-修饰剂C6。这些试剂可从GlenResearchCorporation(Sterling,Va.)商购获得。这些化合物或类似的化合物已经被Krieg等人利用(AntisenseResearchandDevelopment1991,1,161),用于把荧光素连接到寡核苷酸的5'-端。已经经由聚亚甲基连接把其它化合物(例如吖啶)连接到寡核苷酸的3'-端磷酸酯基团(Asseline等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1984,81,3297)。
可以把任何上述基团用作单一的接头或者与一个或更多个另外的接头组合使用。
接头及其在制备寡聚体化合物的缀合物中的用途被提供在整个现有技术中，例如被提供在WO96/11205和WO98/52614以及美国专利号4,948,882；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,580,731；5,486,603；5,608,046；4,587,044；4,667,025；5,254,469；5,245,022；5,112,963；5,391,723；5,510475；5,512,667；5,574,142；5,684,142；5,770,716；6,096,875；6,335,432；以及6,335,437；Wo2012/083046中，全文引入这些文献中的每一篇作为参考文献。
如本文所用，生理学上不稳定的键是不稳定的键，它在正常遇到的或类似于哺乳动物身体内遇到的那些条件的条件下是可切除的(也被称为可切除的接头,例如图12和13中的B区中图解)。选择生理学上不稳定的连接基团，使得当它们存在于某些生理条件中时，发生化学转变(例如切除)。哺乳动物的细胞内条件包括化学条件，例如在哺乳动物细胞中发现的或者类似于在哺乳动物细胞中遇到的pH、温度、氧化或还原条件或试剂以及盐浓度。哺乳动物细胞内条件还包括正常存在于哺乳动物中的酶活性(例如来自蛋白水解酶或水解酶)的存在。在一些实施方式中,所述可切除的接头易于受核酸酶的影响，该核酸酶例如可以在靶细胞中被表达–因此,正如这里所详述的那样,所述接头可以是一个短区(例如1–10个)磷酸二酯连接的核苷,例如DNA核苷。
可以通过向所述的细胞中添加一种药学上可以接受的试剂来引发化学转变(不稳定键的切除)，或者当含有所述不稳定键的分子到达合适的细胞内或细胞外环境时，化学转变可以自发地发生。例如，当所述分子进入酸化的内体中时，pH不稳定的键可以被切除。因此，pH不稳定的键可以被认为是一种内体可切除的键。当暴露于酶(例如存在于内体或溶酶体或细胞质中的那些酶)时，酶可切除的键可以被切除。当所述分子进入所述细胞质的更加还原的环境中时，二硫键可以被切除。因此,二硫键可以被认为是一种细胞质可切除的键。如本文所用，pH-不稳定的键是在酸性条件下(pH<7)选择性地断裂的不稳定键。这样的键也可以被称为内体不稳定的键,因为细胞内体和溶酶体的pH小于7。
寡聚体连接的可生物切除的缀合物
所述的寡聚体化合物可以任选地包含一个位于所述寡聚体(被称为A区)和所述的缀合物(被称为C区)之间的第二区(B区)，参见用于举例说明的图12和13。B区可以是一个接头，例如一个可切除的接头(也被称为一种生理学上不稳定的连接)。易受核酸酶影响的生理学上不稳定的连接:在一些实施方式中,本发明所述的寡聚体(也被称为寡聚体化合物)(或缀合物)包含三个区:
i)第一区(A区),它包含10-18个毗连的核苷酸；
ii)第二区(B区)，它包含一个可生物切除的接头
iii)第三区(C)，它包含一个缀合部分、一个靶向部分、一个活化部分,其中所述第三区与所述第二区共价连接。
在一些实施方式中,B区可以是磷酸酯核苷酸接头。例如，当所述的缀合物是一种亲脂的缀合物时,例如是脂质、脂肪酸、甾醇(例如胆固醇或生育酚)时，可以使用这样的接头。磷酸酯核苷酸接头也可以被用于其它缀合物，例如碳水化合物缀合物，例如GalNAc。
肽接头
在一些实施方式中,所述的可生物切除的接头(B区)是一种肽,例如一种三赖氨酸肽接头，它可以被用在一种聚GalNAc缀合物(例如一种三GalNAc缀合物)中。也参见本文所提到的肽双基。
本领域中已知的可以使用的其它接头包括二硫化物接头。
磷酸酯核苷酸接头
在一些实施方式中,B区包含1-6个核苷酸,它被共价连接(例如经由一个核苷间连接基团，例如一个磷酸二酯连接)到所述第一区的5’或3’核苷酸,其中:
a.在所述第一区和第二区之间的所述核苷间连接是一种磷酸二酯连接，并且[例如紧接地]与所述第一区相邻的所述第二区的核苷是DNA或RNA；和/或
b.所述第二区的至少一个核苷是磷酸二酯连接的DNA或RNA核苷。
在一些实施方式中,A区和B区形成单一的长度为12–22个核苷酸的毗连的核苷酸序列。
在一些方面中，在所述第一区和第二区之间的所述核苷间连接可以被认为是所述第二区的一部分。
在一些实施方式中,在所述第一区和第二区之间有一个含磷的连接基团。所述的含磷的连接基团例如可以是磷酸酯(磷酸二酯)、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或硼烷基磷酸酯基团。在一些实施方式中,这种含磷的连接基团位于所述的第二区和一个与所述第三区相连的接头区之间。在一些实施方式中,所述的磷酸酯基团是磷酸二酯。
因此,在一些方面中，所述的寡聚体化合物包含至少两个磷酸二酯基团,其中至少一个符合上述本发明的声明,而另一个位于所述的第二区和第三区之间,任选地位于接头基团和所述的第二区之间
在一些实施方式中,所述的第三区是活化基团,例如一种用于缀合的活化基团。在这个方面中，本发明还提供活化的寡聚体，它包含A区和B区以及一种活化基团,例如一种适用于随后连接到所述第三区(例如适用于缀合)的中间体。
在一些实施方式中,所述第三区是一种反应性基团,例如适用于缀合的反应性基团。在这个方面中,本发明还提供包含A区和B区以及一种反应性基团的寡聚体,该反应性基团例如是一种适用于随后连接到所述第三区(例如适用于缀合)的中间体。在一些实施方式中，所述的反应性基团可以包含胺或醇基团,例如胺基团。
在一些实施方式中，A区包含至少一个,例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个不同于磷酸二酯的核苷间连接,例如(任选地独立地)选自由下列组成的组的核苷间连接:硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和硼烷基磷酸酯以及甲基膦酸酯,例如硫代磷酸酯。在一些实施方式中，A区包含至少一个硫代磷酸酯连接。在一些实施方式中，在A区中至少50％,例如至少75％,例如至少90％的核苷间连接,例如所有的核苷间连接不同于磷酸二酯,例如是硫代磷酸酯连接。在一些实施方式中,A区中所有的核苷间连接不同于磷酸二酯。
在一些实施方式中,所述的寡聚体化合物包含一种反义寡核苷酸,例如一种反义寡核苷酸缀合物。所述的反义寡核苷酸可以是或者可以包含所述的第一区,以及任选的所述第二区。在这个方面中,在一些实施方式中,B区可以形成一个与(核酸)靶互补的毗连的核碱基序列的一部分。在其它实施方式中,B区可以缺乏与所述靶的互补性。
或者说,在一些实施方式中,本发明提供一种非磷酸二酯连接的(例如一种硫代磷酸酯连接的)寡核苷酸(例如一种反义寡核苷酸)，它具有至少一个经由一种磷酸二酯连接与所述寡核苷酸的相邻核苷相连的末端(5’和/或3’)DNA或RNA核苷,其中所述的末端DNA或RNA核苷进一步被(任选地经由接头部分)共价连接到一个缀合部分、一个靶向部分或一个阻断部分。
在一些实施方式中,所述的寡聚体化合物包含一种反义寡核苷酸,例如一种反义寡核苷酸缀合物。所述的反义寡核苷酸可以是或者可以包含所述的第一区以及任选的第二区。在这个方面中,在一些实施方式中,B区可以形成一个与(核酸)靶互补的毗连的核碱基序列的一部分。在其它实施方式中,B区可以缺乏与所述靶的互补性。
在一些实施方式中,所述第二区的至少两个连续的核苷是DNA核苷(例如至少3或4或5个连续的DNA核苷酸)。
在这样一种实施方式中,可以按照下式来描述本发明所述的寡核苷酸:
5’-A-PO-B[Y]X-3’或3’-A-PO-B[Y]X-5’
其中A是A区，PO是磷酸二酯连接,B是B区,Y是任选的连接基团,而X是缀合基团、靶向基团、阻断基团或反应性基团或活化基团。
在一些实施方式中,B区包含3’–5’或5’-3’:i)连接到A区的5’或3’核苷的磷酸二酯连接,ii)DNA或RNA核苷,例如DNA核苷,和iii)另外一个磷酸二酯连接
5’-A-PO-B–PO-3’或3’-A-PO-B–PO-5’
另外的磷酸二酯连接把所述的B区核苷与一个或更多个另外的核苷(例如一个或更多个DNA或RNA核苷)连接起来，或者所述的B区核苷可以任选地经由一个连接基团(Y)连接到X(是缀合基团、靶向基团、阻断基团或反应性基团或活化基团)。
