KR20140091587A - Smn2 스플라이싱의 조절을 위한 화합물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 저조하게 기능하는 말단절단된 전사체, SMN2 Δ7 보다는 전장(full length) SMN2 mRNA를 선호하는, SMN2 mRNA 스플라이싱의 조절을 야기하는, 세포에서 사람 SMN2를 암호화하는 핵산을 표적으로 하는 올리고머 화합물(올리고머)와 관련된다. SMNA7 mRNA 발현의 감소 및/또는 전장(full length) SMN2 mRNA 발현의 증가는 SMN2의 비정상인 형태 특히 SMN2 Δ7의 과발현 또는 바람직하지 않게 높은 수준과 관련된 질환 또는 장애, 예컨대 척수성 근위축(spinal muscular atrophy)(SMA)의 치료에 유익하다.
Description
본 발명은 SMN2 mRNA 스플라이싱의 조절을 야기하는, SMN2(survival of motor neuron 2) RNA를 표적화하는 올리고머 화합물(올리고머)에 관한 것이다. SMN2 스플라이싱의 조절은 척수성 근위축(spinal muscular atrophy)(SMA)의 치료에 유익한 것으로 생각된다.
척수성 근위축(spinal muscular atrophy)(SMA)은 척수의 운동 뉴런의 퇴화로 특징지어지는 상염색체 열성 유전 신경근 질환이며, 사지와 몸통의 점차적인 위약(weakness), 이어서 근위축과 호흡 부전에 의한 사망을 야기한다. SMA는 유아기에서 사망의 가장 흔한 유전적 원인이다. SMA 환자는 일반적으로 발생 연령과 임상 경과를 기초로 유형 Ⅰ-Ⅲ으로 분류된다. 그러나, SMA의 세 가지 유형은 모두 생존 운동 뉴런 유전자(SMN1 )의 돌연변이에 의해 야기된다; SMA 환자의 96%는 상기 유전자에 돌연변이를 보여준다. Wirth, B. (2000), Human Mutation, 15: 228-237. 동일한 염색체 좌위(locus), 5q13에 이 유전자의 두 개의 거의 동일한 유전자의 복제(copy)인 SMN1와 SMN2가 있다. SMN1의 기능 돌연변이 또는 결손(deletion)의 동형 접합 손실(homozygous loss)은 SMA에 책임이 있다; 대조적으로, SMN2의 동형 접합 결여(homozygous absence)는 임상 표현형(clinical phenotype)을 가지지 않고 건강한 대조군의 약 5%에서 발견된다. SMN1과 SMN2 사이의 단일 뉴클레오티드 차이는 SMN2 엑손 7의 스킵핑(skipping)과 SMN△7로 지칭되는 주로 비기능적인 단백질의 생산을 야기하기 때문에 SMN2의 존재는 SMN1 결여의 효과를 필연적으로 완화시키지 않는다. SMA 질환 심각도는 존재하는 SMN2 유전자의 게놈 복제(genomic copy)의 수에 반비례한다.
SMA 연구에서 주요한 목표는 SMN2로부터 기능적 SMN 단백질의 발현을 개선해왔다. 스플라이싱(splicing)의 조절에 의한 SMN2 엑손 7 포함물(inclusion)의 증가는 SMA에서 전장(full length) SMN 단백질 수준을 올리는 수단으로서 대단히 연구되고 있다.
엑손 내에 위치한 신호(signal)는 스플라이싱 동안 그 엑손의 인식에 긍정적 또는 부정적 영향을 미칠 수 있다. 엑손 스플라이싱 인핸서(Exonic splicing enhancer)(ESEs)는 스플라이싱을 자극하고 종종 효율적인 인트론(intron) 제거를 위해 요구되는 반면에, 엑손 스플라이싱 사일런서(exonic splicing silencer)(ESS)는 스플라이싱을 억제한다. SMN2와 SMN1 사이의 단일 뉴클레오티드 차이는 아마도 엑손 스플라이싱 인핸서(ESE)를 파괴함 및/또는 그것을 대신 hnRNP A1에 결합하는 엑손 스플라이싱 사일런서(ESS)로 전환함에 의해, SMN2 엑손 7 스킵핑에 대한 주요한 원인으로서 널리 받아들여진다[Kashima 외, (2003) Nature Gen 34:460-463; Cartegni 외, (2006) Am J Hum Genet. January; 78(1): 63-77; Hua 외 (2007) PLoS 5(4):e73].
추가적으로 몇몇 시스-작용(cis-acting) 스플라이싱 조절 요소는 엑손 7과 그 주변 인트론 서열에 지도화되었다(도 1에 요약됨). 인트론 6에서 ISS-E1으로 명명된 두 개의 공개된 사일런서 서열[Miyajima 외, (2002) J. Biol. Chem 277:23271 -23277)과 인트론 6의 3'ss에 가까운 명명되지 않은 사일런서(Hua 외, (2008) Am J Hum Genet 82:834-848]가 있다.
엑손 7(Tra23 결합 부위)의 또 다른 인핸서는 또한 엑손 7 포함물에 중요하다. 엑손 7의 말단의 스템 루프(stem loop) 구조(TSL-2)는 인트론 7의 5'ss에 대한 Ul snRNP 모집(recruitment)과 경쟁하고[Singh 외, (2006) Nucl. Acids Res. 35:371 -389; Hua 외, 2007] 그렇게 함으로써 엑손 7 스킵핑을 향상시킨다. 인트론 7에서 스플라이싱 사일런서 ISS-N1은 엑손 7 스키핑을 향상시키고 탠덤 hnRNPA1/A2 모티프(tandem hnRNPA1/A2 motif)로서 특징지어졌다(Singh 2006; Hua 2008). 두 번째 모티프, ISE-E2는 엑손 7 스플라이싱에 대한 인핸서로 처음 기술되었지만 [Miyajima 외, (2003) J. Biol. Chem 278:15825-15831] hnRNP A1 결합 부위는 나중에 가까이에 지도화되었다. 결합 부위는 SMN1과 SMN2 사이에서 A→G 전이(transition)에 의해 발생되고 이 요소의 두 기능을 가진 특성을 나타낸다 [Kashima 외, (2007) Proc. Natl. Acad. Sci.104:3426-3431].
SMN 단백질 자체가 프리-mRNA(pre-mRNA) 스플라이싱 경로에서 기능하기 때문에, 이 단백질이 그것의 자체의 프리-mRNA(pre-mRNA)에 영향을 미칠 수 있다고 제안되었다. Jodelka 등은 SMN 단백질의 양(abundance)은 부분적으로, SMN2 대안적인(alternative) 스플라이싱의 결과를 결정하는 것을 보였다. 그들의 결과는 SMN 단백질에 있어서의 추가적인 감소를 야기하는, 낮은 SMN 단백질 수준이 SMN2 엑손 7 스킵핑을 악화시키는 것에 의한 SMN 발현에서 피드백 루프를 확인한다. 이들 결과는 저자들이 SMN 단백질 양의 완만한 증가가 SMN 발현에서 불균형적으로 큰 증가를 일으키고 따라서 치료 효과의 상당한 가능성을 일으킬 수 있다는 제안을 하도록 하였다. Jodelka, F.M. 외 Hum Mol Genet. 2010 December 15; 19(24): 4906-4917.
여러 노력이 생체 외(in vitro) 실험뿐만 아니라 생체 내(in vivo) 마우스 모델에서 올리고뉴클레오티드를 사용하여 SMN2 스플라이싱을 조절하기 위해 있었다. 엑손 7에서 특이적으로 변형된 2'-메톡시에톡시 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드(2'-methoxyethoxy phosphorothiate oligonucleotide) 및 상기 엑손의 60 뉴클레오티드 상류(upstream) 및 하류(downstream) 내 서열에 대한 서열의 광범위한 표적화(targeting)를 기술하는 특허 출원이 있다. 이것은 공개된 영역 ISS (인트론 6), 엑손 7 내 ESE/ISS 및 TSL2 및 인트론 7 내 ISS-N1를 포함한다(ISIS& Krainer 외, 특허WO/2007/002390 A2; Hua 외,2008). 이러한 생성된 선도 올리고뉴클레오티드, 포스포로티오에이트 백본을 가진, 18-머(mer) 균일한 2'-MOE 올리고머(18-mer uniform 2'-MOE oligomer)는 ISS-N1을 표적으로 하고, 추가로 조사되었고 마우스 모델(WO/2010/120820 A1, WO/2010/148249 A1)로 취해졌고, 단일(single) 뇌실내(intraventricular) 주입이 척수의 모든 영역에 올리고뉴클레오티드의 추정상의 치료학적 수준을 전달하는 것을 보이는 시아노몰거스(cynomolgus) 원숭이로 취해졌다. Passini 외 (2011) 3:72ra18. Singh 외는 ISS-N1 영역을 표적으로 한 집중적인 접근법을 사용하였다[US20070292408, Singh 외, (2009) RNA Biol. 6:341-350. 특히, ISS-N1를 표적으로 하는 짧은 8머(mer) 2'-O-메틸포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드(8mer 2'- O-methyl phosphorothioate oligonucleotide)가 기술되었고 효율적으로 엑손 7 포함물을 증가시켰다.
또한 ISS-E1 (인트론 6)을 표적으로 하는, 단일 2'-0-메틸 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드(single 2'-0-methyl phosphorothioate oligonucleotide)와 ISE/ISS-E2 (인트론 7)을 표적으로 하는 단일 2'-0-메틸 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 사용하는 생체 외(in vitro) 데이터가 있다. 본원에서 관찰되는 것과 대조적으로, 첫 번째("올리고-요소 1 ", Miyajima 2002)는 엑손 7 포함물을 증가시키는 것으로 발견되었고, 인트론 7에서 "요소 2"를 표적으로 하는, 두 번째는 엑손 7 포함물을 감소시키는 것으로 나타났다[Miyaso 외 (2003) J. Biol. Chem 278:15825-15831]. Baughan 등은 인트론 6에서 ISS-E1 요소에 SR-단백질을 지원하는 스플라이스(splice)를 모집하기 위해 두 가지 기능을 가진 2'-0 메틸 올리고뉴클레오티드를 사용했다[Baughan 외. (2009) Hum Mol Ther. 18:1600-1611 ].
광범위한 노력에도 불구하고, 어떠한 안티센스(antisense) 화합물도 SMA에 대한 치료제로서 알려지지 않았다. 본 발명의 LNA 올리고머는 특히 스플라이스 스위칭(splice switching)에 적합한 것으로 생각되었고 따라서 SMN2 스플라이싱을 조절하고, 따라서 이 유전 상태의 징후를 완화시키는 치료 용도를 가지는 것으로 생각되었다.
본원에서 제공하는 것은 10 내지 30 뉴클레오티드 길이의 올리고머이고 이것은 적어도 하나의 잠금 핵산(Locked Nucleic Acid)(LNA) 유닛을 포함하고, 추가로 10 내지 30 뉴클레오염기(nucleobase) 길이의 뉴클레오염기 서열을 포함하며, 여기서 상기 뉴클레오염기 서열은 젠뱅크 수탁번호(Genbank Accession No.) NG_008728 (서열번호 167)의 뉴클레오티드 26231-26300, 31881-31945, 또는 32111-32170에 상응하는 영역 또는 이의 자연적으로 발생하는 변이체에 적어도 80% 상보적이다.
상기 올리고머는 전장(full length) mRNA 전사체(transcript)의 수준의 증가를 초래하는 SMN2 mRNA의 스플라이싱을 조절할 수 있다. 상기 올리고머는 RNAse H 분열을 유도(elicit)하지 않는 올리고머일 수 있다.
일부 양태에서. 올리고머 서열은 젠뱅크 수탁번호(Genbank Accession No.) NG_008728(서열번호 167)의 뉴클레오티드 26231-26246, 26274-26300, 31890-31905, 31918-31945 또는 32115-32162에 상응하는 영역에 적어도 80% 상보적이다. 다른 양태에서, 올리고머 서열은 젠뱅크 수탁번호(Genbank Accession No.) NG_008728(서열번호 167)의 뉴클레오티드 26231-26300에 적어도 80% 상보적이다. 상기 올리고머는 서열번호 1, 2, 3-16, 19-20, 22, 24-34, 35-38, 40, 41, 45-49, 60-80 또는 83의 서열과 적어도 80% 동일한 뉴클레오염기 서열을 가질 수 있고, 서열번호 1, 5, 9, 11, 12, 26, 27, 28, 29, 30, 34, 40, 53-59, 62, 63, 65, 66, 69-77 또는 79를 가질 수 있다.
일부 양태에서, 상기 올리고머는 스플라이싱을 조절하여 전장(full length) SMN2 전사체의 양을 대조군(control)의 110% 초과, 대조군의 120% 초과, 대조군의 130% 초과, 대조군의 140% 초과, 대조군의 150% 초과 대조군의 160% 초과, 대조군의 170% 초과, 대조군의 180% 초과, 대조군의 190% 초과, 또는 대조군의 200% 초과로 증가시킬 수 있다. 상기 올리고머는 12 내지 16 길이의 뉴클레오티드일 수 있고 믹스머(mixmer)일 수 있다.
또한 제공되는 것은 상술한 올리고머와 상기 올리고머에 공유 부착된 적어도 하나의 비-뉴클레오티드(non-nucleotide) 또는 비-폴리뉴클레오티드(non-polynucleotide) 모이어티(moiety)를 포함하는 접합체(conjugate)이다. 상기 올리고머 또는 접합체는 예컨대 유형 Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ 척수성 근위축(spinal muscular atrophy)을 포함하는 척수성 근위축의 치료를 위한 약제로서 사용될 수 있다.
또한 제공되는 것은 상술한 올리고머 또는 상기 접합체, 및 약제학적으로 허용가능한 희석제, 담체(carrier), 염 또는 보조제를 포함하는 조성물이다. 또한 제공되는 것은 척수성 근위축의 치료방법이고, 상기 방법은 상술한 올리고머, 접합체, 또는 약제학적 조성물의 유효한 양을 척수성 근위축을 앓고 있거나 앓는 것 같다고 생각되는 환자에게 투여하는 것(단계)을 포함한다.
본원에서 제공되는 올리고머, 접합체 또는 약제학적 조성물을 사용하여, SMN2 mRNA를 발현하는 사람 세포에서 SMN2 mRNA의 스플라이싱을 조절하기 위한 방법이 또한 제공된다. 예를 들어, 상기 방법은 생체 내(in vivo) 또는 생체 외(in vitro)일 수 있다.
도 1은 표적 서열(target sequence) 상에 사람 SMN2 유전자 (회색 박스)의 엑손 6, 7 및 8, 인트론 6 및 7(각각, 엑손 6 및 7 사이와 엑손 7 및 8 사이에 위치함), 5' 및 3' 스플라이스 부위(ss) 및 일련의 스플라이싱 조절 서열(ISS, ESE/ESS, ISE/ISS, 등)을 보여주는 도식적인 라인이다.
올리고머
본 발명은 사람 SMN2을 암호화하는 핵산 분자, 예컨대 젠뱅크 수탁번호(Genbank Accession No.) NG_008728의 SMN2 핵산 및 사람 SMN2을 암호화하는 이러한 핵산 분자의 자연적으로 발생하는 변이체의 기능을 조절하는데 사용하기 위한 올리고머 화합물(본원에서 올리고머로 지칭됨)을 이용한다. 젠뱅크 수탁번호(Genbank Accession No.) NG_00828은 모든 엑손을 포함하는 사람 SMN2 전사체 변이체 d를 암호화하는 게놈 핵산 서열이다.
본 발명의 문맥에서 용어 "올리고머"는, 2 또는 그 초과의 뉴클레오티드의 공유 연결에 의해 형성된 분자를 지칭한다(즉, 올리고뉴클레오티드). 본원에서, 단일 뉴클레오티드(유닛)는 또한 모노머(monomer) 또는 유닛으로 지칭될 수 있다. 일부 양태에서, 용어 "뉴클레오시드", "뉴클레오티드", "유닛" 및 "모노머"는 상호교환적으로 사용된다. 뉴클레오티드 또는 모노머의 서열을 언급할 때, 염기의 서열, 예컨대 A, T, G, C 또는 U로서 지칭되는 것으로 인식될 것이다.
상기 올리고머는 10-50 길이의 뉴클레오티드, 예컨대 10-30 길이의 뉴클레오티드의 연속적인(contiguous) 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나 포함한다.
다양한 양태에서, 본 발명의 화합물은 RNA (유닛)을 포함하지 않는다. 본 발명에 따른 화합물은 선형 분자이거나 선형 분자로서 합성되는 것이 바람직하다. 상기 올리고머는 단일 가닥 분자이고, 바람직하게는 동일한 올리고머 안에 동등한 영역에 상보적인(즉, 이중나선(duplex)을 형성할 수 있는), 예를 들어, 적어도 3, 4 또는 5 연속적인(contiguous) 뉴클레오티드의 짧은 영역을 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 상기 올리고머는 필수적으로 이중 가닥이 아니고, 즉, siRNA가 아니다. 다양한 양태에서, 본 발명의 올리고머는 전적으로 연속적인(contiguous) 뉴클레오티드 영역으로 이루어질 수 있다. 따라서, 상기 올리고머는 실질적으로 자가-상보적(self-complementary)이 아니다.
표적(
Target
)
적절하게 본 발명의 올리고머는 사람 SMN2 mRNA의 스플라이싱을 조절할 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 올리고머는 일반적으로 사람 세포에서 SMN2의 비정상적인 스플라이싱에 영향을 미칠 수 있다. 이해되는 바와 같이, "비정상적인(aberrant)"은 과도한, 원하지 않는 또는 부적절함을 의미한다.
본 발명의 올리고머는 SMN2 핵산에 결합하고 대조군(예를 들어, 비처리된 또는 모의(mock) 처리된 대조군)에 비해 전장(full length) SMN2 mRNA의 수준을 증가시키고 (즉, 대조군 수준의 100% 초과), 더욱 바람직하게는 전장 SMN2 RNA의 수준을 정상 발현 수준(예컨대 올리고머(들) 또는 접합체(들)이 없을 때의 발현 수준)에 비해 적어도 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% 또는 200% 또는 그 초과 증가시킨다. 바람직하게 전장 SMN2 mRNA의 수준은 대조군의 적어도 150%, 더욱 바람직하게 200% 증가하고, 즉, 인트론 7 포함물(inclusion)이 증가된다. 일부 양태에서, 전장 SMN2 mRNA가 증가함에 따라 SMN2 Δ7 mRNA의 수준이 감소한다(엑손 7 배제물(exclusion)이 감소함). 다른 양태에서, 전장 SMN2와 SMN2 Δ7 mRNA가 둘 다 증가한다.
일부 양태에서 본 발명의 올리고머는 SMN2 mRNA 스플라이싱의 조절을 필요로 하는 포유 동물, 바람직하게는 사람에 투여된다. 상기 올리고머 투여량은, 예를 들어, 하루 당(일일) 약 0.1 내지 약 100mg/kg 체중 예컨대 0.1 및 1 mg/kg 체중, 또는 하루 당(일일) 약 1.0 내지 10 mg/kg 체중일 수 있다. 따라서, 70 kg 사람에게 투여하기 위해, 일부 양태에서, 상기 투여량 범위는 하루 당(일일) 약 7 mg 내지 0.7 g일 수 있다. 일부 양태에서 상기 올리고머의 각 용량은, 예를 들어, 약 0.1 mgs/kg 또는 1 mg/kg와 20mg/kg의 약 10mg/kg 사이,(즉, 예를 들어 0.1 내지 20 mg/kg, 예컨대 1 mg/kg 내지 12mg/kg의 범위)일 수 있다. 그러므로 개별 용량은 예를 들어, 약 0.2mg/kg, 예컨대 약 0.3mg/kg, 예컨대 약 0.4mg/kg, 예컨대 약 0.5mg/kg, 예컨대 약 0.6mg/kg, 예컨대 약 0.7mg/kg, 예컨대 약 0.8mg/kg, 예컨대 약 0.9mg/kg, 예컨대 약 1 mg/kg, 예컨대 약 2mg/kg, 예컨대 약 3mg/kg, 예컨대 약 4mg/kg, 예컨대 약 5mg/kg, 예컨대 약 6mg/kg, 예컨대 약 7mg/kg, 예컨대 약 8mgs/kg, 예컨대 약 9mg/kg, 예컨대 약 10mg/kg일 수 있다. 일부 양태에서 상기 올리고머의 용량은 7mg/kg 미만, 예컨대 5mg/kg 미만 또는 3mg/kg 미만이다. 일부 양태에서 상기 올리고머의 용량은 0.5mg/kg 초과, 예컨대 1 mg/kg 초과이다. 일부 양태에서, 상기 올리고머의 각 투여 사이의 시간 간격은 예를 들어, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 및 매주로 이루어진은 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 양태에서 투여 사이의 시간 간격은 적어도 하루걸러(격일), 예컨대 적어도 매 3일, 예컨대 적어도 매 4일, 예컨대 적어도 매 5일, 예컨대 적어도 매 6일, 예컨대 매주, 예컨대 적어도 매 2주(격주로) 또는 적어도 매 3 또는 4주, 또는 적어도 매달이다.
일부 양태에서, 이러한 조절은 본 발명의 화합물의 0.04 내지 25 nM, 예컨대 0.8 내지 20 nM, 예를 들어, 0.5, 1, 5, 20 또는 25 nM을 사용할 때 보인다. 다른 양태에서, 이러한 조절은 본 발명의 화합물의 5 내지 25 μΜ, 예컨대 8 내지 20μΜ, 예를 들어, 1, 5, 20 μΜ 또는 25 μΜ을 사용할 때 보인다. 전장 SMN2의 스플라이싱의 조절은 SMN 단백질 수준을 측정함으로써, 예를 들어 예컨대 SDS-PAGE 뒤이어 표적 단백질의 적절한 영역에 대한 적합한 항체를 사용하는 웨스턴 블로팅(western blotting)의 방법에 의해 결정될 수 있다. 대안으로, 스플라이싱의 조절은 mRNA 수준을 측정함으로써, 예를 들어, 예컨대 전장 및/또는 Δ7 mRNA에 대한 적절한 프로브(probe)를 사용하는 노던 블로팅(northern blotting) 또는 정량적 RT-PCR에 의해 결정될 수 있다.
