CN114787358A - 细胞的细胞类型选择性免疫保护 - Google Patents

Abstract

本公开涉及由一个或多个细胞构成的制剂，其中所述制剂的细胞被修饰以条件性地表达：(i)与对应的野生型细胞相比，增加水平的一种或多种免疫检查点蛋白；(ii)与对应的野生型细胞相比，降低水平的一种或多种HLA‑I蛋白；或者(i)和(ii)的组合。本公开进一步涉及用于产生所述细胞制剂的方法和构建体，以及向有需要的受试者施用所述细胞制剂的方法。

Description

细胞的细胞类型选择性免疫保护

本申请要求于2019年7月18日提交的美国临时专利申请第62/875,883号的优先权，所述美国临时专利申请特此通过全文引用的方式并入。

技术领域

本公开涉及选择性地诱导终末分化细胞的免疫保护的方法，以及可以被选择性免疫保护的细胞制剂。

背景技术

移植排斥反应的急性期可以在约1-3周内发生并且通常涉及宿主T细胞对供体组织的作用，这是由于宿主系统对供体的人类白细胞抗原I类(HLA-I)和人类白细胞抗原II类(HLA-II)分子的受者致敏而引起的。在大多数情况下，触发抗原是HLA-I蛋白。为了获得最佳的成功，将非自体供体细胞以HLA进行分型，并尽可能完全地与移植受体匹配。然而，即使在可以共享高百分比的HLA同一性的家庭成员之间，同种异体捐赠也往往不成功。为了防止排斥，同种异体移植受体常常受制于艰深的免疫抑制性疗法，所述艰深的免疫抑制性疗法可能由于机会性感染而导致并发症和重大病况。因此，非自身HLA-I和非自身HLA-II蛋白的识别是同种异体细胞移植和细胞替代疗法的主要障碍。

HLA-I或HLA-II基因的表面表达可以由肿瘤细胞和病毒病原体调节。例如，与HLA-Iα链形成异二聚体的β₂-微球蛋白(B2M)的下调是肿瘤细胞用来逃避抗肿瘤介导的免疫应答的广泛机制(Nomura等人,“作为癌症疗法的靶标的β2-微球蛋白介导的信号传导(β2-Microglobulin-mediated Signaling as a Target for Cancer Therapy)”,《医药化学中的抗癌药剂(Anticancer Agents Med Chem.)》14(3):343-352(2014)，其特此通过全文引用的方式并入)。在另一个实例中，用如HSV和HCMV等α-疱疹病毒或β-疱疹病毒感染某些细胞类型导致HLA-I和HLA-II复合物的表面表达通过HLA-I重链和HLA-IIα链(HLA-DRα和HLA-DMα)的蛋白酶体降解而减少(Wiertz等人，“疱疹病毒对主要组织相容性复合物II类限制性T细胞激活的干扰(Herpesvirus Interference with Major HistocompatibilityComplex Class II-Restricted T-Cell Activation)”，《病毒学杂志(J.Virology)》81(9):4389-4386(2007))。

重要的是，在非自体细胞移植的情况下，供体细胞表面的HLA-I和HLA-II分子的下调或缺失可能使此类细胞容易被先天免疫系统清除。例如，自然杀伤(NK)细胞通过识别不表达HLA-I分子的细胞并诱导其凋亡来监测宿主的感染。同样，驻留于脾脏和肝脏中的巨噬细胞靶向未能呈递“自身”蛋白质的自体细胞，以通过程序性细胞吞噬作用进行清除(Krysoko等人，“巨噬细胞通过钙网蛋白调节活细胞的清除(Macrophages Regulate theClearance of Living Cells by Calreticulin)”，《自然通讯(Nature Comm.)》9,文章编号:4644(2018))。

细胞移植和细胞替代疗法的另一个考虑是使用非终末分化细胞，如多能干细胞(pluripotent stem cell)(例如，胚胎干细胞和诱导性多能干细胞)或多能干细胞(multipotent stem cell)。此类细胞可以以同种异体(供体来源)干细胞或自体(自身来源)干细胞的形式被移植。由于未分化干细胞的特征在于能够快速生长和自发分化率低，因此存在对干细胞移植后立即和长期的肿瘤发生风险的担忧(Mousavinejad等人，“当前干细胞疗法的生物安全考虑(Current Biosafety Considerations in Stem Cell Therapy)”，《细胞杂志(Cell J.)》18(2):281-287(2016))。

本公开涉及克服本领域中的缺陷。

发明内容

本公开的一个方面涉及一种重组基因构建体，其包括：以细胞类型特异性方式表达的第一基因序列；位于所述第一基因序列的3'处的一个或多个编码免疫检查点蛋白的核苷酸序列；以及以细胞类型特异性方式表达的第二基因序列，其中所述第二基因序列位于所述一个或多个编码免疫检查点蛋白的核苷酸序列的3'处。

本公开的另一个方面涉及一种重组基因构建体，其包括：以细胞类型特异性方式表达的第一基因序列；对减少一种或多种HLA-I分子的表达的一种或多种药剂进行编码的核苷酸序列，所述核苷酸序列位于所述第一基因序列的3'处；以及以细胞类型特异性方式表达的第二基因序列，其中所述第二基因序列位于所述对减少一种或多种HLA-I分子的表达的一种或多种药剂进行编码的核苷酸序列的3'处。

本公开的另一个方面涉及一种重组基因构建体，其包括：以细胞类型特异性方式表达的第一基因序列；一个或多个编码免疫检查点蛋白的核苷酸序列；对减少一种或多种HLA-I分子的表达的一种或多种药剂进行编码的核苷酸序列，其中所述编码免疫检查点蛋白的核苷酸序列和所述对减少一种或多种HLA-I分子的表达的一种或多种药剂进行编码的核苷酸序列位于所述第一基因序列的3'处。所述重组基因构建体进一步包括以细胞类型特异性方式表达的第二基因序列，其中所述第二基因序列位于所述一个或多个编码免疫检查点蛋白的核苷酸序列和所述对减少一种或多种HLA-I分子的表达的一种或多种药剂进行编码的核苷酸序列的3'处。

本公开的另一个方面涉及一种由一个或多个细胞构成的制剂，所述一个或多个细胞包含本公开的重组基因构建体。

另外的方面涉及一种方法，所述方法涉及向需要的受试者施用由包括本公开的重组基因构建体的一个或多个细胞构成的制剂。

本公开的又另一个方面涉及一种治疗患有由髓磷脂损失或少突胶质细胞损失或功能障碍介导的病状的受试者的方法。此方法涉及在有效地治疗所述病状的条件下向所述受试者施用由包括本文所述的重组基因构建体的一个或多个细胞构成的制剂。

另一个方面涉及一种治疗患有由星形胶质细胞损失或功能障碍介导的病状的受试者的方法。此方法涉及在有效地治疗所述病状的条件下向所述受试者施用由包括本文所述的重组基因构建体的一个或多个细胞构成的制剂。

另一个方面涉及一种治疗患有由神经元损失或功能障碍介导的病状的受试者的方法。此方法涉及在有效地治疗所述病状的条件下向所述受试者施用由包括本文所述的重组基因构建体的一个或多个细胞构成的制剂。

另外的方面涉及一种由一个或多个细胞构成的制剂，其中所述制剂的细胞被修饰以：与对应的野生型细胞相比，条件性地表达增加水平的一种或多种免疫检查点蛋白；与对应的野生型细胞相比，条件性地表达降低水平的一种或多种内源性HLA-I蛋白；或者与对应的野生型细胞相比，条件性地表达增加水平的一种或多种免疫检查点蛋白并条件性地表达降低水平的一种或多种内源性HLA-I蛋白。

又另一个实施例涉及一种产生条件性免疫保护的细胞的方法。此方法涉及：对细胞进行修饰以条件性地表达增加水平的一种或多种免疫检查点蛋白；对所述细胞进行修饰以条件性地表达减少一种或多种内源性HLA-蛋白的表达的一种或多种药剂；或者对细胞进行修饰以条件性地表达增加水平的一种或多种免疫检查点蛋白并条件性地表达减少一种或多种内源性HLA-蛋白的表达的一种或多种药剂。

附图说明

图1是本公开的重组基因构建体的示意图，所述重组基因构建体包括(i)以细胞类型特异性方式表达的第一基因序列和第二基因序列，(ii)一个或多个编码免疫检查点蛋白的核苷酸序列，和(iii)对减少一种或多种HLA-I分子的表达的一种或多种药剂进行编码的核苷酸序列。如此示意图所示，示例性重组基因构建体从5'→3'可以包括：以细胞类型特异性方式表达的第一基因序列(即5'同源臂)；编码自切割肽的核苷酸序列(例如，P2a)；编码免疫检查点蛋白的核苷酸序列；终止密码子；对减少一种或多种HLA-I分子的表达的药剂进行编码的核苷酸序列(即shRNA)；选择标志物；以及以与第一基因序列相同的细胞类型特异性方式表达的第二基因序列(即3'同源臂)。

图2是以细胞类型特异性方式表达的重组基因构建体的示意图，其中所述构建体包括HLA-E/syB2M敲入载体和靶向B2M和CIITA的shRNA。此示例性重组基因构建体从5'→3'包括：以细胞类型特异性方式表达的第一基因序列(即5'同源臂)；编码自切割肽的核苷酸序列(例如，P2a)；编码免疫检查点蛋白的核苷酸序列(例如，HLA-E/syB2M)；终止密码子；对减少一种或多种HLA-I分子的表达的药剂进行编码的核苷酸序列(即抗B2M shRNA)；对减少一种或多种HLA-II分子的表达的一种或多种药剂进行编码的核苷酸序列(即抗CIITAshRNA)；选择标志物(嘌呤霉素)；以及以与第一基因序列相同的细胞类型特异性方式表达的第二基因序列(即3'同源臂)。此实例中所示的选择标志物包括EF1a启动子和多腺苷酸化信号(PA)。

图3是以细胞类型特异性方式表达的重组基因构建体的示意图，所述重组基因构建体包括CD47敲入载体和靶向B2M和CIITA的shRNA。所述重组基因构建体从5'→3'包括：以细胞类型特异性方式表达的第一基因序列(即5'同源臂)；编码自切割肽的核苷酸序列(例如，P2a)；编码免疫检查点蛋白的核苷酸序列(即CD47)；终止密码子；对减少一种或多种HLA-I分子的表达的一种或多种药剂进行编码的核苷酸序列(即抗B2M shRNA)；对减少一种或多种HLA-II分子的表达的一种或多种药剂进行编码的核苷酸序列(即抗CIITA shRNA)；选择标志物(嘌呤霉素)；以及以与第一基因序列相同的细胞类型特异性方式表达的第二基因序列(即3'同源臂)。此实例中所示的选择标志物包括EF1a启动子和多腺苷酸化信号(PA)。

图4是以细胞类型特异性方式表达的重组基因构建体的示意图，所述重组基因构建体包括PD-L1敲入载体和靶向B2M和CIITA的shRNA。所述重组基因构建体从5'→3'包括：以细胞类型特异性方式表达的第一基因序列(即5'同源臂)；编码自切割肽的核苷酸序列(例如，P2a)；编码免疫检查点蛋白的核苷酸序列(即PD-L1)；终止密码子；对减少一种或多种内源性HLA-I分子的表达的一种或多种药剂进行编码的核苷酸序列(即抗B2M shRNA)；对减少一种或多种内源性HLA-II分子的表达的一种或多种药剂进行编码的核苷酸序列(即抗CIITA shRNA)；选择标志物(嘌呤霉素)；以及以与第一基因序列相同的细胞类型特异性方式表达的第二基因序列(即3'同源臂)。此实例中所示的选择标志物包括EF1a启动子和多腺苷酸化信号(PA)。

图5是示出了靶细胞和保护信号(即免疫检查点蛋白)的组合的矩阵。合适的细胞靶标包括少突胶质细胞祖细胞(MYRF基因座)、神经元(SYN1基因座)和星形胶质细胞(GFAP基因座)。免疫检查点蛋白，在本文中也被称为“保护信号”或“别吃我(don't eat me)信号”，包括HLA-E/syB2M单链三聚体、PD-L1和CD47。在矩阵中示出的每个排列组合中，敲入盒进一步包括编码抗B2M shRNA(以耗竭内源性HLA-I/B2M复合物的表达)和/或抗CIITAshRNA(以耗竭HLA-II复合物的表达)的核苷酸序列。

图6是包括靶向在神经元中限制性表达的突触素(SYN1)基因座的HLA-E/syB2M敲入载体的示例性重组基因构建体的示意图。所述重组基因构建体从5'→3'包括：5'同源臂(突触素1基因的第一核苷酸序列)；编码自切割肽的核苷酸序列(例如，P2a)；编码HLA-E/syB2M的核苷酸序列；终止密码子；多腺苷酸化信号(PA)；编码抗B2M shRNA的核苷酸序列；编码抗CIITA shRNA的核苷酸序列；嘌呤霉素选择标志物；以及3'同源臂(突触素1基因的第二核苷酸序列)。此示例性构建体中的选择标志物包括EF1a启动子和多腺苷酸化信号(PA)。

图7是包括靶向在神经元中限制性表达的突触素(SYN1)基因座的CD47敲入载体的示例性重组基因构建体的示意图。所述重组基因构建体从5'→3'包括：5'同源臂(突触素1基因的第一核苷酸序列)；编码自切割肽的核苷酸序列(例如，P2a)；编码CD47的核苷酸序列；终止密码子；多腺苷酸化信号(PA)；编码抗B2M shRNA的核苷酸序列；编码抗CIITAshRNA的核苷酸序列；嘌呤霉素选择标志物；以及3'同源臂(突触素1基因的第二核苷酸序列)。此示例性构建体中的选择标志物包括EF1a启动子和多腺苷酸化信号(PA)。

图8是包括靶向在神经元中表达的突触素(SYN1)基因座的PD-L1敲入载体的示例性重组基因构建体的示意图。所述重组基因构建体从5'→3'包括：5'同源臂(突触素1基因的第一核苷酸序列)；编码自切割肽的核苷酸序列(例如，P2a)；编码PD-L1的核苷酸序列；终止密码子；多腺苷酸化信号(PA)；编码抗B2M shRNA的核苷酸序列；编码抗CIITA shRNA的核苷酸序列；嘌呤霉素选择标志物；以及3'同源臂(突触素1基因的第二核苷酸序列)。此示例性构建体中的选择标志物包括EF1a启动子和多腺苷酸化信号(PA)。

图9是包括靶向在少突胶质细胞祖细胞和少突胶质细胞中表达的髓磷脂调节因子(MYRF)基因座的HLA-E/syB2M敲入载体的重组基因构建体的示意图。所述重组基因构建体包括：5'同源臂(髓磷脂调节因子基因的第一核苷酸序列)；编码自切割肽的核苷酸序列(例如，P2a)；编码HLA-E/syB2M的核苷酸序列；终止密码子；多腺苷酸化信号(PA)；编码抗B2MshRNA的核苷酸序列；编码抗CIITA shRNA的核苷酸序列；嘌呤霉素选择标志物；以及3'同源臂(髓磷脂调节因子基因的第二核苷酸序列)。此示例性构建体中的选择标志物包括EF1a启动子和多腺苷酸化信号(PA)。

图10是包括靶向在少突胶质细胞祖细胞和少突胶质细胞中限制性表达的髓磷脂调节因子(MYRF)基因座的CD47敲入载体的示例性重组基因构建体的示意图。所述重组基因构建体从5'→3'包括：5'同源臂(髓磷脂调节因子基因的第一核苷酸序列)；编码自切割肽的核苷酸序列(例如，P2a)；编码CD47的核苷酸序列；终止密码子；多腺苷酸化信号(PA)；编码抗B2M shRNA的核苷酸序列；编码抗CIITA shRNA的核苷酸序列；嘌呤霉素选择标志物；以及3'同源臂(髓磷脂调节因子基因的第二核苷酸序列)。此示例性构建体中的选择标志物包括用于在哺乳动物细胞中组成型表达的EF1a启动子和多腺苷酸化信号(PA)。

图11是包括靶向在少突胶质细胞祖细胞和少突胶质细胞中限制性表达的髓磷脂调节因子(MYRF)基因座的PD-L1敲入载体的示例性重组基因构建体的示意图。所述重组基因构建体从5'→3'包括：5'同源臂(髓磷脂调节因子基因的第一核苷酸序列)；编码自切割肽的核苷酸序列(例如，P2a)；编码PD-L1的核苷酸序列；终止密码子；多腺苷酸化信号(PA)；编码抗B2M shRNA的核苷酸序列；编码抗CIITA shRNA的核苷酸序列；嘌呤霉素选择标志物；以及3'同源臂(髓磷脂调节因子基因的第二核苷酸序列)。此示例性构建体中的选择标志物包括用于在哺乳动物细胞中组成型表达的EF1a启动子和多腺苷酸化信号(PA)。

图12是包括靶向在星形胶质细胞中限制性表达的胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)基因座的HLA-E/syB2M敲入载体的示例性重组基因构建体的示意图。所述重组基因构建体从5'→3'包括：5'同源臂(胶质原纤维酸性蛋白基因的第一核苷酸序列)；编码自切割肽的核苷酸序列(例如，P2a)；编码HLA-E/syB2M的核苷酸序列；终止密码子；多腺苷酸化信号(PA)；编码抗B2M shRNA的核苷酸序列；编码抗CIITA shRNA的核苷酸序列；嘌呤霉素选择标志物；以及3'同源臂(胶质原纤维酸性蛋白基因的第二核苷酸序列)。此示例性构建体中的选择标志物包括用于在哺乳动物细胞中组成型表达的EF1a启动子和多腺苷酸化信号(PA)。

