KR20060116848A - Ｓｔａｔ3 발현의 안티센스 올리고뉴클레오티드 조절 - Google Patents

Ｓｔａｔ3 발현의 안티센스 올리고뉴클레오티드 조절 Download PDF

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Abstract

인간 STAT3의 발현을 억제하기 위한 화합물, 조성물 및 방법이 제공된다. 조성물은 STAT3을 코드화하는 핵산을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다. STAT3 발현의 억제 및 세포고사의 촉진을 위해 이러한 올리고뉴클레오티드를 사용하는 방법이 제공된다. STAT3의 과다발현 또는 구조적 활성화 또는 불충분한 세포고사와 연관된 질병, 특히 염증성 질병 및 암의 치료 방법이 또한 제공된다.
안티센스 올리고뉴클레오티드, STAT3의 발현 억제, 세포고사.

Description

ＳＴＡＴ3 발현의 안티센스 올리고뉴클레오티드 조절 {ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE MODULATION OF STAT3 EXPRESSION}
본 발명은, 시그날 전달 및 전사 활성화에 관여하는 천연 DNA-결합 단백질을 코드화하고 질병에 연루된, 인간 STAT3 유전자의 발현을 조절하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 STAT3-매개 시그날 전달 및 전사 활성화를 억제하기 위한 방법에 관한 것이고; 이러한 방법은 진단 또는 치료에서 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 인간 STAT3 유전자의 발현과 연관된 상태의 치료에 관한 것이다.
STAT(시그날 전달인자 및 전사 활성화인자 (signal transducers and activators of transcription)) 단백질은, 시그날 전달 및 전사 활성화에서 이중적 역할을 하는 DNA-결합 단백질이다. 현재, STAT 계통의 6개 뚜렷한 요소(STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5 및 STAT6) 및 여러 이소형태 (STAT1-알파, STAT1-베타, STAT3-알파 및 STAT3-베타)가 존재한다. STAT의 활성은 다양한 사이토카인 및 마이토젠 자극에 의해 조절된다. 그의 수용체에 사이토카인이 결합되면, 이러한 수용체와 결합된 재너스(Janus) 단백질 티로신 키나아제(JAKs)가 활성화된다. 이것은 다시 STAT를 포스포릴화하고, 그 결과 핵으로의 전좌 및 STAT 반응성 유전자 의 전사 활성화가 일어난다. STAT 위에서 특정한 티로신 잔기에 대한 포스포릴화는 그들을 활성화시키고, 그 결과 특정한 유전자 프로모터 서열에 결합하는 STAT의 호모이량체 및(또는) 헤테로이량체가 형성된다. STAT 활성화를 통해 사이토카인에 의해 매개되는 사건은, 세포 증식 및 분화와 세포고사의 방지를 포함한다.
STAT 활성화의 특이성은 특정한 사이토카인에 기인하고, 다시말해서 각각의 STAT는 적은 수의 특정한 사이토카인에 반응성이다. 다른 비-사이토카인 시그날링 분자, 예컨대 성장 인자가 STAT를 활성화시키는 것으로 밝혀졌다. 단백질 티로신 키나아제와 연관된 세포 표면 수용체에 이러한 인자를 결합시키면 그 결과 STAT가 포스포릴화된다.
특히, STAT3 (또한, 급성 단계 반응 인자(APRF), STAT3-알파)는 인터류킨-6(IL-6) 뿐만 아니라 표피 성장 인자(EGF)에 반응성인 것으로 밝혀졌다 [Darnell,Jr., J.E., 등, Science, 1994, 264, 1415-1421]. 또한, STAT3은 인터페론에 의한 시그날 전달에서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다 [Yang,C.H. 등, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1998, 95, 5568-5572]. STAT3이 MAPK 경로에 의해 조절될 수도 있음을 제시하는 증거가 존재한다. ERK2는 세린 포스포릴화를 유도하고, STAT3과 관련된다 [Jain,N. 등, Oncogene, 1998, 17, 3157-3167].
STAT3은 대부분의 세포 유형에서 발현된다 [Zhong,Z. 등, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1994, 91, 4806-4810]. 이것은 조직 손상 및 염증에 대한 반응에 관여하는 유전자의 발현을 유도한다. 또한, STAT3은 bcl-2의 발현을 통해 세포고사를 방지하는 것으로 밝혀졌다 [Fukada,T. 등, Immunity, 1996, 5, 449- 460].
STAT3의 이상 발현 또는 구성 발현은 다수의 질병 과정과 연관된다. STAT3은 세포 형질전환에 관여하는 것으로 밝혀졌다. 이것은 v-src-형질전환된 세포에서 구조적으로 활성화된다 [Yu,C.L. 등, Science, 1995, 269, 81-83]. 구조적으로 활성인 STAT3은 STAT3 매개 유전자 발현을 유도하고 src에 의한 세포 형질전환을 위해 요구된다 [Turkson,J. 등, Mol.Cell.Biol.1998, 18, 2545-2552]. STAT3은 또한 인간 T 세포 림프성 바이러스 I (HTLV-I) 형질전환된 세포에서 구조적으로 활성이다 [Migone,T.S. 등, Science, 1995, 269, 79-83].
STAT3의 구조적 활성화 및(또는) 과다발현이 골수종, 유방 암종, 전립선 암, 뇌 종양, 머리 및 목 암종, 흑색종, 백혈병 및 림프종, 특히 만성 골수성 백혈병 및 다발성 골수종을 포함하여 여러 형태의 암에 관여하는 것으로 보인다 [Niu 등, Cancer Res., 1999, 59, 5059-5063]. EGFR을 과다발현하는 유방암 세포주는 포스포릴화된 STAT3을 구조적으로 발현한다 [Sartor,C.T.등, Cancer Res., 1997, 57, 978-987; Garcia, R. 등, Cell Growth and Differentiation, 1997, 8, 1267-1276]. 활성화된 STAT3 수준은 저 등급 교모세포종 및 수모세포종에서 증가하는 것으로 밝혀졌다[Cattaneo,E. 등, Anticancer Res., 1998, 18, 2381-2387].
쥐 및 인간 전립선 암 양쪽에서 유래된 세포들은 구조적으로 활성화된 STAT3을 갖는 것으로 밝혀졌으며, STAT3 활성화는 악성 가능성과 상관관계가 있다. 우성-네가티브 STAT3의 발현은 인간 전립선 세포의 성장을 현저히 억제하는 것으로 밝혀졌다 [Ni 등, Cancer Res. 2000, 60, 1225-1228].
또한, STAT3은 일부 급성 백혈병[Gouilleux-Gruart, V. 등, Leuk.Lymphoma, 1997, 28, 83-88] 및 T 세포 림프종 [Yu,C.L.등, J.Immunol., 1997, 159, 5206-5210]에서 구조적으로 활성화되는 것으로 밝혀졌다. 흥미롭게도, STAT3은 만성 림프성 백혈병에서 세린 잔기 위에 구조적으로 포스포릴화되는 것으로 밝혀졌다 [Frank,D.A. 등, J.Clin.Invest., 1997, 100, 3140-3148]. 또한, STAT3에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 비-소 세포 폐 암 세포 [Song 등, Oncogene 22:4150, 2003] 및 전립선 암 세포 [Mora 등, Cancer Res. 62:6659, 2002]에서 세포고사를 촉진하는 것으로 밝혀졌다.
STAT3은, 다발성 골수종을 가진 환자로부터의 골수 단핵 세포 및 배양액 양쪽 모두에서, 골수종 종양 세포에서 구조적으로 활성인 것으로 밝혀졌다. 이러한 세포는 Fas-매개 세포고사에 내성이고 높은 수준의 Bcl-xL을 발현한다. STAT3 시그날링은 세포고사에 대한 내성을 부여함으로써 골수종 종양 세포의 생존을 위해 필수적인 것으로 밝혀졌다 [Catlett-Falcone,R. 등, Immunity, 1999, 10, 105-115]. 구조적으로 활성화된 STAT3은 만성 골수성 백혈병과 연관된다. 따라서, STAT3은 다발성 골수종 및 활성화된 STAT3 시그날링 경로를 가진 다른 암에서 치료적 중재를 위해 잠재적인 표적이다. 다발성 골수종을 가진 환자의 치료를 위한 선택사항은 완전히 만족스럽지 못하다. 생존율이 아니라 종양 수축을 기준으로 하여, 188명의 평가가능한 환자 주요 시험에 의하여 2003년 5월에 벨캐이드(Velcade)가 승인되었다. 환자의 단지 28％ 만이 부분 반응을 나타내었다. 데이타는 현재 FDA 관찰하에 있다. 화학내성 골수종의 새로운 치료법을 위해 명확한 의료적 요구 가 존재한다.
우성-네가티브 STAT3 변형체를 사용하여 생체내에서 활성화된 STAT3을 억제하기 위하여 선천성 생쥐 종양 모델 체계에서 유전자 요법 접근법이 사용되었다. 활성화된 STAT3 시그날링의 이러한 억제는 B16 흑색종 종양 성장을 억제하고 생체내에서 B16 종양 세포의 세포고사를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 흥미롭게도, 세포고사 세포의 수(95％)는 이입된 세포의 수를 초과하고, 이는 염증 반응(급성 및 만성 염증 세포에 의한 종양 침윤)이 잔류 종양 세포의 사멸에 참여할 수도 있는 항종양 "방관자(bystander) 효과"를 나타낸다 [Niu 등, Cancer Res., 1999, 59, 5059-5063].
STAT3은 류마티스양 관절염을 포함한 염증 질병에서 역할을 할 수도 있다. 활성화된 STAT3은 류마티스양 관절염 환자의 활액 [Sengupta,T.K. 등, J.Exp.Med., 1995, 181, 1015-1025] 및 염증 관절로부터의 세포[Wang,F. 등, J.Exp.Med. 1995, 182, 1825-1831]에서 발견되었다.
대안적인 스플라이싱은 STAT3의 형성을 가져오고, 이는 STAT3의 C-말단에서 발견되는 55개 아미노산 잔기의 부재를 특징으로 한다. 이러한 도메인은 트랜스활성화 도메인을 함유하고, 따라서 STAT3은 STAT3 기능의 네가티브 조절인자로서 작용할 수도 있다. STAT3은 STAT3에 비해 더욱 안정하고 더욱 큰 DNA-결합 활성을 갖는 것으로 밝혀진 반면, STAT3은 전사적으로 더욱 활성이다. STAT3 뿐만 아니라 STAT3은 호모이량체를 형성하고, 2개가 헤테로이량체로서 함께 결합할 수 있다[Caldenhoven,E. 등, J.Biol.Chem. 1996, 271, 13221-13227].
STAT3 발현을 억제하기 위해 몇 가지 접근법이 존재한다. 미국 특허 5,719,042호 및 5,844,082호 (양쪽 모두 Akira,S. 및 Kishimoto,T에게 특허됨)는 염증성 질환, 백혈병 및 암과 같은 IL-6 관련 질환의 치료를 위하여 항체, 안티센스 핵산 및 리보자임을 포함한 APRF의 억제제의 용도를 교시하고 있다. Schreiber,R.D. 등은 미국 특허 5,731,155호; 5,582,999호 및 5,463,023호에서 p91을 결합하는 단쇄 펩티드를 사용한 전사 활성화의 억제 방법을 개시하고 있다. Darnell,J.E. 등은 미국 특허 5,716,622호에서 STATs의 DNA 결합 도메인을 함유하는 펩티드, DNA 결합 도메인을 함유하는 키메라 단백질, 및 STAT 전사 활성화를 억제하기 위한 STAT에 대한 항체를 개시하고 있다.
인간 STAT3의 번역 개시 영역을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 사용이 개시되어 있다[Grandis,J.R. 등, J.Clin.Invest., 1998, 102, 1385-1392]. 이 보고서에서, STAT3의 번역 개시 영역에 상보적인 포스포로티오에이트 올리고데옥시뉴클레오티드가 표피 성장 인자 수용체(EGFR)에 의해 매개되는 TGF-β 자극 세포 성장을 억제하였으며, 이는 STAT3이 EGFR 시그날링 경로의 성분임을 시사한다.
STAT3의 발현 및 이와 관련된 질병 과정을 표적으로 하는 치료 조성물 및 방법에 대하여 충족되지 않은 요구가 여전히 남아있다.
발명의 요약
본 발명은 STAT3을 코드화하는 핵산을 표적으로 하고 STAT3 발현을 조절할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명은 또한 인간 STAT3을 코드화하 는 핵산을 표적으로 하는 키메라 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 세포 및 조직에서 인간 STAT3의 발현을 조절하는 방법을 포함한다.
본 발명은 염증성 질병, 특히 류마티스양 관절염, 및 유방, 전립선, 머리 및 목 및 뇌 암을 포함하는 암, 골수종, 흑색종, 백혈병 및 림프종의 진단 및 치료 방법을 더욱 포함한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드 및 방법은 치료적 및 예방적으로 유용한 것으로 생각된다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드 및 방법은 임상 연구 및 진단 도구로서 뿐만 아니라 다양한 세포 기능 및 생리학적 과정 및 상태에서 STAT3의 역할을 결정하고 STAT3의 발현과 연관된 상태를 진단하는데 유용한 것으로 생각된다.
STAT3은 사이토카인 시그날 전달에서 중요한 역할을 한다. STAT3의 과다발현 및(또는) 구조적 활성화는 다수의 염증성 질환 및 암과 연관된다. 그 자체로, 이러한 DNA-결합 단백질은 이러한 질병을 치료하는 것을 목표로 한다. 특히, 류마티스양 관절염, 유방암, 전립선 암, 뇌 암, 머리 및 목 암, 골수종, 흑색종, 백혈병 및 림프종과 같은 질병의 치료를 위해 STAT3의 발현의 조절이 유용할 수도 있다.
본 발명은 STAT3을 코드화하는 핵산 분자의 기능을 조절하고, 궁극적으로 STAT3의 생성 양을 조절하는데 이용하기 위해 안티센스 화합물, 특히 올리고뉴클레오티드를 사용한다. 이것은 STAT3을 코드화하는 핵산, 바람직하게는 mRNA와 특이적으로 하이브리드형성되는 올리고뉴클레오티드를 제공함으로써 달성된다.
올리고뉴클레오티드와 같은 안티센스 화합물과 이것이 하이브리드형성되는 역 상보적 핵산 표적 간의 관계는 일반적으로 "안티센스"라 일컬어진다. 본 발명의 내용에서, 선택된 핵산 표적에 대해 올리고뉴클레오티드를 "표적화"하는 것은 다단계 과정이다. 이러한 과정은 보통, 기능을 조절해야 하는 핵산 서열을 동정하는 것으로 시작된다. 이것은, 예를들어, 발현이 특정한 질병 상태와 연관되어지는 세포내 유전자(또는 유전자로부터 만들어진 mRNA) 또는 감염 인자로부터의 외래 핵산일 수도 있다. 본 발명에서, 표적은 STAT3을 코드화하는 핵산이고; 다시말해서, STAT3을 코드화하는 유전자, 또는 STAT3 유전자로부터 발현된 mRNA이다. STAT3을 코드화하는 mRNA가 현재 바람직한 표적이다. 표적화 과정은, 유전자 발현의 조절이 얻어지도록, 안티센스 상호작용이 일어나는 핵산 서열 내의 부위 또는 부위들을 결정하는 것을 포함한다.
본 발명에 있어서, 당업자라면, 메신저 RNA가 3문자 유전자 코드를 사용하여 단백질을 코드화하는 정보 뿐만 아니라 5'-비번역 영역, 3'-비번역 영역, 5' 캡 영역 및 인트론/엑손 접합 리보뉴클레오티드로서 당업자에게 알려진 영역을 형성하는 관련된 리보뉴클레오티드를 포함한다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 즉, 본 발명에 따르면, 이러한 관련된 리보뉴클레오티드 뿐만 아니라 정보 리보뉴클레오티드에 전체적 또는 부분적으로 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드를 만들 수 있다. 따라서, 올리고뉴클레오티드는 전사 개시 부위 영역, 번역 개시 코돈 영역, 5' 캡 영역, 인트론/엑손 접합부, 코드화 서열, 번역 종료 코돈 영역 또는 5'- 또는 3'-비번역 영역 내의 서열과 특이적으로 하이브리드형성될 수 있다. 당업자에게 알려진 바와 같이, 번역 개시 코돈은 전형적으로 5'-AUG(전사된 mRNA 분자에서; 상응하는 DNA 분자에서 5'-ATG)이기 때문에, 번역 개시 코돈은 "AUG 코돈", "출발 코돈" 또는 "AUG 출발 코돈"이라 일컬어진다. 소수의 유전자가 RNA 서열 5'-GUG, 5'-UUG 또는 5'-CUG를 가진 번역 개시 코돈을 갖고, 5'-AUA, 5'-ACG 및 5'-CUG가 생체내에서 작용하는 것으로 밝혀졌다. 즉, 각각의 경우에 개시제 아미노산이 전형적으로 메티오닌(진핵세포에서) 또는 포르밀메티오닌(원핵세포에서)이긴 하지만, 용어 "번역 개시 코돈" 및 "출발 코돈"은 다수의 코돈 서열을 포함할 수 있다. 진핵세포 및 원핵세포 유전자가 2 이상의 대안적인 출발 코돈을 가질 수도 있음이 당 기술분야에 알려져 있으며, 이 중 어느 하나가 특정한 세포 유형 또는 조직에서 또는 특정한 일련의 조건하에서 번역 개시를 위해 우선적으로 사용될 수도 있다. 본 발명의 내용에서, "출발 코돈" 및 "번역 개시 코돈"은, 이러한 코돈의 서열(들)에 무관하게, STAT3을 코드화하는 유전자로부터 전사된 mRNA 분자의 번역을 개시하기 위하여 생체내에서 사용되는 코돈 또는 코돈들을 가리킨다. 유전자의 번역 종료 코돈(또는 "정지 코돈")은 3개 서열, 즉 5'-UAA, 5'-UAG 및 5'-UGA (상응하는 DNA 서열은 각각 5'-TAA, 5-'TAG 및 5'-TGA이다) 중의 하나를 가질 수도 있음이 당 기술분야에 알려져 있다. 용어 "출발 코돈 영역", "AUG 영역" 및 "번역 개시 코돈 영역"은 번역 개시 코돈으로부터의 어느 방향(즉, 5' 또는 3')에서 약 25 내지 약 50개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 mRNA 또는 유전자의 일부를 가리킨다. 이러한 영역이 바람직한 표적 영역이다.
유사하게, 용어 "정지 코돈 영역" 및 "번역 종료 코돈 영역"은 번역 종료 코돈으로부터의 어느 방향(즉, 5' 또는 3')에서 약 25 내지 약 50개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 mRNA 또는 유전자의 일부를 가리킨다. 이러한 영역은 바람직한 표적 영역이다. 당 기술분야에서 번역 개시 코돈과 번역 종료 코돈 사이의 영역을 가리키는 것으로 공지된, 개방 판독 프레인(ORF) 또는 "코드화 영역"은 효과적으로 표적화될 수도 있는 영역이다. 다른 바람직한 표적 영역은, 번역 개시 코돈으로부터의 5' 방향에서 mRNA의 일부를 가리키는 것으로 당 기술분야에 공지된 5' 비번역 영역(5' UTR)을 포함하고, 따라서 5' 캡 부위와 mRNA의 번역 개시 코돈 사이의 뉴클레오티드 또는 유전자 위의 상응하는 뉴클레오티드 및 번역 종료 코돈으로부터의 3' 방향에서 mRNA의 일부를 가리키는 것으로 당 기술분야에 공지된 3' 비번역 영역 (3' UTR)을 포함하고, 번역 종료 코돈과 mRNA의 3' 말단 사이의 뉴클레오티드 또는 유전자 위의 상응하는 뉴클레오티드를 포함한다. mRNA의 5' 캡은 5',5'- 트리포스페이트 결합을 통해 mRNA의 5'-최외 잔기에 연결된 N7-메틸화 구아노신 잔기를 포함한다. mRNA의 5' 캡 영역은 5' 캡 구조 자체 뿐만 아니라 캡에 인접한 첫번째 50개 뉴클레오티드를 포함하는 것으로 간주된다. 5' 캡 영역은 또한 바람직한 표적 영역일 수도 있다.
일부 진핵 mRNA 전사체가 직접 번역되기도 하지만, 다수가 "인트론"으로 알려진 하나 이상의 영역을 함유하고 이것은 전구-mRNA 전사체로부터 절단되어 하나 이상의 성숙한 mRNA를 형성한다. 나머지(따라서 번역된) 영역은 "엑손"이라 알려져 있으며 함께 합쳐져서 연속 mRNA 서열을 형성한다. mRNA 스플라이스 부위, 즉 엑손-엑손 또는 인트론-엑손 접합부는 바람직한 표적 영역일 수도 있고, 이상 스플라이싱이 질병에 연루되어진 상황에서 또는 특정한 mRNA 스플라이스 생성물의 과다생성이 질병에 연루되어진 상황에서 특히 유용하다. 재배열 또는 결실에 기인한 이상 융합 접합부가 또한 바람직한 표적이다. 대안적으로 스플라이스된 mRNA에서 특정한 엑손을 표적화하는 것이 또한 바람직할 수도 있다. 또한, 인트론이 효과적일 수 있음을 알아내었으며 따라서 안티센스 화합물을 위한 표적 영역이 예를들어 DNA 또는 전구-mRNA에 표적화된다.
일단 표적 부위 또는 부위들이 동정되면, 바람직한 조절을 제공하기 위하여, 표적에 충분히 상보적인, 다시말해서 충분히 하이브리드형성되고 충분한 특이성을 가진 올리고뉴클레오티드가 선택된다.
본 발명의 명세서에서 "하이브리드형성"은 반대쪽 핵산 가닥 위 또는 핵산 가닥의 2개 영역 위에서 상보적 염기들 간의 수소 결합을 의미하고, 왓슨-크릭 염기 쌍으로 알려진다. 구아닌 및 시토신이 이들 사이에서 3개의 수소 결합을 형성하는 것으로 알려진 상보적 염기의 예이다. 아데닌 및 티민이 이들 사이에서 2개의 수소 결합을 형성하는 상보적 염기의 예이다.
"특이적으로 하이브리드형성가능한" 및 "상보적인"은 DNA 또는 RNA 표적과 올리고뉴클레오티드 간에 안정하고 특이적인 결합이 일어나도록 충분한 정도의 상보성을 나타내기 위해 사용되는 용어이다.
올리고뉴클레오티드는 특이적으로 하이브리드형성가능한 표적 핵산 서열에 100％ 상보적일 필요가 없는 것으로 이해된다. 표적으로의 올리고뉴클레오티드의 결합이 표적 분자의 정상적인 역할을 방해하여 기능 또는 활성의 소실을 일으킬 때 올리고뉴클레오티드는 특이적으로 하이브리드형성될 수 있고, 특이적 결합이 요망되는 조건 하에, 즉 생체내 분석 또는 치료적 처리의 경우에 생리학적 상태 하에서 또는 시험관내 분석의 경우에 분석이 수행되는 조건 하에서 비-표적 서열에 대한 올리고뉴클레오티드의 비-특이적 결합을 피하기 위해 충분한 정도의 상보성이 존재한다.
mRNA와 안티센스 올리고뉴클레오티드와의 하이브리드형성은 mRNA의 하나 이상의 정상적인 기능을 방해한다. 방해되어지는 mRNA의 기능은 예를들어 단백질 번역 부위로의 RNA의 전좌, RNA로부터 단백질의 번역, 하나 이상의 mRMA 종을 생성하는 RNA의 스플라이싱, 및 RNA에 의해 관련될 수도 있는 촉매적 활성과 같은 매우 중요한 기능을 포함한다. RNA로의 특정한 단백질(들)의 결합은 RNA로의 안티센스 올리고뉴클레오티드 하이브리드형성에 의해 방해받을 수도 있다.
바람직한 안티센스 화합물이 하이브리드형성되는 표적 핵산 위의 위치를 이하에서 "표적 분절"이라 일컫는다. 여기에서 사용된 용어 "표적 분절"은, 활성 안티센스 화합물이 표적으로 하는 표적 영역의 적어도 8개-뉴클레오염기 부위로서 정의된다. 어떠한 이론에 의해서도 구속받기를 원하지 않지만, 이러한 표적 분절은 하이브리드형성을 위해 이용할 수 있는 표적 핵산의 일부를 나타내는 것으로 생각된다.
특정한 표적 분절의 특정한 서열이 여기에 기재되어 있긴 하지만, 당업자라면 이들이 본 발명의 범위 내에서 특정한 구현양태를 예증하고 설명하기 위한 것임을 이해할 것이다. 추가의 표적 분절이 당업자에 의해 확인될 수도 있다.
예증된 바람직한 표적 분절 내에서 선택된 적어도 8개의 연속 뉴클레오염기의 연장을 포함하는 8 내지 80개 길이 뉴클레오염기의 표적 분절이 또한 표적을 위해 적절한 것으로 간주된다.
표적 분절은 예증된 표적 분절의 하나의 5'-말단으로부터 적어도 8개 연속 뉴클레오염기를 포함하는 DNA 또는 RNA 서열을 포함할 수 있다 (나머지 뉴클레오염기는 표적 분절의 5'-말단의 바로 상류에서 시작하는 동일한 DNA 또는 RNA의 연속 연장이고 DNA 또는 RNA가 약 8 내지 약 80개 뉴클레오염기를 함유할 때까지 계속된다). 유사하게, 표적 분절은 예증된 바람직한 표적 분절의 하나의 3'-말단으로부터 적어도 8개의 연속 뉴클레오염기를 포함하는 DNA 또는 RNA 서열에 의해 표시된다 (나머지 뉴클레오염기는 표적 분절의 3'-말단의 바로 하류에서 시작하는 동일한 DNA 또는 RNA의 연속 연장이고, DNA 또는 RNA가 약 8개 내지 80개 뉴클레오염기를 함유할 때까지 계속된다). 안티센스 표적 분절은 예증된 바람직한 표적 분절의 내부 서열로부터 적어도 8개의 연속 뉴클레오염기를 포함하는 DNA 또는 RNA 서열에 의해 표시될 수도 있고, 올리고뉴클레오티드가 약 8 내지 약 80개 뉴클레오염기를 함유할 때까지 한쪽 또는 양쪽 방향에서 연장될 수도 있는 것으로 이해된다. 여기에 예증된 표적 분절을 가지고 있는 당업자라면, 과도한 실험 없이도, 추가의 바람직한 표적 분절을 동정할 수 있을 것이다.
일단 하나 이상의 표적 영역, 분절 또는 부위가 동정되면, 바람직한 효과를 제공하기 위하여, 표적에 충분히 상보성인, 다시말해서 충분히 하이브리드형성되고 충분한 특이성을 가진 안티센스 화합물이 선택된다.
올리고머 안티센스 화합물은 표적 뉴클레오염기 서열, 예컨대 여기에 개시된 서열의 영역을 표적으로 할 수 있다. 영역이 8개 이상 80개 이하의 뉴클레오염기인, 올리고머 안티센스 화합물이 표적으로 하는 뉴클레오염기 서열의 모든 영역은 다음과 같이 설명된다:
R(n, n+m-1)은 표적 뉴클레오염기 서열로부터의 영역이고, 여기에서 "n"은 영역의 5'-최외 뉴클레오염기 위치이고, 여기에서 "n+m-1"은 영역의 3'-최외 뉴클레오염기 위치이고, "m"은 영역의 길이이다. 길이 "m"의 영역의 "S(m)"는 n이 1 내지 L-m+1의 범위이고, L이 표적 뉴클레오염기 서열의 길이이고 L>m인 영역으로서 정의된다. 모든 영역의 "A"는 m이 8 이상이고 80이하인 각각의 길이에 대해 일련의 영역의 집합으로서 해석될 수 있다.
이러한 영역의 집합은 하기 수학적 표시를 사용하여 표현될 수 있다:
Figure 112006056137226-PCT00001
상기 식에서, 수학적 연산부호 ｜는 "여기에서(such that)"을 나타내고,
수학식 연산부호 ∈ 는 "집합의 구성요소"를 나타내고 (예를들어 y ∈ Z는 요소 y가 집합 Z의 구성요소임을 나타낸다),
x는 변수이고,
N은 양의 정수로서 정의되는 모든 자연수를 나타내고,
수학적 연산부호
Figure 112006056137226-PCT00002
는 "합집합"을 나타낸다.
예를들어, m이 8, 20 및 80인 영역의 집합은 다음과 같은 방식으로 구성될 수 있다. 100개 뉴클레오염기 길이의 표적 뉴클레오염기 서열(L=100)에서 표적 뉴클레오염기 서열의 위치 1(n=1)에서 시작하여 각각 8개 뉴클레오염기 길이의 영역의 집합(m=8)은 하기 표현:
Figure 112006056137226-PCT00003
을 사용하여 형성될 수 있으며, 이는 뉴클레오염기 1-8, 2-9, 3-10, 4-11, 5-12, 6-13, 7-14, 8-15, 9-16, 10-17, 11-18, 12-19, 13-20, 14-21, 15-22, 16-23, 17-24, 18-25, 19-26, 20-27, 21-28, 22-29, 23-30, 24-31, 25-32, 26-33, 27-34, 28-35, 29-36, 30-37, 31-38, 32-39, 33-40, 34-41, 35-42, 36-43, 37-44, 38-45, 39-46, 40-47, 41-48, 42-49, 43-50, 44-51, 45-52, 46-53, 47-54, 48-55, 49-56, 50-57, 51-58, 52-59, 53-60, 54-61, 55-62, 56-63, 57-64, 58-65, 59-66, 60-67, 61-68, 62-69, 63-70, 64-71, 65-72, 66-73, 67-74, 68-75, 69-76, 70-77, 71-78, 72-79, 73-80, 74-81, 75-82, 76-83, 77-84, 78-85, 79-86, 80-87, 81-88, 82-89, 83-90, 84-91, 85-92, 86-93, 87-94, 88-95, 89-96, 90-97, 91-98, 92-99, 93-100을 포함하는 영역의 집합을 설명한다.
100개 뉴클레오염기 길이의 표적 서열에서 표적 뉴클레오염기 서열의 위치 1에서 시작하여 20개 뉴클레오염기 길이의 영역에 대한 추가의 집합은 하기 표현:
Figure 112006056137226-PCT00004
을 사용하여 설명될 수 있으며, 이는 뉴클레오염기 1-20, 2-21, 3-22, 4-23, 5-24, 6-25, 7-26, 8-27, 9-28, 10-29, 11-30, 12-31, 13-32, 14-33, 15-34, 16-35, 17-36, 18-37, 19-38, 20-39, 21-40, 22-41, 23-42, 24-43, 25-44, 26-45, 27-46, 28-47, 29-48, 30-49, 31-50, 32-51, 33-52, 34-53, 35-54, 36-55, 37-56, 38-57, 39-58, 40-59, 41-60, 42-61, 43-62, 44-63, 45-64, 46-65, 47-66, 48-67, 49-68, 50-69, 51-70, 52-71, 53-72, 54-73, 55-74, 56-75, 57-76, 58-77, 59-78, 60-79, 61-80, 62-81, 63-82, 64-83, 65-84, 66-85, 67-86, 68-87, 69-88, 70-89, 71-90, 72-91, 73-92, 74-93, 75-94, 76-95, 77-96, 78-97, 79-98, 80-99, 81-100을 포함하는 영역의 집합을 설명한다.
100개 뉴클레오염기 길이의 표적 서열에서 표적 뉴클레오염기 서열의 위치 1에서 시작하여 80개 뉴클레오염기 길이의 영역에 대한 추가의 집합은 하기 표현:
Figure 112006056137226-PCT00005
을 사용하여 설명될 수 있으며, 이는 뉴클레오염기 1-80, 2-81, 3-82, 4-83, 5-84, 6-85, 7-86, 8-87, 9-88, 10-89, 11-90, 12-91, 13-92, 14-93, 15-94, 16-95, 17-96, 18-97, 19-98, 20-99, 21-100을 포함하는 영역의 집합을 설명한다.
따라서, 이러한 예에서, A는 영역 1-8, 2-9, 3-10 … 93-100, 1-20, 2-21, 3-22 … 81-100, 1-80, 2-81, 3-82, … 21-100을 포함할 것이다.
상기 언급된 예의 합집합 및 10-19 및 21-79 길이에 대한 다른 집합은 하기 수학적 표현을 사용하여 설명될 수 있다.
Figure 112006056137226-PCT00006
상기 식에서
Figure 112006056137226-PCT00007
는 모든 집합의 모든 구성요소를 조합함으로써 수득되는 합집합을 나타낸다.
여기에 설명된 수학적 표현은 길이 L의 표적 뉴클레오염기 서열에서 모든 가능한 표적 영역을 한정하고, 여기에서 영역은 길이 m이고, m은 8 이상 80 이하의 뉴클레오염기이고, m은 L 미만이고, n은 L-m+1 미만이다.
mRNA 기능을 방해하는 전체 효과는 STAT3의 발현 조절이다. 본 발명의 내용에서 "조절"은 억제 또는 자극을 의미하고; 다시말해서 발현을 감소시키거나 증가시킨다. 이러한 조절은 당 기술분야에서 일상적인 방식으로, 예를들어 mRNA 발현의 노던 블롯 분석에 의해, 또는 본 출원의 실시예에 교시된 바와 같이 역 트랜스크립타제 PCR에 의해, 또는 단백질 발현의 웨스턴 블롯 또는 ELISA 분석에 의해, 또는 단백질 발현의 면역침전 분석에 의해 측정될 수 있다. 세포 증식 또는 종양 세포 성장에 미치는 효과는 본 출원의 실시예에 교시된 바와 같이 측정될 수 있다. 현재, 억제가 바람직하다.
올리고뉴클레오티드의 공지된 안티센스 효과에 추가로, 적어도 하나의 포스포로티오에이트 결합을 가진 올리고뉴클레오티드 유사체가 국소적인 면역 반응의 자극을 유도할 수 있음을 알아내었다. 이것은 미국 특허 5,663,153호 (여기에서 그 전체 내용이 참고문헌으로 인용됨)에 기재되어 있다. 이러한 면역자극 효과는 올리고뉴클레오티드 유사체가 가질 수 있거나 갖지 않을 수 있는 안티센스 효과에 관련되는 것으로 보이지 않는다. 이러한 올리고뉴클레오티드 유사체는 단독으로 또는 다른 치료적 양식, 예컨대 약물, 특히 항감염 및 항암 약물, 및 효능을 증가시키기 위한 수술 절차와 조합하여 면역증강제로서 유용하다. 또한, 특정한 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의해 이미 소유되어진 항감염 및 항암 효과는 이러한 면역 자극을 통해 증가된다.
또한, 전신 또는 체액 면역 반응의 자극을 유도하기 위하여, 적어도 하나의 포스포로티오에이트 결합을 가진 올리고뉴클레오티드 유사체가 사용될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 즉, 이러한 올리고뉴클레오티드는 단독으로 또는 기타 치료 양식과 조합하여 항체 반응의 면역증강제로서 유용하다. 이것은 미국 특허 5,663,153호에 기재되어 있다.
따라서, STAT3을 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드의 안티센스 효과에 추가로, STAT3 시그날링의 우성 네가티브 억제제로 이미 관찰된 항종양 "방관자 효과"에 추가될 수도 있는 면역 반응을 유도해 내는 데 있어서, 적어도 하나의 포스포로티오에이트 주쇄 결합을 함유하는 올리고뉴클레오티드가 유용할 수도 있는 것으로 현재 생각되고 있다 [Niu 등, Cancer Res. 1999, 59, 5059-5063]. 이러한 효과는 잔류 종양 세포의 사멸에 참여할 수도 있는 급성 및 만성 염증성 세포에 의한 종양 침윤에 관련되는 것으로 생각된다. 즉, STAT3을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 치료 효과는 올리고뉴클레오티드 자체의 면역자극 성질에 의해 증가될 수도 있다. 대안적으로, STAT3을 표적으로 하지 않지만 적어도 하나의 포스포로티오에이트 주쇄 결합을 함유하는 올리고뉴클레오티드가 STAT3의 안티센스 또는 기타 억제제와 함께 아주반트로서 사용될 수도 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 진단, 치료, 예방 및 연구 시약 및 키트에서 사용될 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 STAT3을 코드화하는 핵산에 하이브리드형성되기 때문에, 이러한 사실을 이용하기 위하여 샌드위치, 비색 및 기타 분석이 쉽게 구성될 수 있다. STAT3 유전자 또는 mRNA와 올리고뉴클레오티드의 하이브리드형성을 검출하기 위한 수단이 통상적으로 제공될 수 있다. 이러한 제공은 효소 접합, 방사능표지화 또는 기타 적절한 검출 체계를 포함할 수도 있다. STAT3의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 키트가 또한 제조될 수도 있다.
본 발명은 류마티스양 관절염과 같은 염증성 질병 또는 유방암, 뇌암, 또는 머리 및 목 암, 흑색종, 골수종, 백혈병 및 림프종과 같은 암을 가진 것으로 의심되는 환자로부터의 조직 또는 기타 샘플에서 비정상적인 염증 상태 또는 특정한 암을 진단하기 위해 적절하다. 본 발명에서 사용하는 다수의 분석법이 공식화되었으며, 이러한 분석은 일반적으로 억제의 검출 및 정량화를 가능하게 하도록 선택된 조건하에서 조직 샘플을 본 발명의 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 것을 포함한다. 본 발명의 내용에서, 조직 또는 세포를 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드들과 "접촉시킨다"는 것은, 올리고뉴클레오티드(들)을 보통 시험관내 또는 생체외에서 액체 담체 중에서 세포 현탁액 또는 조직 샘플에 첨가하거나 동물 내의 세포 또는 조직에 올리고뉴클레오티드(들)를 투여하는 것을 의미한다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 연구 목적을 위해 사용될 수도 있다. 따라서, 올리고뉴클레오티드에 의해 나타나는 특이적 하이브리드형성이 분석, 정제, 세포 생성물 제조 및 당업자에 의해 인식될 수도 있는 다른 방법에서 사용될 수도 있다.
본 발명의 내용에서, 용어 "올리고뉴클레오티드"는 리보핵산 또는 데옥시리보핵산의 올리고머 또는 중합체를 가리킨다. 이 용어는 자연 발생 뉴클레오염기, 당 및 공유 내부당(주쇄) 결합 뿐만 아니라 유사하게 작용하는 비-자연 발생 부분을 가진 올리고뉴클레오티드로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 변형 또는 치환된 올리고뉴클레오티드는, 예를들어 세포 흡수율 증가, 표적으로의 결합 증가 및 뉴클레아제의 존재하에서 안정성 증가와 같은 바람직한 성질 때문에, 천연 형태에 비해 종종 바람직하다.
본 발명에 따른 안티센스 화합물은 바람직하게는 약 8 내지 약 80개 뉴클레오염기(즉, 약 8 내지 약 80개 결합된 뉴클레오시드)를 포함한다. 당업자라면, 본 발명이 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80개 뉴클레오염기 길이의 화합물을 포함한다는 것을 이해할 것이다.
하나의 구현양태에서, 본 발명의 안티센스 화합물은 12 내지 50개 뉴클레오염기 길이이다. 당업자라면 본 발명이 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개 뉴클레오염기 길이의 화합물을 포함한다는 것을 이해할 것이다.
하나의 구현양태에서, 본 발명의 안티센스 화합물은 13 내지 40개 뉴클레오염기 길이이다. 당업자라면, 본 발명이 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개 뉴클레오염기 길이의 화합물을 포함한다는 것을 이해할 것이다.
다른 구현양태에서, 본 발명의 안티센스 화합물은 15 내지 30개 뉴클레오시드 길이이다. 당업자라면, 본 발명이 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 뉴클레오염기 길이의 화합물을 포함한다는 것을 이해할 것이다.
하나의 구현양태에서, 본 발명의 안티센스 화합물은 19 내지 25개 뉴클레오염기 길이이다. 당업자라면, 본 발명이 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 뉴클레오염기 길이의 화합물을 포함함을 이해할 것이다.
다른 구현양태에서, 본 발명의 안티센스 화합물은 19 내지 21 뉴클레오염기 길이이다. 당업자라면, 본 발명이 19, 20 또는 21개 뉴클레오염기 길이의 화합물을 포함함을 이해할 것이다.
여기에서 사용된 용어 "올리고머 화합물"은 핵산 기재 단량체 소단위를 실질적으로 포함하는 중합체 화합물로서 정의된다. 올리고머 화합물은 올리고뉴클레오티드 및 그의 유사체, 모의체 또는 모방체를 포함한다.
안티센스 화합물의 바람직한 형태는 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드인 반면, 많은 종에서 이중-가닥 구조, 예컨대 이중-가닥 RNA(dsRNA) 분자가 도입되면, 유전자 또는 그의 관련 유전자 생성물 기능의 강력하고 특이적인 안티센스-매개 감소가 유도되는 것으로 밝혀졌다. 식물 및 동물 양쪽 모두에서 이러한 현상이 일어나고, 바이러스 방어 및 트랜스포손 잠재화로의 진화 관계를 갖는 것으로 생각된다.
dsRNA가 동물에서 유전자 잠재화를 유도할 수 있다는 첫번째 증거는 선충류, 캐노르해브디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans)에서의 작업으로부터 1995년에 얻어졌다 [Guo 및 Kempheus, Cell, 1995, 81, 611-620]. 몽고메리(Montgomery) 등은, dsRNA의 주요 간섭 효과가 후전사임을 밝혀내었다 [Montgomery 등, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1998, 95, 15502-15507]. 이중-가닥 RNA(dsRNA)로의 노출로부터 얻어진 캐노르해브디티스 엘레간스에서 정의된 후전사 안티센스 메카니즘은 RNA 간섭(RNAi)이라 명명된다. 이러한 용어는, 내인성 표적화 mRNA 수준의 서열-특이적 감소를 유도하는 dsRNA의 도입과 연관된 안티센스-매개 유전자 잠재화를 의미하는 것으로 보편화된다 [Fire 등, Nature, 1998, 391, 806-811]. 최근들어, 이것이 RNAi의 강력한 유도인자인 dsRNA의 안티센스 극성의 단일-가닥 RNA 올리고머이라는 것이 밝혀졌다 [Tijsterman 등, Science, 2002, 295, 694-697]. STAT3 mRNA의 발현을 억제하고 표적화하기 위해 이중-가닥 RNA 분자 (짧은 간섭 RNA 또는 siRNA)를 사용하는 것이 또한 의도된다. 이러한 이중 가닥 RNA 분자는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의해 표적화되는 것과 유사한 영역을 표적으로 하고 유사한 효과를 갖는다. 이러한 이중 가닥 RNA 분자는 일반적으로 19-21 염기 쌍 길이이지만, 8 내지 50개 뉴클레오염기의 범위일 수도 있다. siRNA 분자의 생성은 이하 제공된 실시예에서 일반적인 의미로 설명되지만, STAT3을 표적으로 하는 바람직한 siRNA가 통상적인 올리고뉴클레오티드 합성 기술에 의해 합성될 수도 있는 것으로 이해된다. 안티센스 가닥의 서열이 일단 알려지면, 상보성인 센스 가닥이 합성된다. 이어서, 센스 및 안티센스 가닥을 조합하여 siRNA를 형성한다.
올리고머 및 단량체 변형
당 기술분야에 공지된 바와 같이, 뉴클레오시드는 염기-당 조합이다. 뉴클레오시드의 염기 부분은 일반적으로 헤테로고리 염기이다. 이러한 헤테로고리 염기의 2개의 가장 일반적인 부류는 퓨린 및 피리미딘이다. 뉴클레오티드는 뉴클레오시드의 당 부분에 공유 결합된 포스페이트 기를 더욱 포함하는 뉴클레오시드이다. 펜토푸라노실 당을 포함하는 뉴클레오시드에 대하여, 포스페이트 기는 당의 2', 3' 또는 5' 히드록실 잔기에 연결될 수 있다. 올리고뉴클레오티드를 형성함에 있어서, 포스페이트 기가 인접한 뉴클레오시드를 서로에 공유 결합시켜 선형 중합체 화합물을 형성한다. 또한, 이러한 선형 중합체 화합물의 각각의 말단이 더욱 연결되어 원형 화합물을 형성할 수 있지만, 선형 화합물이 일반적으로 바람직하다. 또한, 선형 화합물은 내부 뉴클레오염기 상보성을 가질 수도 있고, 따라서 완전히 또는 부분적으로 이중-가닥 화합물을 생성하는 방식으로 접혀질 수 있다. 올리고뉴클레오티드 내에서, 포스페이트 기가 일반적으로 뉴클레오시드간 결합을 형성하거나, 당 고리와 함께 올리고뉴클레오티드의 주쇄를 형성하는 것으로 일컬어진다. RNA 및 DNA의 주쇄를 형성하는 일반적인 뉴클레오시드간 결합은 3'-5' 포스포디에스테르 결합이다.
변형된 뉴클레오시드간 결합
본 발명에서 유용한 바람직한 안티센스 올리고머 화합물의 특정한 예는 변형된, 예를들어 비-천연 발생 뉴클레오시드간 결합을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 본 명세서에 정의된 바와 같이, 변형된 뉴클레오시드간 결합을 가진 올리고뉴클레오티드는 인 원자를 보유하는 뉴클레오시드간 결합 및 인 원자를 갖지 않는 뉴클레오시드간 결합을 포함한다. 본 명세서의 목적을 위하여, 당 기술분야에 때때로 언급되는 것과 같이, 뉴클레오시드간 주쇄에 인 원자를 갖지 않는 변형된 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오시드인 것으로 간주될 수 있다.
씨.엘레간스 체계에서, 뉴크레오티드간 결합(포스포로티오에이트)의 변형은 RNAi 활성을 상당히 방해하지 않았다. 이러한 관찰을 근거로 하여, 본 발명의 특정한 바람직한 올리고머 화합물은 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드간 결합을 가질 수 있는 것으로 제안된다. 바람직한 인 함유 변형 뉴클레오시드간 결합은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합이다.
그 안에 인 원자를 함유하는 바람직한 변형 올리고뉴클레오티드 주쇄는, 예를들어 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로-디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 3'-알킬렌 포스포네이트, 5'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 메틸 및 기타 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트를 포함하는 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 셀레노포스페이트 및 정상 3'-5' 결합, 2'-5' 결합 유사체를 가진 보라노-포스페이트, 및 하나 이상의 인터뉴클레오티스 결합이 3'-3', 5'-5' 또는 2'-2' 결합인 역 극성을 가진 것을 포함한다. 역 극성을 가진 바람직한 올리고뉴클레오티드는 3'-최외 뉴크레오티드간 결합에서 하나의 3'-3' 결합, 즉 비염기성일 수도 있는 하나의 역 뉴클레오시드 잔기를 포함한다 (뉴클레오염기는 빠지거나 또는 그 대신에 히드록실 기를 갖는다). 다양한 염, 혼합된 염 및 자유 산 형태가 또한 포함된다.
상기 인-함유 결합의 제조를 교시하고 있는 바람직한 미국 특허는 이에 한정되지 않지만 US 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; 5,194,599; 5,565,555; 5,527,899; 5,721,218; 5,672,697 및 5,625,050호 (이들의 각각은 여기에서 참고문헌으로 인용된다)를 포함한다.
본 발명의 더욱 바람직한 구현양태에서, 올리고머 화합물은 하나 이상의 포스포로티오에이트 및(또는) 헤테로원자 뉴클레오시드간 결합, 특히 -CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2- [메틸렌 (메틸이미노) 또는 MMI 주쇄로서 공지됨], -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2- 및 -O-N(CH3)-CH2-CH2- (식중, 천연 포스포디에스테르 뉴크레오티드간 결합은 -O-P(=O)(OH)-O-CH2-로서 표시됨)을 갖는다. MMI 유형 뉴클레오시드간 결합은 상기 언급된 미국 특허 5,489,677호에 개시되어 있다. 바람직한 아미드 뉴클레오시드간 결합은 상기 언급된 미국 특허 5,602,240호에 개시되어 있다.
그 안에 인 원자를 포함하지 않는 바람직한 변형 올리고뉴클레오티드 주쇄는 단쇄 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 결합, 혼합된 헤테로원자 및 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 결합, 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로고리 뉴클레오시드간 결합에 의해 형성되는 주쇄를 갖는다. 이들은 모르폴리노 결합을 가진 것(뉴클레오시드의 당 부위로부터 부분적으로 형성됨); 실록산 주쇄; 설파이드, 술폭시드 및 술폰 주쇄; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 주쇄; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 주쇄; 리보아세틸 주쇄; 알켄 함유 주쇄; 술파메이트 주쇄; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 주쇄; 술포네이트 및 술폰아미드 주쇄; 아미드 주쇄; 및 혼합된 N, O, S 및 CH2 성분 부분을 가진 기타 주쇄를 포함한다.
상기 올리고뉴클레오티드의 제조를 교시하고 있는 대표적인 미국 특허는 이에 한정되지 않지만 U.S. 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; 5,792,608; 5,646,269; 및 5,677,439호 (이들은 각각 참고문헌으로 인용된다)를 포함한다.
올리고뉴클레오티드 모방체
본 발명의 화합물의 군은 올리고뉴클레오티드 모방체를 포함한다. 용어 모방체는 올리고뉴클레오티드에 적용될 때, 단지 푸라노스 고리 또는 푸라노스 고리와 뉴크레오티드간 결합 양쪽 모두가 새로운 기로 대체되어진 올리고머 화합물을 포함하는 것으로 해석되고, 단지 푸라노스 고리의 치환은 당 기술분야에서 당 대용으로 일컬어진다. 적절한 표적 핵산과의 하이브리드형성을 위하여 헤테로고리 염기 잔기 또는 변형된 헤테로고리 염기 잔기가 유지된다. 한가지 올리고머 화합물, 즉 뛰어난 하이브리드형성 성질을 갖는 것으로 밝혀진 올리고뉴클레오티드 모방체는 펩티드 핵산이라 일컬어진다(PNA). PNA 올리고머 화합물에서, 올리고뉴클레오티드의 당-주쇄를 아미드 함유 주쇄, 특히 아미노에틸글리신 주쇄로 대체한다. 뉴클레오염기가 유지되고, 주쇄의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 직접적으로 또는 간접적으로 결합된다. PNA 올리고머 화합물의 제조를 교시하고 있는 대표적인 미국 특허는 이에 한정되지 않지만 5,539,082호; 5,714,331호; 및 5,719,262호 (이들은 각각 참고문헌으로 인용된다)를 포함한다. PNA 올리고머 화합물의 추가의 교시내용은 문헌[Nielsen 등, Science, 1991 254, 1497-1500]에서 찾아볼 수 있다.
