CN103946380A - 用于调控smn2剪接的化合物 - Google Patents
用于调控smn2剪接的化合物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103946380A CN103946380A CN201280055524.XA CN201280055524A CN103946380A CN 103946380 A CN103946380 A CN 103946380A CN 201280055524 A CN201280055524 A CN 201280055524A CN 103946380 A CN103946380 A CN 103946380A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- oligomer
- nucleotide
- seq
- group
- nucleotide sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102100021947 Survival motor neuron protein Human genes 0.000 title abstract description 42
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title abstract description 32
- 101000617738 Homo sapiens Survival motor neuron protein Proteins 0.000 title abstract description 15
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 36
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 34
- 208000002320 spinal muscular atrophy Diseases 0.000 claims abstract description 33
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 387
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 349
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 37
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 13
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 9
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 9
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 8
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 abstract description 24
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 23
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 20
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 18
- 101100203485 Homo sapiens SMN2 gene Proteins 0.000 abstract description 6
- 102000053564 human SMN2 Human genes 0.000 abstract description 6
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 abstract description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 abstract 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 abstract 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 59
- 102000047499 Survival of Motor Neuron 2 Human genes 0.000 description 56
- 108700024745 Survival of Motor Neuron 2 Proteins 0.000 description 56
- 239000002585 base Substances 0.000 description 54
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 40
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 40
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 35
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical group NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 29
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 29
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 27
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 25
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 22
- -1 uridylic Chemical compound 0.000 description 22
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 21
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 19
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 19
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 19
- 150000002431 hydrogen Chemical group 0.000 description 18
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 18
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 description 17
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 16
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 16
- 125000002769 thiazolinyl group Chemical group 0.000 description 16
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 12
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 12
- 125000004103 aminoalkyl group Chemical group 0.000 description 11
- 230000008859 change Effects 0.000 description 11
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 10
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 9
- 208000032225 Proximal spinal muscular atrophy type 1 Diseases 0.000 description 8
- 208000026481 Werdnig-Hoffmann disease Diseases 0.000 description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 8
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 8
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 8
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 8
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 8
- 125000001072 heteroaryl group Chemical group 0.000 description 8
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 8
- 208000032471 type 1 spinal muscular atrophy Diseases 0.000 description 8
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 7
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 7
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 7
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 6
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 6
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 6
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 6
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical group C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 6
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 6
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 6
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 6
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 6
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 6
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012625 DNA intercalator Substances 0.000 description 5
- 241000218636 Thuja Species 0.000 description 5
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 5
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 5
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 230000009920 chelation Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 description 5
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 5
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 5
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 5
- HZVOZRGWRWCICA-UHFFFAOYSA-N methanediyl Chemical compound [CH2] HZVOZRGWRWCICA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 5
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 description 5
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 5
- 230000003584 silencer Effects 0.000 description 5
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 5
- 125000004642 (C1-C12) alkoxy group Chemical group 0.000 description 4
- XQCZBXHVTFVIFE-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-hydroxypyrimidine Chemical compound NC1=NC=CC(O)=N1 XQCZBXHVTFVIFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000005947 C1-C6 alkylsulfonyloxy group Chemical group 0.000 description 4
- 125000005129 aryl carbonyl group Chemical group 0.000 description 4
- 125000005161 aryl oxy carbonyl group Chemical group 0.000 description 4
- 125000004104 aryloxy group Chemical group 0.000 description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 4
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 4
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000005223 heteroarylcarbonyl group Chemical group 0.000 description 4
- 125000005553 heteroaryloxy group Chemical group 0.000 description 4
- 125000005226 heteroaryloxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 4
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 4
- CFHIDWOYWUOIHU-UHFFFAOYSA-N oxomethyl Chemical compound O=[CH] CFHIDWOYWUOIHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 4
- 125000000020 sulfo group Chemical group O=S(=O)([*])O[H] 0.000 description 4
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 4
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N urea group Chemical group NC(=O)N XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- YBANXOPIYSVPMH-UHFFFAOYSA-N 3-[[di(propan-2-yl)amino]-[6-[[(4-methoxyphenyl)-diphenylmethyl]amino]hexoxy]phosphanyl]oxypropanenitrile Chemical group C1=CC(OC)=CC=C1C(NCCCCCCOP(OCCC#N)N(C(C)C)C(C)C)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 YBANXOPIYSVPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 3
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 3
- 101150015954 SMN2 gene Proteins 0.000 description 3
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 3
- 238000006356 dehydrogenation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 3
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 3
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 3
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 3
- MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 2-aminopurine Chemical compound NC1=NC=C2N=CNC2=N1 MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HBJGQJWNMZDFKL-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-7h-purin-6-amine Chemical compound NC1=NC(Cl)=NC2=C1NC=N2 HBJGQJWNMZDFKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000189 2-deoxyribosyl group Chemical group C1(C[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 2
- LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 5-bromouracil Chemical compound BrC1=CNC(=O)NC1=O LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VKKXEIQIGGPMHT-UHFFFAOYSA-N 7h-purine-2,8-diamine Chemical compound NC1=NC=C2NC(N)=NC2=N1 VKKXEIQIGGPMHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003601 C2-C6 alkynyl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000017013 Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein A1 Human genes 0.000 description 2
- 108010014594 Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein A1 Proteins 0.000 description 2
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 2
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- 125000003282 alkyl amino group Chemical group 0.000 description 2
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 125000005982 diphenylmethyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])(*)C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 229930182478 glucoside Natural products 0.000 description 2
- 150000008131 glucosides Chemical class 0.000 description 2
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 230000002969 morbid Effects 0.000 description 2
- 150000003014 phosphoric acid esters Chemical class 0.000 description 2
- 229920000233 poly(alkylene oxides) Polymers 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 2
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- BHQCQFFYRZLCQQ-UHFFFAOYSA-N (3alpha,5alpha,7alpha,12alpha)-3,7,12-trihydroxy-cholan-24-oic acid Natural products OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 BHQCQFFYRZLCQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HWPZZUQOWRWFDB-UHFFFAOYSA-N 1-methylcytosine Chemical compound CN1C=CC(N)=NC1=O HWPZZUQOWRWFDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ABEXEQSGABRUHS-UHFFFAOYSA-N 16-methylheptadecyl 16-methylheptadecanoate Chemical compound CC(C)CCCCCCCCCCCCCCCOC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC(C)C ABEXEQSGABRUHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BSYNRYMUTXBXSQ-FOQJRBATSA-N 59096-14-9 Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1[14C](O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-FOQJRBATSA-N 0.000 description 1
- MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 9H-purine-2,6-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical group [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004380 Cholic acid Substances 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 238000006117 Diels-Alder cycloaddition reaction Methods 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102100030011 Endoribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010093099 Endoribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- HEFNNWSXXWATRW-UHFFFAOYSA-N Ibuprofen Chemical compound CC(C)CC1=CC=C(C(C)C(O)=O)C=C1 HEFNNWSXXWATRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000764238 Isis Species 0.000 description 1
- MFGOTAHWOBKNNU-XMHGGMMESA-N Isodigeranyl Chemical group CC(C)=CCC\C(C)=C\CC(C)(C=C)CCC=C(C)C MFGOTAHWOBKNNU-XMHGGMMESA-N 0.000 description 1
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- REYJJPSVUYRZGE-UHFFFAOYSA-N Octadecylamine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCN REYJJPSVUYRZGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 1
- 208000004756 Respiratory Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical group [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010045545 Univentricular heart Diseases 0.000 description 1
- XUIONXHIPYMDMA-KIUQBJHFSA-N [(3S,8S,9S,10R,13S,14S,17R)-16-hexyl-3-hydroxy-10,13-dimethyl-17-[(2R)-6-methylheptan-2-yl]-1,2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,17-dodecahydrocyclopenta[a]phenanthren-16-yl] carbamate Chemical group C(CCCCC)C1([C@@H]([C@]2(CC[C@@H]3[C@]4(CC[C@@H](CC4=CC[C@H]3[C@@H]2C1)O)C)C)[C@H](C)CCCC(C)C)OC(=O)N XUIONXHIPYMDMA-KIUQBJHFSA-N 0.000 description 1
- XVIYCJDWYLJQBG-UHFFFAOYSA-N acetic acid;adamantane Chemical group CC(O)=O.C1C(C2)CC3CC1CC2C3 XVIYCJDWYLJQBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 229940127003 anti-diabetic drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003472 antidiabetic agent Substances 0.000 description 1