在一些实施方式中,B区包含3’–5’或5’-3’:i)连接到A区的5’或3’核苷的磷酸二酯连接,ii)2–10个DNA或RNA磷酸二酯连接的核苷,例如DNA核苷,以及任选地iii)另外一个磷酸二酯连接:
5’-A-[PO-B]n–[Y]-X3’或3’-A-[PO-B]n–[Y]-X5’
5’-A-[PO-B]n–PO-[Y]-X3’或3’-A-[PO-B]n–PO-[Y]-X5’
其中A代表A区,[PO-B]n代表B区,其中n是1-10,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10,PO是一个位于B区和X(或Y，如果存在的话)之间的任选的磷酸二酯连接基团。
在一些实施方式中，本发明提供符合(或包含)下式之一的化合物:
5’[A区]-PO-[B区]3’-Y-X
5’[A区]-PO-[B区]-PO3’-Y-X
5’[A区]-PO-[B区]3’-X
5’[A区]-PO-[B区]-PO3’-X
3’[A区]-PO-[B区]5’-Y-X
3’[A区]-PO-[B区]-PO5’-Y-X
3’[A区]-PO-[B区]5’-X
3’[A区]-PO-[B区]-PO5’-X
B区例如可以包含下列或由其组成:
5’DNA3’
3’DNA5’
5’DNA-PO-DNA-3’
3’DNA-PO-DNA-5’
5’DNA-PO-DNA-PO-DNA3’
3’DNA-PO-DNA-PO-DNA5’
5’DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA3’
3’DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA5’
5’DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA3’
3’DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA5’
应该认识到，磷酸酯连接的可生物切除的接头可以采用不同于DNA和RNA的核苷。可以使用实施例6中的试验来鉴定可生物切除的核苷酸接头。
在一些实施方式中,本发明的化合物包含一个可生物切除的接头(也被称为生理学上不稳定的接头、易受核酸酶影响的生理学上不稳定的连接或易受核酸酶影响的接头),例如所述的磷酸酯核苷酸接头(例如B区)或一个肽接头,它把所述寡聚体(或毗连的核苷酸序列或A区)连接到一个缀合部分(或C区)。
在实施例6中所示的试验中对切割的敏感性可以被用来确定接头是否是可生物切除的或生理学上不稳定的。
根据本发明的可生物切除的接头是指在靶组织(例如肝脏和/或肾)中易受切割影响的(即生理学上不稳定的)接头。优选在靶组织中看到的切除率大于在血清中测得的切除率。适用于测定组织(例如肝脏或肾)和血清中切除水平的方法见实施例6。在一些实施方式中,在实施例6的肝脏或肾匀浆液试验中，本发明的化合物中的所述可生物切除的接头(也被称为生理学上不稳定的接头或易受核酸酶影响的接头)(例如B区)至少大约20％被切除,例如至少大约30％被切除,例如至少大约40％被切除,例如至少大约50％被切除,例如至少大约60％被切除,例如至少大约70％被切除,例如至少大约75％被切除。在一些实施方式中,正如实施例6的试验中所使用的那样，在血清中的切除率(％)小于大约30％,小于大约20％,例如小于大约10％,例如小于5％,例如小于大约1％。
在可以相同或不同的一些实施方式中,本发明的化合物中的所述可生物切除的接头(也被称为生理学上不稳定的接头或易受核酸酶影响的接头)(例如B区)易受S1核酸酶切割的影响。可以使用实施例6中所示的S1核酸酶试验来评价对S1切割的敏感性。在一些实施方式中,根据实施例6中所用的试验，在与S1核酸酶一起温育120分钟后，本发明化合物中的可生物切除的接头(也被称为生理学上不稳定的接头或易受核酸酶影响的接头)(例如B区)至少大约30％被切除,例如至少大约40％被切除,例如至少大约50％被切除,例如至少大约60％被切除,例如至少大约70％被切除,例如至少大约80％被切除,例如至少大约90％被切除,例如至少95％被切除。
在所述第二区中序列的选择:
在一些实施方式中,当将所述寡核苷酸的A区和B与所述互补的靶序列比对时，B区并不形成互补的序列。
在一些实施方式中,当将所述寡核苷酸的A区和B与互补的靶序列比对时，B区确实形成互补的序列。在这个方面中，A区和B区一起可以形成一个单一的与所述的靶序列互补的毗连序列。
在一些实施方式中,基于存在于靶组织或细胞或亚细胞区室中的主要的核酸内切酶切割酶，选择B区中的碱基序列以提供一个最佳的核酸内切酶切割位点。在这个方面中,通过分离来自靶组织和非靶组织的细胞提取物，基于与一种非靶细胞(例如肾)相比，在目的靶细胞(例如肝脏/肝细胞)中优先的切割活性，可以选择用于B区的核酸内切酶切割序列。在这个方面中,可以针对目的组织/细胞来优化用于靶向下调的化合物的潜能。
在一些实施方式中，B区包含一种下列序列的二核苷酸:AA、AT、AC、AG、TA、TT、TC、TG、CA、CT、CC、CG、GA、GT、GC或GG,其中C可以是5-甲基胞嘧啶并且/或T可以被U替换。在一些实施方式中，B区包含一个下列序列的三核苷酸:AAA、AAT、AAC、AAG、ATA、ATT、ATC、ATG、ACA、ACT、ACC、ACG、AGA、AGT、AGC、AGG、TAA、TAT、TAC、TAG、TTA、TTT、TTC、TAG、TCA、TCT、TCC、TCG、TGA、TGT、TGC、TGG、CAA、CAT、CAC、CAG、CTA、CTG、CTC、CTT、CCA、CCT、CCC、CCG、CGA、CGT、CGC、CGG、GAA、GAT、GAC、CAG、GTA、GTT、GTC、GTG、GCA、GCT、GCC、GCG、GGA、GGT、GGC和GGG，其中，C可以是5-甲基胞嘧啶并且/或T可以被U替换。在一些实施方式中，B区包含一个下列序列的三核苷酸:AAAX、AATX、AACX、AAGX、ATAX、ATTX、ATCX、ATGX、ACAX、ACTX、ACCX、ACGX、AGAX、AGTX、AGCX、AGGX、TAAX、TATX、TACX、TAGX、TTAX、TTTX、TTCX、TAGX、TCAX、TCTX、TCCX、TCGX、TGAX、TGTX、TGCX、TGGX、CAAX、CATX、CACX、CAGX、CTAX、CTGX、CTCX、CTTX、CCAX、CCTX、CCCX、CCGX、CGAX、CGTX、CGCX、CGGX、GAAX、GATX、GACX、CAGX、GTAX、GTTX、GTCX、GTGX、GCAX、GCTX、GCCX、GCGX、GGAX、GGTX、GGCX和GGGX,其中X可以选自由下列组成的组:A、T、U、G、C及其类似物,其中C可以是5-甲基胞嘧啶并且/或T可以被U替换。将会认识到:当提到(天然存在的)核碱基A、T、U、G、C时，这些核碱基可以被作用与天然的核碱基等价(例如与所述互补的核苷碱基配对)的核碱基类似物替代。在一些实施方式中，B区并不包含T或U。
氨基烷基中间体
本发明进一步提供包含一种反义LNA寡聚体的所述LNA寡聚体中间体，该反义LNA寡聚体包含(例如5’或3’端)氨基烷基接头,例如C2–C36氨基烷基,例如C6-C12氨基烷基,包括例如C6和C12氨基烷基。所述的氨基烷基可以作为标准寡核苷酸合成的一部分被加入到LNA寡聚体,例如使用一种(例如被保护的)氨基烷基亚磷酰胺。在所述氨基烷基和所述LNA寡聚体之间的连接基团例如可以是一种硫代磷酸酯或一种磷酸二酯或例如本文所提到的一种其它核苷连接基团。可以把所述的氨基烷基共价连接(例如通过所述的核苷连接基团,例如硫代磷酸酯或磷酸二酯连接)到例如所述LNA寡聚体的5’或3’。
本发明还提供一种合成所述的LNA寡聚体的方法，包括所述的LNA寡聚体的顺序合成，例如固相的寡核苷酸合成,包括把氨基烷基加入到所述寡聚体的步骤,例如在第一轮或最后一轮寡核苷酸合成期间。所述的合成方法可以进一步包括使所述的一种缀合物与所述的氨基烷基-LNA寡聚体反应的步骤(所述的缀合步骤)。所述的缀合物可以包含合适的接头和/或分支点基团,以及任选的另外的缀合基团,例如如本文所描述的疏水性基团或亲脂基团。所述的缀合步骤可以与将所述寡聚体结合到所述的固体载体同时进行(例如在寡核苷酸合成之后,但是在把所述寡聚体从所述固体载体洗脱下来之前),或者随后(即在洗脱之后)进行。本发明提供一种氨基烷基接头在合成本发明所述的寡聚体中的用途。
生产/合成方法
本发明提供一种合成(或生产寡聚体化合物,例如本发明所述的寡聚体化合物的方法,所述方法包括：:
a)提供一种[固相]寡核苷酸合成载体的步骤,下列之一与该载体相连[第三区]:
i)一个接头基团(-Y-)
ii)一个选自由下列组成的组的基团:一种缀合基团、一种靶向基团、一种阻断基团、一种反应性基团[例如胺或醇]或一种活化基团(X-)
iii)一个-Y-X基团
和
b)[顺序的]B区然后A区的寡核苷酸合成的步骤，
和/或:
c)[顺序的]第一区(A)和第二区(B)的寡核苷酸合成的步骤,其中所述的合成步骤之后是
d)加入第三区[亚磷酰胺，它包括下列]的步骤
i)一个接头基团(-Y-)
ii)一个选自由下列组成的组的基团:一种缀合基团、一种靶向基团、一种阻断基团、一种反应性基团[例如胺或醇]或一种活化基团(X-)
iii)一个-Y-X基团
随后是
e)把所述的寡聚体化合物从所述的[固相]载体上切除，其中任选地，所述方法进一步包含另外一个选自下列的步骤:
f)其中所述的第三个基团是活化基团,活化所述的活化基团以产生反应性基团的步骤,然后任选地经由接头基团(Y)，把缀合基团、阻断或靶向基团加入到所述的反应性基团；
g)其中所述的第三区是反应性基团,经由接头基团(Y)，把缀合基团、阻断或靶向基团加入到所述的反应性基团的步骤；
h)其中所述的第三区是接头基团(Y),把缀合基团、阻断或靶向基团加入到所述的接头基团(Y)的步骤，
其中步骤f)、g)或h)是在把寡聚体化合物从所述的寡核苷酸合成载体上切除之前或之后进行的。在一些实施方式中,可以使用标准的亚磷酰胺化学法来实施所述方法,因此，可以在把所述的X区和/或X区或X区和Y区掺入所述的寡聚体中之前,以亚磷酰胺形式提供所述的X区和/或X区或X区和Y区。请参见图5-10，它们举例说明本发明方法的非限定性方面。
本发明提供一种合成(或生产)一种寡聚体化合物(例如本发明所述的寡聚体化合物)的方法,所述方法包括:
一个顺序的合成第一区(A)和第二区(B)的寡核苷酸的步骤，其中在所述的合成步骤之后，是一个加入包含X区(也被称为C区)或Y区的第三区亚磷酰胺、随后从所述的[固相]载体上切除寡聚体化合物的步骤,该第三区包含一个选自由下列组成的组的基团:一种缀合基团、一种靶向基团、一种阻断基团、一种官能团、一种反应性基团(例如一种胺或一种醇)或一个活化基团(X)或一个-Y–X基团。
然而认识到:可以在从所述的固体载体上切除之后加入所述的X区或X-Y。备选地，所述的合成方法可以包含所述的合成第一区(A)以及任选的第二区(B)然后从所述的载体上切除所述寡聚体的步骤,以及随后的把第三区(例如X或X-Y基团)加入到所述的寡聚体上的步骤。例如通过在寡聚体合成的最后步骤中(在所述载体上)加入一个氨基亚磷酰胺单元，可以实现第三区的加入,在从所述的载体上切除后,该单元可以被用来(任选地经由所述X或Y(当其存在时)上的一个活化基团)连接到所述的X或X-Y基团。在所述的实施方式中，其中所述可切除的接头不是核苷酸区,B区可以是一个非核苷酸的可切除的接头，例如肽接头,它可以形成X区(也被称为C区)的一部分或者是Y区(或其一部分)。
在所述方法的一些实施方式中，X区(例如C)或(X-Y),例如所述的缀合物(例如一种GalNAc缀合物)包含一个活化基团(一个活化的官能团)并且在所述的合成方法中，所述活化的缀合物(或X区或X-Y)被加入到所述的第一区和第二区,例如氨基连接的寡聚体。通过标准的亚磷酰胺化学法，例如作为寡聚体合成的最后步骤(该步骤典型地将会在所述寡聚体5’端处产生氨基)，可以把所述的氨基加入到所述的寡聚体。例如在所述寡核苷酸合成的最后步骤期间，使用一种被保护的氨基－烷基亚磷酰胺,例如一种TFA-氨基C6亚磷酰胺(6-(三氟乙酰基氨基)-己基-(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)-亚磷酰胺)。
经由NHS酯方法，可以活化X区(或这里所指的C区),例如所述的缀合物(例如GalNAc缀合物)，然后加入所述的氨基连接的寡聚体。例如可以使用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)作为X区(或C区,例如一种缀合物,例如一种GalNAc缀合部分)的活化基团。
本发明提供一种通过本发明的方法制备的寡聚体。
在一些实施方式中,可以经由磷酸酯核苷连接(例如本文所描述的那些,包括磷酸二酯或硫代磷酸酯)或者经由一种可替代的基团(例如一种三唑基团)，把X区和/或X区或X区和Y区共价结合(连接)到B区。
在一些实施方式中,在所述第一区和第二区之间的核苷间连接是一种与所述第二区的第一个(或唯一一个)DNA或RNA核苷相连的磷酸二酯,或者B区包含至少一个磷酸二酯连接的DNA或RNA核苷。
在一些实施方式中,所述第二区可以包含另外的DNA或RNA核苷，该核苷可以是磷酸二酯连接的。所述第二区进一步被共价连接到第三区，该第三区例如可以是缀合基团、靶向基团、反应性基团和/或阻断基团。
在一些方面中,本发明基于一种不稳定区、连接所述第一区的所述第二区(例如一种反义寡核苷酸)和一种缀合基团或官能团(例如一种靶向或阻断基团)的提供。所述的不稳定区包含至少一个磷酸二酯连接的核苷,例如DNA或RNA核苷,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个磷酸二酯连接的核苷,例如DNA或RNA。在一些实施方式中,所述的寡聚体化合物包含可切除的(不稳定的)接头。在这个方面中，所述可切除的接头优选地存在于B区(或者在一些实施方式中,存在于A区和B区之间)。
或者说,在一些实施方式中,本发明提供一种非磷酸二酯连接的(例如硫代磷酸酯连接的)寡核苷酸(例如一种反义寡核苷酸)，它具有至少一个经由一种磷酸二酯连接与所述寡核苷酸的相邻核苷相连的末端(5’和/或3’)DNA或RNA核苷,其中所述的末端DNA或RNA核苷(任选地经由一个接头部分)被进一步共价连接到一个缀合部分、一个靶向部分或一个阻断部分。
组合物
本发明所述的寡聚体或寡聚体缀合物可以被用在药物制剂和组合物中。合适地,这样的组合物包含一种药学上可接受的稀释剂,载体、盐或佐剂。WO2007/031091提供了合适的以及优选的药学上可接受的稀释剂、载体和佐剂-将该文献并入本文作为参考。在WO2007/031091中还提供了合适的剂量、制剂、给药途径、组合物、剂型、与其它治疗剂的组合、前药制剂-将该文献并入本文作为参考。
应用
本发明所述的寡聚体或寡聚体缀合物可以被用作用于例如诊断学、治疗学和预防学的研究试剂。
在研究中，这样的寡聚体可以被用来特异性地抑制细胞和实验动物中PCSK9蛋白的合成(典型地通过降解或抑制mRNA从而阻止蛋白质形成)，因而方便对靶的功能分析或对它作为治疗介入的靶的可用性评价。
在诊断学中，所述寡聚体可以被用于通过RNA印迹法、原位杂交或类似的技术来检测和定量细胞和组织中PCSK9的表达。
对于治疗学，通过施用根据本发明的寡聚体化合物来治疗被怀疑患有一种能够通过调节PCSK9的表达而治疗的疾病或病症的动物或人。进一步提供了通过施用治疗或预防有效量的本发明所述的一种或更多种寡聚体或组合物来治疗被怀疑患有或倾向患一种与PCSK9的表达有关的疾病或状况的哺乳动物(例如人)的方法。根据本发明所述的寡聚体、缀合物或药物组合物典型地是以有效量被给药的。
本发明还提供所述的本发明的化合物或缀合物用于生产用于治疗本文所提到的疾病的药物或用于治疗本文所提到的疾病的方法的用途。
本发明还提供一种用于治疗本文所提到的疾病的方法，所述方法包括向需要治疗疾病的患者施用如本文所描述的根据本发明的化合物和/或根据本发明的缀合物和/或根据本发明的药物组合物。
医学适应症
根据本发明所述的寡聚体、寡聚体缀合物和其它组合物能够被用于治疗与PCSK9的突变形式的过度表达或表达有关的状况。
本发明还提供本发明的一种化合物在生产用于治疗本文所提到的疾病、病症或状况的药物中的用途。
一般来说,本发明的一个方面涉及一种治疗患有与反常的PCSK9水平和/或活性相关的状况或易受其影响的哺乳动物的方法,包括向所述的哺乳动物施用治疗有效量的靶向PCSK9的包含一个或更多个LNA单元的寡聚体或寡聚体缀合物。典型地，以有效量施用根据本发明所述的寡聚体、缀合物或药物组合物。
正如本文所提到的,在一些实施方式中，所述的疾病或病症可能与所述PCSK9基因或一种其蛋白产物与PCSK9相关或相互作用的基因中的突变有关。因此,在一些实施方式中,所述的靶mRNA是所述PCSK9序列的一种突变形式。
本发明的一个有趣的方面涉及本文所定义的寡聚体或本文所定义的缀合物用于制备用于治疗本文所提到的疾病、病症或状况的药物的用途。
本发明所述的方法优选地被用于治疗或预防由反常的PCSK9水平和/或活性引起的疾病。
或者说,在一些实施方式中,本发明进一步涉及一种用于治疗反常的PCSK9水平和/或活性的方法,所述方法包括向需要这种治疗的患者施用本发明的寡聚体、本发明的缀合物或本发明的药物组合物。
本发明还涉及用作一种药物的本文所定义的寡聚体、组合物或缀合物。