본원에 예시된 바와 같이 세포 유형은, 일부 양태에서, SMA를 가지는 사람 환자로부터 유래된 세포, 예컨대 SMA 섬유아세포 세포주 예컨대 GM03813, 의학 연구를 위한 코넬 연구소, 캠던 뉴저지(Cornell Institute for Medical Research, Camden NJ))일 수 있다. 일부 양태에서, 사용된 올리고머의 농도는 5nM일 수 있다. 일부 양태에서, 사용된 올리고머의 농도는 25nM일 수 있다. 일부 양태에서, 올리고머의 농도는 0.5 nM 또는 1 nM일 수 있다. 이 올리고머의 농도는 일반적으로 실시예에서 도시된 바와 같이, 형질감염(transfection)(리포펙션(Lipofection))을 사용하여, 생체 외(in vitro) 세포 분석에 사용된다. 형질감염제(transfection agent)가 없을 때에, 표적의 하향-조절을 얻기 위해 필요한 올리고 농도는 일반적으로 1 내지 25μΜ, 예컨대 5μΜ이다.
따라서 본 발명은 SMN2 mRNA을 발현하는 세포에서 SMN2 mRNA의 스플라이싱을 조절하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명에 따른 올리고머 또는 접합체를 상기 세포에 투여하여 상기 세포에서 SMN2 mRNA의 스플라이싱을 조절하는 것(단계)을 포함한다. 적절하게 상기 세포는 사람세포, 예컨대 SMA 환자로부터의 세포이다. 일부 양태에서, 상기 투여는 생체 외(in vitro)에서 발생할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 투여는 생체 내(in vivo)에서 발생할 수 있다.
용어 "표적 핵산"은 본원에서 사용되는 바와 같이, 사람 SMN 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 또는 RNA, 예컨대 젠뱅크 수탁번호(Genbank Accession No.) NG_008728 또는 이의 자연적으로 발생하는 변이체, 및 그로부터 유래된 RNA 핵산, 바람직하게는 프리-mRNA(pre-m RNA) 및 성숙한 mRNA를 포함하는 RNA를 지칭한다. 일부 양태에서, 예를 들어 연구 또는 진단에 사용되는 경우, "표적 핵산"은 상기 DNA 또는 RNA 핵산 표적으로부터 유래된 cDNA 또는 합성 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명에 따른 올리고머는 표적 핵산에 혼성화(hybrid) 시킬 수 있다. 젠뱅크 수탁번호(Genbank Accession No.) NG_008728은 비록 cDNA 서열에서 우라실(uracil)이 티미딘(thymidine)으로 대체되긴 하지만, 게놈 DNA 서열이고, 그 자체가 프리-mRNA 표적 서열에 상응하는 것으로 이해될 것이다. 프리-mRNA의 표적화가 스플라이싱의 조절을 위해 바람직하다. 스플라이싱의 조절의 문맥에서 "mRNA를 표적화 하는"과 "RNA를 표적화 하는"은 "프리-mRNA를 표적화 하는"을 의미하는 의도인 것으로 이해될 것이다. "SMN2 스플라이싱"은 인트론이 성숙한 SMN2 mRNA를 생산하기 위해 SMN2 프리-mRNA로부터 스플라이싱되는 성숙 과정을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
용어 "이의 자연적으로 발생하는 변이체"는 정의된 분류학상의 그룹, 즉, 사람 내 자연적으로 존재하는 핵산 서열의 SMN 폴리펩티드의 변이체를 지칭한다. 일반적으로, 폴리뉴클레오티드의 "자연적으로 발생하는 변이체"를 언급할 때 상기 용어는 또한 염색체 전좌(translocation) 또는 중복(duplication)으로부터 발생하는 SMN-암호화 게놈 DNA, 및 RNA, 예컨대 그로부터 유래하는 mRNA의 임의의 대립 형질 변이체 포함할 수 있다. "자연적으로 발생하는 변이체"는 또한 SMN2 mRNA의 대안적인 스플라이싱에서 유래하는 변이체를 포함할 수 있다. 특정 폴리펩티드 서열을 지칭할 때, 예를 들어, 상기 용어는 또한 예를 들어 공동 또는 후-번역의 변형, 예컨대 신호 펩티드 절단(signal peptide cleavage), 단백질분해성 절단(proteolytic cleavage), 당화(glycosylation), 등에 의해 그러므로 가공될 수 있는, 단백질의 자연적으로 발생하는 형태를 포함한다.
서열
올리고머는 NG_008728에 존재하는 뉴클레오티드 서열의 역 상보(reverse complement)에 상응하는 연속적인(contiguous) 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이루어질 수 있다. 따라서, 예를 들어, 올리고머는 서열번호 1-83으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나 이루어질 수 있고, 여기서 상기 올리고머(또는 이의 연속적인(contiguous) 뉴클레오티드 부분)은 상기 선택된 서열에 대해 1, 2, 또는 3 개의 미스매치(mismatch)를 임의로(선택적으로) 가질 수 있다.
올리고머는 사람 SMN(예를 들어, 젠뱅크 수탁번호(Genbank accession number) NG_008728)을 암호화하는 핵산에 동등한 영역에 완전히 상보적인 (100% 상보적인) 연속적인(contiguous) 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이루어질 수 있다. 따라서, 상기 올리고머는 안티센스(antisense) 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이루어질 수 있다. 그러나, 일부 양태에서, 올리고머는 표적 서열과 혼성화(hybrid)하였을 때, 1, 2, 3, 또는 4 (또는 그 초과) 미스매치(mismatch)를 허용(tolerate)할 수 있고 표적과 아직 충분히 결합할 수 있어 원하는 효과, 즉 표적의 스플라이싱의 조절을 보여줄 수 있다. 예를 들어, 미스매치(mismatch)는 올리고머 뉴클레오티드 서열의 증가된 길이 및/또는 뉴클레오티드 서열 내에 존재하는 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 LNA의 증가된 수에 의해 보상될 수 있다.
일부 양태에서, 상기 연속적인(contiguous) 뉴클레오티드 서열은 표적 서열, 예컨대 사람 SMN을 암호화하는 핵산의 상응하는 영역에 혼성화(hybrid)하였을 때, 3 이하, 예컨대 2 이하 미스매치(mismatch)를 포함한다. 일부 양태에서, 연속적인(contiguous) 뉴클레오티드 서열은 표적 서열, 예컨대 사람 SMN을 암호화하는 핵산의 상응하는 영역에 혼성화(hybrid)하였을 때, 단일 미스매치 이하를 포함한다.
본 발명의 올리고머의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1-83으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 상응하는 서열에 바람직하게 적어도 80% 상동, 예컨대 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96% 상동, 적어도 97% 상동, 적어도 98% 상동, 또는 적어도 99% 상동, 예컨대 100% 상동(동일)이다.
본 발명의 올리고머의 뉴클레오티드 서열은 NG_008728에 존재하는 상응하는 서열의 역 상보(reverse complement)에 바람직하게 적어도 80% 상동, 예컨대 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96% 상동, 적어도 97% 상동, 적어도 98% 상동, 또는 적어도 99% 상동, 예컨대 100% 상동(동일)이다.
본 발명의 올리고머의 뉴클레오티드 서열은 NG_008728에 존재하는 서브-서열(sub-sequence)에 바람직하게 적어도 80% 상보, 예컨대 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96% 상보, 적어도 97% 상보, 적어도 98% 상보, 또는 적어도 99% 상보, 예컨대 100% 상보(완전히 상보적)이다.
일부 양태에서 상기 올리고머(또는 이의 연속적인(contiguous) 뉴클레오티드 부분)은 서열번호 1-83, 또는 이의 적어도 10 연속적인(contiguous) 뉴클레오티드의 서브-서열(sub-sequence)로 이루어지는 군으로부터 선택되거나 선택된 서열의 하나를 포함하고, 여기서 상기 올리고머는 상기 서열과 비교될 때 임의로(선택적으로) 1, 2, 또는 3개의 미스매치(mismatch)를 포함할 수 있다.
일부 양태에서 상기 올리고머 또는 서브-서열(sub-sequence)은 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 29 연속적인(contiguous) 뉴클레오티드, 예컨대 12-22로부터, 예컨대 12-18 뉴클레오티드로부터 이루어질 수 있다. 일부 양태에서, 상기 올리고머는 16 뉴클레오티드의 길이이고 서열번호 1-20, 22, 24, 26, 28, 또는 30-83의 하나의 서열을 갖는다. 또한 다른 양태에서, 상기 올리고머는 12 뉴클레오티드의 길이이고 서열번호 21, 23, 25, 27, 또는 29의 서열을 갖는다.
적절하게, 일부 양태에서, 서브-서열(sub-sequence)은 본 발명의 올리고머의 연속적인 뉴클레오티드 서열과 같은 길이이다. 그러나, 일부 양태에서 상기 올리고머의 뉴클레오티드 서열은 표적 서열에 비-상보적인 추가적인 5' 또는 3', 예컨대, 독립적으로 1, 2, 3, 4 또는 5 추가적인 5' 및/또는 3'을 포함할 수 있는 것으로 인식된다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 1에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 2에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 3에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 4에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 5에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 6에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 7에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 8에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 9에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 10에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 11에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 12에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 13에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 14에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 15에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 16에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 17에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 18에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 19에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 20에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 21에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 22에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 23에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 24에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 25에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 26에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 27에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 28에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 29에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 30에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 31에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 32에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 33에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 34에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 35에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 36에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 37에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 38에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 39에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 40에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 41에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 42에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 43에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 44에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 45에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 46에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 47에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 48에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 49에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 50에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 51에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 52에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 53에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 54에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 55에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 56에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 57에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 58에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 59에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 60에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 61에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 62에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 63에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 64에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 65에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 66에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 67에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 68에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 69에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 70에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 71에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 72에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 73에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 74에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 75에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 76에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 77에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 78에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 79에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 80에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 81에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 82에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
일부 양태에서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 83에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 서브-서열을 포함하거나 이루어진다.
본 발명의 올리고머(또는 이의 영역)와 사람 SMN, 예컨대 본원에서 개시되는 것을 암호화하는 핵산의 표적 영역 사이에, "상보성(complementarity)"의 정도를 결정하는 것에 있어서 "상보성"의 정도는 올리고머(또는 이의 영역)와 그것과 함께 최상으로 정렬한(best aligned) 표적 영역의 역 상보(reverse complement)의 서열 사이의 백분율 동일성(identity)(백분율 상동성(homology))으로서 표현된다. 상기 백분율은 2 서열 사이의 동일한 정렬된 염기의 개수를 세고, 올리고머 내 연속적인(contiguous) 모노머의 총 개수로 나누고, 그리고 100을 곱함으로써 계산될 수 있다. 이러한 비교에서, 간격(gap)이 존재한다면, 이러한 간격은 상기 간격 안에 모노머의 수가 본 발명의 올리고머와 표적 영역 사이에서 다른 영역이라기보다는 단지 미스매치(mismatch)인 것이 바람직하다.
유사하게, "상동성(homology)" 또는 "동일성(identity)"은 올리고머의 서열(또는 그것의 영역)과 그것과 함께 최상으로 정렬한 표적 영역의 서열 사이의 백분율 동일성(백분율 상동성)으로서 표현된다. 본원에서 사용된, 용어 "상동의(homologous)" 및 "상동성(homology)"은 용어 "동일한(identical)" 및 "동일성(identity)"와 상호교환할 수 있다.
용어 "상응하는(corresponding to)" 과 "상응하다(corresponds to)"는 올리고머의 뉴클레오티드 서열(즉 뉴클레오염기 또는 염기 서열) 또는 연속적인(contiguous) 뉴클레오티드 서열과 i)핵산 표적, 예컨대 SMN 단백질을 암호화하는 핵산, 예컨대 젠뱅크 수탁번호(Genbank Accession No.) NG_008728의 역 상보(reverse complement)의 서브-서열 및/또는 ii)본원에서 제공되는 뉴클레오티드 서열들 예컨대 서열번호 1-83, 또는 이의 서브-서열로 이루어진 군 중 어느 하나로부터 선택되는 추가 서열의 동등한 연속적인(contiguous) 뉴클레오티드 서열 사이의 비교를 지칭한다. 뉴클레오티드 유사체는 그들의 동등한 또는 대응하는 뉴클레오티드와 직접적으로 비교된다. i) 또는 ii) 하에 추가 서열에 상응하는 첫 번째 서열은 일반적으로 첫 번째 서열의 길이 이상의 서열(예컨대 연속적인(contiguous) 뉴클레오티드 서열)과 동일하거나, 또는 본원에서 기술되는 바와 같이, 어떤 양태에서, 상응하는 서열과 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 상동, 예컨대 100% 상동(동일)이다.
용어 "상응하는 뉴클레오티드 유사체(corresponding nucleotide analogue)"와 "상응하는 뉴클레오티드(corresponding nucleotide)"는 뉴클레오티드 유사체 내의 뉴클레오염기 및 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드가 동일하다는 것을 나타내기 위한 의도이다. 예를 들어, 뉴클레오티드의 2-디옥시리보스(deoxyribose) 유닛이 아데닌(adenine)과 연결될 때, 상기 "상응하는 뉴클레오티드 유사체"는 아데닌과 연결된 펜토스(pentose) 유닛(2-디옥시리보스와 다른)을 함유한다.
본원에서 사용되는 용어 "역 상보(reverse complement)", "역 상보적인(reverse complementary)" 및 "역 상보성(reverse complementarity)"은 용어 "상보(complement)", "상보적인(complementary)" 및 "상보성(complementarity)"과 상호교환적이다.
길이(
Length
)
올리고머는 총 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30의 연속적인(contiguous) 뉴클레오티드 길이의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이루어질 수 있다.
일부 양태에서, 올리고머는 총 10 내지 22 뉴클레오티드, 예컨대 12-18, 13-17 또는 12-16 뉴클레오티드, 예컨대 13, 14, 15, 또는 16의 연속적인(contiguous) 뉴클레오티드 길이의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이루어질 수 있다.
일부 양태에서, 올리고머는 총 10, 11, 12, 13, 또는 14의 연속적인(contiguous) 뉴클레오티드 길이의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이루어질 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명에 따른 올리고머는 22 이하의 뉴클레오티드, 예컨대 20 이하의 뉴클레오티드, 예컨대 18 이하의 뉴클레오티드, 예컨대 15, 16 또는 17 뉴클레오티드로 이루어진다. 일부 양태에서 본 발명의 올리고머는 20 미만의 뉴클레오티드를 포함한다. 올리고머, 또는 연속적인(contiguous) 뉴클레오티드 서열 길이에 대한 범위가 주어졌을 때, 그것은 범위에서 제공되는 상부 및 하부 길이, 예를 들어 10부터(또는 내지) 30은 10과 30을 둘 다 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
뉴클레오시드 및 뉴클레오시드 유사체
일부 양태에서, 용어 "뉴클레오시드 유사체" 및 "뉴클레오티드 유사체"는 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "뉴클레오티드"는 당 모이어티(sugar moiety), 염기 모이어티 및 공유 연결된 그룹(연결기), 예컨대 포스페이트(phosphate) 또는 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 뉴클레오티드간 연결기를 포함하는 글리코시드(glycoside)를 지칭하며, 본원에서 "뉴클레오티드 유사체"도 또한 지칭되는, 변형된 당 및/또는 염기 모이어티를 포함하는 비-자연적으로 발생하는 뉴클레오티드와 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 예컨대 DNA 또는 RNA 둘 다를 포함한다. 본원에서, 단일 뉴클레오티드(유닛)은 또한 모노머 또는 핵산 유닛으로서 지칭될 수 있다.
생화학 분야에서, 용어 "뉴클레오시드"는 일반적으로 당 모이어티 및 염기 모이어티를 포함하는 글리코시드를 지칭하는데 사용되며, 따라서 올리고머의 뉴클레오티드 사이에 뉴클레오티드간(internucleotide) 연결기에 의해 공유 연결되는, 뉴클레오티드 유닛을 지칭할 때 사용될 수 있다. 생물공학 분야에서, 용어 "뉴클레오티드"는 종종 핵산 모노머 또는 유닛을 지칭할 때 사용되며, 그 자체로 올리고뉴클레오티드의 문맥은 염기 - 예컨대 "뉴클레오티드 서열"을 지칭할 수 있고, 일반적으로 뉴클레오염기 서열(즉 당 백본 및 뉴클레오시드간(internucleoside) 연결기의 존재를 내포함)을 지칭할 수 있다. 유사하게, 특히 하나 또는 그 초과의 뉴클레오시드간 연결기가 변형된 올리고뉴클레오티드의 경우, 용어 "뉴클레오티드"가 "뉴클레오시드"로 지칭될 수 있고, 예를 들어 용어 "뉴클레오티드"는 뉴클레오시드 사이에 연결의 존재 또는 특성을 구체화하는 경우에도 사용될 수 있다.
당업자가 인식하는 것처럼, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 뉴클레오티드는 비록 5' 말단기를 포함하거나 포함하지 않을 수 있지만, 연결기의 5' 뉴클레오티드간(internucleotide) 연결기를 포함하지 않는다.
비-자연적으로 발생하는 뉴클레오티드는 변형된 당 모이어티, 예컨대 바이사이클릭(bicyclic) 뉴클레오티드 또는 2' 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 2' 치환된 뉴클레오티드를 가지는 뉴클레오티드를 포함한다.
"뉴클레오티드 유사체"는 자연의(natural) 뉴클레오티드, 예컨대 DNA 또는 RNA 뉴클레오티드의 당 및/또는 염기 모이어티에 있어서의 변형에 의한 변이체이다. 유사체는 올리고뉴클레오티드의 문맥에서 자연의 뉴클레오티드에 원칙적으로 단지 "사일런트(침묵)(silent)" 또는 "동등(equivalent)"일 수 있고, 즉 올리고뉴클레오티드가 표적 유전자 발현을 억제하는 작용 방식에 기능적인 효과가 없을 수 있다. 그러한 "동등한" 유사체는 그럼에도 불구하고 예를 들어, 그들은 더 쉽게 또는 더 저렴하게 제조되거나, 또는 저장 또는 제조 조건에 더욱 안정적이거나, 또는 태그 또는 라벨을 나타낼 수 있으면, 유용할 수 있다. 그러나, 바람직하게는 상기 유사체는 발현을 억제하는 작용 방식에, 예를 들어 표적에 대한 증가된 결합 친화도 및/또는 세포 내 뉴클레아제(nuclease)에 증가 된 저항(내성) 및/또는 세포 내로 전송의 증가된 용이성을 생산하는 것에 의해 기능적인 효과를 가질 수 있다. 뉴클레오시드 유사체의 구체적인 예시는 예를 들어, Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 및 Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213, 및 도식 1에 기술된다:
도식 1
올리고머는 따라서 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드-바람직하게 2'-디옥시뉴클레오티드(2'-deoxynucleotide)(본원에 일반적으로 "DNA"로 지칭됨), 하지만 또한 가능하게 리보뉴클레오티드(ribonucleotide)(본원에 일반적으로 "RNA"로 지칭됨), 또는 이러한 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 및 하나 또는 그 초과의 비-자연적으로 발생하는 뉴클레오티드, 즉 뉴클레오티드 유사체의 조합을 포함하거나 이루어질 수 있다. 이러한 뉴클레오티드 유사체는 표적 서열에 대한 올리고머의 친화도를 적합하게 향상할 수 있다.
적합하고 바람직한 뉴클레오티드 유사체의 예시가 WO2007/031091에 의해 제공되거나 본원에 참조 된다.
올리고머에서 친화도-향상된 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 LNA 또는 2'-치환된 당의 포함은, 특이적으로 결합하는 올리고머의 크기가 감소 되도록 할 수 있고, 또한 비특이적인 또는 비정상적인 결합이 발생하기 전에 올리고머의 크기의 상한을 감소시킬 수 있다.
일부 양태에서, 올리고머는 적어도 1 뉴클레오시드 유사체를 포함한다. 일부 양태에서, 올리고머는 적어도 2 뉴클레오시드 유사체를 포함한다. 일부 양태에서, 올리고머는 적어도 3부터 8 뉴클레오시드 유사체, 예를 들어 6 또는 7 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 매우 가장 바람직한 양태에서, 상기 뉴클레오티드 유사체의 적어도 하나는 잠금 핵산(locked nucleic acid)(LNA)이고; 예를 들어 뉴클레오티드 유사체의 적어도 3 또는 적어도 4, 또는 적어도 5, 또는 적어도 6, 또는 적어도 7, 또는 8은 LNA일 수 있다. 일부 양태에서 모든 뉴클레오티드 유사체는 LNA일 수 있다; 다른 양태에서 뉴클레오티드 유사체의 대략 절반은 LNA일 수 있다.
단지 뉴클레오티드를 이루어진, 바람직한 뉴클레오티드 서열 모티프(motif) 또는 뉴클레오티드 서열을 지칭할 때, 그 서열에 의해 정의되는 본 발명의 올리고머는 상기 서열에 존재하는 하나 또는 그 초과의 뉴클레오티드의 대신에 상응하는 뉴클레오티드 유사체(즉, 동일한 뉴클레오염기를 가지는), 예컨대 올리고머/표적 이중나선(duplet)의 이중나선 안정성/Tm을 높이는, LNA 유닛 또는 다른 뉴클레오티드 유사체(즉, 친화도 향상된 뉴클레오티드 유사체)를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 올리고머의 뉴클레오티드 서열과 표적 서열 사이의 임의의 미스매치(mismatch)는 친화도 향상 뉴클레오티드 유사체의 바깥쪽(outside), 및/또는 올리고뉴클레오티드 내의 비변형된 예컨대 DNA 뉴클레오티드의 부위, 및/또는 연속적인(contiguous) 뉴클레오티드 서열에 대한 5' 또는 3'인 영역에서 바람직하게 발견된다.
뉴클레오티드의 이러한 변형의 예시는 결합 친화도를 향상시키고 또한 증가된 뉴클레아제(nuclease) 저항(내성)을 제공하는 가교된(잠금 핵산) 구조를 생산하거나 2'-치환기를 제공하도록 당 모이어티를 변형하는 것을 포함한다.
바람직한 뉴클레오티드 유사체는 LNA, 예컨대 옥시(oxy)-LNA (예컨대 베타-D-옥시-LNA, 및 알파-L-옥시-LNA), 및/또는 아미노-LNA(예컨대 베타-D-아미노-LNA 및 알파-L-아미노-LNA) 및/또는 티오(thio)-LNA(예컨대 베타-D-티오-LNA 및 알파-L-티오-LNA) 및/또는 ENA(예컨대 베타-D-ENA 및 알파-L-ENA)이다. 가장 바람직한 것은 베타-D-옥시-LNA이다.
일부 양태에서 본 발명의 올리고머 내에 존재하는 뉴클레오티드 유사체는 독립적으로, 예를 들어: 2'-0-알킬-RNA 유닛, 2'-아미노-DNA 유닛, 2'-플루오로-DNA 유닛, LNA 유닛, 아라비노 핵산(arabino nucleic acid)(ANA) 유닛, 2'-플루오로-ANA 유닛, HNA 유닛, INA(인터칼레이팅(삽입) 핵산(intercalating nucleic acid)-Christensen, 2002. Nucl. Acids. Res. 2002 30: 4918-4925, 참조에 의해 본원에 포함됨) 유닛 및 2'MOE 유닛으로부터 선택된다. 일부 양태에서 본 발명의 올리고머에 존재하는 뉴클레오티드 유사체의 상기 유형의 단지 하나, 또는 이의 연속적인(contiguous) 뉴클레오티드 서열이 있다.