뛰어난 하이브리드형성 성질을 갖는 것으로 기록된 한가지 올리고뉴클레오티드 모방체는 펩티드 핵산(PNA)이다. PNA 화합물에서의 주쇄는, PNA에 아미드 함유 주쇄를 제공하는 2 이상의 결합된 아미노에틸글리신 단위이다. 헤테로고리 염기 잔기가 주쇄의 아미드 부위의 아자 질소 원자에 직접적으로 또는 간접적으로 결합된다. PNA 화합물의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 이에 한정되지 않지만 미국 특허 5,539,082; 5,714,331; 및 5,719,262호 (이들은 각각 참고문헌으로 인용된다)를 포함한다. PNA 화합물의 추가의 교시내용은 문헌[Nielsen 등, Science, 1991, 254, 1497-1500]에서 찾아볼 수 있다.
PNA는 기본 PNA 구조가 처음으로 제조되었기 때문에 다수의 변형을 포함하도록 변형되어진다. 기본 구조를 이하에 나타낸다:
Figure 112006056137226-PCT00008
상기 식에서,
Bx는 헤테로고리 염기 잔기이고;
T4는 수소, 아미노 보호기, -C(O)R5, 치환 또는 비치환 C1-C10 알킬, 치환 또는 비치환 C2-C10 알케닐, 치환 또는 비치환 C2-C10 알키닐, 알킬술포닐, 아릴술포닐, 화학 작용기, 리포터 기, 접합 기, 아미노산이 아스파르트산 또는 글루탐산일 때 α-카르복실기 또는 임의로 ω-카르복실기를 통해 연결된 D 또는 L α-아미노산, 또는 카르복실기를 통해 D, L 또는 혼합된 D 및 L 아미노산으로부터 유래된 펩티드이고, 여기에서 치환기들은 히드록실, 아미노, 알콕시, 카르복시, 벤질, 페닐, 니트로, 티올, 티오알콕시, 할로겐, 알킬, 아릴, 알케닐 및 알키닐로부터 선택되며;
T5는 -OH, -N(Z1)Z2, R5, 아미노산이 리신 또는 오르니틴일 때 α-아미노기 또는 임의로 ω-아미노기를 통해 연결된 D 또는 L α-아미노산, 또는 아미노기를 통해 D, L 또는 혼합된 D 및 L 아미노산으로부터 유래된 펩티드, 화학적 작용기, 리포터기 또는 접합 기이고;
Z1은 수소, C1-C6 알킬, 또는 아미노 보호기이고;
Z2은 수소, C1-C6 알킬, 아미노 보호기, -C(=O)-(CH2)n-J-Z3, 아미노산이 아스파르트산 또는 글루탐산일 때 α-카르복실기 또는 임의로 ω-카르복실기를 통해 연결된 D 또는 L α-아미노산, 또는 카르복실기를 통해 연결된 D, L 또는 혼합된 D 및 L 아미노산으로부터 유래된 펩티드이고;
Z3은 수소, 아미노 보호기, -C1-C6 알킬, -C(=O)-CH3, 벤질, 벤조일 또는 -(CH2)n-N(H)Z1이고;
각각의 J은 O, S 또는 NH이고;
R5은 카르보닐 보호기이고;
n은 2 내지 약 50이다.
연구되어진 다른 부류의 올리고뉴클레오티드 모의체는 모르폴리노 고리에 부착된 헤테로고리 염기를 가진 연결된 모르폴리노 단위(모르폴리노 핵산)를 기초로 한다. 모르폴리노 핵산에서 모르폴리노 단량체 단위를 연결하는 다수의 결합 기가 보고되어 있다. 비-이온성 올리고머 화합물을 제공하기 위하여 바람직한 부류의 연결 기가 선택되었다. 비-이온성 모르폴리노-기초 올리고머 화합물은 세포 단백질과의 바람직하지 못한 상호작용을 가질 가능성이 적다. 모르폴리노-기초 올리고머 화합물은 올리고뉴클레오티드의 비-이온성 모방체이고, 이는 세포 단백질과의 바람직하지 못한 상호작용을 형성할 가능성이 적다 [Dwaine A. Braasch 및 David R.Corey, Biochemistry, 2002, 41(14), 4503-4510]. 모르폴리노-기초 올리고머 화합물이 미국 특허 5,034,506호 (1991년 7월 23일 발행)에 개시되어 있다. 단량체 소단위를 연결하는 각종 상이한 연결 기를 가진 올리고머 화합물의 모르폴리노 부류가 제조되었다.
단량체 소단위를 연결하는 각종 상이한 연결 기(L2)를 가진 모르폴리노 핵산이 제조되었다. 기본 화학식은 다음과 같다:
Figure 112006056137226-PCT00009
상기 식에서,
T1는 히드록실 또는 보호된 히드록실이고;
T5는 수소 또는 포스페이트 또는 포스페이트 유도체이고;
L2은 연결 기이고;
n은 2 내지 약 50이다.
다른 부류의 올리고뉴클레오티드 모방체는 시클로헥세닐 핵산(CeNA)이라 일컬어진다. DNA/RNA 분자에 보통 존재하는 푸라노스 고리를 시클로헤닐 고리로 대체한다. CeNA DMT 보호된 포스포르아미디트 단량체가 제조되었으며, 전통적인 포스포르아미디트 화학에 따라 올리고머 화합물 합성을 위해 사용된다. 완전히 변형된 CeNA 올리고머 화합물 및 CeNA로 변형된 특정한 위치를 가진 올리고뉴클레오티드가 제조되고 연구되었다 [Wang 등, J.Am.Chem.Soc., 2000, 122, 8595-8602]. 일반적으로, DNA 사슬 내에 CeNA 단량체를 혼입하는 것은 DNA/RNA 하이브리드의 안정성을 증가시킨다. CeNA 올리고아데닐레이트는 천연 착물에 대해 유사한 안정성을 가지고 RNA 및 DNA 보체와 착물을 형성하였다. 천연 핵산 구조 내에 CeNA 구조를 혼입하는 연구는, 용이한 형태적 정합과 함께 진행되는 NMR 및 원형 이색성에 의해 밝혀졌다. 또한, 서열 표적화 RNA 내에 CeNA를 혼입하는 것은 혈청에 안정하고, 이.콜리 RN아제를 활성화시킬 수 있으며 그 결과 표적 RNA 가닥을 절단시킨다.
CeNA의 일반적인 화학식을 하기에 나타낸다:
Figure 112006056137226-PCT00010
상기 식에서,
각각의 Bx는 헤테로고리 염기 잔기이고;
T1은 히드록실 또는 보호된 히드록실이고;
T2는 히드록실 또는 보호된 히드록실이다.
하나 이상의 안히드로헥시톨 뉴클레오시드로부터 다른 부류의 올리고뉴클레오티드 모방체 (안히드로헥시톨 핵산)가 제조될 수 있으며 [Wouters and Herdewijn, Bioorg.Med.Chem.Lett. 1999, 9, 1563-1566], 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112006056137226-PCT00011
추가의 바람직한 변형은, 2'-히드록실 기가 당 고리의 4' 탄소 원자에 연결되어 2'-C, 4'-C 옥시메틸렌 결합을 형성하고 이에 의해 이고리형 당 잔기를 형성하는 고정된(Locked) 핵산(LNAs)을 포함한다. 결합은 바람직하게는 2' 산소 원자 및 4' 탄소 원자에 다리걸친 메틸렌(-CH2-)n기이고, 여기에서 n은 1 또는 2이다 [Singh 등, Chem.Commun., 1998, 4, 455-456]. LNA 및 LNA 유사체는 상보적인 DNA 및 RNA와 매우 높은 중복 열 안정성(Tm= +3 내지 +10℃) , 3'-엑소뉴클레오리틱 분해에 대한 안정성, 및 양호한 가용성 성질을 나타낸다. 이고리형 고리 체계를 나타내는 LNA의 기본 구조를 하기에 나타낸다.
Figure 112006056137226-PCT00012
2D NMR 분광법에 의해 결정된 LNA의 형태는, LNA 뉴클레오티드의 고정된 배향이, 단일-가닥 LNA 및 이중 가닥 LNA 양쪽 모두에서, 더욱 높은 수의 N-유형 형태를 도입하는 방식으로 포스페이트 주쇄를 구속한다는 것을 밝혀내었다 [Petersen 등, J.Mol.Recognit., 2000, 13, 44-53]. 이러한 형태는 뉴클레오염기의 개선된 적중(stacking)과 관련된다.
LNA는 과다하게 안정한 LNA:LNA 이중가닥을 형성하는 것으로 밝혀졌다 [Koshkin 등, J.Am.Chem.Soc., 1998, 120, 13252-13253]. LNA:LNA 하이브리드형성은 가장 열적으로 안정한 핵산 유형 이중가닥 체계인 것으로 밝혀졌고, LNA의 RNA-모방 특징이 이중가닥 수준에서 확립되었다. 3개 LNA 단량체(T 또는 A)의 도입은 DNA 보체 쪽으로 융점을 상당히 증가시켰다 (Tm = +15/+11). LNA-매개 하이브리드형성의 보편성은 과다하게 안정한 LNA:LNA 이중가닥의 형성에 의해 강조되었다. LNA의 RNA-모방은 단량체의 N-유형 형태 제한 및 LNA:RNA 이중가닥의 이차 구조를 고려하여 반영되었다.
LNA는 높은 열 친화력으로 상보적 DNA, RNA 또는 LNA와 이중가닥을 형성한다. 원형 이색(CD) 스펙트럼은, 완전 변형된 LNA를 포함하는 이중가닥(특히 LNA:RNA)이 A-형태 RNA:RNA 이중가닥과 구조적으로 유사하다는 것을 나타낸다. LNA:DNA 이중가닥의 핵자기 공명(NMR) 조사는, LNA 단량체의 3'-엔도 형태를 입증하였다. LNA에 의한 가닥 침습을 시사하는 이중가닥 DNA의 인식이 증명되었다. 불일치 서열의 연구는, 상응하는 비변형 대조군 가닥에 비해 일반적으로 개선된 선택성으로 LNA가 왓슨-크릭 염기쌍 법칙을 지배함을 보여준다.
넓은 범위의 진단 및 치료 용도에서 LNA-올리고머 화합물 뿐만 아니라 LNA의 새로운 유형이 유용하다. 이 중에서 안티센스 용도, PCR 용도, 가닥-변위 올리고머, 핵산 폴리머라제를 위한 기질 및 뉴클레오티드 기재 약물이 존재한다. LNA를 함유하는 강력하고 비독성의 안티센스 올리고뉴클레오티드가 기재되어 있다 [Wahlestedt 등, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 2000, 97, 5633-5638]. 저자는, LNA가 안티센스 인자에 몇몇 바람직한 성질을 부여하는 것을 증명하였다. LNA/DNA 공중합체는 혈액 혈청 및 세포 추출물에서 쉽게 분해되지 않았다. LNA/DNA 공중합체는, 살아있는 쥐의 뇌에서 G-단백질-결합된 수용체 시그날링 및 에스케리키아 콜리에서 리포터 유전자의 검출과는 상이하게, 분석 체계에서 강력한 안티센스 활성을 나타내었다. 또한, 살아있는 인간 유방 암 세포 내로 LNA의 리포펙틴TM-매개 전달을 효율적으로 달성하였다.
이들의 올리고머화와 함께 LNA 단량체 아데닌, 시토신, 구아닌, 5-메틸-시토신, 티민 및 우라실의 합성 및 제조와 핵산 인식 성질이 기재되어 있다 [Koshkin 등, Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630]. LNA 및 그의 제조가 또한 WO 98/39352 및 WO 99/14226호에 기재되어 있다.
LNA의 첫번째 유사체, 포스포로티오에이트-LNA 및 2'-티오-LNA가 또한 제조되었다 [Kumar 등, Bioorg.Med.Chem.Lett. 1998, 8, 2219-2222]. 핵산 폴리머라제를 위한 기질로서, 올리고데옥시리보뉴클레오티드 이중가닥을 함유하는 고정 뉴클레오시드 유사체의 제조가 또한 기재되어 있다 [Wengel 등, PCT 국제출원 WO98-DK93 19980914]. 또한, 신규의 형태적으로 제한된 고-친화성 올리고뉴클레오티드 유사체인 2'-아미노-LNA의 합성 및 그의 취급이 당 기술분야에 기재되어 있다 [Singh 등, J.Org.Chem. 1998, 63, 10035-10039]. 또한, 2'-아미노- 및 2'-메틸아미노-LNA가 제조되었으며, 상보성 RNA 및 DNA 가닥과 함께 그들의 이중가닥의 열 안정성이 이전에 보고되었다.
하기 화학식을 가진 이고리형 및 삼고리형 뉴클레오시드 유사체를 포함하도록 추가의 올리고뉴클레오티드 모방체가 제조되었다 (아미디트 단량체를 나타냄):
Figure 112006056137226-PCT00013
[Steffens 등, Helv.Chim.Acta, 1997, 80, 2426-2439; Steffens 등, J.Am.Chem.Soc. 1999, 121, 3249-3255; 및 Renneberg 등, J.Am.Chem.Soc. 2002, 124, 5993-6002] 참조. 이러한 변형 뉴클레오시드 유사체는 포스포르아미디트 접근법을 사용하여 올리고머화되고, 삼고리형 뉴클레오시드를 함유하는 올리고머 화합물은 DNA, RNA 및 그 자체로 하이브리드형성될 때 증가된 열 안정성(Tm's)을 나타내었다. 이고리형 뉴클레오시드 유사체를 함유하는 올리고머 화합물은 DNA 이중가닥에 근접한 열 안정성을 나타내었다.
다른 부류의 올리고뉴클레오티드 모방체는 주쇄에 인 기를 포함하는 포스포노모노에스테르 핵산이라 일컬어진다. 이러한 부류의 올리고뉴클레오티드 모방체는 유전자 발현을 억제하는 분야에서(안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 센스 올리고뉴클레오티드 및 삼중가닥-형성 올리고뉴클레오티드) 핵산 검출을 위한 프로브로서 및 분자 생물학에서 사용하기 위한 보조제로서 유용한 물리적 및 생물학적 및 약리학적 성질을 갖는 것으로 보고된다.
화학식 (마커시(Markush) 변수의 정의를 위해: 미국 특허 5,874,553 및 6,127,346호 (여기에서 그 전체내용이 참고문헌으로 포함됨))을 이하에 나타낸다:
Figure 112006056137226-PCT00014
푸라노실 고리가 시클로부틸 잔기에 의해 치환되어진 다른 올리고뉴클레오티드 모방체가 보고되어 있다.
변형 당
본 발명의 올리고머 화합물은 하나 이상의 치환된 당 잔기를 함유할 수도 있다. 바람직한 올리고머 화합물은 OH; F; O-; S-; 또는 N-알킬; O-, S- 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬 (여기에서, 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환되거나 비치환된 C1-C10 알킬 또는 C2-C10 알케닐 및 알키닐일 수도 있다)로부터 선택된 당 치환기를 포함한다. 특히 바람직한 것은 O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 및 O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2 (여기에서, n 및 m은 1 내지 약 10이다)이다. 다른 바람직한 올리고뉴클레오티드는 C1-C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알케닐, 알키닐, 알크아릴, 아르알킬, O-알크아릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로시클로알킬, 헤테로시클로알크아릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단 기, 리포터 기, 삽입기, 올리고뉴클레오티드의 약동학적 성질을 개선시키기 위한 기, 또는 올리고뉴클레오티드의 약력학적 성질을 개선시키기 위한 기 및 유사한 성질을 가진 기타 치환기로부터 선택된 당 치환기를 포함한다. 바람직한 변형은 2'-메톡시에톡시 (2'-O-CH2CH2OCH3, 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로서 공지됨)[Martin 등, Helv.Chim.Acta, 1995, 78, 486-504], 즉 알콕시알콕시 기를 포함한다. 추가의 바람직한 변형은 이하 실시예에 기재된 바와 같이 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 즉 O(CH2)2ON(CH3)2기 (또한 2'-DMAOE라고 공지됨), 및 2'-디메틸아미노에톡시에톡시 (당 기술분야에 2'-O-디메틸-아미노에톡시-에틸 또는 2'-DMA EOE로 공지됨), 즉 2'-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2을 포함한다.
기타 바람직한 당 치환기는 메톡시(-O-CH3), 아미노프로폭시(-OCH2CH2CH2NH2), 알릴 (-CH2-CH=CH2), -O-알릴(-O-CH2-CH=CH2) 및 플루오로(F)를 포함한다. 2'-당 치환기는 아라비노(위) 위치 또는 리보(아래) 위치에 있을 수도 있다. 바람직한 2'-아라비노 변형은 2'-F이다. 유사한 변형이 올리고머 화합물 위의 다른 위치, 특히 3'-말단 뉴클레오시드 또는 2'-5' 결합된 올리고뉴클레오티드 위의 당의 3'-위치 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서 행해질 수도 있다. 올리고머 화합물은 펜토푸라노실 당 대신에 시클로부틸 잔기와 같은 당 모방체를 가질 수도 있다. 이러한 변형 당 구조의 제조를 교시하고 있는 대표적인 미국 특허는, 이에 한정되지 않지만, U.S. 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; 5,792,747; 및 5,700,920 (이들의 각각은 그 전체내용이 참고문헌으로 인용된다)을 포함한다.
추가의 대표적인 당 치환기는 화학식 Ia 또는 IIa의 기를 포함한다.
Figure 112006056137226-PCT00015
Figure 112006056137226-PCT00016
상기 식에서,
Rb는 O, S 또는 NH이고;
Rd는 단일 결합, O, S 또는 C(=O)이고;
Re는 C1-C10 알킬, N(Rk)(Rm), N(Rk)(Rn), N=C(Rp)(Rq), N=C(Rp)(Rr)이거나 또는 화학식 IIIa를 갖는다.
Figure 112006056137226-PCT00017
상기 식에서,
Rp 및 Rq은 각각 독립적으로 수소 또는 C1-C10 알킬이고;
Rr은 -Rx-Ry이고;
각각의 Rs, Rt, Ru 및 Rv은 독립적으로 수소, C(O)Rw, 치환 또는 비치환 C1-C10 알킬, 치환 또는 비치환 C2-C10 알케닐, 치환 또는 비치환 C2-C10 알키닐, 알킬술포닐, 아릴술포닐, 화학 작용기 또는 접합 기이고, 여기에서 치환기는 히드록실, 아미노, 알콕시, 카르복시, 벤질, 페닐, 니트로, 티올, 티오알콕시, 할로겐, 알킬, 아릴, 알케닐 및 알키닐로부터 선택되거나;
또는 임의로 Ru 및 Rv는 이들이 부착된 질소 원자와 함께 프탈이미도 잔기를 형성하고;
각각의 Rw은 독립적으로 치환 또는 비치환 C1-C10 알킬, 트리플루오로메틸, 시아노에틸옥시, 메톡시, 에톡시, t-부톡시, 알릴옥시, 9-플루오레닐메톡시, 2-(트리메틸실릴)-에톡시, 2,2,2-트리클로로에톡시, 벤질옥시, 부티릴, 이소-부티릴, 페닐 또는 아릴이고;
Rk은 수소, 질소 보호기 또는 -Rx-Ry이고;
Rp은 수소, 질소 보호기 또는 -Rx-Ry이고;
Rx은 결합 또는 연결 잔기이고;
Ry은 화학 작용기, 접합 기 또는 고체 지지체 매질이고;
각각의 Rm 및 Rn은 독립적으로 H, 질소 보호기, 치환 또는 비치환 C1-C10 알킬, 치환 또는 비치환 C2-C10 알케닐, 치환 또는 비치환 C2-C10 알키닐이고, 여기에서 치환 기는 히드록실, 아미노, 알콕시, 카르복시, 벤질, 페닐, 니트로, 티올, 티오알콕시, 할로겐, 알킬, 아릴, 알케닐, 알키닐; NH3 +, N(Ru)(Rv), 구아디노 및 아실 (상기 아실은 산 아미드 또는 에스테르이다)로부터 선택되거나; 또는
Rm 및 Rn은 함께 질소 보호기이고 N 및 O로부터 선택된 추가의 헤테로원자를 임의로 포함하는 고리 구조에서 연결되거나, 또는 화학 작용기이고;
Ri은 ORz, SRz 또는 N(Rz)2이고;
각각의 Rz은 독립적으로 H, C1-C8 알킬, C1-C8 할로알킬, C(=NH)N(H)Ru, C(=O)N(H)Ru 또는 OC(=O)N(H)Ru이고;
Rf, Rg 및 Rh은 약 4 내지 약 7개 탄소 원자를 갖거나 또는 약 3 내지 약 6개 탄소 원자 및 1 또는 2개 헤테로원자를 갖는 고리 계를 포함하고, 여기에서 상기 헤테로원자는 산소, 질소 및 황으로부터 선택되고, 상기 고리 계는 지방족, 불포화 지방족, 방향족, 또는 포화 또는 불포화 헤테로고리이고;
Rj은 1 내지 약 10개 탄소 원자를 가진 알킬 또는 할로알킬, 2 내지 약 10개 탄소 원자를 가진 알케닐, 2 내지 약 10개 탄소 원자를 가진 알키닐, 약 6 내지 약 14개 탄소 원자를 가진 아릴, N(Rk)(Rm)ORk, 할로, SRk 또는 CN이고;
ma은 1 내지 약 10이고;
각각의 mb는 독립적으로 0 또는 1이고;
mc는 0 또는 1 내지 10의 정수이고;
md는 1 내지 10의 정수이고;
me는 0, 1 또는 2이고;
단 mc가 0일 때, md는 1보다 크다.
화학식 I의 대표적인 치환기는 미국 특허출원 일련번호 09/130,973호 (1998년 8월 7일 출원) (발명의 명칭 "캡형성 2'-옥시에톡시 올리고뉴클레오티드") (여기에서 그 전체내용이 참고문헌으로 인용됨)에 개시되어 있다.
화학식 II의 대표적인 고리형 치환기는 미국 특허출원 일련번호 09/123,108호 (1998년 7월 27일 출원) (발명의 명칭 "형태적으로 예비조직화된 RNA 표적 2'-올리고머 화합물") (그 전체내용이 참고문헌으로 인용됨)에 개시되어 있다.
특히 바람직한 당 치환기는 O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 및 O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2 (여기에서 n 및 m은 1 내지 약 10이다)을 포함한다.
화학식 III 및 IV에 나타낸 대표적인 구아니디노 치환기는 미국 특허 출원 09/349,040호 ("작용기화 올리고머", 1999년 7월 7일 출원) (그 전체내용이 여기에서 참고문헌으로 인용됨)에 개시되어 있다.
대표적인 아세트아미도 치환기는 미국 특허 6,147,200호 (그 전체내용이 여기에서 참고문헌으로 인용됨)에 개시되어 있다.
대표적인 디메틸아미노에틸옥시에틸 치환기는 국제 특허출원 PCT/US99/17895 (1999년 8월 6일 출원, 발명의 명칭 "2'-O-디메틸아미노에틸옥사에틸-올리고머 화합물") (여기에서 그 전체내용이 참고문헌으로 인용됨)에 개시되어 있다.
변형된 뉴클레오염기 /천연 뉴클레오염기
올리고머 화합물은 뉴클레오염기 (당 기술분야에서 간단히 "염기" 또는 "헤테로고리 염기 잔기"라 일컬어진다) 변형 또는 치환을 포함할 수도 있다. 여기에서 사용된 "비변형" 또는 "천연" 뉴클레오염기는 퓨린 염기 아데닌(A) 및 구아닌(G), 및 피리미딘 염기 티미딘(T), 시토신(C) 및 우라실(U)을 포함한다. 여기에서 헤테로고리 염기 잔기라 일컬어지는 변형 뉴클레오염기는 기타 합성 및 천연 뉴클레오염기, 예컨대 5-메틸시토신(5-me-C), 5-히드록시메틸 시토신, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 기타 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 기타 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐(-C=C-CH3), 우라실 및 시토신 및 피리미딘 염기의 기타 알키닐 유도체, 6-아조우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실 (슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록실 및 기타 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 기타 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아 미노-아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함한다.
헤테로고리 염기 잔기는 퓨린 또는 피리미딘 염기가 다른 헤테로고리, 예를들어 7-데아자-아데닌, 7-데아자구아노신, 2-아미노피리딘 및 2-피리돈으로 대체된 것을 포함할 수도 있다. 추가의 뉴클레오염기는 미국 특허 3,687,808호에 개시된 것, 문헌 [The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, 858-859면, Kroschwitz,J.I. ed. John Wiley ＆ Sons, 1990]에 기재된 것, 문헌 [Englisch 등, Angewandte Chemie, Internationl Edition, 1991, 30,613]에 기재된 것 및 문헌 [Sanghvi,Y.S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, 289-302면, Crooke,S.T. 및 Lebleu,B. ed. CRC Press, 1993]에 기재된 것을 포함한다. 본 발명의 올리고머 화합물의 결합 친화력을 증가시키기 위하여 특정한 뉴클레오염기가 특히 유용하다. 이들은 2-아미노프로필아데닌, 5-프로필우라실 및 5-프로피닐시토신을 포함하여 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린을 포함한다. 5-메틸시토신 치환은 핵산 이중가닥 안정성을 0.6 내지 1.2℃ 만큼 증가시키는 것으로 밝혀졌으며[Sanghvi,Y.S., Crooke,S.T. 및 Lebleu,B. eds. Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp.276-278], 더욱 더 바람직하게는 2'-O-메톡시에틸 당 변형과 조합될 때 바람직한 염기 치환이다.
본 발명의 하나의 측면에서, 하나 이상의 헤테로고리 염기 잔기 대신에 다중고리 헤테로고리 화합물을 가진 올리고머 화합물이 제조된다. 다수의 삼고리형 헤 테로고리 화합물이 앞서 보고되었다. 이러한 화합물들은 표적 가닥에 변형 가닥의 결합 성질을 증가시키기 위하여 안티센스 응용에서 일상적으로 사용된다. 가장 많이 연구된 변형은 구아노신을 표적으로 하고, 따라서 이들은 G-클램프 또는 시티딘 유사체로 명명된다. 이러한 다중고리형 헤테로고리 화합물의 다수는 하기 화학식을 갖는다.
Figure 112006056137226-PCT00018
두번째 가닥에서 구아노신과 3개의 수소 결합을 형성하는 대표적인 시토신 유사체는 1,3-디아자페녹사진-2-온 (R10=O, R11-R14=H) [Kurchavov 등, Nucleosides and Nucleotides, 1997, 16, 1837-1846], 1,3-디아자페노티아진-2-온 (R10=S, R11-R14=H) [Lin, K.Y; Jones,R.J.; Matteucci, M.J.Am.Chem.Soc. 1995, 117, 3873-3874] 및 6,7,8,9-테트라플루오로-1,3-디아자페녹사진-2-온 (R10=O, R11-R14=F) [Wang,J.; Lin,K.Y., Matteucci,M. Tetrahedron Lett. 1998, 39, 8385-8388]을 포함한다. 올리고뉴클레오티드 내에 혼입되면, 이러한 염기 변형은 상보성 구아닌과 하이브리드형성되는 것으로 밝혀졌고, 후자는 아데닌과 하이브리드형성되어 연장된 적중 상호작용에 의해 나선의 열 안정성을 높힌다는 것이 밝혀졌다 (미국 특허 출원 "변형된 펩티드 핵산", 2002년 5월 24일 출원, 일련번호 10/155,920호; 미국 특 허출원 "뉴클레아제 내성 키메라 올리고뉴클레오티드" 2002년 5월 24일 출원, 일련번호 10/013,295호, 양쪽 모두 그 전체내용이 참고문헌으로 인용됨).
시토신 유사체/치환기가 엄격한 1,3-디아자페녹사진-2-온 골격에 부착된 아미노에톡시 잔기를 가질 때 추가의 나선-안정화 성질이 관찰되었다 (R10=O, R11= -O-(CH2)2-NH2, R12 -14=H) [Lin,K.Y.; Matteucci,M.J.Am.Chem.Soc. 1998, 120, 8531-8532]. 결합 연구는, 하나의 혼입이 5-메틸 시토신(dC5me)에 비하여 18°이하의 ΔTm으로 상보성 표적 DNA 또는 RNA에 대한 모형 올리고뉴클레오티드의 결합 친화성을 증진시킬 수 있음을 증명하였으며, 이것은 지금까지 단일 변형에 대해 알려진 가장 높은 친화성 증가이다. 다른 한편, 나선 안정성의 획득은 올리고뉴클레오티드의 특이성을 손상시키지 않는다. Tm 데이타는, dC5me에 비하여 완벽한 일치 및 불일치 서열 간의 더욱 큰 구별을 나타낸다. 구속된 아미노 기는 상보성 구아닌의 허그스틴(Hoogsteen) 면과 상호작용하기 위해 추가의 수소 결합 공여체로서 역할을 하고 이에 의해 4개의 수소 결합을 형성한다는 것이 제안되었다. 이것은, G-클램프의 증가된 친화성이 연장된 염기 적중과 추가의 특이적 수소 결합의 조합에 의해 매개된다는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 추가의 삼고리형 헤테로고리 화합물 및 이것의 사용 방법은 미국 특허 일련번호 6,028,183호 (2000년 5월 22일 발행) 및 미국 특허 일련번호 6,007,992호에 개시되어 있다 (이들은 그 전체내용이 참고문헌으로 인용된다).
페녹사진 유도체의 증가된 결합 친화성과 그들의 손상되지 않은 서열 특이성은, 이들을 더욱 강력한 안티센스-기재 약물의 개발을 위해 중요한 뉴클레오염기 유사체로 만든다. 사실상, 페녹사진 치환을 함유하는 헵타뉴클레오티드가 RN아제H를 활성화시킬 수 있고, 세포 흡수를 향상시킬 수 있고 증가된 안티센스 활성을 나타낼 수 있음을 증명하는 시험관내 실험으로부터 유망한 데이타가 유래되었다 [Lin,K-Y; Matteucci, M.J.Am.Chem.Soc. 1998, 120, 8531-8532]. 단일 치환이 20량체 2'-데옥시포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 시험관내 효능을 상당히 개선시키는 것으로 밝혀졌기 때문에, 활성 증가는 G-클램프의 경우에 더욱 현저하였다 [Flanagan,W.M.; Wolf,J.J.; Olson,P.; Grant,D.; Lin,K.Y.; Wagner,R.W.; Matteucci,M. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1999, 96, 3513-3518]. 그럼에도불구하고, 올리고뉴클레오드 구조를 최적화하고, 생물학적 활성에 미치는 헤테로고리 변형의 영향을 더욱 잘 이해하기 위하여, 올리고머의 뉴클레아제 안정성에 미치는 효과를 평가하는 것이 중요하다.
헤테로고리 염기로서 유용한 추가의 변형된 다중고리 헤테로고리 화합물은, 이에 한정되지 않지만 상기 언급된 U.S.3,687,808; 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,434,257; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121; 5,596,091; 5,614,617; 5,645,985; 5,646,269; 5,750,692; 5,830,653; 5,763,588; 6,005,096; 및 5,681,941 및 미국 특허 출원 일련번호 09/996,292호(2001년 11월 28일 출원) (이들의 각각은 참고문헌으로 인용된다)에 개시되어 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 상이한 염기가 올리고뉴클레오티드에서 하나 이상의 뉴클레오티드 위치에 존재하는 변형체를 포함한다. 예를들어, 첫번째 뉴클레오티드가 아데노신이라면, 이 위치에서 티미딘, 구아노신 또는 시티딘을 함유하는 변형체가 생성될 수도 있다. 올리고뉴클레오티드의 임의 위치에서 이것을 수행할 수도 있다. 이어서 STAT3의 발현을 억제하는 능력을 결정하기 위하여 여기에 기재된 방법을 사용하여 올리고뉴클레오티드를 시험한다.
접합체
본 발명의 올리고머 화합물에 추가될 수 있는 바람직한 치환은, 얻어지는 올리고머 화합물의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡수율을 증가시키는 하나 이상의 잔기 또는 접합체의 연결과 관련된다. 하나의 구현양태에서, 히드록실 또는 아미노기와 같은 작용기에 접합 기를 공유 결합시킴으로써 변형 올리고머 화합물이 제조된다. 본 발명의 접합 기는 삽입기, 리포터 분자, 폴리아민, 폴리아미드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에테르, 올리고머의 약력학적 성질을 증진시키는 기, 및 올리고머의 약동학적 성질을 증진시키는 기를 포함한다. 전형적인 접합 기는 콜레스테롤, 지질, 인지질, 바이오틴, 페나진, 폴레이트, 페난트리딘, 안트라퀴논, 아크리딘, 플루오레세인, 로다민, 쿠마린 및 염료를 포함한다. 본 발명의 내용에서 약력학적 성질을 증진시키는 기는 올리고머 흡수를 개선시키고, 올리고머의 분해 내성을 증진시키고 및(또는) RNA와의 서열-특이적 하이브리드형성을 강화시키는 기를 포함한다. 본 발명의 내용에서, 약동학적 성질을 증진시키는 기는 올리고머 흡수, 분포, 대사 또는 분비를 개선시키는 기를 포함한다. 대표적인 접합 기는 국제 특 허출원 PCT/US92/09196 (1992년 10월 23일 출원) (그의 전체 개시내용이 본 명세서에서 참고문헌으로 인용됨)에 개시되어 있다. 접합 잔기는 이에 한정되지 않지만 콜레스테롤 잔기와 같은 지질 잔기 (Letsinger 등, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1989, 86, 6553-6556), 콜린 산(Manoharan 등, Bioorg.Med.Chem.Let., 1994, 4, 1053-1060), 티오에테르, 예를들어 헥실-S-트리틸티올 (Manoharan 등, Ann.N.Y.Acad.Sci. 1992, 660, 306-309; Manoharan 등, Bioorg.Med.Chem.Let., 1993, 3, 2765-2770), 티오콜레스테롤 (Oberhauser 등, Nucl.Acids Res., 1992, 20, 533-538), 지방족 사슬, 예를들어 도데칸디올 또는 운데실 잔기 (Saison-Behmoaras 등, EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov 등, FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk 등, Biochimie, 1993, 75, 49-54), 인지질, 예를들어 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트 (Manoharan 등, Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea 등, Nucl.Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬 (Manoharan 등, Nucleosides ＆ Nucleotides, 1995, 14, 969-973), 또는 아다만탄 아세트산 (Manoharan 등, Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), 팔미틸 잔기 (Mishra 등, Biochem. Biophys.Acta, 1995, 1264, 229-237) 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤 잔기 (Crooke 등, J.Pharmacol.Exp.Ther., 1996, 277, 923-937)를 포함한다.
본 발명의 올리고머 화합물은 활성 약물 물질, 예를들어 아스피린, 와르파린, 페닐부타존, 이부프로펜, 수프로펜, 펜부펜, 나프록센, 케토프로펜, (S)-(+)- 프라노프로펜, 카르프로펜, 단실사르코신, 2,3,5-트리요오도벤조산, 플루페남산, 폴린산, 벤조티아디아지드, 클로로티아지드, 디아제핀, 인도메티신, 바르비투레이트, 세팔로스포린, 술파 약물, 항당뇨병제, 항균제 또는 항생물질에 접합될 수도 있다. 올리고뉴클레오티드-약물 접합체 및 그의 제조가 미국 특허 출원 09/334,130호 (1999년 6월 15일 출원) (이들의 전체 개시내용이 참고문헌으로 인용됨)에 기재되어 있다.
이러한 올리고뉴클레오티드 접합체의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 이에 한정되지 않지만 U.S.4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717; 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,252,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241; 5,391,723; 5,416,203; 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928 및 5,688,941 (이들의 각각은 참고문헌으로 인용된다)을 포함한다.
본 발명의 조성물에서 사용된 올리고머 화합물은, 예를들어 뉴클레아제 안정성과 같은 성질을 향상시키기 위해 올리고머 화합물의 한쪽 또는 양쪽 말단에 일반적으로 부착되는 하나 이상의 안정화 기를 갖도록 변형될 수 있다. 캡 구조가 안 정화 기에 포함된다. "캡 구조 또는 말단 캡 잔기"란, 올리고뉴클레오티드의 어느 한쪽 말단에 혼입되어진 화학 변형을 의미한다 (예를들어 [Wincott 등, WO 97/26270] 참조, 참고문헌으로 인용됨). 이러한 말단 변형은 엑소뉴클레아제 분해로부터 말단 핵산 분자를 가진 올리고머 화합물을 보호하고, 세포 내에서 전달 및(또는) 국소화를 도울 수 있다. 캡은 5'-말단(5'-캡) 또는 3'-말단(3'-캡)에 존재할 수 있거나 양쪽 말단에 존재할 수 있다. 비-제한적 실시예에서, 5'-캡은 역 비염기성 잔기, 4',5'-메틸렌 뉴클레오티드; 1-(베타-D-에리트로푸라노실) 뉴클레오티드, 4'-티오뉴클레오티드, 탄소고리 뉴클레오티드; 1,5-안히드로헥시톨 뉴클레오티드; L-뉴클레오티드; 알파-뉴클레오티드; 변형된 염기 뉴클레오티드; 포스포로디티오에이트 결합; 트레오-펜토푸라노실 뉴클레오티드; 비고리형 3',4'-세코 뉴클레오티드; 비고리형 3,4-디히드록시부틸 뉴클레오티드; 비고리형 3,5-디히드록시펜틸 뉴클레오티드, 3',3'-역 뉴클레오티드 잔기; 3'-3'-역 비염기성 잔기; 3'-2'-역 뉴클레오티드 잔기; 3'-2'-역 비염기성 잔기; 1,4-부탄디올 포스페이트; 3'-포스포르아미데이트; 헥실포스페이트; 아미노헥실 포스페이트; 3'-포스페이트; 3'-포스포로티오에이트; 포스포로디티오에이트; 또는 다리걸침 또는 비-다리걸침 메틸포스포네이트 잔기 (더욱 상세한 사항을 위하여 Wincott 등, 국제 PCT 공개 번호 97/26270, 여기에서 참고문헌으로 인용됨)을 포함한다.
본 발명의 특히 바람직한 3'-캡 구조는 예를들어 4',5'-메틸렌 뉴클레오티드; 1-(베타-D-에리트로푸라노실) 뉴클레오티드; 4'-티오 뉴클레오티드, 탄소고리 뉴클레오티드; 5'-아미노-알킬 포스페이트; 1,3-디아미노-2-프로필 포스페이트, 3- 아미노프로필 포스페이트; 6-아미노헥실 포스페이트; 1,2-아미노도데실 포스페이트; 히드록시프로필 포스페이트; 1,5-안히드로헥시톨 뉴클레오티드; L-뉴클레오티드; 알파-뉴클레오티드; 변형 염기 뉴클레오티드; 포스포로디티오에이트; 트레오-펜토푸라노실 뉴클레오티드; 비고리형 3',4'-세코 뉴클레오티드; 3,4-디히드록시부틸 뉴클레오티드; 3,5-디히드록시펜틸 뉴클레오티드, 5',5'-역 뉴클레오티드 잔기; 5'-5'-역 비염기성 잔기; 5'-포스포르아미데이트; 5'-포스포로티오에이트; 1,4-부탄디올 포스페이트; 5'-아미노; 다리걸침 및(또는) 비-다리걸침 5'-포스포로아미데이트, 포스포로티오에이트 및(또는) 포스포로디티오에이트, 다리걸침 또는 비-다리걸침 메틸포스포네이트 및 5'-메르캅토 잔기 (더욱 상세한 사항을 위하여 문헌[Beaucage and Tyer, 1993, Tetrahedron 49, 1925] (본 명세서에서 참고문헌으로 인용됨)을 참조한다)를 포함한다.
올리고머 화합물의 한쪽 또는 양쪽 말단에 캡형성하여 뉴클레아제 안정성을 부여하기 위해 사용될 수 있는 추가의 3' 및 5;-안정화 기는 WO 03/004602호(2003년 1월16일 발행)에 개시된 것을 포함한다.
키메라 올리고머 화합물
올리고머 화합물 내의 모든 위치가 균일하게 변형될 필요는 없으며, 사실상 상기 언급된 변형의 하나 이상이 하나의 올리고머 화합물 내에 혼입될 수도 있거나 또는 심지어 올리고머 화합물 내의 뉴클레오시드와 같은 단일 단량체 소단위에 혼입될 수 있다. 본 발명은 키메라 올리고머 화합물인 올리고머 화합물을 포함한다. 본 발명의 내용에서 "키메라" 올리고머 화합물 또는 "키메라"는 2개 이상의 화학적 으로 뚜렷한 영역을 함유하는 올리고머 화합물이고, 각각 적어도 하나의 단량체 단위, 다시말해서 핵산 기재 올리고머의 경우에 뉴클레오티드로 이루어진다.
키메라 올리고머 화합물은 전형적으로 뉴클레아제 분해에 대해 증가된 내성, 증가된 세포 흡수, 및(또는) 표적 핵산에 대해 증가된 결합 친화성을 부여하도록 변형되어진 적어도 하나의 영역을 함유한다. 올리고머 화합물의 추가의 영역은 RNA:DNA 또는 RNA:RNA 하이브리드를 절단할 수 있는 효소에 대한 기질로서 작용할 수도 있다. 일례로서, RN아제 H는 RNA:DNA 이중가닥의 RNA 가닥을 절단하는 세포 엔도뉴클레아제이다. 따라서, RN아제 H를 활성화시키면 RNA 표적이 절단되고, 이에 의해 유전자 발현의 억제 효율이 상당히 증가한다. 그 결과, 예를들어 동일한 표적 영역에 하이브리드형성되는 포스포로티오에이트 데옥시올리고뉴클레오티드에 비하여, 키메라가 사용될 때 더욱 짧은 올리고머 화합물에서 필적하는 결과가 종종 수득될 수 있다. RNA 표적의 절단은 겔 전기영동에 의해 일반적으로 검출될 수 있고, 필요하다면 당 기술분야에 공지된 핵산 하이브리드형성 기술과 연관된다.
본 발명의 키메라 올리고머 화합물이 상기 기재된 바와 같이 2 이상의 올리고뉴클레오티드의 복합 구조, 올리고뉴클레오티드 유사체, 올리고뉴클레오시드 및(또는) 올리고뉴클레오디드 모방체의 복합구조로서 형성될 수도 있다. 이러한 올리고머 화합물은 당 기술분야에서 하이브리드 헤미머(hemimer), 개프머(gapmer) 또는 역 개프머라 일컬어진다. 하이브리드 구조의 제조를 교시하고 있는 대표적인 미국 특허는 이에 한정되지 않지만 U.S.5,013,830; 5,149,797; 5,220,007; 5,256,775; 5,366,878; 5,403,711; 5,491,133; 5,565,350; 5,623,065; 5,652,355; 5,652,356; 및 5,700,922 (이것의 각각은 그 전체내용이 참고문헌으로 인용된다)를 포함한다.
3'-엔도 변형
본 발명의 하나의 측면에서, 올리고머 화합물은 3'-엔도 당 형태를 유도하기 위해 합성적으로 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 뉴클레오시드는 원하는 3'-엔도 당 형태를 유도하기 위하여 헤테로고리 염기, 당 잔기 또는 양쪽 모두의 합성적 변형을 포함할 수 있다. 바람직한 3'-엔도 형태 기하구조를 유지하면서 올리고머 화합물의 특정한 성질을 향상시킬 수 있도록 RNA 유사 뉴클레오시드를 모방하기 위하여 이러한 변형 뉴클레오시드가 사용된다. 2'-데옥시-2'F-뉴클레오시드로 이루어진 이중가닥이 시.엘레간스(C.elegans) 시스템에서 RNAi 반응을 유발하는데 효율적이라는 사실에 의하여 부분적으로 뒷받침되는 RNA 간섭의 요건(예, 유발인자)으로서, RNA 유형 이중가닥 (나선형, 주로 3'-엔도)이 뚜렷하게 선호된다. 더욱 안정한 3'-엔도 뉴클레오시드를 사용함으로써 향상되는 성질은, 이에 한정되지 않지만 단백질 결합, 단백질 이탈 속도, 흡수 및 제거의 변형을 통한 약동학적 성질의 조절; 뉴클레아제 안정성 뿐만 아니라 화학적 안정성의 조절; 올리고머의 결합 친화력 및 특이성의 조절(효소 뿐만 아니라 상보성 서열에 대한 친화성 및 특이성); 및 RNA 절단의 효율 증가를 포함한다. 본 발명은 C3'-엔도 유형 형태를 선호하는 방식으로 변형된 하나 이상의 뉴클레오시드를 가진 RNAi의 올리고머 유발인자를 제공한다.
Figure 112006056137226-PCT00019
펜토푸라노실 당의 2',3' 또는 4'-위치에서 치환을 포함하는 다양한 인자에 의해 뉴클레오시드 형태가 영향을 받는다. 축 위치에서 일반적으로 음전기 치환이 선호되는 반면, 입체적으로 요구되는 치환기는 일반적으로 적도 위치를 선호한다. (Principles of Nucleic Acid Structure, Wolfgang Sanger, 1984, Springer-Verlag). 도 2에 도시된 바와 같이 2'-OH를 인지 요소로서 유지하면서, 3'-엔도 형태를 지지하기 위한 2' 위치의 변형이 달성될 수 있다 [Gallo 등, Tetrahedron (2001), 57, 5707-5713, Harry-O'kuru 등, J.Org.Chem., (1997), 62(6), 1754-1759 및 Tang 등, J.Org.Chem.(1999), 64, 747- 754]. 대안적으로, 2'데옥시-2'F-뉴클레오시드에 의해 예시되는 바와 같이 2'-OH의 결실에 의해 3'-엔도 형태에 대한 선호가 달성될 수 있으며(Kawasaki 등, J.Med.Chem.(1993) 36, 831-841), 이것은 축 위치에 음전기 불소 원자를 위치시키는 3'-엔도 형태를 채택한다. 리보스 고리의 다른 변형, 예를들어 4'-F 변형 뉴클레오시드를 수득하기 위한 4'-위치에서의 치환[Guillerm 등, Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters (1995), 5, 1455-1460 및 Owen 등, J.Org.Chem. (1976), 41, 3010-3017] 또는 예를들어 메타노카르바 뉴클레오시드 유사체를 수득하기 위한 변형[Jacobson 등, J.Med.Chem.Lett. (2000), 43, 2196-2203, 및 Lee 등, Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters (2001), 11, 1333-1337]이 3'-엔도 형태에 대한 선호를 유도한다. 유사한 선을 따라, RNAi 반응의 올리고머 유발인자는 형태가 C3'-엔도 유형 형태로 고정되도록 변형된 하나 이상의 뉴클레오시드, 즉 고정된 핵산 (LNA, Singh 등, Chem.Commun. (1998) 4, 455-456) 및 에틸렌 다리걸침 핵산(ENA, Morita 등, Bioorganic ＆ Medicinal Chemistry Letters (2002) 12, 73-76)으로 이루어질 수도 있다. 본 발명에 따른 변형 뉴클레오시드의 예를 하기 표 I에 나타낸다. 이러한 예들은 대표적인 것일 뿐 전부가 아니다.
Figure 112006056137226-PCT00020
변형된 뉴클레옥시드 및 그의 올리고머의 바람직한 형태는 분자 역학 계산, 핵자기 공명 분광법 및 CD 측정과 같은 다양한 방법에 의해 평가될 수 있다. 따라서, 본 발명의 변형 올리고뉴클레오티드에서 사용하기 위하여, RNA 유사 형태, 즉올리고머에서의 A-형태 이중가닥 기하구조를 유도하는 것으로 예측된 변형이 선택된다. 본 발명에 따른 다수의 변형 뉴클레오시드의 합성이 당 기술분야에 공지되어 있다 (예를들어 문헌[Chemistry of Nucleosides and Nucleotides Vol.1-3, ed. Leroy B. Townsend, 1988, Plenum press.] 및 그의 실시예 부분 참조). RNA를 위한 억제제/기질로서 공지된 뉴클레오시드는 RNA 폴리머라제(예를들어 HCV NS5B)에 의존된다.
하나의 측면에서, 본 발명은 핵산 표적에 대한 천연 RNA에 비하여 향상된 성질을 가진 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 표적이 확인되고, 표적 서열의 일부에 상보성인 유효 길이 및 서열을 가진 올리고뉴클레오티드가 선택된다. 가능한 변형 향상을 위하여 선택된 서열의 각각의 뉴클레오시드를 자세히 조사한다. 바람직한 변형은 하나 이상의 RNA 뉴클레오시드를 동일한 3'-엔도 형태 기하구조를 가진 뉴클레오시드로 대체하는 것이다. 이러한 변형은 천연 RNA에 비하여 화학적 및 뉴클레아제 안정성을 향상시킬 수 있는 반면, 동시에 올리고뉴클레오티드로 합성 및(또는) 혼입하기에 더욱 저렴하고 더욱 용이하다. 선택된 서열을 여러 영역으로 더욱 나눌 수 있고, 키메라 배열의 결과일 수도 있는 변형의 향상에 대하여 각 영역의 뉴클레오시드를 평가한다.
