BR112014020885B1 - oligonucleotídeo anti-gene de cadeia única e composição - Google Patents

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Abstract

OLIGONUCLEOTÍDEO ANTI-GENE DE CADEIA ÚNICA E COMPOSIÇÃO A presente invenção refere-se à oligonucleotídeos para a modulação da expressão de um gene, em particular, para a modulação de um gene responsável por uma patologia de origem genética, tumoral ou virai. Além disso, a presente invenção relaciona-se ao uso dos mencionados oligonucleotídeos, possivelmente quimicamente modificados, para o tratamento e/ou o diagnóstico das referidas doenças.

Description

Descrição
[001] A presente invenção se refere à oligonucleotídeos para modulação da expressão de um gene, em particular, para a modulação de um gene responsável por uma patologia de origem genética, tumoral ou virai.
[002] Além disso, a presente invenção relaciona-se ao uso dos referidos oligonucleotídeos, possivelmente quimicamente modificados, para o tratamento e/ou diagnóstico das referidas doenças.
[003] Os oligonucleotídeos são sequências curtas dos ácidos nucleicos naturais RNA ou DNA ou dos ácidos nucleicos sintéticos, por exemplo, PNA (Acido nucleico peptídico), LNA (Acido nucleico bloqueado) e morfolinos.
[004] Os oligonucleotídeos têm experimental mente demonstrado serem muito eficazes na modulação da expressão gênica, tanto no nível da transcrição como da tradução. Devido a esta capacidade, os oligonucleotídeos representam um meio válido para o tratamento de numerosas patologias, em particular doenças de origem genética, tumoral ou virai.
[005] A modulação da expressão de um gene pode implicar na sua inibição ou ativação.
[006] Por exemplo, os oligonucleotídeos são conhecidos por serem capazes de inibir a transcrição de um gene, através da formação de uma ligação complementar com a cadeia antisense do gene (Hélene c, Bioch Bioph Acta 1990, 1049 (2) :99-125), ou a modificação do estado da cromatina nas regiões reguladoras do gene de interesse (Rossi JJ, Nat Chem Bioi 2007,3 (3) :136-7). Outros oligonucleotídeos são conhecidos, os quais são capazes de inibir a tradução de genes, por exemplo, através de uma ligação complementar com o alvo do RNA mensageiro (RNAm). No caso de oligonucleotídeos de fita simples, esta ligação provoca a degradação enzimática do RNAm pelo complexo de RNase H. No caso em que os oligonucleotídeos são moléculas de RNA de dupla fita "interferentes", a ligação complementar dos oligonucleotídeos com o RNAm alvo provoca a degradação do mensageiro pela enzima "cortadora"do complexo RISC. Neste último caso, os oligonucleotídeos também podem ser equivalentes a um micro RNA endógeno capaz de se associar, em virtude da complementaridade imperfeita, com a região 3'UTR (região 3' não traduzida) do RNAm alvo, fazendo com que a tradução do RNAm seja bloqueada.
[007] Os oligonucleotídeos também podem induzir à ativação de um gene ou de um incremento na sua transcrição, por exemplo através de uma ligação complementar com o RNA de antisense não codificado longo {Morris KV, Epigenetic, 2009, 4 (5): 296-301), ou pela inibição do micro RNA complementar, com um consequente aumento na tradução do RNAm alvo do micro RNA.
[008] Os oligonucleotídeos podem ser modificados quimicamente, com o objetivo de aumentar a sua eficácia, em termos terapêuticos e/ou de diagnósticos. Por exemplo, um oligonucleotídeo pode ser modificado, a fim de melhorar a sua especificidade e/ou a força com a qual forma um par com sequência complementar, ou então um oligonucleotídeo pode ser modificado, de modo a torná-lo menos sensível à degradação enzimática, a fim de melhorar o seu perfil farmacocinético/farmacodinâmico, ou para facilitar a sua passagem através das membranas celulares.
