JP5507617B2 - アンチセンスオリゴヌクレドチドによるstat3発現の調節 - Google Patents
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Description
更に本発明は、炎症性疾患、特に関節リウマチ、並びに乳腺、前立腺、頭部及び頸部並びに脳のものを含む癌、骨髄腫、黒色腫、白血病、及びリンパ腫の診断及び治療方法を含む。これらの方法は本発明のオリゴヌクレオチドを用いる。本発明のオリゴヌクレオチド及び方法は、治療的にも予防的にも有用であると思われる。更に本発明のオリゴヌクレオチド及び方法は、臨床研究及び診断のための手段として、また種々の細胞機能及び生理学的過程及び状態におけるSTAT3の役割を検出及び確認するための手段として、並びにSTAT3の発現と関連した状態の診断のための手段として有用であると思われる。
例示的な好ましい標的セグメントから選択された8個の連続的な核酸ストレッチを少なくとも一つ含む、8〜80個の核酸塩基の長さを有する標的セグメントは、ターゲティングに適していると考えられる。
式中、
である。
及び
式中、数学的演算子|は、「例えば」を示し、
数学的演算子 は「セットのメンバー」を示し(例、y zは、要素yが組合せzのメンバーであることを示す)、
xは変数を示し、
Nは、正の整数として定義される全自然数を示し、
そして、数学的演算子
は、「セットの和集合」を示す。
また、1−8、2−9、3−10、4−11、5−12、6−13、7−14、8−15、9−16、10−17、11−18、12−19、13−20、14−21、15−22、16−23、17−24、18−25、19−26、20−27、21−28、22−29、23−30、24−31、25−32、26−33、27−34、28−35、29−36、30−37、31−38、32−39、33−40、34−41、35−42、36−43、37−44、38−45、39−46、40−47、41−48、42−49、43−50、44−51、45−52、46−53、47−54、48−55、49−56、50−57、51−58、52−59、53−60、54−61、55−62、56−63、57−64、58−65、59−66、60−67、61−68、62−69、63−70、64−71、65−72、66−73、67−74、68−75、69−76、70−77、71−78、72−79、73−80、74−81、75−82、76−83、77−84、78−85、79−86、80−87、81−88、82−89、83−90、84−91、85−92、86−93、87−94、88−95、89−96、90−97、91−98、92−99、93−100の核酸塩基からなる領域の組合せを記述する。
また、1−20、2−21、3−22、4−23、5−24、6−25、7−26、8−27、9−28、10−29、11−30、12−31、13−32、14−33、15−34、16−35、17−36、18−37、19−38、20−39、21−40、22−41、23−42、24−43、25−44、26−45、27−46、28−47、29−48、30−49、31−50、32−51、33−52、34−53、35−54、36−55、37−56、38−57、39−58、40−59、41−60、42−61、43−62、44−63、45−64、46−65、47−66、48−67、49−68、50−69、51−70、52−71、53−72、54−73、55−74、56−75、57−76、58−77、59−78、60−79、61−80、62−81、63−82、64−83、65−84、66−85、67−86、68−87、69−88、70−89、71−90、72−91、73−92、74−93、75−94、76−95、77−96、78−97、79−98、80−99、81−100の核酸塩基からなる領域のセットを記述する。
また、1−80、2−81、3−82、4−83、5−84、6−85、7−86、8−87、9−88、10−89、11−90、12−91、13−92、14−93、15−94、16−95、17−96、18−97、19−98、20−99、21−100の核酸塩基からなる領域のセットを記述する。
従って、この例では、Aは1−8、2−9、3−10…93−100、1−20、2−21、3−22…81−100、1−80、2−81、3−82…21−100の領域を含む。
は全セットの全メンバーを組み合わせて得られるセットの和集合を表す。
本願明細書に記載する数式は、任意長Lを有する標的核酸塩基配列中の全ての可能な標的領域を定義する。ここで領域の長さはmであり、mは8個以上かつ80個以下の核酸塩基長を有し、またmはLより小さく、nはL−m+1より小さい。
本願明細書に使用されている用語「オリゴマー化合物」は、実質的に核酸ベースの単量体からなる高分子化合物として定義する。オリゴマー化合物には、オリゴヌクレオチド、及びその類似体、疑似体又は模倣体が含まれる。
公知のように、ヌクレオシドは塩基と糖との組合せである。ヌクレオシドの塩基部分は通常、複素環塩基である。この複素環塩基の最も普遍的なクラスはプリン及びピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基を更に含むヌクレオシドである。ペントフラノシルを含むヌクレオシドに関しては、リン酸基は糖の2’、3’又は5’のいずれかのヒドロキシル部分に結合し得る。オリゴヌクレオチドを形成する際、リン酸基は隣接するヌクレオシド同士を互いに共有結合して線状の高分子化合物を形成する。続いて、この線状高分子化合物の各末端は更に連結されて、環状化合物を形成し得るが、一般に線状化合物が好ましい。更に、線状化合物は内部の核酸塩基層相補正性を有する場合があり、従って完全に又は部分的に二本鎖の化合物を生成するように折り重なり得る。リン酸基は、通常、オリゴヌクレオチド内でヌクレオシド間結合を形成するか、又は糖と共にオリゴヌクレオチドのバックボーンを形成する。RNA及びDNAのバックボーンを形成する通常のヌクレオシド間結合は、3’−5’ホスホジエステル結合である。
本発明に有用な、好ましいアンチセンスオリゴマー化合物の特定の例としては、修飾された、例えば天然に存在しないヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドがある。本明細書に定義されるように、修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドは、リン原子を保持するヌクレオシド間結合と、リン原子を有さないヌクレオシド間結合とを含む。本明細書の、及び当該技術分野にて時折引用されるように、ヌクレオシドのバックボーン内にリン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチドも、オリゴヌクレオチドであると見なされ得る。
本発明の別の一化合物群は、オリゴヌクレオチド模倣体を含む。オリゴヌクレオチドに適用される用語「模倣体」は、フラノース環のみ、又はフラノース環及びヌクレオチド間結合の双方が、新規な基で代替されているオリゴマー化合物を含むことを意図し、フラノース環のみの代替は、当該技術分野にて糖代用物(sugar surrogate)とも称されている。複素環塩基部分又は修飾複素環塩基部分は、適当な標的核酸とのハイブリダイゼーションのために保持されている。このようなオリゴマー化合物の一つである、卓越したハイブリダイゼーション特性を有することが証明されているオリゴヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸(PNA)と称されている。PNAオリゴマー化合物にて、オリゴヌクレオチドの糖バックボーンは、アミド含有バックボーン、詳細にはアミノエチルグリシンのバックボーンで代替されている。核酸塩基は保持され、バックボーンのアミド部分のアザ窒素原子に対して直接的又は間接的に結合している。PNAオリゴマー化合物の調製を教授する代表的な米国特許は、米国特許第5、539、082号、米国特許第5、714、331号、及び米国特許第5、719、262号を含むが、これらに限定されるものではなく、またこれら各々は参照して本願明細書に組み入れられる。PNAオリゴマー化合物の更なる教授は、Nielsen等、Science、1991、254、1497−1500に見出すことができる。
式中、
Bxは、複素環塩基部分であり、
T4は水素、アミノ保護基、−C(O)R5、置換又は非置換C1−C10アルキル、置換又は非置換C2−C10アルケニル、置換又は非置換C2−C10アルキニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、化学官能基、レポーター基、共役基、α−カルボキシル基を介して結合したD若しくはLα−アミノ酸、又は任意にて、アミノ酸がアスパラギン酸若しくはグルタミン酸の場合にω−カルボキシル基を介して結合したD若しくはLα−アミノ酸、又はカルボキシル基を介して結合したD、L若しくはD及びLアミノ酸の混合物から誘導されたペプチドであり、ここで置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルから選択され、
Z1は、水素、C1−C6アルキル、又はアミノ保護基であり、
Z3は、水素、アミノ保護基、−C1−C6アルキル、−C(=O)−CH3、ベンジル、ベンゾイル、又は−(CH2)n−N(H)Z1であり、
各Jは、O、S又はNH−であり、
R5はカルボニル保護基であり、そして
nは、2〜約50である。
モルホリノ核酸は、モノマーサブユニットを結合する多様な異なる結合基(L2)を有するように調製されている。基本の式を以下に示す。
式中、
T1は、ヒドロキシル又は保護されたヒドロキシルであり、
T5は、水素又はリン酸若しくはリン酸誘導体であり、
L2は、結合基であり、そして
nは、2〜約50である。
を有すると思われる。
を有する二環及び三環ヌクレオシド類似体を含む、更なるオリゴヌクレオチド模倣体も調製されている(Steffens等、Helv.Chim.Acta、1997、80、2426−2439、Steffens等、J.Am.Chem.Soc.、1999、121、3249−3255、及びRenneberg等、J.Am.Chem.Soc.、2002、124、5993−6002参照)。これら修飾オリゴヌクレオシド類似体はホスホロアミデート手法を用いてオリゴマー化され、得られた三環ヌクレオシドを含むオリゴマー化合物は、DNA、RNA及びそれ自体とハイブリダイズされた場合、熱安定性(Tm)が向上することが示されている。二環ヌクレオシド類似体を含むオリゴマー化合物は、DNA二重鎖のそれにほぼ等しい熱安定性を示している。
以下に一般式(マーカッシュ変数の定義については、全容が参照して本願明細書に組み入れられる米国特許第5、874、553号及び米国特許第6、127、346号を参照)を示す。
本発明のオリゴマー化合物は、一つ又は二つ以上の置換された糖部分を含むこともできる。好ましいオリゴマー化合物は、OH、F、O−、S−、又はN−アルキル、O−、S−、又はN−アルケニル、O−、S−又はN−アルキニル、又はO−アルキル−O−アルキルから選択された糖置換基を含む。アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換又は非置換のC1〜C10アルキル又はC2〜C10アルケニル及びアルキニルであり得る。特にO[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、及びO(CH2)nON[(CH2)nCH3]2が好ましく、ここでn及びmは、1〜約10である。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、C1〜C10低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、O−アルカリル又はO−アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的性質を改善するための基、又はオリゴヌクレオチドの薬力学的性質を改善するための基、及び同様の性質を有する他の置換基から選択された糖置換基を含む。好ましい修飾には、2’−メトキシエトキシ(2’−O−(2−メトキシエトキシ)又は2’−MOEとしても知られる2’−O−CH2CH2OCH3、)(Martin等、Helv.Chim.Acta、1995、78、486−504)即ちアルコキシアルコキシ基がある。更なる好ましい修飾には、以下の実施例にて記述する2’−DMAOEとしても知られる2’−ジメチルアミノオキシエトキシ、即ちO(CH2)2ON(CH3)2基、及び2’−ジメチルアミノエトキシエトキシ(2’−O−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチル又は2’−DMAEOEとしても知られる)、即ち2’−O−CH2−O−CH2−N(CH3)2がある。