图13是包括靶向在星形胶质细胞中限制性表达的胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)基因座的CD47敲入载体的示例性重组基因构建体的示意图。所述重组基因构建体从5'→3'包括：5'同源臂(胶质原纤维酸性蛋白基因的第一核苷酸序列)；编码自切割肽的核苷酸序列(例如，P2a)；编码CD47的核苷酸序列；终止密码子；多腺苷酸化信号(PA)；编码抗B2M shRNA的核苷酸序列；编码抗CIITA shRNA的核苷酸序列；嘌呤霉素选择标志物；以及3'同源臂(胶质原纤维酸性蛋白基因的第二核苷酸序列)。此示例性构建体中的选择标志物包括用于在哺乳动物细胞中组成型表达的EF1a启动子和多腺苷酸化信号(PA)。

图14是包括靶向在星形胶质细胞中限制性表达的胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)基因座的PD-L1敲入载体的示例性重组基因构建体的示意图。所述重组基因构建体从5'→3'包括：5'同源臂(胶质原纤维酸性蛋白基因的第一核苷酸序列)；编码自切割肽的核苷酸序列(例如，P2a)；编码PD-L1的核苷酸序列；终止密码子；多腺苷酸化信号(PA)；编码抗B2MshRNA的核苷酸序列；编码抗CIITA shRNA的核苷酸序列；嘌呤霉素选择标志物；以及3'同源臂(胶质原纤维酸性蛋白基因的第二核苷酸序列)。此示例性构建体中的选择标志物包括用于在哺乳动物细胞中组成型表达的EF1a启动子和多腺苷酸化信号(PA)。

图15是包括靶向在少突胶质细胞祖细胞和少突胶质细胞中表达的髓磷脂调节因子(MYRF)基因座的CD47敲入载体的示例性重组基因构建体的示意图。所述重组基因构建体包括5'同源臂(HAL)；编码自切割肽的核苷酸序列(P2A)；编码CD47的核苷酸序列；编码抗B2M shRNA的核苷酸序列；编码抗CIITA shRNA的核苷酸序列；编码copGFP、自切割肽(T2A)和与EF1a启动子操作性地连接的嘌呤霉素抗性基因的核苷酸序列；以及3'同源臂(HAR)。

图16A-16D示出了靶向血小板源性生长因子受体α(PDGFRA)基因座的重组基因构建体的设计和验证。图16A是各自靶向PDGFRA基因座的PD-L1或CD47敲入载体(顶部基因构建体)和对照载体(底部构建体)的策略和设计的示意图。PD-L2或CD47敲入载体从5'→3'包括：5'同源臂(血小板源性生长因子α基因的第一核苷酸序列)；终止密码子；内部核糖体进入位点(IRES)；编码CD47或PD-L1的核苷酸序列；编码抗B2M shRNA的核苷酸序列；编码抗CIITA shRNA的核苷酸序列；嘌呤霉素选择标志物；以及3'同源臂(血小板源性生长因子α基因的第二核苷酸序列)。对照载体从5'→3'包括：5'同源臂(血小板源性生长因子α基因的第一核苷酸序列)；终止密码子；IRES；编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的核苷酸序列；终止密码子；嘌呤霉素选择标志物；以及3'同源臂(血小板源性生长因子α基因的第二核苷酸序列)。这些构建体中的嘌呤霉素选择标志物包括用于在哺乳动物细胞中组成型表达的磷酸甘油酸酯激酶(PGK)启动子和多腺苷酸化信号(PA)。图16B-16D是使用图16A的靶向PDGFRA基因座的重组基因构建体并使用CRISPR介导的PD-L1(图16B)、CD47(图16C)和EGFP(图16D)敲入产生的克隆的荧光显微术图像。PD-L1或CD47，红色；DAPI，蓝色。

图17A-17B证明了表达CD47或PD-L1的人U251胶质瘤细胞在免疫人源化宿主中优先扩增和持续存在。图17A示出了人外周血单核细胞嵌合的免疫缺陷型NOG小鼠(huPBMC-NOG小鼠)在胁腹中被皮下注射在PDGFRA基因座中表达PD-L1、CD47或EGFP(即使用图16A的表达载体实现)的基因编辑的U251敲入(KI)细胞后1天、5天和9天的生物发光图像。图17B是示出了第1天、第5天和第9天的肿瘤生物发光的图。图17B示出，到第9天，CD47表达性U251细胞的扩增和持续存在的程度明显高于EGFP表达性对照细胞，这与它们避免了人源化宿主免疫系统的移植排斥一致。处理效果，通过双因素方差分析(2-way ANOVA)(F[2，12)＝9.16；p<0.001，n＝3只小鼠/组。CD47敲入与EGFP对照之间的差异，**p<0.01，通过Sidak事后比较；平均值±SEM。

具体实施方式

本公开涉及一种重组基因构建体、由包括本文所述的重组基因构建体的一个或多个细胞构成的制剂，以及使用所公开的细胞制剂治疗受试者的方法。

本公开的一个方面涉及一种重组基因构建体，所述重组基因构建体被设计成向表达所述构建体的细胞提供细胞类型选择性免疫保护。

在一个实施例中，所述重组基因构建体包括：以细胞类型特异性方式表达的第一基因序列；位于所述第一细胞特异性基因序列的3'处的一个或多个编码免疫检查点蛋白的核苷酸序列；以及以细胞类型特异性方式表达的第二基因序列，其中所述第二基因序列位于所述编码免疫检查点蛋白的核苷酸序列的3'处。

在另一个实施例中，所述重组基因构建体包括：以细胞类型特异性方式表达的第一基因序列；对减少一种或多种HLA-I分子的表达的一种或多种药剂进行编码的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列位于所述第一细胞特异性基因序列的3'处；以及以细胞类型特异性方式表达的第二基因序列，其中所述第二基因序列位于所述对减少一种或多种HLA-I分子的表达的一种或多种药剂进行编码的核苷酸序列的3'处。

在另一个实施例中，所述重组基因构建体包括以细胞类型特异性方式表达的第一基因序列。所述重组基因构建体进一步包括一个或多个编码免疫检查点蛋白的核苷酸序列，所述一个或多个编码免疫检查点蛋白的核苷酸序列与对减少一种或多种HLA-I分子的表达的一种或多种药剂进行编码的核苷酸序列偶联，其中所述编码免疫检查点蛋白的核苷酸序列和所述对减少一种或多种HLA-I分子的表达的一种或多种药剂进行编码的核苷酸序列位于所述第一基因序列的3'处。此构建体进一步包括以细胞类型特异性方式表达的第二基因序列，其中所述第二基因序列位于所述编码免疫检查点蛋白的核苷酸序列和所述对减少一种或多种HLA-I分子的表达的一种或多种药剂进行编码的核苷酸序列的3'处。

如下面更详细描述的，上述重组基因构建体中的任何一种重组基因构建体也可以含有对减少一种或多种HLA-II分子的表达的一种或多种药剂进行编码的另外的核苷酸序列。此另外的核苷酸序列可以与所述一个或多个编码免疫检查点蛋白的核苷酸序列、所述对减少一种或多种HLA-I分子的表达的一种或多种药剂进行编码的核苷酸序列或两者偶联。

如本文所使用的，本公开的“重组基因构建体”是指含有两个或更多个非天然存在的基因元件的组合的核酸分子。重组基因构建体包括非天然存在的核苷酸序列，所述非天然存在的核苷酸序列可以呈线性DNA、环状DNA的形式，即放置在载体(例如，细菌载体、病毒载体)内或整合到基因组中。

如下面更详细描述的，将重组基因构建体引入到所关注细胞的基因组中，以实现一种或多种免疫检查点蛋白或肽和/或减少一种或多种HLA-I蛋白的表达的一种或多种药剂的表达。在一些实施例中，所述减少一种或多种HLA-I蛋白的表达的一种或多种药剂起到减少一种或多种HLA-I蛋白的表面表达的作用。

如本文所使用的，术语“核苷酸序列”和“核酸序列”可互换使用，以指任何长度的核苷酸，核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的聚合物形式。因此，此术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA/RNA杂交体或包括嘌呤和嘧啶碱基或其它天然的、经化学或生化修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。在本公开的重组基因构建体的上下文中，如果核苷酸序列在其天然状态下或当通过本领域技术人员熟知的方法操纵时可以被转录和/或翻译以产生用于蛋白质和/或其片段的mRNA，则所述核苷酸序列可以是“编码”所述蛋白质的核苷酸序列。如果重组基因构建体的核苷酸序列在其天然状态下或当通过本领域众所周知的方法操纵时可以被转录以产生具有期望的效应子功能的药剂(例如，shRNA、siRNA、微RNA、向导RNA等)，则所述核苷酸序列还可以“编码”所述具有效应子功能的药剂。

由本公开的重组基因构建体的核苷酸序列编码的免疫检查点蛋白可以是参与免疫系统下调和/或促进免疫自身耐受性的任何蛋白质或其肽。在一个实施例中，免疫检查点蛋白或其肽是抑制获得性免疫应答的活性的免疫检查点蛋白或其肽。在一个实施例中，免疫检查点蛋白或其肽是抑制先天免疫应答的活性的免疫检查点蛋白或其肽。

在一个实施例中，由重组基因构建体编码的免疫检查点蛋白是与抑制性程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)结合的程序性死亡配体1(PD-L1)、程序性死亡配体2(PD-L2)或其功能活性肽。PD-1主要在外周组织和肿瘤微环境中的成熟T细胞上表达。它还在包括B细胞、专职APC和自然杀伤(NK)细胞的其它非T细胞亚群上表达。PD-1的信号传导是通过与其配体PD-L1(也被称为B7-H1和CD274)和PD-L2(也被称为B7-DC和CD273)相互作用而介导的。PD-1与其配体，即PD-L1和PD-L2中的任何一种配体的相互作用传输抑制性信号，所述抑制性信号减少淋巴结处CD8⁺T细胞的增殖，从而抑制免疫应答。

用于包括在本文所述的重组基因构建体中的编码人类PD-L1和PD-L2的合适的核苷酸序列在下表1中阐述。合适的核苷酸序列还包括与下表1中提供的PD-L1编码序列和PD-L2编码序列(即SEQ ID NO.1-4)具有约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。

表1：合适的PD-L1编码序列和PD-L2编码序列

可以并入本文所述的重组基因构建体中的另外的合适的人类编码PD-L1的核苷酸序列是本领域已知的，参见例如基因库登录号BC113734.1、BC113736.1、BC074984.2和BC069381.1，所述基因库登录号特此通过全文引用的方式并入。

可以并入本文所述的重组基因构建体中的另外的合适的人类编码PD-L2的核苷酸序列是本领域已知的，参见例如基因库登录号BC113680.1、BC113678.1和BC074766.2，所述基因库登录号特此通过全文引用的方式并入。

在另一个实施例中，由本公开的重组基因构建体编码的免疫检查点蛋白或肽是细胞表面抗原分化簇47(CD47；整合素相关蛋白(IAP))。巨噬细胞的吞噬活性由激活性(“吃”)和抑制性(“不吃”)信号调节。在正常生理条件下，普遍表达的CD47通过与巨噬细胞上的信号调节蛋白α(SIRPα)结合来抑制吞噬作用。SIRPα，也称为含Src同源性2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶底物1/具有基于酪氨酸的激活基序的脑Ig样分子/分化簇抗原样家族成员A(SHPS-1/BIT/CD172a)，是在如巨噬细胞和树突细胞等髓系造血细胞中特别丰富的另一种免疫球蛋白超家族膜蛋白。吞噬细胞上的SIRPα与相邻细胞上表达的CD47的连接引起SIRPα质型免疫受体基于酪氨酸的抑制(ITIM)基序的磷酸化，从而导致SHP-1和SHP-2磷酸酶的募集。一种由此产生的下游效应是防止肌球蛋白-IIA在吞噬突触处积累并因此抑制吞噬作用。因此，CD47-SIRPα相互作用以阴性免疫检查点的形式用于发送“别吃我”信号，以确保健康的自体细胞不会被不当吞噬(Lui等人,“CD47是肿瘤逃避的先天免疫检查点吗？(Is CD47an Innate Immune Checkpoint for Tumor Evasion？)”《血液学和肿瘤学杂志(J.Hematol.Oncol.)》10:12(2017)，所述文献特此通过全文引用的方式并入)。

用于包括在本文所述的重组基因构建体中的编码人类CD47的合适的核苷酸序列在下表2中阐述。合适的核苷酸序列还包括与下表2中提供的CD47编码序列(即SEQ IDNO.5-8)具有约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。

表2：示例性CD47编码序列

在另一个实施例中，由重组基因构建体编码的免疫检查点蛋白是CD200。CD200(也被称为OX-2膜糖蛋白)是45kDa跨膜免疫检查点蛋白。CD200受体(CD200R)在单核细胞/巨噬细胞系的细胞以及B细胞和T细胞的亚群上表达。由CD200进行的信号传导阻止了携带CD200R的骨髓细胞的正常激活，最终产生了免疫抑制性级联，所述免疫抑制性级联包括调节性T细胞(T_regs)的诱导(Gaiser等人,“默克细胞癌表达免疫调节性配体CD200并诱导免疫抑制性巨噬细胞和调节性T细胞(Merke Cell Carcinoma Expresses theImmunoregulatory Ligand CD200 and Induces Immunosuppressive Macrophages andRegulatory T Cells)”,《肿瘤免疫学(Oncoimmunology)》7(5):e1426517(2018)，所述文献特此通过全文引用的方式并入)。例如，CD200信号传导抑制经典的巨噬细胞激活(M1极化)并且支持分泌高水平的IL-10的免疫抑制性M2极化状态，从而诱导T_regs。因此，通过本文所述的重组基因构建体实现的CD200的细胞表达将使细胞免受巨噬细胞和T细胞介导的应答的影响。

用于包括在本文所述的重组基因构建体中的编码人类CD200的合适的核苷酸序列在下表3中阐述。合适的核苷酸序列还包括与下表3中提供的CD200编码序列(即SEQ IDNO.9-12)具有约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。

表3：示例性CD200编码序列

在另一个实施例中，由重组基因构建体编码的免疫检查点蛋白是CTLA-4。在免疫识别过程中，T淋巴细胞的扩增和分化需要两种信号：与HLA分子-肽复合物结合的T细胞受体(TCR)；以及由B7(CD80和Cd86)/CD28相互作用提供的抗原非依赖性共刺激性信号。细胞毒性T淋巴细胞抗原(CTLA-4)是作为B7的竞争性拮抗剂的CD28的同源分子。与CD28相比，CTLA-4对B7的亲和力和亲合力更高，并且其在T细胞激活后转位到细胞表面引起B7隔离和负责T细胞失活的阴性信号的转导(Pérez-García等人,“从HLA相同同胞供体进行同种异体干细胞移植后的CTLA-4多态性和临床结果(CTLA-4Polymorphisms and Clinical Outcomeafter Allogeneic Stem Cell Transplantation from HLA-Identical SiblingDonors)”,《血液(Blood)》110(1):461-7(2007)，所述文献特此通过全文引用的方式并入)。因此，通过本文所述的重组基因构建体实现的CTLA-4的细胞表达将使细胞免受细胞毒性T细胞介导的溶解。

CTLA-4基因被翻译成2种同种型：全长蛋白(flCLTA-4)和可溶性对应物(sCTLA-4)，所述可溶性对应物由于可变剪接而缺少外显子3(负责编码跨膜结构域)。flCTLA-4通过诱导细胞周期阻滞和阻断细胞因子产生来下调T细胞应答。因此，在一些实施例中，由重组基因构建体编码的免疫检查点蛋白是全长CTLA-4(flCTLA-4)。

用于包括在本文所述的重组基因构建体中的编码人类CTLA-4的合适的核苷酸序列在下表4中阐述。合适的核苷酸序列还包括与下表4中提供的CTLA-4编码序列(即SEQ IDNO.13-14和44)具有约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。

表4：示例性CTLA-4编码序列

在另一个实施例中，由重组基因构建体编码的免疫检查点蛋白是HLA-E(主要组织相容性复合物，I类、E类)。自然杀伤(NK)细胞检测其中MHC分子的表达已经减少、改变、消除或不存在的受感染细胞(主要由病毒感染)、外来细胞或恶性肿瘤细胞。NK细胞通过识别在正常宿主细胞表面表达的MHC I类的杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)和CD94-NKG2A抑制性受体来区分正常宿主细胞。具体地，CD94-NKG2A识别NK细胞和CD8⁺T细胞的表面的HLA-E。这些受体的结合抑制了被NK细胞溶解和NK细胞的细胞因子分泌。KIR也在CD8⁺T细胞和APC上表达。因此，通过本文所述的重组基因构建体实现的HLA-E的细胞表达将使细胞免受NK细胞溶解。

与其它HLA I类蛋白一样，HLA-E是由重链(α链)和轻链(β₂微球蛋白)组成的异二聚体。在一个实施例中，重组基因构建体可以包括编码HLA-E(α链E)的核苷酸序列和编码β₂微球蛋白链的核苷酸序列。可替代地，重组基因构建体可以包括融合构建体，即编码单链融合蛋白的核苷酸序列，所述单链融合蛋白包括β₂微球蛋白的至少一部分，所述至少一部分与HLA-E的至少一部分共价连接。在其它实施例中，HLA-E/β₂M融合蛋白是syβ₂M-HLA-E，其中syB2M(合成B2M)以与HLA-E形成的复合物的形式表达。syB2M在靶向内源性B2M的shRNA的靶序列处含有若干个沉默突变。如此，syB2M编码与野生型B2M完全相同的蛋白质，而对仅靶向内源性B2M的shRNA具有抗性。