[009] Adicional mente aos oligonucleotídeos de ácidos nucleicos naturais (isto é, sequências curtas de DNA e/ou RNA), existem oligonucleotídeos de ácidos nucleicos sintéticos, por exemplo, ácidos nucleicos peptídicos (PNA) e ácidos nucleicos bloqueados (LNA), os quais têm sido muito estudados e caracterizados, acima de tudo com o objetivo de modular a expressão de um gene, por meio de uma estratégia antigênica (por exemplo, concebida para atingir o gene diretamente). Os oligonucleotídeos de PNA e LNA, como todos os oligonucleotídeos modificados, são, em geral, muito mais estáveis quimicamente do que os oligonucleotídeos de DNA ou RNA. A sua estabilidade pode ser ainda melhorada através da síntese de oligonucleotídeos quiméricos. Um oligonucleotídeo quimérico é, por exemplo, uma sequência de oligonucleotídeos, em que ambos os monômeros clássicos (desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos) e nucleobases sintéticos (monômeros), por exemplo, monômeros de LNA, são inseridos.
[0010] Os LNAs são utilizados com uma estratégia antisense para acalmar genes através da inibição da transcrição do gene alvo {Braasch DA, NuciAcids Res., 2002, 30 (23) :5160-7). Alternativa mente, os oligonucleotídeos de LNA podem também ser utilizados em uma estratégia antigênica, como foi feito por Smith e colegas {Ge R, Faseb J, 2007, 1902-14), os quais conceberam a sequência de oligonucleotídeos, de tal modo a permitir a interação, em ambas as fitas, do ácido nucleico, por meio de um mecanismo de "invasão de fita", de maneira a formar uma estrutura "de formato Z" (definido como oligonucleotídeos "Zorro").
[0011] Os oligonucleotídeos de PNA são enzimaticamente mais estáveis, quando comparados com outras estruturas de oligonucleotídeos. Os PNAs podem se ligar ao DNA de fita dupla (DNAds), através da "invasão de fita", ou pode formar par, de uma maneira complementar, com uma molécula de DNA de fita simples (DNAss), ou então podem ligar- se às fitas de RNA, dando origem a uma estrutura de PNA/RNA ou PNA/DNA dupla hélice híbrida, que é termodinamicamente muito estável quando comparada às estruturas "homoduplex" (como uma fita dupla de DNA/DNA).
[0012] Os PNAs representam um sistema altamente vantajoso para a modulação da expressão de um gene, acima de tudo, usando uma estratégia antigênica. De fato, está demonstrado que os PNAs mostram elevada especificidade para as sequências alvo e, assim, permitem a expressão da proteína a ser inibida de maneira eficiente. Portanto, os PNAs representam uma abordagem terapêutica promissora para o tratamento de doenças genéticas ou virais.
[0013] A única desvantagem do PNA é o fato de que os mesmos têm uma capacidade limitada para passar através de membranas celulares. No entanto, esta limitação foi resolvida mediante a conjugação de oligonucleotídeos em geral, e em particular PNAs, com moléculas capazes de dar passagem através das membranas celulares mais eficazes (transportadores).
[0014] Na verdade, os oligonucleotídeos, e especifica mente os PNAs, podem em geral ser administrados usando os transportadores (ou "apêndices") a eles conjugados, por exemplo, sequências peptídicas com um comprimento variando entre 1 e 30 aminoácidos.
[0015] Uma aplicação particular dos oligonucleotídeos diz respeito à modulação da expressão dos genes, os quais são ativados ou reprimidos em tumores.
[0016] É de conhecimento que os tumores são causados pela desregulação de vários genes. Normalmente, o dano afeta proto-oncogenes (ou também simplesmente oncogenes), como os genes MYC (tra cui MYC, MYCN, MYCL1), survivina (BIRC5), BCL2, PLK4, ALK e PKM2, que são ativados ou sobre expressados no tumor. Além disso, em genes tumorais, antitumorais ou oncosupressores, tais como a caspase-8 e rassfl, são geralmente também inativados.