式中、
Rbは、O、S又はNHであり、
Rdは、単結合、O、S又はC(=O)であり、
Reは、C1−C10アルキル、N(Rk)(Rm)、N(Rk)(Rn)、N=C(Rp)(Rq)、N=C(Rp)(Rr)又は式IIIa
を有し、
Rp及びRqは、各々独立して、水素又はC1−C10アルキルであり、
Rrは、−Rx−Ryであり、
Rs、Rt、Ru及びRvの各々は、独立して、水素、C(O)Rw、置換又は非置換のC1−C10アルキル、置換又は非置換のC2−C10アルケニル、置換又は非置換のC2−C10アルキニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、化学官能基又は共役基であり、ここで置換基は水素、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルから選択されるか、
又は任意にて、Ru及びRvが一緒になって、それらが結合する窒素原子と共にフタルイミド部分を形成し、
各Rwは、独立して、置換又は非置換のC1−C10アルキル、トリフルオロメチル、シアノエチルオキシ、メトキシ、エトキシ、t−ブトキシ、アリルオキシ、9−フルオレニルメトキシ、2−(トリメチルシリル)−エトキシ、2、2、2−トリクロロエトキシ、ベンジルオキシ、ブチリル、イソ−ブチリル、フェニル又はアリール、
Rkは、水素、窒素保護基又は−Rx−Ryであり、
Rpは、水素、窒素保護基又は−Rx−Ryであり、
Rxは、結合又は結合部分であり、
Ryは、化学官能基、共役基又は固体支持媒体であり、
Rm及びRnの各々は、独立して、H、窒素保護基、置換又は非置換のC1−C10アルキル、置換又は非置換のC2−C10アルケニル、置換又は非置換のC2−C10アルキニルであり、ここで置換基はヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、NH3 +、N(Ru)(Rv)、グアニジノ及びアシルから選択され、ここでアシルは酸アミド又はエステルであるか、
又はRm及びRnが一緒になって、窒素保護基であり、連結してN及びOから選択される更なるへテロ原子を任意にて含む環構造を形成し、又は化学官能基であり、
Riは、ORz、SRz、又はN(Rz)2であり、
各Rzは、独立して、H、C1−C8アルキル、C1−C8ハロアルキル、C(=NH)N(H)Ru、C(=O)N(H)Ru又はOC(=O)N(H)Ruであり、
Rf、Rg及びRhは、約4〜約7個の炭素原子、又は約3〜約6個の炭素原子及び1又は2個のヘテロ原子を含む環系を構成し、ここでヘテロ原子は酸素、窒素及び硫黄から選択され、環系は脂肪族、不飽和脂肪族、芳香族、又は置換若しくは非置換の複素環であり、
Rjは、1〜約10個の炭素原子を有するアルキル又はハロアルキル、2〜約10個の炭素原子を有するアルケニル、2〜約10個の炭素原子を有するアルキニル、6〜約14個の炭素原子を有するアリール、N(Rk)(Rm)ORk、ハロ、SRk又はCNであり、
maは、1〜約10であり、
各mbは、独立して、0又は1であり、
mcは、0又は1〜10の整数であり、
mdは、1〜10の整数であり、
meは、0、1又は2であるが、
但しmcが0のとき、mdは1より大きい。
式IIの代表的な環式置換基は、「RNA Targeted 2’−Oligomeric compounds that are Conformationally Preorganized」と題された1998年7月27日出願の米国特許出願第09/123108号に開示されており、その全容は参照して本願明細書に組み入れられる。
式III及び式IVに示す代表的なグアニジノ置換基は、「Functionalized Oligomers」と題された1999年7月7日出願の共有の米国特許出願公開第09/349、040号に開示されており、その全容は参照して本願明細書に組み入れられる。
代表的なジメチルアミノエチルオキシエチル置換基は、「2’−O−Dimethylaminoethyloxyethyl−Oligomeric compounds」と題された1999年8月6日出願の国際特許出願第PCT/US99/17895号に開示されており、その全容は参照して本願明細書に組み入れられる。
オリゴマー化合物は、核酸塩基(当該技術分野にて度々、単に「塩基」又は「複素環塩基部分」と称される)が修飾されたもの、又は置換されたものをも含み得る。本願で使用されているように、「非修飾」又は「天然」の核酸塩基には、プリン塩基のアデニン(A)及びグアニン(G)、並びにピリミジン塩基のチミン(T)、シトシン(C)及びウラシル(U)が含まれる。本願明細書にて複素環塩基部分とも称される修飾核酸塩基は、例えば5−メチルシトシン(5−me−C)、5−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2−アミノアデニン、6−メチル及びアデニン及びグアニンの他のアルキル誘導体、2−チオウラシル、2−チオチミン及び2−チオシトシン、5−ハロウラシル及びシトシン、5−プロピニル(−CC−CH3)ウラシル及びシトシン並びにピリミジン塩基の他のアルキル誘導体、6−アゾウラシル、シトシン及びチミン、5−ウラシル(シュードウラシル)、4−チオウラシル、8−ハロ、8−アミノ、8−チオール、8−チオアルキル、8−ヒドロキシル及び他の8−置換アデニン及びグアニン、5−ハロ特に5−ブロモ、5−トリフルオロメチル及び他の5−置換ウラシル及びシトシン、7−メチルグアニン及び7−メチルアデニン、2−F−アデニン、2−アミノ−アデニン、8−アザグアニン及び8−アザアデニン、7−デアザグアニン及び7−デアザアデニン及び3−デアザグアニン及び3−デアザアデニンのような他の合成及び天然核酸塩基を含む複素環塩基部分も指す。
を有する。
本発明のオリゴマー化合物に追加し得る更なる好ましい置換は、一つ又は二つ以上の部分を結合又は複合させることを含み、それにより得られたオリゴマー化合物の活性、細胞分布又は細胞取り込みを改善する。一実施態様において、この修飾オリゴマー化合物は、複合基を例えばヒドロキシル又はアミノ基のような官能基に共有結合させて調製される。本発明の複合基は、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学特性を高める基、及びオリゴマーの薬物動態学的特性を高める基を含む。典型的な複合物は、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩又はエステル、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、及び染料を含む。本発明の文脈にて、薬力学特性を高める基は、オリゴマー取り込みを改善し、オリゴマーの分解耐性を高め、かつ/又はRNAとの配列特異性ハイブリダイゼーションを強化する基を含む。本発明の文脈にて、薬物動態学的特性を高める基は、オリゴマー取り込み、分布、代謝又は分泌を改善する基を含む。代表的な複合基は、1992年10月23日出願の国際特許出願第PCT/US92/09196号に開示されており、その開示全体は参照して本願明細書に組み入れられる。複合体部分は、例えばコレステロール部分(Letsinger等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、1989、86、6553−6556)、コール酸(Manoharan等、Bioorg.Med.Chem.Let.、1994、4、1053−1060)のような脂質部分、例えばヘキシル−S−トリチルチオール(Manoharan等、Ann.N.Y.Acad.Sci.、1992、660、306−309、Manoharan等、Bioorg.Med.Chem.Let.、1993、3、2765−2770)のようなチオエーテル、チオコレステロール(Oberhauser等、Nucl.Acids Res.、1992、20、533−538)、例えばドデカンジオール又はウンデシル残基(Saison−Behmoaras等、EMBOJ.、1991、10、1111−1118、Kabanov等、FEBS Lett.、1990、259、327−330、Svinarchuk等、Biochimie、1993、75、49−54)のような脂肪鎖、例えばジ−ヘキサデシル−rac−グリセロール又はトリエチルアンモニウム1、2−ジ−O−ヘキサデシル−rac−グリセロ−3−H−ホスホネート(Manoharan等、Tetrahedron Lett.、1995、36、3651−3654、Shea等、Nucl.Acids Res.、1990、18、3777−3783)のようなリン脂質、ポリアミン又はポリエチレングリセロール鎖(Manoharan等、Nucleosides&Nucleotides、1995、14、969−973)、又はアダマンタン酢酸(Manoharan等、Tetrahedron Lett.、1995、36、3651−3654)、パルミチル部分(Mishra等、Biochim.Biophys.Acta、1995、1264、229−237)、又はオクタデシルアミン若しくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分(Rooke等、J.Pharmacol.Exp.Ther.、1996、277、923−937)を含むが、これらに限定されるものではない。
オリゴマー化合物の全ての位置を一様に修飾する必要はなく、事実、1個のオリゴマー化合物内に前述した修飾の二種以上を組み込む、又は例えばオリゴマー化合物内のヌクレオシドのようなモノマーサブユニット内にさえも組み込むことができる。本発明は、キメラのオリゴマー化合物であるオリゴマー化合物も含む。本発明の文脈において、「キメラの」オリゴマー化合物又は「キメラ」とは、各々が少なくとも一つのモノマー単位から構成される二つ又は三つ以上の化学的に異なる領域を含むオリゴマー化合物を指す。即ち核酸ベースのオリゴマーの場合ではヌクレオチドである。
本発明の一局面において、オリゴマー化合物は、3’末端の糖立体配座を導入するように合成的に修飾されたヌクレオシドを含む。ヌクレオシドは、合成的に修飾された複素環塩基、糖部分、又はそれら両方を組み込み、所望の3’末端の糖立体配座を誘導し得る。これら修飾ヌクレオシドは、オリゴマー化合物の所望の3’末端の立体配座構造を保持する一方、オリゴマー化合物の特定の性質を向上し得るように、RNA状ヌクレオシドを疑似するよう使用される。RNA干渉の必要条件(例、誘因)により、RNA型二重鎖には明らかな優位性が存在しており(A型螺旋、3’末端が優位)、これは2’−デオキシ−2’−F−ヌクレオシドからなる二重殻がC.elegans系内でのRNAi応答の誘因に有効であるとの事実に一部支持されている。より安定な3’末端のヌクレオシドを使用して向上される性質としては、タンパク質結合、タンパク質オフレート、吸着及び排除(clearance)の調節を介した薬物動態学的性質の調節、ヌクレアーゼ安定性及び化学的安定性の調節、結合親和性及びオリゴマーの特異性の調節(酵素及び相補的配列の親和性及び特異性)、並びにRNA切断効率の増大があるが、これらに限定されるものではない。本発明は、C3’末端型立体配座に有利なように修飾された一つ又は二つ以上のヌクレオシドを有する、RNAiを誘因するオリゴマーを提供する。
