CN102802637A - 新的有力的抗apob反义化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及寡聚体化合物(寡聚体)，其靶向细胞中的APO-B100mRNA，导致APO-B100的减少的表达。APO-B100表达的减少有益于治疗某些医疗病症，诸如与载脂蛋白B活性关联的疾病，诸如在非限制性例中，不同类型的HDL/LDL胆甾醇不平衡；血脂异常，例如，家族性混合性高脂血症(FCHL)，获得性高脂血症，高胆固醇血症，耐抑制素的高胆固醇血症；冠状动脉疾病(CAD)，冠状心脏病(CHD)，动脉粥样硬化。

Description

新的有力的抗APOB反义化合物
【技术领域】
本发明涉及寡聚体化合物(寡聚体)，其靶向细胞中的APO-B100mRNA，导致APO-B100的减少的表达。APO-B100表达的减少有益于一系列医疗病症，诸如与载脂蛋白B活性关联的疾病，诸如在非限制性例中，不同类型的HDL/LDL胆甾醇不平衡；血脂异常，例如，家族性混合性高脂血症(FCHL)，获得性高脂血症，高胆固醇血症，耐抑制素的高胆固醇血症；冠状动脉疾病(CAD)，冠状心脏病(CHD)，动脉粥样硬化。
【相关申请】
将以下相关申请WO2007/031081和WO2008/113830通过引用整体并入本文。
【背景技术】
见WO2007/031081和WO2008/113830的背景部分，其通过引用并入本文。
仍有对另外的安全和非-毒性且能有效拮抗载脂蛋白B功能及因而降低血浆Lp(a)水平的制剂的需求。
本发明提供有效和安全的锁核酸(LNA)寡聚体化合物和它们在用于调节载脂蛋白B表达的方法中的用途，ApoB-100，包括抑制载脂蛋白B，ApoB-48的替代性的亚型。
【发明概述】
本发明提供长度在10～50个之间，诸如10～30个核苷酸的寡聚体，其包含总共10～30个核苷酸之间的连续的核苷酸序列，其中所述连续的核苷酸序列至少80％(例如，85％，90％，95％，98％或99％)同源于对应于哺乳动物APO-B100基因或mRNA，诸如人(genbank登录No：NM_000384或genbank登录No：NG_011793)的反向互补体或其天然存在的变体的区。由此，例如，寡聚体与具有APOB-100mRNA或APOB-100基因序列的部分序列的单链核酸分子杂交。
本发明提供缀合物，其包含本发明的寡聚体，及共价附接于所述寡聚体的至少一个非-核苷酸或非-多核苷酸部分。
本发明提供药物组合物，其包含本发明的寡聚体或缀合物，及药学可接受的稀释剂，载体，盐或佐剂。
本发明提供本发明的寡聚体或缀合物，其用作药物，诸如用于治疗与载脂蛋白B活性关联的疾病，诸如在非限制性例中，不同类型的HDL/LDL胆甾醇不平衡；血脂异常，例如，家族性混合性高脂血症(FCHL)，获得性高脂血症，高胆固醇血症，耐抑制素的高胆固醇血症；冠状动脉疾病(CAD)，冠状心脏病(CHD)，动脉粥样硬化。
本发明提供本发明的寡聚体或缀合物用于生产用于治疗与载脂蛋白B活性关联的疾病的药物的用途，所述疾病诸如在非限制性例中，不同类型的HDL/LDL胆甾醇不平衡；血脂异常，例如，家族性混合性高脂血症(FCHL)，获得性高脂血症，高胆固醇血症，耐抑制素的高胆固醇血症；冠状动脉疾病(CAD)，冠状心脏病(CHD)，动脉粥样硬化。
本发明提供治疗与载脂蛋白B活性关联的疾病的方法，所述疾病诸如在非限制性例中，不同类型的HDL/LDL胆甾醇不平衡；血脂异常，例如，家族性混合性高脂血症(FCHL)，获得性高脂血症，高胆固醇血症，耐抑制素的高胆固醇血症；冠状动脉疾病(CAD)，冠状心脏病(CHD)，动脉粥样硬化，所述方法包括给患有或可能患有与载脂蛋白B活性关联的疾病的患者施用例如有效剂量的本发明的寡聚体，缀合物或药物组合物，所述疾病诸如在非限制性例中，不同类型的HDL/LDL胆甾醇不平衡；血脂异常，例如，家族性混合性高脂血症(FCHL)，获得性高脂血症，高胆固醇血症，耐抑制素的高胆固醇血症；冠状动脉疾病(CAD)，冠状心脏病(CHD)，动脉粥样硬化。
本发明提供抑制表达APO-B100的细胞中的APO-B100的方法，所述方法包括给所述细胞施用本发明的寡聚体或缀合物，以便实现抑制所述细胞中的APO-B100。
【附图说明】
图1：用LNA寡核苷酸SEQ ID NO：26～50处理后HuH-7细胞中的apoB mRNA表达。将数据标准化到GAPDH及相对于模拟物对照表示，以平均值+STD，n＝2。A显示SEQ ID NO：26～38，及B显示SEQ ID NO：39～50。
图2：在施用10mg/kg SEQ ID NO：28，29，44或45经4周和在最后施用LNA寡核苷酸之后48小时时处死的C57BL/6J小鼠中每周测量一次总血清胆甾醇。数据相对于对照(施用的盐水)以平均值±std，n＝5表示。TC＝总胆甾醇。
图3：靶向apoB，SEQ ID NO：45的3种不同寡核苷酸的以不同施剂水平的重复的施剂。图显示A)对施剂之后1周在血清中测量的总胆甾醇的效应及B)研究末期的ALT水平。
图4：在不同时间点以不同剂量水平单施用SEQ ID NO：29之后的总血清胆甾醇水平(A)及对HDL/LDL比的效应(B)。
图5：施剂(箭标指示(A)每周一次，(B)每两周一次施剂)之后1周每周测量的总血清胆甾醇。对小鼠施剂70天及在处死之前最后剂量之后1～3周回收。
图6：在第77天(处理末，最后剂量后7天)和第91天(回收期末)肝中的ApoB mRNA表达
图7：在第77天处死日(最后施剂之后1周)及第91天(最后施剂之后3周)血清中的ALT水平。
【发明详述】
【寡聚体】
本发明采用寡聚体化合物(称之为寡聚体)，用于调节编码哺乳动物APO-B100的核酸分子，诸如人APO B-100mRNA或基因的APO-B100核酸，及该编码哺乳动物APO-B100的核酸分子的天然存在的变体的功能。本发明的背景中的术语“寡聚体”，指通过2个或更多核苷酸的共价连接形成的分子(即寡核苷酸)。在本文中，单核苷酸(单元)也可指单体或单元。寡聚体由长度在10～50之间，诸如10～30个核苷酸的连续的核苷酸序列组成或包含长度在10～50之间，诸如10～30个核苷酸的连续的核苷酸序列。
在各种实施方式中，本发明的化合物不包含RNA(单元)。优选是，本发明的化合物是线性分子或合成为线性分子。寡聚体是单链分子，及优选不包括如下短区，例如，至少3，4或5个连续的核苷酸，与相同的寡聚体之内的相当的区互补(即双联体)，在这点上，寡聚体不是(基本上)双链。在一些实施方式中，寡聚体基本上不是双链，诸如不是siRNA。在各种实施方式中，本发明的寡聚体可完全由连续的核苷酸区组成。由此，寡聚体基本上不自身-互补。
【靶标】
适宜地，本发明的寡聚体能下调APO-B100基因的表达。在这点上，本发明的寡聚体可影响APO-B100的抑制，一般在哺乳动物诸如人细胞，诸如肝细胞中。在一些实施方式中，本发明的寡聚体结合于靶标核酸及实现相比正常表达水平至少10％或20％的表达抑制，更优选相比正常表达水平至少30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％抑制。在一些实施方式中，当使用0.04和25nM之间，诸如0.8和20nM之间的本发明的化合物的浓度时观察到该调节。在相同的或不同实施方式中，表达抑制少于100％，诸如少于98％抑制，少于95％抑制，少于90％抑制，少于80％抑制，诸如少于70％抑制。表达水平的调节可通过测量蛋白水平测定，例如通过方法，诸如SDS-PAGE然后是使用针对产生的靶蛋白的适合的抗体的蛋白印迹。或者，表达水平的调节可通过测量mRNA水平来测定，例如通过RNA印迹或定量RT-PCR。当经mRNA水平测量时，当使用适当的剂量，诸如0.04和25nM之间，诸如0.8和20nM浓度之间时的下调的水平，在一些实施方式中，在缺乏本发明的化合物下，一般是10～20％之间的正常水平的水平。
本发明因此提供下调或抑制表达APO-B100蛋白和/或mRNA的细胞中APO-B100蛋白和/或mRNA表达的方法，所述方法包括向所述细胞施用本发明的寡聚体或缀合物，以下调或抑制所述细胞中APO-B100蛋白和/或mRNA的表达。适宜地，细胞是哺乳动物细胞诸如人细胞。在一些实施方式中，施用可体外发生。在一些实施方式中，施用可体内发生。
本文使用的术语“靶核酸”指编码哺乳动物APO-B100多肽，诸如人APO-B100，诸如人APO-B100mRNA的DNA或RNA。编码核酸或其天然存在的变体，及由其来源的RNA核酸，优选mRNA，诸如前-mRNA，尽管优选成熟mRNA的APO-B100。在一些实施方式中，例如当在研究或诊断学使用时候，“靶核酸”可为源于以上DNA或RNA核酸靶的cDNA或合成寡核苷酸。本发明的寡聚体优选能与靶标核酸杂交。会认可，人APO-B100mRNA是cDNA序列，且由此，对应于成熟mRNA靶序列，尽管在cDNA序列中用胸苷取代尿嘧啶。
术语“其天然存在的变体”指在定义的分类群之内，诸如哺乳动物，诸如小鼠，猴和优选人中天然地存在的核酸序列的APO-B100多肽的变体。一般而言，当说道多核苷酸的“天然存在的变体”时，术语也可包括通过染色体转位或复制编码基因组DNA，及RNA，诸如由其来源的mRNA的APO-B100的任何等位基因变体。“天然存在的变体”也可包括源于APO-B100mRNA的可变剪接的变体。当参考特定多肽序列时，例如，术语也包括蛋白的天然存在的形式，其可因此加工，例如通过共翻译或翻译后修饰，诸如信号肽切割，蛋白水解切割，糖基化，等。
【序列】
寡聚体包含连续的核苷酸序列或由连续的核苷酸序列组成，所述核苷酸序列对应于存在于人APO-B100mRNA的核苷酸序列的反向互补体。由此，寡聚体可包含SEQ ID NO：1～25或由SEQ ID NO：1～25组成，或选自SEQ ID NO：1～25的序列(表1)，其中所述寡聚体(或其连续的核苷酸部分)可任选地与所述选择的序列具有1，2或3个错配。
表1
 测试物质   长度   靶序列
 SEQ ID NO：1   14   5’-TCTGAAGTCCATGA-3’
 SEQ ID NO：2   14   5’-GGATCAAATATAAG-3’
 SEQ ID NO：3   14   5’-GTTGACACTGTCTG-3’
 SEQ ID NO：4   12   5’-GTTGACACTGTC-3’
 SEQ ID NO：5   14   5’-GACTGCCTGTTCTC-3’
 SEQ ID NO：6   13   5’-CGTTGGAGTAAGC-3’
 SEQ ID NO：7   14   5’-GCGTTGGAGTAAGC-3’
 SEQ ID NO：8   14   5’-CTCTGTGATCCAGG-3’
 SEQ ID NO：9   14   5’-GGACTCTGTGATCC-3’
 SEQ ID NO：10   14   5’-CTGTTTGAGGGACT-3’
 SEQ ID NO：11   14   5’-GAGATGGCAGATGG-3’
 SEQ ID NO：12   14   5’-GCTGGTGTTGCCAC-3’
 SEQ ID NO：13   13   5’-CAGATCCTTGCAC-3’
 SEQ ID NO：14   14   5’-CCAGATCCTTGCAC-3’