하나 이상의 말단 뉴클레오시드에 행해질 수 있는 유리한 변형이 존재하기 때문에 5' 및 3'-말단을 고려한다. 본 발명의 올리고머 화합물은 단일 가닥 위에 또는 이중 가닥 서열 또는 서열들의 적어도 하나의 5'-위치 위에 적어도 하나의 5'-변형 포스페이트 기를 포함할 수도 있다. 추가의 변형, 예컨대 뉴클레오시드간 결합, 접합 기, 치환 당 또는 염기, 하나 이상의 뉴클레오시드와 뉴클레오시드 모방체의 치환 및 목적하는 표적을 위해 선택된 서열을 증진시킬 수 있는 다른 변형이 고려된다. 동종이중가닥 핵산의 형태 기하구조를 설명하기 위해 사용되는 용어는 RNA를 위해 "A 형태" 및 DNA를 위해 "B 형태"이다. RNA 및 DNA 이중가닥을 위한 각각의 형태 기하구조는 핵산 섬유의 X-선 회절 분석으로부터 결정되었다 [Arnott and Hukins, Biochem.Biophys.Res.Comm. 1970, 47, 1504]. 일반적으로, RNA:RNA 이중가닥이 더욱 안정하고, DNA:DNA 이중가닥에 비해 더욱 높은 융점(Tm's)을 갖는다 [Sanger 등, Principles of Nucleic Acid Structure, 1984, Springer-Verlag; New York, NY; Lesnik 등, Biochemistry, 1995, 34, 10807-10815; Conte 등, Nucleic Acids Res., 1997, 25, 2627-2634]. RNA의 증가된 안정성은 몇가지 구조적 특징, 가장 특별하게는 A-형태 기하구조로부터 얻어지는 개선된 기본 적중 상호작용에 기인하였다 [Searle 등, Nucleic Acids Res., 1993, 21, 2051-2056]. RNA에 2'히드록실의 존재는 C3' 엔도 푸커(pucker) (즉, 노던 푸커로서 명명됨) 쪽으로 당을 편향시키고, 이는 이중가닥이 A-형태 기하구조를 선호하도록 한다. 또한, RNA의 2'히드록실 기는 RNA 이중가닥을 안정화하는데 도움이 되는 물 매개 수소 결합의 망상을 형성할 수 있다 [Egli 등, Biochemistry, 1996, 35, 8489-8494. 다른 한편, 데옥시 핵산은 C2' 엔도 당 푸커(즉 서던 푸커로 공지됨)을 선호하고, 덜 안정한 B-형태 기하구조를 부여하는 것으로 생각된다 (Sanger,W. (1984), Principles of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag, New York, NY). 여기에서 사용된 B-형태 기하구조는 C2'-엔도 푸커 및 O4'-엔도 푸커를 모두 포함한다. 이것은 문헌[Berger 등, Nucleic Acids Research, 1998, 26, 2473-2480]에 일치하고, 이 문헌에서는 B-형태 이중가닥을 유발하는 푸라노스 형태를 고려할 때 O4'-엔도 푸커 기여를 고려해야 한다는 것을 지적하고 있다.
그러나, DNA:RNA 하이브리드 이중가닥은 보통 순수한 RNA:RNA 이중가닥에 비해 덜 안정하고, 그의 서열에 의존하여 DNA:DNA 이중가닥에 비해 더 안정하거나 덜 안정할 수도 있다 [Searle 등, Nucleic Acids Res., 1993, 21, 2051-2056]. 하이브리드 이중가닥의 구조는 A- 및 B-형태 기하구조의 중간이고, 이것은 적중 상호작용을 불량하게 할 수도 있다 [Lane 등, Eur.J.Biochem., 1993, 215, 297-306; Fedoroff 등, J.Mol.Biol. 1993, 233, 509-523; Gonzalez 등, Biochemistry, 1995, 34, 4969-4982; Horton 등, J.Mol.Biol., 1996, 264, 521-533]. 표적 RNA 및 합성 서열 간에 형성된 이중가닥의 안정성은, 이러한 메카니즘이 RNA 표적 가닥에 합성 올리고뉴클레오티드 가닥의 결합을 필요로 하기 때문에, 이에 한정되지 않지만 안티센스 및 RNA 간섭과 같은 치료법에 중요하다. 안티센스의 경우에, mRNA의 효과적인 억제는 안티센스 DNA가 mRNA와의 매우 높은 결합 친화성을 갖는 것을 필요로 한다. 그렇지 않으면, 합성 올리고뉴클레오티드 가닥과 표적 mRNA 가닥 간의 바람직한 상호작용이 드물게 일어날 것이고 그 결과 효능이 저하된다.
당 푸커링(puckering)을 변형시키기 위해 일반적으로 사용되는 한가지 방법은 2'-위치에서의 당을 당 기하구조에 영향을 미치는 치환기로 치환하는 것이다. 고리 형태에 대한 영향은 2'-위치에 있는 치환기의 성질에 의존된다. 당 푸커링 효과를 결정하기 위하여 다수의 상이한 치환기가 연구되었다. 예를들어, 2'-할로겐이 연구되었으며, 2'-플루오로 유도체가 C3'-엔도 형태의 가장 큰 집단(65％)을 나타내고 2'-요오도가 가장 적은 집단(7％)을 나타낸다는 것을 밝혀내었다. 아데노신(2'-OH) 대 데옥시아데노신(2'-H)의 집단은 각각 36％ 및 19％이다. 또한, 아데노신 이량체(2'-데옥시-2'-플루오로아데노신-2'-데옥시-2'-플루오로아데노신)의 2'-플루오로기의 효과는 적중된 형태의 안정화와 상관관계를 갖는다.
예측된 바와 같이, 이중가닥 상대적 안정성은 2'-OH 기를 2'-F 기로 대체하여, C3'-엔도 집단을 증가시킴으로써 향상될 수 있다. 2'-F 결합의 높은 극성 성질 및 C3'-엔도 푸커링에 대한 선호가 A-형태 이중가닥에서 적중된 형태를 안정화할 수 있는 것으로 추측된다. UV 흡광감소, 원형 2색성 및 1H NMR로부터의 데이타는, 할로 치환기의 음전기성이 저하됨에 따라 적중 정도가 감소함을 나타낸다. 또한, 당 잔기의 2'-위치에서 입체 벌크는 B-형태 이중가닥에 비해 A-형태 이중가닥에서 더욱 양호하게 수용된다. 따라서, 디뉴클레오시드 모노포스페이트의 3'-말단에서 2'-치환기는 적중 형태에 다수의 효과: 입체 반발, 푸라노스 푸커링 선호, 정전기 반발, 소수성 인력, 및 수소 결합 능력에 영향을 미치는 것으로 생각된다. 이러한 치환기 효과는 분자 크기, 음전기, 및 치환기의 소수성에 의해 결정되는 것으로 생각된다. 또한, 2'-치환된 아데노신 디포스페이트에 따라 상보성 가닥의 융점이 상승된다. 3'-엔도 형태의 선호 또는 치환기의 존재가 결합 증가의 원인이 되는지의 여부는 명확하지 않다. 그러나, 3'-엔도 형태에서 인접한 염기의 중복(적중)이 더 많이 달성될 수 있다.
뉴클레오티드에 증가된 뉴클레아제 내성 및 매우 높은 결합 친화성을 부여하는 한가지 합성 2'-변형은 2-메톡시에톡시(2'-MOE, 2'-OCH2CH2OCH3) 측쇄이다 [Baker 등, J.Biol.Chem., 1997, 272, 11944-12000]. 2'-MOE 치환의 한가지 장점은 결합 친화성의 개선이고, 이것은 O-메틸, O-프로필 및 O-아미노프로필과 같은 유사한 2'변형에 비해 더욱 크다. 2'-O-메톡시에틸 치환기를 가진 올리고뉴클레오티드는 생체내 사용을 위해 유망한 특징을 가진 유전자 발현의 안티센스 억제제인 것으로 밝혀졌다 [Martin,P. Helv.Chim.Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann 등, Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann 등, Biochem.Soc.Trans., 1996, 24, 630-637; 및 Altmann 등, Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926]. DNA에 비하여, 2'-MOE 변형을 가진 올리고뉴클레오티드는 개선된 RNA 친화성 및 높은 뉴클레아제 내성을 나타내었다. 날개 뉴클레오시드 및 데옥시-포스포로티오에이트 뉴클레오티드의 내부 영역에 2'-MOE 치환기를 가진 키메라 올리고뉴클레오티드 (이른바, 갭을 가진 올리고뉴클레오티드 또는 개프머)는, 동물 모델에서 낮은 투여량에서 종양 성장의 효과적인 감소를 나타내었다. 2'-MOE 치환된 올리고뉴클레오티드는 몇몇 질병 상태에서 안티센스 제로서 뛰어난 가망성을 나타내었다. 한가지 MOE 치환된 올리고뉴클레오티드가 CMV 망막염의 치료를 위한 임상 시험에서 연구되고 있다.
화학 정의
달리 정의되지 않는 한, 알킬은 C1-C12, 바람직하게는 C1-C8, 더욱 바람직하게는 C1-C6, 직쇄 또는 (가능하다면) 분지쇄 지방족 히드로카르빌을 의미한다.
달리 정의되지 않는 한, 헤테로알킬은 사슬의 말단 부를 포함하여 사슬에 적어도 하나, 바람직하게는 약 1 내지 약 3개의 헤테로 원자를 함유하는 C1-C12, 바람직하게는 C1-C8, 더욱 바람직하게는 C1-C6, 직쇄 또는 (가능하다면) 분지쇄 지방족 히드로카르빌을 의미한다. 바람직한 헤테로원자는 N, O 및 S를 포함한다. 달리 정의되지 않는 한, 시클로알킬은 C3-C12, 바람직하게는 C3-C8, 더욱 바람직하게는 C3-C6, 지방족 히드로카르빌 고리를 의미한다.
달리 정의되지 않는 한, 알케닐은 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 함유하는, 직쇄 또는 (가능하다면) 분지쇄 히드로카르빌 잔기일 수도 있는 C2-C12, 바람직하게는 C2-C8, 더욱 바람직하게는 C2-C6, 알케닐을 의미한다.
달리 정의되지 않는 한, 알키닐은 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 함유하는, 직쇄 또는 (가능하다면) 분지쇄 히드로카르빌 잔기일 수도 있는 C2-C12, 바람직하게는 C2-C8, 더욱 바람직하게는 C2-C6, 알키닐을 의미한다.
달리 정의되지 않는 한, 헤테로시클로알킬은 적어도 3개의 고리 요소를 함유하는 고리 잔기를 의미하고, 이 요소의 적어도 하나는 탄소이며, 1, 2 또는 3개의 고리 요소는 탄소 이외의 것이다. 바람직하게는, 탄소 원자의 수는 1 내지 약 12, 바람직하게는 1 내지 약 6이고, 고리 요소의 전체 수는 3 내지 약 15, 바람직하게는 약 3 내지 약 8이다. 바람직한 고리 헤테로원자는 N, O 및 S이다. 바람직한 헤테로시클로알킬기는 모르폴리노, 티오모르폴리노, 피페리디닐, 피페라지닐, 호모피페리디닐, 호모피페라지닐, 호모모르폴리노, 호모티오모르폴리노, 피롤로디닐, 테트라히드로옥사졸릴, 테트라히드로이미다졸릴, 테트라히드로티아졸릴, 테트라히드로이속사졸릴, 테트라히드로피라졸릴, 푸라닐, 피라닐 및 테트라히드로이소티아졸릴을 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 아릴은 적어도 하나의 아릴 고리를 함유하는 탄화수소 고리 구조를 의미한다. 바람직한 아릴 고리는 약 6 내지 약 20개 고리 탄소를 갖는다. 특히 바람직한 아릴 고리는 페닐, 나프틸, 안트라세닐 및 페난트레닐을 포함한다.
여기에서 달리 정의되지 않는 한, 헤트아릴은 적어도 하나의 완전 불포화 고리, 탄소 및 비-탄소 원자로 구성된 고리를 함유하는 고리 잔기를 의미한다. 바람직하게는, 고리 체계는 약 1 내지 약 4개 고리를 함유한다. 바람직하게는, 탄소 원자의 수는 1 내지 약 12, 바람직하게는 1 내지 약 6으로 변하고, 고리 요소의 전체 수는 3 내지 약 15, 바람직하게는 약 3 내지 약 8로 변한다. 바람직한 고리 헤테로원자는 N, O 및 S이다. 바람직한 헤트아릴 잔기는 피라졸릴, 티오페닐, 피리딜, 이미다졸릴, 테트라졸릴, 피리딜, 피리미디닐, 푸리닐, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 벤즈이미다졸릴, 벤조티오페닐 등을 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 잔기가 헤트아릴알킬(헤트아릴 및 알킬), 아르알킬(아릴 및 알킬) 등과 같은 화합물 잔기로서 정의되는 경우에, 각각의 부-잔기는 여기에 정의된 바와 같다.
달리 정의되지 않는 한, 전자 끄는 기는 이것이 부착된 탄소로부터 전하를 떼어내는 시아노 또는 이소시아네이토 기와 같은 기이다. 다른 전자 끄는 기는 음전기가 탄소를 초과하는 것, 예를들어 할로겐, 니트로 또는 하나 이상의 시아노, 이소티오시아네이토, 니트로 또는 할로 기로 오르소- 또는 파라-위치에서 치환된 할로겐, 니트로 또는 페닐을 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 용어 할로겐 및 할로는 그의 일반적인 의미를 갖는다. 바람직한 할로(할로겐) 치환기는 Cl, Br 및 I이다. 상기 언급된 임의의 치환기는, 여기에서 달리 정의되지 않는 한, 바람직한 성질에 의존하는 적절한 치환기이다. 할로겐(Cl, Br, I), 알킬, 알케닐 및 알키닐 잔기, NO2, NH3 (치환 및 비치환), 산 잔기(예, -CO2H, -OSO3H2 등), 헤테로시클로알킬 잔기, 헤트아릴 잔기, 아릴 잔기 등이 포함된다. 이전의 모든 화학식에서, 구부러진 선(~)은 5'-포스페이트의 산소 또는 황에 대한 결합을 나타낸다.
포스페이트 보호 기는 미국 특허 5,760,209, 5,614,621, 6,051,699, 6,020,475, 6,326,478, 6,169,177, 6,121,437, 6,465,628 (이들의 각각은 그 전체내용이 참고문헌으로 인용된다)에 기재된 것을 포함한다.
본 발명에 따라 사용된 올리고뉴클레오티드는 고체 상 합성의 공지된 기술을 통해 편리하고 일상적으로 만들어질 수 있다. 이러한 합성 장치는 어플라이드 바이오시스템스를 포함한 몇몇 판매업체에 의해 시판된다. 이러한 합성을 위한 다른 수단이 또한 사용될 수도 있고; 올리고뉴클레오티드의 실제 합성은 작업자의 재능에 따른다. 또한, 2'-O-메톡시에틸 올리고뉴클레오티드를 포함하여 포스포로티오에이트 및 2'-알콕시 또는 2'-알콕시알콕시 유도체와 같은 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위하여 유사한 기술을 사용하는 것이 공지되어 있다 [Martin,P., Helv.Chim.Acta 1995, 78, 486-504]. 형광 표지되거나 비오티닐화되거나 또는 달리 접합된 올리고뉴클레오티드를 합성하기 위하여, 비오틴, 플루오레세인, 아크리딘 또는 프소랄렌-변형 아미디트 및(또는) CPG (글렌 리서치, 미국 버지니아주 스털링)와 같은 통상적으로 입수가능한 변형 아미디트 및 조절된-공극 유리(CPG) 생성물 및 유사한 기술을 사용하는 것이 공지되어 있다.
안티센스 조성물 및 제형
본 발명의 화합물을, 섭취, 분포 및(또는) 흡수를 돕기 위하여, 다른 분자, 분자 구조 또는 예를들어 리포좀, 수용체 표적 분자, 경구, 직장, 국소 또는 기타 제제와 같은 화합물들의 혼합물과 혼합하거나, 캡슐화하거나, 접합하거나 달리 조합할 수 있다. 이러한 섭취, 분포 및(또는) 흡수를 돕는 제형의 제조를 교시하고 있는 대표적인 미국 특허는, 이에 한정되지 않지만, 미국 특허 5,108,921; 5,354,844; 5,416,016; 5,459,127; 5,521,291; 5,543,158; 5,547,932; 5,583,020; 5,591,721; 4,426,330; 4,534,899; 5,013,556; 5,108,921; 5,213,804; 5,227,170; 5,264,221; 5,356,633; 5,395,619; 5,416,016; 5,417,978; 5,462,854; 5,469,854; 5,512,295; 5,527,528; 5,534,259; 5,543,152; 5,556,948; 5,580,575; 및 5,595,756 (이들의 각각은 여기에서 참고문헌으로 인용됨)을 포함한다.
본 발명의 안티센스 화합물은 인간을 포함한 동물에 투여될 때 생물학적 활성 대사물질 또는 그의 잔류물을 (직접적으로 또는 간접적으로) 제공할 수 있는 제약학적으로 허용가능한 염, 에스테르 또는 이러한 에스테르의 염, 또는 다른 화합물을 포함한다. 따라서, 본 발명의 화합물의 전구약물 및 제약학적으로 허용가능한 염, 이러한 전구약물의 제약학적으로 허용가능한 염 및 기타 생체균등물이 개시되어 있다.
용어 "전구약물"은 내인성 효소 또는 기타 화학물질 및(또는) 조건의 작용에 의해 신체 또는 세포 내에서 활성 형태(즉, 약물)로 전환되는 불활성 형태로 제조되어진 치료제를 나타낸다. 특히, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 전구약물 변형체는 WO 93/24510 (Gosselin 등) (1993년 12월 9일 공개) 또는 WO 94/26764호 및 미국 특허 5,770,713(Imbach 등)에 개시된 방법에 따라 SATE [S-(아세틸-2-티오에틸)포스페이트] 유도체로서 제조된다.
용어 "제약학적으로 허용가능한 염"이란 본 발명의 화합물의 생리학적 및 제약학적으로 허용가능한 염을 가리키고; 다시말해서 모 화합물의 바람직한 생물학적 활성을 보유하는 염은 좋지 못한 독성 효과를 부여하지 않는다.
제약학적으로 허용가능한 염기 부가 염이 금속 또는 아민, 예컨대 알칼리 및 알칼리 토금속 또는 유기 아민과 함께 형성된다. 양이온으로서 사용되는 금속의 예는 소듐, 포타슘, 마그네슘, 칼슘 등이다. 적절한 아민의 예는 N,N'-디벤질에틸렌디아민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 디시클로헥실아민, 에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 및 프로카인 (예를들어, 문헌[Berge 등, "Pharmaceutical Salts", J. of Pharma Sci., 1977, 66, 1-19] 참조)이다. 여기에서 사용된 "제약학적 부가 염"은 본 발명의 조성물의 성분 중 하나의 산 형태의 제약학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 이들은 아민의 유기 또는 무기 산 염을 포함한다. 바람직한 산 염은 히드로클로라이드, 아세테이트, 살리실레이트, 니트레이트 및 포스페이트이다. 다른 적절한 제약학적으로 허용가능한 염은 당업자에게 잘 알려져 있고 무기 및 유기 산의 염기성 염을 포함한다.
올리고뉴클레오티드를 위하여, 제약학적으로 허용가능한 염의 바람직한 예는 이에 한정되지 않지만 (a) 소듐, 포타슘, 암모늄, 마그네슘, 칼슘, 폴리아민, 예컨대 스퍼민 및 스페르미딘 등과 같은 양이온과 형성된 염; (b) 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 질산 등과 같은 무기 산과 형성된 산 부가 염; (c) 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 글루콘산, 시트르산, 말산, 아스코르브산, 벤조산, 타닌산, 팔미트산, 알긴산, 폴리글루탐산, 나프탈렌술폰산, 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 나프탈렌디술폰산, 폴리갈락투론산 등과 같은 유기 산과 형성된 염; 및 (d) 염소, 브롬 및 요오드와 같은 원소 음이온으로부터 형성된 염을 포함한다.
제약학적 조성물 및 투여 경로
본 발명의 제약학적 조성물은 국소 또는 전신 처리가 요망되는지의 여부에 따라 그리고 치료되어지는 부위에 따라 여러 방법으로 투여될 수도 있다. 투여는 국소적 (안 투여 및 질 및 직장 전달을 포함한 점막 투여), 폐내 투여, 예를들어 분무기에 의한 것을 포함한 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 통기에 의한 투여 (호흡관내, 비내, 표피 및 경피); 경구 또는 비경구 투여일 수도 있다. 비경구 투여는 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내 또는 점막내 주사 또는 주입; 또는 두개골내, 예를들어 척수강내 또는 심실내 투여를 포함한다. 적어도 하나의 2'-O-메톡시에틸 변형을 가진 올리고뉴클레오티드가 경구 투여를 위해 특히 유용한 것으로 생각된다.
국소 투여를 위한 제약학적 조성물 및 제형은 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 드롭스, 좌약, 스프레이, 액체 및 분말을 포함할 수도 있다. 통상적인 제약학적 담체, 수성 분말 또는 유성 기재, 증점제 등이 필요할 수도 있거나 바람직할 수도 있다. 코팅된 콘돔, 글로브 등이 유용할 수도 있다. 바람직한 국소 제제는 본 발명의 올리고뉴클레오티드가 지질, 리포좀, 지방산, 지방산 에스테르, 스테로이드, 킬레이트화제 및 계면활성제와 같은 국소 전달제와 혼합되어진 것을 포함한다. 바람직한 지질 및 리포좀은 중성(예를들어, 디올레오일포스파티딜 DOPE 에탄올아민, 디미리스토일포스파디틸 콜린 DMPC, 디스테아로일포스파티딜 콜린), 음이온성(예, 디미리스토일포스파티딜 글리세롤 DMPG) 및 양이온성 (예, 디올레오일테트라메틸아미노프로필 DOTAP 및 디올레오일포스파티딜 에탄올아민 DOTMA)을 포함한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 리포좀 내에 캡슐화될 수도 있거나, 또는 리포좀, 특히 양이온성 리포좀과 착물을 형성할 수도 있다. 대안적으로, 올리고뉴클레오티드가 지질, 특히 양이온성 지질에 착물화될 수도 있다. 바람직한 지방산 및 에스테르는 이에 한정되지 않지만 아라키돈산, 올레산, 에이코사논산, 라우르산, 카프릴산, 카프르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 디카프레이트, 트리카프레이트, 모노올레인, 디라우린, 글리세릴 1-모노카프레이트, 1-도데실아자시클로헵탄-2-온, 아실카르니틴, 아실콜린 또는 C1 -10 알킬 에스테르 (예, 이소프로필미리스테이트 IPM), 모노글리세리드, 디글리세리드 또는 제약학적으로 허용가능한 염을 포함한다.
일부 구현양태에서, 올리고뉴클레오티드를 경구 투여 경로를 통해 피시험자에게 투여할 수도 있다. 본 발명의 피시험자는 동물을 포함한다. 동물 피시험자는 포유동물, 예컨대 생쥐, 쥐, 개, 기니아피그, 원숭이, 인간, 비-인간 영장류, 고양이 또는 돼지일 수도 있다. 비-인간 영장류는 원숭이 및 침팬지를 포함한다. 적절한 동물 피시험자는 실험 동물, 예컨대 생쥐, 쥐, 개, 비-인간 영장류, 고양이 또는 돼지일 수 있다.
일부 구현양태에서, 피시험자는 인간일 수도 있다. 특정한 구현양태에서, 환자는 여기에 더욱 상세히 언급된 것과 같이 인간 환자일 수도 있다. 특정한 구현양태에서, 인간 환자의 하나 이상의 유전자의 발현을 조절하는 것이 필요할 수도 있다. 일부 특정한 구현양태에서, 인간 환자의 하나 이상의 유전자의 발현을 억제하는 것이 필요할 수도 있다. 특정한 구현양태에서, 여기에 언급된 치료적 결과를 얻기 위하여 STAT3을 조절, 다시말해서 억제 또는 증진시키는 것이 필요할 수도 있다.
일부 구현양태에서, 본 발명에 따른 비-비경구적(예, 경구) 올리고뉴클레오티드 제제가 올리고뉴클레오티드의 생체이용성을 증진시킨다. 본 명세서에서, 용어 "생체이용성"은 약물을 전달하기 위해 특정한 투여 방식을 사용할 때 순환계 (예, 혈액, 특히 혈장)에 이르르는 투여된 약물의 분량을 측정하는 것을 가리킨다. 생체이용성의 증가는 다른 투여 방식에 비하여 피시험자의 말초 혈장에 올리고뉴클레오티드를 전달하는 특정 투여 방식의 능력을 가리킨다. 예를들어, 약물을 피시험자에게 도입하기 위해 비경구적 투여 방식(예, 경구 방식)이 사용될 때, 그 투여 방식의 생체이용성을 다른 투여 방식, 예를들어 정맥내 투여 방식과 비교할 수도 있다. 일부 구현양태에서, 비-비경구적 투여 후에 화합물의 혈장 농도 곡선 아래의 면적(AUC0)을 정맥내(i.v.) 투여 후의 약물 혈장 농도 곡선 아래의 면적(AUCiv)으로 나누어 무차원 몫 (상대적 생체이용성, RB)을 제공하고, 이것은 IV 경로에 비하여 비-비경구적 경로를 통해 흡수된 화합물의 비율을 나타낸다. 조성물의 생체이용성은, 첫번째 조성물의 상대적 생체이용성(RB1)이 두번째 조성물의 상대적 생체이용성(RB2)보다 클 때, 다른 조성물의 생체이용성에 비해 증진된 것으로 언급된다.
일반적으로, 약물의 궁극적인 작용 부위가 세포내이라 하더라도, 화합물의 치료 효과가 달성된 혈액 농도에 관련될 때 생체이용성은 치료 효능과 상관관계를 갖는다 [van Berge-Henegouwen 등, Gatroenterol., 1977, 73, 300]. 경구 투여 후에 약물의 말초 혈액 수준 변화를 측정함으로써 약물의 장내 흡수 정도를 결정하기 위해 생체이용성 연구가 사용되었다 [DiSanto, Chapter76 In:Remington's Pharmaceutical Sciences, 제18판, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton,PA, 1990, 1451-1458면].
일반적으로, 경구 조성물(올리고뉴클레오티드 포함) 생체이용성은, 그의 상대적 생체이용성이 순수한 올리고뉴클레오티드, 즉 침투 증진제가 부재하는 올리고뉴클레오티드로 실질적으로 구성된 조성물의 생체이용성보다 더 높을 때 "증진된" 것으로 언급된다.
기관 생체이용성은 기관 내에서 화합물의 농도를 가리킨다. 기관 생체이용성은 다수의 수단, 예컨대 전신 방사선사진에 의해 피시험자에서 측정될 수도 있다. 기관 생체이용성은, 여기에 더욱 상세히 언급되는 바와 같이, 올리고뉴클레오티드로의 변형에 의해, 하나 이상의 담체 화합물 또는 부형제의 사용에 의해 또는 기타 방법에 의해 개선, 예를들어 증진될 수 있다. 일반적으로, 생체이용성의 증가는 기관 생체이용성의 증가를 가져올 것이다.
본 발명에 따른 경구 올리고뉴클레오티드 조성물은 하나 이상의 "점막 침투 증진제" (또한 "흡수 증진제" 또는 간단히 "침투 증진제"라고 알려짐)를 포함할 수도 있다. 따라서, 본 발명의 일부 구현양태는 적어도 하나의 침투 증진제와 조합된 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일반적으로, 침투 증진제는 원하는 투여 방식과 결합된 점막(들), 예를들어 소장 상피 막을 가로질러 약물의 전달을 수월하게 하는 물질이다. 따라서, 올리고뉴클레오티드의 활성을 방해하지 않으면서 올리고뉴클레오티드의 흡수를 수월하게 하는 하나 이상의 침투 증진제를 선택하는 것이 바람직하고, 이러한 방식으로 독성, 자극 또는 알레르기 반응과 같은 허용될 수 없는 정도의 부작용 없이 올리고뉴클레오티드를 동물의 신체 내에 도입할 수 있다.
본 발명의 구현양태는 하나 이상의 제약학적으로 허용가능한 침투 증진제를 포함하는 조성물, 및 이러한 조성물의 사용 방법을 제공하며, 이는 비-비경구 투여 방식을 통해 투여된 올리고뉴클레오티드의 생체이용성을 개선시킨다. 종래, 특정한 약물의 생체이용성을 개선하기 위하여 특정한 침투 증진제가 사용되어 왔다. 문헌 [Muranishi, Crit.Rev.Ther. Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1] 및 [Lee 등, Crit.Rev.Ther. Drug Carrier Systems, 1991, 8, 91] 참조. 다수의 상이한 부류의 침투 증진제를 사용함으로써 심지어 비-비경구적 수단에 의해 투여될 때 올리고뉴클레오티드의 흡수 및 전달이 크게 개선될 수 있음을 알아내었다.
일부 구현양태에서, 비-비경구적 투여를 위한 조성물은 천연 올리고뉴클레오티드에 대한 하나 이상의 변형 (즉, 전체-포스포디에스테르 데옥시리보실 또는 전체-포스포디에스테르 리보실 올리고뉴클레오티드)을 포함한다. 이러한 변형은 결합 친화성, 뉴클레아제 안정성, 세포 또는 조직 침투성, 조직 분포, 또는 기타 생물학적 또는 약동학적 성질을 증가시킬 수도 있다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드 화학에 대해 여기에 상세히 기재된 바와 같이 염기, 링커 또는 당에 대해 변형을 행할 수도 있다. 본 발명의 일부 구현양태에서, 피시험자에 투여하기 위한 조성물, 특히 동물(인간 또는 비-인간) 피시험자에 투여하기 위한 경구 조성물은 친화성, 안정성, 조직 분포 또는 기타 생물학적 성질을 증진시키기 위한 하나 이상의 변형을 가진 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함할 것이다.
적절한 변형 링커는 포스포로티오에이트 링커를 포함한다. 본 발명에 따른 일부 구현양태에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 링커를 갖는다. 포스포로티오에이트 링커는 뉴클레아제 안정성 뿐만 아니라 올리고뉴클레오티드로의 혈장 단백질 결합 특징을 제공한다. 뉴클레아제 안정성은 올리고뉴클레오티드의 생체내 수명을 증가시키기 위해 유용한 반면, 혈장 단백질 결합은 신장 분비를 통한 올리고뉴클레오티드의 첫번째 통과 정화 속도를 감소시킨다. 본 발명에 따른 일부 구현양태에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 2개의 포스포로티오에이트 링커를 갖는다. 올리고뉴클레오티드가 실제로 n개의 뉴클레오시드를 갖는 일부 구현양태에서, 올리고뉴클레오티드는 1 내지 n-1개 포스포로티오에이트 결합을 갖는다. 올리고뉴클레오티드가 실제로 n개 뉴클레오시드를 갖는 일부 구현양태에서, 올리고뉴클레오티드는 n-1개 포스포로티오에이트 결합을 갖는다. 올리고뉴클레오티드가 실제로 n개 뉴클레오시드를 갖고, n이 짝수인 다른 구현양태에서, 올리고뉴클레오티드는 1 내지 n/2 포스포로티오에이트 결합을 갖거나, 또는 n이 홀수 일 때 1 내지 (n-1)/2 포스포로티오에이트 결합을 갖는다. 일부 구현양태에서, 올리고뉴클레오티드는 교대하는 포스포디에스테르(PO) 및 포스포로티오에이트(PS) 결합을 갖는다. 다른 구현양태에서, 올리고뉴클레오티드는 2 이상의 연속적인 PO 결합의 적어도 하나의 연장과 2 이상의 PS 결합의 적어도 하나의 연장을 갖는다. 다른 구현양태에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 PS 결합에 의해 중단된 PO 결합의 적어도 2개의 연장을 갖는다.
일부 구현양태에서, 뉴클레아제 안정성, 결합 친화성 또는 일부 다른 유리한 생물학적 성질을 당에 부여하는 변형에 의하여 뉴클레오시드의 적어도 하나가 리보실 당 단위 위에서 변형된다. 일부 경우에, 당 변형은 2'-변형을 포함하고, 예를들어 리보실 당의 2'-OH가 대체되거나 치환된다. 2'-OH를 위해 적절한 치환은 2'-F 및 2'-아라비노-F를 포함한다. OH를 위해 적절한 치환은 2'-O-알킬, 예를들어 2-O-메틸, 및 2'-O-치환된 알킬, 예를들어 2'-O-메톡시에틸, 2'-NH2, 2'-O-아미노프로필 등을 포함한다. 일부 구현양태에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 2'-변형을 함유한다. 일부 구현양태에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 2개의 2'-변형을 함유한다. 일부 구현양태에서, 올리고뉴클레오티드는 각각의 말단에서 적어도 하나의 2'-변형을 갖는다 (다시말해서, 3'- 및 5'-말단 뉴클레오시드는 동일하거나 상이한 2'-변형을 갖는다). 일부 구현양태에서, 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 각 말단에서 적어도 2개의 연속적인 2'-변형을 갖는다. 일부 구현양태에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 데옥시뉴클레오시드를 더욱 포함한다. 특정한 구현양태에서, 올리고뉴클레오티드는 데옥시뉴클레오시드의 연장을 포함하고, 따라서 연장은 올리고뉴클레오티드가 하이브리드형성될 수 있는 RNA의 RN아제(예, RN아제 H) 절단을 활성화할 수 있다. 일부 구현양태에서, RNA의 RN아제-매개 절단을 활성화할 수 있는 데옥시뉴클레오시드의 연장은 약 6 내지 약 16개, 예를들어 약 8 내지 약 16개 연속 데옥시뉴클레오시드를 포함한다. 추가의 구현양태에서, 올리고뉴클레오티드는 RNA:RNA 하이브리드에 작용하는 dsRN아제 효소에 의한 절단을 유도할 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 조성물은 이에 한정되지 않지만 정제, 캡슐, 액체 시럽, 연질 겔, 좌약 및 관장제와 같은 다양한 투여 형태로 제형될 수 있다. 용어 "영양 전달"은 예를들어 경구, 직장, 내시경 및 설하/구강 투여를 포함한다. 이러한 투여 방식을 위한 일반적인 요건은 소화 관의 일부 또는 전부 위에서의 흡수 및 이렇게 투여된 올리고뉴클레오티드 또는 그의 모방체의 효율적인 점막 통과이다.
구강 및 설하 투여의 경우에서와 같이 경구 점막을 통한 약물 전달은, 많은 경우에 약물의 혈장 농도의 더욱 빠른 상승을 포함하여, 몇가지 바람직한 특징을 갖는다 [Harvey, 제35장, In:Remington's Pharmaceutical Sciences, 제18판, Gennaro,ed., Mack Publishing Co., Easton,PA, 1990, 711면].
소화 관의 내부 부분에 직접 약물을 전달하기 위해 내시경법을 사용할 수도 있다. 예를들어, 내시경 역행 시스토판크레아토그래피(cystopancreatography) (ERCP)은 확장된 위경검사법의 장점을 갖고, 담즙관 및 췌장 도관에 선택적으로 접근할 수 있다 [Hirahata 등, Gan To Kagaku Ryoho, 1992, 19(10 Suppl.), 1591]. 리포좀 제제를 포함한 제약학적 조성물은 내시경 수단을 통하여 소화 관, 예컨대 십이지장의 일부 [Somogyi 등, Pharm.Res., 1995, 12, 49] 또는 위장 소점막[Akamo 등, Japanese J.Cancer Res. 1994, 85, 652]에 직접 전달될 수 있다. 제약학적 조성물의 직접적인 소화관 전달을 위하여 위장 세척 장치[Inoue 등, Artif.Organs, 1997, 21, 28] 및 경피 내시경 공급 장치 [Pennington 등, Ailment Pharmacol.Ther., 1995, 9, 471]가 사용될 수 있다.
일부 구현양태에서, 올리고뉴클레오티드 제제를 항문을 통해 직장 또는 하부 대장으로 투여할 수도 있다. 이러한 목적을 위하여 직장 좌약, 체류 관장제 또는 직장 카테터가 사용될 수 있고, 그 외의 방법으로 환자 순응성을 달성하는 것이 어려울 수도 있을 때 바람직할 수도 있다 (예를들어, 소아과 및 노인병 분야에서 또는 환자가 구토하거나 의식이 없을 때). 직장 투여는 경구 경로에 비해 더욱 신속하고 더욱 높은 혈액 수준을 가져올 수 있다 [Harvey, 제35장, In:Remington's Pharmaceutical Sciences, 제18판, Gennaro,ed., Mack Publishing Co., 미국 펜실바니아주 이스톤, 1990, 711면]. 직장으로부터 흡수된 약물의 약 50％가 간을 우회할 수도 있기 때문에, 이러한 경로에 의한 투여는 첫번째 통과 대사의 가능성을 상당히 감소시킨다 [Benet 등, 제1장, In:Goodman ＆ Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 제9판, Hardman 등, eds. MacGraw-Hill, 뉴욕 1996].
경구 올리고뉴클레오티드 조성물에 첨가될 수도 있는 다른 부형제는 계면활성제 (또는 "표면 활성제")를 포함한다. 이들은 수용액에 용해될 때 용액의 표면 장력을 감소시키거나 수용액과 다른 액체 간의 계면 장력을 감소시키는 화합물이고, 그 결과 소화 점막 및 기타 상피 막을 통한 올리고뉴클레오티드의 흡수가 증가된다. 담즙 염 및 지방산에 추가로, 계면활성제는 예를들어 소듐 라우릴 설페이트, 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르 및 폴리옥시에틸렌-20-세틸 에테르[Lee 등, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 92면]; 및 퍼플루오로화합물 에멀젼, 예컨대 FC-43 [Takahashi 등, J.Pharm.Pharmacol. 1988, 40, 252]을 포함한다.
침투 증진제로서 작용하고 본 발명의 조성물에서 사용될 수도 있는 지방산 및 그의 유도체는 예를들어 올레산, 라우르산, 카프르산 (n-데칸산), 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 디카프레이트, 트리카프레이트, 모노올레인 (1-모노올레오일-rac-글리세롤), 디라우린, 카프릴산, 아라키돈산, 글리세릴 1-모노카프레이트, 1-도데실아자시클로헵탄-2-온, 아실카르니틴, 아실콜린 및 모노- 및 디-글리세리드 및(또는) 생리학적으로 허용가능한 그의 염 (즉, 올레에이트, 라우레이트, 카프레이트, 미리스테이트, 팔미테이트, 스테아레이트, 리놀레이트 등)을 포함한다 [Lee 등, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1991, 제92면; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1: El-Hariri 등, J.Pharm.Pharmacol. 1992, 44, 651].
일부 구현양태에서, 경구 전달을 위한 올리고뉴클레오티드 조성물은 적어도 2개의 별개의 상을 포함하고, 이러한 상은 입자, 캡슐, 겔-캡슐, 미소구 등을 포함할 수도 있다. 각각의 상은 하나 이상의 올리고뉴클레오티드, 침투 증진제, 계면활성제, 생체부착제, 비등제, 또는 기타 아쥬반트, 부형제 또는 희석제를 함유할 수도 있다. 일부 구현양태에서, 하나의 상은 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 및 적어도 하나의 침투 증진제를 포함한다. 일부 구현양태에서, 첫번째 상은 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 및 적어도 하나의 침투 증진제를 포함하는 반면, 두번째 상은 적어도 하나의 침투 증진제를 포함한다. 일부 구현양태에서, 첫번째 상은 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 및 적어도 하나의 침투 증진제를 포함하는 반면, 두번째 상은 적어도 하나의 침투 증진제을 포함하고 실질적으로 올리고뉴클레오티드를 포함하지 않는다. 일부 구현양태에서, 적어도 하나의 상을 상의 내용물의 방출을 지연시키는 적어도 하나의 분해 지연제, 예컨대 코팅 또는 기질과 배합한다. 일부 구현양태에서, 첫번째 상은 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드, 적어도 하나의 침투 증진제를 포함하는 반면, 두번째 상은 적어도 하나의 침투 증진제 및 방출 지연제를 포함한다. 특정한 구현양태에서, 경구 올리고뉴클레오티드 조성물은 올리고뉴클레오티드 및 침투 증진제를 함유하는 입자를 포함한 첫번째 상과 방출-지연제로 코팅되고 침투 증진제를 함유하는 입자를 포함한 두번째 상을 포함한다.
다양한 종류의 담즙 염이 약물의 흡수 및 생체이용성을 촉진시키기 위한 침투 증진제로서 작용한다. 담즙의 생리학적 역할은 지질 및 지용성 비타민의 분산 및 흡수 촉진을 포함한다 [Brunton, Chapter 38, In: Goodman ＆ Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 제9판, Hardman 등, eds. McGraw-Hill, 뉴욕, 1996, 934-935면]. 다양한 천연 담즙 염 및 그들의 합성 유도체가 침투 증진제로서 작용한다. 따라서, 용어 "담즙 염"은 담즙의 천연 성분 뿐만 아니라 그들의 합성 유도체를 포함한다. 본 발명의 담즙 염은 예를들어 콜산(또는 그의 제약학적으로 허용가능한 나트륨 염, 소듐 콜레이트), 데히드로콜산 (소듐 데히드로콜레이트), 데옥시콜산(소듐 데옥시콜레이트), 글루콜산(소듐 글루콜레이트), 글리콜산(소듐 글리코콜레이트), 글리코데옥시콜산(소듐 글리코데옥시콜레이트), 타우로콜산(소듐 타우로콜레이트), 타우로데옥시콜산(소듐 타우로데옥시콜레이트), 케노데옥시콜산(CDCA, 소듐 케노데옥시콜레이트), 우르소데옥시콜산(UDCA), 소듐 타우로-24,25-디히드로-푸시데이트 (STDHF), 소듐 글리코디히드로푸시데이트 및 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르(POE)를 포함한다 [Lee 등, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 92면; Swinyard, 제319장, In:Remington's Pharmaceutical Sciences, 제18판, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA. 1990, 782-783면; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1; Yamamoto 등, J.Pharm.Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita 등, J.Pharm.Sci. 1990, 79, 579].
일부 구현양태에서, 본 발명의 침투 증진제는 침투 증진 화합물의 혼합물이다. 하나의 침투 혼합물은 카프르산 및(또는) 라우르산 또는 그의 염, 예를들어 소듐과의 UDCA (및(또는) CDCA)이다. 점막, 특히 소장 점막을 가로지른 생물학적 활성 물질의 전달을 증진시키기 위하여 이러한 혼합물이 유용하다. 다른 침투 증진제 혼합물은 5 내지 95％ 카프르산 및(또는) 라우르산과 약 5 내지 95％의 담즙산 또는 염(들) UDCA 및(또는) CDCA을 포함한다. 특별한 침투 증진제는 각각 약 1:2:2 비율의 UDCA의 나트륨염, 카프르산 및 라우르산의 혼합물이다. 다른 침투 증진제는 0.01:1 내지 1:0.01 비율(몰비)의 카프르산 및 라우르산(또는 그의 염)의 혼합물이다. 특별한 구현양태에서, 카프르산 및 라우르산이 예를들어 0.1:1 내지 약 1:0.1, 특히 약 0.5:1 내지 약 1:0.5의 몰비로 존재한다.
다른 부형제는 킬레이트화 제, 즉 그들과 착물을 형성함으로써 용액으로부터 금속 이온을 제거하는 화합물을 포함하고, 그 결과 소화관 및 기타 점막을 통한 올리고뉴클레오티드의 흡수가 증진된다. 본 발명에서 DNA-유사 올리고뉴클레오티드를 함유하는 조성물에서 침투 증진제로서의 용도에 관하여, 대부분의 특징화된 DNA 뉴클레아제가 촉매작용을 위한 2가 금속 이온을 필요로 하고 따라서 킬레이트화 제에 의해 억제되기 때문에, 킬레이트화 제는 DN아제 억제제로서 작용하는 추가의 장점을 갖는다 [Jarrett,J. Chromatogr., 1993, 618, 315]. 본 발명의 킬레이트화 제는 이에 한정되지 않지만 디소듐 에틸렌디아민테트라아세테이트(EDTA), 시트르산, 살리실레이트(예, 소듐 살리실레이트, 5-메톡시살리실레이트 및 호모바닐레이트), 콜라겐의 N-아실 유도체, 베타-디케톤의 라우레스-9 및 N-아미노 아실 유도체 (에나민)를 포함한다 [Lee 등, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 92면; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1; Burr 등, J.Control Rel., 1990, 14, 43].
여기에서 사용된 비-킬레이트화 비-계면활성제 침투 증진제는, 킬레이트화제로서 또는 계면활성제로서 중요하지 않은 활성을 갖지만, 그럼에도 불구하고 소화관 및 기타 점막을 통한 올리고뉴클레오티드의 흡수를 증진시키는 화합물로서 정의될 수도 있다 [Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1]. 이러한 부류의 침투 증진제는 이에 한정되지 않지만 불포화 고리형 우레아, 1-알킬- 및 1-알케닐아자시클로-알카논 유도체 [Lee 등, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 92면]; 및 비-스테로이드성 항염증 약제, 예컨대 디클로페낙 소듐, 인도메타신 및 페닐부타존 [Yamashita 등, J.Pharm.Pharmacol., 1987, 39, 621]을 포함한다.
세포 수준에서 올리고뉴클레오티드의 흡수를 증진시키는 약제를 본 발명의 제약학적, 치료적 및 기타 조성물에 첨가할 수도 있다. 예를들어, 리포펙틴TM과 같은 양이온성 지질 [Junichi 등, 미국 특허 5,705,188], 양이온성 글리세롤 유도체, 및 다양이온성 분자, 예컨대 폴리리신 [Lollo 등, PCT 출원 WO 97/30731]을 사용할 수 있다.
"제약학적 담체" 또는 "부형제"는 제약학적으로 허용가능한 용매, 현탁제 또는 동물에 하나 이상의 핵산을 전달하기 위한 다른 약리학적 불활성 담체일 수도 있다. 부형제는 액체 또는 고체일 수도 있고, 주어진 제약학적 조성물의 올리고뉴클레오티드 및 기타 성분과 조합될 때, 계획된 투여 방식에 따라 원하는 벌크, 점조도 등을 제공하기 위해 선택된다. 전형적인 제약학적 담체는 이에 한정되지 않지만 결합제 (예, 예비젤라틴화 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로스 등); 충진제 (예, 락토스 및 기타 당, 미세결정성 셀룰로스, 펙틴, 젤라틴, 황산칼슘, 에틸 셀룰로스, 폴리아크릴레이트 또는 인산수소칼슘 등); 윤활제 (예, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 실리카, 콜로이드성 이산화규소, 스테아르산, 금속성 스테아레이트, 수소첨가 식물성 유, 옥수수 전분, 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 등); 붕해제 (예, 전분, 소듐 전분 글리콜레이트, 엑스플로탭(EXPLOTAB)); 및 습윤제(예, 소듐 라우릴 설페이트 등)을 포함한다.
경구 올리고뉴클레오티드 조성물은 제약학적 조성물에서 일반적으로 발견되는 다른 아주반트 성분을 당 기술분야에 확립된 이용 수준으로 추가로 함유할 수도 있다. 예를들어, 조성물은 추가의 친화성 제약학적-활성 물질, 예를들어 항소양증제, 수렴제, 국소 마취제 또는 항염증제를 함유할 수도 있거나, 또는 본 발명의 조성물의 다양한 투여 형태를 물리적으로 제형하는데 유용한 추가의 물질, 예를들어 염료, 향료, 보존제, 항산화제, 불투명화제, 증점제 및 안정화제를 함유할 수도 있다. 그러나, 이러한 물질은 첨가될 때 본 발명의 조성물의 성분의 생물학적 활성을 과도하게 방해하지 않아야 한다.
비경구, 척수강내 또는 심실내 투여를 위한 조성물 및 제제는, 완충제, 희석제 및 이에 한정되지 않지만 침투 증진제, 담체 화합물 및 기타 제약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 같은 기타 적절한 첨가제를 함유할 수도 있는 무균 수용액을 포함할 수도 있다.
본 발명의 제약학적 조성물은 이에 한정되지 않지만 용액, 에멀젼 및 리포좀-함유 제제를 포함한다. 이러한 조성물은 이에 한정되지 않지만 미리형성된 액체, 자가-유화 고체 및 자가-유화 반고체를 포함하는 다양한 성분으로부터 생성될 수도 있다.
단위 투여 형태로 편리하게 존재할 수도 있는 본 발명의 제약학적 제제는 제약 산업에서 알려진 통상적인 기술에 따라 제조될 수 있다. 이러한 기술은 활성 성분을 제약학적 담체(들) 또는 부형제(들)과 결합하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 활성 성분을 액체 담체 또는 미세 분리된 고체 담체 또는 양쪽 모두와 균일하고 밀접하게 결합시킨 다음 필요하다면 생성물을 성형함으로써 제제가 제조된다.
본 발명의 조성물을 이에 한정되지 않지만 정제, 캡슐, 겔 캡슐, 액체 시럽, 연질 겔, 좌약, 및 관장제와 같은 많은 가능한 투여 형태로 제형할 수 있다. 본 발명의 조성물은 수성, 비-수성 또는 혼합 매질 중에서 현탁액으로서 제형될 수 있다. 수성 현탁액은 예를들어 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 소르비톨 및(또는) 덱스트란을 포함한 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 더욱 함유할 수도 있다. 현탁액은 안정화제를 더욱 함유할 수도 있다.
본 발명의 하나의 구현양태에서, 제약학적 조성물을 발포체로서 제형하고 사용할 수도 있다. 제약학적 발포체는 이에 한정되지 않지만 에멀젼, 마이크로에멀젼, 크림, 젤리 및 리포좀과 같은 제형을 포함한다. 기본적으로 성질이 유사하지만, 이러한 제형들은 성분 및 최종 제품의 농도가 다양하다. 이러한 조성물 및 제제의 제조는 제약 및 제제 기술분야의 숙련가에게 알려져 있고, 본 발명의 조성물의 제제에 적용할 수도 있다.
에멀젼
본 발명의 조성물을 에멀젼으로서 제조하고 제형할 수도 있다. 에멀젼은 전형적으로 0.1㎛ 초과의 직경을 가진 방울의 형태로 다른 형태에 분산된 하나의 액체의 불균일 계이다 [Idson, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.) 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, volume 1, 199면; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York NY, Volume 1, 245면; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker,Inc., New York, NY, volume 2, 335면; Higuchi 등, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985, p301]. 에멀젼은 서로 긴밀하게 혼합되고 분산된 2개의 불혼화성 액체 상을 포함하는 이상 계이다. 일반적으로, 에멀젼은 유중수(w/o) 또는 수중유(o/w) 종류일 수도 있다. 수성 상이 미세 분리되고 벌크 오일 상에 미세한 방울로서 분산될 때, 얻어지는 조성물은 유중수(w/o) 에멀젼이라 불리운다. 대안적으로, 오일 상이 작은 방울로 미세하게 분리되고 벌크 수성상 내에 분산될 때, 얻어지는 조성물은 유중수(o/w) 에멀젼이라 불리운다. 에멀젼은 분산된 상에 추가로 추가의 성분 및 수성 상, 유성 상 또는 그 자체에서 분리된 상으로서 용액으로 존재할 수도 있는 활성 약물을 함유할 수도 있다. 유화제, 안정화제, 염료 및 산화방지제와 같은 제약학적 부형제가 필요에 따라 에멀젼에 존재할 수도 있다. 제약학적 에멀젼은 2 이상의 상으로 이루어진 다중 에멀젼, 예를들어 유중수중유(o/w/o) 및 수중유중수(w/o/w) 에멀젼일 수도 있다. 이러한 복합 제제는 단순한 이원 에멀젼이 갖지 않는 특정한 장점을 제공한다. o/w 에멀젼의 각각의 오일 방울이 작은 물방울을 에워싸고 있는 다중 에멀젼은 w/o/w 에멀젼을 구성한다. 유사하게, 오일 연속 상에서 안정화된 물 방울에 에워싸인 오일 방울의 계는 o/w/o 에멀젼을 제공한다.