ヌクレオシドの立体配座は、ペントフラノシル糖の2’、3’又は4’位における置換を含む様々な要因の影響を受ける。電気的に陰性な置換基は、一般にアキシアル位を好み、その一方で、立体的に厳しい置換基は、エクアトリアル位を好む(Principles of Nucleic Acid Structure、Wolfgang Sanger、1984、Springer−Verlag)。以下の図2に示すように、2’−OHを認識要素として保持する一方、3’末端の立体配座に有利なように2’位を修飾することができる。(Gallo等、Tetrahedron(2001)、57、5707−5713.Harry−O’kuru等、J.Org.Chem.、(1997)、62(6)、1754−1759及びTang等、J.Org.Chem.(1999)、64、747−754)。代替的に、2’デオキシ−2’F−ヌクレオシドに例示されるように、2’−OHを排除することにより3’末端の立体配座を優先させることができる(Kawasaki等、J.Med.Chem.(1993)、36、831−841)。ここで3’末端の立体配座は、電気的に陰性なフッ素原子をアキシアル位に配置している。リボース環の他の修飾には、例えば4’位を置換した4’−F修飾ヌクレオシド(Guillerm等、Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters(1995)、5、1455−1460及びOwen等、J.Org.Chem.(1976)、41、3010−3017)、又は例えば、メタノカルバ修飾によってヌクレオシド類似体を得て(Jacobson等、J.Med.Chem.Lett.(2000)、43、2196−2203及びLee等、Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters(2001)、11、1333−1337)3’末端の立体配座の優先が誘導される。同様のラインに沿って、RNAi応答の誘因となるオリゴマーは、立体配座をC3’末端型の立体配座にロックするよう修飾された、即ちLocked Nucleic Acid(LNA、Singh等、Chem.Commun.(1998)、4、455−456)、及びエチレン架橋された核酸(ENA、Morita等、Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters(2002)、12、73−76)の一つ又は二つ以上のヌクレオシドから構成され得る。本発明に従う修飾ヌクレオシドの例を、以下の表Iに示す。これらの例は例示を意味し、網羅的なものではない。
本願明細書に別に定義されない限り、アルキルは、C1−C12、好ましくはC1−C8、より好ましくはC1−C6の直鎖、又は(可能であれば)分岐鎖の脂肪族ヒドロカルビルを意味する。
本発明の化合物は、摂取、分布及び/又は吸収を助けるするために、例えば、リポソーム、受容体を標的とする分子、経口製剤、直腸経由の製剤、局所製剤又は他の製剤として他の分子、分子構造又は化合物の混合物とよく混合、封入、複合化、又は別様に関連され得る。これら分布及び/又は吸収を助ける製剤を教授している代表的な米国特許は、各々参照して本願明細書に組み入れられる米国特許第5、108、921号、米国特許第5、354、844号、米国特許第5、416、016号、米国特許第5、459、127号、米国特許第5、521、291号、米国特許第5、543、158号、米国特許第5、547、932号、米国特許第5、583、020号、米国特許第5、591、721号、米国特許第4、426、330号、米国特許第4、534、899号、米国特許第5、013、556号、米国特許第5、108、921号、米国特許第5、213、804号、米国特許第5、227、170号、米国特許第5、264、221号、米国特許第5、356、633号、米国特許第5、395、619号、米国特許第5、416、016号、米国特許第5、417、978号、米国特許第5、462、854号、米国特許第5、469、854号、米国特許第5、512、295号、米国特許第5、527、528号、米国特許第5、534、259号、米国特許第5、543、152号、米国特許第5、556、948号、米国特許第5、580、575号、及び米国特許第5、595、756号を含むが、これらに限定されるものではない。
本発明の薬剤組成物は、局所又は全身治療のいずれが望ましいかに応じて、及び治療するべき領域に応じて、多数の方法により投与することができる。投与は、局所的に(眼、並びに膣及び直腸送達を含む粘膜に)、肺に(例、ネブライザーによるものを含む粉末又はエアゾルの吸入又は通気)、気管内に、鼻腔内に、上皮に、及び経皮的に、経口的に又は非経口的に行われ得る。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、又は筋内注射若しくは点滴、又は頭蓋内、例、くも膜下腔内若しくは脳室内投与を含む。少なくとも一つの2’−O−メトキシエチル修飾を含むオリゴヌクレオチドは、経口投与に特に有用であると思われる。
本発明の組成物は、乳剤として作成及び調製することができる。乳剤は、通常、一つの液体が他の一液体中に液滴の形態で分散した不均一系であり、該液滴は通常、直径が0.1μmを超える(Idson、Pharmaceutical Dosage Forms、Lieberman、Rieger and Banker(Eds.)、1988、Marcel Dekker、Inc.、New York、N.Y.、volume 1、p.199、Rosoff、Pharmaceutical Dosage Forms、Lieberman、Rieger and Banker(Eds.)、1988、Marcel Dekker、Inc.、New York、N.Y.、Volume 1、p.245、Block in Pharmaceutical Dosage Forms、Lieberman、Rieger and Banker(Eds.)、1988、Marcel Dekker、Inc.、New York、N.Y.、volume2、p.335、Higuchi等、Remington’s Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Co.、Easton、PA、1985、p.301)。乳剤は、多くの場合二相系であり、緊密に混合され、かつ互いに分散された二つの不混和性の液体相からなる。一般に、乳剤は、油中水型(w/o)又は水中油型(o/w)のいずれかであり得る。水相が小さい液滴として大きい油相中に微細化され、かつ分散される場合、得られた組成物は油中水型(w/o)乳剤と称される。代替的に、油相が小さい液滴として大きい水相中に微細化され、かつ分散される場合、得られた組成物は水中油型(w/o)乳剤と称される。乳剤は、分散した相と活性薬物に加えて更なる成分を含んでもよく、該成分は水相、油相又はそれ自体で別個の相として存在し得る。必要に応じて、乳剤中に薬剤賦形剤、例えば乳化剤、安定剤、色素、及び酸化防止剤が存在してもよい。薬剤乳剤は、三つ以上の相を含む複合乳剤、例えば油中水中油型(o/w/o)及び水中油中水型(w/o/w)のような乳剤であってもよい。このような複合製剤は、多くの場合、単純な2成分乳剤が提供しない確かな利点を提供する。o/w乳剤の個々の油滴が小さい水滴を取り囲む複合乳剤は、w/o/w乳剤を構成する。同様に、油滴が、油の連続の中に安定化している水の小球中に取り囲まれた系は、o/w/o乳剤を提供する。
表面活性剤としても周知の合成界面活性剤は、乳剤の調製に幅広く適用されており、文献にて概説されている(Rieger、Pharmaceutical Dosage Forms、Lieberman、Rieger and Banker(Eds.)、1988、Marcel Dekker、Inc.、New York、N.Y.、volume 1、p.285、Idson、Pharmaceutical Dosage Forms、Lieberman、Rieger and Banker(Eds.)、Marcel Dekker、Inc.、New York、N.Y.、1988、volume 1、p.199)。界面活性剤は一般に、両親媒性であり、親水性部分と疎水性部分を含む。界面活性剤の疎水性の性質に対する親水性の性質の比は、親水/疎水バランス(HLB)と称され、製剤の調製において界面活性剤を類別及び選択する際の有用な手段である。界面活性剤は、親水基の性質に基づき次の異なるクラスに分類され得る。非イオン性、アニオン性、カチオン性及び両性(Rieger、Pharmaceutical Dosage Forms、Lieberman、Rieger and Banker(Eds.)、1988、Marcel Dekker、Inc.、New York、N.Y.、volume 1、p.285)。
マイクロエマルジョンの他にも、研究され、薬物製剤に使用されている組織化された界面活性剤構造が存在する。それらには、単分子膜、ミセル、二分子膜及び小胞が含まれる。例えばリポソームのような小胞は、その特異性と、薬物送達の見地からそれらが提供する遅延作用により、多大な興味を集めている。本発明に使用されているように、用語「リポソーム」は球状の二分子膜(一つ又は複数)に配置された親水性脂質から構成される小胞を意味する。
リポソームの更なる利点としては、天然リン脂質から得られたリポソームが生体適合性、及び生分解性を有すること、多様な水溶性及び油溶性薬物を取り込むことができること、その内部区画に封入した薬物を代謝及び分解から保護することができる(Rosoff、Pharmaceutical Dosage Forms、Lieberman、Rieger and Banker(Eds.)、1988、Marcel Dekker、Inc.、New York、N.Y.、volume 1、p.245)ことが挙げられる。リポソーム製剤を調製する際に考慮するべき重要な点は、脂質表面の変化、小胞の寸法、及びリポソームの水性部分の容積である。
(a)前記薬物及び浸透促進剤を含む担体粒子の第一集団と、ここで薬物及び浸透促進剤は腸の第一部位に放出されることと、
(b)浸透促進剤及び遅延放出皮膜又はマトリクスを含む担体粒子の第二集団と、ここで浸透促進剤は、第一部位の下流の腸内の第二部位に放出され、それにより薬物が第二部位に到達した際の薬物吸収が促進されることと、を含む。
このような促進は少なくとも担体粒子の二つの集団を封入することにより得られる。担体粒子の第一集団は、生物学的に活性な物質と浸透促進剤とを含み、担体粒子の第二(場合により追加の)集団は、浸透促進剤と遅延放出皮膜又はマトリクスとを含む。
生物活性物質の高いバイオアベイラビリティも、本発明の組成物の経口投与、及び方法を介して達成される。
本発明の組成物は、更に医薬組成物中に、当該技術分野で確立されている使用レベルで慣習的に見られる他の補助成分を含有してもよい。従って、例えば、組成物は、更なる、適合性を有する、薬剤的に活性な物質、例えば、痒み止め薬、アストリンゼン、局所麻酔薬又は抗炎症薬を含有してもよいし、本発明の組成物を多様な剤形に物理的に調製する際に有用な、例えば色素、着香剤、保存剤、酸化防止剤、乳白剤、増粘剤及び安定剤等の更なる材料を含有してもよい。しかしながら、これらの材料は、添加された場合に、本発明の組成物成分の生物学的活性を過度に妨害しない必要がある。製剤は滅菌されてもよく、また所望であれば、製剤中の核酸(一種又は複数種)と有害な相互作用を起こさない、例えば滑沢剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝液、着色剤、着香及び/又は芳香物質、及び同様物のような補助剤を混合してもよい。