 SEQ ID NO：15   12   5’-ACCTTTTGAGAC-3’
 SEQ ID NO：16   14   5’-CAATGTTCAGACTG-3’
 SEQ ID NO：17   14   5’-CCTGCAATGTTCAG-3’
 SEQ ID NO：18   14   5’-TAGGGCTGTAGCTG-3’
 SEQ ID NO：19   14   5’-GTTGGTCTACTTCA-3’
 SEQ ID NO：20   14   5’-CCAACCAATTTCTC-3’
 SEQ ID NO：21   14   5’-GTCAATTGTAAAGG-3’
 SEQ ID NO：22   14   5’-GTTTAAGAAATCCA-3’
 SEQ ID NO：23   12   5’-CTTAGTGTTAGC-3’
 SEQ ID NO：24   12   5’-GGTTCTTAGTGT-3’
 SEQ ID NO：25   14   5’-CTGGTTCTTAGTGT-3’
寡聚体可包含连续的核苷酸序列或由连续的核苷酸序列组成，所述连续的核苷酸序列完全互补(完美互补)于编码哺乳动物APO-B100的核酸(例如，人APO-B100mRNA)的相当的区。由此，寡聚体可包含反义核苷酸序列或由反义核苷酸序列组成。
但是，在一些实施方式中，当与靶序列杂交时寡聚体可耐受1，2，3或4个(或更)错配，且仍足够结合于靶标，以显示期望效果，即靶的下调。错配可，例如，通过增加的长度的寡聚体核苷酸序列和/或增加的数的存在于核苷酸序列之内的核苷酸类似物，诸如LNA来补偿。
在一些实施方式中，当与靶序列，诸如编码哺乳动物APO-B100的核酸的对应区杂交时，连续的核苷酸序列包含不多于3，诸如不多于2个错配。
在一些实施方式中，当与靶序列，诸如编码哺乳动物APO-B100的核酸的对应区杂交时，连续的核苷酸序列包含不多于单个错配。
本发明的寡聚体的核苷酸序列或连续的核苷酸序列优选至少80％同源于选自SEQ ID NO：1～25的对应序列，诸如至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％同源，诸如100％同源(同一)。
本发明的寡聚体的核苷酸序列或连续的核苷酸序列优选至少80％同源于存在于人APO-B100mRNA的对应序列的反向互补体，诸如至少85％，至少90％，至少91％，至少92％至少93％，至少94％，至少95％，至少96％同源，诸如100％同源(同一)。
本发明的寡聚体的核苷酸序列或连续的核苷酸序列优选至少80％互补于存在于人APO-B100mRNA的亚序列，诸如至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％互补，诸如100％互补(完美互补)。
在一些实施方式中，寡聚体(或其连续的核苷酸部分)选自，或包含，选自SEQ ID NO：1～25之一的序列，或其至少10个连续的核苷酸的亚序列，其中所述寡聚体(或其连续的核苷酸部分)相比序列可任选地包含1，2或3个错配。
但是，需认可，在一些实施方式中，寡聚体的核苷酸序列可包含额外的5’或3’核苷酸，诸如，独立地，1，2，3，4或5个额外的核苷酸5’和/或3’，其非-互补于靶序列。对此，本发明的寡聚体，可，在一些实施方式中，包含5’和/或3’侧翼有额外的核苷酸的连续的核苷酸序列。在一些实施方式中，额外的5’或3’核苷酸是天然存在的核苷酸，诸如DNA或RNA。在一些实施方式中，额外的5’或3’核苷酸可代表在本文间隔聚体寡聚体的背景下称的区D。
在一些实施方式中，本发明的寡聚体由SEQ ID NO：3的核苷酸序列，或其亚序列组成或包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列，或其亚序列。
在一些实施方式中，本发明的寡聚体由SEQ ID NO：4的核苷酸序列，或其亚序列组成或包含SEQ ID NO：4的核苷酸序列，或其亚序列。
在一些实施方式中，本发明的寡聚体由SEQ ID NO：19的核苷酸序列，或其亚序列组成或包含SEQ ID NO：19的核苷酸序列，或其亚序列。
在一些实施方式中，本发明的寡聚体由SEQ ID NO：20的核苷酸序列，或其亚序列组成或包含SEQ ID NO：20的核苷酸序列，或其亚序列。
当测定本发明的寡聚体(或连续的核苷酸序列)和编码哺乳动物APO-B100或其反向互补体，诸如本文公开的那些的核酸之间的“同源性”时，同源性的确定可通过简单比对与本发明的化合物的对应核苷酸序列及编码哺乳动物APO-B100(或靶标核酸)的核酸，或其反向互补体的对应区来进行，及同源性通过计数对齐的碱基数及除以本发明的化合物中连续的核苷酸的总数，及乘以100来测定。在该比较中，如果存在间隔，可优选该间隔仅是错配，而非间隔之内的核苷酸数在本发明的核苷酸序列和靶标核酸之间不同的区。
术语″对应于(corresponding to)″和″对应于(corresponds to)″指寡聚体的核苷酸序列或连续的核苷酸序列(第1序列)和选自下列的再一序列的相当的连续的核苷酸序列之间的比较：(i)核酸靶的反向互补体的亚序列，诸如编码APO-B100蛋白的mRNA，诸如人APO-B100mRNA，和/或(ii)本文提供的核苷酸的序列，诸如由SEQID NO：3，4，19或20组成的组，或其亚序列。核苷酸类似物与它们的相当体或对应核苷酸直接比较。对应于(i)或(ii)的再一序列的第1序列一般在第1序列的长度上(诸如连续的核苷酸序列)等同于该序列，或，如本文描述，可，在一些实施方式中，至少80％同源于对应序列，诸如至少85％，至少90％，至少91％，至少92％至少93％，至少94％，至少95％，至少96％同源，诸如100％同源(同一)。
术语″相应核苷酸类似物″和″相应核苷酸″旨在表示核苷酸类似物中的核苷酸和天然存在的核苷酸同一。例如，当核苷酸的2-脱氧核糖单元连接到腺嘌呤时，″相应核苷酸类似物″含有连接到腺嘌呤的戊糖单元(不同于2-脱氧核糖)。
【长度】
寡聚体可包含连续的核苷酸序列或由连续的核苷酸序列组成，所述连续的核苷酸序列长度总共在10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29或30个连续的核苷酸之间。
在一些实施方式中，寡聚体包含连续的核苷酸序列或由连续的核苷酸序列组成，所述连续的核苷酸序列长度总共在10～22，诸如12～18，诸如13～17或12～16，诸如13，14，15，16个连续的核苷酸之间。
在一些实施方式中，寡聚体包含连续的核苷酸序列或由连续的核苷酸序列组成，所述连续的核苷酸序列长度总共为10，11，12，13或14个连续的核苷酸。
在一些实施方式中，本发明的寡聚体由不多于22个核苷酸，诸如不多于20个核苷酸，诸如不多于18个核苷酸，诸如15，16或17个核苷酸组成。在一些实施方式中，本发明的寡聚体包含少于20个核苷酸。
【核苷酸类似物】
本文使用的术语“核苷酸”指糖苷，其包含糖部分，碱基部分和共价连接的磷酸基团和涵盖天然存在的核苷酸，诸如DNA或RNA，优选DNA，及非-天然存在的核苷酸，其包含修饰的糖和/或碱基部分，也在本文指称为“核苷酸类似物”。
非-天然存在的核苷酸包括具有修饰的糖部分的核苷酸，诸如双环核苷酸或2’修饰的核苷酸，诸如2’取代的核苷酸。
“核苷酸类似物”是依靠糖和/或碱基部分中的修饰的天然的核苷酸，诸如DNA或RNA核苷酸的变体。类似物可原则上在寡核苷酸的背景下仅为天然的核苷酸的“沉默体”或“相当体”，即对寡核苷酸工作而抑制靶基因表达的方式无功能作用。然而该“相当体”类似物可有用，如果，例如，它们生产起来更容易或更廉价，或对于存储或生产条件更稳定，或代表标签或标记物。但是，优选地，类似物会对寡聚体工作而抑制表达的方式具有功能作用；例如通过产生与靶增加的结合亲和力，和/或增加的对细胞内核酸酶的抗性和/或增加的运输到细胞的容易性。核苷类似物的特定例描述于，例如Freier & Altmann；Nucl.Acid Res.，1997，25，4429-4443and Uhlmann；Curr.Opinion in DrugDevelopment，2000，3(2)，293-213和方案1：
Figure BDA0000118525780000101
硫代磷酸酯    2′-O-甲基    2′-MOE             2′-氟
Figure BDA0000118525780000102
2′-AP        HNA           CeNA                PNA
Figure BDA0000118525780000103
吗啉代        2′-F-ANA     2′-(3-羟基)丙基    3′-氨基磷酸酯
硼烷磷酸酯
【方案1】
寡聚体可由此包含或由以下组成：天然存在的核苷酸，优选2’-脱氧核苷酸(在本文通常称之为“DNA”)，而且可能核糖核苷酸(在本文通常称之为“RNA”)，或该天然存在的核苷酸的组合，及一种或更多非-天然存在的核苷酸，即核苷酸类似物的简单序列。该核苷酸类似物可适宜地增强寡聚体对靶序列的亲和性。
适合的及优选的核苷酸类似物的例由PCT/DK2006/000512提供或在其中引用。
寡聚体中增强亲和力的核苷酸类似物的并合，诸如LNA或2’-取代的糖，可允许特异性结合的寡聚体的尺寸减小，及也可在非特异性或异常结合发生之前将上限减小到寡聚体的尺寸。
在一些实施方式中，寡聚体包含至少2个核苷酸类似物。在一些实施方式中，寡聚体包含自3～8个核苷酸类似物，例如6或7个核苷酸类似物。在最最优选的实施方式中，至少所述核苷酸类似物之一是锁核酸(LNA)；例如核苷酸类似物的至少3或至少4，或至少5，或至少6，或至少7，或8个可为LNA。在一些实施方式中，全部核苷酸类似物可为LNA。
会认可，当说道仅由核苷酸组成的优选的核苷酸序列基序或核苷酸序列时，本发明的由该序列定义的寡聚体可代替存在于所述序列的1个或更多核苷酸包含对应核苷酸类似物，诸如LNA单元或其他核苷酸类似物，其升高寡聚体/靶双联体的双联稳定性/Tm(即增强亲和力的核苷酸类似物)。
在一些实施方式中，寡聚体的核苷酸序列和靶序列之间的任何错配优选见于增强亲和力的核苷酸类似物之外的区，诸如本文所称的区B，和/或本文所称的区D，和/或非修饰的位点，诸如寡核苷酸中的DNA核苷酸，和/或在对于连续的核苷酸序列是5’或3’的区。
核苷酸的该修饰的例包括修饰糖部分，以提供2’-取代基或以产生桥接的(锁核酸)结构，其增强结合亲和力且也可提供增加的核酸酶抗性。
优选的核苷酸类似物是LNA，诸如氧基-LNA(诸如β-D-氧基-LNA，及α-L-氧基-LNA)和/或氨基-LNA(诸如β-D-氨基-LNA和α-L-氨基-LNA)和/或硫代-LNA(诸如β-D-硫代-LNA和α-L-硫代-LNA)和/或ENA(诸如β-D-ENA和α-L-ENA)。最优选为β-D-氧基-LNA。
在一些实施方式中，核苷酸类似物存在于本发明的寡聚体之内(诸如在本文提及的区A和C内)，其独立地选自，例如：2’-O-烷基-RNA单元，2’-氨基-DNA单元，2’-氟-DNA单元，LNA单元，阿糖型核酸(ANA)单元，2’-氟-ANA单元，HNA单元，INA(intercalating nucleicacid-Christensen，2002.Nucl.Acids.Res.200230：4918-4925，其通过引用并入本文)单元和2’MOE单元。在一些实施方式中仅有一种存在于本发明的寡聚体的以上类型的核苷酸类似物，或其连续的核苷酸序列。
