ES2928654T3 - Terapia combinada con oligonucleótidos antisentido liposomales - Google Patents

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Abstract

En el presente documento se proporcionan métodos para tratar un cáncer en un paciente que comprenden la administración de una cantidad eficaz de un polinucleótido resistente a nucleasas que se hibrida con el sitio de iniciación de la traducción de un ácido nucleico Grb2 en el paciente y un inhibidor de la tirosina quinasa Bcr-Abl (por ejemplo, dasatinib) o un análogo de citidina (p. ej., decitabina o citarabina). El cáncer puede ser Ph+ y/o Bcr-Abl positivo leucemia mielógena crónica o leucemia mieloide aguda o síndrome mielodisplásico. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Terapia combinada con oligonucleótidos antisentido liposomales
La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud provisional de los Estados Unidos números 62/487.277, presentada el 19 de abril de 2017 y 62/395.680, presentada el 16 de septiembre de 2016.
Antecedentes de la invención
1. Campo de la invención
La presente invención se refiere en general al campo de la medicina. Más particularmente, se refiere al tratamiento de la leucemia mieloide aguda y el síndrome mielodisplásico con una terapia combinada que comprende oligonucleótidos antisentido dirigidos a Grb2.
2. Descripción de la técnica relacionada
La Sociedad Estadounidense del Cáncer estima que en 2015 hubo aproximadamente 6600 pacientes con un nuevo diagnóstico de leucemia mielógena crónica (LMC) en los Estados Unidos y aproximadamente 1140 muertes por LMC. La edad promedio al momento del diagnóstico de la LMC es de aproximadamente 64 años. Casi la mitad de los casos se diagnostican en personas mayores de 65 años. Este tipo de leucemia afecta principalmente a adultos y rara vez se observa en niños. La LMC se diferencia en fase crónica, acelerada y blástica. La mayoría de los pacientes con LMC son diagnosticados en la fase crónica de la enfermedad. Si los pacientes con LMC en fase crónica no reciben tratamiento, pueden progresar rápidamente a las fases acelerada y blástica de la enfermedad. El cromosoma Filadelfia (Ph) está presente en el 90 %-95 % de los pacientes con LMC. Es el resultado de la translocación de los cromosomas 9 y 22, que coloca el gen abl en el extremo 3' del gen bcr. Este reordenamiento genético está presente en todos los pacientes, incluso en aquellos en los que un cariotipo estándar no detecta el cromosoma Ph. Esta translocación cromosómica produce un gen quimérico, que se expresa como la proteína de fusión p210Bcr-Abl en células de LMC Ph+. La proteína de fusión Bcr-Abl tiene actividades de tirosina cinasa desreguladas, dando como resultado la activación de las vías de transducción de señales RAS y fosfatidilinositol-3 cinasa (PI3K), lo que conduce a la transformación maligna, la proliferación y supervivencia de las células Ph+.
Los fármacos conocidos como inhibidores de tirosina cinasa que se dirigen a la proteína de fusión Bcr-Abl son el tratamiento estándar para los pacientes con leucemia mieloide crónica. Esto se debe a que la supresión de la actividad tirosina cinasa de Bcr-Abl disminuye la proliferación y supervivencia de las células Ph+. Imatinib (Gleevec®), el inhibidor de la tirosina cinasa de primera generación, es el tratamiento estándar para pacientes con LMC en fases crónica y acelerada. Sin embargo, Los pacientes con LMC en fase blástica no responden al imatinib. Igualmente, se ha observado resistencia a imatinib en algunos pacientes con LMC en fase crónica o acelerada. Un inhibidor de la tirosina cinasa de segunda generación (p. ej., dasatinib (Das)) generalmente se administra a pacientes con LMC que no pueden tolerar el imatinib o que son resistentes al mismo. Pero los pacientes con LMC no responderán al imatinib ni a los inhibidores de tirosina cinasa de segunda generación si la proteína de fusión Bcr-Abl adopta la mutación del gen T315I. Existe la necesidad de desarrollar terapias más eficaces para los pacientes con leucemia mieloide crónica, que se encuentran en fase acelerada o blástica, o que son resistentes a los inhibidores de tirosina cinasa.
Sumario de la invención
Las referencias a métodos de tratamiento en los párrafos posteriores de esta descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico). La invención se define en las reivindicaciones.
Un aspecto no reivindicado de esta divulgación se refiere a métodos para tratar un cáncer en un paciente que lo necesite, que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de una primera terapia farmacéutica que comprende un polinucleótido resistente a nucleasas que se hibrida con un ácido nucleico de Grb2 en el paciente y una segunda terapia farmacéutica que comprende un inhibidor de la tirosina cinasa Bcr-Abl. En algunos aspectos no reivindicados, en el presente documento se proporcionan composiciones para usar en el tratamiento de un cáncer en un paciente que lo necesite, comprendiendo dichas composiciones una primera terapia farmacéutica que comprende un polinucleótido resistente a nucleasas que se hibrida con un ácido nucleico de Grb2 en el paciente y una segunda terapia farmacéutica que comprende un inhibidor de la tirosina cinasa Bcr-Abl.
En algunos aspectos no reivindicados, el inhibidor de la tirosina cinasa Bcr-Abl es dasatinib, imatinib, nilotinib, bosutinib, ponatinib o bafetinib, en particular dasatinib. El dasatinib se puede administrar a una dosis de aproximadamente 140 mg. El dasatinib se puede administrar una vez al día.
En algunos aspectos, la segunda terapia farmacéutica se administra sistémicamente. En algunos aspectos, la segunda terapia farmacéutica se administra por vía oral, por vía intraarterial o intravenosa.
En algunos aspectos, el paciente es un ser humano. En algunos aspectos, el paciente no ha respondido previamente al tratamiento con imatinib.
En algunos aspectos no reivindicados, el cáncer es cáncer colorrectal, neuroblastoma, cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de cerebro, cáncer de pulmón, cáncer de estómago, un neoplasia hemática, cáncer de piel, cáncer de testículos, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de hígado o cáncer de esófago, cáncer de cuello uterino, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de piel no melanoma o glioblastoma. En algunos aspectos, el cáncer es una neoplasia hemática seleccionada de una leucemia mieloide aguda (LMA) o un síndrome mielodisplásico (SMD). En algunos aspectos, la LMA es LMA Bcr-Abl positivo. En algunos aspectos, la LMA Bcr-Abl positivo es positivo para una mutación T315I Bcr-Abl. En algunos aspectos, la LMA es una lMa con cromosoma Filadelfia positivo.
En una realización, en el presente documento se proporcionan métodos para tratar la LMA o el síndrome mielodisplásico (SMD) en un paciente que lo necesite, que comprenden administrar al paciente una cantidad eficaz de una primera terapia farmacéutica que comprende un polinucleótido resistente a nucleasas que se hibrida con un ácido nucleico de Grb2 y una segunda terapia farmacéutica que comprende decitabina como análogo de citidina. En algunos aspectos, las composiciones se proporcionan en el presente documento para su uso en el tratamiento de la LMA o el síndrome mielodisplásico (SMD) en un paciente que lo necesite, comprendiendo dichas composiciones una cantidad eficaz de una primera terapia farmacéutica que comprende un polinucleótido resistente a nucleasas que se hibrida con un ácido nucleico de Grb2 y una segunda terapia farmacéutica que comprende decitabina como análogo de citidina.
En algunos aspectos, el polinucleótido se hibrida con el sitio de iniciación de la traducción de un ácido nucleico de Grb2. En algunos aspectos, el polinucleótido es un oligonucleótido que tiene una longitud de 8-50 bases. En algunos aspectos, el polinucleótido tiene una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, el polinucleótido comprende enlaces del esqueleto P-etoxi.
En algunos aspectos, el polinucleótido está encapsulado en un liposoma. En algunos aspectos, la primera terapia farmacéutica comprende además un lípido neutro. En algunos aspectos, la primera terapia farmacéutica es BP1001. En algunos aspectos, la primera terapia farmacéutica se administra sistémicamente. En algunos aspectos, la primera terapia farmacéutica está formulada para administración intraarterial o intravenosa. En algunos aspectos, la primera terapia farmacéutica se administra a una dosis de aproximadamente 60 mg/m2 y a aproximadamente 90 mg/m2. En algunos aspectos, la primera terapia farmacéutica se administra de dos a cuatro veces por semana.
En un aspecto, el análogo de citidina es decitabina. En un aspecto no reivindicado, el análogo de citidina es citarabina; la citarabina se puede administrar a una dosis de aproximadamente 20 mg y se puede administrar dos veces al día. La citarabina se puede administrar por vía subcutánea.
En algunos aspectos, la primera terapia farmacéutica se administra antes de la administración de la segunda terapia farmacéutica. En algunos aspectos, la primera terapia farmacéutica y la segunda terapia farmacéutica se administran simultáneamente. En algunos aspectos, la segunda terapia farmacéutica se administra antes de la administración de la primera terapia farmacéutica. En algunos aspectos, la primera terapia farmacéutica y la segunda terapia farmacéutica se administran por vías distintas.
En algunos aspectos, el paciente es un ser humano.
En algunos aspectos no reivindicados, el cáncer es cáncer colorrectal, neuroblastoma, cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de cerebro, cáncer de pulmón, cáncer de estómago, un cáncer de piel, cáncer de testículos, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de hígado o cáncer de esófago, cáncer de cuello uterino, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de piel no melanoma o glioblastoma. En algunos aspectos, el cáncer es una neoplasia hemática seleccionada de una leucemia mieloide aguda (LMA) o un síndrome mielodisplásico (SMD). En algunos aspectos, la LMA es LMA Bcr-Abl positivo. En algunos aspectos, la LMA Bcr-Abl positivo es positivo para una mutación T315I Bcr-Abl. En algunos aspectos, la LMA es una LMA con cromosoma Filadelfia positivo.
En una realización, se proporcionan composiciones que comprenden una población de oligonucleótidos que se hibridan con un producto génico polinucleótido GRB2. En algunos aspectos, los oligonucleótidos de la población están compuestos por moléculas de nucleósidos unidas entre sí a través de enlaces del esqueleto fosfato, en donde al menos uno de los enlaces del esqueleto fosfato en cada oligonucleótido es un enlace del esqueleto P-etoxi, y en donde no más del 80 % de los enlaces del esqueleto fosfato en cada oligonucleótido son enlaces del esqueleto P-etoxi. En algunos aspectos, al menos uno de los enlaces del esqueleto fosfato en cada oligonucleótido es un enlace del esqueleto fosfodiéster. En algunos aspectos, los oligonucleótidos de la población comprenden una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1. En varios aspectos, los oligonucleótidos de la población inhiben la expresión de la proteína Grb2. En algunos aspectos, la composición está liofilizada.
En algunos aspectos, del 10 % al 80 % de los enlaces del esqueleto fosfato son enlaces del esqueleto P-etoxi; del 20 % al 80 % de los enlaces del esqueleto fosfato son enlaces del esqueleto P-etoxi; del 30 % al 80 % de los enlaces del esqueleto fosfato son enlaces del esqueleto P-etoxi; del 40 % al 80 % de los enlaces del esqueleto fosfato son enlaces del esqueleto P-etoxi; del 50 % al 80 % de los enlaces del esqueleto fosfato son enlaces del esqueleto P-etoxi; o del 60 % al 70 % de los enlaces del esqueleto fosfato son enlaces del esqueleto P-etoxi, o cualquier intervalo derivable de los mismos. En algunos aspectos, del 20 % al 90 % de los enlaces del esqueleto fosfato son enlaces del esqueleto fosfodiéster; del 20 % al 80 % de los enlaces del esqueleto fosfato son enlaces del esqueleto fosfodiéster; del 20 % al 70 % de los enlaces del esqueleto fosfato son enlaces del esqueleto fosfodiéster; del 20 % al 60 % de los enlaces del esqueleto fosfato son enlaces del esqueleto fosfodiéster; del 20 % al 50 % de los enlaces del esqueleto fosfato son enlaces del esqueleto fosfodiéster; o del 30 % al 40 % de los enlaces del esqueleto fosfato son enlaces del esqueleto fosfodiéster, o cualquier intervalo derivable de los mismos. En varios aspectos, al menos el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, o 95 %, o cualquier valor intermedio, de los enlaces del esqueleto fosfato son enlaces del esqueleto P-etoxi. En varios aspectos, como máximo el 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, o 95 %, o cualquier valor intermedio, de los enlaces del esqueleto fosfato son enlaces del esqueleto fosfodiéster. En determinados aspectos, los enlaces del esqueleto fosfodiéster se distribuyen a lo largo de los oligonucleótidos. Como tales, los oligonucleótidos no son moléculas quiméricas. En algunos aspectos, los oligonucleótidos no comprenden un enlace del esqueleto fosforotioato.
En algunos aspectos, los oligonucleótidos de la población tienen un tamaño que oscila de 7 a 30 nucleótidos. En determinados aspectos, los oligonucleótidos de la población tienen un tamaño que oscila de 12 a 25 nucleótidos. En varios aspectos, los oligonucleótidos de la población tienen un tamaño de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos. El intervalo de tamaño puede ser un tamaño promedio de los oligonucleótidos en la población.
En algunos aspectos, los oligonucleótidos de la población tienen un tamaño promedio de 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos, en donde no más de 5, 6, 7, 8, 8, 9, 10, 11, 11, 12, 13, 14, 15, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 20, 21,22, 23, o 24, respectivamente, de los enlaces del esqueleto fosfato en cada oligonucleótido es un enlace del esqueleto P-etoxi. En algunos aspectos, los oligonucleótidos de la población tienen un tamaño promedio de 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos y al menos 2, 2, 2, 2, 3, 3, 3, 3, 4, 4, 4, 4, 4, 5, 5, 5, 5, 5, 5, 6, 6, 6, 6 o 6, respectivamente, de los enlaces del esqueleto fosfato en cada oligonucleótido es un enlace del esqueleto fosfodiéster.
En algunos aspectos, la población de oligonucleótidos comprende una única especie de oligonucleótidos. En otros aspectos, la población de oligonucleótidos comprende al menos dos especies de oligonucleótidos. Una sola especie de oligonucleótido puede tener la misma secuencia de nucleótidos pero tener o carecer de enlaces P-etoxi en diferentes posiciones dentro de la molécula. Como tal, la población puede ser homogénea en cuanto a la secuencia de nucleótidos y heterogénea en cuanto a la distribución de los enlaces del esqueleto fosfodiéster entre los oligonucleótidos de la población. Además, la población puede ser heterogénea en cuanto al número de enlaces del esqueleto P-etoxi y enlaces del esqueleto fosfodiéster entre los oligonucleótidos de la población. Como un ejemplo no limitativo, una primera parte de los oligonucleótidos de la población puede tener un 70 % de enlaces P-etoxi y un 30 % de enlaces fosfodiéster, mientras que una segunda parte de los oligonucleótidos de la población puede tener un 60 % de enlaces P-etoxi y un 40 % de enlaces fosfodiéster. En algunos aspectos, la población de oligonucleótidos comprende oligonucleótidos antisentido, ARN de interferencia cortos (ARNic), microARN (miARN) o piwiARN (piARN).
En varios aspectos, la composición comprende además fosfolípidos. En algunos aspectos, los fosfolípidos y los oligonucleótidos están presentes en una proporción molar de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 100:1. En algunos aspectos, los oligonucleótidos y los fosfolípidos forman un complejo oligonucleótido-lípido, tal como, por ejemplo, un complejo de liposomas. En algunos aspectos, al menos el 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de los liposomas tienen menos de 5 micrómetos de diámetro. En algunos aspectos, la población de oligonucleótidos se incorporan en la población de liposomas.
En algunos aspectos, los fosfolípidos no tienen carga o tienen una carga neutra a pH fisiológico. En algunos aspectos, los fosfolípidos son fosfolípidos neutros. En determinados aspectos, los fosfolípidos neutros son las fosfatidilcolinas. En determinados aspectos, los fosfolípidos neutros son dioleoilfosfatidilcolina. En algunos aspectos, los fosfolípidos están prácticamente exentos de colesterol.
En una realización, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden una composición de oligonucleótidos y fosfolípidos de las presentes realizaciones y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunos aspectos, la composición comprende además un agente quimioterapéutico.
En un aspecto no reivindicado, se proporcionan métodos para reducir el nivel de expresión de la proteína Grb2 en una célula que comprende poner en contacto la célula con una composición de oligonucleótidos de las presentes realizaciones. En algunos aspectos, la célula es una célula de mamífero. En algunos aspectos, la célula es una célula cancerosa.
En un aspecto no reivindicado, se proporcionan métodos para administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un oligonucleótido a una célula que comprende poner en contacto la célula con una composición farmacéutica de las presentes realizaciones. En algunos aspectos, el método es un método para tratar la hiperplasia, el cáncer, una enfermedad autoinmunitaria o una enfermedad infecciosa.
En un aspecto no reivindicado, se proporcionan métodos para tratar a un sujeto con una enfermedad autoinmunitaria o una enfermedad infecciosa que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica de las presentes realizaciones. En algunos aspectos, el sujeto es un ser humano. En algunos aspectos no reivindicados, el cáncer es un cáncer de vejiga, sangre, linfoma, páncreas, huesos, médula ósea, cerebro, mama, colon, esófago, estómago, cabeza y cuello, riñón, hígado, pulmón, próstata, piel, testículos, lengua, ovario o de útero. Los tumores incluyen, pero sin limitación, melanoma, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer mamario, cáncer de células escamosas de cabeza y cuello, carcinoma de células renales papilares, cáncer de vesícula biliar, cáncer rectal, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de colon, glioma, astrocitoma, linfoma de Hodgkin clásico y tumores del músculo liso, así como células de glioblastoma, células madre de la médula ósea, células hematopoyéticas, osteoblastos, células epiteliales, fibroblastos, así como cualquier otra célula tumoral que sufra apoptosis e induzca resistencia o regresión de las células tumorales. En algunos aspectos no reivindicados, la enfermedad autoinmunitaria es lupus eritematoso, espondiloartropatía, enfermedad de Sjogren, enfermedad de Crohn, diabetes mellitus, esclerosis múltiple o artritis reumatoide. En algunos aspectos, la enfermedad infecciosa es una infección bacteriana, infección fúngica, infección viral o infección parasitaria. En algunos aspectos, la composición se administra por vía subcutánea, intravenosa o intraperitoneal. En algunos aspectos, el método comprende además administrar al menos una segunda terapia anticancerosa al sujeto. En algunos aspectos, la segunda terapia anticancerosa es una terapia quirúrgica, quimioterapia, radioterapia, crioterapia, terapia hormonal, inmunoterapia o terapia con citocinas. En algunos aspectos, la administración de la composición reduce la expresión de la proteína Grb2 en el paciente.
"Entrampar", "encapsular", e "incorporar" se refiere al lípido o liposoma que forma un impedimento para la difusión libre en la solución mediante una asociación con o aproximadamente un agente de interés, p. ej., un liposoma puede encapsular un agente dentro de una capa lipídica o dentro de un compartimento acuoso dentro o entre capas lipídicas. En ciertas realizaciones, la composición comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable. El vehículo farmacéuticamente aceptable puede formularse para su administración a un sujeto o paciente humano. En ciertas realizaciones, el componente lipídico tiene una carga prácticamente neutra porque comprende un fosfolípido neutro o una carga neta neutra. En ciertos aspectos, un fosfolípido neutro puede ser una fosfatidilcolina, tal como DOPC, fosfatidilcolina de huevo ("EPC"), dilauroilfosfatidilcolina ("DLpC"), dimiristoilfosfatidilcolina ("DMPC"), dipalmitoilfosfatidilcolina ("DPPC"), diestearoilfosfatidilcolina ("DSpC"), dilinoleoilfosfatidilcolina, 1,2-diaraquidoil-sn-glicero-3-fosfocolina ("DAPC"), 1,2-dieicosenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DEPC), 1 -miristoil-2-palmitoil fosfatidilcolina ("MPPC"), 1 -palmitoil-2-miristoil fosfatidilcolina ("PMPC"), l-palmitoil-2-estearoil fosfatidilcolina ("PSPC"), l-estearoil-2-palmitoil fosfatidilcolina ("SPPC"), 1 -palmitoil-2-oleoil fosfatidilcolina ("POPC"), 1 -oleoil-2-palmitoil fosfatidilcolina ("OPPC") o lisofosfatidilcolina. En otros aspectos, el fosfolípido neutro puede ser una fosfatidiletanolamina, tal como dioleoilfosfatidil-etanolamina ("DOPE"), diestearoilfosfatidiletanolamina ("DSPE"), dimiristoilfosfatidiletanolamina ("DMPE"), dipalmitoilfosfatidiletanolamina ("DPPE"), palmitoiloleoil fosfatidiletanolamina ("POPE"), o lisofosfatidiletanolamina. En ciertas realizaciones, el componente de fosfolípido puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más clases o tipos de fosfolípido neutro. En otras realizaciones, un componente de fosfolípido puede comprender 2, 3, 4, 5, 6 o más clases o tipos de fosfolípidos neutros.
En ciertas realizaciones, un componente lipídico puede tener una carga prácticamente neutra porque comprende un lípido con carga positiva y un lípido con carga negativa. El componente lipídico puede comprender además uno o más lípidos o fosfolípidos con carga neutra. El lípido con carga positiva puede ser un fosfolípido con carga positiva. El lípido con carga negativa puede ser un fosfolípido con carga negativa. El fosfolípido con carga negativa puede ser una fosfatidilserina, tal como dimiristoil fosfatidilserina ("DMPS"), dipalmitoilfosfatidilserina ("DPPS") o fosfatidilserina cerebral ("BPS"). El fosfolípido con carga negativa puede ser un fosfatidilglicerol, tal como dilauroilfosfatidilglicerol ("DLPG"), dimiristoilfosfatidilglicerol ("DMPG"), dipalmitoilfosfatidilglicerol ("DPPG"), diestearoilfosfatidilglicerol ("DSPG") o dioleoilfosfatidilglicerol ("DOPG"). En ciertas realizaciones, la composición comprende además colesterol o polietilenglicol (PEG). En otras realizaciones, la composición está prácticamente exenta de colesterol. En ciertas realizaciones, un fosfolípido es un fosfolípido de origen natural. En otras realizaciones, un fosfolípido es un fosfolípido sintético.
Los liposomas pueden estar formados por uno o más fosfolípidos, siempre que el material lipídico esté sustancialmente descargado. Es importante que la composición esté prácticamente exenta de fosfolípidos aniónicos y catiónicos y colesterol. Los fosfolípidos adecuados incluyen fosfatidilcolinas y otros que son bien conocidos por los expertos en este campo.
Como se usa en el presente documento, "prácticamente exento", en términos de un componente específico, se usa en el presente documento para decir que ninguno de los componentes especificados se ha formulado a propósito en una composición y/o está presente solo como contaminante o en cantidades traza. Por consiguiente, la cantidad total del componente especificado resultado de cualquier contaminación involuntaria de una composición es muy inferior al 0,05 %, preferentemente inferior al 0,01 %. Lo más preferido es una composición en la que no puede detectarse ninguna cantidad del componente especificado con métodos analíticos convencionales.
Como se usa en el presente documento en la memoria descriptiva, "un" o "uno/una" pueden significar uno o más. Como se usa en el presente documento en la reivindicación o reivindicaciones, cuando se usa junto con la expresión "que comprende", las palabras "un" o "uno/una" pueden significar uno o más de uno.
El uso del término "o" en las reivindicaciones se usa en el sentido de "y/o", a menos que se indique explícitamente que se refiere solo a alternativas o que las alternativas sean mutuamente excluyentes, aunque la divulgación respalde una definición que se refiere solo a alternativas e "y/o". Como se usa en el presente documento, "otro" puede significar al menos un segundo o más.
A lo largo de la presente solicitud, el término "aproximadamente" se usa para indicar que un valor incluye la variación inherente del error para el dispositivo, empleándose el método para determinar el valor o la variación que existe entre los sujetos de estudio.