일부 양태에서 뉴클레오티드 유사체는 2'-0-메톡시에틸-RNA(2'MOE), 2'-플루오로-DNA 모노머 또는 LNA 뉴클레오티드 유사체이고, 및 그 자체로서 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 유사체의 이들 세 가지 유형으로부터 독립적으로 선택되는 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있거나, 또는 상기 세 가지 유형으로부터 선택되는 유사체의 단지 한 가지 유형을 포함할 수 있다. 일부 양태에서 상기 뉴클레오티드 유사체의 적어도 하나는 2'-MOE-RNA, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 2'-MOE-RNA 뉴클레오티드 유닛이다. 일부 양태에서 상기 뉴클레오티드 유사체의 적어도 하나는 2'-플루오로 DNA, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 2'-플루오로-DNA 뉴클레오티드 유닛이다.
일부 양태에서, 본 발명에 따른 올리고머는 적어도 하나의 잠금 핵산(Locked Nucleic Acid (LNA)) 유닛, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 LNA 유닛, 예컨대 3부터 7 또는 4 내지 8 LNA 유닛, 또는 3, 4, 5, 6 또는 7 LNA 유닛을 포함한다. 일부 양태에서, 모든 뉴클레오티드 유사체는 LNA이다. 일부 양태에서, 올리고머는 베타-D-옥시-LNA와 하나 또는 그 초과의 다음 LNA 유닛 둘 다: 베타-D 또는 알파-L 공간배열(configuration) 중 어느 하나 또는 이의 조합으로 티오(thio)-LNA, 아미노-LNA, 옥시- LNA 및/또는 EMA를 포함할 수 있다. 일부 양태에서 모든 LNA 시토신(cytosine) 유닛은 5'메틸-시토신이다. 본 발명의 일부 양태에서, 상기 올리고머는 LNA 및 DNA 유닛을 둘 다 포함할 수 있다. 바람직하게 조합된 LNA 및 DNA 유닛의 총수는 10-25, 예컨대 10-24, 바람직하게 10-20, 예컨대 10-18, 더욱 더 바람직하게는 12-16이다. 본 발명의 일부 양태에서, 올리고머의 뉴클레오티드 서열, 예컨대 연속적인(contiguous) 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 LNA로 이루어지고 남은 뉴클레오티드 유닛은 DNA 유닛이다. 일부 양태에서 상기 올리고머는 선택적으로 변형된 뉴클레오티드간(internucleotide) 연결 예컨대 포스포로티오에이트(phosphorothioate)를 가지는, 단지 LNA 뉴클레오티드 유사체와 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드(예컨대 RNA 또는 DNA, 가장 바람직하게 DNA 뉴클레오티드)를 포함한다.
용어 "뉴클레오염기(nucleobase)"는 뉴클레오티드의 염기 모이어티를 지칭하고 비자연적으로 발생하는 변이체뿐만 아니라 자연적으로 발생하는 변이체 둘 모두를 포함한다. 따라서, "뉴클레오염기"는 알려진 퓨린(purine)과 피리미딘(pyrimidine) 헤테로사이클(heterocycle)뿐만 아니라 이의 헤테로사이클릭 유사체 및 호변이성체(tautomer)를 포함한다.
뉴클레오염기의 예시는 아데닌(adenine), 구아닌(guanine), 시토신(cytosine), 티미딘(thymidine), 우라실(uracil), 잔틴(xanthine), 하이포잔틴(hypoxanthine), 5-메틸시토신(5-methylcytosine), 이소시토신(isocytosine), 슈도이소시토신(pseudoisocytosine), 5-브로모우라실(5-bromouracil), 5-프로피닐우라실(5-propynyluracil), 6-아미노퓨린(6-aminopurine), 2-아미노퓨린(2-aminopurine), 이노신(inosine), 디아미노퓨린(diaminopurine), 및 2-클로로-6-아미노퓨린(2-chloro-6-aminopurine)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 양태에서, 올리고머에 존재하는 적어도 하나의 뉴클레오염기는 5-메틸시토신(5-methylcytosine), 이소시토신(isocytosine), 슈도이소시토신(pseudoisocytosine), 5-브로모우라실(5-bromouracil), 5-프로피닐우라실(5-propynyluracil), 6-아미노퓨린(6-aminopurine), 2-아미노퓨린(2-aminopurine), 이노신(inosine), 디아미노퓨린(diaminopurine), 및 2-클로로-6-아미노퓨린(2-chloro-6-aminopurine)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 변형된 뉴클레오염기이다.
LNA
용어 "LNA"는 "잠금 핵산(Locked Nucleic Acid)"으로 알려진 바이사이클릭(bicyclic) 뉴클레오시드 유사체를 지칭한다. 이것은 LNA 모노머를 지칭할 수 있고, 또는 "LNA 올리고뉴클레오티드"의 문맥에서 사용될 때, LNA는 하나 또는 그 초과의 이러한 바이사이클릭 뉴클레오티드 유사체를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. LNA 뉴클레오티드는 예를 들어 하기에 기술되는 바와 같은, 이가 라디칼(biradical) R4 *- R2 *로서 나타낸 바와 같은 리보스 당 고리(ribose sugar ring)의 C2' 및 C4' 사이의 링커기(linker group)의 존재(예컨대 가교)에 의해 특징지어진다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 화합물에 사용되는 LNA는 바람직하게 일반식Ⅰ의 구조를 갖는다.
여기서 모든 키랄 중심에서, 비대칭 그룹은 R 또는 S 방향 중 어느 하나로 발견될 수 있고;
여기서 X는 -0-, -S-, -N(RN *)-, -C(R6R6 *)-, 예컨대, 일부 양태에서 -0-로부터 선택되고;
B는 수소, 임의로(선택적으로) 치환된 C1 -4-알콕시, 임의로(선택적으로) 치환된 C1 -4-알킬, 임의로(선택적으로) 치환된 C1 -4-아실옥시, 자연적으로 발생하는 것 및 뉴클레오염기 유사체를 포함하는 뉴클레오염기, DNA 인터칼레이터(intercalator), 광화학적으로 활성 그룹, 열화학적으로 활성 그룹, 킬레이팅 그룹, 리포터(reporter) 그룹, 및 리간드로부터 선택되고; 바람직하게 B는 뉴클레오염기 또는 뉴클레오염기 유사체이고;
P는 인접한(adjacent) 모노머에 대한 뉴클레오티드간(internucleotide) 연결기, 또는 5'-말단기, 예컨대 임의로(선택적으로) 치환기 R5 또는 동등하게 적용가능한 치환기 R5*를 포함하는 5'-말단기 또는 뉴클레오티드간 연결을 나타내고;
P*는 인접한(adjacent) 모노머에 대한 뉴클레오티드간 결합, 또는 3'-말단기를 나타내고;
R4 * 및 R2 *은 함께 -C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -0-, -Si(Ra)2-, -S-, -S02-, -N(Ra)-, 및 >C=Z로부터 선택되는 1-4 그룹/원자로 이루어지는 이가 링커기(bivalent linker group)를 나타내고, 여기서 Z는 -0-, -S-, 및 -N(Ra)-로부터 선택되고, Ra 및 Rb 각각은 독립적으로 수소, 임의로(선택적으로) 치환된 C1 -12-알킬, 임의로(선택적으로) 치환된 C2 -12-알케닐, 임의로(선택적으로) 치환된 C2 -12-알키닐, 히드록시, 임의로(선택적으로) 치환된 C2 -12-알콕시, C2 -12-알콕시알킬, C2 -12-알케닐옥시, 카르복시, C1 -12-알콕시카르보닐, C1 -12-알킬카르보닐, 포르밀(formyl), 아릴, 아릴옥시-카르보닐, 아릴옥시, 아릴카르보닐, 헤테로아릴, 헤테로-아릴옥시-카르보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카르보닐, 아미노, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노, 카르바모일, 모노- 및 디(C1 -6-알킬)-아미노-카르보닐, 아미노-C1 -6-알킬-아미노카르보닐, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노-C1 -6-알킬-아미노카르보닐, C1 -6-알킬-카르보닐아미노, 카르바아미도(carbamido), C1 -6-알카노일옥시, 술포노(sulphono), C1 -6-알킬술포닐옥시, 니트로(nitro), 아지도(azido), 술파닐(sulphanyl), C1 -6-알킬티오, 할로겐, DNA 인터칼레이터, 광화학적으로 활성 그룹, 열화학적으로 활성 그룹, 킬레이팅 그룹, 리포터(reporter) 그룹, 및 리간드로부터 선택되고, 여기서 아릴 및 헤테로아릴은 임의로(선택적으로) 치환될 수 있고 여기서 2 개의 제미널(하나의 원자에 한 쌍의 원자(단)이 결합한)(geminal) 치환기 Ra 및 Rb는 함께 임의로(선택적으로) 치환된 메틸렌(=CH2)을 나타낼 수 있고, 여기서 모든 키랄 중심에 대해, 비대칭 그룹은 R 또는 S 방향 중 어느 하나로 발견될 수 있고; 및
존재하는 각각의 치환기 R1 *, R2, R3, R5, R5 *, R6 및 R6 *는 독립적으로 수소, 임의로(선택적으로) 치환된 C1 -12-알킬, 임의로(선택적으로) 치환된 C2 -12-알케닐, 임의로(선택적으로) 치환된 C2 -12-알키닐, 히드록시, C1 -12-알콕시, C2 -12-알콕시알킬, C2 -12-알케닐옥시, 카르복시, C1 -12-알콕시카르보닐, C1 -12-알킬카르보닐, 포르밀(formyl), 아릴, 아릴옥시-카르보닐, 아릴옥시, 아릴카르보닐, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시-카르보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카르보닐, 아미노, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노, 카르바모일, 모노- 및 디(C1 -6-알킬)-아미노-카르보닐, 아미노-C1-6-알킬-아미노카르보닐, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노-C1 -6-알킬-아미노카르보닐, C1 -6-알킬-카르보닐아미노, 카르바아미도, C1 -6-알카노일옥시, 술포노(sulphono), C1 -6-알킬술포닐옥시, 니트로, 아지도, 술파닐, C1 -6-알킬티오, 할로겐, DNA 인터칼레이터, 광화학적으로 활성 그룹, 열화학적으로 활성 그룹, 킬레이팅 그룹, 리포터(reporter) 그룹, 및 리간드로부터 선택되고, 여기서 아릴 및 헤테로아릴은 임의로(선택적으로) 치환될 수 있고, 여기서 2 개의 제미널(하나의 원자에 한 쌍의 원자(단)이 결합한)(geminal) 치환기는 함께 옥소, 티오옥소(thioxo), 이미노, 또는 임의로(선택적으로) 치환된 메틸렌을 표시할 수 있고;; 여기서 RN은 수소 및 C1 -4-알킬로부터 선택되고, 여기서 2 개의 인접한(adjacent)(비-제미널(하나의 원자에 한 쌍의 원자(단)이 결합한)) 치환기는 이중 결합을 야기하는 추가적인 결합을 나타낼 수 있고; 및 RN *은, 존재하고 이가라디칼(biradical)에 연관되지 않을 때, 수소 및 C1 -4-알킬; 및 이의 염기성 염(basic salt)과 산 부가 염(acid addition salt)으로부터 선택된다. 모든 키랄 중심에 대해, 비대칭 그룹은 R 또는 S 방향 중 어느 하나로 발견될 수 있다.
일부 양태에서, R4 * 및 R2 * 는 함께 C(RaRb)-C(RaRb)-, C(RaRb)-0-, C(RaRb)-NRa-, C(RaRb)-S-, 및 C(RaRb)-C(RaRb)-0-로 이루어지는 군으로부터 선택되는 군으로 이루어진 이가라디칼(biradical)을 나타내고, 여기서 각각의 Ra 및 Rb는 임의로(선택적으로) 독립적으로 선택될 수 있다. 일부 양태에서, Ra 및 Rb는 임의로(선택적으로) 독립적으로 수소 및 C1 -6-알킬, 예컨대 메틸, 예컨대 수소로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 양태에서, R4 * 및 R2 * 는 함께 R- 또는 S- 공간배열 중 어느 하나로- 이가라디칼(biradical) -O-CH(CH2OCH3)- (2'0-메톡시에틸 바이사이클릭 핵산 - Seth 외, 2010, J. Org. Chem)을 나타낸다.
일부 양태에서, R4 * 및 R2 * 는 함께 R- 또는 S- 공간배열 중 어느 하나로- 이가라디칼 -O-CH(CH2CH3)- (2'O-에틸 바이사이클릭 핵산 - Seth 외, 2010, J. Org. Chem)을 나타낸다.
일부 양태에서, R4 * 및 R2 * 는 함께 R- 또는 S- 공간배열 중 어느 하나로- 이가라디칼 -0-CH(CH3)-을 나타낸다. 일부 양태에서, R4 * 및 R2 * 는 함께 이가라디칼 -0-CH2-0-CH2- - (Seth 외, 2010, J. Org. Chem)을 나타낸다.
일부 양태에서, R4 * 및 R2 * 는 함께 이가라디칼 -0-NR-CH3- - (Seth 외, 2010, J. Org. Chem)을 나타낸다.
일부 양태에서, LNA 유닛은 다음 그룹으로부터 선택되는 구조를 갖는다:
일부 양태에서, R1 *, R2, R3, R5, R5 *는 독립적으로 수소, 할로겐, C1 -6 알킬, 치환된 C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, 치환된 C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐 또는 치환된 C2 -6 알키닐, C1 -6 알콕실, 치환된 C1 -6 알콕실, 아실, 치환된 아실, C1 -6 아미노알킬 또는 치환된 C1 -6 아미노알킬로 이루어진 군으로부터 선택된다. 모든 키랄 중심에 대해, 비대칭 그룹은 R 또는 S 방향 중 어느 하나로 발견될 수 있다.
일부 양태에서, R1 *, R2, R3, R5, R5 *는 수소이다.
일부 양태에서, R1 *, R2, R3은 독립적으로 수소, 할로겐, C1 -6 알킬, 치환된 C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, 치환된 C2 -6 알케닐, C2-6 알키닐 또는 치환된 C2 -6 알키닐, C1 -6 알콕실, 치환된 C1 -6 알콕실, 아실, 치환된 아실, C1 -6 아미노알킬 또는 치환된 C1 -6 아미노알킬로 이루어진 군으로부터 선택된다. 모든 키랄 중심에 대해, 비대칭 그룹은 R 또는 S 방향 중 어느 하나로 발견될 수 있다.
일부 양태에서, R1 *, R2, R3은 수소이다.
일부 양태에서, R5 및 R5 *는 각각 독립적으로 H, -CH3, -CH2-CH3,- CH2-0-CH3, 및 -CH=CH2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 적절하게 일부 양태에서, R5 또는 R5 *중 어느 하나는 수소이고, 다른 그룹은 (R5 또는 R5 * 각각) C1 -5 알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, 치환된 C1 -6 알킬, 치환된 C2 -6 알케닐, 치환된 C2 -6 알키닐 또는 치환된 아실 (-C(=0)-)로 이루어진 군으로부터 선택되고; 여기서 각각의 치환기는 할로겐, C1 -6 알킬, 치환된 C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, 치환된 C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, 치환된 C2 -6 알키닐, OJ1, SJ1, NJ1J2, N3, COOJ1, CN, 0-C(=0)NJ1J2, N(H)C(=NH)NJ,J2 또는 N(H)C(=X)N(H)J2로부터 독립적으로 선택되는 치환기 그룹으로 모노(단일) 또는 폴리(다중) 치환되고 여기서 X는 O 또는 S이고; 및 각각의 J1 및 J2는, 독립적으로, H, C1 -6 알킬, 치환된 C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, 치환된 C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, 치환된 C2 -6 알키닐, C1 -6 아미노알킬, 치환된 C1 -6 아미노알킬 또는 보호기(protecting group)이다. 일부 양태에서 R5 또는 R5 * 중 어느 하나는 치환된 C1 -6 알킬이다. 일부 양태에서 R5 또는 R5 * 중 어느 하나는 치환된 메틸렌이고 여기서 바람직한 치환기는 F, NJ1J2, N3, CN, OJ1, SJ1, 0-C(=0)NJ1J2, N(H)C(=NH)NJ, J2 또는 N(H)C(0)N(H)J2으로부터 독립적으로 선택되는 하나 또는 그 초과의 그룹을 포함한다. 일부 양태에서 각각의 J1, 및 J2는, 독립적으로 H 또는 C1 -6 알킬이다. 일부 양태에서 R5 또는 R5 * 중 어느 하나는 메틸, 에틸 또는 메톡시메틸이다. 일부 양태에서 R5 또는 R5 * 중 어느 하나는 메틸이다. 추가 양태에서 R5 또는 R5 * 중 어느 하나는 에틸렌일(ethylenyl)이다. 일부 양태에서 R5 또는 R5 * 중 어느 하나는 치환된 아실이다. 일부 양태에서 R5 또는 R5 * 중 어느 하나는 C(=0)NJ1J2이다. 모든 키랄 중심에 대해, 비대칭 그룹은 R 또는 S 방향 중 어느 하나로 발견될 수 있다. 이러한 5' 변형된 바이사이클릭(bicyclic) 뉴클레오티드는 WO 2007/134181에 개시되고, 본원에 그것의 전체로서 참조에 의해 포함된다.
일부 양태에서 B는 예컨대 퓨린 또는 피리미딘, 또는 치환된 퓨린 또는 치환된 피리미딘, 예컨대 본원에 언급되는 뉴클레오염기, 예컨대 아데닌, 시토신, 티민(thymine), 아데닌, 우라실로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오염기, 및/또는 변형된 또는 치환된 뉴클레오염기, 예컨대 5-티아졸로-우라실, 2-티오-우라실, 5-프로피닐-우라실, 2'티오-티민, 5-메틸 시토신, 5-티오졸로-시토신, 5-프로피닐-시토신, 및 2,6-디아미노퓨린과 같은 뉴클레오염기 유사체 및 자연적으로 발생하는 뉴클레오염기를 포함하는 뉴클레오염기이다.
일부 양태에서, R4 * 및 R2 *는 함께 -C(RaRb)-0-, -C(RaRb)-C(RcRd)-0-, -C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-0-, -C(RaRb)-0-C(RcRd)-, -C(RaRb)-0-C(RcRd)-0-, -C(RaRb)-C(RcRd)-, -C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-, -C(Ra)=C(Rb)-C(RcRd)-, -C(RaRb)-N(Rc)-, -C(RaRb)-C(RcRd)- N(Re)-, -C(RaRb)-N(Rc)-0-, 및 - C(RaRb)-S-, -C(RaRb)-C(RcRd)-S-로부터 선택되는 이가라디칼을 나타내고, 여기서 Ra, Rb, Rc, Rd, Re, 및 Rf 각각은 독립적으로 수소, 임의로(선택적으로) 치환된 C1 -12-알킬, 임의로(선택적으로) 치환된 C2-12-알케닐, 임의로(선택적으로) 치환된 C2 -12-알키닐, 히드록시, C1 -12-알콕시, C2 -12-알콕시알킬, C2 -12-알케닐옥시, 카르복시, C1 -12-알콕시카르보닐, C1 -12-알킬카르보닐, 포르밀, 아릴, 아릴옥시-카르보닐, 아릴옥시, 아릴카르보닐, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시-카르보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카르보닐, 아미노, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노, 카르바모일, 모노- 및 디(C1 -6-알킬)-아미노-카르보닐, 아미노-C1 -6-알킬-아미노카르보닐, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노-C1 -6-알킬-아미노카르보닐, C1 -6-알킬-카르보닐아미노, 카르바아미도, C1 -6-알카노일옥시, 술포노(sulphonoo), C1 -6-알킬술포닐옥시, 니트로, 아지도(azido), 술파닐(sulphanyl), C1 -6-알킬티오, 할로겐, DNA 인터칼레이터(intercalator), 광화학적으로 활성 그룹, 열화학적으로 활성 그룹, 킬레이팅 그룹, 리포터(reporter) 그룹, 및 리간드로부터 선택되고, 여기서 아릴 및 헤테로아릴은 임의적으로(선택적으로) 치환될 수 있고 여기서 2 개의 제미널(geminal)(하나의 원자에 한 쌍의 원자(단)이 결합한) 치환기 Ra 및 Rb는 함께 임의적으로(선택적으로) 치환된 메틸렌(=CH2)일 수 있다. 모든 키랄 중심에 대해, 비대칭 그룹은 R 또는 S 방향 중 어느 하나로 발견될 수 있다.
추가 양태에서, R4 * 및 R2 *는 함께 -CH2-0-, -CH2-S-, -CH2-NH-, -CH2-N(CH3)-, -CH2-CH2-0-, -CH2-CH(CH3)-, -CH2-CH2-S-, -CH2-CH2-NH-, -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-0-, -CH2-CH2-CH(CH3)-, -CH=CH-CH2-, -CH2-0-CH2-0-, -CH2-NH-0-, -CH2-N(CH3)-0-, -CH2-0-CH2-, -CH(CH3)-0-, 및 -CH(CH2-0-CH3)-0-, 및/또는, -CH2-CH2-, 및 -CH=CH-로부터 선택되는 이가라디칼(이가 그룹)을 나타낼 수 있다. 모든 키랄 중심에 대해, 비대칭 그룹은 R 또는 S 방향 중 어느 하나로 발견될 수 있다.
