CN105722980A

CN105722980A - Apob反义缀合物化合物

Info

Publication number: CN105722980A
Application number: CN201480061955.6A
Authority: CN
Inventors: 南纳·阿尔贝克; 亨里克·弗吕登伦·汉森; 苏珊·卡姆勒; 玛丽·林霍尔姆; 马克·图尔纳; 亨里克·奥鲁姆
Original assignee: Copenhagen Co Ltd Of Roche Innovation Center
Current assignee: Copenhagen Co Ltd Of Roche Innovation Center
Priority date: 2013-11-14
Filing date: 2014-11-14
Publication date: 2016-06-29
Also published as: WO2015071388A1; US20160289677A1; JP2017501684A; HK1220724A1; CA2928349A1; EP3068885A1; MX2016005855A; KR20160083876A; RU2016122168A

Abstract

本发明涉及在位置2265?2277处靶向APOB基因的反义寡核苷酸(寡聚体)的缀合物。

Description

APOB反义缀合物化合物

技术领域

本发明涉及靶向ApoB的LNA反义寡核苷酸(寡聚体)的缀合物。

背景技术

载脂蛋白B(也被称作ApoB、载脂蛋白B-100；ApoB-100、载脂蛋白B-48；ApoB-48和Ag(x)抗原)是一种大的糖蛋白，它在脂质的装配和分泌中以及在不同类别脂蛋白的运输和受体介导的摄取和递送中发挥必不可少的作用。ApoB在循环脂蛋白水平的调节中起重要作用，并且因此与动脉粥样硬化易感性相关，所述动脉粥样硬化易感性与含载脂蛋白B的脂蛋白的环境浓度高度相关。关于存在于哺乳动物中的ApoB的两种形式、它们的结构和ApoB的医学重要性的其它细节，参见Davidson和Shelness(Annul Rev.Nutr.,2000,20,169-193)。

含ApoB-100的脂蛋白Lp(a)的血浆水平升高与动脉粥样硬化及其表现的风险增加相关，所述表现可以包括高胆固醇血症(Seed等人,N.Engl.J.Med.,1990,322,1494-1499)、心肌梗死(Sandkamp等人,Clin.Chew.,1990,36,20-23)和血栓形成(Nowak-Gottl等人,Pediatrics,1997,99,Eli)。

Lp(a)的血浆浓度受遗传因素强烈影响，并且对大多数药物和饮食控制无反应(Katan和Beynen,Am.J.Epidemiol.,1987,125,387-399；Vessby等人,Atherosclerosis,1982,44,61-71)。升高的Lp(a)水平的药理学治疗仅获得了很小的成功，去除术(apheresis)仍然是最有效的治疗模态(Hajjar和Nachman,Annul Rev.Med.,1996,47,423-442)。

在哺乳动物中存在载脂蛋白B的两种形式。ApoB-100代表专门在人肝脏中合成的、含有4536个氨基酸残基的全长蛋白(Davidson和Shelness,Annul Rev.Nutr.,2000,20,169-193)。被称为ApoB-48的截短形式与氨基端2152个残基线性对应，并且在所有哺乳动物的小肠中合成(Davidson和Shelness,Annul Rev.Nutr.,2000,20,169-193)。

载脂蛋白B的共同结构基因产生两种不同蛋白同工型的基础是一种被称为RNA编辑的过程。一种位点特异性的胞嘧啶-到-尿嘧啶编辑反应产生一个UAA终止密码子和载脂蛋白B的翻译终止以产生ApoB-48(Davidson和Shelness,Annul Rev.Nutr.,2000,20,169-193)。

已经使用过表达人ApoB的转基因小鼠研究(Kim和Young,J.Lipid Res.,1998,39,703-723；Nishina等人,J.Lipid Res.,1990,31,859-869)或ApoB敲除的小鼠(Farese等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1995,92,1774-1778；Kim和Young,J.Lipid Res.,1998,39,703-723)验证了哺乳动物ApoB的医学重要性。

旨在抑制载脂蛋白B功能的策略已经涉及Lp(a)去除术、抗体、抗体片段和核酶。此外，已经在WO 03/97662、WO 03/11887和WO 2004/44181WO2007/031081、WO2008/113830、WO2010/142805和WO2010/076248中公开了反义寡核苷酸。SPC3833和SPC4955(它们具有SEQID NO 1和2)是两种以前已经被鉴别为靶向人载脂蛋白B(ApoB)mRNA的有效化合物的LNA化合物。

WO2007/146511报道了短二环(LNA)间隔体(gapmer)反义寡核苷酸，其显然比更长的化合物更有效和更低毒性。举例说明的化合物看起来具有14个核苷酸的长度。

根据van Poelgeest等人(American Journal of Kidney Disease,2013年10月；62(4):796-800)，LNA反义寡核苷酸SPC5001在人临床试验中的施用可能导致急性肾损伤。

根据EP 1 984 381B1,Seth等人,Nucleic Acids Symposium Series 2008 No.52553-554和Swayze等人,Nucleic Acid Research 2007,第35卷,第687-700页，LNA寡核苷酸会在动物中造成显著的肝毒性。根据WO2007/146511，通过使用短至12-14个核苷酸长度的LNA间隔体，可以避免LNA寡核苷酸的毒性。EP 1 984 381B1推荐使用6’取代的二环核苷酸来减小LNA寡核苷酸的肝毒性潜力。根据Hagedorn等人,Nucleic Acid Therapeutics2013，可以从它们的序列和修饰模式预测反义寡核苷酸的肝毒性潜力。

已经针对在siRNA中的应用广泛地评价了寡核苷酸缀合物，其中认为它们是得到足够的体内效能所必需的。例如，参见WO2004/044141和WO2009/073809涉及修饰的寡聚体化合物，所述寡聚体化合物通过RNA干扰途径调节基因表达。所述寡聚体化合物包括一个或多个缀合物部分，所述缀合物部分可以改变或增强连接的寡聚体化合物的药代动力学和药效动力学性能。

WO2012/083046、WO2012/089352和WO2012/089602报道了用于siRNA的半乳糖簇-药代动力学调节剂靶向部分。

相反，通常在没有缀合或制剂的情况下在治疗上施用单链反义寡核苷酸。反义寡核苷酸的主要靶组织是肝脏和肾脏，尽管宽范围的其它组织也是反义模态可接近的，包括淋巴结、脾和骨髓。

WO 2005/086775涉及使用治疗性化学部分、可切割的接头和标记结构域向特定器官靶向递送治疗剂。所述可切割的接头可以是，例如，二硫化物基团、肽或限制性酶可切割的寡核苷酸结构域。

WO 2011/126937涉及通过与小分子配体的缀合而靶向细胞内递送寡核苷酸。

WO2009/025669涉及含有吡啶基二硫化物部分的聚合的(聚乙二醇)接头。也参见Zhao等人,Bioconjugate Chem.2005 16 758-766。

Chaltin等人,Bioconjugate Chem.2005 16 827-836报道了胆固醇修饰的单聚体、二聚体和四聚体寡核苷酸，其用于将反义寡核苷酸掺入阳离子脂质体中以产生树枝状聚合递送系统。胆固醇经由赖氨酸接头与寡核苷酸缀合。

其它不可切割的胆固醇缀合物已经用于将siRNA和antagomir靶向肝脏-参见例如，Soutscheck等人,Nature 2004第432卷173-178和Krützfeldt等人,Nature 2005第438卷,685-689。关于部分地硫代磷酸酯化的siRNA和antagomir，发现胆固醇作为肝脏靶向实体的用途是体内活性所必需的。

因此需要具有增强的效力和降低的毒性风险的靶向ApoB的LNA反义化合物。

发明内容

本发明提供了一种反义寡核苷酸缀合物(本发明的化合物)，其包含与脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分(区域C)共价连接的具有SEQ ID NO 2的寡核苷酸基序的寡聚体(区域A)。

本发明提供了一种反义寡核苷酸缀合物(本发明的化合物)，其包含与缀合物部分(区域C)共价连接的具有SEQ ID NO 2的寡核苷酸基序的寡聚体(区域A)，所述缀合物部分包含一个或多个N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)部分。

本发明提供了一种反义寡核苷酸缀合物(本发明的化合物)，其包含与缀合物部分共价连接的SEQ ID NO 27:5’GTtgacactgTC 3’的LNA寡聚体(区域A)，所述缀合物部分包含一个三价N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)部分。

本发明提供了一种反义寡核苷酸缀合物(本发明的化合物)，其包含与含有胆固醇部分的缀合物部分(区域C)共价连接的具有SEQ ID NO 2的寡核苷酸基序的寡聚体(区域A)，其中所述含有胆固醇的缀合物部分经由可生物切割的接头区域(区域B)连接至所述寡聚体。

本发明提供了一种反义寡核苷酸缀合物，其包含LNA寡聚体SEQ ID NO 27:5’G_sT_st_sg_sa_sc_sa_sc_st_sg_sT_sC 3’(区域A)，其中大写字母代表β-D-氧基LNA，小写字母代表DNA核苷，LNA胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶，且所有核苷间键是硫代磷酸酯；和，缀合物部分(区域C)，其包含N-乙酰基半乳糖胺部分或胆固醇部分，其中所述缀合物部分经由可生物切割的接头(区域B)连接至所述LNA寡聚体。

本发明提供了药物组合物，其包含本发明的化合物和药学上可接受的稀释剂、载体、盐或辅剂。

本发明提供了用作药物的本发明的化合物或药物组合物。具体地，用于治疗急性冠状动脉综合征、或高胆固醇血症或有关病症，诸如选自以下的病症：动脉粥样硬化，高脂血症，高胆固醇血症，HDL/LDL胆固醇失衡，血脂异常，例如，家族性高脂血症(FCHL)，获得性高脂血症，耐他汀类(statin)的高胆固醇血症，冠状动脉疾病(CAD)，和冠心病(CHD)。

本发明提供了用作药物的本发明的化合物或药物组合物，所述药物用于预防或减少粥样硬化斑块。

本发明提供了本发明的化合物或药物组合物用于制备药物的用途，所述药物用于治疗急性冠状动脉综合征、或高胆固醇血症或有关病症，诸如选自以下的病症：动脉粥样硬化，高脂血症，高胆固醇血症，HDL/LDL胆固醇失衡，血脂异常，例如，家族性高脂血症(FCHL)，获得性高脂血症，耐他汀类的高胆固醇血症，冠状动脉疾病(CAD)，和冠心病(CHD)。

本发明提供了一种治疗急性冠状动脉综合征、或高胆固醇血症或有关病症、诸如选自以下的病症的方法：动脉粥样硬化，高脂血症，高胆固醇血症，HDL/LDL胆固醇失衡，血脂异常，例如，家族性高脂血症(FCHL)，获得性高脂血症，耐他汀类的高胆固醇血症，冠状动脉疾病(CAD)，和冠心病(CHD)，所述方法包括：将有效量的根据本发明的化合物或药物组合物施用给遭受或可能遭受高胆固醇血症或有关病症的患者。

本发明提供了用于抑制正在表达ApoB的细胞中的ApoB的体内或体外方法，所述方法包括：将本发明的化合物施用给所述细胞从而抑制所述细胞中的ApoB。

本发明提供了用在医学中、诸如用作药物的本发明的化合物。

附图说明

图1:与活化基团(即受保护的反应基团–作为第三个区域)连接的本发明的寡聚体的非限制性图解。核苷间键L可以是，例如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼代磷酸酯或甲基膦酸酯，诸如磷酸二酯。PO是磷酸二酯键。化合物a)具有含有单个DNA或RNA的区域B，第二个区域和第一个区域之间的连接是PO。化合物b)具有通过磷酸二酯键连接的两个DNA/RNA(诸如DNA)核苷。化合物c)具有通过磷酸二酯键连接的三个DNA/RNA(诸如DNA)核苷。在某些实施方案中，区域B可以用其它磷酸二酯DNA/RNA(诸如DNA核苷)进一步延伸。活化基团图示在每个化合物的左侧上，且可以任选地经由磷核苷键基团(诸如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼代磷酸酯或甲基膦酸酯)或在某些实施方案中的三唑键连接至区域B的末端核苷。化合物d)、e)和f)还包含在区域B和活化基团之间的接头(Y)，且区域Y可以经由例如磷核苷键基团(诸如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼代磷酸酯或甲基膦酸酯)或在某些实施方案中的三唑键连接至区域B。

图2:如在图1中所示的等同化合物；但是，使用反应基团替代活化基团。在某些实施方案中，所述反应基团可以是活化基团的活化(例如去保护)的结果。在非限制性实施例中，所述反应基团可以是胺或醇。

图3:本发明的化合物的非限制性图示。命名法与图1相同。在某些实施方案中，X可以是缀合物，诸如亲脂缀合物诸如胆固醇，或脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分诸如半乳糖簇或包含GalNAc的部分，或另一种缀合物，诸如本文描述的那些。另外，或可替换地，X可以是靶向基团或阻断基团。在某些方面，X可以是活化基团(参见图1)或反应基团(参见图2)。X可以经由磷核苷键基团(诸如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼代磷酸酯或甲基膦酸酯)共价连接至区域B，或可以经由替代键例如三唑键而连接(参见化合物d)、e)和f)中的L)。

图4.本发明的化合物的非限制性图示，其中所述化合物包含在第三个区域(X)和第二个区域(区域B)之间的任选接头。命名法与图1相同。本文中公开了合适的接头，且包括，例如烷基接头，例如C6接头。在化合物A、B和C中，在X和区域B之间的接头经由磷核苷键基团(诸如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼代磷酸酯或甲基膦酸酯)连接至区域B，或可以经由替代键例如三唑键(Li)而连接。在这些化合物中，Lii代表第一个区域(A)和第二个区域(B)之间的核苷间键。

图5a和b.5b显示了本发明的化合物的合成方法的非限制性实施例。US代表寡核苷酸合成支持物，其可以是固体支持物。X是第三个区域，诸如缀合物、靶向基团、阻断基团等。在一个任选的预备步骤中，将X添加至寡核苷酸合成支持物。可以以其它方式得到已经连接了X的支持物(i)。在第一步中，合成区域B(ii)，随后合成区域A(iii)，并随后从寡核苷酸合成支持物切割本发明的寡聚体化合物(iv)。在一种替代性方法中，所述预备步骤包括给寡核苷酸合成支持物提供区域X和附带的连接基团(Y)(参见图5a)。在某些实施方案中，X或Y(如果存在的话)经由磷核苷键基团(诸如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼代磷酸酯或甲基膦酸酯)或替代键(诸如三唑键)连接至区域B。

图6.本发明的化合物的合成方法的一个非限制性实施例，所述化合物包含在第三个区域(X)和第二个区域(B)之间的接头(Y)。US代表寡核苷酸合成支持物，其可以是固体支持物。X是第三个区域，诸如缀合物、靶向基团、阻断基团等。在一个任选的预备步骤中，将Y连接至寡核苷酸合成支持物。可以以其它方式得到已经连接了Y的支持物(i)。在第一步中，合成区域B(ii)，随后合成区域A(iii)，并随后从寡核苷酸合成支持物切割本发明的寡聚体化合物(iv)。在某些实施方案(如所示的)中，可以在切割步骤之后将区域X添加至接头(Y)(v)。在某些实施方案中，Y经由磷核苷键基团(诸如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼代磷酸酯或甲基膦酸酯)或替代键(诸如三唑键)连接至区域B。

图7.利用活化基团的本发明的化合物的合成方法的一个非限制性实施例。在一个任选的预备步骤中，将活化基团连接至寡核苷酸合成支持物(i)，或者以其它方式得到具有活化基团的寡核苷酸合成支持物。在步骤ii)中合成区域B，随后合成区域A(iii)。然后从寡核苷酸合成支持物切割寡聚体(iv)。然后可以活化中间体寡聚体(包含活化基团)(vi)或(viii)，并添加第三个区域(X)(vi)，任选地经由接头(Y)(ix)。在某些实施方案中，X(或Y，当存在时)经由磷核苷键基团(诸如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼代磷酸酯或甲基膦酸酯)或替代键(诸如三唑键)连接至区域B。

图8.本发明的化合物的合成方法的一个非限制性实施例，其中使用双功能的寡核苷酸合成支持物(i)。在这样的方法中，在最初系列的步骤(ii)-(iii)中合成寡核苷酸，随后连接第三个区域(任选地经由连接基团Y)，然后可以切割本发明的寡聚体化合物(v)。可替换地，如在步骤(vi)-(ix)中所示，将第三个区域(任选地用连接基团(Y))连接至寡核苷酸合成支持物(这可以是任选的预备步骤)-或以其它方式提供具有第三个区域的寡核苷酸合成支持物(任选地具有Y)，然后合成寡核苷酸(vii-viii)。然后可以切割本发明的寡聚体化合物(ix)。在某些实施方案中，X(或Y，当存在时)经由磷核苷键基团(诸如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼代磷酸酯或甲基膦酸酯)或替代键(诸如三唑键)连接至区域B。在某些实施方案中，在所述方法(诸如预备步骤)之前，US可以包含添加双向(双功能)基团的步骤，所述基团允许独立合成寡核苷酸和将基团X、Y(或X和Y)共价连接至支持物(如所示的)–这可以例如使用三唑或核苷基团实现。然后可以从支持物切割连接了寡聚体的双向(双功能)基团。

图9.本发明的化合物的合成方法的一个非限制性实施例:在一个最初步骤中，合成第一个区域(A)(ii)，随后合成区域B。在某些实施方案中，然后将第三个区域连接至区域B(iii)，任选地经由磷酸核苷键(或例如三唑键)。然后可以切割本发明的寡聚体化合物(iv)。当使用接头(Y)时，在某些实施方案中，步骤(v)-(viii)之后可以是：在合成区域B以后，添加连接基团(Y)，然后连接至(Y)，或在后续步骤中,添加区域X(vi)。然后可以切割本发明的寡聚体化合物(vii)。在某些实施方案中，X(或Y，当存在时)经由磷核苷键基团(诸如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼代磷酸酯或甲基膦酸酯)或替代键(诸如三唑键)连接至区域B。

图10.本发明的化合物的合成方法的一个非限制性实施例:在该方法中，使用活化基团：步骤(i)-(iii)按照图9。但是，寡核苷酸合成(步骤iii)以后，将活化基团(或反应基团)添加至区域B，任选地经由磷酸核苷键。然后从支持物切割寡核苷酸(v)。随后可以活化活化基团以产生反应基团，然后将第三个区域(X)(诸如缀合物、阻断基团或靶向基团)添加至反应基团(其可以是活化的活化基团或反应基团)，以产生寡聚体(vi)。如在(vii)-(viii)中所示，切割以后，添加连接基团(Y)(vii)，然后连接至(Y)，或在后续步骤中，添加区域X以产生寡聚体(viii)。应当认识到，在一个替代方案中，所有步骤(ii)-(viii)可以在寡核苷酸合成支持物上执行，且在这样的情况下，可以执行从支持物切割寡聚体的最终步骤。在某些实施方案中，所述反应基团或活化基团经由磷核苷键基团(诸如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼代磷酸酯或甲基膦酸酯)或替代键(诸如三唑键)连接至区域B。

图11.用胆固醇-缀合物在体内沉默ApoB mRNA。给小鼠注射单次剂量的1mg/kg未缀合的LNA-反义寡核苷酸(SEQ ID NO:3)或等摩尔量的用不同接头(序列参见表7)缀合至胆固醇的LNA反义寡核苷酸，并在给药后第1、3、7和10天处死。将RNA从肝和肾分离并进行ApoB特异性的RT-qPCR。A.来自肝样品的ApoB mRNA的定量，对GAPDH标准化且显示为等同盐水对照的平均值的百分比。B.来自肾样品的ApoB mRNA的定量，对GAPDH标准化且显示为等同盐水对照的平均值的百分比。

