CN102250953A

CN102250953A - 人STAT3基因SiRNA慢病毒载体及其构建方法

Info

Publication number: CN102250953A
Application number: CN 201110202506
Authority: CN
Inventors: 马玲娣; 文世宏; 倪诚; 夏蕾; 蒋丽佳
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-07-19
Filing date: 2011-07-19
Publication date: 2011-11-23

Abstract

本发明涉及一种人STAT3基因SiRNA慢病毒载体，包括：一段核苷酸序列和慢病毒载体pLenti6.3/V5-DEST，该核苷酸序列含有针对人STAT3基因mRNA序列的干扰靶序列SiRNA，该人STAT3基因mRNA序列的Gene bank登录号为NM_139276；该干扰靶序列SiRNA选自：SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4。该慢病毒载体在靶细胞内时表达人STAT3基因siRNA分子的正义链与反义链，使人STAT3mRNA发生特异性降解，导致其表达沉默，提供一种体内敲除STAT3基因表达的有效方式，为治疗肿瘤开辟了新的途径。

Description

人STAT3基因SiRNA慢病毒载体及其构建方法

技术领域

本发明涉及人信号转导与转录激活因子(Signal Transducton andActivators of Transcription STATs)家族成员，更具体的说，本发明涉及人STAT3基因SiRNA慢病毒载体的构建方法。

背景技术

信号转导和转录活化因子STATs家族是一种存在于细胞胞浆并在激活后能够转入细胞核内与DNA结合的蛋白家族，具有信号转导和转录调控的双重功能。已发现的STATs家族成员有STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6七种，分别由不同的基因编码，广泛参与细胞生长、增殖、分化和凋亡等多种生理功能的调控，并与炎症、肿瘤和免疫反应关系密切。

在这些STATs蛋白当中，STAT3与肿瘤的关系最为密切，相当多的证据表明STAT3在细胞恶变的过程中起关键性作用。正常情况下，STAT3的激活对细胞的增殖和分化起着重要的调控作用，但STAT3的异常活化常伴随有细胞的生长失调/增殖失控。在多种人类恶性肿瘤，如白血病、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、结肠癌、甲状腺癌中都发现有STAT3的持续性过度激活。研究证明，STAT3是细胞内EGFR、IL6/JAK、Src等多个致癌性酪氨酸激酶信号传导通路汇聚中枢，STAT3过度激活可诱导上述与细胞增殖、分化及凋亡密切相关的基因的异常高表达，通过多种途径促进细胞的恶性增殖和转化、抑制细胞凋亡，表现出致癌作用。目前，许多STAT3下游的靶基因已经确定，包括编码抗凋亡蛋白的Bcl-xl、Mcl-1和Bcl-2基因，细胞增殖相关蛋白编码基因Cyclin D1和Myc，以及促血管发生因子VEGF等，此外，活化的STAT3还可启动cdc2、cyclinB1、mras和e2f-1等靶基因的异常表达，这些效应蛋白一方面通过促进细胞周期进展、抑制细胞的分化；另一方面通过抑制细胞凋亡，延长细胞生存周期，促使细胞恶性转化。现在倾向于认为STAT3是一个癌基因。

由于肿瘤发生是一个多阶段过程，STAT3基因的组成性激活不会单独导致细胞恶变，STAT3持续性激活所发生的细胞变性也不是细胞的终末表型，使用STAT3蛋白的抑制剂或者反义寡聚核苷酸抑制STAT3活性或表达后，可以逆转细胞的恶性型，达到抗肿瘤的效应。为治疗肿瘤开辟新的途径。以STAT3为作用靶点，旨在抑制STAT3活性的抗肿瘤治疗研究目前已取得初步成果。

RNA干扰(RNA interference SiRNA)是由双链RNA介导，在mRNA转录后水平沉默特定基因表达的基因阻断技术，具有四大明显优势：高特异性、高抑制率、放大效应和可遗传性。SiRNA抑制基因表达的效率极高，甚至可以完全阻断基因表达，达到体内基因敲除的目的。目前已成为研究基因功能、细胞内信号传导通路的不可缺少的工具及进行基因治疗的新策略。

