CN111226114A - 用部分立体限定的寡核苷酸子文库鉴定反义寡核苷酸改进的立体限定硫代磷酸酯寡核苷酸变体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及使用部分立体限定的寡核苷酸子文库，鉴定反义寡核苷酸的改进的立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸变体的方法。这些方法允许高效鉴定具有改进特性的立体限定的变体，如增强的体外或体内活性、增强的功效、增强的比活性、降低的毒性、改变的生物分布、增强的细胞或组织摄取和/或增强的靶特异性(脱靶效应减少)。本文公开了多个平行的文库筛选方案，其中优化立体限定的硫代磷酸酯连接的核苷的多个排他性或重叠性短子区域或基序，以鉴定增强的子文库，并且随后合并来自每个选定(改进的)子文库的立体限定的核苷间键样式，以产生增强的立体限定的化合物。
Description
发明领域
本发明涉及使用部分立体限定的寡核苷酸子文库，鉴定反义寡核苷酸的改进的立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸变体的方法。这些方法允许高效鉴定具有改进特性的立体限定的变体，如增强的体外或体内活性、增强的功效、增强的比活性、降低的毒性、改变的生物分布、增强的细胞或组织摄取和/或增强的靶特异性(脱靶效应减少)。
背景技术
最近已经确立，立体限定的硫代磷酸酯反义寡核苷酸变体的产生可以用来创造卓越的药理学多样性，并且如同小分子药物发现范式一样，立体非对映异构体之间看似微小的结构性差异可以产生药理学性能(包括效价、毒性、功效、细胞摄取和生物分布)重大差异的化合物。
在这个方面，传统的硫代磷酸酯寡核苷酸，16个核苷酸长度含有多达215个不同的非对映异构体，可能超过32,000种药理学不同的化合物。存在从这类混合物鉴定药理学最佳化合物的可观潜力，一种可以产生治疗潜力远大于标准立体无规硫代磷酸酯的化合物的可能性。
先前，研究者已经致力于鉴定立体限定的基序，一般是具有Sp或Rp立体限定的基序的连续样式，所述基序可以赋予例如更有效的RNA酶H活性。
例如，WO2015/107425公布了手性限定的寡核苷酸的手性构思，并且在图22中公布，选择性布置3’-SSR-5’位点允许RNA切割速率的适度分化，但引起等位变体之间对寡核苷酸ONT-453的区分增强。
在我们基于细胞的测定法中体外使用LNA缺口聚物寡核苷酸的研究中，以及在体内，我们已经注意到将源于一种LNA缺口聚物的立体限定的硫代磷酸酯键样式应用于另一者时，有明显的不可预测性，并且注意到通常，需要基于个体优化反义寡核苷酸的骨架键的立体化学。
这种不可预测性增加了发现立体限定的寡核苷酸的范式的迫切需求。理想地，原本会产生母体寡核苷酸的每个可能的立体限定的变体，并且选择具有最佳药理学谱的优化的“子代”寡核苷酸。尽管可能的，但这种大规模并行发现过程将非常耗费资源。
WO2016/96938公开了一种通过生成立体限定的变体文库并从文库选择毒性降低的变体，针对更大的耐受性优化硫代磷酸酯寡核苷酸的方法。WO’938包括一个方面，其中迭代筛选允许进一步改进(系列药物发现过程)。WO’938的实施例包括这样的化合物，其中，化合物中的仅一些核苷间键为立体限定的，剩余部分为立体无规。
本发明人已经确定，这种“子文库”方案允许更有效的药物发现过程，其中并非筛选215个16聚非对映异构体，我们可以筛选这样的子文库，其中一些但非全部的硫代磷酸酯核苷间键具有预定的立体限定，从而大大简化文库复杂度，并且选择改进的“子文库”化合物。
WO 2016/079181公开了序列为Gs mCsasasgscsastscscstsGsT的众多的完全立体确定的LNA缺口聚物，其中大写字母代表β-D-氧LNA核苷酸，其在胞外RNA酶H测定法被评价。
Wan等人,Nucleic Acid Research,2014Dec 16；42(22):13456-68报道，尽管立体限定的核苷间键可能影响胞外RNA酶H活性，相对于立体无规PS ASO的混合物，控制测试的RNA酶H活性的缺口聚物ASO的缺口区中PS键的手性没有为治疗性应用提供可察觉益处。
Iwamoto等人,Nature Biotechnology,2017年8月21日；doi:10.1038/nbt.3948披露：硫代磷酸酯(PS)立体化学大幅度影响ASO的药理学特性，并且公布：Sp构型的PS键相对于Rp稳定化，提供立体化学保护作用使药物免于药理学失活。他们还阐明立体纯ASO中的三联立体化学代码3′-SpSpRp，所述三联立体化学代码在体外促进RNA酶H1切割靶RNA并且在小鼠中提供比立体无规ASO更耐久的反应。值得注意地，Iwamoto等人中的补充性数据显示，关于从体外至体内效价而言，缺少可预测性(参见补充性图5)。
立体限定的反义寡核苷酸的药理特性的不可预测性进一步由发明人的工作展示，其中发明人通过使用其中仅反义寡核苷酸的部分具有立体限定的硫代磷酸酯核苷间键并且剩余部分包含或是立体无规硫代磷酸酯连接的核苷的子文库，解决了立体限定的寡核苷酸的不可预测性问题。
发明简述
本发明人已经发现，子文库方案允许确定立体限定的优选基序及它们在寡核苷酸内部的具体位置。在这个方面，子文库方案降低寡核苷酸文库的复杂度并且克服了一些随完全立体限定的寡核苷酸所见的不可预测性。
子文库方案允许鉴定和最佳定位与改进的药理学相关特性相关联的立体限定的短基序，同时避免一些与完全立体限定的寡核苷酸相关的内在不可预测性。
发明人也已经发现，可以通过将从位置不同的子文库鉴定的立体限定的优选短基序合并成单一化合物，大大简化鉴定完全立体限定的优化寡核苷酸的发现过程。
本发明的方法因此导致高效发现位置依赖性立体限定的基序，所述基序可以作为治疗用寡核苷酸使用或可以用作为不太复杂的起点用于发现具有其他立体限定的核苷间键的化合物或全面立体限定的化合物。
通过生成一系列在否则立体无规寡核苷酸中并入立体限定的短基序的独立子文库，其中基序的位置在每个子文库之间不同，可以鉴定立体限定的基序的最佳位置。这称作基序“游走(walk)”方案，其中可以将基序在每个子文库中依次移动一个位置。可以横跨完整化合物或其区域(例如在缺口聚物的缺口区内部)执行基序“游走”方案。短基序可以是连续基序或可以不连续基序。在其最简单形式下，基序可以在否则完全立体无规的硫代磷酸酯寡核苷酸中短至单个核苷间位置，Rp或Sp。例如，一个基于立体无规16聚母体寡核苷酸的全面文库将具有15个“Sp”子文库，每个Sp子文库在15个可能位置之一处具有Sp，剩余的核苷间键为立体无规，和15个“Rp”子文库，每个Rp子文库在15个可能位置之一处具有Rp，剩余的核苷间键为立体无规。在这个方面，通过筛选仅30个寡核苷酸子文库，可以探索骨架中的最大立体化学多样性。
使用具有2个或更多个立体限定的连续核苷间键的短区域，可以执行相似的方案。例如，可以通过该化合物游走4个双联键基序，如RR、SS、SR、RS，或8个三联键基序RRR、RSR、RRS、RSS、SSS、SRS、SSR、SRR，或16个四联键基序RRRR、RRRS、RRSR；RSRR、RRSS；RSRS；RSSR；RSSS、SSSS、SSSR；SSRS；SRSS；SSRR；SRSR；SRRS、SRRR。
或对于5键的键基序：RRRRR、RRRRS、RRRSR、RRRSS、RRSRR；RRSRS、RSRRR、RRSSR；RSRSR；RSSRR；RSSSR、SSSSR、SSSRR；SSRSR；SRSSR；SSRRR；SRSRR；SRRSR、SRRRR、RSRRS、RRSSS；RSRSS；RSSRS；RSSSS、SSSSS、SSSRS；SSRSS；SRSSS；SSRRS；SRSRS；SRRSS或SRRRS。
使用基序游走方案，可以选择体外或体内效价明显增强的立体限定的变体“子文库”。通过合并来自选定子文库的显示改进特性的基序，可以鉴定其他立体限定的化合物，包括完全立体限定的化合物，所述化合物保留在选定子文库中鉴定的改进或被进一步改进。
发明人已经开发了多个平行的文库筛选方案，其中优化立体限定的硫代磷酸酯连接的核苷的多个排他性或重叠性短子区域或基序，以鉴定增强的子文库，并且随后合并来自每个选定(改进的)子文库的立体限定的核苷间键样式，以产生增强的立体限定的化合物。
本发明提供一种用于鉴定反义寡核苷酸的改进的立体限定的硫代磷酸酯变体的方法，所述方法包括以下步骤：
a.向母体寡核苷酸提供限定的序列和核苷修饰样式；
b.生成立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸的文库，所述硫代磷酸酯寡核苷酸保留母体寡核苷酸的限定的序列和核苷修饰样式，
其中
(i)文库的每个成员是包含立体限定的硫代磷酸酯反义寡核苷酸非对映异构体的混合物的子文库，其中混合物的每个成员包含立体限定的核苷间基序区域，其中，立体限定的核苷间基序区域是2–8个(如3–8个)连续核苷的共有区域，其中剩余的核苷间键包含立体无规硫代磷酸酯核苷间键；其中，每个共有的立体限定核苷间键基序区域的长度和位置在文库的每个成员之间相同；并且其中，文库的每个成员在立体限定的核苷间基序区域包含不同的共有的立体限定核苷间基序；
或
(ii)其中文库的每个成员是包含立体限定的硫代磷酸酯反义寡核苷酸非对映异构体的混合物的子文库，其中混合物的每个成员在寡核苷酸中的相同位置处包含共有的立体限定核苷间键基序，其中剩余的核苷间键包含立体无规硫代磷酸酯核苷间键；其中文库的每个成员包含相同的共有的立体限定核苷间键基序，其中共有的立体限定核苷间键基序的位置在文库的每个成员之间不同；
c.对步骤b)中生成的文库的每个成员筛选至少一个改进的特性，如与母体寡核苷酸相比，改进的效价和/或降低的毒性；
d.鉴定一个或多个具有改进特性的文库成员。
本发明提供一种用于鉴定反义寡核苷酸的改进的立体限定的硫代磷酸酯变体的方法，所述方法包括以下步骤：
a.向母体寡核苷酸提供限定的序列和核苷修饰样式；
b.生成立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸的文库，所述硫代磷酸酯寡核苷酸保留母体寡核苷酸的限定序列和核苷修饰样式，其中文库的每个成员是包含立体限定的硫代磷酸酯反义寡核苷酸非对映异构体的混合物的子文库，其中混合物的每个成员包含立体限定的核苷间基序区域，其中，立体限定的核苷间基序区域是2–8个(如3–8个)连续核苷的共有区域，其中剩余的核苷间键包含立体无规硫代磷酸酯核苷间键；其中，每个共有的立体限定核苷间键基序区域的长度和位置在文库的每个成员之间相同；并且其中，文库的每个成员在立体限定的核苷间基序区域包含不同的共有的立体限定核苷间基序；
c.对步骤b)中生成的文库的每个成员筛选至少一个改进的特性，如与母体寡核苷酸相比，改进的效价和/或降低的毒性；
d.鉴定一个或多个具有改进特性的文库成员。
本发明提供一种用于鉴定反义寡核苷酸的改进的立体限定的硫代磷酸酯变体的方法，所述方法包括以下步骤：
a.向母体寡核苷酸提供限定的序列和核苷修饰样式；
b.生成立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸的文库，所述硫代磷酸酯寡核苷酸保留母体寡核苷酸的限定的序列和核苷修饰样式，其中文库的每个成员是包含立体限定的硫代磷酸酯反义寡核苷酸非对映异构体的混合物的子文库，其中混合物的每个成员在寡核苷酸中的相同位置处包含共有的立体限定核苷间键基序，其中剩余的核苷间键包含立体无规硫代磷酸酯核苷间键；其中文库的每个成员包含相同的共有的立体限定核苷间基序，其中共有的立体限定核苷间键基序的位置在文库的每个成员之间不同；
c.对步骤b)中生成的文库的每个成员筛选至少一个改进的特性，如与母体寡核苷酸相比，改进的效价和/或降低的毒性；
d.鉴定一个或多个具有改进特性的文库成员。
本发明提供一种选自以下的化合物(如LNA缺口聚物寡核苷酸)
5′-GsrP mCssPassPasrPgsrPcssPasrPtsrPcssPcsrPtssPGssPT-3‘(SEQ ID NO1)或
5′-GsrP mCssPasrPasrPgsrPcssPassPtsrPcssPcsrPtssPGssPT-3‘(SEQ ID NO1)或
5′-GsrP mCssPasrPasrPgsrPcssPassPtsrPcsrPcssPtsrPGssPT-3‘(SEQ ID NO1)
其中大写字母代表β-D-氧基LNA核苷(处于β-D取向的2’-O-CH2-4’桥接的核苷)，小写字母代表DNA核苷，下标ssP代表SpSp立体限定的硫代磷酸酯键，并且srP代表Rp立体限定的硫代磷酸酯键。mC代表5-甲基胞嘧啶LNA核苷或其可药用盐。
本发明提供一种缀合物，其包含本发明的LNA缺口聚物寡核苷酸和与所述寡核苷酸共价连接的至少一个缀合物部分。在一些实施方案中，缀合物部分能够与脱唾液酸糖蛋白受体结合，如GalNAc缀合物部分。
在本发明的一个实施方案中，对步骤b)中生成的文库的每个成员筛选至少一个改进的特性，如与母体寡核苷酸相比，改进的效价和/或降低的毒性和/或改进的选择性。
本发明提供一种药物组合物，其包含本发明的LNA缺口聚物寡核苷酸或缀合物和可药用稀释剂、载体、盐和/或辅助剂。
本发明提供本发明化合物(如LNA缺口聚物寡核苷酸)或缀合物的可药用盐。
本发明提供用于药物中的本发明化合物，如LNA缺口聚物寡核苷酸或缀合物。
本发明提供用于治疗癌症的本发明化合物，如LNA缺口聚物寡核苷酸或缀合物。
本发明提供用于制备治疗癌症的药物的本发明化合物，如LNA缺口聚物寡核苷酸或缀合物。
附图简述
图1：子基序优化示意图。在这幅图中，我们显示一种母体LNA缺口聚物寡核苷酸的三种平行优化方法，一种中该文库包含化合物A1–A16，其引入各自在核苷间键1–4中具有16种可能的独特四联立体限定的基序之一的16个子文库；第二种中是化合物B1-B16，其引入各自在核苷间键5–8中具有16种可能的独特四联立体限定的基序之一的16个子文库；和第三化合物C1–16，其引入各自在核苷间键9–12中具有16种可能的独特四联立体限定的基序之一的16个子文库。对每个文库筛选改进的特性，并且鉴定表现出改进特性的各个子文库。
图2：组合性子文库子基序优化。在这幅图中，我们显示，图1中代表和筛选的三个文库可以提供三个优化的子文库，一个来自这三个文库的每一者。来自两个或更多个优化子文库(来自独立文库)的立体限定的基序随后可以合并成单一化合物，其可以被进一步评估所述改进特性或不同的改进特性。鉴定的优化化合物可以经历进一步的优化方法步骤，例如以优化不同特性。
图3：单一位置寡核苷酸游走(Walk)–立体无规背景。在这幅图中，在这种情况下使用在一系列子文库中被“游走穿过”的单一R或S立体限定的核苷间键，我们在否则立体无规的骨架中显示本发明的基序游走方法。这种方案理想用于鉴定寡核苷酸内部其中非对映异构体(R或S)之一与寡核苷酸的药理学特性(如改进的特性)正相关或负相关的核苷间位置。它也将鉴定其中R或S之一对实现所需特性(如效价)必需的特定核苷间位置。该信息可以用来制备子文库化合物，作为改进的寡核苷酸或作为用于进一步优化迭代的新的母体寡核苷酸，其中全部的独立非对映异构体具有有益或必需的手性构型。备选地如所示，与每个核苷间位置处最有益或最必需的手性构型(R或S)有关的信息可以合并入单一的优化化合物，其中可以对所述单一的优化化合物进一步评估改进的特性或不同的改进特性。鉴定的优化化合物可以经历进一步的优化方法步骤，例如以优化不同特性。
图4：单一位置寡核苷酸游走–立体纯背景。在这幅图中，在这种情况下使用一系列子文库中经“游走穿过”的单一R或S立体限定的核苷间键，我们在其他立体限定的键的否则立体纯的骨架下显示本发明的基序游走方法。这可以用来鉴定寡核苷酸内部必需或优选的立体限定的核苷间位置和对映体(R或S)并且用来允许鉴定可以经历进一步优化的子文库，如本文所述。
图5：双联游走–立体无规背景。在这幅图中，使用四个可能的立体限定的双联基序SS、RS、SR和RR，我们展示了双联游走。
图6：三联游走–立体无规背景。在这幅图中，使用八个可能的立体限定的三联基序SSS、SSR、RSS、RSR、SRS、SRR、RRR和RRS，我们展示了三联游走。
图7：子基序游走–立体无规背景。在这幅图中，我们在这种情况下显示子基序游走和RSSR游走，以鉴定寡核苷酸内部立体限定的子基序的最佳位置。
图8：在Hela细胞与浓度5μM的完全立体限定的LNA寡核苷酸3温育天后(通过剥裸递送(gymnosis))，体外Hif-1αmRNA敲低。
图9a：Hifa1 13聚物-位置1-4子文库
图9b：Hifa1 13聚物-位置5-8子文库
图9c：Hifa1 13聚物-位置9-12子文库
图10：全面立体无规筛选图–凸显RSSR位置5作为优选的基序
图11：全面立体无规筛选图–凸显RSSR位置依赖性–在Hif1α化合物.优选基序的位置6处未见RSSR效果。
图12：肝脏中的体内靶敲低，其相比于位置6RSSR化合物(#21)和母体化合物(#39)，说明RSSR位置5化合物(#18)的体内效价。
图13a：体内肝脏含量分析，其说明如与位置6RSSR化合物(#21)和母体化合物(#39)相比，RSSR位置5化合物(#18)的体内效价与肝脏中的组织摄取增加相关。
图13b：体内肾脏含量分析，其说明如与位置6RSSR化合物(#21)和母体化合物(#39)相比，RSSR位置5化合物(#18)的体内效价与肾脏中的组织摄取增加相关。
图14a：体内肝脏中的靶敲低：在独立的ApoB靶向化合物中相比基于位置6RSSR(#41)的基序，评价基于位置5RSSR(#42)的基序。与Hif1α位置5RSSR化合物一样，如与立体无规母体化合物相比，存在体内效价显著增加，说明位置5RSSR基序在序列和靶不同的化合物之间可转移。位置6RSSR化合物(#41)不如母体化合物效力强，再次确认反义化合物内部立体限定的子基序的位置依赖性。
图14b：体内肾脏中的靶敲低：在独立的ApoB靶向化合物中相比基于位置6RSSR(#41)的基序，评价基于位置5RSSR(#42)的基序。与Hif1α位置5RSSR化合物一样，如与立体无规母体化合物相比，存在体内效价显著增加，说明位置5RSSR基序在序列和靶不同的化合物之间可转移。位置6RSSR化合物(#41)不如母体化合物效力强，再次确认反义化合物内部立体限定的子基序的位置依赖性。
