CN115216475A - 用于调节基因表达的寡核苷酸及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于调节基因表达的寡核苷酸,特别是用于调节负责遗传、肿瘤或病毒来源的病状的基因。此外,本发明涉及所述寡核苷酸用于所述疾病的治疗和/或诊断的用途,所述寡核苷酸可能是化学修饰的。
Description
技术领域
本发明涉及用于调节基因表达的寡核苷酸,特别是用于调节负责遗传、肿瘤或病毒来源的病状的基因。
此外,本发明涉及所述寡核苷酸用于所述疾病的治疗和/或诊断的用途,所述寡核苷酸可能是化学修饰的。
背景技术
寡核苷酸是天然RNA或DNA核酸或合成核酸的短序列,例如,PNA(肽核酸)、LNA(锁核酸)和吗啉代寡核苷酸。
已经通过实验证明了寡核苷酸在转录和翻译水平上调节基因的表达中是非常有效的。由于这种能力,寡核苷酸代表了用于各种病状治疗的有效方法,特别是遗传、肿瘤或病毒来源的疾病。
调节基因的表达意味着可以将其抑制或激活。
例如,能够通过与基因的反义链形成互补键(Hélène C,Bioch Bioph Acta 1990,1049(2):99-125)或改变目标基因调控区中的染色质状况(Rossi JJ,Nat Chem Biol2007,3(3):136-7)来抑制基因转录的寡核苷酸是已知的。其他寡核苷酸能够抑制基因翻译,例如,通过与靶标信使RNA(mRNA)的互补键。在单链寡核苷酸的情况中,这种键通过RNase H复合物引起mRNA的酶降解。在其中寡核苷酸是双链“干扰”RNA分子的情况中,寡核苷酸与靶标mRNA的互补键通过RISC复合物的“沉默子”酶,引起信使的降解。在后一种情况中,寡核苷酸还可以是等于内源性microRNA的寡核苷酸,其依靠不完全的互补性,能够与靶标mRNA的3’UTR(3’未翻译区)相连,引起mRNA的翻译被阻断。
寡核苷酸还可以诱导基因的激活或其转录的提高,例如,经由与长的反义非编码RNA的互补键(Morris KV,Epigenetics,2009,4(5):296-301),或通过抑制互补微RNA,结果是微RNA的靶标mRNA的翻译提高。
为了提高它们在治疗和/或诊断条件中的有效性,可以将寡核苷酸进行化学修饰。例如,可以为了提高其特异性和/或与互补序列配对的效力,对寡核苷酸进行修饰,或为了使其对酶降解不太敏感、提高其药物动力学/药效谱,或促进其通过细胞膜,对寡核苷酸进行修饰。
除了天然核酸的寡核苷酸(即,DNA和/或RNA的短序列),还存在合成核酸的寡核苷酸,例如,肽核酸(PNA)和锁核酸(LNA),其已经得到了很大程度的研究和表征,以上全部的目的在于通过反基因策略来调节基因的表达(即,设计来直接冲击(strike)基因)。PNA和LNA寡核苷酸,与全部修饰的寡核苷酸一样,通常在化学上比DNA或RNA寡核苷酸更稳定。可以通过合成嵌合寡核苷酸进一步提高它们的稳定性。嵌合寡核苷酸例如是其中插入了传统单体(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)和合成核碱基(单体)(例如,LNA单体)两者的寡核苷酸序列。
将LNA与反义策略一起使用,通过抑制靶标基因的转录产物来沉默基因(BraaschDA,Nucl Acids Res,2002,30(23):5160-7)。或者,LNA寡核苷酸也可以用于反义策略中,如Smith和同事所做的(Ge R,Faseb J,2007,1902-14),他们设计了以这样的方式能够通过“链入侵”机理在核酸的两条链上相互作用的寡核苷酸序列,使得形成“Z-型”结构(限定为“Zorro”寡核苷酸)。
与其他寡核苷酸结构相比时,PNA寡核苷酸对酶更稳定。PNA可以通过“链入侵”结合双链DNA(DNAds),或可以以互补方式结合单链DNA(DNAss)的分子,或它们可以结合RNA链,产生杂合双螺旋PNA/DNA或PNA/RNA结构,其与“同质双链”结构(如,DNA/DNA双链)相比,在热力学上非常稳定。
PNA代表了用于调节基因表达的高度有利的系统,以上全部使用反基因策略。实际上,已经证明了PNA对靶标序列呈现出高特异性,并且因此能够以有效的方式抑制蛋白质的表达。
因此,PNA代表了用于遗传或病毒的疾病的有前景的治疗方法。
PNA的唯一缺陷是它们具有有限的穿过细胞膜的能力的事实。然而,可以通过通常将寡核苷酸(并且特别是PNA)与能够给予更有效地穿过细胞膜的分子(载体)结合解决了这一限制。
实际上,寡核苷酸,并且特别是PNA,通常可以使用与其结合的载体(或“标记物”)来给药,例如,具有1至30个氨基酸长度的肽序列。
寡核苷酸的一个特别应用是调节基因的表达,其在肿瘤中被激活或抑制。
公知肿瘤是由各种基因的失调引起的。通常,损害影响原癌基因(或也可能仅仅是致癌基因),如MYC基因(tra cui MYC、MYCN、MYCL1)、存活素(BIRC5)、BCL2、PLK4、ALK和PKM2,其在肿瘤中被激活或超表达。此外,在肿瘤中,抗肿瘤或致癌抑制剂基因,如caspase-8和RASSFI,通常也是被灭活的。
特别地,MYC家族的致癌基因涉及各种人肿瘤的产生,并且其中大部分基因引起肿瘤的发作和进展。这些基因的扩增和/或超表达几乎总是与肿瘤相关,儿科类型的(例如,成神经细胞瘤、成神经管细胞瘤和横纹肌肉瘤)和成人类型的(例如,小细胞肺癌或成胶质细胞瘤)(Pession A,Cur Cancer Drug Target,2005,5(4):273-83)。实际上,它们通过对肿瘤生长是基础的机制来起作用,如诱导细胞增殖、抵抗凋亡、形成转移和抵抗化疗药物。
许多具有抗肿瘤作用的寡核苷酸是文献中已知的。
例如,在反义策略中存在针对MYC、MYCN、BCL2、BIRC5基因的寡核苷酸(EVProchownik,Exp Rev Antic Ther 2004,16(6):370-4;CF Bennet,Exp Opin InvestigDrugs,1999,8(3):237-53)或具有反义作用的针对MYCN和MYC的寡核苷酸(LC Boffa,Oligonucleotides 2005,15(2):85-93)。
为了抑制MYCN基因翻译至成神经细胞瘤细胞中,还已经产生了基于DNA的硫逐磷酸酯反义寡核苷酸(Burkhart CA,JNCI,2003,95(18):1394-403),并且通过“小干扰RNA(siRNA)”产生了反义寡核苷酸,以抑制MYCN基因翻译至成神经细胞瘤细胞中(Kang JH,Bioch Bioph Res Com,2006,351(1):192-197)。
然而,仍然强烈地感觉到需要鉴定更多的能够以提高的特异性和选择性方式调节基因表达的寡核苷酸,使得能够具有有效的治疗和/或抗肿瘤作用。
为了获得可用作治疗和/或诊断方法的寡核苷酸,需要鉴定靶标基因,或靶标信使RNA的序列和/或其各自的调控序列,所述调控序列就转录和翻译而言,能够确定对基因自身表达的显著和选择性的调节作用。
因此,还感觉到需要限定控制鉴定过程的一般规则-在基因的序列,或信使RNA的序列或其调控序列内-对于调节基因自身转录/翻译的目的最有前景的寡核苷酸序列。
发明内容
通过本发明满足了刚才所述的这部分中的需求,根据第一个方面,本发明涉及一种用于调节基因表达的寡核苷酸,其包含6-30个核苷酸(单体),优选12-24个核苷酸,所述寡核苷酸的特征在于包含至少一组的至少两个连续鸟嘌呤的序列。理解具有序列SEQ IDNO:1的寡核苷酸从刚才给出的限定中排除。
在天然核酸(DNA和RNA)的情况中,每个单体(核苷酸)由含氮碱基、糖和三磷酸酯组成。碱基选自由腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶(只有在RNA中)组成的组。糖在DNA的情况中是脱氧核糖,在RNA的情况中是核糖。单体在聚合物中通过磷酸二酯键连接。
优选,本发明的寡核苷酸包含含有至少一组的至少三个连续鸟嘌呤的序列。理解具有序列SEQ ID NO:1的寡核苷酸从该限定中排除。
更优选,本发明的寡核苷酸包含含有至少一组的至少四个连续鸟嘌呤的序列。
再更优选,本发明的寡核苷酸包含含有至少一组的至少五个连续鸟嘌呤的序列。
在本发明的一些实施方案中,寡核苷酸包含含有至少由两个至六个连续鸟嘌呤组成的一组的序列。
在进一步的实施方案中,至少一组的鸟嘌呤优选包含至少两组的至少两个连续鸟嘌呤。
或者,至少一组的鸟嘌呤优选包含至少一组的至少两个连续鸟嘌呤和至少一组的至少三个连续鸟嘌呤。
在进一步的实施方案中,至少一组的鸟嘌呤优选包含至少三组的至少两个连续鸟嘌呤。
在进一步的实施方案中,至少一组的鸟嘌呤优选包含至少四、五或六组的至少两个连续鸟嘌呤。
或者,至少一组的鸟嘌呤优选包含至少一组的至少两个连续鸟嘌呤或至少两组的至少三个连续鸟嘌呤。
或者,至少一组的鸟嘌呤优选包含至少一组的至少三个连续鸟嘌呤和至少两组的至少两个连续鸟嘌呤。
或者,至少一组的鸟嘌呤优选包含至少一组的至少两个连续鸟嘌呤、至少一组的至少三个连续鸟嘌呤和/或至少一组的六个连续鸟嘌呤。
通常,本发明的寡核苷酸优选与靶标序列互补,并且优选,连续鸟嘌呤的组可以是彼此连续的,使得,例如,三组2个连续的鸟嘌呤是一组6个连续的鸟嘌呤。或者,连续鸟嘌呤的组可以由至少一个核苷酸间隔开来。
通常,根据本发明的至少一组的至少两个连续鸟嘌呤可以位于寡核苷酸5’端附近,或在寡核苷酸3’端附近,或可以位于寡核苷酸序列的中心。
在本发明的优选实施方案中,优选在其3’和/或5’端使用载体序列结合所述寡核苷酸,所述载体序列优选是短氨基酸序列。
所述短氨基酸序列(载体)优选由1至30个,优选1至10个,甚至更优选1至7个范围的多个氨基酸组成。氨基酸可以是L或D形式的,优选D形式。