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 208000021024 autosomal recessive inheritance Diseases 0.000 description 1
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 1
- 125000002619 bicyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N cholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N 0.000 description 1
- 229960002471 cholic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019416 cholic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N deoxycholic acid Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- GTZOYNFRVVHLDZ-UHFFFAOYSA-N dodecane-1,1-diol Chemical group CCCCCCCCCCCC(O)O GTZOYNFRVVHLDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 1
- 230000008482 dysregulation Effects 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000019439 ethyl acetate Nutrition 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000000219 ethylidene group Chemical group [H]C(=[*])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 125000005313 fatty acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 229960001680 ibuprofen Drugs 0.000 description 1
- 238000005417 image-selected in vivo spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000012739 integrated shape imaging system Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical group 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 125000004184 methoxymethyl group Chemical group [H]C([H])([H])OC([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000002161 motor neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 201000000585 muscular atrophy Diseases 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 208000018360 neuromuscular disease Diseases 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000913 palmityl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 150000002972 pentoses Chemical group 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N phenylmethyl ester of formic acid Natural products O=COCC1=CC=CC=C1 UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229920000768 polyamine Chemical group 0.000 description 1
- 229920000151 polyglycol Chemical group 0.000 description 1
- 239000010695 polyglycol Chemical group 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 1
- 201000004193 respiratory failure Diseases 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 150000003432 sterols Chemical group 0.000 description 1
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical group [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 125000003080 thiophosphoric acid ester group Chemical group 0.000 description 1
- 101150058668 tra2 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-O triethylammonium ion Chemical compound CC[NH+](CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 125000004044 trifluoroacetyl group Chemical group FC(C(=O)*)(F)F 0.000 description 1
- 125000002948 undecyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/11—Antisense
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/315—Phosphorothioates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
- C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
- C12N2310/3235—Chemical structure of the sugar modified ring structure having the O of the ribose replaced by another atom
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/30—Special therapeutic applications
- C12N2320/33—Alteration of splicing
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Neurology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及寡聚体化合物(寡聚体)，其以细胞中编码人SMN2的核酸为靶标，引起对SMN2mRNA剪接的调控，并且其有利于全长SMN2mRNA而非功能差的截短转录本SMN2Δ7。SMNA7mRNA表达的降低和/或全长SMN2mRNA表达的升高有利于治疗与异常形式的SMN2(特别是SMN2Δ7)过表达或以不期望的高水平存在相关的疾病或失调，如脊髓性肌萎缩症(SMA)。
Description
技术领域
本发明涉及寡聚体化合物(寡聚体)，其针对运动神经元2(SMN2)RNA的存活，引起对SMN2mRNA剪接的调控。拒信，对SMN2剪接的调控有益于治疗脊髓性肌萎缩症(SMA)。
背景技术
脊髓性肌萎缩症(SMA)是一种常染色体隐性遗传的神经肌肉疾病，其特征在于脊髓中的运动神经元发生退化，导致肢体进行性无力，之后发生肌肉萎缩并死于呼吸衰竭。SMA是儿童早期死亡最常见的遗传诱因。根据发病年龄和临床发病病程，SMA患者通常被分为I至III型。然而，SMA的所有三种类型都是由运动神经元存活基因(SMN1)的突变引起的；96％的SMA患者表现出该基因的突变。参见文献“Wirth,B.(2000),Human Mutation,15:228–237”。在同一染色体位置(5q13)存在该基因的两个几乎相同的拷贝，SMN1和SMN2。SMN1的纯合功能缺失突变或纯合缺失是引起SMA的原因；相反，SMN2纯合缺失没有临床表型，并且见于大约5％的健康对照中。SMN2的存在不足以能减轻SMN1缺失的影响，这是因为SMN1和SMN2之间单个核苷酸的差异导致SMN2外显子7跳跃(skipping)，并且产生基本上不具有功能的蛋白质，其称为SMNΔ7。SMA疾病的严重程度与SMN2基因所存在的基因组拷贝数成反比。
SMA研究的主要目标为提高来自于SMN2的功能性SMN蛋白的表达。通过调控剪接来增加SMN2外显子7的包含(inclusion)已经作为提高SMA中的全长SMN蛋白水平的手段而得到了深入的研究。
位于外显子中的信号在剪接过程中可对该外显子的识别有积极或消极作用。外显子剪接增强子(ESE)促进剪接，并且通常是内含子被有效去除所需的，而外显子剪接沉默子(ESS)抑制剪接。广泛认为SMN2和SMN1之间的单个核苷酸的差异为SMN2外显子7跳跃的主要原因，其很可能是通过破坏外显子剪接增强子(ESE)和/或使其转变为外显子剪接沉默子(ESS)结合hnRNP A1而导致所述跳跃的[Kashima等，(2003)Nature Gen34:460-463；Cartegni等，(2006)Am J Hum Genet.January；78(1):63–77；Hua等，(2007)PLoS5(4):e73]。
另外，已经在外显子7及其周围的内含子序列中定位到一些顺式作用剪接调控元件(总结在图1中)。在内含子6中，存在两个已经被报道的沉默子序列，一个被命名为ISS-E1[Miyajima等，(2002)J.Biol.Chem277:23271-23277]，另一个为靠近内含子6的3’ss处的未被命名的沉默子[Hua等，(2008)Am J Hum Genet82:834-848]。
外显子7中的另一个增强子(Tra2β结合位点)对外显子7的包含也是至关重要的。外显子7中的末端茎环状结构(TSL-2)与U1snRNP竞争补充至内含子7的5’ss[Singh等，(2006)Nucl.AcidsRes.35:371-389；Hua等，2007]，从而增强了外显子7跳跃。在内含子7中，剪接沉默子ISS-N1增强了外显子7跳跃，并且其特征为串联的hnRNPA1/A2基序(Singh2006；Hua2008)。第二个基序ISE-E2最初被描述为外显子7剪接增强子[Miyajima等，(2003)J.Biol.Chem278:15825-15831]，但是后来在靠近的位置定位了hnRNP A1结合位点。所述结合位点由SMN1和SMN2之间的A→G转换产生，并且表明该元件具有双功能的特点[Kashima等，(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.104:3426-3431]。
由于SMN蛋白自身在前体mRNA剪接通路中具有功能，已经提出该蛋白可能影响其自身的前体mRNA的剪接。Jodelka等已经表明，SMN蛋白的过量一部分上决定了SMN2选择性剪接的结果。他们的结果发现了SMN表达中的反馈回路，通过该反馈回路，低的SMN蛋白水平加强SMN2外显子7跳跃，由此导致SMN蛋白进一步减少。这些结果使这些作者表明，SMN蛋白数量的适度增加可能会导致SMN表达的不成比例的大量增加，因此可能达到显著的治疗效果。参见文献“Jodelka,F.M.等，Hum Mol Genet.2010December15；19(24):4906–4917”。
人们已经做出了一些努力以试图在体外实验以及小鼠体内模型中利用寡核苷酸调控SMN2剪接。有专利申请描述了特异性修饰的2'-甲氧基乙氧基硫代磷酸酯寡核苷酸广泛地靶向外显子7中的序列以及该外显子上游和下游的60个核苷酸。这包括已经公开的区域ISS(内含子6)、外显子7中的ESE/ISS和TSL2、以及内含子7中的ISS-N1(ISIS&Krainer等，patent WO/2007/002390A2；Hua等，2008)。所得的前导寡核苷酸(具有硫代磷酸酯骨架的18聚体均一2’-MOE寡聚体)靶向ISS-N1，并且得到进一步研究并被引入小鼠模型中(WO/2010/120820A1、WO/2010/148249A1)，以及食蟹猕猴中，其中表明，单次心室内注射能将推定治疗水平的寡核苷酸输送至脊髓的所有区域。参见文献“Passini等，(2011)3:72ra18”。Singh等使用了针对ISS-N1区域的集中方法[US20070292408,Singh等，(2009)RNA Biol.6:341-350]。特别地，描述了短8聚体2’-O-甲基硫代磷酸酯寡核苷酸，其靶向ISS-N1并能有效地提高外显子7的包含。
此外，还有使用靶向ISS-E1(内含子6)的单个2'-O-甲基硫代磷酸酯寡核苷酸和靶向ISE/ISS-E2(内含子7)的单个2'-O-甲基硫代磷酸酯寡核苷酸的体外数据。发现第一个(“oligo-element1”,Miyajima2002)能增加外显子7的包含，并且发现第二个(靶向内含子7中的“元件2”)能减少外显子7的包含，这与本文的观察结果形成对比[Miyaso等，(2003)J.BIol.Chem278:15825-15831]。Baughan等使用了双功能2'-O-甲基寡核苷酸以将剪接支持SR-蛋白补充到内含子6中的ISS-E1元件上[Baughan等，(2009)Hum Mol Ther.18:1600-1611]。
尽管作出了广泛的努力，然而没有发现作为SMA治疗手段的反义化合物。认为本发明的LNA寡聚体特别适于剪接的转换，因此认为其在SMN2剪接调控中具有治疗应用，由此改善这种遗传病症的症状。
发明内容
本发明提供了一种长度为10至30个核苷酸的寡聚体，包含至少一个锁核酸(LNA)单元，并且还包含长度为10至30个核碱基的核碱基序列，其中所述核碱基序列与Genbank登陆号NG_008728(SEQ ID NO:167)或其天然变体中的核苷酸26231-26300、31881-31945或32111-32170的相应区域至少80％互补。
所述寡聚体可调控SMN2mRNA的剪接，导致全长mRNA转录本的水平升高。所述寡聚体可以为不引发RNAse H切割的寡聚体。
在一些实施方案中，所述寡聚体序列与Genbank登陆号NG_008728(SEQ ID NO:167)中的核苷酸26231-26246、26274-26300、31890-31905、31918-31945或32115-32162的相应区域至少80％互补。在其他实施方案中，所述寡聚体序列与Genbank登陆号NG_008728(SEQ ID NO:167)中的核苷酸26231-26300至少80％互补。所述寡聚体可以具有与SEQ ID NO:1、2、3-16、19-20、22、24-34、35-38、40、41、45-49、60-80或83的序列有至少80％的同一性的核碱基序列，并且可以具有SEQ ID NO:1、5、9、11、12、26、27、28、29、30、34、40、53-59、62、63、65、66、69-77或79。
在一些实施方案中，所述寡聚体调控剪接以使全长SMN2转录本的量增加至比对照高110％、比对照高120％、比对照高130％、比对照高140％、比对照高150％、比对照高160％、比对照高170％、比对照高180％、比对照高190％、或比对照高200％。所述寡聚体的长度可为12至16个核苷酸，并且可以为混合物聚体(mixmer)。
本发明还提供了一种缀合物，其包含前述的寡聚体、以及至少一个共价连接至所述寡聚体的非核苷酸或非多核苷酸部分。所述寡聚体或所述缀合物可用作例如用于治疗脊髓性肌萎缩症中的药物，所述脊髓性肌萎缩症包括I型、II型或III型脊髓性肌萎缩症。
本发明还提供了一种药物组合物，其包含前述的寡聚体或缀合物、以及可药用的稀释剂、载体、盐或辅料。本发明还提供了一种治疗脊髓性肌萎缩症的方法，所述方法包括对患有脊髓性肌萎缩症的患者或被认为很可能会患脊髓性肌萎缩症的患者施用有效量的前述寡聚体、缀合物或药物组合物。
本发明还提供了一种调控表达SMN2mRNA的人细胞中的SMN2mRNA剪接的方法，所述方法利用本发明所提供的寡聚体、缀合物或药物组合物。例如，所述方法可在体内或体外进行。
附图说明
图1为示出靶序列上的人SMN2基因的外显子6、7和8(灰色方框)、内含子6和7(分别位于外显子6和7之间以及外显子7和8之间)、5’和3’剪接位点(ss)以及一系列剪接调节序列(ISS、ESE/ESS、ISE/ISS等)的示意性线图。
发明详述
寡聚体
本发明涉及寡聚体化合物(本文称为寡聚体)，其用于调节编码人SMN2的核酸分子(例如Genbank登陆号NG_008728中的SMN2核酸)和所述编码人SMN2的核酸分子的天然变体的功能。Genbank登陆号NG_00828为编码人SMN2转录本变体d的基因组核酸序列，其包括所有外显子。
在本发明中的术语“寡聚体”是指由两个或更多个核苷酸共价连接形成的分子(即，寡核苷酸)。在这里，单个核苷酸(单元)也可称为单体或单元。在一些实施方案中，术语“核苷”、“核苷酸”、“单元”和“单体”可交换使用。应当理解，当涉及核苷酸或单体的序列时，其是指碱基(例如A、T、G、C或U)的序列。
寡聚体由长度为10–50个核苷酸(例如长度为10–30个核苷酸)的连续核苷酸序列组成或包含长度为10–50个核苷酸(例如长度为10–30个核苷酸)的连续核苷酸序列。
在多个实施方案中，本发明的化合物不包含RNA(单元)。优选地，根据本发明的化合物为线形分子或被合成为线形分子。寡聚体为单链分子，并且优选不包含与同一寡聚体中的相应区域互补的(即，能够形成双链体)、(例如)具有至少3、4或5个连续核苷酸的短区域。在一些实施方案中，寡聚物基本上不为双链，即，不是siRNA。在多个实施方案中，本发明的寡聚体可完全由连续的核苷酸区域组成。因此，寡聚体基本上不自我互补。
靶标
合适的是，本发明的寡聚体能够调控人SMN2mRNA的剪接。在这一方面，本发明的寡聚体能够影响SMN2的异常剪接(通常在人细胞中)。可以理解，“异常”是指过度的、不需要的或不恰当的。
本发明的寡聚体结合至SMN2核酸，并且相对于对照(例如，未处理的或空处理的对照)而言，提高了全长SMN2mRNA的水平(即提高至大于对照水平的100％)，并且更优选的是，与正常表达水平(例如不存在寡聚体或缀合物时的表达水平)相比，使全长SMN2RNA的水平提高至至少130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％。优选地，全长SMN2mRNA的水平被提高至对照的至少150％，更优选200％，即增加了内含子7的包含。在一些实施方案中，随着全长SMN2mRNA的水平的升高，SMN2Δ7mRNA的水平降低(外显子7的包含降低)。在其他实施方案中，全长SMN2mRNA和SMN2Δ7mRNA都增加。
在一些实施方案中，本发明的寡聚体被施用给需要调控SMN2mRNA剪接的哺乳动物，优选人。寡聚体的剂量可以(例如)在约0.1mg/kg体重和约100mg/kg体重之间，例如在每天0.1mg/kg体重和约1mg/kg体重之间，或在每天1.0mg/kg体重和约10mg/kg体重之间。因此，施用给70kg的人时，在一些实施方案中，剂量范围可为每天约7mg至0.7g。在一些实施方案中，寡聚体的各剂量可(例如)在约0.1mgs/kg或1mg/kg和约10mg/kg或20mg/kg之间(即在(例如)0.1mg/kg和20mg/kg之间的范围，例如在1mg/kg和12mg/kg之间)。因此，个体剂量可为例如约0.2mg/kg，如约0.3mg/kg、如约0.4mg/kg、如约0.5mg/kg、如约0.6mg/kg、如约0.7mg/kg、如约0.8mg/kg、如约0.9mg/kg、如约1mg/kg、如约2mg/kg、如约3mg/kg、如约4mg/kg、如约5mg/kg、如约6mg/kg、如约7mg/kg、如约8mgs/kg、如约9mg/kg、如约10mg/kg。在一些实施方案中，寡聚体的剂量低于7mg/kg，如低于5mg/kg或低于3mg/kg。在一些实施方案中，寡聚体的剂量高于0.5mg/kg，如高于1mg/kg。在一些实施方案中，每次施用寡聚体的时间间隔可为(例如)选自由1天、2天、3天、4天、5天、6天和一周构成的组。在一些实施方案中，施用的时间间隔为至少每两天一次，如至少每三天一次，如至少每四天一次，如至少每五天一次，如至少每六天一次，如至少每周一次，如至少每两周一次(两周一次)或至少每三周一次或每四周一次，或至少每月一次。
在一些实施方案中，当使用0.04nM至25nM，例如0.8nM至20nM本发明的化合物时，如0.5nM、1nM、5nM、20nM或25nM时，可以观察到所述调控。在其他实施方案中，当使用5nM至25nM，例如8nM至20nM本发明的化合物时，如1nM、5nM、20nM或25nM时，可以观察到所述调控。全长SMN2的剪接调控可由测定SMN蛋白质水平而确定，例如通过诸如这样的方法，进行SDS-PAGE，然后用针对靶蛋白的合适的区域的合适的抗体进行蛋白质印迹(western blotting)。可供选择地，剪接的调控可通过测量mRNA的水平确定，例如通过northern印迹、或使用合适的探针(如针对全长mRNA和/或Δ7mRNA)的定量RT-PCR。
如本文所示，在一些实施方案中，细胞类型可为来自患有SMA的人类患者的细胞，如SMA成纤维细胞系，如GM03813(Corriell医学研究研究所，卡姆登NJ)。在一些实施方案中，所用的寡聚体浓度可为5nM。在一些实施方案中，所用的寡聚体浓度可为25nM。在一些实施方案中，所用的寡聚体浓度可为0.5nM或1nM。如实施例所示，所述寡聚体的浓度通常用于利用转染(脂传染(Lipofection))的体外细胞试验中。在不存在转染试剂时，实现靶标下调所需的寡聚体浓度通常在1μM和25μM之间，如5μM。
因此，本发明提供了调控表达SMN2mRNA的细胞中的SMN2mRNA的剪接的方法，所述方法包括对所述细胞施用根据本发明的寡聚体或缀合物，以调控所述细胞中的SMN2mRNA的剪接。合适地，所述细胞为人细胞，如来自SMA患者的细胞。在一些实施方案中，所述施用可在体外进行。在一些实施方案中，所述施用可在体内进行。
本文所用的术语“靶核酸”是指编码人SMN多肽的DNA或RNA，如Genbank登陆号NG_008728或其天然变体，以及源于它们的RNA核酸，优选为RNA，包括前体mRNA和成熟mRNA。在一些实施方案中，例如当用于研究或诊断时，所述“靶核酸”可为来自上述DNA或RNA核酸靶标的cDNA或合成寡核苷酸。根据本发明的寡聚体能够与靶核酸杂交。应当认识到，Genbank Acc.No.NG_008728为基因组DNA序列，因此对应于前体mRNA靶序列，但是cDNA序列中的胸腺嘧啶替代了尿嘧啶。靶向前体mRNA优选用于剪接的调控。应当理解，在剪接调控的语境下，“靶向mRNA”和“靶向RNA”旨在意为“靶向前体mRNA”。“SMN2剪接”应被理解为是指从SMN2前体mRNA中剪接出内含子以产生成熟SMN2mRNA的成熟过程。
术语“其天然变体”是指核酸序列的SMN多肽的变体，其天然地存在于规定的分类群(即，人)中。通常，当涉及多核苷酸的“天然变体”时，该术语还可包括编码SMN的基因组DNA的由染色体易位或复制所得的任意等位基因变体，以及来源于它们的RNA(如mRNA)。“天然变体”还可包括来自SMN2mRNA选择性剪接的变体。当涉及具体的多肽序列时，(例如)该术语还包括该蛋白的天然存在的形式，因此其可通过如共转录修饰或转录后修饰而被加工，如信号肽切割、蛋白水解切割、糖基化等。
序列
寡聚体包含对应于存在于NG_008728中的核苷酸序列的反向互补序列的连续核苷酸序列或由对应于存在于NG_008728中的核苷酸序列的反向互补序列的连续核苷酸序列组成。因此，例如，寡聚体可包含选自由SEQ ID NO:1-83构成的组中的序列或由选自由SEQ IDNO:1-83构成的组中的序列组成，其中所述寡聚体(或其连续的核苷酸部分)可任选相对于所述所选序列存在一个、两个或三个错配。
寡聚体可包含或由与编码人SMN的核酸(即，Genbank登陆号NG_008728)的等价区域完全互补(100％互补)的连续核苷酸序列组成。因此，寡聚体可包含或由反义核苷酸序列组成。然而，在一些实施方案中，寡聚体在与靶序列杂交时可以容忍1、2、3或4(或更多)个错配，并且仍然充分结合至靶标从而表现出期望的作用，即调控靶序列的剪接。错配可(例如)通过寡聚体核苷酸序列长度的增加得以补偿和/或通过存在于核苷酸序列中的核苷酸类似物(如LNA)数目的增加得以补偿。
在一些实施方案中，在与靶序列(如与编码人SMN的核酸的相应区域)杂交时，连续核苷酸序列包含不大于3个错配，如不大于2个错配。在一些实施方案中，在与靶序列(如与编码人SMN的核酸的相应区域)杂交时，连续核苷酸序列包含不大于1个错配。
本发明的寡聚体的核苷酸序列优选与选自由SEQ ID NO:1-83构成的组中的相应序列有至少80％的同源性，如至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％的同源性，至少97％的同源性，至少98％的同源性，或至少99％的同源性，如100％的同源性(相同)。
本发明的寡聚体的核苷酸序列优选与NG_008728中存在的相应序列的反向互补序列有至少80％的同源性，如至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％的同源性，至少97％的同源性，至少98％的同源性，或至少99％的同源性，如100％的同源性(相同)。
本发明的寡聚体的核苷酸序列优选与NG_008728中存在的子序列有至少80％的互补性，如至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％的互补性，至少97％的互补性，至少98％的互补性，或至少99％的互补性，如100％的互补性(完全互补)。
在一些实施方案中，寡聚体(或其连续核苷酸部分)选自或包含选自由SEQ ID NO:1-83构成的组中的一个序列、或其至少10个连续核苷酸的子序列，其中所述寡聚体在与所述序列比对时可以任选包含一个、两个或三个错配。
在一些实施方案中，寡聚体或子序列可由11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个连续的核苷酸组成，如12-22个，如12至18个核苷酸。在一些实施方案中，寡聚体长度为16个核苷酸，并且具有SEQ ID NO:1-20、22、24、26、28或30-83中的一者的序列。在又一个实施方案中，寡聚体的长度为12个核苷酸，并且具有SEQ ID NO:21、23、25、27或29的序列。