Otros objetos, características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada.
Breve descripción de los dibujos
Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente determinados aspectos de la presente invención. La invención puede comprenderse mejor por referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de realizaciones específicas presentadas en el presente documento.
FIG. 1. Concentración de oligo antisentido de Grb2 en el plasma de los pacientes. Los niveles de BP1001 en plasma disminuyeron biexponencialmente. Las líneas continuas representan dosis de 60 mg/m2; las líneas discontinuas representan dosis de 90 mg/m2.
FIG. 2. BP1001 dosis bajas de Ara-C disminuyó los blastos en la médula ósea en pacientes con LMA resistente/recidivante.
FIG. 3. Esquema del diseño del estudio.
FIG. 4. Diagrama que ilustra el papel crítico de GRB2 en la transmisión de señales de tirosina cinasa.
FIGURAS 5A-B. Inhibición selectiva de la producción de proteínas Grb2. Se incubaron células BV173 (FIG. 5A) y ALL-1 (FIG. 5B) con 4 a 8 |jM de oligos antisentido L-Grb2 y oligos L-control. Después de tres días de cultivo, se prepararon capas que contenían proteínas y se sometieron a SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las transferencias se cortaron en cortes y se incubaron con anticuerpos específicos para la proteína Grb2 (diana) o Crk1 (control).
FIGURAS 6A-B. Actividad de BP1001 en modelos de ratón de leucemia. La FIG. 6A muestra el tratamiento de ratones que albergan xenoinjertos de leucemia positivos para 32Dp210 BCR-ABL con 15 mg/kg/dosis de BP1001. La FIG. 6B muestra el tratamiento de ratones que albergan células de leucemia positivas para 32Dp210 BCR-ABL con 5, 10 o 15 mg/kg/dosis de BP1001.
FIGURAS 7A-C. Efecto del momento y la secuenciación de la administración de BP1001 y dasatinib. La FIG. 7A muestra 1 h de pretratamiento con BP1001 antes de la dosificación con dasatinib. La FIG. 7B muestra un pretratamiento de 1 día con dasatinib antes de la dosificación con BP1001. La FIG. 7C muestra un pretratamiento de 1 día con BP1001 antes de la dosificación con dasatinib.
FIGURAS 8A-D. BP1001 mejora la inducción de la muerte celular con dasatinib. La FIG. 8A muestra el porcentaje de células en la fase sub-G1. La FIG. 8B muestra el porcentaje de células en la fase G1. La FIG. 8C muestra el porcentaje de células en la fase S. La FIG. 8D muestra el porcentaje de células en la fase G2/M.
FIGURAS. 9A-B. El pretratamiento con BP1001 mejora la inducción de la muerte celular con dasatinib y nilotinib. La FIG. 9A muestra los porcentajes de células en la fase sub-G1 tras el pretratamiento con BP1001. La FIG. 9B muestra los porcentajes de células en la fase sub-G1 después del pretratamiento con un inhibidor de tirosina cinasa.
DESCRIPCIÓN DE REALIZACIONES ILUSTRATIVAS
I. Proteína de unión al receptor del factor de crecimiento 2 (Grb2)
El gen grb2 se ha mapeado en la región del cromosoma humano 17q22-qter, una región que está duplicada en las leucemias, lo que puede dar como resultado un aumento del número de copias del producto génico grb2. Como Grb2 es importante para la transformación de células hematopoyéticas murinas y la proliferación de células de leucemia humana que expresan altos niveles de tirosina cinasas oncogénicas, la inhibición de Grb2 puede tener un impacto significativo en la historia natural de las leucemias.
Grb2 enlaza las tirosina cinasas oncogénicas con sus moléculas de señalización posteriores, tales como ERK y AKT, que son reguladores críticos de la proliferación y supervivencia celular. La proteína adaptadora Grb2 contiene un dominio de homología Src 2 (SH2), flanqueado por dos dominios de homología Src 3 (SH3). Grb2 usa su dominio SH2 para unirse a los residuos de fosfotirosina que se encuentran en las tirosina cinasas activadas, tales como Bcr-Abl, c-Cbl y el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), mientras que usa sus dominios SH3 para unirse a motivos ricos en prolina, tales como los que se encuentran en el factor de intercambio de nucleótidos de guanina, Son of Sevenless (SOS). RAS, una proteína GTPasa, se activa cuando se une a GTP y se inactiva cuando se une a GDP. Los factores de intercambio de nucleótidos de guanina, tales como SOS, aumentan el intercambio de GDP por GTP en RAS. Tras la estimulación del factor de crecimiento, el complejo Grb2-SOS es reclutado a la membrana plasmática, donde usa su dominio SH2 para unirse a los receptores de tirosina cinasa estimulados por el factor de crecimiento. Esta unión permite que SOS esté muy cerca de RAS, que se localiza en la membrana plasmática. Por lo tanto, es capaz de estimular la actividad de RAS. La activación de RAS, a su vez, activará múltiples vías de señalización posteriores importantes para la regulación de diversos procesos celulares (Tari, 2001a).
La vía de señalización de RAS más conocida es la cascada de cinasas de proteínas activadas por mitógenos (MAP). En esta cascada, RAS se une a RAF de manera dependiente de GTP. Esta unión conduce a la activación de RAF. RAF activada fosforila MEK (proteína cinasa cinasa activada por mitógenos), que a su vez fosforila y activa ERK1,2 (cinasas reguladas extracelulares 1,2). ERK1,2 activada se transloca a continuación al núcleo y activa la transcripción mediante la fosforilación de factores de transcripción (p. ej., ELK-1 y MYC). La FIG. 4 ilustra la vía de señalización de Grb2. Al igual que el oncogén Bcr-Abl, el protooncogén c-Cbl se fosforila constitutivamente en tirosina en las células de LMC. Grb2 puede mediar en las vías dirigidas por c-CBL en las células de LMC porque se ha demostrado que Grb2 forma complejos estables con c-Cbl. Esta interacción puede dar como resultado la transformación maligna de las células progenitoras mieloides.
Al inhibir Grb2, el complejo Grb2-SOS ya no es capaz de intercambiar GDP por GTP en RAS. Por lo tanto, se produce una regulación a la baja de la cascada de mAp cinasa y su transcripción resultante (Tari 2001a).
II. Inhibición de la expresión del gen Grb2
Se han investigado múltiples estrategias para inhibir la función de Grb2. Una estrategia consiste en clonar una forma de corte y empalme alternativo de Grb2, que tiene un dominio SH2 no funcional eliminado (Fath, 1994). La proteína Grb3-3 codificada no se unirá al EGFR fosforilado porque los residuos eliminados son parte integral de la unión de Grb2 a los residuos de fosfotiosina; sin embargo Grb3-3 sí lo hace, retiene los dominios SH3 funcionales. Por lo tanto, Grb3-3 puede competir con Grb2 en la unión de factores de intercambio de nucleótidos de guanina. En un estudio de Fath et al. (1994), la microinyección de Grb3-3 en fibroblastos Swiss 3T3 los indujo a sufrir apoptosis. Estos clones están diseñados para competir con Grb2 en la unión de factores de intercambio de nucleótidos de guanina.
Una segunda estrategia utiliza inhibidores de molécula pequeña para evitar la unión de los receptores del factor de crecimiento al dominio GRb2 SH2 (Gay, 1999). Estos inhibidores de SH2 Grb2 de molécula pequeña se han diseñado utilizando modelos moleculares, basándose en estructuras de rayos X de Grb2, formando complejos con ligandos de fosfopéptidos que contienen el motivo Tyr-X-Asn-X. Estos inhibidores contienen elementos capaces de reconocer y unirse selectivamente al dominio SH2 de Grb2. El objetivo de estos inhibidores es revertir la transformación oncogénica y prevenir la motilidad celular inducida por el factor de crecimiento (Gay, 1999).
Una tercera estrategia implica el uso de fosfopéptidos de unión a Grb2 (Williams, 1997). El tratamiento de las células con fosfopéptidos de unión a Grb2 permeables a las células da como resultado su asociación con Grb2 y la inhibición de la unión del receptor del factor de crecimiento a Grb2 (Williams, 1997). Esto puede detener la mitogénesis estimulada por el factor de crecimiento.
La cuarta, la inhibición de la expresión de Grb2 puede lograrse con el uso de oligonucleótidos antisentido complementarios a regiones específicas del ARNm de Grb2. Cuando los oligonucleótidos antisentido se unen al ARNm diana, se forma un híbrido ADN-ARN. La formación de híbridos inhibe la traducción del ARNm y, por lo tanto, la expresión de la proteína codificada. Si la proteína Grb2 es esencial para la proliferación de la célula, su inhibición puede conducir a la supresión del crecimiento. La inhibición de la expresión de Grb2 también puede superar la resistencia a los fármacos y promover la apoptosis inducida por la quimioterapia en las células cancerosas.
MI. Terapia antisentido con oligonucleótido P-etoxi contra Grb2 y su actividad inhibidora contra la LMC y la LMA
La proteína de unión al receptor del factor de crecimiento 2 (Grb2) es utilizada por las tirosina cinasas oncogénicas, tales como Bcr-Abl, para activar la vía Ras. Grb2 es requerida por Bcr-Abl para transformar fibroblastos e inducir enfermedades similares a la leucemia en ratones. BP1001, un oligodesoxinucleótido (oligo) antisentido incorporado en liposomas específico del ARNm de grb2, fue desarrollado para bloquear la expresión de Grb2. La secuencia de ADNc contigua de Grb2 se proporciona en la SEQ ID NO: 2 y la secuencia de la proteína Grb2 se proporciona en la SEQ ID NO: 3.
La estrategia empleada en este ensayo para inhibir Grb2 es utilizar oligonucleótidos antisentido resistentes a nucleasas, incorporados en liposomas, específicos del ARNm de Grb2. El fármaco oligonucleótido antisentido en BP1001 es un análogo fosfodiéster resistente a nucleasas que contiene un esqueleto P-etoxi. Esta estructura fue la elegida en lugar de un esqueleto de fosforotioato, porque carece de un resto de azufre. El resto de azufre del esqueleto de fosforotioato se ha asociado con una diátesis hemorrágica.
La secuencia de oligonucleótidos que se utiliza es: 5'-ATATTTGGCGATGGCTTC-3' (SEQ ID NO: 1), y es específica del sitio de iniciación de la traducción del ARNm de Grb2 humana, impidiendo de este modo la producción de proteína Grb2. Se ha demostrado que este antisentido inhibe la expresión de Grb2 y el crecimiento celular en células leucémicas positivas para Bcr-Abl, así como en células de cáncer de mama que expresan altos niveles de HER2/neu o EGFR (Figuras 5A-B).
BP1001 es un liposoma neutro que incorpora oligos antisentido P-etoxi hidrófobos con resistencia a las nucleasas dirigidos al ARNm de Grb2. En los estudios preclínicos, BP1001 fue eficaz para inducir la inhibición del crecimiento y disminuir la fosforilación de ERK1,2 y Akt en líneas celulares de LMC sensibles a imatinib y resistentes a imatinib. Además, se demostró que BP1001 inhibe selectivamente la producción de proteína Grb2 en líneas celulares leucémicas Ph+ BV173 y ALL-1, y también inhibe la proliferación de líneas celulares leucémicas Bcr-Abl+ (ALL-1, células BV173 y K562) (Tabla 16).
Tabl 1 . Inhi i i n l r lif r i n lín l l r l mi r BP1 1
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* Línea celular de leucemia Ph negativa (Bcr-Abl negativa)
La inhibición de la expresión de la proteína Grb2 condujo a la inhibición del crecimiento celular en líneas celulares Bcr-Abl+ derivadas de pacientes con leucemia Ph+, lo que demuestra que Grb2 juega un papel funcional en la proliferación celular inducida por Bcr-Abl y, por lo tanto, un papel vital en el mantenimiento del potencial tumorigénico de las leucemias Ph+. Estos resultados muestran que la regulación a la baja de la proteína Grb2 puede conducir a la inhibición del crecimiento celular regulado por la Bcr-Abl tirosina cinasa.
BP1001 fue eficaz para aumentar la supervivencia de ratones NOD/SCID portadores de xenoinjertos de leucemia positivos para Bcr-Abl (Tari, 2007). Los estudios han demostrado una respuesta antitumoral a este agente en ratones inyectados con células de leucemia positivas para 32Dp210 Bcr-Abl que posteriormente fueron tratados con BP1001.
En un estudio, los ratones inyectados con células de leucemia positivas para 32Dp210 Bcr-Abl se trataron con BP1001 (15 mg/kg/dosis) o control (liposomas de DOPC vacíos) por vía intravenosa comenzando un día después de la inyección de células tumorales, dos veces por semana durante un máximo de 6 semanas. Los ratones se observaron diariamente para determinar la mortandad/morbilidad. Todos los ratones supervivientes fueron sacrificados el día 40. En ratones inyectados con células de leucemia positivas para 32Dp210 Bcr-Abl, el 60 % de los ratones tratados con BP1001 sobrevivió hasta 40 días (final del estudio) en comparación con el 17 % de los ratones que recibieron liposomas vacíos. La duración media de la supervivencia en estos animales tratados fue de 31,6 ± 13,1 días en comparación con 23,7 ± 8,3 días en el grupo de liposomas vacíos (FIG. 6A).
En un segundo estudio en ratones inyectados con células de leucemia positivas para 32Dp210 Bcr-Abl, los grupos de tratamiento recibieron BP1001 a 5, 10 o 15 mg/kg/dosis administrado por vía intravenosa comenzando un día después de la inyección de células tumorales, dos veces por semana durante un máximo de 7 semanas. Los grupos de control recibieron liposomas de DOPC que contenían un oligonucleótido de secuencia aleatoria (15 mg/kg/dosis) con el mismo esquema. Los ratones se observaron diariamente para determinar la mortandad/morbilidad. Los ratones supervivientes de los grupos de control se sacrificaron el día 41 y los de los grupos de tratamiento el día 48. A un nivel de dosis de 15 mg/kg/dosis, el 80 % de los ratones tratados con BP1001 sobrevivieron hasta los 48 días (final del estudio), en comparación con el 0 % de ratones que recibieron 15 mg/kg/dosis de oligonucleótido de control liposomal (FIG. 6B). La duración media de la supervivencia fue de 44,2 ± 8,5 frente a 20,4 ± 7,9 días en estos grupos, respectivamente. La duración media de la supervivencia en ratones tratados con 5 o 10 mg/kg/dosis de BP1001 fue de 20,8 ± 4,7 y 22,2 ± 8,7 días, respectivamente. Los resultados indicaron que el tratamiento con BP1001 dos veces por semana a un nivel de dosis de 15 mg/kg/dosis aumentó la supervivencia en ratones inducidos con LMC positiva para 32Dp210 Bcr-Abl en comparación con el tratamiento con oligonucleótidos de control.
Además, en un ensayo de fase I se observó una reducción significativa de los blastos periféricos en un paciente con LMC (del 81 % al 5 %) después de recibir cuatro perfusiones de BP1001. El paciente sufría una crisis blástica de la LMC, caracterizada por la mutación T315I. Estos datos sugieren que Grb2 juega un papel fundamental en la progresión de la LMC. Adicionalmente, los estudios preclínicos indican que el tratamiento previo con BP1001 mejora la citotoxicidad de la citarabina en las células de leucemia mieloide aguda (LMA).
IV. Farmacología y toxicología de BP1001
A. Estudios farmacocinéticos en ratas
Se realizaron estudios farmacocinéticos de BP1001 en ratas después de la administración intravenosa (i.v.) (Tari, 2007). Ratas Lewis (n = 5, 400 g) se sometieron a canulación de la arteria femoral derecha y la vena femoral izquierda y se les inyectó por vía i.v. con BP1001 marcado radiactivamente (32P) a una dosis de 10 mg de oligonucleótido por kg de peso corporal. Se recogió sangre (0,3 ml) de la arteria femoral derecha a los 5, 10, 20, 30, 60, 90, 120, 180 y 240 minutos después de la inyección. Después de cada extracción, el catéter se enjuagó con heparina sódica 1:1000 (unidades/ml). Se extrajeron muestras de sangre completa y se analizó la radiactividad del P32 por centelleo líquido como se ha descrito previamente (Tari, 1998; Gutierrez-Puente, 1999). Los parámetros farmacocinéticos se determinaron mediante análisis de regresión no lineal (Rstrip; Micro Math, Inc., Salt Lake City, UT). Los datos de concentración de fármaco en sangre completa se ajustaron mejor a un modelo de dos compartimentos. Se observó que la eliminación de BP1001 de la sangre se ajustaba perfectamente a un modelo matemático de dos compartimentos (correlación r2 > 0,98). La fase de distribución inicial ocurrió durante los primeros 6 min después de la inyección (t1/2a = 5,16 ± 0,3 minutos). La semivida de la fase terminal (t-î p) fue de 225,6 ± 13,2 min. El volumen de distribución aparente inmediato (36,42 ± 1,88 ml) fue mayor que el volumen de sangre total para ratas de este tamaño. El área bajo la curva de concentración (AUC) fue de 5,4 ± 0,9 mg/ml x min, mientras que el tiempo de residencia fue de 309,6 ± 21,5 minutos. La distribución farmacocinética de BP1001 y el alto volumen de distribución observados en este estudio fueron similares a los descritos para otros oligonucleótidos P-etoxi incorporados en liposomas investigados previamente (Tari, 1998; Gutierrez-Puente, 1999).
B. Estudios de distribución en tejidos de BP1001 en ratones
Se realizaron estudios de distribución en tejidos de BP1001 en ratones después de la administración i.v. Veinte ratones (5/grupo) se dividieron en tres grupos de artículos de prueba y un grupo de control. Los grupos de artículos de prueba se inyectaron por vía i.v. a través de la vena de la cola con BP1001 marcado radiactivamente con (32P) a una dosis de 20 mg de oligonucleótido por kg de peso corporal. Los ratones inyectados fueron sacrificados por inhalación de CO2 a las 4, 24 y 48 horas después de la inyección para la extracción de órganos. Los animales de control eran animales no inyectados. Se recogieron tejido de bazo, hígado, riñón, corazón, estómago, pulmón y médula ósea de todos los animales, y se pesaron y procesaron muestras de tejido (50-100 mg) de cada órgano. La radiactividad del 32P se midió en un contador de centelleo. Los resultados se expresaron como media de |jg de BP1001/g de tejido. Como era de esperar, no se detectó radiactividad en los animales de control. La distribución en tejidos de BP1001 fue similar a la descrita para otros oligonucleótidos P-etoxi incorporados en liposomas investigados previamente. BP1001 se acumuló en todos los tejidos examinados, con la mayor acumulación en tejido del bazo, hígado y riñón. A las 4 h después de la inyección, las concentraciones tisulares medias de BP1001 por gramo de tejido fueron: 64 jg (bazo), 50 jg (hígado), 34 jg (riñón) y varió de 12-34 jg en otros tejidos. La semivida tisular fue de aproximadamente 24 h en bazo, hígado, riñón, corazón y estómago y 48 h en pulmones. Se detectó una cantidad mínima de BP1001 (~0,4 jg en dos fémures) en la médula ósea, donde la concentración se mantuvo relativamente constante durante 72 h.
C. Toxicología de BP1001
1. Estudio de toxicidad de dosis única en ratones
En un estudio de toxicidad de dosis única de BP1001, se asignaron 15 ratones ICR macho (5/grupo) a un grupo de control no inyectado (Grupo I) y a dos grupos de tratamiento (Grupos II y III) para recibir 15 y 30 mg de oligo/kg por vía intravenosa a través de la vena de la cola en una sola inyección. Se asignaron quince ratones ICR hembra (5/grupo) a un grupo de control no inyectado (Grupo IV) y a dos grupos de tratamiento (Grupos V y VI) para recibir 20 y 40 mg de oligo/kg, respectivamente, por vía intravenosa a través de la vena de la cola en una sola inyección. Los animales se observaron diariamente y se recogió sangre para evaluaciones hematológicas y bioquímicas dos y seis semanas después de la inyección. Los animales se sacrificaron después de la extracción de sangre seis semanas después de la inyección y se recogieron tejidos para evaluaciones macroscópicas y microscópicas de toxicidad en órganos. No se observaron signos de morbilidad o mortalidad. Las inyecciones intravenosas únicas de 15-40 mg/kg de BP1001 no produjeron lesiones relacionadas con el fármaco en los órganos examinados. Se observó una reducción en el recuento de leucocitos dos semanas después de la inyección de 30 y 40 mg de oligo/kg. Se observó recuperación de los recuentos de leucocitos seis semanas después de la inyección de 30 mg de oligo/kg. El recuento de leucocitos promedio del grupo no se recuperó por completo a las seis semanas en los animales que recibieron 40 mg de oligo/kg, pero no fue estadísticamente diferente al control (Tari, 2007).
2. Estudio de toxicidad de dosis múltiples en ratones
En un estudio de toxicidad de dosis múltiple de BP1001 en ratones, se asignó a 24 ratones ICR (una cepa exogámica de ratones del Instituto para la Investigación del Cáncer; 5 hembras/grupo, 3 machos/grupo) a un grupo de control no inyectado (Grupo I) y dos grupos de tratamiento (Grupos II-NI) para recibir 15 y 25 mg de oligo/kg por vía intravenosa a través de la vena de la cola diariamente durante cinco días consecutivos. Los animales se observaron diariamente y se recogió sangre para evaluaciones hematológicas y bioquímicas a las dos y seis semanas después de la inyección. Los animales se sacrificaron después de la extracción de sangre seis semanas después de la inyección y se recogieron tejidos para evaluaciones macroscópicas y microscópicas de toxicidad en órganos. No se observaron signos de morbilidad o mortalidad. Múltiples inyecciones intravenosas de 15-25 mg/kg de BP1001 no produjeron lesiones relacionadas con el fármaco en los órganos examinados. Se observó una reducción en los recuentos de leucocitos dos semanas después de la inyección en los grupos tratados, que persistió seis semanas después de la inyección. Los recuentos diferenciales de leucocitos mostraron que las poblaciones específicas de leucocitos en los animales tratados no eran diferentes del control (Tari, 2007).
3. Estudios de toxicidad de dosis múltiples en conejos
Se evaluó la toxicidad potencial de BP1001 administrado dos veces por semana por vía intravenosa (bolo lento) en conejos Dutch Belted. Se administró BP1001 durante un período de 28 días seguido de una fase de recuperación de 2 semanas. El diseño del estudio fue como se muestra en la Tabla 2.
T l 2. Di ñ l i xi i n n
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*De cada grupo, se sacrificaron 3 conejos machos y 3 hembras en los días de estudio 4, 29 y 42.
Las dosis se administraron los días de estudio 1, 3, 8, 10, 15, 17, 22 y 24. El primer día de dosificación en el estudio se designó como Día 1 del estudio. Las dosis se administraron aproximadamente a la misma hora cada día. Los volúmenes de dosis individuales se calcularon en base al peso corporal registrado más recientemente para cada animal. Los niveles de dosis del día 1 del estudio se calcularon respecto a un peso corporal previo a la prueba. Basándose en este diseño de estudio, no hubo cambios toxicológicos aparentes en las observaciones clínicas, peso corporal, citología de la médula ósea, patología clínica, pesos de los órganos o hallazgos microscópicos. Hubo tres observaciones macroscópicas registradas en la necropsia. En un macho del grupo 1, día de estudio 4 (n.° 8939) y una hembra del grupo 2, día de estudio 42 (n.° 8968) hubo una observación macroscópica de una vesícula biliar pequeña. En una hembra del grupo 1, día de estudio 29 (n.° 8944) hubo una observación macroscópica de focos oscuros que afectaban a todos los lóbulos del pulmón. Estos hallazgos no dependientes de la dosis aparentemente no estaban relacionados con la administración de BP1001. Basándose en este diseño de estudio, no hubo toxicidad aparente de una administración intravenosa dos veces por semana (bolo lento) de 3,75, 5,00 o 7,50 mg/kg de BP1001 en observaciones clínicas, peso corporal, citología de la médula ósea, patología clínica, pesos de los órganos o hallazgos microscópicos. Además, los resultados mostraron que cuando se administró BP1001 a conejos, no se observaron efectos sobre los parámetros de coagulación.