慢病毒(Lentivirus，LV)是逆转录病毒的一种，具有逆转录病毒的基本结构和特征，作为外源基因的载体，已广泛用于体外细胞的转染和基因治疗研究。作为SiRNA载体应用，可以高效感染细胞进行体内基因沉默的研究，避免质粒的低效率转染所带来的种种不便，且转染效果更加稳定。慢病毒载体构建的shRNA表达载体，一方面可以代替瞬时表达载体使用，另一方面，可用于感染其他载体难以转染的细胞，如原代细胞、悬浮细胞等，并可整合到宿主细胞基因组长时间稳定表达，产生稳定的基因沉默效应，在基因治疗中具有良好的应用前景。

发明内容

STAT3与肿瘤的关系最为密切，相当多的证据表明STAT3在细胞恶变的过程中起关键性作用。本发明的目的是利用RNA干扰技术和慢病毒载体技术，构建人STAT3基因的SiRNA慢病毒载体，提供一种人STAT3基因SiRNA慢病毒载体及其构建方法，从而提供一种在体内敲除STAT3基因表达的有效方式，为治疗肿瘤开辟了新的途径。

本发明涉及一种人STAT3基因SiRNA慢病毒载体，该载体包括：一段核苷酸序列和慢病毒载体pLenti6.3/V5-DEST，所述核苷酸序列含有针对人STAT3基因mRNA序列的干扰靶序列SiRNA，所述人STAT3基因mRNA序列的Gene bank登录号为NM_139276；所述干扰靶序列SiRNA选自：

SEQ ID NO：1：5’-GGCGTCCAGTTCACTACTAAA-3’，或

SEQ ID NO：2：5’AGGAGGCATTCGGAAAGTATT-3’，或

SEQ ID NO：3：5’TCTACAGTGACAGCTTCCCAA-3’，或

SEQ ID NO：4：5’CGGCAACAGATTGCCTGCATT-3’。

本发明涉及的人STAT3基因SiRNA慢病毒载体，所述人STAT3基因SiRNA慢病毒载体包括含有所述干扰靶序列SiRNA的寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列选自：

SEQ ID NO：6：

5’-CCTGTTTAGTAGTGATGGACGCCGTCAGTCAGTGGCCAAAACGGCG TCCAGTTCACTACTAAAC-3’，或

SEQ ID NO：8：

5’-CCTGAATACTTTCCGTGCCTCCTGTCAGTCAGTGGCCAAAACAGGAG GCATTCGGAAAGTATTC-3’，或

SEQ ID NO：10：

5’-CCTGTTGGGAAGCTGACTGTAGAGTCAGTCAGTGGCCAAAACTCTA CAGTGACAGCTTCCCAAC-3’，或

SEQ ID NO：12：

5’-CCTGAATGCAGGCAATGTTGCCGGTCAGTCAGTGGCCAAAACCGGC AACAGATTGCCTGCATTC-3’。

本发明还涉及一种人STAT3基因SiRNA慢病毒载体的构建方法，包括：

步骤1：针对选自人STAT3基因mRNA序列的干扰靶序列SiRNA，所述人STAT3基因mRNA序列的Gene bank登录号为NM_139276，设计并合成含有干扰靶序列SiRNA的双链寡核苷酸序列，所述双链寡核苷酸序列选自：

1#：

SEQ ID NO：5：

5’-TGCTGTTTAGTAGTGAACTGGACGCCGTTTTGGCCACTGACTGACGGCGTCCATCACTACTAAA-3’

SEQ ID NO：6：

2#：

SEQ ID NO：7：

5’-TGCTGAATACTTTCCGAATGCCTCCTGTTTTGGCCACTGACTGACAGGAGGCACGGAAAGTATT-3’

SEQ ID NO：8：

3#：

SEQ ID NO：9：

5’-TGCTGTTGGGAAGCTGTCACTGTAGAGTTTTGGCCACTGACTGACTCTACAGTCAGCTTCCCAA-3’

SEQ ID NO：10：

4#：

SEQ ID NO：11：

5’-TGCTGAATGCAGGCAATCTGTTGCCGGTTTTGGCCACTGACTGACCGGCAACATTGCCTGCATT-3’