图12.显示了下述缀合部分胆固醇C6、FAM、TOC和叶酸，它们可以在图1-4所示的化合物中用作X-Y-。波浪线代表缀合物部分与寡聚体的共价键。

图12A.显示了GalNAc缀合部分，其可以在图1-4所示的化合物中用作X-Y-。波浪线代表缀合物部分与寡聚体的共价键。

图12B.显示了在实施例中使用且在表3中列出的一些具体胆固醇缀合的化合物。L表示β-D-氧基-LNA单体；没有L的大写字母表示DNA单体，下标“s”表示硫代磷酸酯键，上标“^MeC”表示含有5-甲基胞嘧啶碱基的β-D-氧基-LNA单体；下标“o”表示磷酸二酯键。

图12C.显示了在实施例中使用且在表4中列出的一些具体FAM缀合的化合物。L表示β-D-氧基-LNA单体；没有L的大写字母表示DNA单体，下标“s”表示硫代磷酸酯键，上标“^MeC”表示含有5-甲基胞嘧啶碱基的β-D-氧基-LNA单体；下标“o”表示磷酸二酯键。

图12D.显示了在实施例中使用且在表5中列出的一些具体叶酸、GalNAc、FAM和TOC缀合的化合物。L表示β-D-氧基-LNA单体；没有L的大写字母表示DNA单体，下标“s”表示硫代磷酸酯键，上标“^MeC”表示含有5-甲基胞嘧啶碱基的β-D-氧基-LNA单体；下标“o”表示磷酸二酯键。

图12E.显示了在实施例中使用且在表6中列出的一些具体GalNAc缀合的化合物。L表示β-D-氧基-LNA单体；没有L的大写字母表示DNA单体，下标“s”表示硫代磷酸酯键，上标“^MeC”表示含有5-甲基胞嘧啶碱基的β-D-氧基-LNA单体；下标“o”表示磷酸二酯键。

图13:可以用在本发明中的三价GalNAc缀合物部分的例子。缀合物1-4解释了4种合适的GalNAc缀合物部分，且缀合物1a-4a表示具有额外接头部分(Y)的相同缀合物，所述接头部分(Y)用于将缀合物连接至寡聚体(区域A，或连接至可生物切割的接头，诸如区域B)。波浪线代表缀合物部分与寡聚体的共价键。

图13A:解释了缀合至SEQ ID NO 2的寡核苷酸序列基序的GalNAc缀合物2a和含有SEQ ID NO 27的寡核苷酸的LNA。这对应于SEQ ID NO 29的化合物。

图14:胆固醇缀合物部分的例子。波浪线代表缀合物部分与寡聚体的共价键。

图15:用不同的缀合物(参见实施例4)在体内沉默ApoB mRNA。用1mg/kg的具有不同缀合物的ASO处理小鼠，所述缀合物不具有可生物切割的接头、具有二硫-接头(SS)或具有DNA/PO-接头(PO)。将RNA从肝样品(A)和肾样品(B)分离，并分析ApoB mRNA敲减。显示了与盐水(＝1)相比的数据。

图16:实施例7-ApoB mRNA表达。

图17:实施例7-血清中的总胆固醇。

图18:实施例7-肝和肾中的寡核苷酸含量。

图19:用单次剂量的1.0或2.5mg/kg的SEQ ID NO 28或29治疗的猴中的血清ApoB和LDL-C水平。

图20:用单次剂量的1.0或2.5mg/kg的SEQ ID NO 7或20治疗的猴中的血清ApoB和LDL-C水平。

图21:用单次静脉内剂量的0.1mg/kg、0.25mg/kg或1.0mg/kg的SEQ ID NO 27、28或29治疗的小鼠中的总血清胆固醇水平。

图22:用多次剂量的0.1或0.5mg/kg的SEQ ID NO 27、28或29治疗的猴中的血清ApoB和LDL-C水平。

具体实施方式

本发明的反义寡核苷酸缀合物与未缀合的寡核苷酸相比具有许多改善的性能。缀合的寡核苷酸的效力显著增加。这允许减小剂量，同时仍然实现与对应的未缀合的化合物相比降低ApoB表达和血清胆固醇水平(例如提高的EC50和更宽的治疗指数)的类似效应。此外，当缀合寡核苷酸时，观察到从肾至肝的某种再分布，这可能导致除了通过减小剂量实现的更宽治疗指数以外提高的安全性。最后，本发明的缀合的寡核苷酸的药效动力学半衰期似乎比裸寡核苷酸显著更长，从而允许缀合的寡核苷酸的效应更持久，且由此与裸寡核苷酸相比潜在地降低给药频率。

寡聚体

在本发明的上下文中，术语“寡聚体”或“寡核苷酸”表示通过两个或多个核苷酸的共价键形成的分子(即寡核苷酸)。在本文中，单个核苷酸(单元)也可以被称作单体或单元。在某些实施方案中，术语“核苷”、“核苷酸”、“单元”和“单体”互换使用。应当认识到，当表示核苷酸或单体的序列时，是指碱基(诸如A、T、G、C或U)的序列。

本发明涉及化合物，其中反义寡核苷酸(寡聚体)与缀合物部分(区域C)连接，如在下面部分中的其它细节中所述。

本发明的一个方面是一种反义寡核苷酸缀合物，其包含靶向APOB基因(SEQ IDNO:32)上的位置2265-2277的寡聚体，例如与APOB基因上的位置2265-2277互补的寡聚体。该方面包括一种反义寡核苷酸缀合物，其包含与缀合物部分(区域C)连接的具有SEQ ID NO2的寡核苷酸基序或SEQ ID NO 27的寡核苷酸序列的寡聚体，所述缀合物部分包含N-乙酰基半乳糖胺部分或甾醇部分。表1提供了寡聚体和缀合物的具体组合：

表1:寡聚体/缀合物组合

这些组合可以通过用寡聚体的序列替换图13或14中的波浪线而具体化。图12E显示了Conj2或Conj1与SEQ ID NO 27的组合，分别对应于SEQ ID NO 31和29。图13A是图12E中的Conj2a化合物的一个详细实施例。应当指出，可生物切割的接头(B)可以或不可以存在于缀合物部分(C)和寡聚体(A)之间。对于Conj1-4和1a-4a，利用GalNAc簇中的赖氨酸接头，GalNAc缀合物本身是可生物切割的，且因此可以使用或不使用其它可生物切割的接头(B)。但是，初步的数据指示，可生物切割的接头(B)(诸如本文中公开的磷酸核苷酸接头)的包含可能增强这样的GalNAc簇寡聚体缀合物的活性。对于与Conj 5和Conj 6一起使用，可生物切割的接头的应用会极大地增强化合物活性。因此，当使用包含甾醇的缀合物部分时，推荐包含可生物切割的接头(B)，诸如本文中公开的磷酸核苷酸接头。缀合物部分(和区域B或区域Y或B和Y)可以位于例如SEQ ID的5’或3’侧，诸如区域A的5’侧。

本发明的化合物(例如寡聚体或缀合物)靶向ApoB，且因此能够在动物、人中或在表达ApoB的细胞中下调APOB表达或降低ApoB蛋白水平。在一个优选的实施方案中，当以等摩尔水平施用时，与未缀合的具有相同序列的寡核苷酸相比，本发明的寡核苷酸缀合物能够将动物或人中的血清ApoB水平降低至更低的水平。优选地，当在单次皮下注射中以例如但不限于0.5mg/kg的剂量施用寡核苷酸化合物且在注射以后第7天测量时，缀合的寡核苷酸与未缀合的寡核苷酸相比使血清ApoB水平多降低了2倍，更优选3倍或4倍。甚至更优选地，当在单次皮下注射中以例如但不限于0.5mg/kg的剂量施用寡核苷酸化合物且在注射以后第7天测量时，缀合的寡核苷酸与未缀合的寡核苷酸相比使其多降低了5倍，且最优选地缀合的寡核苷酸与未缀合的寡核苷酸相比使其多降低了至少10倍。这允许显著降低治疗所需的治疗有效量。

本发明的化合物包含具有10-22个(诸如10–20个，诸如12–22个)核苷酸(诸如12-18个核苷酸，诸如13-16或12或13或14或15或16个核苷酸)长度的寡聚体。在下面的单独部分中描述了关于寡核苷酸长度的细节。

在某些实施方案中，所述寡聚体包含一个或多个磷酸硫醇酯(phosporothiolate)连接的核苷。在下面的单独部分中描述了关于核苷酸间键的细节。

本发明的化合物包含具有SEQ ID NO 2的基序的寡核苷酸。在一个优选的实施方案中，所述寡核苷酸是一种修饰的寡聚体，这意味着，它包含非天然存在的核苷或核苷键。在本发明的一个实施方案中，本发明的化合物包含具有SEQ ID NO 2的基序的寡聚体，其中所述寡聚体包含或含有至少一个具有功能效应的核苷酸类似物。所述类似物的功能效应可以是产生增加的与靶标的结合和/或增加的对细胞内核酸酶的抗性和/或增加的向细胞中的运输。在下面的单独部分中描述了关于核苷酸类似物的细节。在某些实施方案中，所述核苷酸类似物是糖修饰的核苷酸，诸如独立地或依赖性地选自以下的糖修饰的核苷酸：锁定核酸(LNA)单元；2’-O-烷基-RNA单元、2’-OMe-RNA单元、2’-氨基-DNA单元和2’-氟-DNA单元。一种优选的核苷酸类似物是LNA。

在某些实施方案中，本发明的寡聚体包含或者是间隔体，诸如基于SEQ ID NO 2的基序设计的LNA间隔体寡核苷酸。在下面的单独部分中描述了关于间隔体和其它寡聚体设计的细节。在优选的实施方案中，所述间隔体对应于SEQ ID No 27。

本文中使用的术语“寡核苷酸基序”描述了具有碱基(诸如A、T、G和C)的确定序列的寡核苷酸序列，其可以形成具体寡核苷酸设计的基础，其中有些碱基是核苷酸类似物，其它碱基是DNA或RNA，且连接也可以变化。

在一个优选的实施方案中，所述寡核苷酸缀合物包含SEQ ID NO 27的LNA寡聚体，5’GTtgacactgTC 3’，其中大写字母是LNA核苷，且小写字母是DNA核苷，诸如LNA寡聚体5’G_sT_st_sg_sa_sc_sa_sc_st_sg_sT_sC 3’(区域A)，其中大写字母代表β-D-氧基LNA，小写字母代表DNA核苷，LNA胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶，且所有核苷间键是硫代磷酸酯。

本发明的化合物可以包含其它核苷酸区域。在某些实施方案中，所述其它核苷酸区域包含可生物切割的核苷酸区域，诸如磷酸核苷酸序列(第二个区域,区域B)，其可以将区域A共价连接至非核苷酸部分，诸如缀合物基团(第三个区域，或区域C)。在某些实施方案中，本发明的寡聚体(区域A)的连续核苷酸序列直接共价连接至区域C。在某些实施方案中，区域C是可生物切割的。关于接头的更多细节参见下面的部分。

在不同的实施方案中，本发明的化合物不包含RNA(单元)。在某些实施方案中，根据本发明的化合物、第一个区域、或第一个和第二个区域一起(例如作为单个连续序列)是直链分子或合成为直链分子。所述寡聚体因此可以是单链分子。在某些实施方案中，所述寡聚体不包含例如与相同寡聚体内的等同区域互补的至少3、4或5个连续核苷酸的短区域(即所述寡聚体不形成双链体)。在某些实施方案中，所述寡聚体可以(基本上)不是双链的。在某些实施方案中，所述寡聚体基本上不是双链的，诸如不是siRNA。

靶标

适当地，本发明的寡聚体能够下调APO-B基因(诸如ApoB-100或ApoB-48(APOB))的表达。在这点上，本发明的寡聚体可以影响APOB的抑制，通常是在哺乳动物诸如人细胞、诸如肝细胞中。在某些实施方案中，本发明的寡聚体结合至靶核酸并实现与正常表达水平相比至少10％或20％的表达抑制，更优选地与正常表达水平相比至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％抑制。在某些实施方案中，当使用本发明的化合物的0.04至25nM(诸如0.8至20nM)浓度时，看到这样的调节。在相同的或不同的实施方案中，表达的抑制是小于100％，诸如小于98％抑制、小于95％抑制、小于90％抑制、小于80％抑制诸如小于70％抑制。通过测量蛋白水平，例如通过方法诸如SDS-PAGE和随后的使用针对靶蛋白产生的合适抗体的蛋白质印迹法，可以确定表达水平的调节。可替换地，通过测量mRNA的水平，例如通过RNA印迹法或定量RT-PCR，可以确定表达水平的调节。当经由mRNA水平来测量时，在某些实施方案中，当使用适当的剂量(诸如0.04至25nM，诸如0.8至20nM浓度)时下调的水平通常是达到在没有本发明的化合物存在下的正常水平的10-20％的水平。

因此，本发明提供了一种下调或抑制正在表达APO-B蛋白和/或mRNA的细胞中的APO-B蛋白和/或mRNA的表达的方法，所述方法包括：将本发明的化合物施用给所述细胞以下调或抑制所述细胞中APO-B蛋白和/或mRNA的表达。适当地，所述细胞是哺乳动物细胞诸如人细胞。在某些实施方案中，所述施用可以发生在体外。在某些实施方案中，所述施用可以发生在体内。

本文中使用的术语“靶核酸”表示编码哺乳动物APO-B多肽(诸如人APO-B100)的DNA或RNA，诸如人APO-B100mRNA。编码APO-B100的核酸或其天然存在的变体以及从它们衍生出的RNA核酸，优选mRNA，诸如前-mRNA，尽管优选成熟的mRNA。在SEQ ID No 32中给出了靶ApoB核酸的一个实例，其对应于NCBI登记号NM_000384。靶ApoB核酸也见于genbank登记号:NG_011793、NM_000384.2、GI:105990531和NG_011793.1GI:226442987，都特此通过引用并入。在某些实施方案中，例如当用于研究或诊断中时，“靶核酸”可以是从上面的DNA或RNA核酸靶标衍生出的cDNA或合成的寡核苷酸。根据本发明的寡聚体优选地能够与靶核酸杂交。应当认识到，人APO-B mRNA是一种cDNA序列，且因此对应于成熟的mRNA靶序列，尽管在cDNA序列中用胸苷替代尿嘧啶。

术语“其天然存在的变体”表示在确定的分类群(诸如哺乳动物，诸如小鼠、猴，且优选人)内天然存在的核酸序列的APO-B1多肽的变体。通常，当提及多核苷酸的“天然存在的变体”时，该术语也可以包括通过染色体易位或复制产生的编码APO-B的基因组DNA的任何等位基因变体，以及RNA，诸如从其衍生出的mRNA。“天然存在的变体”还可以包括从APO-B100mRNA的选择性剪接衍生出的变体。当提及具体多肽序列时，例如，该术语也包括蛋白的天然存在形式，其因此可以经过加工，例如通过共翻译或翻译后修饰，诸如信号肽切割、蛋白水解性裂解、糖基化等。

寡聚体(区域A)包含连续核苷酸序列或由连续核苷酸序列组成，所述连续核苷酸序列对应于存在于例如人APO-B mRNA中的核苷酸序列的反向补体。

术语“对应于”和“与……对应”表示寡聚体的核苷酸序列(即核苷碱基或碱基序列)或连续核苷酸序列(第一个区域/区域A)与核酸靶标或其亚区域的反向补体之间的对比。

将核苷酸类似物与它们的等同或对应核苷酸直接对比。在一个优选的实施方案中，所述寡聚体(或其第一个区域)与靶区域或亚区域互补，诸如完全互补。

本文中使用的术语“反向补体”、“反向互补的”和“反向互补性”可与术语“补体”、“互补的”和“互补性”互换。

术语“对应核苷酸类似物”和“对应核苷酸”意图指示，在核苷酸类似物中的核苷酸与天然存在的核苷酸是相同的。例如，当核苷酸的2-脱氧核糖单元连接至腺嘌呤时，“对应核苷酸类似物”含有与腺嘌呤连接的戊糖单元(不同于2-脱氧核糖)。

术语“核苷碱基”表示核苷酸的碱基部分，且涵盖天然存在的以及非天然存在的变体。因而，“核苷碱基”不仅涵盖已知的嘌呤和嘧啶杂环，而且涵盖其杂环类似物和互变异构体。应当认识到，区域B的DNA或RNA核苷可以具有天然存在的和/或非天然存在的核苷碱基。

核苷碱基的例子包括、但不限于：腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。在某些实施方案中，所述核苷碱基可以独立地选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶和5-甲基胞嘧啶。在某些实施方案中，所述核苷碱基可以独立地选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷和5-甲基胞嘧啶。

在某些实施方案中，存在于寡聚体中的核苷碱基中的至少一个是选自以下的修饰的核苷碱基：5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。

核苷酸类似物

本文中使用的术语“核苷酸”表示包含糖部分、碱基部分和共价连接的基团(诸如磷酸酯或硫代磷酸酯核苷酸间键基团)的糖苷，且涵盖天然存在的核苷酸(诸如DNA或RNA)和包含修饰的糖和/或碱基部分的非天然存在的核苷酸(它们在本文中也被称作“核苷酸类似物”)。在本文中，单个核苷酸(单元)也可以被称作单体或核酸单元。

在生物化学领域中，术语“核苷”常用于表示包含糖部分和碱基部分的糖苷，且因此可以在表示核苷酸单元时使用，所述核苷酸单元通过寡聚体的核苷酸之间的核苷酸间键而共价连接。

本领域普通技术人员会认识到，寡核苷酸的5’核苷酸不包含5’核苷酸间键基团，尽管可能包含或不包含5’末端基团。

非天然存在的核苷酸包括具有修饰的糖部分的核苷酸，诸如二环核苷酸或2’修饰的核苷酸，诸如2’取代的核苷酸。

“核苷酸类似物”是通过糖和/或碱基部分中的修饰而产生的天然核苷酸(诸如DNA或RNA核苷酸)的变体。在寡核苷酸的上下文中，类似物原则上可以仅仅是“沉默的”或“等同”于天然核苷酸，即在寡核苷酸起作用以抑制靶基因表达的方式上不具有功能效应。尽管如此，这样的“等同”类似物可能是有用的，例如，如果它们的制备更容易或更廉价，或它们对贮存或制备条件更稳定，或它们代表标签或标记。但是，优选地，所述类似物将在寡核苷酸起作用以抑制表达的方式上具有功能效应；例如通过产生增加的对靶标的结合亲和力和/或增加的对细胞内核酸酶的抗性和/或增加的向细胞中运输的容易性。核苷类似物的具体例子描述在例如Freier和Altmann；Nucl.Acid Res.,1997,25,4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development,2000,3(2),293-213和方案1中：

方案1

所述寡聚体因而可以包含以下序列或由以下序列组成：天然存在的核苷酸-优选2’-脱氧核苷酸(在这里通常称作“DNA”)的简单序列，但是也可能是核糖核苷酸(在这里通常称作“RNA”)或这样的天然存在的核苷酸与一个或多个非天然存在的核苷酸(即核苷酸类似物)的组合。这样的核苷酸类似物可以适当地增强寡聚体对靶序列的亲和力。

本文中使用的“2′-修饰的”或“2′-取代的”表示包含糖的核苷，所述糖包含除了H或OH以外的在2′位置处的取代基。2′-修饰的核苷包括、但不限于具有非桥连2′取代基(诸如烯丙基、氨基、叠氮基、硫代、O-烯丙基、O-C₁-C₁₀烷基、-OCF₃、O-(CH₂)₂-O-CH₃、2′-O(CH₂)₂SCH₃、O-(CH₂)₂-O-N(R_m)(R_n)或O-CH₂-C(＝O)-N(R_m)(R_n)，其中每个R_m和R_n独立地是H或被取代的或未被取代的C₁-C₁₀烷基)的核苷。2′-修饰的核苷还可以包含其它修饰，例如，在糖的其它位置处和/或在核苷碱基处。

本文中使用的“2′-F”表示在2′位置包含氟代基团的糖。

本文中使用的“2′-OMe”或“2′-OCH₃”或“2′-O-甲基”各自表示核苷。

合适的和优选的核苷酸类似物的例子由WO2007/031091提供或在其中参考。可以用在本发明的寡聚体中的其它核苷酸类似物包括三环核酸，例如请参见WO2013154798和WO2013154798，其特此通过引用并入。