本发明还涉及本文所定义的化合物、组合物或缀合物用于生产用于治疗反常的PCSK9水平和/或活性或PCSK9的突变形式(例如等位基因变体,例如与本文所提到的疾病相关的那些变体)的表达的药物的用途。
此外,本发明涉及一种治疗患有疾病或病症(例如本文所提到的那些疾病)的受试者的方法。
需要治疗的患者是遭受或可能遭受所述疾病或病症的患者。
在一些实施方式中,本文所用的术语‘治疗’是指治疗存在的疾病(例如本文所提到的疾病或病症)或防止疾病(即预防)。因此，将会认识到，在一些实施方式中，本文所提到的治疗可以是预防性的。
在一个实施方式中,本发明涉及用于治疗高胆固醇血症和相关病症的化合物或包含化合物的组合物,或使用这样的化合物或组合物用于治疗高胆固醇血症和相关病症的方法,其中当提及高胆固醇血症时，术语“相关的病症”是指一种或更多种选自由下列组成的组的病症:动脉粥样硬化症、高脂血症、高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症(例如获得PCSK9功能突变)、HDL/LDL胆固醇失衡、血脂异常(例如家族性高脂血症(FCHL)或家族性高胆固醇血症(FHC)、获得性高脂血症、抑制素抗性的高胆固醇血症、冠状动脉病(CAD)和冠心病(CHD)。
组合治疗
在一些实施方式中,本发明的化合物与另一种治疗剂一起用于组合治疗中。例如HMG辅酶A还原酶的抑制剂(例如抑制素)例如被广泛地用于代谢疾病的治疗中(关于组合治疗的实例参见WO2009/043354，并入本文作为参考)。组合治疗可以是其它降低胆固醇的化合物,例如一种选自由下列组成的组的化合物:螯合胆汁盐的树脂(例如胆酪胺、降胆宁和盐酸考来维仑)、HMG辅酶A还原酶的抑制剂(例如洛伐他丁、西伐他丁、普伐他丁、阿托伐他丁、辛伐他丁、罗素伐他丁和氟伐他丁)、烟酸、纤维酸衍生物(例如氯贝丁酯、吉非贝齐、非诺贝特、苯札贝特和西普洛贝特)、丙丁酚、新霉素、右旋甲状腺素、植物胆甾烷醇酯、胆固醇吸收抑制剂(例如依泽替米贝)、英普他派、胆汁酸转运蛋白(顶端钠依赖性胆汁酸转运蛋白)的抑制剂、肝CYP7a的调节剂、雌激素替代治疗剂(例如他莫昔芬)和消炎药(例如糖皮质激素)。与抑制素的组合可以是特别优选的。
本发明的具体实施方式
1.一种反义寡核苷酸缀合物，包含:
a.长度为12–22个核苷酸的反义寡聚体(A),它包含一个与SEQIDNO:30或31或32或33或34或45的相应长度互补的10–16个核苷酸的毗连序列,和
b.至少一个与所述的寡聚体(A)共价连接的非核苷酸或非多核苷酸缀合部分(C)。
2.根据实施方式1所述的寡核苷酸缀合物,其中所述的反义寡聚体包含选自由下列组成的组的毗连序列:SEQIDNO:25、26、27、28、29和44。
3.根据实施方式1或2中任意一个所述的寡核苷酸缀合物,其中所述的反义寡聚体靶向PCSK9。
4.根据实施方式1-3中任意一个所述的寡核苷酸缀合物,其中所述的反义寡聚体包含增强亲和性的核苷酸类似物。
5.根据实施方式4所述的寡核苷酸缀合物,其中所述的核苷酸类似物是糖修饰的核苷酸,例如独立地或依赖性地选自由下列组成的组的糖修饰的核苷酸:锁定核酸(LNA)单元、2’-O-烷基-RNA单元、2’-OMe-RNA单元、2’-氨基-DNA单元和2’-氟-DNA单元。
6.根据实施方式4或5所述的寡核苷酸缀合物,其中所述的核苷酸类似物包含或是锁定核酸(LNA)单元。
7.根据实施方式1-6中任意一个所述的寡核苷酸缀合物,其中所述的反义寡聚体是间隙体。
8.根据实施方式7所述的寡核苷酸缀合物,其中所述的间隙体在每一侧(5’和3’)包含一个具有2-4个核苷酸类似物，优选LNA类似物的翼。
9.根据实施方式7或8所述的寡核苷酸缀合物,其中所述的间隙体设计选自由下列组成的组:2-8-2、3-8-3、2-8-3、3-8-2、4-8-2、2-8-4、2-9-2、2-9-3、3-9-2、3-9-3、3-9-4、4-9-3、2-10-2、2-10-3、3-10-2、3-10-3、3-10-4、4-10-3、2-11-2、2-11-3、3-11-2、3-11-3、3-11-4、4-11-3和4-11-4。
10.根据实施方式7-9中任意一个所述的寡核苷酸缀合物,其中所述的间隙体设计选自由下列组成的组:2-8-3、3-8-3、3-9-4、3-10-3、2-11-2、2-11-3和3-11-2。
11.根据实施方式1-10中任意一个所述的寡核苷酸缀合物,其中所述的寡聚体包含13、14、15或16个核苷酸的毗连序列。
12.根据实施方式1-11中任意一个所述的寡核苷酸缀合物,其中所述的寡聚体包含一个或更多个选自由下列组成的组的核苷连接:硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和硼烷基磷酸酯。
13.根据实施方式1-12中任意一个所述的寡核苷酸缀合物,其中所述的寡聚体包含硫代磷酸酯核苷连接或者由其组成。
14.根据实施方式1-12中任意一个所述的寡核苷酸缀合物,其中所述的寡聚体包含选自由下列组成的组的毗连序列:SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7和8。
15.根据实施方式1-14中任意一个所述的寡核苷酸缀合物,其中所述的缀合部分(C)选自由下列组成的组:碳水化合物,例如GalNAc或GalNAc簇；亲脂性的基团,例如脂质、脂肪酸；甾醇,例如胆固醇或生育酚；或抑制素。
16.根据实施方式1-15中任意一个所述的反义寡核苷酸缀合物,其中所述的缀合部分(C)增强向肝脏细胞的输送和/或摄取。
17.根据实施方式1-16中任意一个所述的反义寡核苷酸缀合物,其中所述的缀合部分(C)包含一种甾醇，例如生育酚、胆固醇,例如以Conj5、Conj5、Conj6或Conj6a显示的那些。
18.根据实施方式1-16所述的反义寡核苷酸缀合物,其中所述的缀合部分(C)包含一种碳水化合物，例如GalNAc或三价的GalNAc,例如以Conj1、2、3或4或1a、2a、3a或4a显示的那些。
19.根据实施方式18所述的反义寡核苷酸缀合物,其中所述的缀合部分(C)包含Conj2a。
20.根据实施方式1-19中任意一个所述的反义寡核苷酸缀合物,它选自由下列组成的组:SEQIDNO:9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23和24。
21.根据实施方式1-20中任意一个所述的反义寡核苷酸缀合物,其中使所述的反义寡聚体(A)经由一个位于所述寡聚体的毗连序列与所述的缀合部分(B和/或Y)之间的接头区与所述的缀合部分(C)缀合。
22.根据实施方式21所述的反义寡核苷酸缀合物,其中所述的接头选自由下列组成的组:氨基烷基接头、磷酸酯核苷酸接头和肽接头。
23.根据实施方式21或22所述的反义寡核苷酸缀合物,其中所述的接头选自C6至C12氨基烷基。
24.根据实施方式21或22所述的反义寡核苷酸缀合物,其中所述的接头是一种包含1-6个核苷酸的可生物切除的磷酸酯核苷酸接头。
25.根据实施方式21-24中任意一个所述的反义寡核苷酸缀合物,其中所述的接头(B)是一种磷酸二酯核苷酸连接,它包含一个或更多个毗连的DNA磷酸二酯核苷酸，例如与所述寡聚体的毗连序列的5’或3’端毗连的并且可以或不可以与所述的PCSK9靶序列形成互补的碱基对的1、2、3、4、5或6个DNA磷酸二酯核苷酸。
26.根据实施方式24或25所述的反义寡核苷酸缀合物,其中所述的磷酸二酯核苷酸连接(或可生物切除的接头)包含1、2或3个DNA磷酸二酯核苷酸,例如2个DNA磷酸二酯核苷酸,例如5’CA3’二核苷酸。
27.一种长度为12–22个核苷酸的寡聚体,其包含
a.与SEQIDNO:31的相应长度互补的16个核苷酸的毗连序列,或
b.与SEQIDNO:33或34或45的相应长度互补的10–16个核苷酸的毗连序列。
28.根据实施方式27所述的寡聚体,它包含一个选自由下列组成的组的毗连序列:SEQIDNO:26、27、28、29和44。
29.根据实施方式27或28中任意一个所述的寡聚体,其中所述的寡聚体靶向PCSK9。
30.根据实施方式27-29中任意一个所述的寡聚体，其中所述的毗连序列包含增强亲和性的核苷酸类似物。
31.根据实施方式30所述的寡聚体,其中所述的核苷酸类似物是糖修饰的核苷酸,例如独立地或依赖性地选自由下列组成的组的糖修饰的核苷酸:锁定核酸(LNA)单元、2’-O-烷基-RNA单元、2’-OMe-RNA单元、2’-氨基-DNA单元和2’-氟-DNA单元。
32.根据实施方式30或31所述的寡聚体,其中所述的核苷酸类似物包含或者是锁定核酸(LNA)单元。
33.根据实施方式27-32中任意一个所述的寡聚体,它是一种间隙体,例如一种锁定核酸间隙体寡核苷酸.