对于本发明的目的,优选的载体选自由SEQ ID NO:47(PKKKRKV);SEQ ID NO:48(VKRKKKP);SEQ ID NO:49(KKKKKK);SEQ ID NO:50(PKRKRKV);SEQ ID NO:51(KRKRKRK);SEQ ID NO:52(KKKRKV);SEQ ID NO:53(PKKKRK);SEQ ID NO:54(KKKRK);SEQ ID NO:55(RRRR)和SEQ ID NO:56(PKKKRKVHHHHH)组成的组。
对于本发明的目的,特别优选的载体是具有SEQ ID NO:47的肽。
在本发明的内容中,“载体”意思是能够有利地改变寡核苷酸的药物动力学/药效谱和/或细胞和/或核渗透的肽。
在本发明的内容中,“调节基因的表达”意思是抑制或激活(提高)基因的表达。所述基因表达的抑制或激活(提高)可以在转录或翻译水平上发生。
可以通过以反基因机制起作用的寡核苷酸(或反基因寡核苷酸,即,针对基因的反义链,也就是说,反基因策略),在转录水平上实现基因表达的抑制或激活。
或者,可以使用通过反基因机制作用的寡核苷酸(或反基因寡核苷酸,即,针对信使,也就是说,反义策略),在翻译水平上实现基因表达的抑制,同时可以通过抑制降解信使RNA的微RNA来实现翻译水平上的表达提高。
申请人鉴定的并且在以上描述的,为了有效调节基因的表达,寡核苷酸必须满足的参数或规则或必要条件适用于任何基因,并且因此可以例如用于鉴定能够调节基因表达的寡核苷酸序列的目的,所述基因负责遗传和/或病毒来源的疾病或涉及肿瘤病况发作的基因。
由此鉴定的寡核苷酸可以用于治疗方法中,用于特定的遗传、病毒或肿瘤疾病,优选用作药物。
或者,寡核苷酸可以用于诊断目的。
实际上,本发明的主题进一步涉及本发明的寡核苷酸用于治疗和/或诊断目的的用途,所述寡核苷酸可能是化学修饰的。
本发明的寡核苷酸是6-30,优选12-24个残基(核苷酸或单体)的短寡核苷酸。寡核苷酸可以由天然核酸碱基组成,例如,DNA或RNA,或由合成的核酸碱基组成,例如,PNA、LNA或吗啉代核苷酸。或者,寡核苷酸可以包含DNA、RNA和/或合成核酸的组合,优选PNA或LNA(杂交或嵌合寡核苷酸)。此外,寡核苷酸可以是单链或双链的。
在本发明的一些实施方案中,寡核苷酸可以是化学修饰的,例如,用于提高它们的治疗和/或诊断有效性的目的。
在本发明的优选实施方案中,寡核苷酸可以是具有主链的PNA分子,其中主链中α位置(Calpha(α))的碳结合取代基,而不是结合甘氨酸的典型氢原子。例如,替代甘氨酸的侧链,可以使用天然或合成来源的另一个氨基酸的侧链,所述氨基酸优选选自由精氨酸、赖氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸盐、天冬氨酸盐、脯氨酸、色氨酸和鸟氨酸。所述氨基酸可以是右旋构造(D)或左旋构造(L)组成的组。
在本发明的其他优选实施方案中,寡核苷酸是:互相互补的单链或双链RNA分子(将互相互补的双链RNA分子限定为siRNA,“小干扰RNA”的首字母缩略词)。
在一些实施方案中,所述“小干扰RNA”包含RNA单体(核糖核苷酸)和至少一个在核糖2’位置修饰的单体,优选2’-O-甲氧基乙基、2’-O-甲基或2’-氟单体;或所述“小干扰RNA”包含RNA单体(核糖核苷酸)和至少一个合成核酸的单体,所述合成核酸选自由LNA、甲基磷酸酯LNA、BNA(桥接核酸)、UNA(未锁闭核酸)、ENA(乙烯-桥接核酸)、ANA(阿拉伯糖核酸)和F-ANA(氟-阿拉伯糖苷核酸)组成的组。
在优选的实施方案中,以如下的方式来设计所述“小干扰RNA”:在互补双链的末端,两条链中只有一条具有至少一个,优选两个突出(即,未配对)的天然或合成核酸的单体。在进一步的实施方案中,天然或合成突出核酸优选选自由2’-O-甲氧基乙基、2’-O-甲基或2’-氟单体,或LNA、甲基磷酸酯LNA、BNA、UNA(未锁闭核酸)、ENA(乙烯-桥接核酸)、ANA(阿拉伯糖核酸)和F-ANA(氟-阿拉伯糖苷核酸)的单体组成的组。
在进一步的实施方案中,将寡核苷酸限定为杂交或嵌合的,并且优选是单链或双链的,包含RNA单体(核糖核苷酸)和LNA单体(将这种寡核苷酸表示为RNA/LNA)。
或者,杂交寡核苷酸可以包含RNA单体(核糖核苷酸)和至少一个选自2’-O-甲氧基乙基(MOE)单体、2’-O-甲基单体或2’-氟单体的RNA单体;或杂交寡核苷酸可以包含RNA单体(核糖核苷酸)和至少一个优选选自LNA、甲基磷酸酯LNA、UNA(未锁闭核酸)、BNA、ENA(乙烯-桥接核酸)、ANA(阿拉伯糖核酸)和F-ANA(氟-阿拉伯糖苷核酸)的合成核酸的单体。
在进一步的实施方案中,基于单链或双链RNA的寡核苷酸可以包含传统的核糖核苷酸(即,没有化学修饰)和已经在磷酸二酯键水平被修饰的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸,例如,通过硫逐磷酸酯键或DNG(脱氧核糖核胍)、RNG(核糖核胍)、GNA(甘油核酸)、G-PNA(γ-PNA)或PMO(吗啉代)进行了修饰。
在本发明的优选实施方案中,寡核苷酸是包含DNA单体(脱氧核糖核苷酸)和LNA单体的嵌合单链序列。
对于反基因策略,其表示在转录水平调节基因的表达,可以优选使用:
·基于PNA的寡核苷酸,可选与载体(通常由1至30个残基组成)结合,优选在3’端和/或5’;或
·基于PNA的寡核苷酸,所述PNA包含至少一个主链的α碳(C-α),与取代基结合,而不是标准甘氨酸的H原子结合;或
·包含RNA单体(传统核糖核苷酸)和可选的至少一个修饰的核苷酸(单体)(例如,2’-O-甲基RNA单体、2’-氟RNA单体),或至少一个选自LNA、甲基磷酸酯LNA、BNA、UNA、GNA、ANA、FANA、ENA、DNG和RNG的核酸的单体,或在磷酸二酯键水平上修饰的核糖核苷酸的单链寡核苷酸;或
·互相互补的双链的基于RNA的寡核苷酸(siRNA);或
·包含RNA单体(传统核糖核苷酸)和至少一个LNA单体的部分互补的双链嵌合寡核苷酸;或
·包含RNA单体(传统核糖核苷酸)和至少一个2’-O-(2-甲氧基甲基)RNA单体的双链嵌合寡核苷酸;或
·包含DNA单体(传统脱氧核糖核苷酸)和至少一个LNA单体的单链嵌合寡核苷酸;或
·包含DNA单体(传统脱氧核糖核苷酸)和至少一个2’-氟RNA单体或至少一个选自LNA、甲基膦酸酯LNA、BNA、UNA、GNA、ENA、ANA、FANA、DNG和RNG的核酸的单体的寡核苷酸。
对于反义策略,其表示在翻译水平上调节基因的表达,可以优选利用:
·包含RNA单体(传统核糖核苷酸)的互相互补的双链寡核苷酸(siRNA);或
·包含RNA单体(传统核糖核苷酸)和至少一个在核糖水平和/或在磷酸二酯键水平修饰的RNA单体的单链寡核苷酸;
·包含DNA单体(传统脱氧核糖核苷酸)和至少一个硫逐磷酸酯DNA单体的单链嵌合寡核苷酸;或
·包含RNA单体(传统核糖核苷酸)和至少一个2’-O-(2-甲氧基乙基)RNA单体的双链嵌合寡核苷酸;或
·包含RNA单体(传统核糖核苷酸)和至少一个2’O-甲基化RNA单体的双链嵌合寡核苷酸;或
·包含RNA单体(传统核糖核苷酸)和至少一个2’-氟RNA单体的双链嵌合寡核苷酸;或
·包含RNA单体(传统核糖核苷酸)和至少一个LNA单体的双链嵌合寡核苷酸;或
·包含RNA单体(传统核糖核苷酸)和至少一个阿拉伯糖苷RNA单体的双链嵌合寡核苷酸;或
·包含DNA单体(传统脱氧核糖核苷酸)和至少一个LNA单体的单链嵌合寡核苷酸;或
·包含吗啉代单体的单链寡核苷酸;或
·基于PNA的寡核苷酸,所述PNA包含至少一个主链的α碳(C-α),与取代基结合,而不是标准甘氨酸的H原子结合;优选取代基是精氨酸或赖氨酸的侧链;或
·包含DNA单体(传统脱氧核糖核苷酸)和至少一个选自PNA、LNA、LNA甲基磷酸酯、BNA、UNA、GNA、ENA、DNG和RNG的核酸的单体的寡核苷酸。
优选,本发明的寡核苷酸针对涉及遗传和/或病毒来源的疾病或肿瘤的产生的基因。所述基因优选选自由MYC家族的基因(优选MYC、MYCN、MYCL1)、存活素基因(BIRC5)、BCL2、PLK4、ALK、PKM2、caspase-8和RASSF1组成的组。
特别地,本发明的寡核苷酸针对MYC家族的基因,优选针对MYCN。
所述寡核苷酸优选选自由SEQ ID NO:2-15、66-84,SEQ ID NO:24、25、31和32组成的组,具有SEQ ID NO:26和57的互补寡核苷酸对,具有SEQ ID NO:27和58的互补寡核苷酸对,具有SEQ ID NO:28和59的互补寡核苷酸对,具有SEQ ID NO:29和60的互补寡核苷酸对,具有SEQ ID NO:30和61的互补寡核苷酸对,具有SEQ ID NO:33和62的互补寡核苷酸对,具有SEQ ID NO:34和63的互补寡核苷酸对,具有SEQ ID NO:35和64的互补寡核苷酸对以及具有SEQ ID NO:36和65的互补寡核苷酸对。
在一些实施方案中,所述寡核苷酸是PNA寡核苷酸,优选所述PNA针对MYCN。
在优选的实施方案中,PNA选自由SEQ ID NO:2-15组成的组。
在进一步优选的实施方案中,PNA选自由SEQ ID NO:66-84组成的组。
在进一步优选的实施方案中,PNA选自由SEQ ID NO:2-15、66-84组成的组。
优选,PNA寡核苷酸选自由SEQ ID NO:2-13,更优选SEQ ID NO:2-8,再更优选SEQID NO:2-6组成的组。对于本发明的目的,特别优选的PNA寡核苷酸是SEQ ID NO:5。