合适地，在一些实施方案中，子序列与本发明的寡聚体的连续核苷酸序列具有相同的长度。然而，应当认识到，在一些实施方案中，寡聚体的核苷酸序列可包含额外的5’或3’核苷酸，如独立地包含1、2、3、4或5个额外的5’和/或3’核苷酸，其与靶序列不互补。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:1的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:1的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:2的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:2的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:3的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:3的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:4的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:4的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:5的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:5的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:6的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:6的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:7的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:7的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:8的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:8的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:9的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:9的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:10的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:10的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:12的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:12的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:13的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:13的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:14的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:14的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:15的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:15的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:16的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:16的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:17的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:17的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:18的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:18的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:19的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:19的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:20的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:20的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:21的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:21的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:22的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:22的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:23的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:23的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:24的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:24的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:25的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:25的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:26的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:26的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:27的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:27的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:28的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:28的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:29的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:29的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:30的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:30的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:31的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:31的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:32的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:32的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:33的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:33的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:34的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:34的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:35的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:35的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:36的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:36的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:37的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:37的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:38的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:38的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:39的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:39的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:40的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:40的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:41的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:41的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:42的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:42的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:43的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:43的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:44的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:44的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:45的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:45的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:46的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:46的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:47的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:47的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:48的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:48的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:49的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:49的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:50的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:50的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:51的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:51的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:52的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:52的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:53的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:53的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:54的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:54的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:55的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:55的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:56的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:56的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:57的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:57的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:58的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:58的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:59的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:59的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:60的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:60的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:61的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:61的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:62的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:62的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:63的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:63的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:64的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:64的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:65的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:65的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:66的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:66的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:67的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:67的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:68的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:68的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:69的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:69的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:70的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:70的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:71的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:71的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:72的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:72的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:73的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:73的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:74的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:74的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:75的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:75的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:76的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:76的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:77的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:77的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:78的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:78的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:79的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:79的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:80的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:80的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:81的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:81的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:82的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:82的核苷酸序列或其子序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含根据SEQ ID NO:83的核苷酸序列或其子序列，或由根据SEQ ID NO:83的核苷酸序列或其子序列组成。
在确定本发明的寡聚体(或其区域)与编码人SMN的核酸的靶区域之间的“互补性”的程度(如本文公开的那些)时，“互补性”的程度被表示为寡聚体(或其区域)的序列和与其表现出最佳比对的靶区域的反向互补序列之间的同一性百分比(同源性百分比)。该百分比通过以下方式计算：对这两个序列之间所比对的相同的碱基数进行计数，除以寡聚体中连续单体的总数目，并乘以100。在这样的比对中，如果存在缺口(gap)，优选的是该缺口仅为错配，而非在其中缺口中的单体数目在本发明的寡聚体与靶区域之间不同的区域。
相似地，“同源性”或“同一性”的程度表示为寡聚体(或其区域)的序列和与其表现出最佳比对的靶区域的序列之间的同一性百分比(同源性百分比)。如本文所用，术语“同源”和“同源性”可与术语“相同”和“同一性”交换使用。
术语“相应于”和“对应于”是指寡聚体的核苷酸序列(即核碱基或碱基序列)或连续核苷酸序列与选自下述序列中的另一个序列的相应连续核苷酸序列之间的比较，所述下述序列为：i)核酸靶标(如编码SMN蛋白的核酸，如Genbank Acc.No.NG_008728的反向互补序列)的子序列，和/或ii)本文提供的核苷酸序列，如由SEQ IDNO:1-83构成的组，或其子序列。直接将核苷酸类似物与它们相当或相应的核苷酸进行比对。对应于i)或ii)中的所述另一个序列的第一序列通常在第一序列的全部长度上(如连续的核苷酸序列)与该序列相同，或者如本文所述，在一些实施方案中，与对应序列有至少80％的同源性，如至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％的同源性，如100％的同源性(相同)。
术语“相应核苷酸类似物”和“相应核苷酸”旨在表示核苷酸类似物中的核碱基与天然存在的核苷酸中的核碱基是相同的。例如，当核苷酸的2-脱氧核糖单元与腺嘌呤连接时，“相应核苷酸类似物”包含与腺嘌呤连接的戊糖单元(不同于2-脱氧核糖)。
本文所用的术语“反向互补”、“反向互补的”和“反向互补性”可与术语“互补”、“互补的”和“互补性”交换使用。
长度
寡聚体可包含长度为总共10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个连续核苷酸的连续核苷酸序列，或由其组成。
在一些实施方案中，寡聚体可包含长度为总共10至22个核苷酸(例如12-18、13-17或12-16个核苷酸，如13、14、15或16个连续核苷酸)的连续核苷酸序列，或由其组成。
在一些实施方案中，寡聚体包含长度为总共10、11、12、13或14个连续核苷酸的连续核苷酸序列，或由其组成。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体由不大于22个核苷酸组成，如由不大于20个核苷酸组成，如由不大于18个核苷酸组成，如由15、16或17个核苷酸组成。在一些实施方案中，本发明的寡聚体包含不大于20个核苷酸。应当理解，当指定寡聚体或连续核苷酸序列的长度的范围时，其包括该范围内提供的最小和最大长度，例如10至30(或在10和30之间)包括10和30。
核苷和核苷类似物
在一些实施方案中，术语“核苷类似物”和“核苷酸类似物”可交换使用。
本文所用的术语“核苷酸”是指含有糖基部分、碱基部分和共价相连基团(连接基团)的糖苷，所述共价相连基团例如核苷酸间磷酸酯或硫代磷酸酯连接基团，并且术语“核苷酸”包含天然存在的核苷酸(如DNA或RNA)以及含有经修饰的糖基和/或碱基部分的非天然存在的核苷酸，其在本文中还称为“核苷酸类似物”。在本文中，单个核苷酸(单元)也称为单体或核酸单元。
在生物化学领域，术语“核苷”通常用来表示包含糖基和碱基部分的糖苷，因此可以在表示核苷酸单元时使用，其通过寡聚体的核苷酸之间的核苷酸间连接物而共价连接。在生物技术领域，术语“核苷酸”通常用来表示核酸单体或单元，因此在寡核苷酸的情况中可以指碱——如“核苷酸序列“通常是指核碱基序列(即，暗含存在有糖主链和核苷间连接物)。同样地，特别是在其中一个或多个核苷间连接基团被修饰的寡核苷酸的情况中，术语“核苷酸”可用于表示“核苷”，例如可以使用术语“核苷酸”，即使是在说明核苷之间的连接的存在或性质时也是如此。
本领域的普通技术人员将认识到，寡核苷酸的5'端核苷酸不包括5'核苷酸间连接基团，但是可能或可能不包括5'端基团。
非天然存在的核苷酸包括具有经修饰的糖基的核苷酸，如双环核苷酸或2’修饰的核苷酸，如2'取代的核苷酸。
由于“核苷酸类似物”在糖基和/或碱基中的修饰，因此其是天然核苷酸(如DNA或RNA核苷酸)的变体。在寡核苷酸的语境中，原则上，类似物可以仅仅“默认”或“等价”为天然核苷酸，即，对寡核苷酸抑制靶基因表达的方式没有功能影响。如果这种“等价”类似物(例如)可被更容易或更廉价地制造，或在存藏或制造条件中更稳定，或可代表标签或标记，它们仍然可以是有用的。然而，优选的是，类似物可(例如)通过产生增强的对靶标的结合亲和力和/或增强的对细胞内核酸酶的抗性和/或增强的运输入细胞的容易度而对寡聚体抑制表达的方式有功能上的影响。核苷类似物的具体例子描述于(例如)文献“Freier&Altmann；Nucl.Acid Res.,1997,25,4429-4443andUhlmann；Curr.Opinion in Drug Development,2000,3(2),293-213”、以及方案1中
方案1
因此，寡聚体可包含天然核苷酸(优选2'-脱氧核苷酸(本文统称为“DNA”)的简单序列或由其组成，但也可以包含核糖核苷酸(本文统称为“RNA”))的简单序列或由其组成，或者包含这些天然核苷酸与一种或多种非天然核苷酸(例如核苷酸类似物)的组合或由其组成。所述核苷酸类似物可适当地增强寡聚体对靶序列的亲和力。
合适和优选的核苷酸类似物的例子在WO2007/031091中提供，或者通过引用将其全文并入本文中。
在寡聚体中掺入增强亲和力的核苷酸类似物(如LNA或2’-取代的糖)可以使得特异性结合的寡聚体的大小减小，并且还可在非特异性或异常结合发生之前减小对寡聚体大小的上限。
在一些实施方案中，寡聚体包含至少1个核苷类似物。在一些实施方案中，寡聚体包含至少2个核苷酸类似物。在一些实施方案中，寡聚体包含3至8个核苷酸类似物，如6或7个核苷酸类似物。在目前最优选的实施方案中，所述核苷酸类似物中的至少一个为锁核酸(LNA)；例如核苷酸类似物中的至少3个或至少4个、或至少5个、或至少6个、或至少7个、或至少8个可为LNA。在一些实施方案中，所有核苷酸类似物可为LNA；在其他实施方案中，大约一半的核苷酸类似物可为LNA。
应当理解，当提到优选的核苷酸序列基序或核苷酸序列(仅由核苷酸组成)时，本发明的由该序列所定义的寡聚体可以包含相应的核苷酸类似物(即，具有相同的核碱基)以代替所述序列中所存在的一个或多个核苷酸，所述核苷酸类似物例如为提高寡聚体/靶双链体的双链体稳定性/Tm的LNA单元或其他核苷酸类似物(即增强亲和力的核苷酸类似物)。
在一些实施方案中，寡聚体的核苷酸序列与靶序列之间的任何错配优选地见于增强亲和力的核苷酸类似物以外的区域，和/或见于寡核苷酸中未经修饰的(例如)DNA核苷酸位点，和/或见于连续核苷酸序列的5'或3'区域。
核苷酸的修饰的例子包括修饰糖基以提供2'-取代基或产生桥接的(锁核酸)结构，其可提高结合亲和力并且还可以提供增加的核酸酶抗性。
优选的核苷酸类似物为LNA，如氧代-LNA(如β-D-氧代-LNA和α-L-氧代-LNA)、和/或氨基-LNA(如β-D-氨基-LNA和α-L-氨基-LNA)和/或硫代-LNA(如β-D-硫代-LNA和α-L-硫代-LNA)和/或ENA(如β-D-ENA和α-L-ENA)。最优选的为β-D-氧代-LNA。
在一些实施方案中，存在于本发明的寡聚体中的核苷酸类似物独立地选自，例如：2’-O-烷基-RNA单元、2’-氨基-DNA单元、2’-氟-DNA单元、LNA单元、阿拉伯核酸(ANA)单元、2’-氟-ANA单元、HNA单元、INA(嵌入核酸-参见文献“Christensen,2002.Nucl.Acids.Res.200230:4918-4925”，这里通过引用的方式并入本文)单元和2’MOE单元。在一些实施方案中，在本发明的寡聚体或其连续核苷酸序列中仅存在上述核苷酸类似物类型中的一种。
在一些实施方案中，核苷酸类似物为2’-O-甲氧基乙基-RNA(2’MOE)、2’-氟-DNA单体或LNA核苷酸类似物，这样本发明的寡核苷酸可包含独立地选自这三种类似物类型的核苷酸类似物，或可仅包含选自这三种类型中的一种类似物类型。在一些实施方案中，所述核苷酸类似物中的至少一种为2’-MOE-RNA，如2、3、4、5、6、7、8、9或10个2’-MOE-RNA核苷酸单元。在一些实施方案中，所述核苷酸类似物中的至少一种为2’-氟DNA，如2、3、4、5、6、7、8、9或10个2’-氟-DNA核苷酸单元。
在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体包含至少一个锁核酸(LNA)单元，如1、2、3、4、5、6、7或8个LNA单元，如3至7个或4至8个LNA单元，或3、4、5、6或7个LNA单元。在一些实施方案中，所有的核苷酸类似物为LNA。在一些实施方案中，寡聚体可包含β-D-氧代-LNA，以及以下LNA单元中的一种或多种：硫代-LNA、氨基-LNA、氧代-LNA、和/或β-D或α-L构型的ENA、或它们的组合。在一些实施方案中，所有LNA胞嘧啶单元为5’甲基-胞嘧啶。在本发明的一些实施方案中，寡聚体可包含LNA和DNA单元。优选地，组合的LNA和DNA单元的总数为10至25，如10至24，优选为10至20，如10至18，更优选为12至16。在本发明的一些实施方案中，寡聚体的核苷酸序列(如连续核苷酸序列)包含至少一个LNA，剩余的核苷酸单元为DNA单元。在一些实施方案中，寡聚体仅包含LNA核苷酸类似物和天然存在的核苷酸(如RNA或DNA，最优选为DNA核苷酸)，任选地具有诸如硫代磷酸酯等经修饰的核苷酸间连接。
术语“核碱基”是指核苷酸的碱基，并且包括天然存在以及非天然存在的变体。因此，“核碱基”不仅包括已知的嘌呤和嘧啶杂环，还包括杂环类似物及其互变异构体。
核碱基的例子包括但不限于腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤.