图15a：体内肝脏含量分析，其说明如与位置6RSSR化合物(#41)和母体化合物(#40)相比，RSSR位置5化合物(#42)的体内效价与肝脏中的组织摄取增加相关。
图15b：体内肾脏含量分析，其说明如与母体化合物(#40)相比，RSSR位置5化合物(#42)的体内效价与肾脏中的组织摄取增加不相关，肾摄取高于位置6化合物(#41)。
图16：来自比较ApoB靶向性母体化合物(#40)、和位置5RSSR(#42)化合物和位置6RSSR(#41)化合物的体内实验的总血清胆固醇降低，说明如与母体化合物(#40)和位置6RSSR化合物(#41)二者相比，位置5RSSR化合物(#42)的体内药理学显著增加。
图17：263种具有3-9-4布局的16聚缺口聚物化合物的统计分析，其说明对于独立序列(如与先前实例相比)和不同长度(16)和布局的寡核苷酸，位置5RSSR基序是产生高度强力化合物的优选基序。
图18：263种具有3-9-4布局的16聚缺口聚物化合物的统计分析，其说明对于独立序列(如与先前实例相比)和不同长度(16)和布局的寡核苷酸，位置5RSSR基序是产生高度强力化合物的优选基序。
图19：利用了使用本发明方法鉴定的立体限定的子代寡核苷酸之间的特性多样性来鉴定具有改进特性的独立非对映异构体的图示。
图20：单一位置基序游走。生成一个选定的立体无规19聚LNA缺口聚物母体化合物和两个文库，一个文库中跨寡核苷酸游走单一Sp立体限定的核苷间键，从而文库的每个成员相对于Sp立体限定的键的位置而言不同，并且第二文库中跨寡核苷酸游走单一Rp立体限定的核苷间键，从而文库的每个成员相对于Rp立体限定的键的位置而言不同。在这个实验中，剩余的核苷间键是立体无规的。在U251细胞中使用1μM剥裸递送，对每个文库的每个成员分析针对mRNA靶的效价(关于方法，参见实施例6)。测定每个文库成员的mRNA靶敲低。结果鉴定到其中立体限定(Sp或Rp)是寡核苷酸效价的明显决定因素的4个位置和其中立体化学不是寡核苷酸效价的有意义决定因素的7个位置。这种方案允许设计部分立体限定的化合物，其在立体相关位置包含优选的立体限定的核苷间键并且在立体不相关位置包含立体无规核苷间键。这类优化的子文库化合物可以在(例如本发明的)进一步优化方法中用于鉴定具有其他改进特性的其他立体限定的变体，包括完全立体限定的变体。
图21：子文库方案：选择一种立体无规19聚LNA缺口聚物母体化合物，并且生成两类32个子文库。19聚LNA缺口聚物在5’和3’末端包含LNA，如图21上以阴影的变化所示。较浅阴影表示DNA核苷，而较深阴影表示LNA核苷的位置。
通过立体限定5'末端中的前五个核苷间键，产生第一子文库。通过立体限定3'末端中的最后五个核苷间键，产生第二文库。在这个实验中，剩余的核苷间键是立体无规的。在图21上，箭头表示已经在其立体限定核苷间键。
图22：显示下述测定法的结果，其中在U251细胞中使用1μM剥裸递送，对图21的第一子文库的每个成员分析针对mRNA靶的效价(关于方法，参见实施例6)。测定每个文库成员的mRNA靶敲低。
图23：显示下述测定法的结果，其中在U251细胞中使用1μM剥裸递送，对图21的第二子文库的每个成员分析针对mRNA靶的效价(关于方法，参见实施例6)。测定每个文库成员的mRNA靶敲低。结果显示，第一文库包含变异性少于第二文库的较多数目的强力寡核苷酸。这种方案允许设计部分立体限定的化合物，其在立体相关位置包含优选的立体限定的核苷间键并且在立体不相关位置包含立体无规核苷间键。这类优化的子文库化合物可以在(例如本发明的)进一步优化方法中用于鉴定具有其他改进特性的其他立体限定的变体，包括完全立体限定的变体。
本发明的具体描述
本发明提供通过使用子文库的文库，鉴定母体寡核苷酸的改进的立体限定的变体的方法，所述方法基于“立体限定的基序游走”，其中立体限定的短基序安置在文库的每个成员之间的不同核苷间位置处(位置多样性)。
本发明提供通过使用子文库的文库，鉴定母体寡核苷酸的改进的立体限定的变体的方法，所述方法基于在寡核苷酸内部的相同核苷间位置处产生不同的立体限定的基序，其中文库的每个成员在寡核苷酸的指定位置具有独特的立体限定的基序。
本发明的方法可以迭代和/或组合使用，并且还可以与立体无规发现方法组合。
立体限定的基序游走：
本发明提供一种用于鉴定反义寡核苷酸的改进的立体限定的硫代磷酸酯变体的方法，所述方法包括以下步骤：
a.向母体硫代磷酸酯寡核苷酸提供限定的序列和核苷修饰样式；
b.生成立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸的文库，所述硫代磷酸酯寡核苷酸保留母体寡核苷酸的限定的序列和核苷修饰样式，其中文库的每个成员[每个成员可以称作非对映异构体子文库]包含立体限定的硫代磷酸酯反义寡核苷酸的混合物，其中混合物的每个成员[子文库]在寡核苷酸中的相同位置处包含共有的立体限定核苷间基序，其中剩余的核苷间键包含立体无规硫代磷酸酯核苷间键；其中文库的每个成员包含相同的共有的立体限定的核苷间键基序，其中共有的立体限定核苷间键基序的位置在文库的每个成员之间不同；
c.对步骤b)中生成的文库的每个成员筛选至少一个改进的特性，如与母体寡核苷酸相比，改进的效价和/或降低的毒性。
d.鉴定一个或多个具有改进特性的文库成员。
在一些实施方案中，在设计文库时，共有的立体限定核苷间基序在文库的成员之间按1个核苷间位置如此移动，从而跨寡核苷酸的核苷间键骨架“游走”共有的立体限定核苷间基序。应当理解这种基序-游走方案可以跨寡核苷酸的整个核苷间键骨架或其连续核苷酸序列适用，或在一些实施方案中跨寡核苷酸的部分或其连续核苷酸序列(例如跨缺口聚物的缺口区)适用。
在本发明方法(如基序游走方法)的一些实施方案中，共有的立体限定核苷间键基序的长度是1-6个核苷间键，如2、3、4或5个核苷间键。
在本发明方法(如基序游走方法)的一些实施方案中，共有的立体限定核苷间键基序包含
-选自SS；RR；RS和SR的双联键基序；或
-选自RRR、RSR、RRS、RSS、SSS、SRS、SSR和SRR的三联键基序；或
-选自RRRR、RRRS、RRSR；RSRR、RRSS；RSRS；RSSR；RSSS、SSSS、SSSR；SSRS；SRSS；SSRR；SRSR；SRRS和SRRR的四联键基序；或
-选自RRRRR、RRRRS、RRRSR、RRRSS、RRSRR；RRSRS、RSRRR、RRSSR；RSRSR；RSSRR；RSSSR、SSSSR、SSSRR；SSRSR；SRSSR；SSRRR；SRSRR；SRRSR、SRRRR、RSRRS、RRSSS；RSRSS；RSSRS；RSSSS、SSSSS、SSSRS；SSRSS；SRSSS；SSRRS；SRSRS；SRRSS和SRRRS的五联键基序。
在本发明方法(如基序游走方法)的一些实施方案中，共有的立体限定核苷间键基序是或包含RSSR。发明人已经发现，在一些情况下，RSSR基序可以赋予寡核苷酸增强的特性，但是这在寡核苷酸内部呈高度位置依赖性，并且将RSSR位置移动单一核苷间位置可能完全移除与RSSR基序相关的任何益处。
在一些实施方案中，剩余的核苷间键(背景骨架键)，而非例如用于基序游走方法中的立体限定的核苷间基序，是立体无规核苷间键，如立体无规硫代磷酸酯核苷间键。在一些实施方案中，背景骨架键是立体纯键，即是全R或是全S(如全Rp或全Sp)的立体限定的键。在一些实施方案中，骨架键可以包含一个或多个立体限定的核苷间键，如已经先前鉴定为有益如与改进的特性相关的键。
在本发明方法的一些实施方案中，文库是全面寡核苷酸游走，即，该文库包含寡核苷酸内部共有的立体限定核苷间键基序、其连续核苷酸序列或缺口聚物区域F、G或F’或合并序列F-G-F’的全部位置变体。
在一些实施方案中，通过立体限定缺口聚物的5'末端或3’末端区中的核苷间键，产生两个子文库。在一个实施方案中，例如在5'端立体限定1、2、3、4或5个连续核苷间键。在一个实施方案中，在3'端立体限定1、2、3、4或5个连续核苷间键，同时其余的核苷间键是立体无规的。可以在如本文所述的五联键基序当中选择这种立体限定。
在本发明方法的一些实施方案中，改进的特性选自增强的活性、增强的效价、增强的功效、增强的比活性、降低的毒性，如肝毒性降低或肾毒性降低、改变的生物分布、增强的细胞或组织摄取、和/或增强的靶特异性。
在本发明方法的一些实施方案中，在体外分析改进的特性。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸是招募RNA酶H的寡核苷酸如反义寡核苷酸缺口聚物寡核苷酸。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸是LNA缺口聚物寡核苷酸。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸的长度是7–26个核苷酸长度，如12–24个核苷酸长度。
连续子基序优化
本发明提供一种用于鉴定反义寡核苷酸的改进的立体限定的硫代磷酸酯变体的方法，所述方法包括以下步骤：
a.向母体寡核苷酸提供限定的序列和核苷修饰样式；
b.生成立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸的文库，所述硫代磷酸酯寡核苷酸保留母体寡核苷酸的限定的序列和核苷修饰样式，
其中，文库的每个成员是包含立体限定的硫代磷酸酯反义寡核苷酸对映异构体的混合物的子文库，其中混合物的每个成员[子文库]包含立体限定的核苷间基序区域，
其中，立体限定的核苷间基序区域是2–8个(如3–8个，如4–8个)连续核苷的共有区域，其中剩余的核苷间键包含立体无规硫代磷酸酯核苷间键；
其中，每个立体限定的核苷间键基序区域的长度和位置在文库的每个成员之间相同；
并且其中，文库的每个成员在立体限定的核苷间基序区域包含不同的共有的立体限定核苷间基序；
c.对步骤b)中生成的文库的每个成员筛选至少一个改进的特性，如与母体寡核苷酸相比，改进的效价和/或降低的毒性；
d.鉴定一个或多个具有改进特性的文库成员。
本发明的上述方法涉及通过产生变体寡核苷酸文库，优化骨架核苷间键的限定子区域，其中所述变体寡核苷酸各自在子区域内部具有不同的立体限定的子基序。这种方案允许选择立体限定的变体，所述变体具有跨子区域的优化的立体限定子基序。以举例方式，该文库包含这样的成员，其中每个成员具有安置在每个成员之间相同位置的独有核苷间基序，例如对于二核苷酸，它将产生两种变体(R或S)；对于三核苷酸区域，这个将产生具有RR、SS、SR或RS核苷间基序的四种变体(文库成员)。对于四核苷酸区域，这将产生具有RRR、RSR、RRS、RSS、SSS、SRS、SSR或SRR核苷间基序的八种变体(文库成员)。
对于5核苷酸区域，这将产生具有RRRR、RRRS、RRSR；RSRR、RRSS；RSRS；RSSR；RSSS、SSSS、SSSR；SSRS；SRSS；SSRR；SRSR；SRRS或SRRR核苷间基序的16种变体(文库成员)。
对于6核苷酸区域，这将产生具有RRRRR、RRRRS、RRRSR、RRRSS、RRSRR；RRSRS、RSRRR、RRSSR；RSRSR；RSSRR；RSSSR、SSSSR、SSSRR；SSRSR；SRSSR；SSRRR；SRSRR；SRRSR、SRRRR、RSRRS、RRSSS；RSRSS；RSSRS；RSSSS、SSSSS、SSSRS；SSRSS；SRSSS；SSRRS；SRSRS；SRRSS或SRRRS的32种变体(文库成员)。
适当地，在一些实施方案中，剩余的核苷间键是立体无规核苷间键，或剩余的硫代磷酸酯核苷间是立体无规的硫代磷酸酯核苷间键。然而认识到，在一些实施方案中，文库成员中一个或多个剩余的核苷间键也可以是立体限定的，例如一个或多个或全部剩余的核苷间键可以是在寡核苷酸或连续核苷酸序列中其他地方优化立体限定的核苷间键的结果，这种情况下每个成员将保留这类优化的立体限定的核苷间键。
备选地，在一些实施方案中，立体限定的基序可以是不连续基序，包含2–8个如3-8个连续核苷的共有区域，和位于寡核苷酸内部其他地方的其他核苷间键。
在本发明方法(如连续基序优化方法)的一些实施方案中，每个立体限定的核苷间键基序区域的长度是3、4、5或6个连续核苷酸(或2、3、4或5个核苷键)，优选地至少4个连续核苷酸(即至少三个核苷键)。
在本发明方法(如连续基序优化方法)的一些实施方案中，每个立体限定的核苷间键基序区域是3或4个核苷键。
在本发明方法(如连续基序优化方法)的一些实施方案中，文库包含在立体限定的核苷间键基序区域内部每个可能的立体限定的核苷间键基序的成员。
在本发明方法(如连续基序优化方法)的一些实施方案中，文库的每个成员各自包含
选自RRR、RSR、RRS、RSS、SSS、SRS、SSR、SRR的四联键基序，或
选自RRRR、RRRS、RRSR；RSRR、RRSS；RSRS；RSSR；RSSS、SSSS、SSSR；SSRS；SRSS；SSRR；SRSR；SRRS、SRRR的四联键基序，
选自RRRRR、RRRRS、RRRSR、RRRSS、RRSRR；RRSRS、RSRRR、RRSSR；RSRSR；RSSRR；RSSSR、SSSSR、SSSRR；SSRSR；SRSSR；SSRRR；SRSRR；SRRSR、SRRRR、RSRRS、RRSSS；RSRSS；RSSRS；RSSSS、SSSSS、SSSRS；SSRSS；SRSSS；SSRRS；SRSRS；SRRSS或SRRRS的五联键基序。
在本发明方法(如连续基序优化方法)的一些实施方案中，文库是全面的，即包含立体限定的核苷间基序区域的每个可能的立体限定的核苷间基序的至少一个成员，例如本文提及的三联、四联或五联键基序。
在一些实施方案中，文库包含每个可能的立体限定的双联核苷间基序的至少一个成员，如双联键基序RR、SS、RS&SR。
在一些实施方案中，文库包含每个可能的立体限定的三联核苷间基序的至少一个成员，如三联键基序RRR、RSR、RRS、RSS、SSS、SRS、SSR&SRR。
在一些实施方案中，文库包含每个可能的立体限定的四联核苷间基序的至少一个成员，如四联键基序RRRR、RRRS、RRSR；RSRR、RRSS；RSRS；RSSR；RSSS、SSSS、SSSR；SSRS；SRSS；SSRR；SRSR；SRRS&SRRR。
在一些实施方案中，文库包含每个可能的立体限定的五联核苷间基序的至少一个成员，如五联键基序RRRRR、RRRRS、RRRSR、RRRSS、RRSRR；RRSRS、RSRRR、RRSSR；RSRSR；RSSRR；RSSSR、SSSSR、SSSRR；SSRSR；SRSSR；SSRRR；SRSRR；SRRSR、SRRRR、RSRRS、RRSSS；RSRSS；RSSRS；RSSSS、SSSSS、SSSRS；SSRSS；SRSSS；SSRRS；SRSRS；SRRSS&SRRRS。
在本发明方法(如连续基序优化方法)的一些实施方案中，在每个文库成员[或子文库]的反义寡核苷酸内部至少30％，如至少40％或至少50％，或大部分的或全部的剩余核苷间键是立体无规硫代磷酸酯核苷间键。
在本发明方法(如连续基序优化方法)的一些实施方案中，该方法还包括步骤
e)选择在步骤d)中鉴定的至少一个改进的寡核苷酸变体
f)生成立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸的文库，所述硫代磷酸酯寡核苷酸保留改进的寡核苷酸变体的限定的序列和核苷修饰样式和相同的立体限定的核苷间基序，其中文库的每个成员包含一个或多个其他立体限定的硫代磷酸酯核苷间键[即不在立体限定的核苷间基序或共有区域内部]，并且其中文库的每个成员就其他立体限定的硫代磷酸酯核苷间键的样式而言不同，
g.对步骤f)中生成的文库的每个成员筛选至少一个改进的特性，所述特性可能与如步骤c)中所分析的不同的改进特性相同。
在本发明方法(如连续基序优化方法)的一些实施方案中，该方法的步骤b包括产生多个文库，其中每个文库如步骤b中那样定义并且其中每个共有的立体限定核苷间键基序区域的位置在多个文库的每者之间不同，其中每个文库可以是如前述任一项权利要求中所限定的文库。
在本发明方法(如连续基序优化方法)的一些实施方案中，该方法还包括步骤：从多个文库的每者鉴定改进的立体限定的变体，并且从多个文库制备又一立体限定的变体，其包含每个鉴定的改进的立体限定的变体的立体限定的核苷间键基序。
在本发明方法(如连续基序优化方法)的一些实施方案中，筛选多个文库的至少两者或至少三者，以从多个文库的每者鉴定改进的立体限定的变体，其中每个文库如步骤b中那样定义。
在本发明方法(如连续基序优化方法)的一些实施方案中，又一立体限定的变体寡核苷酸或其连续核苷酸序列是完全立体限定的硫代磷酸酯序列。
本发明还提供改进的LNA缺口聚物硫代磷酸酯寡核苷酸，其中LNA缺口聚物包含5个连续核苷，其中5个连续核苷之间硫代磷酸酯核苷间键的样式是RSSR，其中R是Rp立体限定的硫代磷酸酯核苷间键，并且S是Sp立体限定的硫代磷酸酯核苷间键，其中如与相同具有立体无规硫代磷酸酯核苷间键的LNA缺口聚物相比，该LNA缺口聚物具有改进的体外或体内效价。在一些实施方案中，RSSR基序存在于缺口聚物的缺口区内部，如位于区域F的3’末端核苷和区域F’的5’末端核苷内部。
在本发明方法的一些实施方案中，文库是全面寡核苷酸游走，即，该文库包含寡核苷酸内部共有的立体限定核苷间键基序、其连续核苷酸序列或缺口聚物区域F、G或F’或合并序列F-G-F’的全部位置变体。
在本发明方法的一些实施方案中，改进的特性选自增强的活性、增强的效价、增强的功效、增强的比活性、降低的毒性、改变的生物分布、增强的细胞或组织摄取、和/或增强的靶特异性。
在本发明方法的一些实施方案中，在体外分析改进的特性。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸是招募RNA酶H的寡核苷酸如反义寡核苷酸缺口聚物寡核苷酸。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸是LNA缺口聚物寡核苷酸。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸的长度是7–26个核苷酸长度，如12–24个核苷酸长度。