优选,SEQ ID NO:5在5’或3’端结合SEQ ID NO:47。更优选,SEQ ID NO:47由D形式的氨基酸组成。
PNA SEQ ID NO:2-15优选针对MYCN,并且更优选,它们以反基因策略调节MYCN的表达。
PNA SEQ ID NO:66-69也优选针对MYCN,并且更优选,它们以反基因策略调节MYCN的表达。
PNA SEQ ID NO:70-74优选针对MYC,并且更优选,它们以反基因策略调节MYC的表达。
PNA SEQ ID NO:75、76优选针对BIRC5,并且更优选,它们以反基因策略调节BIRC5的表达。
PNA SEQ ID NO:77-79优选针对ALK,并且更优选,它们以反基因策略调节ALK的表达。
PNA SEQ ID NO:80-82优选针对BCL2,并且更优选,它们以反基因策略调节BCL2的表达。
PNA SEQ ID NO:83、84优选针对PLK4,并且更优选,它们以反基因策略调节PLK4的表达。
在进一步的实施方案中,所述寡核苷酸是双链的,并且优选包含RNA单体。优选,所述寡核苷酸针对MYCN。
或者,所述双链RNA寡核苷酸选自:具有SEQ ID NO:26和57的互补寡核苷酸对,具有SEQ ID NO:27和58的互补寡核苷酸对,具有SEQ ID NO:28和59的互补寡核苷酸对,具有SEQ ID NO:29和60的互补寡核苷酸对,具有SEQ ID NO:30和61的互补寡核苷酸对。
所述寡核苷酸优选针对MYCN。更优选,它们通过反义策略调节基因的表达。
在进一步的实施方案中,所述寡核苷酸是DNA-LNA嵌合寡核苷酸,优选所述寡核苷酸针对MYCN。
在优选的实施方案中,所述DNA-LNA嵌合寡核苷酸选自由SEQ ID NO:24和25组成的组。
SEQ ID NO:24和25优选针对MYCN基因。
SEQ ID NO:24和25优选通过反基因策略调节基因的表达。
在进一步的实施方案中,所述寡核苷酸是包含DNA单体和/或至少一个硫逐磷酸酯DNA单体的单链嵌合寡核苷酸。所述寡核苷酸优选针对MYCN。
对于本发明的目的,特别优选的是选自由SEQ ID NO:31和32组成的组的嵌合寡核苷酸。SEQ ID NO:31和32优选针对MYCN基因。SEQ ID NO:31和32优选通过反义策略调节MYCN的表达。
在进一步的实施方案中,所述寡核苷酸是包含RNA单体和至少一个优选2’-O-(2-甲氧基乙基)或2’-甲基RNA单体的双链嵌合寡核苷酸。
所述寡核苷酸优选针对MYCN。
对于本发明的目的,特别优选的是具有SEQ ID NO:33和62的互补嵌合寡核苷酸对。所述寡核苷酸对优选通过反义机制调节基因的表达。
在进一步的实施方案中,所述寡核苷酸是包含RNA单体和至少一个优选2’-氟RNA单体的双链嵌合寡核苷酸。
优选,所述寡核苷酸针对MYCN。
对于本发明的目的,特别优选的是具有SEQ ID NO:34和63的互补嵌合寡核苷酸对。所述寡核苷酸对优选通过反义机制调节基因的表达。
在进一步的实施方案中,所述寡核苷酸是包含RNA单体和至少一个LNA单体的双链嵌合寡核苷酸。
所述寡核苷酸优选针对MYCN。
对于本发明的目的,特别优选的是具有SEQ ID NO:35和64的互补嵌合寡核苷酸对。所述寡核苷酸对优选通过反义机制调节基因的表达。
在进一步的实施方案中,所述寡核苷酸是双链嵌合寡核苷酸,包含RNA和至少一个阿拉伯糖苷RNA单体。
优选,所述寡核苷酸针对MYCN。
对于本发明的目的,特别优选的是具有SEQ ID NO:36和65的互补嵌合寡核苷酸对。所述寡核苷酸对优选通过反义机制调节基因的表达。
本发明的再一个方面涉及上述寡核苷酸用于治疗和/或诊断目的的用途。
特别地,寡核苷酸可以单独地或结合在一起用于遗传和/或病毒来源的疾病的治疗,特别是用于由基因的超表达或抑制引起的遗传疾病的治疗,即,需要调节超表达或抑制的基因的表达的遗传疾病。
本发明的寡核苷酸用于遗传疾病的治疗性处理,所述疾病优选选自由Gorlin综合症、唐氏综合症、Feingold综合症、Hirschsprung’s病、Li-Fraumeni综合症、Turcot综合症、家族性肿瘤和帕金森病组成的组。
此外,本发明的寡核苷酸用于儿童或成人的肿瘤病况的治疗性处理。特别地,所述肿瘤优选由基因或致癌基因的超表达引起,所述基因选自由MYC、MYCN、MYCL1、存活素(BIRC5)、BCL2、PLK4、ALK和PKM2组成的组。或者,肿瘤优选是由致癌抑制剂或抗肿瘤基因的抑制(失活)引起的并且优选选自由caspase-8和RASSF1组成的组。
所述肿瘤优选选自由成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、成神经管细胞瘤、室鼓膜瘤、嗜铬细胞瘤、胚胎癌、生殖细胞肿瘤、腺泡状横纹肌肉瘤、胚胎横纹肌肉瘤、Wilms’肿瘤、肾脏的透明细胞肉瘤、滑膜肉瘤、肝胚细胞瘤、急性淋巴性白细胞、慢性淋巴性白血病、急性淋巴母细胞白血病、慢性淋巴母细胞白血病、Burkitt’s淋巴瘤、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性原巨核细胞白血病、B慢性淋巴性白血病、T-细胞白血病、淋巴瘤、小细胞肺癌(肺微小细胞瘤)、肺腺癌、鳞状上皮细胞肺癌、典型和非典型原发性肺癌、大细胞肺癌、大细胞神经内分泌性肺癌、成胶质细胞瘤、肝癌、基细胞癌、卵巢肿瘤、乳房肿瘤和结肠癌组成的组。
对于本发明的目的,特别优选的是选自由成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、Wilms’肿瘤、成神经管细胞瘤、小细胞肺癌和基细胞癌组成的组。
本发明的主题进一步涉及包含至少一种根据本发明的寡核苷酸和至少一种药物学上接受的赋形剂的组合物。优选,所述至少一种寡核苷酸是PNA,优选选自由SEQ ID NO:2-15、66-84,优选SEQ ID NO:2-13,更优选SEQ ID NO:2-8,再更优选SEQ ID NO:2-6组成的组。特别优选的寡核苷酸是SEQ ID NO:5。优选,SEQ ID NO:5在5’或3’端结合SEQ ID NO:47。更优选,SEQ ID NO:47由D型氨基酸组成。
所述PNA优选在5’或3’端结合载体,所述载体优选选自由SEQ ID NO:47-56组成的组。
本发明的主题进一步涉及包含至少一种根据本发明的寡核苷酸(包括具有SEQ IDNO:1的寡核苷酸)、至少一种化合物(优选,至少一种具有药物学作用的化合物,更优选化疗剂)和可选至少一种药学上接受的赋形剂的组合物。
在优选的实施方案中,所述至少一种化合物是至少一种另外的反基因和/或反义寡核苷酸,或至少一种药物学制剂,或至少一种生物或生物技术来源的或源自化学合成或其组合的化合物。
所述生物或生物技术来源或源自化学合成的化合物优选选自由单克隆抗体、化疗剂、免疫调节剂、生长因子、细胞因子、肽、血管生成抑制剂、肿瘤生长抑制剂、甾类激素和/或非甾类激素和维生素组成的组。
对于本发明的目的,特别优选的化合物的实例选自由神经生长因子(NGF)、生长激素抑制素、视磺酸、放线菌素D、天门冬酰胺酶、博来霉素、白消安卡培他滨、卡铂、环磷酰胺、环孢霉素、顺铂、阿糖胞苷、clorambucil、氮烯唑胺、道诺霉素、多西他赛、盐酸阿霉素、盐酸表柔比星、足叶乙苷、磷酸氟达拉滨、氟脲嘧啶、吉西他滨、盐酸伊达比星、羟基脲、ifophosphamide、盐酸伊立替康、美法仑、巯基嘌呤、氨甲喋呤、丝裂霉素、米托蒽醌、nutline、奥沙利铂、紫杉醇、甲基苄肼、雷替曲塞、链脲霉素、替加氟-尿嘧啶、替莫唑胺、巯鸟嘌呤、thiotepe、拓扑替康、长春花碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨,及其组合。
更优选,所述化合物选自由卡铂、顺铂、足叶乙苷、长春新碱、环磷酰胺,及其组合组成的组。
申请人已经发现了至少一种根据本发明的寡核苷酸结合至少一种化合物(优选至少一种化疗剂,如上所述)的给药使得可以降低待给药的所述化合物的浓度,同时确保治疗有效性的提高和较低的毒性。
申请人已经发现了,在这些条件下,所述化合物浓度的降低取决于特定的病状;特别地,化疗组合物的浓度取决于肿瘤的类型。
对于一些肿瘤,如:成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、成神经管细胞瘤、小细胞肺癌、Wilms’肿瘤、腺泡状横纹肌肉瘤和胚胎横纹肌肉瘤,结合至少一种根据本发明的寡核苷酸给药的至少一种化疗剂的浓度可以降低高达10倍,同时确保治疗作用与正常剂量的化疗剂相同。
作为药物组合(就提高的治疗作用而言),特别有效的是至少一种根据本发明的PNA(优选,至少一种选自由SEQ ID NO:1-15、66-84,优选SEQ ID NO:1-13,更优选SEQ IDNO:1-8,更优选SEQ ID NO:1-6,甚至更优选SEQ ID NO:1和/或5的PNA)和至少一种化合物的组合组成的组,所述化合物优选是化疗剂,更优选选自由足叶乙苷(VP16)、卡铂、顺铂或长春新碱、环磷酰胺,及其组合组成的组。
对于本发明的目的,特别优选的是选自以下组成的组的组合:SEQ ID NO:1和卡铂,或足叶乙苷或顺铂或长春新碱;或SEQ ID NO:5和卡铂或足叶乙苷或顺铂或长春新碱。
所述PNA优选在其3’和/或5’端结合载体,所述载体优选选自由SEQ ID NO:47-56组成的组。
优选在同时给药组合物时和连续时间给药至少一种化合物时,发现提高的作用,所述连续时间给药优选以一定间隔给药,更优选以3小时、6小时、12小时、24小时、48小时或72小时的规律间隔给药。