编码人HLA-E(α链)的示例性核苷酸序列在下表5中提供。合适的核苷酸序列还包括与下表5中提供的HLA-E编码序列(即SEQ ID NO.15-17)具有约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。

表5：示例性HLA-E编码序列

编码人β₂M的示例性核苷酸序列在下表6中提供。合适的核苷酸序列还包括与下表6中提供的β₂M编码序列(即SEQ ID NO.18-21)具有约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。

表6：合适的β₂M编码序列

单链HLA-E/β₂M融合蛋白可以包括通过柔性接头与β₂M共价融合的HLA-E重链。在一些实施例中，柔性接头是甘氨酸-丝氨酸接头，例如G₄S₄接头(Gornalusse等人,“HLA-E表达性多能干细胞逃避同种异体应答和NK细胞的溶解(HLA-E-Expressing Pluripotent StemCells Escape Allogenic Responses and Lysis by NK Cells)”,《自然生物技术(Nat.Biotechnol.)》35(8):765-772(2017)，所述文献特此通过全文引用的方式并入)。

HLA-G的信号序列包括通常由HLA-E呈递的肽序列，所述肽序列通过与CD94/NGK2A的结合抑制NK细胞依赖性溶解(Lee等人,“HLA-E是自然杀伤细胞抑制性受体CD94/NKG2A的主要配体(HLA-E is a Major Ligand for the Natural Killer Inhibitory ReceptorCD94/NKG2A)”,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》95:5199-5204(1998)，所述文献特此通过全文引用的方式并入)。因此，在一些实施例中，单链HLA-E/β₂M融合蛋白进一步包括与衍生自HLA-G的信号序列的非多态肽融合的另外的甘氨酸-丝氨酸接头(Gornalusse等人,“HLA-E表达性多能干细胞逃避同种异体应答和NK细胞的溶解(HLA-E-Expressing Pluripotent Stem Cells Escape Allogenic Responses and Lysis by NKCells)”,《自然生物技术》35(8):765-772(2017)，所述文献特此通过全文引用的方式并入)。

如上所述，本文所公开的重组基因构建体可以可替代地或另外地包括对减少一种或多种主要组织相容性I类分子，具体地一种或多种HLA-I分子的表达的一种或多种药剂进行编码的核苷酸序列。在一个实施例中，此核苷酸序列单独存在于重组基因构建体中，位于第一基因序列与第二基因序列之间。在另一个实施例中，此核苷酸序列与一个或多个编码免疫检查点蛋白的核苷酸序列组合存在于重组基因构建体中。在此实施例中，上述核苷酸序列的组合位于第一基因序列与第二基因序列之间。对减少HLA-I分子的表达的一种或多种药剂进行编码的核苷酸序列可以位于一个或多个编码免疫检查点蛋白的核苷酸序列的5'或3'处。

本公开的重组基因构建体可以包括对减少一种或多种HLA-II分子的表达的一种或多种药剂进行编码的另外的核苷酸序列。在一些实施例中，对减少一种或多种HLA-II分子的表达的一种或多种药剂进行编码的核苷酸序列与一个或多个编码免疫检查点蛋白的核苷酸序列偶联和/或与对减少一种或多种HLA-I分子的表达的一种或多种药剂进行编码的核苷酸序列偶联。

减少一种或多种HLA-I和/或HLA-II分子的表达的合适的药剂在下文详细描述，包括但不限于抑制性寡核苷酸分子，如小发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)和/或反义寡核苷酸。

人类白细胞抗原(HLA)系统是人类的主要组织相容性复合物(MHC)。因此，出于本公开的目的，术语HLA和MHC可互换使用，是指主要组织相容性复合物的人类基因和蛋白质。在其它实施例中，重组基因构建体可以包括编码一种或多种药剂的核苷酸序列，所述一种或多种药剂减少一种或多种非人类、哺乳动物MHC I类或II类分子，例如小鼠、大鼠、猪、马、猴MHC I类或II类分子的表达。

I类MHC蛋白(例如，HLA-I蛋白)是两种蛋白质的异二聚体，所述两种蛋白质即：α链，所述α链是由MHC I类基因(人类的6号染色体；小鼠的17号染色体)编码的跨膜蛋白；和β2-微球蛋白(β2M)链(人类的15号染色体；小鼠的2号染色体)。α链折叠成三个球状结构域——α1、α2和α3。α1结构域位于β2M的单元上。α3结构域是跨膜的，将MHC I类分子锚定到细胞膜。MHC I类复合物向免疫系统的细胞呈递外来肽/分子。所呈递的肽/分子由位于MHC的α1/α2异二聚体的中心区中的肽结合性凹槽容纳。典型的MHC I类分子是高度多态的并向CD8⁺T细胞的T细胞受体(TCR)呈递表位，而非典型的MHC I类分子表现出的多态性、表达模式和呈递的抗原有限。

人类的I类HLA基因簇编码典型(HLA-A、HLA-B和HLA-C)和非典型(HLA-E、HLA-F、HLA-G)I类分子的重链。因此在一个实施例中，本文公开的重组基因构建体包括编码一种或多种药剂的核苷酸序列，所述一种或多种药剂减少对于其中表达重组基因构建体的细胞而言是内源性的一种或多种HLA-I分子，即HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G或其组合的表达。在另一个实施例中，本文所公开的重组基因构建体包括对减少β2M表达，从而减少细胞中所有I类HLA的表达的药剂进行编码的核苷酸序列。

II类HLA分子，即人类形式的II类MHC蛋白，是由II类基因(人类的6号染色体上的HLA-II基因；小鼠的17号染色体上的MHC-II基因)编码的两个跨膜蛋白α链和β链的异二聚体。α链和β链中的每条链包括两个结构域——分别为α1和α2，以及β1和β2。α2和β2结构域分别是α链和β链的将MHC/HLA II分子锚定到膜的跨膜结构域。典型的MHC/HLA II类分子在树突细胞、单核吞噬细胞和B淋巴细胞的表面表达并向CD4⁺T细胞呈递肽，而非典型的MHC/HLAII类分子不暴露于细胞膜上，而在溶酶体的内膜上暴露。MHC/HLA II类的表达是由IFN-γ通过产生MHC II类反式激活因子(CIITA)诱导的。因此，在一个实施例中，重组基因构建体的核苷酸序列编码抑制CIITA表达，从而减少细胞中所有II类HLA的表达的药剂。

人类中对应于MHC II类的HLA包括三个基因家族，所述三个基因家族分别编码II类分子的α链和β链。DR基因家族由单个DRA基因和至多九个DRB基因(DRB1到DRB9)组成。DRA基因编码不变α链并且其与由DRB基因编码的各种β链结合。DP和DQ家族各自具有一个针对α和β链的表达基因和另外的未表达的假基因。DQA1和DQB1基因产物缔合以形成DQ分子，并且DPA1和DPB1产物形成DP分子。

如上所述，抑制性寡核苷酸分子是由重组基因构建体编码的用于减少一种或多种HLA-I或HLA-II分子的表达的合适药剂。示例性抑制性寡核苷酸分子包括但不限于小发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)和/或反义寡核苷酸。

siRNA是合成的双链RNA分子，长度为大约20-25个核苷酸，其中两个端部具有2-3个核苷酸的短3′突出部。双链siRNA分子表示靶mRNA分子的一部分的有义和反义链，在这种情况下，所述一部分是HLA-I和/或HLA-II mRNA、β2M mRNA(例如，SEQ ID No:18-21)和/或CIITA mRNA(SEQ ID NO:22-23)中的任何一种的一部分。各种HLA-I(HLA-A、HLA-B、HLA-C)mRNA和HLA-II(HLA-E、HLA-F、HLA-G)mRNA的序列在本领域中是容易知道的，并且本领域的技术人员可将所述序列用于设计siRNA和shRNA寡核苷酸。siRNA分子通常被设计成靶向在起始密码子下游距其大约50-100个核苷酸的mRNA靶标区。用于基于靶mRNA序列设计合适的siRNA序列的方法和在线工具在本领域中易于获得(参见例如Reynolds等人,“用于RNA干扰的合理siRNA设计(Rational siRNA Design for RNA Interference)”,《自然生物技术(Nat.Biotech.)》2:326-330(2004)；Chalk等人,“有效siRNA的改进和自动的预测(Improved and Automated Prediction of Effective siRNA)”,《生物化学与生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.)》319(1):264-274(2004)；Zhang等人,“种子区和3'区两者中的弱碱基配对减少RNAi脱靶并增强si/shRNA设计(Weak Base Pairing in BothSeed and 3'Regions Reduces RNAi Off-targets and Enhances si/shRNA Designs)”,《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》,42(19):12169-76(2014)，所述文献特此通过全文引用的方式并入)。在引入到细胞中后，siRNA复合物触发内源性RNA干扰(RNAi)途径，从而引起靶mRNA分子的切割和降解。已经描述了siRNA组合物的各种改进，如将经修饰的核苷或基序并入到siRNA分子的一条或两条链中以增强稳定性、特异性和功效，并且所述各种改进适用于根据本发明的此方面使用(参见例如Giese等人的WO2004/015107；McSwiggen等人的WO2003/070918；Imanishi等人的WO1998/39352；Jesper等人的美国专利申请公开第2002/0068708号；Kaneko等人的美国专利申请公开第2002/0147332号；Bhat等人的美国专利申请公开第2008/0119427号，所述文献特此通过全文引用的方式并入)。构建用于在哺乳动物细胞中表达siRNA的DNA载体的方法在本领域中是已知的，参见例如Sui等人,“用于抑制哺乳动物细胞中的基因表达的基于DNA载体的RNAi技术(A DNA Vector-Based RNAiTechnology to Suppress Gene Expression in Mammalian Cells)”,《美国国家科学院院刊(Proc.Nat'l Acad.Sci.USA)》99(8):5515-5520(2002)，所述文献特此通过引用的方式并入。

表7：人CIITA mRNA序列

短或小发夹RNA(shRNA)分子在功能上与siRNA分子相似，但包括形成紧密发夹弯的较长RNA序列。shRNA由细胞机器切割成siRNA，并且基因表达通过细胞RNA干扰途径沉默。用于基于靶mRNA序列(例如，β2M、CIITA和HLA-I其它和HLA-II mRNA序列)设计合适的shRNA序列的方法和工具在本领域中是容易获得的(参见例如Taxman等人,“用于有效设计、构造和基因敲低shRNA载体的标准(Criteria for Effective Design,Constructions,andGene Knockdown shRNA Vectors)”,《BMC生物技术(BMC Biotech)》6:7(2006)和Taxman等人,“短发夹RNA(shRNA)：基因敲低的设计、递送和评估(Short Hairpin RNA(shRNA):Design,Delivery,and Assessment of Gene Knockdown)”,《分子生物学方法(Meth.Mol.Biol.)》629:139-156(2010)，所述文献特此通过全文引用的方式并入)。本文描述了构建用于哺乳动物细胞中的shRNA表达和基因沉默的DNA载体的方法，并且所述方法是本领域已知的，参见例如Cheng和Chang,“构建用于哺乳动物细胞中的特异性基因沉默的简单高效的基于DNA载体的短发夹RNA表达系统(Construction of Simple and EfficientDNA Vector-based Short Hairpin RNA Expression Systems for Specific GeneSilencing in Mammalian Cells)”，《分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)》408:223-41(2007)，所述文献特此通过全文引用的方式并入。

可以由本文公开的重组构建体编码的用于抑制HLA-I或HLA-II分子的其它合适的药剂包括微RNA(miRNA)。miRNA是小型、调节性、非编码RNA分子，其主要通过与3'非翻译区(UTR)结合来控制其靶mRNA的表达。单个UTR可以具有用于许多miRNA的结合位点或用于单个miRNA的多个位点，这表明这些调节性RNA对基因表达有复杂的转录后控制(Shulka等人,“微RNA：加工、成熟、靶标识别和调节功能(MicroRNAs:Processing,Maturation,TargetRecognition and Regulatory Functions)”,《分子与细胞药理学(Mol.Cell.Pharmacol.)》3(3):83-92(2011)，所述文献特此通过全文引用的方式并入)。成熟的miRNA最初表达为称为初级miRNA(pri-miRNA)的初级转录物，所述初级转录物在细胞核中由微处理器复合物将加工成称为前miRNA的70个核苷酸的茎-环结构。前miRNA的dsRNA部分由Dicer结合和切割，以产生可以整合到RISC复合物中的成熟的22bp双链miRNA分子；因此，miRNA和siRNA在其初始加工的下游共享相同的细胞机器。

已知可抑制MHC I类分子表达的微RNA在本领域中是已知的并且适合并入到本文所述的重组基因构建体中。例如，已知miR-148a可调节HLA-C的表达(O'Huigin等人,“逃避HLA-C等位基因的miRNA调控的分子起源和后果(The Molecular Origin andConsequences of Escape from miRNA Regulation by HLA-C Alleles)”,《美国人类遗传学杂志(Am.J.Hum.Genet.)》89(3):424-431(2011)，所述文献特此通过全文引用的方式并入)；miR-148和miR-152下调HLA-G表达(Manaster等人,“HLA-G表达和功能的miRNA介导的控制(miRNA-mediated Control of HLA-G Expression and Function)”,《公共科学图书馆·综合(PLoS One)》7(3):e33395(2012)，所述文献特此通过全文引用的方式并入)；miR-9调节β2-微球蛋白、HLA-B和其它I类MHC分子的表达(Gao等人,“MiR-9调节人鼻咽癌细胞中干扰素调控基因和MHC I类分子的表达(MiR-9Modulates the Expression ofInterferon-Regulated Genes and MHC Class I Molecules in Human NasopharyngealCarcinoma Cells)”,《生物化学与生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)》4313:610-616(2013)，所述文献特此通过全文引用的方式并入)；miR-181a调节HLA-A的表达(Liu等人,“稳定的乙型肝炎病毒表达性细胞系中的微RNA的改变的表达谱(AlteredExpression Profiles of microRNAs in a Stable Hepatitis B Virus-ExpressingCell Line)”,《中华医学杂志(Chin.Med J.)》1221:10-14(2009)，所述文献特此通过全文引用的方式并入)。构建用于哺乳动物细胞中的miRNA表达和基因沉默的DNA载体的方法在本领域是已知的，参见例如Yang N.,“微RNA的病毒和非病毒递送系统的概述(An Overviewof Viral and Non-Viral Delivery Systems for microRNA)”,《国际药物研究杂志(Int.J.Pharm.Investig.)》5(4):179-181(2015)。

可以由本文公开的重组构建体编码的用于抑制HLA-I或HLA-II分子的其它合适的药剂包括反义核苷酸。使用反义方法来抑制基因的体内翻译和随后的蛋白质表达是本领域众所周知的(例如，授予Dobie等人的美国专利第7,425,544号；授予Karras等人的美国专利第7,307,069号；授予Bennett等人的美国专利第7,288,530号；授予Cowsert等人的美国专利第7,179,796号，所述美国专利特此通过全文引用的方式并入)。反义核酸是核酸分子(例如，含有DNA核苷酸、RNA核苷酸或修饰(例如，增加分子稳定性的修饰，如2'-O-烷基(例如，甲基)取代的核苷酸)或其组合的分子)，所述核酸分子与如mRNA分子等特定核酸分子的至少一部分互补或杂交(参见例如Weintraub,H.M.,“反义DNA和RNA(Antisense DNA andRNA)”,《科学美国人(Scientific Am.)》262:40-46(1990)，所述文献特此通过全文引用的方式并入)。反义核酸分子与其对应的靶核酸分子，如HLA-I或HLA-II mRNA、β2M mRNA或CIITA mRNA中的任何一种杂交，以形成双链分子，所述双链分子干扰mRNA的翻译，因为细胞不会翻译双链mRNA。本发明方法中使用的反义核酸的长度通常为至少10-15个核苷酸，例如至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或大于75个核苷酸。反义核酸也可以与其旨在与之形成抑制性双链体的靶核酸一样长。

在一些实施例中，对减少一种或多种HLA-I或HLA-II分子的表达的一种或多种药剂进行编码的核苷酸序列编码多个(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个)RNA分子。

在一些实施例中，由本文所公开的重组基因构建体编码的抑制一种或多种HLA-I和/或HLA-II分子的一种或多种药剂包括CRISPR/Cas9系统或锌指核酸酶。

CRISPR/CRISPR相关(Cas)系统使用单向导RNA以序列特异性方式靶向和切割DNA元件。CRISPR/Cas系统在本领域是众所周知的并且包括例如来自化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的II型CRISPR系统(Qi等人,“重新利用CRISPR作为RNA引导平台进行基因表达的序列特异性控制(Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platformfor Sequence-Specific Control of Gene Expression)”,《细胞(Cell)》152(5):1173-1183(2013)，所述文献特此通过全文引用的方式并入)。化脓性链球菌II型CRISPR系统包括编码Cas9蛋白的单个基因和两个RNA，所述两个RNA即成熟的CRISPR RNA(crRNA)和部分互补的反式作用RNA(tracrRNA)。crRNA的成熟需要tracrRNA和RNase II。然而，此要求可以通过使用含有模拟tracrRNA-crRNA复合物的经设计发夹的经工程化的小向导RNA(sgRNA)而绕过。由于Cas9的核酸内切酶活性，sgRNA与靶DNA之间的碱基配对会引起双链断裂(DSB)。结合特异性由sgRNA-DNA碱基配对和与DNA互补区并置的短DNA基序(前间区序列邻近基序(PAM)序列：NGG)两者来确定。