D. Estudio de mutagenicidad de Ames
BP1001 se probó en un estudio de mutagenicidad de Ames. Se añadió cloruro de sodio (0,9 %) a viales de BP1001 que contenían 5 mg de oligonucleótido de Grb2. La muestra se probó contra cinco cepas de Salmonella en varias concentraciones en presencia y ausencia del sistema de activación enzimático S-9. La muestra no fue mutagénica para las cepas probadas.
E. Prueba de anomalías cromosómicas en mamíferos in vitro (células CHO)
BP1001 se probó en el ensayo de anomalías cromosómicas utilizando células CHO tanto en ausencia como en presencia de un sistema de activación S9 inducido por Aroclor. Se realizó una prueba de toxicidad preliminar para establecer el intervalo de dosis para el ensayo de anomalías cromosómicas. El ensayo de anomalías cromosómicas se utilizó para evaluar el potencial clastogénico del BP1001. Basándose en los hallazgos de este estudio, se concluyó que BP1001 era negativo para la inducción de anomalías cromosómicas numéricas y estructurales en células CHO tanto en los sistemas de prueba no activados como en los activados con S9.
V. Ensayos clínicos de BP1001 en humanos
Se realizó un estudio de fase I de BP1001 en dos partes: (A) Aumento escalonado de la dosis de BP1001 y (B) BP1001 con ampliación de dosis simultánea de citarabina en dosis baja (LDAC). Para el aumento escalonado de la dosis (Parte A), se utilizó un diseño estándar "3+3" en el que se trataron cohortes sucesivas de 3 o más pacientes con neoplasias malignas hematológicas con aumento escalonado de las dosis de 5 a 135 mg/m2 de BP1001 hasta que se identificó la dosis máxima tolerada (MTD). Para la parte de ampliación de la dosis del estudio (Parte B), se trataron dos subconjuntos sucesivos de pacientes con LMA con BP1001 a la MTD (o dosis más alta probada [HTD]) y un nivel por debajo de la MTD (o HTD) en combinación con una dosis fija de LDAC para caracterizar aún más la seguridad y el efecto biológico, así como para identificar la dosis recomendada de fase 2. Ambas partes del estudio emplearon un diseño abierto, secuencial, con aumento escalonado de la dosis para evaluar la seguridad, tolerabilidad y toxicidad, farmacocinética (FC), respuesta tumoral y actividad antileucémica. Un total de 39 pacientes fueron tratados en el estudio: LMA (n = 30), LMC-FB (n = 5) y s Md (n = 4). De 39 pacientes, 27 fueron evaluables; 12 no completaron un ciclo completo debido a la progresión de la enfermedad y fueron reemplazados por protocolo. Solo un paciente que recibió 5 mg/m2 experimentó una toxicidad limitante de la dosis (Dose-Limiting Toxicity, DLT), mucositis grado 3 y síndrome mano-pie, aunque en dosis altas de hidroxiurea en el caso de la LMC-FB proliferativa. El fármaco del estudio no se pudo descartar como un factor contribuyente, por lo que este acontecimiento se notificó como una DLT. Tras la ampliación a seis pacientes, ningún otro paciente desarrolló una DLT. No se ha observado ninguna otra toxicidad relacionada con el fármaco en ninguno de los pacientes tratados. No se identificó una MTD. La HTD para BP1001 es de 90 mg/m2.
Entre los 27 pacientes evaluables, se administró una mediana de un ciclo (1-5): cuatro recibieron dos ciclos, tres recibieron tres ciclos, cuatro recibieron cinco ciclos, y todos los demás recibieron un ciclo. Entre los 21 pacientes evaluables en cohortes de agente único (Parte A), 10 experimentaron una reducción de > 50 % en los blastos periféricos o en la médula ósea; dos tuvieron mejoría de la leucemia cutis; seis tuvieron una disminución transitoria de los blastos. Entre los seis pacientes evaluables que recibían terapia combinada de BP1001 LDAC (Parte B), tres lograron la remisión completa (Complete Remission, CR) y dos lograron la remisión parcial (Partial Remission, PR).
A. Estudios de biomarcadores de Grb2
Se usó citometría de flujo para determinar los niveles de proteínas Grb2 y pErk en las células de leucemia circulantes de pacientes que estaban en terapia con un solo agente BP1001, y se notificaron como intensidad de fluorescencia media (Median Fluorescent Instensity, MFI). La MFI de Grb2 y pErk durante el tratamiento se comparó con el valor inicial. En la última muestra medida (fin de tratamiento o ciclo 1 día 22), BP1001 disminuyó > 25 % los niveles de Grb2 en 10 de 12 muestras y > 25 % los niveles de pErk en 7 de 12 muestras. La disminución promedio de los niveles de Grb2 fue del 49 % (intervalo: 28 % al 91 %) y en los niveles de pErk fue del 52 % (intervalo: 27 % al 91 %).
B. Estudios de farmacocinética
El análisis farmacocinético (FC) se realizó en muestras de plasma recogidas de pacientes resistentes/en recidiva diagnosticados con LMA que recibieron BP1001 (60 mg/m2) LDAC o que reciben BP1001 (90 mg/m2) LDAC. En ambas cohortes, Tmáximo fue 1 h después de la administración. Cmáxima de ambas dosis fue de 82 ng/ml. Sin embargo, la semivida plasmática de BP1001 fue más prolongada para la dosis de 60 mg/m2 que para la dosis de 90 mg/m2 (29,6 ± 8,1 h frente a 11,8 ± 5,4 h). La tasa de aclaramiento de BP1001 fue menor para la dosis de 60 mg/m2 que para la dosis de 90 mg/m2 (133 ± 24 l/h frente a 205 ± 70 l/h). Estos resultados sugieren que la dosis de 60 mg/m2 de BP1001 puede ser más favorable que la dosis de 90 mg/m2.
VI. Lípidos y liposomas
"Liposomas" se usa en el presente documento para referirse a vesículas que contienen lípidos que tienen una bicapa lipídica, así como otras partículas vehículos de lípidos que pueden atrapar o incorporar oligonucleótidos antisentido. Como tal, liposoma es un término genérico que abarca una variedad de vehículos lipídicos unilamelares, multilamelares y multivesiculares formados por la generación de agregados o bicapas lipídicas cerradas. Además, los liposomas pueden tener una estructura lamelar indefinida. Los liposomas se pueden caracterizar por tener estructuras vesiculares con una membrana de bicapa de fosfolípidos y un medio acuoso interno. Los liposomas multilamelares tienen múltiples capas lipídicas separadas por medio acuoso. Se forman espontáneamente cuando los fosfolípidos se suspenden en un exceso de solución acuosa. Los componentes lipídicos se autoreorganizan antes de la formación de estructuras cerradas y atrapan agua y solutos disueltos entre las bicapas lipídicas (Ghosh y Bachhawat, 1991). Sin embargo, la presente invención también abarca composiciones que tienen diferentes estructuras en solución que la estructura vesicular normal. Por ejemplo, los lípidos pueden adoptar una estructura micelar o simplemente existir como agregados no uniformes de moléculas de lípidos.
Los liposomas son una forma de nanopartículas que son vehículos para la administración de una variedad de fármacos en un tejido enfermo. El tamaño óptimo de los liposomas depende del tejido diana. En el tejido tumoral, la vasculatura es discontinua y el tamaño de los poros varía de 100 a 780 nm (Siwak et al., 2002). En comparación, el tamaño de poro en el endotelio vascular normal es <2 nm en la mayoría de los tejidos y 6 nm en las vénulas poscapilares. Se cree que los liposomas con carga negativa se eliminan más rápidamente de la circulación que los liposomas con carga neutra o positiva; sin embargo, estudios recientes han indicado que el tipo de lípido con carga negativa afecta a la tasa de captación de liposomas por parte del sistema reticuloendotelial (RES). Por ejemplo, los liposomas que contienen lípidos con carga negativa que no están protegidos estéricamente (fosfatidilserina, ácido fosfatídico y fosfatidilglicerol) se eliminan más rápidamente que los liposomas neutros. Curiosamente, los liposomas catiónicos (1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano [DOTAP]) y los complejos catiónicos-liposoma-ADN se unen e internalizan más ávidamente por las células endoteliales de los vasos sanguíneos angiogénicos a través de la endocitosis que los liposomas aniónicos, neutros o estéricamente estabilizados (Thurston et al., 1998; Krasnici et al., 2003). Los liposomas catiónicos pueden no ser vehículos de administración ideales para las células tumorales porque las interacciones de la superficie con las células tumorales crean un efecto de barrera en el sitio de unión derivado electrostáticamente, inhibiendo una mayor asociación de los sistemas de administración con esferoides tumorales (Kostarelos et al., 2004). Sin embargo, los liposomas neutros parecen tener una mejor penetración intratumoral. La toxicidad con preparaciones liposomales específicas también ha sido motivo de preocupación. Los liposomas catiónicos provocan toxicidad dependiente de la dosis e inflamación pulmonar al promover la liberación de especies intermedias reactivas de oxígeno, y este efecto es más pronunciado con los liposomas catiónicos multivalentes que con los liposomas catiónicos monovalentes, tales como DOTAP (Dokka et al., 2000). Los liposomas neutros y negativos no parecen presentar toxicidad pulmonar (Guitierrez-Puente et al., 1999). Los liposomas catiónicos, aunque albergan eficientemente los ácidos nucleicos, han tenido un éxito limitado para la regulación a la baja in vivo de genes, quizás debido a su naturaleza intracelular estable y a la incapacidad resultante para liberar el contenido de ácido nucleico. Los lípidos con carga neutra o las composiciones lipídicas con carga neutralizada, p. ej., 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), se utilizan en el presente documento debido a las propiedades neutras y al éxito en la administración de oligonucleótidos antisentido in vivo.
La presente invención proporciona métodos y composiciones para asociar un oligonucleótido, tal como un oligonucleótido antisentido, con un lípido y/o liposoma. El oligonucleótido puede incorporarse en el interior acuoso de un liposoma, intercalado dentro de la bicapa lipídica de un liposoma, unido a un liposoma a través de una molécula de enlace que está asociada tanto con el liposoma como con el oligonucleótido, atrapado en un liposoma, formando un complejo con un liposoma, dispersado en una solución que contiene un lípido, mezclado con un lípido, combinado con un lípido, contenido como una suspensión en un lípido, contenido o formando un complejo con una micela o asociado de otra manera a un lípido. Las composiciones asociadas a liposomas o liposomas/oligonucleótidos proporcionadas en el presente documento no se limitan a ninguna estructura particular en solución. Por ejemplo, pueden estar presentes en una estructura de bicapa, tal como micelas, o con una estructura "colapsada". También pueden simplemente intercalarse en una solución, posiblemente formando agregados que no son uniformes ni en tamaño ni en forma.
A. Lípidos
Los lípidos son sustancias grasas que pueden ser naturales o sintéticas. Por ejemplo, los lípidos incluyen las gotitas de grasa que se producen de forma natural en el citoplasma, así como la clase de compuestos que son bien conocidos por los expertos en la materia que contienen hidrocarburos alifáticos de cadena larga y sus derivados, tales como ácidos grasos, alcoholes, aminas, aminoalcoholes y aldehídos. Un ejemplo es el lípido 1,2-dioleoil-snglicero-3-fosfocolina (DOPC).
Las composiciones lipídicas de la presente invención pueden comprender fosfolípidos. En ciertas realizaciones, se puede usar una sola clase o tipo de fosfolípido en la creación de composiciones lipídicas, tales como los liposomas. En otras realizaciones, se puede usar más de una clase o tipo de fosfolípido.
Los fosfolípidos incluyen glicerofosfolípidos y ciertos esfingolípidos. Los fosfolípidos incluyen, pero sin limitación, dioleoilfosfatidilcolina ("DOPC"), fosfatidilcolina de huevo ("EPC"), dilauriloilfosfatidilcolina ("DLPC"), dimiristoilfosfatidilcolina ("DMPC"), dipalmitoilfosfatidilcolina ("DPPC"), diestearoil-fosfatidilcolina ("DSPC"), dilinoleoilfosfatidilcolina, 1,2-diaraquidoil-sn-glicero-3-fosfocolina ("DAPC"), 1,2-dieicosenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DEPC), 1 -miristoil-2-palmitoil fosfatidilcolina ("MPPC"), 1 -palmitoil-2-miristoil fosfatidilcolina ("PMPC"), 1 -palmitoil-2-estearoil fosfatidilcolina ("PSPC"), 1-estearoil-2-palmitoil fosfatidilcolina ("SPPC"), palmitoiloleoil fosfatidilcolina ("POPC"), 1 -oleoil-2-palmitoil fosfatidilcolina ("Op Pc "), dilauriloilfosfatidilglicerol ("d LpG"), dimiristoilfosfatidilglicerol ("DMPG"), dipalmitoilfosfatidilglicerol ("DPPG"), diestearoilfosfatidilglicerol ("DSPG"), dioleoilfosfatidilglicerol ("DOPG"), ácido dimiristoil fosfatídico ("DMPA"), ácido dipalmitoil fosfatídico ("DPPA"), ácido diestearoil fosfatídico ("DSPA"), ácido dioleoil fosfatídico ("DOPA"), dimiristoilfosfatidiletanolamina ("DMPE"), dipalmitoilfosfatidiletanolamina ("DPPE"), diestearoilfosfatidiletanolamina ("DSPE"), dioleoilfosfatidiletanolamina ("DOPE"), palmitoiloleoil fosfatidiletanolamina ("POPE"), dimiristoil fosfatidil-serina ("DMPS"), dipalmitoil fosfatidil serina ("DPPS"), fosfatidil serina cerebral ("BPS"), diestearoil esfingomielina ("DSSP"), esfingomielina cerebral ("BSP"), dipalmitoil esfingomielina ("DPSP"), lisofosfatidilcolina y lisofosfatidiletanolamina.
Los fosfolípidos incluyen, por ejemplo, fosfatidilcolinas, fosfatidilgliceroles y fosfatidiletanolaminas; debido a que las fosfatidiletanolaminas y las fosfatidilcolinas no están cargadas en condiciones fisiológicas (es decir, a un pH de aproximadamente 7), estos compuestos pueden ser particularmente útiles para generar liposomas neutros. En ciertas realizaciones, el fosfolípido DOPC se usa para producir liposomas o composiciones lipídicas no cargados. En ciertas realizaciones, también se puede usar un lípido que no es un fosfolípido (p. ej., un colesterol)
Los fosfolípidos pueden ser de fuentes naturales o sintéticas. Sin embargo, los fosfolípidos de fuentes naturales, tales como la fosfatidilcolina de huevo o soja, el ácido fosfatídico de cerebro, el fosfatidilinositol de cerebro o vegetal, la cardiolipina cardíaca y la fosfatidiletanolamina vegetal o bacteriana, no se usan en determinadas realizaciones como fosfátido primario (es decir, que constituyen el 50 % o más de la composición total de fosfátido) porque esto puede provocar inestabilidad y fugas en los liposomas resultantes.
B. Liposomas neutros
"Liposomas o composición lipídica neutros" o "liposomas o composición lipídica no cargados", como se usa en el presente documento, se definen como liposomas o composiciones lipídicas que tienen uno o más lípidos que producen una carga neta prácticamente neutra (prácticamente sin carga). En ciertas realizaciones, los liposomas o las composiciones de lípidos neutros pueden incluir principalmente lípidos y/o fosfolípidos que son en sí mismos neutros. En ciertas realizaciones, los lípidos anfipáticos pueden incorporarse o usarse para generar liposomas neutros o composiciones lipídicas. Por ejemplo, se puede generar un liposoma neutro mediante la combinación de lípidos con carga positiva y negativa de modo que esas cargas se cancelan prácticamente entre sí, produciendo así una carga neta prácticamente neutra. Por "prácticamente neutra" o "prácticamente sin carga", se entiende que pocos lípidos, si acaso, dentro de una población determinada (p. ej., una población de liposomas) incluyen una carga que no se cancela con una carga opuesta de otro componente (p. ej., menos del 10 % de los componentes incluyen una carga no cancelada, más preferentemente menos del 5 %, y lo más preferentemente menos del 1 %). En determinadas realizaciones de la presente invención, se puede preparar una composición en donde el componente lipídico de la composición es prácticamente neutro pero no está en forma de liposomas.
El tamaño de los liposomas varía según el método de síntesis. Un liposoma suspendido en una solución acuosa generalmente tiene la forma de una vesícula esférica y puede tener una o más capas concéntricas de moléculas de bicapa lipídica. Cada capa consiste en una matriz paralela de moléculas representadas por la fórmula XY, en donde X es un resto hidrófilo e Y es un resto hidrófobo. En suspensión acuosa, las capas concéntricas están dispuestas de manera que los restos hidrófilos tienden a permanecer en contacto con una fase acuosa y las regiones hidrófobas tienden a autoasociarse. Por ejemplo, cuando las fases acuosas están presentes dentro del liposoma, las moléculas lipídicas pueden formar una bicapa, conocida como una lamela, de la disposición XY-YX. Los agregados de lípidos se pueden formar cuando las partes hidrófilas e hidrófobas de más de una molécula lipídica se asocian entre sí. El tamaño y la forma de estos agregados dependerán de muchas variables diferentes, tales como la naturaleza del disolvente y la presencia de otros compuestos en la solución.
Los liposomas dentro del alcance de la presente invención se pueden preparar de acuerdo con técnicas de laboratorio conocidas, tales como, por ejemplo, el método de Bangham et al. (1965); el método de Gregoriadis (1979); el método de Deamer y Uster (1983); y el método de evaporación de fase inversa descrito por Szoka y Papahadjopoulos (1978). Los métodos antes mencionados difieren en sus respectivas capacidades para atrapar material acuoso y sus respectivas proporciones entre espacio acuoso y lípido.
En ciertas realizaciones, se puede usar un liposoma neutro para administrar un oligonucleótido, tal como un oligonucleótido antisentido. El liposoma neutro puede contener una sola especie de oligonucleótido dirigido a la supresión de la traducción de un solo gen, o el liposoma neutro puede contener múltiples especies de oligonucleótidos que están dirigidos a la supresión de la traducción de múltiples genes. Asimismo, el liposoma neutro también puede contener un quimioterapéutico además del oligonucleótido; por lo tanto, en ciertas realizaciones, un agente quimioterapéutico y un oligonucleótido pueden administrarse a una célula (p. ej., una célula cancerosa en un sujeto humano) en la misma composición o en composiciones separadas.
Los lípidos secos o los liposomas liofilizados pueden deshidratarse y reconstituirse a una concentración adecuada con un disolvente adecuado (p. ej., DPBS o tampón Hepes). A continuación, la mezcla se puede agitar vigorosamente en un mezclador de vórtice. Los liposomas se pueden resuspender a una concentración de fosfolípidos totales adecuada (p. ej., aproximadamente 10-200 mM). El oligonucleótido no encapsulado se puede eliminar mediante centrifugación a 29.000 g y los sedimentos liposomales se pueden lavar. Como alternativa, los oligonucleótidos no encapsulados pueden eliminarse dializándolos frente a un exceso de disolvente. La cantidad de oligonucleótido encapsulado se puede determinar de acuerdo con métodos estándar.
VII. Inhibición de la expresión génica
Un oligonucleótido inhibidor puede inhibir la transcripción o traducción de un gen en una célula. Un oligonucleótido puede tener una longitud de 5 a 50 o más nucleótidos y, en ciertas realizaciones, una longitud de 7 a 30 nucleótidos. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido puede tener una longitud de 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 nucleótidos. El oligonucleótido puede comprender un ácido nucleico y/o un análogo de ácido nucleico. Normalmente, un oligonucleótido inhibidor inhibirá la traducción de un solo gen dentro de una célula; sin embargo, en ciertas realizaciones, un oligonucleótido inhibidor puede inhibir la traducción de más de un gen dentro de una célula.
Dentro de un oligonucleótido, los componentes del oligonucleótido no necesitan ser del mismo tipo ni homogéneos en su totalidad (p. ej., un oligonucleótido puede comprender un nucleótido y un ácido nucleico o un análogo de nucleótido). En determinadas realizaciones de la presente invención, el oligonucleótido puede comprender solo un único ácido nucleico o análogo de ácido nucleico. El oligonucleótido inhibidor puede comprender 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 o más bases nitrogenadas contiguas, incluyendo todos los intervalos entre ellos, que se hibridan con un ácido nucleico complementario para formar una estructura de doble cadena.
VIII. Ácidos Nucleicos
La presente invención proporciona métodos y composiciones para la administración de un oligonucleótido mediante liposomas neutros. Como un oligonucleótido está compuesto por un ácido nucleico, los métodos relacionados con los ácidos nucleicos (p. ej., producción de un ácido nucleico, modificación de un ácido nucleico, etc.) también puede usarse con respecto a un oligonucleótido.
La expresión "ácido nucleico" es bien conocida en la técnica. Un "ácido nucleico", tal como se usa en el presente documento, generalmente se refiere a una molécula (es decir, una hebra) de ADN, ARN, o un derivado o análogo del mismo, que comprende una base nitrogenada. Estas definiciones se refieren a un ácido nucleico de cadena sencilla o de cadena doble. Los ácidos nucleicos de cadena doble pueden formarse mediante unión totalmente complementaria; sin embargo, en algunas realizaciones, se puede formar un ácido nucleico de cadena doble mediante unión complementaria parcial o sustancial. Como se usa en el presente documento, un ácido nucleico de cadena sencilla puede indicarse con el sufijo "cs" y un ácido nucleico de cadena doble con el sufijo "cd".
A. Bases nitrogenadas
Como se usa en el presente documento, una "base nitrogenada" se refiere a una base heterocíclica, tal como, por ejemplo, una base nitrogenada natural (es decir, una A, T, G, C o U) que se encuentran en al menos un ácido nucleico natural (es decir, ADN y ARN), y derivados naturales o no naturales y análogos de tal base nitrogenada. Una base nitrogenada generalmente puede formar uno o más enlaces de hidrógeno (es decir, "emparejarse" o "hibridarse") con al menos una base nitrogenada natural de una manera que se pueda sustituir el emparejamiento de base nitrogenada natural (p. ej., el enlace de hidrógeno entre A y T, G y C, y A y U). Una base nitrogenada puede incluirse en un nucleósido o nucleótido, utilizando cualquier método de síntesis química o natural descrito en el presente documento o conocido por un experto en la materia.