增强亲和力的核苷酸类似物(诸如LNA或2’-取代的糖)在寡聚体中的掺入，可以允许减小特异性地结合的寡聚体的大小，且也可以将上限减小至非特异性的或异常的结合发生之前寡聚体的大小。

在本发明的某些实施方案中，存在于本发明的寡聚体中的核苷酸类似物独立地选自，例如：2’-O-烷基-RNA单元、2’-氨基-DNA单元、2’-氟-DNA单元、LNA单元、阿拉伯核酸(arabino nucleic acid，ANA)单元、2’-氟-ANA单元、HNA单元、INA(嵌入核酸-Christensen,2002.Nucl.Acids.Res.200230:4918-4925,特此通过引用并入)单元和2’MOE单元。在某些实施方案中，在本发明的寡聚体(诸如第一个区域或其连续核苷酸序列)中仅存在以上核苷酸类似物类型中的一种。

在某些实施方案中，所述寡聚体包含至少2个核苷酸类似物。在某些实施方案中，所述寡聚体包含3-8个核苷酸类似物，例如6或7个核苷酸类似物。在最优选的实施方案中，所述核苷酸类似物中的至少一个是锁定核酸(LNA)；例如所述核苷酸类似物中的至少3个或至少4个、或至少5个、或至少6个、或至少7个、或8个可以是LNA。在某些实施方案中，所有核苷酸类似物可以是LNA。在一个单独的部分中更详细地描述了LNA类似物。

应当认识到，当提及优选的仅由核苷酸组成的核苷酸序列基序或核苷酸序列时，该该序列定义的本发明的寡聚体可以包含对应核苷酸类似物以替代存在于所述序列中的一个或多个核苷酸，诸如LNA单元或其它核苷酸类似物，它们会增加寡聚体/靶双链体的双链体稳定性/T_m(即增强亲和力的核苷酸类似物)。

T_m测定：将寡核苷酸:寡核苷酸和RNA靶标(PO)双链体在500ml不含RNA酶的水中稀释至3mM，并与500ml 2xT_m-缓冲液(200mM NaCl,0.2mM EDTA,20mM磷酸钠,pH 7.0)混合。将溶液加热至95℃保持3min，然后将其在室温退火30min。使用PE Templab软件(PerkinElmer)在配备Peltier温度程序调控器PTP6的Lambda 40紫外/可见光分光光度计上测量双链体解链温度(T_m)。使温度从20℃升高至95℃，然后下降至25℃，在260nm记录吸收。使用解链和退火的第一导数和局部最大值来评估双链体T_m。

LNA

术语“LNA”表示包含C2*-C4*双基(桥)的二环核苷类似物，且被称作“锁定核酸”。它可以表示LNA单体，或者，当用在“LNA寡核苷酸”的上下文中时，LNA表示含有一个或多个这样的二环核苷酸类似物的寡核苷酸。在某些方面，二环核苷类似物是LNA核苷酸，且这些术语因此可以互换使用，且在这样的实施方案中，二者特征在于在核糖糖环的C2’和C4’之间的连接基团(诸如桥)的存在。

在某些实施方案中，存在于第一个区域(A)中的至少一个核苷类似物是二环核苷类似物，诸如至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个(除了区域B的DNA和/或RNA核苷以外)是糖修饰的核苷类似物，诸如二环核苷类似物，诸如LNA，例如β-D-X-LNA或α-L-X-LNA(其中X是氧基、氨基或硫代)，或本文中公开的其它LNA，包括、但不限于ENA、(R/S)cET、cMOE或5’-Me-LNA。

在本发明的寡核苷酸化合物中使用的LNA优选地具有下面显示的两种示例性立体化学异构体的结构，其包括β-D和α-L异构体,：

下面显示了具体的示例性LNA单元：

一种优选的核苷酸类似物是LNA，诸如氧基-LNA(诸如β-D-氧基-LNA,和α-L-氧基-LNA),和/或氨基-LNA(诸如β-D-氨基-LNA和α-L-氨基-LNA)和/或硫代-LNA(诸如β-D-硫代-LNA和α-L-硫代-LNA)和/或ENA(诸如β-D-ENA和α-L-ENA)。在优选的实施方案中，LNA是β-D-氧基-LNA。

术语“硫代-LNA”包含这样的锁定核苷酸，其中上述通式中的O选自S或-CH₂-S-。硫代-LNA可以呈β-D和α-L-构型。

术语“氨基-LNA”包含这样的锁定核苷酸，其中上述通式中的Y选自-N(H)-、N(R)-、CH₂-N(H)-和-CH₂-N(R)-，其中R选自氢和C_1-4-烷基。氨基-LNA可以呈β-D和α-L-构型。

术语“氧基-LNA”包含这样的锁定核苷酸，其中上述通式中的Y代表-O-。这还可以描述为2’-O-(CH₂)-4’或4′-(CH₂)-O-2′。氧基-LNA可以呈β-D和α-L-构型。

术语“ENA”包含这样的锁定核苷酸，其中上述通式中的Y是-CH₂-O-(其中-CH₂-O-的氧原子连接至相对于碱基B的2’-位置)。这还可以描述为2’-O-(CH₂)₂-4’或4′-(CH₂)₂-O-2′。

可以用于替代β-D-氧基LNA的其它LNA核苷提供在例如PCT/EP2013/073858中，特此通过引用并入。

长度

所述寡聚体可以包含共计10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个连续核苷酸长度的连续核苷酸序列或由其组成。长度可以包括例如区域A或区域A和B。

在某些实施方案中，所述寡聚体包含共计10–22(诸如12-18，诸如13-17或13-16或12-16或12-14，诸如12、13、14、15、16)个连续核苷酸长度的连续核苷酸序列或由其组成。

在某些实施方案中，根据本发明的寡聚体由不超过22个核苷酸组成，诸如不超过20个核苷酸，诸如不超过18个核苷酸，诸如15、16或17个核苷酸。在某些实施方案中，本发明的寡聚体包含小于20个核苷酸。

RNA酶募集

认识到，寡聚体化合物可以通过非RNA酶介导的靶mRNA的降解而起作用，诸如通过翻译的位阻或其它方法，在某些实施方案中，本发明的寡聚体能够募集内切核糖核酸酶(RNA酶)，诸如RNA酶H。

优选地，这样的寡聚体(诸如区域A或连续核苷酸序列)包含至少6个(诸如至少7个)连续核苷酸单元的区域，诸如至少8个或至少9个连续核苷酸单元(残基)，包括7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个连续核苷酸，其当与互补靶RNA形成双链体时能够募集RNA酶(诸如DNA单元)。能够募集RNA酶的连续序列可以是区域Y’，如在本文所述的间隔体的上下文中所提及的。在某些实施方案中，能够募集RNA酶的连续序列(诸如区域Y’)的大小可以更高，诸如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸单元。

EP 1 222 309提供了用于确定RNA酶H活性的体外方法，其可以用于确定募集RNA酶H的能力。在以下情况下，认为寡聚体能够募集RNA酶H：当提供互补RNA靶标时，使用EP 1222 309的实施例91–95提供的方法，它具有的初始速率(以pmol/l/min为单位测量)是使用仅DNA的寡核苷酸确定的初始速率的至少1％(诸如至少5％，诸如至少10％或超过20％)，所述仅DNA的寡核苷酸具有相同碱基序列，但是仅含有DNA单体，不具有2’取代，在寡核苷酸的所有单体之间具有硫代磷酸酯键基团。

在某些实施方案中，在以下情况下，认为寡聚体基本上不能募集RNA酶H：当提供互补RNA靶标和RNA酶H时，使用EP 1 222 309的实施例91–95提供的方法，RNA酶H初始速率(以pmol/l/min为单位测量)是使用等同的仅DNA的寡核苷酸确定的初始速率的小于1％(诸如小于5％，诸如小于10％或小于20％)，所述等同的仅DNA的寡核苷酸不具有2’取代，在寡核苷酸的所有核苷酸之间具有硫代磷酸酯键基团。

在其它实施方案中，在以下情况下，认为寡聚体能够募集RNA酶H：当提供互补RNA靶标和RNA酶H时，使用EP 1 222 309的实施例91–95提供的方法，RNA酶H初始速率(以pmol/l/min为单位测量)是使用等同的仅DNA的寡核苷酸确定的初始速率的至少20％(诸如至少40％，诸如至少60％，诸如至少80％)，所述等同的仅DNA的寡核苷酸不具有2’取代，在寡核苷酸的所有核苷酸之间具有硫代磷酸酯键基团。

通常，所述寡聚体的形成连续核苷酸单元的区域(当与互补靶RNA形成双链体时能够募集RNA酶)由与RNA靶标形成DNA/RNA样双链体的核苷酸单元组成。本发明的寡聚体，诸如第一个区域，可以包含含有核苷酸和核苷酸类似物的核苷酸序列，且可以例如呈间隔体的形式。

间隔体设计

在某些实施方案中，本发明的寡聚体，诸如第一个区域，包含或者是间隔体。间隔体寡聚体是包含核苷酸的连续段的寡聚体，所述连续段能够募集RNA酶，诸如RNA酶H，诸如至少6或7个DNA核苷酸的区域，在本文中被称作区域Y’(Y’)，其中区域Y’在5’和3’侧侧接增强亲和力的核苷酸类似物的区域，诸如在能够募集RNA酶的核苷酸连续段的5’和3’侧的1-6个核苷酸类似物——这些区域分别被称作区域X’(X’)和Z’(Z’)。X’和Z’区域还可以被称作间隔体的翼，且区域Y’也被称作间隔体的间隙。间隔体的例子公开在WO2004/046160、WO2008/113832和WO2007/146511中。

在某些实施方案中，能够募集RNA酶的单体选自：DNA单体、α-L-LNA单体、C4’烷基化的DNA单体(参见PCT/EP2009/050349和Vester等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.18(2008)2296-2300，特此通过引用并入)和UNA(未连接的核酸)核苷酸(参见Fluiter等人,Mol.Biosyst.,2009,10,1039，特此通过引用并入)。UNA是未锁定的核酸，通常其中已经除去了核糖的C2-C3C-C键，从而形成解锁的“糖”残基。优选地，间隔体包含式(5’至3’)X’-Y’-Z’的(聚)核苷酸序列，其中；区域X’(X’)(5’区域)包含至少一个核苷酸类似物(诸如至少一个LNA单元)诸如1-6个核苷酸类似物(诸如LNA单元)或由其组成；且，区域Y’(Y’)包含至少5个能够募集RNA酶的连续核苷酸(当与互补RNA分子诸如mRNA靶标形成双链体时)诸如DNA核苷酸或由其组成；且，区域Z’(Z’)(3’区域)包含至少一个核苷酸类似物(诸如至少一个LNA单元)诸如1-6个核苷酸类似物(诸如LNA单元)或由其组成。

在某些实施方案中，区域X’由1、2、3、4、5或6个核苷酸类似物(诸如LNA单元)诸如2-5个核苷酸类似物(诸如2-5个LNA单元)诸如3或4个核苷酸类似物(诸如3或4个LNA单元)组成；和/或区域Z’由1、2、3、4、5或6个核苷酸类似物(诸如LNA单元)诸如2-5个核苷酸类似物(诸如2-5个LNA单元)诸如3或4个核苷酸类似物(诸如3或4个LNA单元)组成。

在某些实施方案中，Y’包含5、6、7、8、9、10、11或12个能够募集RNA酶的连续核苷酸或由其组成，或包含6-10个、或7-9个(诸如8个)能够募集RNA酶的连续核苷酸或由其组成。在某些实施方案中，区域Y’包含至少一个DNA核苷酸单元(诸如1-12个DNA单元)或由其组成，优选4-12个DNA单元，更优选6-10个DNA单元，诸如7-10个DNA单元，最优选8、9或10个DNA单元。

在某些实施方案中，区域X’由3或4个核苷酸类似物(诸如LNA)组成，区域X’由7、8、9或10个DNA单元组成，且区域Z’由3或4个核苷酸类似物(诸如LNA)组成。这样的设计包括(X’-Y’-Z’)3-10-3、3-10-4、4-10-3、3-9-3、3-9-4、4-9-3、3-8-3、3-8-4、4-8-3、3-7-3、3-7-4、4-7-3。

其它间隔体设计公开在WO2004/046160(其特此通过引用并入)中。WO2008/113832(其要求特此通过引用并入的美国临时申请60/977,409的优先权)涉及‘短体(shortmer)’间隔体寡聚体。在某些实施方案中，这里呈现的寡聚体可以是这样的短体间隔体。

在某些实施方案中，所述寡聚体(例如区域X’)由共计10、11、12、13或14个核苷酸单元的连续核苷酸序列组成，其中所述连续核苷酸序列包含或是式(5’-3’)X’-Y’-Z’，其中；X’由1、2或3个核苷酸类似物单元(诸如LNA单元)组成；Y’由7、8或9个连续核苷酸单元组成，所述连续核苷酸单元当与互补RNA分子(诸如mRNA靶标)形成双链体时能够募集RNA酶；且Z’由1、2或3个核苷酸类似物单元(诸如LNA单元)组成。

在某些实施方案中，X’由1个LNA单元组成。在某些实施方案中，X’由2个LNA单元组成。在某些实施方案中，X’由3个LNA单元组成。在某些实施方案中，Z’由1个LNA单元组成。在某些实施方案中，Z’由2个LNA单元组成。在某些实施方案中，Z’由3个LNA单元组成。在某些实施方案中，Y’由7个核苷酸单元组成。在某些实施方案中，Y’由8个核苷酸单元组成。在某些实施方案中，Y’由9个核苷酸单元组成。在某些实施方案中，区域Y’由10个核苷单体组成。在某些实施方案中，区域Y’包含1-10个DNA单体或由其组成。在某些实施方案中，Y’包含1-9个DNA单元(诸如2、3、4、5、6、7、8或9个DNA单元)。在某些实施方案中，Y’由DNA单元组成。在某些实施方案中，Y’包含至少一个呈α-L构型的LNA单元，诸如2、3、4、5、6、7、8或9个呈α-L-构型的LNA单元。在某些实施方案中，Y’包含至少一个α-L-氧基LNA单元，或其中所有呈α-L-构型的LNA单元是α-L-氧基LNA单元。在某些实施方案中，存在于X’-Y’-Z’中的核苷酸的数目选自(核苷酸类似物单元-区域Y’-核苷酸类似物单元)：1-8-1、1-8-2、2-8-1、2-8-2、3-8-3、2-8-3、3-8-2、4-8-1、4-8-2、1-8-4、2-8-4、或；1-9-1、1-9-2、2-9-1、2-9-2、2-9-3、3-9-2、1-9-3、3-9-1、4-9-1、1-9-4、或；1-10-1、1-10-2、2-10-1、2-10-2、1-10-3、3-10-1。在某些实施方案中，在X’-Y’-Z’中的核苷酸的数目选自2-7-1、1-7-2、2-7-2、3-7-3、2-7-3、3-7-2、3-7-4和4-7-3。在某些实施方案中，每个区域X’和Y’由3个LNA单体组成，且区域Y’由8或9或10个核苷单体(优选DNA单体)组成。在某些实施方案中，X’和Z’二者各自由两个LNA单元组成，且Y’由8或9个核苷酸单元(优选DNA单元)组成。在不同的实施方案中，其它间隔体设计包括这样的那些：其中区域X’和/或Z’由3、4、5或6个核苷类似物(诸如含有2’-O-甲氧基乙基-核糖糖(2’-MOE)的单体或含有2’-氟-脱氧核糖糖的单体)组成，且区域Y’由8、9、10、11或12个核苷(诸如DNA单体)组成，其中区域X’-Y’-Z’具有3-9-3、3-10-3、5-10-5或4-12-4单体。其它间隔体设计公开在WO 2007/146511A2(特此通过引用并入)中。

LNA间隔体是包含至少一个LNA核苷酸的间隔体寡聚体(区域A)。一种优选的LNA间隔体寡聚体是12-16个核苷酸的长度，且包含具有2-8-2间隔体基序的SEQ ID NO 2的寡聚体基序或由其组成。SEQ ID NO 27是这样的LNA间隔体寡聚体的一个实施例。

核苷酸间键

本文描述的寡聚体(例如第一个和第二个区域)的核苷单体经由核苷间键基团偶联到一起。适当地，每个单体经由连接基团连接至3’邻近的单体。

本领域普通技术人员会理解，在本发明的上下文中，在寡聚体的末端处的5’单体不包含5’连接基团，尽管它可能包含或不包含5’末端基团。

术语“连接基团”或“核苷酸间键”意图指能够将两个核苷酸共价地偶联到一起的基团。具体的且优选的例子包括磷酸酯基团和硫代磷酸酯基团。

本发明的寡聚体或其连续核苷酸序列的核苷酸经由连接基团偶联到一起。适当地，每个核苷酸经由连接基团连接至3’邻近的核苷酸。

合适的核苷酸间键包括在WO2007/031091内列出的那些，例如在WO2007/031091(特此通过引用并入)的第34页的第一段上列出的核苷酸间键。

在某些实施方案中，除了区域B(当存在时)的磷酸二酯键以外，优选地将核苷酸间键从它的正常磷酸二酯修饰成对核酸酶攻击更有抗性的键，诸如硫代磷酸酯或硼代磷酸酯——这两种是RNA酶H可切割的，也允许在减少靶基因表达中的反义抑制路线。

本文中提供的合适的含硫(S)的核苷酸间键可以是优选的，诸如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯。硫代磷酸酯核苷酸间键也是优选的，特别是对于第一个区域，诸如在间隔体、混合体(mixmer)、antimirs剪接开关寡聚体和总体(totalmer)中。

对于间隔体，寡聚体中的核苷酸间键可以是例如硫代磷酸酯或硼代磷酸酯，从而允许RNA酶H切割靶向的RNA。由于提高的核酸酶抗性和其它原因，诸如容易制备，硫代磷酸酯是优选的。

在一个方面，除了在第一个和第二个区域之间和任选地在区域B内的磷酸二酯键以外，本发明的寡聚体、核苷酸和/或核苷酸类似物的剩余核苷间键借助于硫代磷酸酯基彼此连接。在某些实施方案中，第一个区域中的核苷之间的至少50％(诸如至少70％、诸如至少80％、诸如至少90％诸如所有)核苷间键是磷酸二酯(磷酸酯)以外的键，诸如选自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或硼代磷酸酯。在某些实施方案中，第一个区域中的核苷之间的至少50％(诸如至少70％、诸如至少80％、诸如至少90％诸如所有)核苷间键是硫代磷酸酯。

WO09124238涉及具有至少一个二环核苷的寡聚体化合物，所述二环核苷通过中性核苷间键连接至3′或5′端。本发明的寡聚体因此可以具有至少一个通过中性核苷间键(诸如一个或多个磷酸三酯、甲基膦酸酯、MMI、酰胺-3、甲缩醛(formacetal)或硫代甲缩醛)连接至3′或5′端的二环核苷。剩余的键可以是硫代磷酸酯。

在一个优选的实施方案中，所有将寡聚体的核苷酸与SEQ ID NO 2的基序连接的核苷间键是硫代磷酸酯键。

GalNAc缀合物部分

通过添加缀合物部分(C)，可以极大地增强向肝脏的靶向。因此，合乎需要的是，使用增强在肝细胞中的摄取和活性的缀合物部分。活性的增强可以是由于增强的摄取，或它可以是由于增强的化合物在肝细胞中的效能。

在某些实施方案中，碳水化合物部分不是直链碳水化合物聚合物。但是，碳水化合物部分可以是多价的，例如，例如2、3或4个相同或不同的碳水化合物部分可以共价地连接至寡聚体，任选地经由一个或多个接头(诸如区域Y)。在某些实施方案中，本发明提供了一种缀合物，其包含本发明的寡聚体和碳水化合物缀合物部分。在某些实施方案中，本发明提供了一种缀合物，其包含本发明的寡聚体和靶向脱唾液酸糖蛋白受体的缀合物部分，诸如GalNAc部分，所述部分可以形成另一个区域(被称作区域C)的组成部分。