再迭代筛选方法
本发明提供一种用于鉴定反义寡核苷酸的一种或多种立体限定的改进硫代磷酸酯变体的方法，所述方法包括以下步骤：
a.向母体寡核苷酸提供限定的序列和核苷修饰样式；
b.生成立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸的文库，所述硫代磷酸酯寡核苷酸保留母体寡核苷酸的限定序列和核苷修饰样式，其中文库的每个成员是包含立体限定的硫代磷酸酯反义寡核苷酸的混合物的子文库，其中混合物的每个成员[子文库]包含共有的立体限定核苷间基序，其中，共有的立体限定核苷间基序是3–8个连续核苷的共有区域，其中剩余的核苷间键包含立体无规硫代磷酸酯核苷间键；其中，每个共有的立体限定核苷间键基序的长度和位置在文库的每个成员之间相同；并且其中，文库的每个成员包含不同的共有的立体限定核苷间基序；
c.对步骤b)中生成的文库的每个成员筛选至少一个改进的特性，如与母体寡核苷酸相比，改进的效价和/或降低的毒性；
d.鉴定一个或多个具有改进特性的文库成员。
e.选择在步骤d)中鉴定的至少一个改进的文库成员
f.生成立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸的文库，所述硫代磷酸酯寡核苷酸保留限定的序列和核苷修饰样式和相同的立体限定的核苷间基序，其中文库的每个成员包含一个或多个其他立体限定的硫代磷酸酯核苷间键[不在立体限定的核苷间基序或共有区域内部]，并且其中文库的每个成员就其他立体限定的硫代磷酸酯核苷间键的样式而言不同，
g.对步骤f)中生成的文库的每个成员筛选至少一个改进的特性，所述特性可能与如步骤c)中所分析的不同的改进特性相同。
联合子文库方案
本发明的立体限定的基序游走和连续子基序优化方法允许鉴定如与立体无规母体寡核苷酸相比，具有改进的特性且具有降低的复杂度(不同的非对映异构体数目)的子文库。
这些鉴定的优化的部分立体限定的(子文库)化合物的方法可以迭代或组合使用，以进一步降低复杂度(不同非对映异构体的数目)并进一步改进选择的化合物。在这个方面，针对连续子基序优化的立体限定的游走可以鉴定优选立体限定的子基序，并且在进一步的优化轮次中，可以合并从任意方法获得的优选立体限定的子基序以产生进一步优化的化合物。
以举例方式，通过产生母体寡核苷酸的几个独立文库，其中连续子基序的位置在每个文库之间不同，发明人已经显示，通过合并从每个文库鉴定的立体限定的优化基序，可以鉴定其他增强的立体限定的寡核苷酸。实际上，如实例中所示，发明人取得一种13聚LNA缺口聚物立体无规母体化合物，并且产生了三个独立文库，一个文库在否则立体无规骨架(16种可能变体)的位置1-4具有4个键基序，第二文库则在位置5–8具有这些键基序(16种可能变体)，和第三文库则在位置9-12具有这些键基序(16种可能变体)–即总计48种化合物。从三个文库的每者中选择最强力的变体，并且随后来自三种选定化合物的三个立体限定的基序合并成单一完全立体限定的化合物。发现所得到的完全立体限定的化合物具有进一步改进的效价，并且其与先前已经通过筛选完全立体限定的化合物的高度复杂的完全随机化文库所鉴定的化合物相同。
本发明提供一种用于鉴定反义寡核苷酸的改进的立体限定的硫代磷酸酯变体的方法，所述方法包括以下步骤：
a.向母体寡核苷酸或母体寡核苷酸布局提供限定的序列和核苷修饰样式；
b.进行多次本发明的立体限定的基序游走或连续子基序优化方法，以鉴定多于一种部分立体限定的变体，如与母体寡核苷酸相比，所述变体各自具有至少一个改进的特性，其中多于一种鉴定的部分立体限定的变体就它们的立体限定的子基序的位置而言各自不同；
c.制备立体限定的变体，所述变体包含来自步骤b的多于一种部分立体限定的变体的立体限定的子基序。
在任选的步骤d.中，还可以评估步骤c.中制备的立体限定的变体，以确定一个或多个其他改进的特性，所述特性可以与不同的一种或多种特性(如步骤b中评估的那些)相同。
将认识到，相对于步骤b.的部分立体限定的变体，步骤c.的产物将具有降低的复杂度(非对映异构体更少)，并且在一些实施方案中，步骤c.的产物可以是完全立体限定的寡核苷酸(或其连续核苷酸序列可以是完全立体限定的)。
在一些实施方案中，步骤b包括多个可以平行(同时)或串联(依次)进行的连续子基序优化步骤。如实施例中所示，在一些实施方案中，来自连续子基序优化文库之每者的子基序一起覆盖寡核苷酸或其连续核苷酸序列的全部硫代磷酸酯核苷间键。这种允许制备步骤c中的完全立体限定的变体。
定义
寡核苷酸
如本文所用的术语“寡核苷酸”如技术人员通常理解其那样定义为包含两个或更多个共价连接的核苷的分子。这类共价结合的核苷也可以称作核酸分子或寡聚物。寡核苷酸常在实验室中通过固相化学合成法产生，随后纯化。当提到寡核苷酸的序列时，指核碱基部分或其修饰物、共价连接的核苷酸或核苷的序列或顺序。本发明的寡核苷酸是人造的，并且是化学合成的，并且一般是纯化或分离的。本发明的寡核苷酸可以包含一个或多个修饰的核苷或核苷酸。
反义寡核苷酸
如本文所用的术语“反义寡核苷酸”定义为能够通过与靶核酸、尤其与靶核酸上的连续序列杂交调节靶基因表达的寡核苷酸。反义寡核苷酸基本上不是双链的并因此不是siRNA或shRNA。在一些实施方案中，反义寡核苷酸能够招募RNA酶H，如缺口聚物寡核苷酸。
连续核苷酸序列
术语“连续核苷酸序列”指与靶核酸互补的寡核苷酸区域。本文中该术语与术语“连续核碱基序列”和术语“寡核苷酸基序序列”互换使用。在一些实施方案中，寡核苷酸的全部核苷酸构成连续核苷酸序列。在一些实施方案中，寡核苷酸包含连续核苷酸序列并且可以任选地包含其他核苷酸，例如可以用来将官能团接合至连续核苷酸序列的核苷酸接头区。核苷酸接头区可以互补于或可以不互补于所述靶核酸。
核苷酸
核苷酸是寡核苷酸和多核苷酸的结构单位并且出于本发明目的，包括天然存在的和非天然存在的核苷酸。自然界中，核苷酸如DNA和RNA核苷酸包含核糖糖部分、核碱基部分和一个或多个磷酸酯基团(它们不存在于核苷中)。核苷和核苷酸还可以可互换地称作“单位”或“单体”。
修饰的核苷
如本文所用的术语“修饰的核苷”或“核苷修饰”指与等同DNA核苷或RNA核苷相比，如通过引入一个或多个糖部分或(核)碱基部分修饰而修饰的核苷。在一个优选实施方案中，修饰的核苷包含修饰的糖部分。术语“修饰的核苷”也可以在本文中与术语“核苷类似物”或修饰的“单位”或修饰的“单体”互换使用。具有未修饰的DNA或RNA糖部分的核苷在本文中称作DNA核苷或RNA核苷。在DNA核苷或RNA核苷的碱基区域中具有修饰的核苷，如果允许Watson Crick碱基配对，通常仍称作DNA或RNA。
立体无规硫代磷酸酯键
硫代磷酸酯键是其中非桥接氧之一已经被硫取代的核苷间磷酸酯键。硫对非桥接氧之一的取代引入了手性中心并且从而在单一硫代磷酸酯寡核苷酸内部，每个硫代磷酸酯核苷间键将处于S(Sp)或R(Rp)立体同工型。这类核苷间键称作“手性核苷间键”。通过比较，磷酸二酯核苷间键是非手性的，因为它们具有两个非末端氧原子。
依据首次发表于以下文献中的标准Cahn-Ingold-Prelog规则(CIP优先规则)确定立构中心手性的命名：Cahn,R.S.；Ingold,C.K.；Prelog,V.(1966)."Specification ofMolecular Chirality".Angewandte Chemie International Edition.5(4):385–415.doi:10.1002/anie.196603851。
在标准寡核苷酸合成期间，偶联和后续硫化的立体选择性不受控。出于这个原因，每个硫代磷酸酯核苷间键的立体化学随机地是Sp或Rp，并且因而通过传统寡核苷酸合成产生的硫代磷酸酯寡核苷酸实际上可以按多达2X种不同的硫代磷酸酯非对映异构体存在，其中X是硫代磷酸酯核苷间键的数目。这类寡核苷酸在本文中称作立体无规硫代磷酸酯寡核苷酸，并且不含有任何立体限定的核苷间键。立体无规硫代磷酸酯寡核苷酸因此是源自非立体限定的合成的独立非对映异构体的混合物。在这种情况下，混合物定义为至多2X种不同的硫代磷酸酯非对映异构体。
立体限定的核苷间键
立体限定的核苷间键是向寡核苷酸引入手性中心的核苷间键，所述手性中心优势地按一种立体异构形式R或S存在于独立寡核苷酸分子的群体内部。
应当认识到，本领域使用的立体选择性寡核苷酸合成方法一般在每个核苷间键立构中心提供至少约90％或至少约95％的立体选择性，并且从而多达约10％，如约5％的寡核苷酸分子可以具有备选性立体异构体形式。
在一些实施方案中，每个立体限定的硫代磷酸酯立构中心的立体选择性是至少约90％。在一些实施方案中，每个立体限定的硫代磷酸酯立构中心的立体选择性是至少约95％。
立体限定的硫代磷酸酯键
立体限定的硫代磷酸酯键是在独立寡核苷酸分子的群体内部已经按Rp或Sp构型(如每个立构中心(Rp或Sp)处至少约90％或至少约95％立体选择性)化学合成的硫代磷酸酯键，并且从而多达约10％，如约5％的寡核苷酸分子可以具有备选性立体异构体形式。
下文展示硫代磷酸酯核苷间键的立体构型
其中3’R基团代表毗邻核苷(5’核苷)的3’位置，并且5’R基团代表毗邻核苷(3’核苷)的5’位置。
本文中，也可以将Rp核苷间键表示为srP，并且可以将Sp核苷间键表示为ssP。
在一些实施方案中，每个立体限定的硫代磷酸酯立构中心的立体选择性是至少约97％。在一些实施方案中，每个立体限定的硫代磷酸酯立构中心的立体选择性是至少约98％。在一些实施方案中，每个立体限定的硫代磷酸酯立构中心的立体选择性是至少约99％。
在一些实施方案中，立体选择性核苷间键在至少97％，如至少98％，如至少99％，或(基本上)全部的存在于寡核苷酸分子群体内的寡核苷酸分子中处于相同的立体异构形式。
可以在仅具有非手性骨架(即磷酸二酯)的模型系统中测量立体选择性。可以通过例如将立体限定的单体偶联至以下模型系统“5’t-po-t-po-t-po 3’”，测量每个单体的立体选择性。这种测量的结果随后将给出：可以使用HPLC分离的5’DMTr-t-srp-t-po-t-po-t-po 3’或5’DMTr-t-ssp-t-po-t-po-t-po 3’。通过积分来自两种可能化合物的UV信号并且得到这些化合物的比率(例如98:2、99:1或>99:1)，确定立体选择性。
应当理解，特定的单一非对映异构体(单一立体限定的寡核苷酸分子)的立体纯度％将是每个核苷间位置处限定的立构中心的偶联选择性和待引入的立体限定的核苷间键的数目的函数。以举例方式，如果每个位置处的偶联选择性是97％，则具有15个立体限定的核苷间键的立体限定的寡核苷酸的所得纯度将是0.9715，即如与37％的其他非对映异构体相比，所需的非对映异构体为63％。可以在合成后，通过纯化(例如通过HPLC，如离子交换色谱或反相色谱)改进限定的非对映异构体的纯度。
在一些实施方案中，立体限定的寡核苷酸指其中群体的至少约40％(如至少约50％)属于所需非对映异构体的寡核苷酸群体。
换而言之，在一些实施方案中，立体限定的寡核苷酸指其中群体的至少约40％(如至少约50％)由所需(特定)的立体限定的核苷间键基序(也称作立体限定的基序)组成的寡核苷酸群体。
对于包含立体无规核苷间立体中心和立体限定的核苷间立体中心的立体限定的寡核苷酸，参考保留限定的立体限定的核苷间键基序的寡核苷酸群体的％，确定立体限定的寡核苷酸的纯度，计算时不考虑立体无规键。
立体限定的寡核苷酸
立体限定的寡核苷酸是其中核苷间键至少之一是立体限定的核苷间键的寡核苷酸。
立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸是其中核苷间键至少之一是立体限定的硫代磷酸酯核苷间键的寡核苷酸。
立体限定的寡核苷酸的子文库
包含立体无规核苷间键和立体限定的核苷间键的寡核苷酸在本文中称作子文库。子文库是完全立体无规寡核苷酸的对映异构混合物的复杂度较低的混合物，因此代表全部可能非对映异构体的子集。例如，理论上，全硫代磷酸酯立体无规16聚物是215种非对映异构体(32768)的混合物，而其中硫代磷酸酯核苷间键之一是立体限定的子文库将具有半数的文库复杂度(16384种非对映异构体)(2个立体限定的键＝8192种非对映异构体；3个立体限定的键＝4096种非对映异构体，4个立体限定的键＝2048种非对映异构体，5个立体限定的键＝1024种非对映异构体)(假定100％立体选择性偶联功效)。
立体限定的核苷间基序
立体限定的核苷间基序，本文中也称作立体限定的基序，指立体限定的寡核苷酸中立体限定的R和S核苷间键的样式，并且按5’–3’书写。例如，立体限定的寡核苷酸
5'-GsrP CssP assP asrP gsrP cssP asrP tsrP cssP csrP tssP GssP T-3‘(SEQ ID NO 1)，
具有立体限定的核苷间基序RSSRSRRSRSS。
对于立体限定的寡核苷酸的子文库而言，这些子文库将在否则立体无规背景(任选地，具有一个或多个非手性核苷间键，例如磷酸二酯键)下含有共有的立体限定核苷间基序。
例如，寡核苷酸5'-Gs Cs as as gsrP cssP assP tsrP cs cs ts Gs T-3‘(SEQ ID NO1)具有立体限定的核苷间基序XXXXRSSRXXXX，X代表立体无规硫代磷酸酯核苷间键(作为下标s显示于化合物中)。在这个实例中将指出，第一个5’立体限定的核苷间键是从5'末端起的第5个核苷间键(在位置4和5处的核苷之间)，并且从而以上基序也称作(核苷间键)位置5处的“RSSR”基序。
在一系列毗邻的立体限定的核苷间键(即位于连续核苷之间)上产生立体限定的核苷间基序(立体限定的基序)时，核苷间基序在本文中称作连续的立体限定的核苷间基序(连续的立体限定的基序)。应当理解，连续的立体限定的基序必须包含两个或更多个毗邻的立体限定的核苷间键。
在子文库混合物中，立体限定的核苷间基序也可以是不连续的，即立体限定的核苷间键为一个或多个种立体无规核苷间键所分散。
例如化合物5'-Gs mCssP as as gsrP cssP as ts cs cssP tsrP GssP T-3‘(SEQ ID NO1)具有一个不连续基序XSXXRSXXXSRS
完全立体限定的寡核苷酸
完全立体限定的寡核苷酸是这样的寡核苷酸，其中寡核苷酸内部存在的全部手性核苷间键均是立体限定的。完全立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸是这样的寡核苷酸，其中寡核苷酸内部存在的全部手性核苷间键均是立体限定的硫代磷酸酯核苷间键。
应当理解，在一些实施方案中，完全立体限定的寡核苷酸可以包含一个或多个、非手性核苷间键，如磷酸二酯核苷间键，例如，磷酸二酯键可以用于缺口聚物的侧翼区内部，和/或当连接末端核苷时，如用于连接缺口聚物序列和缀合物基团的DNA核苷的短区域(生物可切割接头)之间。
在完全立体限定的寡核苷酸的一些实施方案中，存在于寡核苷酸或其连续核苷酸区域(如F-G-F’缺口聚物)中的全部核苷间键均是立体限定的核苷间键，如立体限定的硫代磷酸酯核苷间键。
母体寡核苷酸
母体寡核苷酸是具有限定的核碱基序列(基序序列)和核苷修饰样式(布局)的寡核苷酸。在本发明的方法中，母体寡核苷酸一般是应通过使用本发明方法，通过产生一个或多个文库改进的寡核苷酸，在所述文库中一个或多个(2+)核苷间键的立体化学是立体限定的并且异于母体寡核苷酸的立体化学。
在一些实施方案中，母体寡核苷酸是立体无规硫代磷酸酯寡核苷酸。在一些实施方案中，母体寡核苷酸或其连续核苷酸序列是立体无规硫代磷酸酯寡核苷酸缺口聚物。缺口聚物寡核苷酸可以用于抑制靶mRNA或前mRNA表达。
在一些实施方案中，母体寡核苷酸或其连续核苷酸序列是全聚物(totalmer)或混聚物。全聚物和混聚物可以例如用于剪接切换/调节寡核苷酸或抑制微RNA。
在一些实施方案中，母体寡核苷酸可以是包含立体限定的共有基序的子文库。母体寡核苷酸因此可以是部分立体限定的寡核苷酸，如从先前优化方法鉴定的寡核苷酸。
应当理解在一些实施方案中，不需要针对本发明方法期间改进的特性比较子代寡核苷酸，并且对改进的特性比较文库成员是足够的。在这个方面，母体寡核苷酸可以指保留在文库成员中的母体寡核苷酸的布局(序列和核苷修饰样式)。
立体限定的变体(子代寡核苷酸)
立体限定的变体寡核苷酸是这样的寡核苷酸，其保留与母体寡核苷酸相同的序列和核苷修饰(即，相同的序列和核苷修饰化学和布局)，但是就一个或多个立体限定的核苷间键如一个或多个立体限定的硫代磷酸酯核苷间键(立体限定的硫代磷酸酯变体)而言不同。
立体限定的变体可以是子文库，或可以是完全立体限定的寡核苷酸。
立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸文库
立体限定的寡核苷酸文库包含众多成员，其中每个成员彼此隔离，即，在分立的容器(pot)中，并且其中每个成员具有共有的序列和核苷修饰样式，其中每个成员因包含不同的立体限定的核苷间基序而不同于其他成员。
立体限定的寡核苷酸文库的每个成员可以视为母体寡核苷酸的独立的立体限定的变体。
文库的每个成员可以包含子文库，或在一些实施方案中，文库的每个成员可以是独立的立体限定的寡核苷酸变体。
改进的特性
为了鉴定适合用作治疗药的寡核苷酸，需要鉴定具有为成为安全和有效药物所需的全部独特特性的稀有分子。
生成立体限定的寡核苷酸变体的关键优点是以下能力：增加跨序列基序的多样性并且选择立体限定的寡核苷酸，包括立体限定的寡核苷酸子文库，所述寡核苷酸与母体寡核苷酸相比具有改进的医用化学特性。
与母体寡核苷酸相比显示出一个或多个改进特性的立体限定的寡核苷酸或其他立体限定的寡核苷酸称作改进的硫代磷酸酯变体。如与母体寡核苷酸(如立体无规母体寡核苷酸)相比评估一个或多个特性的改进。
在一些实施方案中，改进的医用化学特性(或改进的特性)选自以下一者或多者：优化的亲和力、增强的效价、增强的比活性、增强的组织摄取、增强的细胞摄取、增强的功效、改变的生物分布、脱靶效应减少、增强的错配区分、降低的毒性、改变的血清蛋白结合、改进的作用持续时间和增强的稳定性。