34.根据实施方式33所述的寡核苷酸缀合物,其中所述的间隙体在每一侧(5’和3’)包含一个翼，该翼具有2-4个核苷酸类似物,优选LNA类似物。
35.根据实施方式33或34所述的寡核苷酸缀合物,其中所述的间隙体设计选自由下列组成的组:2-8-2、3-8-3、2-8-3、3-8-2、4-8-2、2-8-4、2-9-2、2-9-3、3-9-2、3-9-3、3-9-4、4-9-3、2-10-2、2-10-3、3-10-2、3-10-3、3-10-4、4-10-3、2-11-2、2-11-3、3-11-2、3-11-3、3-11-4、4-11-3和4-11-4。
36.根据实施方式33-35中任意一个所述的寡核苷酸缀合物,其中所述的间隙体设计选自由下列组成的组:2-8-3、3-8-3、3-9-4、3-10-3、2-11-2、2-11-3和3-11-2。
37.根据实施方式27-36中任意一个所述的寡聚体,其中所述寡聚体包含13、14、15或16个核苷酸的毗连序列。
38.根据实施方式27-37中任意一个所述的寡聚体,其中所述的寡聚体包含一个或更多个选自由下列组成的组的核苷连接:硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和硼烷基磷酸酯。
39.根据实施方式27-38中任意一个所述的寡聚体,其中所述的寡聚体包含硫代磷酸酯核苷连接或由其组成。
40.根据实施方式27-38中任意一个所述的寡聚体,它包含一个选自由下列组成的组的毗连序列:SEQIDNO:2、3、4、5、6、7和8。
41.一种药物组合物，它包含根据实施方式1-40中任意一个所述的寡聚体或反义寡核苷酸缀合物和药学上可接受的稀释剂、载体、盐或佐剂。
42.根据实施方式1-41中任意一个所述的寡聚体或反义寡核苷酸缀合物或药物组合物，其用作药物,例如该药物用于治疗高胆固醇血症或相关病症，例如一种选自由下列组成的组的病症:动脉粥样硬化症、高脂血症、高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症，例如获得PCSK9中的功能突变、HDL/LDL胆固醇失衡、血脂异常，例如家族性高脂血症(FCHL)或家族性高胆固醇血症(FHC)、获得性高脂血症、抑制素抗性的高胆固醇血症、冠状动脉病(CAD)和冠心病(CHD)。
43.根据实施方式1-41中任意一个所述的寡聚体或反义寡核苷酸缀合物或药物组合物用于生产用于治疗高胆固醇血症或相关病症的药物的用途,所述病症例如是一种选自由下列组成的组的病症:动脉粥样硬化症、高脂血症、高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症，例如获得PCSK9中的功能突变、HDL/LDL胆固醇失衡、血脂异常，例如家族性高脂血症(FCHL)或家族性高胆固醇血症(FHC)、获得性高脂血症、抑制素抗性的高胆固醇血症、冠状动脉病(CAD)和冠心病(CHD)。
44.一种治疗高胆固醇血症或相关病症的方法，所述的病症例如是一种选自由下列组成的组的病症:动脉粥样硬化症、高脂血症、高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症，例如获得PCSK9中功能突变、HDL/LDL胆固醇失衡、血脂异常，例如家族性高胆固醇血症(FHC)、获得性高脂血症、抑制素抗性的高胆固醇血症、冠状动脉病(CAD)和冠心病(CHD)，所述方法包括:向遭受或可能遭受高胆固醇血症或相关病症的患者施用有效量的根据实施方式1-41中任意一个所述的寡聚体或反义寡核苷酸缀合物或药物组合物。
一种用于在体内或在体外抑制表达PCSK9的细胞中的PCSK9的方法，所述方法包括向所述的细胞施用根据实施方式1-41中任意一个所述的寡聚体或反义寡核苷酸缀合物或药物组合物以便抑制所述细胞中PCSK9。
实施例
使用亚磷酰胺方法，在一台Expedite8900/MOSS合成仪(多重寡核苷酸合成系统)或Oligomaker48上，分别以4或1μmol的规模，在尿嘧啶通用载体上合成了寡核苷酸。在所述合成结束时,使用氨水在60℃持续5-16小时，将所述的寡核苷酸从所述的固体载体上切除。通过反相HPLC(RP-HPLC)或固相萃取纯化所述的寡核苷酸并且通过UPLC表征,并且通过ESI-MS进一步证实其分子量。更多细节，请看下文。
所述寡核苷酸的延长
通过使用0.1M的5’-O-DMT-保护的amidite在乙腈中和作为活化剂的DCI(4,5–二氰基咪唑)在乙腈(0.25M)中的溶液，来进行β-氰基乙基-亚磷酰胺(DNA-A(Bz)、DNA-G(ibu)、DNA-C(Bz)、DNA-T、LNA-5-甲基-C(Bz)、LNA-A(Bz)、LNA-G(dmf)、LNA-T或C6-S-S-C6接头)的偶联。对于最后的循环，使用一种0.1M在DCM中的可商购获得的C6-连接的胆固醇亚磷酰胺。为了引入硫代磷酸酯连接，通过使用苍耳烷氢化物(0.01M在9:1的乙腈/吡啶中)进行硫醇化。使用0.02M在7:2:1的THF/吡啶/水中的碘来引入磷酸二酯连接。其余的试剂都是典型地用于寡核苷酸合成的试剂。为了固相合成后的缀合，在所述固相合成的最后循环中以及在去保护和从所述的固体载体上切除后，使用了一种可商购获得的C6氨基接头亚磷酰胺，把所述的氨基连接的去保护的寡核苷酸分离出来。使用标准的合成方法，经由所述官能团的活化，引入了所述的缀合物。
通过RP-HPLC纯化:
通过制备性的RP-HPLC在一个PhenomenexJupiterC1810μ150x10mm柱子上纯化粗化合物。使用0.1MpH8的乙酸铵和乙腈作为缓冲液，流速为5mL/分钟。把收集的流分冷冻干燥而得到纯化的化合物，典型地为白色固体。
缩写
DCI:4,5-二氰基咪唑
DCM:二氯甲烷
DMF:二甲基甲酰胺
DMT:4,4’-二甲氧基三苯甲基
THF:四氢呋喃
Bz:苯甲酰基
Ibu:异丁酰基
RP-HPLC:反相高效液相色谱
在表1中显示了所合成的化合物并且在附图中对它们进行图解。
实施例1新的PCSK9靶标基序的发现
设计并且合成了521种对人和灵长类PCSK9具有特异性的抗-PCSK9的反义寡核苷酸–全部都是两侧带有三个锁定核酸的10DNA，即具有16聚体的LNA间隙体设计。把人细胞系15PC3与靶向人PCSK9的模拟物或所述的锁定核酸修饰的寡核苷酸以0.3μM的浓度一起温育3天。在3个独立的实验中测试每一种抗-PCSK9的寡核苷酸。按照所述的那样，使用实时PCR从提取的RNA中定量PCSK9mRNA水平，并且在归一化到β-肌动蛋白mRNA后，并且相对于在图8中的12个模拟物处理的样品中的平均水平来呈现该PCSK9mRNA水平，在图9中对一小组最有效的分子有精细观察。
实施例2体外mRNA敲减
把人细胞系15PC3与模拟物或靶向人PCSK9的具有SEQIDNO:1-8的锁定核酸修饰的寡核苷酸以0.0012、0.06、0.3和1.5μM的浓度一起温育3天。按照所述的那样，使用实时PCR从提取的RNA中定量PCSK9mRNA水平，并且相对于在图10中在4个模拟物处理的样品中的平均水平来呈现该PCSK9mRNA水平。对于每一种寡核苷酸,通过对二参数逻辑形式的希尔方程进行最小二乘法拟合，将下限固定在0％并且把上限固定在100％，确定了以半最大有效浓度(EC50)形式定量的效力，EC50＝估计值±标准差。
实施例3-体内ALT水平
在到达时体重大约为20g的4周龄雌性NMRI小鼠(Taconic,丹麦)，以7.5和15mg/kg的剂量一次性地给它们静脉注射盐水或靶向人PCSK9的具有SEQIDNO:9-16的锁定核酸修饰的胆固醇-缀合的寡核苷酸。给药7天后，杀死小鼠，使用一种酶测定法(HoribaABXDiagnostics)测定丙氨酸氨基转移酶(ALT)的血清水平。对于每个具有5只小鼠的治疗组，计算平均值和标准差，并且相对于在盐水处理的小鼠中的平均水平，呈现在图11中。对于一些但不是所有的胆固醇-缀合的分子，在这两种浓度下记录到ALT升高。几种化合物(例如SEQIDNO:9和10)并没有以临床上有意义的方式增强小鼠中的ALT，甚至当使用胆固醇作为用于增强化合物在肝脏中的摄取的缀合物时。