本发明还提供了修饰的寡核苷酸(诸如LNA反义)，其缀合至脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分。在某些实施方案中，所述缀合物部分(诸如第三个区域或区域C)包含脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分，诸如半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰基-半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、N-丙酰基-半乳糖胺、N-正丁酰基-半乳糖胺和N-异丁酰基半乳糖胺。在某些实施方案中，所述缀合物包含1-3个脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分，诸如N-乙酰基半乳糖胺，优选2-3个脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分N-乙酰基半乳糖胺。更优选地，所述缀合物部分包含半乳糖簇，诸如N-乙酰基半乳糖胺三聚体。在某些实施方案中，所述缀合物部分包含GalNAc(N-乙酰基半乳糖胺)，诸如单价、二价、三价或四价GalNAc。三价GalNAc缀合物可以用于将化合物靶向肝脏。GalNAc缀合物已经与磷酸二酯、甲基膦酸酯和PNA反义寡核苷酸(例如US 5,994517和Hangeland等人,Bioconjug Chem.1995年11-12月；6(6):695-701,Biessen等人1999Biochem J.340,783-792和Maier等人2003Bioconjug Chem 14,18-29)和siRNA(例如WO2009/126933、WO2012/089352和WO2012/083046)一起使用，且最近与LNA和2′-MOE修饰的核苷(WO2014/076196和WO 2014/179620)一起使用。在其中使用的GalNAc参考文献和具体的缀合物特此通过引用并入，尤其是WO 2014/179620中的缀合物部分通过引用并入。WO2012/083046公开了具有包含可切割的药代动力学调节剂的GalNAc缀合物部分的siRNA，其适合用在本发明中，优选的药代动力学调节剂是C16疏水基团诸如棕榈酰基、十六碳-8-烯酰基、油烯基、(9E,12E)-十八碳-9,12-二烯酰基、二辛酰基和C16-C20酰基。’046的可切割的药代动力学调节剂还可以是胆固醇。

‘靶向部分(缀合物部分)可以选自半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰基-半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、N-丙酰基-半乳糖胺、N-正丁酰基-半乳糖胺、N-异丁酰基半乳糖胺、半乳糖簇和N-乙酰基半乳糖胺三聚体，且可以具有选自以下的药代动力学调节剂：具有16个或更多个碳原子的疏水基团，具有16-20个碳原子的疏水基团，棕榈酰基，十六碳-8-烯酰基，油烯基，(9E,12E)-十八碳-9,12二烯酰基，二辛酰基，和C16-C20酰基，和胆固醇。在’046中公开的某些GalNAc簇包括：(E)-十六碳-8-烯酰基(C16),油烯基(C18)、(9,E,12E)-十八碳-9,12-二烯酰基(C18),辛酰基(C8),十二烷酰基(dodececanoyl)(C12),C-20酰基,C24酰基,二辛酰基(2xC8)。靶向部分-药代动力学调节剂靶向部分可以经由生理学上不稳定的键或例如二硫键或PEG接头连接至多核苷酸。本发明也涉及在寡聚体和缀合物基团之间的磷酸二酯接头(这些在本文中被称作区域B，且适当地位于LNA寡聚体和碳水化合物缀合物基团之间)的应用。

就靶向肝脏中的肝细胞而言，一种优选的靶向配体是半乳糖簇。

半乳糖簇包含具有例如2-4个末端半乳糖衍生物的分子。本文中使用的术语半乳糖衍生物包括半乳糖和对脱唾液酸糖蛋白受体的亲和力等于或大于半乳糖的亲和力的半乳糖衍生物。末端半乳糖衍生物通过它的C-l碳连接至分子。脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPr)是肝细胞独有的且结合支链半乳糖-端糖蛋白。一种优选的半乳糖簇具有三个末端半乳糖胺或半乳糖胺衍生物，各自具有对脱唾液酸糖蛋白受体的亲和力。一种更优选的半乳糖簇具有三个末端N-乙酰基-半乳糖胺。在本领域中常见的其它术语包括三-天线半乳糖、三价半乳糖和半乳糖三聚体。已知的是，三-天线半乳糖衍生物簇以比二-天线或单-天线半乳糖衍生物结构更大的亲和力结合至ASGPr(Baenziger和Fiete,1980,Cell,22,611-620；Connolly等人,1982,1.Biol.Chern.,257,939-945)。达到nM亲和力需要多价。根据WO2012/083046，对脱唾液酸糖蛋白受体具有亲和力的单个半乳糖衍生物的连接不能实现当与递送聚合物一起共同施用时RNAi多核苷酸向体内肝细胞的功能性递送。

一个半乳糖簇可以包含两个或优选地三个半乳糖衍生物，每个连接至中央分支点。半乳糖衍生物通过糖的C-l碳连接至中央分支点。半乳糖衍生物优选地通过接头或间隔物连接至分支点。一种优选的间隔物是柔性的亲水间隔物(美国专利5885968；Biessen等人.J.Med.Chern.1995第39卷第1538-1546页)。一种优选的柔性的亲水间隔物是PEG间隔物。一种优选的PEG间隔物是PEG3间隔物。所述分支点可以是允许连接三个半乳糖衍生物且进一步允许将分支点连接至寡聚体的任何小分子。一种示例性的分支点基团是二-赖氨酸。一个二-赖氨酸分子含有三个胺基(通过它们可以连接三个半乳糖衍生物)和一个羧基反应基团(通过它可以将二-赖氨酸连接至寡聚体)。分支点与寡聚体的连接可以通过接头或间隔物实现。一种优选的间隔物是柔性的亲水间隔物。一种优选的柔性的亲水间隔物是PEG间隔物。一种优选的PEG间隔物是PEG3间隔物(三个亚乙基单元)。使用本领域已知的方法，可以将半乳糖簇连接至寡聚体的3′或5′末端。在优选的实施方案中，半乳糖簇连接至寡聚体的5’末端。

一种优选的缀合物部分是半乳糖衍生物，优选N-乙酰基-半乳糖胺(GalNAc)缀合物部分。更优选地使用一个三价N-乙酰基半乳糖胺部分。对脱唾液酸糖蛋白受体具有亲和力的其它糖可以选自包含以下成员的列表：半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺和N-异丁酰基半乳糖胺。已经研究了众多半乳糖衍生物对脱唾液酸糖蛋白受体的亲和力(参见例如:Jobst,S.T.和Drickamer,K.JB.C.1996,271,6686)，或使用本领域中的典型方法容易地确定。

本发明的缀合物部分优选地包含1-3个N-乙酰基半乳糖胺部分。在某些实施方案中，所述缀合物部分包含这样的半乳糖簇：其具有经由间隔物连接至分支点的三个半乳糖部分或其衍生物。三价N-乙酰基半乳糖胺簇的非限制性例子显示在图13和下面的图中。一种优选的缀合物部分包含三个经由PEG间隔物连接至二-赖氨酸的GalNAc部分。优选地，所述PEG间隔物是3PEG间隔物。

半乳糖簇的一个实施方案

在分支点和核酸之间具有PEG间隔物的半乳糖簇

下面解释了本发明的缀合物的其它例子：

当使用LNA寡聚体(诸如LNA反义寡核苷酸)时，在上面GalNAc簇缀合物中的疏水或亲脂(或其它缀合物)部分(即药代动力学调节剂)是任选的。

关于在本研究中使用的具体GalNAc簇、Conj 1、2、3、4和Conj1a、2a、3a和4a(它们与任选的C6接头一起显示，所述C6接头将GalNAc簇连接至寡聚体)，参见图13。

在本发明的一个优选实施方案中，所述寡核苷酸缀合物对应于SEQ ID NO 29或31。

因此，GalNAc簇(例如GalNAc)的每个碳水化合物部分可以经由间隔物(诸如(聚)乙二醇接头(PEG)，诸如二、三、四、五、六-乙二醇接头)连接至寡聚体。如上所示，PEG部分形成半乳糖糖部分和肽(显示了三赖氨酸)接头之间的间隔物。

在某些实施方案中，所述GalNAc簇包含肽接头，例如Tyr-Asp(Asp)三肽或Asp(Asp)二肽，其经由双基接头连接至寡聚体(或连接至区域Y或区域B)，例如GalNAc簇可以包含下述双基接头：

R¹是双基，其优选地选自-C₂H₄-、-C₃H₆-、-C₄H₈-、-C₅H₁₀-、-C₆H₁₂-、1,4-环己基(-C₆H₁₀-)、1,4-苯基(-C₆H₄-)、-C₂H₄OC₂H₄-、-C₂H₄(OC₂H₄)₂-或-C₂H₄(OC₂H₄)₃-。

碳水化合物缀合物(例如GalNAc)或碳水化合物-接头部分(例如碳水化合物-PEG部分)可以经由分支点基团(例如，氨基酸或肽)共价地结合(连接)至寡聚体，所述分支点基团适当地包含两个或更多个氨基(诸如3、4或5个)，诸如赖氨酸、二-赖氨酸或三-赖氨酸或四-赖氨酸。三-赖氨酸分子含有四个胺基(通过它们可以连接三个碳水化合物缀合物基团诸如半乳糖和衍生物(例如GalNAc)和另一个缀合物诸如疏水或亲脂部分/基团)和一个羧基反应基团(通过它可以将三-赖氨酸连接至寡聚体)。其它缀合物(诸如亲脂/疏水部分)可以连接至与寡聚体相连的赖氨酸残基。

药代动力学调节剂

本发明的化合物还可以包含一个或多个额外的缀合物部分，其亲脂或疏水部分是特别有趣的，诸如当缀合物基团是碳水化合物部分时。这样的亲脂或疏水部分可以充当药代动力学调节剂，且可以共价连接至碳水化合物缀合物、将碳水化合物缀合物连接至寡聚体的接头或连接多个碳水化合物缀合物(多价)缀合物的接头，或者共价连接至寡聚体，任选地经由接头，诸如可生物切割的接头。

因此，寡聚体或缀合物部分可以包含药代动力学调节剂，诸如亲脂或疏水部分。这样的部分公开在WO2012/082046的siRNA缀合物的上下文内。疏水部分可以包含C8-C36脂肪酸，其可以是饱和的或不饱和的。在某些实施方案中，可以使用C10、C12、C14、C16、C18、C20、C22、C24、C26、C28、C30、C32和C34脂肪酸。疏水基团可以具有16个或更多个碳原子。示例性的合适疏水基团可以选自：甾醇、胆固醇、棕榈酰基、十六碳-8-烯酰基、油烯基、(9E,12E)-十八碳-9,12-二烯酰基、二辛酰基和C16-C20酰基。根据WO’346，具有少于16个碳原子的疏水基团在增强多核苷酸靶向方面不太有效，但是它们可以以多个拷贝(例如2x，诸如2x C8或C10、C12或C14)使用来增强效力。可用作多核苷酸靶向部分的药代动力学调节剂可以选自：胆固醇、烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基和芳炔基，其中的每一个可以是直链、支链或环状。药代动力学调节剂优选地是仅含有碳和氢原子的烃。但是，可以允许维持疏水性的取代或杂原子，例如氟。

在某些实施方案中，所述缀合物是或可以包含碳水化合物，或包含碳水化合物基团。在某些实施方案中，所述碳水化合物选自：半乳糖、乳糖、正乙酰基半乳糖胺、甘露糖和甘露糖-6-磷酸。在某些实施方案中，所述缀合物基团是或可以包含甘露糖或甘露糖-6-磷酸。可以使用碳水化合物缀合物来增强在多种组织(诸如肝脏和/或肌肉)中的递送或活性。参见，例如，EP1495769、WO99/65925、Yang等人,Bioconjug Chem(2009)20(2):213-21.Zatsepin和Oretskaya Chem Biodivers.(2004)1(10):1401-17。

令人惊奇地，本发明的发明人已经发现，用于与LNA寡聚体一起使用的GalNAc缀合物不需要药代动力学调节剂，且所以，在某些实施方案中，所述GalNAc缀合物没有共价连接至亲脂或疏水部分，诸如在本文中描述的那些，例如不包含C8-C36脂肪酸或甾醇。因此，本发明也提供了不包含亲脂或疏水药代动力学调节剂或缀合物部分/基团的LNA寡聚体GalNAc缀合物。

在某些实施方案中，所述缀合物部分是亲水的。在某些实施方案中，所述缀合物基团不包含亲脂取代基，诸如脂肪酸取代基，诸如C8-C26，诸如棕榈基取代基，或不包含甾醇，例如胆固醇取代基。在这点上，本发明的组成部分基于以下惊人发现：LNA寡聚体GalNAc缀合物具有显著的药代动力学性能，即使不使用药代动力学调节剂，诸如脂肪酸取代基(例如>C8或>C16脂肪酸基团)。

亲脂缀合物

亲脂缀合物诸如甾醇、植物甾醇和染污(stains)诸如胆固醇或如在本文中公开的，可以用于增强寡核苷酸向例如肝脏(通常是肝细胞)的递送。

在某些实施方案中，所述缀合物基团是或可以包含甾醇(例如，胆固醇、胆甾醇基、胆甾烷醇、豆甾醇、胆烷酸和麦角甾醇)。在某些实施方案中，所述缀合物是或包含生育酚。在某些实施方案中，所述缀合物是或可以包含胆固醇。

在某些实施方案中，所述缀合物是或可以包含脂质、磷脂或亲脂醇，诸如阳离子脂质、中性脂质、鞘脂，和脂肪酸诸如硬脂酸、油酸、反油酸、亚油酸、linoleaidic、亚麻酸和肉豆蔻酸。在某些实施方案中，所述脂肪酸包含C4-C30饱和的或不饱和的烷基链。所述烷基链可以是直链或支链。

可以使用亲脂缀合物部分，例如，以抵消寡聚体化合物的亲水性和增强细胞穿透。

亲脂部分包括，例如，甾醇、植物甾醇和类固醇和有关的化合物诸如胆固醇(美国专利号4,958,013和Letsinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86,6553)、硫代胆甾醇(Oberhauser等人,Nucl Acids Res.,1992,20,533)、羊毛甾醇、粪甾醇、豆甾醇、麦角甾醇、麦角钙化醇、胆酸、脱氧胆酸、雌酮、雌二醇、雌三醇、黄体酮、己烯雌酚、睾酮、雄酮、脱氧皮质酮、可的松、17-羟基皮质酮、它们的衍生物等。在某些实施方案中，所述缀合物可以选自胆固醇、硫代胆甾醇、羊毛甾醇、粪甾醇、豆甾醇、麦角甾醇、麦角钙化醇、胆酸、脱氧胆酸、雌酮、雌二醇、雌三醇、黄体酮、己烯雌酚、睾酮、雄酮、脱氧皮质酮、可的松、和17-羟基皮质酮。其它亲脂缀合物部分包括脂族基团，例如，直链、支链和环状烷基、烯基和炔基。脂族基团可以具有，例如，5至约50个、6至约50个、8至约50个、或10至约50个碳原子。实例脂族基团包括十一烷基、十二烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、萜类、冰片基、金刚烷基、其衍生物等。在某些实施方案中，脂族基团中的一个或多个碳原子可以被杂原子诸如O、S或N替代(例如，香叶基氧基己基)。其它合适的亲脂缀合物部分包括甘油的脂族衍生物诸如烷基甘油、双(烷基)甘油、三(烷基)甘油、甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯。在某些实施方案中，所述亲脂缀合物是二-己基癸基-消旋-甘油或1,2-二-O-己基癸基-消旋-甘油(Manoharan等人,Tetrahedron Lett.,1995,36,3651；Shea,等人,Nuc.Acids Res.,1990,18,3777)或其膦酸酯。饱和的和不饱和的脂肪官能团(例如，脂肪酸、脂肪醇、脂肪酸酯和脂肪胺)也可以充当亲脂缀合物部分。在某些实施方案中，所述脂肪官能团可以含有约6个碳至约30个碳、或约8个碳至约22个碳。实例脂肪酸包括癸酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、二十碳烯酸等。

在其它实施方案中，亲脂缀合物基团可以是具有6至约50个、10至约50个、或14至约40个碳原子的多环芳族基团。实例多环芳族基团包括芘、嘌呤、吖啶、呫吨、芴、菲、蒽、喹啉、异喹啉、萘、其衍生物等。其它合适的亲脂缀合物部分包括薄荷醇、三苯甲基(例如，二甲氧基三苯甲基(DMT))、吩噁嗪、硫辛酸、磷脂、醚、硫醚(例如，己基-S-三苯甲基硫醇)、其衍生物等。寡聚体化合物的亲脂缀合物的制备在本领域中有充分描述，诸如见，例如，Saison-Behmoaras等人,EMBO J.,1991,10,1111；Kabanov等人,FEBS Lett.,1990,259,327；Svinarchuk等人,Biochimie,1993,75,49；(Mishra等人,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264,229,和Manoharan等人,Tetrahedron Lett.,1995,36,3651。

含有对低密度脂蛋白(LDL)具有亲和力的缀合物部分的寡聚体化合物可以帮助提供有效的靶向递送系统。针对LDL的受体在肿瘤细胞上的高表达水平使得LDL成为药物向这些细胞的选择性递送的有吸引力的载体(Rump,等人,Bioconjugate Chem.,1998,9,341；Firestone,Bioconjugate Chem.,1994,5,105；Mishra,等人,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264,229)。对LDL具有亲和力的部分包括许多亲脂基团诸如类固醇(例如，胆固醇)、脂肪酸、其衍生物和它们的组合。在某些实施方案中，具有LDL亲和力的缀合物部分可以是胆酸(诸如鹅去氧胆酸和石胆酸)的二油烯基酯。

在某些实施方案中，所述亲脂缀合物可以是或可以包含生物素。在某些实施方案中，所述亲脂缀合物可以是或可以包含甘油酯或甘油酯酯。

下述参考文献也涉及亲脂缀合物的应用：Kobylanska等人,Acta Biochim Pol.(1999)；46(3):679-91.Felber等人,.Biomaterials(2012)33(25):599-65)；Grijalvo等人,J Org Chem(2010)75(20):6806-13。Koufaki等人,Curr Med Chem(2009)16(35):4728-42。Godeau等人J.Med.Chem.(2008)51(15):4374-6和WO 2013/033230。

在本发明的一个优选实施方案中，所述寡核苷酸缀合物对应于SEQ ID NO 28。

接头(例如区域Y)

连接或接头是两个原子之间的连接物，其将一个目标化学基团或区段经由一个或多个共价键连接至另一个目标化学基团或区段。缀合物部分(或靶向或阻断部分)可以直接地或通过连接部分(接头或系链)即接头连接至寡聚体化合物。接头是用于将第三个区域(例如缀合物部分)共价地连接至寡聚体化合物(诸如区域B)的双功能部分。在某些实施方案中，所述接头包含链结构或重复单元(诸如乙二醇或氨基酸单元)的寡聚体。所述接头可以具有至少两个官能团，一个用于连接至寡聚体化合物，且其它用于连接至缀合物部分。实例接头官能团可以是亲电子的(用于与寡聚体或缀合物部分上的亲核基团反应)或亲核的(用于与亲电子基团反应)。在某些实施方案中，接头官能团包括氨基、羟基、羧酸、硫醇、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、磷酸酯、亚磷酸酯、不饱和键(例如，双键或三键)等。一些实例接头包括8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-l-甲酸酯(SMCC)、6-氨基己酸(AHEX或AHA)、6-氨基己氧基、4-氨基丁酸、4-氨基环己基羧酸、琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-(6-酰氨基-己酸酯)(LCSMCC)、琥珀酰亚胺基间-马来酰亚胺基-苯甲酸酯(MBS)、琥珀酰亚胺基N-e-马来酰亚胺基-己酸酯(EMCS)、琥珀酰亚胺基6-(β-马来酰亚胺基-丙酰氨基)己酸酯(SMPH)、琥珀酰亚胺基N-(a-马来酰亚胺基乙酸酯)(AMAS)、琥珀酰亚胺基4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(SMPB)、β-丙氨酸(β-ALA)、苯基甘氨酸(PHG)、4-氨基环己酸(ACHC)、β-(环丙基)丙氨酸(β-CYPR)、氨基十二烷酸(ADC)、亚烷基二醇、聚乙二醇、氨基酸等。