在一些实施例中，由重组基因构建体编码的CRISPR/Cas 9系统包括Cas9蛋白和sgRNA。

Cas9蛋白可以包括野生型Cas9蛋白或核酸酶缺陷型Cas9蛋白。野生型Cas9与sgRNA结合形成蛋白质-RNA复合物，所述蛋白质-RNA复合物介导cas9核酸酶对靶DNA的切割。核酸酶缺陷型Cas9与sgRNA结合形成蛋白质-RNA复合物，所述蛋白质-RNA复合物介导核酸酶缺陷型Cas9对靶DNA的转录调控(Qi等人,“重新利用CRISPR作为RNA引导平台进行基因表达的序列特异性控制(Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform forSequence-Specific Control of Gene Expression)”,《细胞》152(5):1173-1183(2013)；Maeder等人,“CRISPR RNA引导的内源性人类基因激活(CRISPR RNA-Guided Activationof Endogenous Human Genes)”,《自然方法(Nat.Methods)》10(10):977-999(2013)；和Gilbert等人,“真核生物中CRISPR介导的模块化RNA引导的转录调控(CRISPR-MediatedModular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes)”,《细胞》154(2):442-451(2013)，所述文献特此通过全文引用的方式并入)。

sgRNA包括与特定DNA序列互补的区(例如，HLA-I或HLA-II基因的区)、用于Cas9结合的发夹和/或转录终止子(Qi等人,“重新利用CRISPR作为RNA引导平台进行基因表达的序列特异性控制(Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression)”,《细胞》152(5):1173-1183(2013)，所述文献特此通过全文引用的方式并入)。设计用于靶向特定基因序列的sgRNA的方法在本领域是众所周知的并且在例如WO2015/089364、WO2014/191521和WO2015/065964中进行了更详细地描述，所述文献特此通过全文引用的方式并入)。

在一些实施例中，由本文所公开的重组基因构建体编码的用于抑制HLA-I或HLA-II分子的一种或多种药剂是锌指核酸酶。锌指核酸酶(ZFN)是包括三个(或更多个)锌指结构域的合成酶，所述三个(或更多个)锌指结构域连接在一起以产生结合DNA的≥9bp的人工DNA结合性蛋白。为了切割DNA，锌指结构域与FokI核酸酶结构域的一半融合，使得当两个ZFN结合由合适的间隔子分离的两个独特的9bp位点时，所述ZFN可以在间隔子内切割以形成DSB。设计用于识别期望靶标的锌指核酸酶的方法在本领域是众所周知的并且在以下中进行了更详细地描述：例如，授予Cox III的美国专利第7,163,824号；Kim等人的美国专利申请公开第2017/0327795号；以及Harrison等人,“基因编辑初学者指南(A Beginner'sGuide to Gene Editing)”,《实验生理学(Exp.Physiol.)》103(4):439-448(2018)，所述文献特此通过全文引用的方式并入。

在一些实施例中，减少一种或多种内源性HLA-I和/或HLA-II分子的表达的一种或多种药剂减少所有HLA-I和/或HLA-II分子的表达。在一些实施例中，所述一种或多种药剂能够使在细胞表面的一种或多种HLA-I和/或HLA-II分子的表达相对于野生型表达水平减少5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％或100％。

本文所述的重组基因构建体进一步包括在本文中也被称为“同源臂”的第一和第二“基因序列”。以细胞类型特异性方式表达的这些基因序列通过例如同源重组将重组构建体直接插入到细胞群中的所关注基因(即靶基因)中。因此，重组基因构建体包括：以细胞类型特异性方式表达的第一基因序列，所述第一基因序列位于一个或多个编码免疫检查点蛋白的核苷酸序列和/或对用于减少HLA-I和/或HLA-II分子表达的药剂进行编码的一个或多个核苷酸序列的5'处；以及以与第一基因序列相同的细胞类型特异性方式表达的第二基因序列。第二基因序列位于一个或多个编码免疫检查点蛋白的核苷酸序列和/或对用于减少HLA-I和/或HLA-II分子表达的药剂进行编码的一个或多个核苷酸序列的3'处。

本文所述的重组基因构建体的第一基因序列和第二基因序列是与靶基因(即重组基因构建体将被插入的基因)的特定区的核苷酸序列相同或密切同源(即共享显著的序列同一性)的核苷酸序列。优选地，重组构建体的第一基因序列和第二基因序列与紧接插入切割位点的上游和下游的靶基因序列相同或相似(例如，与靶基因的有义链相同)。

在一些实施例中，位于重组构建体的5'端处的第一基因序列(即5'同源臂)与靶基因(例如，有义链)的对应序列之间的同一性百分比为至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％。在一些实施例中，位于重组构建体的3'端处的第二基因序列(即3'同源臂)与靶基因(例如，有义链)的对应序列之间的同一性百分比为至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％。

在一些实施例中，第一基因序列和第二基因序列(例如，5'同源臂和3'同源臂)的长度超过约30个核苷酸残基，例如超过约50个核苷酸残基、超过约100个核苷酸残基、超过约200个核苷酸残基、超过约300个核苷酸残基、超过约500个核苷酸残基、超过约800个核苷酸残基、超过约1,000个核苷酸残基、超过约1,500个核苷酸残基、超过约2,000个核苷酸残基和超过约5,000个核苷酸残基中的任何一个。

本文所公开的重组基因构建体可以是环状的或线性的。当重组基因构建体为线性时，第一基因序列和第二基因序列(例如，5'同源臂和3'同源臂)分别靠近线性核酸的5'端和3'端，即距线性核酸的5'端和3'端约200bp。在一些实施例中，第一基因序列(例如，5'同源臂)距线性DNA的5'端约为1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180或200个核苷酸残基中的任何一个。在一些实施例中，第二基因序列(例如，3'同源臂)距线性DNA的3'端约为1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180或200个核苷酸残基中的任何一个。

重组基因构建体的第一基因序列和第二基因序列被设计成模拟“靶基因”的序列，以便于将构建体插入到靶基因中。根据本公开的各个方面，“靶基因”是以细胞类型特异性方式表达的基因。在一些实施例中，“靶基因”是在终末分化细胞中选择性和/或限制性表达的基因。“终末分化细胞”是指已经获得并定型于特殊功能的特化细胞，并且已经不可逆转地失去了分裂和增殖的能力。

在一些实施例中，靶基因是在中枢神经系统的终末分化细胞中表达的基因。示例性终末分化的脑细胞包括但不限于少突胶质细胞、星形胶质细胞和神经元，所述神经元包括胆碱能神经元、中等棘神经元和中间神经元以及多巴胺能神经元。表8中鉴定了示例性终末分化的脑细胞和在这些细胞中选择性表达的基因靶标，并且所述终末分化的脑细胞和所述基因靶标在下文中进行更详细地讨论。

表8：示例性CNS细胞和在其中选择性表达的基因靶标

在一些实施例中，靶基因是在少突胶质细胞中限制性表达的基因。少突胶质细胞是脊椎动物中枢神经系统(CNS)的终末分化的髓磷脂化细胞，所述终末分化的髓磷脂化细胞负责包裹接受性神经元轴突，这对于神经冲动的快速传播至关重要。少突胶质细胞祖细胞(OPC)分化为少突胶质细胞以及其随后的轴突髓磷脂化是高度调节性过程。在少突胶质细胞中选择性或限制性表达的基因包括但不限于转录调节因子SRY-盒10(SOX10)(Stolt等人,“形成髓磷脂的少突胶质细胞的终末分化取决于转录因子Sox10(TerminalDifferentiation of Myelin-Forming Oligodendrocytes Depends on theTranscription Factor Sox10)”,《基因与发育(Genes and Dev.)》16:165-170(2002)，所述文献特此通过全文引用的方式并入)；膜相关转录因子、髓磷脂调节因子(MYRF)(Bujalka等人,“MYRF是可通过自身蛋白水解切割以直接激活髓磷脂基因的膜相关转录因子(MYRFis a Membrane-Associated Transcription Factor that AutoproteolyticallyCleaves to Directly Activate Myelin Genes)”,《公共科学图书馆生物学(PLoSBiol.)》11(8):e1001625(2013)，所述文献特此通过全文引用的方式并入)；髓磷脂相关糖蛋白(MAG)；和髓磷脂碱性蛋白(MBP)。

在一个实施例中，本文所述的重组基因构建体被设计成用于插入到SOX10、MYRF、MAG或MBP基因中的任一个基因，使得重组构建体的表达与少突胶质细胞中的基因的表达偶联。根据此实施例，第一基因序列和第二基因序列源自SOX10、MYRF、MAG或MBP基因。

在一个实施例中，重组基因构建体被设计成在上述基因中的任何一个基因的3'非翻译区处或其周围插入，其中重组基因构建体的第一基因序列和第二基因序列分别与所选基因的处于所选插入位点的5'和3'处的区同源。插入位点的具体位置可以变化，并且因此重组构建体的第一基因序列和第二基因序列的特定序列也将变化。然而，使用在本领域中例如通过NCBI基因数据库和基因ID号而容易获得的这些基因中的每一个基因的已知序列和结构对这些参数的选择完全在本领域技术人员的水平之内。

在另一个实施例中，靶基因是在星形胶质细胞中限制性表达的基因。星形胶质细胞是CNS内最丰富的终末分化细胞类型，并执行从轴突引导和突触支持到控制血脑屏障和血流等各种任务。

终末分化的星形胶质细胞可以通过各种细胞表面标志物的存在来鉴定，所述细胞表面标志物包括例如胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和水通道蛋白-4(AQP4)。因此，重组构建体可以插入的在星形胶质细胞中选择性表达的基因包括但不限于GFAP和AQP4。根据此实施例，第一基因序列和第二基因序列源自GFAP和AQP4。

在一个实施例中，将本文所述的重组基因构建体插入到GFAP或AQP4中，使得重组构建体的表达与GFAP或AQP4的表达偶联。在一个实施例中，将重组基因构建体在GFAP或AQP4的3'非翻译区处或其周围插入，其中重组基因构建体的第一基因序列和第二基因序列分别与GFAP或AQP4的处于所选插入位点的5'和3'处的区同源。插入位点的具体位置可以变化，并且因此重组构建体的第一细胞特异性基因序列和第二细胞特异性基因序列的特定序列也将变化。然而，使用本领域中容易获得的这些基因中的每一个基因的已知序列和结构对这些参数的选择完全在本领域技术人员的水平之内。

在另一个实施例中，靶基因是在神经元中限制性表达的基因。神经元是中枢和外周神经系统中的起到处理和传输信息功能的电可兴奋细胞。终末分化神经元可以通过各种细胞表面标志物的存在来鉴定，所述细胞表面标志物包括例如突触素1(SYN1)、微管相关蛋白2(MAP2)和ELAV样RNA结合蛋白4(ELAV4)。因此，在一个实施例中，将本文所述的重组基因构建体插入到SYN1、MAP2或ELAV4中的任何一个中，使得重组构建体的表达与神经元中SYN1、MAP2或ELAV4基因中的任何一个基因的表达偶联。根据此实施例，第一基因序列和第二基因序列来自SYN1、MAP2或ELAV4基因。

在期望将重组基因构建体的表达限制到特定类型的神经元，例如多巴胺能神经元的实施例中，将重组基因构建体插入在期望的神经元群中限制性表达的基因中。因此，在一个实施例中，本文所述的重组基因构建体被设计成用于插入到酪氨酸羟化酶基因(TH)或多巴脱羧酶基因(DDC)，所述酪氨酸羟化酶基因或所述多巴脱羧酶基因是在多巴胺能神经元中选择性表达的基因。在另一个实施例中，所述重组基因构建体被设计成用于插入到编码谷氨酸脱羧酶2的基因(GAD2，也称为GAD65)或编码谷氨酸脱羧酶1的基因(GAD1，也称为GAD67)中，所述基因是在中等棘神经元和皮质中间神经元中选择性表达的基因。在另一个实施例中，本文所述的重组基因构建体插入在胆碱能神经元中选择性表达的胆碱O-乙酰转移酶基因(CHAT)中。

在一个实施例中，将重组基因构建体在上述神经元特异性基因(即SYN1、MAP2、ELAV4、TH、DDC、GAD65、GAD67或CHAT)中的任何一个神经元特异性基因的3'非翻译区处或其周围插入，其中重组基因构建体的第一基因序列和第二基因序列分别与处于所选插入位点的5'和3'处的区同源。插入位点的具体位置可以变化，并且因此重组构建体的第一基因序列和第二基因序列的具体序列也将变化。然而，使用本领域中容易获得的这些基因中的每一个基因的已知序列和结构对这些参数的选择完全在本领域技术人员的水平之内。

在另一个实施例中，靶基因是在中枢神经系统(CNS)外的终末分化细胞中表达的基因。示例性终末分化的非CNS细胞包括但不限于脂肪细胞、软骨细胞、内皮细胞、上皮细胞(角质化细胞、黑素细胞)、骨细胞(成骨细胞、破骨细胞)、肝脏细胞(胆管细胞、肝细胞)、肌肉细胞(心肌细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞)、视网膜细胞(神经节细胞、缪勒氏细胞(muller cell)、感光细胞)、视网膜色素上皮细胞、肾细胞(足细胞(podocyte)、近端小管细胞、集合管细胞、远端小管细胞)、肾上腺细胞(皮质肾上腺细胞、髓质肾上腺细胞)、胰腺细胞(α细胞、β细胞、δ细胞、ε细胞、胰腺多肽产生性细胞、外分泌细胞)；肺细胞、骨髓细胞(早期B细胞发育、早期T细胞发育、巨噬细胞、单核细胞)、尿路上皮细胞、成纤维细胞、甲状旁腺细胞、甲状腺细胞、下丘脑细胞、垂体细胞、唾液腺细胞、卵巢细胞和睾丸细胞。下表9中鉴定了示例性终末分化的非CNS细胞和在这些细胞中选择性表达的基因靶标。

表9：示例性非CNS细胞和在其中选择性表达的基因靶标

在一个实施例中，本文所述的重组基因构建体被设计成用于插入到表9中提供的基因中的任一个基因中，使得重组构建体的表达与在期望细胞中的特定基因的表达偶联。在一个实施例中，重组基因构建体在上述基因中的任何一个基因的3'非翻译区处或其周围插入，其中重组基因构建体的第一基因序列和第二基因序列分别与所选基因的处于所选插入位点的5'和3'处的区同源。插入位点的具体位置可以变化，并且因此重组构建体的第一细胞特异性基因序列和第二细胞特异性基因序列的特定序列也将变化。然而，使用在本领域中例如通过NCBI基因数据库和所提供的基因ID号而容易获得的这些基因中的每一个基因的已知序列和结构对这些参数的选择完全在本领域技术人员的水平之内。

在一些实施例中，重组基因构建体进一步包括一个或多个编码自切割肽的核苷酸序列，其中编码自切割肽的核苷酸序列以有效地介导一种或多种免疫检查点蛋白在体内翻译的方式位于构建体内。“自切割肽”是18-22个氨基酸长的病毒寡肽序列，所述序列在真核细胞中的翻译期间介导核糖体跳跃(Liu等人,“用于在多顺反子载体中克隆多基因的2A肽的系统性比较(Systemic Comparison of 2A peptides for Cloning Multi-Genes in aPolycistronic Vector)”,《科学报告(Scientific Reports)》7:文章编号2193(2017)，所述文献特此通过全文引用的方式并入)。此类自切割肽的非限制性实例是肽2A，它是在细小核糖核酸病毒中首次发现的短蛋白质序列。肽2A通过使核糖体跳过在2A元件的C端处合成肽键，从而在2A序列的末端与其下游的肽之间产生间隔来起作用。这种“切割”发生在C端处的甘氨酸残基与脯氨酸残基之间。因此，成功的核糖体跳跃和重新开始翻译会产生单独的“切割”蛋白质，其中除了C端脯氨酸之外，2A元件上游的蛋白质与完整的2A肽连接，并且2A元件下游的蛋白质与N端处的一个脯氨酸连接(Liu等人,“用于在多顺反子载体中克隆多基因的2A肽的系统性比较(Systemic Comparison of 2A peptides for Cloning Multi-Genes in a Polycistronic Vector)”,《科学报告》7:文章编号2193(2017)，所述文献特此通过全文引用的方式并入)。

可以并入重组基因构建体中的示例性自切割肽包括但不限于猪捷申病毒-1 2A(P2A)、口蹄疫病毒2A(F2A)、明脉扁刺蛾(thosea asigna)病毒2A(T2A)、马甲型鼻炎病毒2A(E2A)、质型多角体病毒(BmCPV 2A)和软化病病毒(BmIFV 2A)。适合包括在本文所述的重组基因构建体中的编码这些自切割肽的核苷酸序列在下表10中提供。

表10：合适的编码自切割肽的核苷酸序列

*参见Wang等人,“家蚕中基于2A自切割肽的多基因表达系统(2A Self-CleavingPeptide-Based Multi-Gene Expression System in the Silkworm Bombyx mori)”,《科学报告(Sci.Rep.)》5:16273(2015)和Schmitt等人的美国专利申请公开第2018/0369280号，所述文献特此通过全文引用的方式并入。

在一些实施例中，重组基因构建体进一步包括可诱导细胞死亡基因，所述可诱导细胞死亡基因以有效地实现可诱导细胞自杀的方式位于构建体内。可诱导细胞死亡基因是指基因编码的元件，所述基因编码的元件允许在面对不可接受的毒性时通过施用激活性药剂来选择性地破坏表达细胞。