종종, 에멀젼의 분산 또는 불연속 상을 외부 또는 연속 상 내에 분산시키고, 유화제의 수단 또는 제제의 점도를 통해 이러한 형태에 유지시킨다. 에멀젼-유형 연고 기재 및 크림의 경우에서와 같이, 에멀젼의 상의 어느 하나는 반고체 또는 고체일 수도 있다. 에멀젼을 안정화시키는 다른 수단은 에멀젼의 어느 하나의 상에 혼입될 수도 있는 에멀젼을 사용하는 것이다. 유화제는 크게 4개 범주로 분류된다: 합성 계면활성제, 천연 유화제, 흡수 기재 및 미세 분산 고체 [Idson, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker,Inc. New York. NY. volume 1, 199면].
표면 활성제로서 알려진 합성 계면활성제는 에멀젼의 제제에서 넓은 응용성을 갖고, 문헌에 검토되어 있다 [Rieger, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.) 1988, Marcel Dekker, Inc. New York, NY, volume 1, 285면; Idson, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.) Marcel Dekker, Inc. New York, NY, 1988, volume 1, 199면]. 계면활성제는 전형적으로 친양쪽성이고, 친수성 및 소수성 부위를 포함한다. 계면활성제의 친수성 대 소수성 성질의 비율은 친수성/친유성 밸런스(HLB)로 명명되고 제제의 제조시에 계면활성제를 분류 및 선택하는데 있어서 중요한 도구이다. 계면활성제는 친수성 기의 성질을 기준으로 하여 상이한 부류로 분류될 수 있다: 비이온성, 음이온성, 양이온성 및 양쪽성 [Rieger, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman Rieger and Banker(Eds), 1988, Marcel Dekker,Inc. New York, NY, Volume 1, p.285].
에멀젼 제제에서 사용되는 천연 유화제는 라놀린, 밀랍, 포스파티드, 레시틴 및 아라비아고무를 포함한다. 흡수 기재는 친수성 성질을 가지며, 따라서 이들은 물을 빨아들여서 w/o 에멀젼을 형성할 수 있고 그들의 반고체 농도, 예컨대 무수 라놀린 및 친수성 페트로라텀을 보유한다. 미세 분리된 고체는 계면활성제와 조합하여 점성 제제에서 양호한 유화제로서 사용되었다. 이들은 극성 무기 고체, 예컨대 중금속 수산화물, 비팽윤성 점토, 예컨대 벤토나이트, 아타펄기트, 헥토라이트, 카올린, 몬트모릴로나이트, 콜로이드성 알루미늄 실리케이트 및 콜로이드성 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 안료 및 비극성 고체, 예컨대 탄소 또는 글리세릴 트리스테아레이트를 포함한다.
많은 종류의 비-유화 물질이 에멀젼 제제에 포함되고 에멀젼의 성질에 기여한다. 이들은 지방, 오일, 왁스, 지방산, 지방 알콜, 지방 에스테르, 습윤제, 친수성 콜로이드, 보존제 및 산화방지제를 포함한다 [Block, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker,Inc. New York. NY, Volume 1, 335면; Idson, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker,Inc. NewYork, NY, Volume 1, p199].
친수성 콜로이드 또는 히드로콜로이드는 천연 고무 및 합성 중합체, 예컨대 다당류 (예를들어, 아라비아 고무, 한천, 알긴산, 카라기난, 구아 고무, 카라야 고무 및 트라가칸트), 셀룰로스 유도체(예를들어, 카르복시메틸셀룰로스 및 카르복시프로필셀룰로스), 및 합성 중합체(예를들어, 카르보머, 셀룰로스 에테르 및 카르복시비닐 중합체)를 포함한다. 이들은 물에 분산되거나 팽윤되어, 분산된 상 방울 주위에 강력한 계면 필름을 형성하고, 외부 상의 점도를 증가시킴으로써 에멀젼을 안정화시키는 콜로이드 용액을 형성한다.
에멀젼은 종종 미생물의 성장을 쉽게 뒷받침할 수도 있는 다수의 성분, 예컨대 탄수화물, 단백질, 스테롤 및 포스파티드를 함유하기 때문에, 이러한 제제는 종종 보존제를 포함한다. 에멀젼 제제에 포함된 일반적으로 사용되는 보존제는 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 4급 암모늄 염, 벤즈알코늄 클로라이드, p-히드록시벤조산의 에스테르 및 붕산을 포함한다. 제제의 열화를 막기 위하여 산화방지제가 에멀젼 제제에 일반적으로 첨가된다. 사용된 산화방지제는 자유 라디칼 스캐빈져, 예컨대 토코페롤, 알킬 갈레이트, 부틸화 히드록시아니졸, 부틸화 히드록시톨루엔, 또는 환원제, 예컨대 아스코르브산 및 소듐 메타비설파이트, 및 산화방지제 효력상승제, 예컨대 시트르산, 타르타르산 및 레시틴을 포함한다.
피부, 경구 및 비경구 경로를 통한 에멀젼 제제의 적용 및 그의 제조 방법이 문헌[Idson, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.) 1988, Marcel Dekker,Inc. New York, N.Y. Volume 1, 199면]에 검토되어 있다. 제형 용이성, 흡수 효율 및 생체이용성 관점의 이유 때문에, 경구 전달을 위한 에멀젼 제제가 널리 사용되었다 [Rosoff, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds), 1988, Marcel Dekker,Inc. New York, NY, volume 1, 245면; Idson, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds), 1988, Marcel Dekker,Inc. New York, NY, volume 1, 199면]. o/w 에멀젼으로서 일반적으로 경구 투여되는 물질 중에 광물유 기재 하제, 지용성 비타민 및 고 지방 영양 제제가 있다.
본 발명의 하나의 구현양태에서, 올리고뉴클레오티드의 조성물이 마이크로에멀젼으로 제형된다. 마이크로에멀젼은 단일 광학 등방성이고 열역학적으로 안정한 액체 용액인 수성계, 유성계 및 양쪽성계로서 정의될 수도 있다 [Rosoff, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds), 1988, Marcel Dekker,Inc. New York, NY, volume 1, 245면]. 전형적으로 마이크로에멀젼은 오일을 계면활성제 수용액에 먼저 분산시킨 다음 충분한 양의 네번째 성분, 일반적으로 중간 사슬 길이 알콜을 첨가하여 투명한 계를 형성함으로써 제조되는 계이다. 따라서, 마이크로에멀젼은, 표면-활성 분자의 계면 필름에 의해 안정화되는, 2개의 불혼화성 액체의 열역학적으로 안정하고 균등하게 투명한 분산액으로서 기재되어 있다 [Leung and Shah, in:Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, 185-215면]. 마이크로에멀젼은 오일, 물, 계면활성제, 공동계면활성제 및 전해질을 포함하는 3 내지 5개 성분의 조합을 통해 제조된다. 마이크로에멀젼이 유중수(w/o) 또는 수중유(o/w) 유형인지의 여부는, 사용되는 오일 및 계면활성제의 성질 및 계면활성제 분자의 극성 헤드와 탄화수소 꼬리의 기하학적 패킹에 의존된다 [Schott, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton,PA, 1985, p271].
상 다이아그램을 이용하는 현상학적 접근이 광범위하게 연구되어 왔으며, 마이크로에멀젼을 어떻게 제형하는지에 관해 당업자에게 포괄적인 지식을 제공하였다 [Rosoff, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.) 1988, Marcel Dekker, Inc. New York, NY, volume 1, 245면; Block, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker,Inc., New York, NY, volume 1, 335면]. 통상적인 에멀젼에 비하여, 마이크로에멀젼은 자발적으로 형성된 열역학적으로 안정한 방울의 형성에서 수-불용성 약물을 가용화시키는 장점을 제공한다.
마이크로에멀젼의 제조에서 사용되는 계면활성제는, 이에 한정되지 않지만 이온성 계면활성제, 비-이온성 계면활성제, 브리즈(Brij) 96, 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르, 폴리글리세롤 지방산 에스테르, 테트라글리세롤 모노라우레이트(ML310), 테트라글리세롤 모노올레에이트(MO310), 헥사글리세롤 모노올레에이트(PO310), 헥사글리세롤 펜타올레에이트(PO500), 데카글리세롤 모노카프레이트(MCA750), 데카글리세롤 모노올레에이트(MO750), 데카글리세롤 세퀴올레에이트(SO750), 데카글리세롤 데카올레에이트(DAO750)의 단독 또는 공동계면활성제와의 조합을 포함한다. 계면활성제 분자 중에서 발생된 빈 공간 때문에, 보통 단쇄 알콜, 예컨대 에탄올, 1-프로판올 및 1-부탄올과 같은 공동계면활성제는 계면활성제 필름 내로 침투하고 그 결과 혼란된 필름을 생성함으로써 계면 유동성을 증가시키는 역할을 한다. 그러나, 공동계면활성제을 사용하지 않고도 마이크로에멀젼이 제조될 수도 있고, 무-알콜 자기-유화 마이크로에멀젼이 당 기술분야에 공지되어 있다. 수성 상은 전형적으로 이에 한정되지 않지만 물, 약물, 글리세롤, PEG300, PEG400, 폴리글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 에틸렌 글리콜의 유도체의 수용액일 수도 있다. 오일상은 이에 한정되지 않지만 카프텍스(Captex) 300, 카프텍스 355, 카프멀 MCM, 지방산 에스테르, 중 사슬(C8-C12) 모노, 디 및 트리-글리세리드, 폴리옥시에틸화 글리세릴 지방산 에스테르, 지방 알콜, 폴리글리콜화 글리세리드, 포화 폴리글리콜화 C8-C10 글리세리드, 식물성 유 및 실리콘 유를 포함할 수도 있다.
마이크로에멀젼은 약물 가용화 및 약물 흡수 증가의 관점에서 특히 중요하다. 지질 기재 마이크로에멀젼(o/w 및 w/o)은 펩티드와 같은 약물의 경구 생체이용성을 증진시키는 것으로 제안되었다 [Constantinides 등, Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel,Meth.Find.Exp.Clin.Pharmacol., 1993, 13, 205]. 마이크로에멀젼은 약물 가용화 개선, 효소적 가수분해로부터 약물의 보호, 막 유동성 및 투과성에서 계면활성제-유도 변화에 기인한 약물 흡수 증가, 제조 용이성, 고체 투여 형태에 비해 경구 투여의 용이성, 임상적 효능 개선, 및 독성 저하 등의 장점을 제공한다 [Constantinides 등, Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho 등, J.Pharm.Sci., 1996, 85, 138-143]. 종종, 이들의 성분이 주변 온도에서 함께 주어질 때 마이크로에멀젼이 자발적으로 형성할 수도 있다. 이것은 열불안정성 약물, 펩티드 또는 올리고뉴클레오티드를 제형할 때 특히 유리할 수도 있다. 마이크로에멀젼은 화장품 및 제약 적용 양쪽모두에서 활성 성분의 경피 전달에 효과적이었다. 본 발명의 마이크로에멀젼 조성물 및 제제는 위장관으로부터 올리고뉴클레오티드의 전신 흡수의 증가를 촉진할 뿐만 아니라 위장관, 질, 구강 및 기타 투여 부위 내에서 올리고뉴클레오티드의 국소 세포내 흡수를 개선시킬 것으로 기대된다.
본 발명의 마이크로에멀젼은 제제의 성질을 개선시키고 본 발명의 올리고뉴클레오티드 및 핵산의 흡수를 증진시키기 위하여 추가의 성분 및 첨가제, 예컨대 소르비탄 모노스테아레이트(그릴 3), 라브라졸 및 침투 증진제를 함유할 수도 있다. 본 발명의 마이크로에멀젼에서 사용된 침투 증진제는 5개의 넓은 부류 - 계면활성제, 지방산, 담즙염, 킬레이트화 제, 및 비-킬레이트화 비-계면활성제 중의 하나에 속하는 것으로 분류될 수도 있다 [Lee 등, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92]. 이러한 부류의 각각은 상기에 언급되어 있다.
리포좀
약물의 제형에서 연구되고 사용되는 마이크로에멀젼 이외에 다수의 조직화된 계면활성제 구조가 존재한다. 이들은 단층, 교질입자, 이층 및 소포체를 포함한다. 리포좀과 같은 소포체는 약물 전달의 관점에서 제공하는 특이성 및 작용 지속성 때문에 많은 관심을 끈다. 본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 "리포좀"은 구형 이층 또는 이층들에 배열된 양쪽성 지질로 이루어진 소포체를 의미한다.
리포좀은 친유성 물질 및 수성 내부로부터 형성된 막을 가진 단층 또는 다층 부형제이다. 수성 부분은 전달되어지는 조성물을 함유한다. 양이온성 리포좀은 세포벽에 융합할 수 있는 장점을 갖는다. 세포벽과 효율적으로 융합할 수 없긴 하지만, 비-양이온성 리포좀은 생체내에서 대식구에 의해 섭취된다.
본래의 포유동물 피부를 가로지르기 위하여, 지질 소포제는 적절한 경피 구배의 영향하에서 각각 50nm 미만의 직경을 가진 일련의 미세한 공극을 통해 통과되어야 한다. 따라서, 고 변형성이고 미세한 공극을 통해 통과할 수 있는 리포좀을 사용하는 것이 바람직하다.
리포좀의 추가의 장점은, 천연 인지질로부터 수득된 리포좀이 생체친화성이고 생체분해성이며; 리포좀이 넓은 범위의 수용성 및 지용성 약물을 포함할 수 있고; 리포좀이 그들의 내부 격막에 있는 캡슐화된 약물을 대사 및 분해로부터 보호할 수 있음을 포함한다 [Rosoff, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, volume 1, p.245]. 리포좀 제제의 제조에서 중요한 고려사항은 지질 표면 전하, 소포체 크기 및 리포좀의 수성 부피이다.
리포좀은 활성 성분을 작용 부위에 전달하기 위해 유용하다. 리포좀 막은 생물학적 막과 구조적으로 유사하기 때문에, 리포좀을 조직에 적용할 때 리포좀은 세포 막과 합쳐지기 시작한다. 리포좀과 세포의 합체가 진행됨에 따라, 리포좀 내용물이 세포 안으로 옮겨지고, 이곳에서 활성제가 작용할 수 있다.
리포좀 제제는 많은 약물의 전달 방식으로서 광범위한 연구에서 집중을 받았다. 국소 투여를 위하여, 리포좀은 기타 제제에 비해 몇가지 장점을 나타낸다는 증거가 존재한다. 이러한 장점은 투여된 약물의 높은 전신 흡수, 원하는 표적에서 투여된 약물의 축적 증가, 및 친수성 및 소수성의 넓은 범위의 약물을 피부에 투여하는 능력에 관련된 감소된 부작용을 포함한다.
몇가지 기록은 고 분자량 DNA를 포함한 약제를 피부 내에 전달하기 위한 리포좀의 능력을 상세히 보고하고 있다. 진통제, 항체, 호르몬 및 고분자량 DNA를 포함한 화합물을 피부에 투여하였다. 다수의 적용이 윗쪽 표피를 표적으로 한다.
리포좀은 2개의 넓은 부류에 속하고, DNA, RNA 또는 다른 핵산-기재 구조물의 전달을 위해 유용하다. 양이온성 리포좀은 양 전하를 띤 리포좀이고, 음 전하를 띤 DNA 분자와 상호작용하여 안정한 착물을 형성한다. 양 전하를 띤 DNA/리포좀 착물이 음 전하를 띤 세포 표면에 결합하고 엔도좀에서 내재화된다. 엔도좀 내부의 산성 pH로 인하여, 리포좀이 파괴되어 그들의 내용물을 세포 세포질로 방출한다 [Wang 등, Biochem.Biophys.Res.Commun. 1987, 147, 980-985].
pH-감수성 또는 음 전하를 띤 리포좀은 DNA와 착물을 형성한다기 보다 DNA를 포획한다. DNA와 지질이 유사하게 전하를 띠기 때문에, 착물 형성보다는 반발이 일어난다. 그럼에도 불구하고, 일부 DNA가 이러한 리포좀의 수성 내부 내에 포획된다. 티미딘 키나아제 유전자를 코드화하는 DNA를 배양액에서 세포 단층에 전달하기 위하여 pH-감수성 리포좀이 사용되어 왔다. 외인성 유전자의 발현이 표적 세포에서 검출되었다 [Zhou 등, Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274].
리포좀 조성물의 주요한 유형은 천연-유래 포스파티딜콜린 이외의 인지질을 포함한다. 중성 리포좀 조성물은 예를들어 디미리스토일 포스파티딜콜린(DMPC) 또는 디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC)로부터 형성될 수 있다. 음이온성 리포좀 조성물은 일반적으로 디미리스토일 포스파티딜글리세롤로부터 형성되는 반면, 음이온성 푸소겐 리포좀은 주로 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE)으로부터 형성된다. 다른 유형의 리포좀 조성물은 포스파티딜콜린(PC), 예를들어 대두 PC 및 계란 PC로부터 형성된다. 다른 유형은 인지질 및(또는) 포스파티딜콜린 및(또는) 콜레스테롤의 혼합물로부터 형성된다.
몇 가지 연구들은 리포좀 약물 제제를 피부에 국소 전달하는 것을 평가하였다. 인터페론을 함유하는 리포좀을 기니아 피그 피부에 적용하면, 피부 헤르페스 상처를 감소시키는 반면, 다른 수단을 통해 인터페론을 전달(예를들어 용액 또는 에멀젼으로서)하는 것은 효과가 없었다 [Weiner 등, Journal of Drug Targeting, 1992 2, 405-410]. 또한, 추가의 연구는, 수성 계를 사용하여 인터페론의 투여에 리포좀 제제의 일부로서 투여된 인터페론의 효능을 시험하였으며, 리포좀 제제가 수성 투여에 비해 뛰어나다는 결론을 내렸다 [du Plessis 등, Antiviral Research, 1992, 18, 259-265].
피부에 약물, 특히 비-이온성 계면활성제 및 콜레스테롤을 포함한 체계를 전달하는 것의 유용성을 결정하기 위하여, 비-이온성 리포좀 체계를 시험하였다. 생쥐 피부 내에 시클로스포린-A를 전달하기 위하여, 노바좀(Novasome)TM I (글리세릴 디라우레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르) 및 노바좀TM II (글리세릴 디스테아레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르)를 포함하는 비-이온성 리포좀 제제를 사용하였다. 결과는, 피부의 상이한 층 안에 시클로스포린-A의 침착을 촉진함에 있어서 이러한 비-이온성 리포좀 체계가 효과적임을 나타내었다 [Hu 등, S.T.P.Pharma.Sci., 1994, 4, 6, 466].
리포좀은 "입체적으로 안정화된" 리포좀을 포함하였으며, 여기에서 사용된 이들의 용어는 리포좀 내에 혼입될 때 특정한 지질이 결여된 리포좀에 비하여 순환 수명을 증가시키는 하나 이상의 특정한 지질을 포함하는 리포좀을 가리킨다. 입체적으로 안정화된 리포좀의 예는 , 리포좀의 소포체-형성 지질 부분의 일부가 (A) 하나 이상의 당지질, 예컨대 모노시알로강글리오시드 GM1을 포함하거나, 또는 (B) 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 잔기와 같은 하나 이상의 친수성 중합체와 유도체화된 리포좀이다. 어떠한 특정한 이론에 의해서도 구속되기를 원하지 않지만, 적어도 강글리오시드, 스핑고마이엘린 또는 PEG-유도체화 지질을 함유하는 입체적으로 안정화된 리포좀을 위하여, 입체적으로 안정화된 리포좀의 순환 수명의 증가는 망상내피 체계(RES)의 세포 내로의 흡수 감소로부터 유래된다는 것이 당 기술분야에 교시되어 있다 [Allen 등, FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu 등, Cancer Research, 1993, 53, 3765].
하나 이상의 당지질을 포함하는 다양한 리포좀이 당 기술분야에 공지되어 있다. 파파하조폴로스(Papahadjopoulos) 등 [Ann.N.Y.Acad.Sci. 1987, 507, 64]은 리포좀의 혈액 반감기를 개선시키기 위한 모노시알로강글리오시드 GM1, 갈락토세레브로시드 설페이트 및 포스파티딜리노시톨의 능력을 보고하였다. 이러한 연구결과는 가비존(Gabizon) 등에 의해 해설되었다 [Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 1988, 85, 6949]. 미국 특허 4,837,028호 및 WO 88/04924호 (Allen 등)는 (1)스핑고마이엘린 및 (2) 강글리오시드 GM1 또는 갈락토세레브로시드 설페이트 에스테르를 포함하는 리포좀을 개시하고 있다. 미국 특허 5,543,152호 (Webb 등)는 스핑고마이엘린을 포함한 리포좀을 개시하고 있다. 1,2-sn-디미리스토일포스파티딜콜린을 포함하는 리포좀은 WO 97/13499 (Lim 등)에 개시되어 있다.
하나 이상의 친수성 중합체로 유도체화된 지질을 포함하는 다수의 리포좀, 및 그의 제조 방법이 당 기술분야에 공지되어 있다. 스나모또(Sunamoto) 등 [Bull.Chem.Soc.Jpn. 1980, 53, 2778]은 PEG 잔기를 함유하는 비이온성 세제, 2C1215G을 포함한 리포좀을 기재하고 있다. 일럼(Illum) 등 [FEBS Lett. 1984, 167, 79]은 폴리스티렌 입자를 중합체 글리콜로 친수성 코팅하면 혈액 반감기가 현저히 증가한다는 것을 주목하였다. 폴리알킬렌 글리콜(예, PEG)의 카르복실 기의 부착에 의해 개질된 합성 인지질은 문헌[미국 특허 4,426,330호 및 4,534,899호, Sears]에 기재되어 있다. 클리바노브(Klibanov) 등 [FEBS Lett., 1990, 268, 235]은, PEG 또는 PEG 스테아레이트로 유도체화된 포스파티딜에탄올아민(PE)을 포함하는 리포좀이 혈액 순환 반감기에서 상당한 증가를 갖는다는 것을 증명하는 실험을 기재하고 있다. 문헌 [Blume 등, Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91]은, 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE) 및 PEG의 조합으로부터 형성된, 다른 PEG-유도체화 인지질, 예를들어 DSPE-PEG에 대한 관찰을 확대하였다. 그들의 외부 표면 위에서 공유 결합된 PEG 잔기를 가진 리포좀이 유럽 특허 EP 0 445 131 B1 및 WO 90/04384호 (Fisher)에 기재되어 있다. PEG로 유도체화된 PE의 1 내지 20몰％를 함유하는 리포좀 조성물 및 그의 사용 방법은 문헌 [Woodle 등, 미국 특허 5,013,556호 및 5,356,633호] 및 Martin 등 [미국 특허 5,213,804호 및 유럽 특허 EP 0 496 813B1]에 의해 기재되었다. 다수의 기타 지질-중합체 접합체를 포함하는 리포좀은 WO 91/05545 및 미국 특허 5,225,212 (양쪽 모두 Martin 등) 및 WO 94/20073호 (Zalipsky 등)에 기재되어 있다. PEG-개질 세라미드 지질을 포함하는 리포좀은 WO 96/10391호(Choi 등)에 기재되어 있다. 미국 특허 5,540,935호 (Miyazaki 등) 및 5,556,948호 (Tagawa 등)는 표면 위에서 작용 잔기로 더욱 유도체화될 수 있는 PEG-함유 리포좀을 기재하고 있다.
WO 96/40062호(Thierry 등)는, 리포좀 내에서 고 분자량 핵산을 캡슐화하기 위한 방법을 개시하고 있다. 미국 특허 5,264,221호(Tagawa 등)는 단백질-결합된 리포좀을 개시하고 있으며, 이러한 리포좀의 내용물이 안티센스 RNA를 포함할 수도 있음을 주장하고 있다. 미국 특허 5,665,710호(Rahman 등)는 리포좀 내에서 올리고데옥시뉴클레오티드를 캡슐화하는 방법을 기재하고 있다. WO 97/04787호 (Love 등)는 raf 유전자로 표적화된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 리포좀을 개시하고 있다.
트랜스퍼좀은 또 다른 유형의 리포좀이고, 약물 전달 소포체를 위한 매력적인 후보인 고 변형성 지질 응집체이다. 트랜스퍼좀은 고 변형성이어서 작은 방울보다 작은 공극을 통해 쉽게 침투할 수 있는 지질 방울로서 설명될 수도 있다. 트랜스퍼좀은 이들이 사용되는 환경에 적용할 수 있고, 예를들어 이들은 자기-최적화되고 (피부에서 공극의 형태에 적응하고), 자기-회복되고, 단편화없이 그의 표적에 이르르고, 종종 자기-부하된다. 트랜스퍼좀을 형성하기 위하여, 표면 경계-활성화제, 통상 계면활성제를 표준 리포좀 조성물에 첨가할 수 있다. 피부에 혈청 알부민을 전달하기 위하여 트랜스퍼좀이 사용되었다. 혈청 알부민의 트랜스퍼좀-매개 전달은 혈청 알부민을 함유하는 용액의 피하 주사로서 효과적임이 밝혀졌다.
계면활성제는 에멀젼(마이크로에멀젼 포함) 및 리포좀과 같은 제제에서 넓은 응용을 갖는다. 많은 상이한 유형의 계면활성제(천연 및 합성 양쪽 모두)의 성질을 분류하고 평가하는 가장 일반적인 방법은 친수성/친유성 밸런스(HLB)를 사용하는 것이다. 친수성 기 (또한 "헤드"로서 알려짐)의 성질은 제제에서 사용되는 상이한 계면활성제를 분류하기 위해 가장 유용한 수단을 제공한다 [Rieger, Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker,Inc., New York, NY, 1988, p.285].
계면활성제 분자가 이온화되지 않는다면, 이것은 비이온성 계면활성제로서 분류된다. 비이온성 계면활성제는 제약 및 화장품에서 넓은 응용을 갖고, 넓은 범위의 pH 값에 걸쳐 이용가능하다. 일반적으로, 이들의 HLB 값은 그들의 구조에 의존하여 2 내지 18의 범위이다. 비이온성 계면활성제는 에틸렌 글리콜 에스테르, 프로필렌 글리콜 에스테르, 글리세릴 에스테르, 폴리글리세릴 에스테르, 소르비탄 에스테르, 슈크로스 에스테르 및 에톡시화 에스테르와 같은 비이온성 에스테르를 포함한다. 비이온성 알칸올아미드 및 에테르, 예컨대 지방 알콜 에톡실레이트, 프로폭시화 알콜 및 에톡시화/프로폭시화 블록 중합체가 이 부류에 포함된다. 폴리옥시에틸렌 계면활성제는 비이온성 계면활성제 부류의 가장 유망한 요소이다.
계면활성제 분자가 물에 용해 또는 분산될 때 음전하를 띤다면, 계면활성제가 음이온성으로서 분류된다. 음이온성 계면활성제는 비누, 아실 락틸레이트, 아미노산의 아실 아미드, 황산의 에스테르, 예컨대 알킬 설페이트 및 에톡시화 알킬 설페이트, 술포네이트, 예컨대 알킬 벤젠 술포네이트, 아실 이세티오네이트, 아실 타우레이트 및 술포숙시네이트, 및 포스페이트를 포함한다. 음이온성 계면활성제 부류의 가장 중요한 요소는 알킬 설페이트 및 비누이다.
계면활성제 분자가 물에 용해 또는 분산될 때 양 전하를 띤다면 계면활성제는 양이온성으로 분류된다. 양이온성 계면활성제는 4급 암모늄 염 및 에톡시화 아민을 포함한다. 4급 암모늄 염은 이 부류의 가장 많이 사용되는 요소이다.
계면활성제 분자가 양 전하 또는 음 전하를 띠는 능력을 갖는다면, 계면활성제가 양쪽성으로서 분류된다. 양쪽성 계면활성제는 아크릴산 유도체, 치환된 알킬아미드, N-알킬베타인 및 포스파티드를 포함한다.
약물 제품, 제제 및 에멀젼에서 계면활성제의 사용이 검토되었다 [Rieger, Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker,Inc. New York, NY 1988, p285].
본 발명의 조성물을 제형하기 위해, 핵산과 유해하게 반응하지 않는 비-경구적 투여를 위해 적절한 제약학적으로 허용가능한 유기 또는 무기 부형제가 사용될 수 있다. 적절한 제약학적으로 허용가능한 담체는, 이에 한정되지 않지만 물, 염 용액, 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토스, 아밀로스, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 규산, 점성 파라핀, 히드록시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈 등을 포함한다.
핵산의 국소 투여를 위한 제제는 살균 및 비-살균 수용액, 알콜과 같은 일반적인 용매 중의 비-수용액, 또는 액체 또는 고체 오일 기재 중의 핵산의 용액을 포함할 수도 있다. 용액은 완충제, 희석제 및 기타 적절한 첨가제를 함유할 수도 있다. 핵산과 해롭게 반응하지 않는 비-비경구적 투여를 위해 적절한 제약학적으로 허용가능한 유기 또는 무기 부형제를 사용할 수도 있다.
적절한 제약학적으로 허용가능한 부형제는, 이에 한정되지 않지만 물, 염 용액, 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토스, 아밀로스, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 규산, 점성 파라핀, 히드록시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈 등을 포함한다.
맥동성 전달
본 발명의 화합물은 맥동성 전달에 의해 투여될 수도 있다. "맥동성 전달"이란, 침투 증진제와 조합된 약물(예, 안티센스 화합물)의 첫번째 펄스 및 침투 증진제의 첫번째 펄스와 함께 방출시에 흡수되지 않는 약물의 흡수를 촉진하기 위한 침투 증진제의 두번째 펄스를 전달하는 제약학적 제제를 가리킨다.
본 발명의 하나의 구현양태는,
(a) 약물 및 침투 증진제가 소장의 첫번째 위치에 방출되어지는, 약물 및 침투 증진제를 포함하는 담체 입자의 첫번째 집단; 및
(b) 침투 증진제가 첫번째 위치로부터 하류의 소장에 위치한 두번째 위치에서 방출되고, 이에 의해 약물이 두번째 위치에 이르를 때 약물의 흡수가 증진되는,침투 증진제 및 지연 방출 코팅 또는 기질을 포함하는 담체 입자의 두번째 집단을 포함하는, 소장 약물 흡수의 증진을 위한 지연 방출 경구 제제이다.
대안적으로, (a) 및 (b)에서의 침투 증진제가 상이하다.
담체 입자의 적어도 2개 집단을 캡슐화함으로써 이러한 증진이 달성된다. 담체 입자의 첫번째 집단은 생물학적 활성 물질 및 침투 증진제를 포함하고, 담체 입자의 두번째 (및 임의로 추가의) 집단은 침투 증진제 및 지연 방출 코팅 또는 기질을 포함한다.
경구 투여 약물에 적용된 "첫번째 통과 효과"는 위산의 작용 및 다양한 소화 효소의 작용에 기인한 분해이다. 첫번째 통과 정화 효과를 개선하기 위한 한가지 수단은 투여된 약물의 투여량을 증가시키는 것이고, 이에 의해 첫번째 통과 정화에 소실된 약물의 비율을 상쇄시킨다. 이것은 예를들어 하나 이상의 약물을 동물에 단순히 제공함으로써 정맥내 투여에 의해 쉽게 달성될 수도 있긴 하지만, 다른 요인은 비-비경구적 수단을 통해 투여된 약물의 생체이용성에 영향을 미친다. 예를들어, 약물은 소화관 또는 혈류에서 효소적 또는 화학적으로 분해될 수도 있고(있거나) 다양한 점막에 불투과성 또는 반투과성일 수도 있다.
또한, 이러한 제약학적 조성물이 직장, 질, 비내 또는 폐 경로를 통해 투여될 때 생물학적 활성 물질의 흡수를 증진시킬 수 있는 것으로 생각된다. 또한, 생물학적 활성 물질의 방출이 위장관의 일부에서 달성될 수 잇는 것으로 생각된다.
올리고뉴클레오티드의 액체 제약학적 조성물은 올리고뉴클레오티드를 적절한 부형제, 예를들어 무균 비병원성 물 또는 염 용액과 조합함으로써 제조될 수 있다. 다른 치료적 화합물이 임의로 포함될 수도 있다.
본 발명은 고체 입자 조성물의 사용을 의도한다. 이러한 조성물은 바람직하게는 호흡가능한 크기인 올리고뉴클레오티드의 입자를 포함한다. 이러한 입자들은 예를들어 건조한 올리고뉴클레오티드를 통상적인 수단, 예를들어 막자사발에 의해 분쇄한 다음, 400메시 망을 통해 분말 조성물을 통과시켜 더욱 큰 입자 및 응집물을 분리함으로써 제조될 수 있다. 활성 올리고뉴클레오티드로 이루어진 고체 입자 조성물은 임의로 에어로졸, 예를들어 락토스의 형성을 수월하게 하는 분산제를 함유할 수 있다.
본 발명에 따르면, 올리고뉴클레오티드 조성물을 에어로졸화할 수 있다. 액체 입자의 에어로졸화는 예컨대 분무기와 같은 적절한 수단에 의해 제조될 수 있다. 예를들어 미국 특허 4,501,729호 참조. 분무기는 좁은 벤튜리 구멍을 통한 압축 기체, 전형적으로 공기 또는 산소의 가속화에 의해 또는 초음파 교반에 의해 용액 또는 현탁액을 치료적 에어로졸 연무 내로 변형시키는 통상적으로 입수가능한 장치이다. 적절한 분무기는 블래이렉스(Blairex)®에 의해 파리 LC 플러스(PARI LC PLUS), 파리 듀라넵(PARI DURANEB) 2000, 파리-베이비(PARI-BABY) 크기, LC 플러스를 가진 파리 프로넵(PARI PRONEB) 압축기, 파리 워크할러(WALKHALER) 압축기/분무기 시스템, 파리 LC 플러스 재사용가능한 분무기, 및 파리 LC 제트+분무기®의 이름으로 시판되는 것을 포함한다.
분무기에서 사용하기 위한 제제는 액체, 예컨대 무균 비병원성 물 또는 염 용액 중에 올리고뉴클레오티드로 구성될 수도 있고, 여기에서 올리고뉴클레오티드는 약 40％ w/w 이하의 제제를 포함한다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드는 20％ w/w 미만을 포함한다. 원한다면, 보존제(예를들어, 메틸 히드록시벤조에이트) 산화방지제 및 향미제와 같은 추가의 첨가제를 조성물에 첨가할 수 있다.
당 기술분야에 공지된 고체 입자 약제 에어로졸 발생장치를 사용하여 올리고뉴클레오티드를 포함하는 고체 입자를 에어로졸화할 수 있다. 이러한 에어로졸 발생장치는 앞서 기재된 바와 같이 호흡가능한 입자를 생성하고, 에어로졸의 단위 부피 당 재생가능한 계량된 투여량을 더욱 생성한다. 적절한 고체 입자 에어로졸 발생장치는 취입기 및 계량된 투여량 흡입기를 포함한다. 계량된 투여량 흡입기가 당 기술분야에서 사용되고 본 발명에서 유용하다.
바람직하게는, 액체 또는 고체 에어로졸은 1분당 약 10 내지 150리터의 비율, 더욱 바람직하게는 1분당 약 30 내지 150리터, 가장 바람직하게는 1분당 약 60리터로 생산된다.
생물학적 활성 물질의 증가된 생체이용성은 본 발명의 조성물 및 방법의 경구 투여를 통해 달성된다.
기타 성분들
본 발명의 조성물은 제약학적 조성물에서 통상적으로 발견되는 기타 아주반트 성분들을 당 기술분야에 확립된 사용 수준으로 더욱 함유할 수도 있다. 따라서, 예를들어 조성물은 추가의 친화성 제약학적 활성 물질, 예를들어 항소양제, 수렴제, 국소 마취제 또는 항염증제를 함유할 수도 있거나, 또는 본 발명의 조성물의 다양한 투여 형태를 물리적으로 제형하는데 유용한 추가의 물질, 예컨대 염료, 향료, 보존제, 산화방지제, 광택제, 증점제 및 안정화제를 함유할 수도 있다. 그러나, 이러한 물질은 첨가시에 본 발명의 조성물의 성분들의 생물학적 활성을 과도하게 방해해서는 안된다. 제제는 안정화될 수 있고, 원한다면 보조제, 예를들어 윤활제, 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 미치기 위한 염, 완충제, 착색제, 향료 및(또는) 방향족 물질 및 제제의 핵산(들)에 해로운 영향을 미치지 않는 기타 물질과 혼합될 수 있다.
수성 현탁액은 예를들어 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 소르비톨 및(또는) 덱스트란을 포함한 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 함유할 수도 있다. 현탁액은 안정화제를 함유할 수도 있다.
본 발명의 특정한 구현양태는 (a) 하나 이상의 안티센스 화합물 및 (b) 비-안티센스 메카니즘에 의해 작용하는 하나 이상의 다른 화학요법 제를 함유한 제약학적 조성물을 제공한다. 이러한 화학요법제의 예는 이에 한정되지 않지만 다우노루비신, 다우노마이신, 닥티노마이신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 에소루비신, 블레오마이신, 마포스파미드, 이포스파미드, 시토신 아라비노시드, 비스-클로로에틸니트로스우레아, 부술판, 미토마이신 C, 악티노마이신 D, 미트라마이신, 프레드니존, 히드록시프로게스테론, 테스토스테론, 타목시펜, 다카르바진, 프로카르바진, 헥사메틸멜라민, 펜타메틸멜라민, 미톡산트론, 암사크린, 클로람부실, 메틸시클로헥실니트로스우레아, 질소 머스타드, 멜파란, 시클로포스파미드, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-아자시티딘, 히드록시우레아, 데옥시코포르마이신, 4-히드록시퍼옥시시클로포스포라미드, 5-플루오로우라실(5-FU), 5-플루오로데옥시우리딘(5-FUdR), 메토트렉세이트(MTX), 콜히친, 탁솔, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토폭시드 (VP-16), 트리메트렉세이트, 이리노테칸, 토포테칸, 겜시타빈, 테니포시드, 시스플라틴 및 디에틸스틸베스트롤(DES)을 포함한다. 일반적으로 문헌 [The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 제15판, 1987, pp1206-1228, Berkow 등, eds. Rahway, N.J.] 참조.
본 발명의 화합물과 함께 사용될 때, 이러한 화학요법 약제는 개별적으로 (예, 5-FU 및 올리고뉴클레오티드), 연속적으로 (예, 일정 기간 동안 5-FU 및 올리고뉴클레오티드에 이어서, MTX 및 올리고뉴클레오티드), 또는 하나 이상의 다른 화학요법 약제와의 조합으로 (예, 5-FU, MTX 및 올리고뉴클레오티드, 또는 5-FU, 방사능요법 및 올리고뉴클레오티드) 사용될 수 있다. 이에 한정되지 않지만 비스테로이드성 항염증 약물 및 코르티코스테로이드를 포함한 항-염증 약물 및 이에 한정되지 않지만 리비비린, 비다라빈, 아시클로비르 및 간시클로비르를 포함한 항바이러스 약물을 본 발명의 조성물에서 조합할 수도 있다. 일반적으로 문헌 [The Merck Manual of Diagnosis and Therapy; 제15판, Berkow 등, eds., 1987, Rahway, N.J. 2499-2506면 및 46-49면] 참조. 다른 비-안티센스 화학요법제가 본 발명의 범위 내에 있다. 2 이상의 조합된 화합물이 함께 또는 연속적으로 사용될 수도 있다.
다른 관련된 구현양태에서, 본 발명의 조성물은 첫번째 핵산을 표적으로 하는 하나 이상의 안티센스 화합물, 특히 올리고뉴클레오티드 및 두번째 핵산 표적을 표적으로 하는 하나 이상의 추가의 안티센스 화합물을 함유할 수도 있다. 2 이상의 안티센스 화합물은 함께 또는 연속적으로 사용될 수 있다.
투여
투여는, 수 일 내지 수 개월 지속되는 치료 과정에서 또는 치료가 행해지거나 질병 상태의 감소가 달성될 때까지, 치료되어지는 질병 상태의 중증도 및 반응성에 의존된다. 최적 투여 계획은 환자의 신체에서 약물 축적의 측정으로부터 계산될 수 있다. 당업자라면 최적의 투여량, 투여 방법 및 반복 속도를 쉽게 결정할 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 예증하며 이를 제한하는 것으로 해석되지 않는다.
실시예 1: 올리고뉴클레오티드의 합성
요오드에 의한 산화와 함께 표준 포스포르아미디트 화학을 사용하여 비변형 올리고데옥시뉴클레오티드를 자동화 DNA 합성장치(어플라이드 바이오시스템스 모델 380B)에서 합성하였다. β-시아노에틸디이소프로필포스포라미디트를 어플라이드 바이오시스템스(미국 캘리포니아주 포스퍼시티)로부터 구입하였다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 위하여, 표준 산화 용기를 포스파이트 결합의 단계적 황화(thiation)를 위하여 아세토니트릴 중의 3H-1,2-벤조디티올-3-온 1,1-디옥시드의 0.2M 용액으로 대체하였다. 황화 주기 대기 단계를 68초로 증가시키고 이어서 캡형성 단계를 수행하였다. 시토신은 5-메틸 시토신일 수도 있다 (미국 버지니아주 스털링의 글렌 리서치 또는 미국 뉴저지주 피스카타웨이 아머샴 파마시아 바이오테크로부터의 5-메틸 데옥시시티딘 포스포르아미디트).
테트라졸 및 염기의 펄스 전달 후의 대기 단계를 360초로 증가시키는 것 이외에는, 비변형 올리고뉴클레오티드를 위한 표준 주기 및 2'-메톡시 β-시아노에틸디이소프로필-포스포르아미디트 (미국 메사츄세츠주 니드햄 켐진스)를 사용하여 2'-메톡시 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 글렌 리서치 인코포레이티드(미국 버지니아주 스털링)로부터 입수가능한 것과 같은 적절한 2'-변형 아미디트를 사용하여 이 방법의 변형에 의하여 다른 2'-알콕시 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
문헌[Kawasaki 등, J.Med.Chem.1993, 36, 831-841]에 기재된 바와 같이 2'-플루오로 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 간략하게, 출발 물질로서 통상적으로 입수가능한 9-β-D-아라비노푸라노실아데닌을 사용하고, 문헌 절차를 변형시킴으로써 2'-a-플루오로 원자를 2'-β-O-트리틸 기의 SN2-치환에 의해 도입하여, 보호된 뉴클레오시드 N6-벤조일-2'-데옥시-2'-플루오로아데노신을 합성하였다. 따라서, N6-벤조일-9-β- D-아라비노푸라노실아데닌을 3',5'-디테트라히드로피라닐(THP) 중간체로서 적절한 수율로 선택적으로 보호하였다. 표준 방법을 사용하여 THP 및 N6- 벤조일 기의 탈보호를 달성하였으며, 5'-디메톡시트리틸-(DMT) 및 5'-DMT-3'-포스포르아미디트 중간체를 수득하기 위해 표준 방법을 사용하였다.
테트라이소프로필디실록사닐(TPDS) 보호된 9-β-D-아라비노푸라노실구아닌을 출발물질로서 사용하고, 중간체 디이소부티릴-아라비노푸라노실구아노신으로 전환시킴으로써 2'-데옥시-2'-플루오로구아노신의 합성을 달성하였다. TPDS 기의 탈보호에 이어서 THP로 히드록실 기를 보호하여 디이소부티릴 디-THP 보호된 아라비노푸라노실구아닌을 수득하였다. 선택적 O-탈아실화 및 트리플화(triflation)에 이어서, 조 생성물을 플루오라이드로 처리한 다음 THP기를 탈보호한다. 5'-DMT- 및 5'-DMT-3'-포스포르아미디트를 수득하기 위하여 표준 방법을 사용하였다.
2,2'-안히드로-1-β-D-아라비노푸라노실우라실을 70％ 플루오르화수소-피리딘으로 처리하는 공지된 절차의 변형에 의하여 2'-데옥시-2'-플루오로우리딘의 합성을 달성하였다. 5'-DMT 및 5-DMT-3'-포스포르아미디트를 수득하기 위해 표준 절차를 사용하였다.
2'-데옥시-2'-플루오로우리딘의 아민화를 통해 2'-데옥시-2'-플루오로시티딘을 합성한 다음 선택적 보호에 의해 N4-벤조일-2'-데옥시-2'-플루오로시티딘을 수득하였다. 5'-DMT 및 5'-DMT-3'-포스포르아미디트를 수득하기 위해 표준 절차를 사용한다.
문헌 [Martin, P. 등, Helv. Chim. Acta 1995, 78, 486-506]에 따라 2'-(2-메톡시에틸)변형 아미디트를 합성하였다. 합성 용이성을 위하여, 최종 뉴클레오티 드는 데옥시뉴클레오티드일 수도 있다. 2'-O-CH2CH2OCH3-시토신은 5-메틸 시토신일 수도 있다.
5- 메틸 시토신 단량체의 합성:
2,2'-안히드로[1-(β-D- 아라비노푸라노실 )-5- 메틸우리딘 ]
5-메틸우리딘 (리보실티민, 일본 조시 야마사로부터 통상적으로 입수가능함) (72.0g, 0.279M), 디페닐카르보네이트 (90.0g, 0.420M) 및 중탄산나트륨 (2.0g, 0.024M)을 DMF (300mL)에 첨가하였다. 혼합물을 교반하면서 가열 환류시켜, 발생된 이산화탄소 기체를 조절된 방식으로 방출시켰다. 1시간 후에, 약간 어두운 용액을 감압 하에 농축하였다. 얻어진 시럽을 교반하에 디에틸에테르 (2.5L)에 부었다. 생성물은 고무를 형성하였다. 에테르를 경사분리하고 잔류물을 메탄올의 최소량(약 400mL)에 용해시켰다. 용액을 새로운 에테르(2.5L)에 부어서 경질 고무를 생성하였다. 에테르를 경사분리하고 고무를 진공 오븐에서 건조시켜 (1mmHg에서 24시간동안 60℃), 고체를 수득하고 이것을 연갈색 분말로 분쇄하였다 (57g, 85％ 조 수율). 추가의 반응을 위해 물질을 사용하였다.
2'-O- 메톡시에틸 -5- 메틸우리딘 :
2,2'-안히드로-5-메틸우리딘 (195g, 0.81M) 트리스(2-메톡시에틸)보레이트 (231g, 0.98M) 및 2-메톡시-에탄올 (1.2L)을 2L 스테인레스 스틸 압력 용기에 첨가하고 160℃에서 예열된 오일 욕에 넣었다. 48시간 동안 155 내지 160℃에서 가열한 후에, 용기를 개봉하고 용액을 증발 건조시키고 MeOH (200mL)로 분쇄하였다. 잔류물을 고온 아세톤(1L)에 현탁시켰다. 불용성 염을 여과하고 아세톤(150mL)으로 세척하고, 여액을 증발시켰다. 잔류물(280g)을 CH3CN(600mL)에 용해시키고 증발시켰다. 실리카겔 컬럼(3kg)을 0.5％ Et3NH를 함유하는 CH2Cl2/아세톤/MeOH (20:5:3)에 충진하였다. 잔류물을 CH2Cl2(250mL)에 용해시키고 컬럼에 부하하기에 앞서서 실리카(150g) 위에 흡착시켰다. 생성물을 충진 용매로 용출하여 160g (63％)의 생성물을 용출시켰다.
2'-O- 메톡시에틸 -5'-O- 디메톡시트리틸 -5- 메틸우리딘
2'-O-메톡시에틸-5-메틸우리딘 (160g, 0.506M)을 피리딘(250mL)으로 공동-증발시키고, 건조된 잔류물을 피리딘(1.3L)에 용해시켰다. 디메톡시트리틸 클로라이드 (94.3g, 0.278M)의 첫번째 분취량을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간동안 교반하였다. 두번째 분취량의 디메톡시트리틸 클로라이드 (94.3g, 0.278M)를 첨가하고, 반응을 추가의 1시간동안 교반하였다. 메탄올(170mL)을 첨가하여 반응을 정지시켰다. HPLC는 약 70％ 생성물의 존재를 나타내었다. 용매를 증발시키고 CH3CN(200mL)로 분쇄하였다. 잔류물을 CHCl3(1.5L)에 용해시키고 2×500mL의 포화 NaHCO3 및 2×500mL의 포화 NaCl로 추출하였다. 유기 상을 Na2SO4 위에서 건조시키고 여과하고 증발하였다. 275g의 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 3.5kg 실리카 겔 컬럼 위에 정제하고 충진하고 0.5％ Et3NH를 함유하는 EtOAc/헥산/아세톤 (5:5:1)으로 용출하였다. 순수한 분획을 증발시켜 164g의 생성물을 수득하였다. 불순한 분획으로부터 대략 20g 추가량을 수득하여 183g의 총 수율을 수득하였다 (57％).
3'-O-아세틸-2'-O- 메톡시에틸 -5'-O- 디메톡시트리틸 -5- 메틸우리딘 :
2'-0-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸우리딘 (106g, 0.167M), DMF/피리딘 (562mL의 DMF 및 188mL의 피리딘으로부터 제조된 750mL의 3:1 혼합물) 및 아세트 안히드라이드 (24.38mL, 0.258M)을 합하고 실온에서 24시간동안 교반하였다. MeOH의 첨가에 의해 tlc 샘플을 먼저 정지시킴으로써 tlc에 의해 반응을 조사하였다. tlc에 의해 판정할 때 반응의 완결 시에, MeOH(50mL)을 첨가하고 혼합물을 35℃에서 증발시켰다. 잔류물을 CHCl3(800mL)에 용해시키고, 2×200mL의 포화 중탄산나트륨 및 2×200mL의 포화 NaCl로 추출하였다. 물 층을 200mL의 CHCl3로 다시 추출하였다. 합한 유기물을 황산나트륨으로 건조시키고, 증발시켜 122g의 잔류물(약 90％ 생성물)을 수득하였다. 잔류물을 3.5kg의 실리카겔 컬럼 위에서 정제시키고 EtOAc/헥산(4:1)을 사용하여 용출시켰다. 순수한 생성물 분획을 증발시켜 96g을 수득하였다 (84％).