在一些实施方案中，改进的特性选自改变或增强的亲和力、增强的稳定性、增强的效价、增强的功效、增强的比活性、降低的毒性、改变或增强的生物分布、增强的作用持续时间、改变的PK/PD、增强的细胞或组织摄取和/或增强的靶特异性。
应当理解，尽管通常需要具有更强力和毒性较小的化合物，但许多已改进特性的益处将取决于化合物需要解决的药理学挑战。
改进的效价和改进的功效
改进的效价指寡核苷酸在体外或在体内的效价，并且一般通过如与参比化合物(母体寡核苷酸)相比，比较靶调节作用的水平(如某剂量时的靶抑制作用)来确定。可以通过进行剂量反应实验以确定提供50％抑制作用的化合物剂量(所述抑制作用可以是体外IC50水平或体内EC50水平)确定改进的效价。
增强的功效指不考虑剂量，所实现的靶最大调节作用，并且可以在体外或体内确定。
降低的毒性
在一些实施方案中，改进的特性是降低的毒性，如降低的肝毒性或降低的肾毒性。在一些实施方案中，体内确定降低的毒性。在一些实施方案中，体外确定降低的毒性。
WO2017067970和WO2016/096938中提供了用于确定反义寡核苷酸的肝毒性的合适体外测定法，所述文献因而通过引用的方式并入。还参见Sewing等人,PLoS One 11(2016)e0159431。
在一些实施方案中，母体寡核苷酸是已经在体外或体内确定有肝毒性的寡核苷酸。如与母体寡核苷酸相比，借助本发明方法鉴定的子代寡核苷酸具有降低的毒性，例如降低的肝毒性。
在一些实施方案中，降低的毒性是降低的肝毒性。可以体内(例如在小鼠中)评估寡核苷酸的肝毒性。体内肝毒性测定法一般基于测定肝损伤的血清标志物，如ALT、AST或GGT。将超过正常值上限三倍的水平视为表示体内毒性。可以在小鼠中例如使用单一30mg/kg剂量的寡核苷酸评价体内毒性，7天后评价毒性(7天体内毒性测定法)。
合适的细胞毒性标志物包括LDH升高或细胞ATP下降，并且这些标志物可以用来在体外确定细胞毒性，例如使用原代细胞或细胞培养物来确定。为了确定肝毒性，可以使用小鼠肝细胞或大鼠肝细胞，包括原代肝细胞。肝细胞中合适的细胞毒性标志物包括LDH升高或细胞ATP下降。如果可获得，可以使用灵长类(如人类)原代肝细胞。在哺乳动物(如小鼠)肝细胞中，LDH升高表示毒性。细胞ATP降低表示毒性，如肝毒性。
在一些实施方案中，降低的毒性是降低的肾毒性。PCT/EP2017/064770中公开了用于确定肾毒性的合适的体外测定法，所述文献因而通过引用的方式并入。还参见Moisan等人,Mol.Ther.Nucleic Acids 17(2017)89-105。在一些实施方案中，如果确定的话，通过使用基于细胞的体外测定法，确定肾毒性，所述测定法测量表皮生长因子(EGF)水平作为毒性生物标记物，所述生物标记物可能与其他生物标记物如三磷酸腺苷(ATP)和肾损伤分子-1(KIM-1)组合。上清液中EGF表达增加与增强的肾毒性相关。备选地或额外地，可以通过使用肾损害标志物在体内评估肾毒性，所述的肾损害标志物包括血清肌酐水平升高或kim-1(肾损伤标志物-1)mRNA和/或蛋白升高。适当地，可以使用小鼠或啮齿类。
可以用来评估毒性的其他体外毒性测定法包括胱天蛋白酶测定法、免疫刺激测定法和细胞活力测定法，例如MTS测定法
增强的靶调节作用
在一些实施方案中，改进的特性可以是寡核苷酸如通过改进与涉及调节靶表达的细胞装置相互作用来调节靶表达的能力，以举例方式，增强的RNA酶H活性、改进的剪接调节活性或改进的微RNA抑制。
在一些实施方案中，改进的特性是RNA酶H特异性、RNA酶H等位区分作用和/或RNA酶H活性。在一些实施方案中，改进的特性除RNA酶H特异性、RNA酶H等位区分作用和/或RNA酶H活性之外。在一些实施方案中，改进的特性是改进的胞内摄取。
RNA酶H招募
许多反义寡核苷酸借助RNA酶H介导的靶核酸降解发挥作用，并且存在许多可以通过DNA核苷之间核苷间键立体化学实现RNA酶H1活性的报告。可以在离体酶促测定法中或在测量靶抑制作用的基于细胞的体外测定法中确定RNA酶H活性。应当指出，来自基于细胞的测定法的读出将并入其他变量，如细胞摄取、区室化和靶接合作用，以及寡核苷酸招募RNA酶H的能力。在一些实施方案中，RNA酶H活性改进伴随RNA酶H切割特异性改进或以其为特征。
特异性和错配区分作用
在一些实施方案中，改进的特性包含改进的反义寡核苷酸子代特异性。改进的特异性指相对于靶调节作用的改进比率，如与一种或多种非靶核酸(或非预期靶，经常称作脱靶序列)相比的抑制作用。改进的特性可以例如是如与非致病等位变体相比，针对致病等位变体的活性改进。改进的特性因此可以是改进的错配区分作用或靶特异性。
生物分布
经常需要拥有在靶组织或细胞中被选择性摄取的反义寡核苷酸。本发明的方法可以用来鉴定在所需的靶组织中具有更高生物分布或摄取或更高活性的子代寡核苷酸。这可以通过在衍生自靶组织的细胞(如原代细胞)中体外评估摄取/效价，在体外评估。备选地或额外地，可以在体内确定生物分布，通过确定组织含量或靶接合作用(例如抑制)或通过例如使用放射标记的寡核苷酸，随后进行全身或组织放射自显影术来确定。
亲和力优化
替代的、增强或优化的亲和力指对靶核酸的结合亲和力增加或减少。对于RNA酶H/缺口聚物寡核苷酸，在寡核苷酸的结合亲和力和其效价之间存在关系并且因而经常需要优化结合亲和力以使寡核苷酸对靶核酸的效价最大化(参见Pedersen等人,Mol TherNucleic Acids.2014Feb 18；3:e149.doi:10.1038/mtna.2013.72)。
增强的稳定性
增强的稳定性是指寡核苷酸免遭核酸内切降解或核酸外切降解的稳定性。经常通过确定寡核苷酸在血清中的稳定性或针对蛇毒磷酸二酯酶(SVPD)的稳定性，评价针对核酸酶降解的稳定性。
背景键
在本发明的方法中，子代寡核苷酸可以在否则立体无规背景下包含立体限定的核苷间键基序，即，剩余的核苷间键或剩余的硫代磷酸酯核苷间键是立体无规键(它们具有立体无规背景)。但是，在一些实施方案中，子代寡核苷酸可以包含一个或多个呈立体限定的其他核苷间键。对于基序优化方法，在一些实施方案中，其他立体限定的键是不同的文库成员之间共有的(均就R与S和位置而言)。在一些实施方案中，背景核苷间键(即除立体限定的核苷间基序中那些之外的核苷间键)，可以是全R，如全Rp，或全S，如全Sp。除立体限定的核苷间键基序之外，为全S/Sp或全R/Rp的寡核苷酸称作具有立体均一背景。
还将认识到，在一些实施方案中，母体寡核苷酸是至少部分立体限定的，如可以是通过先前优化鉴定的立体限定的寡核苷酸，并且除了对立体限定的核苷间基序的修饰之外，子代寡核苷酸可以保留一个或多个存在于母体寡核苷酸中的立体限定的核苷间键。在一些此类实施方案中，母体寡核苷酸可以完全立体限定的寡核苷酸。
组合性发现方法
本发明涉及使用子文库，鉴定母体寡核苷酸的改进的立体限定的变体的方法。可以平行或串联或迭代使用本发明的多种备选方法。
以举例方式，在一些实施方案中，如图2中所示，平行优化多个独立的子基序，并且随后可以合并从多个文库获得的每个优选的子基序的信息。
还构思了初始文库筛选可以是寡核苷酸游走以鉴定其中备选非对映异构体之一为关键或优选的关键位置。结合这种初始文库筛选，可以进行又一文库筛选，以优化寡核苷酸的另一区域，可以平行进行这种又一文库筛选并且鉴定的优选基序可以与第一文库中鉴定的关键或优选的立体限定的核苷间键在后续步骤中组合，或首先进行寡核苷酸游走并且随后使用从其中鉴定的优选变体作为母体寡核苷酸用于一个或多个后续基序优化方法，其中从初始文库筛选鉴定的关键或优选的立体限定的核苷间键在后续基序优化步骤中保留在文库成员中。
修饰的核苷间键
术语“修饰的核苷间键”如技术人员通常理解定义为除了将二个核苷共价连接在一起的磷酸二酯(PO)键之外的键。具有修饰的核苷间键的核苷酸也称作“修饰的核苷酸”。在一些实施方案中，与磷酸二酯键相比，修饰的核苷间键增加寡核苷酸的核酸酶抗性。对于天然存在的寡核苷酸，核苷间键包括在毗邻核苷之间产生磷酸二酯键的磷酸酯基团。修饰的核苷间键特别可用于稳定体内使用的寡核苷酸，并且可以在本发明寡核苷酸中的DNA核苷或RNA核苷区域(例如在缺口聚物寡核苷酸的缺口区内部)以及在修饰的核苷区域起到防范核酸酶剪切的作用。
在一些实施方案中，核苷间键包含硫(S)，如硫代磷酸酯核苷间键。
硫代磷酸酯核苷间键特别有用，原因在于核酸酶抗性、有益的药代动力学和易于生产。在一些实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的至少50％核苷间键是硫代磷酸酯，如寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的至少60％、如至少70％、如至少80或如至少90％核苷间键是硫代磷酸酯。在一些实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列的全部核苷间键均是硫代磷酸酯。
WO2009/124238公开了其他的核苷间键(所述文献通过引用方式并入本文)。在一个实施方案中，核苷间键选自WO2007/031091中公开的接头(所述文献通过引用方式并入本文)。如，核苷间键可以选自-O-P(O)2-O-、-O-P(O,S)-O-、-O-P(S)2-O-、-S-P(O)2-O-、-S-P(O,S)-O-、-S-P(S)2-O-、-O-P(O)2-S-、-O-P(O,S)-S-、-S-P(O)2-S-、-O-PO(RH)-O-、O-PO(OCH3)-O-、-O-PO(NRH)-O-、-O-PO(OCH2CH2S-R)-O-、-O-PO(BH3)-O-、-O-PO(NHRH)-O-、-O-P(O)2-NRH-、-NRH-P(O)2-O-、-NRH-CO-O-、-NRH-CO-NRH-，和/或核苷间接头可以选自-O-CO-O-、-O-CO-NRH-、-NRH-CO-CH2-、-O-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-、-CO-NRH-CH2-、-CH2-NRHCO-、-O-CH2-CH2-S-、-S-CH2-CH2-O-、-S-CH2-CH2-S-、-CH2-SO2-CH2-、-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-CO-、-CH2-NCH3-O-CH2-，其中RH选自氢和C1-4-烷基。
抗核酸酶键如硫代磷酸酯键特别可用于与靶核酸(如缺口聚物的区域G或头聚物和尾聚物的未修饰核苷区域)形成双链体时能够招募核酸酶的寡核苷酸区域中。然而，硫代磷酸酯键还可以用于无核酸酶招募作用的区域和/或增强亲和力的区域(如缺口聚物的区域F和F’或头聚物和尾聚物的修饰核苷区域)中。
然而，布局区域的每一者可以包含除硫代磷酸酯之外的核苷间键，如磷酸二酯键，尤其在修饰的核苷(如LNA)保护该键对抗核酸酶降解的区域中。纳入磷酸二酯键、尤其在修饰的核苷单位之间或与之毗邻(通常在无核酸酶招募作用的区域中)纳入，如一个或两个键，可以修饰寡核苷酸的生物利用率和/或生物分布–参见通过引用方式并入本文的WO2008/113832。
在一个实施方案中，寡核苷酸中的全部核苷间键均是硫代磷酸酯。有利地，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的全部核苷间键均是硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列的全部核苷间键均是硫代磷酸酯，任选地具有1、2或3个磷酸二酯键。
核碱基
术语“核碱基”包括在核苷和核苷酸中的在核酸杂交中形成氢键的嘌呤部分(例如腺嘌呤和鸟嘌呤)和嘧啶部分(例如尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)。在本发明的上下文中，术语“核碱基”还涵盖可以与天然存在的核碱基不同、但在核酸杂交期间有功能的修饰的核碱基。在这种情况下，“核碱基”指天然存在的核碱基如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤，以及非天然存在的变体。此类变体例如在Hirao等人(2012)Accountsof Chemical Research第45卷第2055页和Bergstrom(2009)Current Protocols inNucleic Acid Chemistry Suppl.37 1.4.1中描述。
在一些实施方案中，通过以下方式修饰核碱基部分：将嘌呤或嘧啶变更成修饰的嘌呤或嘧啶，如取代的嘌呤或取代的嘧啶，如选自异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并胞嘧啶、5-炔丙基-胞嘧啶、5-炔丙基-尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-噻唑并尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、2’硫代-胸腺嘧啶、肌苷、二氨基嘌呤、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤的核碱基。
核碱基部分可以借助每相应核碱基的字母代码(例如A、T、G、C或U)指示，其中每种字母可以任选地包括功能等同的修饰的核碱基。例如，在例举的寡核苷酸中，核碱基部分选自A、T、G、C和5-甲基胞嘧啶。任选地，对于LNA缺口聚物，可以使用5-甲基胞嘧啶LNA核苷。
修饰的寡核苷酸
术语“修饰的寡核苷酸”描述了包含一个或多个糖修饰的核苷和/或修饰的核苷间键的寡核苷酸。术语“嵌合”寡核苷酸是这样的术语，其已经在文献中用来描述具有修饰的核苷和DNA核苷或RNA核苷的寡核苷酸，或包含多于一个类型的糖修饰的核苷的寡核苷酸(例如LNA和2’取代物，如2’-O-MOE核苷)。寡核苷酸或其连续核苷酸序列可以形成嵌合寡核苷酸。
互补性
术语“互补性”描述核苷/核苷酸的Watson-Crick碱基配对能力。Watson-Crick碱基对是鸟嘌呤(G)-胞嘧啶(C)和腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。应当理解，寡核苷酸可以包含具有修饰的核碱基的核苷，例如经常使用5-甲基胞嘧啶替代胞嘧啶，并且从而术语“互补性”涵盖未修饰的核碱基和修饰的核碱基之间的Watson Crick碱基配对(参见例如Hirao等人(2012)Accounts of Chemical Research第45卷第2055页和Bergstrom(2009)Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl.37 1.4.1)。
如本文所用，术语“％互补的”指核酸分子(例如寡核苷酸)中连续核苷酸序列以百分数计的核苷酸的数目，其中在给定位置，所述核苷酸与在分开的核酸分子(例如靶核酸)的给定位置处的连续核苷酸序列互补(即与之形成Watson Crick碱基对)。通过以下方式计算该百分数：(靶序列5’-3’和从3’-5’的寡核苷酸序列对齐时)计数两个序列之间形成配对的对齐碱基的数目，除以寡核苷酸中核苷酸的总数并乘以100。在这种比较中，未对齐(形成碱基对)的核碱基/核苷酸称作错配。优选地，计算连续核苷酸序列的互补性％中时不允许插入和缺失。
术语“完全互补的”指100％互补性。
同一性
如本文所用的术语“同一性”指核酸分子(例如寡核苷酸)中连续核苷酸序列以百分数计的核苷酸数目，其中在给定位置，所述核苷酸与在分开的核酸分子(例如靶核酸)的给定位置处的连续核苷酸序列相同(即在其与互补性核苷形成Watson Crick碱基对的能力方面)。通过以下方式计算该百分数：计数两个序列之间相同的对齐碱基的数目，除以寡核苷酸中核苷酸的总数并乘以100。同一性百分数＝(匹配x 100)/对齐区域的长度。优选地，计算连续核苷酸序列的互补性％中时不允许插入和缺失。
杂交
如本文所用，术语“杂交”以及其各种词性形式将理解为两条核酸链(例如寡核苷酸和靶核酸)在对侧链上的碱基对之间形成氢键，因而形成双链体。两条核酸链之间结合作用的亲和力是杂交的强度。经常根据解链温度(Tm)描述它，所述解链温度定义为半数寡核苷酸与靶核酸形成双链体的温度。在生理条件下，Tm不与亲和力严格成正比(Mergny和Lacroix,2003,Oligonucleotides 13:515–537)。标准状态Gibbs自由能ΔG°是结合亲和力的更精确表述并且与反应的解离常数(Kd)通过ΔG°＝-RTln(Kd)相关，其中R是气体常数并且T是绝对温度。因此，寡核苷酸和靶核酸之间反应的很低ΔG°反映了寡核苷酸和靶核酸之间强力杂交。ΔG°是与其中水浓度为1M、pH是7和温度是37℃的反应相关的能量。寡核苷酸与靶核酸杂交是自发反应并且对于自发反应，ΔG°小于零。例如，通过利用如Hansen等人,1965,Chem.Comm.36–38和Holdgate等人,2005,Drug Discov Today中所述的等温滴定量热法(ITC)法，可以实验测量ΔG°。本领域技术人员将知道商业设备可用于测量ΔG°。也可以通过使用如SantaLucia,1998,Proc Natl Acad Sci USA.95:1460–1465所述的最近相邻模型，适当使用Sugimoto等人,1995,Biochemistry 34:11211–11216和McTigue等人,2004,Biochemistry43:5388–5405描述的热动力参数，以数值方式估计ΔG°。为了获得通过杂交调节其预期核酸靶的可能性，本发明的寡核苷酸与靶核酸以针对长度10-30个核苷酸的寡核苷酸的低于-10kcal的ΔG°估计值杂交。在一些实施方案中，依据标准状态Gibbs自由能ΔG°测量杂交的程度或强度。寡核苷酸可以与靶核酸以针对长度8-30个核苷酸的寡核苷酸的低于10kcal、如低于-15kcal、如低于-20kcal和如低于-25kcal的范围的ΔG°估计值杂交。在一些实施方案中，寡核苷酸与靶核酸以-10至-60kcal、如-12至-40kcal、如-15至-30kcal或-16至-27kcal如-18至-25kcal的ΔG°估计值杂交。
靶核酸
靶核酸可以是哺乳动物RNA，如人RNA，如mRNA、和前mRNA、成熟的mRNA或cDNA序列。