一些可诱导细胞死亡基因在本领域中是众所周知的并且适合包括在本文所述的重组基因构建体中(参见Stavrou等人,“基于雷帕霉素激活的胱天蛋白酶9的自杀基因(ARapamycin-Activated Caspase 9-Based Suicide Gene)”,《分子疗法(Mol.Ther.)》26(5):1266-1276(2018)，所述文献特此通过全文引用的方式并入)。示例性自杀基因包括但不限于：RQR8和huEGFRt，它们是由治疗性单克隆抗体(mAb)识别的表面蛋白；单纯性疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)，其是由小分子更昔洛韦(ganciclovir)激活的可诱导细胞死亡基因；可诱导胱天蛋白酶9(iCasp9)，其是突变的FKBP12与胱天蛋白酶9的催化结构域的融合体，所述融合体允许二聚化的小分子化学诱导剂(CID，AP1903/AP20187)的对接；雷帕霉素激活的胱天蛋白酶9(rapaCasp9)，其是由雷帕霉素激活的可诱导细胞死亡基因(Stavrou等人,“基于雷帕霉素激活的胱天蛋白酶9的自杀基因(A Rapamycin-Activated Caspase 9-Based Suicide Gene)”,《分子疗法》26(5):1266-1276(2018)，所述文献特此通过全文引用的方式并入)；和可诱导胱天蛋白酶-3(iCasp3)，其是突变的FK506结合结构域与胱天蛋白酶-3的融合体，所述融合体允许CID(AP20187)的对接(Ono等人,“暴露于体内隔离的自身抗原不足以诱导自身免疫性糖尿病(Exposure to Sequestered Self-Antigens in vivo isnot Sufficient for the Induction of Autoimmune Diabetes)”,《公共科学图书馆·综合》12(3):e0173176(2017)和MacCorkle等人,“胱天蛋白酶的合成激活：人工死亡开关(Synthetic Activation of Caspases:Artificial Death Switches)”,《美国国家科学院院刊(PNAS)》95(7):3655-3660(1998)，所述文献特此通过全文引用的方式并入)。在另一个实施例中，重组基因构建体含有与如细胞分裂基因(CDK1)等细胞分裂基因的表达相关的可诱导细胞死亡基因(Liang等人,“将细胞分裂基因和自杀基因连接以定义和提高细胞疗法安全性(Linking a Cell-Division Gene and a Suicide Gene to Define and ImproveCell Therapy Safety)”,《自然(Nature)》563:701-704(2018)，所述文献特此通过全文引用的方式并入)。

在一些实施例中，重组基因构建体进一步包括选择标志物。哺乳动物细胞的合适选择标志物是本领域已知的并且包括例如胸苷激酶、二氢叶酸还原酶(与甲氨蝶呤一起作为DHFR扩增剂)、氨基糖苷磷酸转移酶、潮霉素B磷酸转移酶、天冬酰胺合成酶、腺苷脱氨酶、金属硫蛋白和抗生素抗性基因，例如嘌呤霉素抗性基因或新霉素抗性基因。可以用作本文所述的重组基因构建体中的选择标志物的示例性抗生素抗性基因序列在下表11中提供。

表11：合适的选择标志物基因序列

当重组基因构建体包括哺乳动物选择标志物时，所述选择标志物可以与组成型哺乳动物启动子操作性地连接。

适合包括在本文所述的重组构建体中的示例性组成型哺乳动物启动子在本领域是众所周知的并且在下表12中示出(Qin等人,“组成型启动子和多西环素可诱导启动子的系统性比较(Systematic Comparison of Constitutive Promoters and theDoxycycline-Inducible Promoter)”,《公共科学图书馆·综合》5(5):e10611(2010)，所述文献特此通过全文引用的方式并入)。

表12：合适的启动子序列

*参见Qin等人,“组成型启动子和多西环素可诱导启动子的系统性比较(Systematic Comparison of Constitutive Promoters and the Doxycycline-Inducible Promoter)”,《公共科学图书馆·综合》5(5):e10611(2010)，所述文献特此通过全文引用的方式并入。

在一些实施例中，重组基因构建体进一步编码至少一个标志物结构域。标志物结构域的非限制性实例包括荧光蛋白、纯化标签和表位标签。

在一些方面，标志物结构域可以是荧光蛋白。合适的荧光蛋白的非限制性实例包括绿色荧光蛋白(例如，GFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、EGFP、祖母绿(Emerald)、Azami绿(Azami Green)、单体Azami绿、CopGFP、AceGFP、ZsGreenl)、黄色荧光蛋白(例如，YFP、EYFP、柠檬黄(Citrine)、Venus、YPet、PhiYFP、ZsYellowl)、蓝色荧光蛋白(例如，EBFP、EBFP2、石青(Azurite)、mKalamal、GFPuv、天蓝色(Sapphire)、T-天蓝色)、青色荧光蛋白(例如，ECFP、蔚蓝色(Cerulean)、CyPet、AmCyanl、Midoriishi-青色(Midoriishi-Cyan))、红色荧光蛋白(mKate、mKate2、mPlum、DsRed单体、mCherry、mRFP1、DsRed-表达(DsRed-Express)、DsRed2、DsRed-单体、HcRed-Tandem、HcRedl、AsRed2、mRasberry、mStrawberry、Jred)和橙色荧光蛋白(例如，mOrange、mKO、Kusabira-橙色(Kusabira-Orange)、单体Kusabira-橙色、mTangerine、tdTomato)或任何其它合适的荧光蛋白。

在其它方面，标志物结构域可以是纯化标签和/或表位标签。示例性标签包括但不限于谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、几丁质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白、硫氧还蛋白(TRX)、聚(NANP)、串联亲和纯化(TAP)标签、myc、AcV5、AU1、AU5、E、ECS、E2、FLAG、HA、nus、Softag 1、Softag 3、Strep、SBP、Glu-Glu、HSV、KT3、S、S1、T7、V5、VSV-G、6xHis、生物素羧基载体蛋白(BCCP)和钙调蛋白。

所述标志物结构域可以与组成型哺乳动物启动子操作性地偶联。例如，在一些实施例中，所述组成型哺乳动物启动子是EF1a，并且所述标志物结构域与EF1a操作性地偶联。根据此实施例，所述标志物结构域可以是CopGFP。编码合适的标志物结构域序列的示例性核苷酸序列在下表13中示出。

表13：合适的标志物结构域序列

在一些实施例中，将本公开的重组基因构建体并入到递送载体中。合适的递送载体包括但不限于质粒载体、病毒载体，包括但不限于牛痘载体、慢病毒载体(整合能力强或整合缺陷型慢病毒载体)、腺病毒载体、腺相关病毒载体、用于杆状病毒表达的载体、基于转座子的载体或适用于通过任何手段将本文所述的重组基因构建体引入到细胞中以促进重组构建体的基因/细胞选择性表达的任何其它载体。

本公开的另一方面涉及一种由包括本文所述的重组基因构建体的一个或多个细胞构成的制剂。所述制剂可以是来自任何生物体的细胞制剂。在一些实施例中，所述制剂是哺乳动物细胞制剂，例如啮齿动物细胞(即小鼠或大鼠细胞)、兔细胞、豚鼠细胞、猫细胞、犬细胞、猪细胞、马细胞、牛细胞、绵羊细胞、猴细胞或人类细胞的制剂。在一个实施例中，所述制剂是人类细胞制剂。包括如本文所述的重组基因构建体的合适细胞包括处于其谱系的任何阶段的原代或永生化胚胎细胞、胎儿细胞或成体细胞，例如全能细胞、多能(pluripotent/multipotent)细胞或分化细胞。

在一些实施例中，所述制剂是多能干细胞制剂。多能干细胞可以产生三个胚层(即内胚层、中胚层和外胚层)的任何细胞。在一个实施例中，包括重组基因构建体的细胞制剂是诱导性多能干细胞(iPSC)制剂。在另一个实施例中，包括重组基因构建体的细胞制剂是多能胚胎干细胞制剂。

在另一个实施例中，由一个或多个细胞构成的制剂可以是多能干细胞制剂。多能干细胞可以发育成特定谱系中数量有限的细胞。多能干细胞的实例包括祖细胞，例如神经祖细胞，所述神经祖细胞产生中枢神经系统的细胞，如神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。祖细胞是未成熟或未分化的细胞群，所述细胞群具有成熟和分化成更特化的分化细胞类型的潜力。祖细胞也可以增殖以产生更多类似地未成熟或未分化的祖细胞。包括重组基因构建体的祖细胞的合适制剂包括但不限于神经祖细胞、神经元祖细胞、神经胶质祖细胞、少突胶质细胞偏向性祖细胞和星形胶质细胞偏向性祖细胞的制剂。其它合适的祖细胞群包括但不限于骨髓祖细胞、心脏祖细胞、内皮祖细胞、上皮祖细胞、造血祖细胞、肝祖细胞、骨祖细胞、肌肉祖细胞、胰腺祖细胞、肺祖细胞、肾祖细胞、血管祖细胞、视网膜祖细胞。

包括本文所述的重组基因构建体的细胞制剂也可以是终末分化细胞制剂。在一个实施例中，由一个或多个细胞构成的制剂可以是终末分化的神经元、少突胶质细胞或星形胶质细胞的制剂。在另一个实施例中，由包括重组基因构建体的一个或多个细胞构成的制剂是以下的制剂：脂肪细胞、软骨细胞、内皮细胞、上皮细胞(角质化细胞、黑素细胞)、骨细胞(成骨细胞、破骨细胞)、肝脏细胞(胆管细胞、肝细胞)、肌肉细胞(心肌细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞)、视网膜细胞(神经节细胞、缪勒氏细胞、感光细胞)、视网膜色素上皮细胞、肾细胞(足细胞、近端小管细胞、集合管细胞、远端小管细胞)、肾上腺细胞(皮质肾上腺细胞、髓质肾上腺细胞)、胰腺细胞(α细胞、β细胞、δ细胞、ε细胞、胰腺多肽产生性细胞、外分泌细胞)；肺细胞、骨髓细胞(早期B细胞发育、早期T细胞发育、巨噬细胞、单核细胞)、尿路上皮细胞、成纤维细胞、甲状旁腺细胞、甲状腺细胞、下丘脑细胞、垂体细胞、唾液腺细胞、卵巢细胞和睾丸细胞。

可以包括本文所述的重组基因构建体的另外的示例性细胞类型包括但不限于胎盘细胞、角质化细胞、基底表皮细胞、泌尿上皮细胞、唾液腺细胞、粘液细胞、浆液细胞、冯·埃布纳腺(von Ebner's gland)细胞、乳腺细胞、泪腺细胞、外分泌汗腺细胞、大汗腺细胞、MpH腺细胞、皮脂腺细胞、鲍曼氏腺(Bowman's gland)细胞、布伦纳氏腺(Brunner's gland)细胞、精囊细胞、前列腺细胞、尿道球腺细胞、巴多林氏腺(Bartholin's gland)细胞、利特雷腺(Littre gland)细胞、子宫内膜细胞、呼吸道或消化道的杯状细胞、胃的粘液细胞、胃腺的酶原细胞、胃腺的泌酸细胞、产生胰岛素的P细胞、产生胰高血糖素的α细胞、产生生长抑素的δ细胞、胰腺多肽产生性细胞、胰腺导管细胞、小肠潘氏细胞(Paneth cell)、肺II型肺细胞、肺克拉拉细胞(Clara cell)、垂体前叶细胞、垂体中叶细胞、垂体后叶细胞、肠道或呼吸道的激素分泌细胞、性腺细胞、肾的近肾小球细胞、肾致密斑细胞、肾极周细胞、肾系膜细胞、肠刷状缘细胞、外分泌腺横纹导管细胞、胆囊上皮细胞、肾近端小管刷状缘细胞、肾远端小管细胞、输出小管的调和细胞(conciliated cells of the ductulus efferens)、附睾主细胞、附睾基底细胞、肝细胞、脂肪细胞、I型肺细胞、胰管细胞、汗腺非横纹管细胞、唾液腺非横纹管细胞、乳腺非横纹管细胞、肾小球壁细胞、肾小球足细胞、亨利袢(loop ofHenle)薄段细胞、集合管细胞、精囊导管细胞、前列腺导管细胞、血管内皮细胞、滑膜细胞、浆膜细胞、内衬于耳朵外淋巴隙的鳞状细胞、内衬于耳朵内淋巴隙的细胞、脉络丛细胞、软膜蛛网膜的鳞状细胞、眼睛睫状体上皮细胞眼、角膜内皮细胞、具有推进功能的纤毛细胞、成釉细胞、耳前庭器官的半月面细胞、柯蒂氏器官(organ of Corti)的齿间细胞、成纤维细胞、毛细血管周细胞、椎间盘髓核细胞、成牙骨质细胞、牙骨质细胞、成牙本质细胞、成细胞(odontocyte)、软骨细胞、骨细胞、骨祖细胞、眼睛玻璃体的透明细胞、耳外淋巴隙的星状细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、肌上皮细胞、血小板、巨核细胞、单核细胞、结缔组织巨噬细胞、朗格汉斯细胞(Langerhan's cell)、破骨细胞、树突细胞、小胶质细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、浆细胞、辅助性T细胞、抑制性T细胞、杀伤性T细胞、杀伤细胞、视杆细胞、视锥细胞、柯蒂氏器官的内毛细胞、柯蒂氏器官的外毛细胞、I型毛细胞、耳前庭器官细胞、II型耳前庭器官细胞、II型味蕾细胞、嗅觉神经元、嗅上皮基底细胞、I型颈动脉体细胞、II型颈动脉体细胞、默克尔细胞(Merkel cell)、初级感觉神经元、自主神经系统的胆碱能神经元、自主神经系统的肾上腺素能神经元、自主神经系统的肽能神经元、柯蒂氏器官的内柱细胞、柯蒂氏器官的外柱细胞、柯蒂氏器官的内指状细胞、柯蒂氏器官的外指状细胞、边缘细胞、汉森细胞(Hensen cell)、前庭器官的支持细胞、味蕾的支持细胞、嗅觉上皮的支持细胞、雪旺细胞(Schwann cell)、卫星细胞、肠神经胶质细胞、中枢神经系统的神经元、中枢神经系统的星形胶质细胞、中枢神经系统的少突胶质细胞、晶状体前上皮细胞、晶状体纤维细胞、黑素细胞、视网膜色素上皮细胞、虹膜色素上皮细胞、卵原细胞、卵母细胞、精母细胞、精原细胞、卵巢细胞、塞尔托利细胞(Sertoli cell)和胸腺上皮细胞。

根据本公开的此方面，重组基因构建体被整合到制剂中的一个或多个细胞的染色体中。当在本公开的重组基因构建体的上下文中使用时，术语“整合”是指重组基因构建体被插入到制剂中的一个或多个细胞的基因组或基因组序列中。当被整合时，整合的重组基因构建体被复制并以与细胞的原始基因组相同的方式传递给分裂细胞的子细胞。

根据重组基因构建体的设计，构建体的基因组整合靶向期望的所关注基因，以实现一个或多个编码免疫检查点蛋白的核苷酸序列和/或对减少一种或多种HLA-I和/或HLA-II分子的表达的一种或多种药剂进行编码的核苷酸序列的细胞选择性表达。在一些实施例中，所关注基因是在终末分化细胞中限制性表达的基因。在一些实施例中，重组基因构建体被整合到在少突胶质细胞中选择性表达的基因，如SOX10、MYRF、MAG或MBP。在一些实施例中，重组基因构建体被整合到在星形胶质细胞中选择性表达的基因，如GFAP或AQP4。在一些实施例中，重组基因构建体被整合到在神经元中选择性表达的基因，如SYN1、MAP2和ELAV4；在多巴胺能神经元中选择性表达的基因，如TH或DDC；在中等棘神经元和中间神经元中选择性表达的基因，如GAD65或GAD67；或在胆碱能神经元中选择性表达的基因，如CHAT。根据这些实施例，一个或多个编码免疫检查点蛋白的核苷酸序列和/或对减少一种或多种HLA-I和HLA-II分子的表达的一种或多种药剂进行编码的核苷酸序列在终末分化细胞中条件性地表达(即转录和/或翻译)。在终末分化细胞的制剂中表达本文所述的重组基因构建体使这些细胞在体内环境中不易受到免疫细胞的攻击。因此，在将包括重组基因构建体的细胞移植到宿主受试者体内时，如下面更详细描述的，由于所述细胞表达了一种或多种免疫检查点蛋白和/或表达了抑制一种或多种HLA-I/HLA-II蛋白的一种或多种药剂，因此所述细胞在其分化状态下受到保护以免受宿主免疫系统的攻击。

本公开的另一个方面涉及一种将包括本文所述的重组基因构建体的细胞制剂施用于有需要的受试者的方法。

如本文所使用的，适合施用包括本文所述的重组基因构建体的细胞制剂的“受试者”或“患者”涵盖任何动物，优选地哺乳动物。合适的受试者包括但不限于家养动物和非家养动物，如啮齿动物(小鼠或大鼠)、猫、狗、兔子、马、绵羊、猪和猴。在一个实施例中，受试者是人类受试者。合适的人类受试者包括但不限于婴儿、儿童、成人和老年受试者。

在一个实施例中，受试者需要终末分化细胞类型。例如，受试者患有由分化细胞群的损失或功能障碍介导的病状。因此，将包括重组基因构建体的细胞制剂以足以恢复所选受试者中分化细胞群的正常水平和/或功能的量施用于此受试者，从而治疗所述病状。在一些实施例中，向受试者施用的包括重组基因构建体的细胞制剂是受试者中损失或发生功能障碍的分化细胞群的制剂。在另一个实施例中，向受试者施用的包括重组基因构建的细胞制剂是分化细胞群的前体细胞或祖细胞的制剂。根据此实施例，包括重组基因构建体的前体细胞或祖细胞在向有需要的受试者施用后成熟或分化成期望的分化细胞群。