SEQ ID NO：12：

5’-CCTGAATGCAGGCAATGTTGCCGGTCAGTCAGTGGCCAAAACCGGC AACAGATTGCCTGCATTC-3’

其中，所述干扰靶序列SiRNA分别对应于：

SEQ ID NO：1：5’-GGCGTCCAGTTCACTACTAAA-3’，

SEQ ID NO：2：5’-AGGAGGCATTCGGAAAGTATT-3’，

SEQ ID NO：3：5’-TCTACAGTGACAGCTTCCCAA-3’，

SEQ ID NO：4：5’-CGGCAACAGATTGCCTGCATT-3’；

步骤2：将步骤1中设计并合成的所述双链寡核苷酸序列退火后形成含有干扰靶序列SiRNA的双链DNA，将所述含有干扰靶序列SiRNA的双链DNA插入到表达载体pcDNA^TM6.2-GW/EmGFPmiR中，转化感受态大肠杆菌DH5α后，测序，构建得到STAT3 SiRNA干扰载体；

步骤3：将所述STAT3 SiRNA干扰载体亚克隆至pDONR221载体中，再与慢病毒表达载体pLenti6.3/V5-DEST进行重组，构建得到人STAT3基因SiRNA慢病毒载体pLenti6.3/V5-DEST/STAT3SiRNA；

步骤4：将所述慢病毒载体pLenti6.3/V5-DEST/STAT3SiRNA转化感受态大肠杆菌DH5α后，筛选阳性克隆进行测序鉴定，鉴定正确的克隆即为成功构建的人STAT3基因SiRNA慢病毒载体。

本发明涉及的人STAT3基因SiRNA慢病毒载体的构建方法，进一步包括采用不对人类任何基因产生干扰的SiRNA双链作为阴性对照重复上述步骤1-2，所述阴性对照SiRNA双链和所选中的STAT3siRNA序列有相同的核苷酸组成，但没有明显的同源性，和细胞中其他基因也没有同源性。

本发明涉及的人STAT3基因SiRNA慢病毒载体的构建方法，所述阴性对照的双链寡核苷酸序列为：

NC：

SEQ ID NO：13：

5’-TGCTGAAATGTACTGCGCGTGGAGACGTTTTGGCCACTGACTGACGTCTCCACGCAGTACATTT-3’

SEQ ID NO：14：

5’-CCTGAAATGTACTGCGTGGAGACGTCAGTCAGTGGCCAAAACGTCTCCACGCGCAGTACATTTC-3’。

本发明涉及的人STAT3基因SiRNA慢病毒载体的构建方法，步骤2进一步包括对所述STAT3SiRNA干扰载体进行干扰效果测定，筛选出干扰效率最高的干扰载体，用于步骤3。

本发明涉及的人STAT3基因SiRNA慢病毒载体的构建方法，所述STAT3SiRNA干扰载体的所述干扰效果测定包括实时定量Q-PCR技术与免疫印记法技术。

本发明涉及的人STAT3基因SiRNA慢病毒载体的构建方法，步骤4进一步包括以所述成功构建的人STAT3基因SiRNA慢病毒载体与其相应慢病毒包装系统载体一起感染293T细胞48小时后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，浓缩后进行慢病毒滴度测定。

为了构建本发明的人STAT3基因SiRNA慢病毒载体，可以按照本领域技术人员熟知的DNA操作技术(例如参见Sambrook et.al.，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour，1989)进行基因的分离、核苷酸片断的切割与连接、克隆和表达载体的构建及扩增、核苷酸序列的分析与鉴定、细胞的转化和扩大培养等操作。首先是针对目的基因SiRNA靶点序列，利用公共网站设计并合成4对含目的基因SiRNA序列的双链寡核苷酸(DNAoligo)，4对寡核苷酸退火形成双链后，分别插入到SiRNA的表达载体pcDNA^TM6.2-GW/EmGFPmiR中，构建4个STAT3SiRNA干扰载体，转化感受态细胞DH5α，筛选阳性克隆并经测序鉴定序列正确后，转染目的细胞，分别采用实时定量Q-PCR技术和Western-blot方法检测目的基因mRNA及蛋白的表达情况，判断STAT3SiRNA干扰载体对目的基因的抑制情况。再利用Invitrogen的