在一些实施方式中，核苷酸类似物是2’-O-甲氧基乙基-RNA(2’MOE)，2’-氟-DNA单体或LNA核苷酸类似物，及由此本发明的寡核苷酸可包含独立地选自这3种类型的类似物的核苷酸类似物，或可包含仅一种类型的选自3种类型的类似物。在一些实施方式中，所述核苷酸类似物中的至少一种是2’-MOE-RNA，诸如2，3，4，5，6，7，8，9或10个2’-MOE-RNA核苷酸单元。在一些实施方式中，所述核苷酸类似物中的至少一种是2’-DNA氟，诸如2，3，4，5，6，7，8，9或10个2’-氟-DNA核苷酸单元。
在一些实施方式中，本发明的寡聚体包含至少1个锁核酸(LNA)单元，诸如1，2，3，4，5，6，7或8个LNA单元，诸如3～7或4～8个之间的LNA单元，或3，4，5，6或7个LNA单元。在一些实施方式中，全部核苷酸类似物是LNA。在一些实施方式中，寡聚体可包含β-D-氧基-LNA，及以下LNA单元中的一种或多种：β-D或α-L构型或其组合的硫代-LNA，氨基-LNA，氧基-LNA和/或ENA。在一些实施方式中，全部LNA胞嘧啶单元是5’甲基-胞嘧啶。在本发明的一些实施方式中，寡聚体可包含LNA和DNA单元二者。优选LNA和DNA单元的总和是10～25，优选10～20，甚至更优选12～16。在本发明的一些实施方式中，寡聚体的核苷酸序列，诸如连续的核苷酸序列包含至少一个LNA及余下核苷酸单元是DNA单元。在一些实施方式中寡聚体仅包含LNA核苷酸类似物和天然存在的核苷酸(诸如RNA或DNA，最优选DNA核苷酸)，任选地有修饰的核苷酸间键，诸如硫代磷酸酯。
术语“核碱基”指核苷酸的碱基部分，且涵盖天然存在的，以及非-天然存在的变体。由此，“核碱基”涵盖不仅知道的嘌呤和嘧啶杂环，而且杂环类似物及其互变异构体。
核碱基的例包括，但不限于腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，胸苷，尿嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，5-甲基胞嘧啶，异胞嘧啶，假异胞嘧啶，5-溴脲嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶，6-二氨基嘌呤，2-二氨基嘌呤，肌苷，二氨基嘌呤和2-氯-6-二氨基嘌呤。
在一些实施方式中，存在于寡聚体的至少1个核碱基是修饰的核碱基，其选自：5-甲基胞嘧啶，异胞嘧啶，假异胞嘧啶，5-溴脲嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶，6-二氨基嘌呤，2-二氨基嘌呤，肌苷，二氨基嘌呤和2-氯-6-二氨基嘌呤。
【LNA】
术语“LNA”指双环核苷酸类似物，称为“锁核酸”。其可指LNA单体，或，当在“LNA寡核苷酸”的背景下使用时，LNA指含有1个或更多该双环核苷酸类似物的寡核苷酸。LNA核苷酸特征在于，核糖糖环的C2’和C4’之间存在双基‘桥’，例如以下描述的双基R4＊-R2＊所显示。
本发明的寡核苷酸化合物中使用的LNA优选具有通式I的结构：
Figure BDA0000118525780000141
式1
其中对于全部手性中心，不对称基团可见取R或S方向；
其中X选自：-O-，-S-，-N(RN＊)-，-C(R6R6＊)-，诸如，在一些实施方式中是-O-；
B选自氢，任选地取代的C1-4-烷氧基，任选地取代的C1-4-烷基，任选地取代的C1～4-酰氧基，核碱基包括天然存在的和核碱基类似物，DNA嵌入剂，光化学活性基团，热化学活性基团，螯合基团，报告基团，及配体；
P表示与相邻单体的核苷酸间键，或5’-末端基团，该核苷酸间键或5’-末端基团任选地包括取代基R5或等同可应用的取代基R5＊；
P＊表示与相邻单体的核苷酸间键，或3’-末端基团；
R4＊和R2＊一起表示由选自：下列的1～4种基团/原子组成的双基：-C(RaRb)-，-C(Ra)＝C(Rb)-，-C(Ra)＝N-，-O-，-Si(Ra)2-，-S-，-SO2-，-N(Ra)-及＞C＝Z，其中Z选自：-O-，-S-及-N(Ra)-，及Ra和Rb各独立地选自：氢，任选地取代的C1～12-烷基，任选地取代的C2～12-烯基，任选地取代的C2～12-炔基，羟基，任选地取代的C1～12-烷氧基，C2～12-烷氧基烷基，C2～12-烯氧基，羧基，C1～12-烷氧羰基，C1～12-烷基羰基，甲酰基，芳基，芳氧基-羰基，芳氧基，芳羰基，杂芳基，杂芳基氧基-羰基，杂芳基氧基，杂芳基羰基，氨基，单-及二(C1～6-烷基)氨基，氨基甲酰基，单-及二(C1～6-烷基)-氨基-羰基，氨基-C1～6-烷基-氨基羰基，单-及二(C1～6-烷基)氨基-C1～6-烷基-氨基羰基，C1～6-烷基-羰氨基，脲基，C1～6-烷酰氧基，砜代，C1～6-烷基磺酰氧基，硝基，叠氮基，硫烷基，C1～6-烷硫基，卤素，DNA嵌入剂，光化学活性基团，热化学活性基团，螯合基团，报告基团，及配体，其中芳基和杂芳基可为任选地取代的且其中2个成对的取代基Ra和Rb一起可表示任选地取代的亚甲基(＝CH2)，其中对于全部手性中心，不对称基团可见取R或S方向，及；
各取代基R1＊，R2，R3，R5，R5＊，R6和R6＊，其独立地选自：氢，任选地取代的C1～12-烷基，任选地取代的C2～12-烯基，任选地取代的C2～12-炔基，羟基，C1～12-烷氧基，C2～12-烷氧基烷基，C2～12-烯氧基，羧基，C1～12-烷氧羰基，C1～12-烷基羰基，甲酰基，芳基，芳氧基-羰基，芳氧基，芳羰基，杂芳基，杂芳基氧基-羰基，杂芳基氧基，杂芳基羰基，氨基，单-及二(C1～6-烷基)氨基，氨基甲酰基，单-及二(C1～6-烷基)-氨基-羰基，氨基-C1～6-烷基-氨基羰基，单-及二(C1～6-烷基)氨基-C1～6-烷基-氨基羰基，C1～6-烷基-羰氨基，脲基，C1～6-烷酰氧基，砜代，C1～ 6-烷基磺酰氧基，硝基，叠氮基，硫烷基，C1～6-烷硫基，卤素，DNA嵌入剂，光化学活性基团，热化学活性基团，螯合基团，报告基团，及配体，其中芳基和杂芳基可为任选地取代的，且其中2个成对的取代基一起可表示氧代，硫代，亚氨基或任选地取代的亚甲基；其中RN选自：氢和C1～4-烷基，且其中2个相邻(非-成对的)取代基可表示产生双键的额外的键；及RN＊，当存在且不参与双基时，选自：氢和C1～4-烷基；及其碱式盐和酸加成盐。对于全部手性中心，不对称基团可见取R或S方向。
在一些实施方式中，R4＊和R2＊一起表示由选自下列的基团组成的双基：C(RaRb)-C(RaRb)-，C(RaRb)-O-，C(RaRb)-NRa-，C(RaRb)-S-及C(RaRb)-C(RaRb)-O-，其中各Ra和Rb可任选地独立地选择。在一些实施方式中，Ra和Rb可为，任选地独立地选自：氢和C1～6烷基，诸如甲基，诸如氢。
在一些实施方式中，R1＊，R2，R3，R5，R5＊独立地选自：氢，卤素，C1-6烷基，取代的C1～6烷基，C2～6烯基，取代的C2～6烯基，C2～ 6炔基或取代的C2～6炔基，C1～6烷氧基，取代的C1-6烷氧基，酰基，取代的酰基，C1～6氨基烷基或取代的C1～6氨基烷基。对于全部手性中心，不对称基团可见取R或S方向。
在一些实施方式中，R1＊，R2，R3，R5，R5＊是氢。
在一些实施方式中，R1＊，R2，R3独立地选自：氢，卤素，C1～6烷基，取代的C1～6烷基，C2～6烯基，取代的C2～6烯基，C2～6炔基或取代的C2～6炔基，C1～6烷氧基，取代的C1～6烷氧基，酰基，取代的酰基，C1～6氨基烷基或取代的C1～6氨基烷基。对于全部手性中心，不对称基团可见取R或S方向。
在一些实施方式中，R1＊，R2，R3是氢。
在一些实施方式中，R5和R5＊各独立地选自：H，-CH3，-CH2-CH3，-CH2-O-CH3，及-CH＝CH2。适宜地，在一些实施方式中，R5或R5＊之任何是氢，其中作为其他基团(分别R5或R5＊)选自：C1～ 5烷基，C2～6烯基，C2～6炔基，取代的C1～6烷基，取代的C2～6烯基，取代的C2～6炔基或取代的酰基(-C(＝O)-)；其中各取代的基团是用独立地选自下列的取代基单或多取代的：卤素，C1～6烷基，取代的C1～ 6烷基，C2～6烯基，取代的C2～6烯基，C2～6炔基，取代的C2～6炔基，OJ1，SJ1，NJ1J2，N3，COOJ1，CN，O-C(＝O)NJ1J2，N(H)C(＝NH)NR，R2或N(H)C(＝X)N(H)J2，其中X是O或S；及各J1和J2独立地为H，C1～6烷基，取代的C1～6烷基，C2～6烯基，取代的C2～6烯基，C2～6炔基，取代的C2～6炔基，C1～6氨基烷基，取代的C1～6氨基烷基或保护基。在一些实施方式中，R5或R5＊之任何是取代的C1～6烷基。在一些实施方式中，R5或R5＊之任何是取代的亚甲基，其中优选的取代基包括独立地选自下列的一种或更多种基团：F，NJ1J2，N3，CN，OJ1，SJ1，O-C(＝O)NJ1J2，N(H)C(＝NH)NJ，J2或N(H)C(O)N(H)J2。在一些实施方式中，各J1和J2独立地为H或C1～6烷基。在一些实施方式中，R5或R5＊之任何是甲基，乙基或甲氧甲基。在一些实施方式中，R5或R5＊之任何是甲基。在进一步实施方式中，R5或R5＊之任何是乙炔基。在一些实施方式中，R5或R5＊之任何是取代的酰基。在一些实施方式中，R5或R5＊之任何是C(＝O)NJ1J2。对于全部手性中心，不对称基团可见取R或S方向。该5’修饰的双环核苷酸公开于WO2007/134181，其通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，B是核碱基，包括核碱基类似物和天然存在的核碱基，诸如嘌呤或嘧啶，或取代的嘌呤或取代的嘧啶，诸如本文所述的核碱基，诸如选自下列的核碱基：腺嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶，腺嘌呤，尿嘧啶，和/或修饰的或取代的核碱基，诸如5-噻唑并-尿嘧啶，2-硫代-尿嘧啶，5-丙炔基-尿嘧啶，2’硫代-胸腺嘧啶，5-甲基胞嘧啶，5-噻唑并-胞嘧啶，5-丙炔基-胞嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。