[0017] Em particular, os oncogenes da família MYC estão envolvidos no desenvolvimento de numerosos tumores humanos e estão entre os genes mais responsáveis pelo aparecimento e progressão dos neoplasmas. A amplificação e/ou a super-expressão destes genes está quase sempre associada a tumores, tanto do tipo infantil (por exemplo, neuroblastoma, meduloblastoma e rabdomiossarcoma) como do tipo adulto (por exemplo, o câncer de pulmão de pequenas células ou glioblastoma) (Pession A, Cur Câncer Drug Target, 2005, 5 (4) :273-83). Na verdade, os mesmos agem por meio de mecanismos que são fundamentais para o crescimento do tumor, tais como indução de proliferação celular, resistência à apoptose, formação de metástases e resistência à quimioterapia. Muitos oligonucleotídeos com um efeito antitumoral são conhecidos na literatura.
[0018] Por exemplo, existem os oligonucleotídeos que são direcionados em relação aos genes MYC, MYCN, BCL2, BIRC5 em estratégias antisense (EV Prochownik, Exp Rev Antic Ther 2004, 4 (2): 289-302; Feisher DW, Drug News Persp, 2003, 16 (6):370-4; CF Bennet, Exp. Opin InvestigDrugs, 1999, 8(3):237-53) ou oligonucleotídeos direcionados em relação ao MYCN e MYC com um efeito anti-gene (LCBoffa, oligonucleotides 2005,15(2): 85 -93).
[0019] Oligonucleotídeos antisense fosforotioatos, baseados em DNA, também foram gerados com o objetivo de inibir a tradução do gene MYCN nas células de neuroblastoma (Burkhart CA, JNCI, 2003, 95 (18) :1394-403) e os oligonucleotídeos antisense têm sido gerados através de "RNA de pequena interferência (siRNA)", para inibir a tradução do gene MYCN em células de neuroblastoma {Kang JH, Bioch Bioph Res. Com., 2006, 351 (1) :192- 197).
[0020] No entanto, existe ainda uma forte necessidade de identificar outros oligonucleotídeos, capazes de modular a expressão de um gene, de uma maneira cada vez mais específica e seletiva, de modo a serem capazes de ter um potente efeito terapêutico e/ou antitumoral.
[0021] A fim de obter oligonucleotídeos utilizáveis como meios terapêuticos e/ou de diagnóstico, é necessário identificar as sequências de um gene alvo ou de um RNA mensageiro alvo e/ou as suas respectivas sequências de regulação, que são capazes de determinar um efeito de modulação significativo e seletivo sobre a expressão do gene em si, tanto em termos de transcrição e tradução.
[0022] Assim, é também sentida a necessidade de definir as regras gerais que regem o processo de identificação - na sequência de um gene ou na sequência de um RNA mensageiro ou nas sequências regulatórias das mesmas - das sequências dos oligonucleotídeos, que são mais promissoras para o propósito de modulação da transcrição/tradução do gene.
[0023] As necessidades em esta área, como se acabou de descrever, são alcançadas pela presente invenção, que, de acordo com um primeiro aspecto, refere-se a um oligonucleotídeo para modular a expressão de um gene, que compreende 6-30 nucleotídeos (monômeros), de preferência, 12-24 nucleotídeos, estando o referido oligonucleotídeo caracterizado por uma sequência que compreende, pelo menos, um grupo de, pelo menos, duas guaninas consecutivas. Deve ser entendido que o oligonucleotídeo, com a sequência SEQ ID NO:1, está excluído da definição dada.
[0024] No que diz respeito aos ácidos nucleicos naturais (DNA e RNA), cada monómero (nucleotídeo) é constituído por uma base azotada, um açúcar e um trifosfato. A base é selecionada dentre adenina, guanina, timina, citosina e uracilo (apenas no RNA). O açúcar é desoxirribose no caso de DNA e ribose no caso do RNA. Os monômeros são ligados no polímero por uma ligação fosfodiéster.
[0025] De preferência, o oligonucleotídeo da presente invenção compreende uma sequência que inclui, pelo menos, um grupo de, pelo menos, três guaninas consecutivas. Deve ser entendido que o oligonucleotídeo, com a sequência SEQ ID NO:1, está excluído desta definição.
[0026] Ainda mais preferível, o oligonucleotídeo da presente invenção compreende uma sequência que inclui, pelo menos, um grupo de, pelo menos, quatro guaninas consecutivas.