在其他优选实施方案中,本发明的至少一种寡核苷酸,包括具有SEQ ID NO:1的寡核苷酸,可以优选与至少一种载体颗粒、至少一种载体聚合物或至少一种自体装配的载体寡核苷酸(也称为适体)结合或复合给药。
在进一步优选的实施方案中,本发明的至少一种寡核苷酸,包括具有SEQ ID NO:1的寡核苷酸,可以与至少一种脂质体胶束、至少一种微粒或至少一种纳米颗粒结合或复合并给药,使得促进靶标组织的渗透。
所述颗粒,通常是球形的,并且用作特定传送的工具,可以与许多不同的化合物一起配制。例如,所述颗粒可以是聚合化合物的配方或共同-配方,所述聚合化合物如:壳聚糖、透明质酸、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯亚胺(PEI)、聚乳酸(PLA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、羟磷灰石(HAP)、多不饱和脂肪酸、饱和脂肪酸、阳离子脂质、HAP-PLA、HAP-PLA/PGA及其衍生物。在进一步优选的实施方案中,至少一种本发明的寡核苷酸可以优选与至少一种之前所述类型的颗粒和至少一种配体或至少一部分的配体结合或复合,所述配体针对靶标细胞的特定受体(如,例如,GD2、叶酸、TRAIL、NGF),化学或生物技术来源的,可以作为佐剂存在于聚合膜中,用于促进所述本发明的寡核苷酸在靶标细胞中的内在化。
在进一步优选的实施方案中,至少一种本发明的寡核苷酸可以结合至少一种配体或配体(如,例如,GD2(神经节苷脂GD2)、叶酸、TRAIL(TNF-相关凋亡诱导配体)、NGF(神经生长因子))的一部分,所述配体对于靶标细胞的受体是特异性的。
在进一步优选的实施方案中,至少一种本发明的寡核苷酸,包括具有SEQ ID NO:1的寡核苷酸,可以自身单独给药,或在组合中,结合至少一种另外的医学应用来给药,以增强其有效性,优选还通过促进靶标细胞和/或组织的渗透来增强其有效性。
所述医学应用优选选自由氧疗法、磁疗法、热疗法、电刺激、超声波、放疗、化疗和光线疗法组成的组。
具体实施方式
实施例1
寡核苷酸的化学合成。
寡核苷酸的化学合成是基于在5’-OH用保护基团4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMTr)和在3’-磷酸酯基团用β-氰基乙基修饰的DNA核苷酸亚磷酰胺的使用;保护基团还用于伯胺(核碱基杂环),其另外也是反应性的。
DNA寡核苷酸的化学合成以3’-5’方向进行。使用了CPG(受控孔玻璃的首字母缩略词)树脂或聚苯乙烯支持物,用第一个核苷酸碱基功能化。合成从使用二氯甲烷(DCM)中的3%三氯乙酸(TCA)溶液使5’-二甲氧基三苯甲基基团去保护的步骤开始。这接着是激活,使用对应于序列中待插入的第二个碱基的亚磷酰胺的乙基硫代四唑(ETT)或苄基硫代四唑(BTT)0.3M,然后其将结合之前去保护的5’OH,由此形成磷酸二酯键。
下一个步骤是“加帽”,其用于使未反应的5’OH基团乙酰化。使用2种溶液来进行加帽,一种含有四氢呋喃(THF)/卢剔啶/乙酸酐(8∶1∶1),而另一种含有THF中的10%甲基咪唑溶液。通过THF/吡啶溶液中的碘稳定亚磷酸三酯不稳定的三价键,碘将其氧化成五价磷酸二酯。
氧化后,重复该循环,从第二个引入的单体的脱三苯甲基开始等等。将该循环重复需要的次数,这取决于希望多少碱基插入序列中。最后,通过在室温下用酸处理来除去最后的5’-DMTr基团。
根据碱基上存在的保护基团(其随后取决于选定的碱基的化学性质,PTO、2’OMe等),可以与氢氧化铵在55℃下持续16小时,或与氢氧化铵/甲胺(AMA)溶液在55℃下持续35分钟,使得通过氰基乙基基团的β-消除使磷去保护,并且除去核碱基杂环上的保护基团。
或者,可以在整个分析(HPLC、MS)和制备性色谱期间保持5’-DMTr基团,以更好地从副产物中纯化出终产物,并且最终通过用乙酸处理来除去。
由于核糖上存在的2’OH基团,并且因此用于每个亚磷酰胺的另外的保护基团的存在,RNA寡核苷酸的化学合成不同于DNA寡核苷酸。
因此,RNA寡核苷酸的合成需要较长的耦合时间和更多的步骤,来使基团去保护。
将如上所述的相同方案用于寡核苷酸的合成,使用化学修饰的单体,如硫逐磷酸酯(PTO)、2’O-甲基(2’OMe)、2’氟(2’-F)、阿拉伯糖苷核酸(ANA)和锁核酸(LNA)。
通过购买公司(Link Technologies Ltd.)的单体分子来提供用于每种修饰碱基的特定技术的详细内容。
吗啉代核酸购自制造商(Gene Tools,LLC)。
以10微摩尔规模来进行PNA寡核苷酸的合成,并且包括纯化和表征步骤。
分子的合成在固相进行,使用Rink Amide-树脂和Syro自动化合成仪(MultiSynTech)。将合成的第一个单体手动结合树脂。每个自动化合成循环分成三个步骤。第一个步骤是去保护,使用DMF(二甲基甲酰胺)中的20%哌啶溶液来进行。
第二个步骤是进入的单体和生长中的链之间的耦合反应。通过加入NMP(N-甲基吡咯烷酮)中的50.22M当量(eq)的单体(FMOC-PNA-G(Bhoc)-OH、FMOC-PNA-A(Bhoc)-OH、FMOC-PNA-C(Bhoc)-OH、FMOC-PNA-T-OH)和碱性环境中的DMF中的4.5 0.32M eq的激活剂(在这种情况中,为HATU)来进行这一反应,所述碱性环境含有DMF中的2,6-卢剔啶和DIPEA(N,N-二异丙基乙胺)的8%溶液。在预先装载树脂上的第一个和第二个单体的连接点,从肽链通过至PNA链,并且最后一个单体上,重复耦合反应,一式两份。
第三个步骤是“加帽”反应,其通过乙酰化用于阻断耦合步骤过程中未反应的位点。使用DMF中含有6%2,6-卢剔啶和5%乙酸酐的溶液来实现这一反应。合成完成时,从固体支持物上取下分子。
使用4∶1比例的TFA(三氟乙酸)和间酚紫的溶液来获得这一反应。
通过在二乙醚中的沉淀来收集由此获得的分子。
一旦收集在水中,在HPLC中纯化。用于纯化的柱子是C18 300A 5u Jupiter(Inc.)。在30分钟内使用从100%A(水95%;乙腈5%;0.1%TFA)-0%B(水60%;乙腈40%;0.1%TFA)至60%A-40%B的线性梯度来进行纯化。所用的完整梯度为0-5分钟0%B;5-35分钟40%B;35-37 100%;37-42 100%B;42-44 0%B。
用于阻断基因转录的反基因寡核苷酸
为了证明根据本发明中所述的参数选择和设计的本发明的寡核苷酸能够选择性地阻断基因的转录的目的,设计并合成了针对MYCN基因的基于PNA的寡核苷酸;它们显示于表1中。
表1
针对促进细胞膜渗透的目的,单独地以及在3’和/或5’端结合载体,测试了PNA寡核苷酸。特别地,将寡核苷酸结合羧基端,在3’具有氨基酸序列SEQ ID NO:43,即,脯氨酸-赖氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-赖氨酸-缬氨酸。
具有SEQ ID NO:1的寡核苷酸是专利EP 1618195主题的序列,并且表示对照序列和用于比较的序列。
具有SEQ ID NO:2-15的寡核苷酸含有一组两个连续鸟嘌呤(SEQ ID NO:14、15),或一组三个连续鸟嘌呤(SEQ ID NO:13),或两组两个连续鸟嘌呤(SEQ ID NO:12),或一组两个鸟嘌呤和一组三个连续鸟嘌呤(SEQ ID NO:11、10、9、8和7),或两组两个连续鸟嘌呤和一组三个连续鸟嘌呤(SEQ ID NO:6和4),或一组两个连续鸟嘌呤和两组三个连续鸟嘌呤(SEQ ID NO:5),或一组六个连续鸟嘌呤(SEQ ID NO:3),或一组六个连续鸟嘌呤,一组三个连续鸟嘌呤和一组两个连续鸟嘌呤(SEQ ID NO:2)。
连续鸟嘌呤的组在表1中以下划线显示。
具有SEQ ID NO:16-23的寡核苷酸不具有连续鸟嘌呤组,为负对照。
此外,对于选择性调节基因转录的目的,还设计和合成了具有SEQ ID NO:24-25的寡核苷酸;这些显示于表2中。
表2
特别地,设计和合成了包含DNA单体和LNA单体(SEQ ID NO:24和25)的单链嵌合寡核苷酸。
寡核苷酸序列中的DNA碱基显示为粗体字类型的碱基,而LNA单体是下划线的。通过间隔1、2或3个DNA碱基插入LNA单体来设计和合成每个嵌合寡核苷酸分子,间隔DNA碱基是为了避免受到内源性核酸酶的快速降解,如文献中已经报道的(Koch T,Biochem J2001,354(Pt 3):481-4;Koji Nagahama,Bioorg Med Chem Lett,2009,19(10):2707-9)。
用于阻断基因翻译的反义寡核苷酸
为了证明根据本发明中所述的参数选择和设计的本发明的寡核苷酸能够选择性地阻断靶标基因的翻译的目的,设计、合成并在体外实验分析了针对MYCN基因的具有SEQID NO:26-36的反义寡核苷酸。它们显示于表3中。
表3
生产了基于RNA(小干扰RNA(siRNA)(SEQ ID NO:26-30))的互补双链寡核苷酸,以选择性地调节靶标基因MYCN的翻译。
此外,生产了基于DNA SEQ ID NO:31和32的寡核苷酸,其中将磷酸二酯键修饰成硫逐磷酸酯。
还生产了基于以下的双链嵌合寡核苷酸:基于RNA单体和单体2’O-甲基(SEQ IDNO:33);基于RNA单体和2’-氟单体(SEQ ID NO:34);基于RNA单体和LNA单体(SEQ ID NO:35)和基于RNA单体和阿拉伯糖苷RNA单体(SEQ ID NO:36)。在寡核苷酸序列SEQ ID NO:33-36中,2’O-甲基、2’-氟、LNA和阿拉伯糖苷(ANA)单体以粗体字显示,而每组至少两个连续鸟嘌呤是下划线的。