在一些实施方式中，R4＊和R2＊一起表示选自下列的双基：-C(RaRb)-O-，-C(RaRb)-C(RcRd)-O-，-C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-O-，-C(RaRb)-O-C(RcRd)-，-C(RaRb)-O-C(RcRd)-O-，-C(RaRb)-C(RcRd)-，-C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-，-C(Ra)＝C(Rb)-C(RcRd)-，-C(RaRb)-N(Rc)-，-C(RaRb)-C(RcRd)-N(Re)-，-C(RaRb)-N(Rc)-O-及-C(RaRb)-S-，-C(RaRb)-C(RcRd)-S-，其中Ra，Rb，Rc，Rd，Re和Rf各独立地选自：氢，任选地取代的C1～12-烷基，任选地取代的C2～12-烯基，任选地取代的C2～12-炔基，羟基，C1～12-烷氧基，C2～12-烷氧基烷基，C2～12-烯氧基，羧基，C1～12-烷氧羰基，C1～12-烷基羰基，甲酰基，芳基，芳氧基-羰基，芳氧基，芳羰基，杂芳基，杂芳基氧基-羰基，杂芳基氧基，杂芳基羰基，氨基，单-及二(C1～6-烷基)氨基，氨基甲酰基，单-及二(C1～ 6-烷基)-氨基-羰基，氨基-C1～6-烷基-氨基羰基，单-及二(C1～6-烷基)氨基-C1～6-烷基-氨基羰基，C1～6-烷基-羰氨基，脲基，C1～6-烷酰氧基，砜代，C1～6-烷基磺酰氧基，硝基，叠氮基，硫烷基，C1～6-烷硫基，卤素，DNA嵌入剂，光化学活性基团，热化学活性基团，螯合基团，报告基团，及配体，其中芳基和杂芳基可为任选地取代的且其中2个成对的取代基Ra和Rb一起可表示任选地取代的烯基(＝CH2)。对于全部手性中心，不对称基团可见取R或S方向。
在进一步实施方式中，R4＊和R2＊一起表示双基(二价基团)，其选自：-CH2-O-，-CH2-S-，-CH2-NH-，-CH2-N(CH3)-，-CH2-CH2-O-，-CH2-CH(CH3)-，-CH2-CH2-S-，-CH2-CH2-NH-，-CH2-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-O-，-CH2-CH2-CH(CH3)-，-CH＝CH-CH2-，-CH2-O-CH2-O-，-CH2-NH-O-，-CH2-N(CH3)-O-，-CH2-O-CH2-，-CH(CH3)-O-及-CH(CH2-O-CH3)-O-，和/或，-CH2-CH2-，及-CH＝CH-。对于全部手性中心，不对称基团可见取R或S方向。
在一些优选的实施方式中，R4＊和R2＊一起表示双基-O-CH(CH2OCH3)-(2’O-甲氧基乙基双环核酸-Seth at al.，2010，J.Org.Chem)-R-或S-构型之任何的。
在一些优选的实施方式中，R4＊和R2＊一起表示双基-O-CH(CH2CH3)-(2’O-乙基双环核酸-Seth at al.，2010，J.Org.Chem)-R-或S-构型之任何。
在一些优选的实施方式中，R4＊和R2＊一起表示R-或S-构型之任何的双基-O-CH(CH3)-。在一些实施方式中，R4＊和R2＊一起表示双基C(RaRb)-N(Rc)-O-，其中Ra和Rb独立地选自：氢，卤素，C1～6烷基，取代的C1～6烷基，C2～6烯基，取代的C2～6烯基，C2～6炔基或取代的C2～6炔基，C1～6烷氧基，取代的C1～6烷氧基，酰基，取代的酰基，C1～6氨基烷基或取代的C1～6氨基烷基，诸如氢，及；其中Rc选自：氢，卤素，C1～6烷基，取代的C1～6烷基，C2～6烯基，取代的C2～6烯基，C2～6炔基或取代的C2～6炔基，C1～6烷氧基，取代的C1～6烷氧基，酰基，取代的酰基，C1～6氨基烷基或取代的C1～6氨基烷基，诸如氢。
在一些实施方式中，R4＊和R2＊一起表示双基C(RaRb)-O-C(RcRd)-O-，其中Ra，Rb，Rc和Rd独立地选自：氢，卤素，C1～6烷基，取代的C1～6烷基，C2～6烯基，取代的C2～6烯基，C2～ 6炔基或取代的C2～6炔基，C1～6烷氧基，取代的C1～6烷氧基，酰基，取代的酰基，C1～6氨基烷基或取代的C1～6氨基烷基，诸如氢。
在一些实施方式中，R4＊和R2＊形成双基-CH(Z)-O-，其中Z选自：C1～6烷基，C2～6烯基，C2～6炔基，取代的C1～6烷基，取代的C2～6烯基，取代的C2～6炔基，酰基，取代的酰基，取代的酰胺，硫氢基或取代的硫代；且其中各取代的基团，独立地为用独立地选自下列的任选地保护的取代基单或多取代的：卤素，氧代，羟基，OJ1，NJ1J2，SJ1，N3，OC(＝X)J1，OC(＝X)NJ1J2，NJ3C(＝X)NJ1J2和CN，其中各J1，J2和J3独立地为，H或C1～6烷基，及X是O，S或NJ1。在一些实施方式中Z是C1～6烷基或取代的C1～6烷基。在一些实施方式中，Z是甲基。在一些实施方式中，Z是取代的C1～6烷基。在一些实施方式中，所述取代基是C1～6烷氧基。在一些实施方式中，Z是CH3OCH2-。对于全部手性中心，不对称基团可见取R或S方向。该双环核苷酸公开于US 7,399,845，其通过引用整体并入本文。在一些实施方式中，R1＊，R2，R3，R5，R5＊是氢。在一些一些实施方式中，R1＊，R2，R3＊是氢，及R5，R5＊之一或之二者可不是氢，如上和WO 2007/134181中所述。
在一些实施方式中，R4＊和R2＊一起表示在桥中包含取代的氨基的双基，诸如由以下组成或包含以下：双基-CH2-N(Rc)-，其中Rc是C1～ 12烷基氧基。在一些实施方式中，R4＊和R2＊一起表示双基-Cq3q4-NOR-，其中q3和q4独立地选自：氢，卤素，C1～6烷基，取代的C1～6烷基，C2～6烯基，取代的C2～6烯基，C2～6炔基或取代的C2～6炔基，C1～6烷氧基，取代的C1～6烷氧基，酰基，取代的酰基，C1～6氨基烷基或取代的C1～6氨基烷基；其中各取代的基团独立地为用独立地选自下列的取代基单或多取代的：卤素，OJ1，SJ1，NJ1J2，COOJ1，CN，O-C(＝O)NJ1J2，N(H)C(＝NH)N J1J2或N(H)C(＝X＝N(H)J2，其中X是O或S；及各J1和J2独立地为，H，C1～6烷基，C2～6烯基，C2～6炔基，C1～6氨基烷基或保护基。对于全部手性中心，不对称基团可见取R或S方向。该双环核苷酸公开于WO2008/150729，其通过引用整体并入本文。在一些实施方式中，R1＊，R2，R3，R5，R5＊独立地选自：氢，卤素，C1～6烷基，取代的C1～6烷基，C2～6烯基，取代的C2～6烯基，C2～6炔基或取代的C2～6炔基，C1～6烷氧基，取代的C1～6烷氧基，酰基，取代的酰基，C1～6氨基烷基或取代的C1～6氨基烷基。在一些实施方式中，R1＊，R2，R3，R5，R5＊是氢。在一些实施方式中，R1＊，R2，R3是氢，且R5，R5＊之一或之二者可不是氢，如上和WO 2007/134181中所述。在一些实施方式中，R4＊和R2＊一起表示双基(二价基团)C(RaRb)-O-，其中Ra和Rb各独立地是：卤素，C1～C12烷基，取代的C1～C12烷基，C2～C12烯基，取代的C2～C12烯基，C2～C12炔基，取代的C2～C12炔基，C1～C12烷氧基，取代的C1～C12烷氧基，OJ1SJ1，SOJ1，SO2J1，NJ1J2，N3，CN，C(＝O)OJ1，C(＝O)NJ1J2，C(＝O)J1，O-C(＝O)NJ1J2，N(H)C(＝NH)NJ1J2，N(H)C(＝O)NJ1J2或N(H)C(＝S)NJ1J2；或Ra和Rb一起是＝C(q3)(q4)；q3和q4各独立地是：H，卤素，C1～C12烷基或取代的C1～C12烷基；各取代的基团独立地为用独立地选自下列的取代基单或多取代的：卤素，C1～C6烷基，取代的C1～C6烷基，C2～C6烯基，取代的C2～C6烯基，C2～C6炔基，取代的C2～C6炔基，OJ1，SJ1，NJ1J2，N3，CN，C(＝O)OJ1，C(＝O)NJ1J2，C(＝O)J1，O-C(＝O)NJ1J2，N(H)C(＝O)NJ1J2或N(H)C(＝S)NJ1J2.及；各J1和J2独立地为，H，C1～C6烷基，取代的C1～C6烷基，C2～C6烯基，取代的C2～C6烯基，C2～C6炔基，取代的C2～C6炔基，C1～C6氨基烷基，取代的C1～C6氨基烷基或保护基。该化合物公开于WO2009006478A，其通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，R4＊和R2＊形成双基-Q-，其中Q是C(q1)(q2)C(q3)(q4)，C(q1)＝C(q3)，C[＝C(q1)(q2)]-C(q3)(q4)或C(q1)(q2)-C[＝C(q3)(q4)]；q1，q2，q3，q4各独立地是：H，卤素，C1～ 12烷基，取代的C1～12烷基，C2～12烯基，取代的C1～12烷氧基，OJ1，SJ1，SOJ1，SO2J1，NJ1J2，N3，CN，C(＝O)OJ1，C(＝O)-NJ1J2，C(＝O)J1，-C(＝O)NJ1J2，N(H)C(＝NH)NJ1J2，N(H)C(＝O)NJ1J2或N(H)C(＝S)NJ1J2；各J1和J2独立地为，H，C1～6烷基，C2～6烯基，C2～ 6炔基，C1～6氨基烷基或保护基；及，任选地其中当Q是C(q1)(q2)(q3)(q4)及q3或q4之一是CH3时，则q3或q4之外的至少之一或q1和q2之一不是H。在一些实施方式中，R1＊，R2，R3，R5，R5＊是氢。对于全部手性中心，不对称基团可见取R或S方向。该双环核苷酸公开于WO2008/154401，其通过引用整体并入本文。在一些实施方式中，R1＊，R2，R3，R5，R5＊独立地选自：氢，卤素，C1～6烷基，取代的C1～6烷基，C2～6烯基，取代的C2～6烯基，C2～6炔基或取代的C2～6炔基，C1～ 6烷氧基，取代的C1～6烷氧基，酰基，取代的酰基，C1～6氨基烷基或取代的C1～6氨基烷基。在一些实施方式中，R1＊，R2，R3，R5，R5＊是氢。在一些实施方式中，R1＊，R2，R3是氢及R5，R5＊之一或之二者可不是氢，如上和WO 2007/134181或WO2009/067647中所述(α-L-双环核酸类似物)。
在一些实施方式中，本发明中使用的LNA的寡核苷酸化合物优选具有通式II的结构：
Figure BDA0000118525780000211
式II
其中Y选自：-O-，-CH2O-，-S-，-NH-，N(Re)和/或-CH2-；Z和Z＊独立地选自核苷酸间键，RH，末端基团或保护基；B构成天然的或非-天然的核苷酸碱基部分(核碱基)，及RH选自：氢和C1～4-烷基；Ra，Rb Rc，Rd和Re任选地独立地选自：氢，任选地取代的C1～12-烷基，任选地取代的C2～12-烯基，任选地取代的C2～12-炔基，羟基，C1～ 12-烷氧基，C2～12-烷氧基烷基，C2～12-烯氧基，羧基，C1～12-烷氧羰基，C1～12-烷基羰基，甲酰基，芳基，芳氧基-羰基，芳氧基，芳羰基，杂芳基，杂芳基氧基-羰基，杂芳基氧基，杂芳基羰基，氨基，单-及二(C1～ 6-烷基)氨基，氨基甲酰基，单-及二(C1～6-烷基)-氨基-羰基，氨基-C1～ 6-烷基-氨基羰基，单-及二(C1～6-烷基)氨基-C1～6-烷基-氨基羰基，C1～6-烷基-羰氨基，脲基，C1～6-烷酰氧基，砜代，C1～6-烷基磺酰氧基，硝基，叠氮基，硫烷基，C1～6-烷硫基，卤素，DNA嵌入剂，光化学活性基团，热化学活性基团，螯合基团，报告基团，及配体，其中芳基和杂芳基可为任选地取代的且其中2个成对的取代基Ra和Rb一起可表示任选地取代的烯基(＝CH2)；及RH选自：氢和C1～4-烷基。在一些实施方式中，Ra，Rb Rc，Rd和Re任选地独立地选自：氢和C1～6烷基，诸如甲基。对于全部手性中心，不对称基团可见取R或S方向，例如，2种例示立体化学异构体包括β-D和α-L亚型，其可如下所示：
特定例示LNA单元示于下：
Figure BDA0000118525780000221
β-D-氧基-LNA              α-L-氧基-LNA
Figure BDA0000118525780000222