在一些实施方案中，寡聚体中所存在的核碱基中的至少一者为选自由以下物质构成的组中的经修饰的核碱基：5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。
LNA
术语“LNA”是指二环核苷类似物，其称为“锁核酸”。其可表示LNA单体，或者当在“LNA寡核苷酸”的情况中使用时，LNA表示含有一个或多个所述二环核苷酸类似物的寡核苷酸。LNA核苷酸的特征在于核糖糖环的C2’和C4’之间存在连接基团(如桥)，例如下述的二元基团(biradical)R4*-R2*所示。
本发明的寡核苷酸化合物中所用的LNA优选地具有通式I的结构：
其中对于所有手性中心，非对称基团可以以R或S构型存在；
其中X选自-O-、-S-、-N(RN*)-、-C(R6R6*)-，如在一些实施方案中为–O-；
B选自氢、任选取代的C1-4-烷氧基、任选取代的C1-4-烷基、任选取代的C1-4-酰氧基，包括天然核碱基和核碱基类似物的核碱基、DNA嵌入剂、光化学活性基团、热化学活性基团、螯合基团、报告基团和配体；优选地，B为核碱基或核碱基类似物；
P表示与相邻单体的核苷酸间连接、或5'-端基团，如任选包括取代基R5或等价可用的取代基R5*的核苷酸间连接或5'-端基团；
P*表示与相邻单体的核苷酸间连接或3'-端基团；
R4*和R2*一起表示二价连接基团，其由1至4个选自以下基团的基团/原子构成：-C(RaRb)-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-O-、-Si(Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-和>C＝Z，其中Z选自-O-、-S-和-N(Ra)-，并且Ra和Rb各自独立地选自氢、任选取代的C1-12-烷基、任选取代的C2-12-烯基、任选取代的C2-12-炔基、羟基、任选取代的C1-12-烷氧基、C2-12-烷氧基烷基、C2-12-烯氧基、羧基、C1-12-烷氧基羰基、C1-12-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳氧基-羰基、芳氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳氧基-羰基、杂芳氧基、杂芳基羰基、氨基、单(C1-6-烷基)氨基和二(C1-6-烷基)氨基、氨甲酰基、单(C1-6-烷基)-氨基-羰基和二(C1-6-烷基)-氨基-羰基、氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、单-和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、C1-6-烷基-羰基氨基、脲基、C1-6-烷酰氧基、磺基(sulphono)、C1-6-烷基磺酰氧基、硝基、叠氮基、硫烷基、C1-6-烷基巯基、卤素、DNA嵌入剂、光化学活性基团、热化学活性基团、螯合基团、报告基团和配体，其中芳基和杂芳基可以任选地被取代，并且其中两个偕取代基Ra和Rb可以一起表示任选取代的亚甲基(＝CH2)，其中对于所有手性中心，在R或S取向中可以发现非对称基团，以及；
所存在的R1*、R2、R3、R5、R5*、R6和R6*中的每个取代基独立地选自氢、任选取代的C1-12-烷基、任选取代的C2-12-烯基、任选取代的C2-12-炔基、羟基、C1-12-烷氧基、C2-12-烷氧基烷基、C2-12-烯氧基、羧基、C1-12-烷氧基羰基、C1-12-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳氧基-羰基、芳氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳氧基-羰基、杂芳氧基、杂芳基羰基、氨基、单-和二(C1-6-烷基)氨基、氨甲酰基、单-和二(C1-6-烷基)-氨基-羰基,氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、单-和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、C1-6-烷基-羰基氨基、脲基、C1-6-烷酰氧基、磺基、C1-6-烷基磺酰氧基、硝基、叠氮基、硫烷基、C1-6-烷基巯基、卤素、DNA嵌入剂、光化学活性基团、热化学活性基团、螯合基团、报告基团和配体，其中芳基和杂芳基可以任选地被取代，并且其中两个偕取代基可以一起表示氧代、硫代(thioxo)、亚氨基、或任选取代的亚甲基；其中RN选自氢和C1-4-烷基，并且其中连续的两个(非偕)取代基可表示额外的键以形成双键；并且RN*(当存在且不包含在二元基团中时)选自氢和C1-4-烷基；及其碱式盐和酸加成盐。对于所有的手性中心，在R或S取向中可以发现非对称基团。
在一些实施方案中，R4*和R2*一起表示由以下基团组成的二元基团团，所述基团选自由C(RaRb)-C(RaRb)-、C(RaRb)-O-、C(RaRb)-NRa-、C(RaRb)-S-和C(RaRb)-C(RaRb)-O-构成的组中，其中Ra和Rb可以各自任选独立地选择。在一些实施方案中，Ra和Rb可任选独立地选自由氢和C1-6烷基(例如甲基)构成的组中，如氢。
在一些实施方案中，R4*和R2*一起表示R-或S-构型的二元基团–O-CH(CH2OCH3)-(2’O-甲氧基乙基双环核酸–参见文献“Seth等，2010,J.Org.Chem”)。
在一些实施方案中，R4*和R2*一起表示R-或S-构型的二元基团–O-CH(CH2CH3)-(2’O-乙基双环核酸–参见文献“Seth等，2010,J.Org.Chem”)。
在一些实施方案中，R4*和R2*一起表示R-或S-构型的二元基团–O-CH(CH3)-。在一些实施方案中，R4*和R2*一起表示二元基团–O-CH2-O-CH2--(Seth等，2010,J.Org.Chem)。
在一些实施方案中，R4*和R2*一起表示二元基团–O-NR-CH3--(Seth等，2010,J.Org.Chem)。
在一些实施方案中，LNA单元具有选自以下基团的结构：
在一些实施方案中，R1*、R2、R3、R5、R5*独立地选自由以下基团构成的组：氢、卤素、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、C2-6烯基、取代的C2-6烯基、C2-6炔基或取代的C2-6炔基、C1-6烷氧基、取代的C1-6烷氧基、酰基、取代的酰基、C1-6氨基烷基或取代的C1-6氨基烷基。对于所有手性中心，非对称基团都可以以R或S构型存在。
在一些实施方案中，R1*、R2、R3、R5、R5*为氢。
在一些实施方案中，R1*、R2、R3独立地选自由以下基团构成的组：氢、卤素、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、C2-6烯基、取代的C2-6烯基、C2-6炔基或取代的C2-6炔基、C1-6烷氧基、取代的C1-6烷氧基、酰基、取代的酰基、C1-6氨基烷基或取代的C1-6氨基烷基。对于所有手性中心，非对称基团都可以以R或S构型存在。
在一些实施方案中，R1*、R2、R3为氢。
在一些实施方案中，R5和R5*各自独立地选自由以下基团构成的组：H、–CH3、-CH2-CH3,-CH2-O-CH3和-CH＝CH2。合适地，在一些实施方案中，R5或R5*为氢，而另外的基团(分别指R5或R5*)选自由以下基团构成的组：C1-5烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、取代的C1-6烷基、取代的C2-6烯基、取代的C2-6炔基或取代的酰基(-C(＝O)-)；其中各被取代的基团被一个或多个独立地选自以下基团的取代基取代：卤素、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、C2-6烯基、取代的C2-6烯基、C2-6炔基、取代的C2-6炔基、OJ1、SJ1、NJ1J2、N3、COOJ1、CN、O-C(＝O)NJ1J2、N(H)C(＝NH)NJ、J2或N(H)C(＝X)N(H)J2，其中X为O或S；并且J1和J2各自独立地为H、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、C2-6烯基、取代的C2-6烯基、C2-6炔基、取代的C2-6炔基、C1-6氨基烷基、取代的C1-6氨基烷基或保护基团。在一些实施方案中，R5或R5*为取代的C1-6烷基。在一些实施方案中，R5或R5*为取代的亚甲基，其中优选的取代基包括一个或多个独立地选自以下基团的基团：F、NJ1J2、N3、CN、OJ1、SJ1、O-C(＝O)NJ1J2、N(H)C(＝NH)NJ、J2或N(H)C(O)N(H)J2。在一些实施方案中，J1和J2各自独立地为H或C1-6烷基。在一些实施方案中，R5或R5*为甲基、乙基或甲氧基甲基。在一些实施方案中，R5或R5*为甲基。在又一个实施方案中，R5或R5*为亚乙基。在一些实施方案中，R5或R5*为取代的酰基。在一些实施方案中，R5或R5*为C(＝O)NJ1J2。对于所有手性中心，非对称基团都可以以R或S构型存在。在WO2007/134181中描述了这样的5’修饰的二环核苷酸，这里通过引用将其全文并入本文中。
在一些实施方案中，B为核碱基，包括核碱基类似物和天然存在的核碱基，如嘌呤或嘧啶，或取代的嘌呤或取代的嘧啶，例如本文所指的核碱基，如选自由以下物质构成的组中的核碱基：腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、尿嘧啶和/或修饰的或取代的核碱基，如5-噻唑-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、2’硫代-胸腺嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。
在一些实施方案中，R4*和R2*一起表示选自以下基团的二元基团：-C(RaRb)-O-、-C(RaRb)-C(RcRd)-O-、-C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-O-、-C(RaRb)-O-C(RcRd)-、-C(RaRb)-O-C(RcRd)-O-、-C(RaRb)-C(RcRd)-、-C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-、-C(Ra)＝C(Rb)-C(RcRd)-、-C(RaRb)-N(Rc)-、-C(RaRb)-C(RcRd)-N(Re)-、-C(RaRb)-N(Rc)-O-和-C(RaRb)-S-、-C(RaRb)-C(RcRd)-S-，其中Ra、Rb、Rc、Rd、Re和Rf各自独立地选自氢、任选取代的C1-12-烷基、任选取代的C2-12-烯基、任选取代的C2-12-炔基、羟基、C1-12-烷氧基、C2-12-烷氧基烷基、C2-12-烯氧基、羧基、C1-12-烷氧基羰基、C1-12-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳氧基-羰基、芳氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳氧基-羰基、杂芳氧基、杂芳基羰基、氨基、单-和二(C1-6-烷基)氨基、氨甲酰基、单-和二(C1-6-烷基)-氨基-羰基、氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、单-和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、C1-6-烷基-羰基氨基、脲基、C1-6-烷酰氧基、磺基、C1-6-烷基磺酰氧基、硝基、叠氮基、硫烷基、C1-6-烷基巯基、卤素、DNA嵌入剂、光化学活性基团、热化学活性基团、螯合基团、报告基团和配体，其中芳基和杂芳基可以任选地被取代，并且其中两个偕取代基Ra和Rb可以一起表示任选取代的亚甲基(＝CH2)。对于所有手性中心，在R或S取向中可以发现非对称基团。
在又一个实施方案中，R4*和R2*一起表示选自以下基团的二元基团(二价基团)：-CH2-O-、-CH2-S-、-CH2-NH-、-CH2-N(CH3)-、-CH2-CH2-O-、-CH2-CH(CH3)-、-CH2-CH2-S-、-CH2-CH2-NH-、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-O-、-CH2-CH2-CH(CH3)-、-CH＝CH-CH2-、-CH2-O-CH2-O-、-CH2-NH-O-、-CH2-N(CH3)-O-、-CH2-O-CH2-、-CH(CH3)-O-和–CH(CH2-O-CH3)-O-、和/或-CH2-CH2-和-CH＝CH-。对于所有手性中心，非对称基团都可以以R或S构型存在。
在一些实施方案中，R4*和R2*一起表示二元基团C(RaRb)-N(Rc)-O-，其中Ra和Rb独立地选自由以下基团构成的组：氢、卤素、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、C2-6烯基、取代的C2-6烯基、C2-6炔基或取代的C2-6炔基、C1-6烷氧基、取代的C1-6烷氧基、酰基、取代的酰基、C1-6氨基烷基或取代的C1-6氨基烷基，如氢，以及；其中Rc选自由以下基团构成的组：氢、卤素、C1-6烷基、取代的C1-6烷基,C2-6烯基、取代的C2-6烯基、C2-6炔基或取代的C2-6炔基、C1-6烷氧基、取代的C1-6烷氧基、酰基、取代的酰基、C1-6氨基烷基或取代的C1-6氨基烷基，如氢。
在一些实施方案中，R4*和R2*一起表示二元基团C(RaRb)-O-C(RcRd)-O-，其中Ra、Rb、Rc和Rd独立地选自由以下基团构成的组：氢、卤素、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、C2-6烯基、取代的C2-6烯基、C2-6炔基或取代的C2-6炔基、C1-6烷氧基、取代的C1-6烷氧基、酰基、取代的酰基、C1-6氨基烷基或取代的C1-6氨基烷基，如氢。
在一些实施方案中，R4*和R2*形成二元基团–CH(Z)-O-，其中Z选自由以下基团构成的组：C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、取代的C1-6烷基、取代的C2-6烯基、取代的C2-6炔基、酰基、取代的酰基、取代的酰胺、巯基或取代的巯基；并且其中各个取代基独立地被一个或多个任选保护的取代基取代，该任选保护的取代基独立地选自卤素、氧、羟基、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(＝X)J1、OC(＝X)NJ1J2、NJ3C(＝X)NJ1J2和CN，其中J1、J2和J3各自独立地为H或C1-6烷基，并且X为O、S或NJ1。在一些实施方案中，Z为C1-6烷基或取代的C1-6烷基。在一些实施方案中，Z为甲基。在一些实施方案中，Z为取代的C1-6烷基。在一些实施方案中，所述取代基为C1-6烷氧基。在一些实施方案中，Z为CH3OCH2-。对于所有手性中心，非对称基团都可以以R或S构型存在。在US7,399,845中公开了这样的二环核苷酸，这里通过引用将其全文并入本文中。在一些实施方案中，R1*、R2、R3、R5、R5*为氢。在一些实施方案中，R1*、R2、R3*为氢，并且R5、R5*中的一者或两者可为上述和WO2007/134181中所述的除氢以外的基团。
在一些实施方案中，R4*和R2*一起表示桥中包含取代的氨基的二元基团，例如包含二元基团–CH2-N(Rc)-或由二元基团–CH2-N(Rc)-组成，其中Rc为C1–12烷氧基。在一些实施方案中，R4*和R2*一起表示二元基团–Cq3q4-NOR-，其中q3和q4独立地选自由以下基团构成的组：氢、卤素、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、C2-6烯基、取代的C2-6烯基、C2-6炔基或取代的C2-6炔基、C1-6烷氧基、取代的C1-6烷氧基,酰基、取代的酰基、C1-6氨基烷基或取代的C1-6氨基烷基；其中各个取代基独立地由这样的取代基单取代或多取代，所述取代基独立地选自：卤素、OJ1、SJ1、NJ1J2、COOJ1、CN、O-C(＝O)NJ1J2、N(H)C(＝NH)N J1J2或N(H)C(＝X＝N(H)J2，其中X为O或S；并且J1和J2各自独立地为H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6氨基烷基或保护基团。对于所有手性中心，非对称基团都可以以R或S构型存在。在WO2008/150729中描述了这样的二环核苷酸，这里通过引用将其全文并入本文中。在一些实施方案中，R1*、R2、R3、R5、R5*独立地选自由以下基团构成的组：氢、卤素、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、C2-6烯基、取代的C2-6烯基、C2-6炔基或取代的C2-6炔基、C1-6烷氧基、取代的C1-6烷氧基、酰基、取代的酰基、C1-6氨基烷基或取代的C1-6氨基烷基。在一些实施方案中，R1*、R2、R3、R5、R5*为氢。在一些实施方案中，R1*、R2、R3为氢，并且R5、R5*中的一者或两者可为上述和WO2007/134181中所述的除氢以外的基团。