实施例4:非人灵长类研究
这个研究的主要目标是:在给食蟹猴单次缓慢推注抗-PCSK9的LNA化合物后，7周内研究所选择的脂质标记物，并且评估化合物在猴子中的潜在毒性。在这个研究中使用的化合物是以0.625和2.5mg/ml)的初始浓度配制在无菌盐水(0.9％)中的SEQIDNO:10、13、18、19、20和21。
使用了至少24月龄的雄性猴子，并且给予它们获取自来水的自由，并且每日给每只动物分发180gMWM(E)SQCSHORT膨化饮食(Dietex法国,SDS,SaintGratien,法国)。根据那一天笼子中动物的个数，将会计算出每个笼子中分发的食物总量。此外，每日给每只动物提供水果或蔬菜。在所述的处理期开始之前，让所述的动物适应所述的研究条件至少14天的时间。在该处理期期间，进行了预处理研究。以0.25、1.0或2.5mg/kg(SEQIDNO:10、13、18和21)的单次剂量或以1.0或2.5mg/kg(SEQIDNO:19和20)的单次剂量，对动物静脉内给药。剂量体积是0.4mL/kg。每个组使用2只动物。
在第1天施用剂量制剂。在处理后，观察动物7周的时间，并且在第51天把动物从所述研究中释放。第1天对应于所述处理期的第一日。在所述研究之前和期间，将会记录临床观察和体重以及食物摄取(每个组)。
在下列时间点采集血样并且进行分析:
RCP＝常规临床病理学,LSB＝肝脏安全性生物化学,PK＝药代动力学,OA＝其它分析,L＝脂质。
在下列所指示的场合下，针对所有存活的动物，测定了下列参数:
全部生物化学组(下面的完全列表)-在第-8、15和50天,
肝脏安全性(仅仅ASAT、ALP、ALAT、TBIL和GGT)-在第4、8、22和36天,
仅仅脂质分布图(总胆固醇、HDL-C、LDL-C和甘油三酯)和Apo-B-在第-1、4、8、22、29、36和43天。
采集血液(大约1.0mL)放入肝素锂试管中(使用ADVIA1650血液生物化学分析仪):Apo-B、钠、钾、氯化物、钙、无机磷、葡萄糖、HDL-C、LDL-C、尿素、肌酸酐、总胆红素(TBIL)、总胆固醇、甘油三酯、碱性磷酸酶(ALP)、丙氨酸转氨酶(ALAT)、天冬氨酸转氨酶(ASAT)、肌酸激酶、γ-谷氨酰基转移酶(GGT)、乳酸脱氢酶、总蛋白、白蛋白、白蛋白/球蛋白比率。
血液中PCSK9的分析:在第-8、-1、4、8、15、22、29、36、43和50天采集用于PCSK9分析的血液样品。从每只动物中的合适的静脉采集静脉血液(大约2mL)放入血清分离管(SST)并且允许它在室温凝固至少60±30分钟。在冷藏条件下(设定为保持+4℃)，以1000g将血液离心10分钟。血清将会被转移到3个单独试管中，并且被储存在-80℃下直到使用ELISA方法(CirculexHumanPCSK9ELISA试剂盒,CY-8079,对来自食蟹猴的样品有效)在CitoxLABFrance上进行分析。
其它分析:WO2011009697提供了用于下列分析的方法:qPCR、PCSK9mRNA分析。其它的分析包括PCSK9蛋白ELISA、采用ELISA的血清Lp(a)分析(Mercodia序号10-1106-01)、组织和血浆寡核苷酸分析(药物含量)、样品提取、标准样品和QC样品、通过ELISA测定寡核苷酸含量。
关于靶向PCSK9的化合物的数据如下表中所示:
使用靶向PCSK9的所述化合物，没有肝毒性或肾毒性的指征。值得注意的是，所述的PCSK9-GalNAc化合物提供了对PCSK9的迅速而且高效的下调，这种下调被维持超过了一个延长的时期(所述研究的全部时间长度)，阐明了与没有缀合的亲本化合物和使用替代缀合技术(例如胆固醇缀合)的化合物相比，GalNAc缀合的化合物在快速初始敲减和长持续时间方面均更有效，表明它们可以相对不频繁地并且以较低的剂量给药。在整个所述研究持续期间，SEQIDNO18提供了对PCSK9和LDL-C迅速而且一贯的下调(参见在第34天在2.5mg/kg剂量时,在使用单次2.5mg/kg剂量48天后，看到了显著的PCSK9下调，其中血浆PCSK9蛋白水平是剂量前的71％)。
实施例5:在大鼠中肝脏和肾毒性评估
可以对本发明化合物在啮齿类(例如在小鼠或大鼠)中的毒性分布进行评估。可以使用下列方案:使用年龄大约为8周龄的WistarHanCrl:WI(Han)。在这个年龄，雄性重量大约为250g。所有的动物自由获取SSNIFFR/M-H丸状维持饮食(GmbH,Soest,德国)和盛放在瓶子中的自来水(采用0.22μm过滤器过滤)。使用了10和40mg/kg/剂的剂量水平(皮下给药)并且在第1天和第8天定量给药。在第15天对动物实施安乐死。在第7天和第14天，采集尿样和血样。在第14天进行临床病理学评估。在所述研究前、在给药的第一天和在坏死前一星期，测定体重。每日评估每个组的食物消耗量。在禁食6小时后，经由尾静脉采集血样。进行了下列血清分析:红细胞计数、平均细胞体积、细胞压积、血红蛋白、平均细胞血红蛋白浓度、血小板计数、白细胞计数、具有细胞形态的分化的白细胞计数、网状细胞计数、钠、钾、氯化物、钙、无机磷、葡萄糖、尿素、肌酸酐、总胆红素、总胆固醇、甘油三酯、碱性磷酸酶、丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、总蛋白、白蛋白、白蛋白/球蛋白比率。进行了尿分析:α-GST、β-2微球蛋白、钙结合蛋白、簇蛋白、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C、KIM-1、骨桥蛋白、TIMP-1、VEGF和NGAL。基于第一组(MAP大鼠肾毒性磁性珠第一组,RKTX1MAG-37K)定量了7种分析物(钙结合蛋白、簇蛋白、GST-α、KIM-1、骨桥蛋白、TIMP-1、VEGF)。基于第二组(MAP大鼠肾毒性磁性珠第二组,RKTX2MAG-37K)定量了3种分析物(β-2微球蛋白、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C、脂笼蛋白-2/NGAL)。用于测定大鼠尿中这些生物标记物浓度的测定法基于Luminex技术。包被了抗-α-GST/β-2微球蛋白/钙结合蛋白/簇蛋白/抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/KIM-1/骨桥蛋白/TIMP-1/VEGF/NGAL抗体的微球体用两种不同的荧光染料进行颜色编码。测定了下列参数(尿，使用ADVIA1650):尿蛋白、尿肌酸酐。定量参数:体积、pH(使用10-MultistixSG测试带/Clinitek500尿分析仪)、比重(使用折光仪)。半定量参数(使用10-MultistixSG测试带/Clinitek500尿分析仪):蛋白质、葡萄糖、酮、胆红素、亚硝酸盐、血液、尿胆素原、沉降细胞学(通过显微检查)。质量参数:外观、颜色。杀死后，测定体重以及肾、肝脏和脾的重量，并且计算器官与体重的比率。采集肾和肝脏样品并且冷冻或储存在福尔马林中。进行显微分析。在图15中显示了Kim-1表达的数据,其中证明除SEQIDNO4以外的所有分子都具有比SEQIDNO1更低的尿kim-1信号,这证明与原初的以及以前表征过的没有缀合的分子相比改善的肾安全性。
实施例6对可切除的接头的分析
让带有不同的DNA/PO-接头的FAM-标记的反义寡聚体(ASOs)在S1核酸酶提取物(下表)、肝脏或肾匀浆物或血浆中接受体外切除。
大写字母是LNA核苷(例如β-D-氧基LNA),小写字母是DNA核苷。下标代表硫代磷酸酯核苷间连接。LNA胞嘧啶任选地是5-甲基胞嘧啶。所述FAM缀合部分被显示在图6中，而所述的分子被显示在图7中。
使带有不同的DNA/PO-接头的100μMFAM-标记的ASOs在体外接受在核酸酶缓冲液中的S1核酸酶(60Upr.100μL)切除20和120分钟(A)。通过向缓冲液中添加EDTA来停止酶活性。然后使用DionexDNApacp-100柱子和梯度范围在10mM-1M的pH为7.5的高氯酸钠，在DionexUltimate3000上对所述溶液进行AIEHPLC分析。使用荧光检测仪(在615nm处)和紫外检测仪(在260nm处)相对于标准品测定被切除的和没有被切除的寡核苷酸的含量。