因为寡核苷酸的siRNA是双链的,以这样的方式设计和合成了嵌合体,使得在3’和5’留下两个2’O-Me单体,或两个2’-氟单体,或两个LNA单体,或两个RNA阿拉伯糖苷单体,与互补链未配对,并且由此避免受到细胞酶的快速降解。
使用寡核苷酸的处理-QT-PCR
为了评价本发明的寡核苷酸调节靶标基因表达的能力的目的,使用实时PCR技术分析了它们降低信使RNA含量的能力。
为此,使用了24-孔平板,将其接种5.0×104细胞,每孔含有0.3ml OPTI-MEM(GIBCO BRL)培养基,4%FBS和2mM L-谷氨酰胺(实验重复三份)。
将细胞在37℃下,在含有5%CO2的气氛中,孵育24小时,以允许粘附壁的底部。
预先用2μl Lipofectamine 2000(Invitrogen)孵育每种分析的寡核苷酸,除了PNA寡核苷酸,使用0.3mL无血清OPTI-MEM(GIBCO BRL)培养基。
对于每个孔,在以下终浓度下分析寡核苷酸:
·使用200nM的反义寡核苷酸siRNA和siRNA gapmer(即,含有一个或多个在3’或5’端化学修饰的核酸的单体的寡核苷酸,同时在中央部分,它们具有未修饰的或在磷酸二酯键水平修饰为硫逐磷酸酯键的核酸的单体);
·使用10μM的含有硫逐磷酸酯DNA单体的反义寡核苷酸,RNA反基因寡核苷酸(agRNA)和含有DNA单体和LNA单体的寡核苷酸;
·使用1μM浓度的吗啉代寡核苷酸,和
·以1μM浓度给予PNA寡核苷酸。
用寡核苷酸处理细胞,给予寡核苷酸后6小时,加入FBS至4%。24小时后,使用RNeasy Mini试剂盒(QIAGEN),从每个孔提取总RNA,并且纯化。
对从5个不同的与MYCN表达相关的人肿瘤获得的8个细胞系进行了试验,即:
·作为成神经细胞瘤模型使用,由细胞系Kelly、IMR-32(其中MYCN基因得到扩增和超表达)以及SKNBE2c和LAN1(其中MYCN基因得到扩增和超表达,并且p53基因突变)组成;
·作为横纹肌肉瘤使用,由细胞系RH30组成,其中MYCN基因得到扩增和超表达;
·作为Wilms’肿瘤模型使用,由细胞系WiT49组成,其中MYCN基因得到扩增和超表达;
·作为成视网膜细胞瘤模型使用,由细胞系Y79组成,其中MYCN基因得到扩增和超表达;和
·作为小细胞肺癌模型使用,由细胞系H69组成,其中MYCN基因得到扩增和超表达。
作为对照,使用了用无菌水替代寡核苷酸处理的上述相同的细胞系。
使用NanoDrop ND-1000分光光度计(NanoDrop Technologies)定量了每种RNA样品(一式两份)。
使用用于RT-PCR的cDNA合成试剂盒(Roche)生产了cDNA的第一条链。对于cDNA合成反应,总地使用了1μg RNA。对于实时PCR,使用了20μl终体积中的10ng cDNA,使用SYBRGreen Master Mix 2X(Applied Biosystems)(3个相同的实验重复进行三份)。用于进行实时PCR的引物的序列和浓度显示于表4中。两个管家基因用作阳性对照:GAPDH和β-肌动蛋白(ACTB)。
QT-PCR反应的条件为:95℃ 10min,95℃ 20sec和60℃ 30sec,持续50个循环。
表4
使用寡核苷酸的处理-细胞增殖试验
为了评价本发明的寡核苷酸的基因调节能力的目的,测定了它们的给予对细胞生活力的作用。
为此,将每孔5x103细胞接种于96-孔细胞培养平板中(实验重复进行三份),孔中含有100μl含有4%FBS和2mM L-谷氨酰胺的OPTI-MEM(GIBCO BRL)培养基。
给予不同浓度(1μM-2、5μM-5μM-10μM)的PNA寡核苷酸,以观察剂量作用相关性。
至于所有其他寡核苷酸,给予的浓度列于段落中:
使用寡核苷酸的处理-QT-PCR
在处理后48、72、96和168小时时,测定了处理过的细胞的生活力。
通过ATP-Lite试验(发光ATP检测试验系统,PerkinElmer)评价了细胞生活力,并且作为与未处理对照细胞的孔的平均值相比较的处理过的孔的平均信号之间的比例来记录。按照试剂盒提供的说明来处理细胞。
在用于测定MYCN基因信使水平的相同细胞系上进行了试验并且列于以下段落中:使用寡核苷酸的处理-QT-PCR。
结果
只要涉及PNA寡核苷酸,关于它们抑制MYCN基因转录和Kelly细胞增殖的能力显示于表1中。表6显示了在不同浓度的分析的PNA下,增殖Kelly细胞的值(以百分比的形式)。
表5
结果证明了这些PNA对靶标基因翻译的蛋白的抑制作用是高度选择性和特异性的。此外,观察到了给予反基因PNA后,用作模型的肿瘤细胞的生长停止(通过MYCN基因的扩增来表征)直接接着就是凋亡。
通常,具有SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:13(含有一组或多组Gs)的PNA反基因寡核苷酸与不含Gs组(SEQ ID NO:16-SEQ ID NO:23)的PNA寡核苷酸相比,具有更高的反基因有效性(即,MYCN mRNA和具有MYCN表达的肿瘤细胞增殖的抑制)。
特别地,表1和表5中显示的结果证明了序列SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:13具有比序列SEQ ID NO:1(专利EP 1618195的主题)更高的反基因有效性。
序列SEQ ID NO:7-SEQ ID NO:12(含有两组两个或三个连续Gs)显示出高于序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:15(只含有一组两个或三个连续Gs)的反基因有效性。
序列SEQ ID NO:4-SEQ ID NO:6(含有三组两个或三个连续Gs)显示出高于序列SEQ ID NO:7-SEQ ID NO:12(含有两组两个或三个连续Gs)的反基因有效性。
含有一组六个连续Gs的SEQ ID NO:3显示出高于序列SEQ ID NO:1和含有一组或两组或三组Gs(其中每组由至少两个或三个连续Gs组成)的序列SEQ ID NO:4-SEQ ID NO:12的反基因有效性。
序列SEQ ID NO:2,含有三组连续Gs,其除了两组两个和三个连续Gs以外,还包含一组六个连续Gs,显示出高于SEQ ID NO:3(只含有一组六个Gs)和序列SEQ ID NO:1和含有一组或两组或三组Gs(其中每组由至少两个或三个连续Gs组成)的序列SEQ ID NO:4-SEQID NO:12的反基因有效性。
此外,在成纤维样型细胞系(NTH-3T3和Phoenix)中给予了具有SEQ ID NO:1-23的寡核苷酸,并且结果显示于表1中(最后两栏)。
结果清楚地证明了所分析的寡核苷酸针对这些细胞不是特异性地有效并且对这些细胞是无毒的(即,没有表达靶标基因的细胞,在这种情况中,是MYCN)。
实际上,观察到这两个非肿瘤成纤维细胞系的细胞增殖没有变化,并且这一结果表明PNA寡核苷酸以抑制MYCN表达的特异性作用来起作用,而它们在不表达MYCN的细胞中不具有非特异性的毒性作用。
因此,可以推断基于本发明中所述的参数设计的PNA寡核苷酸特异性地且有效地作用于靶标基因,并且因此作用于表达/超表达这种基因的细胞。
还对超表达MYCN的不同细胞系(Kelly、SKNBE2c、RH30、WiT90、WERI-Rb1和H69)测试了具有SEQ ID NO:1-12的PNA。结果显示于表6中,并且证实了PNA对MYCN基因的蛋白质翻译产物的抑制作用的选择性和特异性。
表6
以更详细的方式分析了具有SEQ ID NO:5的反基因PNA寡核苷酸。
特别地,合成了修饰的寡核苷酸,其中对序列中存在的连续鸟嘌呤组进行了修饰(连续鸟嘌呤组是下划线的,而修饰的核苷酸是粗体类型的),使得打断了鸟嘌呤的连续性,并且在Kelly细胞(其超表达MYCN)上进行了体外分析。
结果(概括于表7中)清楚地证明了连续的鸟嘌呤对于调节基因表达活性的目的是基础的事实。实际上,具有SEQ ID NO:43的PNA,其中具有SEQ ID NO:5的PNA的所有连续鸟嘌呤组被突变,引起PNA的抑制活性丢失,而三个连续鸟嘌呤组中的一个或两个的突变受到明显损害,但没有完全抑制分子的抑制活性。
表7
在腺泡状横纹肌肉瘤细胞(RH30)上,在体外测试了包含DNA单体和LNA单体并且具有MYCN基因作为其靶标的嵌合寡核苷酸。结果概括于表8中,并且证明了这些寡核苷酸具有强烈的、特异性的反基因活性。
表8
在腺泡状横纹肌肉瘤细胞(RH30)上,在体外分析了通过申请人根据本发明所述的参数设计并合成的反义寡核苷酸。结果概括于表9中,并且显示出寡核苷酸能够以特异性且有效的方式抑制MYCN转录产物;此外,它们还能够以比目前可用于MYCN基因的标准反义寡核苷酸(Chung DH,Bioch Bioph Res Commun,2006,351(1):192-7)更有效的方式选择性地抑制肿瘤细胞增殖。
特别地,描述于表11中的通过申请人鉴定的并且针对MYCN mRNA的siRNA发挥出反义活性,具有最小70%至最大85%范围的MYCN mRNA的抑制。
表9
为了证实本发明的寡核苷酸是否能够降低对抗癌症的治疗方案中目前所用的化疗剂的浓度的目的,将寡核苷酸结合化疗药物一起给药。
在不同的人和小鼠成神经细胞瘤肿瘤细胞系(SMS-KAN、LAN 1、IMR-32、SMS-KCN、Kelly、NHO2A、SKNBE2c)上针对PNA和化疗药物(卡铂、足叶乙苷(VP16)、顺铂和长春新碱)之间的相关作用进行了研究。
对于待使用PNA治疗的细胞提供了所进行的治疗中使用的治疗时间表,并且随后,在预定的时间(可以是6或12小时),给予化疗剂。