在执行本公开的方法时，“治疗(treating/treatment)”包括抑制、预防、改善或延迟特定病状的发作。治疗还涵盖病状或病症的一个或多个症状的任何改善。治疗涵盖与在不存在治疗性干预的情况下的病状或疾病相比，对病状或疾病进展过程的任何改变。

在一些实施例中，所述施用有效地减少了与分化细胞类型的损失或功能障碍相关的疾病或病状的至少一种症状。在另一个实施例中，所述施用有效地介导了与分化细胞类型的损失或功能障碍相关的疾病或病状的改善。在另一个实施例中，与不执行施用时的预期存活期相比，所述施用有效地延长了受试者的存活期。

根据本公开的此方面，由包括重组基因构建体的一个或多个细胞构成的制剂对于受体受试者来说可以是自体的(autologous/autogeneic)(“自身的”)。在另一个实施例中，包括重组基因构建体的细胞制剂对于受体受试者来说是非自体的(“非自身的”，例如同种异体的、同基因的或异基因的)。

在执行本公开的方法时，所述施用可以在不存在免疫抑制或免疫抑制疗法的改善疗程的情况下执行。例如，在一个实施例中，所述施用可以在最初的免疫抑制疗法疗程后进行，但不需要施用长期的免疫抑制疗法。

在一个实施例中，治疗需要本文所述的细胞制剂的受试者的方法涉及治疗患有由少突胶质细胞损失或功能障碍或髓磷脂损失或功能障碍介导的病状的受试者，所述髓磷脂由少突胶质细胞产生。此方法涉及向受试者施用包括本文所述的重组基因构建体的细胞制剂，其中所述细胞制剂是神经胶质祖细胞或少突胶质细胞偏向性祖细胞的制剂。根据此方法，在有效地治疗由少突胶质细胞损失或功能障碍或由髓磷脂损失或功能障碍介导的病状的条件下以足以治疗所述病状的量施用所述细胞。

少突胶质细胞产生髓磷脂，所述髓磷脂是沿轴突跳跃式传导电冲动所需的绝缘鞘(Goldman等人,“如何制造少突胶质细胞(How to Make an Oligodendrocyte)”,《发育(Development)》142(23):3983-3985(2015)，所述文献特此通过全文引用的方式并入)。如本文所描述的，少突胶质细胞的损失导致脱髓磷脂，从而导致从小儿脑白质营养不良和脑瘫到多发性硬化症和白质中风等一系列广泛的疾病中的神经功能受损。

可以根据所述方法和包括本文所述的重组基因构建体的细胞制剂治疗的由髓磷脂损失或由少突胶质细胞损失或功能障碍介导的病状包括低髓磷脂化病症和脱髓磷脂病症。在一个实施例中，所述病状是自身免疫性脱髓磷脂病状，例如，多发性硬化症、谢耳德氏病(Schilder's Disease)、视神经脊髓炎、横贯性脊髓炎和视神经炎。在另一个实施例中，髓磷脂相关病症是血管性脑白质病，例如，皮层下中风、糖尿病性脑白质病、高血压性脑白质病、年龄相关性白质疾病和脊髓损伤。在另一个实施例中，髓磷脂相关病状是辐射诱导的脱髓磷脂病状。在另一个实施例中，髓磷脂相关病症是小儿脑白质营养不良，例如，佩利措伊斯-梅茨巴赫病(Pelizaeus-Merzbacher Disease)、泰萨氏病(Tay-Sach Disease)、山德霍夫氏神经节苷脂沉积症(Sandhoff's gangliosidoses)、克腊伯氏病(Krabbe'sdisease)、异染性脑白质营养不良、粘多糖贮积症(例如，斯莱氏病(Sly's disease))、尼曼-匹克A病(Niemann-Pick A disease)、肾上腺脑白质营养不良、卡纳万氏病(Canavan'sdisease)、白质消失病和亚历山大病(Alexander Disease)。在又另一个实施例中，髓磷脂相关病状是脑室周围白质软化或脑瘫。

产生适用于治疗患有由少突胶质细胞或髓磷脂的损失或功能障碍介导的病状的受试者的神经胶质祖细胞或少突胶质细胞偏向性祖细胞的方法是本领域已知的，参见例如授予Goldman等人的美国专利第9,790,553号、授予Goldman等人的美国专利第10,190,095号和Goldman等人的美国专利申请公开第2015/0352154号，所述文献中的每个文献特此通过全文引用的方式并入。在移植前的任何时间点根据本公开对这些细胞进行修饰以包括重组基因载体。例如，在一个实施例中，刚好在移植之前将重组基因构建体引入到神经胶质祖细胞或少突胶质细胞偏向性祖细胞中。在另一个实施例中，将重组基因构建体引入到神经胶质祖细胞或少突胶质细胞偏向性祖细胞的前体细胞，例如神经祖细胞或多能干细胞中。

在另一个实施例中，治疗需要本文描述的细胞制剂的受试者的方法涉及治疗由星形胶质细胞损失或功能障碍介导的病状。此方法涉及向受试者施用包括本文所述的重组基因构建体的制剂细胞，其中所述细胞制剂是神经胶质祖细胞或星形胶质细胞偏向性祖细胞的制剂。在有效地治疗由星形胶质细胞损失或功能障碍介导的病状的条件下以足以治疗所述病状的量施用所述细胞。

如上所述，星形胶质细胞是中枢神经系统中最大和最普遍的神经胶质细胞类型。星形胶质细胞有助于血脑屏障的形成，参与维持细胞外离子和化学稳态，参与对损伤的应答，并且影响神经元发育和可塑性。

因此，在一些实施例中，由星形胶质细胞损失或功能障碍介导的病状是神经退行性病症。可以根据本公开的方法和细胞制剂治疗的与星形胶质细胞损失相关的神经退行性病症包括但不限于帕金森氏病(Parkinson's Disease，PD)、阿尔茨海默氏病(Alzheimer'sdisease，AD)和其它痴呆、退行性神经疾病、脑炎、癫痫、遗传性脑部病症、头部和大脑畸形、脑积水、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化(ALS或鲁盖瑞氏病(Lou Gehrig's Disease))、亨廷顿氏病(Huntington's disease，HD)、朊病毒病、额颞叶痴呆、路易体痴呆、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、多系统萎缩、遗传性痉挛性截瘫、脊髓小脑萎缩、淀粉样变性、运动神经元疾病(MND)、脊髓小脑性共济失调(SCA)以及中风和脊髓性肌萎缩(SMA)。

产生适用于治疗患有由星形胶质细胞损失或功能障碍介导的病状的受试者的神经胶质祖细胞或星形胶质细胞偏向性祖细胞的方法是本领域已知的，参见例如Goldman等人的美国专利申请公开第2015/0352154号，所述美国专利申请公开特此通过全文引用的方式并入。在移植到有需要的受试者中之前的任何时间点根据本公开对这些细胞进行修饰以包括重组基因载体。例如，在一个实施例中，刚好在移植之前将重组基因构建体引入到神经胶质祖细胞或星形胶质细胞偏向性祖细胞中。在另一个实施例中，将重组基因构建体引入到神经胶质祖细胞或星形胶质细胞偏向性祖细胞的前体细胞，例如神经祖细胞或多能干细胞中。

在另一个实施例中，治疗需要本文描述的细胞制剂的受试者的方法涉及治疗由神经元损失或功能障碍介导的病状。此方法涉及向受试者施用包括本文所述的重组基因构建体的制剂细胞，其中所述细胞制剂是神经元祖细胞的制剂。在有效地治疗由神经元损失或功能障碍介导的病状的条件下以足以治疗所述病状的量施用所述细胞。

根据此实施例，待治疗的病状可以是由特定类型神经元的损失或功能障碍介导的病状。例如，在一个实施例中，待治疗的病状是由胆碱能神经元的损失或功能障碍介导的病状。由胆碱能神经元的损失或功能障碍介导的示例性病状包括阿尔茨海默氏病、皮质基底节变性、路易体痴呆、额颞叶痴呆、多系统萎缩、帕金森氏病、帕金森氏病痴呆和进行性核上性麻痹(Roy等人,“痴呆谱病症中的胆碱能成像(Cholinergic Imaging in DementiaSpectrum Disorders)”,《欧洲核医学与分子成像杂志(Eur.J.Nucl.Med.Mol.Imaging)》.43:1376-1386(2016)，所述文献特此通过全文引用的方式并入)。

在另一个实施例中，待治疗的病状是由多巴胺能神经元的损失或功能障碍介导的病状。由多巴胺能神经元的损失或功能障碍介导的示例性病状包括帕金森氏病、帕金森症样病症(例如，青少年帕金森症、拉姆齐-亨特麻痹综合征(Ramsey-Hunt paralysissyndrome))和精神病症(例如，精神分裂症、抑郁症、药物成瘾)。

在另一个实施例中，待治疗的病状是由中等棘神经元和/或皮质中间神经元的损失或功能障碍介导的病状。由中等棘神经元和/或皮质中间神经元的损失或功能障碍介导的示例性病状包括亨廷顿氏病、癫痫、焦虑症和抑郁症(Powell等人,“皮质中间神经元发育的遗传性中断引起区域和GABA细胞类型特异性缺陷、癫痫和行为功能障碍(GeneticDisruption of Cortical Interneuron Development Causes Region-and GABA CellType-Specific Deficits,Epilepsy,and Behavioral Dysfunction)”,《神经科学杂志(J.Neurosci.)》23(2):622-631(2003)，所述文献特此通过全文引用的方式并入)。

产生适用于治疗患有由神经元损失或功能障碍介导的病状的受试者的神经元祖细胞的方法在本领域中是已知的，参见例如Goldman,SAl.,“移植的神经祖细胞弥合间隙以使脊髓受伤的猴子受益(Transplanted Neural Progenitors Bridge Gaps to BenefitCord-Injured Monkeys)”.《自然医学(Nat.Med.)》24(4):388-390(2018)；Roy等人,“通过与端粒酶永生化中脑星形胶质细胞共培养富集的人类ES细胞源性多巴胺能神经元的功能性植入(Functional Engraftment of Human ES Cell-Derived Dopaminergic NeuronsEnriched by Coculture with Telomerase-Immortalized Midbrain Astrocytes)”,《自然医学》12(11):1259-1268(2006)；Nunes等人,“从成人大脑皮层下白质中鉴定和分离多能神经祖细胞(Identification and Isolation of Multipotential Neural ProgenitorCells from the Subcortical White Matter of the Adult Human Brain)”,《自然医学》9(4):439-447(2003)，授予Goldman等人的美国专利第6,812,027号；授予Goldman等人的美国专利第7,150,989号；授予Goldman等人的美国专利第7,468,277号；授予Goldman的美国专利第7,785,882号；授予Goldman等人的美国专利第8,263,406号；授予Goldman等人的美国专利第8,642,332号；以及授予Goldman等人的美国专利第8,945,921号，所述文献中的每一个文献特此通过全文引用的方式并入。在移植到有需要的受试者中之前的任何时间点根据本公开对这些细胞进行修饰以包括重组基因载体。例如，在一个实施例中，刚还在移植之前将重组基因构建体引入到神经元祖细胞中。在另一个实施例中，将重组基因构建体引入到神经元祖细胞的前体细胞，例如神经祖细胞或多能干细胞中。

在执行涉及中枢神经系统中的细胞替代的本发明的方法中，本文所述的细胞制剂可以全身施用到循环中，或者直接施用到脑、脑干、脊髓或其组合的一个或多个部位。

当将细胞制剂全身注射到循环中时，可以将细胞制剂放置在注射器、套管或其它注射设备中以精确放置在预选部位处。术语“可注射的”是指可以在正常条件下和在常压下从注射器中分配细胞制剂。

用于将各种神经组织/细胞直接施用(即移植)到宿主脑中的方法在本领域中是众所周知的。在一些实施例中，所述制剂是通过脑室内、胼胝体内或脑实质内施用的。

脑实质内施用，即在宿主脑内施用(与脑外或脑实质外移植相比)是通过在施用时将细胞注射或沉积在脑实质内来实现的。可以使用以下两种方法进行脑实质内移植：(i)将细胞制剂注射到宿主脑实质中；或(ii)通过手术手段制备空腔以使宿主脑实质暴露，并且然后将细胞制剂沉积到空腔中。两种方法都在施用时提供细胞制剂与宿主脑组织之间的实质沉积，并且都促进移植物(即细胞制剂)与宿主脑组织之间的解剖整合。

可替代地，可以将细胞移植物放置在室，例如脑室中或硬脑膜下，即在宿主大脑的表面上，在所述表面处，所述细胞移植物通过中间的软脑膜或蛛网膜和软脑膜与宿主脑实质分开。移植到脑室可以通过注射供体细胞或通过使细胞在如3％胶原等基质中生长以形成实体组织塞来完成，所述实体组织塞然后可以植入脑室中以防止移植物脱位。对于硬膜下移植，可以在硬脑膜中切开一个切口后，将细胞注射到大脑表面周围。

为了移植到空腔中(这对于脊髓移植可能是优选的)，通过去除覆盖在大脑上的骨骼并用如明胶海绵等材料止血来从靠近CNS外表面的区去除组织以形成移植空腔。抽吸可以用于产生空腔。然后将细胞制剂放置在空腔中。可以将多于一种细胞制剂放置在同一空腔中。在一些实施例中，植入部位由所治疗的CNS病症决定。

可以通过钻孔并刺穿硬脑膜以允许插入微量注射器的针头来向宿主大脑的所选区进行注射。微量注射器优选地安装在立体定位框架中，并且选择三维立体定位坐标来将针头放置到大脑或脊髓的期望位置。也可以将所述细胞引入到脑的壳核、基底核、海马皮质、纹状体、黑质或尾状区以及脊髓中。

给定体积中的细胞数量可以通过众所周知的常规程序和仪器来确定。在给定体积的细胞混合物中细胞的百分比可以通过几乎相同的程序来确定。可以手动或通过使用自动细胞计数器轻松地对细胞进行计数。可以使用特异性染色和目视检查以及通过使用特异性结合试剂(通常是抗体、荧光标签)和荧光激活细胞分选仪的自动化方法来确定给定体积中的特定细胞。

考虑到如特定患者的年龄、性别、体重和病状以及将要施用的调配物等因素，可以按剂量并通过医学和兽医领域技术人员熟知的技术来施用细胞制剂。适合根据本文所述的各个实施例使用的剂量将取决于许多因素。对于不同的情况，所述剂量可能会有很大差异。确定主要和辅助疗法施用的最佳剂量的参数通常将包括以下中的一些或全部：正在治疗的疾病和其阶段；受试者的物种、其健康状况、性别、年龄、体重；受试者的免疫能力；正在实施的其它疗法；以及根据受试者的病史或基因型预期的潜在并发症。所述参数还可以包括：细胞是同基因的、自体的、同种异体的还是异基因的；细胞的效力(比活性)；为了使细胞/培养基有效而必须靶向的位点和/或分布；以及所述位点的如细胞/培养基的可及性和/或细胞的植入等此类特性。另外的参数包括与其它因子(如生长因子和细胞因子)的共施用。在给定情况下的最佳剂量也将考虑细胞/培养基的调配方式、细胞/培养基的施用方式以及细胞/培养基在施用后定位于靶位点处的程度。最后，最佳剂量的确定必然会提供既不低于最大有益作用的阈值，也不高于与所述剂量相关的有害影响超过增加的优势的阈值的有效剂量。

对于相当纯的细胞制剂，各个实施例中的最佳剂量范围为每次施用约10⁴到约10⁹个细胞。在一些实施例中，每次施用的最佳剂量将为介于约10⁵到约10⁷个细胞之间。在许多实施例中，每次施用的最佳剂量将为约5×10⁵到约5×10⁶个细胞。

应当理解，单一剂量可以一次、分次地或在一定时间段内连续地递送。也可以将整个剂量递送到单个位置或分次地在若干个位置上分布。

人类受试者的治疗时间通常比实验动物长；但是，治疗时长通常与疾病过程的时长和治疗有效性成比例。本领域技术人员在使用在人类和/或在如大鼠、小鼠、非人灵长类动物等动物中执行的其它程序的结果来确定人类的合适剂量时将考虑到这一点。基于这些考虑因素并考虑到由本公开和现有技术提供的指导，此类确定将使技术人员能够在没有过度实验的情况下这样做。

用于初始施用和另外的剂量或顺序施用的合适方案可以全部相同或可以是可变的。技术人员可以根据本公开、本文引用的文件和本领域的知识确定合适的方案。

在一些实施例中，细胞制剂以一个剂量施用于受试者。在其它实施例中，细胞制剂以一系列两个或更多个剂量连续施用于受试者。在以单一剂量、以两个剂量和/或多于两个剂量施用细胞制剂的一些其它实施例中，所述剂量可以相同或不同，并且所述剂量以其间相等或不相等的间隔施用。

细胞制剂可以在宽泛的时间范围内以多种频率施用。在一些实施例中，细胞制剂在少于一天的时间段内施用。在其它实施例中，细胞制剂在两天、三天、四天、五天或六天内施用。在一些实施例中，细胞制剂在数周的时间段内每周施用一次或多次。在其它实施例中，细胞制剂在数周的时间段内施用，持续一个月到若干月。在各个实施例中，细胞制剂可以在数月的时间段内施用。在其它实施例中，细胞制剂可以在一年或多年的时间段内施用。一般来说，治疗时长将与疾病过程的时长、所应用的疗法的有效性以及所治疗的受试者的病状和应答成比例。