结论:所述的PO接头(或这里所指的B区)导致所述的缀合物(或C基团)被切除,并且所述接头的长度和/或序列组成两者都能够被用来调节B区对核酸降解切除的敏感性。所述的DNA/PO-接头序列能够调节切除速率，如在核酸酶S1提取物中20分钟以后看到的那样。因此，也能够利用针对B区(例如对于所述的DNA/PO-接头)的序列选择来调节在血清和靶组织的细胞中的切除水平。
给肝脏和肾的匀浆物和血清掺杂SEQIDNO35的化合物达到200μg/g组织的浓度。把从NMRI小鼠收集的肝脏和肾样品在匀浆缓冲液(0,5％IgepalCA-630,25mMTrispH8.0,100mMNaCl,pH8.0(用1NNaOH调节)中匀浆。将匀浆物在37℃温育24小时，然后使用苯酚-氯仿萃取匀浆物。使用上述HPLC方法相对于标准品测定来自肝脏和肾的提取物中被切除的和没有被被切除的寡聚体的含量:
结论:所述的PO接头(或这里所指的B区)导致所述的缀合物(或C基团)在肝脏或肾的匀浆物中被切除了,但是在血清中没有被切除。可以利用在实施例6中所示的测定中对切除的敏感性来确定接头是否是可生物切除的或生理学上不稳定的。请注意在上述测定中的切除是指对所述可切除的接头的切除,所述的寡聚体或A区应当保持功能完整。
实施例7:在体内用胆固醇缀合物对PCSK9mRNA的敲减
PCSK9-小鼠特异性化合物
# 序列(5’-3’)(A) 可切除的接头(B) 缀合物(C)
40 GTctgtggaaGCG 无 无
41 GTctgtggaaGCG 无 胆固醇
42 GTctgtggaaGCG 2PO-DNA(5’ca3’) 胆固醇
43 GTctgtggaaGCG 2PO-DNA(5’ct3’) 胆固醇
根据表5，给NMRI小鼠注射单次剂量的盐水或10mg/kg没有缀合的LNA-反义寡核苷酸(SEQIDNO40)或等摩尔量的采用不同的接头与胆固醇缀合的LNA反义寡核苷酸，并且在第1-10天杀死小鼠。
把RNA从肝脏和肾中分离出来，并且使用PCSK9特异性引物和探针对其进行qPCR，以分析PCSK9mRNA的敲减。结果如图14中所示。
结论:用由2个具有磷酸二酯骨架的DNA构成的接头与PCSK9LNA反义寡核苷酸缀合的胆固醇(SEQIDNO:42和SEQIDNO:43)与没有缀合的化合物(SEQIDNO:40)以及具有稳定接头的胆固醇缀合物(SEQIDNO:41)相比，显示了增强的肝脏PCSK9敲减(图14)。
材料和方法:
实验设计:
剂量给药。根据上表，给在到达时大约20g的NMRI雌性动物在静脉内定量给药10ml/kg体重(根据第0天的体重)在盐水中配制的所述化合物或只给予盐水。
肝脏个肾组织的采样。根据表4，用70％CO2-30％O2将动物麻醉，并且通过颈脱臼法将其杀死。将大肝叶的一半和一个肾切碎并且此后浸没在RNA中。
根据生产商的说明书,使用MagNa纯96细胞RNA大体积试剂盒(Roche目录号5467535001)，在MagNA纯LCRNA分离组织缓冲液(Roche目录号03604721001)存在下，从最多10mg通过玻珠研磨匀浆的组织中提取总RNA。根据生产商的说明书，使用来自Ambion的逆转录酶试剂进行第一链的合成。
对于每一个样品，用不含RNA酶的H2O把0.5μg总RNA调整到(10.8μl)，并且与2μl随机十聚体(50μM)和4μldNTP混合物(2.5mM每一种dNTP)混合，并且加热到70℃持续3分钟，在此之后，迅速地在冰上冷却样品。向每一个样品中添加2μl处在室温的10倍缓冲液、1μlMMLV逆转录酶(100U/μl)和0.25μlRNA酶抑制剂(10U/μl)，然后在42℃温育60分钟，在95℃加热灭活所述的酶10分钟，然后把样品冷却到4℃。把cDNA样品1:5稀释，使用2倍的Taqman快速通用PCR大师混合物(AppliedBiosystems目录号4364103)和Taqman基因表达测定法(mPCSK9、Mn00463738_m1和mActin#4352341E)，遵照生产商的方案对其进行RT-QPCR，并且在AppliedBiosystemsRT-qPCR仪器(7500/7900或ViiA7)中以快速模式进行加工。
实施例8:非人灵长类研究；多重皮下注射
该项非人灵长类研究的目标是要评估当通过皮下注射(s.c.)施用化合物时，在重复给药的设定中，抗-PCSK9化合物的效力和安全性。在这项研究中所用的化合物是SEQIDNO:2、3、18和19,它们被以0.625和2.5mg/ml的初始浓度配制在无菌盐水(0.9％)中。
使用了至少24个月龄的雌性食蟹猴，并且给予它们自由获取自来水，并且每日给每只动物分发180gOWM(E)SQCSHORT膨化食品(DietexFrance,SDS,SaintGratien,法国)。此外，每日给每只动物提供水果或蔬菜。在所述的处理期开始之前，让所述的动物适应所述的研究条件至少14天的时间。在该处理期期间，进行了预处理研究。以0.5mg/kg(SEQIDNO:2、3、18和19)或1.5mg/kg/注射(SEQIDNO:18和19)的剂量，每周向所述的动物皮下注射给药一次，持续4周，4次注射总共持续4周的时间。剂量体积是0.4mL/kg/注射。每个组使用6只动物。在第四次而且是最后的剂量后，观察动物1周，在此之后将一半的动物杀死，以便研究肝脏apoB转录物调节、脂质参数、肝脏和肾组织学以及肝脏和肾组织分布。第1天对应于所述处理期的第一日。在所述研究之前和期间，记录临床观察和体重以及食物摄取(每个组)。
在下列时间点对血液和组织进行采样和分析:
RCP:常规临床病理学,LSB:肝脏安全性生物化学,PK:药代动力学,OA:其它分析,L:脂质
采集血液(大约1.0mL)放入肝素锂试管中(使用ADVIA1650血液生物化学分析仪)，分析钠、钾、氯化物、钙、无机磷、葡萄糖、HDL-C、LDL-C、尿素、肌酸酐、总胆红素(TBIL)、总胆固醇、甘油三酯、碱性磷酸酶(ALP)、丙氨酸转氨酶(ALAT)、天冬氨酸转氨酶(ASAT)、肌酸激酶、γ-谷氨酰基转移酶(GGT)、乳酸脱氢酶、总蛋白、白蛋白、白蛋白/球蛋白比率。
血液分析:在第-8、-1、4、8、15、22、29、36、43和50天从仅组1－16动物(即，用抗ApoB化合物处理的动物)采集用于ApoB分析的血液样品。从每只动物中的合适的静脉采集静脉血液(大约2mL)放入血清分离管(SST)并且允许它在室温凝固至少60±30分钟。在冷藏条件下(设定以保持+4℃)，以1000g将血液离心10分钟。将血清转移到3个单独的试管中，并且储存在-80℃直到通过ELISA分析ApoB蛋白。
其它分析:WO2010142805提供了用于下列分析的方法:qPCR、ApoBmRNA分析。其它的分析包括采用ELISA的血清Lp(a)分析(Mercodia序号10-1106-01)、组织和血清寡核苷酸分析(药物含量)、样品提取、标准样品和QC样品、通过ELISA测定寡核苷酸含量。
抗-PCSK9的寡核苷酸的预期的药理学是由于循环中的PCSK9蛋白(“血清PCSK9”)减少而导致LDL胆固醇减少。当研究血清PCSK9和LDL胆固醇(图16和图17)时，与没有缀合的分子相比，所述GalNAc缀合的分子展示了增强的效力。图16图解了4周注射(0.5mg/kg/注射)没有缀合的SEQIDNO2对血清PCSK9和LDL胆固醇只有较小的影响,然而具有相同LNA间隙体(SEQID18)的GalNAc缀合物对血清PCSK9和LDL胆固醇两者都具有强有力的减少效应。当比较多次注射SEQIDNO:3和SEQIDNO:19(图17)的数据时，注意到相同的关系:没有缀合的分子只有较小的效应，而相应的GalNAc缀合物(SEQIDNO:19)对血清PCSK9和LDL胆固醇具有强有力的下调。应该注意到:SEQIDNO:18和19对血清PCSK9和LDL胆固醇的效应是剂量依赖性的，并且具有长的作用持续期,在最后一次注射后(最后一次注射在第22天,关于直到第71天为止的恢复期阐明的数据)，其血清PCSK9和LDL胆固醇低于平均基线水平持续了至少7周。