结果证明了这些化合物与本发明的寡核苷酸的结合,在特定的浓度范围下,确定了比使用相同化合物的单独治疗更高的治疗作用。
特别地,可以观察到治疗-伴随和同时的或以不同的时间间隔(3小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时等)-使用由本发明的寡核苷酸和其他具有药物作用的化合物的组合,用来增强所需的治疗作用。
因此,与目前标准的治疗浓度相比,结合一种或多种由申请人鉴定的寡核苷酸和化疗药物使得可以将化疗药物浓度降低多如10倍,同时仍然获得相同的作用。
特别地,这一研究的结果证明了就抑制细胞增殖而言,与使用单独的寡核苷酸或使用单独的上述化疗剂的治疗中获得的结果相比,结合长春新碱,或足叶乙苷,或卡铂,或顺铂给药时,SEQ ID NO:1具有协同作用。
实施例2
为了支持本发明的目的,还合成了表10中概括的寡核苷酸。特别地,表10显示了寡核苷酸序列、SEQ ID NO、(G+C)含量的百分比值和合成的寡核苷酸所针对的基因。按照实施例1,实现了寡核苷酸的合成。
表10
特别地,合成了以下的:针对MYCN的SEQ ID NO:66-69,针对MYC的SEQ ID NO:70-74,针对BIRC5的SEQ ID NO:75、76,针对ALK的SEQ ID NO:77-79,针对BCL2的SEQ ID NO:80-82和针对PLK4的SEQ ID NO:83、84。
在体外测试了寡核苷酸(以2.5μM的浓度),以通过测量其中目标基因超表达的细胞模型中基因信使的水平来确定它们抑制它们针对的基因的转录的能力。使用的这些方法是实施例1中描述的那些方法。
特别地,在Kelly和H69细胞系中,体外测试了SEQ ID NO:66-69(针对MYCN);在H82和RD细胞系中体外测试了SEQ ID NO:70-74(针对MYC),在Kelly细胞系中体外测试了SEQID NO:75、76(针对BIRC5),在Kelly细胞系中体外测试了SEQ ID NO:77-79(针对ALK),在Kelly细胞系中体外测试了SEQ ID NO:80-82(针对BCL2)和在Kelly细胞系中测试了SEQ IDNO:83、84(针对PLK4)。
测量了所测试的寡核苷酸抑制目标基因信使的能力,并且还评价了给予寡核苷酸后细胞的增殖能力。结果概括于表11中。
数据显示出对抗靶标基因的mRNA的有效抑制活性和细胞增殖的抑制,其随着寡核苷酸序列中存在的Gs组数量的增加而升高。
表11
最后,在成纤维样型的细胞系中(Phoenix和NIH-3T3)中给予具有SEQ ID NO:66-84的寡核苷酸。在这些细胞中,测试的寡核苷酸没有显示出有毒。
这些结果表明PNA寡核苷酸通过特定的抑制作用对目标基因的表达起作用,而它们在不表达这些基因的细胞中不具有任何非特异性的、毒性作用。
因此,可以推断基于本发明中描述的参数设计的PNA寡核苷酸特异性地且有效地作用于靶标基因,并且因此作用于表达/超表达这种基因的细胞。
序列表
<110> 生物基因有限责任公司
罗伯特·托内利
利奥纳多·万徒勒里
安德里亚·托尔托里
卢卡·蒙特穆罗
<120> 用于调节基因表达的寡核苷酸及其用途
<130> 21.B0278.12.IT.2
<160> 84
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对MYCN的PNA
<400> 1
atgccgggca tgatct 16
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对MYCN的PNA
<400> 2
gggtggatgc gggggg 16
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对MYCN的PNA
<400> 3
gatgcggggg gctcct 16
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对MYCN的PNA
<400> 4
gtcggcggga ggtaag 16
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对MYCN的PNA
<400> 5
gctgggtgga tgcggg 16
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对MYCN的PNA
<400> 6
tggacgcgct gggtgg 16
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对MYCN的PNA
<400> 7
cgcgctgggt ggatgc 16
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对MYCN的PNA
<400> 8
gtctggacgc gctggg 16
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对MYCN的PNA
<400> 9
ccctgcagtc ggcggg 16
<210> 10
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对MYCN的PNA
<400> 10
cggccgcggg ccgcca 16
<210> 11
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对MYCN的PNA
<400> 11
gggaactgtg ttggag 16
<210> 12
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对MYCN的PNA
<400> 12
tgtctggacg cgctgg 16
<210> 13
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对MYCN的PNA
<400> 13
acgctcaggg accacg 16
<210> 14
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对MYCN的PNA
<400> 14
cccggacgaa gatgac 16
<210> 15
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对MYCN的PNA
<400> 15
actgtgttgg agccga 16
<210> 16
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 针对MYCN的PNA
<400> 16
cctgtcgtag acagct 16
<210> 17
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对MYCN的PNA
<400> 17
tgtgacagtc atctgt 16
<210> 18
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对MYCN的PNA
<400> 18
gtgacagtca tctgtc 16
<210> 19
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对MYCN的PNA
<400> 19
gacagtcatc tgtctg 16
<210> 20
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对MYCN的PNA
<400> 20
cgtcgatttc ttcctc 16
<210> 21
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对MYCN的PNA
<400> 21
ctcgagtttg actcgc 16
<210> 22
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对MYCN的PNA
<400> 22
gcgcctcccc tgattt 16
<210> 23
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对MYCN的PNA
<400> 23
atatcccccg agcttc 16
<210> 24
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对MYCN的DNA/LNA
<400> 24
atgccgggca tgatct 16
<210> 25
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对MYCN的DNA/LNA
<400> 25
atgccgggca tgatct 16
<210> 26
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正义寡核苷酸 siMYCN (795)
<400> 26
ugaagaugau gaagaggaa 19
<210> 27
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正义寡核苷酸siMYCN (799)
<400> 27
gaugaugaag aggaagaug 19
<210> 28
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正义寡核苷酸 siMYCN (801)