3'-O-아세틸-2'-O- 메톡시에틸 -5'-O- 디메톡시트리틸 -5- 메틸 -4- 트리아졸유리딘
3'-O-아세틸-2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸우리딘 (96g, 0.144M)을 CH3CN(700mL)에 용해시키고 정치시킴으로써 첫번째 용액을 제조하였다. 트리에틸아민 (189mL, 1.44M)을 CH3CN(1L) 중의 트리아졸(90g, 1.3M)의 용액에 첨가하고, -5℃로 냉각하고, 오버헤드 교반기를 사용하여 0.5시간동안 교반하였다. 30 분의 기간에 걸쳐 POCl3을 0 내지 10℃로 유지된 교반된 용액에 적가하고, 얻어진 혼합물을 추가의 2시간동안 교반하였다. 첫번째 용액을 45분 기간에 걸쳐 후기 용액에 적가하였다. 얻어진 반응 혼합물을 냉각 룸에서 밤새 교반하였다. 염을 반응 혼합물로부터 여과하고 용액을 증발시켰다. 잔류물을 EtOAc(1L)에 용해시키고, 불용성 고체를 여과에 의해 제거하였다. 여액을 1×300mL의 NaHCO3 및 2×300mL의 포화 NaCl로 세척하고, 황산나트륨 위에 건조시키고 증발시켰다. 잔류물을 EtOAc로 분쇄하여 표제 화합물을 수득하였다.
2'-O- 메톡시에틸 -5'-O- 디메톡시트리틸 -5- 메틸시티딘
디옥산(500mL) 및 NH4OH(30mL) 중의 3'-O-아세틸-2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸-4-트리아졸유리딘(103g, 0.141M)의 용액을 실온에서 2시간동안 교반하였다. 디옥산 용액을 증발시키고, 잔류물을 MeOH(2×200mL)로 공비시켰다. 잔류물을 MeOH(300mL)에 용해시키고, 2리터 스테인레스 스틸 압력 용기에 옮겼다. NH3 기체로 포화된 MeOH(400mL)를 첨가하고, 용기를 2시간동안 100℃로 가열하였다 (tlc는 완전한 전환을 나타내었다). 용기 내용물을 증발 건조시키고 잔류물을 EtOAc(500mL)에 용해시키고, 포화 NaCl(200mL)로 한번 세척하였다. 유기물질을 황산나트륨 위에서 건조시키고, 용매를 증발시켜 85g(95％)의 표제 화합물을 수득하였다.
N 4 - 벤조일 -2'-O- 메톡시에틸 -5'-0- 디메톡시트리틸 -5- 메틸시티딘
2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸시티딘 (85g, 0.134M)을 DMF(800mL)에 용해시키고 벤조 안히드라이드 (37.2g, 0.165M)를 교반하에 첨가하였다. 3시간동안 교반한 후에, tlc는 반응이 약 95％ 완료되었음을 나타내었다. 용매를 증발시키고 잔류물을 MeOH(200mL)과 공비시켰다. 잔류물을 CHCl3(700mL)에 용해시키고 포화 NaHCO3 (2×300mL) 및 포화 NaCl(2×300mL)로 추출하고, MgSO4 상에서 건조시키고 증발시켜 잔류물을 수득하였다 (96g). 잔류물을 용출 용매로서 0.5％ Et3NH를 함유하는 EtOAc/헥산(1:1)을 사용하여 1.5kg 실리카 컬럼 위에서 크로마토그래피하였다. 순수한 생성물 분획을 증발시켜 90g (90％)의 표제 화합물을 수득하였다.
N 4 - 벤조일 -2'-O- 메톡시에틸 -5'-O- 디메톡시트리틸 -5- 메틸시티딘 -3'- 아미디트
N4-벤조일-2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸시티딘(74g, 0.10M)을 CH2Cl2 (1L)에 용해시켰다. 테트라졸 디이소프로필아민 (7.1g) 및 2-시아노에톡시테트라(이소프로필)포스파이트 (40.5mL, 0.123M)을 질소 대기 하에서 교반하에 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 실온에서 20시간동안 교반하였다 (tlc는 반응이 95％ 완료되었음을 나타내었다). 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 (1×300mL) 및 포화 NaCl( 3×300mL)로 추출하였다. 수성 세척액을 CH2Cl2(300mL)로 다시 추출하고, 추출물을 합하고, MgSO4 상에서 건조시키고 농축하였다. 수득된 잔류물을 용출 용매 로서 EtOAc/헥산 (3:1)을 사용하여 1.5kg 실리카 컬럼 상에서 크로마토그래피하였다. 순수한 분획을 합하여 90.6g (87％)의 표제 화합물을 수득하였다.
통상적으로 입수가능한 포스포르아미디트 (미국 버지니아주 스터링의 글렌 리서치 또는 미국 메사츄세츠주 니드햄의 켐진스)를 사용하여 공개된 방법 [Sanghvi 등, Nucl.Acids Res. 1993, 21, 3197-3203]에 따라서 올리고뉴클레오티드를 함유하는 5-메틸-2'-데옥시시티딘(5-me-C)을 합성하였다.
2'-O-( 디메틸아미노옥시에틸 ) 뉴클레오시드 아미디트
하기 문단에 기재된 바와 같이, 2'-(디메틸아미노옥시에톡시)뉴클레오시드 아미디트 [또한, 2'-O-(디메틸아미노옥시에틸)뉴클레오시드 아미디트로서 공지됨]를 제조하였다. 아데노신 및 시티딘의 경우에 엑소시클릭 아민을 벤조일 잔기로 보호하고 구아노신의 경우에 이소부티릴로 보호하는 것 이외에는, 티미딘(5-메틸우리딘)과 유사하게, 아데노신, 시티딘 및 구아노신 뉴클레오시드 아미디트를 제조하였다.
5'-O- tert - 부틸디페닐실릴 - O 2 -2'- 안히드로 -5- 메틸우리딘
O2-2'-안히드로-5-메틸우리딘 [Pro.Bio.Sint., 이탈리아 바레스, 100.0g, 0.416밀리몰], 디메틸아미노피리딘 (0.66g, 0.013당량, 0.0054밀리몰)을 아르곤 대기하에서 기계적 교반하에 주변 온도에서 무수 피리딘(500ml)에 용해시켰다. tert-부틸디페닐클로로실란 (125.8g, 119.0mL, 1.1당량, 0.458밀리몰)을 한번 분량으로 첨가하였다. 반응을 주변 온도에서 16시간동안 교반하였다. TLC (Rf 0.22, 에틸 아세테이트)는 완전한 반응을 나타내었다. 용액을 진한 오일로 감압하에 농축하였다. 이것을 디클로로메탄(1L) 및 포화 중탄산나트륨(2×1L) 및 염수(1L) 사이에 분배시켰다. 유기 층을 황산나트륨 위에서 건조시키고 감압하에 진한 오일로 농축하였다. 오일을 에틸 아세테이트 및 에틸 에테르의 1:1 혼합물(600mL)에 용해시키고 용액을 -10℃로 냉각하였다. 얻어진 결정성 생성물을 여과에 의해 수집하고 에틸 에테르(3×200mL)로 세척하고 149g (74.8％)의 백색 고형물로 건조시켰다 (40℃, 1mmHg, 24시간). TLC 및 NMR은 순수한 생성물에 일치하였다.
5'-O- tert - 부틸디페닐실릴 -2'-O-(2- 히드록시에틸 )-5- 메틸우리딘
2L 스테인레스 스틸, 비-교반 압력 반응기에 테트라히드로푸란 중의 보란 (1.0M, 2.0eq. 622mL)을 첨가하였다. 후드에서 수동 교반하에, 수소 기체의 발생이 진정될 때까지 에틸렌 글리콜(350mL, 과량)을 조심스럽게 첨가하였다. 5'-O-tert-부틸디페닐실릴-O2-2'-안히드로-5-메틸우리딘(149g, 0.311몰) 및 중탄산나트륨 (0.074g, 0.003g)을 수동 교반하에 첨가하였다. 반응기를 밀봉하고 160℃의 내부 온도에 이르를 때까지 오일 욕에서 가열한 다음 16시간동안 유지하였다 (압력<100psig). 반응 용기를 주변 용기로 냉각하고 개봉하였다. TLC(목적하는 생성물을 위한 Rf 0.67 및 era-T 부산물, 에틸 아세테이트를 위한 Rf 0.82)는 생성물로의 약 70％ 전환율을 나타내었다. 추가의 부산물 형성을 피하기 위하여, 반응을 정지하고, 에틸렌 글리콜을 제거하기 위해 사용되는 더욱 극한 조건 하에서 온수 욕(40 내지 100℃)에서 감압(10 내지 1mmHg)하에 농축하였다 [대안적으로, 일단 낮은 비 점 용매가 없어지면, 나머지 용액이 에틸 아세테이트와 물 사이에서 분배될 수 있다. 생성물은 유기 상에 있을 것이다]. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(2kg 실리카겔, 에틸 아세테이트-헥산 구배 1:1 내지 4:1)에 의해 정제하였다. 적절한 분획을 조합하고, 탈거하고 백색의 부서지기 쉬운 발포체로서의 생성물(84g, 50％), 오염된 출발 물질(17.4g) 및 순수한 재사용가능한 출발 물질 20g으로 건조시켰다. 출발 물질을 기준으로 하여 덜 순수한 회수된 출발 물질의 수율은 58％였다. TLC 및 NMR은 99％ 순수한 생성물과 일치하였다.
2'-O-([2- 프탈이미독시 )에틸]-5'-t- 부틸디페닐실릴 -5- 메틸우리딘
5'-O-tert-부틸디페닐실릴-2'-O-(2-히드록시에틸)-5-메틸우리딘 (20g, 36.98밀리몰)을 트리페닐포스핀(11.63g, 44.36밀리몰) 및 N-히드록시프탈이미드(7.24g, 44.36밀리몰)와 혼합하였다. 이어서, 이것을 고 진공 하에 40℃에서 2일 동안 P2O5 위에서 건조시켰다. 반응 혼합물을 아르곤으로 씻어 내리고, 무수 THF (369mL, 알드리치, 완전 밀봉 용기)를 첨가하여 투명한 용액을 얻었다. 디에틸-아조디카르복실레이트 (6.98mL, 44.36밀리몰)를 반응 혼합물에 적가하였다. 그 다음 방울을 첨가하기 전에 진한 적색 착색이 방출되도록 첨가 속도를 유지하였다. 첨가를 완료한 후에, 반응을 4시간동안 교반하였다. 이 때까지 TLC는 반응의 완결을 나타내었다 (에틸 아세테이트:헥산, 60:40). 용매를 진공하에 증발시켰다. 수득된 잔류물을 플래시 컬럼 위에 위치시키고 에틸 아세테이트:헥산(60:40)으로 용출하여, 백색 발포체로서 2'-O-([2-프탈이미독시)에틸]-5'-t-부틸디페닐실릴-5-메틸우리딘을 수 득하였다 (21.819, 86％).
5'-O- tert - 부틸디페닐실릴 -2'-O-[(2- 포름아독시미노옥시 )에틸]-5- 메틸우리딘
2'-O-([2-프탈이미독시)에틸]-5'-t-부틸디페닐실릴-5-메틸우리딘(3.1g, 4.5밀리몰)을 무수 CH2Cl2(4.5mL)에 용해시키고 메틸히드라진(300mL, 4.64밀리몰)을 -10℃ 내지 0℃에서 적가하였다. 1시간 후에 혼합물을 여과하고 여액을 빙냉 CH2Cl2로 세척하고 합한 유기 상을 물, 염수로 세척하고 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용액을 농축하여 2'-O-(아미노옥시에틸)티미딘을 수득하고 이것을 MeOH(67.5mL)에 용해시켰다. 여기에 포름알데히드(20％ 수용액, w/w, 1.1당량)를 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 놓아두었다. 용매를 진공하에 제거하고, 잔류물을 크로마토그래피하여 5'-O-tert-부틸디페닐실릴-2'-O-[(2-포름아독시미노옥시)에틸]-5-메틸우리딘을 백색 발포체(1.95, 78％)로서 수득하였다.
5'-O- tert - 부틸디페닐실릴 -2'-O-[N,N- 디메틸아미노옥시에틸 ]-5- 메틸우리딘
5'-O-tert-부틸디페닐실릴-2'-O-[(2-포름아독시미노옥시)에틸]-5-메틸우리딘 (1.77g, 3.12밀리몰)을 무수 MeOH(30.6mL)중의 1M 피리디늄 p-톨루엔술포네이트(PPTS)의 용액에 용해시켰다. 시아노붕수소화나트륨(0.39g, 6.13밀리몰)을 10℃에서 불활성 대기하에 이 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 10℃에서 10분동안 교반하였다. 반응 용기를 빙욕에서 제거하고 실온에서 2시간동안 교반한 후에, 반응을 TLC에 의해 검사하였다 (CH2Cl2 중의 5％ MeOH). 수성 NaHCO3 용액 (5％, 10mL)을 첨가하고, 에틸 아세테이트(2×20mL)로 추출하였다. 에틸 아세테이트 층을 무 수 Na2SO4 상에서 건조시키고 증발 건조시켰다. 잔류물을 MeOH 중의 1M PPTS (30.6mL)의 용액에 용해시켰다. 포름알데히드 (20％ w/w, 30mL, 3.37밀리몰)를 첨가하고 반응 혼합물을 실온에서 10분동안 교반하였다. 반응 혼합물을 빙욕에서 10℃로 냉각하고, 시아노붕수소화나트륨 (0.39g, 6.13밀리몰)을 첨가하고, 반응 혼합물을 10℃에서 10분동안 교반하였다. 10분 후에, 반응 혼합물을 빙욕으로부터 제거하고 실온에서 2시간동안 교반하였다. 반응 혼합물에 5％ NaHCO3 (25mL) 용액을 첨가하고 에틸 아세테이트(2×25mL)로 추출하였다. 에틸 아세테이트 층을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고 증발 건조시켰다. 수득된 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하고 CH2Cl2 중의 5％ MeOH로 용출하여 백색 발포체로서 5'-O-tert-부틸디페닐실릴-2'-O-[N,N-디메틸아미노옥시에틸]-5-메틸우리딘을 수득하였다 (14.6g, 80％).
2'-O-( 디메틸아미노옥시에틸 )-5- 메틸우리딘
트리에틸아민 트리히드로플루오라이드(3.91mL, 24.0밀리몰)를 무수 THF 및 트리에틸아민 (1.67mL, 12밀리몰, 무수, KOH 위에서 유지)에 용해시켰다. 트리에틸아민-2HF의 혼합물을 5'-O-tert-부틸디페닐실릴-2'-O-[N,N-디메틸아미노옥시에틸]-5-메틸우리딘 (1.40g, 2.4밀리몰)에 첨가하고, 실온에서 24시간동안 교반하였다. 반응을 TLC에 의해 검사하였다 (CH2Cl2 중의 5％ MeOH). 용매를 진공하에 제거하고, 잔류물을 플래시 컬럼 상에 놓고 CH2Cl2 중의 10％ MeOH로 용출하여 2'-O-( 디메틸아미노옥시에틸)-5-메틸우리딘 (766mg, 92.5％)을 수득하였다.
5'-O- DMT -2'-O-( 디메틸아미노옥시에틸 )-5- 메틸우리딘
2'-O-(디메틸아미노옥시에틸)-5-메틸우리딘 (750mg, 2.17밀리몰)을 고 진공 하에 40℃에서 밤새동안 P2O5 상에서 건조시켰다. 이어서, 이것을 무수 피리딘(20mL)로 동시-증발시켰다. 수득된 잔류물을 아르곤 대기 하에서 피리딘(11mL)에 용해시켰다. 4-디메틸아미노피리딘(26.5mg, 2.60밀리몰), 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드 (880mg, 2.60밀리몰)를 혼합물에 첨가하고, 출발 물질이 모두 사라질 때까지 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다. 피리딘을 진공하에 제거하고, 잔류물을 크로마토그래피하고 CH2Cl2 중의 10％ MeOH(몇 방울의 피리딘 함유)로 용출하여 5'-O-DMT-2'-O-(디메틸아미노-옥시에틸)-5-메틸우리딘 (1.13g, 80％)을 수득하였다.
5'-O- DMT -2'-O-(2-N,N- 디메틸아미노옥시에틸 )-5- 메틸우리딘 -3'-[(2- 시아노에틸 )-N,N- 디이소프로필포스포르아미디트 ]
5'-O-DMT-2'-O-(디메틸아미노옥시에틸)-5-메틸우리딘(1.08g, 1.67밀리몰)을 톨루엔(20mL)으로 동시-증발시켰다. 잔류물에 N,N-디이소프로필아민 테트라조니드(0.29g, 1.67밀리몰)를 첨가하고, 고 진공하에 40℃에서 밤새 P2O5 상에서 건조시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 무수 아세토니트릴 (8.4mL) 중에 용해시키고, 2-시아노에틸-N,N,N1,N1-테트라이소프로필포스포르아미디트 (2.12mL, 6.08밀리몰)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 주변 온도에서 4시간동안 불활성 대기하에 교반하였다. 반응의 진행을 TLC(헥산:에틸 아세테이트 1:1)에 의해 검사하였다. 용매를 증발시 킨 다음, 잔류물을 에틸 아세테이트(70mL)에 용해시키고 5％ 수성 NaHCO3 (40mL)로 세척하였다. 에틸 아세테이트 층을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고 농축하였다. 수득된 잔류물을 크로마토그래피(용출제로서 에틸 아세테이트)하여, 발포체로서 5'-O-DMT-2'-O-(2-N,N-디메틸아미노옥시에틸)-5-메틸우리딘-3'-[(2-시아노에틸)-N,N-디이소프로필포스포르아미디트]을 수득하였다 (1.04g, 74.9％).
메틸렌(메틸이미노)(MMI) 주쇄를 가진 올리고뉴클레오티드를 미국 특허 5,378,825호 (본 발명의 양수인에게 공동양도됨, 본 명세서에서 전체내용이 참고문헌으로 인용됨)에 따라 합성한다. 합성 용이성을 위하여, MMI 결합을 함유하는 다양한 뉴클레오시드 이량체를 합성하고 올리고뉴클레오티드 내에 혼입하였다. WO 92/20823호 (본 발명의 양수인에게 공동양도됨, 본 명세서에서 그 전체내용이 참고문헌으로 인용됨)에 따라서 다른 질소-함유 주쇄를 합성하였다.
아미드 주쇄를 가진 올리고뉴클레오티드를 문헌[De Mesmaeker 등, Acc. Chem.Res. 1995, 28, 366-374]에 따라 합성하였다. 아미드 잔기는 단순하고 잘 공지되어 있는 합성 방법에 의해 쉽게 접근할 수 있고, 올리고뉴클레오티드의 고체상 합성을 위해 요구되는 조건과 상용가능하다.
모르폴리노 주쇄를 가진 올리고뉴클레오티드를 미국 특허 5,034,506호 (Summerton 및 Weller)에 따라 합성한다.
펩티드-핵산(PNA) 올리고머를 P.E.Nielsen 등 [Science 1991, 254, 1497-1500]에 따라 합성한다.
조절된 공극 유리 컬럼(어플라이드 바이오시스템스)로부터 절단하고, 55℃에서 18시간동안 진한 수산화암모늄에서 탈봉쇄한 후에, 2.5부피 에탄올로 0.5M NaCl로부터 두 번 침전함으로써 올리고뉴클레오티드를 정제한다. 변형 겔 또는 모세관 겔 전기용동 위에서 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 합성된 올리고뉴클레오티드를 분석하고, 적어도 85％ 전체 길이 물질임을 판정하였다. 합성에서 수득된 포스포로티오에이트 및 포스포디에스테르 결합의 상대 량은 31P 핵 자기 공명 분광법에 의해 주기적으로 체크하고, 일부 연구를 위하여 올리고뉴클레오티드를 문헌[Chiang 등, J.Biol.Chem.1991, 266, 18162]에 기재된 바와 같이 HPLC에 의해 분석하였다. HPLC-정제 물질로 수득된 결과는 비-HPLC 정제 물질로 수득된 것과 유사하였다.
대안적으로, 표준 96웰 형식에서 동시에 96개 서열을 조립할 수 있는 자동화 합성장치 위에서 고체상 P(III)포스포르아미디트 화학을 통해 96웰 플레이트 형식에서 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 포스포디에스테르 뉴크레오티드간 결합은 수성 요오드와의 산화에 의해 부여되었다. 무수 아세토니트릴 중에서 3,H-1,2 벤조디티올-3-온 1,1-디옥사이드(뷰케이지 시약)를 사용한 황화반응에 의해 포스포로티오에이트 뉴크레오티드간 결합이 생성되었다. 표준 염기-보호된 베타-시아노에틸-디-이소프로필 포스포르아미디트를 판매업자(예, 미국 캘리포니아주 포스퍼시티 PE-어플라이드 바이오시스템스, 또는 미국 뉴저지주 피스카타웨이 파마시아)로부터 구입하였다. 비-표준 뉴클레오시드를 공개된 방법에 따라 합성한다. 이들은 염기 보호된 베타-시아노에틸디이소프로필 포스포르아미디트로서 사용된다.
올리고뉴클레오티드를 지지체로부터 절단하고 승온(55 내지 60℃)에서 12 내지 16시간동안 진한 NH4OH로 탈보호시키고 방출된 생성물을 진공하에 건조시켰다. 건조된 생성물을 멸균수에 재-현탁시켜 마스터 플레이트를 수득하고, 로봇을 이용한 피펫터를 사용하여 이것으로부터 모든 분석 및 시험 플레이트 샘플을 희석한다.
실시예 2: 인간 STAT3 올리고데옥시뉴클레오티드 서열
인간 STAT3을 표적화하기 위해 안티센스 올리고뉴클레오티드를 설계하였다. 문헌[Akira,S 등, Cell. 1994, 77, 63-71]에 의해 발표된 APRF cDNA 서열로부터 표적 서열 데이타를 얻었다; 진뱅크® 수탁 번호 L29277 (서열번호 1으로 제공됨). 일련의 올리고데옥시뉴클레오티드를 포스포로티오에이트 결합으로 합성하였다. 2'-데옥시 시토신은 5-메틸 시토신이었다. 이러한 올리고뉴클레오티드 서열을 표 1에 나타낸다. 추가의 올리고뉴클레오티드 세트를, 10개 2'-데옥시뉴클레오티드로 구성된 중심 "갭" 영역으로 이루어진 20개 뉴클레오티드 길이의 키메라 올리고뉴클레오티드("개프머")로서 합성하고, 이것은 5개의 뉴클레오티드 "날개"에 의해 양 측(5' 및 3' 방향)에서 인접되어 있다. 뉴크레오티드간(주쇄)결합은 올리고뉴클레오티드 전체에 걸친 포스포로티오에이트(P=S)이다. 모든 2'-MOE 시토신 및 2'-데옥시 시토신은 5-메틸-시토신이다. 이러한 올리고뉴클레오티드 서열을 표 2에 나타낸다.
전형적으로 높은 수준의 STAT3을 발현하는 적절한 세포 주를 시험관내 연구 를 위해 선택한다. 세포 배양 조건은 특정한 세포 주를 위한 표준이다. 올리고뉴클레오티드 처리를 4시간 동안 하고, 초기 처리 후 24 내지 48시간 후에 mRNA를 단리한다. RNAEASY7 키트(미국 캘리포니아주 산타 클래리타 퀴아겐)를 사용하여 mRNA를 단리한다.
Figure 112006056137226-PCT00021
Figure 112006056137226-PCT00022
Figure 112006056137226-PCT00023
Figure 112006056137226-PCT00024
1"C" 잔기는 5-메틸-시토신이고; 모든 결합은 포스포로티오에이트 결합이다.
2진뱅크® 수탁 번호 L29277로부터의 동등물, 좌 이름 "HUMAPRF", 서열번호 1
Figure 112006056137226-PCT00025
Figure 112006056137226-PCT00026
Figure 112006056137226-PCT00027
1확대된 잔기는 2'-메톡시에톡시 잔기이고, 2'-메톡시에톡시 시토신 잔기 및 2'-OH 시토신 잔기는 5-메틸-시토신이며; 모든 결합은 포스포로티오에이트 결합이다.
2진뱅크® 수탁 번호 L29277로부터의 동등물, 좌 이름 "HUMAPRF", 서열번호 1
제조업자의 지시에 따라서 ABI 프리즘TM 7700 서열 검출 시스템(PE-어플라이드 바이오시스템스, 미국 캘리포니아주 포스터 시티)를 사용하여 실시간 PCT에 의해 STAT3 mRNA 수준의 정량화에 의하여 올리고뉴클레오티드 활성을 분석한다. 이것은 밀폐된 관이고, 겔을 기재로 하지 않으며, 실시간에 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 생성물의 고-처리량 정량화를 가능하게 하는 형광 검출 시스템이다. 표준 PCR을 완료한 후에 증폭 생성물을 정량화하는 표준 PCR과는 반대로, 이들이 축적될 때 실시간 PCR에서의 생성물을 정량화한다. 이것은 정방향 및 역방향 PCR 프라이머 사이에서 특이적으로 어닐링되고 2개의 형광 염료를 함유하는 올리고뉴클레오티드 프로브를 PCR 반응에 포함시킴으로써 달성된다. 리포터 염료(예, JOE 또는 FAM, 미국 캘리포니아주 포스터시티의 PE-어플라이드 바이오시스템스)가 프로브의 5' 말단에 부착되고 소광제 염료(예, TAMRA 또는 MGB, PE-어플라이드 바이오시스템스, 미국 캘리포니아주 포스터시티)가 프로브의 3' 말단에 부착된다. 프로브 및 염료가 본래 상태일 때, 3' 소광제 염료의 근접에 의하여 리포터 염료 방출이 정지된다. 증폭 동안에, 표적 서열에 프로브를 어닐링시키면, Taq 폴리머라제의 5'-엑소뉴클레아제 활성에 의해 절단될 수 있는 기질이 생성된다. PCR 증폭 주기의 연장 단계 동안에, Taq 폴리머라제에 의한 프로브의 절단은 프로브의 나머지로부터 (따라서 소광제 잔기로부터) 리포터 염료를 방출하고 서열-특이적 형광 시그날이 발생된다. 각각의 주기에서, 그들의 각각의 프로브로부터 추가의 리포터 염료 분자가 절단되고, ABI 프리즘TM 7700 서열 검출 시스템 내에 설치된 레이저 광학에 의해 규칙적(6초) 간격에서 형광 강도를 측정한다. 각각의 분석에서, 비처리 대조군 샘플로부터 mRNA의 연속 희석을 함유하는 일련의 병렬 반응이 표준 곡선을 생성하며, 이것은 시험 샘플의 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리 후에 퍼센트 억제를 정량화하기 위해 사용된다.
RNA로부터 상보성 DNA(cDNA)를 제조하기 위하여, 먼저 단리된 RNA를 역 트랜스크립타제 반응으로 처리한다. 얻어진 cDNA는 실시간 PCR을 위한 기질이다. PE-어플라이드 바이오시스템스(미국 캘리포니아주 포스터시티)로부터 역 트랜스크립타제 및 실시간 PCR 시약을 수득한다. 25리터 PCR 칵테일(1×TAQMAN7 완충액 A, 5.5mM MgCl2, 각각 dATP, dCTP 및 dGTP의 300M, 600M의 dUTP, 각각 100nM의 정방향 프라이머, 역방향 프라이머, 및 프로브, 20U RNA아제 억제제, 1.25유닛의 앰플리택 골드7, 및 12.5U MuLV 역 트랜스크립타제)을 25리터 폴리(A) mRNA 용액을 함유하는 96웰 플레이트에 첨가함으로써 반응을 수행한다. 48℃에서 30분동안 배양한 후에 95℃에서 10분동안 배양하여 앰플리택 골드7을 활성화함으로써 역 트랜스크립타제 반응을 수행하고, 2-단계 PCR 프로토콜의 40주기를 수행하였다: 95℃에서 15초 동안(변형)에 이어서 60℃에서 1.5분동안 (어닐링/연장).
상업적 소프트웨어 (예, 올리고 5.0 또는 프라이머 익스프레스®)를 사용하여, STAT3 PCR 프라이머 및 프로브를 설계할 수 있다.
실시예 3: 생쥐 STAT3 올리고뉴클레오티드 서열
생쥐 STAT3을 표적화하기 위하여 안티센스 올리고뉴클레오티드를 설계하였다. Zhong,Z.에 의해 제출된 STAT3 cDNA 서열; 진뱅크® 수탁 번호 U06922 (서열번호 82)로부터 표적 서열 데이타를 얻었다. 10개의 2'-데옥시뉴클레오티드로 구성된 중심 "갭" 영역으로 이루어진 20개 뉴클레오티드 길이의 키메라 올리고뉴클레오티드(개프머)로서 올리고뉴클레오티드를 합성하였으며, 이들은 5개 뉴클레오티드 "날개"에 의해 양 측(5' 및 3' 방향) 위에 인접된다. 날개는 2'-O-메톡시에틸 (2'-MOE) 뉴클레오티드로 이루어진다. 뉴크레오티드간(주쇄) 결합은 올리고뉴클레오티드 전체에 걸쳐 포스포로티오에이트(P=S)이다. 모든 2'-MOE 시토신은 5-메틸-시토신이었다. 올리고뉴클레오티드 서열을 표 3에 나타낸다. ATCC(미국 버지니아주 마나사스)로부터 B 림프종 세포주, BCL1을 수득하였다. RPMI 1640 배지 중에서 표준 조건하에서 BCL1 세포를 배양하였다.
BCL1 (PBS 중의 5×106 세포)를 BTX 일렉트로 세포 조작장치TM 600 (미국 캘리포니아주 샌디에고 제네트로닉스)를 사용하여 200V, 1000F에서 일렉트로포레이션에 의해 올리고뉴클레오티드로 이입하였다. 초기 선별을 위하여, BCL1 세포를 10M 올리고뉴클레오티드로 일렉트로포레이트하고, 그 후 24시간에 RNA를 수집하였다. 올리고뉴클레오티드를 갖지 않은 대조군 샘플을 동일한 일렉트로포레이션 조건으로 처리하였다.
RNEASY7® 키트 (미국 캘리포니아주 산타 클라리타 퀴아겐)를 사용하여 전체 세포 RNA를 단리하였다. 리보퀀트(RIBOQUANT)TM 키트를 사용하여 RNA아제 보호 실험을 수행하고, 제조업자의 지시에 따라 주형을 고정하였다 (Pharmingen, 미국 캘리포니아주 샌디에고). 문헌[M-Y 등, J.Biol.Chem. 1991, 266, 18162-18171]에 기재된 바와 같이, psvsport-1 플라스미드(미국 미들랜드주 록빌의 ATCC)의 Xho I/Sal I 제한효소 소화에 의해 제조된 쥐 cDNA 프로브를 사용하여 노던 블롯팅을 수행하였다. 포스포르이미저(PhosphorImager)TM (몰레큘러 다이나믹스, 미국 캘리포니아주 서니베일)를 사용하여 mRNA 수준을 정량화하였다.
Figure 112006056137226-PCT00028
1 모든 2'-MOE 시토신 잔기는 5-메틸-시토신이고; 모든 결합은 포스포로티오에이트 결합이다.
2 진뱅크 수탁번호 U06922로부터의 동등물, 좌 이름 "MMU06922", 서열번호 82
결과를 표 4에 나타낸다. 올리고뉴클레오티드 17138 (서열번호 85), 17139(서열번호 86), 17140(서열번호 87), 17143 (서열번호 90), 17144(서열번호 91), 17152(서열번호 99), 17153(서열번호 100), 17156(서열번호 103) 및 17153(서열번호 104)은 이 분석에서 45％ 억제율보다 더 양호한 값을 제공하였다.
Figure 112006056137226-PCT00029
실시예 4: BCL1 세포에서 생쥐 STAT3 단백질 수준에 미치는 안티센스 키메라( 데옥시 갭을 가진) 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 효과의 투여량 반응
추가의 연구를 위해 아이시스 17152(서열번호 99)를 선택하였다. 단백질 수준에 미치는 올리고뉴클레오티드의 효과를 웨스턴 블롯에 의해 결정하였다. 아이시스 23177 (서열번호 106), 3개 염기 불일치를 대조군으로서 사용하였다. 필수적으로 실시예 3에 기재된 것과 같이 BCL1 세포를 생육시키고, 처리하고 가공하였다.
문헌[Karras, J.G. 등, J.Exp.Med., 1997, 185, 1035-1042]에 기재된 바와 같이 주요 B 세포 및 B 림프구 세포주로 부터 핵 추출물을 제조하였다.
문헌[Karras,J.G. 등, J.Immunol., 1996, 157, 2299]에 기재된 바와 같이 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. UBI (미국 뉴욕주 레이크 플라시드)로부터 STAT1 및 STAT3 항체를 수득하였다.
결과를 표 5에 나타낸다. 아이시스 17152(서열번호 99)는 불일치 대조군에 비해 STAT3 단백질 수준을 현저히 감소시켰다.
Figure 112006056137226-PCT00030
실시예 5: STAT3 안티센스 키메라 ( 데옥시 갭을 가진) 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드에 의한 BCL1 증식의 억제
BCL1 증식에 대한 아이시스 17152(서열번호 99)의 효과를 결정하였다. BCL1 세포는 구성적으로 활성인 STAT3을 함유하며, 이것은 증식의 원인이 되는 것으로 생각된다. BCL1 세포 (1×105)를 필수적으로 실시예 3에 기재된 바와 같이 10nm, 15nm 또는 20nm의 STAT3 (아이시스 17152) 또는 불일치(아이시스 23177) 올리고뉴클레오티드로 일렉트로포레이트하였다. 일렉트로포레이션 후에, 세포를 200L 완전 RPMI에서 48시간 동안 96-웰 플레이트에서 배양하였다. 배양액을 배양액 중에서 최종 8시간동안 1Ci의 [3H] 티미딘으로 펄스화하였다. 세포를 수집하고 문헌[Francis,D.A. 등, Int.Immunol., 1995, 7, 151-161]에 기재된 바와 같이 티미딘 혼입에 대해 분석하였다.
결과를 표 6에 나타낸다. 아이시스 17152(서열번호 99)는 BCL1 세포 증식을 대략 50％ 만큼 감소시키는 반면, 불일치 대조군은 세포 증식에 대해 영향을 미치지 않았다.
Figure 112006056137226-PCT00031
실시예 6: STAT3 안티센스 키메라 ( 데옥시 갭을 가진) 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드에 의한 BCL1 IgM 분비의 억제
BCL1 세포에서 IgM 분비 수준에 대한 아이시스 17152(서열번호 99)의 효과를 결정하였다. STAT3은 IgM 발현의 조절에 연루되었다[Faris, M. 등, Immunology, 1997, 90, 350-357]. BCL1 세포(1×106)를 5nm 또는 15nm의 STAT3 (아이시스 17152) 또는 불일치(아이시스 23177) 올리고뉴클레오티드로 실시예 3에 필수적으로 기재된 바와 같이 일렉트로포레이트하였다. 일렉트로포레이션 후에, 세포를 2mL 완전 RPMI에서 12-웰 플레이트에서 배양하였다. 일렉트로포레이션 후 24시간에 배지를 새로운 배지로 바꾸었다. 추가의 48시간 후에, 생육 배지를 수집하고 원심분리하여 세포를 제거하고, 생쥐 IgM 항체(미국 알라바마 버밍햄의 서던 바이오테크놀로지)를 포획 및 검출하기 위하여 OPT-EIATM ELISA 키트(미국 캘리포니아주 샌디에고 Pharmingen)를 사용하여 IgM 함량에 대해 분석하였다.
결과를 표 7에 나타낸다. 아이시스 17152(서열번호 99)는 불일치 대조군 올리고뉴클레오티드 (아이시스 23177)에 비하여 IgM 분비를 현저히 감소시켰다.
Figure 112006056137226-PCT00032
실시예 7: STAT3 안티센스 키메라 ( 데옥시 갭을 가진) 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로의 처리 후에 BCL1 세포에서 케모킨의 유도
BCL1 세포에서 케모킨 수준에 대한 아이시스 17152(서열번호 99)의 효과를 결정하였다. 5nm, 10nm 또는 20nm의 STAT3 (아이시스 17152) 또는 불일치(아이시스 23177) 올리고뉴클레오티드로, BCL1 세포를 필수적으로 실시예 3에 기재된 바와 같이 일렉트로포레이트하였다. 일렉트로포레이션 후 16시간에 10μM의 CpG-함유 올리고뉴클레오티드를 배지에 첨가함으로써 일렉트로포레이트화된 BCL1 세포에서 케모킨 유전자 발현을 유도하였다. CpG-함유 올리고뉴클레오티드는 면역-자극 분자이다[Krieg, A.M., 등 Nature, 1995, 374, 546-549]. 생쥐 케모킨 주형 세트, Mck-5 (미국 캘리포니아주 샌디에고 Pharmingen)를 사용하여 당업자에게 공지된 방법에 의해 RN아제 보호 분석을 사용하여 8시간 후에 케모킨 수준을 측정하였다.
결과를 표 8에 나타낸다. 아이시스 17152(서열번호 99)는 케모킨 RANTES, MIP-1-알파 및 MIP-1-베타의 발현을 유도할 수 있는 반면, 불일치 대조군은 최소의 효과를 갖는다.
Figure 112006056137226-PCT00033
실시예 8: 인간 STAT3 을 표적으로 하는 추가의 안티센스 올리고뉴클레오티드
서열번호 1을 표적으로 하는 추가의 올리고뉴클레오티드 세트를 설계하고, 10개의 2'-데옥시뉴클레오티드로 구성된 중심 "갭" 영역으로 이루어진, 20개 뉴클레오티드 길이의 키메라 올리고뉴클레오티드("개프머")로서 합성하였으며, 이것은 5개 뉴클레오티드 "날개"에 의해 양 측에서 (5' 및 3' 방향)에서 인접해 있다. 날개는 2'-O-메톡시에틸 (2'-MOE)뉴클레오티드 (굵게 나타냄)으로 구성된다. 뉴크레오티드간(주쇄) 결합은 올리고뉴클레오티드 전체에 걸쳐 포스포로티오에이트(P=S)이다. 모든 2'-MOE 시토신 및 2'-데옥시 시토신은 5-메틸-시토신이다. 이러한 올리고뉴클레오티드 서열을 표 9에 나타낸다.
Figure 112006056137226-PCT00034
Figure 112006056137226-PCT00035
이러한 올리고뉴클레오티드를 U266 세포에서 시험하거나 2.5μM의 올리고뉴클레오티드 농도에서 STAT3 발현을 감소시키는 능력을 시험하였다. U266 인간 골수종 세포주 (원래 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션으로부터 입수됨)를 보충된 RPMI 1640 배지 중의 표준 조건 하에서 유지하였다. 세포(PBS 중의 15×106 세포)를, BTX 일렉트로 스퀘어 포레이터 T820 (제네트로닉스, 미국 캘리포니아주 샌디에고)을 사용하여 하나의 6-밀리초 펄스에 의해 200V에서 올리고뉴클레오티드로 이입하였다. 세포를 RNA 추출 전에 24시간동안 배양하였다.
RN이지® 키트 (미국 캘리포니아주 산타 클라리타 퀴아겐)를 사용하여 전체 세포 RNA를 단리하였다. 표준 RT-PCR에 이어서 내포된 프라이머 반응에 의하여 MB-MDA 468 RNA로부터 제조된 cDNA 프로브를 사용하여, 15㎍의 RNA 위에서 노던 블롯 분석을 수행하였다. 몰레큘라 다이나믹스 포스포르이미저(Molecular Dynamics Phosphorimager)TM를 사용하여 시그날을 정량화하였다.
선택된 화합물(대조군 mRNA 발현의 퍼센트 및 mRNA 발현의 퍼센트 억제로서 표현됨)에 대한 결과를 표 10에 나타낸다.
Figure 112006056137226-PCT00036
아이시스 113176, 129987, 113187, 129991, 113209, 129995, 113210 및 129999 뿐만 아니라 아이시스 17148 및 생쥐 STAT3 올리고 아이시스 114054를 사용하여 투여량-반응성 실험을 수행하였다. 일련의 불일치 올리고뉴클레오티드, 아이시스 129987, 아이시스 114505, 아이시스 129991, 아이시스 129995 및 아이시스 129999를 대조군으로서 사용하였다. 결과를 표 11에 나타낸다.
Figure 112006056137226-PCT00037
아이시스 17148(서열번호 95), 113176 (서열번호 115), 113187(서열번호 126), 113209(서열번호 148) 및 113210(서열번호 149)는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 농도에서 50％ 이상만큼 STAT3 발현을 감소시켰다. 따라서, 이러한 화합물이 바람직하다.
실시예 9: STAT3 의 안티센스 억제는 생쥐 흑색종 세포에서 세포고사 세포 사멸을 유발한다.
생쥐 B16 흑색종 세포를 보충된 RPMI 1640 배지(라이프 테크놀로지스 인코포레이티드, 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드) 중에서 표준 조건 하에 생육시켰다.
세포를 생쥐 STAT3을 표적으로 하는 아이시스 17152(서열번호 99) 또는 3-염기 불일치 대조군, 아이시스 28084 (AAAAAGAGGCCTGATTGCCC; 서열번호 151)로 처리하였다. 세포를 리포펙타민TM 플러스J 시약(기브코BRL)을 사용하여 올리고뉴클레오티드로 이입하였다. 올리고뉴클레오티드를 100㎕ 무-혈청 RPMI 1640 배지와 혼합한 다음, 6㎕의 리포펙타민TM 플러스J 시약을 첨가함으로써 올리고뉴클레오티드를 리포펙타민TM 플러스J로 예비-착화시켰다. 샘플을 잘 혼합하고 실온에서 15분동안 배양하였다. 추가의 4㎕의 리포펙타민TM 플러스J 시약을 무-혈청 RPMI중에 100㎕까지 희석하였다. 이렇게 희석된 리포펙타민TM 플러스J를 예비-착화된 올리고뉴클레오티드/리포펙타민TM 플러스J 혼합물과 혼합하고 실온에서 15분동안 배양하였다. 800리터의 무-혈청 RPMI 1640을 첨가하고, 얻어진 올리고뉴클레오티드-리포펙타민 플러스J-배지 혼합물 (약 1ml)을 6-웰 플레이트에서 세포에 첨가하였다. 3시간 배양 후에, 20％ 태아 소 혈청으로 보충된 1ml의 RPMI 1640을 첨가하였다. 최종 올리고뉴클레오티드 농도는 200nM 또는 300nM이었다.
세포를 이입 후 24시간에 계수하여 세포 생존율에 대한 안티센스 처리 효과를 결정하였다. 웨스턴 블롯 분석을 위해 이입 후 24시간에 세포를 수집하고, 세포고사에 대한 아넥신-V 염색을 위해 이입 후 48시간에 수집하였다. 세포 수에 대한 올리고뉴클레오티드의 효과를 표 12에 나타낸다.
Figure 112006056137226-PCT00038
데이타는, STAT3 안티센스 올리고뉴클레오티드로의 처리가 불일치 대조군 올리고로의 처리에 비하여 세포 사멸을 증가시킨다는 것을 나타낸다.
B16 세포에서의 세포고사를, 아넥신 V-PE (미국 캘리포니아주 팔로 알토 클론테크)로의 염색에 의한 안티센스 처리 후 48시간에 측정한 다음, 유동 세포분석법에 의해 분석하였다. 아넥신-V에 대한 포지티브 염색은 세포고사의 지시인자이다. 모의-이입 및 대조군 올리고뉴클레오티드-처리된 세포는 각각 11％ 및 10％ 아넥신-V 포지티브 세포를 가졌다. 반대로, 30％ 아이시스 17152-처리된 세포는 아넥신-V 포지티브이며, 이것은 세포고사 세포 수의 거의 3배 증가를 나타낸다. 세포고사 분석에서 세포를 처리함에 있어서 사멸 세포가 씻겨져 나가기 때문에, 이러한 뚜렷한 증가가 STAT3 올리고로의 처리에 대한 반응에서 세포고사를 겪은 세포 수보다 과소평가되기 쉽다는 것을 주목해야 한다.
안티센스 처리 후에 24시간에 수집된 세포 상에서 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 STAT3을 검출하기 위하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 안티-STAT3 항체는 K15 산타 크루즈 바이오테크놀로지 (미국 캘리포니아주 산타 크루즈)로부터 구입되었다. 200nM 또는 300nM에서 아이시스 17152는 B16 세포에서 STAT3 단백질 생성을 현저히 감소시켰다.
실시예 10: 백혈병 대과립 림프구( LGL )에 대한 STAT3 안티센스 올리고뉴클레오티드의 효과
LGL 백혈병은 자가면역 특징을 가진 림프증식 질병이고, LGL 세포는 높은 수준의 Fas 및 FasL 발현에도 불구하고 Fas-의존성 세포고사를 겪지 않는 것으로 알려져 있다 [Lamy 등, Blood, 1998, 92, 4771-7]. 이러한 세포에서 세포고사 시그날에 대해 LGL 세포를 감작화하는 능력에 대하여 STAT3 안티센스 올리고뉴클레오티드를 시험하였다.
증가되는 LGL 수 및 클론 TCR 유전자 재배열을 가진 T 세포(CD3+) LGL 백혈병의 임상 기준을 만족하는 환자로부터 LGL 백혈구 세포를 수득하였다. 모든 환자는 분석 시점에서 치료를 요구하지 않는 만성 질병을 가졌다. 정제된 백혈병 LGL 세포 (2×106)를 24-웰 플레이트에서 0.5mL의 완전 배지 중에 도말하였다 (RPMI-1640으로 보충됨, 미국 미들랜드주 게이서스버그 기브코 라이프 테크놀로지스). 세포를 아이시스 17148 안티센스 올리고뉴클레오티드(서열번호 95) 또는 대조군 올리고뉴클레오티드, 아이시스 16094 (서열번호 152)와 함께 배양하였다. 수동 흡수에 의하여 안티센스 올리고뉴클레오티드를 LGL 백혈구 세포에 전달하였다. 전달을 위해 이입 시약을 사용하지 않았다.
1μM 투여량의 STAT3(아이시스 17148, 서열번호 95) 또는 대조군 불일치 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리된 3명의 환자의 각각의 LGL 세포로부터 추출물을 준비하였다. STAT3 단백질 수준을 결정하기 위하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. STAT3 단백질 수준에서의 감소는 불일치 올리고로 처리된 대조군에 비하여 25 내지 45％의 범위였다.
1, 2 및 5μM 의 투여량에서 STAT3 (아이시스 17148, 서열번호 95) 또는 대조군 불일치 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리된 LGL 세포에서의 유도 세포고사를 유동 세포분석법에 의해 측정하였다. 세포고사가 STAT3 안티센스 처리된 세포에서 상당히 증가하였으며 투여량 의존성이었다. 중복 반응에서 퍼센트 특이적 세포고사의 측정은, 비처리 세포에서의 약 5％로부터, 각각 1, 2 및 5μM 에서 STAT3 안티센스-처리된 세포에서 6, 17 및 24％의 수준까지 세포고사의 증가를 드러내었다. 대조군 올리고뉴클레오티드 처리된 세포에서 세포고사의 수준은 모든 투여량에서 약 6％로 유지되었다. 세포고사는 Fas-매개 경로를 통해 활성화되는 것으로 생각되었다.
실시예 11
STAT3 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리 후에 인간 골수종 세포주 U266 에서 세포고사의 유도
다발성 골수종(MM)은 과증식 질환이다. 이전의 연구는, 원상태 트랜스활성화 도메인이 결여된 우성 네가티브 STAT3의 발현에 대한 반응에서, MM 세포주 U266에서의 세포고사 증가를 나타내었다.
안티센스 STAT3 올리고뉴클레오티드 아이시스 17148(서열번호 95) 및 아이시스 113176 (서열번호 115)은, 불일치 대조군 올리고뉴클레오티드에 비해 U266 세포에서 세포고사를 증가시키는 능력에 대해 시험하였다. 다양한 양의 올리고뉴클레오티드를 이입에 의해 배양된 세포에 전달하였다. 노던 및 웨스턴 블롯에 의하여 STAT3 mRNA 및 단백질 수준을 결정하기 위하여 세포를 이입 후 48시간에 수집하였다. STAT3 mRNA 및 단백질의 상당한 투여량 의존성 감소가 STAT3 안티센스 올리고뉴클레오티드 양쪽 모두의 투여에 대한 반응에서 관찰되었다. 불일치 대조군 올리고뉴클레오티드는 STAT3 mRNA 또는 단백질 수준에 대한 의미있는 효과를 갖지 않았다.
상기 기재된 바와 같이 아넥신 5 염색 및 유동 세포분석법에 의하여 STAT3 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대한 반응에서 세포고사 증가에 대해 세포를 분석하였다. 아이시스 17148 및 아이시스 113176으로 이입된 세포에서 세포고사의 상당한 증가가 관찰되었다. 불일치 대조군 올리고뉴클레오티드로 처리된 세포에서 세포고사의 현저한 변화가 관찰되지 않았다.
실시예 12
2'- MOE 날개 및 데옥시 갭을 가진 키메라 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드에 의한 인간 STAT3 의 안티센스 억제
본 발명에 따르면, 공개된 서열 (진뱅크® 수탁 번호 L29277, 서열번호 1으로서 포함됨, 진뱅크® 수탁 번호 NT_010755.13(서열번호 153으로 포함됨) 및 진뱅크® 수탁 번호 NM_139276.1(서열번호 154로서 포함됨)을 가진 서열의 뉴클레오티드 4189213 내지 4263636의 보체)을 사용하여, 인간 STAT3의 상이한 영역을 표적으로 하기 위하여, 추가의 일련의 올리고뉴클레오티드를 설계하였다. 올리고뉴클레오티드를 표 13에 나타낸다. "표적 부위"는 올리고뉴클레오티드가 결합하는 특정한 표적 서열 위에서 첫번째 (5'-최외) 뉴클레오티드 수를 나타낸다. 표 13에서 모든 화합물은 10개 2'-데옥시뉴클레오티드로 구성된 중심 "갭" 영역으로 이루어진 20개 뉴클레오티드 길이의 키메라 올리고뉴클레오티드("개프머")이고, 이것은 5개 뉴클레오티드 "날개"에 의해 양 측 (5' 및 3' 방향) 위에서 인접한다. 날개는 2'-O-메톡시에틸 (2'-MOE) 뉴클레오티드로 구성된다. 뉴크레오티드간(주쇄) 결합은 올리고뉴클레오티드 전체에 걸쳐 포스포로티오에이트(P=S)이다. 모든 시티딘 잔기는 5-메틸시티딘이다.