β-D-硫代-LNA              β-D-ENA
β-D-氨基-LNA
术语″硫代-LNA″包含锁核苷酸，其中以上通式中的Y选自：S或-CH2-S-。硫代-LNA可兼为β-D和α-L-构型。
术语″氨基-LNA″包含锁核苷酸，其中以上通式中的Y选自：-N(H)-，N(R)-，CH2-N(H)-及-CH2-N(R)-，其中R选自：氢和C1～4-烷基。氨基-LNA可兼为β-D和α-L-构型。
术语″氧基-LNA″包含锁核苷酸，其中以上通式中的Y代表-O-。氧基-LNA可兼为β-D和α-L-构型。
术语″ENA″包含锁核苷酸，其中以上通式中的Y是-CH2-O-(其中相对于碱B，-CH2-O-的氧原子附接于2’-位置)。Re是氢或甲基。
在一些例示实施方式中，LNA选自：β-D-氧基-LNA，α-L-氧基-LNA，β-D-氨基-LNA和β-D-硫代-LNA，尤其是β-D-氧基-LNA。
【RNA酶募集】
需知，寡聚体化合物可经非RNA酶介导的靶标mRNA降解发挥功能，诸如通过翻译位阻，或其他方法，但是，优选的本发明的寡聚体能募集核糖核酸内切酶(RNA酶)，诸如RNA酶H。
优选地，寡聚体，或连续的核苷酸序列，包含至少6，诸如至少7个连续核苷酸单元，诸如至少8或至少9个连续核苷酸单元(残留物)，包括7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个连续核苷酸的区，其当与互补靶标RNA形成双链体时，能募集RNA酶。能募集RNA酶的连续的序列可为在如本文描述的间隔聚体的背景下所称的区B。在一些实施方式中，能募集RNA酶的连续的序列，诸如区B的尺寸可更大，诸如10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20个核苷酸单元。
EP 1 222 309提供测定RNA酶H活性的体外方法，其可用于测定募集RNA酶H的能力。寡聚体被认为能募集RNA酶H，如果，当用互补RNA靶提供时，其具有初速度，如以pmol/l/min测量，相当的仅DNA寡核苷酸的至少1％，诸如至少5％，诸如至少10％或少于20％，无2’取代，在寡核苷酸中的全部核苷酸之间有硫代磷酸酯键基，其使用由EP 1 222 309的实施例91～95提供的方法。
在一些实施方式中，寡聚体被认为基本上不能募集RNA酶H，如果，当以互补RNA靶和RNA酶H提供时，RNA酶H初速度，如以pmol/l/min测量，是使用相当的仅DNA寡核苷酸测定的初速度的少于1％，诸如少于5％，诸如少于10％或少于20％，无2’取代，在寡核苷酸中的全部核苷酸之间有硫代磷酸酯键基团，其使用由EP 1 222309的实施例91～95提供的方法。
在其他实施方式中，寡聚体被认为能募集RNA酶H，如果，当以互补RNA靶及RNA酶H提供时，RNA酶H初速度，如以pmol/l/min测量，是使用相当的仅DNA寡核苷酸测定的初速度的至少20％，诸如至少40％，诸如至少60％，诸如至少80％，无2’取代，在寡核苷酸中的全部核苷酸之间有硫代磷酸酯键基团，其使用由EP 1 222 309的实施例91～95提供的方法。
一般，形成连续核苷酸单元的寡聚体的区，其当与互补靶标RNA形成双链体时能募集RNA酶，其由与RNA靶标形成DNA/RNA样双链体的核苷酸单元组成-且兼包括为α-L构型的DNA单元和LNA单元，特别优选为α-L-氧基LNA。
本发明的寡聚体可包含兼包括核苷酸和核苷酸类似物的核苷酸序列，及可为间隔聚体，头聚体或混聚体形式。
头聚体被定义为在5’-端非-RNA酶募集核苷酸类似物的连续的延伸物，然后是由RNA酶可识别的和可切割的DNA或修饰的核苷酸单元向3’-端的连续的延伸物(诸如至少7个该核苷酸)，而尾聚体被定义为：在5’-端由RNA酶可识别的和可切割的DNA或修饰的核苷酸的连续的延伸物(诸如至少7个该核苷酸)，然后是非-RNA酶募集核苷酸类似物向3’-端的连续的延伸物。称之为混聚体的本发明的其他嵌合体由RNA酶可识别的和可切割的交替组成的DNA或修饰的核苷酸和非-RNA酶募集核苷酸类似物组成。一些核苷酸类似物也可能介导RNA酶H结合及切割。由于α-L-LNA某些程度募集RNA酶H活性，可需要用于间隔聚体构建体的由RNA酶H可识别的和可切割的DNA或修饰的核苷酸的更小间隔，及混聚体构建中可导入更多柔性。
【间隔聚体设计】
优选地，本发明的寡聚体是间隔聚体。间隔聚体寡聚体是寡聚体，其包含：能募集RNA酶，诸如RNA酶H的核苷酸的连续的延伸物，诸如至少6或7个DNA核苷酸的区，在本文中称作区B，其中区B在5’和3’侧翼有增强亲和力的核苷酸类似物的区，诸如在相对能募集RNA酶的核苷酸的连续的延伸物5’和3’的1～6个核苷酸类似物之间-这些区分别称作区A和C。
在一些实施方式中，能募集RNA酶的核苷酸选自：DNA核苷酸，α-L-LNA核苷酸，C4’烷基化的DNA(见PCT/EP2009/050349，其通过引用并入本文)，及UNA核苷酸(见Fluiter et al.，Mol.Biosyst.，2009，10，1039，其通过引用并入本文)。在一些实施方式中，区B由至少6或7个DNA核苷酸或选自DNA和α-L-LNA的核苷酸的连续的长度组成。
优选间隔聚体包含式(5’到3’)，A-B-C或任选地A-B-C-D或D-A-B-C的(聚)核苷酸序列，其中；区A(5’区)由以下组成或包含以下：至少1个核苷酸类似物，诸如至少1个LNA单元，诸如1～6个核苷酸类似物之间，诸如LNA单元，及；区B由以下组成或包含以下：能募集RNA酶的至少5个连续核苷酸(当形成与互补RNA分子，诸如mRNA靶形成双链体时)，诸如DNA核苷酸，及；区C(3’区)由以下组成或包含以下：至少1个核苷酸类似物，诸如至少1个LNA单元，诸如1～6个核苷酸类似物之间，诸如LNA单元，及；区D，当存在时，由以下组成或包含以下：1，2或3个核苷酸单元，诸如DNA核苷酸。
在一些实施方式中，区A由1，2，3，4，5或6个核苷酸类似物，诸如LNA单元，诸如2～5之间个核苷酸类似物，诸如2～5LNA单元，诸如3或4个核苷酸类似物，诸如3或4LNA单元组成；和/或区C由1，2，3，4，5或6个核苷酸类似物，诸如LNA单元，诸如2～5之间个核苷酸类似物，诸如2～5LNA单元，诸如3或4个核苷酸类似物，诸如3或4LNA单元组成。
在一些实施方式中，B由以下组成或包含以下：5，6，7，8，9，10，11或12个能募集RNA酶的连续核苷酸，或6～10之间，或7～9之间，诸如8个能募集RNA酶的连续核苷酸。在一些实施方式中，区B由以下组成或包含以下：至少1个DNA核苷酸单元，诸如1～12个DNA单元，优选4～12之间个DNA单元，更优选6～10之间个DNA单元，诸如7～10之间个DNA单元，最优选8，9或10个DNA单元。
在一些实施方式中，区A由3或4个核苷酸类似物，诸如LNA组成，区B由7，8，9或10个DNA单元组成，及区C由3或4个核苷酸类似物，诸如LNA组成。该设计包括(A-B-C)3-10-3，3-10-4，4-10-3，3-9-3，3-9-4，4-9-3，3-8-3，3-8-4，4-8-3，3-7-3，3-7-4，4-7-3和可还包括区D，其可具有1个或2个核苷酸单元，诸如DNA单元。
其他间隔聚体设计公开于WO2004/046160，其通过引用并入本文。
US临时申请，60/977409，其通过引用并入本文，涉及‘短聚体’间隔聚体寡聚体，其在一些实施方式中，可为本发明的间隔聚体寡聚体。
在一些实施方式中，寡聚体由总共10，11，12，13或14个核苷酸单元的连续的核苷酸序列组成，其中所述连续的核苷酸序列是式(5’-3’)，A-B-C或任选地A-B-C-D或D-A-B-C，其中；A由1，2或3个核苷酸类似物单元，诸如LNA单元组成；B由7，8或9个当与互补RNA分子(诸如mRNA靶)形成双链体时能募集RNA酶的连续的核苷酸单元组成；及C由1，2或3个核苷酸类似物单元，诸如LNA单元组成。当存在时，D由单DNA单元组成。
在一些实施方式中，A由1个LNA单元组成。在一些实施方式中，A组成由2LNA单元。在一些实施方式中，A由3个LNA单元组成。在一些实施方式中，C由1个LNA单元组成。在一些实施方式中，C由2个LNA单元组成。在一些实施方式中，C由3个LNA单元组成。在一些实施方式中，B由7个核苷酸单元组成。在一些实施方式中，B由8个核苷酸单元组成。在一些实施方式中，B由9个核苷酸单元组成。在一些实施方式中，B包含1～9之间个DNA单元，诸如2，3，4，5，6，7或8个DNA单元。在一些实施方式中，B由DNA单元组成。在一些实施方式中，B包含至少1个α-L构型的LNA单元，诸如2，3，4，5，6，7，8或9个α-L-构型的LNA单元。在一些实施方式中，B包含至少1个α-L-氧基LNA单元或其中全部α-L-构型的LNA单元是α-L-氧基LNA单元。在一些实施方式中，存在于A-B-C的核苷酸数选自：(核苷酸类似物单元-区B-核苷酸类似物单元)：1-8-1，1-8-2，2-8-1，2-8-2，3-8-3，2-8-3，3-8-2，4-8-1，4-8-2，1-8-4，2-8-4，或；1-9-1，1-9-2，2-9-1，2-9-2，2-9-3，3-9-2，1-9-3，3-9-1，4-9-1，1-9-4，或；1-10-1，1-10-2，2-10-1，2-10-2，1-10-3，3-10-1。在一些实施方式中，A-B-C中的核苷酸数选自：：2-7-1，1-7-2，2-7-2，3-7-3，2-7-3，3-7-2，3-7-4和4-7-3。在一些实施方式中，A和C均各由2个LNA单元组成，及B由8或9个核苷酸单元，优选DNA单元组成。
【核苷酸间连接】
术语″连接基团″或“核苷酸间键”旨在表示能将2个核苷酸，2个核苷酸类似物，及核苷酸和核苷酸类似物，等共价偶联在一起的基团。特定及优选的例包括磷酸基团和硫代磷酸基团。
本发明的寡聚体的核苷酸或其连续的核苷酸序列经连接基团偶联在一起。适宜地，各核苷酸经连接基团连接到3’相邻核苷酸。
适合的核苷酸间键包括PCT/DK2006/000512中所列的那些，例如PCT/DK2006/000512(其通过引用并入本文)的第34页的第1段落中列的核苷酸间键。
在一些实施方式中，优选将核苷酸间键从其正常磷酸二酯修饰成对核酸酶攻击更抗性的核苷酸间键，诸如硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯-这2种可被RNA酶H切割，也允许减少靶基因表达中的反义抑制途径。
可优选本文提供的适合的含硫(S)核苷酸间键。也优选硫代磷酸酯核苷酸间键，特别对于间隔聚体的间隔区(B)。也可使用硫代磷酸酯键用于侧翼区(A和C，及用于将A或C连接到D，及在区D内，如果适当的)。
但是，区A，B和C可包含不是硫代磷酸酯的核苷酸间键，诸如磷酸二酯键，特别，例如当核苷酸类似物的使用保护区A和C之内的核苷酸间键免于内切核酸酶降解，诸如当区A和C包含LNA核苷酸时。
寡聚体中的核苷酸间键可为磷酸二酯，硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯，以便允许RNA酶H切割靶标的RNA。优选硫代磷酸酯，用于改善的核酸酶抗性和其他原因，诸如容易生产。
在本发明的寡聚体的一方面，核苷酸和/或核苷酸类似物利用硫代磷酸基团彼此连接。