多种其它的连接基团是本领域已知的，其可用于将缀合物部分连接至寡聚体化合物。许多有用的连接基团的综述可以参见，例如，Antisense Research and Applications(反义研究和应用),S.T.Crooke和B.Lebleu,编,CRC Press,Boca Raton,Fla.,1993,第303-350页。已经使用二硫键将寡核苷酸的3′末端连接至肽(Corey,等人,Science 1987,238,1401；Zuckermann,等人,J Am.Chem.Soc.1988,110,1614；和Corey,等人,JAm.Chem.Soc.1989,111,8524)。Nelson,等人,Nuc.Acids Res.1989,17,7187描述了用于将生物素连接至寡核苷酸的3′-端的连接试剂。该试剂N-Fmoc-O-DMT-3-氨基-1,2-丙二醇可在名称3′-胺(Amine)下商购得自Clontech Laboratories(Palo Alto,Calif.)。它也可在名称3′-氨基-修饰剂(Amino-Modifier)试剂下商购得自Glen Research Corporation(Sterling,Va.)。该试剂也用于将肽连接至寡核苷酸，如Judy,等人,Tetrahedron Letters1991,32,879所报道的。一种类似的市售的用于连接至寡核苷酸的5′-端的试剂是5′-氨基-修饰剂(Amino-Modifier)C6。这些试剂可得自Glen Research Corporation(Sterling,Va.)。Krieg,等人,Antisense Research and Development(反义研究和发展)1991,1,161利用这些化合物或类似的化合物将荧光素连接至寡核苷酸的5′-端。其它化合物诸如吖啶已经已经经由聚亚甲基连接而连接至寡核苷酸的3′-端磷酸酯基团(Asseline,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1984,81,3297)。[0074]以上基团中的任一种可以用作单个接头或与一种或多种其它接头联合使用。

在本领域中提供了接头和它们在制备寡聚体化合物的缀合物中的用途，诸如见WO96/11205和WO 98/52614和美国专利号4,948,882、5,525,465、5,541,313、5,545,730、5,552,538、5,580,731、5,486,603、5,608,046、4,587,044、4,667,025、5,254,469、5,245,022、5,112,963、5,391,723、5,510475、5,512,667、5,574,142、5,684,142、5,770,716、6,096,875、6,335,432和6,335,437，Wo2012/083046，它们中的每一篇通过引用整体并入。

本文中使用的生理学上不稳定的键是在哺乳动物体内通常遇到的条件下或在与哺乳动物体内通常遇到的那些条件类似的条件下可切割的不稳定的键(也被称作可切割的接头)。选择生理学上不稳定的连接基团，使得它们当在某些生理条件下存在时经历化学转化(例如，切割)。哺乳动物细胞内条件包括在哺乳动物细胞内存在的或与哺乳动物细胞内遇到的那些类似的化学条件诸如pH、温度、氧化或还原条件或试剂、和盐浓度。哺乳动物细胞内条件也包括在哺乳动物细胞中通常存在的酶活性的存在，诸如来自蛋白水解酶或水解酶。在某些实施方案中，所述可切割的接头对核酸酶敏感，所述核酸酶可能例如在靶细胞中表达，且因此，如本文中详述的，所述接头可以是短区域(例如1–10个)磷酸二酯连接的核苷，诸如DNA核苷。

化学转化(不稳定的键的切割)可以通过将药学上可接受的试剂加给细胞而开始，或可以在含有不稳定的键的分子到达适当的细胞内和/或细胞外环境时自发地发生。例如，当分子进入酸化的核内体时，pH不稳定的键可以被切割。因而，可以认为pH不稳定的键是胞内体可切割的键。当暴露于酶诸如在核内体或溶酶体中或在细胞质中存在的那些酶时，酶可切割的键可以被切割。当分子进入细胞细胞质的更加还原环境时，二硫键可以被切割。因而，可以认为二硫键是细胞质可切割的键。本文中使用的pH-不稳定的键是在酸性条件(pH<7)下选择性地断裂的不稳定的键。这样的键也可以被称作在胞内体中不稳定的键，因为细胞核内体和溶酶体具有小于7的pH。

寡聚体连接的可生物切割的缀合物

寡聚体化合物可以任选地包含位于寡聚体(被称作区域A)和缀合物(被称作区域C)之间的第二个区域(区域B)。区域B可以是接头诸如可切割的接头(也被称作生理学上不稳定的键)。(参见实施例6)

核酸酶敏感的生理学上不稳定的键：

在某些实施方案中，本发明(或缀合物)的寡聚体(也被称作寡聚体化合物)包含三个区域：

i)第一个区域(区域A)，其包含具有SEQ ID NO 2的基序的寡核苷酸；

ii)第二个区域(区域B)，其包含可生物切割的接头

iii)第三个区域(C)，其包含缀合物部分、靶向部分、活化部分，其中所述第三个区域共价连接至所述第二个区域。

可以构造本发明的寡核苷酸缀合物，使得赖氨酸接头(区域B)任选地经由其它接头Y连接N-乙酰基半乳糖胺基(区域C)和寡聚体(区域A)。所述其它接头Y插入在赖氨酸接头和寡聚体之间。与赖氨酸接头连接的N-乙酰基半乳糖胺基也可以视作缀合物部分(区域C)，其中区域B嵌入在区域C中。因此接头Y可以是在区域C和A之间。

对于三价GalNAc缀合物，每个GalNAc部分可以连接至可生物切割的接头(例如二-赖氨酸或三-赖氨酸接头)，所述接头进一步共价连接至寡聚体(SEQ ID NO 2或SEQ ID NO:27)。任选地，另一个接头(Y)可以插入在可生物切割的赖氨酸接头和寡聚体之间。接头Y可以例如是脂肪酸诸如C6接头。除了接头Y以外，生理学上可切割的接头区域B可以插入在寡聚体和接头Y之间。

在某些实施方案中，区域B可以是磷酸核苷酸接头。例如，当缀合物是甾醇诸如胆固醇或生育酚时，可以使用这样的接头。磷酸核苷酸接头还可以用于其它缀合物，例如碳水化合物缀合物，诸如GalNAc。

在一个优选的实施方案中，所述寡核苷酸缀合物包含与间隔物连接的三个N-乙酰基半乳糖胺单元和将寡聚体连接至二-赖氨酸接头的C6接头。这样的构建体的例子显示在图13和13A中。在另一个实施方案中，PEG间隔物插入在GalNAc部分和赖氨酸接头(例如Conl1a和Conj2a)之间。在另一个实施方案中，生理学上不稳定的核苷酸接头可以插入在C6接头和寡聚体之间。

肽接头

在某些实施方案中，所述可生物切割的接头(区域B)是肽，诸如三赖氨酸肽接头，其可以用在聚GalNAc缀合物(诸如三聚体GalNAc缀合物)中。

可以使用的本领域已知的其它接头包括二硫化物接头。

磷酸核苷酸接头

在某些实施方案中，区域B包含1-6个核苷酸，其共价连接至第一个区域的5’或3’核苷酸，诸如经由核苷间键基团诸如磷酸二酯键，其中

a.在第一个和第二个区域之间的核苷间键是磷酸二酯键，且与第一个区域[诸如直接]邻近的第二个区域的核苷是DNA或RNA；和/或

b.所述第二个区域的至少1个核苷是磷酸二酯连接的DNA或RNA核苷；

在某些实施方案中，区域A和区域B形成13-16个核苷酸长度的单个连续核苷酸序列。

在某些方面，在第一个和第二个区域之间的核苷间键可以视作第二个区域的组成部分。

在某些实施方案中，在第二个和第三个区域之间存在含磷的连接基团。所述磷连接基团可以例如是磷酸酯(磷酸二酯)、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或硼代磷酸酯基团。在某些实施方案中，该含磷的连接基团位于第二个区域和连接至第三个区域的接头区域之间。在某些实施方案中，所述磷酸酯基团是磷酸二酯。

因此，在某些方面，所述寡聚体化合物包含至少两个磷酸二酯基，其中至少一个是根据以上发明陈述，且另一个位于第二个和第三个(缀合物)区域之间，任选地在连接基团和第二个区域之间。

反义寡核苷酸可以是或可以构成第一个区域和任选的第二个区域。在这方面，在某些实施方案中，区域B可以形成与(核酸)靶标互补的连续核苷碱基序列的组成部分。在其它实施方案中，区域B可以缺乏与靶标的互补性。

在某些实施方案中，第二个区域的至少两个连续核苷是DNA核苷(诸如至少3或4或5个连续DNA核苷酸)。

在这样的一个实施方案中，可以根据下式描述本发明的寡核苷酸：

5’-A-PO-B[Y)X-3’或3’-A-PO-B[Y)X-5’

其中A是区域A，PO是磷酸二酯键，B是区域B，Y是任选的连接基团，且X是缀合物、靶向基团、阻断基团或反应基团或活化基团。

在某些实施方案中，区域B包含，3’-5’或5’-3’:i)与区域A的5’核苷的磷酸二酯键，ii)DNA或RNA核苷，诸如DNA核苷，和iii)另一个磷酸二酯键

5’-A-PO-B-PO-3’或3’-A-PO-B-PO-5’

其它磷酸二酯键将区域B核苷与一个或多个其它核苷(诸如一个或多个DNA或RNA核苷)连接，或可以任选地经由连接基团(Y)连接至X(是缀合物、靶向基团或阻断基团、或反应基团或活化基团)。

在某些实施方案中，区域B包含，3’-5’或5’-3’:i)与区域A的5’核苷的磷酸二酯键，ii)2–10个DNA或RNA磷酸二酯连接的核苷，诸如DNA核苷，和任选地iii)另一个磷酸二酯键：

5’-A-[PO-B]n-[Y]-X 3’或3’-A-[PO-B]n-[Y]-X 5’

5’-A-[PO-B]n-PO-[Y]-X 3’或3’-A-[PO-B]n-PO-[Y]-X 5’

其中A代表区域A，[PO-B]n代表区域B，其中n是1-10，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，PO是在区域B和X(或Y，如果存在的话)之间的任选的磷酸二酯键基团。

在某些实施方案中，本发明提供了根据(或包含)下式之一的化合物：

5’[区域A]-PO-[区域B]3’-Y–X

5’[区域A]-PO-[区域B]-PO 3’-Y–X

5’[区域A]-PO-[区域B]3’-X

5’[区域A]-PO-[区域B]-PO 3’-X

3’[区域A]-PO-[区域B]5’-Y–X

3’[区域A]-PO-[区域B]-PO 5’-Y–X

3’[区域A]-PO-[区域B]5’-X

3’[区域A]-PO-[区域B]-PO 5’-X

区域B可以例如包含或由以下组成：

5’DNA3’

3’DNA 5’

5’DNA-PO-DNA-3’

3’DNA-PO-DNA-5’

5’DNA-PO-DNA-PO-DNA 3’

3’DNA-PO-DNA-PO-DNA 5’

5’DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA 3’

3’DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA 5’

5’DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA 3’

3’DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA 5’

应当认识到，磷酸酯连接的可生物切割的接头可以采用除了DNA和RNA以外的核苷。例如，使用实施例7中的测定，可以鉴别可生物切割的核苷酸接头。

在某些实施方案中，本发明的化合物包含可生物切割的接头(也被称作生理学上不稳定的接头、核酸酶敏感的生理学上不稳定的键或核酸酶敏感的接头)，例如磷酸核苷酸接头(诸如区域B)或肽接头，其将寡聚体(或连续核苷酸序列或区域A)连接至缀合物部分(或区域C)。

在实施例7所示的测定中对切割的敏感性可以用于确定接头是否是可生物切割的或生理学上不稳定的。

根据本发明的可生物切割的接头表示在靶组织(例如肝脏和/或肾脏)中对切割敏感的接头(即生理学上不稳定的)。优选的是，在靶组织中看到的切割速率大于在血清中发现的结果。用于确定在组织(例如肝或肾)中和在血清中的切割水平(％)的合适方法参见实施例6。在某些实施方案中，在实施例7的肝或肾匀浆物测定中，在本发明的化合物中的可生物切割的接头(也被称作生理学上不稳定的接头或核酸酶敏感的接头)诸如区域B被切割了至少约20％，诸如被切割了至少约30％，诸如被切割了至少约40％，诸如被切割了至少约50％，诸如被切割了至少约60％，诸如被切割了至少约70％，诸如被切割了至少约75％。在某些实施方案中，如在实施例7的测定中使用的，在血清中的切割(％)小于约30％，小于约20％，诸如小于约10％，诸如小于5％，诸如小于约1％。

在某些可能相同或不同的实施方案中，在本发明的化合物中的可生物切割的接头(也被称作生理学上不稳定的接头或核酸酶敏感的接头)诸如区域B对S1核酸酶切割敏感。使用在实施例7中所示的S1核酸酶测定，可以评价对S1切割的敏感性。在某些实施方案中，根据实施例6中使用的测定，与S1核酸酶一起温育120min以后，在本发明的化合物中的可生物切割的接头(也被称作生理学上不稳定的接头或核酸酶敏感的接头)诸如区域B被切割了至少约30％，诸如被切割了至少约40％，诸如被切割了至少约50％，诸如被切割了至少约60％，诸如被切割了至少约70％，诸如被切割了至少约80％，诸如被切割了至少约90％，诸如被切割了至少95％。

第二个区域中的序列选择：

在某些实施方案中，当将寡核苷酸区域A和B与互补靶序列比对时，区域B不形成互补序列。

在某些实施方案中，当将寡核苷酸区域A和B与互补靶序列比对时，区域B形成互补序列。在这方面，区域A和B一起可以形成与靶序列互补的单个连续序列。

在某些实施方案中，基于存在于靶组织或细胞或亚细胞隔室中的优势内切核酸酶切割酶，选择在区域B中的碱基的序列以提供最佳内切核酸酶切割位点。在这方面，通过从靶组织和非靶组织分离细胞提取物，可以基于相对于非靶细胞(例如肾脏)在期望的靶细胞(例如肝脏/肝细胞)中的优先切割活性来选择用在区域B中的内切核酸酶切割序列。在这方面，可以针对期望的组织/细胞优化用于靶标下调的化合物的效能。

在某些实施方案中，区域B包含序列AA、AT、AC、AG、TA、TT、TC、TG、CA、CT、CC、CG、GA、GT、GC或GG的二核苷酸，其中C可以是5-甲基胞嘧啶，和/或T可以用U替代。在某些实施方案中，区域B包含序列AAA、AAT、AAC、AAG、ATA、ATT、ATC、ATG、ACA、ACT、ACC、ACG、AGA、AGT、AGC、AGG、TAA、TAT、TAC、TAG、TTA、TTT、TTC、TAG、TCA、TCT、TCC、TCG、TGA、TGT、TGC、TGG、CAA、CAT、CAC、CAG、CTA、CTG、CTC、CTT、CCA、CCT、CCC、CCG、CGA、CGT、CGC、CGG、GAA、GAT、GAC、CAG、GTA、GTT、GTC、GTG、GCA、GCT、GCC、GCG、GGA、GGT、GGC和GGG的三核苷酸，其中C可以是5-甲基胞嘧啶，和/或T可以用U替代。在某些实施方案中，区域B包含序列AAAX、AATX、AACX、AAGX、ATAX、ATTX、ATCX、ATGX、ACAX、ACTX、ACCX、ACGX、AGAX、AGTX、AGCX、AGGX、TAAX、TATX、TACX、TAGX、TTAX、TTTX、TTCX、TAGX、TCAX、TCTX、TCCX、TCGX、TGAX、TGTX、TGCX、TGGX、CAAX、CATX、CACX、CAGX、CTAX、CTGX、CTCX、CTTX、CCAX、CCTX、CCCX、CCGX、CGAX、CGTX、CGCX、CGGX、GAAX、GATX、GACX、CAGX、GTAX、GTTX、GTCX、GTGX、GCAX、GCTX、GCCX、GCGX、GGAX、GGTX、GGCX和GGGX的三核苷酸，其中X可以选自A、T、U、G、C和其类似物，其中C可以是5-甲基胞嘧啶，和/或T可以用U替代。应当认识到，当提及(天然存在的)核苷碱基A、T、U、G、C时，这些可以用充当等同的天然核苷碱基的核苷碱基类似物替换(例如含有互补核苷的碱基对)。

氨基烷基中间体

本发明还提供了包含反义LNA寡聚体(SEQ ID NO 2)的LNA寡聚体中间体，所述反义LNA寡聚体包含(例如末端,5’或3’)氨基烷基，诸如C2-C36氨基烷基，包括，例如C6和C12氨基烷基。所述氨基烷基可以添加至LNA寡聚体作为标准寡核苷酸合成的组成部分，例如使用(例如受保护的)氨基亚磷酸氨基烷基酯。在氨基烷基和LNA寡聚体之间的连接基团可以例如是硫代磷酸酯或磷酸二酯，或例如在本文中提及的其它核苷键基团之一。所述氨基烷基可以共价连接至，例如，LNA寡聚体的5’或3’，诸如通过核苷键基团，诸如硫代磷酸酯或磷酸二酯键。

本发明还提供了LNA寡聚体的合成方法，其包括LNA寡聚体的连续合成，诸如固相寡核苷酸合成，所述方法包括下述步骤：将氨基烷基添加至寡聚体，例如在寡核苷酸合成的第一个或最后一个循环中。所述合成方法还可以包含使缀合物与氨基烷基-LNA寡聚体反应的步骤(缀合步骤)。所述缀合物可以包含合适的接头和/或分支点基团和任选的如本文中所述的其它缀合物基团，诸如疏水或亲脂基团。可以在寡聚体与固体支持物结合的同时(例如在寡核苷酸合成以后，但是在从固体支持物洗脱寡聚体之前)或随后(即洗脱以后)执行所述缀合步骤。本发明提供了氨基烷基接头在合成本发明的寡聚体中的用途。

制备/合成的方法

本发明提供了合成(或制备)本发明的寡核苷酸缀合物的方法，所述方法包括：

a)提供固相寡核苷酸合成支持物的步骤，以下之一将第三个区域连接至所述支持物：

i)连接基团(-Y-)

ii)选自缀合物、靶向基团、阻断基团、反应基团(例如胺或醇)或活化基团的基团(X-)

iii)-Y-X基团

和

b)区域B、随后区域A的连续寡核苷酸合成的步骤，

和/或：

c)第一个区域(A)和第二个区域(B)的连续寡核苷酸合成的步骤，其中所述合成步骤之后是

d)添加第三个区域[包含以下基团的氨基亚磷酸酯]的步骤

i)连接基团(-Y-)

ii)选自缀合物、靶向基团、阻断基团、反应基团[例如胺或醇]或活化基团的基团(X-)

iii)-Y-X基团

随后

e)从固相支持物切割寡聚体化合物

其中，任选地所述方法进一步包括选自以下的另一个步骤：

f)其中所述第三个基团是活化基团，活化所述活化基团以产生反应基团、随后任选地经由连接基团(Y)向所述反应基团添加缀合物、阻断基团或靶向基团的步骤；

g)其中所述第三个区域是反应基团，任选地经由连接基团(Y)向所述反应基团添加缀合物、阻断基团或靶向基团的步骤。

h)其中所述第三个区域是连接基团(Y)，向所述连接基团(Y)添加缀合物、阻断基团或靶向基团的步骤。

其中在从寡核苷酸合成支持物切割寡聚体化合物之前或之后执行步骤f)、g)或h)。在某些实施方案中，可以使用标准的氨基亚磷酸酯化学法执行所述方法，且这样可以在掺入寡聚体中之前提供区域X和/或区域X或区域X和Y，如氨基亚磷酸酯。请参见图5–10，它们解释了生产本发明的寡核苷酸缀合物的方法的非限制性方面。