일부 양태에서, R4 * 및 R2 *는 함께 이가라디칼 C(RaRb)-N(Rc)-0-을 나타내고, 여기서 Ra 및 Rb는 수소, 할로겐, C1 -6 알킬, 치환된 C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, 치환된 C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐 또는 치환된 C2 -6 알키닐, C1 -6 알콕실, 치환된 C1 -6 알콕실, 아실, 치환된 아실, C1 -6 아미노알킬 또는 치환된 C1 -6 아미노알킬, 예컨대 수소로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되고 및; 여기서 Rc는 수소, 할로겐, C1 -6 알킬, 치환된 C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, 치환된 C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐 또는 치환된 C2-6 알키닐, C1 -6 알콕실, 치환된 C1 -6 알콕실, 아실, 치환된 아실, C1 -6 아미노알킬 또는 치환된 C1 -6 아미노알킬, 예컨대 수소로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, R4 * 및 R2 *는 함께 이가라디칼(biradical) C(RaRb)-0-C(RcRd) -0-를 나타내고, 여기서 Ra, Rb, Rc 및 Rd는 수소, 할로겐, C1 -6 알킬, 치환된 C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, 치환된 C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐 또는 치환된 C2 -6 알키닐, C1 -6 알콕실, 치환된 C1 -6 알콕실, 아실, 치환된 아실, C1 -6 아미노알킬 또는 치환된 C1 -6 아미노알킬, 예컨대 수소로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
일부 양태에서, R4 * 및 R2 *는 이가라디칼 -CH(Z)-0-을 형성하고, 여기서 Z는 C1-6 알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, 치환된 C1 -6 알킬, 치환된 C2 -6 알케닐, 치환된 C2-6 알키닐, 아실, 치환된 아실, 치환된 아미드, 티올 또는 치환된 티오로 이루어지는 군으로부터 선택되고; 및 여기서 각각의 치환기는 할로겐, 옥소(oxo), 히드록시, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2 및 CN으로부터 독립적으로 선택된 임의적으로(선택적으로) 보호된 치환기로 모노(단일) 또는 폴리(다중) 치환되고, 여기서 각각의 J1, J2 및 J3은, 독립적으로, H 또는 C1 -6 알킬이고, 및 X는 O, S 또는 NJ1이다. 일부 양태에서 Z는 C1 -6 알킬 또는 치환된 C1 -6 알킬이다. 일부 양태에서 Z는 메틸이다. 일부 양태에서 Z는 치환된 C1 -6 알킬이다. 일부 양태에서 치환기는 C1 -6 알콕시이다. 일부 양태에서 Z는 CH3OCH2-이다. 모든 키랄 중심에 대해, 비대칭 그룹은 R 또는 S 방향 중 어느 하나로 발견될 수 있다. 이러한 바이사이클릭(bicyclic) 뉴클레오티드는 US 7,399,845에 개시되고 본원에 그것의 전체로서 참조에 의해 포함된다. 일부 양태에서, R1 *, R2, R3, R5, R5 * 는 수소이다. 일부 양태에서, R1 *, R2, R3 *는 수소이고, R5, R5 *의 하나 또는 둘 다는 상기 및 WO 2007/134181에서 언급된 바와 같은 수소 이외일 수 있다.
일부 양태에서, R4 * 및 R2 *는 함께 예컨대 이가라디칼 -CH2-N(Rc)-을 이루거나 포함하는 가교(bridge) 내 아미노기를 포함하는 이가라디칼을 나타내고, 여기서 Rc는 C1 -12 알킬옥시이다. 일부 양태에서 R4 * 및 R2 *는 함께 이가라디칼 -Cq3q4-Nor-을 나타내고, 여기서 q3 및 q4는 수소, 할로겐, C1 -6 알킬, 치환된 C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, 치환된 C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐 또는 치환된 C2 -6 알키닐, C1 -6 알콕실, 치환된 C1 -6 알콕실, 아실, 치환된 아실, C1 -6 아미노알킬 또는 치환된 C1 -6 아미노알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택될 수 있고; 여기서 각각의 치환기는 독립적으로, 할로겐, OJ1, SJ1, NJ1J2, COOJ1, CN, 0-C(=0)NJ1J2, N(H)C(=NH)NJ1J2 또는 N(H)C(=X=N(H)J2 으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 모노(단일) 또는 폴리(다중) 치환되고 여기서 X는 O 또는 S이고; 및 각각의 J1 및 J2은, 독립적으로, H, C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C1 -6 아미노알킬 또는 보호기(protecting group)이다. 모든 키랄 중심에 대해, 비대칭 그룹은 R 또는 S 방향 중 어느 하나로 발견될 수 있다. 이러한 바이사이클릭(bicyclic) 뉴클레오티드는 WO2008/150729에 개시되고 이것은 본원에 그것의 전체로서 참조에 의해 포함된다. 일부 양태에서, R1 *, R2, R3, R5, R5 * 는 수소, 할로겐, C1 -6 알킬, 치환된 C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, 치환된 C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐 또는 치환된 C2 -6 알키닐, C1 -6 알콕실, 치환된 C1 -6 알콕실, 아실, 치환된 아실, C1 -6 아미노알킬 또는 치환된 C1 -6 아미노알킬으로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 양태에서, R1 *, R2, R3, R5, R5 *는 수소이다. 일부 양태에서, R1 *, R2, R3 은 수소이고 R5, R5 *의 하나 또는 둘 다는 상기 및 WO 2007/134181에서 언급되는 바와 같이 수소 이외일 수 있다. 일부 양태에서 R4 * 및 R2*는 함께 이가라디칼(biradical) (이가 그룹) C(RaRb)-0-을 나타내고, 여기서 Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 할로겐, C1 -12 알킬, 치환된 C1 -12 알킬, C2 -12 알케닐, 치환된 C2-12 알케닐, C2 -12 알키닐, 치환된 C2 -12 알키닐, C1 -12 알콕시, 치환된 C1 -12 알콕시, OJ1 SJ1, SOJ1, SO2J1, NJ1J2, N3, CN, C(=0)OJ1, C(=0)NJ1J2, C(=0)J1, 0-C(=0)NJ1J2, N(H)C(=NH)NJ1J2, N(H)C(=O)NJ1J2 , 또는 N(H)C(=S)NJ1J2이고; 또는 Ra 및 Rb는 함께 =C(q3)(q4)이고; q3 및 q4는 각각, 독립적으로, H, 할로겐, C1 -12 알킬 또는 치환된 C1-12 알킬이고; 각각의 치환기는 독립적으로, 할로겐, C1 -6 알킬, 치환된 C1 -6 알킬, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 치환된 C2-C6 알키닐, OJ1, SJ1, NJ1J2, N3, CN, C(=0)OJ1, C(=0)NJ1J2, C(=0)J1, 0-C(=0)NJ1J2, N(H)C(=0)NJ1J2 또는 N(H)C(=S)NJ1J2로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 모노(단일) 또는 폴리(다중) 치환되고 및; 각각의 J1, 및 J2는, 독립적으로, H, C1 -C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 치환된 C2-C6 알키닐, C1-C6 아미노알킬, 치환된 C1-C6 아미노알킬 또는 보호기(protecting group)이다. 이러한 화합물은 WO2009006478A에 개시되고, 본원에 그것의 전체로서 참조에 의해 포함된다.
일부 양태에서, R4 * 및 R2 *는 이가라디칼 -Q-를 형성하고, 여기서 Q는 C(q1)(q2)C(q3)(q4), C(q1)=C(q3), C[=C(q1)(q2)]-C(q3)(q4) 또는 C(q1)(q2)-C[=C(q3)(q4)]이고; q1, q2, q3, q4은 각각 독립적으로. H, 할로겐, C1 -12 알킬, 치환된 C1 -12 알킬, C2 -12 알케닐, 치환된 C1 -12 알콕시, OJ1, SJ1, SOJ1, SO2J1, NJ1J2, N3, CN, C(=0)OJ1, C(=0)-NJ1J2, C(=0)J1, C(=0)NJ1J2, N(H)C(=NH)NJ1J2, N(H)C(=0)NJ1J2 또는 N(H)C(=S)NJ1J2이고, 각각의 J1 및 J2는, 독립적으로, H, C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C1 -6 아미노알킬 또는 보호기(protecting group)이고; 및, 임의로(선택적으로) Q가 C(q1)(q2)(q3)(q4)이고 및 q3 또는 q4의 하나가 CH3일 때 그리고 나서 적어도 하나의 다른 q3 또는 q4 또는 q1 및 q2 의 하나는 H 이외이다. 일부 양태에서, R1 *, R2, R3, R5, R5 * 는 수소이다. 모든 키랄 중심에 대해, 비대칭 그룹은 R 또는 S 방향 중 어느 하나로 발견될 수 있다. 이러한 바이사이클릭(bicyclic) 뉴클레오티드는 WO2008/154401에 개시되고 이것은 본원에 그것의 전체로서 참조에 의해 포함된다. 일부 양태에서, R1 *, R2, R3, R5, R5 * 는 수소, 할로겐, C1 -6 알킬, 치환된 C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, 치환된 C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐 또는 치환된 C2 -6 알키닐, C1 -6 알콕실, 치환된 C1 -6 알콕실, 아실, 치환된 아실, C1 -6 아미노알킬 또는 치환된 C1 -6 아미노알킬로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 양태에서, R1 *, R2, R3, R5, R5 * 는 수소이다. 일부 양태에서, R1 *, R2, R3은 수소이고 및 R5, R5 *의 하나 또는 둘 다는 상기 및 WO 2007/134181 또는 WO2009/067647에서 언급된 바와 같이 수소 이외일 수 있다(알파-L-바이사이클릭 핵산 유사체).
일부 양태에서 본 발명의 올리고뉴클레오티드 화합물에 사용되는 LNA는 바람직하게 일반식 II의 구조를 갖는다:
여기서 Y는 -0-, -CH20-, -S-, -NH-, N(Re) 및/또는 -CH2-으로 이루어지는 군에서 선택되고; Z 및 Z* 는 뉴클레오티드간 연결, RH, 말단기 또는 보호기 중에 독립적으로 선택되고; B는 자연적 또는 비-자연적 뉴클레오티드 염기 모이어티(뉴클레오염기)를 구성하고, 및 RH는 수소 및 C1 -4-알킬로부터 선택되고; Ra, Rb, Rc, Rd 및 Re는, 임의로(선택적으로) 독립적으로, 수소, 임의로(선택적으로) 치환된 C1 -12-알킬, 임의로(선택적으로) 치환된 C2 -12-알케닐, 임의로(선택적으로) 치환된 C2 -12-알키닐, 히드록시, C1 -12-알콕시, C2 -12-알콕시알킬, C2 -12-알케닐옥시, 카르복시, C1 -12-알콕시카르보닐, C1 -12-알킬카르보닐, 포르밀, 아릴, 아릴옥시-카르보닐, 아릴옥시, 아릴카르보닐, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시-카르보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카르보닐, 아미노, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노, 카르바모일, 모노- 및 디(C1 -6-알킬)-아미노-카르보닐, 아미노-C1 -6-알킬-아미노카르보닐, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노-C1 -6-알킬-아미노카르보닐, C1 -6-알킬-카르보닐아미노, 카르바아미도, C1 -6-알카노일옥시, 술포노(sulphono), C1 -6-알킬술포닐옥시, 니트로, 아지도(azido), 술파닐(sulphanyl), C1 -6-알킬티오, 할로겐, DNA 인터칼레이터(intercalator), 광화학적으로 활성 그룹, 열화학적으로 활성 그룹, 킬레이팅 그룹, 리포터(reporter) 그룹, 및 리간드로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 아릴 및 헤테로아릴은 임의로(선택적으로) 치환될 수 있고 여기서 2 개의 제미널(geminal)(하나의 원자에 한 쌍의 원자(단)이 결합한) 치환기 Ra 및 Rb는 함께 임의로(선택적으로) 치환된 메틸렌(=CH2)를 나타낼 수 있고; 및 RH는 수소 및 C1 -4-알킬로부터 선택될 수 있다. 일부 양태에서 Ra, Rb, Rc, Rd 및 Re는 임의로(선택적으로) 독립적으로, 수소 및 C1 -6 알킬, 예컨대 메틸로 이루어진 군으로부터 선택된다. 모든 키랄 중심에 대해, 비대칭 그룹은 R 또는 S 방향 중 어느 하나로 발견될 수 있고, 예를 들어 두 개의 예시적인 입체화학적 이성질체(stereochemical isomer)는 베타-D 및 알파-L 아이소폼(isoform)을 포함하고, 이것은 다음과 같이 예시될 수 있다:
특정한 예시적인 LNA 유닛은 하기와 같이 나타낸다:
용어 "티오-LNA(thio-LNA)"는 상기 일반식에서 Y는 S 또는 -CH2-S-에서 선택되는 잠금(locked) 뉴클레오티드를 포함한다. 티오-LNA는 베타-D 및 알파-L-공간배열 둘 다일 수 있다.
용어 "아미노-LNA(amino-LNA)"는 상기 일반식에서 Y는 -N(H)-, N(R)-, CH2-N(H)-, 및 -CH2-N(R)-로부터 선택되고 여기서 R은 수소 및 C1 -4-알킬로부터 선택되는 잠금 뉴클레오티드를 포함한다. 아미노-LNA는 베타-D 및 알파-L 공간배열 둘 다일 수 있다.
용어 "옥시-LNA(oxy-LNA)"는 상기 일반식에서 Y는 -0-를 나타내는 잠금 뉴클레오티드를 포함한다. 옥시-LNA는 베타-D 및 알파-L-공간배열 둘 다 일 수 있다.
용어 "ENA"는 상기 일반식에서 Y는 -CH2-0-(여기서 -CH2-0-의 산소 원자는 염기 B에 관하여 2'-위치에 부착된다)인 잠금 뉴클레오티드를 포함한다. Re는 수소 또는 메틸이다.
일부 예시적인 양태에서 LNA는 베타-D-옥시-LNA, 알파-L-옥시-LNA, 베타-D-아미노-LNA 및 베타-D-티오-LNA, 특히 베타-D-옥시-LNA로부터 선택된다.
RNAse
동원(
RNAse
recruitment
)
올리고머 화합물은 엔도리보뉴클레아제(endoribonuclease) (RNase) 예컨대 RNase H를 동원함에 의하여, 또는 예컨대 번역(translation)의 입체 장애 또는 스플라이싱의 조절에 의해 표적 mRNA의 분해를 매개하는 비 RNase를 통해 기능할 수 있다. EP 1 222 309 (특히 실시예 91-95)는 RNaseH를 동원하는 능력을 결정하는데 사용할 수 있는 RNaseH 활성을 결정하기 위한 생체 외(in vitro) 방법을 제공한다.
스플라이싱의
조절(
Modulation
of
Splicing
)
많은 진핵세포(eukaryotic) mRNA 전사체는 이것이 번역되기 전에 전사체(transcript)로부터 삭제(밖으로 스플라이싱)되는 "인트론"으로 알려진 하나 또는 그 이상의 영역을 함유한다. 스플라이싱 전에 RNA 전사체는 프리-mRNA(pre-mRNA)로 지칭된다. 남은(및 따라서 번역된) 영역은 "엑손"으로 알려져 있고 연속적인(continous)(성숙한) mRNA 서열을 형성하기 위해 함께 스플라이싱된다. mRNA 스플라이스 위치, 즉 인트론-엑손 연결(junction)은, 또한 바람직한 표적 영역이고, 그리고 비정상적인(aberrant) 스플라이싱이 질환에 연루되거나, 또는 특정 mRNA 스플라이스 산물이 질환에 연루되는 상황에 특히 유용하다. 본 발명에서와 같이 스플라이싱의 조절에 대해, 올리고뉴클레오티드는 세포에 존재하는 표적 mRNA의 양을 감소시킬 것인 핵산 표적의 RNAse H 절단(cleavage)을 유도하지 않는 것이 바람직하다. 대신에, 올리고머는 원하는 스플라이스 산물(이 경우, 전장 SMN2 mRNA)에 유리한 비정상적인 스플라이싱을 조절하는 목표와 함께, 비-RNAse H 방법을 통해 스플라이싱을 방해하도록 설계된다. 따라서 원하는 스플라이스 산물(mRNA 또는 그것의 단백질 산물)의 수준은 안티센스(antisense) 방법의 사용을 통해 실제로 증가될 수 있다.
믹스머
(
Mixmer
) 디자인
"믹스머(mixmer)"라 불리는 일부 "키메라(chimeric)" 올리고머는 (i) RNase에 의해 인식될 수 있고 절단될 수 있는 DNA 모노머(monomer) 또는 뉴클레오시드 유사체 모노머, 및 (ii) 비-RNase 동원되는(recruiting) 뉴클레오시드 유사체 모노머의 대체 조성물로 이루어진다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 바람직하게 RNAse H를 유도하지 못하고, 그리고 바람직한 양태에서 상기 올리고뉴클레오티드는 "믹스머(mixmer)" 즉, RNAse H에 의해 쉽게 절단되지 않는 변형된 뉴클레오시드, 및 RNAse H에 의해 절단될 수 있는 비변형된 DNA 유닛의 혼합물을 가지나, 갭머(gapmer)와 달리 결합하고 RNAse H 절단을 가능하게 하기에 충분히 긴 DNA "갭(gap)" 영역을 가지지 않는다. 4 내지 5 연속적인(contiguous) DNA 유닛이 RNAse H 절단에 필요하고 따라서 RNAse H를 유도하지 않는다고 의도되는 4 미만, 더욱 바람직하게 3 미만, 또는 2 미만의 올리고머 내 연속적인(contiguous) DNA 유닛을 가지는 것이 바람직하다고 현재 생각된다. 표 1에서 나타내는 바와 같이, 본 발명의 바람직한 믹스머(mixmer)는 하나 걸러 위치에서 LNA와 3' 말단에 2 또는 3 LNA를 가지고, 이것은 올리고뉴클레오티드를 안정화시키고 RNAse H 절단을 최소화하는 것을 생각된다. 백본 연결(backbone linkage)은 포스포티오에이트(phosphorothioate) 연결이다.
일부 양태에서, 올리고머는 LNA 및 DNA 뉴클레오티드만을 포함한다.
일부 양태에서, 올리고머는 4 미만의 연속적인(contiguous) DNA 유닛, 예컨대 3 미만의 연속적인(contiguous) DNA 유닛, 예컨대 2 미만의 연속적인(contiguous) DNA 유닛을 가진다. 일부 양태에서 올리고머는 1 또는 2 이하의 연속적인(contiguous) DNA 유닛을 가진다.
일부 양태에서, 올리고머의 5' 유닛은 LNA 뉴클레오티드이다. 일부 양태에서, 올리고머의 3' 유닛, 예컨대 2 3' 유닛은 LNA 뉴클레오티드이다.
일부 양태에서, 올리고머는 LNA 및 DNA 뉴클레오티드를 포함하고, 여기에는 3 이하의 연속적인(consecutive) LNA 유닛, 예컨대 2 이하의 연속적인 LNA 유닛이 있고, 및 여기서 5' 뉴클레오티드는 LNA 유닛이고 3' 뉴클레오티드, 예컨대 2 3' 뉴클레오티드는 LNA 유닛이다. 일부 양태에서, LNA 올리고머는 LNA 유닛이 되는 교차의(alternating) 5'-LNA-DNA-3' 뉴클레오티드, 임의로(선택적으로) LNA 유닛인 말단 (5' 및 또는 3') 2 뉴클레오티드와 함께 이루어지거나 포함한다.
일부 양태에서, 올리고머는, 예컨대 상기 기술된 믹스머는 12-16 뉴클레오티드 길이, 예컨대 13, 14 또는 15 뉴클레오티드이다..
일부 양태에서, 올리고머, 예컨대 상기 기술된 믹스머는 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 올리고머이다.
뉴클레오티드간 연결(
Internucleotide
Linkage
)
본원에서 기술된 올리고머의 모노머는 연결기(linkage group)를 통해 함께 연결된다. 적절하게, 각각의 모노머는 연결기를 통해 3' 인접한(adjacent) 모노머와 연결된다.
당업자는 본 발명의 문맥에서, 올리고머의 말단에 5' 모노머는 5' 말단기를 포함하거나 포함하지 않을 수도 있지만, 5' 연결기를 포함하지 않는 것을 이해할 수 있을 것이다.
용어 "연결기(linkage group)" 또는 "뉴클레오티드간 연결기(internucleotide linkage)"는 2 뉴클레오티드를 공유적으로 함께 커플링(coupling) 할 수 있는 기(group)를 의미하도록 의도된다. 특정하고 바람직한 예시는 포스페이트(phosphate)기와 포스포로티오에이트(phosphorothioate)기를 포함한다.
본 발명의 올리고머의 뉴클레오티드 또는 이의 연속적인(contiguous) 뉴클레오티드 서열은 연결기를 통해 함께 연결된다. 적절하게 각각의 뉴클레오티드는 연결기를 통해 3' 인접한(adjacent) 뉴클레오티드에 연결된다.
적절한 뉴클레오티드간 연결(internucleotide linkage)은, WO2007/031091 내에 열거된 것, 예를 들어 WO2007/031091의 34 페이지의 첫 번째 단락에 열거된 뉴클레오티드간 연결을 포함한다(본원에 참조에 의해 포함됨).
일부 양태에서, 뉴클레오티드간 연결을 이것의 정상 포스포디에스터(phosphodiester)로부터 뉴클레아제(nuclease) 공격에 더욱 저항성인 것, 예컨대 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 보라노포스페이트(boranophosphate)-이 둘, RNase H에 의해 절단될 수 있는 것은, 또한 표적 유전자의 발현을 감소시키는 안티센스(antisense) 억제의 경로를 허용하는 것으로 뉴클레오티드간 연결을 변형하는 것이 바람직하다.
본원에서 제공되는 것과 같이 적절한 황(sulphur) (S)을 함유하는 뉴클레오티드간 연결이 바람직할 수 있다. 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결(internucleotide linkage)은 또한 개선된 뉴클레아제 저항(내성)과 다른 이유, 예컨대 제조의 용이성에 대해 바람직하다.
그러나, 올리고머는 포스포로티오에이트 외에 뉴클레오티드간 연결 특히, 예를 들어 뉴클레오티드 유사체 예컨대 LNA 뉴클레오티드의 사용이 뉴클레오티드간 연결을 엔도-뉴클레아제 분해로부터 보호할 때, 예컨대 포스포디에스터 연결을 포함한다.
포스포디에스터 연결, 예컨대 하나 또는 둘의 연결의, 그외 포스포로티오에이트 올리고머로의, 특히 뉴클레오티드 유사체 유닛의 사이 또는 뉴클레오티드 유사체 유닛에 인접(adjacent)으로의 포함물(inclusion)은 올리고머의 생체이용율 및/또는 생물학적-분배(bio-distribution)를 변형하는 것으로 인식된다- WO2008/053314 참조, 본원에 참조에 의해 포함됨.
일부 양태에서, 예컨대 상기 언급되는 양태에서, 적절하고 특별히 지적되지 않는 경우, 모든 남아 있는 연결기(linkage group)는 포스포디에스터 또는 포스포로티오에이트 중 어느 하나, 또는 이의 혼합물이다.
일부 양태에서 모든 뉴클레오티드간 연결기는 포스포로티오에이트이다.
특이적 갭머(gapmer) 올리고뉴클레오티드 서열, 예컨대 본원에서 제공되는 것을 지칭할 때, 다양한 양태에서, 연결이 포스포로티오에이트 연결일 때, 대체적인 연결, 예컨대 본원에서 개시되는 것이 사용될 수 있고, 예를 들어 포스페이트(포스포디에스터) 연결은, 특히 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 LNA, 유닛 사이 연결을 위해 사용될 수 있는 것으로 이해될 수 있을 것이다. 유사하게, 특이적 갭머(gapmer) 올리고뉴클레오티드 서열, 예컨대 본원에서 제공되는 것을 지칭할 때, C (시토신) 잔기(residue)가 5'메틸 변형된 시토신으로서 주석을 붙일 때, 다양한 양태에서, 올리고머에 존재하는 하나 또는 그 초과의 C는 변형되지 않은 C 잔기일 수 있다.