在一些实施方案中，R4*和R2*一起表示二元基团(二价基团)C(RaRb)-O-，其中Ra和Rb各自独立地为卤素、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C1-C12烷氧基、取代的C1-C12烷氧基、OJ1SJ1、SOJ1、SO2J1、NJ1J2、N3、CN、C(＝O)OJ1、C(＝O)NJ1J2、C(＝O)J1、O-C(＝O)NJ1J2、N(H)C(＝NH)NJ1J2、N(H)C(＝O)NJ1J2或N(H)C(＝S)NJ1J2；或Ra和Rb一起为＝C(q3)(q4)；q3和q4各自独立地为H、卤素、C1-C12烷基或取代的C1-C12烷基；各个取代基独立地由这样的取代基单取代或多取代，所述取代基独立地选自：卤素、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C2-C6炔基、OJ1、SJ1、NJ1J2、N3、CN、C(＝O)OJ1、C(＝O)NJ1J2、C(＝O)J1、O-C(＝O)NJ1J2、N(H)C(＝O)NJ1J2或N(H)C(＝S)NJ1J2，并且J1和J2各自独立地为H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C2-C6炔基、C1-C6氨基烷基、取代的C1-C6氨基烷基或保护基团。在WO2009006478A中公开了这样的化合物，这里通过引用将其全文并入本文中。
在一些实施方案中，R4*和R2*形成二元基团-Q-，其中Q为C(q1)(q2)C(q3)(q4)、C(q1)＝C(q3)、C[＝C(q1)(q2)]-C(q3)(q4)或C(q1)(q2)-C[＝C(q3)(q4)]；q1、q2、q3、q4各自独立地为H、卤素、C1-12烷基、取代的C1-12烷基、C2-12烯基、取代的C1-12烷氧基、OJ1、SJ1、SOJ1、SO2J1、NJ1J2、N3、CN、C(＝O)OJ1、C(＝O)-NJ1J2、C(＝O)J1、-C(＝O)NJ1J2、N(H)C(＝NH)NJ1J2、N(H)C(＝O)NJ1J2或N(H)C(＝S)NJ1J2；J1和J2各自独立地为H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6氨基烷基或保护基团；并且，任选地，其中当Q为C(q1)(q2)(q3)(q4)且q3或q4之一为CH3时，那么q3或q4中的另外的至少一个或q1和q2中的一个不为H。在一些实施方案中，R1*、R2、R3、R5、R5*为氢。对于所有手性中心，非对称基团都可以以R或S构型存在。在WO2008/154401中公开了这样二环核苷酸，这里通过引用将其全文并入本文中。在一些实施方案中，R1*、R2、R3、R5、R5*独立地选自由以下基团构成的组：氢、卤素、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、C2-6烯基、取代的C2-6烯基、C2-6炔基或取代的C2-6炔基、C1-6烷氧基、取代的C1-6烷氧基、酰基、取代的酰基、C1-6氨基烷基或取代的C1-6氨基烷基。在一些实施方案中，R1*、R2、R3、R5、R5*为氢。在一些实施方案中，R1*、R2、R3为氢，并且R5、R5*中的一者或两者可为上述和WO2007/134181或WO2009/067647中所述的除氢以外的基团(α-L-双环核酸类似物)。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸化合物中所用的LNA优选地具有通式II的结构：
其中Y选自由以下基团构成的组：-O-、-CH2O-、-S-、-NH-、N(Re)和/或–CH2-；Z和Z*独立地选自核苷酸间连接、RH、末端基团或保护基团；B构成天然或非天然核苷酸碱基部分(核碱基)，并且RH选自氢和C1-4-烷基；Ra、Rb、Rc、Rd和Re任选地独立地选自由以下基团组成的组中：氢、任选取代的C1-12-烷基、任选取代的C2-12-烯基、任选取代的C2-12-炔基、羟基、C1-12-烷氧基、C2-12-烷氧基烷基、C2-12-烯氧基、羧基、C1-12-烷氧基羰基、C1-12-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳氧基-羰基、芳氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳氧基-羰基、杂芳氧基、杂芳基羰基、氨基、单-和二(C1-6-烷基)氨基、氨甲酰基、单-和二(C1-6-烷基)-氨基-羰基、氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、单-和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基,C1-6-烷基-羰基氨基、脲基、C1-6-烷酰氧基、磺基、C1-6-烷基磺酰氧基、硝基、叠氮基、硫烷基、C1-6-烷基巯基、卤素、DNA嵌入剂、光化学活性基团、热化学活性基团、螯合基团、报告基团和配体，其中芳基和杂芳基可以任选地被取代，并且其中两个偕取代基Ra和Rb可以一起表示任选取代的亚甲基(＝CH2)；并且RH选自氢和C1-4-烷基。在一些实施方案中，Ra、Rb、Rc、Rd和Re任选地独立地选自由以下基团构成的组：氢和C1-6烷基，如甲基。对于所有手性中心，非对称基团都可以以R或S构型存在，例如，两个示例性立体化学异构体包括β-D和α-L异构体，其可以如下所示：
具体的示例性LNA单元如下所示：
术语“硫代-LNA”包括这样的锁核苷酸，其中上述通式中的Y选自S或-CH2-S-。硫代-LNA可以为β-D和α-L-构型。
术语“氨基-LNA”包括这样的锁核苷酸，其中上述通式中的Y选自-N(H)-、N(R)-、CH2-N(H)-和-CH2-N(R)-，其中R选自氢和C1-4-烷基。氨基-LNA可以为β-D和α-L-构型。
术语“氧代-LNA”包括这样的锁核苷酸，其中上述通式中的Y表示–O-。氨基-LNA可以为β-D和α-L-构型。
术语“ENA”包括这样的锁核苷酸，其中上述通式中的Y为-CH2-O-(其中–CH2-O-中的氧原子连接至相对于碱基B的2’-位)。Re为氢或甲基。
在一些示例性实施方案中，LNA选自β-D-氧代-LNA、α-L-氧代-LNA、β-D-氨基-LNA和β-D-硫代-LNA，特别是β-D-氧代-LNA。
RNAse补充
应当认识到，寡聚体化合物可通过补充核糖核酸内切酶(RNase)(如RNase H)来发挥功能，或者通过非RNase介导的靶mRNA降解来发挥功能，例如通过翻译的空间位阻或剪接的调控来发挥功能。EP 1 222 309(特别是实施例91-95)提供了确定RNaseH活性的体外方法，其可用于确定补充RNaseH的能力。
剪接的调控
许多真核mRNA转录本包含一个或多个称为“内含子”的区域，其在翻译之前从转录本上被切除(剪接掉)。剪接之前的RNA转录本称为前体mRNA(pre-mRNA)。剩余的(因此被翻译的)区域称为“外显子”并且被剪接在一起形成连续的(成熟的)mRNA序列。mRNA剪接位点(即内含子-外显子接合点)还优选地称为靶区域，并且在以下情况中是特别有用的：涉及异常剪接的疾病、或涉及过度产生特定mRNA剪接产物的疾病。对于如本发明所述的剪接调控，优选的是，寡核苷酸不诱导RNAse H切割靶核酸，其会降低细胞内存在的靶mRNA的量。相反的是，寡聚体被设计为通过非RNAse H的方法干扰剪接，其目的在于调控异常剪接，从而有利于获得所需剪接产物(在这种情况下为全长SMN2mRNA)。因此，实际上可通过使用反义方法提高所需剪接产物(mRNA或其蛋白质产物)的水平。
混合物聚体的设计
一些“嵌合”寡聚体(称为“混合物聚体”)由以下(i)和(ii)的交替组合物组成：(i)可被RNase识别并切割的DNA单体或核苷类似物单体，以及(ii)补充非RNase的核苷类似物单体。
本发明的寡核苷酸优选不诱导RNAse H，并且在一个优选的实施方案中所述寡核苷酸为“混合物聚体”，即，具有不容易被RNAseH切割的经修饰的核苷和可被RNAse H切割的未经修饰的DNA单元的混合物，但是与缺口聚体(gapmer)不同，其不具有足够长以结合并介导RNAse H切割的DNA“缺口”区域。目前认为，4至5个连续的DNA单元是RNAse H切割必需的，因此优选的是，不期望诱导RNAse H的寡聚体中具有小于4个，更优选小于3个或小于2个连续的DNA单元。如表1所示，本发明的优选的混合物聚体在每隔一个位置处具有LNA，并且在3’末端具有两个或三个LNA，拒信，它们能够稳定寡核苷酸并使RNAse H切割最小化。骨架连接为硫代磷酸酯连接。
在一些实施方案中，寡聚体仅包含LNA和DNA核苷酸。
在一些实施方案中，寡聚体具有小于4个连续的DNA单元，如小于3个连续的DNA单元，如小于2个连续的DNA单元。在一些实施方案中，寡聚体具有不多于1或2个连续的DNA单元。
在一些实施方案中，寡聚体的5’单元为LNA核苷酸。在一些实施方案中，寡聚体的3’单元(如23’单元)为LNA核苷酸。
在一些实施方案中，寡聚体包含LNA和DNA核苷酸，其中具有不大于3个连续的LNA单元，如不大于2个连续的LNA单元，并且其中5’核苷酸为LNA单元并且3’核苷酸(如23’核苷酸)为LNA单元。在一些实施方案中，LNA寡聚体由交替的5’–LNA-DNA–3’核苷酸组成，或包含交替的5’–LNA-DNA–3’核苷酸，任选地末端(5’和/或3’)两个核苷酸为LNA单元。
在一些实施方案中，寡聚体(例如上述的混合物聚体)的长度为12–16个核苷酸，如13、14或15个核苷酸。
在一些实施方案中，寡聚体(例如上述的混合物聚体)为硫代磷酸酯寡聚体。
核苷酸间连接
本文所述的寡聚体的单体是通过连接基团偶联在一起的。合适地，各个单体通过连接基团连接至3’相邻单体。
本领域普通技术人员能够理解，在本发明的内容中，寡聚体末端的5’单体不包含5’连接基团，但是其可包含或可能不包含5’端基团。
术语“连接基团”或“核苷酸间连接”旨在意为能够将两个核苷酸共价偶联在一起的基团。其具体和优选的例子包括磷酸酯基团和硫代磷酸酯基团。
本发明的寡聚体的核苷酸或其连续核苷酸序列通过连接基团偶联在一起。适当地，各个核苷酸通过连接基团连接至3’相邻核苷酸。
合适的核苷酸间连接包括在WO2007/031091中列出的那些，例如在WO2007/031091第34页第1段中列出的核苷酸间连接(这里通过引用的方式并入本文中)。
在一些实施方案中，优选的是，将核苷酸间连接由正常的磷酸二酯修饰为对核酸酶攻击更有抗性的那些，如硫代磷酸酯或硼代磷酸酯，这两种被RNase H切割后还允许减少靶基因的表达的反义抑制路径。
本文提供的合适的含硫核苷酸间连接是优选的。为了提高核酸酶抗性和其他原因(如易于制备)，硫代磷酸酯核苷酸间连接也是优选的。
然而，寡聚体可以包含硫代磷酸酯之外的核苷酸间连接，如磷酸二酯连接，特别是当(例如)使用诸如LNA核苷酸等核苷酸类似物保护核苷酸间连接免受核酸内切酶降解时。
应当认识到，将磷酸二酯连接(如一个或两个连接)包含在另外的硫代磷酸酯寡聚体中(特别是在核苷酸类似物单元之间或与核苷酸类似物单元相邻)，改进了寡聚体的生物利用度和/或体内分布(参见WO2008/053314，这里通过引用的方式并入本文中)。
在一些实施方案中(例如其中适于但未具体指出的上述的实施方案)，所有剩余的连接基团为磷酸二酯或硫代磷酸酯、或它们的混合物。
在一些实施方案中，所有核苷酸间连接基团为硫代磷酸酯。
当涉及具体的缺口聚体寡核苷酸序列时(例如本文提供的那些)，应当理解，在多个实施方案中，当连接为硫代磷酸酯连接时，可使用交替连接，例如本文公开的那些，例如可使用磷酸酯(磷酸二酯)连接，特别是对于核苷酸类似物(如LNA)单元之间的连接。相似地，当涉及具体的缺口聚体寡核苷酸序列时(如本文提供的那些)，当C(胞嘧啶)残基被表示为5’甲基修饰的胞嘧啶时，在多个实施方案中，寡聚体中存在的一个或多个C可为未经修饰的C残基。
寡聚体化合物
本发明的寡聚体可(例如)具有选自由表1所示的SEQ ID NO1-83构成的组中的序列，或具有前述中的一个的亚类的序列。在一个实施方案中，寡聚体为16聚体，其中第一、三、五、七、九、十一、十三、十五和十六单体单元(从5’端开始)为LNA，其余的单元为DNA，并且所有的连接为硫代磷酸酯。在另一个实施方案中，寡聚体为15聚体，其中第一、三、五、七、九、十一、十三、十四和十五单体单元(从5’端开始)为LNA，其余的单元为DNA，并且所有的连接为硫代磷酸酯。在另一个实施方案中，寡聚体为12聚体，其中第一、三、五、七、九、十一和十二单体单元(从5’端开始)为LNA，其余的单元为DNA，并且所有的连接为硫代磷酸酯。
缀合物
在本公开的内容中，术语“缀合物”旨在意为通过将本文所述的寡聚体与一个或多个非核苷酸或非多核苷酸部分共价连接(“缀合”)而形成的异质分子。非核苷酸或非多核苷酸部分的例子包括大分子物质(agent)，如蛋白质、脂肪酸链、糖残基、糖蛋白、聚合物、或它们的组合。通常蛋白质可以为靶蛋白的抗体。典型的聚合物可以是聚乙二醇。
因此，在多个实施方案中，本发明的寡聚体可包含通常由核苷酸连续序列组成的多核苷酸区域，还可包含非核苷酸区域。当涉及由连续核苷酸序列组成的本发明的寡聚体时，化合物可包含非核苷酸组分，如缀合物化合物。
在本发明的多个实施方案中，寡聚体化合物连接至配体/缀合物，其可用于(例如)提高寡聚体化合物的细胞摄取。WO2007/031091提供了合适的配体和缀合物，这里通过引用的方式并入本文中。
本发明还提供了一种缀合物，其包含根据本文所述的本发明的化合物，以及至少一个共价连接至所述化合物的非核苷酸或非多核苷酸部分。因此，在多个实施方案中，其中如本文中所公开，本发明的化合物由特定的核酸或核苷酸序列组成，化合物还可包含至少一个共价连接至该化合物的非核苷酸或非多核苷酸部分(例如不包含一个或多个核苷酸或核苷酸类似物)。
缀合(至缀合物部分)可增强本发明的寡聚体的活性、细胞分布或细胞摄取。这样的部分包括但不限于，抗体、多肽、脂质部分(例如胆固醇部分)、胆酸、硫醚(例如己基-s-三苯甲基硫醇)、巯基胆固醇、脂肪链(例如十二烷二醇或十一烷基残基)、磷脂(例如二-十六烷基-消旋-甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-消旋-甘油基-3-h-膦酸酯)、聚胺或聚乙二醇链、金刚烷乙酸、棕榈基部分、十八烷基胺或己基氨基-羰基-羟胆固醇部分。
本发明的寡聚体还可以缀合有活性药物物质，例如，阿司匹林、布洛芬、磺胺药、抗糖尿病药、抗菌剂或抗生素。
在某些实施方案中，缀合的部分为固醇，如胆固醇。
在多个实施方案中，缀合的部分包含带正电荷的聚合物或由带正电荷的聚合物组成，例如长度为(例如)1-50，如2-20，如3-10个氨基酸残基的带正电荷的肽，和/或聚环氧烷烃，如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇-参见WO2008/034123，这里通过引用的方式并入本文。合适地，该带正电荷的聚合物(如聚环氧烷烃)可通过连接物(如WO2008/034123中所述的可释放连接物)连接到本发明的寡聚体上。
作为例子，下述缀合物部分可用于本发明的缀合物中：
活化的寡聚体