本发明提供了合成(或制备)本发明的寡核苷酸缀合物的方法，所述方法包括寡聚体的连续寡核苷酸合成的步骤，所述寡聚体含有具有SEQ ID NO 2的寡核苷酸基序的寡聚体(区域(A))和任选的第二个区域(B)，其中所述合成步骤之后是添加包含N-乙酰基半乳糖胺部分或甾醇部分的缀合物部分氨基亚磷酸酯、随后从固相支持物切割寡聚体化合物的步骤。所述N-乙酰基半乳糖胺部分或甾醇部分可以选自在对应的部分中描述的那些。在一个优选的实施方案中，所述N-乙酰基半乳糖胺部分选自Conj1a或Conj2a。

但是认识到，包含N-乙酰基半乳糖胺部分或甾醇部分的缀合物部分氨基亚磷酸酯可以在从固体支持物切割以后添加。可替换地，所述合成方法可以包括合成具有SEQ ID NO2的寡核苷酸基序的寡聚体(区域(A))和任选的第二个区域(B)、随后从支持物切割寡聚体的步骤，以及向所述寡聚体添加包含N-乙酰基半乳糖胺部分或甾醇部分的缀合物部分的后续步骤。可以如下实现第三个区域的添加：例如，通过在寡聚体合成(在支持物上)的最终步骤中添加氨基氨基亚磷酸酯单元，其在从支持物切割以后可以用于将包含N-乙酰基半乳糖胺部分或甾醇部分的缀合物部分连接至寡聚体。在其中可切割的接头不是核苷酸区域的实施方案中，区域B可以是非核苷酸的可切割的接头例如肽接头，其可以形成缀合物部分(也被称作区域C)的组成部分或是区域Y(或其组成部分)。

在所述方法的某些实施方案中，缀合物部分(例如GalNAc缀合物)包含活化基团(活化的官能团)，且在所述合成方法中，将活化的缀合物添加至寡聚体，诸如氨基连接的寡聚体。可以通过标准氨基亚磷酸酯化学法将氨基添加至寡聚体，例如作为寡聚体合成的最终步骤(其通常将在寡聚体的5’末端处产生氨基)。例如在寡核苷酸合成的最后一步中，使用受保护的氨基-烷基氨基亚磷酸酯，例如TFA-氨基C6氨基亚磷酸酯(6-(三氟乙酰基氨基)-己基-(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)-氨基亚磷酸酯)。

缀合物部分(例如GalNac缀合物)可以通过NHS酯方法活化，并然后添加氨基连接的寡聚体。例如可以使用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)作为缀合物部分(诸如GalNAc)的活化基团。

本发明提供了通过本发明的方法制备的寡核苷酸缀合物。

在某些实施方案中，包含甾醇部分的缀合物部分可以经由磷酸核苷键(诸如本文描述的那些，包括磷酸二酯或硫代磷酸酯)或经由替代基团(诸如三唑基团)共价地结合(连接)至区域B。

在某些实施方案中，在第一个和第二个区域之间的核苷间键是与第二个区域的第一个(或唯一的)DNA或RNA核苷连接的磷酸二酯，或区域B包含至少一个磷酸二酯连接的DNA或RNA核苷。

在某些实施方案中，第二个区域可以包含其它DNA或RNA核苷，所述核苷可以是磷酸二酯连接的。第二个区域进一步共价连接至第三个区域，所述第三个区域可以是例如缀合物、靶向基团、反应基团和/或阻断基团。

在某些方面，本发明是基于不稳定的区域(即第二个区域)的提供，所述不稳定的区域连接第一个区域(例如反义寡核苷酸)和缀合物部分。所述不稳定的区域包含至少一个磷酸二酯连接的核苷，诸如DNA或RNA核苷，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个磷酸二酯连接的核苷，诸如DNA或RNA。在某些实施方案中，所述寡聚体化合物包含可切割的(不稳定的)接头。在这方面，所述可切割的接头优选地存在于区域B中(或在某些实施方案中，在区域A和B之间)。

换而言之，在某些实施方案中，本发明提供了一种非磷酸二酯连接的(诸如硫代磷酸酯连接的)寡核苷酸(例如反义寡核苷酸)，所述寡核苷酸具有至少一个经由磷酸二酯键与所述寡核苷酸的邻近核苷连接的末端(5’和/或3’)DNA或RNA核苷，其中所述末端DNA或RNA核苷进一步任选地经由接头部分共价连接至缀合物部分、靶向部分或阻断部分。

组合物

所述寡聚体，尤其是本发明的寡核苷酸缀合物，可以用在药物制剂和组合物中。适当地，这样的组合物包含药学上可接受的稀释剂、载体、盐或辅剂。WO2007/031091提供了合适的和优选的药学上可接受的稀释剂、载体和辅剂，它们特此通过引用并入。合适的剂量、制剂、施用途径、组合物、剂型、与其它治疗剂的组合、前药制剂也提供在WO2007/031091中，它们也特此通过引用并入。

本发明的反义寡核苷酸缀合物可以与药学上可接受的有活性的或惰性的物质混合用于制备药物组合物或制剂。组合物和用于配制药物组合物的方法取决于许多标准，包括、但不限于，施用途径、疾病的程度或要施用的剂量。

通过将反义寡核苷酸缀合物化合物与合适的药学上可接受的稀释剂或载体组合，可以将反义寡核苷酸缀合物用在药物组合物中。药学上可接受的稀释剂包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)。PBS是适合用在要胃肠外地递送的组合物中的稀释剂。

包含反义寡核苷酸缀合物化合物的药物组合物包括任何药学上可接受的盐、酯、或这样的酯的盐，其在施用给动物(包括人)以后能够(直接地或间接地)提供其生物活性的代谢物或残余物。因此，例如，本公开内容也涉及反义寡核苷酸缀合物化合物的药学上可接受的盐、前药、这样的前药的药学上可接受的盐和其它生物等同物。合适的药学上可接受的盐包括、但不限于钠和钾盐。在某些实施方案中，本发明的寡聚体是前药，其中一旦所述前药递送至作用部位、尤其是肝细胞，缀合物部分就从寡核苷酸切掉。

在一个优选的实施方案中通过非肠道途径施用本发明的药物组合物，所述非肠道途径包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉内注射或输注；或颅内(例如鞘内或心室内)施用。在一个实施方案中，静脉内地施用所述有活性的寡聚体或寡核苷酸缀合物，如果缀合物部分是甾醇，这是特别有关的。在另一个实施方案中，皮下地施用所述有活性的寡聚体或寡核苷酸缀合物，如果缀合物部分是N-乙酰基半乳糖胺部分，这是特别有关的。

应用

所述寡聚体，尤其是本发明的寡核苷酸缀合物可以用作研究试剂，用于例如诊断、治疗和预防。

在研究中，这样的寡聚体或寡核苷酸缀合物可以用于特异性地抑制细胞和实验动物中的ApoB蛋白的合成(通常通过降解或抑制mRNA和由此阻止蛋白形成)，由此促进靶标的功能分析或它作为治疗干预的靶标的有用性的评估。

在诊断中，所述寡聚体可以用于通过RNA印迹法、原位杂交或类似的技术检测和量化细胞和组织中的APOB表达。

就治疗而言，通过施用根据本发明的寡聚体化合物、尤其是寡核苷酸缀合物，治疗可以通过调节APOB的表达来治疗的疑似具有疾病或病症的动物或人。还提供了通过施用治疗或预防有效量的一种或多种本发明的寡聚体或寡核苷酸缀合物或组合物来治疗疑似具有或易感与APOB表达有关的疾病或病症的哺乳动物(诸如治疗人)的方法。通常以有效量施用根据本发明的寡聚体、缀合物或药物组合物。

在一个优选的实施方案中，使用2.0-2.5mg/kg之间的剂量，更优选地以1.5至2.0mg/kg之间的剂量，更优选地以1.0至1.5mg/kg之间的剂量，甚至更优选地以0.5至1.0mg/kg之间的剂量，和最优选的以0.1至0.5mg/kg之间的剂量，以有效量施用本发明的寡核苷酸缀合物。

在一个优选的实施方案中，与治疗之前的ApoB血清水平相比，有效量的本发明的寡核苷酸缀合物会降低动物或人中的血清ApoB水平。

本发明还提供了关于药物制备所述的本发明的化合物或缀合物用于治疗本文提及的病症的用途，或用于本文提及的病症的治疗方法的用途。

本发明还提供了用于治疗本文提及的病症的方法，所述方法包括给有此需要的患者施用如本文所述的根据本发明的化合物和/或根据本发明的缀合物和/或根据本发明的药物组合物。

医学适应症

根据本发明的寡聚体、尤其是寡核苷酸缀合物和其它组合物可以用于治疗与ApoB的突变形式的过表达或表达有关的病症。

本发明还提供了本发明的化合物在药物制备中的用途，所述药物用于治疗本文提及的疾病、病症或病症。

一般而言，本发明的一个方面涉及治疗遭受或易感与异常的APOB水平和/或活性有关的病症的哺乳动物的方法，所述方法包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的靶向APOB的寡聚体或寡核苷酸缀合物。优选地，所述寡聚体包含一个或多个LNA单元。通常以有效量施用根据本发明的寡聚体、寡核苷酸缀合物或药物组合物。

在某些实施方案中，本文提及的疾病或病症可能与APOB基因或特定基因中的突变有关，所述特定基因的蛋白产物与APOB有关或相互作用。因此，在某些实施方案中，所述靶mRNA是APOB序列的突变形式。

本发明的一个有趣的方面涉及如本文中定义的寡聚体(化合物)或如本文中定义的缀合物用于药物制备的用途，所述药物用于治疗本文提及的疾病、病症或病症。

本发明的方法优选地用于治疗或预防由异常的ApoB水平和/或活性造成的疾病。

换而言之，在某些实施方案中，本发明此外涉及用于治疗异常的ApoB水平和/或活性的方法，所述方法包括给有此需要的患者施用本发明的寡聚体、或本发明的缀合物或本发明的药物组合物。

本发明也涉及用作药物的如本文中定义的寡聚体、组合物或缀合物。

本发明还涉及如本文中定义的化合物、组合物或缀合物用于药物制备的用途，所述药物用于治疗异常的ApoB水平和/或活性或APOB的突变形式(诸如等位基因变体，诸如与本文中提及的疾病之一有关的那些)的表达。

此外，本发明涉及治疗遭受疾病或病症(诸如本文中提及的那些)的受试者的方法。

需要治疗的患者是遭受或可能遭受疾病或病症的患者。

在某些实施方案中，本文中使用的术语’治疗’表示现有疾病(例如本文中提及的疾病或病症)的治疗，或疾病的阻止，即预防。因此认识到，本文提及的治疗在某些实施方案中可能是预防性的。

在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗高胆固醇血症和有关病症的化合物或包含化合物的组合物，或使用这样的用于治疗高胆固醇血症和有关病症的化合物或组合物的治疗方法，其中当提及高胆固醇血症时，术语“有关病症”表示选自以下的病症中的一种或多种：动脉粥样硬化、高脂血症、高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症(例如APOB中的功能突变的获得)、HDL/LDL胆固醇失衡、血脂异常(例如，家族性高脂血症(FCHL)、获得性高脂血症、耐他汀类的高胆固醇血症)、冠状动脉疾病(CAD)和冠心病(CHD)。

联合治疗

在某些实施方案中，本发明的化合物与另一种治疗剂一起用在联合治疗中。例如HMG CoA还原酶的抑制剂(诸如他汀类药物)例如被广泛地用于治疗代谢疾病(参见WO2009/043354，特此通过引用并入，作为联合治疗的例子)。联合治疗可以是其它降低胆固醇的化合物，诸如可以选自这样的化合物，所述化合物选自：胆汁盐螯合树脂(例如，考来烯胺、考来替泊和盐酸考来维仑)、HMGCoA-还原酶抑制剂(例如，洛伐他汀、西立伐他汀、普伐他汀、阿托伐他汀、辛伐他汀和氟伐他汀)、烟酸、贝酸衍生物(例如，氯贝丁酯、吉非贝齐、非诺贝特、苯扎贝特和环丙贝特)、普罗布考、新霉素、右甲状腺素、植物-植物甾醇酯、胆固醇吸收抑制剂(例如，依折麦布)、英普他派、胆汁酸转运蛋白(顶端钠依赖性的胆汁酸转运蛋白)的抑制剂、肝调节剂CYP7a、雌激素替代治疗剂(例如，他莫昔芬)和抗炎药(例如，糖皮质激素)。与他汀类药物的组合可能是特别优选的。

本发明的具体实施方案

1.一种反义寡核苷酸缀合物，其包含与缀合物部分(区域C)连接的具有SEQ ID NO2的寡核苷酸基序的寡聚体，其中所述缀合物部分包含N-乙酰基半乳糖胺部分或甾醇部分。

2.根据实施方案1所述的反义寡核苷酸缀合物，其中所述寡聚体包含至少2个增强亲和力的核苷酸类似物。

3.根据实施方案2所述的寡核苷酸缀合物，其中所述核苷酸类似物是糖修饰的核苷酸，诸如独立地或依赖性地选自以下的糖修饰的核苷酸：锁定核酸(LNA)单元；2’-O-烷基-RNA单元、2’-OMe-RNA单元、2’-氨基-DNA单元和2’-氟-DNA单元。

4.根据实施方案1-3中的任一项所述的反义寡核苷酸缀合物，其中所述寡聚体是含有LNA的寡聚体。

5.根据实施方案3或4所述的反义寡核苷酸缀合物，其中所述LNA单元选自：β-D-X-LNA或α-L-X-LNA(其中X是氧基、氨基或硫代)、ENA、cET、cMOE和5’-Me-LNA。

6.根据实施方案5所述的反义寡核苷酸缀合物，其中所述LNA是β-D-氧基-LNA。

7.根据实施方案1-6中的任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中所述寡聚体是间隔体。

8.根据实施方案7所述的寡核苷酸缀合物，其中所述间隔体包含在6-10个核苷酸的间隙的每一侧(5’和3’)上的1-3个核苷酸类似物的翼。

9.根据实施方案7或8所述的寡核苷酸缀合物，其中所述间隔体设计选自2-8-2、2-7-3、3-7-2和3-6-3。

10.根据实施方案1-9中的任一项所述的反义寡核苷酸缀合物，其中所述寡聚体包含一个或多个选自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和硼代磷酸酯的核苷键。

11.根据实施方案1-10中的任一项所述的反义寡核苷酸缀合物，其中所述寡聚体包含硫代磷酸酯核苷键或由硫代磷酸酯核苷键组成。

12.根据实施方案1-11中的任一项所述的反义寡核苷酸缀合物，其中所述寡聚体对应于SEQ ID NO 27:5’G_sT_st_sg_sa_sc_sa_sc_st_sg_sT_sC 3’，其中大写字母代表β-D-氧基LNA，小写字母代表DNA核苷，LNA胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶，且所有核苷间键是用s指示的硫代磷酸酯。

13.根据实施方案1-12中的任一项所述的反义寡核苷酸缀合物，其中所述寡聚体能够下调正在表达ApoB的细胞中的ApoB表达。

14.根据实施方案13所述的反义寡核苷酸缀合物，其中所述ApoB下调是在动物或人中。

15.根据实施方案1-14中的任一项所述的反义寡核苷酸缀合物，其中所述缀合物部分包含选自胆固醇或生育酚的甾醇，诸如作为Conj 5a和Conj 6a显示的那些。

16.根据实施方案1-15中的任一项所述的反义寡核苷酸缀合物，其中所述缀合物部分经由可切割的接头(B)连接至所述寡聚体。

17.根据实施方案16所述的反义寡核苷酸缀合物，其中所述可切割的接头包含选自肽接头、多肽接头、赖氨酸接头或生理学上不稳定的核苷酸接头的部分。

18.根据实施方案16或17所述的反义寡核苷酸缀合物，其中所述可生物切割的接头包含生理学上不稳定的核苷酸接头。

19.根据实施方案17或18所述的反义寡核苷酸缀合物，其中所述生理学上不稳定的核苷酸接头是包含一个或多个邻近DNA磷酸二酯核苷酸诸如1、2、3、4、5或6个DNA磷酸二酯核苷酸的磷酸二酯核苷酸键，所述DNA磷酸二酯核苷酸与所述寡聚体的连续序列的5’或3’末端邻接且可以与或不与ApoB靶序列形成互补的碱基配对。

20.根据实施方案19所述的反义寡核苷酸缀合物，其中所述磷酸二酯核苷酸键(或可生物切割的接头)包含1、2或3个DNA磷酸二酯核苷酸，诸如两个DNA磷酸二酯核苷酸，诸如5’CA3’二核苷酸。

21.根据实施方案16或17所述的反义寡核苷酸缀合物，其中所述可生物切割的接头包含可切割的赖氨酸接头，诸如二-赖氨酸。

22.根据实施方案1-14或16-21中的任一项所述的反义寡核苷酸缀合物，其中所述缀合物部分包含一个或多个N-乙酰基半乳糖胺部分。

23.根据实施方案1-14或16-21中的任一项所述的反义寡核苷酸缀合物，其中所述缀合物部分包含2或3个N-乙酰基半乳糖胺部分。

24.根据实施方案1-14或16-23中的任一项所述的反义寡核苷酸缀合物，其中所述缀合物部分包含一个三价N-乙酰基半乳糖胺簇。

25.根据上述实施方案中的任一项所述的反义寡核苷酸缀合物，其中所述寡核苷酸缀合物包含将所述缀合物部分共价连接至所述寡聚体的接头Y。

26.根据实施方案25所述的反义寡聚体缀合物，其中所述接头区域Y包含脂肪酸，诸如C6-C12接头，优选C6接头。

27.根据实施方案1-14或16-26中的任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述N-乙酰基半乳糖胺部分包含柔性的亲水间隔物。

28.根据实施方案27所述的反义寡核苷酸，其中所述亲水间隔物是PEG间隔物。

29.根据实施方案1-14或16-28中的任一项所述的反义寡核苷酸缀合物，其中所述缀合物部分包含三个经由PEG间隔物连接至二-赖氨酸的N-乙酰基半乳糖胺部分。

30.根据实施方案1-14中的任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述缀合物包含选自Conj1、Conj2、Conj3、Conj4、Conj1a、Conj2a、Conj3a和Conj4a的缀合物部分。

31.根据实施方案30所述的反义寡核苷酸缀合物，其中所述缀合物部分包含Conj2或Conj2a，最优选Conj2a。

32.根据上述实施方案中的任一项所述的反义寡核苷酸缀合物，其中所述缀合物部分(区域C)不包含药代动力学调节剂诸如长度超过C6的脂肪酸基团。

33.根据实施方案1所述的反义寡聚体，所述反义寡聚体由SEQ ID NO 28或SEQ IDNO 31或SEQ ID NO 29组成。

34.一种药物组合物，其包含根据实施方案1-33中的任一项所述的反义寡核苷酸缀合物和药学上可接受的稀释剂、载体、盐或辅剂。

35.用于降低动物或人中的血清ApoB水平的根据实施方案1-34中的任一项所述的反义寡核苷酸缀合物或药物组合物。

36.用作药物的根据实施方案1-34中的任一项所述的反义寡核苷酸缀合物或药物组合物。

37.用作药物的根据实施方案1-34中的任一项所述的反义寡核苷酸缀合物或药物组合物，所述药物诸如用于治疗急性冠状动脉综合征、或高胆固醇血症或有关病症，诸如选自以下的病症：动脉粥样硬化，高脂血症，高胆固醇血症，HDL/LDL胆固醇失衡，血脂异常，例如，家族性高脂血症(FCHL)，获得性高脂血症，耐他汀类的高胆固醇血症，冠状动脉疾病(CAD)，和冠心病(CHD)。

38.根据实施方案1-34中的任一项所述的反义寡核苷酸缀合物或药物组合物，用于治疗急性冠状动脉综合征、或高胆固醇血症或有关病症，诸如选自以下的病症：动脉粥样硬化，高脂血症，高胆固醇血症，HDL/LDL胆固醇失衡，血脂异常，例如，家族性高脂血症(FCHL)，获得性高脂血症，耐他汀类的高胆固醇血症，冠状动脉疾病(CAD)，和冠心病(CHD)。