技术，经过两步重组进一步构建STAT3SiRNA的慢病毒表达载体。具体步骤是先将上述阶段筛选出的干扰效率最高的干扰载体亚克隆至pDONR221载体(美国Invitrogen公司)中，再与慢病毒表达载体pLenti6.3/V5-DEST(美国Invitrogen公司)进行重组，构建得到重组慢病毒载体pLenti6.3/V5-DEST/STAT3SiRNA，上述重组慢病毒载体转化感受态大肠杆菌DH5α后，筛选阳性克隆进行测序鉴定，鉴定正确的克隆即为成功构建的STAT3基因SiRNA慢病毒载体。以该重组慢病毒载体与其相应包装系统载体一起感染293T细胞48小时后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，浓缩后进行慢病毒滴度测定。

本发明选择的慢病毒表达载体系统，可用于在细胞内直接包装成为慢病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，尤其适用于难转染细胞，如血液系统细胞的感染，也可用于制备多种稳定沉默特定基因的细胞株筛选。此外，所使用的慢病毒包装载体去除了慢病毒的关键蛋白，所包装出的病毒颗粒自身活性丢失，病毒感染细胞后整合到细胞基因组中并不会产生具有自身包装能力的活性病毒，对人体的安全性较高，也适用于RNAi干扰的体内实验研究。

本发明是基于已知的人STAT3基因RNA干扰有效靶点序列的基础上，设计合成4对针对STAT3基因的SiRNA寡核苷酸序列，使用特定载体和方法成功构建了表达人STAT3基因SiRNA慢病毒载体，经PCR和基因测序证实，本发明所构建的人STAT3基因shRNA慢病毒载体序列正确。进一步在靶细胞中进行基因敲减实验证明，本发明所构建的STAT3SiRNA慢病毒对目的基因的表达抑制率达70％以上，具有良好的基因敲减效率。因此，本发明提供了一种如上限定的人STAT3基因SiRNA慢病毒载体的构建方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的上述和其他特征，以下借助附图和实施例对本发明进行详细描述。本领域技术人员可以在不背离本发明的基本精神和原则的前提下，改变或改动本说明书中描述的某些技术内容或技术环节。但人们可以理解到，这些平行的改变或改动均将包括在本发明的待批权利要求范围之内。

图1是本发明的STAT3SiRNA干扰载体阳性重组克隆的测序鉴定图；

其中，A-D分别为1至4号含目的基因干扰靶序列阳性重组干扰载体的测序结果。

图2是本发明的STAT3SiRNA干扰效果的Western-blot检测；

其中，STAT3为目的基因STAT3的蛋白表达，GAPDH为内参管家基因GAPDH蛋白的表达；1-4分别为1-4号干扰质粒转染后细胞内STAT3蛋白表达情况；NC为阴性对照质粒；CON为无质粒转染细胞。

图3是本发明的STAT3SiRNA慢病毒载体的测序鉴定结果。

具体实施方式

实施例1STAT3SiRNA干扰载体构建与鉴定

根据STAT3mRNA全长序列(使用的人STAT3基因mRNA序列Genebank登录号为NM_139276)，利用SiRNA在线设计软件B LOCK-iT^TM RNAiDesigner(https://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/rnaiExpress.jsp)分别设计4对含STAT3基因SiRNA序列的双链寡核苷酸序列(寡核苷酸序列见表1)，采用不对人类任何基因产生干扰的SiRNA双链作为阴性对照(PSC-NC)，合成4对STAT3SiRNA寡核苷酸序列(由美国Invitrogen公司合成)。

表1含STAT3基因SiRNA序列的双链寡核苷酸

注：划线部分为碱基互补区域(从5’→3’)，粗体部分为STAT3 SiRNA干扰靶序列，方框部分为限制性内切酶位点。

将4对寡核苷酸退火后形成双链，分别插入到SiRNA表达载体pcDNA^TM6.2-GW/EmGFPmiR(美国Invitrogen公司)中，构建含STAT3SiRNA序列的干扰载体，并转化感受态细胞DH5α。退火和连接的具体方法如下：