本文所用的术语“活化的寡聚体”是指这样的本发明的寡聚体，其共价连接(即官能化)到至少一个允许该寡聚体与一个或多个缀合部分(即自身不是核酸或单体的部分)共价连接从而形成本文所述的缀合物的官能部分。通常，官能部分包括能够通过(例如)以下基团共价结合至寡聚体的化学基团，所述以下基团为腺嘌呤碱的3'-羟基或环外NH2基团、优选亲水的间隔、以及能与缀合部分结合的末端基团(例如，氨基、巯基或羟基)。在一些实施方案中，该末端基团是不受保护的，例如是NH2基团。在其他实施方案中，末端基团通过(例如)任何合适的保护基团被保护，所述保护基团例如TheodoraW Greene和Peter G M Wuts的“Protective Groups in OrganicSynthesis”，第三版(John Wiley&Sons,1999)中的所述的那些。合适的羟基保护基团的例子包括酯(如乙酸酯)、芳烷基(如苯甲基、二苯甲基、或三苯甲基)、和四氢吡喃基。合适的氨基保护基团的例子包括苯甲基、α-甲基苯甲基、二苯甲基、三苯甲基、苯甲氧基羰基、叔丁氧基羰基、和酰基(如三氯乙酰基或三氟乙酰基)。在一些实施方案中，官能部分是自切割的。在其他实施方案中，官能部分是可生物降解的。参见例如，美国专利No.7,087,229，其通过引用的方式将其全文并入本文中。
在一些实施方案中，本发明的寡聚体在5’端被官能化，以使缀合部分与寡聚体的5’端共价连接。在其他实施方案中，本发明的寡聚体可在3’端官能化。在其他实施方式中，本发明的寡聚体可沿着骨架或在杂环碱基部分官能化。在其他实施方案中，本发明的寡聚体可在大于一个独立地选自5’端、3’端、骨架和碱基中的位置被官能化。
在一些实施方案中，本发明的活化的寡聚体是通过在合成中掺入一个或多个共价连接至官能部分的单体而合成的。在其他实施方案中，本发明的活化的寡聚体通过未被官能化的单体合成，并且所述寡聚体在完成合成时官能化。在一些实施方案中，寡聚体通过含有氨基烷基连接物的受阻酯被官能化，其中所述烷基部分具有式(CH2)w，其中w为1至10的整数，优选地约为6，其中所述烷基氨基的烷基部分可为直链或支链，并且其中官能团通过酯基(-O-C(O)-(CH2)wNH)连接至寡聚体。
在其他实施方案中，寡聚体通过含有(CH2)w-巯基(SH)连接物的受阻酯官能化，其中w为1至10的整数，优选地约为6，其中所述烷基氨基的烷基部分可为直链或支链，并且其中官能团通过酯基(-O-C(O)-(CH2)wSH)连接至寡聚体。
在一些实施方案中，巯基-活化的寡核苷酸与聚合物基团(如聚乙二醇或多肽)缀合(通过形成二硫键)。
含有上述受阻酯的活化的寡聚体可以通过本领域已知的任意方法合成，特别是通过在PCT公开No.WO2008/034122中以及其中的实施例中公开的方法，这里通过引用的方式将其全文并入本文中。
在又一个实施方案中，本发明的寡聚体通过向该寡聚体中引入巯基、氨基或羟基而被官能化，这通过基本如美国专利Nos.4,962,029和4,914,210中所述的官能化试剂的方式实现，所述官能化试剂即：在一端具有通过亲水性间隔链连接至相对端(包含保护或未保护的巯基、氨基或羟基)的亚磷酰胺的基本上为线形的试剂。这些试剂首先与寡聚体的羟基反应。在一些实施方案中，这样的活化的寡聚体具有偶联至该寡聚体的5'-羟基的官能化试剂。在其他实施方案中，活化的寡聚体具有偶联至3'-羟基的官能化试剂。在又一个实施方案中，本发明的活化的寡聚体具有偶联至该寡聚体的骨架上的羟基的官能化试剂。在又一个实施方案中，本发明的寡聚体通过多于一个如美国专利Nos.4,962,029和4,914,210中所述的官能化试剂被官能化，这里通过引用的方式将其全文并入本文中。合成这样的官能化试剂以及将它们引入单体或寡聚体的方法在美国专利4,962,029和4,914,210中公开。
在一些实施方案中，固相结合的寡聚体的5’-端用二烯基亚磷酰胺衍生物官能化，然后通过Diels-Alder环加成反应将脱保护的寡聚体与(例如)氨基酸或肽缀合在一起。
在多个实施方案中，将含有2'-糖修饰(如2'-氨基甲酸酯取代的糖或2'-(O-戊基-N-苯二甲酰亚氨基)-脱氧核糖)的单体引入寡聚体中有利于缀合基团与所述寡聚体的糖共价结合。在其他实施方案中，利用这样的试剂制备在一个或多个单体的2'-位置具有含氨基连接物的寡聚体，所述试剂例如为(如)5'-二甲氧基三苯甲基-2'-O-(e-苯二甲酰亚氨基氨基戊基)-2'-脱氧腺苷-3'-N,N-二异丙基-氰基乙氧基亚磷酰胺。参见例如“Manoharan等，Tetrahedron Letters,1991,34,7171”。
在又一个实施方案中，本发明的寡聚体可在核碱基上具有含胺的官能部分，包括在N6嘌呤氨基上、在鸟嘌呤的环外N2上、在胞嘧啶的N4或5位。在多个实施方案中，这样的官能化可通过使用市售的已在寡聚体的合成中官能化的试剂实现。
一些官能部分是可商购的，例如，异双功能和同双功能连接部分可购自Pierce公司(罗克福德，Ill.)。其他市售可得的连接基团为5'-氨基-修饰物C6(5'-Amino-Modifier C6)和3'-氨基-修饰物(3'-Amino-Modifier)试剂，其均可购自Glen Research公司(斯特林，Va.)。5'-氨基-修饰剂C6也可购自ABI(Applied Biosystems公司，福斯特城，Calif.)作为氨基连接-2(Aminolink-2)，3'-氨基-修饰物也可购自Clontech Laboratories公司(帕洛阿尔托，Calif.)。
组合物
本发明所述的寡聚体可用于药物制剂和组合物。合适地，所述组合物包含可药用的稀释剂、载体、盐或辅料。WO/2007/031091提供了合适和优选的可药用的稀释剂、载体和辅料，在这里通过引用的方式将其并入本文。WO/2007/031091中还提供了合适的剂量、配方、给药途径、组合物、剂型、与其他治疗剂的组合、前药制剂，这里通过引用的方式将其并入本文。
应用
本发明的寡聚体可用作用于(例如)诊断、治疗和预防的研究试剂。在研究中，所述寡聚体还可用于特异性地调控SMN2mRNA的剪接，从而有利于各种剪接产物的作用的功能化分析。
在诊断中，所述寡聚体可通过northern印迹法、原位杂交或类似技术检测和定量细胞和组织中的SMN2的表达。
对于治疗，通过施用本发明的寡聚体化合物治疗疑似患有这样的疾病或失调的动物或人，所述疾病或失调可通过调控SMN或特定的SMN2mRNA剪接产物的表达而得到治疗。本发明还提供了通过施用治疗有效量或预防有效量的一种或多种本发明的寡聚体或组合物来治疗疑似患有或者易患与SMN的异常表达(包括表达异常的SMN剪接产物)有关的疾病或病症的人的方法。根据本发明的寡聚体、缀合物或药物组合物通常以有效量施用。
本发明还提供了一种用于治疗如上所述的失调的方法，所述方法包括向需要的患者施用本文所述的根据本发明的化合物、和/或根据本发明的缀合物、和/或根据本发明的药物组合物。
拒信，治疗组合物的配方以及它们后来的施用在本领域技术人员的技能范围内。给药取决于待治疗的疾病的严重度和响应性，并且疗程持续数天至数月，或直到治疗起到效果或实现了疾病状态的减轻。最佳给药方案可以通过测量患者体内的药物积累来计算。普通技术人员可以容易地确定最佳剂量、给药方法和重复率。最佳剂量可以根据单个寡核苷酸的相对效力而变化，并且通常可以基于EC50(发现在体外和体内动物模型中是有效的)来估计。在一般情况下，剂量为每千克体重0.01ug至10g，并且可以每天、每周、每月或每年给药一次或多次，甚至可以每个使用期(lifetime)施用单剂量或根据需要给药。本领域普通技术人员可以容易地根据所测量的药物在体液或组织中的停留时间和浓度来估计给药的重复率。治疗成功之后，可以理想地使患者接受维持治疗以防止疾病状态的复发，其中以维持剂量施用寡核苷酸，维持剂量为每千克体重0.01ug至100g，每天一次或多次至每20年一次。
医学说明
根据本发明的寡聚体和其他组合物可用于治疗与SMN过表达、不期望的或异常的水平(特别是可能由于过度积累而导致的高水平)的SMN、或表达突变的或其他异常形式的SMN有关的病症。
本发明还提供了本发明的化合物在制备用于治疗本文所述的疾病、失调或病症的药物中的应用。
一般来说，本发明的一个方面涉及治疗患有或易患有与不期望的或异常的水平的SMN有关的病症的人类受试者的方法，该方法包括向人类受试者施用治疗有效量的包含一个或多个LNA单元的靶向SMN2的寡聚体。根据本发明的寡聚体、缀合物或药物组合物通常以有效量施用。
在一些实施方案中，本文所述的疾病或失调可以与SMN2基因的突变有关，或与蛋白质产物与SMN相关或与SMN相互作用的基因的突变有关。因此，在一些实施方案中，靶前体mRNA是SMN2序列的突变形式。
所述疾病或失调可与SMN2的异常剪接相关，因此在一些实施方案中，寡聚体被设计为调控SMN2mRNA的剪接。
本发明的方法优选应用于治疗或预防由异常或不期望水平的SMN引起的疾病，或由异常的SMN mRNA的剪接产物引起的疾病。
可供选择地，在一些实施方案中，本发明进一步涉及调节异常的或不期望的水平的SMN(例如高于SMN的期望水平)、或异常的或不期望的水平的特定SMN mRNA剪接产物的方法，所述方法包括向需要的患者施用本发明的寡聚体、或本发明的缀合物或本发明的药物组合物。
本发明还涉及本文所定义的寡聚体、组合物或缀合物用作药物。此外，本发明涉及治疗患有如本文所述的疾病或病症的受试者的方法。需要治疗的患者为患有或可能患有所述疾病或失调的患者。
在一些实施方案中，本文所用的术语“治疗”是指治疗已有的疾病(如本文中所提到的疾病或失调)，或预防疾病(即预防)。因此，应当认识到在一些实施方案中本文所述的治疗是预防性的。
实施方案
1.一种长度为10至30个核苷酸的寡聚体，包含至少一个锁核酸(LNA)单元并且不诱导RNAse H的活性，并且其中所述寡聚体还包含长度为10至30个核碱基的核碱基序列，其中所述核碱基序列与对应于Genbank登陆号NG_008728(SEQ ID NO:167)或其天然存在的变体中的核苷酸26231-26300、31881-31945或32111-32170的区域至少80％互补，并且所述寡聚体调控SMN2mRNA的剪接从而导致全长SMN2mRNA转录本的水平升高。
2.根据实施方案1所述的寡聚体，其中所述核碱基序列与对应于Genbank登陆号NG_008728(SEQ ID NO:167)中的核苷酸26231-26246、26274-26300、31890-31905、31918-31945或32115-32162的区域至少80％互补。
3.根据实施方案1所述的寡聚体，其中所述寡聚体与Genbank登陆号NG_008728(SEQ ID NO:167)中的核苷酸26231-26300至少80％互补。
4.根据实施方案1所述的寡聚体，其中所述寡聚体的核碱基序列与SEQ ID NO:1、2、3-16、19-20、22、24-34、35-38、40、41、45-49、60-80或83的序列具有至少80％的同一性。
5.根据实施方案1所述的寡聚体，其中所述寡聚体的核碱基序列具有SEQ ID NO:1、5、9、11、12、26、27、28、29、30、34、40、53-59、62、63、65、66、69-77或79的序列。
6.根据实施方案1所述的寡聚体，其中剪接的调控为使全长SMN2转录本的量增加至高于对照的110％，高于对照的120％，高于对照的130％，高于对照的140％，高于对照的150％，高于对照的160％，高于对照的170％，高于对照的180％，高于对照的190％，或高于对照的200％。
7.根据实施方案1所述的寡聚体，其中所述核苷酸序列的长度为12至16个核苷酸。
8.根据实施方案8所述的寡聚体，其为混合物聚体。
9.一种缀合物，其包含根据实施方案1所述的寡聚体、以及至少一个共价连接至所述寡聚体的非核苷酸或非多核苷酸部分。
10.根据实施方案1所述的寡聚体，或根据实施方案9所述的缀合物，其用作例如用于治疗脊髓性肌萎缩症的药物。
11.根据实施方案10所述的寡聚体，其中所述脊髓性肌萎缩症为I型、II型或III型脊髓性肌萎缩症。
12.一种药物组合物，其包含根据实施方案1所述的寡聚体或根据实施方案9所述的缀合物、以及可药用的稀释剂、载体、盐或辅料。
13.一种治疗脊髓性肌萎缩症的方法，所述方法包括向患有或认为可能患有脊髓性肌萎缩症的患者施用有效量的根据实施方案1所述的寡聚体、或根据实施方案9所述的缀合物、或根据实施方案12所述的药物组合物。
15.一种调控表达SMN2mRNA的人细胞中的SMN2mRNA剪接的方法，所述方法包括向所述人细胞施用根据实施方案1所述的寡聚体、或根据实施方案9所述的缀合物、或根据实施方案12所述的药物组合物，其中所述人细胞中的所述SMN2RNA剪接得到调控，并且全长SMN2mRNA与截短的SMN2mRNA的比例增加。
实施例
实施例1:寡核苷酸的设计
根据本发明，设计一系列寡核苷酸以靶向人SMN2基因组序列(Genbank登陆号NG_008728)。如表1所示，在某些位置(大写)有具有β-D-氧LNA单元的嵌合寡核苷酸，并且在其他位置(小写)有DNA单元。如所示出的，寡核苷酸靶向所述基因组序列的不同区域。“靶位点”表示在Genbank Acc.No.NG_008728上与所述寡核苷酸互补的第一个(5’-most)核苷酸的核苷酸数。在表1中，所有核苷间连接为硫代磷酸酯连接，并且所有LNA-胞嘧啶(大写)为5-甲基胞嘧啶。
表1靶向人SMN2的反义寡核苷酸序列
*寡聚序列和修饰：大写字母为β-D-氧LNA核苷，小写字母为DNA核苷。LNA胞嘧啶可选地为5-甲基胞嘧啶LNA。核苷间连接为硫代磷酸酯。
实施例2:体外模型：细胞培养
可以在多种细胞类型中的任意细胞类型中测试反义寡核苷酸对靶核酸表达的作用，条件是靶核酸以可测到的水平存在。靶核酸可内源表达、或通过瞬时或稳定转染编码所述靶标的核酸进行表达。靶核酸的表达水平可使用常规测量方法确定，例如Northern印迹分析、实时定量PCR、核糖核酸酶保护检验。为了示例性目的提供以下细胞类型，但是也可常规地使用其他细胞类型，条件是靶标在选定的细胞类型中表达。
细胞在如下所述的合适的培养基中培养，并保持在37℃、95-98％湿度和5％CO2中。细胞每周常规传代2-3次。
SMA1细胞：在具有10％胎牛血清(Biochrom,BCHS0115)和0,25μg/ml庆大霉素(G1397,Sigma)的Eagle’s最低必需培养基(Eagle’s Minimum Essential Medium，#M5650,Sigma)、2mM谷胺酰胺(AQ,#G8541,Sigma)和非必需氨基酸(11140-035,Invitrogen)中培养SMA1人类患者成纤维细胞系(目录ID No:GM03813，Coriell医学研究研究所,卡姆登,NJ)。该细胞系表达SMN2，但不表达SMN1，因此能代表SMA患者的情况。
实施例3:体外模型：利用脂质体转染，用反义寡核苷酸处理
对实施例2中列出的SMA1细胞系用寡核苷酸处理，使用阳离子脂质体制剂LipofectAMINE2000(#11668-019,Invitrogen)作为转染载体。将细胞与lipofectamine/寡核苷酸混合物一起接种在6孔细胞培养板(NUNC,#)中。所用的寡聚体终浓度为25nM。寡聚体-脂质体复合物的配制基本上按照制造商所述进行，使用不含血清的OptiMEM(#51985,Gibco)以及脂质体终浓度为2.5μg/mL的LipofectAMINE2000。如随后的实施例所述，转染24小时后制备总RNA(RNeasy Mini Kit,#74106,Qiagen)，进行反转录(M-MLV反转录酶和无规十聚体，#2044,#5722G,Ambion)，利用两个定制设计的TaqMan基因表达分析(#Applied Biosystems,AI39QW5,AI5I03D)进行实时定量PCR，从而检测全长转录本或外显子7跳跃的短转录本。使用GAPDH作为标准物。
结果在下述实施例7中示出(表2)。
实施例4:体外模型：RNA的提取和cDNA的合成
总RNA的分离和第一链的合成
根据制造商说明使用Qiagen RNeasy试剂盒(#74106,Qiagen)从如上所述转染的细胞中提取总RNA。根据制造商说明使用购自Ambion公司的MMLV-反转录酶(#2044,Ambion)和无规十聚体引物(#5722G,Ambion)试剂进行第一链的合成。
对于每个样品，用无RNase的H2O将0.3-0.4μg的总RNA调节至10.8μl，并与2μl无规十聚体(50μM)和4μl dNTP混合物(每种dNTP为2.5mM)混合，加热至70℃持续3分钟，之后将样品在冰上快速冷却。在冰上冷却所述样品后，向各个样品中加入2μl10xBuffer RT、1μl MMLV反转录酶(100U/μl)和0.25μl RNase抑制剂(10U/μl)，然后在42℃下孵育60分钟，在95℃下对酶进行热失活10分钟，然后将样品冷却至4℃。
实施例5:体外模型：通过实时PCR分析SMN2RNA剪接的寡核苷酸调控
可以使用本领域已知的各种方法分析SMN2表达的反义调控。例如，SMN2mRNA水平可以通过(例如)Northern印迹分析、竞争性聚合酶链式反应(PCR)或实时PCR来定量。实时定量PCR目前是优选的。RNA分析可在细胞总RNA或mRNA水平上进行。