39.根据实施方案1-34中的任一项所述的反义寡核苷酸缀合物或药物组合物用于药物制备的用途，所述药物用于治疗急性冠状动脉综合征、或高胆固醇血症或有关病症，诸如选自以下的病症：动脉粥样硬化，高脂血症，高胆固醇血症，HDL/LDL胆固醇失衡，血脂异常，例如，家族性高脂血症(FCHL)，获得性高脂血症，耐他汀类的高胆固醇血症，冠状动脉疾病(CAD)，和冠心病(CHD)。

40.一种治疗急性冠状动脉综合征、或高胆固醇血症或有关病症的方法，所述病症是诸如选自以下的病症：动脉粥样硬化，高脂血症，高胆固醇血症，HDL/LDL胆固醇失衡，血脂异常，例如，家族性高脂血症(FCHL)，获得性高脂血症，耐他汀类的高胆固醇血症，冠状动脉疾病(CAD)，和冠心病(CHD)，所述方法包括给遭受或可能遭受高胆固醇血症或有关病症的患者施用有效量的根据实施方案1-34中的任一项所述的反义寡核苷酸缀合物或药物组合物。

41.一种用于抑制正在表达ApoB的细胞中的ApoB的体内或体外方法，所述方法包括给所述细胞施用根据实施方案1-34中的任一项所述的寡核苷酸缀合物或药物组合物从而抑制所述细胞中的ApoB。

实施例

寡核苷酸ApoB靶向化合物

下表显示了与ApoB基因(NCBI登录号NM_000384和SEQ ID NO:32)互补的寡核苷酸序列基序和在实施例中使用的寡核苷酸设计。

表2:寡核苷酸序列基序

表3:具有胆固醇缀合物的ApoB靶向化合物

在图12B中图示了化合物。

表4:具有FAM标记缀合物的ApoB靶向化合物

在图12C中图示了化合物。

表5:具有不同缀合物和接头的ApoB靶向化合物

在图12D中图示了化合物。

表6:具有不同缀合物和接头的ApoB靶向化合物

在图12E中图示了化合物。

在3-6中，大写字母是LNA核苷(诸如β-D-氧基LNA)，小写字母是DNA核苷。LNA胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。在寡核苷酸(寡物)序列中的核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。

小鼠实验

除非另外指出，小鼠实验可以如下执行：

剂量施用和取样：

使用7-10周龄的C57Bl6-N小鼠，动物是年龄和性别匹配的(雌性用于研究1、2和4，雄性用于研究3)。将化合物静脉内地注射进尾静脉中。对于中间血清取样，通过面静脉的穿刺来收集2-3滴血液，最终的出血取自下腔静脉。将血清收集在含凝胶的血清分离试管(Greiner)中并在分析之前保持冷冻。

根据显示的信息，给C57BL6小鼠静脉内施用单次剂量的在盐水中配制的1mg/kg反义寡聚体(ASO)(或显示的量)或单独的盐水。在例如给药后第4天或第7天(或显示的时间)处死动物，并将肝和肾取样。

RNA分离和mRNA分析：使用Qantigene mRNA定量试剂盒(“bDNA-测定”,Panomics/Affimetrix)，按照生产商的方案，执行得自组织的mRNA分析。对于组织裂解物，将50-80mg组织在1ml含有蛋白水解酶K的裂解缓冲液中通过声处理进行裂解。不经RNA提取，将裂解物直接用于bDNA-测定。从Panomics得到用户定制设计的用于靶标和GAPDH的探针集合。对于分析，将对靶基因得到的发光单元针对持家GAPDH进行标准化。

使用10μl血清，在“Cobas INTEGRA 400plus”临床化学平台(Roche Diagnostics)上执行针对ALT、AST和胆固醇的血清分析。

对于寡核苷酸定量，使荧光标记的PNA探针与组织裂解物中的目标寡核苷酸杂交。将相同的裂解物用于bDNA-测定，只是与准确称重的量的组织一起。使用AEX-HPLC和荧光检测定量异源双链体。

实施例1：化合物的合成

使用氨基亚磷酸酯方案在Oligomaker 48上在尿苷通用支持物上以1μmol规模合成寡核苷酸。在合成结束时，在60℃使用氨水从固体支持物切割寡核苷酸5-16小时。通过反相HPLC(RP-HPLC)或通过固相萃取纯化寡核苷酸，并通过UPLC进行表征，且通过ESI-MS进一步证实分子质量。更多细节参见下面。

寡核苷酸的延伸：

使用0.1M的5’-O-DMT-保护的酰胺化物(amidite)在乙腈中的溶液和DCI(4,5-二氰基咪唑)在乙腈中的溶液(0.25M)作为活化剂，执行β-氰基乙基-氨基亚磷酸酯(DNA-A(Bz)、DNA-G(ibu)、DNA-C(Bz)、DNA-T、LNA-5-甲基-C(Bz)、LNA-A(Bz)、LNA-G(dmf)、LNA-T或C6-S-S接头)的偶联。对于最终的循环，以在DCM中的0.1M使用商购可得的C6-连接的胆固醇氨基亚磷酸酯。使用苍耳烷氢化物(0.01M在9:1的乙腈/吡啶中)进行用于引入硫代磷酸酯键的硫醇化。使用0.02M的碘在7:2:1的THF/吡啶/水中的溶液引入磷酸二酯键。剩余的试剂是通常用于寡核苷酸合成的那些。对于固相合成后缀合，在固相合成的最后一个循环中使用商购可得的C6氨基接头亚磷酰胺，并在去保护和从固体支持物切割以后，分离氨基连接的去保护的寡核苷酸。使用标准的合成方法，通过官能团的活化引入缀合物。

通过RP-HPLC进行纯化：

通过在Phenomenex Jupiter C18 10μ150x10mm柱上的制备型RP-HPLC，纯化粗制的化合物。使用0.1M乙酸铵pH 8和乙腈作为缓冲液，流速为5mL/min。将收集的级分低压冻干以得到纯化的化合物，通常作为白色固体。

缩写：

DCI:4,5-二氰基咪唑

DCM:二氯甲烷

DMF:二甲基甲酰胺

DMT:4,4’-二甲氧基三苯甲基

THF:四氢呋喃

Bz:苯甲酰基

Ibu:异丁酰基

RP-HPLC:反相高效液相色谱法

实施例2.用胆固醇-缀合物在体内敲减ApoB mRNA.

根据下表，给C57BL6/J小鼠注射单次剂量的盐水或1mg/kg未缀合的LNA-反义寡核苷酸(SEQ ID NO 3)或等摩尔量的用不同接头(参见下面表7)与胆固醇缀合的LNA反义寡核苷酸，并在第1-10天处死。将RNA从肝和肾分离，并用ApoB特异性的引物和探针进行qPCR以分析ApoB mRNA敲减。

表7：具有不同缀合物和接头的ApoB靶向化合物

大写字母表示β-D-氧基-LNA单体；小写字母表示DNA单体；下标“s”表示硫代磷酸酯键；上标“m”表示含有5-甲基胞嘧啶碱基的β-D-氧基-LNA单体；上标“o”表示氧基-LNA。

材料和方法：

实验设计:

剂量施用。根据上表给C57BL/6JBom雌性动物(在到达时约20g)静脉内施用10ml/千克体重(根据第0天体重)的在盐水中配制的化合物或单独的盐水。

肝和肾组织的取样。根据上表将动物用70％CO₂-30％O₂麻醉并通过颈椎脱位处死。将大肝叶的一半和一个肾切碎并浸没在RNAlater中。

总RNA分离和第一链合成。根据生产商的说明书，使用Qiagen RNeasy试剂盒(Qiagen目录号74106)，从最大30mg组织提取总RNA，所述组织在有RLT-裂解缓冲液存在下通过珠子研磨匀浆化。根据生产商的说明书，使用得自Ambion的逆转录酶试剂执行第一链合成。

对于每个样品，将0.5μg总RNA用不含RNA酶的H₂O调至(10.8μl)，并与2μl随机十倍体(50μM)和4μl dNTP混合物(2.5mM每种dNTP)混合，并加热至70℃保持3min，此后将样品在冰上快速地冷却。将2μl 10x缓冲液RT、1μl MMLV逆转录酶(100U/μl)和0.25μl RNA酶抑制剂(10U/μl)加给每个样品，随后在42℃温育60min，将酶在95℃热灭活10min，然后将样品冷却至4℃。将cDNA样品1:5稀释，并使用Taqman Fast Universal PCR Master Mix 2x(Applied Biosystems目录号4364103)和Taqman基因表达测定(mApoB,Mn01545150_m1和mGAPDH#4352339E)按照生产商的方案进行RT-QPCR，并在Applied Biosystems RT-qPCR仪器(7500/7900或ViiA7)中以快速模式处理。

结果显示在图11中。

结论：用由2或3个具有磷酸二酯主链的DNA组成的接头(SEQ ID NO 6和7)缀合至ApoB LNA反义寡核苷酸的胆固醇表现出对ApoB的肝特异性抑制的偏好(图11)。总之，与未缀合的化合物(SEQ IDNO 3)相比，以及与具有稳定接头(SEQ ID NO 4)和具有二硫化物接头(SEQ ID NO 5)的胆固醇缀合物相比，具有可切割的接头(SEQ ID NO 6和7)的胆固醇缀合的寡核苷酸会增加在肝组织中的ApoB mRNA敲减的效力和持续时间，并伴有SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 7在肾组织中的更小敲减活性。

实施例3.用不同缀合物在体内沉默ApoB mRNA

为了探究不同的缀合部分和接头对ApoB化合物的活性的影响，使用不可切割的接头或可生物切割的接头(二硫代(SS)或2个具有磷酸二酯主链(PO)的DNA核苷酸)将SEQ IDNO 3缀合至单GalNAc、叶酸、FAM或生育酚。另外，将单GalNAc与GalNAc簇(缀合物2a)进行了对比。关于更多构建体细节，参见表5。用盐水对照或用单次剂量的1或0.25mg/kg的ASO缀合物静脉内地治疗C57BL6In小鼠。7天以后，将动物处死并从肝和肾样品分离RNA和针对ApoBmRNA表达进行分析。

材料和方法：

实验设计:

剂量施用和取样。根据上表给C57BL6小鼠静脉内地施用单次剂量的1mg/kg或0.25mg/kg的在盐水中配制的ASO或单独的盐水。在给药后第7天将动物处死，并将肝和肾取样。进行RNA分离和mRNA分析。从肝和肾样品提取总RNA，并使用分支DNA测定分析ApoB mRNA水平。

结果显示在图15中。

结论：用DNA/PO-接头(SEQ ID NO 26)缀合至ApoB化合物的生育酚与未缀合的ApoB化合物(SEQ ID NO 3)相比会增加肝中的ApoB敲减，同时降低在肾中的活性(对比图15A和B)。这指向生育酚将ApoB化合物从肾重新导向肝的能力。不可切割的(SEQ ID NO 24)和SS-连接的(SEQ ID NO 25)生育酚缀合物在两种组织中是无活性的。具有不可切割的(SEQ ID NO 17)和具有可生物切割的DNA/PO接头(SEQ ID NO 19)的单-GalNAc缀合物表现出维持未缀合的化合物(SEQ ID NO 3)在肾中的活性并同时提高在肝中的活性的趋势。SS-接头的引入降低了在两种组织中的活性(对比图15A和B)。不同的GalNAc缀合物例如单GalNAcPO(SEQ ID NO 19)和GalNAc簇(SEQ ID NO 20)的缀合也允许以肝或肾为焦点细调化合物活性(图15C)。具有可切割的DNA/PO-接头(SEQ ID NO:16和23)的叶酸和FAM缀合物的表现与未缀合的化合物(SEQ ID NO:3)相当。在这里，不可切割的(SEQ ID NO 14和21)或SS-接头(SEQ ID NO 15和22)的引入同样降低了两种组织中的化合物活性(对比图15a和15b)。

实施例4A：未缀合的抗-ApoB LNA化合物在非人灵长类动物中的作用

下述实施例对比了来自两个不同猴研究的数据，其目的是对比未缀合的抗-ApoBLNA化合物相对于彼此的有效性。

以前已经在食蟹猴的多次剂量研究中试验了SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 27。以前已经公开了来自关于SEQ ID NO 3的研究的数据(Straarup等人,Nucleic AcidsResearch,2010,第38卷,第7100-7110页)。

在Bridge Laboratories 32Kexue Yuan Road,Zhongguancun Life SciencePark,Changping District,Beijing 102206,People’s Republic of China执行SEQ ID27的研究。该研究的目的是评价SEQ ID NO 27当施用2周或13周时在雄性和雌性食蟹猴中的毒性，并评估分别在2-和13-周治疗期以后在6-周和8-周观察期中的可逆性、进展和/或潜在迟发效应。在给药第一天时的年龄是2.0-4.0岁，在给药第一天时的重量是2.0-4.0kg。以1、4、8或24mg/kg/注射施用SEQ ID NO 27。在第1、6、11、16、23、30、37、44、51、58、65、72、79和86天注射动物。

在类似的时间点对比在两个研究中得到的对LDL-C降低的影响，如在下表8中所示。

表8

在各个研究中，两种化合物(SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 27)将LDL-C降低至盐水(对照)动物中的LDL-C的60％，但是在非常不同的剂量达到所述效果。当施用给雄性和雌性食蟹猴时，SEQ ID NO 3表现出比SEQ ID NO 27显著更高的效能，因为两剂2mg/kg(总剂量2x2mg/kg)的SEQ ID NO 3对最终的药理学终点(LDL-C的降低)具有与四剂4mg/kg(总剂量4x4mg/kg)的SEQ ID NO 27相同的效果。

实施例4B：非人灵长类动物(NHP)研究

该研究的主要目的是，研究在给食蟹猴单次缓慢静脉内快速推注抗-ApoB LNA缀合的化合物以后7周中的选定脂质标志物，并评估化合物在猴中的潜在毒性。在该研究中使用的化合物是以0.625和2.5mg/ml的初始浓度在无菌盐水(0.9％)中制备的SEQ ID NO 7、20、28和29。

使用至少24个月龄的雌性猴，自由接近自来水，并每只动物每天分配180g OWM(E)SQC SHORT膨化饮食(Dietex France,SDS,Saint Gratien,France)。另外，每天给每只动物提供水果或蔬菜。在开始治疗期之前，使动物适应研究条件至少14天的时段。在该阶段中，执行预治疗研究。给动物静脉内施用1mg/kg的剂量。剂量体积是0.4mL/kg。每组使用两只动物。三周以后，分析数据，并开始使用更高或更低定量施用方案的第二组动物-最初剂量设定是2.5mg/kg，或低于基于第一个数据集的剂量。

在第1天施用剂量制剂1次。在治疗后观察动物7周的时段。第1天对应于治疗期的第一天。在研究之前和过程中记录临床观察结果、体重和食物摄入(每组)。

将血液取样并在下述时间点执行分析:

RCP＝常规临床病理学，LSB＝肝安全性生物化学，PK＝药代动力学，OA＝其它分析，L＝脂质。

血液生物化学：在下面指示的时机，对所有存活动物确定下述参数：

·全生物化学小组(下面的完整列表)–在第-8、15和50天，

·肝安全性(仅ASAT、ALP、ALAT、TBIL和GGT)-在第4、8、22和36天，

·脂质特性(总胆固醇、HDL-C、LDL-C和甘油三酯)和仅Apo-B-在第-1、4、8、22、29、36和43天。

将血液(大约1.0mL)取入肝素锂试管(使用ADVIA 1650血液生物化学分析仪)：Apo-B、钠、钾、氯化物、钙、无机磷、葡萄糖、HDL-C、LDL-C、尿素、肌酸酐、总胆红素(TBIL)、总胆固醇、甘油三酯、碱性磷酸酶(ALP)、丙氨酸氨基转移酶(ALAT)、天冬氨酸氨基转移酶(ASAT)、肌酸激酶、γ-谷氨酰基转移酶(GGT)、乳酸脱氢酶、总蛋白、白蛋白、白蛋白/球蛋白比率。

血液分析:在第-8、-1、4、8、15、22、29、36、43和50天收集用于ApoB分析的血液样品。将血液在冷冻条件(设定成维持+4℃)下在1000g离心10分钟。将血清转移进3个单独试管并在分析之前在-80℃储存。

其它分析:WO2010142805提供了用于下述分析的方法：qPCR、ApoB mRNA分析(特此通过引用并入)。其它分析包括ApoB蛋白ELISA、使用ELISA(Mercodia No.10-1106-01)的血清Lp(a)分析、组织和血清寡核苷酸分析(药物含量)、样品的提取、标准-和QC-样品、通过ELISA确定寡核苷酸含量。

关于SEQ ID NO 27缀合物化合物(SEQ ID NO:28和29)的数据显示在图19中，关于SEQ ID NO 3缀合物(SEQ ID NO 7和20)的数据显示在图20中。值得注意的是，在NHP研究中，SEQ ID NO 3的缀合的化合物(SEQ ID NO 7和20)在使用的剂量没有导致ApoB或LDL胆固醇的显著下降(图20)，尽管母体化合物(SEQ ID NO 3)比在实施例4A中描述的SEQ ID NO27的母体化合物更有效。对于任何靶向ApoB的化合物，没有指示肝毒性或肾毒性。值得注意的是，SEQ ID NO 27-GalNAc化合物(SEQ ID NO 29)提供了快速且非常有效的ApoB和LDL的下调，其在宽广时间段(研究的整个长度)中得到维持。这表明，GalNAc缀合的SEQ ID NO:27化合物(SEQ ID NO:29)在快速最初敲减和长持续时间方面比胆固醇缀合物更有效(图19)，尽管胆固醇缀合的SEQ ID NO:27(SEQ ID NO:28)在2.5mg/kg剂量也具有相当好的作用。这指示，与未缀合的母体化合物和使用替代缀合技术的化合物相比，GalNAc化合物可以较不频繁地和以较低剂量施用。

实施例5：在大鼠中的肝和肾毒性评估

可以针对它们的毒性谱在啮齿类动物中(诸如在小鼠或大鼠中)评价本发明的化合物。作为示例，可以使用下述方案：使用处于大约8周龄的Wistar Han Crl:WI(Han)。在该年龄，雄性重量应当为大约250g。所有动物自由接近SSNIFF R/M-H粒状维持饮食(SSNIFFGmbH,Soest,德国)和装在瓶子中的自来水(经0.22μm过滤器过滤)。使用10和40mg/kg/剂的剂量水平(皮下施用)并在第1和8天施用。在第15天将动物安乐死。在第7和14天收集尿和血液样品。在第14天做出临床病理学评估。在研究之前、施用的第一天和尸检前1周确定体重。每天评估每组的食物消耗。在禁食6小时以后通过尾静脉取血液样品。执行下述血清分析：红细胞计数、平均细胞体积、血细胞压积、血红蛋白、平均细胞血红蛋白浓度、平均细胞血红蛋白、凝血细胞计数、白细胞计数、细胞形态学白细胞分类计数、网织红细胞计数、钠、钾、氯化物、钙、无机磷、葡萄糖、尿素、肌酸酐、总胆红素、总胆固醇、甘油三酯、碱性磷酸酶、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、总蛋白、白蛋白、白蛋白/球蛋白比率。执行尿分析：α-GST、β-2微球蛋白、钙结合蛋白、簇连蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、KIM-1、骨桥蛋白、TIMP-1、VEGF和NGAL。几种分析物(钙结合蛋白、簇连蛋白、GST-α、KIM-1、骨桥蛋白、TIMP-1、VEGF)将在Panel 1(MAP Rat Kidney ToxicityMagnetic Bead Panel 1,RKTX1MAG-37K)下定量。三种分析物(β-2微球蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、脂质运载蛋白-2/NGAL)将在Panel 2(MAP Rat KidneyToxicity Magnetic Bead Panel 2,RKTX2MAG-37K)下定量。用于确定大鼠尿中的这些生物标志物的浓度的测定是基于Luminex技术。将用抗-α-GST/β-2微球蛋白/钙结合蛋白/簇连蛋白/半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/KIM-1/骨桥蛋白/TIMP-1/VEGF/NGAL抗体包被的微球用两种不同的荧光染料进行颜色编码。确定下述参数(使用ADVIA 1650的尿)：尿蛋白、尿肌酸酐。定量参数：体积、pH(使用10-Multistix SG试验条/Clinitek 500尿分析仪)、比重(使用折光计)。半定量参数(使用10-Multistix SG试验条/Clinitek 500尿分析仪)：蛋白、葡萄糖、酮、胆红素、亚硝酸盐、血液、尿胆素原、沉积物的细胞学(通过显微镜检查)。定性参数：外观、颜色。处死以后，确定体重和肾、肝及脾重量，并计算器官与体重的比率。取肾和肝样品，并冷冻或在福尔马林中保存。执行显微分析。