I寡核苷酸退火：

先将4对合成的寡核苷酸用双蒸水(ddH₂O)分别溶解成100μM，互补单链各取5μL后两两混合，加入退火缓冲液(oligo annealing buffer)2μL，以ddH₂O补足，配为总反应体积20μL。将4对寡核苷酸的反应混合物95℃加热5min，然后放置室温自然冷却20min，形成双链寡核苷酸。

II载体连接：

将退火后的双链寡核苷酸稀释成10nM浓度，按下表2配制反应体系，室温下连接反应30min。

表2连接pcDNA^TM6.2-GW/EmGFP载体体系

每个转化平板挑取转化后3个阳性克隆进行测序，验证重组克隆中插入片段序列是否与设计的寡核苷酸序列一致。结果如图1所示，4个重组载体中所插入的目的片段序列与所设计的寡核苷酸序列完全一致，证实STAT3SiRNA干扰载体pcDNA^TM6.2-GW/EmGFPmiR/STAT3SiRNA构建成功。

实施例2STAT3SiRNA干扰效果检测

感染前一天，将生长状态良好的293T细胞按每孔5×10⁵个细胞接种于六孔板中进行感染，具体方法如下：用无血清培养基洗细胞一次后加入1.5mL细胞培养基；分别用250uL培养基稀释4ug干扰质粒及阴性对照质粒，轻轻混匀；将10uL Lipofectamine 2000试剂以250uL细胞培养基稀释后，轻轻混匀，室温孵育5min；混合已稀释质粒和Lipofectamine 2000稀释液，室温放置20min；慢慢加入到各细胞孔中，轻轻混匀；放置在37℃，5％的CO₂的培养箱中培养4-6h后，换不含抗生素的完全培养液继续培养过夜。感染后48h收集细胞，按Trizol操作说明提取细胞总RNA，实时定量Q-PCR方法检测目的基因mRNA表达情况。STAT3基因的Q-PCR检测引物为：

SEQ ID NO：15：5′-TGCGGAGAAGCATCGTGAGT-3′，

SEQ ID NO：16：5′-CCTCCAATGCAGGCAATCTGT-3′(由美国Invitrogen公司合成)。

反应条件：95℃预变性2min，进入循环；95℃变性10S，60℃退火20S，72℃延伸30S，共进行40个循环；最后72℃延伸10min。

ΔΔct计算方法及结果分析：

ΔΔct＝(待测样品目的基因的Ct均值-待测样本管家基因的Ct均值)-(对照样品目的基因的Ct均值-对照样本管家基因的Ct均值)

基因的表达量F＝2^-ΔΔct，目的基因的沉默效率为1-2^-ΔΔct

结果如表3所示，转染STAT3SiRNA干扰质粒后，目的基因STAT3的表达量显著抑制，其中2号干扰质粒的干扰效率最高，为88％，用于构建STAT3SiRNA慢病毒载体。

表3STAT3SiRNA干扰效果的Q-PCR检测

实施例3 STAT3SiRNA Western-blot检测

病毒感染方法同前。Western-blot检测具体步骤如下：

1)冷PBS洗去细胞碎片，将细胞放于冰上；

2)加入适量预冷的含蛋白酶抑制剂(PI)1×Lysis Buffer；

3)冰上裂解细胞10-15min。将样品转移入Ep管中；

4)超声破碎仪破碎细胞(200W共4次，每次5S，间隔2S)；

5)4℃，12000g，离心15min；

6)取上清，测定样品总蛋白浓度后，将其调整为2μg/μL的蛋白终浓度；

7)取适量样品进行SDS-PAGE电泳，控制上样量中总蛋白含量在20-60μg之间，加入相应上样缓冲液，振荡器混匀后，100℃煮5-10min。本实验中使用上样量为30μg/lane；