A549 세포에서 STAT3 mRNA 수준에 대한 효과에 대하여 화합물을 분석하였다. 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC) (미국 버지니아주 마나사스)로부터 인간 폐 암종 세포주 A549를 수득하였다. A549 세포를 10％ 태아 소 혈청(인비트로겐 라이프 테크놀로지스, 미국 캘리포니아주 칼스배드), 100유닛/mL 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신(인비트로겐 라이프 테크놀로지스, 미국 캘리포니아주 칼스배드)로 보충된 DMEM 기본 배지 (인비트로겐 라이프 테크놀로지, 미국 캘리포니아주 칼스배드)에서 일반적으로 배양하였다. 90％ 융합에 이르를 때까지 트립신처리 및 희석에 의해 세포를 통과시켰다.
대조군 올리고뉴클레오티드로서 아이시스 18078호를 사용하고 75nM에서 사용하였다. 아이시스 18078(GTGCGCGCGAGCCCGAAATC, 서열번호 155)는 9개 2'-데옥시뉴클레오티드로 구성된 중심 "갭" 영역으로 이루어진 20개 뉴클레오티드 길이의 키메라 올리고뉴클레오티드("개프머")이고, 각각 5개-뉴클레오티드 및 6개-뉴클레오티드 "날개"에 의해 양 측(5' 및 3' 방향)에 인접한다. 날개는 2'-O-메톡시에틸 (2'-MOE) 뉴클레오티드로 구성된다. 뉴클레오시드간(주쇄) 결합은 올리고뉴클레오티드 전체에 걸친 포스포로티오에이트(P=S)이다. 모든 시티딘 잔기는 5-메틸시티딘이다.
세포가 65 내지 75％ 융합에 이르를 때, 이들을 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 96-웰 플레이트에서 배양된 세포에 대하여, 웰을 100L OPTI-MEM-1TM 환원-혈청 배지(인비트로겐 라이프 테크놀로지스, 미국 캘리포니아주 칼스배드)로 한번 세척한 다음, 3.75g/mL 리포펙틴TM (인비트로겐 라이프 테크놀로지스, 미국 캘리포니아주 칼스배드) 및 표 13에 있는 75nM의 화합물을 함유하는 130L의 OPTI-MEM-1TM으로 처리하였다. 세포를 처리하고 데이타를 중복하여 수득하였다. 비처리 세포가 대조군으로서 사용되었다. 37℃에서 4 내지 7시간의 처리 후에, 배지를 새로운 배지로 바꾸었다. 세포를 올리고뉴클레오티드 처리 후 16 내지 24시간에 수집하였다. A549 세포에서의 STAT3 mRNA 수준을 여기에 기재된 다른 방법에 의해 기재된 바와 같이 실시간 PCR에 의해 정량화하였다.
공개된 서열 정보(서열번호 1으로서 포함됨)을 사용하여 인간 STAT3 서열에 하이브리드형성하기 위하여 인간 STAT3에 대한 프로브 및 프라이머를 설계하였다. 프라이머-프로브 세트 199 (PPS199)에 대하여, PCR 프라이머는
정방향 프라이머: ACATGCCACTTTGGTGTTTCATAA (서열번호 156)
역방향 프라이머: TCTTCGTAGATTGTGCTGATAGAGAAC (서열번호 157)이고,
PCR 프로브는 FAM-CAGTATAGCCGCTTCCTGCAAGAGTCGAA-TAMRA (서열번호 158)이었으며, 여기에서 FAM은 형광 리포터 염료이고 TAMRA는 소광제 염료이다. 리보그린TM (몰레큘라 프로브 인코포레이티드, 미국 오레곤주 유진)을 사용하여 총 RNA를 정량화함으로써 실시간 RT-PCR에 의해 수득된 유전자 표적 양을 표준화하였다. 이 분석에서, 30㎕ 정제된 세포 RNA를 함유하는 96-웰 플레이트 내에 170㎕의 리보그린TM 작업 시약 (리보그린TM, 10mM 트리스-HCl, 1mM EDTA 중의 1:350으로 희석된 시약, pH 7.5)을 피펫으로 넣었다. 플레이트를 485nm에서의 여기 및 530nm에서의 방출을 가진 사이토플루오르(CytoFluor)® 4000 (PE 어플라이드 바이오시스템스, 미국 캘리포니아주 포스터시티)에서 판독하였다.
안티센스 올리고뉴클레오티드 처리의 결과는 2회 실험의 평균이고 표 13에 나타낸다. 데이타를 비처리 대조군 세포에 비해 퍼센트 억제로서 표현한다.
Figure 112006056137226-PCT00039
Figure 112006056137226-PCT00040
Figure 112006056137226-PCT00041
표 13에 나타낸 것과 같이, 서열번호 159, 161, 165, 166, 169, 170, 171, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 215, 216, 217, 220, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 232, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 293, 294, 295, 296, 297, 298 및 299는 인간 STAT3 발현을 적어도 60％ 억제하였다.
실시예 13
2'- MOE 날개 및 데옥시 갭을 가진 인간 STAT3 을 표적으로 하는 키메라 포스 포로티오에이트 올리고뉴클레오티드
본 발명에 따르면, 공개된 서열 (진뱅크® 수탁 번호 L29277, 서열번호 1으로 포함됨, 진뱅크® 수탁번호 NM_139276.1, 서열번호 154로서 포함됨)을 사용하여, 인간 STAT3의 상이한 영역을 표적으로 하기 위하여 추가의 일련의 올리고뉴클레오티드를 설계하였다. 올리고뉴클레오티드를 표 14에 나타낸다. "표적 부위"는 올리고뉴클레오티드가 결합하는 특정한 표적 서열 위의 첫번째 (5'-최외) 뉴클레오티드 수를 나타낸다. 표 14에서의 모든 화합물은 10개의 2'-데옥시뉴클레오티드로 구성된 중심 "갭" 영역으로 이루어진 20개 뉴클레오티드 길이의 키메라 올리고뉴클레오티드("개프머")이고, 이것은 5개-뉴클레오티드 "날개"에 의해 양 측(5' 및 3'-방향)에서 인접한다. 날개는 2'-O-메톡시에틸 (2'-MOE)뉴클레오티드로 구성된다. 뉴크레오티드간(주쇄) 결합은 올리고뉴클레오티드 전체에 걸친 포스포로티오에이트(P=S)이다. 모든 시티딘 잔기는 5-메틸시티딘이다.
A549 세포에서 인간 STAT3 발현에 미치는 효과에 대하여 화합물을 시험하였다. 세포를 1.5㎕/mg 리포펙틴TM과 혼합된 50nM 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 세포를 이입 후 약 20시간에 수집하고, 실시간 PCR을 사용하여 STAT3 mRNA 발현을 측정하였다. 데이타는 2회 실험의 평균이고 비처리 대조군 세포에 비해 퍼센트 억제율로서 표 14에 나타낸다.
Figure 112006056137226-PCT00042
Figure 112006056137226-PCT00043
Figure 112006056137226-PCT00044
실시예 14
2'- MOE 날개 및 데옥시 갭을 가진, 생쥐 STAT3 을 표적으로 하는 키메라 포 스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드
본 발명에 따르면, 공개된 서열 (진뱅크® 수탁 번호 U06922.1, 서열번호 82로 포함됨, 진뱅크® 수탁번호 U30709.1, 서열번호 382로서 포함됨)을 사용하여, 생쥐 STAT3 RNA의 상이한 영역을 표적으로 하기 위하여 추가의 일련의 올리고뉴클레오티드를 설계하였다. 올리고뉴클레오티드를 표 15에 나타낸다. "표적 부위"는 올리고뉴클레오티드가 결합하는 특정한 표적 서열 위의 첫번째 (5'-최외) 뉴클레오티드 수를 나타낸다. 표 15에서의 모든 화합물은 10개의 2'-데옥시뉴클레오티드로 구성된 중심 "갭" 영역으로 이루어진 20개 뉴클레오티드 길이의 키메라 올리고뉴클레오티드("개프머")이고, 이것은 5개-뉴클레오티드 "날개"에 의해 양 측(5' 및 3'-방향)에서 인접한다. 날개는 2'-O-메톡시에틸 (2'-MOE)뉴클레오티드로 구성된다. 뉴크레오티드간(주쇄) 결합은 올리고뉴클레오티드 전체에 걸친 포스포로티오에이트(P=S)이다. 모든 시티딘 잔기는 5-메틸시티딘이다.
Figure 112006056137226-PCT00045
추가의 구현양태에서, 공개된 서열 (진뱅크® 수탁 번호 U06922.1, 서열번호 82로 포함됨)을 사용하여, 생쥐 STAT3 RNA의 상이한 영역을 표적으로 하기 위하여 추가의 일련의 올리고뉴클레오티드를 설계하였다. 화합물을 표 16에 나타낸다. "표적 부위"는 화합물이 결합하는 특정한 서열 위의 첫번째 (5'-최외) 뉴클레오티드 수를 나타낸다. 표 16에서의 모든 화합물은 12개의 2'-데옥시뉴클레오티드로 구성된 "갭" 영역으로 이루어진 키메라 올리고뉴클레오티드이고, 이것은 2'-O-메톡시에틸 (2'-MOE) 뉴클레오티드로 구성된 "날개"에 의해 양 측(5' 및 3'-방향)에서 인접한다. 갭에서의 2'-MOE 뉴클레오티드의 수는 2 내지 5개 뉴클레오티드의 길이이고, 2'-데옥시뉴클레오티드는 일반 형태로 나타내고 2'-MOE 뉴클레오티드는 굵은 형태로 나타낸다. 각각의 올리고뉴클레오티드의 실제 구조는 "날개" 구조로서 표 16에 나타낸다. 예를들어, 5~10~5의 명명법은, 첫번째 및 마지막 5개 뉴클레오티드가 2'-MOE 뉴클레오티드이고 중심 10개 뉴클레오티드가 2-데옥시뉴클레오티드임을 나타낸다. 뉴클레오시드간(주쇄) 결합은 올리고뉴클레오티드 전체에 걸친 포스포로티오에이트(P=S)이다. 비변형 시티딘 잔기가 강조되고, 모든 다른 시티딘 잔기는 5-메틸시티딘이다.
Figure 112006056137226-PCT00046
본 발명의 추가의 구현양태에서, 공개된 서열 (진뱅크® 수탁 번호 U06922.1, 서열번호 82로 포함됨)을 사용하여, 생쥐 STAT3 RNA의 상이한 영역을 표적으로 하기 위하여 추가의 일련의 올리고뉴클레오티드를 설계하였다. 올리고뉴클레오티드를 표 17에 나타낸다. "표적 부위"는 올리고뉴클레오티드가 결합하는 특정한 표적 서열 위의 첫번째 (5'-최외) 뉴클레오티드 수를 나타낸다. 표 17에서의 모든 화합물은 2'-O-메톡시에틸(2'-MOE) 뉴클레오티드로 균일하게 구성된다. 뉴크레오티드간(주쇄) 결합은 올리고뉴클레오티드 전체에 걸친 포스포로티오에이트(P=S)이고, 모든 시티딘 잔기는 5-메틸시티딘이다.
Figure 112006056137226-PCT00047
실시예 15
2'- MOE 날개 및 데옥시 갭을 가진 키메라 올리고뉴클레오티드에 의한 인간 STAT3 의 안티센스 억제: 투여량 반응
본 발명에 따르면, 인간 STAT3을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 부분집합을 투여량-반응 연구에서 더욱 조사하였다. T-24 세포에서 인간 STAT3 mRNA 수준에 미치는 영향에 대하여 화합물을 분석하였다.
전이되는 세포 방광 암종 세포주 T-24를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC, 미국 버지니아주 마나사스)로부터 구입하였다. T-24 세포를 10％ 태아 소 혈청, mL 페니실린 당 100유닛, 및 mL 스트렙토마이신 당 100마이크로그램이 보충된 완전 맥코이 5A 기본 배지(미국 캘리포니아주 칼스배드, 인비트로겐 라이프 테크놀로지스로부터의 배지 및 보충물) 중에서 일상적으로 배양하였다. 세포가 90％ 융합에 이르를 때 트립신처리 및 희석에 의해 세포를 일상적으로 통과시켰다. 세포를 안티센스 올리고뉴클레오티드 이입 실험에서 사용하기 위해 7000세포/웰의 밀도에서 96-웰 플레이트 (팔콘-파마시아 #3872, BD 바이오사이언스, 미국 메사츄세츠주 베드포드)내에 접종하였다.
사용된 대조군 올리고뉴클레오티드는 아이시스 129695 (TTCTACCTCGCGCGATTTAC, 서열번호 391), 아이시스 129694(GTACAGTTATGCGCGGTAGA 서열번호 392), 아이시스 129690 (TTAGAATACGTCGCGTTATG 서열번호 393), 아이시스 129686(CGTTATTAACCTCCGTTGAA 서열번호 394), 아이시스 116847(CTGCTAGCCTCTGGATTTGA, 서열번호 395) 및 아이시스 113529(CTCTTACTGTGCTGTGGACA 서열번호 396)이었다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 STAT3을 표적으로 하지 않고 네가티브 대조군으로서 사용된다.
T-24 세포를 다른 실시예에 기재된 바와 같이 100nM 올리고뉴클레오티드 당 3 ㎍/mL 리포펙틴TM과 혼합된 18.75, 37.5, 75 또는 150nM의 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 비처리 세포가 대조군으로서 사용되었다. 16시간 처리 후에, 이후의 실시간 PCR 분석을 위한 세포로부터 RNA를 제조하였다.
프라이머 프로브 세트 PPS199를 사용하여 실시간 PCR에 의해 인간 STAT3 mRNA 발현 수준을 정량화하고, 다른 실시예에 기재된 바와 같이 리보그린®을 사용하여 유전자 표적 양을 표준화하였다. 데이타는 2개 실험으로부터의 평균이고 표 18에 나타낸다. "-" 및 "+" 표시는 각각 비처리 대조군 세포에 비하여 STAT3 mRNA 발현의 감소 또는 증가를 나타낸다.
Figure 112006056137226-PCT00048
표 18에 나타낸 것과 같이, 시험된 화합물은 투여량-의존성 방식으로 인간 STAT3 mRNA 발현을 억제한다.
투여량-반응을 T-24세포에서 반복하고, 상이한 프라이머-프로브 세트(PPS 2033이라 불림)를 사용하여 유전자 표적 양을 측정하였다. PPS2033은 인간 STAT3에 대한 프로브 및 프라이머를 포함하고, 공개된 서열 정보(여기에서 서열번호 154)를 사용하여 인간 STAT3 서열에 하이브리드되도록 설계된다. PPS2033에 대하여 PCR 프라이머는 정방향 프라이머: GAGGCCCGCCCAACA(서열번호 397), 역방향 프라이머: TTCTGCTAATGACGTTATCCAGTTTT(서열번호 398)이고, PCR 프로브는 FAM-CTGCCTAGATCGGC-MGB (서열번호 399)이고, 여기에서 FAM은 형광 리포터 염료이고 MGB는 소광제 염료이다. 실시간 PCR에 의해 수득된 유전자 표적 양은 리보그린TM(몰레큘라 프로브,인코포레이티드. 미국 오레곤주 유진)을 사용하여 전체 RNA을 정량화함으로써 표준화한다. 사용된 대조군 올리고뉴클레오티드는 아이시스 129695 (서열번호 391), 아이시스 129694 (서열번호 392), 아이시스 129690 (서열번호 393), 아이시스 129686 (서열번호 394), 아이시스 116847(서열번호 395) 및 아이시스 113529 (서열번호 396)이었다.
다른 실시예에 기재된 바와 같이 100nM 올리고뉴클레오티드 당 3㎍/mL 리포펙틴TM과 혼합된 18.75, 37.5, 75 또는 150 nM의 올리고뉴클레오티드로 T-24 세포를 처리하였다. 비처리 세포가 대조군으로서 사용되었다. 16시간의 처리 후에, 이후의 실시간 PCR 분석을 위한 세포로부터 RNA를 제조하였다.
프라이머 프로브 세트 PPS2033을 사용하여 인간 STAT3 mRNA 발현 수준을 실시간 PCR에 의해 정량화하고, 다른 실시예에 기재된 바와 같이 리보그린®을 사용하여 유전자 표적 양을 표준화하였다. 데이타는 2개 실험으로부터의 평균이고, 표 19에 나타내었다. "-" 또는 "+" 표시는 각각 비처리 대조군 세포에 비하여 STAT3 mRNA 발현의 감소 또는 증가를 나타낸다.
Figure 112006056137226-PCT00049
표 19에 나타낸 바와 같이, PPS2033을 사용한 표적 유전자 양의 측정은, 시험된 화합물이 투여량-의존성 방식으로 인간 STAT3 mRNA 발현을 억제한다는 것을 증명한다.
추가의 투여량-반응 실험을 A549 세포에서 수행하였다. A549 세포를 다른 실시예에 기재된 바와 같이 100nM 올리고뉴클레오티드 당 3 ㎍/mL 리포펙틴TM과 혼합된 18.75, 37.5, 75 또는 150nM의 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 사용된 대조군 올리고뉴클레오티드는 아이시스 129686(서열번호 394) 및 아이시스 129690 (서열번호 393)이었다. 비처리 세포가 대조군으로서 사용된다. 처리 16시간 후에, 이후의 실시간 PCR 분석을 위하여 RNA를 세포로부터 제조하였다.
프라이머 프로브 세트 PPS199를 사용하여 인간 STAT3 mRNA 발현 수준을 실시간 PCR에 의해 정량화하였으며, 다른 실시예에 기재된 바와 같이 리보그린TM을 사용하여 유전자 표적 양을 표준화하였다. 데이타는 2개 실험으로부터의 평균이고 표 20에 나타낸다. "-" 또는 "+" 표시는 각각 비처리 대조군 세포에 비하여 STAT3 mRNA 발현의 감소 또는 증가를 나타낸다.
Figure 112006056137226-PCT00050
표 20에 나타낸 바와 같이, 시험된 화합물은 투여량 의존성 방식으로 A549 세포에서 인간 STAT3 mRNA 발현을 억제한다.
실시예 16
RNA 합성
일반적으로, RNA 합성 화학은 전략상 중요한 중간 반응에서 각종 보호기의 선택적 혼입을 기초로 한다. 당업자라면 유기 합성에서 보호기의 사용을 이해할 것이지만, 보호기의 유용한 부류는 실릴 에테르를 포함한다. 특히, 2'-히드록실 위에서 산-불안정성 오르소에스테르 보호기와의 조합에서 5'-히드록실을 보호하기 위하여 부피가 큰 실릴 에테르가 사용된다. 이러한 일련의 보호기들을 표준 고체상 합성 기술에서 사용한다. 모든 다른 합성 단계 후에 산 불안정성 오르소에스테르 보호기를 마지막에 제거하는 것이 중요하다. 또한, 합성 동안에 실릴 보호기를 조기 사용하면, 2'-히드록실이 바람직하지 않게 탈보호되지 않으면서, 원할 경우 손쉬운 제거를 보장한다.
차별적으로 제거되고 차별적으로 화학적으로 불안정한 보호기에 의하여 2-히드록실의 보호와 함께 5'-히드록실의 연속 보호를 위한 절차를 행한 후에, RNA 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
RNA 올리고뉴클레오티드를 단계적 방식으로 합성한다. 각각의 뉴클레오티드를 순서대로 (3'- 내지 5'- 방향) 고체 지지체-결합된 올리고뉴클레오티드에 첨가한다. 사슬의 3'-말단에서 첫번째 뉴클레오시드가 고체 지지체에 공유 결합된다. 뉴클레오티드 전구체, 리보뉴클레오시드 포스포르아미디트 및 활성화제를 첨가하고, 두번째 염기를 첫번째 뉴클레오시드의 5'-말단에 결합시킨다. 지지체를 세척하고 반응되지 않은 5'-히드록실 기를 아세트 안히드라이드로 캡형성하여 5'-아세틸 잔기를 얻는다. 이어서, 결합을 더욱 안정하고 궁극적으로 바람직한 P(V) 결합으로 산화시킨다. 뉴클레오티드 첨가 주기의 마지막에, 5'-실릴 기를 플루오라이드로 절단한다. 각각의 뉴클레오티드에 대해 주기를 반복한다.
합성 후에, DMF중에서 1M 디소듐-2-카르바모일-2-시아노에틸렌-1,1-디티올레이트 삼수화물(S2Na2)을 사용하여 포스페이트 위의 메틸 보호기를 30분 내에 절단한다. 탈보호 용액을 물을 사용하여 고체 지지체-결합된 올리고뉴클레오티드로부터 세척한다. 지지체를 물 중의 40％ 메틸아민으로 55℃에서 10분동안 처리한다. 이것은 RNA 올리고뉴클레오티드를 용액으로 방출하고 엑소시클릭 아민을 탈보호하고 2'-기를 변형시킨다. 올리고뉴클레오티드를 이 단계에서 음이온 교환 HPLC에 의해 분석할 수도 있다.
2'-오르소에스테르 기는 제거되어지는 마지막 보호기이다. 에틸렌 글리콜 모노아세테이트 오르소에스테르 보호기(다르마콘 리서치 인코포레이티드(미국 코넥티컷주 라파이에트))가 유용한 오르소에스테르 보호기의 한가지 예이고, 이것은 하기 중요한 성질을 갖는다. 이것은 뉴클레오시드 포스포르아미디트 합성 및 올리고뉴클레오티드 합성 조건에 대해 안정하다. 그러나, 올리고뉴클레오티드 합성 후에, 올리고뉴클레오티드를 메틸아민으로 처리하며, 이것은 고체 지지체로부터 올리고뉴클레오티드를 절단할 뿐만 아니라 오르소에스테르로부터 아세틸 기를 제거한다. 오르소에스테르 위의 2-에틸-히드록실 치환기는 아세틸화 전구체에 비해 덜 전자를 끈다. 그 결과, 변형된 오르소에스테르가 산-촉매화 가수분해에 대해 더욱 불안정화된다. 구체적으로, 절단 속도는 아세틸 기가 제거된 후에 대략 10배 더 빠르다. 따라서, 이러한 오르소에스테르는 올리고뉴클레오티드 합성과 친화성이 되기 위해 충분한 안정성을 갖고 있으며, 이후에 변형될 때 최종 RNA 올리고뉴클레오티드 생성물과 친화성인 비교적 온화한 수성 조건하에서 탈보호가 수행될 수 있다.
추가로, RNA 합성 방법이 당 기술분야에 공지되어 있다 [Scaringe,S.A Ph.D. Thesis, University of Colorado, 1996; Scaringe,S.A. 등, J.Am.Chem.Soc., 1998, 120, 11820-11821; Matteucci, M.D. 및 Caruthers, M.H. J.Am.Chem.Soc. 1981, 103, 3185-3191; Beaucage S.L. 및 Caruthers,M.H. Tetrahedron Lett., 1981, 22, 1859-1862; Dahl, B.J. 등, Acta Chem. Scand,. 1990, 44, 639-641; Reddy,M.P. 등, Tetrahedron Lett., 1994, 25, 4311-4314; Wincott,F. 등, Nucleic Acids Res., 1995, 23, 2677-2684; Griffin,B.E. 등, Tetrahedron, 1967, 23, 2301-2313; Griffin,B.E. 등, Tetrahedron, 1967, 23, 2315-2331].
본 발명의 RNA 안티센스 화합물(RNA 올리고뉴클레오티드)는 여기에 기재된 방법에 의해 합성될 수 있거나 다마콘 리서치 인코포레이티드(Dharmacon Research, Inc.) (미국 코넥티컷주 라파에트)로부터 구입된다. 일단 합성되면, 상보성 RNA 안티센스 화합물이 당 기술분야에 공지된 방법에 의해 어닐링되어 이중 가닥(이중가닥) 안티센스 화합물을 형성할 수 있다. 예를들어, 각각 30㎕의 RNA 올리고뉴클레오티드의 상보성 가닥(50 μM RNA 올리고뉴클레오티드 용액) 및 15㎕의 5X 어닐링 완충액(100mM 아세트산칼륨, 30mM HEPES-KOH pH 7.4, 2mM 아세트산마그네슘)을 조합한 다음 90℃에서 1분동안 가열하고 37℃에서 1시간동안 가열함으로써 이중가닥이 형성될 수 있다. 얻어진 이중가닥 안티센스 화합물은 표적 핵산의 역할을 조사하거나 진단 또는 치료적 목적을 위하여 키트, 분석, 스크린 또는 기타 방법에서 사용될 수 있다.
실시예 17
STAT3 을 표적으로 하는 이중가닥 안티센스 화합물의 설계 및 선별
본 발명에 따르면, STAT3을 표적화하기 위하여, 본 발명의 안티센스 화합물 및 그의 보체를 포함하는 일련의 핵산 이중가닥을 설계할 수 있다. 이중가닥의 안티센스 가닥의 뉴클레오염기 서열은 여기에 개시된 바와 같이 STAT3을 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부를 포함한다. 돌출부를 형성하기 위해, 하나 이상의 천연 또는 변형 뉴클레오염기를 첨가하여 가닥의 말단을 변형시킬 수도 있다. dsRNA의 센스 가닥을 설계하고, 안티센스 가닥의 보체로서 합성하며, 이것은 어느 한쪽 말단에 대한 변형 또는 첨가를 함유할 수도 있다. 예를들어, 하나의 구현양태에서, dsRNA 이중가닥의 양쪽 가닥이 중심 뉴클레오염기에 대해 상보적이고, 각각 한쪽 또는 양쪽 말단에서 돌출부를 갖는다. 이중가닥의 안티센스 및 센스 가닥은 약 17 내지 25개 뉴클레오티드, 또는 약 19 내지 23개 뉴클레오티드를 포함한다. 대안적으로, 안티센스 및 센스 가닥은 20, 21 또는 22개 뉴클레오티드를 포함한다.
예를들어, 서열 CGAGAGGCGGACGGGACCG을 갖고 데옥시티미딘(dT)의 2개-뉴클레오염기 돌출부를 갖는 안티센스 가닥을 포함하는 이중가닥이 하기 구조를 갖는다:
Figure 112006056137226-PCT00051
돌출부는 2 내지 6개 뉴클레오염기의 범위일 수 있고, 이러한 뉴클레오염기는 표적 핵산에 대해 상보적일 수도 있거나 그렇지 않을 수도 있다. 다른 구현양태에서, 이중가닥은 단지 하나의 말단에서 돌출부를 가질 수도 있다.
다른 구현양태에서, 나타낸 바와 같이 블런트 말단(단일 가닥 돌출부가 없음)을 가진 동일한 서열 CGAGAGGCGGACGGGACCG를 가진 안티센스 가닥을 포함하는 이중가닥을 제조할 수도 있다:
Figure 112006056137226-PCT00052
RNA 이중가닥은 일분자 또는 이분자일 수 있고, 다시말해서 2개의 가닥이 단일 분자의 일부일 수 있거나 별개의 분자일 수도 있다.
이중가닥의 RNA 가닥을 여기에 기재된 방법에 의해 합성할 수 있거나, 또는다마콘 리서치 인코포레이티드(미국 코넥티컷주 라파에트)로부터 구입할 수 있다. 일단 합성되면, 상보성 가닥을 어닐링한다. 단일 가닥을 분취하고 50μM의 농도로 희석한다. 일단 희석되면, 30㎕의 각각의 가닥을 15㎕의 어닐링 완충액의 5X 용액과 합한다. 상기 완충액의 최종 농도는 100mM 아세트산칼륨, 30mM HEPES-KOH pH 7.4 및 2mM 아세트산마그네슘이다. 최종 부피는 75㎕이다. 이 용액을 90℃에서 1분동안 배양한 다음 15초 동안 원심분리하였다. 관을 37℃에서 1시간동안 정치시키고, 이 때 dsRNA 이중가닥을 실험에서 사용한다. dsRNA 이중가닥의 최종 농도는 20μM이다. 이 용액을 동결 보관하고(-20℃), 5번까지 동결-해동시켰다.
일단 제조되면, 이중가닥 안티센스 화합물을 STAT3을 조절하는 능력에 대해 평가한다.
세포가 80％ 융합에 이르를 때, 이들을 본 발명의 이중가닥 안티센스 화합물로 처리한다. 96-웰 플레이트에서 생육된 세포에 대하여, 웰을 200L OPTI-MEM-1TM 감소된 혈청 배지(기브코 BRL)로 한번 세척한 다음, 12g/mL 리포펙틴TM (기브코 BRL) 및 바람직한 이중가닥 안티센스 화합물을 200nM의 최종 농도(100nM 이중가닥 안티센스 화합물 당 6g/mL 리포펙틴TM의 비율)로 함유하는 130L의 OPTI-MEM-1TM으로 처리한다. 5시간의 처리 후에, 배지를 새로운 배지로 바꾼다. 세포를 처리 후 16시간에 수집하고, 이 때 RNA를 단리하고 RT-PCR에 의해 표적 감소를 측정하였다.
공개된 서열(진뱅크® 수탁 번호 L29277, 서열번호 1로서 여기에 포함됨)을 사용하여 STAT3 mRNA를 표적화하기 위하여 본 발명의 안티센스 화합물 및 그의 보체를 포함하는 일련의 핵산 이중가닥을 설계하였다. 이중가닥의 안티센스 가닥의 뉴클레오염기 서열은 20개 뉴클레오티드 길이이다. 안티센스 가닥의 서열을 표 21에 나타낸다. dsRNA의 센스 가닥을 설계하고, 안티센스 가닥의 보체로서 합성한다.
표 21의 모든 화합물은 올리고데옥시뉴클레오티드이고, 3' 말단 위에 2개 뉴클레오티드를 가진 21개 뉴클레오티드 길이는 TT 돌출부이고 전체에 걸쳐 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 결합(주쇄)을 갖는다. 이러한 서열은 티민(T)을 함유하는 것으로 나타나지만, 당업자라면 티민(T)이 RNA 서열에서 우라실(U)에 의해 일반적으로 치환된다는 것을 이해할 것이다.
Figure 112006056137226-PCT00053
표 21의 화합물을 A549 세포에서 인간 STAT3 발현에 비치는 효과에 대해 시험하였다. 아이시스 330249 및 그의 보체를 포함한 dsRNA는 안티센스 올리고뉴클레오티드 아이시스 106734(서열번호 45)와 동일한 부위를 표적으로 하고, 아이시스 330247 및 그의 보체를 포함하는 dsRNA는 안티센스 올리고뉴클레오티드 아이시스 113176 (서열번호 115)와 동일한 부위를 표적으로 하며; 따라서 아이시스 106734 및 아이시스 113176이 또한 시험되었다. A549 세포를 여기에 기재된 바와 같이 리포펙틴TM(미국 캘리포니아주 칼스배드의 인비트로겐 라이프 테크놀로지스)과 혼합된 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 사용된 올리고뉴클레오티드 농도를 표 22에 나타낸다. 사용된 대조군 올리고뉴클레오티드는 아이시스 129698 (TTTGATCGAGGTTAGCCGTG, 서열번호 402)이었다. 세포를 4시간동안 올리고뉴클레오티드로 처리하고 추가로 16시간 후에 수집하였다. 비처리 세포를 대조군으로서 사용하였다.
프라이머 프로브 세트 PPS199를 사용하여 인간 STAT3 mRNA 발현 수준을 실시간 PCR에 의해 정량화하고, 유전자 표적 양을 다른 실시예에 기재된 바와 같이 리보그린TM을 사용하여 표준화하였다. 데이타는 2회 실험으로부터의 평균이고 표 22에 나타낸다. "-" 또는 "+" 는 각각 비처리 대조군 세포에 비하여 STAT3 mRNA 발현의 감소 또는 증가를 나타낸다. 존재하는 경우, "N.D."는 결정되지 않음을 나타낸다.
Figure 112006056137226-PCT00054
실시예 18
전립선 압종의 LNCaP 생쥐 모델에서 종양 성장 억제
인간 전립선 암종의 LNCaP 생쥐 모델은 문헌[Kiyama 등, Cancer Res. 63: 3575-3584, 2003 (여기에서 참고문헌으로 인용됨)]에 기재되어 있다. 간략하게, LNCaP 인간 전립선 암종 세포를 배양하고 5％ 열-불활성화 태아 소 혈정으로 보충된 RPMI 배지 (미국 캘리포니아주 칼스배드의 인비트로겐 라이프 테크놀로지스)에 유지하였다. 약 1×106 LNCaP 세포를 6 내지 8주령 수컷 무흉선 무모 생쥐(할랜 스프라그 돌리, 인코포레이티드, 미국 인디애나주 인디아나폴리스)의 측면 영역에서 메톡시플루오란 마취 하에 27-게이지 바늘을 통해 0.1ml의 마트리겔(미국 뉴저지주 프랭클린 레이크의 벡톤 디킨슨 랩웨어)로 피하 접종하였다. 300 내지 500mm3 부피 사이의 종양을 가진 생쥐를 음낭 접근을 통해 거세하고, 첫번째 주일동안 1주 당 5회에 이어서 그 후에 1주당 3회로 복강내에 10mg/kg의 아이시스 113176(서열번호 115) 인간 안티센스 또는 아이시스 129987(서열번호 404) 인간 불일치 대조군 STAT3 올리고뉴클레오티드로 무작위로 처리하였다. 처리는 거세 후 1일에 시작되었다. 종양 부피 및 혈청 전립선 특이적 항원(PSA) 측정을 1주 1회 수행하였다. 종양 부피는 식 L X W X H X 0.5236 에 의해 계산하였다 [Gleave 등, Cancer Res. 51: 1598-1605, 1992]. 혈액 샘플을 생쥐의 꼬리 정맥 절개로부터 수득하고, 제조업자의 프로토콜에 따라서 혈청 PSA 수준을 0.2㎍/리터의 감도 하한치를 가진 효소적 면역분석 키트에 의해 결정하였다 (Abbott IMX, 캐나다 퀘벡 몬트리올).
아이시스 113176은 거세된 무모 생쥐에서 LNCaP 이종이식 모델에서 혈청 PSA 수준 및 종양 성장의 유도를 억제하였다. 불일치 대조군 올리고뉴클레오티드 아이시스 129987을 가진 생쥐의 유사한 처리는 효과를 갖지 않았다. PSA 및 종양 부피에 대해 관찰된 STAT3 안티센스 올리고뉴클레오티드-매개 효과는 불일치 올리고뉴클레오티드 아이시스 129987 또는 염수 처리된 대조군(학생의 t-시험, p≤0.05)와 상당히 상이하였다. 처리 효과는 관찰 기간의 마지막에 증명되었다 (거세 후 10주). 이러한 접근의 가능한 표적-특이적 독성을 해결하기 위하여, 정상 생쥐를 최적화된 생쥐 STAT3 안티센스 올리고뉴클레오티드로 피하 처리하고(50mg/kg 이하, 2주일동안 1주당 3회), 약력학적 및 독성 효과를 혈액, 간 및 골수에서 평가하였다. STAT3 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리는 85％ 간 mRNA를 감소시키고, 골수 예비-단핵세포 소집단에서 STAT3 단백질을 상당히 억제하였다. STAT3 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리된 동물에서 완전 혈액 계수, 간 조직 또는 골수 소집단에서 명백한 변화가 관찰되지 않았다. STAT3의 간 및 골수 발현은 STAT3 안티센스 올리고뉴클레오티드로의 처리에 의해 상당히 감소되었다. 따라서, STAT3에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 전립선 암의 치료를 위해 치료 기회를 나타낸다.
실시예 19
1차 인간 간세포에서 인간 STAT3 의 안티센스 억제: 투여량 반응
추가의 구현양태에서, 1차 인간 간세포에서 투여량 반응 연구를 위하여 인간 STAT3을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 선택하였다. 1차 인간 간세포를 인비트로 테크놀로지스(미국 미들랜드주 발티모어)로부터 구입하였다. 세포를 24-웰 플레이트(미국 메사츄세츠주 베드포드 팔콘-파마시아, BD 바이오사이언스)에 50,000세포/웰의 밀도로 10％ 태아 소 혈청, 100유닛/mL 페니실린 및 100㎍/mL 스트렙토마이신이 보충된 고-글루코스 DMEM 배지 (미국 캘리포니아주 칼스배드 인비트로겐 라이프 테크놀로지스로부터의 배지 및 보충물)에 도말하였다. 세포를 밤새 고정시키고, 그 다음날 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리하였다.
이러한 분석에서 처리된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 아이시스 113196, 아이시스 337332, 아이시스 337333, 아이시스 345778, 아이시스 345781, 아이시스 345794, 아이시스 345815 및 아이시스 345823이었다. 세포를 100nM의 올리고뉴클레오티드 당 3 ㎍/mL 리포펙틴TM의 농도에서 리포펙틴TM과 혼합된 5, 10, 25, 50 및 150nM의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 비처리 세포는 데이타가 표준화되는 대조군으로서 사용되었다. 4시간 후에, 배양 배지를 바꾸고 세포를 추가로 20시간동안 배양하였다. RNA를 단리하고, 여기에 기재된 바와 같이 PPS199를 사용하여 실시간 PCR에 의해 STAT3 mRNA 수준을 측정하였다. 데이타를 3번 수득하고 평균내었다. 결과를 비처리 대조군에 비해 퍼센트 mRNA 발현으로서 표 23에 나타낸다. 시험된 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대하여, STAT3 mRNA 발현이 50％ 억제되는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 농도인 IC50을 표 24에 나타낸다.
Figure 112006056137226-PCT00055
Figure 112006056137226-PCT00056
표 23에 나타낸 것과 같이, 아이시스 113196, 아이시스 337332, 아이시스 345794 및 아이시스 345823은 투여량-의존성 방식으로 1차 인간 간세포에서 인간 STAT3 mRNA 수준을 감소시켰다. 표 24에 나타낸 것과 같이, 아이시스 345794는 가장 낮은 IC50을 나타내었다.
상기 기재된 세포에서 STAT1의 발현 수준을 표 25에 나타낸다. STAT1 발현 수준을, 당 기술분야에서 일상적이고 여기에 기재된 방법에 의해 설계된 프라이머 및 프로브를 사용하여 실시간 PCR에 의해 측정하였다 (예, 프라이머 익스프레스® 어플라이드 바이오시스템스, 미국 캘리포니아주 포스터시티).
Figure 112006056137226-PCT00057
표 25에 나타낸 바와 같이, STAT3을 표적으로 한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 STAT1 발현의 실질적 또는 투여량-의존성 억제를 유발하지 않았다. 당 기술분야에 알려진 유전자 분석 기술인, 아이시스 345794의 기본 국소 정렬 조사 도구(basic local alignment search tools; BLAST) 분석은, STAT3 이외의 핵산 분자에 대한 상동성을 나타내지 않았다.
실시예 20
HepG2 세포에서 인간 STAT3 의 안티센스 억제: 투여량 반응
추가의 구현양태에서, HepG2 세포에서 투여량 반응 연구를 위하여 인간 STAT3을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 선택하였다.
아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(미국 버지니아주 마나사스)로부터 인간 간모세포종 세포 주 HepG2를 수득하였다. HepG2 세포를, 1.5g/L 중탄산나트륨을 함유하도록 조절되고 10％ 태아 소 혈청, 0.1mM 비-필수 아미노산 및 1mM 소듐 피루베이트로 보충된 이글스(Eagle's) MEM (인비트로겐 라이프 테크놀로지스, 미국 캘리포니아주 칼스배드)에서 일상적으로 배양하였다. 세포가 약 90％ 융합에 이르렀을 때 트립신처리 및 희석에 의해 세포를 통과시켰다. 포스페이트-완충 염수에서 유형 1 생쥐 꼬리 콜라겐(BD 바이오사이언스, 미국 메사츄세츠주 베드포드)의 1:100 희석액으로 코팅함으로써 세포 배양을 위해 멀티웰 배양 플레이트를 준비하였다. 콜라겐-함유 플레이트를 37℃에서 대략 1시간동안 배양하고, 그 후에 콜라겐을 제거하고 웰을 포스페이트-완충 염수로 2번 세척하였다. 올리고머 화합물 이입 실험에서 사용하기 위하여, 세포를 96-웰 플레이트(팔콘-프리마리아 #3872, BD 바이오사이언스, 미국 메사츄세츠주 베드포드) 내에 약 8,000 세포/웰의 밀도로 접종하였다.
이 분석에서 시험된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 아이시스 113196, 아이시스 337332, 아이시스 337333, 아이시스 345778, 아이시스 345781, 아이시스 345794, 아이시스 345815 및 아이시스 345823이었다. 세포를 올리고뉴클레오티드 100nM 당 3㎍/ml 리포펙틴TM의 농도로 리포펙틴TM과 혼합된 5, 10, 25, 50 및 150nM의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 비처리 세포를 데이타를 표준화하는 대조군으로서 사용하였다. 4시간 후에, 배양 배지를 바꾸고 추가의 20시간동안 세포를 배양하였다. RNA를 단리하고, 여기에 기재된 프라이머 프로브 세트 PPS199를 사용하여 실시간 PCR에 의해 STAT3 mRNA 수준을 측정하였다. 데이타를 3번 수득하고 평균내었다. 결과를 비처리 대조군에 대한 퍼센트 mRNA 발현으로서 표 26에 나타낸다. STAT3 mRNA 발현이 50％ 억제되는 안티센스 화합물의 농도인 IC50을 또한 나타낸다.
Figure 112006056137226-PCT00058
표 26에 나타낸 것과 같이, 아이시스 113916, 아이시스 337333, 아이시스 345794, 아이시스 345815 및 아이시스 345823은 HepG2 세포에서 STAT3 mRNA 발현의 투여량-의존성 감소를 유발하였다.
상기 기재된 STAT3을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리된 세포에서 STAT1의 발현 수준을 표 27에 나타낸다. 당 기술분야에서 일상적이고 여기에 기재된 방법에 의해 설계된 프라이머 및 프로브를 사용하여, STAT1 mRNA 수준을 실시간 PCR에 의해 측정하였다.
Figure 112006056137226-PCT00059
표 27에 나타낸 것과 같이, STAT3 올리고뉴클레오티드는 STAT1 발현의 실질적 또는 투여량-의존성 억제를 유발하지 않았다.
HepG2 세포를 안티센스 올리고뉴클레오티드로 이입한 후에 STAT3 단백질 수준을 측정하였다. 세포를 STAT3을 표적으로 하는 10nM, 50nM 또는 100nM 투여량의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리하고, STAT3 단백질 수준을 통상적으로 입수가능한 STAT3 항체 (산타 크루즈 바이오테크놀로지 인코포레이티드, 미국 캘리포니아주 산타 크루즈)를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 측정하였으며, 이것은 ECL플러스TM 시약(미국 뉴저지주 피스카타웨이, 아머샴 바이오사이언스)를 사용하여 검출되고, 케미독(Chemidoc)TM EQ 시스템(바이오-래드 래보러토리즈, 미국 캘리포니아주 헤르큘스)을 사용하여 정량하였다. 샘플 중에서 단백질 수준의 차이를 표준화하기 위하여 관리 유전자 G3PDH에 의해 발현된 단백질을 사용하였다. 데이타를 표 28에 나타내고, 비처리 대조군 세포에 비해 퍼센트 단백질 발현으로서 표현한다.
Figure 112006056137226-PCT00060
표 28에 나타낸 바와 같이, 아이시스 113196, 아이시스 337332, 아이시스 337333, 아이시스 345778, 아이시스 345781, 아이시스 345794, 아이시스 345815 및 아이시스 345823로의 처리는 HepG2 세포에서 STAT3 단백질 수준의 투여량-의존성 감소를 유발하였다.
실시예 21
A549 세포에서 인간 STAT3 의 안티센스 억제: 투여량 반응
인간 STAT3을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 A549 세포에서 투여량 반응 연구에서 시험하였다. 세포를 100nM의 올리고뉴클레오티드 당 3㎍/mL 리포펙틴TM의 농도로 리포펙틴TM과 혼합된 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 올리고뉴클레오티드 농도를 표 29 및 30에 나타낸다. 비처리 세포는 데이타가 표준화되는 대조군으로서 사용되었다. 양쪽 모두 여기에 기재된 2개의 상이한 프라이머 프로브 세트: PPS199 및 PPS2033을 사용하여 STAT3 mRNA 발현 수준을 중복하여 측정하였다. PPS2033 및 PPS199를 사용한 데이타를 각각 비처리 대조군에 대한 퍼센트 발현으로서 표 29 및 30에 나타낸다.
Figure 112006056137226-PCT00061
표 29에 나타낸 것과 같이, 인간 STAT3을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 전부는 PPS2033을 사용하여 측정시에 A459 세포에서 발현을 억제하였다.
Figure 112006056137226-PCT00062
표 30에 나타낸 것과 같이, 인간 STAT3을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 PPS199를 사용하여 측정시에 A549 세포에서 투여량-의존성 방식으로 발현을 억제하였다.
안티센스 올리고뉴클레오티드 농도의 대안적인 범위를 사용하여, 동일한 방식으로 추가의 투여량-반응 실험을 수행하였다. 프라이머 프로브 세트 PPS2033 및PPS199를 사용한 데이타를 비처리 대조군 세포에 대한 STAT3 mRNA 발현의 퍼센트로서 각각 표 31 및 32에 나타낸다.
Figure 112006056137226-PCT00063
표 31의 데이타는, 시험된 추가의 농도가 투여량-의존성 방식으로 인간 STAT3을 억제함을 증명한다.
Figure 112006056137226-PCT00064
표 32의 데이타는, 시험된 추가의 농도가 투여량-의존성 방식으로 인간 STAT3을 억제함을 증명한다.
실시예 22
Hep3 세포에서 인간 STAT3 의 안티센스 억제: 투여량 반응
STAT3의 안티센스 억제를 Hep3B 세포에서 투여량-반응 연구에서 시험하였다.
인간 간암 세포주 Hep3B (Hep3B2. 1-7)을 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC, 미국 버지니아주 마나사스)로부터 수득하였다. 이 세포주는 초기에 8세 아프리칸-아메리칸 남자의 간세포 암종으로부터 유래되었다. 세포는 형태면에서 상피이고, 무모 생쥐에서 발암성이었다. Hep3B 세포를 이글스 밸런스드 염 용액, 2mM L-글루타민, 1.5g/L 중탄산나트륨, 0.1mM 비필수 아미노산, 1.0mM 피루브산나트륨 (ATCC #20-2003, 미국 마나사스) 및 10％ 열-불활성화 태아 소 혈청(미국 캘리포니아주 칼스배드 인비트로겐 라이프 테크놀로지스)을 가진 최소 필수 배지(MEM)에 배양하였다. 90％ 융합에 이르를 때까지 세포를 트립신처리 및 희석에 의해 일상적으로 통과시켰다.
세포를 각각 100nM의 올리고뉴클레오티드 당 3㎍/mL 리포펙틴TM의 농도로 리포펙틴TM과 혼합된 안티센스 올리고뉴클레오티드 아이시스 129688, 아이시스 113196, 아이시스 337333, 아이시스 345794, 아이시스 345815 또는 대조군 올리고뉴클레오티드 아이시스 129688 (TTCGCGGCTGGACGATTCAG, 서열번호 411로서 포함됨)로 처리하였다. STAT3을 표적으로 하지 않는 아이시스 129688은, 2'-O-메톡시에틸(2'-MOE) 뉴클레오티드로 구성된 5개-뉴클레오티드 "날개"에 의해 양 측 (5' 및 3' 방향)에서 인접한 10개의 2'-데옥시뉴클레오티드로 구성된 20개 뉴클레오티드 "개프머"이다. 아이시스 129688은 올리고뉴클레오티드 전체에 걸쳐 포스포로티오에이트 주쇄를 가지며, 모든 시티딘 잔기는 5-메틸시티딘이다.
올리고뉴클레오티드 농도는 6.25nM, 25nM, 50nM 및 100nM이었다. 비처리 세포는 데이타가 표준화되는 대조군으로서 사용되었다. STAT3 mRNA 발현 수준은 PPS2033을 사용하여 여기에 기재된 바와 같이 실시간 PCR에 의하여 중복으로 측정되었다. 데이타를 비처리 대조군에 비해 퍼센트 발현으로서 표 33에 나타낸다.
Figure 112006056137226-PCT00065
표 33에 나타낸 것과 같이, 아이시스 113926, 아이시스 337333, 아이시스 345815 또는 아이시스 345815로의 처리는 Hep3B 세포에서 STAT3 mRNA 발현의 투여량-의존성 감소를 유발하였다. 아이시스 345794는 Hep3B 세포에서 50nM 투여량에서 STAT3 mRNA 발현을 감소시켰다.
실시예 23
THLE -2 세포에서 인간 STAT3 의 안티센스 억제: 투여량 반응
STAT3의 안티센스 억제를 THLE-2 세포에서 투여량-반응 연구에서 시험하였다.
아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC; 미국 버지니아주 마나사스)으로부터 SV-40 형질전환된 간 상피 세포주 THLE-2를 수득하고, 공급업자의 지시에 따라 배양하였다. 올리고뉴클레오티드 이입 실험에서 사용하기 위하여, 세포를 웰 당 약 10,000 세포의 밀도로 96-웰 플레이트에 도말하였다.
세포를 각각 100nM의 올리고뉴클레오티드 당 3 ㎍/mL 리포펙틴TM의 농도로 리포펙틴TM과 혼합된 안티센스 올리고뉴클레오티드 아이시스 129688, 아이시스 113196, 아이시스 337333, 아이시스 345794, 아이시스 345815 또는 대조군 올리고뉴클레오티드 아이시스 129688로 처리하였다. 올리고뉴클레오티드 농도는 6.25nM, 25nM, 50nM 및 100nM이었다. 비처리 세포는 데이타가 표준화되는 대조군으로서 사용되었다. STAT3 mRNA 발현 수준을 여기에 기재된 바와 같이 PPS2033을 사용하는 실시간 PCR에 의해 중복하여 측정하였다. 데이타를 비처리 대조군에 비해 퍼센트 발현으로서 표 34에 나타낸다.
Figure 112006056137226-PCT00066
표 34에 나타낸 바와 같이, 아이시스 113926, 아이시스 337333 또는 아이시스 345815로의 처리는 THLE-2 세포에서 STAT3 mRNA 발현에서의 투여량-의존성 환원을 유발하였다. 아이시스 354794호는 THLE-2 세포에서 STAT3 mRNA 발현을 감소시켰다.