올리고머
화합물(
Oligomeric
Compound
)
본 발명의 올리고머는, 예를 들어, 표 1에서 나타낸 바와 같은 서열번호 1-83으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 가지거나 전술한 것의 하나의 서브세트(subset)인 서열을 가진다. 하나의 양태에서, 상기 올리고머는 첫 번째, 세 번째, 다섯 번째, 일곱 번째, 아홉 번째, 열한 번째, 열세 번째, 열다섯 번째 및 열여섯 번째 모노머(monomer) 유닛(5' 말단에서 시작함)은 LNA이고, 남아있는 유닛은 DNA이고, 및 연결(linkage)은 전체에 걸쳐(throughout) 포스포로티오에이트인 16머(mer)이다. 다른 양태에서, 상기 올리고머는 첫 번째, 세 번째, 다섯 번째, 일곱 번째, 아홉 번째, 열한 번째, 열세 번째, 열네 번째 및 열다섯 번째 모노머(monomer) 유닛(5' 말단에서 시작함)은 LNA이고, 남아있는 유닛은 DNA이고, 및 연결은 전체에 걸쳐 포스포로티오에이트인 15머(mer)이다. 추가 양태에서, 상기 올리고머는 첫 번째, 세 번째, 다섯 번째, 일곱 번째, 아홉 번째, 열한 번째 및 열두 번째 모노머(monomer) 유닛(5' 말단에서 시작함)은 LNA이고, 남아있는 유닛은 DNA이고, 및 연결(linkage)은 전체에 걸쳐(throughout) 포스포로티오에이트인 12머(mer)이다.
접합체(
Conjugate
)
이 개시의 문맥에서, 용어 "접합체(conjugate)"는 하나 또는 그 초과의 비-뉴클레오티드, 또는 비-폴리뉴클레오티드 모이어티(moiety)에 대한 본원에서 기술된 바와 같은 올리고머의 공유 부착(covalent attachment)("접합(conjugation)")에 의해 형성되는 이종의(heterogeneous) 분자를 나타내는 것으로 의도된다. 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 모이어티(moiety)는 거대분자 제제(macromolecular agent) 예컨대 단백질, 지방산 사슬, 당 잔기(sugar residue), 당단백질(glycoprotein), 폴리머(polymer), 또는 이의 조합을 포함한다. 일반적으로 단백질은 표적 단백질에 대한 항체일 수 있다. 일반적인 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜일 수 있다.
따라서, 다양한 양태에서, 본 발명의 올리고머는 일반적으로 뉴클레오티드의 연속적인(contiguous) 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 영역, 및 추가 비-뉴클레오티드 영역둘 다를 포함할 수 있다. 연속적인 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 본 발명의 올리고머를 언급할 때, 상기 화합물은 비-뉴클레오티드 요소, 예컨대 접합체(conjugate) 요소를 포함할 수 있다.
본 발명의 다양한 양태에서 올리고머 화합물은 예를 들어, 올리고머 화합물의 세포의 흡수(cellular uptake)를 증가시키는데 사용될 수 있는 리간드/접합체(ligand/conjugate)에 연결된다. WO2007/031091는 적절한 리간드와 접합체를 제공하고, 이것은 본원에 참조에 의해 포함된다.
본 발명은 또한 본원에서 기술된 바와 같은 발명에 따른 화합물 및 상기 화합물에 공유 부착된(covalently attached) 적어도 하나의 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 모이어티(moiety)를 포함하는 접합체(conjugate)를 제공한다. 따라서, 다양한 양태에서 본 발명의 화합물이, 본원에서 개시하는 바와 같은, 특이적 핵산 또는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 경우, 상기 화합물은 또한 상기 화합물에 공유 부착된 적어도 하나의 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 모이어티 (예를 들어, 하나 또는 그 초과의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함하지 않음)를 포함할 수 있다.
접합(conjugation) (접합체(conjugate) 모이어티에 대한)는 본 발명의 올리고머의 활성, 세포의 분포 또는 세포의 흡수(uptake)를 향상시킬 수 있다. 이러한 모이어티는 항체, 폴리펩티드, 지질 모이어티 예컨대 콜레스테롤 모이어티, 콜산(cholic acid), 티오에테르(thioether), 예를 들어, 헥실-s-트리틸티올(hexyl-s-tritylthiol), 티오콜레스테롤(thiocholesterol), 지방족 사슬(aliphatic chain), 예를 들어, 도데칸디올(dodecandiol) 또는 운데실(undecyl) 잔기(residue), 인지질, 예를 들어, 디-헥사데실-랙-글리세롤(di-hexadecyl-rac-glycerol) 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-o-헥사데실-랙-글리세로-3-h-포스포네이트(triethylammonium 1,2-di-o-hexadecyl-rac-glycero-3-h-phosphonate), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다만탄(adamantane) 아세트산, 팔미틸(palmityl) 모이어티, 옥타데실아민(octadecylamine) 또는 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤(hexylamino-carbonyl-oxycholesterol) 모이어티(moiety)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 올리고머는 또한 활성 약물 물질, 예를 들어, 아스피린, 이부프로펜, 설파(sulfa) 약물, 항당뇨제, 항박테리아제 또는 항생제에 접합될 수 있다.
특정 양태에서 접합된 모이어티는 스테롤, 예컨대 콜레스테롤이다.
다양한 양태에서, 접합된 모이어티는 양으로 하전된 폴리머, 예컨대 예를 들어 1 내지 50, 예컨대 2 내지 20 예컨대 3 내지 10 아미노산 잔기 길이의 양으로 하전된 펩티드, 및/또는 폴리알킬렌 옥사이드(polyalkylene oxide) 예컨대 폴리에틸글리콜(PEG) 또는 폴리프로필렌 글리콜을 포함하거나 이루어질 수 있다-본원에 참조에 의해 포함되는, WO 2008/034123 참조. 적절하게 양으로 하전된 폴리머, 예컨대 폴리알킬렌 옥사이드는 링커 예컨대 WO 2008/034123에 기술된 방출가능한 링커를 통해 본 발명의 올리고머에 부착될 수 있다.
예로서, 다음의 접합체(conjugate) 모이어티가 본 발명의 접합체에 사용될 수 있다:
활성화된
올리고머
(
Activated
oligomer
)
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "활성화된 올리고머,"는 본원에 기술된 접합체(conjugate)를 형성하도록 하나 또는 그 초과의 모이어티, 즉, 그들 자신이 핵산 또는 모노머가 아닌 모이어티에 대한 올리고머의 공유 연결을 허용하는 적어도 하나의 기능적인 모이어티에 공유 연결된(즉, 기능화된), 본 발명의 올리고머를 지칭한다. 일반적으로, 기능적인 모이어티(moiety)는 예를 들어, 아데닌 염기의 3'-히드록실기(3'-hydroxyl group) 또는 외향고리(exocyclic) NH2기를 통해 올리고머에 공유 결합을 할 수 있는 화학 그룹(chemical group), 바람직하게 친수성인 스페이서(spacer) 및 접합된 모이어티에 결합할 수 있는 말단기(예를 들어, 아미노, 설프히드릴(sulfhydryl) 또는 히드록실(hydroxyl)기)를 포함할 것이다. 일부 양태에서, 이 말단기는 보호되지 않고, 예를 들어 NH2 기이다. 다른 양태에서, 말단기는 예를 들어, 예컨대 테오드라 W 그린과 피터 G M 워츠(Theodora W Greene and Peter G M Wuts)에 의한 "유기 합성에서 보호기(Protective Groups in Organic Synthesis)", 제3판 (John Wiley & Sons, 1999)에 기술된 임의의 적절한 보호기에 의해 보호된다. 적절한 히드록실 보호기의 예시는 에스터 예컨대 아세테이트 에스터, 아랄킬(aralkyl)기 예컨대 벤질, 디페닐메틸(diphenylmethyl), 또는 트리페닐메틸(triphenylmethyl), 및 테트라히드로피라닐(tetrahydropyranyl)을 포함한다. 적절한 아미노 보호기의 예시는 벤질, 알파-메틸벤질, 디페닐메틸, 트리페닐메틸, 벤질옥시카르보닐(benzyloxycarbonyl), 터트-부톡시카르보닐(tert-butoxycarbonyl), 및 아실기 예컨대 트리클로로아세틸(trichloroacetyl) 또는 트리플루오로아세틸(trifluoroacetyl)을 포함한다. 일부 양태에서, 기능적인 모이어티는 자가-절단(self-cleaving)된다. 다른 양태에서, 기능적인 모이어티는 생분해성(biodegradable)이다. 예를 들어, 본원에 참조에 의해 전체로서 포함되는 미국 특허 번호 7,087,229 참조.
일부 양태에서, 본 발명의 올리고머는 올리고머의 5' 말단에 대한 접합된 모이어티의 공유 부착(covalent attachment)을 허용하기 위해 5' 말단에 기능화된다. 다른 양태에서, 본 발명의 올리고머는 3' 말단에 기능화될 수 있다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 올리고머는 백본(backbone)을 따라 또는 헤테로사이클릭(heterocyclic) 염기 모이어티 상에 기능화될 수 있다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 올리고머는 5' 말단, 3' 말단, 백본(backbone)과 염기로부터 독립적으로 선택되는 1 초과 위치에 기능화될 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명의 활성화된 올리고머는 기능적인 모이어티에 공유 부착되는 하나 또는 그 초과의 모노머 합성 동안에 포함(통합)됨으로써 합성될 수 있다. 다른 양태에서, 본 발명의 활성화된 올리고머는 기능화되지 않은 모노머로 합성되고, 상기 올리고머는 합성이 완료되면 기능화된다. 일부 양태에서, 올리고머는 아미노알킬 링커(linker)를 함유하는 방해된 에스터(hindered ester)로 기능화되고, 여기서 알킬 부분은 화학식 (CH2)W을 가지고, 여기서 w는 1 내지 10 범위의 정수이고, 바람직하게 약 6이고, 여기서 알킬아미노기의 알킬 부분은 직선 사슬(straight chain) 또는 분지 사슬(branched chain)일 수 있고, 및 여기서 기능적인 기는 에스터기(-0-C(0)-(CH2)WNH)을 통해 올리고머에 부착된다.
다른 양태에서, 올리고머는 (CH2)W-설프히드릴((CH2)W-sulfhydryl)(SH) 링커(linker)를 함유하는 방해된 에스터(hindered ester)로 기능화되고, 여기서 w는 1 내지 10 범위의 정수이고, 바람직하게 약 6이고, 여기서 알킬아미노기의 알킬 부분은 직선 사슬(straight chain) 또는 분지 사슬(branched chain)일 수 있고, 및 여기서 기능적인 기는 에스터기(-0-C(0)-(CH2)WSH)를 통해 올리고머에 부착된다.
일부 양태에서, 설프히드릴(sulfhydryl)-활성화된 올리고뉴클레오티드는 폴리머 모이어티 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 또는 펩티드로 접합된다(이황화(disulfide) 결합의 형성을 통해).
상기 기술된 바와 같이 방해된 에스터(hindered ester)를 함유하는 활성화된 올리고머는 본 기술분야에 알려진 임의의 방법으로, 특히 본원에 참조에 의해 전체로 포함되는 PCT 공개번호 WO 2008/034122에 개시된 방법과 그 안에 실시예에 의해서 합성될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 올리고머는 실질적으로 미국 특허 번호 4,962,029호 및 4,914,210호에 기술된 바와 같은 기능화 시약, 즉, 친수성 스페이서 사슬을 통해 보호된 또는 보호되지 않은 설프히드릴(sulfhydryl), 아미노 또는 히드록실(hydroxyl)기를 포함하는 대립하는 말단에 연결된 하나의 말단에 포스포라미디트(phosphoramidite)를 갖는 실질적으로 선형 시약(linear reagent)에 의해 설프히드릴(sulfhydryl), 아미노 또는 히드록실기의 올리고머로의 도입에 의해 기능화될 수 있다. 이러한 시약은 주로 올리고머의 히드록실(hydroxyl)기와 반응한다. 일부 양태에서, 이러한 활성화된 올리고머는 올리고머의 5'-히드록실기와 커플링 된 기능화 시약을 갖는다. 다른 양태에서, 활성화된 올리고머는 3'-히드록실기와 커플링 된 기능화 시약을 갖는다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 활성화된 올리고머는 올리고머의 백본(backbone) 상에 히드록실(hydroxyl)기와 커플링 된 기능화된 시약을 갖는다. 더 추가 양태에서, 본 발명의 올리고머는 본원에 참조에 의해 전체로 포함되는, 미국 특허 번호 4,962,029호 및 4,914,2101호에서 기술된 바와 같은 1 초과의 기능화 시약으로 기능화된다. 이러한 기능화 시약을 합성하고 및 그들을 모노머 또는 올리고머 내로 포함(통합)하는 방법은 미국 특허 번호 4,962,029호 및 4,914,210호에 개시된다.
일부 양태에서, 고체-상(solid-phase) 결합된 올리고머의 5'-말단은 디에닐 포스포라미디트(dienyl phosphoramidite) 유도체로 기능화되고, 뒤이어 디엘스-알더 고리화첨가 반응(Diels-Alder cycloaddition reaction)을 통해 예를 들어, 아미노산 또는 펩티드와 탈보호된 올리고머가 접합된다.
다양한 양태에서, 2'-당 변형, 예컨대 2'-카바메이트(2'-carbamate) 치환된 당 또는 2'-(0-펜틸-N-프탈이미도)-디옥시리보스(2'-(0-pentyl-N-phthalimido)-deoxyribose) 당을 함유하는 모노머의 올리고머로의 포함(통합)은 올리고머의 당에 대한 접합된 모이어티의 공유 부착을 용이하게 한다. 다른 양태에서, 하나 또는 그 초과의 모노머의 2'-위치에 아미노-함유하는 링커를 가진 올리고머는 시약 예컨대, 예를 들어 5'-디메톡시트리틸-2'-0-(e-프탈이미딜아미노펜틸)-2'-디옥시아데노신-3'-N,N-디이소프로필-시아노에톡시 포스포라미디트(5'-dimethoxytrityl-2'-0-(e-phthalimidylaminopentyl)-2'-deoxyadenosine-3'- N,N- diisopropyl-cyanoethoxy phosphoramidite)를 사용하여 제조된다. 예를 들어, Manoharan, 외, Tetrahedron Letters, 1991, 34, 7171 참조.
더 추가 양태에서, 본 발명의 올리고머는 N6 퓨린 아미노기상, 구아닌(guanine)의 외향고리(exocyclic) N2상, 또는 시토신의 N4 또는 5 위치상을 포함하는, 뉴클레오염기 상에 아민-함유하는 기능적인 모이어티를 가질 수 있다. 다양한 양태에서, 이러한 기능화는 올리고머 합성에서 이미 기능화된 상업적인 시약을 사용함으로써 달성될 수 있다.
일부 기능적인 모이어티는 상업적으로 이용가능하며, 예를 들어, 이종이관능성(heterobifunctional) 및 동종이관능성(homobifunctional) 연결 모이어티는 피얼스 코포레이션(Pierce Co.) (록퍼드(Rockford), III.)로부터 이용가능하다. 다른 상업적으로 이용가능한 연결기는 5'-아미노-변형자 C6(5'-Amino-Modifier C6) 및 3'-아미노-변형자(3'-Amino-Modifier) 시약이고, 둘 다 글렌 리서치 코포레이션(Glen Research Corporation) (스털링, 버지니아 주(Sterling, Va.))로부터 이용가능하다. 아미노링크-2(Aminolink-2)로서 5'-아미노-변형자 C6(5'-Amino-Modifier C6)는 또한 ABI(어플라이드 바이오시스템즈 주식회사, 포스터 시티, 캘리포니아(Applied Biosystems Inc., Foster City, Calif.))로부터 이용가능하고, 및 3'-아미노-변형자(3'-Amino-Modifier)는 또한 클론테크 레보레토리 주식회사(Clontech Laboratories Inc.)(팔로 알토, 캘리포니아 주(Palo Alto, Calif.))로부터 이용가능하다.
조성물(
Composition
)
본 발명의 올리고머는 약제학적 제형 및 조성물에 사용될 수 있다. 적절하게, 이러한 조성물은 약제학적으로 허용가능한 희석제, 담체(carrier), 염 또는 보조제(adjuvan)를 포함한다. WO/2007/031091는 적절하고 바람직한 약제학적으로 허용가능한 희석제, 담체 및 보조제를 제공하고, 이것은 본원에 참조에 의해 포함된다. 적절한 투여량(dosage), 제형, 투여 경로, 조성물, 투여 형태, 다른 치료제와의 조합, 전구-약물(pro-drug) 제형은 또한 WO/2007/031091에 제공되고, 참조에 의해 본원에 포함된다.
적용(
Application
)
본 발명의 올리고머는 예를 들어, 진단, 치료 및 예방을 위한 연구 시약으로서 이용될 수 있다. 연구에서, 이러한 올리고머는 또한 다양한 스플라이스 산물의 역할의 기능적인 분석을 용이하게 하기 위해 SMN2 mRNA의 스플라이싱을 특이적으로 조절하는 데 사용될 수 있다.
진단에서 올리고머는 노던 블로팅(northern blotting), 원-위치 혼성화(in -situ hybridization) 또는 유사한 기술에 의해 세포 및 조직 내 SMN2 발현을 검출하고 정량하기 위해 사용될 수 있다.
치료를 위해, SMN의 발현 또는 특정 SMN2 mRNA 스플라이스 산물의 발현을 조절함으로써 치료될 수 있는 질환 또는 장애를 갖는 것으로 의심되는 동물 또는 사람은 본 발명에 따른 올리고머 화합물을 투여함으로써 치료된다. 또한 제공되는 것은 본 발명의 올리고머 또는 조성물의 하나 또는 그 초과의 치료적으로 또는 예방적으로 유효한 양을 투여함에 의한 비정상적인 SMN 스플라이스 산물의 발현을 포함하는, SMN의 비정상적인 발현과 관련된, 질환 또는 상태를 가지거나 가지기 쉽다고 의심되는 사람을 치료하는 방법이다. 본 발명에 따른 올리고머, 접합체 또는 약제학적 조성물은 일반적으로 유효한 양으로 투여된다.
본 발명은 또한 본원에서 기술되는 바와 같은 본 발명에 따른 화합물, 및/또는 본 발명에 따른 접합체, 및/또는 본 발명에 따른 조성물을 이를 필요로 하는 환자에 투여하는 것(단계)을 포함하는 본원의 상기 방법에 언급된 바와 같은 장애를 치료하는 방법을 위해 제공한다.
치료의 조성물의 제형 및 그들의 그 다음의 투여는 본 발명의 기술 내에 있는 것으로 생각된다. 투약(dosing)은 수일 내지 수개월 지속되는 치료의 과정과 함께, 또는 치료가 유효하거나 질환 상태 감소가 달성될 때까지 치료될 질환 상태의 심각도 및 민감성에 의존한다. 최적의 투약 일정은 환자의 신체에서 약물 축적의 측정으로부터 계산될 수 있다. 평균 기술의 사람은 쉽게 최적의 투여량, 투약 방법론 및 반복률을 결정할 수 있다. 최적 투여량은 개별 올리고뉴클레오티드의 상대적인 효능(potency)에 따라 다양할 수 있고, 일반적으로 생체 외(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 동물 모델에서 유효한 것으로 밝혀진 EC50에 기반하여 추산될 수 있다. 일반적으로, 투여량은 체중의 kg 당 0.01 ug 내지 10 g이고, 그리고 매일, 매주, 매달 또는 매년 한 번 또는 그 초과, 또는 일생 당 단일 투여 또는 필요한 대로 주어질 수 있다. 본 발명의 평균 기술자는 체액 또는 조직에서 약물의 측정된 체류 시간 및 농도에 기반하여 투약을 위한 반복률(repetition rate)을 쉽게 추산할 수 있다. 성공적인 치료에 이어, 환자가 질환 상태의 재발을 방지하는 유지 치료를 받아야 하는 것이 바람직할 수 있고, 여기서 올리고뉴클레오티드는 유지 용량으로, 체중의 kg 당 0.01 ug 내지 100 g의 범위로, 매일 한 반 또는 그 초과에서, 매 20년 한 번까지로 투여된다.
의학적 표시(
Medical
Indication
)
본 발명에 따른 올리고머 및 다른 조성물은 SMN의 과발현(overexpression), 원하지 않거나 비정상적인 수준(특히 과축적(overaccumulation) 때문일 수 있는 높은 수준) 또는 돌연변이된 또는 그 외 비정상적인 버전의 발현과 관련된 상태의 치료를 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 본원에서 언급된 바와 같은 질환, 장애 또는 상태의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서의 본 발명의 화합물의 사용을 제공한다.
일반적으로 말하면, 본 발명의 일 측면은 하나 또는 그 초과의 LNA 유닛을 포함하는 SMN2를 표적으로 한 올리고머의 치료적으로 유효한 양을 사람 대상체에 투여하는 것(단계)을 포함하는, SMN의 원하지 않거나 비정상적인 수준과 관련된 상태를 앓고 있거나 또는 걸리기 쉬운 사람 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 올리고머, 접합체 또는 약제학적 조성물은 일반적으로 유효한 양으로 투여된다.
본원에 언급된 바와 같은, 질환 또는 장애는, 일부 양태에서, SMN2 유전자 또는 이의 단백질 산물이 SMN과 관련되거나 상호작용하는 유전자에 있어서의 돌연변이와 관련된다. 따라서, 일부 양태에서, 표적 프리-mRNA(pre-mRNA)는 SMN2 서열의 돌연변이된 형태이다.
질환 또는 장애는, SMN2의 비정상적인 스플라이싱과 관련될 수 있고, 따라서 일부 양태에서 올리고머는 SMN2 mRNA의 스플라이싱을 조절하기 위해 설계된다.
본 발명의 방법은 바람직하게 SMN의 비정상적인 또는 원하지 않은 수준, 또는 비정상적인 SMN mRNA 스플라이스 산물에 의해 야기되는 질환에 대한 치료 또는 예방(prophylaxis)에 사용된다.
대안적으로 언급된, 일부 양태에서, 본 발명은 또한 SMN의 비정상적이거나 또는 원하지 않은 수준, 예를 들어, SMN의, 또는 특정 SMN mRNA 스플라이스 산물의 원하는 수준보다 더 높은 수준을 조절하기 위한 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 본 발명의 올리고머, 또는 본 발명의 접합체 또는 본 발명의 약제학적 조성물을, 이를 필요로 하는 사람 대상체에 투여하는 것(단계)을 포함한다.