在法国的CiToxLabs执行大鼠安全性研究。选择Male Wistar大鼠(n＝4/组)用于研究，因为在使用的研究方案(剂量范围和时程)中的Wistar Han大鼠以前已经证实会预测在人类中的肾(和在某种程度上肝)毒性。在第1天和第8天给动物皮下注射缀合的LNA化合物(以10mg/kg)或对应的未缀合的“母体化合物”(以40mg/kg)。在第7天和第14天收集尿并在分析之前保持在冰上。将尿样品离心(大约380g,5min,在+4℃)，并用基于Luminex技术的多路测定分析一组尿损伤标志物。在研究KIM-1(肾损伤标志物1)中的该组尿肾损伤标志物表现出最大动态范围和最清楚的信号，如最近在尿肾损伤标志物的后设分析中关于KIM-1已经描述的(Vlasakova等人,Evaluation of the Relative Performanceof Twelve Urinary Biomarkers for Renal Safety across Twenty Two RatSensitivity and Specificity Studies Toxicol.Sci.2013年12月21日)。结果显示在表9中。

表9:Kim标志物结果

	尿Kim 1平均值(2)
		SEQ ID NO 28 10mg/kg x2	13.5
SEQ ID NO 20 10mg/kg x2	103

两种化合物都没有给出大鼠尿中的kim-1的有关水平，但是SEQ ID NO 2胆固醇缀合物(SEQ ID NO 28)给出了比SEQ ID NO 1GalNAc缀合物(SEQ ID NO 20)更低的平均kim-1水平。但是，请注意，与来自表现出明显肾小管毒性的大鼠的尿中的kim-1水平相比，关于SEQ ID NO 28和SEQ ID NO 20的尿kim-1蛋白水平仍然较低，如在相同时间点通过肾组织学分析所证实的。

实施例6：具有FAM标记缀合物的ApoB靶向化合物

用S1核酸酶提取物、肝或肾匀浆物或血清对具有如在表4中所示的不同DNA/PO-接头的FAM-标记的反义寡聚体(ASO)进行体外切割。

S1核酸酶切割：用在核酸酶缓冲液中的S1核酸酶(60U/100μL)对100μM的具有不同DNA/PO-接头的FAM-标记的寡核苷酸进行体外切割20和120分钟(参见下表)。通过将EDTA加入缓冲溶液中，停止酶活性。然后使用Dionex DNApac p-100柱和10mM-1M高氯酸钠(pH7.5)范围内的梯度，对溶液进行在Dionex Ultimate 3000上的AIE HPLC分析。使用荧光检测器在615nm和紫外检测器在260nm，相对于标准品确定切割的和未切割的寡核苷酸的含量。结果显示在表10中。

表10.使用核酸酶切割磷酸二酯键

SEQ ID NO	接头序列	20min S1以后切割的百分比	120min S1以后切割的百分比
				13	--	2	5
11	a	29.1	100
				10	ca	40.8	100
9	tca	74.2	100
				12	gac	22.9	n.d

结论：PO接头(或本文提及的区域B)导致缀合物(或基团C)被切掉，且接头的长度和/或序列组成可以用于调节对区域B的溶核(nucleolytic)切割的敏感性。DNA/PO-接头的序列可以调节切割速率，如在20min以后在核酸酶S1提取物中所看到的。因此，区域B(例如关于DNA/PO-接头)的序列选择也可以用于调节血清中和靶组织细胞中的切割水平。

通过匀浆物和血清实现的切割：将肝和肾匀浆物和血清用寡核苷酸SEQ ID NO 9掺合至200μg/g组织的浓度(参见下表)。将从NMRI小鼠收集的肝和肾样品在匀浆化缓冲液(0,5％Igepal CA-630,25mM Tris pH 8.0,100mM NaCl,pH 8.0(用1N NaOH调节))中匀浆化。将匀浆物在37℃温育24小时，此后将匀浆物用苯酚-氯仿萃取。使用以上HPLC方法相对于标准品确定来自肝和肾和来自血清的萃取物中的切割的和未切割的寡核苷酸的含量。结果显示在表11中。

表11.使用匀浆物切割磷酸二酯键

结论：PO接头(或本文提及的区域B)导致肝或肾匀浆物中缀合物(或基团C)从寡核苷酸的切割，但是在血清中没有。注：在以上测定中的切割表示可切割的接头的切割，寡聚体或区域A应当保持在功能上完整。

实施例7：用GalNAc-缀合物在体内敲减ApoB mRNA、组织含量和血清总胆固醇

表12：化合物

区域A：大写字母是LNA核苷(诸如β-D-氧基LNA)，小写字母是DNA核苷。下标s代表硫代磷酸酯核苷间键。LNA胞嘧啶任选地是5-甲基胞嘧啶。区域B：2PO接头是在序列区域A的5’侧，且包含通过磷酸二酯键连接的在()中指示的两个DNA核苷，在区域B的3’DNA核苷和区域A的5’LNA核苷之间的核苷间键也是磷酸二酯。呈C6接头形式的连接基团(Y)(在表中未显示)已经用于将缀合物基团连接至区域B(SEQ ID NO 7)或连接至区域A(SEQ ID NO 20和30)。

根据下表(实验设计)给C57BL6/J小鼠静脉内或皮下注射单次剂量的盐水或0.25mg/kg的未缀合的LNA-反义寡核苷酸(SEQ ID NO 3)或等摩尔量的缀合至GalNAc1(SEQID NO 30)、GalNAc2(SEQ ID NO 20)或胆固醇(2PO)(SEQ ID NO 7)的LNA反义寡核苷酸，并在第1-7天处死。

从肝和肾分离RNA，并用ApoB特异性的引物和探针进行qPCR以分析ApoB mRNA敲减。使用ELISA方法测量寡核苷酸含量，并测量血清中的总胆固醇。结果显示在图16和17中。

材料和方法：

实验设计:

剂量施用。根据上表给C57BL/6JBom雌性动物(在到达时约20g)静脉内或皮下施用10ml/千克体重(根据第0天体重)的在盐水中配制的化合物或单独的盐水。

肝和肾组织的取样。根据上表将动物用70％CO₂-30％O₂麻醉并通过颈椎脱位处死。将大肝叶的一半和一个肾切碎并浸没在RNAlater中。将肝的另一半和其它肾冷冻并用于组织分析。

对于每个样品，将0.5μg总RNA用不含RNA酶的H₂O调至(10.8μl)，并与2μl随机十倍体(50μM)和4μl dNTP混合物(2.5mM每种dNTP)混合，并加热至70℃保持3min，此后将样品在冰上快速地冷却。将2μl 10x缓冲液RT、1μl MMLV逆转录酶(100U/μl)和0.25μl RNA酶抑制剂(10U/μl)加给每个样品，随后在42℃温育60min，将酶在95℃热灭活10min，然后将样品冷却至4℃。将cDNA样品1:5稀释，并使用Taqman Fast Universal PCR Master Mix 2x(Applied Biosystems目录号4364103)和Taqman基因表达测定(mApoB,Mn01545150_m1和mGAPDH#4352339E)按照生产商的方案进行RT-QPCR，并在Applied Biosystems RT-qPCR仪器(7500/7900或ViiA7)中以快速模式处理。通过夹心ELISA方法测量肝和肾中的寡核苷酸含量。

血清胆固醇分析：在即将处死之前，使用S-monovette Serum-Gel管形瓶(Sarstedt,Nümbrecht,Germany)收集眶后窦血液用于血清制备。根据生产商的说明书，使用ABX Pentra Cholesterol CP(Triolab,Brondby,Denmark)分析血清的总胆固醇。

结论：缀合至ApoB LNA反义寡核苷酸(SEQ ID NO 30和20)的GalNAc1和GalNAc2表现出比未缀合的ApoB LNA更好的ApoB mRNA敲减(图16)。对于GalNAc 1缀合物(SEQ ID NO30)，似乎静脉内给药优于皮下给药，这是惊人的，因为关于另一个GalNAc簇已经报道了相反结论(Alnylam,8th Annual Meeting of the Oligonucleotide TherapeuticsSociety)。总胆固醇(TC)数据表明在静脉内和皮下施用时GalNAc簇缀合物(SEQ ID NO 30和20)给出的效果如何优于未缀合的(SEQ ID NO 3)和胆固醇缀合的化合物(SEQ ID NO 7)(图17,a和b)。寡核苷酸的组织含量(图18,a-f)显示了缀合物如何增强在肝中的摄取，同时给出与母体化合物相比更少的在肾中的摄取。这适用于静脉内和皮下施用。当静脉内给药时，GalNAc 1(SEQ ID NO 30)与GalNAc 2(SEQ ID NO 20)相比给出非常多的肝内摄取，但是由于两种化合物的活性都较好，所以GalNAc 2缀合物似乎诱导比GalNAc1缀合物更高的比活性，从而指示没有药代动力学调节剂的GalNAc缀合物与LNA反义寡核苷酸一起可能是特别有用的。

实施例8.用GalNAc-缀合物在体内敲减ApoB mRNA和血清总胆固醇。

为了探究不同的缀合部分对ApoB化合物的活性的作用的持续时间，将SEQ ID NO27缀合至胆固醇+可生物切割的接头(具有磷酸二酯主链(PO)的两个DNA核苷酸；SEQ ID28)或GalNAc簇(SEQ ID NO 29)。关于更多构建体细节，参见表6。给C57BL6In小鼠分别静脉内注射盐水对照或单次剂量的0、1、0.25或1.0mg/kg的SEQ ID NO 27、SEQ ID NO 28或SEQID NO 29(缀合的剂量与未缀合的SEQ ID NO 27等摩尔)。通过在单次注射各种化合物以后第4、7、10、14和24天分析血浆胆固醇，监测效果。在单次注射以后第4、14和24天处死四只动物的组，并如在实施例7中所示从肝和肾样品分离RNA和分析ApoB mRNA表达。结果显示在表13中。

表13肝ApoB mRNA水平

将数据对GAPDH标准化，并呈现为在相同时间点处死的盐水治疗的动物的百分比。数据是平均值±SD。

在第0、4、7、10、14和24天如在实施例7中所述分析总血清胆固醇。结果显示在图21中。

与未缀合的寡核苷酸相比，具有SEQ ID NO 27的寡核苷酸的胆固醇和GalNAc缀合形式都表现出肝中ApoB mRNA增加的下调。具体地，GalNAc缀合导致与未缀合的寡核苷酸和胆固醇缀合相比改善的效果。对总血清胆固醇水平观察到相同的效果，其中两种缀合物在1.0mg/kg剂量是非常有效的。当减小剂量时，GalNAc缀合物(SEQ ID NO 29)似乎比未缀合的寡核苷酸和胆固醇缀合更有效。

实施例9：非人灵长类动物研究；多次皮下注射.

该非人灵长类动物研究的目的是，评估当通过皮下注射(皮下)施用化合物时，抗-apoB化合物在重复施用场合下的效力和安全性。在该研究中使用的化合物是以0.625和2.5mg/ml的最初浓度在无菌盐水(0.9％)中制备的SEQ ID NO 27、28和29。

使用至少24个月龄的雄性猴，自由接近自来水，并每只动物每天分配180g OWM(E)SQC SHORT膨化饮食(Dietex France,SDS,Saint Gratien,法国)。另外，每天给每只动物提供水果或蔬菜。在开始治疗期之前，使动物适应研究条件至少14天的时段。在该阶段中，执行预治疗研究。给动物每周1次皮下施用0.1mg/kg或0.5mg/kg/注射的剂量持续4周，在4周的时段内共计4次注射，在第1天、第8天、第15天和第22天注射。剂量体积是0.4mL/kg/注射。除了仅含有2只动物的未缀合的寡聚体(SEQ ID NO 27)的组以外，每组使用四只动物。第四次和最终剂量以后，观察动物1周(第29天)，此后将两只动物处死以便研究肝ApoB转录物调节、脂质参数、肝和肾组织学和肝和肾组织分布。将剩余的两只动物跟踪另外7周。第1天对应于治疗期的第一天。在研究之前和过程中记录临床观察结果和体重和食物摄入(每组)。

将血液和组织取样并在下述时间点分析:

RCP：常规临床病理学，LSB：肝安全性生物化学，PK：药代动力学，OA：其它分析，L：脂质

将血液(大约1.0mL)放入肝素锂试管(使用ADVIA 1650血液生物化学分析仪)中分析钠、钾、氯化物、钙、无机磷、葡萄糖、HDL-C、LDL-C、尿素、肌酸酐、总胆红素(TBIL)、总胆固醇、甘油三酯、碱性磷酸酶(ALP)、丙氨酸氨基转移酶(ALAT)、天冬氨酸氨基转移酶(ASAT)、肌酸激酶、γ-谷氨酰基转移酶(GGT)、乳酸脱氢酶、总蛋白、白蛋白、白蛋白/球蛋白比率。

血液分析:在第-8、-1、4、8、15、22、29、36、43和50天仅从组1-16动物(即用抗-ApoB化合物治疗的动物)收集用于ApoB分析的血液样品。从每只动物的适当静脉收集静脉血(大约2mL)到血清分离试管(SST)中，并允许在室温凝结至少60±30分钟。将血液在冷冻条件(设定成维持+4℃)下在1000g离心10分钟。将血清转移进3个单独试管并在通过ELISA分析ApoB蛋白之前在-80℃储存。

在WO2010/142805中描述的其它分析是qPCR、ApoB mRNA分析。其它分析包括，使用ELISA(Mercodia No.10-1106-01)的血清Lp(a)分析，组织和血清寡核苷酸分析(药物含量)，样品的提取，标准-和QC-样品，通过ELISA确定寡核苷酸含量。

关于SEQ ID NO 27、SEQ ID NO 28和SEQ ID NO 29的数据显示在图22中。从该图可以看出，在第二次注射时，两种缀合的寡聚体(SEQ ID NO 28和29)在相同剂量都比未缀合的寡聚体(SEQ ID NO 27)更有效。具体地，SEQ ID NO 27-GalNAc化合物(SEQ ID NO 29)给出快速的、剂量依赖性的且非常有效的血清ApoB和LDL-C的下调。这表明，就像在实施例5中描述的单次剂量实验一样，SEQ ID NO 27的GalNAc缀合比SEQ ID NO 27的胆固醇-缀合更有效，即SEQ ID NO 29的效力优于SEQ ID NO 28的效力。这指示，与未缀合的母体化合物和使用替代缀合技术诸如胆固醇缀合(诸如SEQ ID 28)的化合物相比，GalNAc化合物可以较不频繁地和以较低剂量施用。在第22天在最后一次注射以后，SEQ ID NO 27-GalNAc化合物(SEQ ID NO 29)也表现出非常长的持久效应。甚至在最后一次治疗以后8周，血清中的ApoB和LDL胆固醇水平仍未恢复至治疗之前的基线。对于SEQ ID NO 27-胆固醇化合物(SEQID NO 28)也是如此。这指示这些缀合的化合物的长药效动力学半衰期。

在最后一次注射以后1周，即研究的第29天，分析肝和肾寡核苷酸含量。使用杂交ELISA(基本上如在Lindholm等人,Mol Ther.2012 Feb；20(2):376-81中所述)分析寡核苷酸含量，在已经控制如果将(缀合的)SEQ ID NO 28或SEQ ID NO 29用于制备标准曲线则结果没有变化以后，使用SEQ ID NO 27制备来自用SEQ ID NO 27、SEQ ID 28和SEQ ID NO 29治疗的动物的样品的标准曲线。结果显示在表14中。

表14 最后一次注射以后1周组织中的寡核苷酸含量

如在上表中所示，每周4次皮下注射等摩尔量的各种化合物以后，与未缀合的化合物(SEQ ID NO 27)和胆固醇缀合的化合物(SEQ ID NO 28)两者相比，SEQ ID NO 29(GalNAc缀合)表现出肝/肾分布的强迁移。预期向较高肝/肾比率(具有保持的或提高的效力)的迁移会导致所述化合物的提高的安全性谱，具有寡核苷酸组织含量的较高vs.较低肝/肾比率。

Claims

1.一种反义寡核苷酸缀合物，其包含与缀合物部分(区域C)连接的具有SEQ ID NO 2的寡核苷酸基序的寡聚体，其中所述缀合物部分包含一个或多个N-乙酰基半乳糖胺部分。

2.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸缀合物，其中所述寡聚体包含至少2个选自以下的增强亲和力的核苷酸类似物：锁定核酸(LNA)单元；2’-O-烷基-RNA单元、2’-OMe-RNA单元、2’-氨基-DNA单元和2’-氟-DNA单元。

3.根据权利要求1或2所述的反义寡核苷酸缀合物，其中所述寡聚体对应于SEQ ID NO27:5’GsTstsgsascsascstsgsTsC 3’，其中大写字母代表β-D-氧基LNA，小写字母代表DNA核苷，LNA胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶，且所有核苷间键是由s指示的硫代磷酸酯。

4.根据权利要求1-3中的任一项所述的反义寡核苷酸缀合物，其中所述寡聚体能够下调正在表达ApoB的细胞中的ApoB表达。

5.根据权利要求1-4中的任一项所述的反义寡核苷酸缀合物，其中所述缀合物部分经由可切割的接头(B)连接至所述寡聚体。

6.根据权利要求5所述的反义寡核苷酸缀合物，其中所述可切割的接头包含可切割的赖氨酸接头。

7.根据权利要求1-6中的任一项所述的反义寡核苷酸缀合物，其中所述缀合物部分包含1-3个N-乙酰基半乳糖胺部分。

8.根据前述权利要求中的任一项所述的反义寡核苷酸缀合物，其中所述寡核苷酸缀合物包含将所述缀合物部分共价连接至所述寡聚体的接头Y。

9.根据权利要求8所述的反义寡聚体缀合物，其中所述接头区域Y包含脂肪酸，诸如C6接头。

10.根据权利要求1-9中的任一项所述的反义寡核苷酸，其中缀合物部分包含在所述N-乙酰基半乳糖胺部分和所述接头(B和/或Y)或所述寡聚体之间的PEG间隔物。

11.根据权利要求1-10中的任一项所述的反义寡核苷酸缀合物，其中所述缀合物部分包含三个N-乙酰基半乳糖胺部分，所述三个N-乙酰基半乳糖胺部分各自独立地经由PEG间隔物连接至可切割的二-赖氨酸接头。

12.根据权利要求1-11中的任一项所述的反义寡核苷酸缀合物，其中所述缀合物包含选自Conj1、Conj2、Conj3、Conj4、Conj1a、Conj2a、Conj3a和Conj4a的缀合物部分。

13.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸缀合物，所述反义寡核苷酸缀合物由SEQ IDNO 28或SEQ ID NO 31组成。

14.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-13中的任一项所述的反义寡核苷酸缀合物和药学上可接受的稀释剂、载体、盐或辅剂。

15.用作药物的根据权利要求1-14中的任一项所述的反义寡核苷酸缀合物或药物组合物。

16.用于抑制正在表达ApoB的细胞中的ApoB的体内或体外方法，所述方法包括：将根据权利要求1-14中的任一项所述的寡核苷酸缀合物或药物组合物施用给所述细胞从而抑制所述细胞中的ApoB。