[0027] Ainda mais preferível, o oligonucleotídeo da presente invenção compreende uma sequência que inclui, pelo menos, um grupo de, pelo menos, cinco guaninas consecutivas.
[0028] Particularmente preferido para os fins da presente invenção é um oligonucleotídeo que compreende uma sequência que inclui, pelo menos, um grupo de, pelo menos, seis guaninas consecutivas.
[0029] Em algumas formas de realização da invenção, o oligonucleotídeo compreende uma sequência que inclui, pelo menos, um grupo que consiste de 2 a 6 guaninas consecutivas.
[0030] Em outras formas de realização, o, pelo menos, um grupo de guaninas, de preferência, compreende, pelo menos, dois grupos de, pelo menos, duas guaninas consecutivas.
[0031] Alternativa mente, o, pelo menos, um grupo de guaninas, de preferência, compreende, pelo menos, um grupo de, pelo menos, duas guaninas consecutivas e, pelo menos, um grupo de, pelo menos, três guaninas consecutivas.
[0032] Em outras formas de realização, pelo menos, um grupo de guaninas compreende, de preferência, pelo menos três grupos de, pelo menos, duas guaninas consecutivas.
[0033] Em outras formas de realização, o, pelo menos, um grupo de guaninas compreende de preferência, pelo menos, quatro, cinco ou seis grupos de, pelo menos, duas guaninas consecutivas.
[0034] Alternativa mente, o, pelo menos, um grupo de guaninas compreende de preferência, pelo menos, um grupo de, pelo menos, duas guaninas consecutivas e, pelo menos, dois grupos de, pelo menos, três guaninas consecutivas.
[0035] Alternativa mente, o, pelo menos, um grupo de guaninas compreende de preferência, pelo menos, um grupo de, pelo menos, três guaninas consecutivas e, pelo menos, dois grupos de, pelo menos, duas guaninas consecutivas.
[0036] Alternativa mente, o, pelo menos, um grupo de guaninas preferencialmente compreende, pelo menos, um grupo de, pelo menos, duas guaninas consecutivas, pelo menos, um grupo de, pelo menos, três guaninas consecutivas e/ou, pelo menos, um grupo de seis guaninas consecutivas.
[0037] Em geral, os oligonucleotídeos da presente invenção são perfeitamente complementares à sequência alvo, e, de preferência, os grupos de guaninas consecutivas podem ser consecutivos de um em relação ao outro, de modo que, por exemplo, três grupos de duas guaninas consecutivas é um grupo de seis guaninas consecutivas. Alternativa mente, os grupos de guaninas consecutivas podem estar distanciados de, pelo menos, um nucleotídeo.
[0038] Em geral, o, pelo menos, um grupo de, pelo menos, duas guaninas consecutivas, de acordo com a presente invenção, pode estar localizado perto da extremidade 5' do oligonucleotídeo, ou próximo da extremidade 3' do oligonucleotídeo, ou então pode estar localizado no centro da sequência oligonucleotidica.
[0039] Em formas de realização preferidas da presente invenção, o referido oligonucleotídeo é conjugado, de preferência, com a sua extremidade 3' e/ou 5', com uma sequência de transportador, a qual é de preferência uma sequência curta de aminoácidos.
[0040] A referida sequência curta de aminoácidos (transportador), de preferência, é constituída por um número de aminoácidos que varia de 1 a 30, de preferência de 1 a 10, ainda mais preferível de 1 a 7. Os aminoácidos podem estar na forma L ou D, de preferência na forma D.
[0041] Os transportadores que são preferidos para os fins da presente invenção são selecionados do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 47 (PKKKRKV); SEQ ID NO: 48 (VKRKKKP); SEQ ID NO: 49 (KKKKKK); SEQ ID NO: 50 (PKRKRKV); SEQ ID NO: 51 (KRKRKRK); SEQ ID NO: 52 (KKKRKV); SEQ ID NO: 53 (PKKKRK); SEQ ID NO: 54 (KKKRK); SEQ ID NO: 55 (RRRR) e SEQ ID NO: 56 (PKKKRKVHHHHH).
[0042] O transportador que é particularmente preferido para os fins da presente invenção é o péptido, que tem a SEQ ID NO: 47.