Las bases nitrogenadas "purina" y/o "pirimidina" incluyen bases nitrogenadas purina y/o pirimidina de origen natural y también derivados y análogos de las mismas, que incluyen, pero sin limitación, una purina o pirimidina sustituida por uno o más de un alquilo, carboxialquilo, amino, hidroxilo, halógeno (es decir, flúor, cloro, bromo o yodo), resto tiol o alquiltiol. Los restos alquilo preferidos (p. ej., alquilo, caboxialquilo, etc.) comprenden de aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, a aproximadamente 6 átomos de carbono. Otros ejemplos no limitativos de una purina o pirimidina incluyen una deazapurina, una 2,6-diaminopurina, un 5-fluorouracilo, una xantina, una hipoxantina, una 8-bromoguanina, una 8-cloroguanina, una bromotilina, una 8-aminoguanina, una 8-hidroxiguanina, una 8-metilguanina, una 8-tioguanina, una azaguanina, una 2-aminopurina, una 5-etilcitosina, una 5-metilcitosina, un 5-bromouracilo, un 5-etiluracilo, un 5-yodouracilo, un 5-clorouracilo, un 5-propiluracilo, un tiouracilo, una 2-metiladenina, una metiltioadenina, una N,N-dimetiladenina, una azaadenina, una 8-bromoadenina, una 8-hidroxiadenina, una 6-hidroxi-aminopurina, una 6-tiopurina, una 4-(6-aminohexil/citosina) y similares. Los derivados o análogos de purina y pirimidina incluyen, pero sin limitación (abreviatura/descripción de la base modificada): ac4c/4-acetilcitidina, Mam5s2u/5-metoxiaminometil-2-tiouridina, Chm5u/5-(carboxi-hidroximetil)uridina, Man q/Beta, D-manosilación, Cm/2-O-metilcitidina, Mcm5s2u/5-metoxicarbonilmetil-2-tiouridina, Cmnm5s2u/5-carboximetilamino-metil-2-tiouridina, Mcm5u/5-metoxicarbonilmetiluridina, Cmnm5u/5-carboximetil-aminometiluridina, Mo5u/5-metoxiuridina, D/dihidrouridina, Ms2i6a, 2-metiltio-N6-isopenteniladenosina, Fm/2'-0-metilpseudouridina, Ms2t6a/N-((9-beta-D-ribofuranosil-2-metiltiopurina-6-il)carbamoil)treonina, Gal q/Beta, D-galactosilqueosina, Mt6a/N-((9-beta-D-ribofuranosilpurina-6-il)N-metil-carbamoil)treonina, Gm/2'-O-metilguanosina, Mv/éster metílico del ácido uridin-5-oxiacético, I/Inosina, o5u/ácido uridin-5-oxiacético (v), I6a/N6-isopenteniladenosina, Osyw/Wibutoxosina, m1a/1-metiladenosina, P/Pseudouridina, mlf/1-metilpseudouridina, Q/Queosina, m1g/1-metilguanosina, s2c/2-tiocitidina, m1I/1-metilinosina, s2t/5-metil-2-tiouridina, m22g/2,2-dimetil guanosina, s2u/2-tiouridina, m2a/2-metiladenosina, s4u/4-tiouridina, m2g/2-metilguanosina, T/5-metiluridina, m3c/3-metilcitidina, t6a/N-((9-beta-D-ribofuranosilpurin-6-il)carbamoil)treonina, m5c/5-metilcitidina, Tm/2'-O-metil-5-metiluridina, m6a/N6-metiladenosina, A/2'-O-metiluridina, m7g/7-metilguanosina, Yw/Wibutosina, Mam5u/5-metilamino-metiluridina, o X/3-(3-amino-3-carboxipropil)uridina, (acp3)u.
B. Nucleósidos
Como se usa en el presente documento, un "nucleósido" se refiere a una unidad química individual que comprende una base nitrogenada unida covalentemente a un resto enlazador de base nitrogenada. Un ejemplo no limitativo de un "resto enlazador de base nitrogenada" es un azúcar que comprende 5 átomos de carbono (es decir, un "azúcar de 5 carbonos"), incluyendo aunque no de forma limitativa una desoxirribosa, una ribosa, una arabinosa, o un derivado o un análogo de un azúcar de 5 carbonos. Los ejemplos no limitativos de un derivado o un análogo de un azúcar de 5 carbonos incluyen una 2'-fluoro-2'-desoxirribosa o un azúcar carbocíclico en el que en el anillo del azúcar un carbono se sustituye por un átomo de oxígeno. Como se usa en el presente documento, un "resto" generalmente se refiere a un componente químico o molecular más pequeño de una estructura química o molecular más grande.
En la técnica se conocen diferentes tipos de unión(es) covalente(s) de una base nitrogenada a un resto enlazador de base nitrogenada. A modo de ejemplo no limitativo, un nucleósido que comprende una purina (es decir, A o G) o una base nitrogenada 7-deazapurina normalmente comprende una unión covalente de la posición 9 de la purina o de la 7-deazapurina a la posición 1' de un azúcar de 5 carbonos. En otro ejemplo no limitativo, un nucleósido que comprende una base nitrogenada pirimidina (es decir, C, T, o U) normalmente comprende una unión covalente de la posición 1 de la pirimidina a la posición 1' de un azúcar de 5 carbonos (Kornberg y Baker, 1992).
C. Nucleótidos
Como se usa en el presente documento, un "nucleótido" se refiere a un nucleósido que comprende además un "enlace del esqueleto". Un enlace del esqueleto generalmente une covalentemente un nucleótido a otra molécula que comprende un nucleótido, o a otro nucleótido para formar un ácido nucleico. El "enlace del esqueleto" en los nucleótidos naturales normalmente comprende un resto de fosfato (p. ej., un enlace del esqueleto fosfodiéster), que está unido covalentemente a un azúcar de 5 carbonos. La unión del resto del esqueleto ocurre normalmente en la posición 3' o 5' del azúcar de 5 carbonos. Sin embargo, en la técnica se conocen otros tipos de uniones, particularmente cuando un nucleótido comprende derivados o análogos de un resto de azúcar de 5 carbonos de origen natural o un resto de fosfato.
D. Análogos de ácido nucleico
Un ácido nucleico puede comprender, o estar compuesto en su totalidad por, un derivado o análogo de una base nitrogenada, un resto enlazador de base nitrogenada y/o enlace del esqueleto que puede estar presente en un ácido nucleico natural. Como se usa en este documento, un "derivado" se refiere a una forma químicamente modificada o alterada de una molécula natural, mientras que los términos "imitador" o "análogo" se refieren a una molécula que puede o no parecerse estructuralmente a una molécula o resto natural, pero que posee funciones similares. Los análogos o derivados de bases nitrogenadas, nucleósidos y nucleótidos son bien conocidos en la técnica.
Ejemplos no limitantes de nucleósidos, nucleótidos, o ácidos nucleicos que comprenden derivados o análogos del azúcar de 5 carbonos y/o de enlaces del esqueleto, incluyen los de la patente de Ee .UU. n.° 5.681.947 que describe oligonucleótidos que comprenden derivados de purina que forman hélices triples con y/o evitan la expresión del ADNcd; las patentes de Ee .UU. números 5.652.099 y 5.763.167 que describen ácidos nucleicos que incorporan análogos fluorescentes de nucleósidos que se encuentran el ADN o el ARN, particularmente para uso como sondas de ácidos nucleicos fluorescentes; la patente de EE. UU. n.° 5.614.617 que describe análogos de oligonucleótidos con sustituciones en los anillos de pirimidina que poseen una estabilidad frente a nucleasas mejorada; las patentes de EE.UU. números 5.670.663, 5.872.232 y 5.859.221 que describen análogos de oligonucleótidos con azúcares de 5 carbonos modificados (es decir, restos 2'-desoxifuranosilo modificados) utilizados en la detección de ácidos nucleicos; la patente de EE.UU. n.° 5.446.137 que describe oligonucleótidos que comprenden al menos un resto de azúcar de 5 carbonos sustituido en la posición 4' con un sustituyente distinto del hidrógeno que puede usarse en ensayos de hibridación; la patente de EE.UU. n.° 5.886.165 que describe oligonucleótidos con ambos desoxirribonucleótidos con enlaces del esqueleto 3'-5' y ribonucleótidos con enlaces del esqueleto 2'-5'; la patente de EE.UU. n.° 5.714.606 que describe un enlace del esqueleto modificado en donde un oxígeno de la posición 3' del enlace del esqueleto se reemplaza por un carbono para aumentar la resistencia a las nucleasas de los ácidos nucleicos; la patente de EE.UU. n.° 5.672.697 que describe oligonucleótidos que contienen uno o más enlaces del esqueleto de fosfonato de metileno en 5' que aumentan la resistencia a las nucleasas; las patentes de EE.UU. números 5.466.786 y 5.792.847 que describen el enlace de un resto sustituyente que puede comprender un fármaco o un marcaje en el carbono 2' de un oligonucleótido para proporcionar una mayor estabilidad frente a las nucleasas y capacidad para administrar fármacos o restos de detección; la patente de EE.UU. n.° 5.223.618 que describe análogos de oligonucleótidos con un enlace del esqueleto de 2 o 3 carbonos que une la posición 4' y la posición 3' del resto de azúcar de 5 carbonos adyacente para mejorar la captación celular, la resistencia a nucleasas y la hibridación con el ARN diana; la patente de EE.UU. n.° 5.470.967 que describe oligonucleótidos que comprenden al menos un enlace del esqueleto de sulfamato o sulfamida que son útiles como sondas de hibridación de ácidos nucleicos; las patentes de EE.UU. números 5.378.825, 5.777.092, 5.623.070, 5.610.289 y 5.602.240 que describen oligonucleótidos con un resto de enlace del esqueleto de tres o cuatro átomos que reemplaza el enlace del esqueleto fosfodiéster usado para mejorar la resistencia a las nucleasas, la captación celular y la regulación de la expresión del ARN; la patente de EE.UU. n.° 5.858.988 que describe un agente vehículo hidrófobo unido a la posición 2'-O de los oligonucleótidos para aumentar la permeabilidad y la estabilidad de su membrana; la patente de EE.UU. n.° 5.214.136 que describe oligonucleótidos conjugados con antraquinona en el extremo 5' que poseen una hibridación potenciada con ADN o ARN y una mayor estabilidad frente a las nucleasas; la patente de EE.UU. n.° 5.700.922 que describe quimeras ANP-ADN-ANP en donde el ADN comprende nucleótidos 2'-desoxi-eritropentofuranosilo para aumentar la resistencia a las nucleasas, la afinidad de unión y la capacidad para activar la ARNasa H; la patente de EE.UU. n.° 5.708.154 que describe el ARN unido a un AdN para formar un híbrido de ADN-ARN; la patente de EE.UU. n.° 5.908.845 que describe ácidos nucleicos de poliéter en donde una o más bases nitrogenadas están unidas a átomos de carbono quirales en un esqueleto de poliéter; las patentes de EE.UU. números 5.786.461, 5.891.625, 5.786.461, 5.773.571, 5.766.855, 5.736.336, 5.719.262, 5.714.331, 5.539.082 y el documento WO 92/20702 que describen ácidos nucleicos peptídicos (ANP o análogos de ácidos nucleicos a base de péptidos; o PENAM) que generalmente comprenden uno o más nucleótidos o nucleósidos que comprenden un resto de base nitrogenada, un resto enlazador de base nitrogenada que no es un azúcar de 5 carbonos (p. ej., átomos de nitrógeno aza, conexiones de amido y/o ureido), y/o un enlace del esqueleto que no es un enlace del esqueleto de fosfato (p. ej., aminoetilglicina, poliamida, polietilo, politioamida, polisulfinamida, o polisulfonamida); y la patente de EE.u U. n.° 5.855.911 que describe el enlace del esqueleto P-etoxi resistente a nucleasas hidrófobo.
Se conocen en la técnica otras modificaciones y usos de los análogos de ácidos nucleicos, y se prevé que estas técnicas y tipos de análogos de ácidos nucleicos se puedan usar con la presente invención.
E. Preparación de ácidos nucleicos
Un ácido nucleico puede prepararse mediante cualquier técnica conocida por un experto en la materia, tal como síntesis química, producción enzimática o producción biológica. Los ejemplos no limitativos de un ácido nucleico sintético (p. ej., un oligonucleótido sintético) incluyen un ácido nucleico producido mediante síntesis química in vitro usando la química del fosfotriéster, fosfito, o fosforamidita y técnicas de fase sólida, tales como se describe en el documento EP 266.032, o mediante intermedios de desoxinucleósido H-fosfonato como se describe por Froehler et al. (1986) y en la patente de EE.UU. n.° 5.705.629. En los métodos de la presente invención, se pueden usar una o más especies de oligonucleótidos. Se han divulgado varios mecanismos de síntesis de oligonucleótidos en, por ejemplo, las patentes de EE.UU. números 4.659.774, 4.816.571, 5.141.813, 5.264.566, 4.959.463, 5.428.148, 5.554.744, 5.574.146 y 5.602.244.
F. Purificación de ácidos nucleicos
Un ácido nucleico puede purificarse en geles de poliacrilamida, gradientes de centrifugación de cloruro de cesio, o por cualquier otro medio conocido por un experto en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook et al. (2001)).
En ciertas realizaciones, la presente invención se refiere a un ácido nucleico que es un ácido nucleico aislado. Como se usa en el presente documento, la expresión "ácido nucleico aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico (p. ej., una molécula de ARN o ADN) que se ha aislado exenta de, o que de otro modo está exenta de, la mayor parte de los ácidos nucleicos genómicos y transcritos totales de una o más células. En ciertas realizaciones, "ácido nucleico aislado" se refiere a un ácido nucleico que se ha aislado exento de, o que de otro modo está exento de, la mayor parte de los componentes celulares o componentes de reacción in vitro, tal como, por ejemplo, macromoléculas, tales como lípidos o proteínas, moléculas biológicas pequeñas, y similares.
G. Hibridación
Como se usa en el presente documento, "hibridación", "hibrida", o "capaz de hibridar" se entiende la formación de una molécula de doble o triple cadena o de una molécula con naturaleza de doble o triple cadena parcial. El término "emparejar" como se usa en el presente documento es sinónimo de "hibridar".
Tal como se utiliza en el presente documento, "condición(es) rigurosa(s)" o "alta rigurosidad" son aquellas condiciones que permiten la hibridación entre o dentro de una o más cadenas de ácido nucleico que contienen secuencias complementarias, pero excluye la hibridación de secuencias aleatorias. Las condiciones rigurosas toleran poco, si acaso, un error de apareamiento entre un ácido nucleico y una hebra diana. Tales condiciones son bien conocidas por los expertos en la materia y se prefieren para aplicaciones que requieren una alta selectividad. Las condiciones rigurosas pueden comprender condiciones de baja salinidad y/o alta temperatura, tales como las proporcionadas por NaCl de aproximadamente 0,02 M a aproximadamente 0,15 M a temperaturas de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 70 °C. Se entiende que la temperatura y la fuerza iónica de una rigurosidad deseada están determinadas en parte por la longitud del ácido(s) nucleico(s) particular(es), la longitud y el contenido de bases nitrogenadas de la(s) secuencia(s) diana, la composición de carga del ácido(s) nucleico(s), y a la presencia o concentración de formamida, cloruro de tetrametilamonio u otro(s) disolvente(s) en una mezcla de hibridación.
También se entiende que estos intervalos, composiciones y condiciones para la hibridación se mencionan únicamente a modo de ejemplos no limitativos, y que la rigurosidad deseada para una reacción de hibridación particular a menudo se determina empíricamente en comparación con uno o más controles positivos o negativos. Dependiendo de la aplicación prevista, se prefiere emplear diversas condiciones de hibridación para lograr diversos grados de selectividad de un ácido nucleico por una secuencia diana. En un ejemplo no limitativo, la identificación o el aislamiento de un ácido nucleico diana relacionado que no hibrida con un ácido nucleico en condiciones rigurosas puede lograrse mediante hibridación a baja temperatura y/o alta fuerza iónica. Tales condiciones se denominan "baja rigurosidad" o "condiciones de baja rigurosidad", y los ejemplos no limitativos de baja rigurosidad incluyen la hibridación realizada con NaCl de aproximadamente 0,15 M a aproximadamente 0,9 M en un intervalo de temperatura de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 50 °C. Por supuesto, está dentro de la experiencia de un experto en la materia modificar aún más las condiciones de rigurosidad baja o alta para adaptarse a una aplicación particular.
IX. Método de fabricación del fármaco antisentido p-etoxi liposomal
Se han utilizado oligonucleótidos (oligos) antisentido complementarios de regiones específicas de un ARNm diana para inhibir la expresión de genes endógenos. Cuando los oligonucleótidos antisentido se unen a un ARNm diana, se forma un híbrido ADN-ARN. Esta formación híbrida inhibe la traducción del ARNm y, por lo tanto, la expresión de la proteína codificada. Si la proteína es esencial para la supervivencia de la célula, la inhibición de su expresión puede conducir a la muerte celular. Por consiguiente, los oligonucleótidos antisentido pueden ser herramientas útiles en terapias anticancerosas y antivirales.
Los principales obstáculos en el uso de oligonucleótidos antisentido para inhibir la expresión génica son la inestabilidad celular, la baja captación celular y el suministro intercelular deficiente. Los fosfodiésteres naturales no son resistentes a la hidrólisis por nucleasas; por tanto, se necesitan altas concentraciones de oligonucleótidos antisentido antes de que se observe cualquier efecto inhibidor. Se han fabricado análogos de fosfodiéster modificados, tales como P-etoxi, para superar este problema de hidrólisis por nucleasas, pero no han dado una solución satisfactoria al problema.
La captación celular de oligonucleótidos antisentido es baja. Para resolver este problema, se han utilizado técnicas físicas, tales como la precipitación de fosfato de calcio, método del DEAE-dextrano, o electroporación, para aumentar la captación celular de oligonucleótidos. Estas técnicas son difíciles de reproducir y son inaplicables in vivo. También se han utilizado lípidos catiónicos, tales como la lipofectina, para administrar oligonucleótidos. Se forma una interacción electrostática entre los lípidos catiónicos y los oligonucleótidos con carga negativa, lo que da como resultado un complejo que luego es absorbido por las células diana. Dado que estos lípidos catiónicos no protegen a los oligonucleótidos de la digestión por nucleasas y son perjudiciales para la membrana celular, solo son útiles para administrar los fosforotioatos resistentes a las nucleasas, pero no los fosfodiésteres escindibles por nucleasas.
Otro análogo de fosfodiéster modificado que se ha preparado es el P-etoxi. El esqueleto antisentido de P-etoxi no tiene un efecto adverso sobre la hemorragia y la activación del complemento, que son algunas de las toxicidades que se han descrito para otros análogos antisentido. Las modificaciones de los oligonucleótidos P-etoxi se realizan en el esqueleto de fosfato para que la modificación no interfiera con la unión de estos oligonucleótidos con un ARNm diana. Los oligonucleótidos p-etoxi se fabrican agregando un grupo etilo al átomo de oxígeno que no forma puente del esqueleto de fosfato, lo que hace que estos oligonucleótidos sean compuestos sin carga. A pesar de su resistencia a las nucleasas, la captación celular y el suministro intracelular de oligonucleótidos P-etoxi son deficientes porque tras la internalización, estos oligonucleótidos quedan secuestrados dentro de las vacuolas endosomales/lisosomales, impidiendo su acceso al ARNm diana.
A. Fármaco antisentido P-etoxi
El fármaco antisentido P-etoxi liposomal se compone de dos productos cGMP, los cuales tienen un Certificado de análisis requerido por la FDA con criterios de liberación aprobados por la FDA. Las materias primas, los disolventes y el fármaco final se describen en el presente documento. Cuando se fabrica, el fármaco es un cristal o polvo liofilizado de color ámbar o blanco que comprende los siguientes materiales: oligonucleótido (p. ej., fármaco antisentido P-etoxi), lípidos neutros (p. ej., DOPC) y tensioactivo (p. ej., polisorbato 20). En la preparación para la administración a un paciente, se agrega solución salina normal al vial, en cuyo momento se forman los liposomas con el antisentido P-etoxi incorporado en el interior.
B. Fármaco antisentido P-etoxi
Las propiedades físicas específicas (p. ej., solubilidad e hidrofobicidad, que afectan entonces a la solubilidad del fármaco en solución salina, la incorporación de oligos en los liposomas y el tamaño de las partículas de los liposomas) del producto terminado puede definirse usando una mezcla de materia prima predeterminada de P-etoxi y fosfodiéster amidita durante la producción del fármaco antisentido P-etoxi. Si bien la pérdida del grupo del esqueleto P-etoxi se produce aleatoriamente durante la fabricación de oligonucleótidos, lo que da como resultado enlaces fosfodiéster en esos enlaces, esa pérdida puede no generar la proporción preferida de P-etoxi: enlace del esqueleto fosfodiéster dentro del oligonucleótido. En este caso, la mezcla de materia prima de P-etoxi y fosfodiéster amidita complementa el valor esperado de las deleciones del esqueleto de P-etoxi, generando así un oligonucleótido con la proporción deseada. El aumento del número de moléculas de P-etoxi en el esqueleto del oligonucleótido hace que la molécula sea más hidrófoba (lo que da como resultado partículas de liposomas más grandes; Tabla 1), menos polares y menos solubles (Tabla 2). Los métodos para probar el fármaco P-etoxi hidrófobo de carga neutra incluyen espectrometría de masas para determinar la distribución de longitudes de oligonucleótidos y ensayos para determinar la solubilidad del fármaco, que para fines prácticos de solubilidad es una inspección visual del fármaco reconstituido en solución salina. A medida que el oligonucleótido se vuelve menos soluble debido a un mayor número de enlaces del esqueleto P-etoxi, la solución reconstituida se vuelve más blanca hasta que se forman partículas a medida que la hidrofobicidad se vuelve demasiado alta.
T l 1. V ri ili l m ñ l rí l l li m n m i i n l l ni ni
Figure imgf000018_0001
** El criterio de liberación del fármaco es que el 90 % de las partículas de liposomas sean menores o iguales a 5000 nm.
a. Este lote se descartó debido a la mala solubilidad; específicamente, partículas antisentido en la solución reconstituida.
b. Este lote tenía un volumen más bajo de DMSO y tBA con 2 mg de antisentido en un vial de 20 ml, lo que añadió un componente adicional al volumen de los liposomas.
c. Este lote no fue liberado porque no cumplió con la especificación de liberación del tamaño de las partículas.
T l 2. l ili l rí l li m n m i i n l l ni ni
Figure imgf000018_0002
continuación
Figure imgf000019_0001
** Si la muestra del fármaco presenta partículas, el lote será rechazado
a. Este lote se descartó debido a la mala solubilidad; específicamente, partículas antisentido en la solución reconstituida.
b. Este lote tenía un volumen más bajo de DMSO y tBA con 2 mg de antisentido en un vial de 20 ml, lo que añadió un componente adicional al volumen de los liposomas.
c. Este lote no fue liberado porque no cumplió con la especificación de liberación del tamaño de las partículas. C. Formulación, filtración y liofilización del fármaco antisentido P-etoxi liposomal
Se disuelve un gramo (1 g) de pE oligos en DMSO en una proporción de 10 mg de oligonucleótido por 1 ml de DMSO. Seguidamente, se añade DOPC a alcohol ferc-butílico en una proporción de 1 g de DOPC por 1719 ml de alcohol ferc-butílico. El oligo y DOPC se combinan y mezclan en una proporción de 1 g de oligonucleótido por 2,67 g de DOPC. A continuación, se añaden a la mezcla 20 ml de una solución al 0,835 % (v/v) de polisorbato 20 dando como resultado una concentración final de 0,039 mg/ml. La solución se pasa a través de un filtro estéril antes de distribuirla en viales de vidrio para la liofilización.
El efecto del tensioactivo sobre el tamaño de las partículas de los liposomas se determinó valorando la cantidad de tensioactivo (Tabla 3). En ausencia de polisorbato 20, solo el 2,8 % de las partículas tenía un diámetro de 300 nm o menos. En presencia de 1x polisorbato 20, el 12,5 % de las partículas tenía un diámetro de 300 nm o menos. Con la adición de 3x-10x polisorbato 20, alrededor del 20 % de las partículas tenían un diámetro de 300 nm o menos. Por lo tanto, un aumento en el tensioactivo de 1x a 3x da como resultado una disminución en el tamaño de las partículas.
T l . V ri ili l m ñ rí l li m n n i iv
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** El criterio de liberación del fármaco es que el 90 % de las partículas de liposomas sean menores o iguales a 5000 nm.
D. Preparación del fármaco antisentido P-etoxi liposomal para administración
La preparación liofilizada se hidrató con solución salina normal (0,9 %/NaCl 10 mM) a una concentración final de oligo de 10-5000 pM. Los oligos liposomales-P-etoxi se mezclaron mediante agitación manual.
E. Métodos de prueba del fármaco antisentido p-etoxi liposomal
Inspección visual del fármaco fabricado. Después de la fabricación, se selecciona un vial de muestra que contiene el fármaco y se inspecciona visualmente. La ausencia de líquido es obligatoria, y después los cristales ámbar en el fondo del vial son aceptables, y aumentan en aceptación hasta un aspecto de polvo floculado blanco, que es el mejor resultado. El aspecto blanco indica un mejor proceso de secado, con una alta proporción entre área superficial y masa, que es muy propicia para la reconstitución para su uso.