실시예 24
인간 STAT3 을 표적으로 하는 dsRNAs 의 설계 및 선별
추가의 구현양태에서, STAT3 mRNA(진뱅크® 수탁 번호 NM_139276.2, 서열번호 412로서 포함됨)을 표적화하기 위하여 일련의 핵산 이중가닥을 설계하고, 표 35에 나타낸다. 표 35에서의 모든 화합물은 19개 뉴클레오티드 길이의 올리고리보뉴클레오티드이고, 전체에 걸쳐 포스포디에스테르 뉴크레오티드간 결합(주쇄)을 갖는다. 화합물은 블런트 말단을 갖도록 제조되었다. 표 35는 dsRNA의 안티센스 가닥을 나타내고, 센스 가닥이 안티센스 가닥의 보체로서 합성된다. 이러한 서열은 우라실(U)을 함유하는 것으로 나타나지만, 당업자라면 우라실(U)이 일반적으로 DNA 서열에서 티민(T)에 의해 대체됨을 이해할 것이다. "표적 부위"는 화합물이 결합하는 특정한 표적 서열 위에서 첫번째 (5'-최외) 뉴클레오티드 수를 나타낸다.
표 35에서의 화합물은 A549 세포에서 STAT3 mRNA에 대한 효과에 대해 시험하였다. 인간 STAT3을 표적으로 하지 않는 dsRNA 대조군은 아이시스 335449 (UUUGUCUCUGGUCCUUACUU; 서열번호 413 으로서 포함됨)의 이중가닥 및 그의 보체; 아이시스 359661 (UUAUCGCUUCUCGUUGCUU; 서열번호 414로서 포함됨)의 이중가닥 및 그의 보체를 포함하였다. 아이시스 335449는 화합물 전체에 걸쳐 포스포디에스테르 뉴크레오티드간 결합(주쇄)을 가진 20개 뉴클레오티드 길이의 올리고리보뉴클레오티드이다. 아이시스 359661은 화합물 전체에 걸쳐 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 결합(주쇄)를 가진 19개 뉴클레오티드 길이의 올리고리보뉴클레오티드이다. 아이시스 335449 및 아이시스 359661 및 이들의 보체는 모두 블런트 말단을 갖도록 제조되었다. STAT3을 표적으로 하지 않는 아이시스 129700 (TAGTGCGGACCTACCCACGA, 서열번호 415로서 포함됨)이 대조군 단일-가닥 올리고뉴클레오티드로서 사용되었다. 아이시스 129700은 10개의 2'-데옥시뉴클레오티드로 구성된 중심 "갭" 영역으로 구성된 20개 뉴클레오티드 길이의 키메라 올리고뉴클레오티드("개프머")이고, 이는 5개 뉴클레오티드 "날개"에 의해 5' 및 3' 말단 위에서 인접한다. 날개는 2'-O-메톡시에틸 (2'-MOE) 뉴클레오티드로 구성된다. 뉴크레오티드간(주쇄) 결합은 올리고뉴클레오티드 전체에 걸쳐 포스포로티오에이트(P=S)이다. 모든 시티딘은 5-메틸시티딘이다.
A549 세포를 15g/mL 리포펙틴TM(인비트로겐 라이프 테크놀로지스, 미국 캘리포니아주 칼스배드)과 혼합된 150nM의 dsRNA 화합물 또는 15g/mL 리포펙틴TM과 혼합된 150nM의 단일-가닥 올리고뉴클레오티드로 4시간동안 처리한 다음, 정상 생육 배지에서 20시간 배양하였다.
다른 실시예에 의해 기재된 바와 같이 PPS2033을 사용하여 인간 STAT3 mRNA 발현을 측정하였다. 결과를 비처리 대조군 세포에 표준화하고, 이것은 dsRNA 화합물 또는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드로 처리되지 않았다. 데이타는 2회 실험의 평균이고 표 35에 나타낸다.
Figure 112006056137226-PCT00067
Figure 112006056137226-PCT00068
이러한 데이타는, 인간 STAT3을 표적으로 한 dsRNA가 A549 세포에서 mRNA 발현을 감소시킴을 나타낸다. 서열번호. 417, 418, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 431, 432, 433, 435, 436, 440, 441, 443, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451 및 452의 안티센스 가닥 및 그들의 보체를 포함하는 dsRNA는 이 분석에서 STAT3의 적어도 30％ 억제를 나타내었다.
실시예 25
인간 STAT3 의 안티센스 억제 후에 폐 암종 세포주에서의 세포고사
인간 STAT3을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 A549 및 H460 세포에서 세포고사에 미치는 영향에 대해 시험하였다 (양쪽 모두 폐 암종 세포주이다).
A549 세포를 수득하고 여기에 기재된 바와 같이 배양하였다. H-460 폐 암종 세포 주를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC; 미국 버지니아주 마나사스)으로부터 수득하고, 10％ 태아 소 혈청, 100 유닛/mL 페니실린 및 100㎍/ml 스트렙토마이신으로 보충된 RPMI 배지에서 배양하였다 (미국 캘리포니아주 칼스배드 인비트로겐 라이프 테크놀로지스로부터의 배지 및 보충물). 양쪽 세포 유형을 웰 당 10,000 세포의 밀도로 96-웰 플레이트에 도말하였다.
세포를 100nM의 올리고뉴클레오티드 당 3 ㎍/ml 리포펙틴TM의 농도로 리포펙틴TM과 혼합된 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 올리고뉴클레오티드 농도는 10, 20, 40 및 80nM이었다. 아이시스 29848 (NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN, 여기에서 N=A,T,C 또는 G이다; 서열번호 453)은 무작위 서열이고 네가티브 대조군으로서 사용되었다. 비처리 세포는 데이타가 표준화되는 대조군으로서 사용되었다. 세포를 안티센스 올리고뉴클레오티드로 이입하고, PPS2033을 사용한 실시간 PCR에 의해 처리 후에 24시간동안 STAT3 mRNA 수준을 측정하였다.
세포고사에 미치는 STAT3의 안티센스 억제 효과를 평가하기 위하여, 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리 후 24 및 48시간에 카스파제 분석을 수행하였다. 펩티드 서열 DEVD에서 아스파테이트 잔기 후에 절단을 검출하는 형광측정 HTS 카스파제-3 분석(목록 번호 #HTS02; EMD 바이오사이언스, 미국 캘리포니아주 샌디에고)으로 카스파제-3 활성을 평가하였다. DEVD 기질을 형광성 분자로 표시하고, 이것은 카스파제-3-에 의한 절단 시에 형광이 청색에서 녹색으로 변위하는 것을 나타낸다. 제조업자의 지시에 따라 이 분석에 의하여 올리고머 화합물-처리된 세포에서 활성 카스파제-3을 측정하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리 후에, 10M 디티오트레이톨을 함유하는 50L의 분석 완충액을 각각의 웰에 첨가한 다음, 카스파제-3 형광성 기질 접합체의 2 0L를 첨가하였다. 형광 플레이트 판독기(스펙트라맥스TM, 제미니XSTM, 분자 장치, 미국 캘리포니아주 서니베일)를 사용하여 웰에서의 형광을 즉시 검출하였다 (여기/방출 400/505nm). 플레이트를 덮고 추가로 3시간동안 37℃에서 배양한 후에, 형광성을 다시 측정하였다 (여기/방출 400/505nm). 시간 0에서의 값을 3시간에 수득된 측정치로부터 뺐다. 비처리 대조군 세포로부터 수득된 측정을 100％ 활성으로 나타내었다. 올리고머 화합물로 처리된 세포에서 카스파제-3 활성을 비처리 대조군 세포에서의 활성으로 표준화하였다. 화합물이 카스파제 활성을 자극 또는 억제하는 능력을 갖는지를 나타내기 위하여, 100％ 위 또는 아래의 카스파제 활성에 대한 값을 고려하였다.
A549 및 H460 세포에서 폴리(ADP-리보스)폴리머라제(PARP)의 절단을 검출하기 위하여 세포고사를 평가하였으며, 이것은 인간 STAT3을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 150nM로 처리된 6-웰 중에서 웰 당 250,000개 세포로 도말되었다. 올리고뉴클레오티드 처리 후 48시간에 단백질을 단리하고 웨스턴 블롯 분석을 행하였다. 통상적으로 입수가능한 항체(셀 시그날링, 미국 메사츄세츠주 베버리)로 검출한 다음 ECL플러스TM(아머샴 바이오사이언스, 미국 뉴저지주 피스카타웨이)로 검출하였다. 시그날을 케미독TM EQ 시스템(바이오-래드 래보러토리즈, 미국 캘리포니아주 헤르큘스)으로 검출하였다. 전체 길이 PARP 및 절단된 PARP를 정량화하였다.
A549 및 H460 세포에서 저이배수성을 측정함으로써 세포고사를 더욱 평가하고, 이것을 24웰 플레이트에서 웰 당 50,000 세포로 도말하고, 인간 STAT3을 표적으로 하는 20, 80 및 150nM의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 아이시스 226844 (GCCCTCCATGCTGGCACAGG, 서열번호 454)는 STAT3을 표적으로 하지 않으며, 네가티브 대조군으로서 사용되었다. 아이시스 183891(CCGAGCTCTCTTATCAACAG, 서열번호 455)은 키네신-유형 1을 표적으로 하고, 그것의 억제는 세포 주기를 저지시키며 100nM의 투여량에서 포지티브 대조군으로서 사용되었다. 처리 후 48시간에 세포를 수집하고, 유동 세포분석법 분석을 위해 세포를 제조하기 위하여 일반적인 절차를 사용하였다. 세포를 프로피듐 요오다이드로 염색하여 유동 세포분석계를 사용하여 세포 주기 프로파일을 생성하였다. 세포 주기 프로파일을 모드피트(ModFit) 프로그램 (베리티 소프트웨어 하우스,인코포레이티드, 미국 ME Topsham)으로 분석하였다. 핵 DNA의 분절화는 세포고사의 특징이고 저이배수성 DNA 함량과 함께 세포에서 증가를 일으키며, "subG1"으로서 분류된다. G1 단계에서 세포 증가는 S 단계로의 도입 이전에 세포 주기 저지의 표시이고; S 단계에서 세포의 증가는 DNA 합성 동안에 세포 주기 저지의 표시이고; G2/M 단계에서 세포 증가는 세포유사분열 직전 또는 동안에 세포 주기 저지의 표시이다. 이수성(A) 세포는 이배수 세포에서 보다 더욱 큰 DNA 함량을 갖는다. 올리고머 화합물로 처리된 세포의 세포 주기 프로파일을 비처리 대조군 세포로 표준화하였다. 100％ 위 또는 아래의 값은 각각, 표시된 세포 주기 단계의 DNA 함량을 가진 세포 비율에서의 증가 또는 감소를 나타내는 것으로 간주되었다.
A549 세포에서 이러한 분석으로부터의 데이타를 하기 표에 나타낸다. A549 세포에서 STAT3 mRNA 수준을 비처리 대조군 세포에 대한 퍼센트 mRNA 발현으로서 표 36에 나타낸다. 올리고뉴클레오티드 처리 후 24 및 48시간에 카스파제-3 활성을 비처리 대조군 세포의 퍼센트로서 표 37에 나타낸다. PARP 정량화를 비처리 대조군 세포에 대한 퍼센트로서 표 38에 나타낸다. DNA 프로파일을 세포 주기의 각 단계에서 퍼센트로서 표 39에 나타낸다.
Figure 112006056137226-PCT00069
Figure 112006056137226-PCT00070
Figure 112006056137226-PCT00071
Figure 112006056137226-PCT00072
이러한 데이타로부터, 3개의 상이한 분석에 의해 측정시에, STAT3의 안티센스 억제는 A549 세포에서의 세포고사를 일으키는 것이 명백하다. 예를들어, 20nM에서 아이시스 345781로의 처리는 99％ 만큼 STAT3 mRNA 발현을 억제하였으며(표 36), 비처리 대조군에서 관찰되는 것보다 약 30배 이상의 수준(표 37)까지 48시간에 카스파제-3 활성을 상당히 증가시켰다. 추가로, 전체 길이 PARP가 대조군의 2％로 감소되었으며, 절단된 PARP가 대조군의 약 8배였다 (표 38). 또한, 아이시스 345781로 처리된 세포의 subG1 집단은 대조군에 비해 약 20배 이상 컸으며(표 39), 이는 DNA 분절화가 발생됨을 나타낸다. 일반적으로, 세포 주기의 다른 단계, subG1, G1, G1/S 및 G2/M에서 세포 분포가 현저히 변화되지 않았다. 아이시스 337332는 80 및 150nM 투여량에서 G1 집단을 증가시켰으며, 이는 G1 세포 주기 저지의 표시이다. 이와 함께, 이러한 데이타는 아이시스 345781에 의한 STAT3의 안티센스 억제가 A549 세포에서 세포고사를 유도함을 명백히 증명한다. 다른 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리는 세포고사의 유도와 동시에 STAT3 발현에서의 저하를 유사하게 일으켰다.
H-460 세포에서 실시간 PCR, 카스파제-3, PARP 및 DNA 프로파일 분석으로부터의 데이타를 하기 표에 나타낸다. H-460 세포에서 STAT3 mRNA 수준을 비처리 대조군 세포에 비해 퍼센트 mRNA 발현으로서 표 40에 나타낸다. 올리고뉴클레오티드 처리 후 24 및 48시간에서 카스파제-3 활성을 비처리 대조군 세포의 퍼센트로서 표 41에 나타낸다. PARP 정량화를 비처리 대조군 세포에 대한 퍼센트로서 표 42에 나타낸다. DNA 프로파일을 세포 주기의 각 단계에서 퍼센트로서 표 43에 나타낸다.
Figure 112006056137226-PCT00073
Figure 112006056137226-PCT00074
Figure 112006056137226-PCT00075
Figure 112006056137226-PCT00076
H-460 세포에서 STAT3의 안티센스 억제가 세포고사를 유도하였다. 예를들어, 아이시스 345785로의 처리는 대략 92％ 만큼 STAT3 발현을 억제하였다 (표 40). 비처리 대조군에 비해 카스파제-3 활성의 약 2.4배 증가(표 41)에 의하여, 표적 발현에서의 감소가 달성되었다. 전체 길이 PARP가 대조군의 43％로 감소된 반면, 절단된 PARP가 대조군의 143％로 증가되었다 (표 42). 또한, 20nM의 아이시스 345785로 처리된 세포에서의 저이배수성이 대조군 세포에서보다 약 4배 증가되었다 (표 43). 즉, H-460 세포에서 아이시스 3456785에 의한 STAT3의 안티센스 억제는 세포고사를 유도하였다. 다른 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리는 세포고사의 유도와 동시에 STAT3 발현에서 유사하게 저하를 일으켰다.
세포고사를 유도하는 것에 추가로, 아이시스 113176에 의한 STAT3의 안티센스 억제는 S 단계를 저지하였고, 이것은 DNA 복제가 차단됨을 나타낸다.
실시예 26
ALCL 모델에서 생체내에서 STAT3 및 종양 성장 억제
NPM-ALK 트랜스제닉 생쥐는 자발적으로 T-세포 림프종 및 혈장 세포 종양을 발생한다 [Chiarle 등, Blood, 2003, 101, 1919-1927]. 따라서, 이들은 미분화 대세포 림프종(ALCL) 및 다발성 골수종의 생체내 모델로서 사용되고, 양쪽 모두 STAT3 활성화와 관련된다. 추가로, T-세포 림프종 및 혈장 세포 종양으로부터의 세포를 수용 생쥐에 주입할 때, 수용 생쥐에서 피하 종양이 발생된다. 이식된 T-세포 림프종 및 혈장 세포 종양은 각각 ALCL 및 다발성 골수종을 위한 동물 모델로서 사용된다.
STAT3을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를, 생체내에서 STAT3 발현 및 ALCL에서의 종양 성장에 미치는 효과에 대해 시험하였다. 생쥐 NPM-ALK T세포 종양으로부터 유래된 대략 2×106 세포를 동유전자형 (유전적으로 동일한) 생쥐 내에 주입하였다. 종양 세포의 주입 후 7일에, 생쥐에 아이시스 17152(서열번호 99) 또는 3염기 불일치 대조군 올리고뉴클레오티드 아이시스 28084 (서열번호 151)를 매일 20mg/kg의 투여량으로 피하 주사하였다. 올리고뉴클레오티드를 올리고뉴클레오티드 치료 당 6마리의 동물에게 14일동안 투여하였다. 올리고뉴클레오티드를 종양 부위에 반대 측면에서 피하 주사하였다. 종양 부피를 매일 측정하고 표 44에 나타낸다.
Figure 112006056137226-PCT00077
아이시스 17152로 처리된 동물에서 종양의 최소 성장이 관찰되거나 성장이 관찰되지 않았다. 역으로, 대조군 올리고뉴클레오티드로 처리된 동물에서, 종양 세포의 주입 14일 이내에 모든 5마리 동물에서 큰 종양 덩어리가 발생하였다. STAT3 단백질을, 화학발광 시스템(ECL, 아머샴 바이오사이언스, 미국 뉴저지주 피스카타웨이)로 검출되어진 단클론성 STAT3 항체 (자이메드 래보러토리즈 인코포레이티드, 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코)를 사용하여, 여기에 기재된 바와 같이 웨스턴 블롯에 의해 측정하였다. STAT3 단백질은 아이시스 17152로 처리된 동물에서 종양 뿐만 아니라 간에서 감소되었다. 또한, 잔류 종양 덩어리의 조직학적 연구는, 실질적으로 더욱 적은 것 이외에도, 아이시스 17152로 처리된 동물로부터의 종양이 상당한 면적의 괴사 및 단일-세포 사멸을 나타냄을 밝혀내었다.
대략 1×107 인간 NPM-ALK 종양 세포(Dr.A.Lorenzana에 의해 제공됨, 반 에스랜더 암 센터, 미국 미들랜드주 그로스 포인트 우드)를 면역손상된 생쥐 내에 주입하는 유사한 생체내 실험이 실행되었다. 이 연구를 생쥐 NPM-ALK 세포에 대해 기재된 바와 같이 아이시스 113176(서열번호 115) 또는 불일치 대조군 올리고뉴클레오티드 (129987, 서열번호 404)를 사용하여 20mg/kg에서 수행하였다. 올리고뉴클레오티드를 종양에 반대쪽 측면에서 피하 주입하였다. 각각 3마리 동물을 포함한 군에 올리고뉴클레오티드를 14일 동안 투여하였다. 종양 부피를 측정하고 표 44a에 나타낸다.
Figure 112006056137226-PCT00078
아이시스 113176으로 처리된 동물에서 종양의 최소 성장 또는 비 성장을 관찰하였다. 역으로, 불일치 대조군 올리고뉴클레오티드로 주입된 동물에서 종양 성장을 관찰하였다. 이러한 데이타는 STAT3의 안티센스 억제가 종양에서 STAT3 단백질 발현을 억제하고, ALCL 모델에서 생체내에서 종양 성장을 억제함을 나타낸다. 이러한 연구결과는, STAT3 억제가 인간 ALCL의 치료에서 치료적 접근임을 증명한다.
실시예 27
다발성 골수종의 모델에서 생체내 종양 성장의 억제
구조적으로 활성화된 STAT3의 존재를 특징으로 하는, NPM-ALK 트랜스제닉 생쥐로부터 유래된 다발성 골수종 세포를 동유전자형 생쥐에 피하 주입하였다. 생쥐는 20mg/kg의 투여량으로 아이시스 17152(서열번호 99) 또는 불일치 대조군 올리고뉴클레오티드 (서열번호 151)의 피하 주사를 매일 받았다. 올리고뉴클레오티드를 14일동안 투여하였다. 올리고뉴클레오티드를 종양 쪽에 반대측면에서 피하 주사하였다. 종양 부피를 매 2일마다 측정하고 표 45에 나타낸다.
Figure 112006056137226-PCT00079
표 45에 나타낸 것과 같이, STAT3을 표적으로 하는 아이시스 17152는 이 모델에서 종양 성장을 억제한 반면, 대조군 올리고뉴클레오티드는 그렇지 않았다. 이러한 데이타는, STAT3의 안티센스 억제는 다발성 골수종의 모델에서 생체내 종양 성장을 방지함을 증명한다.
실시예 28
ALCL 세포주에서 인간 STAT3 의 안티센스 억제의 효과
인간 ALCL 세포에서 세포 성장 및 생존에 대한 효과에 관하여 STAT3의 안티센스 억제를 평가하였다 (TS ALCL 세포 또는 SU-DHL 세포, Dr.A.Lorenzana에 의해 제공됨, 반 에스랜더 암 센터(Van Eslander Cancer Center), 미국 미들랜드주 그로스 포인트 우즈). ALCL 세포를 0.02, 0.3, 1.5, 3, 6, 12 및 15M의 아이시스 113176(서열번호 115) 또는 3-염기 불일치 아이시스 129987(서열번호 404)으로 일렉트로포레이션에 의해 이입하였다. 제조업자의 지시에 따라서 아맥사(Amaxa)® 일렉트로포레이션 장치를 사용하여 2×106 세포를 일렉트로포레이트하였다. 24시간 후에, 세포를 수확하였다. 세포 생존성을 트립판 블루 염색에 의해 평가하였으며, 이것은 건강하지 못하거나 죽은 세포에 의해서만 흡수된다. 세포 생존성 및 STAT3 단백질은 불일치 대조군으로 처리된 세포에서 감소되지 않았다. 그러나, 아이시스 113176으로 처리된 세포는 세포 생존성에서 투여량-의존성 감소를 나타내었으며, 이것은 0.03, 1.5, 3, 6 및 12M의 투여량에서 대조군의 97％, 87％, 67％, 60％ 및 29％였다. 세포 생존율은 15M 투여량의 아이시스 113176을 받은 세포에서 대조군의 36％로 감소되었다. 세포 생존율의 감소에 추가로, 여기에 기재된 바와 같이 수행되는 처리된 세포의 웨스턴 블롯팅은, STAT3 단백질 발현이 투여량-의존성 방식으로 감소됨을 나타내었다.
새로 합성된 DNA 내로 삼중수소표지 티미딘을 혼입한 것은 세포 증식의 측정으로서 사용된다. STAT3의 안티센스 억제 후의 세포 성장은 아이시스 113176(서열번호 115)로 이입된 세포 내로 혼입된 삼중수소표지(3H) 티미딘의 양을 측정함으로써 평가되었다. SU-DHL 세포를 7μM의 아이시스 113176으로 이입하였다. 세포를 구조적으로 활성화된 STAT3, STAT3c로 이입하고, 이것은 STAT3을 자발적으로 이량화시키고 DNA에 결합하고 전사를 활성화시키는 아미노산 치환을 갖는다 [Bromberg,J.F. 등, Cell, 1999, 98, 295-303]. 세포를 마지막 18시간의 배양 동안에 1 Ci의 3H-티미딘의 존재하에 배양하였다. 올리고뉴클레오티드 처리 후 24, 48 및 72 시간에, 세포를 수집하였다. 일상적인 섬광 계수에 의해 3H-티미딘 혼입을 측정하고 표 46에 1분당 계수(CPM)로 나타낸다. STAT3 활성화 또는 억제에 의해 영향을 받지 않는 세포를 위한 대조군으로서 주르캣(Jurkat) 세포(미국 버지니아주 마나사스 ATCC로부터 수득될 수 있음)를 사용하였다.
Figure 112006056137226-PCT00080
표 46에 나타낸 바와 같이, 인간 SU-DHL 세포에서의 안티센스 억제가 세포 증식을 현저히 억제하였다. 활성화된 STAT3을 구조적으로 발현하지 않는 주르캣 세포는 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리에 의해 영향을 받지 않는다. 즉, 세포 증식에 대한 효과는 STAT3의 안티센스 억제에 특이적이다.
유사한 분석에서, TS ALCL 세포를 7μM의 아이시스 113176으로 이입하였다. 여기에 기재된 절차를 사용하여, 올리고뉴클레오티드 처리 후 24, 48 및 72시간에 웨스턴 블롯에 의해 STAT3 발현 및 PARP 절단을 평가하였다. STAT3 단백질 발현이 감소되고, 세포고사의 지시인자인 PARP의 절단이 관찰되었으며, 양쪽 모두 시간-의존적 방식으로 일어났다. 세포 내로의 3H-티미딘 혼입을 측정함으로써 세포 성장을 평가하였다.
Figure 112006056137226-PCT00081
이러한 데이타는 STAT3의 안티센스 억제가 미분화 림프종 세포에서 세포 증식을 감소시킴을 증명한다.
실시예 29
정상 생쥐에서 STAT3 을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 효과: 독성 선별
STAT3을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 정상 생쥐에서의 효과에 대해 평가하였다. C57B1/6 생쥐를 4주일의 기간동안 1주 2회씩 50mg/kg 투여량의 올리고뉴클레오티드로 피하 주사하였다. 투여된 STAT3 안티센스 올리고뉴클레오티드는 아이시스 337332, 아이시스 337333, 아이시스 345778, 아이시스 345781, 아이시스 113196, 아이시스 345815, 아이시스 345794, 또는 아이시스 345823이었다. 아이시스 335099(GAGTATCACTATGGCTGGCC, 서열번호 456)는 STAT3을 표적으로 하지 않고 대조군 올리고뉴클레오티드로서 사용되었다. 염수 주사를 받는 동물을 대조군으로서 사용하였다. 각각의 처리 군은 5마리 동물을 포함하였다. 처리 전(Wk0) 및 처리 후 2주(Wk2) 및 4주(Wk4) 후에 혈액 샘플을 모았다. 혈액 글루코스, 콜레스테롤 및 트리글리세리드를 일상적인 임상 분석에 의해 측정하였다. 이러한 데이타를 표 48에 나타낸다.
Figure 112006056137226-PCT00082
독성을 나타낼 수 있는 간 트랜스아미나제 ALT 및 AST 증가를 일상적인 임상 분석에 의해 혈액 중에서 측정하였다. 이러한 데이타를 표 49에 나타낸다.
Figure 112006056137226-PCT00083
4주 처리 후에, 동물을 희생시키고 간 조직으로부터 RNA를 제조하였다. STAT3 mRNA 발현을 여기에 기재된 바와 같이 실시간 PCR에 의해 측정하였다. 데이타를 염수-처리 대조군 생쥐에 비하여 mRNA 발현의 퍼센트 억제로서 표 50에 나타낸다.
Figure 112006056137226-PCT00084
표 50에 나타낸 것과 같이 아이시스 113916, 아이시스 337332, 아이시스 337333, 아이시스 345778, 아이시스 345794 및 아이시스 345823은 간에서 STAT3 mRNA의 감소를 일으켰다.
간, 비장, 지방 패드 및 신장 중량을 연구 마지막에 측정하였다. 각각의 측정 군에 대한 평균 간 중량을 표 51에 나타낸다.
Figure 112006056137226-PCT00085
염수-처리된 동물의 지방 패드 중량은 평균 약 0.33g이었다. 아이시스 337333, 아이시스 345778, 아이시스 345815, 아이시스 345794 또는 아이시스 345823 처리 군의 평균 지방 패드 중량은 약 0.29g 내지 0.36g의 범위이고, 따라서 염수 처리 군에 대해 측정된 값에 비해 상당히 다르지 않았다. 아이시스 337333, 아이시스 345781 및 아이시스 113196으로 처리된 동물에 대한 평균 지방 패드 중량은 각각 약 0.23g, 0.22g 및 0.26g으로 염수-처리된 대조군에 비해 현저히 낮았다.
아이시스 337332, 아이시스 337333, 아이시스 345778 및 아이시스 113196으로 처리된 동물의 비장 중량을 측정하면, 평균 약 0.09 내지 0.1g이었고, 이것은 염수-처리된 동물에 대한 평균과 다르지 않았다(약 0.09g). 아이시스 345815, 아이시스 345794 또는 아이시스 345823으로 처리된 동물에 대한 평균 비장 중량은 각각 약 0.08, 0.07 및 0.08이었다. 따라서, STAT3을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드로의 처리는 정상 생쥐의 비장 중량을 증가시키지 않았다.
처리 군에 대해 측정된 평균 신장 중량은 약 0.29g 내지 약 0.34g의 범위였다. 염수-처리된 대조군(약 0.36g)에 대해 측정된 평균 신장 중량에 비하여, 이러한 데이타는 STAT3을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드로의 처리가 정상 생쥐에서 신장 증량을 증가시키지 않음을 나타낸다.
체중을 0주, 2주 및 4주에 측정하였다. 염수-처리된 대조군 동물에 대해 측정된 평균 체중은 약 24g 내지 27g의 범위이고, 동물은 시간에 따라 체중 획득을 나타내었다. STAT3을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리된 동물은 시간에 따라 유사한 체중 증가를 나타내었고, 그의 평균 중량은 대조군 동물과 상당히 다르지 않았다.
인간 STAT3을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드로 정상 생쥐를 처리하면, 상당한 부작용이 일어나지 않았다.
실시예 30
암의 치료로서 STAT3 을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 평가
STAT3의 부적절한 발현 및(또는) 활성화가 전립선 암, 머리 및 목의 편평상피세포 암종, 비-소 세포 폐 암종 및 간세포 암종, 다발성 골수종, 미분화 대 세포 림프종, 만성 림프성 백혈병, 급성 골수성 백혈병 및 비-허드킨스 림프종을 포함한 각종 암과 관련된다. 따라서, STAT3을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 고형 종양 또는 혈액학적 악성 종양을 가진 환자에서 평가한다. 치료 군은 약 30 내지 40명의 환자이다. 부하 기간 동안에, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 1주에 3회 정맥 투여하고, 그 후에 안티센스 올리고뉴클레오티드를 주마다 투여한다. 투여량은 2mg/kg 내지 10mg/kg의 범위이다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 치료 효과를 치료에 대한 반응을 평가하고 바이오마커를 측정함으로써 평가한다. 다발성 골수종 환자에서 생물학적 마커의 예는 혈청 파라단백질 및 다발성 골수종 세포를 순환시킴에 있어서 세포고사이다. 또한, 순환되는 골수종 세포에서 STAT3 단백질 및 포스포릴화를 측정한다.
STAT3을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 화학요법 약제에 저항성인 환자 또는 암의 재발을 경험한 환자에서 시험한다.
STAT3을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 단독으로 또는 다른 약제, 예를들어 화학요법 약제 벨캐이드®와 함께 투여한다.
실시예 31
인간 STAT3 의 안티센스 억제 후에 폐 암종 세포주에서의 세포고사
사이토카인 IL6는 STAT 기능의 공지된 상류 조절인자이고, 폐암 세포에서 상향조절된다. STAT3이 종종 종양 형성 및 상피세포에서의 생존에 연관되기 때문에, 인간 비-소 세포 폐 암종 세포에서 STAT3의 역할을 묘사하는 것이 중요하였다. 이것 때문에, 세포 성장 및 세포고사의 유도에 미치는 영향에 대하여 STAT3의 안티센스 억제를 시험하였다. 문헌[Song 등, Oncogene, 2003, 22, 4150-4165]에 기재된 바와 같이 분석을 수행하였다.
A549, H460, H358 및 H1299 세포 주 (이들의 모두는 ATCC(미국 버지니아주 마나사스)로부터 수득될 수 있음)을 5％ 태아 소 혈청, 2mM 글루타민 및 1％ 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 RPMI 배지(인비트로겐 라이프 테크놀로지스, 미국 캘리포니아주 칼스배드에서 생육시켰다). A549, H358 및 H1299 세포는 구조적으로 활성화된 STAT3을 나타낸다.
캡슐화된 리포좀 또는 일렉트로포레이션을 사용하여 인간 폐 암 세포 내에 올리고뉴클레오티드를 이입하였다. A549, H358 및 H1299 세포 (60mm 접시에서 100,000 내지 200,000 세포)를, 1.5ml의 옵티멤(OptiMEM)TM 배지(인비트로겐 라이프 테크놀로지스, 미국 캘리포니아주 칼스배드) 중에서 15mg의 리포펙틴TM(인비트로겐 라이프 테크놀로지스, 미국 캘리포니아주 칼스배드)과 함께 500nM의 올리고뉴클레오티드로 이입하였다. 세포를 올리고뉴클레오티드로 4시간동안 배양하고, 혼합물을 제거하고 세포를 RPMI + 5％ 태아 소 혈청으로 한번 세척한 다음 배양 배지에서 배양하였다. 면역블롯트, 전기영동 이동성 변위 분석 및 현미경검사법을 위하여, 세포를 이입 후 24시간에 수집하였다. 아포-BRDUTM 분석을 위하여, 세포를 이입 후 48시간에 수집하였다.
H460 세포의 일렉트로포레이션을 위하여, 세포를 대략 20~30 × 106 수로 생육시키고, 트립신처리하고, 10㎛의 최종 농도에서 올리고뉴클레오티드와 함께 배양하였다. 세포를 바이오래드 일렉트로포레이터(바이오-래드 래보러토리즈, 미국 캘리포니아주 헤르큘스)에서 총 400mL의 부피로 옵티멤, 이글스 배지에서 1000μF 및 230V에서 일렉트로포레이트하였다. 세포를 10cm 접시에 5％ FBS 및 1％ 페니실린/스트렙토마이신을 가진 RPMI 중에 다시 도말하고 5％ CO2 및 37℃ 배양기에 밤새 놓아두었다. 다음날 아침 세포를 PBS로 세척하고 혈청 및 항생물질을 가진 새로운 배지를 첨가하였다.
제조업자의 지시에 따라서 아포-BRDUTM 키트(미국 캘리포니아주 샌디에고, 파르밍겐, BD 바이오사이언스)를 사용하여 세포고사를 분석하였다. 실험 조건 당 10,000 세포로부터의 데이타를 획득하고, 셀퀘스트(CELLQuest)TM 소프트웨어 (BD 바이오사이언스, 미국 캘리포니아주 산요세)를 사용한 FAC스캔TM 면역세포분석법 시스템 상에서 형광에 대해 분석하였다. 전체 길이 PARP 뿐만 아니라 절단된 큰 단편을 검출하기 위하여 PARP 항체(셀 시그날링, 미국 메사츄세츠주 베버리)를 사용하여 폴리-(ADP-리보스) 폴리머라제(PARP)의 절단(이것은 세포고사의 표시이다)을 측정함으로써 세포고사를 검출하였다.
앞서 기재된 바와 같이 STAT DNA-결합 분석을 수행하였다 [Yu 등, Science, 1995, 269, 81-83; Garcia 등, Cell Growth Differ., 1997, 8, 1267-1276]. 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)을 비-변형시킴으로써 단백질-DNA 착물을 분석하고, 자동방사선사진에 의해 검출하였다. 전기영동 이동성 변위 분석(EMSA)에 의해 특정한 STAT3 착물을 동정하기 위해 사용된 항-STAT3 (C-20) 다클론성 항체를 산타 크루즈 바이오테크놀로지스로부터 수득하였다. 과변위 분석에서 사용하기 위하여, 1g의 C-20 항체를 방사능표지 프로브(들)의 첨가 및 전기영동 전에 실온에서 20분동안 핵 추출물과 함께 배양하였다.
웨스턴 블롯을 다음과 같이 수행하였다. 세포 용해물을 전체 단백질 함량(50mg)에 대해 표준화하고 SDS-PAGE로 처리하였다. 이러한 연구에서 사용된 주요 항체는 STAT3(트랜스덕션 래보러토리즈, 미국 켄터키주 렉싱톤), 포스포릴화 STAT3 Y705(셀 시그날링, 미국 메사츄세츠주 베버리), PARP(셀 시그날링, 미국 메사츄세츠주 베버리) 및 베타-액틴(시그마, 미국 미조리주 세인트루이스)로 구성되었다. 아머샴 바이오사이언시스(미국 뉴저지주 피스카타웨이)로부터의 양고추냉이 퍼옥시제-접합 2차 항체 및 향상된 화학발광(ECL) 키트를 사용하여 단백질의 검출을 달성하였다.
A549 세포를 올리고뉴클레오티드, 안티센스 또는 불일치 올리고뉴클레오티드 없이 이입시키고, 24시간 후에 세포를 수집하고 전체 단백질 및 핵 추출물을 제조하였다. 웨스턴 블롯팅은, 아이시스 113176에 의한 세포의 전체 STAT3 단백질 함량 감소를 나타낸 반면, 불일치 대조군 올리고뉴클레오티드로 처리된 세포 또는 비처리 세포에서는 감소가 관찰되지 않았다. 이입 후 24시간 정도의 조기에 PARP의 절단에 의해 증명되는 바와 같이, STAT3 수준에서의 감소가 세포고사의 활성화에 의해 수반되는 반면, 불일치 대조군-처리 또는 비처리 세포에서는 PARP의 절단이 관찰되지 않았다. EMSA에 의해 분석되는 바와 같이, STAT3의 안티센스 억제는 STAT3 DNA-결합 활성의 거의 완벽한 억제를 일으키는 반면, 불일치 올리고뉴클레오티드 처리는 STAT3 DNA-결합 활성에 영향을 미치지 않았다. 48시간동안 아이시스 113176으로 처리된 세포의 광현미경 검사는, 세포 파편 및 공포가 있는 세포의 증가와 함께, 변경된 세포 크기 및 형태의 외관 및 감소된 수를 나타내었다. 역으로, 불일치 대조군 올리고뉴클레오티드로 처리된 세포는 세포 수, 크기, 형태의 변화를 갖지 않을 뿐만 아니라 세포 사멸을 시사하는 세포 파편을 증가시키지 않았다. A549 세포에서 세포고사를 조절하는데 있어서 STAT3의 역할을 뒷받침하기 위한 추가의 증거를 제공하기 위하여, 세포를 수집하고 아포-BrdU의 혼입에 의해 DNA 분절화를 분석하였다. 3개의 독립적 실험으로부터의 결과를 모으고, 아포-BrdU를 포함한 세포의 퍼센트에 의해 퍼센트 세포고사를 결정하였다. 안티센스 STAT3 올리고뉴클레오티드로 처리된 세포는 아포-BrdU 혼입을 증가시켰으며, 불일치-대조군 처리된 세포의 약 16배이고 비처리 대조군 세포의 약 48배이며, 이러한 결과는 세포고사의 표시이다. 비처리 및 불일치 대조군-처리된 세포는 절단표지된 DNA의 최소 증가를 가졌다. 따라서, STAT3의 안티센스 억제는, A549 폐 암종 세포에서 PARP 절단 및 DNA 분절화에 의해 표시되는 바와 같이, 세포고사를 유도하였다.
A549 세포에서 얻어진 연구결과를 확대하기 위하여, H358 및 H1299 폐 암종 세포로 유사한 실험을 수행하였다. STAT3의 안티센스 억제는 불일치 대조군 올리고뉴클레오티드로의 처리에 비하여 H358 및 H1299 세포에서 STAT3 단백질을 소실하였다. 아이시스 113176으로 처리된 세포에서 PARP 절단에 의해 입증되는 바와 같이 세포고사 경로의 활성화가 H358 세포에서 증명되는 반면, STAT3 단백질의 부재에도 불구하고 H1299 세포에서 세포고사의 증거가 관찰되지 않았다.
STAT3 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리의 효과를 최소의 STAT3 DNA-결합 활성을 가진 H460 폐 암종 세포에서 평가하였다. H460 세포를 일렉트로포레이션에 의해 10m 이하의 아이시스 113176 또는 아이시스 129987으로 이입하였다. EMSA에 의해 측정되는 STAT3 활성은 최소의 DNA-결합 활성을 나타내었으며, 이것은 STAT3 안티센스 억제에 의해 감소되지만 불일치 대조군 올리고뉴클레오티드 처리에 의해서는 감소되지 않는다. 세포 형태 또는 세포 수에 미치는 효과가 명확하지 않으며, 세포고사가 증가되지 않으며 (각각 아이시스 129987 및 아이시스 113176으로 처리된 후에 0.53％ 및 0.27％ 세포고사 세포), 아포-BrdU의 증가된 혼입이 관찰되지 않았다. 이러한 데이타는 STAT3의 안티센스 억제가 특이적이고 H460 세포에서 세포 사멸을 유도하지 않는다는 결론을 뒷받침하고, 최소의 STAT3 활성을 갖는다.
이러한 데이타로부터, STAT3의 안티센스 억제가 A549 및 H358 세포에서 세포고사를 일으키는 반면, 세포고사가 H1299 또는 H460 세포에서 관찰되지 않음이 명백하다. 이러한 연구결과는, STAT3의 직접적인 억제가 세포고사 세포 사멸을 유도한다는 것을 증명하고, 특정한 인간 폐 암 세포에서 STAT3이 세포고사 경로를 제어한다는 것을 제안한다.
실시예 32
전립선 암 세포에서 인간 STAT3 의 안티센스 억제
다발성 골수종의 병인론은 사이토카인 IL-6에 의한 STAT3의 활성화와 연관되고, 이것은 세포고사를 방지한다. 전립선 암과 IL-6을 포함한 사이토카인의 결합에 기인하여, STAT3의 기능을 전립선 암 세포에서 관찰하였다. 추가의 구현양태에서, STAT3의 안티센스 억제로 처리한 DU145 세포를 STAT3 활성, 세포고사 및 증식에 대해 평가하였다. 이러한 분석을 사용한 절차를 문헌[Mora 등, Cancer Research, 2002, 62, 6659-6666]에 상세히 기재한다.
ATCC(미국 버지니아주 마나사스)로부터 DU45 전립선 암 세포를 수득하고, 10％ 태아 소 혈청으로 보충된 RPMI 배지에서 배양하였다. 세포를 250nM의 아이시스 113176(서열번호 115) 또는 STAT3을 표적으로 하지 않는 불일치 대조군 올리고뉴클레오티드인 아이시스 129987(GCTCCAATACCCGTTGCTTC. 서열번호 404)로 처리하였다. 세포를 이입 전 18시간에 10cm 플레이트에서 2×106 세포의 밀도로 접종하였다. 세포를 리포펙타민TM 플러스(인비트로겐 라이프 테크놀로지스, 미국 캘리포니아주 칼스배드) 단독, 리포펙타민TM 플러스 및 아이시스 113176과 함께, 또는 리포펙타민TM 플러스와 아이시스 129987과 함께 3시간동안 이입하였다. 비처리 세포가 대조군으로서 사용되었다.
24시간의 처리 후에, 단백질 단리 및 핵 추출물 제조를 위하여 세포를 수집하였다. 핵 추출물에서 전기영동 이동성 변위 분석(EMSA)에 의하여 STAT3의 DNA-결합 활성을 평가하였다. 5㎍의 전체 세포 단백질을 활성화된 STAT3 단백질에 결합하는 32P-표지화된 올리고뉴클레오티드 프로브와 함께 배양하였다. 단백질-DNA 착물을 비변형 폴리아크릴아미드 전기영동에 의해 분석하고 자동방사선사진에 의해 검출하였다. 산타 크루즈 바이오테크놀로지(미국 캘리포니아주 산타 크루즈)로부터의 항체를 사용하여 STAT3 단백질 수준을 웨스턴 블롯에 의해 평가하였다. 이입된 세포를 수집하고, 토끼 인간 다클론성 항체(포스포-Tyr705-Stat3; 미국 메사츄세츠주 베버리 셀 시그날링)를 사용하여, 포스포릴화 STAT3의 면역조직화학적 염색을 위해 95％ 에탄올에 고정시켰다.
EMSA은, 대조군 세포(불일치 대조군 올리고뉴클레오티드, 리포펙타민TM 플러스 단독 또는 비처리)에 비하여, 아이시스 113176으로 이입된 DU145 세포에서 상당히 감소된 STAT3 DNA-결합 활성을 밝혀내었다. STAT3에 대한 항체는 DNA-결합 활성을 봉쇄하고 초변위시켰으며, 이는 활성이 STAT3에 상응함을 증명한다. STAT3 단백질 발현은 대조군 세포에 비하여 아이시스 113176으로 형질이입된 DU145 세포에서 상당히 감소되었다. 또한, 포스포릴화 STAT3의 염색을 이입된 DU145 세포에서 폐지하였다. 이러한 데이타는, STAT3의 안티센스 억제가 포스포릴화 STAT3을 포함한 STAT3 단백질 수준 및 STAT3 DNA-결합 활성을 감소시킨다는 것을 증명한다.
공급업자의 프로토콜(벡톤 디킨슨 파르밍겐, 미국 캘리포니아주 샌디에고)에 따라서 활성화된 카스파제-3에 특이적인 항체를 사용하여 카스파제-3 수준을 측정함으로써 대조군 및 이입된 DU145 세포에서의 세포고사를 평가하였다. 유동 세포분석법에 의해 염색을 분석하였다. 혈구계수기 및 트립판 블루 염색 배제를 사용하여 생존 세포의 수를 계수함으로써 세포 증식을 측정하였다. 활성화된 카스파제-3은 리포펙타민 플러스 단독, 아이시스 129987 또는 아이시스 113176을 각각 수용하는 세포에서 비처리 대조군의 대략 5％, 7％ 및 18％였으며, 이는 STAT3의 안티센스 억제 후에 세포고사의 증가를 증명한다. 세포 증식을 48시간 기간에 걸쳐 억제하고, 아이시스 113176-처리된 시료에서 3×106 세포 이상으로 증가하지 않았다. 불일치 대조군 및 리포펙타민-플러스 처리된 세포에서의 세포 수는 동일한 48시간 기간에 걸쳐 각각대략 5×106 및 9×106 세포로 증가하였다.
실시예 33
2'- MOE 날개 및 데옥시 갭을 가진 생쥐 STAT3 을 표적으로 하는 키메라 포 스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드
본 발명에 따르면, 공개된 서열(진뱅크® 수탁 번호 U06922, 서열번호 82로서 포함됨, 진뱅크® 수탁 번호 NT_039521.2의 뉴클레오티드 12369484 내지 12421464의 보체, 서열번호 461로서 포함됨; 진뱅크® 수탁 번호 NM_213659.1 서열번호 462로서 포함됨; 및 진뱅크® 수탁 번호 NM_011486.3, 서열번호 463으로 포함됨)을 사용하여 생쥐 STAT3의 상이한 영역을 표적으로 하기 위하여 추가의 올리고뉴클레오티드 계열을 설계하였다. 올리고뉴클레오티드를 표 52에 나타낸다. "표적 부위"는 올리고뉴클레오티드가 결합된 특정한 표적 서열 위에서 처음(5'-최외) 뉴클레오티드 수를 나타낸다. 표 52의 모든 화합물은 10개의 2'-데옥시뉴클레오티드로 구성된 중심 "갭" 영역으로 이루어진 20개 뉴클레오티드 길이의 키메라 올리고뉴클레오티드("개프머")이고, 5개-뉴클레오티드 "날개"에 의하여 양 측(5' 및 3' 방향)에서 인접된다. 날개는 2'-O-메톡시에틸(2'-MOE) 뉴클레오티드로 구성된다. 뉴크레오티드간(주쇄) 결합은 올리고뉴클레오티드 전체에 걸쳐 포스포로티오에이트(P=S)이다. 모든 시티딘 잔기는 5-메틸시티딘이다.
다른 실시예에 기재된 바와 같이 정량적 실시간 PCR에 의해 생쥐 STAT3 mRNA 수준에 미치는 효과에 대해 화합물을 분석하였다. 데이타는 b.END 세포를 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 75nM로 처리한 2개 실험으로부터의 평균이다.
생쥐 뇌 상피세포 세포주 b.END를 맥스 플랭크 인스티튜트(독일 배드 나우헤임)에서 Dr.Werner Risau로부터 수득하였다. b.END 세포를 10％ 태아 소 혈청(인비트로겐 라이프 테크놀로지스, 미국 캘리포니아주 칼스배드)로 보충된 DMEM, 고 글루코스(인비트로겐 라이프 테크놀로지스, 미국 캘리포니아주 칼스배드)에서 일상적으로 배양하였다. 세포를 대략 90％ 융합에 이르를 때까지 트립신처리 및 희석에 의해 통과시켰다. 세포를 올리고머 화합물 이입 실험에서 사용하기 위하여 대략 3000 세포/웰의 밀도에서 96-웰 플레이트(팔콘-프리마리아 #3872, BD 바이오사이언스, 미국 메사츄세츠주 베드포드) 내에 접종하였다.
공개된 서열 정보(진뱅크® 수탁 번호 NM_213659.1, 서열번호 462로서 포함됨)를 사용하여 생쥐 STAT3 서열에 하이브리드형성하기 위하여 생쥐 STAT3으로의 프로브 및 프라이머를 설계하였다. 생쥐 STAT3를 위하여 PCR 프라이머는 정방향 프라이머: GCCACGTTGGTGTTTCATAATCT (서열번호 464) 역방향 프라이머: GATAGAGGACATTGGACTCTTGCA (서열번호 465)이었고, PCR 프로브는 FAM-TTGGGTGAAATTGACCAGCAATATAGCCG-TAMRA(서열번호 466)이었으며, 여기에서 FAM은 형광성 염료이고 TAMRA는 소광제 염료이다.
Figure 112006056137226-PCT00086
Figure 112006056137226-PCT00087
실시예 34
STAT3 의 안티센스 억제는 다발성 골수종의 모델에서 세포 사멸 및 종양 성장 억제를 유발한다
추가의 구현양태에서, 다발성 골수종의 발생 및 다발성 골수종-유래 종양의 성장에서 STAT3의 요건을 연구하였다. 트랜스제닉 NPM-ALK (NPM-ALK Tg) 생쥐는 구조적으로 활성화된 STAT3을 특징으로 하는 다발성 골수종을 자발적으로 발생시킨다. 다발성 골수종의 발생을 위해 STAT3이 요구되는지의 여부를 결정하기 위하여, NPM-ALK Tg 생쥐의 B-세포에서 STAT3이 유전적으로 붕괴된다. 문헌[Raz 등, PNAS, 1999, 96, 2846-2851]에 기재된 바와 같이, Cre 재조합효소 인식 부위(loxP 부위)를 함유하도록 생쥐 STAT3 좌를 유전자조작하였다. 이러한 변형 STAT3 좌를 가진 생쥐를 Cre 재조합효소 트랜스유전자를 가진 생쥐와 교배시킬 때, Cre 재조합효소는 loxP 부위에 의해 인접한 좌의 일부를 잘라내고 그 결과 결실된 STAT3 좌가 얻어진다. NPM-ALK Tg 생쥐를 번식시켜 상태적으로 파괴된 STAT3 유전자를 도입하였다. 이러한 생쥐를 CD+19 - 특이적 Cre 트랜스유전자를 보유하는 생쥐에 교배하고, 이것은 B 계통-제한된 CD19 유전자의 제어하에 Cre를 발현시켰다 (Rickert 등, Nuc.Acids Res., 1997, 25, 1317]. 얻어진 자손은 STAT3 유전자의 B-세포 특이적 결실을 갖는다. B-세포는 C19 항원에 의해 동정될 수 있고, 다발성 골수종의 원인이 되는 혈장 세포로 성숙되며, 이는 CD19 및 CD138 항원 양쪽 모두의 존재에 의해 동정된다.