본 발명은 또한 약제로서 사용을 위한 본원에서 정의된 바와 같은 올리고머, 조성물 또는 접합체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 질환 또는 상태 예컨대 본원에서 언급된 것을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법과 관련된다. 치료를 필요로 하는 환자는 상기 질환 또는 장애를 앓고 있거나 앓을 수 있는 환자이다.
일부 양태에서, 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "치료"는 기존의 질환(예를 들어, 본원에서 지칭하는 질환 또는 장애)의 치료, 또는 질환의 예방, 즉, 예방(prophylaxis) 모두를 지칭한다. 따라서 본원에서 언급하는 바와 같은 치료, 일부 양태에서, 예방되는 것으로 인식될 것이다.
양태
1. 적어도 하나의 잠금 핵산(Locked Nucleic Acid) (LNA) 유닛을 포함하고 RNAse H 활성을 유도하지 않는 10 내지 30 뉴클레오티드 길이의 올리고머, 여기서 상기 올리고머는 10 내지 30 뉴클레오염기 길이의 뉴클레오염기 서열을 더 포함하고, 여기서 상기 뉴클레오염기 서열은 젠뱅크 수탁번호(Genbank Accession No.) NG_008728 (서열번호 167)의 뉴클레오티드 26231-26300, 31881-31945, 또는 32111-32170에 상응하는 영역 또는 이의 자연적으로 발생하는 변이체에 적어도 80% 상보적이고, 및 이것은 전장(full length) SMN2 mRNA 전사체(transcript)의 수준의 증가를 초래하는 SMN2 mRNA의 스플라이싱을 조절한다.
2. 양태 1에 따른 올리고머 여기서 상기 뉴클레오염기 서열은 젠뱅크 수탁번호(Genbank Accession No.) NG_008728 (서열번호 167)의 뉴클레오티드 26231 -26246, 26274-26300, 31890-31905, 31918-31945 또는 32115-32162에 상응하는 영역에 적어도 80% 상보적이다.
3. 양태 1에 따른 올리고머 여기서 상기 올리고머는 젠뱅크 수탁번호(Genbank Accession No.) NG_008728(서열번호 167)의 뉴클레오티드 26231-26300에 적어도 80% 상보적이다.
4. 양태 1에 따른 올리고머 여기서 상기 올리고머의 뉴클레오염기 서열은 서열번호 1, 2, 3-16, 19-20, 22, 24-34, 35-38, 40, 41 , 45-49, 60-80 또는 83의 서열과 적어도 80% 동일하다.
5. 양태 1에 따른 올리고머 여기서 상기 올리고머의 뉴클레오염기 서열은 서열번호 1, 5, 9, 11, 12, 26, 27, 28, 29, 30, 34, 40, 53-59, 62, 63, 65, 66, 69-77 또는 79의 서열을 갖는다.
6. 양태 1에 따른 올리고머 여기서 스플라이싱의 조절은 대조군의 110% 초과, 대조군의 120% 초과, 대조군의 130% 초과, 대조군의 140% 초과, 대조군의 150% 초과, 대조군의 160% 초과, 대조군의 170% 초과, 대조군의 180% 초과, 대조군의 190% 초과, 또는 대조군의 200% 초과의 전장(full length) SMN2 전사체(transcript) 양으로 증가 된다.
7. 양태 1에 따른 올리고머 여기서 뉴클레오티드 서열은 12 내지 16 뉴클레오티드의 길이이다.
8. 양태 8에 따른 올리고머에서 이것은 믹스머(mixmer)이다.
9. 양태 1에 따른 올리고머 및 상기 올리고머에 공유 부착된(covalently attached) 적어도 하나의 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 모이어티(moiety)를 포함하는 접합체(conjugate).
10. 약제로서 사용을 위한, 예컨대 척수성 근위축(spinal muscular atrophy)의 치료를 위한, 양태 1에 따른 올리고머, 또는 양태 9에 따른 접합체(conjugate).
11. 양태 10의 올리고머 여기서 척수성 근위축(spinal muscular atrophy)은 유형Ⅰ, 유형 Ⅱ 또는 유형 Ⅲ 척수성 근위축이다.
12. 양태 1에 따른 올리고머, 또는 양태 9에 따른 접합체(conjugate), 및 약제학적으로 허용가능한 희석제, 담체(carrier), 염 또는 보조제를 포함하는 약제학적 조성물.
13. 척수성 근위축(spinal muscular atrophy) 치료의 방법, 상기 방법은 척수성 근위축을 앓거나 또는 앓을 수 있다고 생각되는 환자에, 양태 1에 따른 올리고머, 또는 양태 9에 따른 접합체(conjugate), 또는 양태 12에 따른 약제학적 조성물의 유효한 양을 투여하는 것(단계)을 포함한다.
15. SMN2 mRNA를 발현하는 사람 세포에서 SMN2 mRNA의 스플라이싱을 조절하기 위한 방법, 상기 방법은 양태 1에 따른 올리고머, 또는 양태 9에 따른 접합체(conjugate), 또는 양태 12의 약제학적 조성물을 상기 사람 세포에 투여하는 것(단계)을 포함하고, 여기서 상기 사람 세포에서 SMN2 RNA의 스플라이싱이 조절되고 말단절단된(truncated) SMN2 mRNA에 대한 전장(full length) SMN2 mRNA의 비율이 증가된다.
실시예
실시예
1: 올리고뉴클레오티드의 설계
본 발명에 따라, 일련의 올리고뉴클레오티드는 사람 SMN2 게놈 서열(genomic sequenc) (젠뱅크 수탁번호 NG_008728)을 표적화하도록 설계되었다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 이들은 일부 위치(대문자)에 베타-D-옥시 LNA 유닛 및 다른 위치(소문자)에 DNA 유닛을 갖는 키메라 올리고뉴클레오티드(chimeric oligonucleotide)이다. 나타낸 바와 같이 올리고뉴클레오티드는 게놈 서열(genomic sequenc)의 다양한 영역에 대해 표적화되었다. "표적 위치"는 올리고뉴클레오티드가 상보적인 젠뱅크 수탁번호(Genbank Acc. No.) NG_008728 상의 첫 번째 (5'-최대(5'-most)) 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 번호를 나타내다. 표 1에서, 모든 뉴클레오시드간 연결(internucleoside linkage)은 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 연결이고 모든 LNA-시토신(대문자)은 5-메틸시토신이다.
표 1 사람
SMN2
을 표적으로 하는
안티센스
올리고뉴클레오티드 서열
* 올리고 서열 및 변형: 대문자는 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드이고, 소문자는 DNA 뉴클레오시드이다. LNA 시토신은 임의적으로(선택적으로) 5-메틸 시토신 LNA이다. 뉴클레오시드간 연결(internucleoside linkage)은 포스포로티오에이트이다.
실시예
2: 생체 외(
In
vitro
) 모델: 세포 배양
표적 핵산이 측정가능한 수준으로 존재한다면 표적 핵산 발현에 안티센스 올리고뉴클레오티드의 효과는 임의의 다양한 세포 유형에서 시험될 수 있다. 표적은 상기 표적을 암호화하는 핵산의 내인성으로 또는 일시적인 또는 안정한 형질감염에 의해 발현될 수 있다. 표적 핵산의 발현 수준은 예를 들어, 노던 블롯(Northern blot) 분석, 실-시간 PCR, 리보노클레아제 보호 분석을 사용하여, 일상적으로 결정될 수 있다. 다음 세포 유형은 설명 목적을 위해 제공되지만, 표적이 선택된 세포 유형에서 발현되면, 다른 세포 유형이 일상적으로 사용될 수 있다.
세포는 하기 기술된 적절한 배지에서 배양될 수 있고 37℃, 95-98% 습도 및 5% C02에서 유지될 수 있다. 세포는 일상적으로 매주 2-3 회 계대 배양하였다.
SMA1 세포: 사람 SMA1 환자 섬유아세포(fibroblast) 세포주(카탈로그 번호: GM03813, 의학 연구를 위한 코리엘 연구소, 캠던, 뉴저지(Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ))가 이글 최소 필수 배지(Eagle's Minimum Essential Medium)(#M5650, 시그마), 2mM 글루타민(AQ, #G8541 , 시그마) 및 비-필수 아미노산(11140-035, 인비트로젠)에서 10% 소 태아 혈청(바이오크롬, BCHS0115) 및 0,25 g/ml 겐타마이신(G1397, 시그마)와 함께 배양되었다, 이 세포 주는 SMN2을 발현하지만 SMN1을 발현하지 않고 따라서 SMA 환자에서의 상황을 대표한다.
실시예
3: 생체 외(
In
vitro
) 모델: 지질 형질감염을 사용하여
안티센스
올리고뉴클레오티드로 처리
실시예 2에 열거된 SMA1 세포주는 형질감염 비히클(vehicle)로서 양이온성 리포좀 제제 리포펙타민 2000(LipofectAMINE 2000)(#11668-019, 인비트로젠)을 사용하여 올리고뉴클레오티드로 처리되었다. 세포는 6-웰 세포 배양 플레이트(NUNC, #)에 리포펙타민/올리고뉴클레오티드 믹스(lipofectamine/oligonucleotide mix)와 함께 파종 되었다. 올리고는 25 nM 최종 농도로 사용되었다. 올리고-리피드 복합제의 제제는 무혈청(serum-free) 옴티멤(OptiMEM) (#51985, 깁코) 및 최종 지질 농도의 2.5 μg/mL 리포펙타민 2000(LipofectAMINE 2000)을 사용하여 제조자에 의해 기술된 바와 같이 기본적으로 수행되었다. 형질감염 24 시간 후에 그 다음의 실시예에서 기술된 바와 같은 총 RNA 제제(알엔이지 미니 키트(RNeasy Mini Kit), #74106, 퀴아젠,), 역 전사(reverse transcription)(M-MLV 역 전사효소(M-MLV reverse transcriptase) 및 임의적 십합체(random decamer), #2044, #5722G, 앰비온(Ambion)) 및 전장(full length) 또는 스킵된(skipped) 엑손 7을 가지는 짧은 전사체 중 어느 하나를 검출하기 위한 두 개의 주문제작된 태크맨(TaqMan) 유전자 발현 분석(#어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems), AI39QW5, AI5I03D)를 이용하는 실시간 PCR이 이어졌다. GAPDH는 정규화자(normalizer)로서 사용되었다.
결과가 하기 실시예 7에 주어진다(표 2).
실시예
4: 생체 외(
In
vitro
) 모델:
RNA
추출 및
cDNA
합성
총
RNA
분리 및 첫 번째 가닥(
First
strand
) 합성
상기 기술된 바와 같이 형질감염된 세포로부터 제조자의 지시에 따라 퀴아젠 알엔이지 키트(Qiagen RNeasy kit)(#74106, 퀴아젠)를 사용하여 총 RNA가 추출되었다. 제조자의 지시에 따라 앰비온(Ambion)으로부터 MMLV-역전사효소(Reverse Transcriptase)(#2044, 앰비온) 및 임의적 십합체 프라이머(Random decamer primer)(#5722G, 앰비온) 시약을 사용하여 첫 번째 가닥 합성이 수행되었다.
각각의 시료에 대하여 0.3-0.4 μg 총 RNA가 RNase 없는 H20로 조정되었고 (10.8 ㎕) 2 ㎕ 임의적 십합체(random decamer)(50 μΜ)와 4 ㎕ dNTP 믹스(각각의 dNTP의 2.5 mM)와 혼합하고 3 분 동안 70 ℃에서 가열한 후, 각 시료를 얼음에서 빠르게 냉각시켰다. 시료를 얼음에서 냉각한 후에, 2 ㎕ 10x 완충액 RT, 1 ㎕ MMLV 역전사 효소(Reverse Transcriptase) (100 U/㎕) 및 0.25 ㎕ RNase 저해제(10 U/㎕)를 각각의 시료에 첨가한 후에, 42 ℃에서 60 분 동안 배양하였고, 95 ℃에서 10분 동안 효소의 열 불활성화시켰고, 그리고 나서 시료를 4 ℃에서 냉각시켰다.
실시예
5: 생체 외(
In
vitro
) 모델: 실-시간
PCR
에 의한
SMN2
RNA
스플라이싱의
올리고뉴클레오티드 조절의 분석
본 기술 분야에 알려진 다양한 방법으로 SMN2 발현의 안티센스 조절이 분석될 수 있다. 예를 들어, SMN2 mRNA 수준은 예를 들어, 노던 블롯(Northern blot) 분석, 경쟁적 중합효소 연쇄 반응(competitive polymerase chain reaction)(PCR), 또는 실시간 PCR에 의해 정량화될 수 있다. 실시간 정량적인 PCR이 현재 바람직하다. RNA 분석은 총 세포의 RNA 또는 mRNA에서 수행될 수 있다.
RNA 분리 및 RNA 분석 예컨대 노던 블롯(Northern blot) 분석의 방법이 이 기술 분야에서 일상적이며, 예를 들어, 분자 생물학에서의 현재 프로토콜, 존 와일리 및 선즈(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons)에서 가르친다. 실시간 정량적인 (PCR)은 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)로부터 이용가능한, 상업적으로 이용가능한 멀티-컬러(Multi-Color) 실시간 PCR 검출 시스템을 사용하여 편리하게 달성할 수 있다.
SMN2
mRNA
수준의 실시간 정량적인
PCR
분석
사람 전장(full length) 및 엑손7-스킵된(exon7-skipped) SMN2 mRNA의 시료 함량은 제조자의 지시에 따라 주문제작된 사람 SMN ABI 프리즘 태크맨 분석(SMN ABI Prism TaqMan Assay) (전장(full length) #AI5I03D, 엑손 7-스킵된 #AI39QW5, 어플라이드 바이오시스템즈)을 사용하여 정량화되었다. 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)(GAPDH) mRNA 양은 시료 제제에서 임의의 분산(variance)을 정규화하기 위한 내인성(내부, endogenous) 대조군으로 사용되었다.
사람 GAPDH mRNA의 시료 함량은 제조자의 지시에 따라 사람 GAPDH ABI 프리즘 프리-개발된 태크맨 분석 시약(human GAPDH ABI Prism Pre-Developed TaqMan Assay Reagent) (#4310884E, 어플라이드 바이오시스템즈)을 사용하여 정량화되었다.
실시간 정량적인 PCR은 본 기술분야에 잘 알려진 기술이고 예를 들어 Heid 외 실시간 정량적인 PCR, 게놈 리서치(Real time quantitative PCR, Genome Research)(1996), 6: 986-994에서 가르친다.
실시간 PCR : 실시예 5에 기술된 바와 같이 수행된 첫 번째 가닥 합성으로부터의 cDNA가 5 배 희석되었고, 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)로부터의 태크맨(Taqman) 7500 FAST 또는 7900 FAST를 사용하여 실시간 정량적인 PCR에 의해 분석되었다. 프라이머(primer)와 프로브(probe)는 2 x 태크맨 패스트 유니버셜 PCR 마스터 믹스(Taqman Fast Universal PCR master mix) (2x) (# 4352042, 어플라이드 바이오시스템즈)와 혼합되었고 10 ㎕의 최종 부피로 4 ㎕의 cDNA를 첨가하였다. 각각의 시료는 두벌로(duplicate) 분석되었다. 관심의 RNA를 발현하는 세포 주로부터 정제된 물질에서 제조된 cDNA의 2 배 희석 분석이 분석을 위한 표준 곡선을 생성하였다. 멸균된 H20가 주형(template) 없는 대조군을 위해 cDNA 대신에 사용되었다. PCR 프로그램은 20초 동안 95℃, 이어서 95℃, 3초, 60℃, 30초의 40 사이클이었다. 표적 mRNA 서열의 상대적인 양은 어플라이드 바이오시스템즈 패스트 시스템 SDS 소프트웨어 버전 1.3.1.21(Applied Biosystems Fast System SDS Software Version 1.3.1.21) 또는 SDS 소프트웨어 버전 2.3을 사용하여 계산된 역치 사이클(Threshold cycle)로부터 결정되었다.
실시예
6: 생체 외(
In
vitro
) 분석:
SD6
의 5'
SMN2
영역(
인트론
6)을 표적으로 한 올리고뉴클레오티드 화합물에 의한 사람
SMN2
mRNA
스플라이싱의
안티센스
조절
표 1에 제시된 올리고뉴클레오티드는 지질 형질감염을 사용하여 25 nM의 올리고 농도에서 SMN2 mRNA 스플라이싱을 조절하는 그들의 가능성(potential)에 대해 SMA1 세포 주에서 평가되었다. 이들 올리고뉴클레오티드는 문헌에서 이전에는 표적으로 되지 않은 영역, SMN2의 인트론 6에서 스플라이스 공여체(donor) 6 (SD6)의 5' 영역을 표적으로 한다. 결과는 표 2에 나타내진다.
표 2: 사람
SMN2
스플라이싱
-의
안티센스
조절
표 2에서 데이터는 SMA1 세포에서 25 nM에서 모의(mock) 형질감염된 세포에 대한 상대적인 하향-조절(down-regulation) 백분율로 제시된다. 올리고뉴클레오티드 서열 및 변형은 표 1에 나타낸다.
표 2:
SD6
의 5'
SMN2
영역(
인트론
6)에서
LNA
안티센스
올리고뉴클레오티드의 정교한 타일링(
fine
tiling
)
대조군의 100% 초과의 전장(full length) SMN2 mRNA 수준을 초래하는 올리고뉴클레오티드가 바람직하다. 표 2에서 알 수 있는 바와 같이, 서열번호 1, 2, 3-16, 19-20, 22 및 24-34를 갖는 올리고뉴클레오티드는 이러한 전장(full-length) SMN2 전사체(transcript)의 증가를 달성한다. 이들 현재 바람직한 올리고머는 젠뱅크 수탁번호(Genbank Acc. No.) NG_008728의 뉴클레오티드 26231-26300를 표적으로 한다.
서열번호 1, 5, 9, 11, 12, 26, 27, 28, 29, 30 및 34의 올리고뉴클레오티드는 대조군(이 실험에서, 모의(mock) 형질감염된 세포)과 비교하여 전장(full length) SMN2 mRNA 발현의 약 150% 또는 그 초과로 증가를, 이들 실험에서 SMN2 Δ7 mRNA 발현의 감소와 함께 입증하였고 따라서 특히 바람직하다. 이해되는 바와 같이, 이들 올리고는 스플라이스 스위칭(splice switching)을 야기하여 SMN2 엑손 7 포함물(inclusion)을 증가시키고 저조하게 기능하는 말단절단된(truncated) SMN2 Δ7 전사체(transcript)의 수준을 감소시킨다. 이들 특히 바람직한 화합물은 NG_008728 상에 뉴클레오티드 위치 26231-26246 및 26274-26300를 표적으로 한다.
또한 예시된 안티센스 올리고 서열 예를 들어, 변화하는 길이(더 짧거나 더 긴) 및/또는 뉴클레오염기 함량(예를 들어, 유사체 유닛의 유형 및/또는 비율)에 기반한 올리고뉴클레오티드가 바람직하며, 또한 이것은 전장(full length) 전사체에 유리하게 SMN2 발현의 좋은 조절, 바람직하게 대조군과 비교하여 적어도 150%의 전장을 제공한다.
실시예
7: 생체 외(
In
vitro
) 분석:
SMN2
영역
ISS
-
E1
(
인트론
6)을 표적으로 한 올리고뉴클레오티드 화합물에 의한 사람
SMN2
mRNA
스플라이싱의
안티센스
조절
표 1에 제시된 올리고뉴클레오티드는 지질 형질감염을 사용하여 25 nM의 올리고 농도에서 SMN2 mRNA 스플라이싱을 조절하는 그들의 가능성(potential)에 대해 SMA1 세포 주에서 평가되었다. 결과는 표 3에 나타낸다.
표 3:
SMN2
영역
ISS
-
E1
(
인트론
6)에서
LNA
-
안티센스
올리고뉴클레오티드의 정교한 타일링(
fine
tiling
)
표 3에서 데이터는 SMA1 세포에서 25 nM에서 모의(mock) 형질감염된 세포에 대한 상대적인 하향-조절(down-regulation) 백분율로 제시된다. 올리고뉴클레오티드 서열 및 변형은 표 1에 나타낸다.
대조군(표 3에 나타내는 바와 같음)의 100% 초과의 전장(full length) SMN2 mRNA 수준을 초래하는 올리고머가 바람직하다. 표로부터 알 수 있는 바와 같이, 서열번호 35-38, 40, 41, 및 45-49을 갖는 올리고머는 이러한 전장(full-length) SMN2 전사체(transcript)의 증가를 달성한다. 이들 올리고머는 젠뱅크 수탁번호(Genbank Acc. No.) NG_008728의 뉴클레오티드 위치 31881-31945를 표적으로 한다. 서열번호 53-59의 올리고머는 젠뱅크 수탁번호(Genbank Acc. No.) NG_008728의 뉴클레오티드 위치 31890-31905 및 31918-31945를 표적으로 하고, 대조군(이 실험에서, 모의(mock) 형질감염된 세포)과 비교하여 전장(full length) SMN2 mRNA 발현의 약 200% 또는 그 초과의 증가를, 이들 실험에서 SMN2 Δ7 mRNA 발현의 감소와 함께 입증하였고 따라서 특히 바람직하다. 이해되는 바와 같이, 이들 올리고는 스플라이스 스위칭(splice switching)을 야기하여 SMN2 엑손 7 포함물(inclusion)을 증가시키고 저조하게 기능하는 말단절단된 SMN2 Δ7 전사체(transcript)의 수준을 감소시킨다. 또한 이는 이 실험에서 대조군과 비교하여 전장(full length) SMN2 mRNA 발현의 200% 초과의 증가를, SMNΔ7의 증가와 함께 입증하였기 때문에 서열번호 40의 올리고뉴클레오티드는 특히 바람직하다. 이들 특히 바람직한 올리고머는 NG_008728 상에 뉴클레오티드 위치 31890-31905 및 31918-31945를 표적으로 한다.
또한 예시된 안티센스 올리고머 서열, 예를 들어 변화하는 길이(더 짧거나 더 긴) 및/또는 뉴클레오염기 함량(예를 들어, 유사체 유닛의 유형 및/또는 비율)에 기반한 올리고머가 바람직하며, 또한 이것은 SMN2 엑손 7 포함물(inclusion)을 증가(전장 SMN2 전사체의 증가)시키도록 SMN2 스플라이싱의 비교할만한 조절(대조군과 비교하여 적어도 약 200%)을 제공한다.