Inspección visual del fármaco reconstituido listo para administración IV al paciente: Se agrega solución salina normal a un vial que contiene el fármaco antisentido P-etoxi liposomal y se agita para reconstituirlo en una solución con el cristal o el polvo del fármaco completamente disuelto. Se hacen tres observaciones principales: 1) que el cristal o polvo esté completamente disuelto, 2) que no haya grumos blancos de material no disuelto, y 3) que es aspecto sea blanco lechoso o de leche desnatada. Cuanto más azul sea el aspecto del líquido reconstituido, mejor, ya que esto indica un tamaño de las partículas del liposoma más pequeño que refleja la luz en el espectro azul.
Espectrometría de masas: La espectrometría de masas (espec. masas) se utiliza para mostrar el perfil de las diversas masas en una muestra. Cuando se produce material antisentido P-etoxi, se realiza un análisis de espectrometría de masas en la muestra. El resultado muestra picos de material presente en una cuadrícula que tiene una masa creciente en el eje "x" a la derecha, y una abundancia de masa relativa en el eje "y" que aumenta hacia arriba. El perfil de una muestra se analiza para determinar la cantidad relativa de esqueletos de P-etoxi en la muestra de P-etoxi, reconociendo que el perfil de los picos representa (comenzando desde lo más a la derecha), material de longitud completa con todos los esqueletos compuestos por el enlace P-etoxi, el siguiente pico hacia la izquierda es una longitud total con un esqueleto con una eliminación de P-etoxi (y por lo tanto, el etilo se eliminó y el resultado fue un enlace de esqueleto de fosfodiéster normal) y continuando. El patrón de espectrometría de masas desplazado hacia la derecha representa una muestra de P-etoxi que tiene más esqueletos de P-etoxi y, por lo tanto, tiene las propiedades de ser más hidrófoba y menos soluble; y de la misma manera, si está desplazado hacia la izquierda tiene los efectos opuestos. La inspección del gráfico de espectrometría de masas de una muestra también se puede utilizar para determinar si la filtración durante la fabricación produce algún efecto adverso en la composición de oligonucleótidos presente en el fármaco filtrado.
Análisis UV: El análisis de luz ultravioleta se usa para determinar la masa de oligonucleótido presente en una muestra. Los oligonucleótidos absorben luz en el intervalo de 260 nanómetros. Como resultado, el análisis UV del fármaco reconstituido terminado ha llegado a utilizarse como un método para determinar la cantidad de fármaco oligonucleótido en un vial de fármaco. En términos de desarrollo de fabricación e innovaciones, se utilizó el análisis UV para determinar si se produjeron problemas durante la filtración en la fabricación o si la solubilidad del fármaco antisentido P-etoxi era deficiente, lo que da como resultado menos oligonucleótidos en solución y, por lo tanto, una lectura UV más baja. El método será validado y probablemente formará parte de las pruebas de liberación del producto final.
Tamaño de las partículas del liposoma: Se reconstituye un vial de fármaco terminado y se analiza el tamaño de las partículas del liposoma. El resultado suele ser una distribución aproximadamente normal, con un punto central, colas y valores promedio o una distribución aproximadamente normal de la mayoría de las partículas y picos secundarios más pequeños de las partículas de liposoma más pequeñas que resultan de los efectos de formación de partículas de segundo orden. Es importante que las partículas de liposomas no sean demasiado grandes, ya que pueden crear efectos adversos en los pacientes (p. ej., pueden crear problemas de flujo sanguíneo en los vasos sanguíneos más pequeños de los pulmones). Como resultado, los criterios de liberación del fármaco incluyen que las pruebas del tamaño de las partículas determinen que el 90 % de los liposomas tienen un tamaño de 5 micrómetros o menos. Además, se prefieren los liposomas más pequeños porque tendrán una mejor absorción en las células y, en segundo lugar, los liposomas más pequeños pueden penetrar a través de los poros vasculares, permitiendo de este modo que los liposomas penetren dentro de los tumores, aumentando la eficacia del tratamiento de un fármaco antisentido P-etoxi liposomal.
X. Medios de Tratamiento
Las referencias a métodos de tratamiento en los párrafos posteriores de esta descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico). Ciertos aspectos de la presente invención proporcionan métodos para tratar a un paciente con cáncer como se define en las reivindicaciones con un complejo oligonucleótido-lípido (p. ej., un oligonucleótido incorporado en un liposoma neutro) que contiene un oligonucleótido inhibidor resistente a nucleasas que se dirige a Grb2. Particularmente, el oligonucleótido puede tener una secuencia que permita el emparejamiento de bases con una secuencia de nucleótidos humana en el sitio de inicio de la traducción de Grb2 y, por lo tanto, puede inhibir la expresión de Grb2. En algunos aspectos, los métodos comprenden además la administración en primera línea de un agente terapéutico al paciente, tal como, por ejemplo, un inhibidor de la tirosina cinasa (p. ej., imanitib, dasantib, nilotinib, bosutinib, ponatinib o bafetinib) o un análogo de citidina (p. ej., decitabina, azacitidina o citarabina).
"Tratamiento" y "tratar" se refieren a la administración o aplicación de un agente terapéutico a un sujeto o la realización de un procedimiento o modalidad en un sujeto con el propósito de obtener un beneficio terapéutico de una enfermedad o afección relacionada con la salud. Por ejemplo, un tratamiento puede incluir la administración de una cantidad farmacéuticamente eficaz de un complejo oligonucleótido-lípido.
"Sujeto" y "paciente" se refieren a un ser humano o no humano, tales como los primates, mamíferos y vertebrados. En realizaciones particulares, el sujeto es un ser humano.
La expresión "beneficio terapéutico" o "terapéuticamente eficaz", como se usa en esta solicitud, se refiere a cualquier cosa que promueva o mejore el bienestar del sujeto con respecto al tratamiento médico de esta afección. Esto incluye, pero sin limitación, una reducción en la frecuencia o gravedad de los signos o síntomas de una enfermedad. Por ejemplo, el tratamiento del cáncer puede implicar, por ejemplo, una reducción en el tamaño de un tumor, una reducción en la invasividad de un tumor, una reducción en la tasa de crecimiento del cáncer, o prevención de metástasis. El tratamiento del cáncer también puede referirse a la prolongación de la supervivencia de un sujeto con cáncer.
Los tumores incluyen cualquier tipo de célula maligna, tales como las que se encuentran en un tumor sólido, un tumor hematológico, cáncer metastásico o cáncer no metastásico. Los tumores sólidos de ejemplo pueden incluir, pero sin limitación, un tumor de un órgano seleccionado del grupo que consiste en páncreas, colon, ciego, esófago, gastrointestinal, encía, hígado, piel, estómago, testículos, lengua, útero, estómago, cerebro, cabeza, cuello, ovario, riñón, laringe, sarcoma, huesos, pulmón, vejiga, melanoma, próstata y mama. Los tumores hematológicos de ejemplo incluyen tumores de la médula ósea, neoplasias malignas de linfocitos T o B, leucemias, linfomas, blastomas, mielomas, y similares. Otros ejemplos de cánceres incluyen, pero sin limitación, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, leucemia, cáncer escamocelular, cáncer de pulmón (incluyendo el cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, adenocarcinoma de pulmón y carcinoma escamoso de pulmón), cáncer de peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago (incluyendo cáncer gastrointestinal y cáncer del estroma gastrointestinal), cáncer de páncreas, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñón o renal, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, varios tipos de cáncer de cabeza y cuello, melanoma, melanoma de diseminación superficial, melanoma lentigo maligno, melanomas lentiginosos acrales, melanomas nodulares, así como linfoma de linfocitos B (incluido el linfoma no Hodgkin (LNH) de bajo grado/folicular); LNH de linfocitos pequeños (LP); LNH de grado intermedio/folicular; LNH difuso de grado intermedio; LNH inmunoblástico de grado alto; LNH linfoblástico de grado alto; LNH de células pequeñas no escindidas de grado alto; LNH con gran masa tumoral; linfoma de células del manto; linfoma asociado a SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom, leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia linfoblástica aguda (LLA), tricoleucemia, mieloma múltiple, leucemia mieloide aguda (LMA) y leucemia mieloblástica crónica.
El cáncer puede ser específicamente del siguiente tipo histológico: neoplasia, maligno; carcinoma; carcinoma, indiferenciado; carcinoma de células gigantes y carcinoma espinocelular; carcinoma microcítico; carcinoma papilar; carcinoma de células escamosas; carcinoma linfoepitelial; carcinoma de células basales; pilomatrixoma; carcinoma de células transicionales; carcinoma de células transicionales papilares; adenocarcinoma; gastrinoma, maligno; colangiocarcinoma; carcinoma hepatocelular; carcinoma hepatocelular combinado y colangiocarcinoma; adenocarcinoma trabecular; carcinoma adenoide quístico; adenocarcinoma en pólipo adenomatoso; adenocarcinoma, poliposis familiar de colon; carcinoma sólido; tumor carcinoide, maligno; adenocarcinoma branquiolo-alveolar; adenocarcinoma papilar; carcinoma cromófobo; carcinoma acidófilo; adenocarcinoma oxifílico; carcinoma basófilo; adenocarcinoma de células transparentes; carcinoma de células granulares; adenocarcinoma folicular; adenocarcinoma papilar y folicular; carcinoma esclerosante no encapsulante; carcinoma cortical adrenal; carcinoma endometrioide; carcinoma de apéndices de piel; adenocarcinoma apocrino; adenocarcinoma sebáceo; adenocarcinoma ceruminoso; carcinoma mucoepidermoide; cistadenocarcinoma; cistadenocarcinoma papilar; cistadenocarcinoma seroso papilar; cistadenocarcinoma mucinoso; adenocarcinoma mucinoso; carcinoma de células en anillo de sello; carcinoma ductal infiltrante; carcinoma medular; carcinoma lobular; carcinoma inflamatorio; enfermedad de Paget, mamaria; carcinoma de células acinares; carcinoma adenoescamoso; adenocarcinoma con metaplasia escamosa; timoma, maligno; tumor del estroma ovárico, maligno; tecoma, maligno; tumor de células de la granulosa, maligno; androblastoma, maligno; carcinoma de células de Sertoli; tumor de células de Leydig, maligno; tumor de células lipídicas, maligno; paraganglioma, maligno; paraganglioma extramamario, maligno; feocromocitoma; glomangiosarcoma; melanoma maligno; melanoma amelanótico; melanoma de diseminación superficial; melanoma maligno en nevo pigmentado gigante; melanoma de células epitelioides; nevo azul, maligno; sarcoma; fibrosarcoma; histiocitoma fibroso, maligno; mixosarcoma; liposarcoma; leiomiosarcoma; rabdomiosarcoma; rabdomiosarcoma embrionario; rabdomiosarcoma alveolar; sarcoma estromal; tumor mixto, maligno; tumor mixto mulleriano; nefroblastoma; hepatoblastoma; carcinosarcoma; mesenquimoma, maligno; tumor de Brenner, maligno; tumor filoides, maligno; sarcoma sinovial; mesotelioma, maligno; disgerminoma; carcinoma embrionario; teratoma, maligno; bocio de ovario, maligno; coriocarcinoma; mesonefroma, maligno; hemangiosarcoma; hemangioendotelioma, maligno; sarcoma de Kaposi; hemangiopericitoma, maligno; limfangiosarcoma; osteosarcoma; osteosarcoma yuxtacortical; condriosarcoma; condroblastoma, maligno; condriosarcoma mesenquimal; tumor óseo de células gigantes; sarcoma de Ewing; tumor odontogénico, maligno; odontosarcoma ameloblástico; ameloblastoma, maligno; fibrosarcoma ameloblástico; pinealoma, maligno; cordoma; glioma, maligno; ependimoma; astrocitoma; astrocitoma protoplásmico; astrocitoma fibrilar; astroblastoma; glioblastoma; oligodendroglioma; oligodendroblastoma; neuroectodérmico primitivo; sarcoma cerebeloso; ganglioneuroblastoma; neuroblastoma; retinoblastoma; tumor neurogénico olfatorio; meningioma, maligno; neurofibrosarcoma; neurilemoma, maligno; tumor de células granulares, maligno; linfoma maligno; enfermedad de Hodgkin; paragranuloma de Hodgkin; linfoma linfocítico de células pequeñas maligno; linfoma maligno difuso de células grandes; linfoma maligno, folicular; micosis fungoide; otros linfomas no de Hodgkin especificados; histiocitosis maligna; mieloma múltiple; sarcoma mastocítico; enfermedad inmunoproliferativa del intestino delgado; leucemia; leucemia linfoide; leucemia de células plasmáticas; eritroleucemia; leucemia de células de linfosarcoma; leucemia mieloide; leucemia basófila; leucemia eosinófila; leucemia monocítica; leucemia de mastocitos; leucemia megacarioblástica; sarcoma mieloide; y leucemia de células pilosas.
En una realización particular, la invención contempla métodos de uso de un complejo oligonucleótido-lípido que comprende poner en contacto una población de células enfermas in vivo con una cantidad terapéuticamente eficaz de un complejo oligonucleótido-lípido durante un período de tiempo suficiente para inhibir o revertir la enfermedad. En una realización, el contacto in vivo se logra administrando, por vía intravenosa, intraperitoneal, inyección subcutánea o intratumoral, una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición fisiológicamente tolerable que comprende un complejo oligonucleótido-lípido de esta invención a un paciente. El complejo oligonucleótido-lípido se puede administrar por vía parenteral mediante inyección o mediante perfusión gradual a lo largo del tiempo.
Las composiciones terapéuticas que comprenden un complejo oligonucleótido-lípido se administran convencionalmente por vía intravenosa o subcutánea, tal como por inyección de una dosis unitaria, por ejemplo. La expresión "dosis unitaria" cuando se usa en referencia a una composición terapéutica se refiere a unidades físicamente concretas adecuadas como dosificación unitaria para el sujeto, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el diluyente requerido, es decir, excipiente o vehículo.
Las composiciones se administran de manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad terapéuticamente eficaz. La cantidad para administrar depende del sujeto que se va a tratar, la capacidad del sistema del sujeto para utilizar el principio activo y el grado de efecto terapéutico deseado. Las cantidades precisas de principio activo que se requiere administrar dependen del criterio del médico y son peculiares de cada individuo. Sin embargo, los intervalos de dosificación adecuados para la administración sistémica se divulgan en el presente documento y dependen de la vía de administración. También se contemplan regímenes adecuados para la administración inicial y de refuerzo y se caracterizan por una administración inicial seguida de dosis repetidas a intervalos de una o más horas mediante una inyección posterior u otra administración. Ejemplos de administraciones múltiples se describen en el presente documento y se prefieren particularmente para mantener continuamente altos niveles de polipéptido en suero y tejido. Como alternativa, se contempla la perfusión intravenosa continua suficiente para mantener las concentraciones en la sangre en los intervalos especificados para las terapias in vivo.
Se contempla que un método de la invención puede requerir la administración de una composición de oligonucleótidos sistémica o localmente para tratar enfermedades, tales como inhibir el crecimiento de células tumorales o destruir células cancerosas en pacientes de cáncer con cánceres metastásicos o localmente avanzados. Se pueden administrar por vía intravenosa, vía intratecal, vía subcutánea y/o intraperitoneal. Se pueden administrar solos o en combinación con fármacos antiproliferativos. En una realización, se administran para reducir la carga de cáncer en el paciente antes de la cirugía u otros procedimientos. Como alternativa, se pueden administrar después de la cirugía para asegurar que cualquier cáncer remanente (p. ej., cáncer que la cirugía no pudo eliminar) no sobreviva.
Una cantidad terapéuticamente efectiva de un oligonucleótido es una cantidad predeterminada calculada para lograr el efecto deseado, es decir, para inhibir la proliferación de células cancerosas. Por lo tanto, los intervalos de dosificación para la administración de los oligonucleótidos de la invención son los suficientemente amplios para producir el efecto deseado. La dosis no debe ser tan grande como para causar efectos secundarios adversos, tales como los síndromes de hiperviscosidad, edema pulmonar, insuficiencia cardíaca congestiva, efectos neurológicos, y similares. Generalmente, la dosis variará con la edad, estado, sexo y la extensión de la enfermedad en el paciente y pueden ser determinados por un experto en la materia. La dosis puede ser ajustada por el médico individual en caso de cualquier complicación.
Una composición de la presente invención se administra preferentemente a un paciente por vía parenteral, por ejemplo mediante inyección intravenosa, intraarterial, intramuscular, intralinfática, intraperitoneal, subcutánea, intrapleural o intratecal, o puede usarse ex-vivo. Las dosis preferidas están entre 5-90 mg/m2. La administración se repite preferentemente según un esquema programado hasta que el cáncer desaparece o retrocede, y puede realizarse junto con otras formas de terapia.
XI. Preparaciones farmacéuticas
Una composición farmacéutica que comprende los liposomas normalmente incluirá una solución, vehículo o diluyente estéril farmacéuticamente aceptable, tal como agua o solución salina.
Cuando se lleve a cabo la administración clínica de un componente lipídico neutro (p. ej., en forma de liposoma) que contenga un oligonucleótido, generalmente será beneficioso preparar el complejo lipídico como una composición farmacéutica apropiada para la administración prevista. Normalmente, esto implicará preparar una composición farmacéutica que esté prácticamente exenta de pirógenos, así como cualquier otra impureza que pudiera ser dañina para humanos o animales. También se pueden emplear tampones apropiados para hacer que el complejo sea estable y permitir la absorción por parte de las células diana.
Las expresiones "farmacéuticamente aceptable" o "farmacológicamente aceptable" se refieren a entidades moleculares y composiciones que no producen efectos adversos, reacciones alérgicas u otras reacciones no deseadas cuando se administran a un animal, tal como un ser humano, según sea adecuado. La preparación de una composición farmacéutica que contiene al menos un componente lipídico no cargado que comprende un oligonucleótido o un principio activo adicional será conocida por los expertos en la materia a la luz de la presente divulgación, como se ilustra en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a, 2005. Asimismo, para la administración en animales (p. ej., humanos), se entenderá que los preparados deben cumplir con la esterilidad, la pirogenicidad, las normas generales de seguridad y pureza según lo exige la Oficina de Estándares Biológicos de la FDA.
Como se usa en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, tensioactivos, antioxidantes, conservantes (p. ej., agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotónicos, agentes que retrasan la absorción, sales, conservantes, fármacos, estabilizadores de fármacos, geles, aglutinantes, excipientes, agentes disgregantes, lubricantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, tintes, tales como materiales y combinaciones de los mismos, como sabría un experto en la materia. Un vehículo farmacéuticamente aceptable se formula preferentemente para su administración a un ser humano, aunque en ciertas realizaciones puede ser deseable usar un vehículo farmacéuticamente aceptable que se formula para la administración a un animal no humano pero que no sería aceptable (p. ej., debido a regulaciones gubernamentales) para la administración a un ser humano. Excepto en la medida en que cualquier vehículo convencional sea incompatible con el principio activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas o farmacéuticas.
La cantidad de dosificación real de una composición de la presente invención administrada a un paciente o sujeto puede determinarse mediante factores físicos y fisiológicos tales como peso corporal, gravedad de la afección, el tipo de enfermedad a tratar, intervenciones terapéuticas previas o simultáneas, idiopatía del paciente y la vía de administración. El médico responsable de la administración, en cualquier caso, determina la concentración del principio(s) activo(s) en una composición y la(s) dosis apropiada(s) para el sujeto individual.
En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas pueden comprender, por ejemplo, al menos aproximadamente del 0,1 % de un compuesto activo. En otras realizaciones, un compuesto activo puede comprender entre aproximadamente el 2 % y aproximadamente el 75 % del peso de la unidad, o entre aproximadamente el 25 % y aproximadamente el 60 %, por ejemplo, y cualquier intervalo derivable de los mismos. En otros ejemplos no limitativos, una dosis también puede comprender de aproximadamente 1 microgramo/kg/peso corporal, aproximadamente 5 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 10 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 50 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 100 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 200 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 350 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 500 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 1 miligramo/kg/peso corporal, aproximadamente 5 miligramo/kg/peso corporal, aproximadamente 10 miligramo/kg/peso corporal, aproximadamente 50 miligramo/kg/peso corporal, aproximadamente 100 miligramo/kg/peso corporal, aproximadamente 200 miligramo/kg/peso corporal, aproximadamente 350 miligramo/kg/peso corporal, aproximadamente 500 miligramo/kg/peso corporal, a aproximadamente 1000 mg/kg/peso corporal o más por administración, y cualquier intervalo derivable de los mismos. En ejemplos no limitativos de un intervalo derivable de los números enumerados en el presente documento, se puede administrar un intervalo de aproximadamente 5 pg/kg/peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg/peso corporal, de aproximadamente 5 microgramos/kg/peso corporal a aproximadamente 500 miligramos/kg/peso corporal, etc.
Un oligonucleótido de las presentes realizaciones se puede administrar en una dosis de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más pg de ácido nucleico por dosis. Cada dosis puede estar en un volumen de 1, 10, 50, 100, 200, 500, 1000 o más pl o ml.
Las soluciones de composiciones terapéuticas se pueden preparar en agua mezclada adecuadamente con un tensioactivo, tal como la hidroxipropilcelulosa. También se pueden preparar dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos, mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.
Las composiciones terapéuticas de la presente invención pueden administrarse en forma de composiciones inyectables como soluciones líquidas o suspensiones; también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en, líquido antes de la inyección. Estas preparaciones también se pueden emulsionar. Una composición típica para tal fin comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, la composición puede contener 10 mg, 25 mg, 50 mg o hasta aproximadamente 100 mg de seroalbúmina humana por mililitro de solución salina tamponada con fosfato. Otros vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones acuosas, excipientes no tóxicos, incluyendo sales, conservantes, tampones y similares.
Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceite vegetal y ésteres orgánicos inyectables tales como el oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, soluciones salinas, vehículos parenterales tales como el cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, etc. Los vehículos intravenosos incluyen reponedores de líquidos y nutrientes. Los conservantes incluyen agentes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes. El pH y la concentración exacta de los diversos componentes de la composición farmacéutica se ajustan según parámetros bien conocidos.
Las composiciones terapéuticas de la presente invención pueden incluir preparaciones farmacéuticas clásicas. La administración de las composiciones terapéuticas de acuerdo con la presente invención se realizará por cualquier vía común siempre que el tejido diana esté disponible por esa vía. Esto incluye la vía oral, nasal, bucal, rectal, vaginal o tópica. La administración tópica puede ser particularmente ventajosa para el tratamiento de cánceres de piel, para prevenir la alopecia inducida por quimioterapia u otro trastorno hiperproliferativo dérmico. Como alternativa, la administración puede ser por inyección ortotópica, intradérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa. Dichas composiciones normalmente se administrarían como composiciones farmacéuticamente aceptables que incluyen vehículos fisiológicamente aceptables, tampones u otros excipientes. Para el tratamiento de afecciones de los pulmones, se puede utilizar la administración de aerosoles. El volumen del aerosol está entre aproximadamente 0,01 ml y 0,5 ml.
Se determina una cantidad eficaz de la composición terapéutica en función del objetivo previsto. La expresión "dosis unitaria" o "dosis" se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas para su uso en un sujeto, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de la composición terapéutica calculada para producir las respuestas deseadas descritas anteriormente en asociación con su administración, es decir, la vía y el régimen de tratamiento adecuados. La cantidad a administrar, tanto por número de tratamientos como por dosis unitaria, depende de la protección o efecto deseado.
Las cantidades precisas de la composición terapéutica también dependen del criterio del médico y son peculiares de cada individuo. Los factores que afectan a la dosis incluyen el estado físico y clínico del paciente, la vía de administración, el objetivo previsto del tratamiento (p. ej., alivio de los síntomas frente a la cura) y la potencia, estabilidad y toxicidad de la sustancia terapéutica particular.