<400> 28
ugaugaagag gaagaugaa 19
<210> 29
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正义寡核苷酸 siMYCN (808)
<400> 29
gaggaagaug aagaggaag 19
<210> 30
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正义寡核苷酸 siMYCN (810)
<400> 30
ggaagaugaa gaggaagaa 19
<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反义寡核苷酸 MYCN-PTO (1)
<400> 31
cgtggagcag ctcggcat 18
<210> 32
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反义寡核苷酸 MYCN-PTO (763)
<400> 32
cagggtgtcc tctccgga 18
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正义寡核苷酸siRNA-2'-OMe-RNA 808
<400> 33
gaggaagaug aagaggaagt t 21
<210> 34
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正义寡核苷酸 siRNA-2'F-RNA 808
<400> 34
caggaagaug aagaggaagu u 21
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正义寡核苷酸siRNA-LNA 808
<400> 35
gaggaagaug aagaggaagt t 21
<210> 36
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正义寡核苷酸siRNA-ANA 808
<400> 36
caggaagaug aagaggaaga a 21
<210> 37
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物MYCN正义
<400> 37
cgaccacaag gccctcagt 19
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物MYCN反义
<400> 38
tgaccacgtc gatttcttcc t 21
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物ACTB正义
<400> 39
gagcacagag cctcgccttt g 21
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物ACTB反义
<400> 40
accatcacgc cctggtgcct g 21
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物GAPDH正义
<400> 41
ccaatatgat tccacccatg gc 22
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物GAPDH反义
<400> 42
cttgattttg gagggatctc gc 22
<210> 43
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 经修饰的SEQ ID NO: 5
<400> 43
gctgagtcga tgcgtg 16
<210> 44
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 经修饰的SEQ ID NO: 5
<400> 44
gctgagtgga tgcgtg 16
<210> 45
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 经修饰的SEQ ID NO: 5
<400> 45
gctgggtcga tgcggg 16
<210> 46
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 经修饰的SEQ ID NO: 5
<400> 46
gttgggtgga tgtggg 16
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 载体多肽
<400> 47
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
1 5
<210> 48
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 载体多肽
<400> 48
Val Lys Arg Lys Lys Lys Pro
1 5
<210> 49
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 载体多肽
<400> 49
Lys Lys Lys Lys Lys Lys
1 5
<210> 50
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 载体多肽
<400> 50
Pro Lys Arg Lys Arg Lys Val
1 5
<210> 51
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 载体多肽
<400> 51
Lys Arg Lys Arg Lys Arg Lys
1 5
<210> 52
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 载体多肽
<400> 52
Lys Lys Lys Arg Lys Val
1 5
<210> 53
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 载体多肽
<400> 53
Pro Lys Lys Lys Arg Lys
1 5
<210> 54
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 载体多肽
<400> 54
Lys Lys Lys Arg Lys
1 5
<210> 55
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 载体多肽
<400> 55
Arg Arg Arg Arg
1
<210> 56
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 载体多肽
<400> 56
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val His His His His His
1 5 10
<210> 57
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反义寡核苷酸siMYCN (795)
<400> 57
uuccucuuca ucaucuuca 19
<210> 58
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反义寡核苷酸siMYCN (799)
<400> 58
caucuuccuc uucaucauc 19
<210> 59
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反义寡核苷酸siMYCN (801)
<400> 59
uucaucuucc ucuucauca 19
<210> 60
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正义寡核苷酸siMYCN (808)
<400> 60
cuuccucuuc aucuuccuc 19
<210> 61
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反义寡核苷酸siMYCN (810)
<400> 61
uucuuccucu ucaucuucc 19
<210> 62
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反义寡核苷酸siRNA-2'-OMe-RNA 808
<400> 62
cuuccucuuc aucuuccuct t 21
<210> 63
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A反义寡核苷酸siRNA-2'F-RNA 808
<400> 63
guuccucuuc aucuuccucu u 21
<210> 64
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反义寡核苷酸siRNA-LNA 808
<400> 64
cuuccucuuc aucuuccuct t 21
<210> 65
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反义寡核苷酸siRNA-ANA 808