对于体内或体外应用，本文提及的寡核苷酸，如通过本发明方法鉴定的寡核苷酸，一般能够抑制靶核酸在表达靶核酸的细胞中表达。在一些实施方案中，靶核酸是编码Hif1α的核酸。在一些实施方案中，靶核酸是编码ApoB的核酸。
反义寡核苷酸的核碱基连续序列与靶核酸完全互补，如跨寡核苷酸长度所测量，任选地例外是一个或两个错配，并且任选地不包括基于接头区域的核苷酸，所述接头区域可以将寡核苷酸连接至任选官能团(如缀合物)或其他非互补性末端核苷酸(例如区域D’或D”)。在一些实施方案中，靶核酸可以是RNA或DNA，如信使RNA，如成熟的mRNA或前mRNA。
反义寡核苷酸因此包含与靶核酸如靶核酸的子序列互补或杂交的连续核苷酸序列。
反义寡核苷酸因此可以包含与靶核酸分子中存在的靶序列互补或杂交的至少8个核苷酸的连续核苷酸序列。连续核苷酸序列(和因此靶序列)由包含至少8个连续核苷酸，如9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个连续核苷酸，如12-25个，如14-18个连续核苷酸组成。
靶细胞
如本文所用的术语“靶细胞”指表达靶核酸的细胞。在一些实施方案中，靶细胞可以是在体内或体外。在一些实施方案中，靶细胞是哺乳动物细胞如啮齿类细胞，如小鼠细胞或大鼠细胞、或灵长类细胞如猴细胞或人细胞。
对表达的调节
如本文所用的术语“对表达的调节作用”将理解为针对与施用寡核苷酸之前靶核酸的量相比时，寡核苷酸改变靶核酸量的能力的总体术语。备选地，可以通过参考对照实验确定对表达的调节。通常理解，对照是用盐水组合物处理的个体或靶细胞或用非靶向性寡核苷酸(模拟)处理的个体或靶细胞。
一个类型的调节作用是寡核苷酸例如通过降解mRNA或阻断转录抑制、下调、减少、阻抑、移除、停止、阻断、阻止、减弱、降低、避免或终止靶核酸表达的能力。另一个类型的调节作用是寡核苷酸例如通过修复剪接位点或阻止剪接过程或移除或阻塞抑制性机制如微RNA阻抑作用而恢复、增加或增强靶核酸表达的能力。
修饰的高亲和力核苷
修饰的高亲和力核苷是当并入寡核苷酸时，增强寡核苷酸对其互补靶的亲和力(例如如通过解链温度(Tm)所测量)的修饰的核苷酸。本发明的修饰的高亲和力核苷优选地导致解链温度增幅为每个修饰的核苷+0.5至+12℃之间、更优选地在+1.5至+10℃之间并且最优选地+3至+8℃之间。众多修饰的高亲和力核苷是本领域已知的并且例如包括许多2’取代的核苷以及锁核酸(LNA)(参见，例如Freier和Altmann；Nucl.Acid Res.,1997,25,4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development,2000,3(2),293-213)。
糖修饰
与DNA和RNA中存在的核糖糖部分相比时，本发明的寡聚物可以包含一个或多个具有修饰的糖部分(即糖部分修饰)的核苷。
已经产生众多具有核糖糖部分修饰的核苷，主要目的在于改善寡核苷酸的某些特性，如亲和力和/或核酸酶抗性。
这类修饰包括这样的修饰，其中例如通过用以下者替换而修饰核糖环结构：己糖环(HNA)或一般在核糖环上C2和C4碳之间具有双基桥的双环状环(LNA)或一般在C2碳和C3碳之间缺少键的非连接核糖环(例如UNA)。其他的糖修饰核苷例如包括双环己糖核酸(WO2011/017521)或三环核酸(WO2013/154798)。修饰的核苷还包括其中糖部分由非糖部分替换的核苷，例如在肽核酸(PNA)或吗啉代核酸的情况下。
糖修饰还包括通过将核糖环上的取代基变成氢之外的基团或DNA核苷和RNA核苷中天然存在的2’-OH基团所做出的修饰。可以例如在2’、3’、4’或5’位置引入取代基。
2’糖修饰的核苷
2’糖修饰的核苷是这样的核苷，其在2’位置具有除H或–OH之外取代基的核苷(2’取代的核苷)或包含2’连接的能够在核糖环中2’碳和第二碳之间形成桥的双基，如LNA(2’–4’双基桥接的)核苷。
实际上，多数注意力已经投入开发2’取代的核苷方面，并且已经发现众多2’取代的核苷在并入寡核苷酸时具有有益的特性。例如，2’修饰的糖可以向寡核苷酸提供增强的结合亲和力和/或增加的核酸酶抗性。2’取代的修饰的核苷实例是2’-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧乙基-RNA(MOE)、2’-氨基-DNA、2'-氟-RNA和2’-F-ANA核苷。对于其他实例，请参见例如Freier和Altmann；Nucl.Acid Res.,1997,25,4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development,2000,3(2),293-213及Deleavey和Damha,Chemistry and Biology 2012,19,937。下文展示了一些2’取代的修饰的核苷。
与本发明有关，2’取代不包括2’桥接的分子如LNA。
锁核酸核苷(LNA)
“LNA核苷”是2’-修饰的核苷，其包含连接所述核苷的核糖糖环的C2’和C4’的双基(“2’-4’桥”)，所述双基限制或锁定核糖环的构象。向互补性RNA或DNA分子的寡核苷酸并入LNA时，锁定核糖的构象与增强的杂交亲和力相关(双链体稳定作用)。可以通过测量寡核苷酸/互补双链体的解链温度，例行地确定这点。
以下文献中公开了非限制的示例性LNA核苷：WO 99/014226、WO 00/66604、WO 98/039352、WO 2004/046160、WO 00/047599、WO 2007/134181、WO 2010/077578、WO 2010/036698、WO 2007/090071、WO 2009/006478、WO 2011/156202、WO 2008/154401、WO 2009/067647、WO 2008/150729；Morita等人,Bioorganic&Med.Chem.Lett.12,73-76；Seth等人J.Org.Chem.2010,Vol 75(5)第1569-81页和Mitsuoka等人,Nucleic Acids Research2009,37(4),1225-1238。
在一些实施方案中，本发明寡聚物的糖修饰的核苷或LNA核苷具有式I或II的一般结构：
其中W选自-O-、-S-、-N(Ra)-、-C(RaRb)-，如在一些实施方案中，选自–O-；
B指核碱基或修饰的核碱基部分；
Z指至相邻核苷的核苷间键或5'末端基团；
Z*指至相邻核苷的核苷间键或3'末端基团；
X指选自-C(RaRb)-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-O-、-Si(Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-和>C＝Z的基团。
在一些实施方案中，X选自：–O-、-S-、NH-、NRaRb、-CH2-、CRaRb、-C(＝CH2)-和-C(＝CRaRb)-。
在一些实施方案中，X是-O-。
Y指选自-C(RaRb)-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-O-、-Si(Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-和>C＝Z的基团。
在一些实施方案中，Y选自：–CH2-、-C(RaRb)-、–CH2CH2-、-C(RaRb)-C(RaRb)-、–CH2CH2CH2-、-C(RaRb)C(RaRb)C(RaRb)-、-C(Ra)＝C(Rb)-和-C(Ra)＝N-。
在一些实施方案中，Y选自：-CH2-、-CHRa-、-CHCH3-、CRaRb-或-X-Y-共同指双价接头基团(也称作原子团)，共同指由1个、2个、3个或4个选自-C(RaRb)-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-O-、-Si(Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-和>C＝Z的基团/原子组成的双价接头基团。
在一些实施方案中，-X-Y-指双基，所述双基选自：-X-CH2-、-X-CRaRb-、-X-CHRa-、-X-C(HCH3)-、-O-Y-、-O-CH2-、-S-CH2-、-NH-CH2-、-O-CHCH3-、-CH2-O-CH2、-O-CH(CH3CH3)-、-O-CH2-CH2-、OCH2-CH2-CH2-,-O-CH2OCH2-、-O-NCH2-、-C(＝CH2)-CH2-、-NRa-CH2-、N-O-CH2、-S-CRaRb-和-S-CHRa-。
在一些实施方案中，–X-Y-指–O-CH2-或–O-CH(CH3)-。
其中Z选自-O-、-S-和-N(Ra)-
且Ra和存在时的Rb各自独立地选自氢、任选取代的C1-6-烷基、任选取代的C2-6-烯基、任选取代的C2-6-炔基、羟基、任选取代的C1-6-烷氧基、C2-6-烷氧基烷基、C2-6-烯氧基、羧基、C1-6-烷氧基羰基、C1-6-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳氧基-羰基、芳氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳氧基-羰基、杂芳氧基、杂芳基羰基、氨基、单-和二(C1-6-烷基)氨基、氨基甲酰基、单-和二(C1-6-烷基)-氨基-羰基、氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、单-和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、C1-6-烷基-羰基氨基、脲基、C1-6-烷酰氧基、磺酰基、C1-6-烷基磺酰氧基、硝基、叠氮基、硫烷基、C1-6-烷硫基、卤素，其中芳基和杂芳基可以任选地被取代，且其中两个孪位取代基Ra和Rb一起可表示任选取代的亚甲基(＝CH2)，其中对于所有手性中心，不对称基团可以为R或S取向。
其中R1、R2、R3、R5和R5*独立地选自：氢、任选取代的C1-6-烷基、任选取代的C2-6-烯基、任选取代的C2-6-炔基、羟基、C1-6-烷氧基、C2-6-烷氧基烷基、C2-6-烯氧基、羧基、C1-6-烷氧基羰基、C1-6-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳氧基-羰基、芳氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳氧基-羰基、杂芳氧基、杂芳基羰基、氨基、单-和二(C1-6-烷基)氨基、氨基甲酰基、单-和二(C1-6-烷基)-氨基-羰基、氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、单-和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、C1-6-烷基-羰基氨基、脲基、C1-6-烷酰氧基、磺酰基、C1-6-烷基磺酰氧基、硝基、叠氮基、硫烷基、C1-6-烷硫基、卤素，其中芳基和杂芳基可以任选地被取代，且其中两个孪位取代基一起可表示氧代、硫代、亚氨基或任选取代的亚甲基。
在一些实施方案中，R1、R2、R3、R5和R5*独立选自C1-6烷基(如甲基)和氢。
在一些实施方案中，R1、R2、R3、R5和R5*均是氢。
在一些实施方案中，R1、R2、R3均是氢并且R5和R5*中一者也是氢并且R5和R5*的另一者是除氢之外，如C1-6烷基如甲基。
在一些实施方案中，Ra是氢或甲基。在一些实施方案中，当存在时，Rb是氢或甲基。
在一些实施方案中，Ra和Rb中一者或二者是氢。
在一些实施方案中，Ra和Rb中一者氢并且另一者是除氢之外。
在一些实施方案中，Ra和Rb中一者是甲基并且另一者是氢。
在一些实施方案中，Ra和Rb均是甲基。
在一些实施方案中，双基–X-Y-是–O-CH2-，W是O并且R1、R2、R3、R5和R5*全部均是氢。这类LNA核苷在WO99/014226、WO00/66604、WO98/039352和WO2004/046160中公开，所述文献均因而通过引用的方式并入，并且包括所通称的β-D-氧基LNA和α-L-氧LNA核苷。
在一些实施方案中，双基–X-Y-是–S-CH2-，W是O并且R1、R2、R3、R5和R5*全部均是氢。这类硫代LNA核苷在WO99/014226和WO2004/046160中公开，所述文献因而通过引用的方式并入。
在一些实施方案中，双基–X-Y-是–NH-CH2-，W是O并且R1、R2、R3、R5和R5*全部均是氢。这类氨基LNA核苷在WO99/014226和WO2004/046160中公开，所述文献因而通过引用的方式并入。
在一些实施方案中，双基–X-Y-是–O-CH2-CH2-或–O-CH2-CH2-CH2-，W是O并且R1、R2、R3、R5和R5*全部均是氢。这类LNA核苷在WO00/047599和Morita等人,Bioorganic&Med.Chem.Lett.12 73-76中公开，所述文献均因而通过引用的方式并入，并且包括所通称的2’-O-4’C-乙烯桥接核酸(ENA)。
在一些实施方案中，双基–X-Y-是–O-CH2-，W是O和R1、R2、R3全部和R5和R5*之一是氢并且R5和R5*的另一个是除氢之外如C1-6烷基，如甲基。这类5’取代的LNA核苷在WO2007/134181中公开，所述文献因而通过引用的方式并入。
在一些实施方案中，双基–X-Y-是–O-CRaRb-，其中Ra和Rb中一者或二者是除氢之外如甲基，W是O和R1、R2、R3全部和R5和R5*之一是氢并且R5和R5*的另一个是除氢之外如C1-6烷基，如甲基。这类双修饰的LNA核苷在WO2010/077578中公开，所述文献因而通过引用的方式并入。
在一些实施方案中，双基–X-Y-指双价接头基团–O-CH(CH2OCH3)-(2’O-甲氧乙基)双环核酸(Seth等人,2010,J.Org.Chem.Vol 75(5)第1569-81页)。在一些实施方案中，双基–X-Y-指双价接头基团–O-CH(CH2CH3)-(2’O-乙基双环核酸(Seth等人,2010,J.Org.Chem.Vol 75(5)第1569-81页)。在一些实施方案中，双基–X-Y-是–O-CHRa-，W是O并且R1、R2、R3、R5和R5*全部均是氢。这类6’取代的LNA核苷在WO10036698和WO07090071中公开，所述文献均因而通过引用的方式并入。
在一些实施方案中，双基–X-Y-是–O-CH(CH2OCH3)-，W是O并且R1、R2、R3、R5和R5*全部均是氢。这类LNA核苷在本领域中也称作环状的MOE(cMOE)并在WO07090071中公开。
在一些实施方案中，双基–X-Y-指处于R构型或S构型的双价接头基团–O-CH(CH3)-。在一些实施方案中，双基–X-Y-一起指双价接头基团–O-CH2-O-CH2-(Seth等人,2010,J.Org.Chem)。在一些实施方案中，双基–X-Y-是–O-CH(CH3)-，W是O并且R1、R2、R3、R5和R5*全部均是氢。这类6’甲基LNA核苷在本领域也称作cET核苷并且可以是(S)cET或(R)cET立体异构体，如WO07090071(β-D)和WO2010/036698(α-L)中公开，所述文献均因而通过引用的方式并入。
在一些实施方案中，双基–X-Y-是–O-CRaRb-，其中Ra或Rb均不是氢，W是O并且R1、R2、R3、R5和R5*全部均是氢。在一些实施方案中，Ra和Rb均是甲基。这类6’双取代的LNA核苷在WO2009006478中公开，所述文献因而通过引用的方式并入。
在一些实施方案中，双基–X-Y-是–S-CHRa-，W是O并且R1、R2、R3、R5和R5*全部均是氢。这类6’取代的硫代LNA核苷在WO11156202中公开，所述文献因而通过引用的方式并入。在某些6’取代的硫代LNA实施方案中，Ra是甲基。
在一些实施方案中，双基–X-Y-是–C(＝CH2)-C(RaRb)-如–C(＝CH2)-CH2-或–C(＝CH2)-CH(CH3)-，W是O并且R1、R2、R3、R5和R5*全部均是氢。这类乙烯基羰LNA核苷在WO08154401和WO09067647中公开，所述文献均因而通过引用的方式并入。
在一些实施方案中，双基–X-Y-是–N(-ORa)-，W是O并且R1、R2、R3、R5和R5*全部均是氢。在一些实施方案中，Ra是C1-6烷基如甲基。这类LNA核苷也称作N取代的LNA并且在WO2008/150729中公开，所述文献因而通过引用的方式并入。在一些实施方案中，双基–X-Y-一起指双价接头基团–O-NRa-CH3-(Seth等人,2010,J.Org.Chem)。在一些实施方案中，双基–X-Y-是–N(Ra)-，W是O并且R1、R2、R3、R5和R5*全部均是氢。在一些实施方案中，Ra是C1-6烷基如甲基。
在一些实施方案中，R5和R5*中一者或二者是氢并且当取代时，R5和R5*的另一个是C1-6烷基如甲基。在这种实施方案中，R1、R2、R3可以全部是氢并且双基–X-Y-可以选自–O-CH2-或–O-C(HCRa)-如–O-C(HCH3)-。
在一些实施方案中，双基是–CRaRb-O-CRaRb-，如CH2-O-CH2-，W是O并且R1、R2、R3、R5和R5*全部均是氢。在一些实施方案中，Ra是C1-6烷基如甲基。这类LNA核苷也称作构象限制的核苷酸(CRN)并且在WO2013036868中公开，所述文献因而通过引用的方式并入。
在一些实施方案中，双基是–O-CRaRb-O-CRaRb-，如O-CH2-O-CH2-，W是O并且R1、R2、R3、R5和R5*全部均是氢。在一些实施方案中，Ra是C1-6烷基如甲基。这类LNA核苷也称作COC核苷酸并且在Mitsuok等人,Nucleic Acids Research 2009 37(4),1225-1238中公开，所述文献因而通过引用的方式并入。
将认识到，除非具体说明，否则LNA核苷可以处于β-D或α-L立体同工型。
方案1中展示LNA核苷的某些例子。
方案1