[0043] No contexto da presente invenção, "transportador" significa um péptido capaz de modificar favoravelmente a farmacocinética e/ou o perfil farmacodinâmico e/ou a penetração celular e/ou nuclear de um oligonucleotídeo.
[0044] No contexto da presente invenção, "modulação da expressão de um gene" significa a inibição ou a ativação (aumento) da expressão de um gene. Referida inibição ou ativação (aumento) da expressão gênica pode ocorrer em um nível de tradução ou transcrição.
[0045] A inibição ou a ativação da expressão do gene pode ser conseguida através de um nível de transcrição, por meio de oligonucleotídeos que atuam com um mecanismo antigênico (ou oligonucleotídeo antígeno, isto é, dirigido contra a fita antisense do gene, ou seja, a estratégia antigênica). Alternativa mente, a inibição da expressão do gene pode ser conseguida através de um nível de tradução, utilizando oligonucleideos que atuam através de um mecanismo antisense (ou oligonucleotídeo antisense, isto é, dirigido contra o mensageiro, ou seja, estratégia antisense), ao passo que um aumento na expressão em um nível de tradução pode ser conseguido através da inibição das microRNAs que degradam o mensageiro do RNA.
[0046] Os parâmetros ou regras ou pré-requisitos que um oligonucleotídeo deve satisfazer, a fim de efetivamente modular a expressão de um gene, identificados pela Requerente e acima indicados, são válidos para qualquer gene e podem, portanto, ser aplicados, por exemplo, com a finalidade de identificar sequências de oligonucleotídeos que são capazes de modular a expressão do gene (s), responsável por doenças de origem genética e/ou virai ou dos genes envolvidos no aparecimento de patologias tumorais.
[0047] Os oligonucleotídeos, assim identificados, podem ser utilizados, de preferência, como medicamentos, em abordagens terapêuticas, para o tratamento de doenças genéticas, virais ou tumorais específicas. Alternativa mente, os oligonucleotídeos podem ser utilizados para fins de diagnóstico.
[0048] De fato, o objeto da presente invenção ainda refere-se à utilização dos oligonucleotídeos da invenção, possivelmente quimicamente modificados, para fins terapêuticos e/ou de diagnósticos.
[0049] Os oligonucleotídeos presente invenção são oligonucleotídeos curtos de resíduos 6- 30, de preferência 12-24 (nucleotídeos ou monômeros). Os oligonucleotídeos podem consistir de uma base de ácido nucleico natural, por exemplo, DNA ou RNA, ou uma base de ácido nucleico sintético, por exemplo, PNA, LNA ou morfolino. Alternativa mente, os oligonucleotídeos podem compreender uma combinação de DNA, RNA e/ou ácidos nucleicos sintéticos, de preferência, PNA ou LNA (oligonucleotídeos híbridos ou quiméricos). Além disso, os oligonucleotídeos podem ser fita simples ou dupla.
[0050] Em algumas formas de realização da presente invenção, os oligonucleotídeos podem ser modificados quimicamente, por exemplo, com a finalidade de melhorar a sua eficácia terapêutica e/ou diagnóstica.
[0051] Em formas de realização preferidas da presente invenção, os oligonucleotídeos podem ser moléculas de PNA com um esqueleto, em que o carbono na posição alfa (Caifa(a)) está ligado a substituintes outros do que o típico átomo de hidrogénio de glicina. Por exemplo, em vez de a cadeia lateral da glicina, pode ser usada a cadeia lateral de outro aminoácido de origem natural ou sintética, de preferência, selecionado do grupo que consiste em: arginina, lisina, histidina, leucina, isoleucina, tirosina, asparagina, serina, treonina, glutamina, valina, alanina, cisteína, metionina, fenilalanina, glutamato, aspartato, prolina, triptofano e ornitina. O referido aminoácido pode ser de configuração dextrórrotatória (D) ou de configuração levorrotatória (L).
[0052] Em outras formas de realização preferidas da invenção, os oligonucleotídeos são: moléculas de RNA de fita simples ou dupla, mutuamente complementares (as moléculas de RNA de fita dupla, mutuamente complementares, são definidas como siRNA, acrónimo de "RNA interferente pequeno").