投薬は治療するべき疾病状態の重症度及び感応性に依存する。治療の期間が数日〜数ヶ月継続するか、又は治癒するか、又は疾病状態が縮小される迄、最適な投薬計画は患者の身体内の薬物蓄積測定値から計算され得る。当業者は最適な投薬、投薬方法及び反復率を容易に決定することができる。
非修飾オリゴデオキシヌクレオチドをヨウ素で酸化した標準的なホスホロアミデートを使用して、自動DNA合成機(Applied Biosystems model 380B)上で合成した。Applied Biosystems(Foster City、CA)からβ−シアノエチルジイソプロピル−ホスホロアミデートを購入した。Forホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのために、標準的な酸化ボトルを0.2M溶液のアセトニトリル中の3H−1、2−ベンゾジチオール−3−オン1、1−ジオキシドの0.2M溶液と交換し、亜リン酸エステル結合を段階的にチエート化(thiation)した。チエート化サイクル待機ステップは、68秒に増大され、キャッピングステップが続いた。シトシンは、5−メチルシトシンであり得る(5−メチルデオキシシチジンホスホロアミデート、GlenResearch、Sterling、VA、又はAmersham Pharmacia Biotech、Piscataway、NJから入手可能)。
2、2’−アンヒドロ[1−(β−D−アラビノフラノシル)−5−メチルウリジン]:
5−メチルウリジン(リボシルチミン、Yamasa、Choshi、Japanを介して商業的に入手可能な)(72.0g、0.279M)、ジフェニルカーボネート(90.0g、0.420M)及び重炭酸ナトリウム(2.0g、0.024M)をDMF(300mL)に加えた。混合物を攪拌しながら加熱還流して、発生した二酸化炭素を制御下で放出させた。1時間後、僅かに暗化した溶液を減圧濃縮した。得られたシロップを攪拌しながらジエチルエーテル(2.5L)中に注いだ。生成物はゴム状物を形成した。エーテルを傾けて除去し、残基を少量のメタノール中に溶解した(約400mL)。溶液を新鮮なエーテル(2.5L)内に注いで、堅いゴム状物を得た。エーテルを傾けて除去し、ゴム状物をオーブン中で乾燥して(60°Cで1mmHgにて24時間)固体を得、これは粉砕して明るい黄褐色粉末となった(57g、85%粗収率。この材料をそのまま次の反応に使用した。
2、2’−アンヒドロ−5−メチルウリジン(195g、0.81M)、トリス(2−メトキシエチル)ボレート(borate)(231g、0.98M)及び2−メトキシエタノール(1.2L)を、2Lステンレス鋼の圧力容器に加え、160℃の予め加熱した油浴中に配置した。155〜160°Cで48時間加熱した後、容器を開放して溶液を乾燥するまで蒸発させ、MeOH(200mL)で粉砕した。残留物を熱アセトン(1L)中に懸濁させた。不溶の塩をろ過し、アセトン(150mL)で洗浄し、ろ液を蒸発させた。残留物(280g)をCH3CN(600mL)中に溶解し、蒸発させた。シリカゲルカラム(3kg)を、5%Et3NHを含有するCH2Cl2/アセトン/MeOH(20:5:3)中に充填した。残留物をCH2Cl2(250mL)中に溶解し、カラムに充填する前にシリカ(150g)上に吸着させた。生成物を溶媒で溶出して、160g(63%)の生成物を得た。
2’−O−メトキシエチル−5−メチルウリジン(160g、0.506M)をピリジン(250mL)と共蒸発させ、乾燥した残留物をピリジン(1.3L)中に溶解した。塩化ジメトキシトリチル(94.3g、0.278M)の第一のアリコートを加え、混合物を室温で1時間攪拌した。塩化ジメトキシトリチル(94.3g、0.278M)の第二のアリコートを加え、反応物を更に1時間攪拌した。次いでメタノール(170mL)を加えて反応を停止させた。HPLCは約70%の生成物の存在を示した。溶媒を蒸発させ、CH3CN(200mL)で粉砕した。残留物をCHCl3(1.5L)中に溶解し、2x500mLの飽和NaHCO3及び2x500mLの飽和NaClで抽出した。有機相をNa2SO4上で乾燥し、ろ過し、蒸発させた。275gの残留物を得た。残留物をpackした3.5kgシリカゲルカラム上で、0.5%Et3NHを含有するEtOAc/ヘキサン/アセトン(5:5:1)で溶出して精製した純粋な画分を蒸発させて生成物164gを得た。不純な画分から更に約20gを得、全収率は183g(57%)であった。
2’−O−メトキシエチル−5’−O−ジメトキシトリチル−5−メチル−ウリジン(106g、0.167M)、DMF/ピリジン(562mLのDMF及び188mLのピリジンから調製した750mLの3:1混合物)及び無水酢酸(aceticanhydride)(24.38mL、0.258M)を一緒にして、室温で24時間攪拌した。最初にMeOHを加えることによってtlc標本をクエンチし、反応物をtlcで監視した。tlcによる判断によって反応が完了したら、MeOH(50mL)を加え、混合物を35℃で蒸発させた。残留物をCHCl3(800mL)中に溶解し、2x200mLの飽和中炭酸ナトリウム及び2x200mLの飽和NaClで抽出した。水層を200mLのCHCl3で逆抽出した。一緒にした有機物を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させて残留物122g(約90%生成物)を得た。残留物を3.5kgシリカゲルカラム上で精製し、EtOAc/ヘキサン(4:1)を使用して溶出した。純粋な生成物画分(画分s)を蒸発させて、96g(84%)を得た。
3’−O−アセチル−2’−O−メトキシエチル−5’−O−ジメトキシトリチル−5−メチルウリジン(96g、0.144M)をCH3CN(700mL)中に溶解して第一の溶液を調製し、とっておいた。トリエチルアミン(189mL、1.44M)CH3CN(1L)中のトリアゾール(90g、1.3M)溶液に加え、−5°Cに冷却し、オーバーヘッドスターラーを用いて0.5時間攪拌した。0−10°Cに保持した攪拌溶液にPOCl3を30分間かけて滴加し、得られた混合物を更に2時間攪拌した。後者の溶液に、第一の溶液を45分間かけて滴加した。得られた反応混合物を一夜、冷室内に貯蔵した。反応混合物から塩をろ過し、溶液を蒸発させた。残留物をEtOAc(1L)中に溶解し、不溶固体をろ過して除去した。ろ液を1x300mLのNaHCO3及び2x300mLの飽和NaClで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発させた。残留物をEtOAcで粉砕して表題の化合物を得た。
3’−O−アセチル−2’−O−メトキシエチル−5’−O−ジメトキシトリチル−5−メチル−4−トリアゾールウリジン(103g、0.141M)のジオキサン(500mL)及びNH4OH(30mL)溶液を、室温で2時間攪拌した。ジオキサン溶液を蒸発させ、残留物をMeOH(2x200mL)と共沸させた。残留物をMeOH(300mL)中に溶解し、2リットルのステンレス鋼圧力容器に移動した。NH3ガスで飽和させたMeOH(400mL)を加え、容器を2時間かけて100°Cに加熱した(tlcは完全な転換を示した。)。容器の内容物を乾燥するまで蒸発させ、残留物をEtOAc(500mL)中に溶解し、飽和NaCl(200mL)で一回洗浄した。有機物を硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶媒を蒸発させて85g(95%)の表題の化合物を得た。
2’−O−メトキシエチル−5’−O−ジメトキシトリチル−5−メチル−シチジン(85g、0.134M)をDMF(800mL)中に溶解し、無水安息香酸(37.2g、0.165M)を攪拌しながら加えた。3時間攪拌した後、tlcでは反応が約95%完了したことが示された。溶媒を蒸発させ、残留物をMeOH(200mL)と共沸させた。残留物をCHCl3(700mL)中に溶解し、飽和NaHCO3(2x300mL)及び飽和NaCl(2x300mL)で抽出し、MgSO4上で乾燥して残留物(96g)を得た。残留物を、0.5%Et3NHを含有するEtOAc/ヘキサン(1:1)で溶出する1.5kgシリカゲルカラムのクロマトグラフィーにかけた。純粋な生成物画分を蒸発させて、90g(90%)の表題の化合物を得た。
N4−ベンゾイル−2’−O−メトキシエチル−5’−O−ジメトキシトリチル−5−メチル−シチジン(74g、0.10M)を、CH2Cl2(1L)中に溶解した。テトラゾールジイソプロピルアミン(7.1g)及び2−シアノエトキシ−テトラ−(イソプロピル)ホスファイト(40.5mL、0.123M))を、窒素雰囲気下で攪拌しながら加えた。得られた混合物を室温で20時間攪拌した(tlcでは反応が95%完了したことが示された)。反応混合物を飽和NaHCO3(1x300mL)及び飽和NaCl(3x300mL)で抽出した。水性洗浄物をCH2Cl2(300mL)で逆抽出し、抽出物を一緒にして、MgSO4上で乾燥し、濃縮した。得られた残留物を、EtOAc:ヘキサン(3:1)を溶出溶媒として使用する1.5kgシリカカラム上のクロマトグラフィーにかけた。純粋な画分を一緒にして、90.6g(87%)の表題の化合物を得た。
2’−(ジメチルアミノオキシエトキシ)ヌクレオシドアミダイト[2’−O−(ジメチルアミノオキシエチル)ヌクレオシドアミダイトとしても公知の]を以下のパラグラフに記述するように製造した。アミンを、アデノシン及びシチジンの場合はベンゾイル部分で、グアノシンの場合はイソブチリルで保護した以外は、チミジン(5−メチルウリジン)と同様にアデノシン、シチジン及びグアノシンヌクレオシドアミダイトを製造した。
O2−2’−アンヒドロ−5−メチルウリジン(Pro.Bio.Sint.、Varese、Italy、100.0g、0.416mmol)、ジメチルアミノピリジン(0.66g、0.013eq、0.0054mmol)を周囲温度にてアルゴン雰囲気下で、機械的に攪拌しながら乾燥ピリジン(500ml)中に溶解した。tert−ブチルジフェニルクロロシラン(125.8g、119.0mL、1.1eq、0.458mmol)を一度に加えた。反応物を16時間、周囲温度にて攪拌した。TLC(Rf0.22、酢酸エチル)では、反応が完了したことが示された。溶液を減圧濃縮して、濃厚な油状物を得た。これをジクロロメタン(1L)及び飽和重炭酸ナトリウム(2x1L)並びにブライン(1L)間に分割した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、減圧濃縮して濃厚な油状物を得た。この油状物を酢酸エチル及びエチルエーテル(600mL)の1:1混合物中に溶解し、溶液を−10℃に冷却した。得られた結晶生成物をろ過して収集し、エチルエーテル(3x200mL)で洗浄し、乾燥して(40℃、1mmHg、24h)149g(74.8%)の白色固体を得た。TLC及びNMRは、純粋な生成物と一致した。
2Lステンレス鋼内にて、非撹拌加圧反応器に、テトラヒドロフラン(1.0M、2.0eq、622mL)中のボランを加えた。ドラフト内で手動で撹拌して、最初にエチレングリコール(350mL、過剰量)を、水素ガスの発生が沈下するまで注意深く加えた。5’−O−tert−ブチルジフェニルシリル−O2−2’−アンヒドロ−5−メチルウリジン(149g、0.311mol)及び重炭酸ナトリウム(0.074g、0.003eq)を手動で攪拌しながら加えた。反応器を密封し、内部温度が160℃に到達するまで、油浴中で加熱し、その後、16時間保持した(圧力<100psig)。反応容器を周囲温度に冷却し、開放した。TLC(所望の生成物のRf0.67、ara−Tside生成物のRf0.82、酢酸エチル)は、生成物の約70%の転換を示した。更なる副生物の形成を回避するため、反応を停止させ、温浴中で、エチレングリコールを除去するより過酷な条件下で、減圧濃縮した(10〜1mmHg)(40〜100℃)。[代表的に、低沸騰溶媒を除去した後、残留溶液を酢酸エチル及び水間に分割してもよい。生成物は有機相に移る。]残留物をカラムクロマトグラフィー(2kgシリカゲル、酢酸エチル−ヘキサン勾配1:1〜4:1)で生成した。適切な画分を一緒にして、揮散させ、乾燥して生成物を白色の砕けやすい発泡体(84g、50%)、不純物を含む出発物質(17.4g)及び純粋な再使用可能な出発物質20gを得た。出発物質に基づく純粋な回収出発物質の収率は58%であった。TLC及びNMRは99%純粋な生成物と一致した。