需知，将磷酸二酯键，诸如1或2个连接，包含到另外的硫代磷酸酯寡聚体中，特别在核苷酸类似物单元之间或相邻于核苷酸类似物单元(一般在区A及/或C内)可修饰寡聚体的生物利用度和/或生物-分布，见WO2008/053314，其通过引用并入本文。
在一些实施方式中，诸如以上所述的实施方式中，如果适合的及不特别指示，全部其余连接基团是磷酸二酯或硫代磷酸酯，或其混合物。
在一些实施方式中全部核苷酸间键基团是硫代磷酸酯。当说道特定间隔聚体寡核苷酸序列，诸如那些本文提供的时，需理解，在各种实施方式中，当连接是硫代磷酸酯键时，可使用替代性的连接，诸如本文公开的那些，例如可使用磷酸酯(磷酸二酯)连接，特别用于连接核苷酸类似物之间，诸如LNA，单元。同样，当说道特定间隔聚体寡核苷酸序列，诸如那些本文提供的时，当C残基标注为5’甲基修饰的胞嘧啶时，在各种实施方式中，存在于寡聚体的1个或更多C可为未修饰的C残基。在一些实施方式中
【寡聚体化合物】
本发明的寡聚体可，例如，选自：SEQ ID NO：26～50。在尤其优选的实施方式中，本发明的寡聚体选自：SEQ ID NO：28，29，44和45。
【缀合物】
在本文背景中，术语″缀合物″旨在表示通过如本文描述的寡聚体与1个或更多非-核苷酸，或非-多核苷酸部分共价连接(“缀合”)形成的异源分子。非-核苷酸或非-多核苷酸部分的例包括大分子制剂诸如蛋白，脂肪酸链，糖残留物，糖蛋白，聚合物或其组合。一般蛋白可为靶蛋白的抗体。典型聚合物可为聚乙二醇。
因此，在各种实施方式中，本发明的寡聚体可包含：一般由核苷酸的连续的序列组成的多核苷酸区，及还有非-核苷酸区。当说道本发明的由连续的核苷酸序列组成的寡聚体时，化合物可包含非-核苷酸组分，诸如缀合物组分。
在本发明的各种实施方式中，寡聚体化合物连接到配体/缀合物，其可使用，例如来增加寡聚体化合物的细胞摄取。WO2007/031091提供适合的配体和缀合物，其通过引用并入本文。
本发明也提供缀合物，其包含本文所述的本发明的化合物的，及共价附接于所述化合物的至少一个非-核苷酸或非-多核苷酸部分。因此，在本发明的化合物由如本文公开的特定的核酸或核苷酸序列组成的各种实施方式中，化合物也可包含共价附接于所述化合物的至少一个非-核苷酸或非-多核苷酸部分(例如不包含一个或更多核苷酸或核苷酸类似物)。
缀合(到缀合物部分)可增强本发明的寡聚体的活性，细胞分布或细胞摄取。该部分包括，但不限于，抗体，多肽，脂质部分诸如胆甾醇部分，胆酸，硫醚，例如己基-s-三苯甲基硫醇，硫代胆甾醇，脂肪族链，例如，十二烷二醇或十一烷基残基，磷脂，例如，二-十六基-消旋-甘油或三乙基铵1，2-二-o-十六基-消旋-甘油基-3h-膦酸酯，聚胺或聚乙二醇链，金刚烷乙酸，棕榈基部分，十八烷胺或己基氨基-羰基-氧基胆甾醇部分。
本发明的寡聚体也可缀合于活性药物物质，例如，阿司匹林，布洛芬，磺胺药物，抗糖尿病药，抗细菌剂或抗生素。
在某些实施方式中，缀合的部分是甾醇，诸如胆甾醇。
在各种实施方式中，缀合的部分包含带正电的聚合物或由带正电的聚合物组成，诸如，例如长度1～50，诸如2～20诸如3～10个之间的氨基酸残基的带正电的肽，和/或聚亚烷基氧化物，诸如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇-见WO 2008/034123，其通过引用并入本文。适宜地带正电的聚合物，诸如聚亚烷基氧化物可经接头诸如WO2008/034123中描述的可释放的接头附接于本发明的寡聚体。
例如，如下缀合物部分可用于本发明的缀合物：
Figure BDA0000118525780000291
5’-寡聚体-3’
Figure BDA0000118525780000292
5’-寡聚体-3’
【活化的寡聚体】
本文使用的术语“活化的寡聚体”指本发明的共价连接(即，官能化)到允许寡聚体与1个或更多缀合的部分，即，不本身是核酸或单体的部分，共价连接而形成本文所述的缀合物的至少一个官能部分的寡聚体。一般而言，官能部分会包含：能经，例如，腺嘌呤碱的3’-羟基或环外NH2基与寡聚体共价键合的化学基团，优选亲水的间隔物和能结合于缀合的部分的末端基团(例如，氨基，巯基或羟基)。在一些实施方式中，此末端基团未被保护，例如，是NH2基。在其他实施方式中，末端基团被保护，例如，通过任何适合的保护基，诸如描述于“Protective Groups in Organic Synthesis″by Theodora WGreene and Peter G M Wuts，3rd edition(John Wiley & Sons，1999)的那些。适合的羟基保护基的例包括酯诸如乙酸酯，芳烷基诸如苄基，二苯甲基或三苯甲基，及四氢吡喃基。适合的氨基保护基的例包括苄基，α-甲基苄基，二苯甲基，三苯甲基，苄氧基羰基，叔-丁氧羰基和酰基诸如三氯乙酰基或三氟乙酰基。在一些实施方式中，官能部分自我切割。在其他实施方式中，官能部分可生物降解。见例如，美国专利No.7,087,229，其通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，本发明的寡聚体在5’端官能化以便允许缀合的部分共价连接到寡聚体的5’端。在其他实施方式中，本发明的寡聚体可在3’端官能化。在仍其他实施方式中，本发明的寡聚体可沿着主链或在杂环碱基部分上官能化。在仍其他实施方式中，本发明的寡聚体可在多于一个独立地选自下列的位置官能化：5’端，3’端，主链和碱基。
在一些实施方式中，本发明的活化的寡聚体通过在合成期间合并1个或更多共价附接于官能部分的单体来合成。在其他实施方式中，本发明的活化的寡聚体用未官能化的单体合成，及寡聚体在合成完成后官能化。在一些实施方式中，寡聚体用含有氨基烷基接头的阻碍的酯官能化，其中烷基部分具有式(CH2)w，其中w是跨1～10的整数，优选约6，其中烷氨基的烷基部分可为直链或支链，且其中官能团经酯基(-O-C(O)-(CH2)wNH)附接于寡聚体。
在其他实施方式中，寡聚体用含有(CH2)w-巯基(SH)接头的阻碍的酯官能化，其中w是跨1～10的整数，优选约6，其中烷氨基的烷基部分可为直链或支链，且其中官能团经酯基(-O-C(O)-(CH2)wSH)附接于寡聚体。
在一些实施方式中，巯基-活化的寡核苷酸与聚合物部分诸如聚乙二醇或肽(经二硫键的形成)缀合。
含有以上描述的阻碍的酯的活化的寡聚体可通过任何本领域知道的方法合成，且尤其是通过公开于PCT公开No.WO 2008/034122和该文实施例的方法，其通过引用整体并入本文。
在仍其他实施方式中，本发明的寡聚体官能化通过将巯基，氨基或羟基利用基本上如美国专利No.4,962,029和4,914,210中描述的官能化剂(即，具有在一端通过亲水间隔物链连接到包含保护的或未保护的巯基，氨基或羟基的对侧端的亚磷酰胺的基本上线性试剂)导入寡聚体。该试剂主要与寡聚体的羟基反应。在一些实施方式中，该活化的寡聚体具有偶联于寡聚体的5’-羟基的官能化剂。在其他实施方式中，活化的寡聚体具有偶联于3’-羟基的官能化剂。在仍其他实施方式中，本发明的活化的寡聚体具有偶联于寡聚体主链上的羟基的官能化剂。在仍进一步实施方式中，本发明的寡聚体用美国专利No.4,962,029和4,914,210中描述的多于一种官能化剂官能化，其通过引用整体并入本文。合成该官能化剂及将它们合并到单体或寡聚体的方法公开于美国专利No.4,962,029和4,914,210。
在一些实施方式中，结合固相的寡聚体的5’-端用二烯基亚磷酰胺衍生物官能化，然后是将去保护的寡聚体与，例如，氨基酸或肽经Diels-Alder环加成反应缀合。
在各种实施方式中，将含有2’-糖修饰的单体，诸如2’-氨基甲酸酯取代的糖或2′-(O-戊基-N-酞酰亚氨基)-脱氧核糖并合到寡聚体辅助缀合的部分与寡聚体的糖的共价连接。在其他实施方式中，使用如下制剂制备在1个或更多单体的2′-位置有含有氨基的接头的寡聚体，所述制剂诸如，例如，5’-二甲氧基三苯甲基-2′-O-(e-酞酰亚氨基氨基戊基)-2′-脱氧腺苷-3’--N，N-二异丙基-氰基乙氧基亚磷酰胺。见，例如，Manoharan，et al.，Tetrahedron Letters，1991，34，7171。
在再进一步实施方式中，本发明的寡聚体可在核碱基上(包括在N6嘌呤氨基上，在鸟嘌呤的环外N2上，或在胞嘧啶的N4或5位置上)具有含有胺的官能部分。在各种实施方式中，该官能化可通过使用已在寡聚体合成中官能化的商业试剂来实现。
一些官能部分可商购，例如，异双官能和同双官能连接部分可获自Pierce Co.(Rockford，Ill.)。其他可商购的连接基是5’-氨基-修饰物C6和3’-氨基-修饰物试剂，均可获自Glen Research Corporation(Sterling，Va.)。5’-氨基-修饰物C6也可获自ABI(AppliedBiosystems Inc.，Foster City，Calif.)如Aminolink-2，及3’-氨基-修饰物也可获自Clontech Laboratories Inc.(Palo Alto，Calif.)。
【组合物】
本发明的寡聚体可用于药物制剂和组合物。适宜地，该组合物包含药学可接受的稀释剂，载体，盐或佐剂。PCT/DK2006/000512提供适合的及优选的药学可接受的稀释剂，载体和佐剂-通过引用并入本文。适合的剂量，制剂，施用途径，组合物，剂型，与其他治疗剂组合，前药制剂也提供于PCT/DK2006/000512，其也通过引用并入本文。
【应用】
可将本发明的寡聚体用作研究试剂，用于例如，诊断学，治疗剂和预防。
在研究中，该寡聚体可用于特别抑制细胞和实验动物中APO-B100蛋白的合成(一般通过降解或抑制mRNA和由此阻止蛋白形成)，由此辅助靶的功能分析或评价其作为治疗性干扰的靶的有用性。
在诊断学中，寡聚体可用于通过RNA印迹，原位杂交或类似技术检测及定量细胞和组织中的APO-B100表达。
有关治疗剂，将怀疑具有可通过调节APO-B100的表达治疗的疾病或病症的动物或人通过施用本发明的寡聚体化合物来治疗。还提供通过施用治疗或预防有效量的一种或更多种本发明的寡聚体或组合物来治疗哺乳动物，诸如治疗，怀疑具有与APO-B100的表达关联的疾病或病情或具有与APO-B100的表达关联的疾病或病情的倾向的人的方法。本发明的寡聚体，缀合物或药物组合物一般以有效量施用。
本发明也提供描述的本发明的化合物或缀合物用于生产用于治疗本文所述的病症的药物，或用于治疗本文所述的病症的方法的用途。
本发明也提供用于治疗本文所述的病症的方法，所述方法包括给有需要的患者施用本文所述的本发明的化合物，和/或本发明的缀合物，和/或本发明的药物组合物。
【医疗指示】
本发明的寡聚体和其他组合物可用于治疗与突变形式的APO-B100的过表达或表达关联的病情。
本发明还提供本发明的化合物在生产用于治疗本文所述的疾病，病症或病情的药物中的用途。
总言之，本发明的一方面针对治疗患有或敏感于与APO-B100的异常水平关联的病情的哺乳动物的方法，包含给哺乳动物施用治疗有效量的靶向包含1个或更多LNA单元的APO-B100的寡聚体。本发明的寡聚体，缀合物或药物组合物一般以有效量施用。
本文所述的疾病或病症可在一些实施方式中相关于APO-B100基因或蛋白产物与APO-B100相关或相互作用的基因中的突变。因此，在一些实施方式中，靶标mRNA是突变的形式的APO-B100序列。