RNA分离和RNA分析(如Northern印迹分析)的方法在本领域中是常规的，并且在例如John Wiley和Sons的现代分子生物学实验流程(Current Protocols in Molecular Biology)中教导了所述方法。实时定量PCR可使用市售可得的Multi-Color实时PCR检测系统(可购自Applied Biosystems公司)方便地完成。
SMN2mRNA水平的实时定量PCR分析
根据制造商的说明，使用定制设计的人SMN ABI Prism TaqMan检验(全长#AI5I03D,外显子7-跳跃#AI39QW5,Applied Biosystems)对人全长SMN2mRNA和外显子7跳跃的SMN2mRNA的样品的含量进行定量。将甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)mRNA的量作为内源对照以用于对样品制备中的任何变化进行校准。
根据制造商的说明，使用人GAPDH ABI Prism Pre-DevelopedTaqMan检验试剂(#4310884E,Applied Biosystems)对人GAPDHmRNA的样品含量进行定量。
实时定量PCR是本领域已知的技术，(例如)文献“Heid等，Real time quantitative PCR,Genome Research(1996),6:986-994”教导了该技术。
实时PCR：将来自如实施例5所述的第一链合成的cDNA稀释5倍，并利用购自Applied Biosystems公司的Taqman7500FAST或7900FAST通过实时定量PCR分析。将引物和探针与2x Taqman FastUniversal PCR master混合物(2x)(#4352042,Applied Biosystems)混合，并加入4μl cDNA中至终体积10μl。每个样品一式两份进行分析。由纯化自表达目的RNA的细胞系的物质制备cDNA，对两倍稀释的cDNA的检验产生了用于分析的标准曲线。对于无模板的对照，使用无菌水代替cDNA。PCR程序：95℃持续20秒，然后进行95℃3秒、60℃30秒的40个循环。使用Applied Biosystems Fast System1.3.1.21.版SDS软件或2.3版SDS软件，由所计算的阈值循环确定靶mRNA序列的相对量。
实施例6:体外分析:通过靶向SMN2SD6(内含子6)的5’区域的寡核苷酸化合物来对人SMN2mRNA剪接进行反义调控
通过脂质体转染，在SMA1细胞系中评价表1中示出的寡核苷酸在25nM的寡聚体浓度下调控SMN2mRNA剪接的潜力。这些寡核苷酸靶向SMN2内含子6中的剪接供体(SD6)的5’区域，该区域为之前在文献中未被靶向的区域。结果在表2中示出。
表2：人SMN2剪接的反义调控
以在SMA1细胞中、25nM下的相对于空转染细胞的下调百分比表示表2中的数据。寡核苷酸序列和修饰在表1中示出。
表2：LNA反义寡核苷酸在SMN2SD6(内含子6)的5’区域中的精确定位(tiling)
导致全长SMN2mRNA的水平高于对照的100％的寡核苷酸是优选的。由表2可以得知，具有SEQ ID NO:1、2、3-16、19-20、22和24-34的寡核苷酸使全长SMN2转录本实现了这样的升高。这些目前优选的寡聚体靶向Genbank Acc.No.NG_008728的核苷酸26231-26300。
SEQ ID NO:1、5、9、11、12、26、27、28、29、30和34的寡核苷酸证明，与对照(在该试验中为空转染的细胞)相比，全长SMN2mRNA的表达增加至约150％或更高，并且在这些试验中，SMN2Δ7mRNA表达降低，因此是特别优选的。如可以理解的，这些寡聚体导致剪接转换，从而提高了SMN2外显子7的包含并降低了功能差的截短SMN2Δ7转录本的水平。这些特别优选的化合物靶向NG_008728上的核苷酸位置26231-26246和26274-26300。
还优选的为基于所示出的反义寡聚体序列(例如)改变长度(更短或更长)和/或核碱基含量(例如类似物单元的类型和/或比例)的寡核苷酸，它们也提供了有利于全长转录本的对SMN2表达的良好调控，与对照相比优选为至少150％全长。
实施例7:体外分析:通过靶向SMN2ISS-E1(内含子6)区域的寡核苷酸化合物来对人SMN2mRNA剪接进行反义调控
通过脂质体转染，在SMA1细胞系中评价表1中示出的寡核苷酸在25nM的寡聚体浓度下调控SMN2mRNA剪接的潜力。结果在表3中示出。
表3:LNA-反义寡核苷酸在SMN2ISS-E1(内含子6)区域中的精确定位
以在SMA1细胞中、25nM下的相对于空转染细胞的下调百分比表示表3中的数据。寡核苷酸序列和修饰在表1中示出。
导致全长SMN2mRNA的水平高于对照的100％的寡核苷酸(如表3所示)是优选的。从表中可以看出，具有SEQ ID NO:35-38、40、41和45-49的寡聚体使全长SMN2转录本实现了这样的升高。这些寡聚体靶向Genbank Acc.No.NG_008728的核苷酸位置31881-31945。靶向Genbank Acc.No.NG_008728的核苷酸位置31890-31905和31918-31945的SEQ ID NO:53-59的寡聚体证明，与对照(在该试验中为空转染的细胞)相比，全长SMN2mRNA的表达增加至约200％或更高，并且在这些试验中，SMN2Δ7mRNA的表达降低，因此是特别优选的。如可以理解的，这些寡聚体导致剪接转换，从而提高了SMN2外显子7的包含并降低了功能差的截短SMN2Δ7转录本的水平。由于SEQ ID NO40的寡核苷酸在该试验中证明，与对照相比，全长SMN2增加至大于200％，并且SMNΔ7增加，因此也是特别优选的。这些特别优选的寡聚体靶向NG_008728上的核苷酸位置31890-31905和31918-31945。
还优选的为基于所示出的反义寡聚体序列(例如)改变长度(更短或更长)和/或核碱基含量(例如类似物单元的类型和/或比例)的寡聚体，它们也提供了相当的(与对照相比至少约200％)对SMN2剪接的调控以增加SMN2外显子7的包含(全长SMN2转录本增加)。
实施例8:体外分析:通过靶向SMN2ISE/ISS-E2(内含子7)区域的寡核苷酸化合物来对人SMN2mRNA剪接进行反义调控
通过脂质体转染，在SMA1细胞系中评价表1中示出的寡核苷酸在25nM的寡聚体浓度下调控SMN2mRNA剪接的潜力。结果在表4中示出。
表4：LNA-反义寡核苷酸在SMN2ISE/ISS-E2(内含子7)区域中的精确定位
以在SMA1细胞中、25nM下的相对于空转染细胞的下调百分比表示表4中的数据。寡核苷酸序列和修饰在表1中示出。
导致全长SMN2mRNA的水平高于对照的100％的寡核苷酸(如表4所示)是优选的。从表中可以看出，具有SEQ ID NO:60-80和83的寡聚体使全长SMN2转录本实现了这样的升高。这些寡聚体靶向Genbank Acc.No.NG_008728的核苷酸位置31211-32170。靶向Genbank Acc.No.NG_008728的核苷酸位置32115-32162的SEQ IDNO:62、63、65、66和69-77的寡聚体证明，与对照细胞(在该试验中为空转染的细胞)相比，全长SMN2mRNA的表达增加至约200％或更高，并且在这些试验中，SMN2Δ7mRNA的表达降低，因此是特别优选的。如可以理解的，这些寡聚体导致剪接转换，从而提高了SMN2外显子7的包含并降低了功能差的截短SMN2Δ7转录本的水平。由于SEQ ID NO79的寡核苷酸在该试验中证明，与对照相比，全长和SMNΔ7转录本有至少约200％的升高，因此也是特别优选的。这些特别优选的寡聚体靶向NG_008728上的核苷酸位置32115-32162。
还优选的为基于所示出的反义寡聚体序列(例如)改变长度(更短或更长)和/或核碱基含量(例如类似物单元的类型和/或比例)的寡聚体，它们也提供了相当的对SMN2剪接的调控以增加SMN2外显子7的包含(全长SMN2转录本增加)。
根据本文公开的内容，本文所描述和要求保护的所有组合物和方法可以不需要过度的实验而进行和执行。已经以优选的实施方案的方式对本发明的组合物和方法进行了描述，对本领域技术人员显而易见的是，各种变化可以应用于所述组合物和方法中。所有这些对本领域技术人员显而易见的相似的替代和修改应当视为在由所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围内。
Claims (16)
1.一种长度为10至30个核苷酸的寡聚体，包含至少一个LNA单元，其中所述寡聚体的核碱基序列与Genbank登陆号NG_008728(SEQ ID NO:167)或其天然存在的变体中的核苷酸26231-26300、31881-31945或32111-32170的相应区域至少80％互补。
2.根据权利要求1所述的LNA寡聚体，其中所述核碱基序列与Genbank登陆号NG_008728(SEQ ID NO:167)中的核苷酸26231-26246、26274-26300、31890-31905、31918-31945或32115-32162的相应区域至少80％互补。
3.根据权利要求1所述的寡聚体，其中所述寡聚体与Genbank登陆号NG_008728(SEQ ID NO:167)中的核苷酸26231-26300至少80％互补。
4.根据权利要求1所述的寡聚体，其中所述寡聚体的核碱基序列与SEQ ID NO:1、2、3-16、19-20、22、24-34、35-38、40、41、45-49、60-80或83的序列有至少80％的同一性。
5.根据权利要求1所述的寡聚体，其中所述寡聚体的核碱基序列具有SEQ ID NO:1、5、9、11、12、26、27、28、29、30、34、40、53-59、62、63、65、66、69-77或79的序列。
6.根据权利要求1至5中任意一项所述的寡聚体，其中所述寡聚体调控SMN2mRNA的剪接，从而导致全长SMN2mRNA转录本的水平升高。
7.根据权利要求1至6中任意一项所述的寡聚体，其中所述寡聚体不诱导RNAse H切割核酸靶标。
8.根据权利要求1至7中任意一项所述的寡聚体，其中所述寡聚体仅包含LNA核苷酸和DNA核苷酸。
9.根据权利要求1至8中任意一项所述的寡聚体，其具有小于4个连续的DNA单元，例如小于3个连续的DNA单元，例如小于2个连续的DNA单元。
10.根据权利要求1至9中任意一项所述的寡聚体，其中所述寡聚体包含LNA核苷酸和DNA核苷酸，其中所述寡聚体具有不大于3个连续的LNA单元，例如不大于2个连续的LNA单元，并且其中5’核苷酸为LNA单元，并且3’核苷酸为LNA单元，所述3’核苷酸例如为23’核苷酸。
11.根据权利要求1至10中任意一项所述的寡聚体，其中所述寡聚体的长度为12至16个核苷酸。
12.根据权利要求1至11中任意一项所述的寡聚体，其中所述寡聚体为硫代磷酸酯寡聚体。
13.一种缀合物，包含根据权利要求1至12中任意一项所述的寡聚体、以及至少一个共价连接至所述寡聚体的非核苷酸或非多核苷酸部分。
14.权利要求1至12中任意一项所述的寡聚体或根据权利要求13所述的缀合物，其用作例如用于治疗脊髓性肌萎缩症的药物，所述脊髓性肌萎缩症例如为I型、II型或III型脊髓性肌萎缩症。
15.一种药物组合物，包含根据权利要求1至12中任意一项所述的寡聚体或根据权利要求13所述的缀合物、以及可药用的稀释剂、载体、盐或辅料。
16.一种调控表达SMN2mRNA的人细胞中的SMN2mRNA剪接的体外方法，所述方法包括对所述人细胞施用根据权利要求1至12中任意一项所述的寡聚体、或根据权利要求13所述的缀合物、或根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述人细胞中的所述SMN2RNA的剪接得到调控，并且全长SMN2mRNA与截短的SMN2mRNA的比例增加。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201161558462P | 2011-11-11 | 2011-11-11 | |
| US61/558,462 | 2011-11-11 | ||
| PCT/EP2012/072100 WO2013068441A1 (en) | 2011-11-11 | 2012-11-08 | Compounds for the modulation of smn2 splicing |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103946380A true CN103946380A (zh) | 2014-07-23 |
Family
ID=47178001
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201280055524.XA Pending CN103946380A (zh) | 2011-11-11 | 2012-11-08 | 用于调控smn2剪接的化合物 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20140343127A1 (zh) |
| EP (1) | EP2776563A1 (zh) |
| JP (1) | JP2014533944A (zh) |
| KR (1) | KR20140091587A (zh) |
| CN (1) | CN103946380A (zh) |
| AU (1) | AU2012334045A1 (zh) |
| BR (1) | BR112014011018A2 (zh) |
| CA (1) | CA2855241A1 (zh) |
| EA (1) | EA201400566A1 (zh) |
| IL (1) | IL232380A0 (zh) |
| MA (1) | MA35635B1 (zh) |
| TN (1) | TN2014000200A1 (zh) |
| WO (1) | WO2013068441A1 (zh) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8802642B2 (en) | 2010-04-28 | 2014-08-12 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Spinal muscular atrophy treatment via targeting SMN2 catalytic core |
| ES2932304T3 (es) * | 2014-04-17 | 2023-01-17 | Biogen Ma Inc | Composiciones y métodos para la modulación del empalme de SMN2 en un sujeto |
| GB201410693D0 (en) | 2014-06-16 | 2014-07-30 | Univ Southampton | Splicing modulation |
| WO2016040748A1 (en) | 2014-09-12 | 2016-03-17 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for detection of smn protein in a subject and treatment of a subject |
| EP3201339A4 (en) | 2014-10-03 | 2018-09-19 | Cold Spring Harbor Laboratory | Targeted augmentation of nuclear gene output |
| SG11201802870RA (en) | 2015-10-09 | 2018-05-30 | Univ Southampton | Modulation of gene expression and screening for deregulated protein expression |
| US11096956B2 (en) | 2015-12-14 | 2021-08-24 | Stoke Therapeutics, Inc. | Antisense oligomers and uses thereof |
| SG11201804443UA (en) | 2015-12-14 | 2018-06-28 | Cold Spring Harbor Laboratory | Antisense oligomers for treatment of autosomal dominant mental retardation-5 and dravet syndrome |