5’−O−tert−ブチルジフェニルシリル−2’−O−(2−ヒドロキシエチル)−5−メチルウリジン(20g、36.98mmol)を、トリフェニルホスフィン(11.63g、44.36mmol)及びN−ヒドロキシフタルイミド(7.24g、44.36mmol)と混合した。次いでこれを40℃で2日間、高真空下でP2O5上にて乾燥した。反応混合物をアルゴンでフラッシュし、乾燥THF(369mL、Aldrich、sureseal bottle)を加えて透明な溶液を得た。反応混合物に、ジエチルアゾジカルボキシレート(6.98mL、44.36mmol)を滴加した。滴加の速度は、丁度次の滴加の前に暗赤色が消える速度で行われた。滴加が完了した後、反応物を4時間撹拌した。その時点でTLCは反応の完了を示した(酢酸エチル:ヘキサン、60:40)。溶媒を真空蒸発させた。得られた残留物をフラッシュカラム上に配置し、酢酸エチル:ヘキサン(60:40)で溶出して、2’−O−([2−フタルイミドオキシ)エチル]−5’−t−ブチルジフェニルシリル−5−メチルウリジンを白色発泡体(21.819、86%)として得た。
2’−O−([2−フタルイミドオキシ)エチル]−5’−t−ブチルジフェニルシリル−5−メチルウリジン(3.1g、4.5mmol)を乾燥CH2Cl2(4.5mL)中に溶解し、メチルヒドラジン(300mL、4.64mmol)を−10℃〜0℃で滴加した。1時間後、混合物をろ過し、ろ液を氷冷CH2Cl2で洗浄し、一緒にした有機相を水、ブラインで洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥した。溶液を濃縮して2’−O−(アミノオキシエチル)チミジンを得、次いでこれをMeOH(67.5mL)中に溶解した。ここにホルムアルデヒド(20%水溶液、w/w、1.1eg)を加え、混合物を1時間攪拌した。溶媒を真空除去し、残留物をクロマトグラフィーにかけて、5’−O−tert−ブチルジフェニルシリル−2’−O−[(2−ホルムアドキシイミノオキシ)エチル]−5−メチルウリジンを白色発泡体(1.95、78%)として得た。
5’−O−tert−ブチルジフェニルシリル−2’−O−[(2−ホルムアドキシイミノオキシ)エチル]−5−メチルウリジン(1.77g、3.12mmol)を、乾燥MeOH(30.6mL)中の1Mピリジニウムp−トルエンスルホネート(PPTS)溶液中に溶解した。この溶液に、シアノ水素化ホウ素ナトリウム(0.39g、6.13mmol)を10℃にて不活性雰囲気下で加えた。反応混合物を10℃で10分間攪拌した。その後、反応容器を氷浴から除去し、室温で2時間攪拌し、反応物をTLC(5%MeOH、CH2Cl2中)で監視した。NaHCO3水溶液(5%、10mL)を加え、酢酸エチル(2x20mL)で抽出した。酢酸エチル相を無水Na2SO4上で乾燥し、乾燥するまで蒸発させた。残留物をMeOH(30.6mL)中の1MPPTS溶液に溶解した。ホルムアルデヒド(20%w/w、30mL、3.37mmol)を加え、反応混合物を室温で10分間攪拌した。反応混合物を氷浴中で10℃に冷却し、シアノ水素化ホウ素ナトリウム(0.39g、6.13mmol)を加え、反応混合物を10℃で10分間攪拌した。10分後、反応混合物を氷浴から除去し、室温で2時間攪拌した。この反応混合物に5%NaHCO3(25mL)溶液を加え、酢酸エチル(2x25mL)で抽出した。酢酸エチル層を無水Na2SO4上で乾燥し、乾燥するまで蒸発させた。得られた残留物をカラムクロマトグラフィーで精製し、CH2Cl2中の5%MeOHで溶出して、5’−O−tert−ブチルジフェニルシリル−2’−O−[N、N−ジメチルアミノオキシエチル]−5−メチルウリジンを白色発泡体(14.6g、80%)として得た。
トリエチルアミントリヒドロフルオライド(3.91mL、24.0mmol)を乾燥THF及びトリエチルアミン(1.67mL、12mmol、乾燥、KOH上で保持)中に溶解した。次いでこのトリエチルアミン−2HF混合物を、5’−O−tert−ブチルジフェニルシリル−2’−O−[N、N−ジメチルアミノオキシエチル]−5−メチルウリジン(1.40g、2.4mmol)に加え、室温で24時間攪拌した。反応物をTLC(5%MeOH、CH2Cl2中)で監視した。溶媒を減圧除去し、残留物をフラッシュカラム上に配置し、CH2Cl2中の10%MeOHで溶出して2’−O−(ジメチルアミノオキシエチル)−5−メチルウリジン(766mg、92.5%)を得た。
2’−O−(ジメチルアミノオキシエチル)−5−メチルウリジン(750mg、2.17mmol)をP2O5上で、40℃の高速真空下で乾燥した。次いでこれを無水ピリジン(20mL)と共蒸発させた。得られた残留物を、アルゴン雰囲気下でピリジン(11mL)中に溶解した。混合物に4−ジメチルアミノピリジン(26.5mg、2.60mmol)、4、4’−ジメトキシトリチルクロリド(880mg、2.60mmol)を加え、反応混合物を出発物質が全て消失するまで室温で攪拌した。真空下でピリジンを除去し、残留物をクロマトグラフィーにかけ、CH2Cl2中の10%MeOH(数滴のピリジンを含有する)で溶出して、5’−O−DMT−2’−O−(ジメチルアミノ−オキシエチル)−5−メチルウリジン(1.13g、80%)を得た。
5’−O−DMT−2’−O−(ジメチルアミノオキシエチル)−5−メチルウリジン(1.08g、1.67mmol)を、トルエン(20mL)と共蒸発させた。残留物にN、N−ジイソプロピルアミンテトラzonide(0.29g、1.67mmol)を加え、P2O5上で、40℃の高真空下で乾燥した。その後、反応混合物を無水アセトニトリル(8.4mL)中に溶解し、2−シアノエチル−N、N、N1、N1−テトライソプロピルホスホロアミデート(2.12mL、6.08mmol)を加えた。反応混合物を、不活性雰囲気下で、周囲温度にて4時間攪拌した。反応の進行はTLC(ヘキサン:酢酸エチル1:1)で監視した。溶媒を蒸発させた後、残留物を酢酸エチル(70mL)中に溶解し、5%NaHCO3(40mL)水溶液で洗浄した。酢酸エチル層を無水Na2SO4上で乾燥し、濃縮した。得られた残留物をクロマトグラフィーにかけ(溶離液として酢酸エチルを使用)、5’−O−DMT−2’−O−(2−N、N−ジメチルアミノオキシエチル)−5−メチルウリジン−3’−[(2−シアノエチル)−N、N−ジイソプロピルホスホロアミデート]を白色発泡体(1.04g、74.9%)として得た。
ペプチド−核酸(PNA)オリゴマーをP.E.Nielsenetal(Science1991、254、1497−1500)に従って合成した。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを、ヒトSTAT3を標的とするよう設計した。標的配列のデータは、Akira、S.等(Cell、1994、77、63−71)(GenBank(登録商標)受入番号L29277、本願明細書に配列番号1として提供する。)から公表されたAPRFcDNA配列から得た。ホスホロチオエート結合を有する一連のオリゴデオキシヌクレオチドを合成した。2’−デオキシシトシンは5−メチルシトシンであった。これらオリゴヌクレオチド配列を、表1に示す。オリゴヌクレオチドの更なるセットを、10個の2’−デオキシヌクレオチドからなる中央「ギャップ」領域を含む20個のヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド(「ギャップマー」)として合成した。同キメラオリゴヌクレオチドは、両側(5’及び3’方向)に5個のヌクレオチドの「ウイング」が存在する。「ウイング」は2’−O−メトキシエチル(2’−MOE)ヌクレオチドから構成されている。ヌクレオシド間(バックボーン)結合は、オリゴヌクレオチド全体を通してホスホロチオエート(P=S)である。2’−MOEシトシン及び2’−デオキシシトシンの全ては、5−メチル−シトシンであった。これらのオリゴヌクレオチド配列を表2に示す。
ヒトSTAT3ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドのヌクレオチド配列
2 GenBank(登録商標)受入番号L29277、遺伝子座名「HUMAPRF」、配列番号1からコーディネート。
ヒトSTAT3キメラ(デオキシギャップ)ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列
2 GenBank(登録商標)受入番号L29277、遺伝子座名「HUMAPRF」、配列番号1からコーディネート。
STAT3PCRプライマー及びプロ−ブは、市販のソフトウエア(例、Oligo5.0又はPrimer Express(登録商標))を使用して設計し得る。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを、マウスSTAT3を標的とするよう設計した。標的配列のデータは、Zhong、Z.、(GenBank(登録商標)受入番号U06922、本願明細書に配列番号82として提供する。)により提出されたSTAT3cDNA配列から得た。オリゴヌクレオチド10個の2’−デオキシヌクレオチドからなる中央「ギャップ」領域を含む20個のヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド(「ギャップマー(gapmers)」)として合成した。同キメラオリゴヌクレオチドは、両側(5’及び3’方向)に5個のヌクレオチドの「ウイング」が存在する。「ウイング」は2’−O−メトキシエチル(2’−MOE)ヌクレオチドから構成されている。ヌクレオシド間(バックボーン)結合は、オリゴヌクレオチド全体を通してホスホロチオエート(P=S)である。全2’−MOEシトシンは、5−メチル−シトシンである。オリゴヌクレオチド配列を表3に示す。
BCL1細胞(PBS中5X106細胞)にBTX Electro Cell Manipulator(登録商標)600(Genetronics、San Diego、CA)を使用した電気穿孔により、200V、1000μFにて、オリゴヌクレオチドを移入した。最初のスクリーニングにて、BCL1細胞は10μMオリゴヌクレオチドを電気穿孔され、24時間後、RNAを収集した。オリゴヌクレオチドを含まない対照標本を、同一の電気穿孔条件にかけた。
マウスSTAT3キメラ(デオキシギャップ)ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドのヌクレオチド配列
2 GenBank(登録商標)受入番号U06922、遺伝子座名「MMU06922」、配列番号82からコーディネート。
ISIS17152(配列番号99)を更なる研究のために選択した。このオリゴヌクレオチドのタンパク質レベル上の効果を、ウエスタンブロット法により測定した。ISIS23177(配列番号106)、3塩基ミスマッチ、を対照として使用した。BCL1細胞を増殖させ、本質的に実施例3に記載したように処理及び加工した。
Karras、J.G.等(J.Immunol.、1996、157、2299)に記載されているように、ウエスタンブロッテッィングを実行した。STAT1及びSTAT3抗体はUBI(LakePlacid、NY)から得た。
結果を表5に示す。ISIS17152(配列番号99)は、ミスマッチ対照と比較してSTAT3タンパク質レベルを有意に低下させた。