针对给定应用选择用于施用组合物的调配物将取决于多种因素。其中突出的因素将是受试者的物种、所治疗的病症、功能障碍或疾病的性质及其在受试者中的状态和分布、正在施用的其它疗法和药剂的性质、最佳施用途径、通过所述途径的存活性、给药方案和对本领域技术人员来说显而易见的其它因素。具体地，例如，合适的载体和其它添加剂的选择将取决于确切的施用途径和特定剂型的性质。

例如，细胞存活期可能是基于细胞的疗法的功效的重要决定因素。这对于主要和辅助疗法两者都是如此。当靶位点不适合细胞接种和细胞生长时，就会出现另一个问题。这可能会阻碍治疗性细胞进入所述位点和/或在其处植入。因此，可以采取措施来提高细胞存活期和/或克服由接种和/或生长障碍造成的问题。

最终调配物可以包括细胞/培养基和任选的蛋白质和/或小分子的水性悬浮液，并且通常将涉及将悬浮液的离子强度调节到等渗性(即约0.1到0.2)和生理pH(即约pH 6.8到7.5)。最终调配物通常还将含有流体润滑剂，如麦芽糖，所述流体润滑剂必须为身体所耐受。示例性润滑剂组分包括甘油、糖原、麦芽糖等。如聚乙二醇和透明质酸等有机聚合物基础材料以及如琥珀酰化胶原等非纤维状胶原也可以充当润滑剂。此类润滑剂通常用于改善注射材料在注射部位的可注射性、可侵入性和分散性，并通过改变组合物的粘度来减少掺入量。根据定义，此最终调配物是在药学上可接受的载体中的本文所述的细胞。

可以将多个细胞制剂同时施用到不同的位置，如鞘内和静脉内的组合施用，以最大化靶向到受影响区域中的机会。

另外的方面涉及一种由一个或多个细胞构成的制剂，其中与对应的野生型细胞相比，所述制剂的细胞被修饰以条件性地表达增加水平的一种或多种免疫检查点蛋白。在一个实施例中，与对应的野生型细胞相比，所述制剂的细胞被进一步修饰以条件性地表达降低水平的一种或多种内源性HLA-I蛋白。在一些实施例中，与对应的野生型细胞相比，所述制剂的细胞被进一步修饰以条件性地表达降低水平的一种或多种HLA-II蛋白。

另一个方面涉及一种由一个或多个细胞构成的制剂，其中与对应的野生型细胞相比，所述制剂的细胞被修饰以条件性地表达降低水平的一种或多种内源性HLA-I蛋白。在一些实施例中，与对应的野生型细胞相比，所述制剂的细胞被进一步修饰以条件性地表达降低水平的一种或多种HLA-II蛋白。

在所述制剂的经修饰的细胞中条件性表达的示例性免疫检查点蛋白在上文进行了详细描述并且包括例如程序性死亡配体1(PD-L1)、程序性死亡配体2(PD-L2)、CD47、HLA-E、CD200和CTLA-4。

同样，在所述制剂的经修饰的细胞中的条件性表达降低的示例性HLA-I蛋白在上文中进行了描述并且包括例如以下中的一种或多种：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G和其组合。在所述制剂的经修饰的细胞中的条件性表达降低的示例性HLA-II蛋白包括以下中的任何一种或多种：HLA-DM、HLA-DO、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR。

本公开的又另一个方面涉及一种产生条件性免疫保护的细胞的方法。此方法涉及对细胞进行修饰以：(i)条件性地表达增加水平的一种或多种免疫检查点蛋白；或者(ii)条件性地表达减少一种或多种内源性HLA-蛋白的表面表达的一种或多种药剂。在另一个实施例中，所述方法涉及对细胞进行修饰以：(i)条件性地表达增加水平的一种或多种免疫检查点蛋白；和(ii)条件性地表达减少一种或多种内源性HLA-蛋白的表面表达的一种或多种药剂。

根据本公开的此方面，一种或多种免疫检查点蛋白的条件性表达和/或减少一种或多种内源性HLA蛋白表达的一种或多种药剂的条件性表达与在终末分化细胞中限制性表达的基因的表达可操作地连接。合适的终末分化细胞和在其中选择性表达的基因在上文中进行了详细描述。

可以根据本公开的此方面修饰的细胞包括来自任何生物体的细胞。在一些实施例中，所述制剂是哺乳动物细胞制剂，例如啮齿动物细胞(即小鼠或大鼠细胞)、兔细胞、豚鼠细胞、猫细胞、犬细胞、猪细胞、马细胞、牛细胞、绵羊细胞、猴细胞或人类细胞的制剂。合适的细胞包括处于其谱系的任何阶段的原代或永生化胚胎细胞、胎儿细胞或成体细胞，例如全能细胞、多能细胞或分化细胞。

在一些实施例中，对所关注细胞进行修饰涉及将序列特异性核酸酶引入到细胞中，所述序列特异性核酸酶在靶基因的3′UTR处或其内或刚好在3'UTR的上游的位置处切割所述基因。如上文详细描述的，合适的靶基因是以细胞特异性方式选择性或限制性表达的基因。一旦靶基因被序列特异性核酸酶切割，所述方法就进一步涉及例如通过同源重组向靶基因中引入本文所述的重组基因构建体中的任何重组基因构建体。

用于切割靶基因以引入重组基因构建体的合适的序列特异性核酸酶包括但不限于锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)和RNA引导的核酸酶。在一些实施例中，将序列特异性核酸酶以蛋白质、mRNA或cDNA的形式引入到所述细胞中。

锌指核酸酶是一类经工程化的DNA结合蛋白，其通过以序列特异性方式引入双链DNA断裂来促进DNA的靶向编辑。每种ZFN包括两个功能结构域，即由各自识别独特的DNA六聚体序列的双指模块的链构成的DNA结合结构域以及由Fok I的核酸酶结构域构成的DNA切割结构域。适合靶向切割本文所述的靶基因以促进插入重组基因构建体的ZFN在本领域是已知的，参见例如授予Carroll等人的美国专利第8,106,255号、授予Cai等人的美国专利第9,428,756号、Soo和Joo的美国专利公开第20110281306号；Cox等人的美国专利公开第20050130304号，所述文献特此通过全文引用的方式并入。

在另一个实施例中，利用类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)介导的DNA编辑来将本文所述的重组基因构建体引入到所关注靶基因中。功能性TALEN由衍生自类转录激活因子效应物(TALE)蛋白的DNA结合结构域和来自DNA核酸酶FokI的核酸酶催化结构域组成。TALE的DNA结合结构域的特征在于由33-34个氨基酸重复序列构成的阵列。除了在氨基酸位置12和13处的决定每个重复序列识别靶DNA序列的哪个核苷酸的重复序列可变二残基(RVD)之外，每个重复序列都是保守的。使用重复序列单元内的典型或非典型的RVD定制TALE蛋白以结合到靶位点的方法是本领域已知的并且适合根据本公开使用(参见例如授予Philip等人的美国专利第8,586,526号和授予Philip等人的美国专利第9,458,205号，所述美国专利特此通过全文引用的方式并入)。同样，适用于根据本公开使用的将TALEN用于基因编辑的方法在本领域中也是已知的，参见例如授予Osborn等人的美国专利第9,393,257号，所述美国专利特此通过全文引用的方式并入。

在另一个实施例中，用于将本文所述的重组基因构建体引入到所关注靶基因中的序列特异性核酸酶是呈Cas9形式的RNA引导的核酸酶。Cas9是含有两个核酸酶结构域的CRISPR相关蛋白，所述两个核酸酶结构域当与CRISPR RNA(cRNA)和反式激活rRNA复合时可以实现位点特异性DNA识别和双链切割。适合根据本公开使用的用于基因编辑的CRISPR-Cas9系统和方法在本领域中是众所周知的，参见例如Jinek,M.等人“适应性细菌免疫中的可编程双RNA引导的DNA核酸内切酶(Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonucleasein Adaptive Bacterial Immunity)”,《科学(Science)》337:816-821(2012)；Doench等人,“用于CRISPR介导的基因失活的高活性sgRNA的合理设计(Rational Design of HighlyActive sgRNA for CRISPR-mediated Gene Inactivation)”,《自然生物技术(NatureBiotechnol.)》32(12):1262-7(2014)，授予Miller的美国专利第9,970,001号；Gori等人的美国专利公开第20180282762号和Gersbach等人的美国专利公开第20160201089号，所述文献特此通过全文引用的方式并入。

实例

提供以下实例以说明本发明的实施例，但所述实例决不旨在限制本发明的范围。

实例1-用于在终末分化细胞中靶向表达的重组基因敲入构建体

包括靶向细胞特异性基因(例如，MYRF、SYN1或GFAP)的免疫抑制性蛋白敲入载体的各种重组基因构建体的设计在图1-14中示出。

图1示出了重组基因构建体的一般设计，所述重组基因构建体包括：以细胞类型特异性方式表达的第一基因序列(即5'同源臂)；编码自切割肽的核苷酸序列(例如，P2a)；编码一种或多种免疫抑制性蛋白(例如，HLA-E/syB2M、CD47或PD-L1)的第一核苷酸序列；终止密码子；对减少一种或多种内源性HLA-I分子的表面表达的一种或多种药剂进行编码的第二核苷酸序列(即shRNA)；选择标志物；以及以细胞类型特异性方式表达的第二基因序列(即3'同源臂)。

图2-4示出了包括5'同源臂和3'同源臂的敲入载体的一般设计。所述敲入载体编码：免疫抑制性蛋白，即HLA-E/syB2M(图2)、CD47(图3)或PD-L1(图4)；自切割肽(P2a)；HLA-E/syB2M；抗B2M shRNA；抗CIITA shRNA；和嘌呤霉素。嘌呤霉素的表达与用于在哺乳动物细胞中组成型表达的EF1a启动子操作性地连接。

图5是示出了各种靶细胞和保护信号(即免疫抑制性蛋白或其肽)的组合的矩阵。

图6-8示出了靶向SYN1基因座以实现以神经元特异性方式表达的敲入载体的一般示例性设计。每个SYN1靶向敲入载体包括5'同源臂和3'同源臂并且编码：免疫抑制性蛋白，即HLA-E/syB2M(图6)、CD47(图7)或PD-L1(图8)；自切割肽(P2a)；HLA-E/syB2M；抗B2MshRNA；抗CIITA shRNA；和嘌呤霉素。嘌呤霉素的表达与用于在哺乳动物细胞中组成型表达的EF1a启动子操作性地连接。

图9-11示出了靶向MYRF基因座以实现以少突胶质细胞特异性方式表达的敲入载体的一般设计。每个MYRF靶向敲入载体包括5'同源臂和3'同源臂并且编码：免疫抑制性蛋白，即HLA-E/syB2M(图9)、CD47(图10)或PD-L1(图11)；自切割肽(P2a)；HLA-E/syB2M；抗B2MshRNA；抗CIITA shRNA；和嘌呤霉素。嘌呤霉素的表达与用于在哺乳动物细胞中组成型表达的EF1a启动子操作性地连接。

图12-14示出了靶向GFAP基因座以实现以星形胶质细胞特异性方式表达的敲入载体的一般设计。每个GFAP靶向敲入载体包括5'同源臂和3'同源臂并且编码：免疫抑制性蛋白，即HLA-E/syB2M(图12)、CD47(图13)或PD-L1(图14)；自切割肽(P2a)；HLA-E/syB2M；抗B2M shRNA；抗CIITA shRNA；和嘌呤霉素。嘌呤霉素的表达与用于在哺乳动物细胞中组成型表达的EF1a启动子操作性地连接。

预示性实例2-产生表达CD47 cDNA的具有针对MYRF基因座的靶序列的重组基因敲入构建体

包括靶向MYRF基因座的CD47敲入载体的重组基因构建体的示意图在图15中示出。所述重组基因构建体包括：5'同源臂(HAL)；编码自切割肽的核苷酸序列(P2A)；编码CD47的第一核苷酸序列；编码抗β₂M shRNA的第二核苷酸序列；编码抗CIITA shRNA的第三核苷酸序列；编码GFP的与EF1a启动子操作性地连接的核苷酸序列；以及3'同源臂(HAR)。图15的重组基因构建体将按以下方式产生。

β₂-微球蛋白和CIITA敲低

β₂M和CIITA的shRNA将使用在线工具(例如，来自赛默飞世尔(Thermofisher)的iRNA设计器)来产生。shRNA将紧接在慢病毒载体pTANK-EF1a-copGFP-Puro-WPRE中嘌呤霉素基因的下游插入。将产生用水疱性口炎病毒G糖蛋白假型化的病毒颗粒，将所述病毒颗粒通过超速离心浓缩，并在293HEK细胞上滴定。

HAD100衍生的hGPC将用携带用于β₂M或CIITA的shRNA的慢病毒进行转导(MOI＝1)。敲低的效率将通过QPCR进行评估。敲低效率>80％的shRNA将通过相应蛋白质的表达并借助于免疫染色和蛋白质印迹来进一步验证。

sgRNA设计和CRSPR/Cas9载体构建体

将使用由麻省理工学院(MIT)的Zhang实验室(crispr.mit.edu)开发的CRISPR/Cas9设计工具来设计单向导RNA以允许双切刻。将在刚好在密码子终止之前的编码序列中选择sgRNA(例如，TCAGGCCAACTGCAGTTCAGAGG(SEQ ID NO:45))。sgRNA将通过使用Surveyor突变检测试剂盒(IDT公司(IDT inc))转染HEK-29细胞来验证。

同源臂的克隆

将按照制造商的说明书使用DNeasy血液和组织试剂盒(QIAGEN)从细胞中提取基因组DNA。将使用AmpliTaq Gold 360(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific))来从HAD100细胞系的基因组DNA中扩增同源臂(引物TBD)。两个同源臂都将被亚克隆到pCR2.1-TOPO中并进行序列验证。左同源臂(HAL)将包括靶基因中的最后一个外显子。

hESC转染和选择

将使用无内毒素的Maxi-prep试剂盒(凯杰(Qiagen))来扩增敲入和sgRNA-CRIPR/Cas9质粒。使用Amaxa 4D-Nucleofector(龙沙(Lonza)；按照制造商的说明书使用程序CA-137)将两种质粒(每种3μg)转染到hESC(800,000个细胞)中。在电穿孔后二十四小时，细胞将在含有嘌呤霉素(1μg/mL)的培养基中生长。

将单个集落分离并扩增。转基因克隆将通过PCR验证敲入盒的正确整合和sgRNA-CRISPR/Cas9质粒的缺失。

用于产生表达CD47 cDNA的具有针对MYRF基因座的靶序列的重组基因敲入构建体的合适序列在下表14中示出。

表14：用于表达CD47 cDNA的具有针对MYRF基因座的靶序列的重组基因敲入构建体的示例性序列

实例3-表达PD-L1和CD47的人U251胶质瘤细胞在免疫人源化宿主中优先扩增和持续存在

材料与方法：

靶向质粒的构建：使用基本分子克隆技术用PCR产生的插入物来产生靶向载体。人PD-L1(NCBI参考序列：NM_014143.4，其特此通过全文引用的方式并入)、人CD47(NCBI参考序列：NM_001777.3，其特此通过全文引用的方式并入)或EGFP的编码序列被紧接地克隆在pIRES-hPGK-Puro-WPRE-BGHpa中的内部核糖体进入位点(IRES)的下游。紧接在PDL1或CD47之后也克隆了靶向CIITA和B2M的两种shRNA(表15)。

表15：shRNA序列

与最后一个编码外显子重叠的同源臂是从HEK293细胞基因组DNA中克隆出来的。左同源臂由842bp组成(NCBI参考序列：NC_000004.12(横跨54294436-54295277)，其特此通过全文引用的方式并入)，而右同源臂由875bp组成(NCBI参考序列：NC_000004.12(横跨54295286-54296160)，其特此通过全文引用的方式并入)。

sgRNA(5'-CTG TAA CTG GCG GAT TCG AGG-3'；SEQ ID NO:56)被克隆在pU6-PDGFRA2-CBh-Cas9-T2A-mCherry(Addgene质粒#64324)的U6启动子的下游，并在HEK293细胞中使用Surveyor核酸酶测定(Surveyor突变检测试剂盒，IDT)进行验证。

细胞转染和选择。将U251人恶性胶质母细胞瘤细胞维持在37℃、5％CO₂下在杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM；美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA))中，所述培养基补充有10％热灭活胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素(100单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素)。

使用4D Nucleofector^TM(龙沙)利用SE细胞系4D-NucleofectorTMX转染试剂盒，按照DS-126方案和由制造商提供的说明书，用靶向质粒和sgRNA/Cas9质粒的2μg DNA混合物(1:1比率)转染U251细胞(5×10⁵)。在转染后三天，将细胞传代并在含嘌呤霉素(1.5μg/ml；西格马)的培养基中培养以进行选择。出于正确整合、转基因完整性和不存在供体细菌质粒，对单独的克隆进行扩增和基因分型。

用表达荧光素酶的慢病毒(pTANK-CMV-荧光素酶-IRES-mCherry-WPRE；MOI＝5)转导所选克隆。对于移植，通过胰蛋白酶消化收集细胞并将所述细胞在汉克氏平衡盐溶液(Hanks'Balanced Salt solution)中浓缩到1×10⁷个细胞/ml。

动物、细胞移植和成像。雌性huPBMC-NOG小鼠(NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Sug/JicTac)购自泰康利(Taconic)。将小鼠饲养在无菌环境中(每笼3-4只小鼠)。在2.5％异氟烷麻醉下执行移植。将100μl HBSS中的总共1×10⁶个细胞皮下单侧注射到小鼠的侧腹中。