如例子中所示，在本发明的一些实施方案中，寡核苷酸中的LNA核苷是β-D-氧代-LNA核苷。
核酸酶介导的降解
核酸酶介导的降解涉及与互补性核苷酸序列形成双链体时，能够介导这种序列降解的寡核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸可以借助核酸酶介导的靶核酸降解过程发挥作用，其中本发明的寡核苷酸能够招募核酸酶、尤其核酸内切酶、优选地内切核糖核酸酶(RNA酶)，如RNA酶H。通过核酸酶介导的机制发挥作用的寡核苷酸布局的例子是一般包含至少5个或6个连续DNA核苷的区域并且在一侧或两侧旁侧分布有增强亲和力的核苷的寡核苷酸，例如缺口聚物、头聚物和尾聚物。
RNA酶H活性和招募
反义寡核苷酸RNA酶H活性指其与互补性RNA分子形成双链体时招募RNA酶H的能力。WO01/23613提供用于确定RNA酶H活性的体外方法，所述方法可以用来确定招募RNA酶H的能力。如果以下情况出现，则一般认定寡聚体能够招募RNA酶H：向RNA酶H提供互补性靶核酸序列时，其具有如以pmol/l/分钟计量的如此初始速率，所述初始速率是使用下述寡核苷酸并使用WO01/23613的实施例91-95(所述文献因而通过引用的方式并入)提供的方法所确定的初始速率的至少5％，如至少10％或超过20％，其中所述寡核苷酸具有与受检的修饰寡核苷酸相同的碱基序列，但仅含有DNA单体，同时寡核苷酸的全部单体之间均为硫代磷酸酯键。
缺口聚物寡核苷酸和缺口聚物布局
本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列可以是缺口聚物。反义缺口聚物常用来借助RNA酶H介导的降解，抑制靶核酸。缺口聚物寡核苷酸按‘5->3’取向包含至少三个不同的结构区5’-侧翼、缺口和3’-侧翼、F-G-F’。“缺口”区(G)包含一段使寡核苷酸能够招募RNA酶H的连续DNA核苷酸。缺口区旁侧分布有包含一个或多个糖修饰的核苷、有利地糖修饰的高亲和力核苷的5’侧翼区(F)和包含一个或多个糖修饰的核苷、有利地糖修饰的高亲和力核苷的3’侧翼区(F’)。区域F和F’中一个或多个糖修饰的核苷增强寡核苷酸对靶核酸的亲和力(即，是增强亲和力的糖修饰的核苷)。在一些实施方案中，区域F和F’中的一个或多个糖修饰的核苷是如独立地选自LNA和2’-MOE的2’糖修饰的核苷，如高亲和力2’糖修饰。
在缺口聚物布局中，缺口区的5’和3’末端核苷是DNA核苷，并且分别毗邻5’(F)区域或3’(F’)区域的糖修饰的核苷。这些侧翼区可以通过最远离缺口区的末端(即在5’侧翼区5'末端和在3’侧翼区3'末端)处具有至少一个糖修饰的核苷来进一步限定。
区域F-G-F’形成连续核苷酸序列。本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列可以包含式F-G-F’的缺口聚物区域。
缺口聚物布局F-G-F’的总体长度可以例如是12至32个核苷，如13至24个，如14至22个核苷，如14至17，如16至18个核苷。
以举例方式，本发明的缺口聚物寡核苷酸可以由下式代表：
F1-8-G5-16-F’1-8，如
F1-8-G7-16-F’2-8
条件是缺口聚物区域F-G-F’的总体长度是至少12个，如至少14个核苷酸长度。
区域F、G和F’在下文进一步限定并且可以并入F-G-F’式中。
缺口聚物区域G
缺口聚物的区域G(缺口区)是使寡核苷酸能够招募RNA酶H如人RNA酶H1的核苷区域，一般是DNA核苷。RNA酶H是识别DNA和RNA之间双链体并酶促切割RNA分子的细胞酶。适当地，缺口聚物可以具有长度至少5个或6个连续DNA核苷，如5–16个连续DNA核苷，如6–15个连续DNA核苷，如7-14个连续DNA核苷，如8–12个连续DNA核苷酸，如8–12个连续DNA核苷酸的缺口区(G)。在一些实施方案中，缺口区G可以由6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个连续DNA核苷组成。
在一些实施方案中，缺口区G可以由6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个连续的硫代磷酸酯连接的DNA核苷组成。在一些实施方案中，缺口中的全部核苷间键均是硫代磷酸酯键。
尽管传统的缺口聚物具有DNA缺口区，但存在用于缺口区内部时允许招募RNA酶H的修饰核苷的众多实例。已经报道为纳入缺口区内部时，能够招募RNA酶H的修饰的核苷例如包括α-L-LNA、C4’烷基化DNA(如PCT/EP2009/050349和Vester等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.18(2008)2296–2300中所述，二者均通过引用方式并入本文)、阿拉伯糖衍生的核苷如ANA和2'F-ANA(Mangosr等人2003J.AM.CHEM.SOC.125,654-661)、UNA(非锁核酸)(如Fluiter等人,Mol.Biosyst.,2009,10,1039中所述，所述文献通过引用方式并入本文)。UNA是非锁核酸，一般其中核糖C2和C3之间的键已经移除，形成非锁定的“糖”残基。已经报道5’取代的DNA核苷，如5’甲基DNA核苷用于DNA缺口区(EP 2 742 136)中。用于这类缺口聚物中的修饰的核苷可以是引入缺口区时采取2’内式(DNA样)结构的核苷，即允许招募RNA酶H的修饰。在一些实施方案中，本文所述的DNA缺口区(G)可以任选地含有1至3个当引入缺口区时采取2’内式(DNA样)结构的糖修饰的核苷。
区域G“缺口破坏者”
备选地，存在向缺口聚物的缺口区插入赋予3’内式构象的修饰的核苷，同时保留某些RNA酶H活性的众多报告。这类具有下述缺口区的缺口聚物称作“缺口破坏者”或“妨碍缺口的”缺口聚物，所述缺口区包含一个或多个3’内式修饰的核苷，参见例如WO2013/022984。缺口破坏者寡核苷酸在缺口区内部保留足够的DNA核苷区域以允许招募RNA酶H。缺口破坏者寡核苷酸布局招募RNA酶H的能力一般具有序列特异性或甚至化合物特异性–参见Rukov等人.2015Nucl.Acids Res.卷43第8476-8487页，所述文献公开了在一些情况下提供更特异的靶RNA切割作用的招募RNA酶H的“缺口破坏者”寡核苷酸。用于缺口破坏者寡核苷酸的缺口区内部的修饰的核苷可以例如是赋予3’内式构象的修饰的核苷，如2’–O-甲基(OMe)或2’-O-MOE(MOE)核苷，或β-D LNA核苷(核苷的核糖糖环C2’和C4’之间的桥处于β构象)，如β-D-氧基LNA或ScET核苷。
与含有上述区域G的缺口聚物一样，缺口破坏者缺口聚物或妨碍缺口的缺口聚物的缺口区在缺口的5'末端具有DNA核苷(毗邻于区域F的3’核苷)并且在缺口的3'末端具有DNA核苷(毗邻于区域F’的5’核苷)。包含受妨碍缺口的缺口聚物一般在缺口区的5'末端或3’末端保留至少3或4个连续DNA核苷的区域。
缺口破坏者寡核苷酸的示例性布局包括
F1-8-[D3-4-E1-D3-4]-F’1-8
F1-8-[D1-4-E1-D3-4]-F’1-8
F1-8-[D3-4-E1-D1-4]-F’1-8
其中区域G处于括号[Dn-Er-Dm]内，D是连续的DNA核苷序列，E是修饰的核苷(缺口破坏者或妨碍缺口的核苷)，并且F和F’是如本文定义的侧翼区，并且条件是缺口聚物区域F-G-F’的总体长度是至少12个、如至少14个核苷酸长度。
在一些实施方案中，妨碍缺口的缺口聚物的区域G包含至少6个DNA核苷，如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个DNA核苷。如前所述，DNA核苷可以是连续或可以任选地散布有一个或多个修饰的核苷，条件是缺口区G能够介导RNA酶H招募。
缺口聚物侧翼区F和F’
区域F位于紧邻于区域G的5’DNA核苷。区域F的3’末端核苷是糖修饰的核苷，如糖修饰的高亲和力核苷，例如2’取代的核苷，如MOE核苷，或LNA核苷。
区域F’位于紧邻于区域G的3’DNA核苷存在。区域F’的5’末端核苷是糖修饰的核苷，如糖修饰的高亲和力核苷，例如2’取代的核苷，如MOE核苷，或LNA核苷。
区域F具有1–8个连续核苷酸长度，如2-6个，如3-4个连续核苷酸长度。有利地，区域F’的5’末端核苷是糖修饰的核苷。在一些实施方案中，区域F的两个5’末端核苷是糖修饰的核苷。在一些实施方案中，区域F的5’末端核苷是LNA核苷。在一些实施方案中，区域F的两个5’末端核苷是LNA核苷。在一些实施方案中，区域F的两个5’末端核苷是2’取代的核苷核苷，如两个3’MOE核苷。在一些实施方案中，区域F的5’末端核苷是2’取代的核苷，如MOE核苷。
区域F’具有2-8个连续核苷酸长度，如3-6个，如4-5个连续核苷酸长度。有利地，区域F’的3’末端核苷是糖修饰的核苷。在一些实施方案中，区域F’的两个3’末端核苷是糖修饰的核苷。在一些实施方案中，区域F’的两个3’末端核苷是LNA核苷。在一些实施方案中，区域F’的3’末端核苷是LNA核苷。在一些实施方案中，区域F’的两个3’末端核苷是2’取代的核苷核苷，如两个3’MOE核苷。在一些实施方案中，区域F’的3’末端核苷是2’取代的核苷，如MOE核苷。
应当指出，当区域F或F’的长度是一时，它有利地是LNA核苷。
在一些实施方案中，区域F和F’独立地由糖修饰的核苷的连续序列组成或包含该序列。在一些实施方案中，区域F的糖修饰的核苷可以独立地选自2’-O-烷基-RNA单位、2'-O-甲基-RNA、2’-氨基-DNA单位、2'-氟代-DNA单位、2’-烷氧基-RNA、MOE单位、LNA单位、阿糖核酸(ANA)单位和2'-氟代-ANA单位。
在一些实施方案中，区域F和F’独立地包含LNA和2’取代的修饰的核苷(混合型翼部布局)。
在一些实施方案中，区域F或F’的全部核苷或F和F’是LNA核苷，如独立地选自β-D-氧基LNA、ENA或ScET核苷。在一些实施方案中，区域F由1-5个、如2-4个、如3-4个如1、2、3、4或5个连续LNA核苷组成。在一些实施方案中，区域F和F’的全部核苷均是β-D-氧基LNA核苷。
在一些实施方案中，区域F或F’的全部核苷，或F和F’是2’取代的核苷，如OMe或MOE核苷。在一些实施方案中，区域F由1、2、3、4、5、6、7或8个连续OMe或MOE核苷组成。在一些实施方案中，仅侧翼区之一可以由2’取代的核苷(如OMe或MOE核苷)组成。在一些实施方案中，正是5’(F)侧翼区才由2’取代的核苷(如OMe或MOE核苷)组成，而3’(F’)侧翼区包含至少一个LNA核苷，如β-D-氧基LNA核苷或cET核苷。在一些实施方案中，正是3’(F’)侧翼区才由2’取代的核苷(如OMe或MOE核苷)组成，而5’(F)侧翼区包含至少一个LNA核苷，如β-D-氧基LNA核苷或cET核苷。
在一些实施方案中，区域F和F’的全部修饰的核苷均是LNA核苷，如独立地选自β-D-氧基LNA、ENA或ScET核苷，其中区域F或F’或者F和F’可以任选地包含DNA核苷(交替性侧翼，关于更多详情，参见这些区域的定义)。在一些实施方案中，区域F和F’的全部修饰的核苷均是β-D-氧基LNA核苷，其中区域F或F’或者F和F’可以任选地包含DNA核苷(交替性侧翼，关于更多详情，参见这些区域的定义)。
在一些实施方案中，区域F和F’的5’末端核苷和3’末端核苷是LNA核苷，如β-D-氧基LNA核苷或ScET核苷。
在一些实施方案中，区域F和区域G之间的核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。在一些实施方案中，区域F’和区域G之间的核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。在一些实施方案中，在区域F或F’、F和F’的核苷之间的核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。
LNA缺口聚物
LNA缺口聚物是其中区域F和F’中任一者或两者均包含LNA核苷或由其组成的缺口聚物。β-D-氧基缺口聚物是其中区域F和F’中任一者或两者均包含β-D-氧基LNA核苷或由其组成的缺口聚物。
在一些实施方案中，LNA缺口聚物具有下式：[LNA]1–5-[区域G]-[LNA]1-5，其中区域G如缺口聚物定义中那样限定。
MOE缺口聚物
MOE缺口聚物是其中区域F和F’由MOE核苷组成的缺口聚物。在一些实施方案中，MOE缺口聚物具有以下布局：[MOE]1-8-[区域G]-[MOE]1-8，如[MOE]2-7-[区域G]5-16-[MOE]2-7，如[MOE]3-6-[区域G]-[MOE]3-6，其中区域G如缺口聚物定义中那样限定。本领域中已经广泛使用具有5-10-5布局(MOE-DNA-MOE)的MOE缺口聚物。
混合型翼部缺口聚物
混合型翼部缺口聚物是这样的LNA缺口聚物，其中区域F和F’中一者或两者包含2’取代的核苷，如独立选自以下的2’取代的核苷：2’-O-烷基-RNA单位、2'-O-甲基-RNA、2’-氨基-DNA单位、2'-氟代-DNA单位、2’-烷氧基-RNA、MOE单位、阿糖核酸(ANA)单位和2'-氟代-ANA单位，如MOE核苷。在区域F和F’的至少一者或区域F和F’两者均包含至少一个LNA核苷的一些实施方案中，区域F和F’的剩余核苷独立地选自MOE和LNA。在区域F和F’的至少一者或区域F和F’两者均包含至少两个LNA核苷的一些实施方案中，区域F和F’的剩余核苷独立地选自MOE和LNA。在一些混合型翼部实施方案中，区域F和F’中一者或两者可以进一步包含一个或多个DNA核苷。
WO2008/049085和WO2012/109395中公开了混合型翼部缺口聚物布局，所述两篇文献因而均通过引用的方式并入。
交替性侧翼缺口聚物
具有交替性侧翼的寡核苷酸是其中侧翼至少之一(F或F’)包含除LNA核苷之外的DNA的LNA缺口聚物寡核苷酸。在一些实施方案中，区域F或F’的至少一者或区域F和F’两者均包含LNA核苷和DNA核苷二者。在这类实施方案中，侧翼区F或F’，或F和F’两者包含至少三个核苷，其中F和/或F’区域的5’和3’末端核苷是LNA核苷。
在一些实施方案中，区域F或F’的至少一者或区域F和F’两者均包含LNA核苷和DNA核苷二者。在这类实施方案中，侧翼区F或F’，或F和F’两者包含至少三个核苷，其中F或F’区域的5’和3’末端核苷是LNA核苷。包含LNA核苷和DNA核苷二者的侧翼区称作交替性侧翼，因为它们包含LNA-DNA-LNA核苷的交替性基序。WO2016/127002中公开了交替性侧翼LNA缺口聚物。
交替性侧翼区域可以包含多达3个连续DNA核苷，如1至2个或1或2或3个连续DNA核苷。
可以将交替性侧翼注释为一系列整数，其代表一些LNA核苷(L)，随后是一些DNA核苷(D)，例如
[L]1-3-[D]1-4-[L]1-3
[L]1-2-[D]1-2-[L]1-2-[D]1-2-[L]1-2
在寡核苷酸布局中，这些将经常作为数字表示，从而2-2-1代表5’[L]2-[D]2-[L]3’，并且1-1-1-1-1代表5’[L]-[D]-[L]-[D]-[L]3’。具有交替性侧翼的寡核苷酸中侧翼(区域F和F’)的长度可以独立地是3至10个核苷，如4至8个，如5至6个核苷，如4、5、6或7个修饰的核苷。在一些实施方案中，缺口聚物寡核苷酸中的仅侧翼之一有交替性，而另一者由LNA核苷酸构成。可以有利的是在3’侧翼(F’)的3'末端具有至少两个LNA核苷，以赋予额外的核酸外切酶抗性。一些具有交替性侧翼的寡核苷酸的实例是：
[L]1-5-[D]1-4-[L]1-3-[G]5-16-[L]2-6
[L]1-2-[D]1-2-[L]1-2-[D]1-2-[L]1-2-[G]5-16-[L]1-2-[D]1-3-[L]2-4
[L]1-5-[G]5-16-[L]-[D]-[L]-[D]-[L]2
条件是缺口聚物区域F-G-F’的总体长度是至少12个，如至少14个核苷酸长度。
全聚物
在一些实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列的全部核苷均是糖修饰的核苷。本文中这类寡核苷酸称作全聚物。
在一些实施方案中，全聚物的全部糖修饰的核苷包含相同的糖修饰，例如，它们可以全部是LNA核苷，或可以全部是2’O-MOE核苷。在一些实施方案中，全聚物的糖修饰的核苷可以独立地选自LNA核苷和2’取代的核苷，如选自以下的2’取代的核苷：2’-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧乙基-RNA(MOE)、2’-氨基-DNA、2'-氟代-RNA和2’-F-ANA核苷。在一些实施方案中，寡核苷酸包含LNA核苷和2’取代的核苷，如2’取代的核苷，如选自以下的2’取代的核苷：2’-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧乙基-RNA(MOE)、2’-氨基-DNA、2'-氟代-RNA和2’-F-ANA核苷。在一些实施方案中，寡核苷酸包含LNA核苷和2’-O-MOE核苷。在一些实施方案中，寡核苷酸包含(S)cET LNA核苷和2’-O-MOE核苷。
在一些实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列的全部核苷是LNA核苷，如β-D-氧基-LNA核苷和/或(S)cET核苷。在一些实施方案中，这类LNA全聚物寡核苷酸具有7–12个核苷之间的长度(参见例如，WO2009/043353)。这类短的完整LNA寡核苷酸在抑制微RNA方面特别有效。
各种全聚物化合物作为治疗用寡聚物高度地有效，尤其在靶向微RNA(抗miR)或作为剪接转换寡聚物(SSO)时。
在一些实施方案中，全聚物包含至少一个XYX或YXY序列基序，如重复序列XYX或YXY或由其组成，其中X是LNA和Y是替代性(即非LNA)核苷酸类似物，如2’-OMe RNA单位和2'-氟代DNA单位。在一些实施方案中，以上序列基序可以例如是XXY、XYX、YXY或YYX。