ISIS17152(配列番号99)のBCL1増殖上の効果を測定した。BCL1細胞は、その増殖の原因と考えられる恒常的に活性化したSTAT3を含んでいた。BCL1細胞(1×105)に、本質的に実施例3に記載されたように、10nm、15nm又は20nmのSTAT3(ISIS17152)又はミスマッチ(ISIS23177)オリゴヌクレオチドを電気穿孔した。電気穿孔から48時間後、細胞を96−ウエルプレート内で、200μL完全RPMI中にてインキュベートした。培養物に1μCiの[3H]−チミジンを培養物中で最後の8時間にパルスした。細胞を回収して、D.A.等(Int.Immunol.、1995、7、151−161)に記載されているように、チミジン取り込みについて分析した。
結果を表6に示す。ISIS17152(配列番号99)はBCL1細胞増殖を約50%低下させたのに対し、ミスマッチ対照は細胞増殖上の効果を有さなかった。
ISIS17152(配列番号99)の、BCL1細胞内のIgM分泌レベル上の効果を測定した。STAT3はIgM発現の調節に関与している(Faris、M.等、Immunology、1997、90、350−357)。BCL1細胞(1×106)に、本質的に実施例3に記載されたように、5nm又は15nmのSTAT3(ISIS17152)又はミスマッチ(ISIS23177)オリゴヌクレオチドを電気穿孔した。電気穿孔後、細胞を12−ウエルプレート内で、2mLの完全RPMI中にてインキュベートした。電気穿孔から24時間後、培地を新鮮な培地と交換した。更に48時間後、増殖培地を回収して、遠心分離により細胞を除去し、OPT−EIATMELISAキット(Pharmingen、San Diego、CA)を使用してマウスIgM抗体(Southern Biotechnology、Birmingham、AL)を捕獲及び検出することにより、IgM含有量をアッセイした。
結果を表7に示す。ISIS17152(配列番号99)は、ミスマッチ対照オリゴヌクレオチド(ISIS23177)と比較して、IgM分泌を有意に減少させた。
ISIS17152(配列番号99)の、BCL1細胞内のケモカインレベル上の効果を測定した。BCL1細胞に、本質的に実施例3に記載されたように、5nm、10nm又は20nmのSTAT3(ISIS17152)又はミスマッチ(ISIS23177)オリゴヌクレオチドを電気穿孔した。電気穿孔から16時間後、培地に10uMのCpG−含有オリゴヌクレオチドを加えて、電気穿孔したBCL1細胞内でケモカイン遺伝子発現を誘導した。CpG−含有オリゴヌクレオチドは、免疫賦活性の分子である(Krieg、A.M.、等、Nature、1995、374、546−549)。8時間後、マウスケモカインテンプレートセット、Mck−5(Pharmingen、San Diego、CA)を使用して、当業者周知の方法によって、RNase保護アッセイによりケモカインレベルを測定した。
結果を表8に示す。ISIS17152(配列番号99)は、ケモカインRANTES、MIP−1−α及びMIP−1−βの発現を誘導することができたのに対し、ミスマッチ対照では効果が小さかった。
配列番号1を標的とした更なるオリゴヌクレオチドのセットを設計し、10個の2’−デオキシヌクレオチドからなる中央「ギャップ」領域を含む20個のヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド(「ギャップマー」)として合成した。同キメラオリゴヌクレオチドは、両側(5’及び3’方向)に5個のヌクレオチドの「ウイング」が存在する。「ウイング」は2’−O−メトキシエチル(2’−MOE)ヌクレオチドから構成されている(太字で示す)。ヌクレオシド間(バックボーン)結合は、オリゴヌクレオチド全体を通してホスホロチオエート(P=S)である。2’−MOEシトシン及び2’−デオキシシトシンの全ては、5−メチル−シトシンであった。これらのオリゴヌクレオチド配列を表9に示す。
補充したRPMI1640培地(Life Technologies、Inc.、Grand Island、NY)の標準的な条件下で、マウスB16黒色腫細胞を増殖させた。
オリゴヌクレオチドの細胞数に関する効果を、表12に示す。
LGL白血病は、自己免疫性のリンパ球増殖性疾患であり、LGL細胞は、高いレベルのFas及びFasL発現にも関わらず、Fas−依存性アポトーシスを受けないことで知られている(Lamy等、Blood、1998、92、4771−7)。STAT3アンチセンスオリゴヌクレオチドのLGL細胞をアポトーシスシグナルに感作させる能力について試験した。
多発性骨髄腫(MM)は、過剰増殖性疾患である。以前の研究にて、手付かずのトランス活性化ドメインを欠くドミナントネガティブなSTAT3の発現に応答して、MM細胞ラインU266でアポトーシスが増大することが示された。
アンチセンスSTAT3オリゴヌクレオチドISIS17148(SEQ ID 95)及びISIS113176(SEQ ID 115)を、ミスマッチ対照オリゴヌクレオチドと比較して、U266細胞でアポトーシスを増大させる能力について試験した。様々な量のオリゴヌクレオチドを、移入により培養細胞へ送達した。細胞を移入から48時間後に回収して、STAT3mRNA及びタンパク質レベルを各々ノーザン及びウエスタンブロットにより測定した。両方のSTAT3アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与に応答して、STAT3mRNA及びタンパク質の有意な用量依存的低下が見られた。ミスマッチ対照オリゴヌクレオチドは、STAT3mRNA又はタンパク質レベル上に有意な効果を有さなかった。
本発明によれば、公表された配列(GenBank(登録商標)受入番号L29277、本願明細書に配列番号1として組み入れる、GenBank(登録商標)受入番号NT_010755.13のヌクレオチド配列4189213〜4263636の相補体、本願明細書に配列番号153として組み入れる、及びGenBank(登録商標)受入番号NM_139276.1、本願明細書に配列番号154として組み入れる)を使用して、ヒトSTAT3の異なる領域を標的とする更なる一連のオリゴヌクレオチドを設計した。オリゴヌクレオチドを表13に示す。“標的部位“は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的配列上の第一の(最も5’側)ヌクレオチドの番号を示す。表13の全化合物は、10個の2’−デオキシヌクレオチドからなる中央「ギャップ」領域を含む20個のヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド(「ギャップマー」)であり、その両側(5’及び3’方向)には5個のヌクレオチド「ウイング」が存在する。ウイングは2’−O−メトキシエチル(2’−MOE)ヌクレオチドから構成されている。ヌクレオシド間(バックボーン)結合は、オリゴヌクレオチド全体を通してホスホロチオエート(P=S)である。全シチジン残基は5−メチルシチジンである。
アンチセンスオリゴヌクレオチド処理の結果は2つの実験の平均であり、表13に示す。データは未処理対照細胞に関する抑制パーセントとして表される。
本発明によれば、公表された配列(GenBank(登録商標)受入番号L29277、本願明細書に配列番号1として組み入れる、GenBank(登録商標)受入番号NM_139276.1、本願明細書に配列番号154として組み入れる)を使用して、ヒトSTAT3の異なる領域を標的とするように、更なる一連のオリゴヌクレオチドを設計した。オリゴヌクレオチドを表14に示す。“標的部位“は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的配列上の第一の(最も5’側)ヌクレオチドの番号を示す。表14の全化合物は10個の2’−デオキシヌクレオチドからなる中央「ギャップ」領域を含む20個のヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド(「ギャップマー」)であり、その両側(5’及び3’方向)には5個のヌクレオチド「ウイング」が存在する。ウイングは2’−O−メトキシエチル(2’−MOE)ヌクレオチドから構成されている。ヌクレオシド間(バックボーン)結合は、オリゴヌクレオチド全体を通してホスホロチオエート(P=S)である。全シチジン残基は5−メチルシチジンである。
本発明によれば、公表された配列(GenBank(登録商標)受入番号U06922.1、本願明細書に配列番号82として組み入れる、GenBank(登録商標)受入番号U30709.1、本願明細書に配列番号382として組み入れる)を使用して、マウスSTAT3RNAの異なる領域を標的とするように、オリゴヌクレオチドの更なる連続を設計した。そのオリゴヌクレオチドを表15に示す。“標的部位“は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的配列の第一の(最も5’−側)ヌクレオチド番号を示す。表15に示す全化合物は、キメラオリゴヌクレオチド(「ギャップマー」)20個のヌクレオチドの長さを有する、から構成される10個の2’−デオキシヌクレオチドからなる中央「ギャップ」領域から構成され、その両端には(5’及び3’方向)5個のヌクレオチド「ウイング」が存在する。ウイングは、2’−O−メトキシエチル(2’−MOE)ヌクレオチドから構成されている。ヌクレオシド間(バックボーン)結合は、オリゴヌクレオチド全体を通してホスホロチオエート(P=S)である。全シチジン残基は、5−メチルシチジンである。
本発明によれば、ヒトSTAT3を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドのサブセットを、用量反応試験で更に研究した。化合物を、そのT−24細胞中のヒトSTAT3mRNAレベルに対する効果について分析した。
用量反応はT−24細胞で繰り返され、本願明細書でPPS2033と称される異なるプライマー−プローブセットを使用して、遺伝子標的の量を測定した。PPS2033はプローブを含み、ヒトSTAT3に対するプライマーは、(配列番号154として本願明細書に組み入れた)配列情報を使用して、ヒトSTAT3配列とハイブリダイズするように設計された。PPS2033では、PCRプライマーは、フォワードプライマー:GAGGCCCGCCCAACA(配列番号397)リバースプライマー:TTCTGCTAATGACGTTATCCAGTTTT(配列番号398)及びPCRプローブは:FAM−CTGCCTAGATCGGC-MGB(配列番号399)であり、ここでFAMは、レポーターの蛍光色素であり、MGBは、消光色素である。リアルタイムPCRで得られた遺伝子標的の量は、RiboGreen(商標登録)TM(Molecular Probes、Inc.Eugene、OR)を使用して、全RNAを定量することによって正規化された。使用した対照オリゴヌクレオチドは、ISIS129695(配列番号391)、ISIS129694(配列番号392)、ISIS129690(配列番号393)、ISIS129686(配列番号394)、ISIS116847(配列番号395)及びISIS113529(配列番号396)であった。
A549細胞にて、更なる用量反応実験を行った。A549細胞を、本願明細書の他の実施例に記載するように、100nMオリゴヌクレオチドにつき3ug/mLLIPOFECTIN(登録商標)を混合した18.75、37.5、75、又は150nMのオリゴヌクレオチドで処理した。使用した対照オリゴヌクレオチドは、ISIS129686(配列番号394)及びISIS129690(配列番号393)であった。未処理細胞を対照として使用した。処理から16時間後、その後のリアルタイムPCR分析のために、細胞からRNAを調製した。
ヒトSTAT3mRNA発現レベルを、プライマープローブセットPPS199を使用したリアルタイムPCRによって定量し、遺伝子標的の量を、本願明細書の他の実施例に記載するように、RiboGreen(登録商標)を使用して標準化した。2つの実験による平均のデータを、表20に示す。用量反応における“−”又は“+”は、各々、未処理対照細胞に関するSTAT3mRNA発現の減少又は増加を示す。