8)SDS-PAGE电泳：采用Bio-Rad垂直电泳装置进行总蛋白分离，所采用的分离胶浓度为10％；

9)电转移：电泳结束后，使用Bio-Rad的半干转移电泳装置，按仪器常规操作说明进行4℃，400mA恒流条件下电转移120min，将蛋白样品转移到PVDF膜上；

10)封闭：使用TBST(TBS+0.05％Tween20)加5％脱脂牛奶配制成封闭液。室温封闭PVDF膜1h或4℃过夜；

11)一抗孵育：用含5％脱脂牛奶的TBST分别稀释目的蛋白STAT3或者内参Actin的一抗(美国Cell signling公司产品)。室温下与封闭好的PVDF膜孵育2h或4℃过夜；

12)洗膜：TBST洗膜3次，每次10min；

13)二抗孵育：用含5％脱脂牛奶的TBST稀释与一抗相应的辣根过氧化物酶驴抗兔/小鼠二抗(美国Santa-Cruz公司产品)，室温下孵育2h；

14)洗膜：TBST洗膜3次，每次10min。TBS洗膜一次，10min。

15)ECL：按照Amersham公司ECL+plusTM Western blotting system试剂盒操作说明进行显色反应，

16)X光片在暗房中曝光、显影、过水、定影后晾干待分析。

如图2所示，转染STAT3SiRNA干扰质粒后，STAT3蛋白的表达被显著抑制，其中2号干扰质粒的干扰效率最高，与Q-PCR检测结果相吻合，筛选用作慢病毒干扰载体构建。

实施例4 STAT3SiRNA慢病毒载体构建与鉴定

将上述阶段筛选出的干扰效率最高的2号干扰载体亚克隆至pDONR221载体中，具体反应步骤如下：

1)按下表4配制反应体系：

表4亚克隆至pDONR221载体反应体系

2)25℃反应1小时。

3)加入1uL的蛋白酶K，37℃反应10min。

4)取5uL重组反应液转化100uL DH5α感受态细胞。

5)筛选阳性克隆并测序验证，保留测序正确的pDONR221/STAT3SiRNA质粒。

上述验证正确的pDONR221/STAT3 SiRNA重组质粒再与慢病毒表达载体plenti6.3/V5-DEST进行重组，具体反应如下：

1)按下表5配制反应体系：

表5与慢病毒表达载体plenti6.3/V5-DEST重组体系

2)25℃反应1h。

3)加入1uL的蛋白酶K，37℃反应10min。

4)取5uL重组反应液转化100uL Stbl3感受态细胞。

5)筛选阳性克隆并测序验证，保留测序验证正确的plenti6.3/V5-DEST/STAT3SiRNA质粒。

经过上述两步质粒重组，构建得到STAT3SiRNA的重组慢病毒载体pLenti6.3/V5-DEST/STAT3SiRNA。

本发明中将所获得的STAT3基因SiRNA慢病毒载体定名为LV-RiSTAT3，同时构建的非特异性对照(普适性阴性对照)质粒定名为LV-RiNS。上述重组慢病毒载体转化感受态细胞后，挑取转化的阳性克隆进行测序，验证重组克隆中插入片段序列是否与设计的oligo序列一致。如图3所示，插入的目标靶序列完全正确，STAT3SiRNA慢病毒载体构建成功。

实施例5慢病毒包装和滴度测定

处于对数生长期的293T细胞，细胞消化计数后，每个10cm的细胞培养皿接种3×10⁶个细胞，37℃，5％的CO₂培养箱中培养过夜。将9ug PackagingMix(慢病毒包装混合液)和3ug重组慢病毒质粒加入至1.5ml Opti-MEM中，36ul Lipofectamine2000加入至1.5mL Opti-MEM中，室温放置5min；混合质粒和Lipofectamine 2000稀释液，室温孵育20min；以Opti-MEM小心的洗两遍细胞培养皿中细胞，加入5ML Opti-MEM；再将3ml质粒-脂质体复合物小心加入细胞培养皿中，轻轻混匀，37℃，5％CO₂孵育4-6h，更换完全培养基。感染48h后，收集富含慢病毒的细胞上清液，3000rpm离心15min后，以0.45μm滤器过滤后分装于小管中，每管1.0mL。