本发明的感兴趣的方面针对本文定义的寡聚体(化合物)或本文定义的缀合物用于制备用于治疗本文所述的疾病，病症或病情的药物的用途。
本发明的方法优选采用来治疗或预防由APO-B100的异常水平导致的疾病。
换言之，在一些实施方式中，本发明此外针对治疗APO-B100的异常水平的方法，所述方法包括给有需要的患者施用本发明的寡聚体，或本发明的缀合物或本发明的药物组合物。
本发明也涉及用作药物的本文定义的寡聚体，组合物或缀合物。
本发明还涉及本文定义的化合物，组合物，或缀合物用于生产用于治疗APO-B100的异常水平或突变体形式的APO-B100(诸如等位基因变体，诸如与本文所述的疾病之一关联的那些)的表达的药物的用途。
而且，本发明涉及治疗患有疾病或病情，诸如本文所述的那些的受试者的方法。
有治疗需求的患者是患有或可能患有疾病或病症的患者。
在一些实施方式中，本文使用的术语‘治疗’指治疗既患疾病(例如本文所述的疾病或病症)，或预防疾病，即预防。需知，本文所称的治疗可，在一些实施方式中，是预防。
【实施方式】
本发明的以下实施方式可与本文所述的其他实施方式组合使用。
1.长度在10～30个核苷酸之间的寡聚体，其包含总共10～30个核苷酸之间的连续的核苷酸序列，其中所述连续的核苷酸序列至少80％同源于对应于哺乳动物APO-B100基因或mRNA，诸如人APO-B100mRNA的反向互补体或其天然存在的变体的区，且其中连续的核苷酸序列至少80％同源于对应于SEQ ID NO：1～25之任一个的区。
2.实施方式1的寡聚体，其中所述连续的核苷酸序列与人APO-B100mRNA的对应区的反向互补体不包含错配或包含不多于1个或2个错配。
3.实施方式1～2中任一项的寡聚体，其中寡聚体的核苷酸序列由连续的核苷酸序列组成。
4.实施方式1～3中任一项的寡聚体，其中所述连续的核苷酸序列长度在10～18个核苷酸之间。
5.实施方式1～4中任一项的寡聚体，其中所述连续的核苷酸序列包含核苷酸类似物。
6.实施方式5的寡聚体，其中所述核苷酸类似物是糖修饰的核苷酸，诸如选自下列的糖修饰的核苷酸：锁核酸(LNA)单元；2’-O-烷基-RNA单元，2’-OMe-RNA单元，2’-氨基-DNA单元和2’-氟-DNA单元。
7.实施方式5的寡聚体，其中核苷酸类似物是LNA。
8.实施方式5～7中任一项的寡聚体，其为间隔聚体。
9.实施方式1～9中任一项的寡聚体，其中寡聚体由SEQ ID NO：26～50之任何一个组成或包含SEQ ID NO：26～50之任何一个。
10.实施方式1～9中任一项的寡聚体，其中寡聚体由SEQ ID NO：28，29，44或45之任何一个组成或包含SEQ ID NO：28，29，44或45之任何一个。
11.实施方式1～10中任一项的寡聚体，其抑制表达APO-B100基因或mRNA的细胞中APO-B100基因或mRNA的表达。
12.缀合物，其包含实施方式1～11中任一项的寡聚体，及共价附接于所述寡聚体的至少一个非-核苷酸或非-多核苷酸部分。
13.药物组合物，其包含实施方式1～11中任一项的寡聚体，或实施方式12的缀合物，及药学可接受的稀释剂，载体，盐或佐剂。
14.实施方式1～11中任一项的寡聚体，或实施方式12的缀合物，其用作药物，诸如用于治疗与载脂蛋白B活性关联的疾病，诸如在非限制性例中，不同类型的HDL/LDL胆甾醇不平衡；血脂异常，例如，家族性混合性高脂血症(FCHL)，获得性高脂血症，高胆固醇血症，耐抑制素的高胆固醇血症；冠状动脉疾病(CAD)，冠状心脏病(CHD)，动脉粥样硬化。
15.实施方式1～11中任一项的寡聚体，或实施方式12中定义的缀合物，用于生产用于治疗与载脂蛋白B活性关联的疾病的药物的用途，所述疾病诸如在非限制性例中，不同类型的HDL/LDL胆甾醇不平衡；血脂异常，例如，家族性混合性高脂血症(FCHL)，获得性高脂血症，高胆固醇血症，耐抑制素的高胆固醇血症；冠状动脉疾病(CAD)，冠状心脏病(CHD)，动脉粥样硬化。
16.治疗与载脂蛋白B活性关联的疾病的方法，所述疾病诸如在非限制性例中，不同类型的HDL/LDL胆甾醇不平衡；血脂异常，例如，家族性混合性高脂血症(FCHL)，获得性高脂血症，高胆固醇血症，耐抑制素的高胆固醇血症；冠状动脉疾病(CAD)，冠状心脏病(CHD)，动脉粥样硬化，所述方法包括给患有或可能患有与载脂蛋白B活性关联的疾病的患者施用有效量的实施方式1～11中任一项的寡聚体，或实施方式12的缀合物，或实施方式13的药物组合物，所述疾病诸如在非限制性例中，不同类型的HDL/LDL胆甾醇不平衡；血脂异常，例如，家族性混合性高脂血症(FCHL)，获得性高脂血症，高胆固醇血症，耐抑制素的高胆固醇血症；冠状动脉疾病(CAD)，冠状心脏病(CHD)，动脉粥样硬化。
17.抑制表达APO-B100的细胞中的APO-B100的方法，所述方法包括给所述细胞施用实施方式1～11中任一项的寡聚体，或实施方式12的缀合物，以便抑制所述细胞中的APO-B100。
18.在一实施方式中，根据实施方式1～17中任一项，将SEQ IDNO：26～50的化合物中1个或更多氧基LNA核苷酸类似物用非氧基LNA的另一LNA取代。
19.在根据实施方式18的实施方式中，LNA选自：2’O-甲氧基乙基双环核酸，2’O-乙基双环核酸，ENA，β-D-氨基-LNA和β-D-硫代-LNA。
【实施例】
【实施例1：单体合成】
LNA单体构件和其衍生物使用标准方法制备，诸如W02007/031081中公开的方法和引用的参考文献。
【实施例2：寡核苷酸合成】
寡核苷酸使用描述于WO2007/031081的实施例2的方法合成，其通过引用并入本文。
表2：本发明的寡核苷酸化合物
Figure BDA0000118525780000381
在SEQ ID NO：26～51中，大写字母表示核苷酸类似物单元(LNA)，上标字母“o”表示氧基-LNA，“m”表示甲基C-LNA及下标字母“s”代表硫代磷酸酯键。“s”的缺失表示磷酸二酯键。
【实施例3：测定】
apoB-100表达的反义调节可在本领域知道的各种方式中测定。例如，apoB-100mRNA水平可通过，例如RNA印迹分析，竞争性聚合酶链反应(PCR)，或实时PCR定量。目前优选实时定量PCR。RNA分析可对总细胞RNA或mRNA进行。RNA分离和RNA分析的方法，诸如RNA印迹分析是本领域的常规，及教导于，例如，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons。
实时定量(PCR)可使用获自BioRAD的商业iQ多-色彩实时PCR检测系统便利地实现。实时定量PCR是本领域熟知的技术，且教导于例如Heid et al.Real time quantitative PCR，Genome Research(1996)，6：986-994。
【实施例4：体外模型：细胞培养】
反义化合物对靶标核酸表达的效应可在只要是靶标核酸以可测量的水平的存在的任何各种细胞类型中测试。靶可内源性地表达或通过编码所述核酸的核酸的瞬时或稳定的转染来表达。
靶标核酸的表达水平可使用，例如，RNA印迹分析，定量PCR，核糖核酸酶保护测定来常规测定。以例证性目的提供以下细胞类型，但其他细胞类型可常规使用，只要是靶在选择的细胞类型中表达。
将细胞在以下描述的适当的培养基中培养及于37℃，95～98％湿度和5％CO2中维持。将细胞每周常规传代2～3次。
BNCL-2：小鼠肝细胞系BNCL-2购自ATCC，及培养于含10％FBS+Glutamax I+非-必要的氨基酸+庆大霉素的DMEM(Sigma)。
Hepa1-6：小鼠肝细胞系Hepa1-6购自ATCC及培养于含10％FBS+Glutamax I+非-必要的氨基酸+庆大霉素的DMEM(Sigma)。
HepG2：人肝细胞系HepG2购自ATCC及培养于含10％FBS+Glutamax I+非-必要的氨基酸+庆大霉素的Eagle MEM(Sigma)。
HuH-7：人肝细胞系HepG2购自ATCC及培养于含10％FBS+Glutamax I+非-必要的氨基酸+庆大霉素的Eagle MEM(Sigma)。
【实施例5：体外模型：用反义寡核苷酸治疗】
细胞培养和转染：Huh-7和Hepa 1-6细胞接种于6-孔板，于37℃(5％CO2)，在补充了10％FBS，Glutamax I和庆大霉素的生长培养基中。当细胞达到60～70％汇合，将它们以一式两份用不同浓度的寡核苷酸(0.04～25nM)使用阳离子脂质体2000(对于Huh-7和Hepa1-6分别5μg/mL和10μg/ml)转染。转染基本上如由Dean等人所描述的进行(1994，JBC 269：16416-16424)。简言之，将细胞与阳离子脂质体在OptiMEM中预温育7min，然后是添加寡核苷酸至每孔1.5mL总体积的转染混合物。4小时后，除去转染混合物；将细胞洗涤及于37℃在适当的生长培养基中生长约20小时(mRNA分析和蛋白分析)。然后收获细胞，用于蛋白和RNA分析。
【实施例6：体外模型：RNA提取和cDNA合成】
【总RNA分离】
使用RNeasy mini试剂盒(Qiagen)分离总RNA。细胞用PBS洗涤，及将补充了1％巯基乙醇的细胞裂解缓冲液(RTL，Qiagen)直接添加到孔。几分钟之后，根据制造商的使用说明处理样品。
【第1链合成】
第1链合成使用OmniScript反转录酶试剂盒或M-MLV反转录酶(基本上如制造商(Ambion)描述)根据制造商的使用说明(Qiagen)进行。当使用OmniScript反转录酶时，将各样品0.5μg总RNA调至12μl及与0.2μl聚(dT)12～18(0.5μg/μl)(Life Technologies)，2μl dNTP混合物(5mM各)，2μl 10×RT缓冲液，0.5μl RNAguardTM RNA酶抑制剂(33U/mL，Amersham)和1μl OmniScript反转录酶混合，然后是于37℃温育60min和于93℃热灭活5min。
当使用随机十聚体及M-MLV-反转录酶(基本上如制造商(Ambion)描述)进行第1链合成时，将各样品0.25μg总RNA在H2O中调至10.8μl。添加2μl十聚体及2μl dNTP混合物(2.5mM各)。将样品加热到70℃经3min及立即在冰水中冷却及添加3.25μl的含有(2μl 10×RT缓冲液；1μl M-MLV反转录酶；0.25μl RNA酶抑制剂)的混合物。于42℃经60min合成cDNA，然后是于95℃经10min的加热灭活步骤，以及最终冷却到4℃。
【实施例7：筛选不同LNA寡核苷酸的结果】
用化合物SEQ ID NO：26～50处理后，在Huh-7细胞中，通过实时定量PCR测定apoB mRNA表达。数据标准化到GAPDH及标准化到模拟物对照(图1A和B)。
【实施例8：血清中的胆甾醇水平】
使用来自ABX Pentra的比色检定胆甾醇CP测量血浆中的总胆甾醇水平。酶促水解和氧化之后测量胆甾醇。将21.5μL水加入3μL血清。添加250μL试剂及在15min内以540nM的波长测量胆甾醇含量。对各动物的测量以一式两份进行。用对照化合物(ABX Pentra N对照)的稀释系列测试灵敏度和线性。通过减去背景测定胆甾醇水平，及相对于盐水处理的小鼠血清中的胆甾醇水平表示。
【体内研究】
在以下研究中，将LNA寡核苷酸施用于在标准喂食摄食的C57BL/6J雌性小鼠。