一般に、RNAの合成化学は、戦略的中間段階(反応において、多様な保護基を選択的に組み込むことを基本とする。当業者は有機合成において保護基を使用することを理解するであろうが、有用な保護基のクラスはシリルエーテルを含む。詳細には、5´−ヒドロキシルの保護には、2´−ヒドロキシル上の酸に不安定なオルトエステル保護基と組み合わせて、嵩高いシリルエーテルが使用される。次にこの保護基のセットは、標準的な固相合成技術と共に使用される。他の全合成ステップの後、最終的に酸に不安定なオルトエステル保護基を除去することが重要である。更に、合成の早い段階でのシリル保護基の使用は、望ましくない2´−ヒドロキシルの脱保護を行うことなく、所望の際の容易な除去を確実にする。
本発明によれば、STAT3を標的とするために、本発明のアンチセンス化合物と、その相補体とからなる一連の核酸二重鎖を設計し得る。二重鎖のアンチセンス鎖の核酸塩基配列は、本願明細書に開示するSTAT3を標的とするオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分を含む。鎖の末端は、天然又は修飾核酸塩基を追加することにより修飾されてオーバーハングを形成し得る。次いでアンチセンス鎖の相補体としてdsRNAのセンス鎖が設計及び合成され、このセンス鎖は双方の末端に修飾又は付加物も含み得る。例えば、一実施態様にて、dsRNA二重鎖の両方の鎖は、核酸塩基の中央全体において相補性を有し、各々片方又は両方の末端にオーバーハングを有するであろう。二重鎖のアンチセンス鎖及びセンス鎖は、約17〜25個のヌクレオチドを含むか、又は約19〜23個のヌクレオチドを含む。代替的に、アンチセンス鎖及びセンス鎖は、20、21又は22ヌクレオチドを含む。
cgagaggcggacgggaccgTT アンチセンス鎖
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TTgctctccgcctgccctggc 相補体
cgagaggcggacgggaccg アンチセンス鎖
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gctctccgcctgccctggc 相補体
二重鎖のRNA鎖は、本願明細書に開示する方法によって合成されるか、又はDharmacon Research Inc.(Lafayette、CO)から購入することができる。いったん合成された後、相補的な鎖がアニールされる。一つの鎖がアリコートされ、濃度50uMに希釈される。いったん希釈した後、30uLの各鎖を、15uLの5Xアニーリング緩衝溶液と一緒にする。該緩衝液の最終濃度は、100mM酢酸カリウム、30mM HEPES−KOH pH7.4、及び2mM酢酸マグネシウムである。最終容積は75uLである。この溶液を90℃で1分間インキュベートした後、15秒間遠心分離する。このチューブを37℃で1時間静止させ、この間にdsRNA二重鎖を実験に使用する。dsRNA二重鎖の最終濃度は、20uMである。この溶液は、5回まで冷凍貯蔵(−20°C)及び解凍することができる。
集密度が80%に到達したときに、細胞を本発明の二重鎖アンチセンス化合物で処理する。96−ウエルプレート内で増殖した細胞に関しては、ウエルを200μLOPTI−MEM−1(登録商標)低下させた−血清培地(GibcoBRL)で一回洗浄し、次いで、12μg/mL LIPOFECTIN(登録商標)(GibcoBRL)を含有する130μLのOPTI−MEM−1(登録商標)と、最終濃度200nM(100nM二重鎖アンチセンス化合物につき6μg/mL LIPOFECTIN(登録商標)の割合)の所望の二重鎖アンチセンス化合物で処理する。5時間の処理後、培地を新鮮な培地と交換する。処理から16時間後、細胞を回収し、この時RNAを単離し、標的低下をRT−PCRで測定する。
前立腺癌腫
ヒト前立腺癌腫のLNCaPハツカネズミモデルは、参照して本願明細書に組み入れられるKiyama等、CancerRes.63:3575−3584、2003に記載されている。即ち、LNCaPヒト前立腺癌腫細胞を、5%の熱不活性化ウシ胎児血清で補充したRPMI培地(Invitrogen Life Technologies、Carlsbad、CA)中で培養保持した。6〜8週齢の雄の無胸腺ヌードマウス(Harlan Sprague Dawley、Inc.、Indianapolis、IN)の脇腹に、メトキシフルラン麻酔下で27−ゲージ針を用いて、約1X106LNCaP細胞を、0.1mlのMatrigel(Becton Dickinson Labware、Franklin Lakes、NJ)で皮下免疫した。300〜500mm3の容積の腫瘍を有するマウスは、陰嚢からのアプローチにより去勢され、10mg/kgのISIS113176(配列番号115)ヒトアンチセンス又はISIS129987(配列番号404)ヒトミスマッチ対照STAT3オリゴヌクレオチドのいずれかによる、第一週目の5回/週、その後の3回/週の腹腔内処理にランダムに割り当てられた。去勢後、1日目に処理を開始した。腫瘍の容積及び血清前立腺に特異的な抗原(PSA)測定を週に1回実行した。公式LXWXHX0.5236(Gleave等、Cancer Res.51:1598−1605、1992)により腫瘍容積を計算した。マウスの尾の静脈を切開して血液標本を得て、血清PSAレベルを、感度の下限値が0.2μg/リットル(Abbott IMX、Montreal、Quebec、Canada)である酵素イムノアッセイキットを使用して、製造業者のプロトコールに従って決定した。
更なる実施態様において、ヒトSTAT3を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒト肝細胞の用量反応研究のために選択された。初代ヒト肝細胞をIn Vitro Technologies(Baltimore、MD)から購入した。細胞を24−ウエルプレート(Falcon−Primaria、BD Biosciences、Bedford、MA)内に、10%ウシ胎児血清、100単位s/mLペニシリン、及び100μg/mLストレプトマイシンで補充した高グルコースDMEM培地中に(培地及び補充物はInvitrogen Life Technologies、Carlsbad、CAから入手)、50、000細胞/ウエルの密度でプレーティングした。細胞を一夜吸着させ、翌日アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した。
更なる実施態様にて、ヒトSTAT3を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを、HepG2細胞内での用量反応のために選択した。
ヒトSTAT3標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドを、A549細胞内での用量反応の研究にて試験した。細胞を、オリゴヌクレオチド100nMにつきLIPOFECTIN(登録商標)3μg/mLの濃度にてLIPOFECTIN(登録商標)を混合したアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した。オリゴヌクレオチド濃度を、表29及び表30に示す。未処理細胞を対照として使用し、そのデータを標準化した。両方とも本願明細書に記載したPPS199及びPPS2033である二つの異なるプライマープローブセットを使用して、STAT3mRNA発現レベルを二重に測定した。PPS2033及びPPS199を使用したデータを、未処理対照に関する発現のパーセントとして、各々、表29及び表30に示す。
代替的なアンチセンスオリゴヌクレオチド濃度の範囲を使用して、更なる用量反応実験を同様に実行した。プライマープローブセットPPS2033及びPPS199を使用したデータを、未処理対照細胞に関するSTAT3mRNA発現のパーセントとして、各々、表31及び表32に示す。
Hep3B細胞内での用量反応研究にて、STAT3のアンチセンス抑制を試験した。
ヒト肝細胞腫細胞ラインHep3B(Hep3B2.1−7)を、American Type Culture Collection(ATCC、Manassas、VA)から得た。この細胞ラインは、最初、8歳のAfrican−American雄の肝細胞の癌腫から誘導された。細胞は、are上皮形態を有し、ヌードマウスにて発癌性を有する。Hep3B細胞を、Minimum Essential培地(MEM)内でEarleの平衡塩類溶液、2mML−グルタミン、1.5g/L重炭酸ナトリウム、0.1mM非必須アミノ酸、1.0mMピルビン酸ナトリウム(ATCC#20−2003、Manassas、VA)及び10%加熱不活性化したウシ胎児血清(Invitrogen Life Technologies、Carlsbad、CA)と共に慣習的に培養した。90%集密度に到達した際に、細胞を慣習的にトリプシン処理及び希釈して継代した。
THLE−2細胞内での用量反応研究にて、STAT3のアンチセンス抑制を試験した。
SV−40で形質転換した肝臓上皮細胞ラインTHLE−2を、AmericanType Culture Collection(ATCC、Manassas、VA)から得、供給者の指示に従って培養した。オリゴヌクレオチド移入実験で使用するために、細胞を96−ウエルプレート内で約10、000細胞/ウエルの密度にてプレーティングした。
更なる実施態様にて、STAT3mRNA(GenBank(登録商標)受入番号NM_139276.2、本願明細書に配列番号412として組み入れる)を標的とする一連の核酸二重鎖を設計した。これらを表35に示す。表35の全化合物は、19ヌクレオチドの長さを有し、全体にホスホジエステルヌクレオシド間結合(バックボーン)を有するオリゴリボヌクレオチドである。化合物は、平滑末端を有するように調製(製造)された。表35はdsRNAのアンチセンス鎖を示し、センス鎖はアンチセンス鎖の相補体として合成した。これらの配列はウラシル(U)を含んでいるが、当業者はウラシル(U)は一般に、DNA配列においてはチミン(T)に代替されることを理解するであろう。「標的部位」は、化合物が結合する特定の標的配列上の第一(最も5’−側)ヌクレオチド番号を示す。
ヒトSTAT3を標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドを、両方とも肺癌腫細胞ラインであるA549及びH460細胞内でのアポトーシスに対する効果について試験した。
NPM−ALKトランスジェニックマウスは、自発的にT−細胞リンパ腫及び形質細胞腫瘍を発症する(Chiarle、等、Blood、2003、101、1919−1927)。従って、これらマウスを、両方ともSTAT3活性化と関連した胞性リンパ腫(ALCL)及び多発性骨髄腫のインビボモデルとして使用した。加えて、T−細胞リンパ腫及び形質細胞腫瘍からの細胞をレシピエントマウスに注入すると、レシピエントマウスに皮下腫瘍が発症する。移植したT−細胞リンパ腫及び形質細胞腫瘍は、各々、ALCL及び多発性骨髄腫の動物モデルとして働く。
恒常的に活性化されたSTAT3の存在により特徴付けられる、NPM−ALKトランスジェニックマウス由来の多発性骨髄腫細胞を、同系マウスに皮下注射した。マウスは、ISIS17152(配列番号99)又はミスマッチ対照オリゴヌクレオチド(配列番号151)を毎日皮下注射された。オリゴヌクレオチドを14日間投与した。オリゴヌクレオチドは、腫瘍の反対側に皮下注射された。腫瘍容積を二日に一回測定し、表45に示した。