생쥐를 상기 기재된 바와 같이 교배하고, 자손의 유전자형은 모든 CD19+ 또는 CD138+ 세포 (앞서 기재된 바와 같이 동정됨, Chiarle 등, Blood, 2003, 101, 1919-1927)의 80％ 초과가 STAT3 결실을 겪는다는 것을 나타내었다. 또한, 23NPM-ALK Tg STAT3-결핍 동물에서, STAT3-네가티브 다발성 골수종 세포가 검출되지 않는 것으로 관찰되었다. 앞서 기재된 바와 같은 세포로부터 핵 추출물을 제조하였다 [Mora 등, Cancer Res. 62:6659, 2002]. 여기에 기재된 바와 같은 웨스턴 블롯팅에 의해 핵 추출물에서 포스포릴화 STAT3의 검출은, 이러한 생쥐에서 모든 CD138+ 다발성 골수종 세포가 검출가능한 핵 포스포릴화 STAT3을 함유함을 나타내었다. 서던 블롯팅(Raz 등, PNAS, 1999, 96, 2846-2851에 기재됨)에 의해 결정된 바와 같이, 이러한 세포에서의 STAT3 유전자는 원상태였다. 이러한 데이타는, 플라스마 세포의 형질전환을 위해 STAT3이 절대적으로 요구됨을 증명한다.
STAT3-포지티브 CD19+ 세포가 다발성 골수종을 발생시키고, 다발성 골수종 세포를 수용 생쥐 내에 이식하였다. STAT3 안티센스 억제의 효과를 종양에서 시험하였다. 다발성 골수종 세포를 무모 또는 동유전자형 생쥐(Balb/c 생쥐) 내에 피하 주사(2×106 세포) 또는 정맥 주사(1×107 세포)하였다. 측정가능한 다발성 골수종 종양(약 0.5mm3)을 가진 동물을 14일 동안 20mg/kg의 투여량으로 아이시스 17152(서열번호 99) 또는 대조군 올리고뉴클레오티드 아이시스 28084 (서열번호 151)로 매일 주사하였다. 주사를 종양에 반대측면에서 피하 투여하였다. 각각의 처리 군은 3 내지 9마리 동물을 포함하였다.
15일의 올리고뉴클레오티드 처리 후에, 아이시스 17152-주입된 동물에서의 종양 성장이 대조군 올리고뉴클레오티드-주입 동물에서 15％로 감소되었다. 일반적인 조직학적 분석에 의해 판정되는 바와 같이, 아이시스 17152-처리된 종양은 대조군 올리고뉴클레오티드-처리된 종양에 비하여 그 전체에 걸쳐 큰 괴사 면적을 나타내었으며, 이것은 단지 하나의 세포고사 특징을 나타내었다. 추가로, 다발성 골수종에서 증가된 혈청 IgM 수준을 통상적으로 입수가능한 키트(예, OPT-EIATM, BD 바이오사이언시스 파르밍겐, 미국 캘리포니아주 샌디에고)를 사용하여 ELISA에 의해 측정하였으며, 대조군 올리고뉴클레오티드-처리된 동물에 비하여 아이시스 17152-처리된 동물에서 저하되는 것으로 밝혀졌다. 또한, 아이시스 17152 처리를 받은 동물의 전체 생존율은 대조군 동물에 비해 상당히 증가되었다.
확립된 종양 위에서 STAT3의 안티센스 억제 효과를 시험하기 위하여, 1cm3 종양이 발생된 생쥐에서 유사한 실험을 수행하였다. 생쥐를 14일동안 40mg/kg 아이시스 17152 또는 대조군 올리고뉴클레오티드로 매일 처리하였다. 이 실험에서, STAT3의 안티센스 억제 결과로서 종양 괴사 및 종양 세포 주기 저지가 관찰되었다.
종양에서의 괴사를 제조업자의 지시에 따라서 아넥신-V 염색 키트(클론테크, 미국 캘리포니아주 팔로알토)를 사용하여 아넥신-V 염색에 의해 평가하였다. 간략하게, 세포를 0.2mL의 염색 완충제(10mM HEPES, pH 7.4, 140mM NaCl, 5mM CaCl2)에 재현탁시키고, 10㎕의 요오드화프로피듐(50㎍/ml) 및 5㎕의 아넥신-V 시약을 4℃에서 10분동안 첨가하였다. 샘플을 팩스플로우(FacsFlow) 완충제로 희석하고 벡톤 딕킨슨 팩스캔TM(미국 캘리포니아주 마운틴뷰)에서 분석하였다. STAT3을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 받은 생쥐의 종양 세포에서, 대조군에 비하여, 아넥신-V 포지티브 종양 세포에서 약 2배 증가가 관찰되었다. 제조업자의 지시에 따라 통상적으로 입수가능한 키트(예, 아포-다이렉트TM, 미국 캘리포니아주 샌디에고 파르밍겐, BD 바이오사이언스)를 사용하여 수행되는 튜넬(TUNEL) 염색에 의하여 세포고사를 평가하였다. 아이시스 17152로 처리된 생쥐의 종양 세포에서, 대조군 올리고뉴클레오티드 처리된 종양에 비하여, TUNEL-포지티브 세포의 큰 부위가 존재하였다. 이러한 데이타는, 안티센스 억제가 이식된 다발성 골수종 종양에서 세포고사를 유발함을 증명한다.
유동 세포분석법에 의하여 세포 주기 저지를 평가하였다. 세포를 여기에 기재된 바와 같이 제조하였다. 아이시스 17152-처리된 종양(20mg/kg 투여량)으로부터의 세포는, 대조군-처리된 종양으로부터의 세포에 비하여, S-단계 집단에서 45％ 감소를 나타내었다. 따라서, STAT3의 안티센스 억제는 세포 주기의 G1 단계를 저지하였다.
주요 다발성 골수종 종양 및 이식된 종양을 STAT3, 포스포릴화 STAT3, Bcl-xL, 서비빈, ERK, 포스포릴화 ERK 및 c-myc의 발현을 위해 웨스턴 블롯에 의해 평가하였다. 단백질 용해제를 제조하고, 통상적으로 입수가능한 항체(여기에 기재된 바와 같이 수득된 STAT3 및 포스포릴화 STAT3 항체; 다른 항체는 미국 캘리포니아주 산타크루즈의 산타 크루즈 바이오테크놀로지로부터 입수가능함)를 사용하여 웨스턴 블롯 분석하였다. 주요 및 이식된 다발성 골수종 종양에서, 높은 수준의 단백질이 관찰되었으며, 이것은 이식된 종양 세포가 일차 종양 세포와 유사한 특징을 갖고 있음을 나타낸다.
다발성 골수종의 생쥐 모델에서 조합 치료를 시험하였다. 이식된 다발성 골수종 세포로부터 유래된 종양을 가진 동물을 보르테조미브("벨케이드(Velcade)®"로서 알려짐, 미국 메사츄세츠주 캠브리지 밀레니엄 파마슈티칼스) 또는 시클로포스파미드 (엔독사나(Endoxana)®로 알려짐, 독일 프랑크푸르트 아스타메디카)와 조합하여 아이시스 17152로 처리하였다. 적어도 10마리 동물로 구성된 하나의 처리 군은, 14일 동안, 보르테즈미브와 조합된 20mg/kg의 아이시스 17152의 일일 피하 투여량을 받았다. 보르테즈미브를 14일의 연구 기간동안 0.05mg/kg 내지 1.0mg/kg 범위의 투여량에서 1주 2회 정맥 투여하였다. 적어도 10마리 동물로 구성된 추가의 처리 군은 시클로포스파미드와 조합하여 20mg/kg으로 아이시스 17152의 피하 투여량을 매일 받았다. 시클로포스파미드를 14일 연구 기간동안 1주 2회 35mg/kg의 투여량으로 복강내 투여하였다. 조합 처리 군에서, 하기 종료점을 평가하였다: 종양 성장, 생존율, 혈청 IgM 수준, 세포고사, 세포 주기 저지, STAT3 및 포스포릴화 STAT3 단백질 수준, 및 종양 괴사.
이러한 데이타는, STAT3의 안티센스 억제가 생체내에서 G1 단계 저지, 세포 사멸 및 종양 성장 억제를 유도함을 증명한다. 따라서, STAT3을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 다발성 골수종의 치료에서 사용되는 치료제이다.
SEQUENCE LISTING <110> Karras, James G <120> Antisense Oligonucleotide Modulation of STAT3 Expression <130> X-17294 <160> 406 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 2787 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 cagctggaat tcggggcggc ggcgcagact gggaggggga gccgggggtt ccgacgtcgc 60 agccgaggga acaagcccca accggatcct ggacaggcac cccggcttgg cgctgtctct 120 ccccctcggc tcggagaggc ccttcggcct gagggagcct cgccgcccgt ccccggcaca 180 cgcgcagccc cggcctctcg gcctctgccg gagaaacagg atggcccaat ggaatcagct 240 acagcagctt gacacacggt acctggagca gctccatcag ctctacagtg acagcttccc 300 aatggagctg cggcagtttc tggccccttg gattgagagt caagattggg catatgcggc 360 cagcaaagaa tcacatgcca ctttggtgtt tcataatctc ctgggagaga ttgaccagca 420 gtatagccgc ttcctgcaag agtcgaatgt tctctatcag cacaatctac gaagaatcaa 480 gcagtttctt cagagcaggt atcttgagaa gccaatggag attgcccgga ttgtggcccg 540 gtgcctgtgg gaagaatcac gccttctaca gactgcagcc actgcggccc agcaaggggg 600 ccaggccaac caccccacag cagccgtggt gacggagaag cagcagatgc tggagcagca 660 ccttcaggat gtccggaaga gagtgcagga tctagaacag aaaatgaaag tggtagagaa 720 tctccaggat gactttgatt tcaactataa aaccctcaag agtcaaggag acatgcaaga 780 tctgaatgga aacaaccagt cagtgaccag gcagaagatg cagcagctgg aacagatgct 840 cactgcgctg gaccagatgc ggagaagcat cgtgagtgag ctggcggggc ttttgtcagc 900 gatggagtac gtgcagaaaa ctctcacgga cgaggagctg gctgactgga agaggcggca 960 acagattgcc tgcattggag gcccgcccaa catctgccta gatcggctag aaaactggat 1020 aacgtcatta gcagaatctc aacttcagac ccgtcaacaa attaagaaac tggaggagtt 1080 gcaccaaaaa gtttcctaca aaggggaccc cattgtacag caccggccga tgctggagga 1140 gaggatcgtg gagctgttca gaaacttaat gaaaagtgcc tttgtggtgg agcggcagcc 1200 ctgcatgccc atgcatcctg accggcccct cgtcatcaag accggcgtcc agttcactac 1260 taaagtcagg ttgctggtca agttccctga gttgaattat cagcttaaaa ttaaagtgtg 1320 cattgacaaa gactctgggg acgttgcagc tctcagagga tcccggaaat ttaacattct 1380 gggcacaaac acaaaagtga tgaacatgga agaatccaac aacggcagcc tctctgcaga 1440 attcaaacac ttgaccctga gggagcagag atgtgggaat gggggccgag ccaattgtga 1500 tgcttccctg attgtgactg aggagctgca cctgatcacc tttgagaccg aggtgtatca 1560 ccaaggtctc aagattgacc tagagaccca ctccttgtca gttgtggtga tctccaacat 1620 ctgtcagatg ccaaatgcct gggcgtccat cctgtggtac aacatgctga ccaacaatcc 1680 caagaatgtg aacttcttca ctaagccgcc aattggaacc tgggaccaag tggccgaggt 1740 gctcagctgg cagttctcgt ccaccaccaa gcgggggctg agcatcgagc agctgacaac 1800 gctggctgag aagctcctag ggcctggtgt gaactactca gggtgtcaga tcacatgggc 1860 taacttctgc aaagaaaaca tggctggcaa gggcttctcc tactgggtct ggctagacaa 1920 tatcatcgac cttgtgaaaa agtatatctt ggccctttgg aatgaagggt acatcatggg 1980 tttcatcagc aaggagcggg agcgggccat cttgagcact aagcccccag gcaccttcct 2040 gctgcgcttc agtgaaagca gcaaagaagg aggcgtcact ttcacttggg tggagaagga 2100 catcagcggt aagacccaga tccagtccgt ggaaccatac acaaagcagc agctgaacaa 2160 catgtcattt gctgaaatca tcatgggcta taagatcatg gatgctacca atatcctgtt 2220 gtctccactt gtctatctct atcctgacat tcccaaggag gaggcattcg ggaagtattg 2280 tcggccagag agccaggagc atcctgaagc tgacccaggt agcgctgccc catacctgaa 2340 gaccaagttt atctgtgtga caccaacgac 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 53 gctgctttca ctgaagcgca 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 54 gtgaaagtga cgcctccttc 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 55 ctgatgtcct tctccaccca 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 56 actggatctg ggtcttaccg 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 57 aaatgacatg ttgttcagct 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 58 gcccatgatg atttcagcaa 20 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 59 tattggtagc atccatgatc 20 <210> 60 <211> 20 <212> 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Sequence: Synthetic <400> 80 acatccttat ttgcatttag 20 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 81 gatcatgggt ctcagagaac 20 <210> 82 <211> 2869 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 82 gccgcgacca gccaggccgg ccagtcgggc tcagcccgga gacagtcgag acccctgact 60 gcagcaggat ggctcagtgg aaccagctgc agcagctgga cacacgctac ctgaagcagc 120 tgcaccagct gtacagcgac acgttcccca tggagctgcg gcagttcctg gcaccttgga 180 ttgagagtca agactgggca tatgcagcca gcaaagagtc acatgccacg ttggtgtttc 240 ataatctctt gggtgaaatt gaccagcaat atagccgatt cctgcaagag tccaatgtcc 300 tctatcagca caaccttcga agaatcaagc agtttctgca gagcaggtat cttgagaagc 360 caatggaaat tgcccggatc gtggcccgat gcctgtggga agagtctcgc ctcctccaga 420 cggcagccac ggcagcccag caagggggcc aggccaacca cccaacagcc gccgtagtga 480 cagagaagca gcagatgttg gagcagcatc ttcaggatgt ccggaagcga gtgcaggatc 540 tagaacagaa aatgaaggtg gtggagaacc tccaggacga ctttgatttc aactacaaaa 600 ccctcaagag ccaaggagac atgcaggatc tgaatggaaa caaccagtct gtgaccagac 660 agaagatgca gcagctggaa cagatgctca cagccctgga ccagatgcgg agaagcattg 720 tgagtgagct ggcggggctc ttgtcagcaa tggagtacgt gcagaagaca ctgactgatg 780 aagagctggc tgactggaag aggcggcagc agatcgcgtg catcggaggc cctcccaaca 840 tctgcctgga ccgtctggaa aactggataa cttcattagc agaatctcaa cttcagaccc 900 gccaacaaat taagaaactg gaggagctgc agcagaaagt gtcctacaag ggcgacccta 960 tcgtgcagca ccggcccatg ctggaggaga ggatcgtgga gctgttcaga aacttaatga 1020 agagtgcctt cgtggtggag cggcagccct gcatgcccat gcacccggac cggcccttag 1080 tcatcaagac tggtgtccag tttaccacga aagtcaggtt gctggtcaaa tttcctgagt 1140 tgaattatca gcttaaaatt aaagtgtgca ttgataaaga ctctggggat gttgctgccc 1200 tcagagggtc tcggaaattt aacattctgg gcacgaacac aaaagtgatg aacatggagg 1260 agtctaacaa cggcagcctg tctgcagagt tcaagcacct gacccttagg gagcagagat 1320 gtgggaatgg aggccgtgcc aattgtgatg cctccttgat cgtgactgag gagctgcacc 1380 tgatcacctt cgagactgag gtgtaccacc aaggcctcaa gattgaccta gagacccact 1440 ccttgccagt tgtggtgatc tccaacatct gtcagatgcc aaatgcttgg gcatcaatcc 1500 tgtggtataa catgctgacc aataacccca agaacgtgaa cttcttcact aagccgccaa 1560 ttggaacctg ggaccaagtg gccgaggtgc tcagctggca gttctcgtcc accaccaagc 1620 gagggctgag catcgagcag ctgacaacgc tggctgagaa gctcctaggg cctggtgtga 1680 actactcagg gtgtcagatc acatgggcta aattctgcaa agaaaacatg gctggcaagg 1740 gcttctcctt ctgggtctgg ctagacaata tcatcgacct tgtgaaaaag tatatcttgg 1800 ccctttggaa tgaagggtac atcatgggtt tcatcagcaa ggagcgggag cgggccatcc 1860 taagcacaaa gcccccgggc accttcctac tgcgcttcag cgagagcagc aaagaaggag 1920 gggtcacttt cacttgggtg gaaaaggaca tcagtggcaa gacccagatc cagtctgtag 1980 agccatacac caagcagcag ctgaacaaca tgtcatttgc tgaaatcatc atgggctata 2040 agatcatgga tgcgaccaac atcctggtgt ctccacttgt ctacctctac cccgacattc 2100 ccaaggagga ggcatttgga aagtactgta ggcccgagag ccaggagcac cccgaagccg 2160 acccaggtag tgctgccccg tacctgaaga ccaagttcat ctgtgtgaca ccaacgacct 2220 gcagcaatac cattgacctg ccgatgtccc cccgcacttt agattcattg atgcagtttg 2280 gaaataacgg tgaaggtgct gagccctcag caggagggca gtttgagtcg ctcacgtttg 2340 acatggatct gacctcggag tgtgctacct cccccatgtg aggagctgaa accagaagct 2400 gcagagacgt gacttgagac acctgccccg tgctccaccc ctaagcagcc gaaccccata 2460 tcgtctgaaa ctcctaactt tgtggttcca gatttttttt tttaatttcc tacttctgct 2520 atctttgggc aatctgggca ctttttaaaa gagagaaatg agtgagtgtg ggtgataaac 2580 tgttatgtaa agaggagaga cctctgagtc tggggatggg gctgagagca gaagggaggc 2640 aaaggggaac acctcctgtc ctgcccgcct gccctccttt ttcagcagct cgggggttgg 2700 ttgttagaca agtgcctcct ggtgcccatg gctacctgtt gccccactct gtgagctgat 2760 accccattct gggaactcct ggctctgcac tttcaacctt gctaatatcc acatagaagc 2820 taggactaag cccaggaggt tcctctttaa attaaaaaaa aaaaaaaaa 2869 <210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 83 gttccactga gccatcctgc 20 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 84 ttcaggtagc gtgtgtccag 20 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 85 atgtgactct ttgctggctg 20 <210> 86 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 86 ccaagagatt atgaaacacc 20 <210> 87 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 87 gctccaacat ctgctgcttc 20 <210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 88 gctcttcatc agtcagtgtc 20 <210> 89 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 89 atctgacacc ctgagtagtt 20 <210> 90 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 90 gccagaccca gaaggagaag 20 <210> 91 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 91 cgctccttgc tgatgaaacc 20 <210> 92 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 92 aacttggtct tcaggtacgg 20 <210> 93 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 93 atcaatgaat ctaaagtgcg 20 <210> 94 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 94 tcagcacctt caccgttatt 20 <210> 95 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 95 actcaaactg ccctcctgct 20 <210> 96 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 96 ggtttcagct cctcacatgg 20 <210> 97 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 97 taaaaaaaaa aatctggaac 20 <210> 98 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 98 aagatagcag aagtaggaaa 20 <210> 99 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 99 aaaaagtgcc cagattgccc 20 <210> 100 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 100 atcacccaca ctcactcatt 20 <210> 101 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 101 cctttgcctc ccttctgctc 20 <210> 102 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 102 tgaaaaagga gggcaggcgg 20 <210> 103 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 103 caccaggagg cacttgtcta 20 <210> 104 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 104 aacctcctgg gcttagtcct 20 <210> 105 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 105 aaaaagtgcg 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Sequence: Synthetic <400> 112 ccattgggaa gctgtcactg 20 <210> 113 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 113 tgtgattctt tgctggccgc 20 <210> 114 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 114 gcggctatac tgctggtcaa 20 <210> 115 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 115 gctccagcat ctgctgcttc 20 <210> 116 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 116 gattcttccc acaggcaccg 20 <210> 117 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 117 tgattcttcc cacaggcacc 20 <210> 118 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 118 atcctgaagg tgctgctcca 20 <210> 119 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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Artificial Sequence: Synthetic <400> 139 cccaagtgaa agtgacgcct 20 <210> 140 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 140 acccaagtga aagtgacgcc 20 <210> 141 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 141 ccgaatgcct cctccttggg 20 <210> 142 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 142 gccgacaata cttcccgaat 20 <210> 143 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 143 gatgctcctg gctctctggc 20 <210> 144 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 144 tcaatgaatc taaagcgcgg 20 <210> 145 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 145 gactcaaact gccctcctgc 20 <210> 146 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 146 atcacccaca ttcactcatt 20 <210> 147 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 147 aaaagtgccc agattgc 17 <210> 148 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 148 aaaagtgccc agattgctca 20 <210> 149 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 149 taaaagtgcc cagattgctc 20 <210> 150 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 150 aagcagatca cccacattca 20 <210> 151 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 151 aaaaagaggc ctgattgccc 20 <210> 152 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 152 tctggcaaag tgtcagtatg 20 <210> 153 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cgtcgcccaa gttggtattt ccatgtttgg tacacatcac tctgtgccat atcaggtcgt 1680 tgttaagtgt ggtgacaaaa tcagtggtta gtcatttttt taattaaaaa tgtgtatagt 1740 gtgtacctgc tggtcttact gtatgtgcaa ctaaaggttt acatagtctg tgtatgggtt 1800 gtaaattttt ggctggctgt gctgataaag cattgggctt gaataaagca aagcagaaaa 1860 tcatctcaat cttttatatg tggatttaga ctgtgttatg acttggttca gccagttttc 1920 tatcttattt tatattaaat atgtctgtgt tctctgagtc agcacattta tttccttatt 1980 acatgttcca gacaggagtg ctagcccagt ttttgttcag tttgcacagt gggatgggga 2040 aacaagtctg gaatttaaaa aaaaatgttt tagaggttgg agccttgatt ttagtctcta 2100 tattagcaca tccatcacaa agaaccatta gtaaattcat gaatcttttg ttttttatgt 2160 agttcatttg agaagaataa tcacttagaa atatccacag tgccaggcat ggtggtgcac 2220 acctctgatc ccagctaatt gaaggctgag gtgggaggat tccttgagtc caggagttga 2280 gtctggtctg ggcaacatgg tgagaggcca ggaattgggt ctagagtcta gtctaagcac 2340 cataatgaga acccatcttt aagaaagaaa gaaaggaaag gaggaagaaa ggaaagaaaa 2400 agaaataccc acagcacagt tatgaattaa cccacaaagg acttgtgagg tgggtagttc 2460 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gctaggcatg 70620 gtggcagatg cctgtaatcc agctactcag gaggctgatg aaggagaatc acttgaaccc 70680 tggaggcaga ggttgtagag agccaagatg gcgctactgc actccaacct gggcgaaaga 70740 gagcaagact ccgtctcaaa aaaaaaaaag acaaaaatta gccaggcatg gtggtgccac 70800 ctgtagtccc agctgcttgg gagcctaagg caggagaatc gttttgacct gggagtagga 70860 ggttgcggta accgagattg tgccactgca cttgagcctg ggcaacagag tgagactctg 70920 tctcaaaaca ataagaacaa cagcaacaaa agagagagac catgccttgc tccaggtctc 70980 ttagctattg aagatgtacc tggacccagg tctccggtct tctagttgaa gcaattgtac 71040 tgccttacaa agtcacattc tctttggtgc tttttgattg acgtatttat ccaactagaa 71100 agttactcat gccctcatcc aaaaatgtgg tagaggccag attagtgctg gtaggaataa 71160 gagatataac ctttggcttt ggaaccacaa gcattagcag tctccatgtt ctttaaagac 71220 ttggtgatat tggtatttag gctggacacc atgcaaagac tacacaggct cggttcctgc 71280 atgcagagaa gttatctaag agatatgacc aggccggaat agaatgctca gaccacgtgg 71340 aggctgttaa acttttacat aatctaggga aagaagggac acaaggtggc attagtctag 71400 ggtcaggtgg gaaaaggtta tgctgaaaag tctctgcagc 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cag cag ctt gac aca cgg tac ctg gag 288 Met Ala Gln Trp Asn Gln Leu Gln Gln Leu Asp Thr Arg Tyr Leu Glu 1 5 10 15 cag ctc cat cag ctc tac agt gac agc ttc cca atg gag ctg cgg cag 336 Gln Leu His Gln Leu Tyr Ser Asp Ser Phe Pro Met Glu Leu Arg Gln 20 25 30 ttt ctg gcc cct tgg att gag agt caa gat tgg gca tat gcg gcc agc 384 Phe Leu Ala Pro Trp Ile Glu Ser Gln Asp Trp Ala Tyr Ala Ala Ser 35 40 45 aaa gaa tca cat gcc act ttg gtg ttt cat aat ctc ctg gga gag att 432 Lys Glu Ser His Ala Thr Leu Val Phe His Asn Leu Leu Gly Glu Ile 50 55 60 gac cag cag tat agc cgc ttc ctg caa gag tcg aat gtt ctc tat cag 480 Asp Gln Gln Tyr Ser Arg Phe Leu Gln Glu Ser Asn Val Leu Tyr Gln 65 70 75 80 cac aat cta cga aga atc aag cag ttt ctt cag agc agg tat ctt gag 528 His Asn Leu Arg Arg Ile Lys Gln Phe Leu Gln Ser Arg Tyr Leu Glu 85 90 95 aag cca atg gag att gcc cgg att gtg gcc cgg tgc ctg tgg gaa gaa 576 Lys Pro Met Glu Ile Ala Arg Ile Val Ala Arg Cys Leu Trp Glu Glu 100 105 110 tca cgc ctt cta cag act gca gcc 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tac gtg cag aaa act ctc acg gac gag gag ctg 960 Leu Ser Ala Met Glu Tyr Val Gln Lys Thr Leu Thr Asp Glu Glu Leu 225 230 235 240 gct gac tgg aag agg cgg caa cag att gcc tgc att gga ggc ccg ccc 1008 Ala Asp Trp Lys Arg Arg Gln Gln Ile Ala Cys Ile Gly Gly Pro Pro 245 250 255 aac atc tgc cta gat cgg cta gaa aac tgg ata acg tca tta gca gaa 1056 Asn Ile Cys Leu Asp Arg Leu Glu Asn Trp Ile Thr Ser Leu Ala Glu 260 265 270 tct caa ctt cag acc cgt caa caa att aag aaa ctg gag gag ttg cag 1104 Ser Gln Leu Gln Thr Arg Gln Gln Ile Lys Lys Leu Glu Glu Leu Gln 275 280 285 caa aaa gtt tcc tac aaa ggg gac ccc att gta cag cac cgg ccg atg 1152 Gln Lys Val Ser Tyr Lys Gly Asp Pro Ile Val Gln His Arg Pro Met 290 295 300 ctg gag gag aga atc gtg gag ctg ttt aga aac tta atg aaa agt gcc 1200 Leu Glu Glu Arg Ile Val Glu Leu Phe Arg Asn Leu Met Lys Ser Ala 305 310 315 320 ttt gtg gtg gag cgg cag ccc tgc atg ccc atg cat cct gac cgg ccc 1248 Phe Val Val Glu Arg Gln Pro Cys Met Pro Met His Pro Asp Arg Pro 325 330 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Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 170 gaagggcctc tccgagccga 20 <210> 171 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 171 ggcggcgagg ctccctcagg 20 <210> 172 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 172 tccggcagag gccgagaggc 20 <210> 173 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 173 ccatcctgct aaaatcaggg 20 <210> 174 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 174 ccattgggcc atcctgctaa 20 <210> 175 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 175 tgtcaagctg ctgtagctga 20 <210> 176 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 176 aactgccgca gctccattgg 20 <210> 177 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 177 tcttgactct caatccaagg 20 <210> 178 <211> 20 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oligonucleotide <400> 317 caggagatta tgaaacacca 20 <210> 318 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 318 tcccaggaga ttatgaaaca 20 <210> 319 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 319 ctcccaggag attatgaaac 20 <210> 320 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 320 ctctcccagg agattatgaa 20 <210> 321 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 321 atctctccca ggagattatg 20 <210> 322 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 322 cttgccagcc atgttttctt 20 <210> 323 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 323 cccttgccag ccatgttttc 20 <210> 324 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 324 agcccttgcc agccatgttt 20 <210> 325 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial 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acccagaagg 20 <210> 372 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 372 tgtccagcca gacccagaag 20 <210> 373 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 373 attgtccagc cagacccaga 20 <210> 374 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 374 atattgtcca gccagaccca 20 <210> 375 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 375 catgatctta tagcccatga 20 <210> 376 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 376 tccatgatct tatagcccat 20 <210> 377 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 377 catccatgat cttatagccc 20 <210> 378 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 378 agcatccatg atcttatagc 20 <210> 379 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 379 tggtagcatc catgatctta 20 <210> 380 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 380 ttggtagcat ccatgatctt 20 <210> 381 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 381 gatattggta gcatccatga 20 <210> 382 <211> 2924 <212> DNA <213> M. musculus <220> <221> CDS <222> (173)...(2341) <400> 382 gtcgacccac gcgtccgcgc tgaggtacaa ccccgctcgg tgtcgcctga ccgcgtcggc 60 taggagaggc caggcggccc tcgggagccc agcagctcgc gcctggagtc agcgcaggcc 120 ggccagtcgg gcctcagccc cggagacagt cgagacccct gactgcagca gg atg gct 178 Met Ala 1 cag tgg aac cag ctg cag cag ctg gac aca cgc tac ctg gag cag ctg 226 Gln Trp Asn Gln Leu Gln Gln Leu Asp Thr Arg Tyr Leu Glu Gln Leu 5 10 15 cac cag ctg tac agc gac acg ttc ccc atg gag ctg cgg cag ttc ctg 274 His Gln Leu Tyr Ser Asp Thr Phe Pro Met Glu Leu Arg Gln Phe Leu 20 25 30 gca cct tgg att gag agt caa gac tgg gca tat gca gcc agc aaa gag 322 Ala Pro Trp Ile Glu Ser Gln Asp Trp Ala Tyr Ala Ala Ser Lys Glu 35 40 45 50 tca cat gcc acg ttg gtg ttt cat aat ctc ttg ggt gaa att gac cag 370 Ser His Ala Thr Leu Val Phe His Asn Leu Leu Gly Glu Ile Asp Gln 55 60 65 caa tat agc cga ttc ctg caa gag tcc aat gtc ctc tat cag cac aac 418 Gln Tyr Ser Arg Phe Leu Gln Glu Ser Asn Val Leu Tyr Gln His Asn 70 75 80 ctt cga aga atc aag cag ttt ctg cag agc agg tat ctt gag aag cca 466 Leu Arg Arg Ile Lys Gln Phe Leu Gln Ser Arg Tyr Leu Glu Lys Pro 85 90 95 atg gaa att gcc cgg atc gtg gcc cga tgc ctg tgg gaa gag tct cgc 514 Met Glu Ile Ala Arg Ile Val Ala Arg Cys Leu Trp Glu Glu Ser Arg 100 105 110 ctc ctc cag acg gca gcc acg gca gcc cag caa ggg ggc cag gcc aac 562 Leu Leu Gln Thr Ala Ala Thr Ala Ala Gln Gln Gly Gly Gln Ala Asn 115 120 125 130 cac cca aca gcc gcc gta gtg aca gag aag cag cag atg ttg gag cag 610 His Pro Thr Ala Ala Val Val Thr Glu Lys Gln Gln Met Leu Glu Gln 135 140 145 cat ctt cag gat gtc cgg aag cga gtg cag gat cta gaa cag aaa atg 658 His Leu Gln Asp Val Arg Lys Arg Val Gln Asp Leu Glu Gln Lys Met 150 155 160 aag gtg gtg gag aac ctc cag gac gac ttt gat ttc aac tac aaa acc 706 Lys Val Val Glu Asn Leu Gln Asp Asp Phe Asp Phe Asn Tyr Lys Thr 165 170 175 ctc aag agc caa gga gac atg cag gat ctg aat gga aac aac cag tct 754 Leu Lys Ser Gln Gly Asp Met Gln Asp Leu Asn Gly Asn Asn Gln Ser 180 185 190 gtg acc aga cag aag atg cag cag ctg gaa cag atg ctc aca gcc ctg 802 Val Thr Arg Gln Lys Met Gln Gln Leu Glu Gln Met Leu Thr Ala Leu 195 200 205 210 gac cag atg cgg aga agc att gtg agt gag ctg gcg ggg ctc ttg tca 850 Asp Gln Met Arg Arg Ser Ile Val Ser Glu Leu Ala Gly Leu Leu Ser 215 220 225 gca atg gag tac gtg cag aag aca ctg act gat gaa gag ctg gct gac 898 Ala Met Glu Tyr Val Gln Lys Thr Leu Thr Asp Glu Glu Leu Ala Asp 230 235 240 tgg aag agg cgg cag cag atc gcg tgc atc gga ggc cct ccc aac atc 946 Trp Lys Arg Arg Gln Gln Ile Ala Cys Ile Gly Gly Pro Pro Asn Ile 245 250 255 tgc ctg gac cgt ctg gaa aac tgg ata act tca tta gca gaa tct caa 994 Cys Leu Asp Arg Leu Glu Asn Trp Ile Thr Ser Leu Ala Glu Ser Gln 260 265 270 ctt cag acc cgc caa caa att aag aaa ctg gag gag ctg cag cag aaa 1042 Leu Gln Thr Arg Gln Gln Ile Lys Lys Leu Glu Glu Leu Gln Gln Lys 275 280 285 290 gtg tcc tac aag ggc gac cct atc gtg cag cac cgg ccc atg ctg gag 1090 Val Ser Tyr Lys Gly Asp Pro Ile Val Gln His Arg Pro Met Leu Glu 295 300 305 gag agg atc gtg gag ctg ttc aga aac tta atg aag agt gcc ttc gtg 1138 Glu Arg Ile Val Glu Leu Phe Arg Asn Leu Met Lys Ser Ala Phe Val 310 315 320 gtg gag cgg cag ccc tgc atg ccc atg cac ccg gac cgg ccc tta gtc 1186 Val Glu Arg Gln Pro Cys Met Pro Met His Pro Asp Arg Pro Leu Val 325 330 335 atc aag act ggt gtc cag ttt acc acg aaa gtc agg ttg ctg gtc aaa 1234 Ile Lys Thr Gly Val Gln Phe Thr Thr Lys Val Arg Leu Leu Val Lys 340 345 350 ttt cct gag ttg aat tat cag ctt aaa att aaa gtg tgc att gat aaa 1282 Phe Pro Glu Leu Asn Tyr Gln Leu Lys Ile Lys Val Cys Ile Asp Lys 355 360 365 370 gac tct ggg gat gtt gct gcc ctc aga ggg tct cgg aaa ttt aac att 1330 Asp Ser Gly Asp Val Ala Ala Leu Arg Gly Ser Arg Lys Phe Asn Ile 375 380 385 ctg ggc acg aac aca aaa gtg atg aac atg gag gag tct aac aac ggc 1378 Leu Gly Thr Asn Thr Lys Val Met Asn Met Glu Glu Ser Asn Asn Gly 390 395 400 agc ctg tct gca gag ttc aag cac ctg acc ctt agg gag cag aga tgt 1426 Ser Leu Ser Ala Glu Phe Lys His Leu Thr Leu Arg Glu Gln Arg Cys 405 410 415 ggg aat gga ggc cgt gcc aat tgt gat gcc tcc ttg atc gtg act gag 1474 Gly Asn Gly Gly Arg Ala Asn Cys Asp Ala Ser Leu Ile Val Thr Glu 420 425 430 gag ctg cac ctg atc acc ttc gag act gag gtg tac cac caa ggc ctc 1522 Glu Leu His Leu Ile Thr Phe Glu Thr Glu Val Tyr His Gln Gly Leu 435 440 445 450 aag att gac cta gag acc cac tcc ttg cca gtt gtg gtg atc tcc aac 1570 Lys Ile Asp Leu Glu Thr His Ser Leu Pro Val Val Val Ile Ser Asn 455 460 465 atc tgt cag atg cca aat gct tgg gca tca atc ctg tgg tat aac atg 1618 Ile Cys Gln Met Pro Asn Ala Trp Ala Ser Ile Leu Trp Tyr Asn Met 470 475 480 ctg acc aat aac ccc aag aac gtg aac ttc ttc act aag ccg cca att 1666 Leu Thr Asn Asn Pro Lys Asn Val Asn Phe Phe Thr Lys Pro Pro Ile 485 490 495 gga acc tgg gac caa gtg gcc gag gtg ctc agc tgg cag ttc tcg tcc 1714 Gly Thr Trp Asp Gln Val Ala Glu Val Leu Ser Trp Gln Phe Ser Ser 500 505 510 acc acc aag cga ggg ctg agc atc gag cag ctg aca acg ctg gct gag 1762 Thr Thr Lys Arg Gly Leu Ser Ile Glu Gln Leu Thr Thr Leu Ala Glu 515 520 525 530 aag ctc cta ggg cct ggt gtg aac tac tca ggg tgt cag atc aca tgg 1810 Lys Leu Leu Gly Pro Gly Val Asn Tyr Ser Gly Cys Gln Ile Thr Trp 535 540 545 gct aaa ttc tgc aaa gaa aac atg gct ggc aag ggc ttc tcc ttc tgg 1858 Ala Lys Phe Cys Lys Glu Asn Met Ala Gly Lys Gly Phe Ser Phe Trp 550 555 560 gtc tgg cta gac aat atc atc gac ctt gtg aaa aag tat atc ttg gcc 1906 Val Trp Leu Asp Asn Ile Ile Asp Leu Val Lys Lys Tyr Ile Leu Ala 565 570 575 ctt tgg aat gaa ggg tac atc atg ggt ttc atc agc aag gag cgg gag 1954 Leu Trp Asn Glu Gly Tyr Ile Met Gly Phe Ile Ser Lys Glu Arg Glu 580 585 590 cgg gcc atc cta agc aca aag ccc ccg ggc acc ttc cta ctg cgc ttc 2002 Arg Ala Ile Leu Ser Thr Lys Pro Pro Gly Thr Phe Leu Leu Arg Phe 595 600 605 610 agc gag agc agc aaa gaa gga ggg gtc act ttc act tgg gtg gaa aag 2050 Ser Glu Ser Ser Lys Glu Gly Gly Val Thr Phe Thr Trp Val Glu Lys 615 620 625 gac atc agt ggc aag acc cag atc cag tct gta gag cca tac acc aag 2098 Asp Ile Ser Gly Lys Thr Gln Ile Gln Ser Val Glu Pro Tyr Thr Lys 630 635 640 cag cag ctg aac aac atg tca ttt gct gaa atc atc atg ggc tat aag 2146 Gln Gln Leu Asn Asn Met Ser Phe Ala Glu Ile Ile Met Gly Tyr Lys 645 650 655 atc atg gat gcg acc aac atc ctg gtg tct cca ctt gtc tac ctc tac 2194 Ile Met Asp Ala Thr Asn Ile Leu Val Ser Pro Leu Val Tyr Leu Tyr 660 665 670 ccc gac att ccc aag gag gag gca ttt gga aag tac tgt agg ccc gag 2242 Pro Asp Ile Pro Lys Glu Glu Ala Phe Gly Lys Tyr Cys Arg Pro Glu 675 680 685 690 agc cag gag cac ccc gaa gcc gac cca ggt agt gct gcc ccg tac ctg 2290 Ser Gln Glu His Pro Glu Ala Asp Pro Gly Ser Ala Ala Pro Tyr Leu 695 700 705 aag acc aag ttc atc tgt gtg aca cca ttc att gat gca gtt tgg aaa 2338 Lys Thr Lys Phe Ile Cys Val Thr Pro Phe Ile Asp Ala Val Trp Lys 710 715 720 taa cggtgaaggt gctgagccct cagcaggagg gcagtttgag tcgctcacgt 2391 * ttgacatgga tctgacctcg gagtgtgcta cctcccccat gtgaggagct gaaaccagaa 2451 gctgcagaga cgtgacttga gacacctgcc ccgtgctcca cccctaagca gccgaacccc 2511 atatcgtctg aaactcctaa ctttgtggtt ccagattttt ttttttaatt tcctacttct 2571 gctatctttg ggcaatctgg gcacttttta aaagagagaa atgagtgagt gtgggtgata 2631 aactgttatg taaagaggag agcacctctg agtctgggga tggggctgag agcagaaggg 2691 aggcaaaggg gaacacctcc tgtcctgccc gcctgccctc ctttttcagc agctcggggg 2751 ttggttgtta gacaagtgcc tcctggtgcc catggctacc tgttgcccca ctctgtgagc 2811 tgatacccca ttctgggaac tcctggctct gcactttcaa ccttgctaat atccacatag 2871 aagctaggac taagcccagg aggttcctct ttaaattaaa aaaaaaaaaa aaa 2924 <210> 383 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 383 tggtattgct gcaggtcgtt 20 <210> 384 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 384 cggcaggtca atggtattgc 20 <210> 385 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 385 ggacatcggc aggtcaatgg 20 <210> 386 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 386 ttgtacctca gcgcggacgc 20 <210> 387 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 387 aaaagtgccc agattgccc 19 <210> 388 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 388 aaaagtgccc agattgcc 18 <210> 389 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 389 aaagtgccca gattgcc 17 <210> 390 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 390 gctgcaggtc gttggtgtca 20 <210> 391 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 391 ttctacctcg cgcgatttac 20 <210> 392 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 392 gtacagttat gcgcggtaga 20 <210> 393 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 393 ttagaatacg tcgcgttatg 20 <210> 394 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 394 cgttattaac ctccgttgaa 20 <210> 395 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 395 ctgctagcct ctggatttga 20 <210> 396 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 396 ctcttactgt gctgtggaca 20 <210> 397 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 397 gaggcccgcc caaca 15 <210> 398 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 398 ttctgctaat gacgttatcc agtttt 26 <210> 399 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Probe <400> 399 ctgcctagat cggc 14 <210> 400 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 400 attcttggga ttgttggtct t 21 <210> 401 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 401 ctccagcatc tgctgcttct t 21 <210> 402 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 402 tttgatcgag gttagccgtg 20 <210> 403 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 1-19 <223> bases at these positions are RNA <400> 403 cgagaggcgg acgggaccgt t 21 <210> 404 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 3, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 21 <223> bases at these positions are RNA <400> 404 ttgctctccg cctgccctgg c 21 <210> 405 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 405 cgagaggcgg acgggaccg 19 <210> 406 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 1, 2, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 17, 18, 19 <223> bases at these positions are RNA <400> 406 gctctccgcc tgccctggc 19

Claims (51)

  1. 인간 STAT3을 코드화하는 핵산 분자에 특이적으로 하이브리드형성되는 올리고뉴클레오티드와 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에서 인간 STAT3 발현을 억제하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 세포가 간 또는 폐로부터 유래되는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 세포가 형질전환된 간 세포인 방법.
  4. 인간 STAT3을 코드화하는 핵산 분자를 표적으로 하기 위해 설계된 siRNA와 폐 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 인간 STAT3 발현의 억제 방법.
  5. 인간 STAT3을 코드화하는 핵산 분자를 표적으로 하기 위해 설계된 올리고뉴클레오티드와 폐 암종 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 폐 암종 세포에서 세포고사의 유도 방법.
  6. 서열번호 99를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 동물을 접촉시키는 것을 포함하는, 동물에서 T-세포 림프종 종양 성장의 억제 방법.
  7. 서열번호 99를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 동물을 접촉시키는 것을 포함하는, 동물에서 다발성 골수종 종양 성장의 억제 방법.
  8. 서열번호 115를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 동물을 접촉시키는 것을 포함하는, 동물에서 다발성 골수종 종양 성장의 억제 방법.
  9. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 서열번호 342의 적어도 8개 뉴클레오염기 부분을 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 서열번호 342로 구성된 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 세포가 전립선으로부터 유래되는 것인 방법.
  12. 인간 STAT3을 코드화하는 핵산 분자를 표적으로 하기 위해 설계된 올리고뉴클레오티드와 전립선 암 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 전립선 암 세포에서 세포고사의 유도 방법.
  13. 13 내지 40개 뉴클레오염기 길이의 안티센스 화합물을 상기 세포 또는 조직과 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 안티센스 화합물이 서열번호 342의 적어도 8개 뉴클레오염기 부분을 포함하고, 상기 안티센스 화합물이 인간 STAT3을 코드화하는 핵산 분자(서열번호 1)에 100％ 상보적인 것인, 세포 또는 조직에서 인간 STAT3의 발현을 억제하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 안티센스 화합물이 15 내지 30개 뉴클레오염기 길이를 포함하는 것인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 안티센스 화합물이 안티센스 올리고뉴클레오티드인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 적어도 하나의 변형 뉴크레오티드간 결합을 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 변형 뉴크레오티드간 결합이 포스포로티오에이트 결합인 방법.
  18. 제15항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 적어도 하나의 변형 당 잔기를 포함하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 변형 당 잔기가 2'-O-(2-메톡시에틸) 잔기인 방법.
  20. 제15항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 적어도 하나의 변형 뉴클레오염기를 포함하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 변형 뉴클레오염기가 5-메틸 시토신인 방법.
  22. 제15항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 키메라 올리고뉴클레오티드인 방법.
  23. 제13항에 있어서, 상기 화합물이 서열번호 342를 포함하는 것인 방법.
  24. 제13항에 있어서, 상기 화합물이 서열번호 342로 구성된 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 화합물이 데옥시뉴클레오티드를 포함하는 첫번째 영역 및 상기 첫번째 영역에 인접하고 적어도 하나의 2'-O-(2-메톡시에틸)뉴클레오티드를 포함하는 두번째 및 세번째 영역을 가진 키메라 올리고뉴클레오티드인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 첫번째 영역이 10개의 데옥시뉴클레오티드 길이이고, 상기 두번째 및 세번째 영역이 각각 5개 뉴클레오티드 길이인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 각각의 뉴클레오시드간 결합이 포스포로티오에이트인 방 법.
  28. 제27항에 있어서, 각각의 시토신이 5-메틸 시토신인 방법.
  29. 13 내지 40개 뉴클레오염기 길이인 안티센스 화합물과 세포를 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 안티센스 화합물이 서열번호 342의 적어도 8개 뉴클레오염기 부분을 포함하고, 상기 안티센스 화합물이 인간 STAT3을 코드화하는 핵산 분자(서열번호 1)에 100％ 상보적인 것인, 암 세포에서 STAT3의 발현을 억제하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 암 세포가 다발성 골수종 세포인 방법.
  31. 13 내지 40개 뉴클레오염기 길이인 안티센스 화합물과 세포를 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 안티센스 화합물이 서열번호 342의 적어도 8개 뉴클레오염기 부분을 포함하고, 상기 안티센스 화합물이 인간 STAT3을 코드화하는 핵산 분자(서열번호 1)에 100％ 상보적인 것인, 암 세포에서 세포고사를 유도하는 방법.
  32. 13 내지 40개 뉴클레오염기 길이인 안티센스 화합물을 동물에 투여하는 것을 포함하고, 상기 안티센스 화합물이 서열번호 342의 적어도 8개 뉴클레오염기 부분을 포함하고, 상기 안티센스 화합물이 인간 STAT3을 코드화하는 핵산 분자(서열번호 1)에 100％ 상보적인 것인, 동물에서 다발성 골수종 종양 성장을 억제하는 방 법.
  33. 13 내지 40개 뉴클레오염기 길이를 갖고 서열번호 342의 적어도 8개 뉴클레오염기 부분을 포함하고, 인간 STAT3을 코드화하는 핵산 분자(서열번호 1)에 100％ 상보성이고, 인간 STAT3의 발현을 억제하는 것인 안티센스 화합물.
  34. 제33항에 있어서, 15 내지 30개 뉴클레오염기 길이를 포함하는 안티센스 화합물.
  35. 제33항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드인 안티센스 화합물.
  36. 제35항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 적어도 1개의 변형 뉴클레오시드간 결합을 포함하는 것인 안티센스 화합물.
  37. 제36항에 있어서, 변형된 뉴클레오시드간 결합이 포스포로티오에이트 결합인 안티센스 화합물.
  38. 제35항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 적어도 하나의 변형 당 잔기를 포함하는 것인 안티센스 화합물.
  39. 제38항에 있어서, 변형 당 잔기가 2'-O-(2-메톡시에틸) 잔기인 안티센스 화합물.
  40. 제35항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 적어도 하나의 변형 뉴클레오염기를 포함하는 것인 안티센스 화합물.
  41. 제40항에 있어서, 변형 뉴클레오염기가 5-메틸 시토신인 안티센스 화합물.
  42. 제35항에 있어서, 키메라 올리고뉴클레오티드인 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  43. 제33항의 안티센스 화합물 및 제약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 제약학적 조성물.
  44. 제43항에 있어서, 콜로이드성 분산 시스템을 더욱 포함하는 제약학적 조성물.
  45. 제43항에 있어서, 안티센스 화합물이 안티센스 올리고뉴클레오티드인 제약학적 조성물.
  46. 제33항에 있어서, 상기 화합물이 서열번호 342를 포함하는 것인 안티센스 화합물.
  47. 서열번호 342로 구성된 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  48. 제47항에 있어서, 데옥시뉴클레오티드를 포함하는 첫번째 영역 및 상기 첫번째 영역에 인접하고 적어도 하나의 2'-O-(2-메톡시에틸)뉴클레오티드를 포함하는 두번째 및 세번째 영역을 가진 키메라 올리고뉴클레오티드인 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  49. 제48항에 있어서, 상기 첫번째 영역이 10개의 데옥시뉴클레오티드 길이이고, 상기 두번째 및 세번째 영역이 각각 5개 뉴클레오티드 길이인 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  50. 제49항에 있어서, 각각의 뉴클레오시드간 결합이 포스포로티오에이트인 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  51. 제51항에 있어서, 각각의 시토신이 5-메틸 시토신인 안티센스 올리고뉴클레오티드.
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