[0053] Em algumas formas de realização da invenção, o referido "RNA interferente pequeno" inclui monômeros de RNA (ribonucleotídeos) e, pelo menos, um monômero modificado na posição 2'-ribose, de preferência, um monômero de 2'-0-metoxietil, 2'-0-metil ou 2'-flúor; ou o referido "RNA interferente pequeno" inclui monômeros de RNA (ribonucleotídeos) e, pelo menos, um monômero de um ácido nucleico sintético, de preferência selecionado dentre: LNA, LNA metilfosfonato, LNA (ácido nucleico em ponte), ANU (ácido nucleico desbloqueado), ENA (ácido nucleico em ponte de etileno), ANA (ácido nucléico arabinose) e F-NA (ácido nucleico flúor-arabinosideo).
[0054] Em formas de realização preferidas, o referido "RNA interferente pequeno" é concebido de tal maneira que nas extremidades da fita dupla complementar, apenas uma das duas fitas tem pelo menos um, de preferência dois, monômeros de ácidos nucleicos naturais ou sintéticos, que se projetam, ou seja, não estão em pares. Em outras formas de realização, ácidos nucleicos naturais ou sintéticos, que se projetam, são de preferência, selecionados dentre: monômeros de 2'-0-metoxietil, 2'-0-metil ou 2'-flúor ou um monômero de: LNA, LNA metilfosfonato, BNA, ANU (ácido nucleico desbloqueado), ENA (ácido nucleico em ponte de etileno), ANA (ácido nucleico de arabinose) e F-ANA (ácido nucleico de flúor- arabinosideo).
[0055] Em outras formas de realização, os oligonucletídeos são definidos como híbridos ou quiméricos e são, de preferência, de fita simples ou dupla, compreendendo monômeros de RNA (ribonucleotídeos) e monômeros de LNA (este oligonucleotídeo é representado como RNA/LNA).
[0056] Alternativa mente, os oligonucleotídeos híbridos podem compreender os monômeros de RNA (ribonucleotídeos) e pelo menos um monômero de RNA, selecionado dentre: um monômero de 2'-0-metoxietil (MOE), um monômero de 2'-0-metil e um monômero de 2'- flúor; ou os oligonucleotídeos híbridos podem compreender monômeros de RNA (ribonucleotídeos) e, pelo menos, um monómero de um ácido nucleico sintético, de preferência, selecionado dentre: LNA, LNA metilfosfonato, ANU (ácido nucleico desbloqueado), BNA, ENA (ácido nucleico de etileno), ANA (ácido nucleico de arabinose) e F-ANA (ácido nucleico de flúor arabinosideo).
[0057] Em outra forma de realização, os oligonucleotídeos com base em RNA de fita simples ou dupla podem compreender ribonucleotídeos clássicos (ou seja, não modificados quimicamente) e ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos que tenham sido modificados ao nível da ligação fosfodiéster, por exemplo, por meio de uma ligação de fosforotioato, ou DNG (guanidina desoxirribonucleica), RNG (guanidina ribonucleica), GNA (ácido nucleico de glicerol), L-PNA (gama-PNA) ou PMO (morfolino).
[0058] Em formas de realização preferidas da invenção, os oligonucleotídeos são sequências quiméricas de fita simples, que compreendem monômeros de DNA (desoxirribonucleotídeos) e monômeros de LNA.