在最后一次注射1周之后，即在所述研究的第29天，分析了肝脏和肾的寡核苷酸含量。使用杂交ELISA方法(基本上按照Lindholm等人在MolTher.2012Feb；20(2):376-81中所描述的方法)来分析寡核苷酸含量，在已经控制使得如果使用所述的(缀合的)SEQIDNO:18来制作标准曲线而结果没有任何变化之后，使用SEQIDNO:2为被SEQIDNO:2和SEQIDNO:18处理的动物样品制作一条标准曲线。以同样的方式，在已经控制使得如果使用SEQIDNO:19来制作用于那些样品的ELISA分析的标准曲线而结果没有任何差别之后，使用SEQIDNO:3来为SEQIDNO:3和SEQIDNO:19制作一条标准曲线。
正如上表中所阐明的那样，当给动物一周静脉内注射一次持续4周时，在最后一次注射1周之后，SEQIDNO:2和SEQIDNO:3的缀合导致所缀合的分子(SEQIDNO:18和SEQIDNO:19)的肝脏/肾比率比相应的没有缀合的分子的肝脏/肾比率高。考虑到采用其它没有缀合的抗-PCSK9的分子(例如SEQIDNO:1,如图15中所阐明的那样)已经展示了肾小管毒性征兆，以及考虑到肝脏是抗-PCSK9治疗的靶器官,期望向更高肝脏/肾比率的转变将要导致所述缀合的SEQIDNO:18和19与所述没有缀合的SEQIDNO:2和3相比，具有增大的安全性。
正如图16和图18中所图解的，以药理学相关的水平定量给药SEQIDNO:18和19。在所述处理期和恢复期期间，同样动物的临床化学分布图没有展示出肝脏或肾安全性参数的相关增加。

Claims (26)

1.一种反义寡核苷酸缀合物，其包含:
a.长度为12-22个核苷酸的反义寡聚体(A),它包含与SEQIDNO30或31或32或33或34或45的相应长度互补的10-16个核苷酸的毗连序列,和
b.至少一个与所述的寡聚体(A)共价连接的非核苷酸或非多核苷酸缀合部分(C)。
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸缀合物,其中所述的反义寡聚体包含一个选自由下列组成的组的毗连序列:SEQIDNO25、26、27、28、29和44。
3.根据权利要求1或2中任意一项所述的寡核苷酸缀合物,其中所述的反义寡聚体靶向PCSK9。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的寡核苷酸缀合物,其中所述的反义寡聚体包含一个选自由下列组成的组的毗连序列:SEQIDNO1、2、3、4、5、6、7和8。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的寡核苷酸缀合物,其中所述的缀合部分(C)选自由下列组成的组:碳水化合物,例如GalNAc或GalNAc簇；亲脂性基团,例如脂质、脂肪酸；甾醇,例如胆固醇或生育酚；或抑制素。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的反义寡核苷酸缀合物,其中所述的缀合部分(C)增强向肝细胞的递送和/或摄取。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的反义寡核苷酸缀合物,其中所述的缀合部分(C)包含甾醇，例如生育酚、胆固醇,例如以Conj5、Conj5、Conj6或Conj6a显示的那些。
8.根据权利要求1-6的反义寡核苷酸缀合物,其中所述的缀合部分(C)包含碳水化合物，例如GalNAc或三价的GalNAc,例如以Conj1、2、3或4或1a、2a、3a或4a显示的那些。
9.根据权利要求8所述的反义寡核苷酸缀合物,其中所述的缀合部分(C)包含Conj2a。
10.根据权利要求1-9中任意一项所述的反义寡核苷酸缀合物,其选自由下列组成的组:SEQIDNO9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23和24。
11.根据权利要求1-10中任意一项所述的反义寡核苷酸缀合物,其中所述的反义寡聚体(A)经由一个位于所述寡聚体的毗连序列与所述的缀合部分(C)之间的接头区(B和/或Y)与所述的缀合部分(C)缀合。
12.根据权利要求11所述的反义寡核苷酸缀合物,其中所述的接头选自C6至C12氨基烷基。
13.根据权利要求12所述的反义寡核苷酸缀合物,其中所述的接头是包含1-6个核苷酸的可生物切除的磷酸酯核苷酸接头。
14.一种长度为12-22个核苷酸的寡聚体,其包含
a.一个与SEQIDNO31的相应长度互补的16个核苷酸的毗连序列,或
b.一个与SEQIDNO33或34或45的相应长度互补的10-16个核苷酸的毗连序列。
15.根据权利要求14所述的寡聚体,其包含一个选自由下列组成的组的毗连序列:SEQIDNO26、27、28、29和44。
16.根据权利要求14或15中任意一项所述的寡聚体,其中所述的寡聚体靶向PCSK9。
17.根据权利要求14-16中任意一项所述的寡聚体，其中所述的毗连序列包含增强亲和性的核苷酸类似物。
18.根据权利要求14-17中任意一项所述的寡聚体,其是间隙体。
19.根据权利要求14-18中任意一项所述的寡聚体,其中所述的寡聚体包含一个13、14、15或16个核苷酸的毗连序列。
20.根据权利要求14-19中任意一项所述的寡聚体,其中所述的寡聚体包含一个或更多个选自由下列组成的组的核苷连接:硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和硼烷基磷酸酯。
21.根据权利要求14-20中任意一项所述的寡聚体,其包含选自由下列组成的组的毗连序列:SEQIDNO2、3、4、5、6、7和8。
22.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-21中任意一项所述的寡聚体或反义寡核苷酸缀合物和药学上可接受的稀释剂、载体、盐或佐剂。
23.根据权利要求1-22中任意一项所述的寡聚体或反义寡核苷酸缀合物或药物组合物，其用作药物，如用于治疗高胆固醇血症或相关病症,所述病症例如是一种选自由下列组成的组的病症:动脉粥样硬化症、高脂血症、高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症，例如获得PCSK9中的功能突变、HDL/LDL胆固醇失衡、血脂异常，例如家族性高脂血症(FCHL)或家族性高胆固醇血症(FHC)、获得性高脂血症、抑制素抗性的高胆固醇血症、冠状动脉病(CAD)和冠心病(CHD)。
24.根据权利要求1-22中任意一项所述的寡聚体或反义寡核苷酸缀合物或药物组合物用于生产用于治疗高胆固醇血症或相关病症的药物的用途,所述病症例如是一种选自由下列组成的组的病症:动脉粥样硬化症、高脂血症、高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症，例如获得PCSK9中的功能突变、HDL/LDL胆固醇失衡、血脂异常，例如家族性高脂血症(FCHL)或家族性高胆固醇血症(FHC)、获得性高脂血症、抑制素抗性的高胆固醇血症、冠状动脉病(CAD)和冠心病(CHD)。
25.一种治疗高胆固醇血症或相关病症的方法，所述的病症例如是一种选自由下列组成的组的病症:动脉粥样硬化症、高脂血症、高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症，例如获得PCSK9中的功能突变、HDL/LDL胆固醇失衡、血脂异常，例如家族性高胆固醇血症(FHC)、获得性高脂血症、抑制素抗性的高胆固醇血症、冠状动脉病(CAD)和冠心病(CHD)，所述方法包括向遭受或可能遭受高胆固醇血症或相关病症的患者施用有效量的根据权利要求1-22中任意一项所述的寡聚体或反义寡核苷酸缀合物或药物组合物。
26.一种用于在体内或在体外抑制表达PCSK9的细胞中的PCSK9的方法，所述方法包括向所述的细胞施用根据权利要求1-22中任意一项所述的寡聚体或反义寡核苷酸缀合物或药物组合物。
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