在一些实施方案中，全聚物可以包含7个和24个核苷酸之间如7、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个核苷酸的连续核苷酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，全聚物的连续核苷酸序列包含至少30％、如至少40％、如至少50％、如至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％、如95％、如100％的LNA单位。对于完全LNA化合物，有利的是它们具有小于12个(如7–10个)核苷酸长度。
剩余的单位可以选自本文中提及的非LNA核苷酸类似物，如选自2’-O-烷基-RNA单位、2’-OMe-RNA单位、2’-氨基-DNA单位、2'-氟代-DNA单位、LNA单位、PNA单位、HNA单位、INA单位和2’MOE RNA单位或选自2’-OMe RNA单位和2'-氟代DNA单位的那些。
混聚物
术语‘混聚物’指包含DNA核苷和糖修饰的核苷二者的寡聚物，其中存在招募RNA酶H的不足长度的连续DNA核苷。适当地，混聚物可以包含多达3个或多达4个连续DNA核苷。在一些实施方案中，混聚物包含糖修饰的核苷交替的区域和DNA核苷。通过并入寡核苷酸时与DNA核苷短区域形成RNA样(3’内式)构象的糖修饰的核苷的交替区域，可以产生不招募RNA酶H的寡核苷酸。有利地，糖修饰的核苷是增强亲和力的糖修饰的核苷。
寡核苷酸混聚物经常用来提供基于占据的对靶基因(如剪接调节物或微RNA抑制物)的调节作用。
在一些实施方案中，在混聚物或其连续核苷酸序列中的糖修饰的核苷包含或全部是LNA核苷，如(S)cET或β-D-氧基LNA核苷。
在一些实施方案中，混聚物的全部糖修饰的核苷包含相同的糖修饰，例如，它们可以全部是LNA核苷，或可以全部是2’O-MOE核苷。在一些实施方案中，混聚物的糖修饰的核苷可以独立地选自LNA核苷和2’取代的核苷，如选自以下的2’取代的核苷：2’-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧乙基-RNA(MOE)、2’-氨基-DNA、2'-氟代-RNA和2’-F-ANA核苷。在一些实施方案中，寡核苷酸包含LNA核苷和2’取代的核苷，如2’取代的核苷，如选自以下的2’取代的核苷：2’-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧乙基-RNA(MOE)、2’-氨基-DNA、2'-氟代-RNA和2’-F-ANA核苷。在一些实施方案中，寡核苷酸包含LNA核苷和2’-O-MOE核苷。在一些实施方案中，寡核苷酸包含(S)cET LNA核苷和2’-O-MOE核苷。
在一些实施方案中，混聚物或其连续核苷酸序列仅包含LNA和DNA核苷，这类LNA混聚物寡核苷酸可以例如长度在8–24个核苷之间(参见例如，WO2007112754，其公开了微RNA的LNA antmiR抑制剂)。
各种混聚物化合物作为治疗用寡聚物高度地有效，尤其在靶向微RNA(抗miR)或作为剪接转换寡聚物(SSO)时。
在一些实施方案中，混聚物包含以下基序
…[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m…或
…[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m…或
…[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m…或
…[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m…或
其中L代表糖修饰的核苷如LNA或2’取代的核苷(例如2’-O-MOE)，D代表DNA核苷，并且其中每个m独立地选自1–6，并且每个n独立地选自1、2、3和4，如1-3或1-2，并且…代表寡核苷酸或其连续核苷酸序列的任选的5’端或3’端核苷(例如区域D或D”)或5’或3’末端。
在一些实施方案中，每个L是LNA核苷。在一些实施方案中，至少一个L是LNA核苷并且至少一个L是2’-O-MOE核苷。在一些实施方案中，每个L独立地选自LNA和2’-O-MOE核苷。
在一些实施方案中，混聚物可以包含10个和24个核苷酸之间如11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个核苷酸的连续核苷酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，混聚物的连续核苷酸序列包含至少30％，如至少40％，如至少50％的LNA单位。
在一些实施方案中，混聚物包含核苷酸类似物和天然存在核苷酸或一个类型的核苷酸类似物和第二类型的核苷酸类似物的重复样式的连续核苷酸序列，或由其组成。该重复样式例如可以如下：每隔一个或每隔二个核苷酸是核苷酸类似物，如LNA，并且剩余的核苷酸是天然存在的核苷酸，如DNA，或可以是2’取代的核苷酸类似物如本文提到的2’氟代类似物的2’MOE，或在一些实施方案中，可以选自本文中提及的核苷酸类似物群组。认识到，核苷酸类似物(如LNA单位)的重复样式可以与固定位置处–例如5’或3’末端处的核苷酸类似物组合。
在一些实施方案中，从3’末端计数，寡聚物的第一核苷酸是核苷酸类似物，如LNA核苷酸或2’-O-MOE核苷。
在可以相同或不同的一些实施方案中，从3’末端计数，寡聚物的第二核苷酸是核苷酸类似物，如LNA核苷酸或2’-O-MOE核苷。
在可以相同或不同的一些实施方案中，寡聚物的5’末端是核苷酸类似物，如LNA核苷酸或2’-O-MOE核苷。
在一些实施方案中，混聚物包含至少这样的区域，所述区域由至少两个连续核苷酸类似物单位(如至少两个连续LNA单位)组成。
在一些实施方案中，混聚物包含至少这样的区域，所述区域由至少三个连续核苷酸类似物单位(如至少三个连续LNA单位)组成。
寡核苷酸中的区域D’或D”
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸可以包含寡核苷酸的与靶核酸互补的连续核苷酸序列(如缺口聚物F-G-F’)和其他5’和/或3’核苷或由其组成。其他5’和/或3’核苷可以完全互补于或可以不完全互补于靶核酸。本文中这类其他5’和/或3’核苷可以称作区域D’和D”。
为了将连续核苷酸序列(如缺口聚物)与缀合物部分或另一个官能团连接，可以使用添加区域D’或D”。当用于连接时，具有缀合物部分的连续核苷酸序列可以充当生物可切割接头。备选地，它可以用来提供核酸外切酶防护作用或促进合成或制造。
区域D’和D”可以分别连接至区域F的5'末端或区域F’的3’末端，以产生以下式的布局：D’-F-G-F’、F-G-F’-D”或D’-F-G-F’-D”。在这个实例中，F-G-F’是寡核苷酸的缺口聚物部分并且区域D’或D”构成寡核苷酸的分开的部分。
区域D’或D”可以独立地包含1、2、3、4或5个额外核苷酸或由其组成，所述额外核苷酸可以互补或不互补于靶核酸。与F或F’区域毗邻的核苷酸不是糖修饰的核苷酸，如DNA或RNA或这些的碱基修饰形式。D’或D’区域可以充当核酸酶易感的生物可切割接头(参见接头的定义)。在一些实施方案中，额外的5’和/或3’末端核苷酸以磷酸二酯键连接并且是DNA或RNA。WO2014/076195中公开了适合用作区域D’或D”的基于核苷酸的生物可切割接头，其以举例方式包含磷酸二酯连接的DNA二核苷酸。WO2015/113922中公开了生物可切割接头在多-寡核苷酸构建体中的用途，其中它们用来连接单个寡核苷酸内部的多个反义构建体(例如缺口聚物区域)。
在一个实施方案中，除连续核苷酸序列之外，本发明的寡核苷酸包含构成缺口聚物的区域D’和/或D”。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸可以由下式代表：
F-G-F’；尤其F1-8-G5-16-F’2-8
D’-F-G-F’；尤其D’1-3-F1-8-G5-16-F’2-8
F-G-F’-D”；尤其F1-8-G5-16-F’2-8-D”1-3
D’-F-G-F’-D”；尤其D’1-3-F1-8-G5-16-F’2-8-D”1-3
在一些实施方案中，位于区域D’和区域F之间的核苷间键是磷酸二酯键。在一些实施方案中，位于区域F’和区域D”之间的核苷间键是磷酸二酯键。
缀合物
如本文所用的术语“缀合物”指与非核苷酸部分(缀合物部分或区域C或第三区域)共价连接的寡核苷酸。
本发明寡核苷酸与一个或多个非核苷酸部分的缀合可以例如通过影响寡核苷酸的活性、细胞分布、细胞摄取或稳定性，改善寡核苷酸的药理学。在一些实施方案中，缀合物部分通过改进寡核苷酸的细胞分布、生物利用度、代谢、排泄、通透性和/或细胞摄取，调节或增强寡核苷酸的药代动力学特性。尤其，缀合物可以导引寡核苷酸至特定的器官、组织或细胞类型并且因而增强寡核苷酸在这种器官、组织或细胞类型中的有效性。同时，缀合物可以起到减少寡核苷酸在非靶细胞类型、组织或器官中活性(例如非靶细胞类型、组织或器官中的脱靶活性或活性)的作用。WO 93/07883和WO2013/033230提供了合适的缀合物部分，所述文献因而通过引用的方式并入。其他的合适缀合物部分是能够与脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPr)结合的那些。特别地，三价N-乙酰半乳糖胺缀合物部分适于与ASGPr结合，参见例如WO 2014/076196、WO 2014/207232和WO 2014/179620(所述文献因而通过引用的方式并入)。
寡核苷酸缀合物和它们的合成也已经在以下文献中报道：Manoharan的综合述评，引自Antisense Drug Technology,Principles,Strategies,and Applications,S.T.Crooke编著,第16章，Marcel Dekker,Inc.,2001和Manoharan,Antisense andNucleic Acid Drug Development,2002,12,103，所述文献的每一篇通过引用方式完整地并入本文。
在一个实施方案中，非核苷酸部分(缀合物部分)选自糖、细胞表面受体配体、药物成分、激素、亲脂物质、聚合物、蛋白质、肽、毒素(例如细菌毒素)、维生素、病毒蛋白(例如衣壳)或其组合。
接头
键或接头是在两个原子之间借助一个或多个共价键将一个目的化学基团或区段与另一个目的化学基团或区段结合的连接。缀合物部分可以与寡核苷酸直接连接或通过连接部分(例如接头或系留物)连接。接头起到的作用是将第三区域例如缀合物部分(区域C)共价连接至第一区域，例如与所述靶核酸(区域A)互补的寡核苷酸或连续核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，本发明的缀合物或寡核苷酸缀合物可以任选地包含位于互补于所述靶核酸(区域A或第一区域)的寡核苷酸或连续核苷酸序列和缀合物部分(区域C或第三区域)之间的接头区(第二区域或区域B和/或区域Y)。
区域B指生物可切割接头，其包含在哺乳动物身体内部通常遇到的条件或与哺乳动物身体内部遇到的那些条件类似的条件下可切割的生理不稳定键或由其组成。在其下生理不稳定接头发生化学转化(例如，切割)的条件下包括在哺乳动物细胞中存在或与哺乳动物细胞中遇到的那些类似的化学条件如pH、温度、氧化或还原条件或物质以及盐浓度。哺乳动物胞内条件还包括在哺乳动物细胞中正常存在的酶活性的存在，如来自蛋白酶解酶或水解酶或核酸酶。在一个实施方案中，生物可切割接头易遭S1核酸酶切割。在一个优选实施方案中，核酸酶敏感接头包含1和10个之间的核苷，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷，更优选地2和6个之间的核苷和最优选地2和4个之间连接的核苷，所述核苷包含至少两个连续磷酸二酯键，如至少3或4或5个连续磷酸二酯键。优选地，核苷是DNA或RNA。WO2014/076195中更详细地描述了含有生物可切割接头的磷酸二酯(所述文献因而通过引用的方式并入)。
区域Y指这样的接头，所述接头不必是生物可切割的，但主要起到以下作用：将缀合物部分(区域C或第三区域)共价连接至寡核苷酸(区域A或第一区域)。区域Y接头可以包含重复单位如乙二醇单位、氨基酸单位或氨基烷基的链结构或寡聚物。本发明的寡核苷酸缀合物可以由以下区域性元件A-C、A-B-C、A-B-Y-C、A-Y-B-C或A-Y-C构成。在一些实施方案中，接头(区域Y)是氨基烷基，如C2–C36氨基烷基，例如包括C6至C12氨基烷基。在一个优选实施方案中，接头(区域Y)是C6氨基烷基。
实施例
实施例1
DNA 3’-O-噁唑磷烷单体的合成如先前所述那样进行(Oka等人,J.Am.Chem.Soc.2008130:16031–16037；和Wan等人,NAR 2014,11月,在线发表)。LNA单体的合成如先前所述那样进行(WO2016/079181)。
实施例2子文库发现方法的开发
母体化合物：5'-Gs mCs as as gs cs as ts cs cs ts Gs T-3‘(SEQ ID NO 1)，其中大写字母代表β-D-氧基LNA核苷(处于β-D取向的2’-O-CH2-4’桥接的核苷)，小写字母代表DNA核苷，下标s代表立体无规硫代磷酸酯键，并且mC是5甲基胞嘧啶。
分析体系：在5μM浓度借助剥裸递送法向HeLa细胞引入，在体外测试寡核苷酸。3天后收获细胞。
分析：通过qPCR分析Hif-1αmRNA敲低。
13聚母体化合物具有12个立体化学未确定的硫代磷酸酯核苷间键。为了鉴定母体化合物的立体限定的变体，利用两种替代性方案：
策略1：用随机化立体限定的基序合成236种基于母体化合物的完全立体限定的化合物。在分析体系中筛选这些化合物。图8中显示结果。三种最强力的已鉴定化合物是：
RTR34818：5′-GsrP mCssP assP asrP gsrP cssP asrP tsrP cssP csrP tssP GssP T-3‘
RTR34887：5′-GsrP mCssP asrP asrP gsrP cssP assP tsrP cssP csrP tssP GssP T-3‘
RTR34593：5′-GsrP mCssP asrP asrP gsrP cssP assP tsrP csrP cssP tsrP GssP T-3‘
策略2–第1部分：我们将母体化合物分成三个区域，每个区域包含4个连续硫代磷酸酯键。对于每个区域，我们产生16个子文库，其中该区域内部的硫代磷酸酯核苷间键各自具有16种可能的(24)立体限定的基序中的1种，其中剩余的核苷间键是立体无规核苷间键。合成的部分立体限定的化合物的总数因此是16+16+16＝48个子文库化合物(实验的示意图，参见图2)。在分析体系中筛选每个子文库。图9a、图9b和图9c中显示结果。
策略2–第1部分：从第1部分起，我们鉴定了三个区域中每一者的立体限定的基序的最强力子文库并且设计了完全立体限定的化合物，其并入来自全部三个最强力子文库的立体限定的基序，三个区域中每一者并入一个。
鉴定的化合物是：
RTR34593：5′-GsrP mCssP asrP asrP gsrP cssP assP tsrP csrP cssP tsrP GssP T-3‘
这与依据策略1鉴定的最强力化合物相同，从而验证子文库方案为一种不合成独立变体的广泛文库的情况下选择母体寡核苷酸的优选的优化立体限定的变体的方案。本发明的方法因此允许通过大幅度降低非对映异构体文库的复杂度，高效发现立体限定的变体(子文库或完全立体限定的化合物)。例如，位置5 RSSR子文库将文库的复杂度从2^12＝4096降低至2^8＝256种非对映异构体，并且利用合并的子文库方案(第2部分)，该复杂度可以从4096降至49。
实施例3：检查“RSSR”基序的位置要求
在实施例2中，我们确定，最强力子文库和最强力化合物中数者具有立体限定的核苷间键“5’–RSSR 3’”基序，其随置于第5和第6核苷之间的第一Rp核苷间键一起定位，称作位置5(图10中所示)。下文提供位置5–8区域子文库的数据：
从下表的策略1参见关于完全立体限定的化合物的数据：
位置5(5-8立体限定的)
位置6(6–9立体限定的)
我们得出结论，RSSR基序的位置就其对效价的影响而言至关重要，并且随后通过将RSSR基序移动1个位置，例如移动至位置6，一般导致效价净损失(还在11图中显示)。因此得出结论，RSSR立体限定的基序在寡核苷酸序列内部不可动。
实施例4：位置5RSSR基序的体外→体内可转换性。
为了确定RSSR位置5基序在SEQ ID NO:1的化合物中的效价增强作用是否从体外转换至体内。选择两种立体限定的Hif1a化合物用于这项研究：
6只黑色小鼠接受立体限定的LNA寡核苷酸或对照LNA化合物混合物处理并且测量Hif-1αmRNA敲低、寡核苷酸的组织含量和ALT。
向雌性C57BL6/J小鼠(5只/组，到达时大约20g)静脉内注射单剂盐水或10mg/kgLNA-反义寡核苷酸硫代磷酸酯随机混合物(来自实施例2的母体寡核苷酸)或10mg/kg立体限定的LNA反义寡核苷酸(ID#22或ID#18)。在第3天处死动物并且采集总血清以及肝脏和肾。
通过qPCR分析Hif-1αmRNA敲低。简言之，根据生产商的说明，使用Magna Pure RNA分离和纯化系统(目录号#03604721001和#05467535001；Roche)从均化的肝脏和肾脏分离RNA。使用Taqman Fast通用PCR主混合物2x(Applied Biosystems目录号4364103)和Taqman基因表达测定(mHif-1α，Mm004688869_m1和mGAPDH#4352339E)，遵循制造商方案，进行RT-QPCR。图12中显示结果。
使用夹心ELISA方法，测量肝脏和肾脏中的寡核苷酸含量，并且图13a和图13b中显示结果。
结论：在肝脏中，与随机混合物(ID#39)相比，位置5RSSR化合物，RTR25859立体限定的LNA寡核苷酸(ID#18)，对mRNA靶显示改进的效果，而与随机混合物相比，位置6RSSR立体限定的LNA寡核苷酸(ID#21)显示较少下调靶向的mRNA。