XII. Tratamientos combinados
En ciertas realizaciones, los métodos de la presente invención implican la administración de un oligonucleótido inhibidor, u oligonucleótido capaz de expresar un inhibidor de la expresión génica, en combinación con una segunda terapia o terapia adicional. Los métodos y composiciones que incluyen terapias combinadas potencian el efecto terapéutico o protector y/o aumentan el efecto terapéutico de otra terapia anticancerosa o antihiperproliferativa. Los métodos y composiciones terapéuticos y profilácticos se pueden proporcionar en una cantidad combinada efectiva para lograr el efecto deseado, tal como la destrucción de una célula cancerosa y/o la inhibición de la hiperproliferación celular. Este proceso puede implicar el contacto de las células con un inhibidor de la expresión génica y una segunda terapia, como un análogo de citidina (decitabina). Un tejido, el tumor o la célula se pueden poner en contacto con una o más composiciones o formulación(es) farmacológica(s) que incluyen uno o más de los agentes (es decir, un inhibidor de la expresión génica o un agente anticanceroso), o se puede poner en contacto el tejido, tumor y/o célula con dos o más composiciones o formulaciones distintas, en donde una composición proporciona 1) un oligonucleótido inhibidor; 2) un agente anticanceroso, o 3) un oligonucleótido inhibidor y un agente anticanceroso. Igualmente, se contempla que dicha terapia combinada pueda usarse junto con una quimioterapia, radioterapia, tratamiento quirúrgico o inmunoterapia.
Se puede administrar un oligonucleótido inhibidor antes, durante, después o en varias combinaciones relativas a un tratamiento anticanceroso. Las administraciones pueden realizarse en intervalos que van desde al mismo tiempo hasta minutos, días o semanas. En realizaciones en las que el oligonucleótido inhibidor se proporciona a un paciente por separado de un agente anticanceroso, por lo general, se aseguraría de que no transcurriera un período de tiempo significativo entre el momento de cada administración, de manera que los dos compuestos todavía podrían ejercer un efecto combinado ventajoso sobre el paciente. En dichos casos, se contempla que se puede proporcionar a un paciente la terapia con oligonucleótidos inhibidores y la terapia anticancerosa con un intervalo de aproximadamente 12 a 24 o 72 h entre sí y, más preferentemente, con un intervalo de aproximadamente 6-12 h entre sí. En algunas situaciones, puede ser deseable extender significativamente el período de tiempo para el tratamiento de modo que entre las administraciones respectivas transcurren desde varios días (2, 3, 4, 5, 6 o 7) hasta varias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8).
En ciertas realizaciones, un ciclo de tratamiento durará 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 días o más. Se contempla que se pueda administrar un agente los días 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 y/o 90, cualquier combinación de los mismos y otro agente se administra los días 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 y/o 90, o cualquier combinación de los mismos. En un solo día (período de 24 horas), el paciente puede recibir una o varias administraciones del (de los) agente(s). Asimismo, después de un ciclo de tratamiento, se contempla que exista un periodo de tiempo en el que no se administre tratamiento anticanceroso. Este período de tiempo puede durar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 días y/o 1, 2, 3, 4, 5 semanas y/o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 meses o más, dependiendo del estado del paciente, como su pronóstico, concentración, el estado de salud, etc.
Se pueden emplear varias combinaciones. Para el siguiente ejemplo, una terapia de oligonucleótido inhibidor es "A" y una terapia anticancerosa es "B":
A /B /A B/A/B B/B/A AIA/B A/B/B B /A /A A/B/B/B
B/A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A
B/B /A /A B /A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B /A /A /A A /B /A /A
A /A /B /A
La administración de cualquier compuesto o terapia de la presente invención a un paciente seguirá los protocolos generales para la administración de tales compuestos, teniendo en cuenta la toxicidad, si acaso, de los agentes. Por consiguiente, en algunas realizaciones hay una etapa de control de la toxicidad que es atribuible a la terapia combinada. Se espera que los ciclos de tratamiento se repitan según sea necesario. También se contempla que diversas terapias estándar, así como la intervención quirúrgica, puede aplicarse en combinación con la terapia descrita.
En aspectos específicos, se contempla que una terapia estándar incluirá quimioterapia, radioterapia, inmunoterapia, terapia quirúrgica o terapia génica y puede emplearse en combinación con el inhibidor de la terapia de expresión génica, terapia anticancerosa, o tanto el inhibidor de la terapia de expresión génica como la terapia anticancerosa, como se describe en el presente documento.
A. Quimioterapia
Se puede usar una amplia variedad de agentes quimioterapéuticos de acuerdo con las presentes realizaciones. El término "quimioterapia" se refiere al uso de fármacos para tratar el cáncer. Un "agente quimioterapéutico" se usa para indicar un compuesto o composición que se administra en el tratamiento del cáncer. Estos agentes o fármacos se clasifican por su modo de actividad dentro de una célula, por ejemplo, si afectan y en qué etapa afectan al ciclo celular. Como alternativa, un agente puede caracterizarse en función de su capacidad para reticular directamente el ADN, para intercalar en el ADN, o para inducir anomalías cromosómicas y mitóticas al afectar la síntesis de ácidos nucleicos.
Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes, tales como tiotepa y ciclosfosfamida; sulfonatos de alquilo, tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas, tales como la benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas, incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (tales como bullatacina y bullatacinona); una camptotecina (incluido el topotecán análogo sintético); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluidos sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluidos los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas nitrogenadas, tales como clorambucilo, clornafacina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida y mostaza de uracilo; nitrosureas, tales como la carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibióticos, tales como los antibióticos de enediyna (p. ej., caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gammalI y caliqueamicina omegaI1); dinemicina, incluyendo dinemicina A; bisfosfonatos, tales como clodronato; una esperamicina; así como cromóforo de neocarzinostatina y cromóforos de cromoproteína de antibióticos de enediyna relacionados, aclacinomisinas, actinomicina, autarranicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (incluyendo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina y desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, tales como la mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina y zorubicina; antimetabolitos, tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico, tales como denopterina, pteropterina y trimetrexato; análogos de purina, tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina y tioguanina; análogos de pirimidina, tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, decitabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina y floxuridina; andrógenos, tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano y testolactona; antiadrenérgicos, tales como mitotano y trilostano; reponedor de ácido fólico, tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diacicuona; elformitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidainina; maitansinoides, tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etilhidracida; procarbacina; complejo PSKpolisacárido; razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triacicuona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente la toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbacina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; taxoides, p. ej., paclitaxel y docetaxel gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; complejos de coordinación de platino, tales como cisplatino, oxaliplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; novantrona; tenipósido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; irinotecán (p. ej., CPT-11); inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); inhibidores de tirosina cinasa, tales como imatinib, nilotinib, dasatinib, bosutinib, ponatinib y bafetinib; retinoides, tales como ácido retinoico; capecitabina; carboplatino, procarbazina, plicomicina, gemcitabina, navelbina, inhibidores de la farnesil-proteína transferasa, transplatino y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores.
B. Radioterapia
Otros factores que causan daño en el ADN y que se han utilizado ampliamente incluyen lo que comúnmente se conoce como rayos y, rayos X y/o la administración dirigida de radioisótopos a las células tumorales. También se contemplan otras formas de factores que dañan el ADN, tales como las microondas, irradiación con haz de protones (Patentes de EE.UU. números 5.760.395 y 4.870.287) e irradiación UV. Lo más probable es que todos estos factores afecten a una amplia gama de daños en el ADN, a los precursores del ADN, a la replicación y reparación del ADN, y al ensamblaje y mantenimiento de los cromosomas. Los intervalos de dosificación para loa rayos X van desde dosis diarias de 50 a 200 roentgens durante períodos prolongados (3 a 4 semanas), hasta dosis únicas de 2000 a 6000 roentgens. Los intervalos de dosis para los radioisótopos varían ampliamente y dependen de la vida media del isótopo, la fuerza y el tipo de radiación emitida, y la captación por las células neoplásicas.
Los términos "contactado" y "expuesto", cuando se aplica a una célula, se utilizan en el presente documento para describir el proceso mediante el cual una construcción terapéutica y un agente quimioterapéutico o radioterapéutico se administran a una célula diana o se colocan en yuxtaposición directa con la célula diana. Para lograr la muerte celular, por ejemplo, ambos agentes se administran a una célula en una cantidad combinada eficaz para destruir la célula o evitar que se divida.
C. Inmunoterapia
En el contexto del tratamiento del cáncer, los inmunoterapéuticos, generalmente, se basan en el uso de células y moléculas efectoras inmunitarias para atacar y destruir las células cancerosas. Trastuzumab (Herceptin™) es un ejemplo de ello. El efector inmunitario puede ser, por ejemplo, un anticuerpo específico para algún marcador en la superficie de una célula tumoral. El anticuerpo solo puede servir como efector de la terapia o puede reclutar a otras células para afectar realmente a la muerte celular. El anticuerpo también puede conjugarse con un fármaco o toxina (quimioterapéutico, radionucleido, cadena de ricina A, toxina del cólera, toxina pertussis, etc.) y sirven simplemente como un agente de direccionamiento. Como alternativa, el efector puede ser un linfocito que lleva una molécula de superficie que interactúa, ya sea directa o indirectamente, con una diana de células tumorales. Varias células efectoras incluyen linfocitos T citotóxicos y linfocitos NK. La combinación de modalidades terapéuticas, es decir, la actividad citotóxica directa y la inhibición o reducción de ErbB2 proporcionarían un beneficio terapéutico en el tratamiento de los cánceres que sobreexpresan ErbB2.
También podría usarse otra inmunoterapia como parte de una terapia combinada con la terapia de silenciamiento génico descrita anteriormente. En un aspecto de la inmunoterapia, la célula tumoral debe tener algún marcador que sea susceptible de ser diana, es decir, que no está presente en la mayoría de las otras células. Existen muchos marcadores tumorales y cualquiera de estos puede ser adecuado para el direccionamiento en el contexto de la presente invención. Los marcadores tumorales comunes incluyen antígeno carcinoembrionario, antígeno específico de la próstata, antígeno asociado a tumor urinario, antígeno fetal, tirosinasa (p97), gp68, TAG-72, HMFG, Antígeno Sialil Lewis, MucA, MucB, PLAP, receptor de estrógeno, receptor de laminina, erb B y p155. Un aspecto alternativo de la inmunoterapia es combinar efectos anticancerosos con efectos inmunoestimuladores. También existen moléculas inmunoestimulantes que incluyen: citocinas tales como IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, gamma-IFN, quimiocinas tales como MIP-1, MCP-1, IL-8 y factores de crecimiento tales como el ligando FLT3. La combinación de moléculas inmunoestimulantes, ya sea como proteínas o el uso de la administración de genes en combinación con un supresor de tumores, se ha demostrado que aumenta los efectos antitumorales. Asimismo, pueden usarse anticuerpos contra cualquiera de estos compuestos para dirigirse a los agentes anticancerosos descritos en el presente documento.
Ejemplos de inmunoterapias actualmente en investigación o en uso son los adyuvantes inmunológicos, por ejemplo, Mycobacterium bovis, Plasmodium falciparum, dinitroclorobenceno y compuestos aromáticos (Patentes de EE. UU. números 5.801.005 y 5.739.169; Hui y Hashimoto, 1998; Christodoulides et al., 1998), terapia con citocinas, p. ej., interferones a, p y y; IL-1, GM-CSF y TNF (Bukowski et al., 1998; Davidson et al., 1998; Hellstrand et al., 1998), terapia génica, p. ej., TNF, IL-1, IL-2, p53 (Qin et al., 1998; Austin-Ward y Villaseca, 1998; Patentes de EE.UU. números 5.830.880 y 5.846.945) y anticuerpos monoclonales, p. ej., antigangliósido GM2, anti-HER-2, anti-p185 (Pietras et al., 1998; Hanibuchi et al., 1998; patente de EE. Uu . n.° 5.824.311). Se contempla que se pueden emplear una o más terapias anticancerosas con las terapias de silenciamiento génico descritas en el presente documento.
En inmunoterapia activa, se administra un péptido antigénico, un polipéptido o una proteína, o una composición de células tumorales autólogas o alogénicas o una "vacuna", generalmente con un adyuvante bacteriano distinto (Ravindranath y Morton, 1991; Morton et al., 1992; Mitchell et al., 1990; Mitchell et al., 1993).
En la inmunoterapia adoptiva, los linfocitos circulantes del paciente, o los linfocitos infiltrados en el tumor, se aíslan in vitro, se activan con linfocinas tales como IL-2 o se transducen con genes para necrosis tumoral y se readministran (Rosenberg et al., 1988; 1989).
Cirugía
Aproximadamente el 60 % de las personas con cáncer se someterán a algún tipo de cirugía, que incluye la cirugía preventiva, de diagnóstico o estadificación, curativa y paliativa. La cirugía curativa es un tratamiento contra el cáncer que puede usarse junto con otras terapias, tales como el tratamiento de la presente invención, quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal, terapia génica, inmunoterapia y/o terapias alternativas.
La cirugía curativa incluye la resección en la que se elimina, extirpa y/o destruye físicamente todo o parte del tejido canceroso. La resección de un tumor se refiere a la eliminación física de al menos una parte de un tumor. Además de la resección del tumor, el tratamiento por cirugía incluye cirugía láser, criocirugía, electrocirugía y cirugía controlada microscópicamente (cirugía de Mohs). Se contempla además que la presente invención se pueda utilizar junto con la eliminación de cánceres superficiales, precánceres, o cantidades incidentales de tejido normal.
Tras la escisión de una parte o la totalidad de las células cancerosas, tejido o tumor, se puede formar una cavidad en el cuerpo. El tratamiento puede llevarse a cabo por perfusión, inyección directa o aplicación local del área con una terapia anticancerosa adicional. Dicho tratamiento puede repetirse, por ejemplo, cada 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7 días, o cada 1, 2, 3, 4 y 5 semanas o cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses. Estos tratamientos también pueden ser de dosis variables.
E. Otros agentes
Se contempla que se puedan usar otros agentes en combinación con ciertos aspectos de las presentes realizaciones para mejorar la eficacia terapéutica del tratamiento. Estos agentes adicionales incluyen agentes que afectan a la regulación positiva de los receptores de la superficie celular y las uniones GAP, agentes citostáticos y de diferenciación, inhibidores de la adhesión celular, agentes que aumentan la sensibilidad de las células hiperproliferativas a los inductores apoptóticos u otros agentes biológicos. Los aumentos en la señalización intercelular al elevar el número de uniones GAP aumentarían los efectos antihiperproliferativos en la población de células hiperproliferativas vecinas. En otras realizaciones, los agentes citostáticos o de diferenciación se pueden usar en combinación con ciertos aspectos de las presentes realizaciones para mejorar la eficacia antihiperproliferativa de los tratamientos. Se contemplan inhibidores de la adhesión celular para mejorar la eficacia de las presentes realizaciones. Ejemplos de inhibidores de la adhesión celular son los inhibidores de la cinasa de adhesión focal (Focal Adhesion Kinase, FAK) y la lovastatina. Se contempla además que se puedan utilizar otros agentes que aumentan la sensibilidad de una célula hiperproliferativa a la apoptosis, tal como el anticuerpo c225, en combinación con ciertos aspectos de las presentes realizaciones para mejorar la eficacia del tratamiento.
XNI. Ejemplos
Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar la invención. Los expertos en la materia deben apreciar que las técnicas divulgadas en los ejemplos siguientes representan técnicas descubiertas por el inventor para funcionar bien en la práctica de la invención y, por tanto, se puede considerar que constituyen modos preferidos para su práctica. Sin embargo, los expertos en la materia, a la luz de la presente divulgación, deberían apreciar que se pueden realizar muchos cambios en las realizaciones específicas que se divulgan y aún así obtener un resultado parecido o similar.
Ejemplo 1: Estudio de fase I de BP1001 (Grb2 antisentido liposomal) en pacientes con neoplasias malignas hematológicas
Esencial para la señalización de células cancerosas, la proteína de unión al receptor del factor de crecimiento 2 (Grb2) es utilizada por las tirosina cinasas oncogénicas para activar Ras y ERK. BP1001 es un antisentido incorporado en liposomas que inhibe la expresión de Grb2. El estudio tuvo como objetivo definir la seguridad, dosis máxima tolerada (MTD), farmacocinética y actividad antileucémica de BP1001 en pacientes con neoplasias malignas hematológicas.
Fármaco BP1001 y administración. La secuencia del oligo antisentido de Grb2 es: 5'-ATA TTT GGC GAT GGC TTC-3' (SEQ ID NO: 1), que se dirige a los codones 2-7 del ARNm de grb2 humana. El oligo antisentido de Grb2, compuesto de la modificación del oligo P-etoxi, fue fabricado por Nitto Denko Avecia, Inc. (8560 Reading Road, Cincinnati, Ohio 45215, EE. UU.). El oligo antisentido de Grb2 se incorporó al lípido 1,2-dioleoil-3-fosfatidilcolina (Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, Estados Unidos), mediante un protocolo de liofilización. BP1001 se preparó como un fármaco en polvo de 5 mg y se almacenó a 4 °C. El día de la perfusión del fármaco, se añadieron dos ml de solución salina normal al 0,9 % para lograr una concentración final de BP1001 de 2,5 mg/ml. A los participantes se les administraron perfusiones intravenosas (IV) de 2 a 3 horas de BP1001 dos veces por semana (cada 3 o 4 días) durante 28 días. Los participantes pudieron recibir hasta 6 ciclos de tratamiento, si continuaban beneficiándose del tratamiento.
Paciente y diseño del estudio. El estudio fue diseñado como un ensayo estándar de aumento escalonado de la dosis 3+3 para la evaluación de la seguridad, farmacocinética y eficacia de BP1001 en pacientes adultos diagnosticados con LMC con cromosoma Filadelfia positivo resistente/recidivante, LLA, LMA o SMD. Se incluyeron cohortes de tres pacientes en cada nivel de dosis. La dosis inicial de BP1001 fue de 5 mg/m2 (Cohorte 1). Si un paciente desarrollaba una toxicidad de grado 3 o superior, tres pacientes más se añadían a ese nivel de dosis. Si dos o más pacientes desarrollaban una toxicidad de grado 3 o superior, ese nivel de dosis se consideró tóxico. La dosis máxima tolerada (MTD) se definió como la dosis inferior a la que produce toxicidad limitante de la dosis en dos o más pacientes. Las toxicidades se calificaron utilizando los Criterios de Terminología Común para Acontecimientos Adversos del Instituto Nacional del Cáncer (NCI CTCAE, versión 3.0). Si no se observaba toxicidad limitante de la dosis (DLT), los pacientes se incluían secuencialmente en la Cohorte 2 (10 mg/m2), Cohorte 3 (20 mg/m2), Cohorte 4 (40 mg/m2), Cohorte 5 (60 mg/m2), o Cohorte 6 (90 mg/m2).
Al completar las cohortes 1-6 de la fase I de BP1001 como agente único, se estudió la seguridad y eficacia de la combinación de BP1001 y citarabina a dosis bajas (fase Ib). BP1001 se administró por vía IV a 60 mg/m2 (Cohorte 7) o 90 mg/m2 (Cohorte 8). Los pacientes recibieron tres inyecciones de BP1001 antes de administrarles 20 mg de citarabina en dosis baja (LDAC) por vía subcutánea, dos veces al día durante 10 días continuos. Este estudio se registró en ClinicalTrials.gov, número NCT01159028.
Evaluaciones de sangre periférica y médula ósea. Las evaluaciones de sangre periférica se realizaron al inicio (dentro de los 14 días posteriores al inicio del estudio) y los días 1, 8, 15, 22, al completar el primer ciclo, y según indicación clínica. Las evaluaciones de la médula ósea se realizaron al inicio (dentro de los 14 días del inicio del estudio), al finalizar el primer ciclo, ciclo 2, y según indicación clínica. Los datos de citogenética iniciales se obtuvieron antes del tratamiento. Se realizó un análisis molecular para detectar mutaciones somáticas inicialmente en la médula ósea.
Citometría de flujo. Se recogió sangre periférica de pacientes en las cohortes 3, 4, 5 y 6, antes de recibir la dosis en los días 1, 8, 15 y 22 del Ciclo 1, y el día 1 del Ciclo 2. Los leucocitos se aislaron de sangre periférica utilizando tubos de preparación celular BD Vacutainer CPT con heparina sódica (BD Dickinson), se fijaron y almacenaron en congelador a -80 °C. Se utilizó citometría de flujo para determinar los niveles de Grb2 y Erk1,2 fosforilada (pErk) en células que expresan CD33 usando un método validado (Flow Contract Site Laboratory, Bothell, WA, EE. UU.). Recogida y análisis de muestras para farmacocinética. Se recogieron muestras de sangre para medir las concentraciones de oligo antisentido de Grb2 de pacientes en las cohortes 7 y 8, antes de la dosis, 1,2, 4, 6, 8, 24, 72 h después del inicio de la perfusión (start-of-infusion, SOI). También se recogieron muestras de orina para medir las concentraciones de BP1001 de los pacientes en las cohortes 7 y 8, al inicio de la dosis-4 h, 4-8 h después de la dosis y 8-24 h después de la dosis. Las muestras de sangre para FC se procesaron para obtener plasma y se analizaron usando un método validado (Charles River Laboratories, Montreal, Canadá) con un límite inferior de cuantificación (LLOQ; 0,5 ng/ml). Las muestras de orina se analizaron utilizando un método validado (Charles River Laboratories, Montreal, Canadá) con un LLOQ de 1,00 ng/ml.
Los parámetros farmacocinéticos se estimaron utilizando el software de farmacocinética Phoenix (Certara). Se utilizó un enfoque no compartimental concordante con la vía de administración de perfusión IV para la estimación de los parámetros, utilizando un tiempo de perfusión estimado de 2,5 h. Todos los parámetros se generaron a partir de concentraciones individuales de oligo antisentido de Grb2 en plasma desde el Día 1 del Ciclo 1, siempre que fue posible. Los valores de concentración antes de la dosis del Ciclo 1, Día 1 fueron < LLOQ y, por lo tanto, se supuso que el valor del tiempo cero era cero. Los parámetros se estimaron utilizando tiempos de muestreo nominales con respecto al inicio de la perfusión. El área bajo la curva (Area Under the Curve, AUC) de concentración frente al tiempo se calculó utilizando el método trapezoidal lineal con interpolación lineal. La pendiente de la fase de eliminación terminal se determinó mediante regresión lineal logarítmica a partir de los datos de concentración no ponderados. Los parámetros que dependen de la determinación de la fase de eliminación terminal no se daban si el coeficiente de determinación (R2) era inferior a 0,800, o si la extrapolación del AUC al infinito (% AUCextrap) representaba más del 20 % del área total.
Los parámetros estimados a partir del plasma fueron: Tmáx., el tiempo después de la dosificación en el que se observó la concentración máxima observada; Cmáx, la concentración máxima observada medida después de la dosificación; T1/2, semivida de eliminación terminal aparente; AUC(0-24), AUC desde la dosificación hasta las 24 h posteriores a la administración; ABC(0-t), AUC desde la dosificación hasta el momento posterior a la dosificación en el que se observó la última concentración cuantificable; ABC(0-inf), AUC estimada desde la dosificación hasta el infinito; Cl , tasa de aclaramiento aparente del oligo antisentido de Grb2; Vz, volumen aparente de distribución del oligo antisentido de Grb2.
La estimación de los parámetros urinarios se realizó con Microsoft Excel. Todos los parámetros se generaron a partir de concentraciones individuales de oligo antisentido de Grb2 en la orina del Día 1 del Ciclo 1. Los parámetros descritos fueron: U total, cantidad acumulada de oligo antisentido de Grb2 excretado en la orina durante todo el período de muestreo; CLr, aclaramiento renal en relación con el plasma; por ciento recuperado, cantidad relativa de oligo antisentido de Grb2 excretada en la orina en comparación con el fármaco total administrado.