<400> 65
guuccucuuc aucuuccuca a 21
<210> 66
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对MYCN的PNA
<400> 66
tcgggagcag tgggca 16
<210> 67
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对MYCN的PNA
<400> 67
gcgggtcgcg ggcacg 16
<210> 68
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对MYCN的PNA
<400> 68
tggaggtcgg cgccgg 16
<210> 69
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对MYCN的PNA
<400> 69
tcggcgggag gtaagg 16
<210> 70
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对MYC的PNA
<400> 70
ctcagaggct tggcgg 16
<210> 71
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对MYC的PNA
<400> 71
gcggccggct agggtg 16
<210> 72
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对MYC的PNA
<400> 72
cggccggcta gggtgg 16
<210> 73
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对MYC的PNA
<400> 73
cgacggcggt ggcggg 16
<210> 74
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对MYC的PNA
<400> 74
ggacgggggc ggtgga 16
<210> 75
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对BIRC5的PNA
<400> 75
gcggcggcat gggtgc 16
<210> 76
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对BIRC5的PNA
<400> 76
ggcggcggca tgggtg 16
<210> 77
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对ALK的PNA
<400> 77
gcaggagagg acggta 16
<210> 78
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对ALK的PNA
<400> 78
caggagagga cggtac 16
<210> 79
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对ALK的PNA
<400> 79
ggcaggagag gacggt 16
<210> 80
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对BCL2的PNA
<400> 80
ggatggcgca cgctgg 16
<210> 81
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对BCL2的PNA
<400> 81
gggaaggatg gcgcac 16
<210> 82
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对BCL2的PNA
<400> 82
ccacggtggt ggagga 16
<210> 83
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对PLK4的PNA
<400> 83
acggcaagcg gcggga 16
<210> 84
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ANTI PLK4 PNA
<400> 84
ggacggcaag cggcgg 16
Claims (19)
1.一种单链反基因寡核苷酸,所述寡核苷酸与靶基因的反义DNA链互补并且通过反基因机制调节靶基因的表达,所述寡核苷酸的特征在于6-30个核苷酸和包含至少三组的至少两个连续鸟嘌呤的DNA或合成核酸序列,其中所述寡核苷酸选自:SEQ ID NO:2-15、SEQ IDNO:24、25和SEQ ID NO:66-84。
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸,其特征在于,所述寡核苷酸选自:SEQ ID NO:2、4、5和6。
3.根据权利要求1所述的寡核苷酸,其特征在于,所述寡核苷酸选自:SEQ ID NO:68-84。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的寡核苷酸,其特征在于,所述寡核苷酸在所述寡核苷酸的3′和/或5端与载体序列缀合,所述载体选自由SEQ ID NO:47-56组成的组。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的寡核苷酸,其特征在于,SEQ ID NO:2、4、5、6、68和69针对MYCN基因。
6.根据权利要求3或4所述的寡核苷酸,其特征在于,SEQ ID NO:70-74针对基因MYC。
7.根据权利要求3或4所述的寡核苷酸,其特征在于,SEQ ID NO:75、76针对基因BIRC5。
8.根据权利要求3或4所述的寡核苷酸,其特征在于,SEQ ID NO:77-79针对基因ALK。
9.根据权利要求3或4所述的寡核苷酸,其特征在于,SEQ ID NO:80-82针对基因BCL2。
10.根据权利要求3或4所述的寡核苷酸,其特征在于,SEQ ID NO:83、84针对基因PLK4。
11.根据权利要求1-4中任一项所述的寡核苷酸,其特征在于,所述寡核苷酸是选自由SEQ ID NO:2-6组成的组的PNA。
12.根据权利要求11所述的寡核苷酸,其特征在于,所述PNA是SEQ ID NO:5。
13.一种组合物,其包含至少一种根据权利要求1至12中任一项所述的寡核苷酸和至少一种药学上可接受的赋形剂。
14.组合物,其包含至少一种根据权利要求1至12中任一项所述的寡核苷酸并与选定的具有药理作用的化合物组合,所述寡核苷酸包括SEQ ID NO:1,所述化合物选自由NGF、生长激素抑制素、视黄酸、放线菌素D、天门冬酰胺酶、博来霉素、白消安卡培他滨、卡铂、环磷酰胺、环孢霉素、顺铂、阿糖胞苷、clorambucil、氮烯唑胺、道诺霉素、多西他赛、盐酸阿霉素、盐酸表柔比星、足叶乙苷、磷酸氟达拉滨、氟脲嘧啶、吉西他滨、盐酸伊达比星、羟基脲、ifophosphamide、盐酸伊立替康、美法仑、巯基嘌呤、氨甲喋呤、丝裂霉素、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、甲基苄肼、雷替曲塞、链脲霉素、替加氟-尿嘧啶、替莫唑胺、巯鸟嘌呤、thiotepe、拓扑替康、长春花碱、硫酸长春新碱、长春地辛和长春瑞滨组成的组。
15.根据权利要求14所述的组合物,其特征在于,所述组合是SEQ ID NO:1与卡铂,或足叶乙苷或顺铂或长春新碱;或SEQ ID NO:5与卡铂,或足叶乙苷或顺铂或长春新碱。
16.根据权利要求1至12中任一项所述的寡核苷酸或根据权利要求13-15所述的组合物用作药物或诊断剂的用途。
17.根据权利要求16所述的寡核苷酸或组合物的用途,其特征在于,用于遗传疾病和/或病毒来源的疾病的治疗中或用于治疗肿瘤,所述遗传疾病和/或病毒来源的疾病和所述肿瘤由基因的超表达或抑制引起。
18.根据权利要求17所述的寡核苷酸或组合物的用途,其特征在于,所述遗传疾病选自由Gorlin综合征、唐氏综合征、Feingold综合征、先天性巨结肠、Von Hippel Lindau综合征、共济失调毛细血管扩张症、Li-Fraumeni综合征、Turcot综合征、家族性肿瘤和帕金森病组成的组。
19.根据权利要求17所述的寡核苷酸或的组合物的用途,其特征在于,所述肿瘤是选自由以下组成的组中的成人或儿科肿瘤:成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、成神经管细胞瘤、室管膜瘤、嗜铬细胞瘤、胚胎癌、生殖细胞肿瘤、腺泡状横纹肌肉瘤、胚胎横纹肌肉瘤、Wilms’肿瘤、肾脏的透明细胞肉瘤、滑膜肉瘤、肝胚细胞瘤、急性淋巴性白血病、慢性淋巴性白血病、Burkitt’s淋巴瘤、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性原巨核细胞白血病、T-细胞白血病、淋巴瘤、小细胞肺癌、肺腺癌、鳞状上皮细胞肺癌、典型和非典型原发性肺癌、大细胞肺癌、大细胞神经内分泌性肺癌、成胶质细胞瘤、肝癌、基细胞癌、卵巢肿瘤、乳房肿瘤和结肠癌。
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