【实施例9：体内筛选不同LNA寡核苷酸的结果】
在此研究中，对小鼠以2种不同剂量水平(10mg/kg的SEQ ID NO：28，29，44和45)每周一次皮下施用LNA寡核苷酸而持续4周(总共5次施用)。每周一次采样血清和处死(最后施用后48小时)，以检查化合物对总胆甾醇的效应。
4种LNA寡核苷酸中的任何一种的施用导致施用之后第1周之内总胆甾醇显著减小。2周后，得到总胆甾醇的稳定状态，当施用之后1周时测量时(总胆甾醇40～65％减少)。但是，施用之后48小时测量总胆甾醇显示总胆甾醇进一步减少，如在第30天处死日观察的，总胆甾醇60～80％减少，指示施用之后2～3天对总胆甾醇的最大效应(图2)。
【实施例10：不同LNA寡核苷酸的重复的体内施剂的结果】
在此研究中，对小鼠每周一次皮下施用LNA寡核苷酸持续4周(总共5次施用)。以4种不同剂量水平(0.02，0.4，2和10mg/kg/周)将SEQ ID NO：45施剂，而以10mg/kg/周将SEQ ID NO：29和51施剂。每周一次采样血清和处死(最后施用后48小时)，以检查化合物对总胆甾醇的效应。
以10mg/kg/周的3种LNA寡核苷酸中的任一种的施用导致施用之后第1周之内总胆甾醇显著减少。分别2和4周后，当施用之后1周测量时，用全部3种化合物得到58和70％的总胆甾醇减少(图3A)。血清中的ALT水平的分析显示以10mg/kg/周剂量水平增加，但对于SEQ ID NO：29和45，其在正常范围之内，然而SEQ ID NO：51导致血清ALT水平5倍增加(图3B)。
【实施例11：单剂量的SEQ ID NO：29的作用的持续时间】
在第0天以不同剂量水平(1，2.5，5和10mg/kg)给小鼠施用一静脉内剂量的SEQ ID NO：29，及在第0，1，3，8，16，24和32天测量血清胆甾醇。施用寡核苷酸之后1天后，以5和10mg/kg得到对总胆甾醇的显著效应。在第3天测量对胆甾醇的最大效应；对于1，2.5，5和10mg/kg，总血清胆甾醇分别减少16％，36％，42％和70％。24天后，在5和10mg/kg剂量水平组中总胆甾醇水平仍显著减少13％和19％(图4A)。
在脂蛋白特征谱上展示对apoB的快降低效应。HDL/非-HDL比在施用寡核苷酸之后非常快增加。在施剂之后24小时后，比率以剂量依赖性方式以低剂量水平(1和2.5mg/kg)增加140～170％，且以高剂量水平(5和10mg/kg)增加325％(图4B)。
【实施例12：SEQ ID NO：29的每周或每两周重复的施剂一次】
每周一次或每两周一次以剂量水平1，2.5或5mg/kg对小鼠皮下施用SEQ ID NO：29持续70天。处理时期后，在处死之前7或21天回收小鼠。前5周期间每周一次采样血清，然后是从第35天～第63天每两周采样和从第63天～第91天再次每周采样。在每周施剂的组中，在第14天(2剂后)总血清胆甾醇达到对于2.5和5mg/kg剂量水平减少约30～40％的持续的水平，然而1mg/kg剂量水平在处理时期期间给出总胆甾醇仅10％减少的平均持续的效应(图5A)。降低施剂频度到每两周施剂，自第35天之后得到总胆甾醇的持续的减少，对于2.5和5mg/kg剂量水平，以30％和20％。1mg/kg剂量水平不给出任何总胆甾醇减少(图5B)。
回收时期期间，效应降低及在每两周施剂的组中在第91天对于全部剂量水平胆甾醇返回到基线。在每周施剂的组中，在回收期末2.5和5mg/kg组仍具有血清总胆甾醇的13～17％减少。
在处理结束之后1及3周小鼠处死，将肝采样用于qPCR分析，以测定肝脏apoB mRNA的表达。每周和每两周施剂导致apoB mRNA表达的剂量依赖性下调(图6)。每周施剂5mg/kg给出最高效应，apoBmRNA减少75％，然而每两周施剂给63％减少。回收3周后，仅2.5和5mg/kg/周组和5mg/kg/每两周具有相比对照肝脏apoB水平的可测量的减少；分别25％，40％和33％。
在第77和91天测量血清ALT水平。在ALT中观察到相比盐水对照无显著差异，在第77天也是，在第91天也是(图7)。
Figure IDA0000118525860000011
Figure IDA0000118525860000021
Figure IDA0000118525860000031
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Figure IDA0000118525860000051
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Figure IDA0000118525860000091
Figure IDA0000118525860000101
Figure IDA0000118525860000111
Figure IDA0000118525860000121
Figure IDA0000118525860000131
Figure IDA0000118525860000141
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.单链长度在10～30个核苷酸之间的寡聚体，其包含总共10～30个核苷酸之间的连续的核苷酸序列，
其中所述连续的核苷酸序列至少80％同源于对应于哺乳动物APO-B100基因或mRNA，诸如人APO-B100mRNA的反向互补体或其天然存在的变体的区，且
其中连续的核苷酸序列至少80％同源于对应于SEQ ID NO：4，3，19，20之任何一个或SEQ ID NO：1～25之任何一个的区。
2.权利要求1的寡聚体，其中所述连续的核苷酸序列与人APO-B100mRNA的对应区的反向互补体不包含错配或包含不多于1个或2个错配。
3.权利要求1～2中任一项的寡聚体，其中所述寡聚体的核苷酸序列由连续的核苷酸序列组成。
4.权利要求1～3中任一项的寡聚体，其中所述连续的核苷酸序列长度在10～18个核苷酸之间。
5.权利要求1～4中任一项的寡聚体，其中所述连续的核苷酸序列包含核苷酸类似物。
6.权利要求5的寡聚体，其中所述核苷酸类似物是糖修饰的核苷酸，诸如选自下列的糖修饰的核苷酸：锁核酸(LNA)单元；2’-O-烷基-RNA单元，2’-OMe-RNA单元，2’-氨基-DNA单元和2’-氟-DNA单元。
7.权利要求5的寡聚体，其中所述核苷酸类似物是LNA。
8.权利要求5～7中任一项的寡聚体，其为间隔聚体。
9.权利要求1～8中任一项的寡聚体，其中寡聚体由SEQ ID NO：26～50之任何一个组成或包含SEQ ID NO：26～50之任何一个。
10.权利要求1～9中任一项的寡聚体，其中寡聚体由SEQ ID NO：29，28，44或45之任何一个组成或包含SEQ ID NO：29，28，44或45之任何一个。
11.权利要求1～10中任一项的寡聚体，其抑制表达APO-B100基因或mRNA的细胞中APO-B100基因或mRNA的表达。
12.缀合物，其包含权利要求1～11中任一项的寡聚体，及共价附接于所述寡聚体的至少一个非-核苷酸或非-多核苷酸部分。

Claims (17)

1.长度在10～30个核苷酸之间的寡聚体，其包含总共10～30个核苷酸之间的连续的核苷酸序列，
其中所述连续的核苷酸序列至少80％同源于对应于哺乳动物APO-B100基因或mRNA，诸如人APO-B100mRNA的反向互补体或其天然存在的变体的区，且
其中连续的核苷酸序列至少80％同源于对应于SEQ ID NO：4，3，19，20之任何一个或SEQ ID NO：1～25之任何一个的区。
2.权利要求1的寡聚体，其中所述连续的核苷酸序列与人APO-B100mRNA的对应区的反向互补体不包含错配或包含不多于1个或2个错配。
3.权利要求1～2中任一项的寡聚体，其中所述寡聚体的核苷酸序列由连续的核苷酸序列组成。
4.权利要求1～3中任一项的寡聚体，其中所述连续的核苷酸序列长度在10～18个核苷酸之间。
5.权利要求1～4中任一项的寡聚体，其中所述连续的核苷酸序列包含核苷酸类似物。
6.权利要求5的寡聚体，其中所述核苷酸类似物是糖修饰的核苷酸，诸如选自下列的糖修饰的核苷酸：锁核酸(LNA)单元；2′-O-烷基-RNA单元，2′-OMe-RNA单元，2′-氨基-DNA单元，及2′-氟-DNA单元。
7.权利要求5的寡聚体，其中所述核苷酸类似物是LNA。
8.权利要求5～7中任一项的寡聚体，其为间隔聚体。
9.权利要求1～8中任一项的寡聚体，其中寡聚体由SEQ ID NO：26～50之任何一个组成，或包含SEQ ID NO：26～50之任何一个。
10.权利要求1～9中任一项的寡聚体，其中寡聚体由SEQ ID NO：29，28，44或45之任何一个组成，或包含SEQ ID NO：29，28，44或45之任何一个。
11.权利要求1～10中任一项的寡聚体，其抑制表达APO-B100基因或mRNA的细胞中APO-B100基因或mRNA的表达。
12.缀合物，其包含：
权利要求1～11中任一项的寡聚体，及
共价附接于所述寡聚体的至少一个非-核苷酸或非-多核苷酸部分。
13.药物组合物，其包含：
权利要求1～11中任一项的寡聚体，或权利要求12的缀合物，及
药学可接受的稀释剂，载体，盐或佐剂。
14.权利要求1～11中任一项的寡聚体，或权利要求12的缀合物，其用作药物，诸如用于治疗与载脂蛋白B活性关联的疾病，诸如在非限制性例中，不同类型的HDL/LDL胆甾醇不平衡；血脂异常，例如，家族性混合性高脂血症(FCHL)，获得性高脂血症，高胆固醇血症，耐抑制素的高胆固醇血症；冠状动脉疾病(CAD)，冠状心脏病(CHD)，动脉粥样硬化。
15.权利要求1～11中任一项的寡聚体，或权利要求12中定义的缀合物，用于生产用于治疗与载脂蛋白B活性关联的疾病的药物的用途，所述疾病诸如在非限制性例中，不同类型的HDULDL胆甾醇不平衡；血脂异常，例如，家族性混合性高脂血症(FCHL)，获得性高脂血症，高胆固醇血症，耐抑制素的高胆固醇血症；冠状动脉疾病(CAD)，冠状心脏病(CHD)，动脉粥样硬化。
16.治疗与载脂蛋白B活性关联的疾病的方法，
所述疾病诸如在非限制性例中，不同类型的HDL/LDL胆甾醇不平衡；血脂异常，例如，家族性混合性高脂血症(FCHL)，获得性高脂血症，高胆固醇血症，耐抑制素的高胆固醇血症；冠状动脉疾病(CAD)，冠状心脏病(CHD)，动脉粥样硬化，
所述方法包括给患有或可能患有与载脂蛋白B活性关联的疾病的患者施用有效量的权利要求1～11中任一项的寡聚体，或权利要求12的缀合物，或权利要求13的药物组合物，
所述疾病诸如在非限制性例中，不同类型的HDL/LDL胆甾醇不平衡；血脂异常，例如，家族性混合性高脂血症(FCHL)，获得性高脂血症，高胆固醇血症，耐抑制素的高胆固醇血症；冠状动脉疾病(CAD)，冠状心脏病(CHD)，动脉粥样硬化。
17.抑制表达APO-B100的细胞中的APO-B100的方法，所述方法包括给所述细胞施用权利要求1～11中任一项的寡聚体，或权利要求12的缀合物，以便抑制所述细胞中的APO-B100。
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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