실시예
8: 생체 외(
In
vitro
) 분석:
SMN2
영역
ISE
/
ISS
-
E2
(
인트론
7)을 표적으로 한 올리고뉴클레오티드 화합물에 의한 사람
SMN2
mRNA
스플라이싱의
안티센스
조절
표 1에 제시된 올리고머는 지질 형질감염을 사용하여 25 nM의 올리고 농도에서 SMN2 mRNA 스플라이싱을 조절하는 그들의 가능성(potential)에 대해 SMA1 세포 주에서 평가되었다. 결과는 표 4에 나타낸다.
표 4:
SMN2
영역
ISE
/
ISS
-
E2
(
인트론
7)에서
LNA
-
안티센스
올리고뉴클레오티드의 정교한
타일링
(
fine
tiling
)
표 4에서 데이터는 SMA1 세포에서 25 nM에서 모의(mock) 형질감염된 세포에 대한 상대적인 하향-조절(down-regulation) 백분율로 제시된다. 올리고뉴클레오티드 서열 및 변형은 표 1에 나타낸다.
대조군(표 4에 나타내는 바와 같음)의 100% 초과의 전장(full length) SMN2 mRNA 수준을 초래하는 올리고머가 바람직하다. 표로부터 알 수 있는 바와 같이, 서열번호 60-80 및 83을 갖는 올리고머는 이러한 전장(full-length) SMN2 전사체(transcript)의 증가를 달성한다. 이들 올리고머는 젠뱅크 수탁번호(Genbank Acc. No.) NG_008728의 뉴클레오티드 위치 31211-32170를 표적으로 한다. 서열번호 62, 63, 65, 66 및 69-77의 올리고머는, 젠뱅크 수탁번호(Genbank Acc. No.) NG_008728의 뉴클레오티드 위치 32115-32162를 표적으로 하고, 대조군 세포(이 실험에서, 모의(mock) 형질감염된 세포)와 비교하여 전장(full length) SMN2 mRNA 발현의 약 200% 또는 그 초과의 증가를, 이들 실험에서 SMN2 Δ7 mRNA 발현의 감소와 함께 입증하였고 따라서 특히 바람직하다. 이해되는 바와 같이, 이들 올리고는 스플라이스 스위칭(splice switching)을 야기하여 SMN2 엑손 7 포함물(inclusion)을 증가시키고 저조하게 기능하는 말단절단된 SMN2 Δ7 전사체(transcript)의 수준을 감소시킨다. 또한 이는 이 실험에서 대조군과 비교하여 전장(full length) 및 SMNΔ7 전사체(transcript) 둘 다에서 적어도 약 200% 증가를 입증하였기 때문에 서열번호 79의 올리고뉴클레오티드가 특히 바람직하다. 이들 특히 바람직한 올리고머는 NG_008728 상에 뉴클레오티드 위치 32115-32162를 표적으로 한다.
또한 예시된 안티센스 올리고머 서열, 예를 들어 변화하는 길이(더 짧거나 더 긴) 및/또는 뉴클레오염기 함량(예를 들어, 유사체 유닛의 유형 및/또는 비율)에 기반한 올리고뉴클레오티드가 바람직하며, 또한 이것은 SMN2 엑손 7 포함물(inclusion)을 증가(전장 SMN2 전사체의 증가)시키도록 SMN2 스플라이싱의 비교할만한 조절을 제공한다.
본원에서 기술되고 청구된 모든 조성물 및 방법은 본 개시에 비추어 과도한 실험 없이 만들어지고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물과 방법은 바람직한 양태의 관점에서 기술되었지만, 상기 조성물 및 방법에 변형이 적용될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 모든 그러한 유사한 대체물 및 변형은 첨부된 청구항에 의해 정의된 바와 같이 본 발명의 사상 및 범위 내로 간주 된다.
SEQUENCE LISTING
<110> Santaris Pharma A/S
<120> COMPOUNDS FOR THE MODULATION OF SMN2 SPLICING
<130> 1125 WO
<150> 61/558462
<151> 2011-11-11
<160> 167
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> artificial
<220>
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<213> artificial
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<213> artificial
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<213> artificial
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<213> artificial
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<213> artificial
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<213> artificial
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<213> artificial
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<211> 16
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<213> artificial
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<213> artificial
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<213> artificial
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<213> artificial
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<213> artificial
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<213> artificial
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<213> artificial
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<213> artificial
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<213> artificial
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<213> artificial
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<213> artificial
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<213> artificial
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<213> artificial
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<213> artificial
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<213> artificial
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<213> artificial
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<223> nucleobase sequence / LNA oligonucleotide sequence
<400> 150
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<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> nucleobase sequence / LNA oligonucleotide sequence
<400> 151
aagtttttaa atgttc 16
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<211> 16
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<213> artificial
<220>
<223> nucleobase sequence / LNA oligonucleotide sequence
<400> 152
tgaagttttt aaatgt 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> artificial
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<400> 153
ctgaagtttt taaatg 16
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<211> 16
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<213> artificial
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<400> 154
tctgaagttt ttaaat 16
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<211> 16
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<213> artificial
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catctgaagt ttttaa 16
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<211> 16
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<213> artificial
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aacatctgaa gttttt 16
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<213> artificial
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ctaacatctg aagttt 16
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ttctaacatc tgaagt 16
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ctttctaaca tctgaa 16
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aactttctaa catctg 16
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tcaactttct aacatc 16
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tttcaacttt ctaaca 16
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ctttcaactt tctaac 16
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cctttcaact ttctaa 16
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ttaacctttc aacttt 16
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cattaacctt tcaact 16
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<211> 35073
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 167
tctgattggt gagcgatggt ggtaggtaaa accagtctta gagtcatggc agttcatttt 60
agcagctatt aggtaaaact ggtcttaggg atacagaagg ctggttcagc agttggactt 120
gtggaaaatt taattcttga agcagatgct gtgtgccccg aatgcttctt ccccctggcc 180
cttcaactct gatttagttg agtatttcaa gaatgaccca atttatgtaa tcaactttca 240
caggtataca tgtcttaaac tttaaacaga tgttttgggt tttgttgttg ttgtttttga 300
gacggagtct cactctgttg tccaagctgg agtgtagtgg tgtgatctcg gctcactgca 360
acctccgcct ccagggtcaa gtgattctcc agcctcagcc tcctgaatag ctgggattac 420
aggcgcccgc caccacgccc agctaatttt tgtattttta gtagagatgg ggtggggttt 480
caccatgttg gccaggctgg tcttgaactc ctgacatcaa gtgttctgct cacctcagcc 540
tctgaaagtg ctgggattac aggcgtgagc cactgcgccc ggcagtcttt ccttcttttt 600
tttttttttt tttttttttt taatgacatg gggtcttact ttattactca ggctggtctc 660
aaacttctgg cctcaaggaa tcttcccacc ttggcctccc aaattgctgg gattacaggc 720
ataagtcatc atgcctggct acaaacagat attttcaata agaggataaa agttcatttc 780
cccatacttt gctaacatca aatgttatta attcctaata gttttgccaa actgagagga 840
aaatggtatg ttagtttttc tgggttttct ttctttttaa ttttttttct tttttattca 900
tcgcaacact attcacgatt tttttatttt ttattttatt tatttattta tttttttttg 960
agacaaggtc tccctatgtt gcccaggctg gtcttgtacc cctgggctca aaggatcctc 1020
ctgcctcagc ctcccaaagt gctaggatta caggcatgag tcaccacgcc tggttcacaa 1080
tttctttttg tttttaccaa aggcaggtat attcctgaaa ttttttgttt ttttgttttt 1140
tttttgagat gaagtctcac cctgtcactc agactggagt gcactggcac gatctcagct 1200
cactgcaacc tccgcttcct aggttcaagc gattctcctg cctcagtctt caaagtagct 1260
aggattatag gcgccgcaac catgctcagc taatttttgt atttttagta gagacaggat 1320
ttcaccatgt tggccagggt gatctcaaat cctgacctca agtgatccgc ctgcctcagc 1380
ctcccaaagt gctgggatta ctggcatgag ccaccgtgcc aggccctgaa atgttatctt 1440
agttattaat ttgcaattcc ttggctctag aggttgggca tcttctcaga tctctagtgg 1500
acatttggat tttctttttg gtgaactgtc cagtttttct ctctgcttta caatctttat 1560
tatatgcaat cttcacatgt aggtactacc atttttttag tttgtttttg aaacagcata 1620
ttgctctgtt gcccaggctg gagcacggtg gcaaaaacat ggcttactgc agcctttgac 1680
ctccttggct caagtactcc tcctgtctca gcctcctgag tagctggtac cacaagccca 1740
taccaccatg cccagctaat ttatttttgt agagatgggg cctgaccatg ttacttgggc 1800
tcaaatgatc ctctcccact cagcctccca aagtgctagg attacaggca tgagccacca 1860
tacttggccc cttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttg agacacagtc 1920
ttgctctgtc tcacaggctg gtgtgcagtg gcacgatctc agctcattgc aacctccacc 1980
tcccagtttc aagtgatttt tgtgcctcag cctccctagt agctgagatt acaggcatgc 2040
accaccatgc ctggctgact ttcatatctt tagtgttgcc atgttggcta ggctggtctc 2100
aaactcctga cctcatgtga tccacctgcc tcggactccc acagtgctgg gattacaggt 2160
gttagccacc accccgacat tatttgaaac ttttatttta tcatgagaga gttccaggag 2220
tcaactgaag agagattttt ggtatgaaaa ttacatatgc aaaaagactg attccagtac 2280
atgaaattaa attcaacatt tacattaaat gccttcaaat atggtaaaat ggtttctttt 2340
ggcagtttac ctcattatgt tttgaatgat ttgtctatca tatgaaataa cttttataaa 2400
tatagtaact caggcctggg cacagcggct caagtgggag gactgcttaa gcaaccgagt 2460
ttgagaccag cgtggacaac atggggagac cccttctctc ccaaaaaata gctgagcatg 2520
gcagcgcact gttaaaggaa acagagtttc tttggtgggt gattaaaatg ttctggagtt 2580
agatagtagt gatggttgca caaccttgtg aatatattaa ggtttccgct ctatctacca 2640
ttcaattgta ctctctaaaa cgattaattc tatagtatat caattatatc tctaaataat 2700
aaaaacaaaa agaaatggct gggtgcggtg gctcatgcct gtaatcgcag cactttggga 2760
ggctgaggcg ggcggatcac aaggtcagga gtttgagacc aacctgacca acatggcaaa 2820
acccagtctc tactaaaaat acaaaaatta gctgggtgtg gtggcacacg cctgtaatcc 2880
caggtactcg ggaagctgag acaggagaat cacttgaacc cgggaggcag aggttgcagt 2940
gagccactgc actccagtct gggtggcaga gcgagactcc gtctcaaaaa gaaaaaaatt 3000
aaaaaacaaa aagaaacctg gttctatatt ttgtttaaat ttattttttt aaccatcatg 3060
taatatgtcc aggtaatttg tttaaatttt gacatcaaat gcaattgtga gaatttttat 3120
gattcagaaa aatctaagca agctttataa aaacatactt ttttttttac tttttttttt 3180
ttttctgaga cacagcctca ctctgtcgcc caggctggag ggcaggtttt catgtttatc 3240
tgtgagatgt acctttggca cattactttc ctgacatgag atttaaattt ttttttttat 3300
cttgtgacaa tttaactttt ttgacacata aaaattgtac atatttattt gtttgagatg 3360
gagtcgcact ctgtcactca ggctggagtg cagtggcgtg atcttggctc actgcaacct 3420
ccgcctcccg agttcaagtg attctcctgg ctcagcctcc caagcagctg tcattacagg 3480
cctgcaccac cacacccggc tgatttttgt atttttagga gaaacagggt ttcaccatgt 3540
tggccaggct ggtcttgaag tcctgacctc aagtgatcca cccaccttgg cctcccaaag 3600
tgctgggatt ataggcatga gccaccgtac cagaccccta aaaattgtat atatttaagg 3660
tgtaccattt gatgtttaga tatacattgt gaaatgatta cattccacat attacctcta 3720
cagagttacc atttttgtac acttggtcaa catcatccca ttctcccctt cctccacaga 3780
tatttcttgt atactatata gaagccaagg gtattttggg ggaagagctc aaagttcctt 3840
tcgtggagtt aaaaatatat atatactatg tacatataag ccatttagca accctagatg 3900
cttaataaag aatactggag gcccggtgtg gtggctcaca cctgtaatcc cagcactttg 3960
ggaggccgag gcggtcggat tacgaggtca ggagttcaag accagcctgg ccaacatggt 4020
gaaaccccat ctttactaaa aatacaaaaa ttagccgggt gtggtggtgg gcgcctgtaa 4080
tcccagctac tcggggggct gaggcagaat tgcttgaacc tgggaggcag aggttgcagt 4140
gagctgagat cacgccactg cattccagcc tgggtgacag agcaatactc tgtcgcaaaa 4200
aaaaaaaaga atactggagg ctgggcgagg tggctcacac ctgtaatccc agcattttgg 4260
gatgccagag gcgggcggaa tatcttgagc tcaggagttc gagaccagcc tacacaatat 4320
gctccaaacg ccgcctctac aaaacataca gaaactagcc gggtgtggtg gcgtgcccct 4380
gtggtcctag ctacttggga ggttgaggcg ggaggatcgc ttgagctcgg gaggtcgagg 4440
ctgcaatgag ccgagatggt gccactgcac tctgacgaca gagcgagact ccgtctcaaa 4500
acaaacaaca aataaggttg ggggatcaaa tatcttctag tgtttaagga tctgccttcc 4560
ttcctgcccc catgtttgtc tttccttgtt tgtctttata tagatcaagc aggttttaaa 4620
ttcctagtag gagcttacat ttacttttcc aagggggagg gggaataaat atctacacac 4680
acacacacac acacacacac acacacacac tggagttcga gacgaggcct aagcaacatg 4740
ccgaaacccc gtctctacta aatacaaaaa atagctgagc ttggtggcgc acgcctatag 4800
tcctagctac tggggaggct gaggtgggag gatcgcttga gcccaagaag tcgaggctgc 4860
agtgagccga gatcgcgccg ctgcactcca gcctgagcga cagggcgagg ctctgtctca 4920
aaacaaacaa acaaaaaaaa aaggaaagga aatataacac agtgaaatga aaggattgag 4980
agaaatgaaa aatatacacg ccacaaatgt gggagggcga taaccactcg tagaaagcgt 5040
gagaagttac tacaagcggt cctcccggcc accgtactgt tccgctccca gaagccccgg 5100
gcggcggaag tcgtcactct taagaaggga cggggcccca cgctgcgcac ccgcgggttt 5160
gctatggcga tgagcagcgg cggcagtggt ggcggcgtcc cggagcagga ggattccgtg 5220
ctgttccggc gcggcacagg ccaggtgagg tcgcagccag tgcagtctcc ctattagcgc 5280
tctcagcacc cttcttccgg cccaactctc cttccgcagc ctcgggacag catcaagtcg 5340
atccgctcac tggagttgtg gtccgcgttt ttctacgtct tttcccactc cgttccctgc 5400
gaaccacatc cgcaagctcc ttcctcgagc agtttgggct ccttgatagc gttgagtgga 5460
ggccctgccg cgacttggca gtagcttatt ttgttcactc ctctctggct ggtgtggggg 5520
aggtgggggc attaggccag ggtgaagcag gggaaccact taggagtctg ttaagatgat 5580
ctgaacttca gaacaagatg ttattaacag agtgaaagta tttggattct gggtatattt 5640
tgaaatcgga ggcaacaggt ttttcagata gattcgataa cggaggttat cctgaatagt 5700
tgaaaagata aagttgcctt ttgctgaggt gggaaagaga agattgccag tagagcaggt 5760
ttctcaggag ttcagtcttg ggcatagcat ggtaggggtg aatttggctg gagtgagttg 5820
gagagtagga gaagagaaat ccaaggcaac atttgaccag cctgggcaac atagtgtgac 5880
tccgagtctg caaaaattag acgggtgttg tggtgcgcgt ctgtggtctc agctacctgg 5940
aaggttcagg ccttggaagg ctcagggagg tggaggctgc agtgatctgt gattgcgcct 6000
ctgcactcca gcctgggcga cagagccaga ccctgtctta aaacaaaata aacggccggg 6060
cgcggtggct caagcctgta atcccagcac tttgggaggc cgaggcggcc ggatcacaag 6120
gtcaggagat cgagaccatc ctggctaaca cggtgaaacc ccgtctctac tacaaataca 6180
aaaaattagc cgggcgtggt gacgggcgcc tgtagtccca gctactcggg aggctgaggc 6240
aggagaatgt catgaagccg ggaggcggag cttgcagtga gccgagatcg cgccactgca 6300
ctccagcctg ggcgatagag caagactccg tctcaaataa ataaataaat aaataaataa 6360
ataataaaaa catcggtagg catatttcaa ggaattctat ttaaaaaaaa tttttttaga 6420
gacaagttcg ctctctgtgg cccaggctgg agtacagtgg catgatccta gcccatggca 6480
gcgttgatct cttggcctca agcgaccctc ctttggagtc gctgggccta aaggagtgag 6540
ccaccacgaa attttattat aaatggaggg tagagaaatt gggcaataaa tggaggggga 6600
agtgagttaa gaggaatttt aattatgtgt gtgtggtttt aaaagagggg ggtcttgctc 6660
tgttgcccag gctgctgggg tgccagtggc gcaatcatga atcactacag ccttggactc 6720
ctggcctcaa gctatcctcc cacctctgcc tcccaaagta ctgggattac tagtgtgagc 6780
cactgcacta agataggagc aacatgtttc agcatgtttg tgggttgata ggaaagatga 6840
gaatgggaaa gttgatgtcg gaaagaagac aatggctaga gcaatgtcct agagtaggta 6900
agaagggatg gatttggcct ttgttggaaa cattagcggt tcttttggtg acagctatat 6960
agttaacaca tctatgatac gtgaatgggc agataggatg gcaggagatt ttgaaagttc 7020
tcttgattct tactgttctc ttagtgaaag aagcaaggtt atcagctaga agctgggatg 7080
ggagaggaaa gagaagatgg gaagtagata gttctttaga agagtgggca agggttggac 7140
tagggaagtt tagtggaaat attgctaggc aacataaaga gcctacttga gattcgtggt 7200
catgagttga aggagaccag acagcaagat tgtgtatgag ggcacccaca gagtaaatgg 7260
agagttgaaa ttaatgcagt tgtgatttta ccacgtggat atgaagaagt gagggggaga 7320
agtacaaagg agttctctta atgattgacc atggaattta agctggctaa gaaaggaagt 7380
gagaggccgg gcgcggtggc tcacgcctgt aatcccagca ctttgggaga ctgaggtggg 7440
tggattacct gaggtcagga gtttgagacc aacctggccg atatggcgaa accccatctc 7500
taataaaaat acagaaaaat tagccgggaa tggtggcagg tgcctgtaat cccagctact 7560
caagaggctg tggcaggagt atcccttgga cccaggaggt ggaggttgca gtgagccgag 7620
atcacgccac tgtactccag cctggacgat atagtgagac ttcacctcaa aaaaaaaaaa 7680
aaagaaagga agtgaggatt ttaagaccct gagagacagt ttaaaaagtg ggaggatcgg 7740
ccgggcgctg tggctgacac ctgtaatccc agcactttgg gaggccgagt tgggcagatc 7800
acaaggtcag gagttcgaga ccagcctggc caatatggtg aaaccttgtc tctactaaaa 7860
atacaaaaat tagccgggca tggtgtcacg tgtctataat cccagctact cgggaggctg 7920
aggcagaaaa attgcttgaa cctgggaggc agaggttgca gacagctgag atcactccat 7980
tgcactccag cctgggcaac aagagcaaaa ctttgtcttt aaaaaaaaaa aaaaaaaaag 8040
aatacaaaaa ttagccgggc gtggtggcgc gtgcctataa tcccagctac ttgggaggct 8100
gaggcaggag aatcagttga acacgggagg cgaggtttgc agtgagccga gattgcgcca 8160
ctgcactcca gcctgggcga cagagcagga ctcctcttgg aaaaaaaaaa ttagctgggc 8220
atggtggcag gtgcctgtag tctcagctac tagggaggct gaggcaggaa aatcacttga 8280
acccgggatg tggagtttgc agtgacccga gatcgtgcca ctgtactcca tcctgggcga 8340
caaaatgaga ctctgcctca aaaaaaaaaa aaaaaaaaag tgggaggatc aatgtactgc 8400
cagtcctaat gaagtggaat gattgtcccc atcaaatcac tagtaggagt aagttgcaga 8460
gcctagaagg tgatggttaa gagagtggga ttcttgaaac tgcatttatg gagaggttgt 8520
ggttattggt tataataaat aaatacagtt gaagtgagtg agtagctgag atttggggat 8580
gtatcagttc attcttacac tgctacaaag acatacctga gaccaggtat ttataaagat 8640
aagaggttta atcagctcac agttctgctg cctgtacagg cttctcttgt ggaggcctaa 8700
ggaaacttac agtcatggtg gaaggtgaag gggaaacaag cacagtcttc acatggccag 8760
caggagagag agagaagggg gaagtgctac atactttaaa acaaccagat cttgtgagaa 8820
cgcttatcag gaaacagcac ttggggatgg tgctaaatca ttagaaatca cccccatgat 8880
ccagtcgcct cctaccatgc ccacctccaa cactggggat cacaattcag catgagattt 8940