STAT3のアンチセンス抑制を、そのヒトALCL細胞(TSALCL細胞、又はSU−DHL細胞、Dr.A.Lorenzana、Van Eslander Cancer Center、Gross Pointe Woods、MIより提供)における細胞の増殖及び生存に対する効果について評価した。TSALCL細胞に、電気穿孔法により0.02、0.3、1.5、3、6、12及び15μMのISIS113176(配列番号115)、又は3−塩基ミスマッチISIS129987(配列番号404)を移入した。Amaxa(登録商標)電気穿孔ユニット(AmaxaBiosystems、Gaithersburg、MD)を使用して、製造業者の指示に従い2X106細胞に電気穿孔した。24時間後、細胞を回収した。細胞生存率を不健康細胞又は死細胞のみによって取り上げられるトリパンブルー染色により評価した。ミスマッチ対照で処理した細胞内で、細胞生存率及びSTAT3タンパク質は低下しなかった。しかしながら、ISIS113176で処理した細胞では細胞生存率の用量依存的な低下が見られ、用量0.03、1.5、3、6及び12μMにおいて、対照の97%、87%、67%、60%及び29%であった。細胞生存率は、15μM用量のISIS113176を受容した細胞内では、対照の36%に低下した。細胞生存率の低下に加えて、本願明細書に記載したように実施した、処理細胞のウエスタンブロッティングにて、STAT3タンパク質発現が用量依存的に低下することが明らかとなった。
正常マウスにおける、STAT3を標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を評価した。C57Bl/6マウスに、50mg/kg用量のオリゴヌクレオチドを4週間の間、週に2回皮下注射した。投与したSTAT3アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ISIS337332、ISIS337333、ISIS345778、ISIS345781、ISIS113196、ISIS345815、ISIS345794、又はISIS345823であった。ISIS335099(GAGTATCACTATGGCTGGCC、配列番号456)はSTAT3を標的とせず、対照オリゴヌクレオチドとして使用した。対照グループとして、生理食塩水を受容する動物も使用した。各処理グループは、5匹の動物を含んでいた。処理前(Wk0)及び処理から2週間後(Wk2)及び4週間後(Wk4)の血液標本を収集した。慣習的な臨床分析により、血糖、コレステロール及びトリグリセリドを測定した。これらのデータを表48に示す。
試験の終わりに、肝臓、脾臓、脂肪パッド及び腎臓の重量を測定した。各処理グループにおける平均の肝臓重量を、表51に示す。
正常マウスの、ヒトSTAT3を標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処理は、有意な悪影響を与えなかった。
STAT3の不適切な発現及び/又は活性化は、前立腺癌、頭頸部の扁平上皮細胞癌腫、非小細胞肺癌腫及び肝細胞癌腫、多発性骨髄腫、未分化大細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、並びに非ホジキンリンパ腫を含む様々な癌と関連している。従って、STAT3を標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、固形腫瘍又は血液悪性腫瘍の患者にて評価された。処理グループは約30〜40人の患者からなる。充填期間にて、第一週にアンチセンスオリゴヌクレオチドを3回静脈内投与し、その後、アンチセンスオリゴヌクレオチドを毎週投与した。用量は、2mg/kg〜10mg/kgの範囲であった。処理応答を評価し、またバイオマーカーを測定することにより、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理による効果を評価した。多発性骨髄腫患者のバイオマーカーの例には、血清パラプロテイン、及び循環多発性骨髄腫細胞におけるアポトーシスがある。循環骨髄腫細胞にてSTAT3タンパク質及びリン酸化も測定した。
サイトカインIL6は、STAT機能の上流制御因子であり、肺癌細胞においても上方制御されていることが知られている。STAT3は腫瘍形成及び上皮細胞の生存と頻繁に関係するため、STAT3のヒト非小細胞肺癌腫細胞における役割を描写することに興味が持たれていた。そのため、細胞増殖及びアポトーシス誘導におけるSTAT3のアンチセンス抑制の効果が試験された。アッセイは記述されているように実施された(Song等、Onco遺伝子、2003、22、4150−4165)。
A549細胞での発見を拡大するために、同様の実験をH358及びH1299肺癌腫細胞にて実施した。STAT3のアンチセンス抑制は、ミスマッチ対照オリゴヌクレオチドでの処理と比較して、H358及びH1299細胞の両方でSTAT3タンパク質を消失させた。H358細胞内で、ISIS113176で処理された該細胞内でのPARP切断を証拠としたアポトーシス経路の活性化が見られたが、STAT3タンパク質の欠損にも関わらずH1299細胞内でアポトーシスの証拠は見られなかった。
多発性骨髄腫の発病には、アポトーシスを妨げる、サイトカインIL−6によるSTAT3の活性化が関与している。前立腺癌にIL−6を含むサイトカインが関与するため、前立腺癌細胞内におけるSTAT3の機能が研究された。更なる実施態様にて、STAT3のアンチセンス抑制を実施したDU145細胞のSTAT3活性、アポトーシス及び増殖を評価した。これらのアッセイに使用した手法は、Mora等(Cancer Research、2002、62、6659−6666)に詳細に記述されている。
本発明によれば、公表された配列(GenBank(登録商標)受入番号U06922、本願明細書に配列番号82として組み入れる、GenBank(登録商標)受入番号NT_039521.2のヌクレオチド12369484〜12421464の相補体、本願明細書に配列番号461として組み入れる、GenBank(登録商標)受入番号NM_213659.1、本願明細書に配列番号462として組み入れる、及びGenBank(登録商標)受入番号NM_011486.3、本願明細書に配列番号463として組み入れる)を使用して、マウスSTAT3の異なる領域を標的とする更なる一連のオリゴヌクレオチドを設計した。そのオリゴヌクレオチドを、表52に示す。“標的部位“は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的配列上の第一(最も5’側)のヌクレオアチド番号を示す。表52の全化合物は、両側(5’及び3’方向)上に5個のヌクレオチド”ウイング”が存在する、10個の2’−デオキシヌクレオチドからなる中央”ギャップ”領域を含む、20ヌクレオチドの長さを有するキメラオリゴヌクレオチド(「ギャップマー」)である。ウイングは、2’−O−メトキシエチル(2’−MOE)ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間(バックボーン)結合は、オリゴヌクレオチド全体を通してホスホロチオエート(P=S)である。全シチジン残基は、5−メチルシチジンである。
リバースプライマー:GATAGAGGACATTGGACTCTTGCA(配列番号465)
及びPCRプローブは、FAM−TTGGGTGAAATTGACCAGCAATATAGCCG−TAMRA(配列番号466)であり、ここでFAMは蛍光色素であり、TAMRAは消光色素である。
更なる実施態様にて、多発性骨髄腫発症と、多発性骨髄腫由来の腫瘍の成長とにおけるSTAT3の必要性について研究した。トランスジェニックNPM−ALK(NPM−ALK Tg)マウスは、構成的に活性化されたSTAT3によって特徴付けられる多発性骨髄腫を自発的に発症する。多発性骨髄腫の発症にSTAT3が必要か否かを決定するために、NPM−ALK TgマウスのB細胞のSTAT3遺伝子を破壊した。前述したように、マウスSTAT3遺伝子座はCreリコンビナーゼ認識部位(loxP部位)を含むように設計した(Raz等、PNAS、1999、96、2846−2851)。この改変STAT3を持つマウスとCreリコンビナーゼ導入遺伝子を持つマウスと交雑させると、Creリコンビナーゼが、loxP部位に隣接する遺伝子座部分を切除して、STAT3遺伝子座を削除(delete)する。NPM−ALKTgマウスは、条件的に破壊可能なSTAT3遺伝子を導入するように育種された。次にこれらマウスを、B系統限定CD19遺伝子の制御下でCreを発現する、CD19+特異的なCre導入遺伝子を保有するマウスと交雑させた(Rickert等、Nuc.AcidsRes.、1997、25、1317)。得られた子孫は、B−細胞特異的なSTAT3遺伝子削除を有していた。B細胞はCD19抗原で確認することができ、多発性骨髄腫の原因となる形質細胞に成熟し、これはCD19及びCD138抗原の両方の存在で確認される。
Claims (19)
- 配列番号154で示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド2971〜3140を標的とする、STAT3をコードする核酸分子と特異的にハイブリダイズし、STAT3の発現を阻害することができる長さが15〜30核酸塩基であるアンチセンス化合物。
- (a)配列番号154で示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド2983〜3127、または(b)配列番号154で示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド2983〜3066を標的とする、請求項1に記載のアンチセンス化合物。
- STAT3をコードする核酸分子と100%相補的である請求項1または2記載のアンチセンス分子。
- 少なくとも一つの修飾されたヌクレオシド間結合を有する請求項1〜3のいずれかに記載のアンチセンス化合物。
- 修飾されたヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である請求項4記載のアンチセンス化合物。
- 少なくとも一つの置換された糖部分を含む請求項1〜5のいずれかに記載のアンチセンス化合物。
- 置換された糖部分が2’−O−(2−メトキシエチル)部分または二環式糖部分である請求項6に記載のアンチセンス化合物。
- 少なくとも一つの修飾核酸塩基を含む請求項1〜7のいずれかに記載のアンチセンス化合物。
- 修飾核酸塩基が5−メチルシトシンである請求項8に記載のアンチセンス化合物。
- キメラオリゴヌクレオチドである請求項1〜9のいずれかに記載のアンチセンス化合物。
- ギャップマーである請求項10に記載のアンチセンス化合物。
- デオキシヌクレオチドを含む第1領域と、少なくとも一つの2’−O−(2−メトキシエチル)ヌクレオチドを含む、該第1領域と隣接する第2および第3領域を有するキメラオリゴヌクレオチドである請求項11に記載のアンチセンス化合物。
- 該第1領域の長さが10デオキシヌクレオチドであり、該第2および第3領域の長さがそれぞれ5ヌクレオチドである請求項12に記載のアンチセンス化合物。
- 請求項1〜13のいずれかに記載のアンチセンス化合物と医薬的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物。
- 治療または予防に用いるための請求項1〜13のいずれかに記載のアンチセンス化合物。
- 異常な炎症状態または炎症性疾患を治療または予防するのに用いるための請求項15に記載のアンチセンス化合物。
- リウマチ性関節炎を治療または予防するのに用いるための請求項16に記載のアンチセンス化合物。
- 癌を治療または予防するのに用いるための請求項15に記載のアンチセンス化合物。
- 乳癌、前立腺癌、脳もしくは頭部および頸部の癌、骨髄腫、黒色腫、白血病、またはリンパ腫からなる群より選択される癌を治療または予防するのに用いるための請求項18に記載のアンチセンス化合物。
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