值得注意地，与随机混合物(ID#39)和立体限定的其他形式(ID#21)相比，肝脏和肾脏中RTR25859(ID#18)的组织含量均较高。这两者(ID#39和ID#21)在肝脏中具有相似的摄取，但是与随机混合物(ID#39)和ID#18相比，立体限定的LNA(ID#21)在肾组织中具有较少的摄取。与随机混合物(ID#39)相比以及彼此相比，立体限定的LNA(ID#18和ID#21)具有不同的摄取和效价。这个实施例显示，鉴定的优选基序在体外和体内实验之间可转换并且效价可能与增强的摄取有关。
实施例5相比随机混合物LNA，立体限定的LNA寡核苷酸对ApoB mRNA的体内影响
已经对单一化合物展示，位置5RSSR基序是体外和体内优选的基序(实施例3和4)，我们希望确定该基序是否在序列不同的反义寡核苷酸之间可转移。
母体寡核苷酸：(#40)Gs mCsaststsgsgstsastsTs mCsA,(SEQ ID NO 2)，其中大写字母代表β-D-氧基LNA核苷(处于β-D取向的2’-O-CH2-4’桥接的核苷)，小写字母代表DNA核苷，下标s代表立体无规硫代磷酸酯键，并且mC是5甲基胞嘧啶。
所用的立体限定的变体：
6只黑色小鼠接受立体限定的LNA寡核苷酸或对照LNA化合物混合物处理并且测量ApoB mRNA敲低、寡核苷酸的组织含量、ALT和总胆固醇。
向雌性C57BL6/J小鼠(5只/组，到达时大约20g)静脉内注射单剂盐水或1mg/kgLNA-反义寡核苷酸硫代磷酸酯随机混合物(ID#40)或1mg/kg立体限定的LNA反义寡核苷酸(本发明的ID#41或ID#42)。在给药前第-6天和给药后第3天采集50μl的血液样品。在第7天处死动物并且采集总血清以及肝脏和肾。
通过qPCR分析ApoB mRNA敲低。简言之，根据生产商的说明，使用Magna Pure RNA分离和纯化系统(目录号#03604721001和#05467535001；Roche)从均化的肝脏和肾脏分离RNA。使用Taqman Fast通用PCR主混合物2x(Applied Biosystems目录号4364103)和Taqman基因表达测定(mApoB，Mm01545150_m1和mGAPDH#4352339E)，遵循制造商方案，进行RT-QPCR。图14a和图14b中显示结果。
使用夹心ELISA方法，测量肝脏和肾脏中的寡核苷酸含量，并且图15a和图15b中显示结果。
肝组织和肾组织采样.将动物用70％CO2-30％O2麻醉并且在第7天通过颈椎脱臼法处死用于ApoB靶。将一半肝脏大叶和一只肾切碎并淹没在RNAlater中。将另一半肝脏和另一只肾冷冻并用于组织分析。通过夹心ELISA方法测量肝脏和肾脏中的寡核苷酸含量(基本上如Lindholm等人,Mol Ther.2012Feb；20(2):376-81中所述)。
根据制造商的说明，使用ABX Pentra胆固醇CP(Triolab,Brondby,丹麦)测量血清中的总胆固醇。图16中显示结果。
结论：在肝脏中，与随机混合物(ID#40)相比，立体限定的LNA寡核苷酸之一(ID#42)，对mRNA靶显示明显的改进效果，而与随机混合物相比，另一立体限定的LNA寡核苷酸(ID#41)对靶向的mRNA显示相似效果。总胆固醇读数支持mRNA效果，在于立体限定的LNA寡核苷酸ID#42远比随机混合物ID#40和立体限定的另一形式ID#41更强力。结果表明对于最佳体内功效，还应当将RSSR基序置于位置5处(如随Hif1α化合物所见)并且该基序向3’末端单一移动产生了比非立体限定的对照效力更小的化合物。
我们已经先前报道了基于母体化合物#40的ApoB化合物的明显不同的RNA酶H活性，并对该数据的评审没有将RSSR位置5鉴定为与升高的RNA酶H活性相关：参见WO2016/096938中的实施例7。我们因此得出结论，位置5RSSR化合物的增强效价不归因于RNA酶H酶的酶偏好性。
实施例6在U251细胞系中按单次给药浓度体外测试靶向人mRNA的寡核苷酸的功效。
为了验证位置5RSSR基序是否适于靶向不同靶的不同的序列和布局的不同LNA缺口聚物和，我们产生了具有下述布局的LNA缺口聚物化合物的263种完全立体无规变体：5’LLLdddddddddLLLL 3’，其中L是β-D-氧基LNA核苷(2’-O-CH2-4’桥接的处于β-D-方向的核苷)并且d代表DNA核苷，其中全部核苷间键均是立体限定的硫代磷酸酯核苷间键。
人胶质母细胞瘤U251细胞系购自ECACC并且如供应商推荐那样在37℃含5％CO2的增湿培养箱中下维持。对于测定法，将2000个U251个细胞/孔接种在96多孔平板中供应商推荐的培养基内。将细胞温育2小时，之后添加溶解于PBS中的寡核苷酸。寡核苷酸浓度：5μM。添加寡核苷酸后4天，收获细胞。使用PureLink Pro 96RNA纯化试剂盒(Ambion，根据生产商的说明)提取RNA。使用qScript XLT一步RT-qPCR ToughMix Low ROX,95134-100(QuantaBiosciences)，进行cDNA合成和qPCR。TaqMan引物测定法用来检测靶mRNA和持家基因GAPDH。全部引物集合均购自Life Technologies。表中靶mRNA表达的相对表达水平作为对照(PBS处理的细胞)的％显示。
图17中显示结果。与13聚Hif1α2-9-3化合物和2-8-3ApoB化合物一样，具有位置5RSSR基序的16聚3-9-4化合物明显更强力。
为了进一步验证这点，我们使用独立的靶和序列重复该实验，这次使用子文库方案使RSSR基序游走穿过13核苷酸母LNA缺口聚物寡核苷酸布局(基序游走方案)。与从ApoB和Hif1α化合物获得的结果相反，位置5子文库并未比母体更强力，并且在这种情况下，位置3RSSR基序显著地更强力(图18)。
因此，我们得到结论：一些立体限定的基序可能与立体限定的变体的增强特性相关，同时，这种基序的效果取决于独立寡核苷酸的背景，如寡核苷酸的序列、化学修饰和布局。
实施例7立体限定的变体的多参数优化。
为了确定我们是否可利用本文所公开的发现方法，我们在小鼠的体内实验中评价了一系列通过体外效力和在体外肝毒性测定法(WO2016/096938中公开)鉴定的完全立体限定的化合物，并且评价化合物选择项的效价、肝毒性和寡聚物含量。
体内实验中所用的化合物均基于Hif1α母体化合物并且是如下：
| 寡聚物 | 手性 | 序列 |
| RTR4358 | 混合 | G<sup>m</sup>CaagcatccsGT |
| RTR34818 | RSSRRSRRSRSS | G<sup>m</sup>CaagcatccsGT |
| RTR34887 | RSRRRSSRSRSS | G<sup>m</sup>CaagcatccsGT |
| RTR34593 | RSRRRSSRRSRS | G<sup>m</sup>CaagcatccsGT |
| RTR39330 | RRSSRSSRSRSS | G<sup>m</sup>CaagcatccsGT |
| RTR30233 | SRRSRSSRRSRR | G<sup>m</sup>CaagcatccsGT |
化合物34887、34593、39330和30233全部包含位置5RSSR基序。化合物34818没有位置5RSSR基序。按照实施例4进行实验，并且图19中显示数据。
图19显示，尽管RSSR位置5基序可以为化合物提供增强的体内效价，但存在体内不如母体化合物强力的位置5RSSR化合物。然而，效价和毒性之间不存在相关性并且本发明的方法因而可以用来鉴定在不引入升高的肝毒性情况下具有增强的效价的化合物。我们惊讶地发现，在受测化合物的效价或肝毒性与肝脏之间不存在相关性，不过与实施例4和5中所述的体内实验一样，如与母体化合物相比，最强力的RSSR化合物具有升高的寡聚物含量。获得的这个结果显示各个完全立体限定的化合物之间产生的可观体内药理学多样性，及具有非常相似的立体限定的基序的化合物之间药理学性能的不可预测性，这进一步凸显本文所公开的多个子文库发现方法在鉴定药理学改进的化合物方面的价值。
实施例8/图20：单个位置基序游走。生成一个选定的立体无规19聚LNA缺口聚物母体化合物和两个文库，一个文库中跨寡核苷酸游走单一Sp立体限定的核苷间键，从而文库的每个成员相对于Sp立体限定的键的位置而言不同；和第二文库中跨寡核苷酸游走单一Rp立体限定的核苷间键，从而文库的每个成员相对于Rp立体限定的键的位置而言不同。在这个实验中，剩余的核苷间键是立体无规的。在U251细胞中使用1μM剥裸递送，对每个文库的每个成员分析针对mRNA靶的效价(关于方法，参见实施例6)。测定每个文库成员的mRNA靶敲低。结果鉴定到其中立体限定(Sp或Rp)是寡核苷酸效价的明显决定因素的4个位置和其中立体化学不是寡核苷酸效价的有意义决定因素的7个位置。这种方案允许设计部分立体限定的化合物，其在立体相关位置包含优选的立体限定的核苷间键并且在立体不相关位置包含立体无规核苷间键。这类优化的子文库化合物可以在(例如本发明的)进一步优化方法中用于鉴定具有其他改进特性的其他立体限定的变体，包括完全立体限定的变体。
可以使用子文库重复位置游走实验或本文所述的方法，其中，每个文库中的背景核苷间键为全Sp或全Rp(立体纯背景键)，而非立体无规的。对于单一核苷间键游走，可以在Rp核苷间键背景中游走单一Sp核苷间键，并且可以在Sp核苷间键背景中游走单一Rp核苷间键。
Claims (31)
1.一种用于鉴定反义寡核苷酸的改进的立体限定的硫代磷酸酯变体的方法，所述方法包括以下步骤：
a.向母体寡核苷酸提供限定的序列和核苷修饰样式；
b.生成立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸的文库，所述硫代磷酸酯寡核苷酸保留母体寡核苷酸的限定的序列和核苷修饰样式，
其中
(i)文库的每个成员是包含立体限定的硫代磷酸酯反义寡核苷酸非对映异构体的混合物的子文库，其中混合物的每个成员包含立体限定的核苷间基序区域，其中，立体限定的核苷间基序区域是3-8个或2–8个连续核苷的共有区域，其中剩余的核苷间键包含立体无规硫代磷酸酯核苷间键；其中，每个共有的立体限定核苷间键基序区域的长度和位置在文库的每个成员之间相同；并且其中，文库的每个成员在立体限定的核苷间基序区域包含不同的共有的立体限定核苷间基序；
或
(ii)其中文库的每个成员是包含立体限定的硫代磷酸酯反义寡核苷酸非对映异构体的混合物的子文库，其中混合物的每个成员在寡核苷酸中的相同位置处包含共有的立体限定核苷间键基序，其中剩余的核苷间键包含立体无规硫代磷酸酯核苷间键；其中文库的每个成员包含相同的共有的立体限定核苷间键基序，其中共有的立体限定核苷间键基序的位置在文库的每个成员之间不同；
c.对步骤b)中生成的文库的每个成员筛选至少一个改进的特性，如与母体寡核苷酸相比，改进的效价和/或降低的毒性；
d.鉴定一个或多个具有改进特性的文库成员。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤b.包括在步骤b(i)中定义的步骤。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，每个立体限定的核苷间键基序区域的长度是3、4、5或6连续核苷酸(或2、3、4或5个核苷键)。
4.根据权利要求2-3中任一项所述的方法，其中，每个立体限定的核苷间键基序区域是3或4个核苷键。
5.根据权利要求2–4中任一项所述的方法，其中文库在立体限定的核苷间键基序区域内部包含每个可能的立体限定的核苷间键基序的成员。
6.根据权利要求2–5中任一项所述的方法，其中文库的每个成员各自包含
-选自RRR、RSR、RRS、RSS、SSS、SRS、SSR、SRR的三联键基序，或
-选自RRRR、RRRS、RRSR；RSRR、RRSS；RSRS；RSSR；RSSS、SSSS、SSSR；SSRS；SRSS；SSRR；SRSR；SRRS、SRRR的四联键基序，或
-选自RRRRR、RRRRS、RRRSR、RRRSS、RRSRR；RRSRS、RSRRR、RRSSR；RSRSR；RSSRR；RSSSR、SSSSR、SSSRR；SSRSR；SRSSR；SSRRR；SRSRR；SRRSR、SRRRR、RSRRS、RRSSS；RSRSS；RSSRS；RSSSS、SSSSS、SSSRS；SSRSS；SRSSS；SSRRS；SRSRS；SRRSS或SRRRS的五联键基序。
7.根据权利要求2-6中任一项所述的方法，其中文库是全面的。
8.根据权利要求2–7中任一项所述的方法，其中在每个文库成员的反义寡核苷酸内部至少30％，如至少40％或至少50％，或大部分的或全部的剩余核苷间键是立体无规硫代磷酸酯核苷间键。
9.根据权利要求2–8中任一项所述的方法，其中方法还包括步骤
e)选择在步骤d)中鉴定的至少一个改进的寡核苷酸变体
f)生成立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸的文库，所述硫代磷酸酯寡核苷酸保留改进的寡核苷酸变体的限定的序列和核苷修饰样式和相同的立体限定的核苷间基序，其中文库的每个成员包含一个或多个其他立体限定的硫代磷酸酯核苷间键，并且其中文库的每个成员就其他立体限定的硫代磷酸酯核苷间键的样式而言不同，
g.对步骤f)中生成的文库的每个成员筛选至少一个改进的特性，所述特性可能与如步骤c)中所分析的不同的改进特性相同。
10.根据权利要求2–9中任一项所述的方法，其中所述方法的步骤b(i)包括产生多个文库，其中每个文库如步骤b(i)中那样限定并且其中每个共有的立体限定核苷间键基序区域的位置在多个文库的每者之间不同，其中每个文库可以是如前述任一项权利要求中所限定的文库。
11.根据权利要求10所述的方法，其中方法还包括步骤：从多个文库的每者鉴定改进的立体限定的变体，并且从多个文库制备又一立体限定的变体，其包含每个鉴定的改进的立体限定的变体的立体限定的核苷间键基序。
12.根据权利要求11所述的方法，其中筛选多个文库的至少两者或至少三者，以从多个文库的每者鉴定改进的立体限定的变体，其中每个文库如步骤b(i)中那样定义。
13.根据权利要求12所述的方法，其中又一立体限定的变体寡核苷酸或其连续核苷酸序列是完全立体限定的硫代磷酸酯序列。
14.根据权利要求1所述的方法，其中步骤b.包括在步骤b(ii)中定义的步骤。
15.根据权利要求14所述的方法，其中共有的立体限定核苷间键基序的长度是1-6个核苷间键，如2、3、4或5个核苷间键。
16.根据权利要求15所述的方法，其中共有的立体限定核苷间键基序包含
-选自RRR、RSR、RRS、RSS、SSS、SRS、SSR、SRR的三联键基序，或
-选自RRRR、RRRS、RRSR；RSRR、RRSS；RSRS；RSSR；RSSS、SSSS、SSSR；SSRS；SRSS；SSRR；SRSR；SRRS、SRRR的四联键基序，或
-选自RRRRR、RRRRS、RRRSR、RRRSS、RRSRR；RRSRS、RSRRR、RRSSR；RSRSR；RSSRR；RSSSR、SSSSR、SSSRR；SSRSR；SRSSR；SSRRR；SRSRR；SRRSR、SRRRR、RSRRS、RRSSS；RSRSS；RSSRS；RSSSS、SSSSS、SSSRS；SSRSS；SRSSS；SSRRS；SRSRS；SRRSS或SRRRS的五联键基序
17.根据权利要求14–16中任一项所述的方法，其中共有的立体限定核苷间键基序是或包含RSSR。
18.根据权利要求14–16中任一项所述的方法，其中文库是全面寡核苷酸游走。
19.根据权利要求1–18中任一项所述的方法，其中改进的特性选自增强或优化的亲和力、增强的稳定性、增强的效价、增强的功效，增强的比活性、降低的毒性、改变的生物分布、增强的细胞或组织摄取、增强的作用持续时间和/或增强的靶特异性。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中体外测定改进的特性。
21.根据权利要求1–20中任一项所述的方法，其中反义寡核苷酸是招募RNA酶H的寡核苷酸如反义寡核苷酸缺口聚物寡核苷酸，或是混聚物或全聚物(totalmer)。
22.根据权利要求21所述的方法，其中反义寡核苷酸是LNA寡核苷酸，如LNA缺口聚物寡核苷酸。
23.根据权利要求1–22中任一项所述的方法，其中反义寡核苷酸的长度是7–26个核苷酸长度，如12–24个核苷酸长度。
24.LNA缺口聚物寡核苷酸，选自
5'-GsrP mCssPassPasrPgsrPcssPasrPtsrPcssPcsrPtssPGssPT-3‘(SEQ ID NO 1)或
5'-GsrP mCssPasrPasrPgsrPcssPassPtsrPcssPcsrPtssPGssPT-3‘(SEQ ID NO 1)或
5'-GsrP mCssPasrPasrPgsrPcssPassPtsrPcsrPcssPtsrPGssPT-3‘(SEQ ID NO 1)
其中大写字母代表β-D-氧基LNA核苷(处于β-D取向的2’-O-CH2-4’桥接的核苷)，小写字母代表DNA核苷，下标ssP代表SpSp立体限定的硫代磷酸酯键，并且srP代表Rp立体限定的硫代磷酸酯键。mC代表5-甲基胞嘧啶LNA核苷，或其可药用盐。
25.缀合物，包含根据权利要求24所述的LNA缺口聚物寡核苷酸和与所述寡核苷酸共价连接的至少一个缀合物部分。
26.根据权利要求25所述的缀合物，其中缀合物部分能够与脱唾液酸糖蛋白受体结合，如GalNAc缀合物部分。
27.药物组合物，包含根据权利要求24-26中任一项所述的LNA缺口聚物寡核苷酸或缀合物和可药用稀释剂、载体、盐和/或辅助剂。
28.根据权利要求24-26中任一项所述的LNA缺口聚物寡核苷酸或缀合物的可药用盐。
29.如根据权利要求24-28中任一项所述的LNA缺口聚物寡核苷酸或缀合物，用于药物中。
30.根据权利要求24-28中任一项所述的LNA缺口聚物寡核苷酸或缀合物，用于治疗癌症。
31.根据权利要求24-28中任一项所述的LNA缺口聚物寡核苷酸或缀合物的用途，用于制造治疗癌症的药物。
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