gggtaggaac acagagctgc accacatcag aggatgtaca agattgtggt ggagaggagt 9000
ttagagacct gcaaatatag ggtaattgaa gggatcatct acatggatat ttaaatcacc 9060
aaaaattatg acaggagtag tgttggagag agaactgcga tgtaaacatt aaggaatgag 9120
gaagagtgac tcggtaggct gtaggtgact gcaataggaa acgataatag actgtgagtc 9180
tggtgacaag attttccttc tttctttttt tccccccccc cgagacaggg cctctttttg 9240
ttgcccaggt gggagtgcag tggcgcgatc acggctcact acaacctcct cccaagctca 9300
agggattctc ccacttcagc ctctcaagta gctggaacta caggtgctga ccaccatgcc 9360
tggctacttt ttgtcaggat tttcaaggct gggaattttg agaggggaat ggaggagaat 9420
aatctgaaag tgcaagtaag gagcagggaa gatttctttt ttcttttttt tttttttttt 9480
tgagtcggag tctggctcag tcgcccaggc tggagtgcag tggcgagatc tccgctcact 9540
gcaagctccg cctcccgtgt tcacgccatt ctcctccttc agcctcccga gtagctggga 9600
ctacaggcgc ccgccaccac gcccagctaa ttgttttttt gtatttttag tagagacggg 9660
gtttcaccgt gttagccagg atggtctcaa tctcctgact ttgtgatccg cccaccccgg 9720
cctcccaaag cgcttgggat tacaggcgtg agccaccgcg ccagccagag cagggaagat 9780
ttcttcccca catctccagt aggtacagtg atatgaagtg tgtggaggag aaaagaggaa 9840
acatctatca tttgagatgg ctgcgaaagg aaaaggcatc ctcagggagc tagattttac 9900
ttagagcaag aaatgaaggg atgattcaga ggttaaaaga gtggatttta tgaattactc 9960
aagggagcac agtggaagtt tcaggaagtg gtaggagaag gtagaagatg gcagggtgtt 10020
gggaataatt tgagaaatct gagctactgg aaatgactga gaatcagata taaaggcagt 10080
cctggtggtc cgttctggct gccgttgctg tgtaacgaat ctgccaaaac ttagtggctt 10140
gaaacaacaa agaacatttt attatctctc attgtttctg tgggttagga atttgtgaga 10200
gccgtgctgg gcagttttcg tgcggctgtc tcgtggttgc acctacatag ttgctagagc 10260
tacagtagct ggggactgag cagctaggga ttggcaggct atctcttttt ttcatgtagt 10320
ctcatgaaga tttctttatg tggtttcaat gtgtgggctg gtttggattt ccttatagca 10380
tggtggcctc agttggattg ctgttttgtg atccttttca tccctccttg tcctgtcccc 10440
agacaaccac tgatctactt tctgtcacca tagattagcc tgcattttta agaattttta 10500
taaacgtgga atgatagagt accttttttg tcacgtttct tttatttatc atagctattt 10560
tgattttcat ccattttatt gctgagtagt atcccattgc atgtatatac tatactgtat 10620
tcattcgctt gcttgtgaac atttgggctt tttccagttt gggactgtta acaagtagag 10680
ccactatgaa tattagtgta taagacttca tatagccaag gctggcagat cgcttgagcc 10740
caggagtttg agaccagcct gggaaacatg gtgaaacctc tatttttatt ttaaaatcaa 10800
aaattaaaaa ttttctataa aaaattttaa agaagacttt gtatagacat acgctttcat 10860
ttttcttgag tgaatactta ggtctcaggg tagatgtatt ttaagtcttt aaggagctgt 10920
caaactcttc ctcaaagtgg tggttgtacc atgttacttt ttaatataac agagattaat 10980
tgagcaaaga aaaattcaaa agttggacag cccccacaac taaataggtt cagaacagct 11040
cccccatttt gcattttgac cagcaatgta tgaaagttcc atttgctcag tgtccctgca 11100
aacacctggt atggtcagtc tttttaattt taggcattat aatagatata gtggcttctt 11160
gtgattttaa ttagcatttc ctaatgacca gtgctgctgt tgatcatttc atgagtgtat 11220
ttgccatccg tatatctttt ttggtgaagt gtctattcaa atcatttggg tttttttttt 11280
ttttgttttt tttttttgga gacagtgtct cactctgtca cccaggctgt tgtgcagtgg 11340
tgcaatcaca cagcctactg cagcctccac ctcctgcgct cagtcttctt gtctcagcct 11400
tctgagtagc tgaaattacg agcacacgcc acaatgcctg gctaattttt taaaattttg 11460
tagaaacaag gtctcattat gttgcctggg cttgtcgtga actcctgggc tcaagcaatc 11520
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ttacccatct tttaattgaa tttttttgtt gttgaggttt gagagttctt catgtttgct 11640
gggtacaata tctttatcag ataggtaact tgcatgtatt ttctcccggt ttacactttg 11700
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atctttttct gtctccagat aattccccca ccacctccca tatgtccaga ttctcttgat 26160
gatgctgatg ctttgggaag tatgttaatt tcatggtaca tgagtggcta tcatactggc 26220
tattatatgg taagtaatca ctcagcatct tttcctgaca atttttttgt agttatgtga 26280
ctttgttttg taaatttata aaatactact tgcttctctc tttatattac taaaaaataa 26340
aaataaaaaa atacaactgt ctgaggctta aattactctt gcattgtccc taagtataat 26400
tttagttaat tttaaaaagc tttcatgcta ttgttagatt attttgatta tacacttttg 26460
aattgaaatt atactttttc taaataatgt tttaatctct gatttgaaat tgattgtagg 26520
gaatggaaaa gatgggataa tttttcataa atgaaaaatg aaattctttt tttttttttt 26580
ttttttttga gacggagtct tgctctgttg cccaggctgg agtgcaatgg cgtgatcttg 26640
gctcacagca agctctgcct cctggattca cgccattctc ctgcctcagc ctcagaggta 26700
gctgggacta caggtgcctg ccaccacgcc tgtctaattt tttgtatttt tttgtaaaga 26760
cagggtttca ctgtgttagc caggatggtc tcaatctcct gaccccgtga tccacccgcc 26820
tcggccttcc aagagaaatg aaattttttt aatgcacaaa gatctggggt aatgtgtacc 26880
acattgaacc ttggggagta tggcttcaaa cttgtcactt tatacgttag tctcctacgg 26940
acatgttcta ttgtatttta gtcagaacat ttaaaattat tttattttat tttatttttt 27000
tttttttttt gagacggagt ctcgctctgt cacccaggct ggagtacagt ggcgcagtct 27060
cggctcactg caagctccgc ctcccgggtt cacgccattc tcctgcctca gcctctccga 27120
gtagctggga ctacaggcgc ccgccaccac gcccggctaa ttttttttta tttttagtag 27180
agacggggtt tcaccgtggt ctcgatctcc tgacctcgtg atccacccgc ctcggcctcc 27240
caaagtgctg ggattacaag cgtgagccac cgcgcccggc ctaaaattat ttttaaaagt 27300
aagctcttgt gccctgctaa aattatgatg tgatattgta ggcacttgta tttttagtaa 27360
attaatatag aagaaacaac tgacttaaag gtgtatgttt ttaaatgtat catctgtgtg 27420
tgcccccatt aatattctta tttaaaagtt aaggccagac atggtggctt acaactgtaa 27480
tcccaacagt ttgtgaggcc gaggcaggca gatcacttga ggtcaggagt ttgagaccag 27540
cctggccaac atgatgaaac cttgtctcta ctaaaaatac caaaaaaaat ttagccaggc 27600
atggtggcac atgcctgtaa tccgagctac ttgggaggct gtggcaggaa aattgcttta 27660
atctgggagg cagaggttgc agtgagttga gattgtgcca ctgcactcca cccttggtga 27720
cagagtgaga ttccatctca aaaaaagaaa aaggcctggc acggtggctc acacctataa 27780
tcccagtact ttgggaggta gaggcaggtg gatcacttga ggttaggagt tcaggaccag 27840
cctggccaac atggtgacta ctccatttct actaaataca caaaacttag cccagtggcg 27900
ggcagttgta atcccagcta cttgagaggt tgaggcagga gaatcacttg aacctgggag 27960
gcagaggttg cagtgagccg agatcacacc gctgcactct agcctggcca acagagtgag 28020
aatttgcgga gggaaaaaaa agtcacgctt cagttgttgt agtataacct tggtatattg 28080
tatgtatcat gaattcctca ttttaatgac caaaaagtaa taaatcaaca gcttgtaatt 28140
tgttttgaga tcagttatct gactgtaaca ctgtaggctt ttgtgttttt taaattatga 28200
aatatttgaa aaaaatacat aatgtatata taaagtattg gtataattta tgttctaaat 28260
aactttcttg agaaataatt cacatggtgt gcagtttacc tttgaaagta tacaagttgg 28320
ctgggcacaa tggctcacgc ctgtaatccc agcactttgg gaggccaggg caggtggatc 28380
acgaggtcag gagatcgaga ccatcctggc taacatggtg aaaccccgtc tctactaaaa 28440
gtacaaaaac aaattagccg ggcatgttgg cgggcacctt ttgtcccagc tgctcgggag 28500
gctgaggcag gagagtggcg tgaacccagg aggtggagct tgcagtgagc cgagattgtg 28560
ccagtgcact ccagcctggg cgacagagcg agactctgtc tcaaaaaata aaataaaaaa 28620
gaaagtatac aagtcagtgg ttttggtttt cagttatgca accatcacta caatttaaga 28680
acattttcat caccccaaaa agaaaccctg ttaccttcat tttccccagc cctaggcagt 28740
cagtacactt tctgtctcta tgaatttgtc tattttagat attatatata aacggaatta 28800
tacgatatgt ggtcttttgt gtctggcttc tttcacttag catgctattt tcaagattca 28860
tccatgctgt agaatgcacc agtactgcat tccttcttat tgctgaatat tctgttgttt 28920
ggttatatca cattttatcc attcatcagt tcatggacat ttaggttgtt tttatttttg 28980
ggctataatg aataatgttg ctatgaacat tcgtttgtgt tctttttgtt tttttggttt 29040
tttgggtttt ttttgttttg tttttgtttt tgagacagtc ttgctctgtc tcctaagctg 29100
gagtgcagtg gcatgatctt ggcttactgc aagctctgcc tcccgggttc acaccattct 29160
cctgcctcag cccgacaagt agctgggact acaggcgtgt gccaccatgc acggctaatt 29220
ttttgtattt ttagtagaga tggggtttca ccgtgttagc caggatggtc tcgatctcct 29280
gacctcgtga tctgcctgcc taggcctccc aaagtgctgg gattacaggc gtgagccact 29340
gcacctggcc ttaagtgttt ttaatacgtc attgccttaa gctaacaatt cttaaccttt 29400
gttctactga agccacgtgg ttgagatagg ctctgagtct agcttttaac ctctatcttt 29460
ttgtcttaga aatctaagca gaatgcaaat gactaagaat aatgttgttg aaataacata 29520
aaataggtta taactttgat actcattagt aacaaatctt tcaatacatc ttacggtctg 29580
ttaggtgtag attagtaatg aagtgggaag ccactgcaag ctagtataca tgtagggaaa 29640
gatagaaagc attgaagcca gaagagagac agaggacatt tgggctagat ctgacaagaa 29700
aaacaaatgt tttagtatta atttttgact ttaaattttt tttttattta gtgaatactg 29760
gtgtttaatg gtctcatttt aataagtatg acacaggtag tttaaggtca tatattttat 29820
ttgatgaaaa taaggtatag gccgggcacg gtggctcaca cctgtaatcc cagcactttg 29880
ggaggccgag gcaggcggat cacctgaggt cgggagttag agactagcct caacatggag 29940
aaaccccgtc tctactaaaa aaaatacaaa attaggcggg cgtggtggtg catgcctgta 30000
atcccagcta ctcaggaggc tgaggcagga gaattgcttg aacctgggag gtggaggttg 30060
cggtgagccg agatcacctc attgcactcc agcctgggca acaagagcaa aactccatct 30120
caaaaaaaaa aaaataaggt ataagcgggc tcaggaacat cattggacat actgaaagaa 30180
gaaaaatcag ctgggcgcag tggctcacgc cggtaatccc aacactttgg gaggccaagg 30240
caggcgaatc acctgaagtc gggagttcca gatcagcctg accaacatgg agaaaccctg 30300
tctctactaa aaatacaaaa ctagccgggc atggtggcgc atgcctgtaa tcccagctac 30360
ttgggaggct gaggcaggag aattgcttga accgagaagg cggaggttgc ggtgagccaa 30420
gattgcacca ttgcactcca gcctgggcaa caagagcgaa actccgtctc aaaaaaaaaa 30480
ggaagaaaaa tattttttta aattaattag tttatttatt ttttaagatg gagttttgcc 30540
ctgtcaccca ggctggggtg caatggtgca atctcggctc actgcaacct ccgcctcctg 30600
ggttcaagtg attctcctgc ctcagcttcc cgagtagctg tgattacagc catatgccac 30660
cacgcccagc cagttttgtg ttttgttttg ttttttgttt tttttttttg agagggtgtc 30720
ttgctctgtc ccccaagctg gagtgcagcg gcgcgatctt ggctcactgc aagctctgcc 30780
tcccaggttc acaccattct cttgcctcag cctcccgagt agctgggact acaggtgccc 30840
gccaccacac ccggctaatt tttttgtgtt tttagtagag atggggtttc actgtgttag 30900
ccaggatggt ctcgatctcc tgaccttttg atccacccgc ctcagcctcc ccaagtgctg 30960
ggattatagg cgtgagccac tgtgcccggc ctagtcttgt atttttagta gagtcgggat 31020
ttctccatgt tggtcaggct gttctccaaa tccgacctca ggtgatccgc ccgccttggc 31080
ctccaaaagt gcaaggcaag gcattacagg catgagccac tgtgaccggc aatgttttta 31140
aattttttac atttaaattt tattttttag agaccaggtc tcactctatt gctcaggctg 31200
gagtgcaagg gcacattcac agctcactgc agccttgacc tccagggctc aagcagtcct 31260
ctcacctcag tttcccgagt agctgggact acagtgataa tgccactgca cctggctaat 31320
ttttattttt atttatttat ttttttttga gacagagtct tgctctgtca cccaggctgg 31380
agtgcagtgg tgtaaatctc agctcactgc agcctccgcc tcctgggttc aagtgattct 31440
cctgcctcaa cctcccaagt agctgggatt agaggtcccc accaccatgc ctggctaatt 31500
ttttgtactt tcagtagaaa cggggttttg ccatgttggc caggctgttc tcgaactcct 31560
gagctcaggt gatccaactg tctcggcctc ccaaagtgct gggattacag gcgtgagcca 31620
ctgtgcctag cctgagccac cacgccggcc taatttttaa attttttgta gagacagggt 31680
ctcattatgt tgcccagggt ggtgtcaagc tccaggtctc aagtgatccc cctacctccg 31740
cctcccaaag ttgtgggatt gtaggcatga gccactgcaa gaaaacctta actgcagcct 31800
aataattgtt ttctttggga taacttttaa agtacattaa aagactatca acttaatttc 31860
tgatcatatt ttgttgaata aaataagtaa aatgtcttgt gaaacaaaat gctttttaac 31920
atccatataa agctatctat atatagctat ctatatctat atagctattt tttttaactt 31980
cctttatttt ccttacaggg ttttagacaa aatcaaaaag aaggaaggtg ctcacattcc 32040
ttaaattaag gagtaagtct gccagcatta tgaaagtgaa tcttactttt gtaaaacttt 32100
atggtttgtg gaaaacaaat gtttttgaac atttaaaaag ttcagatgtt agaaagttga 32160
aaggttaatg taaaacaatc aatattaaag aattttgatg ccaaaactat tagataaaag 32220
gttaatctac atccctacta gaattctcat acttaactgg ttggttgtgt ggaagaaaca 32280
tactttcaca ataaagagct ttaggatatg atgccatttt atatcactag taggcagacc 32340
agcagacttt tttttattgt gatatgggat aacctaggca tactgcactg tacactctga 32400
catatgaagt gctctagtca agtttaactg gtgtccacag aggacatggt ttaactggaa 32460
ttcgtcaagc ctctggttct aatttctcat ttgcaggaaa tgctggcata gagcagcact 32520
aaatgacacc actaaagaaa cgatcagaca gatctggaat gtgaagcgtt atagaagata 32580
actggcctca tttcttcaaa atatcaagtg ttgggaaaga aaaaaggaag tggaatgggt 32640
aactcttctt gattaaaagt tatgtaataa ccaaatgcaa tgtgaaatat tttactggac 32700
tctattttga aaaaccatct gtaaaagact gaggtggggg tgggaggcca gcacggtggt 32760
gaggcagttg agaaaatttg aatgtggatt agattttgaa tgatattgga taattattgg 32820
taattttatg agctgtgaga agggtgttgt agtttataaa agactgtctt aatttgcata 32880
cttaagcatt taggaatgaa gtgttagagt gtcttaaaat gtttcaaatg gtttaacaaa 32940
atgtatgtga ggcgtatgtg gcaaaatgtt acagaatcta actggtggac atggctgttc 33000
attgtactgt ttttttctat cttctatatg tttaaaagta tataataaaa atatttaatt 33060
tttttttaaa ttagctgtat ctgtgattgt atttcttttt tgcatattat tttgcccttt 33120
ggcccatatt ttgatatgga tgccaccata gcattttgtg tatgtgcatg tgtattccca 33180
cttaatgtca catttttcat gtctttacat attcttattt ttgtttgttt ttgagacaga 33240
gtctcgctct gctgcccacg ctggagtgca gtggtgcaat ctcagctcac tgcaacctct 33300
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tgtggcacca tgccccacta agttttgtat ttttagtaga gatggagttt caccatgttg 33420
gccaggctgg tctcaaactc ctgccctcaa gtgattcgac caccctggcc tcccaaagtg 33480
ctgggattac agccgtgagc caccgcacac ggcctctcta tttatttcta tacatagctt 33540
ttcacattat attatgttta tatattgttt atatctgtat ttcctctttc attagagaaa 33600
aggtagtaca tcttattctt catggtgtct acaatatctg gcagtttttg gaagtcaagc 33660
gtgagcttag agcatagact ggtgggattg tcaaagaaga gggcaactgg aagagaactg 33720
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ttgctaattt tgaagaagac ttattaacaa atcctacatt aggtaaatgg ttttgaaagt 33840
tgagttaatc ataatggtgt ttgacctagg actattttta ggccctattt atcttaatat 33900
cgaataatga agcagcttcc cccttagata tagacagaaa acatcaaagc caccacacta 33960
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taataattgt ccttgtggtt gtaaggaatc tagatgaaaa ttacatggtc tgttctacag 34080
ccacagctgt acctacattc agaagacaga caaaagttgc tgtgtttgaa gagatccttc 34140
attaagggat cagacagaga ttactttgag acatattcta agtttaactt ttctgcaggg 34200
ttgccattaa cagaaataaa ctacagagtt aatttctttt tgtttttgat acagtctaac 34260
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ctggtctgga actcctgacc ccaggtaatc cacctgcctc ggcctcccaa agtgctggga 34500
ttacaagctt gagccactac gcctgaccca gagttaactt tttaaaaaag tttttatgaa 34560
cttaagtctt gtgatgtttg aaataatgga ttcaatttag acatcaaatt ccagaagtta 34620
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cgggtggatc acctgagatc aggagttcca gaccagcctg gccaacatag taaaaccctg 34740
tctctactaa aaatacaaaa attagcccgg catggtggca cgccctgtag tcccagctac 34800
ttgggaggct gaggcaggag aattgcttga acccgggagg tggaggttgt ggtgagccga 34860
gattgtgcca ctgtactcaa gcctgggcta aaaagcgaga ctccgtctca aaaaaaaaaa 34920
aaaaaaaaac acgttactaa gagcaactct gggccaggca cggtggctta cacctgtaat 34980
cccagcattt tgggaggacg agacaggcgg atcacttgag cccaggagtt caagaccagc 35040
ataagcaaca acgcaaaacc cctgactcta caa 35073
Claims (16)
- 적어도 하나의 LNA 유닛을 포함하는, 10-30 뉴클레오티드 길이의 올리고머:
상기 올리고머의 뉴클레오염기(nucleobase) 서열은 젠뱅크 수탁번호(Genbank Accession No.) NG_008728 (서열번호 167)의 뉴클레오티드 26231-26300, 31881-31945, 또는 32111-32170에 상응하는 영역 또는 이의 자연적으로 발생하는 변이체(variant)에 적어도 80% 상보적(complementary)이다.
- 제1항에 있어서, 상기 뉴클레오염기 서열은 젠뱅크 수탁번호(Genbank Accession No.) NG_008728 (서열번호 167)의 뉴클레오티드 26231-26246, 26274-26300, 31890-31905, 31918-31945 또는 32115-32162의 상응하는 영역에 적어도 80% 상보적인 LNA 올리고머.
- 제1항에 있어서, 상기 올리고머는 젠뱅크 수탁번호(Genbank Accession No.) NG_008728(서열번호 167)의 뉴클레오티드 26231-26300에 적어도 80% 상보적인 올리고머.
- 제1항에 있어서, 상기 올리고머의 뉴클레오염기 서열은 서열번호 1, 2, 3-16, 19-20, 22, 24-34, 35-38, 40, 41, 45-49, 60-80 또는 83의 서열과 적어도 80% 동일한(identical) 올리고머.
- 제1항에 있어서, 상기 올리고머의 뉴클레오염기 서열은 서열번호 1, 5, 9, 11, 12, 26, 27, 28, 29, 30, 34, 40, 53-59, 62, 63, 65, 66, 69-77 또는 79의 서열을 갖는 올리고머.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고머는 전장(full length) SMN2 mRNA 전사체(transcript)의 수준의 증가를 초래하는 SMN2 mRNA의 스플라이싱을 조절하는 올리고머.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고머는 핵산 표적(nucleic acid target)의 RNAse H 절단(cleavage)을 유도하지 않는 올리고머.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고머는 LNA 및 DNA 뉴클레오티드만을 포함하는 올리고머.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 4 미만의 연속적인(contiguous) DNA 유닛, 예컨대 3 미만의 연속적인 DNA 유닛, 예컨대 2 미만의 연속적인 DNA 유닛을 갖는 올리고머.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고머는 LNA 및 DNA 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 3 이하의 연속적인(consecutive) LNA 유닛, 예컨대 2 이하의 연속적인 LNA 유닛이고, 및 여기서 5' 뉴클레오티드는 LNA 유닛이고 3' 뉴클레오티드, 예컨대 2 3' 뉴클레오티드는 LNA 유닛인 올리고머.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고머는 12-16 뉴클레오티드 길이인 올리고머.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고머는 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 올리고머인 올리고머.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 올리고머 및 상기 올리고머에 공유 부착된 적어도 하나의 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 모이어티(moiety)를 포함하는 접합체(conjugate).
- 약제로서 사용을 위한, 예컨대 유형Ⅰ, 유형 Ⅱ 또는 유형 Ⅲ 척수성 근위축의 치료를 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 올리고머, 또는 제13항에 따른 접합체(conjugate).
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 올리고머, 또는 제13항의 접합체(conjugate), 및 약제학적으로 허용가능한 희석제, 담체(carrier), 염 또는 보조제를 포함하는 약제학적 조성물.
- SMN2 mRNA를 발현하는 사람 세포에서 SMN2 mRNA의 스플라이싱을 조절하기 위한 생체 외(in vitro) 방법:
상기 방법은 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 올리고머, 또는 제13항에 따른 접합체(conjugate), 또는 제15항의 약제학적 조성물을, 상기 사람 세포에 투여하는 단계를 포함하고,
여기서 상기 사람 세포에서 SMN2 RNA의 상기 스플라이싱이 조절되고 말단절단된(truncated) SMN2 mRNA에 대한 전장(full length) SMN2 mRNA의 비율이 증가 된다.
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