使用逐孔稀释滴度测定法进行慢病毒滴度测定。根据病毒预期滴度，准备7-10个无菌Ep管，每管加入90μL无血清培养基。取待测病毒原液10μl加入第一管中，混匀，再从中取出10μL加入第二管中，依次进行梯度稀释，直至最后一管。取上述系列稀释后的慢病毒溶液感染细胞。转染后4天，观察不同浓度感染孔中细胞表达GFP荧光情况，数出荧光细胞比例在10％左右的孔中的荧光细胞个数，将所得数值除以相应稀释倍数即得到病毒滴度值。

本发明得到的慢病毒滴度测定结果为3.0×10⁶TU/ml。

Claims

1.一种人STAT3基因SiRNA慢病毒载体，包括：一段核苷酸序列和慢病毒载体pLenti6.3/V5-DEST，所述核苷酸序列含有针对人STAT3基因mRNA序列的干扰靶序列SiRNA，所述人STAT3基因mRNA序列的Genebank登录号为NM_139276；其特征在于，所述干扰靶序列SiRNA选自：SEQ ID NO：1，或SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3，或SEQ ID NO：4。

2.如权利要求1所述的人STAT3基因SiRNA慢病毒载体，其特征在于，所述人STAT3基因SiRNA慢病毒载体包括含有所述干扰靶序列SiRNA的寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列选自：

SEQ ID NO：6，或SEQ ID NO：8，或SEQ ID NO：10，或SEQ ID NO：12。

3.一种人STAT3基因SiRNA慢病毒载体的构建方法，其特征在于，包括：

步骤1：针对选自人STAT3基因mRNA序列的干扰靶序列SiRNA，所述人STAT3基因mRNA序列的Gene bank登录号为NM 139276，设计并合成含有干扰靶序列SiRNA的双链寡核苷酸序列，所述双链寡核苷酸序列选自：

1#：

SEQ ID NO：5与SEQ ID NO：6，或

2#：

SEQ ID NO：7与SEQ ID NO：8，或

3#：

SEQ ID NO：9与SEQ ID NO：10，或

4#：

SEQ ID NO：11与SEQ ID NO：12。

其中，所述干扰靶序列SiRNA分别对应于：

SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4；

步骤2：将步骤1中设计并合成的所述双链寡核苷酸序列退火后形成含有干扰靶序列SiRNA的双链DNA，将所述含有干扰靶序列SiRNA的双链DNA插入到表达载体pcDNA^TM6.2-GW/EmGFPmiR中，转化感受态大肠杆菌DH5α后，测序，构建得到STAT3SiRNA干扰载体；

4.根据权利要求3所述的人STAT3基因SiRNA慢病毒载体的构建方法，其特征在于，进一步包括采用不对人类任何基因产生干扰的SiRNA双链作为阴性对照重复上述步骤1-2，所述阴性对照SiRNA双链和所选中的STAT3siRNA序列有相同的核苷酸组成，但没有明显的同源性，和细胞中其他基因也没有同源性。

5.根据权利要求4所述的人STAT3基因SiRNA慢病毒载体的构建方法，其特征在于，所述阴性对照的双链寡核苷酸序列为：

NC：

SEQ ID NO：13与SEQ ID NO：14。

6.根据权利要求3所述的人STAT3基因SiRNA慢病毒载体的构建方法，其特征在于，步骤2进一步包括对所述STAT3SiRNA干扰载体进行干扰效果测定，筛选出干扰效率最高的干扰载体，用于步骤3。

7.根据权利要求6所述的人STAT3基因SiRNA慢病毒载体的构建方法，其特征在于，所述STAT3SiRNA干扰载体的所述干扰效果测定包括实时定量Q-PCR技术与免疫印记法技术。

8.根据权利要求3所述的人STAT3基因SiRNA慢病毒载体的构建方法，其特征在于，步骤4进一步包括以所述成功构建的人STAT3基因SiRNA慢病毒载体与其相应慢病毒包装系统载体一起感染293T细胞48小时后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，浓缩后进行慢病毒滴度测定。