Análisis estadístico. El análisis FC, así como la generación de tablas y gráficos, fueron generados con Phoenix versión 1.4. Los estadísticos descriptivos (N, media aritmética, desviación estándar) para agrupar y clasificar las variables apropiadas se generaron utilizando Phoenix versión 1.4 y Microsoft Excel 2007.
Objetivos del estudio. Los objetivos principales del estudio de fase I de BP1001 fueron determinar la toxicidad y la tolerancia de dosis crecientes de BP1001 como terapia de agente único; determinar la dosis máxima tolerada (Maximum Tolerated Dose, MTD) de BP1001; y determinar la toxicidad y tolerancia de BP101 en combinación con citarabina en dosis bajas (Ara-C; Fase Ib). Los objetivos secundarios del estudio de fase I BP1001 fueron determinar la dosis biológicamente activa óptima (OBAD; definida como una reducción del 50 % en la expresión de Grb2 en células leucémicas circulantes); determinar la farmacocinética in vivo de BP1001; y evaluar la respuesta del tumor.
Criterios de inclusión y de exclusión. Ambas partes del estudio emplearon un diseño abierto, secuencial, con aumento escalonado de la dosis para evaluar la seguridad, tolerabilidad y toxicidad, FC, respuesta tumoral y actividad antileucémica. Los criterios de inclusión fueron tener al menos 18 años; tener LMA resistente o LMA reemplazada, LMC Ph+, LLA o SMD; no haber recibido terapia anticancerosa durante al menos dos semanas antes de la entrada en el estudio (con la excepción de hidroxiurea o anagrelida (24 h), TKI 95 d) e interferón (2 semanas)); tener funciones hepáticas y renales adecuadas (ALT <2x ULN, creatinina sérica <2x ULN, bilirrubina sérica <2x ULN); y tener un estado funcional ECOG de 0-2. Los criterios de exclusión fueron tener enfermedades médicas intercurrentes graves que pudieran interferir con la capacidad del paciente para llevar a cabo el programa de tratamiento; y recibir otro producto de investigación dentro del plazo más largo de 14 días o 5 semividas del producto anterior.
Características del paciente. Se incluyeron en el estudio un total de 39 pacientes: 13 pacientes (cohorte 1), 6 pacientes (cohorte 2), 3 pacientes (cohorte 3), 3 pacientes (cohorte 4), 3 pacientes (cohorte 5), 4 pacientes (cohorte 6), 4 pacientes (cohorte 7) y 3 pacientes (cohorte 8). Cinco pacientes fueron diagnosticados con LMC en fase blástica, 30 pacientes con LMA y 4 pacientes con SMD (Tabla 3). La mediana de edad de los pacientes fue de 66 años, variando de 32 a 89 años de edad. Veintisiete eran pacientes masculinos y doce eran pacientes femeninas. Antes de la inclusión, los pacientes habían recibido una mediana de cuatro regímenes. La mediana de su estado funcional fue 1. La mediana del recuento de blastos en sangre periférica fue del 15 %, variando entre 0 y 96 %. Como era de esperar, estos pacientes tenían citogenética diversa, que incluía: t(9;22) (n = 7), diploide (n = 12), compleja (n = 10), varios (n = 13). Dos pacientes tenían LMC t(9;22)-positivo y citogenética compleja, mientras que un paciente tenía LMA t(9;22)-positivo.
Acontecimientos adversos en pacientes evaluables. De los 39 pacientes, 27 pacientes fueron evaluables. Doce pacientes no completaron un ciclo completo debido a la progresión de la enfermedad y fueron reemplazados por protocolo (Tabla 4). Entre los 27 pacientes evaluables, 21 pacientes estaban en terapia de BP1001 como agente único mientras que 6 pacientes estaban en terapia combinada BP1001 LDAC. Tal como se muestra en la Tabla 8, los pacientes evaluables tenían diversas anomalías moleculares en sus leucemias, que incluía ASXL1 (n = 1), BCR-ABL (n = 2; incluyendo T315I en 1), CEBPA (n = 4), DNMT3A (n = 1), FLT-ITD (n = 2), IDH1/2 (n = 3), JAK2 (n = 2), NOTCH1 (n = 1), NPM1 (n = 2), NRAS (n = 2), TET2 (n = 2), TP53 (n = 2). Las características de los pacientes incluidos se proporcionan en la Tabla 3.
Solo un paciente que recibió 5 mg/m2 experimentó una toxicidad limitante de la dosis (DLT), mucositis grado 3 y síndrome mano-pie, aunque en dosis altas de hidroxiurea en el caso de la LMC-FB proliferativa. El fármaco del estudio no se pudo descartar como un factor contribuyente, por lo que este acontecimiento se notificó como una DLT. Tras la ampliación a 6 pacientes, ningún otro paciente desarrolló una DLT. No se ha observado ninguna otra toxicidad relacionada con el fármaco en ninguno de los pacientes tratados. No se identificó una MTD. La HTD para BP1001 es de 90 mg/m2.
T l . r rí i l in inli
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a Los datos son n (intervalo) o % (intervalo) a menos que se indique lo contrario.
b Dos pacientes tenían LMC t(9;22)-positivo y citogenética compleja, mientras que un paciente tenía LMA t(9;22)-positivo.
T l 4. P i n i r hr
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Farmacocinética del oligo antisentido de Grb2. El límite inferior de cuantificación (LLOQ) de la concentración de oligo antisentido de Grb2 en plasma es 0,50 ng/ml. No hubo una concentración cuantificable de oligo antisentido de Grb2 en el punto de tiempo previo al estudio. Los niveles de oligo antisentido de Grb2 en plasma disminuyeron biexponencialmente (FIG.1). La concentración máxima de oligo antisentido de Grb2 en plasma se observó 1 hora después de la perfusión (FIG. 1). A las 72 h después de la perfusión, los niveles de oligo antisentido de Grb2 en plasma estaban por debajo del LLOQ o ligeramente por encima (FIG. 1). El t-i/2 del oligo antisentido de Grb2 en plasma varió de 22,2 a 37,7 h para la dosis de 60 mg/m2, y de 4,64 a 14,2 h para la dosis de 90 mg/m2 (Tabla 5). La Cmáxima, AUC(0-24), AUC(0-t) y AUC(0-inf) fueron similares para ambos niveles de dosis, a pesar de que hubo un aumento de 1,5 veces en la dosis de 60 a 90 mg/m2 (Tabla 5). El Vz disminuyó aproximadamente 1,5 veces y el CL aumentó aproximadamente 1,5 veces para el aumento de dosis de 60 a 90 mg/m2 (Tabla 5).
T l . n nr i n l m i BP1 1 n ni rf i n IV BP1 1
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La cantidad de oligo antisentido de Grb2 recuperada en la orina en comparación con la dosis total administrada varió de 0,04 a 3,23 % para la dosis de 60 mg/m2, y de 0,36 a 4,77 % para la dosis de 90 mg/m2 Las concentraciones medias de oligo antisentido de Grb2 en orina fueron mayores en la cohorte de 90 mg/m2 que en la cohorte de 60 mg/m2 (Tabla 6).
Ta l . n nr i n BP1 1 n rin n ni rf i n IV BP1 1
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BP1001 disminuyó los niveles de Grb2 y Erk1,2 (pErk) fosforilada. Se utilizó citometría de flujo para determinar los niveles de proteínas Grb2 y pErk en las células de leucemia circulantes de pacientes que estaban en terapia con BP1001 como agente único, y se expresaron como intensidad de fluorescencia media (MFI). La MFI de Grb2 y pErk durante el tratamiento se comparó con el valor inicial (Tabla 7). En la última muestra medida (fin de tratamiento o ciclo 1 día 22), BP1001 disminuyó > 25 % los niveles de Grb2 en 10 de 12 muestras y > 25 % los niveles de pErk en 7 de 12 muestras. La disminución promedio de los niveles de Grb2 fue del 49 % (intervalo: 28 % al 91 %) y en los niveles de pErk fue del 52 % (intervalo: 27 % al 91 %).
Tabla 7. Reducción de los niveles de Grb2 Erk tras la administración de BP1001
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NS = ninguna muestra recogida
Actividad antileucémica de BP1001. BP1001, como terapia de agente único, redujo >50% los blastos de sangre periférica en 9 de 21 pacientes y redujo >50 % los blastos de la médula ósea en 3 de 21 pacientes (Tabla 8). Por protocolo, los pacientes podían recibir tratamiento con BP1001 durante un máximo de 6 meses si presentaban una enfermedad estable (es decir, menos del 50 % de aumento de leucocitos durante las primeras 4 semanas de tratamiento) o si presentaban mejoría de la enfermedad. Cuatro pacientes completaron 2 ciclos de tratamiento y tres pacientes completaron 5 ciclos de tratamiento (Tabla 8). Estos siete pacientes tenían diversas anomalías citogenéticas y moleculares, tales como mutaciones en JAK2 y NRAS (Tabla 8).
Entre los seis pacientes evaluables que estaban en terapia combinada de BP1001 LDAC, tres pacientes recibieron 3 ciclos de tratamiento y un paciente recibió 5 ciclos de tratamiento (Tabla 8). Y lo que es más importante, tres pacientes lograron una remisión completa (blastos en la médula ósea <5 %) y dos pacientes lograron una remisión parcial (>50 % de reducción en los blastos en la médula ósea) (Tabla 8; FIG. 2).
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Ejemplo de referencia 2- Eficacia in vitro de BP1001 en combinación con Das
La actividad clínica de BP1001 se investigará en pacientes con LMC que se encuentran en fase acelerada o blástica. La respuesta de los pacientes en fase acelerada y blástica al imatinib es deficiente o de corta duración. Estos pacientes a menudo se tratan con otros inhibidores de tirosina cinasa, tales como dasatinib, nilotinib, bosutinib y ponatinib. Aquí, se determinó si BP1001 podría potenciar los efectos inhibitorios de dasatinib, nilotinib, bosutinib y ponatinib en células de LMC.
Cultivo celular. Las células BV173 y K562 son líneas celulares positivas para Bcr-Abl derivadas de pacientes con LMC. Se obtuvieron de CLS Cell Lines Service GmbH (Eppelheim, Alemania) y se cultivaron en medio RPMI suplementado con suero bovino fetal al 10 % inactivado por calor.
Productos químicos. La secuencia del oligo antisentido de Grb2 es: 5'-ATATTTGGCGATGGCTTC-3' (SEQ ID NO: 1). El oligo antisentido de Grb2 fue fabricado por Avecia (Cincinnati, OH, EE. UU.). BP1001 fue preparado por Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, EE. UU.) como se ha descrito. En resumen, el oligo antisentido de Grb2 se mezcló con lípidos de dioleoilfosfatidilcolina (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, EE. UU.), se congeló y liofilizó. El liofilizado se almacenó a 4 °C. El día del experimento, BP1001 se hidrató con medio y se añadió a las células a una concentración final de 0 a 120 pg/ml. Los inhibidores de tirosina cinasa, tales como dasatinib, nilotinib, bosutinib y ponatinib, fueron adquiridos de Selleck Chemicals (Houston, Texas, EE. UU.) como soluciones madre de DMSO l0 mM.
Ensayos de viabilidad celular. Se sembraron células BV173 y K562 a 5 y 15 x 103 células/pocillo, respectivamente, en placas de 96 pocillos en 0,1 ml de medio. Las células se incubaron con BP1001 y/o inhibidores de tirosina cinasa durante 4 días. La viabilidad de las células leucémicas no tratadas y tratadas se midió mediante el ensayo de viabilidad de células luminiscentes CellTiter-Glo® (Promega, Madison, WI, EE. UU.). El ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® determina el número de células viables mediante la cuantificación de la presencia de ATP, un indicador de células metabólicamente activas.
Análisis del ciclo celular. Después de incubar con BP1001 y/o inhibidores de tirosina cinasa durante 4 días, las células BV173 se recogieron y se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS). A continuación, las células se fijaron y permeabilizaron durante 1 h a 4 °C con tampón de fijación/permeabilización IX (Ebioscience, San Diego, CA, EE.u U.). Después de la permeabilización, las células se lavaron e incubaron con 7-aminoactinomicina D (7-AAD, Biolegend, San Diego, CA, EE. UU.) en la oscuridad a 4 °C durante aproximadamente 30 min. La adquisición de datos de citometría de flujo se adquirió utilizando el software BD FACSDiva™ (BD Biosciences, San José, CA, EE.UU.). El citómetro de flujo se configuró para recoger 20.000 eventos. Se dieron los porcentajes relativos en las diferentes fases del ciclo celular (sub-G1, G1, S, G2/M).
El pretratamiento con BP1001 aumentó la inhibición de dasatinib. Primero se determinó si BP1001 podría aumentar la inhibición de dasatinib en líneas celulares de LMC. Para establecer si el momento de la adición de BP1001 podría afectar a la actividad de dasatinib, se realizó la incubación conjunta de BP1001 y dasatinib en diferentes secuencias: (1) Se añadió BP1001 a las células 1 h antes de añadir dasatinib (para imitar el tratamiento el mismo día); (2) Se añadió BP1001 a las células 1 día después de haber tratado las células con dasatinib; (3) Se añadió BP1001 a las células un día antes de que las células fueran tratadas con dasatinib.
Secuencia de la incubación conjunta (1): BP1001 y dasatinib añadidos el mismo día. Las células K562 y BV173 se incubaron con BP1001 (0-120 pg/ml) durante 1 hora antes de tratarlas con dasatinib 1 nM. Cuatro días después, se determinaron los efectos inhibidores del crecimiento. En ausencia y presencia de 120 pg/ml de BP1001, dasatinib disminuyó la viabilidad de K562 en un 25 % y un 15 %, respectivamente (FIG. 7A). En ausencia y presencia de 120 pg/ml de BP1001, dasatinib disminuyó la viabilidad de BV173 en un 40 y 49 %, respectivamente (FIG. 7A). Estos datos indican que cuando las células de LMC se trataban con BP1001 y dasatinib el mismo día, BP1001 tuvo efectos mínimos sobre la inhibición de dasatinib.
Secuencia de la incubación conjunta (2): Dasatinib añadido antes de BP1001. Las líneas celulares de LMC se trataron con dasatinib durante 1 día, seguido de tratamiento con BP1001. La viabilidad celular se determinó 3 días después. Dasatinib redujo la viabilidad de K562 en un 12 % (FIG. 7B). La adición de una concentración de 190 pg/ml de BP1001 redujo la viabilidad de K562 al 50 % (FIG. 7B). Sin embargo, cuando se añadió una concentración de 120 pg/ml de BP1001 a dasatinib, la viabilidad de K562 se redujo en un 25 % (FIG. 7B). Dasatinib redujo la viabilidad de BV173 en un 6 % (FIG. 7B). La adición de 120 pg/ml de BP1001 redujo la viabilidad de BV173 en un 34 % (FIG. 7B). BP1001 añadido 1 día después del tratamiento con dasatinib redujo aún más la viabilidad de BV173. Pero no está claro si BP1001 añadido 1 día después del tratamiento con dasatinib podría disminuir aún más la viabilidad de K562. Secuencia de la incubación conjunta (3): BP1001 añadido antes de dasatinib. Las líneas celulares de LMC se incubaron con BP1001 durante 1 día antes de tratarlas con dasatinib. Dasatinib solo redujo la viabilidad de K562 en un 25 % (FIG. 7C). Cuando se añadieron 120 pg/ml de BP1001 a dasatinib, la viabilidad de K562 se redujo en un 44 % (FIG. 7C). En ausencia y presencia de 120 pg/ml de BP1001, dasatinib disminuyó la viabilidad de BV173 en un 10% y un 68%, respectivamente (FIG. 7C). Estos datos indican que el pretratamiento de 1 día con BP1001 aumentó la inhibición de dasatinib en ambas líneas celulares de LMC.
BP1001 aumentó la inducción de la muerte celular con dasatinib. Seguidamente, determinamos el mecanismo por el cual BP1001 aumentó la inhibición de dasatinib. Las células BV173 se incubaron con BP1001 durante 1 día, antes de ser tratadas con dasatinib. Tres días después, las células se recogieron y procesaron para citometría de flujo. El principal mecanismo de inhibición de la combinación BP1001 dasatinib fue la inducción de la muerte celular, como se muestra por el aumento en los porcentajes de células en la fase sub-G1 (Figuras 8A-D). Los porcentajes de células en fase sub-G1 al ser tratadas con BP1001, dasatinib y la combinación fueron 3,1, 10,6 y 28,0, respectivamente (Figuras 8A-D).
El pretratamiento con BP1001 aumentó selectivamente la inducción de la muerte celular con dasatinib y nilotinib. Se utilizó citometría de flujo para determinar los efectos del pretratamiento con BP1001 en nilotinib, bosutinib y ponatinib. La FIG. 3 mostró que el tratamiento previo con BP1001 aumentó la inhibición de dasatinib y nilotinib. Los porcentajes de células en la fase sub-G1 aumentaron de 30,7 a 40,6 para dasatinib y de 26,4 a 32 para nilotinib (FIG. 9A). Sin embargo, El pretratamiento con BP1001 no afectó a la inhibición de bosutinib ni ponatinib (FIG. 9A). Los porcentajes de células tratadas con bosutinib y la combinación BP1001 bosutinib en la fase sub-G1 fueron 34,3 y 36,4, respectivamente, mientras que para ponatinib y la combinación de BP1001 ponatinib fueron 34,0 % y 36,0 %, respectivamente (FIG. 9A). Estos datos indican que el pretratamiento con BP1001 aumentó selectivamente la inhibición de dasatinib y nilotinib.
Curiosamente, se observó una reducción de la muerte celular cuando las células se trataron con BP1001 después de los inhibidores de tirosina cinasa. Los porcentajes de células en la fase sub-G1 se redujeron de 64,1 a 51,8 para dasatinib, de 65,0 a 57,1 para nilotinib, de 66,1 a 48,6 para bosutinib y de 71,1 a 51,7 para ponatinib (FIG. 9B). Ejemplo de referencia 3: Un ensayo clínico de fase Ib/IIa para evaluar la seguridad, farmacocinética y eficacia de BP1001 en combinación con dasatinib (Das) en pacientes con LMC Ph+ en fase acelerada o blástica Justificación del estudio. El estudio de fase Ib incluirá a participantes con LMC Ph+ en fase acelerada o blástica. Los participantes recibirán BP1001 más Das. Este es un ensayo clínico abierto, de un solo grupo. Los participantes que reúnan los requisitos para recibir tratamiento en el estudio de fase Ib recibirán BP1001 (60 mg/m2 para la cohorte 1 o 90 mg/m2 para la cohorte 2) y el mismo nivel de dosis de Das (140 mg). Una vez identificada la dosis para la fase IIa, todos los participantes que sean elegibles para recibir tratamiento en la fase IIa recibirán los mismos niveles de dosis para BP1001 y Das. No habrá aleatorización para este estudio.
Cada ciclo de tratamiento será de 28 días. BP1001 se administrará durante aproximadamente 1 a 3 horas cada 2 a 4 días (ventana permitida de /- 1 día) a partir del día 1 del ciclo para un total de ocho administraciones en cada ciclo de tratamiento. En o aproximadamente el Día 5 del ciclo, y no menos de 24 h después de completar la segunda dosis de BP1001, los participantes iniciarán una dosis oral diaria de 140 mg de Das que se continuará desde ese momento todos los días sin interrupción. Se programarán ciclos repetidos después de este régimen cada 4 semanas hasta la progresión, recaída, intolerancia, el participante ha completado 6 ciclos de tratamiento, o el participante/investigador solicitó la suspensión. Cuando los participantes hayan completado la parte de dosificación del estudio, serán seguidos durante aproximadamente 6 meses, o hasta la muerte o el cierre del estudio, lo que suceda primero.
Justificación del estudio: Selección de dosis. Los datos preliminares muestran que la regulación a la baja de Grb2 (y el posible beneficio antileucémico) se puede lograr en participantes con BP1001 a HTD (90 mg/m2) y en un nivel por debajo de la HTD (60 mg/m2), y que la seguridad/tolerabilidad no es sustancialmente diferente entre estas dos dosis. Basándose en esto, se estudiará la seguridad y tolerabilidad de combinar 60 o 90 mg/m2 de BP1001 con Das.
En el estudio de fase Ib, BP1001 se administrará por vía intravenosa (IV) dos veces por semana (cada 2-4 días), con una ventana permitida de /- 1 día, durante aproximadamente 1-3 horas para un total de ocho dosis administradas en un ciclo de 28 días. La dosis inicial será de 60 mg/m2 con la primera dosis de BP1001 a partir del día 1 de cada ciclo de 28 días. No menos de 24 h después de completar la segunda dosis de BP1001, los participantes iniciarán la dosificación diaria de 140 mg de Das y se continuará todos los días a partir de entonces sin interrupción. La dosificación de Das puede comenzar tan pronto como el Día 5 siempre que se inicie no menos de 24 h después de completar la segunda dosis de BP1001. Tres pacientes recibirán BP1001 en cada nivel de dosis durante 28 días en ausencia de DLT. El aumento de la dosis dentro de esta parte del estudio continuará hasta que se detecte DLT de grado 3.
La siguiente cohorte de pacientes entrará en el estudio una vez que tres pacientes de la cohorte anterior hayan completado 28 días de tratamiento, sin evidencia de DLT. En lo sucesivo, el aumento escalonado de la dosis será a 90 mg/m2. Si un paciente experimenta DLT, esta cohorte se ampliará con 3 pacientes adicionales. Se considerará que cualquier cohorte en la que >2 de 3-6 pacientes tratados experimentan DLT ha excedido la MTD y se seleccionará la cohorte de dosis más baja inmediata para un estudio adicional. Se evaluará la toxicidad de todos los pacientes al final del tratamiento (28 días) utilizando los criterios CTCAE del NCI. Se programarán ciclos repetidos después de este régimen cada 4 semanas hasta la progresión, recaída, intolerancia, el participante ha completado 6 ciclos de tratamiento, o el participante/investigador solicitó la suspensión.
El programa de tratamiento de fase IIa será idéntico al del estudio de fase Ib. Sin embargo, todos los participantes recibirán las mismas dosis de BP1001 (identificado en el estudio de fase Ib) y 140 mg de Das.
Justificación del estudio: Diseño del estudio. Se evaluará la eficacia y la seguridad de BP1001 junto con Das, un régimen terapéutico bien establecido en el tratamiento de pacientes con LMC Ph+ que se encuentran en fase acelerada o blástica. Basándose en nuestros estudios preclínicos, se prevé que BP1001 en combinación con Das proporcione un beneficio a los pacientes con LMC en fase acelerada o blástica, que normalmente no responden al tratamiento de primera línea, imatinib. El diseño del estudio se presenta gráficamente en la FIG. 3.
Este ensayo utilizará un diseño de un solo grupo, abierto, para evaluar el perfil de seguridad, farmacocinética y eficacia de BP1001 en combinación con Das. El estudio de fase Ib emplea un diseño abierto, secuencial, con aumento escalonado de la dosis para evaluar la seguridad, tolerabilidad y toxicidad, respuesta tumoral y actividad antileucémica.
Se utilizará un diseño estándar "3+3" en el que cohortes sucesivas de pacientes con LMC se tratan con BP1001 a la dosis máxima tolerada (MTD) o HTD si la MTD no está definida y 1 nivel por debajo de la MTD (o HTD) en combinación con una dosis fija de Das para caracterizar la seguridad y el efecto biológico, así como para identificar la dosis recomendada de fase Ila.
Tres pacientes recibirán BP1001 en cada nivel de dosis durante 28 días en ausencia de DLT. La siguiente cohorte de pacientes entrará en el estudio una vez que 3 pacientes de la cohorte anterior hayan completado 28 días de tratamiento, sin evidencia de DLT. En lo sucesivo, el aumento escalonado de la dosis será a 90 mg/m2 Si un paciente experimenta DLT, esta cohorte se ampliará con 3 pacientes adicionales. Se considerará que cualquier cohorte en la que >2 de 3-6 pacientes tratados experimentan DLT ha excedido la MTD y se seleccionará la cohorte de dosis más baja inmediata para un estudio adicional. Se evaluará la toxicidad de todos los pacientes al final del tratamiento (28 días) utilizando los criterios CTCAE del NCI.