体内生物发光成像。在2.5％异氟烷麻醉下，在

Spectrum谱成像站(珀金埃尔默(PerkinElmer))上进行生物发光成像。在对小鼠进行成像时，在成像前10分钟注射D-荧光素(150mg/kg体重，腹膜内；西格马)。使用

Spectrum软件计算发光。

结果：

产生表达PD-L1、CD47和EGFP cDNA的具有针对PDGFRA基因座的靶序列的重组基因敲入构建体。包括靶向PDGFRA基因座的PD-L1或CD47敲入载体的重组基因构建体的示意图在图16A中示出。PD-L2和CD47敲入载体从5'→3'包括：5'同源臂；终止密码子；内部核糖体进入位点(IRES)；编码CD47或PD-L1的核苷酸序列；编码抗B2M shRNA的核苷酸序列；编码抗CIITA shRNA的核苷酸序列；嘌呤霉素选择标志物；以及3'同源臂。EGFP载体(对照载体)从5'→3'包括：5'同源臂；终止密码子；IRES；编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的核苷酸序列；终止密码子；嘌呤霉素选择标志物；以及3'同源臂。这些构建体中的嘌呤霉素选择标志物包括用于在哺乳动物细胞中组成型表达的磷酸甘油酸酯激酶(PGK)启动子和多腺苷酸化信号(PA)。CD47和PD-L1敲入载体能够通过β2-微球蛋白和2类反式激活因子CIITA的shRNAi抑制来敲低I类和II类主要组织相容性复合物(图16A，顶部构建体)。EGFP敲入载体(对照载体)仅表达EGFP以代替CD47或PDL1，并且不表达任何一种shRNA(图16A，底部构建体)。图16B-16D示出了通过对通过CRISPR介导的将图16A的重组基因构建体敲入PDGFRA基因座中而产生的克隆在嘌呤酶素选择和克隆扩增后进行免疫染色来进行的验证。

表达PD-L1和CD47的人U251胶质瘤细胞在免疫人源化宿主中优先扩增和持续存在。U251细胞与其相关的神经胶质祖细胞一样表达PDGFRA。在所述基础上，将在PDGFRA基因座中表达PD-L1或CD47或EGFP(对照)的基因编辑的U251敲入(KI)细胞皮下注射到huPBMC-NOG小鼠(人外周血单核细胞嵌合的免疫缺陷型NOG小鼠)的侧腹中。在移植后1天、5天或9天，通过体内生物发光成像监测肿瘤生长(图17A)。到移植后9天，CD47表达性U251细胞的扩增和持续存在的程度明显高于EGFP表达性对照细胞(图17B)，这与它们避免了人源化宿主免疫系统的移植排斥一致。

尽管本文已经详细描绘和描述了优选实施例，但是对于相关领域的技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的精神的情况下可以进行各种修改、添加、替换等，并且因此这些被认为是在随后的权利要求中限定的本发明的范围内。

Claims (84)

1.一种重组基因构建体，其包括：

以细胞类型特异性方式表达的第一基因序列；

位于所述第一基因序列的3'处的一个或多个编码免疫检查点蛋白的核苷酸序列；以及

以细胞类型特异性方式表达的第二基因序列，所述第二基因序列位于所述编码免疫检查点蛋白的核苷酸序列的3'处。

2.根据权利要求1所述的重组基因构建体，其进一步包括：

对减少一种或多种HLA-I分子的表达的一种或多种药剂进行编码的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与所述一个或多个编码免疫检查点蛋白的核苷酸序列偶联。

3.一种重组基因构建体，其包括：

以细胞类型特异性方式表达的第一基因序列；

对减少一种或多种HLA-I分子的表达的一种或多种药剂进行编码的核苷酸序列，所述核苷酸序列位于所述第一细胞特异性基因序列的3'处；以及

以细胞类型特异性方式表达的第二基因序列，所述第二基因序列位于所述对减少一种或多种HLA-I分子的表达的一种或多种药剂进行编码的核苷酸序列的3'处。

4.根据权利要求1或权利要求2所述的重组基因构建体，其中所述一种或多种免疫检查点蛋白选自程序性死亡配体1(PD-L1)、程序性死亡配体2(PD-L2)、CD47、CD200、CTLA-4、HLA-E和其任何组合。

5.根据权利要求2到4中任一项所述的重组基因构建体，其中减少所述一种或多种HLA-I分子的表达的所述一种或多种药剂选自由以下组成的组：shRNA、miRNA和siRNA。

6.根据权利要求2到4中任一项所述的重组基因构建体，其中减少所述一种或多种HLA-I分子的表达的所述一种或多种药剂是核酸酶缺陷型Cas9或锌指核酸酶。

7.根据权利要求2到6中任一项所述的重组基因构建体，其中减少所述一种或多种HLA-I分子的表达的所述一种或多种药剂是减少β₂M的表达的药剂。

8.根据权利要求2到6中任一项所述的重组基因构建体，其中所述一种或多种HLA-I分子选自由以下组成的组：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G和其组合。

9.根据权利要求1到8中任一项所述的重组基因构建体，其中所述重组基因构建体的所述第一基因序列和所述第二基因序列来自在一个或多个终末分化细胞中限制性表达的基因。

10.根据权利要求9所述的重组基因构建体，其中所述终末分化细胞是少突胶质细胞。

11.根据权利要求10所述的重组基因构建体，其中所述第一基因序列和所述第二基因序列来自选自由以下组成的组的基因：SOX10、MYRF、MAG和MBP。

12.根据权利要求9所述的重组基因构建体，其中所述终末分化细胞是星形胶质细胞。

13.根据权利要求12所述的重组基因构建体，其中所述第一基因序列和所述第二基因序列来自选自GFAP和AQP4的基因。

14.根据权利要求9所述的重组基因构建体，其中所述终末分化细胞是神经元。

15.根据权利要求14所述的重组基因构建体，其中所述第一基因序列和所述第二基因序列来自选自由以下组成的组的基因：SYN1、MAP2和ELAV4。

16.根据权利要求14所述的重组基因构建体，其中所述终末分化细胞是多巴胺能神经元，并且所述第一基因序列和所述第二基因序列来自选自TH和DDC的基因。

17.根据权利要求14所述的重组基因构建体，其中所述终末分化细胞是中等棘神经元和皮质中间神经元，并且所述第一基因序列和所述第二基因序列来自选自GAD65和GAD67的基因。

18.根据权利要求14所述的重组基因构建体，其中所述终末分化细胞是胆碱能神经元，并且所述第一基因序列和所述第二基因序列来自CHAT。

19.根据权利要求1到16中任一项所述的重组基因构建体，其进一步包括：

对减少一种或多种HLA-II分子的表达的一种或多种药剂进行编码的另外的核苷酸序列，其中所述构建体的所述另外的核苷酸序列与所述一个或多个编码免疫检查点蛋白的核苷酸序列和/或所述对减少一种或多种HLA-I分子的表达的一种或多种药剂进行编码的核苷酸序列偶联。

20.根据权利要求17所述的重组基因构建体，其中减少一种或多种HLA-II分子的表达的所述一种或多种药剂选自由以下组成的组：shRNA、miRNA和siRNA。

21.根据权利要求17所述的重组基因构建体，其中减少一种或多种HLA-II分子的表达的所述一种或多种药剂是核酸酶缺陷型Cas9蛋白或锌指核酸酶。

22.根据权利要求17所述的重组基因构建体，其中减少所述一种或多种HLA-II分子的表达的所述一种或多种药剂是减少II类主要组织相容性复合物反式激活因子(CIITA)的表达的药剂。

23.根据权利要求1到20中任一项所述的重组基因构建体，其进一步包括：

一个或多个编码自切割肽的核苷酸序列，其中所述编码自切割肽的核苷酸序列以有效地介导所述一种或多种免疫检查点蛋白的翻译的方式位于所述构建体内。

24.根据权利要求21所述的重组基因构建体，其中所述自切割肽选自由以下组成的组：猪捷申病毒-1 2A(P2A)、明脉扁刺蛾病毒2A(T2A)、马甲型鼻炎病毒2A(E2A)、质型多角体病毒(BmCPV 2A)和软化病病毒(BmIFV 2A)。

25.根据权利要求1到22中任一项所述的重组基因构建体，其进一步包括：

可诱导细胞死亡基因，所述可诱导细胞死亡基因以有效地实现可诱导细胞自杀的方式位于所述构建体内。

26.根据权利要求22所述的重组基因构建体，其中所述可诱导细胞死亡基因选自胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-9和胸苷激酶。

27.一种由一个或多个细胞构成的制剂，其中所述制剂的细胞包含根据权利要求1到24中任一项所述的重组基因构建体。

28.根据权利要求25所述的制剂，其中所述制剂的细胞是哺乳动物细胞。

29.根据权利要求25所述的制剂，其中所述制剂的细胞是人类细胞。

30.根据权利要求25所述的制剂，其中所述制剂的细胞是多能细胞。

31.根据权利要求28所述的制剂，其中所述多能细胞是诱导性多能干细胞。

32.根据权利要求28所述的制剂，其中所述多能细胞是胚胎干细胞。

33.根据权利要求25所述的制剂，其中所述制剂的细胞是祖细胞。

34.根据权利要求31所述的制剂，其中所述祖细胞是神经胶质祖细胞。

35.根据权利要求31所述的制剂，其中所述祖细胞是少突胶质细胞偏向性祖细胞。

36.根据权利要求31所述的制剂，其中所述祖细胞是星形胶质细胞偏向性祖细胞。

37.根据权利要求31所述的制剂，其中所述祖细胞是神经元祖细胞。

38.根据权利要求25所述的制剂，其中所述制剂的细胞是终末分化细胞。

39.根据权利要求36所述的制剂，其中所述终末分化细胞是神经元、少突胶质细胞或星形胶质细胞。

40.一种方法，其包括：

向有需要的受试者施用根据权利要求25到37中任一项所述的制剂。

41.一种治疗患有由髓磷脂损失或由少突胶质细胞损失或功能障碍介导的病状的受试者的方法，所述方法包括：

在有效地治疗所述病状的条件下向所述受试者施用根据权利要求32或权利要求33所述的制剂。

42.一种治疗患有由星形胶质细胞损失或功能障碍介导的病状的受试者的方法，所述方法包括：

在有效地治疗所述病状的条件下向所述受试者施用根据权利要求32或权利要求34所述的制剂。

43.一种治疗患有由神经元损失或功能障碍介导的病状的受试者的方法，所述方法包括：在有效地治疗所述病状的条件下向所述受试者施用根据权利要求31或权利要求35所述的制剂。

44.根据权利要求39到41中任一项所述的方法，其中将所述制剂施用于脑、脑干、脊髓或其组合的一个或多个部位。

45.根据权利要求42所述的方法，其中所述制剂是通过脑室内、胼胝体内或脑实质内施用的。

46.一种由一个或多个细胞构成的制剂，其中所述制剂的细胞被修饰以条件性地表达：

(i)与对应的野生型细胞相比，增加水平的一种或多种免疫检查点蛋白，

(ii)与对应的野生型细胞相比，降低水平的一种或多种HLA-I蛋白，或者

(iii)(i)和(ii)的组合。

47.根据权利要求44所述的制剂，其中所述制剂的经修饰的细胞是终末分化细胞。

48.根据权利要求44所述的制剂，其中所述一种或多种HLA-I蛋白选自由以下组成的组：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G和其组合。

49.根据权利要求44所述的制剂，其中所述一种或多种免疫检查点蛋白选自程序性死亡配体1(PD-L1)、程序性死亡配体2(PD-L2)、CD47、CD200、CTL4A、HLE-1和其任何组合。

50.根据权利要求44到47中任一项所述的制剂，其中与对应的野生型细胞相比，所述制剂的经修饰的细胞条件性地表达降低水平的一种或多种HLA-II蛋白。

51.根据权利要求48所述的细胞制剂，其中所述一种或多种HLA-II蛋白选自由以下组成的组：HLA-DM、HLA-DO、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR和其组合。

52.一种产生条件性免疫保护的细胞的方法，所述方法包括：

对细胞进行修饰以条件性地表达(i)增加水平的一种或多种免疫检查点蛋白；(ii)减少一种或多种HLA-I蛋白的表达的一种或多种药剂；或者(iii)(i)和(ii)两者。

53.根据权利要求50所述的方法，其中所述一种或多种免疫检查点蛋白的条件性表达和减少一种或多种HLA-I分子的表达的所述一种或多种药剂的条件性表达与在终末分化细胞中限制性表达的基因可操作地偶联。

54.根据权利要求51所述的方法，其中所述终末分化细胞是少突胶质细胞。

55.根据权利要求52所述的方法，其中在所述少突胶质细胞中限制性表达的所述基因选自由以下组成的组：SOX10、MYRF、MAG和MBP。

56.根据权利要求51所述的方法，其中所述终末分化细胞是星形胶质细胞。

57.根据权利要求54所述的方法，其中在所述星形胶质细胞中限制性表达的基因是GFAP或AQP4。

58.根据权利要求51所述的方法，其中所述终末分化细胞是神经元。

59.根据权利要求56所述的方法，其中在所述神经元中限制性表达的所述基因选自由以下组成的组：SYN1、MAP2和ELAV4。

60.根据权利要求51所述的重组基因构建体，其中所述终末分化细胞是多巴胺能神经元，并且在所述多巴胺能神经元中限制性表达的所述基因是TH或DDC。

61.根据权利要求51所述的重组基因构建体，其中所述终末分化细胞是中等棘神经元和皮质中间神经元，并且在所述中等棘神经元和所述皮质中间神经元中限制性表达的所述基因是GAD65或GAD67。

62.根据权利要求51所述的重组基因构建体，其中所述终末分化细胞是胆碱能神经元，并且在所述胆碱能神经元中限制性表达的所述基因是乙酰胆碱转移酶。

63.根据权利要求50所述的方法，其中所述一种或多种免疫检查点蛋白选自程序性死亡配体1(PD-L1)、程序性死亡配体2(PD-L2)、CD47、CD200、CTLA4、HLE-A和其任何组合。

64.根据权利要求50所述的方法，其中所述一种或多种HLA-I蛋白选自由以下组成的组：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G和其组合。

65.根据权利要求50所述的方法，其中减少一种或多种HLA-I蛋白的表达的所述一种或多种药剂选自由以下组成的组：shRNA、miRNA和siRNA。

66.根据权利要求50所述的方法，其中减少一种或多种HLA-I蛋白的表达的所述一种或多种药剂是核酸酶缺陷型CRISPR-Cas9蛋白或锌指核酸酶。

67.根据权利要求50所述的方法，其中减少所述一种或多种HLA-I分子的表达的所述一种或多种药剂是减少β₂M的表达的药剂。

68.根据权利要求50所述的方法，其进一步包括：

对所述细胞进行修饰以条件性地表达减少一种或多种HLA-II分子的表达的一种或多种药剂。

69.根据权利要求66所述的方法，其中减少所述一种或多种HLA-II分子的表达的所述一种或多种药剂是减少II类主要组织相容性复合物反式激活因子(CIITA)的表达的药剂。

70.根据权利要求62所述的方法，其中减少一种或多种HLA-II分子的表达的所述一种或多种药剂选自由以下组成的组：shRNA、miRNA和siRNA。

71.根据权利要求62所述的方法，其中减少一种或多种HLA-II蛋白的表达的所述一种或多种药剂是核酸酶缺陷型CRISPR-Cas9蛋白或锌指核酸酶。

72.根据权利要求50到69中任一项所述的方法，其中所述条件性免疫保护的细胞是哺乳动物细胞。

73.根据70所述的方法，其中所述条件性免疫保护的哺乳动物细胞是人类细胞。

74.根据权利要求50到69中任一项所述的方法，其中所述条件性免疫保护的细胞是多能细胞。

75.根据权利要求72所述的方法，其中所述条件性免疫保护的多能细胞是诱导性多能干细胞。

76.根据权利要求73所述的方法，其中所述条件性免疫保护的多能细胞是胚胎干细胞。

77.根据权利要求50到69中任一项所述的方法，其中所述条件性免疫保护的细胞是祖细胞。

78.根据权利要求75所述的方法，其中所述条件性免疫保护的祖细胞是神经胶质祖细胞。

79.根据权利要求75所述的方法，其中所述条件性免疫保护的祖细胞是少突胶质细胞偏向性祖细胞。

80.根据权利要求75所述的方法，其中所述条件性免疫保护的祖细胞是星形胶质细胞偏向性祖细胞。

81.根据权利要求50所述的方法，其中所述修饰包括：

(i)将序列特异性核酸酶引入到所述细胞中，所述序列特异性核酸酶在位于靶基因的3'非翻译区(UTR)上游的位置处切割所述靶基因，其中所述靶基因是以细胞特异性方式表达的基因，以及

(ii)将重组基因构建体引入到所述细胞中，所述重组基因构建体包括：

(a)一个或多个编码免疫检查点蛋白的核苷酸序列；

(b)对减少一种或多种HLA-I分子的表达的一种或多种药剂进行编码的核苷酸序列；或者

(c)(a)和(b)两者，

其中将所述重组基因构建体在核酸酶切割位点处通过同源重组插入到所述靶基因中。

82.根据权利要求79所述的方法，其中所述序列特异性核酸酶选自由以下组成的组：锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)和RNA引导的核酸酶。

83.根据权利要求80所述的方法，其中所述序列特异性核酸酶是呈Cas9形式的RNA引导的核酸酶。

84.根据权利要求79所述的方法，其中将所述序列特异性核酸酶以蛋白质、mRNA或cDNA的形式引入到所述细胞中。

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