| US11198867B2 (en) | 2016-06-16 | 2021-12-14 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Combinations for the modulation of SMN expression |
| RS65031B1 (sr) | 2017-08-25 | 2024-02-29 | Stoke Therapeutics Inc | Antisens oligomeri za lečenje stanja i bolesti |
| WO2019213525A1 (en) | 2018-05-04 | 2019-11-07 | Stoke Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for treatment of cholesteryl ester storage disease |
| EP4013387A4 (en) * | 2019-08-15 | 2023-09-27 | Biogen MA Inc. | COMBINATION THERAPY FOR SPINAL MUSCLE ATROPHY |
| AU2021225957A1 (en) | 2020-02-28 | 2022-09-08 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Compounds and methods for modulating SMN2 |
| MX2022014151A (es) | 2020-05-11 | 2022-11-30 | Stoke Therapeutics Inc | Oligomeros antisentido de opa1 para tratamiento de afecciones y enfermedades. |
Family Cites Families (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4914210A (en) | 1987-10-02 | 1990-04-03 | Cetus Corporation | Oligonucleotide functionalizing reagents |
| US4962029A (en) | 1987-10-02 | 1990-10-09 | Cetus Corporation | Covalent oligonucleotide-horseradish peroxidase conjugate |
| US6617442B1 (en) | 1999-09-30 | 2003-09-09 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Human Rnase H1 and oligonucleotide compositions thereof |
| US7087229B2 (en) | 2003-05-30 | 2006-08-08 | Enzon Pharmaceuticals, Inc. | Releasable polymeric conjugates based on aliphatic biodegradable linkers |
| US7838657B2 (en) | 2004-12-03 | 2010-11-23 | University Of Massachusetts | Spinal muscular atrophy (SMA) treatment via targeting of SMN2 splice site inhibitory sequences |
| DK3308788T3 (da) | 2005-06-23 | 2019-01-02 | Biogen Ma Inc | Sammensætninger og fremgangsmåder til modulering af smn2-splejsning |
| WO2007031091A2 (en) | 2005-09-15 | 2007-03-22 | Santaris Pharma A/S | Rna antagonist compounds for the modulation of p21 ras expression |
| ES2516815T3 (es) | 2006-01-27 | 2014-10-31 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos modificados en la posición 6 |
| WO2007134181A2 (en) | 2006-05-11 | 2007-11-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 5'-modified bicyclic nucleic acid analogs |
| CA2662520A1 (en) | 2006-09-15 | 2008-03-20 | Enzon Pharmaceuticals, Inc. | Polymeric conjugates containing positively-charged moieties |
| MX2009002859A (es) | 2006-09-15 | 2009-03-30 | Enzon Pharmaceuticals Inc | Enlazadores biodegradables a base de ester impedido para suministro de oligonucleotidos. |
| EP2090127A2 (en) | 2006-10-30 | 2009-08-19 | Nokia Corporation | Method, apparatus and system providing operator controlled mobility for user equipment |
| EP2170917B1 (en) | 2007-05-30 | 2012-06-27 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs |
| EP2173760B2 (en) | 2007-06-08 | 2015-11-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Carbocyclic bicyclic nucleic acid analogs |
| EP2176280B2 (en) | 2007-07-05 | 2015-06-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 6-disubstituted bicyclic nucleic acid analogs |
| US8546556B2 (en) | 2007-11-21 | 2013-10-01 | Isis Pharmaceuticals, Inc | Carbocyclic alpha-L-bicyclic nucleic acid analogs |
| ES2573981T3 (es) * | 2009-04-10 | 2016-06-13 | Association Institut De Myologie | Oligonucleótidos antisentido de triciclo-ADN, composiciones, y métodos para el tratamiento de enfermedades |
| WO2010120820A1 (en) | 2009-04-13 | 2010-10-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for modulation of smn2 splicing |
| AU2010262862C1 (en) | 2009-06-17 | 2020-04-30 | Biogen Ma Inc. | Compositions and methods for modulation of SMN2 splicing in a subject |
-
2012
- 2012-11-08 CN CN201280055524.XA patent/CN103946380A/zh active Pending
- 2012-11-08 BR BR112014011018A patent/BR112014011018A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2012-11-08 KR KR1020147015781A patent/KR20140091587A/ko not_active Application Discontinuation
- 2012-11-08 CA CA2855241A patent/CA2855241A1/en not_active Abandoned
- 2012-11-08 EA EA201400566A patent/EA201400566A1/ru unknown
- 2012-11-08 EP EP12784575.8A patent/EP2776563A1/en not_active Withdrawn
- 2012-11-08 JP JP2014540450A patent/JP2014533944A/ja active Pending
- 2012-11-08 AU AU2012334045A patent/AU2012334045A1/en not_active Abandoned
- 2012-11-08 US US14/357,385 patent/US20140343127A1/en not_active Abandoned
- 2012-11-08 WO PCT/EP2012/072100 patent/WO2013068441A1/en active Application Filing
-
2014
- 2014-04-30 IL IL232380A patent/IL232380A0/en unknown
- 2014-05-02 TN TNP2014000200A patent/TN2014000200A1/en unknown
- 2014-05-07 MA MA36990A patent/MA35635B1/fr unknown
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| HUA YIMIN ET AL: "Antisense masking of an hnRNP A1/A2 intronic splicing silencer corrects SMN2 splicing in transgenic mice", 《AMERICAN JOURNAL OF HUMAN》 * |
| MIYAJIMA ET AL1: "Identification of a Cis-acting Element for the Regulation of SMN Exon 7 Splicing", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 * |
| MIYASO ET AL: "An Intronic Splicing Enhancer Element in Survival Motor Neuron (SMN) Pre-mRNA", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2776563A1 (en) | 2014-09-17 |
| JP2014533944A (ja) | 2014-12-18 |
| US20140343127A1 (en) | 2014-11-20 |
| KR20140091587A (ko) | 2014-07-21 |
| CA2855241A1 (en) | 2013-05-16 |
| WO2013068441A1 (en) | 2013-05-16 |
| MA35635B1 (fr) | 2014-11-01 |
| TN2014000200A1 (en) | 2015-09-30 |
| AU2012334045A1 (en) | 2014-04-24 |
| BR112014011018A2 (pt) | 2017-05-02 |
| IL232380A0 (en) | 2014-06-30 |
| EA201400566A1 (ru) | 2014-09-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103946380A (zh) | 用于调控smn2剪接的化合物 | |
| CN101932709B (zh) | 靶向雄激素受体的lna拮抗剂 | |
| TWI657819B (zh) | 用於調節τ蛋白表現之組合物 | |
| EP3126499B1 (en) | Compositions for modulating sod-1 expression | |
| DK2563920T3 (en) | Modulation of transthyretin expression | |
| CN105452464A (zh) | 用于调节肌强直性营养不良蛋白激酶(dmpk)表达的化合物和方法 | |
| CN104968783A (zh) | 用于调节c9orf72表达的组合物 | |
| CN105247052A (zh) | B-细胞cll/淋巴瘤11a(bcl11a)的寡核苷酸调节剂及其用途 | |
| CN101842483A (zh) | 用于调节β-联蛋白的RNA拮抗剂化合物 | |
| JP2021511042A (ja) | Ａｌｄｈ２発現を阻害するための組成物及び方法 | |
| KR20220024153A (ko) | 안지오포이에틴 유사 7(angptl7) 관련 질환의 치료 | |
| US20220389430A1 (en) | Chemical modifications of small interfering rna with minimal fluorine content | |
| CN101939429A (zh) | 用于调节pik3ca表达的rna拮抗剂化合物 | |
| KR101839177B1 (ko) | Ｐｔｐｉｂ 발현의 안티센스 조절 | |
| EP4358973A1 (en) | Rnai agents for inhibiting expression of xanthine dehydrogenase (xdh), pharmaceutical compositions thereof, and methods of use | |
| WO2020139764A1 (en) | Compositions and methods for inhibiting hmgb1 expression | |
| JP2022513111A (ja) | Ａｎｇｐｔｌ８を阻害するための新規のｒｎａ組成物および方法 | |
| CN102802637A (zh) | 新的有力的抗apob反义化合物 | |
| US20110054011A1 (en) | RNA Antagonist Compounds for the Modulation of FABP4/AP2 | |
| CN105980560A (zh) | 抑制β2GPI表达的核酸 | |
| KR20200014320A (ko) | Apcs의 발현을 억제하는 핵산 | |
| CN102203255A (zh) | 靶向hsp27的rna拮抗剂 | |
| JP7017193B2 (ja) | Ｒｎａ作用抑制剤及びその利用 | |
| JP2013039036A (ja) | ＨＩＦ−２αの発現を抑制する核酸 | |
| CA3235941A1 (en) | Compositions and methods for modulating apoc3 expression |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20140723 |