Los pacientes pueden recibir la extensión del tratamiento. Se programarán ciclos repetidos después de este régimen cada 4 semanas hasta la progresión, recaída, intolerancia, el participante ha completado 6 ciclos de tratamiento, o el participante/investigador solicitó la suspensión.
El estudio de fase IIa es un estudio abierto, de nivel de dosis única. Todos los participantes que sean elegibles para recibir tratamiento en el estudio recibirán el mismo nivel de dosis para BP1001 (la HTD o 1 nivel por debajo de la HTD) según lo determinado por el estudio de fase Ib y Das (140 mg). No habrá aleatorización para este estudio. El estudio de fase IIa comparará la eficacia de BP1001 en combinación con Das con las tasas de respuesta históricas documentadas para Das solo, y evaluará la farmacocinética de BP1001, cuando se administra solo o en combinación con Das.
Aproximadamente 40 participantes evaluables recibirán la combinación de BP1001 con Das en la fase IIa de la siguiente manera. Después de la verificación de elegibilidad durante el período de selección, los participantes recibirán su dosis inicial de BP1001. La dosis se identificará en la fase Ib en función de la seguridad y tolerabilidad de combinar BP1001 con Das. BP1001 se administrará en C1D1 y cada 2 a 4 días a partir de entonces, para un total de 8 dosis administradas en un ciclo de 28 días. En o aproximadamente el Día 5 del ciclo, y no menos de 24 horas después de completar la segunda dosis de BP1001, los participantes iniciarán una dosis oral diaria de 140 mg de Das y se continuará todos los días a partir de entonces sin interrupción.
Se evaluará la respuesta de los participantes que hayan completado al menos 3 ciclos de tratamiento. La tasa de respuesta objetivo es del 35 %. Se implementará el enfoque bayesiano de Thall, Simon, Estey para el seguimiento de la inutilidad. La siguiente regla de detención por inutilidad se aplicará en un tamaño de cohorte de 5, a partir del 5° paciente: prob{p(RR)> 0,35) < 0,03, donde p(RR) indica la tasa de respuesta. Es decir, el ensayo se detendrá antes de tiempo debido a la inutilidad, si durante el estudio determinamos que hay menos del 3 % de probabilidad de que la RR sea superior al 35 %.
El enfoque bayesiano también se implementará para el control de la toxicidad de los pacientes incluidos, donde la toxicidad se define como cualquier toxicidad no hematológica determinada como DLT que esté al menos posiblemente relacionada con el tratamiento. La toxicidad, indicada como TOX será controlada mediante los límites de detención bayesianos calculados basándose en distribuciones beta-binomiales. Suponemos a priori, p(TOX) ~ beta (0,6, 1,4). El estudio se detendrá por toxicidad si Pr(p(TOX)> 0,30 | datos) >0,88. Es decir, detendremos el ensayo para la inclusión de nuevos pacientes si en cualquier momento durante el estudio determinamos que hay más del 88 % de probabilidad de que la tasa de toxicidad sea superior al 30 %.
Los pacientes pueden recibir la extensión del tratamiento. Se programarán ciclos repetidos después de este régimen cada 4 semanas hasta la progresión, recaída, intolerancia, el participante ha completado 6 ciclos de tratamiento, o el participante/investigador solicitó la suspensión.
Objetivos del estudio. El objetivo principal del estudio de fase Ib es determinar la toxicidad limitante de la dosis (DLT) y la dosis máxima tolerada (MTD) de BP1001 en combinación con Das. Los objetivos principales del estudio de fase lia son evaluar la farmacocinética (FC) y la eficacia de la combinación de BP1001 y Das.
Son objetivos secundarios de este estudio los siguientes: evaluar la seguridad de BP1001 en combinación con Das; determinar si la combinación de BP1001 y Das proporciona mayor eficacia (respuesta hematológica, respuesta citogenética o respuesta molecular) que Das solo (por comparación histórica); evaluar la farmacocinética (FC) de BP1001 cuando se administra solo y en combinación con Das; evaluar la supervivencia global, el tiempo hasta la respuesta y la duración de la respuesta.
El objetivo exploratorio de este estudio evaluará la correlación de la respuesta al tratamiento con mutaciones del dominio cinasa abl.
Población del estudio: Criterios de inclusión. En el momento de la selección, los participantes deben cumplir con todos los siguientes criterios para ser considerados elegibles para participar en el estudio:
1. Adultos >18 años de edad
2. Las mujeres deben estar en edad no fértil, ser quirúrgicamente estériles, posmenopáusicas, o practicar métodos anticonceptivos adecuados durante el estudio y durante 30 días después de la última dosis del fármaco del estudio o Das
3. Los hombres deben aceptar usar un método anticonceptivo adecuado durante el estudio y durante al menos 30 días después de la última dosis del fármaco del estudio o Das
4. Diagnóstico histológicamente documentado de LMC Ph+, en fase acelerada o blástica. La fase blástica se define como >30 % de blastos en sangre periférica o médula ósea, o presencia de enfermedad extramedular, excepto el hígado o el bazo. Se requiere uno de los siguientes parámetros para cumplir con los criterios de LMC acelerada: a. Blastos en sangre periférica o médula ósea >15 %
b. Promielocitos y blastos en sangre periférica o médula ósea >30 %
c. Basófilos en SP o MO >20 %
d. Trombocitopenia <100 x 103/ml, no relacionada con la terapia
e. Evolución clonal citogenética
5. Funciones hepáticas y renales adecuadas definidas por:
a. Aspartato transaminasa (AST) y alanina transaminasa (ALT) < 2,5 veces el límite superior normal (ULN); y b. Bilirrubina total <1,5 veces ULN; y
c. Tasa de filtración glomerular estimada (eGFR) de al menos 50 ml/min; la fórmula de Cockcroft Gault se utilizará para determinar la eGFR cuando se realicen pruebas de nitrógeno ureico en sangre (BUN) y creatinina al inicio del estudio. La combinación de creatinina sérica eGFR y BUN se utilizará para evaluar la función renal del paciente para garantizar la seguridad.
(i) Ecuación de Cockcroft Gault: aclaramiento de creatinina estimado = [(140 - edad) x peso corporal total] / (creatinina sérica x 72)
(ii) Multiplicar por 0,85 para mujeres
6. Estado funcional documentado del Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) de 0, 1 o 2 (Tabla 9)
7. Recuperado de los efectos de cualquier cirugía previa, radioterapia o tratamiento antineoplásico (a excepción de la alopecia)
8. Estar en disposición y ser capaz de otorgar su consentimiento informado por escrito
Tabla 9. Estado funcional ECOG
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Población del estudio: Criterios de exclusión. En el momento de la selección, los participantes que cumplan con alguno de los siguientes criterios serán excluidos de participar en el estudio:
1. No se excluirán pacientes con mutación T315I, pero su respuesta será analizada por separado
2. Otra neoplasia maligna primaria distinta de la LMC en los últimos 2 años, excepto cáncer de piel no melanoma o carcinoma in situ del cuello uterino.
3. Leucemia leptomeníngea activa conocida que requiere tratamiento intratecal. NOTA: Los pacientes con antecedentes de enfermedad del SNC pueden participar en función de al menos dos evaluaciones negativas consecutivas, documentadas de líquido cefalorraquídeo antes de la selección
4. Leucemia extramedular aislada sin cumplir tampoco los criterios de médula ósea para leucemia
5. Recibir cualquier terapia anticancerosa dentro de los 14 días posteriores al inicio de BP1001, con la excepción de hidroxiurea o anagrelida, o TKI (en el período de 2 días)
6. Infección activa no controlada, no tratada o progresiva
7. Recepción de cualquier agente en investigación dentro de los 14 días o 5 semividas posteriores al inicio de BP1001
8. Mujeres embarazadas, con prueba de embarazo positiva, o amamantando durante el período de selección, o con intención de quedar embarazada o amamantar durante el trancurso del estudio o dentro de los 30 días posteriores a la última dosis del fármaco del estudio
9. Exposición previa a BP1001
10. Pacientes con antecedentes de intolerancia a Das o para quienes Das podría no ser apropiado
11. Enfermedad médica o psiquiátrica intercurrente grave que podría interferir con la capacidad del participante para completar el estudio
12. Infección por hepatitis B activa/crónica (basada en antígeno de superficie positivo [HBsAg]), infección por hepatitis C (basada en anticuerpos positivos [Ab anti-VHC]), o virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1 o VIH-2, basado en anticuerpos positivos)
13. Presencia de condiciones concurrentes que puedan comprometer la capacidad del participante para tolerar el tratamiento del estudio o interferir con cualquier aspecto de la realización del estudio o la interpretación de los resultados. Esto incluye, pero sin limitación, angina inestable o no controlada, insuficiencia cardíaca congestiva clase III o IV de la New York Heart Association (NYHA), hipertensión no controlada y sostenida, arritmia cardíaca clínicamente significativa o anomalía en el ECG clínicamente significativa (p. ej., QTcF >470 mseg)
14. En los últimos 6 meses, haber sufrido alguno de los siguientes: derrame pleural, infarto de miocardio, angina de pecho inestable, injerto de derivación de arteria coronaria/periférica, accidente cerebrovascular o episodio isquémico transitorio
15. Trastorno convulsivo no controlado (es decir, convulsiones en los últimos 2 meses)
16. Incapacidad o falta de voluntad de comunicarse o cooperar con el Investigador o seguir el protocolo por cualquier motivo
Tratamientos del estudio: Dosis y Administración de BP1001. BP1001 se suministra en forma de polvo liofilizado blanco estéril, sin conservantes, para reconstitución para administración IV y se presenta en viales de 20 ml. Cada vial de 20 ml de BP1001 de un solo uso contiene 5 mg de oligonucleótido de Grb2 y 13,35 mg de DOPC. Los cálculos de dosificación se basan en el oligonucleótido de Grb2. Cada vial de BP1001 debe reconstituirse con 2 ml de solución salina normal (cloruro de sodio al 0,9 %) para inyección para obtener una concentración de 5,0 mg/2,0 ml (2,5 mg/ml) de BP1001. BP1001 reconstituido es estable durante aproximadamente 6 horas después de la reconstitución; por consiguiente, la perfusión IV debe realizarse no más tarde de aproximadamente 6 horas después de la reconstitución.
En el estudio de fase Ib, la dosis de BP1001 a utilizar es de 60 mg/m2 (cohorte 1) o 90 mg/m2 (cohorte 2). BP1001 se administrará como una perfusión IV los días 1, 4, 8, 11, 15, 18, 22 y 25 (con una ventana permitida de /-1 día) de cada ciclo de 28 días. En el Ciclo 1 de tratamiento, los participantes deben recibir ambas dosis de BP1001 (para los días 1 y 4) para continuar con la dosificación con Das y continuar en el estudio. Los participantes que no reciban ambas dosis de BP1001 antes de iniciar la dosificación de Das pueden interrumpir la parte de dosificación del estudio y entrar en la parte de seguimiento del estudio.
Las cantidades de dosis para BP1001 se basarán en el área de superficie corporal (BSA) inicial (en la selección); sin embargo, las dosis se ajustarán para los participantes que experimenten un cambio de peso de >10 % con respecto al valor inicial. El peso real se utilizará para calcular el BSA excepto para los participantes que pesen más de 100 kg; la dosis se calculará respecto a 100 kg para estos individuos.
La perfusión IV se administrará durante aproximadamente 1 a 3 horas y no debe administrarse como bolo o bolo intravenoso. La perfusión se administrará a través de una línea IV central o periférica dedicada y no se puede administrar al mismo tiempo que otros medicamentos.
Tratamientos del estudio: Dosis y administración de dasatinib. Dasatinib (Das) debe administrarse por vía oral, una vez al día comenzando aproximadamente el día 5 de cada ciclo de 28 días. La dosificación de Das puede comenzar tan pronto como el Día 5 de cada ciclo siempre que se inicie no menos de 24 horas después de completar la segunda dosis de BP1001. Una vez iniciado, el tratamiento con Das se debe continuar sin interrupción. La dosis de Das utilizada en este estudio es de 140 mg (cada dosis).
Medicamentos concomitantes. Durante las primeras 4 semanas de tratamiento, se permitirá la hidroxiurea. También se permitirá la anagrelida en cualquier momento para controlar la trombocitosis >500K. Los siguientes medicamentos no están permitidos durante el período de tratamiento: cualquier agente anticanceroso (aparte de Das, hidroxiurea o anagrelida) para el tratamiento de la enfermedad en estudio u otras neoplasias malignas.
Esquema y Descripción de los procedimientos. Los participantes se someterán a procedimientos de selección como se muestra en la Tabla 10.
Tabla 10. Es uema de eventos evaluaciones
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a Actualizado, basado en el historial dado en el SCR
b El examen físico debe incluir una revisión completa de los síntomas y un examen completo
c Solo EF breve orientado a los síntomas
d Solo Ciclo 1; Las muestras se recogerán antes de la dosis (dentro de los 30 minutos previos a la dosificación) y a continuación 1, 2, 4, 6, 8 y 24 horas después de la dosis. Se pueden tomar muestras posteriores a la dosis /-15 minutos de su tiempo especificado,
e Solo peso
f Se deben tomar muestras de sangre antes de cualquier fármaco del estudio o dosificación de Das
g Respuesta hematológica evaluada al final de cada ciclo
h Evaluación de la médula ósea, incluyendo respuestas citogenéticas y moleculares, se realizará al final de los ciclos 1, 2, 4, 6 e incluso ciclos posteriores
i Solo mujeres en edad fértil
j BP1001 administrado como perfusión intravenosa (IV) dos veces por semana (cada 2-4 días), con una ventana de ±1 día
k Das administrado sin interrupción; vía oral 1 al día, no menos de 24 horas después de completar la segunda dosis de BP1001
l Múltiples evaluaciones FC. Las muestras deben recolectarse en los siguientes momentos: antes de la dosis, 1, 2, 4, 6, 8 y 24 horas después de la dosis. Las muestras posteriores a la dosis pueden ser de ± 15 min
La visita de seguimiento inicial debe ocurrir dentro de los 30 días (+/- 7 días) después de suspender los ciclos de tratamiento. La visita de seguimiento inicial incluirá: Examen físico; Hemograma completo con fórmula diferencial y plaquetas, incluyendo % blastos; Perfil bioquímico; Registro de los medicamentos concomitantes; Registro de acontecimientos adversos.
Las visitas de seguimiento a largo plazo deben realizarse cada 8 semanas (+/- 1 semana) a partir de la visita de seguimiento de 30 días, hasta 12 meses desde el inicio de la terapia o hasta el cierre del estudio o inicio de otra terapia o muerte.
Criterios de valoración de la eficacia. La eficacia preliminar se evaluará evaluando la remisión y la respuesta objetiva, utilizando los siguientes Criterios de Respuesta y medidas. Los criterios de evaluación de eficacia adicionales incluirán el tiempo hasta la respuesta, la duración de la respuesta y la supervivencia global.
Los criterios de respuesta hematológica (HR) se proporcionan en la Tabla 11. Se obtiene una HR confirmada cuando se cumplen todos los criterios al menos 28 días después de que se cumplen por primera vez.
Tabla 11. Criterios de res uesta hematoló ica
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Una respuesta citogenética se clasifica según la supresión del cromosoma Filadelfia (Ph) por citogenética (o FISH si el análisis citogenético no es informativo, por ej., metafases insuficientes) como se indica en la Tabla 12. Una respuesta citogenética mayor es una combinación de una respuesta completa y una parcial.
Tabla 12. Criterios de res uesta cito enética
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Una respuesta molecular se clasifica de acuerdo con los criterios proporcionados en la Tabla 13.
Tabla 13. Criterios de res uesta molecular
Figure imgf000041_0001
Notificaciones de seguridad: Acontecimientos adversos (AA). Cada participante que recibe el fármaco del estudio se controlará de cerca en busca de AA. Un AA es cualquier evento médico no deseado asociado con el uso de un fármaco en seres humanos, independientemente de si se considera o no relacionado con el fármaco. Los acontecimientos adversos incluyen cualquier signo, síntomas, enfermedades o diagnósticos que aparecen o empeoran durante el transcurso del estudio. Un AA puede ser una enfermedad intercurrente, una lesión o cualquier deterioro concomitante de la salud del participante. Todos los AA que ocurran en cualquier momento desde el momento del consentimiento hasta el final de la visita de tratamiento se notificarán independientemente de la etiología del acontecimiento. El CTCAE v4.03 del NCI se utilizará para clasificar los AA. El CTCAE se puede encontrar en la red mundial en evs.nci.nih.gov/ftpl/CTCAE/CTCAE_4.03_2010-06-14_QuickReference_5x7.pdf.
Los acontecimientos adversos se clasifican como "graves" y "no graves" a efectos de notificación reglamentaria. Hay que tener en cuenta que la definición de "grave" no depende necesariamente de la gravedad del evento. Todos los AA que no cumplen los criterios de graves se consideran no graves.
Cualquier AA que ocurra a cualquier dosis (incluida la sobredosis), independientemente de la relación con el fármaco del estudio, se clasificará como un acontecimiento adverso grave (AAG) cuando (1) tenga como resultado la muerte (es decir, el AA causó o condujo al desenlace fatal, el participante estuvo en riesgo de muerte en el momento del acontecimiento; no se refiere a un acontecimiento, que hipotéticamente podría haber causado la muerte si fuera más grave); (2) fue potencialmente mortal (es decir, el AE puso al individuo en riesgo inmediato de morir, no si el AA podría haber conducido hipotéticamente a la muerte si hubiera sido más grave); (3) requirió hospitalización u hospitalización prolongada más allá de la estancia esperada (es decir, las hospitalizaciones para tratamientos programados y procedimientos médicos/quirúrgicos electivos no son AAG según este criterio); (4) fue incapacitante (es decir, el AA tuvo como resultado una reducción sustancial de la capacidad del participante para realizar actividades de la vida diaria); (5) tuvo como resultado una anomalía congénita o defecto congénito (es decir, un hallazgo adverso en un niño o feto de un participante expuesto al fármaco del estudio antes de la concepción o durante el embarazo); o (6) fue una afección médicamente importante (es decir, el AA no cumple con ninguno de los criterios graves anteriores pero se basa en el criterio médico apropiado, pudo haber puesto en peligro al participante o haber requerido una intervención médica o quirúrgica para prevenir 1 de los resultados graves enumerados en estos criterios [es decir, tratamiento intensivo en urgencias o en el domicilio por broncoespasmo alérgico; discrasias sanguíneas o convulsiones que no requieren hospitalización]).
La relación causal con el principio activo BP1001 o Das para todos los AA se evaluará de la siguiente manera: (1) definitivamente relacionados: AA claramente atribuibles a la administración del régimen del estudio; (2) probablemente relacionados: AA para los que existe una posibilidad razonable de asociación causal con el régimen de estudio; (3) posiblemente relacionados: AA para los que existe confusión por comorbilidades, medicamentos u otras consideraciones, pero para los cuales no es irrazonable que el AA pueda haber sido causado por el régimen del estudio; o (4) no relacionado: acontecimientos adversos que se consideran claramente no relacionados causalmente con el régimen del estudio, o para los cuales existe una explicación alternativa clara
Un AA inesperado es cualquier AA que no está identificado en cuanto a naturaleza, gravedad o frecuencia como consecuencia conocida de BP1001 o Das. "Inesperado", como se usa en esta definición, se refiere a un AA que no se ha observado previamente desde la perspectiva de que dicha experiencia no se prevea a partir de las propiedades farmacológicas del fármaco.
La Tabla 14 detalla los AA más frecuentes para la monoterapia con BP1001, así como los AA con una intensidad de grado 3 o superior (según los criterios de Terminología Común para Acontecimientos Adversos [CTCAE] del Instituto Nacional del Cáncer [NCI], Versión 4.0) en el estudio 2003-0578, presentados por grupo de tratamiento, diagnóstico de la enfermedad en el momento de la inclusión en el estudio y clasificación de órganos del sistema (SOC)/término preferido (PT) como se especifica en el Diccionario médico para actividades de registro farmacéutico (MedDRA, versión 18.0).
Tabla 14. Acontecimientos adversos más frecuentes (> Grado 3) por grupo de tratamiento, Enfermedad, SOC y PT
Figure imgf000042_0001
continuación
Figure imgf000043_0001
La Tabla 15 detalla una lista completa de la incidencia de todos los tratamientos para monoterapia con BP1001 en el estudio 2003-0578 presentado por SOC/PT, incidencia e intensidad (basado en los CTCAE del NCI).
Tabla 15. Acontecimientos adversos evaluados en relación con el fármaco del estudio BP1001
Figure imgf000043_0002
continuación
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a Dado que estos acontecimientos se evaluaron como posiblemente relacionados con el fármaco del estudio BP1001 y eran de grado 3, fueron evaluados como DLT. Ambos acontecimientos ocurrieron en el paciente 001, en el nivel de dosis de 5 mg/m2 (Cohorte 1). Por protocolo, la cohorte se amplió a 6 pacientes evaluables. En este momento, los 6 pacientes han sido revisados, sin recurrencias de ninguno de estos acontecimientos en ningún paciente tratado. b Se notificaron dos (2) incidencias de este acontecimiento para este paciente, en el mismo nivel de grado.
Posibles riesgos y efectos secundarios. Dasatinib (Das) y BP1001 pueden estar asociados a recuentos sanguíneos bajos (hematíes, plaquetas y leucocitos. Los efectos secundarios conocidos de Das incluyen fiebre, erupción cutánea, cefalea, cansancio, diarrea, náuseas, dificultad para respirar y dolor muscular. Basándose en estudios en animales y humanos, BP1001 puede causar el síndrome mano-pie, ampollas/llagas en la boca y recuentos bajos de leucocitos.
REFERENCIAS
Las siguientes referencias proporcionan detalles procedimentales de ejemplo u otros detalles complementarios a aquellos expuestos en el presente documento.
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Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Un primer agente activo que comprende un polinucleótido resistente a nucleasas que se híbrida con un ácido nucleico de Grb2 e inhibe la expresión de Grb2 en el paciente y un segundo agente activo que comprende un análogo de citidina para usar en el tratamiento de la leucemia mieloide aguda (LMA) o el síndrome mielodisplásico (SMD) en un paciente que lo necesita, preferentemente un ser humano, en donde el análogo de citidina es decitabina.
2. Los agentes activos para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polinucleótido se hibrida con el sitio de iniciación de la traducción de un ácido nucleico de Grb2.
3. Los agentes activos para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el polinucleótido es un oligonucleótido que tiene una longitud de 8-50 bases, preferentemente el polinucleótido tiene una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1, más preferentemente, el polinucleótido comprende enlaces del esqueleto P-etoxi.
4. Los agentes activos para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el polinucleótido está encapsulado en un liposoma.
5. Los agentes activos para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde se cumplen una o más de las siguientes condiciones:
(i) el primer agente activo comprende además un lípido neutro;
(ii) el primer agente activo se administra sistémicamente; y
(iii) el primer agente activo se formula para administración intraarterial o intravenosa.
6. Los agentes activos para su uso de acuerdo con la reivindicación 5 comprenden además un lípido neutro, en donde el primer agente activo se administra a una dosis de aproximadamente 60 mg/m2 y a aproximadamente 90 mg/m2, y/o en donde el primer agente activo se administra de dos a cuatro veces por semana.
7. Los agentes activos para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el primer agente activo se administra antes de la administración del segundo agente activo, o en donde el segundo agente activo es un análogo de citidina y se administra antes de la administración del primer agente activo, o en donde el primer agente activo y el segundo agente activo se administran al mismo tiempo.
8. Los agentes activos para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el primer agente activo y el segundo agente activo se administran por vías distintas.
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