[0059] Para uma estratégia antigênica, o que significa a modulação da expressão de um gene ao nível de transcrição, pode-se, de preferência, empregar: • oligonucleotídeos baseados em PNA, opcionalmente conjugados com um transportador (que consiste geralmente de 1 a 30 resíduos), de preferência, na extremidade 3' e/ou 5'; ou • oligonucleotídeos baseados em PNA, referido PNA compreendendo, pelo menos, um carbono alfa (C-alfa) da cadeia principal, com um substituinte diferente do átomo H da glicina canónica; ou • oligonucleotídeos de fita simples, que compreendem monômeros de RNA (os ribonucleotídeos clássicos) e, opcionalmente, pelo menos, um nucleotídeo modificado (monómero) (por exemplo, um monómero de RNA 2'-0-metil, um monómero de RNA 2'- Flúor), ou, pelo menos, um monómero de um ácido nucleico selecionado dentre: LNA, LNA metilfosfonato, BNA, UNA, GNA, ANA, FANA, ENA, DNG e RNG, ou um ribonucleotídeo modificado ao nível da ligação fosfodiéster; ou • oligonucleotídeos baseados em RNA, de fita dupla, mutuamente complementares (siRNA); ou • oligonucleotídeos quiméricos, de fita dupla, parcialmente complementares, compreendendo monômeros de RNA (os ribonucleotídeos clássicos) e, pelo menos, um monômero de LNA; ou • oligonucleotídeos quiméricos, de fita dupla, que compreendem monômeros de RNA (os ribonucleotídeos clássicos) e, pelo menos, um monômero de RNA 2'-0-(2-metoxietil); ou • oligonucleotídeos quiméricos, de fita simples, que compreendem monômeros de DNA (os desoxirribonucleotídeos clássicos) e, pelo menos, um monômero de LNA; ou • oligonucleotídeos, que compreendem monômeros de DNA (os desoxirribonucleotídeos clássicos) e, pelo menos, um monômero de RNA 2'-Flúor ou, pelo menos, um monômero de um ácido nucleico selecionado dentre: LNA, LNA metilfosfonato, BNA, UNA, GNA, ENA, ANA, FAN DNG e RNG.
[0060] Para uma estratégia antisense, o que significa a modulação da expressão de um gene em um nível de tradução, pode-se, de preferência, utilizar: • oligonucleotídeos de fita dupla, mutuamente complementares, compreendendo monômeros de RNA (os ribonucleotídeos clássicos) (siRNA); ou • oligonucleotídeos de fita simples, que compreendem monômeros de RNA (os ribonucleotídeos clássicos) e, pelo menos, um monômero de RNA modificado no nível de ribose e/ou no nível da ligação fosfodiéster; ou • oligonucleotídeos quiméricos, de fita simples, que compreendem monômeros de DNA (os desoxirribonucleotídeos clássicos) e, pelo menos, um monômero de DNA fosforotioato; ou • oligonucleotídeos quiméricos, de fita dupla, que compreendem monômeros de RNA (os ribonucleotídeos clássicos) e, pelo menos, um monômero de RNA 2'-0-(2-metoxietil); ou • oligonucleotídeos quiméricos, de fita dupla, que compreendem monômeros de RNA (os ribonucleotídeos clássicos) e, pelo menos, um monômero de RNA 2'0-metilato; ou • oligonucleotídeos quiméricos, de fita dupla, que compreendem monômeros de RNA (os ribonucleotídeos clássicos) e, pelo menos, um monômero de RNA 2'-flúor; ou • oligonucleotídeos quiméricos, de fita dupla, que compreendem monômeros de RNA (os ribonucleotídeos clássicos) e, pelo menos, um monômero de LNA; ou • oligonucleotídeos quiméricos, de fita dupla, que compreendem monômeros de RNA (os ribonucleotídeos clássicos) e, pelo menos, um monômero de RNA arabinosido; ou • oligonucleotídeos quiméricos, de fita simples, que compreendem monômeros de DNA (os desoxirribonucleotídeos clássicos) e, pelo menos, um monômero de LNA; ou • oligonucleotídeos, de fita simples, que compreendem monômeros morfolinos; ou • oligonucleotídeos baseados em PNA, referido PNA compreendendo, pelo menos, um carbono alfa (C-alfa) da cadeia principal, com um substituinte diferente do átomo H da glicina canónica; de preferência, o substituinte é a cadeia lateral de arginina, ou lisina; ou • oligonucleotídeos, que compreendem monômeros de DNA (os desoxirribonucleotídeos clássicos) e, pelo menos, um monômero de um ácido nucleico selecionado dentre: PNA, LNA, LNA metilfosfonato, BNA, UNA, GNA, ENA, DNG e RNG.
[0061] De preferência, os oligonucleotídeos da presente invenção são direcionados em relação a um gene envolvido no desenvolvimento de uma doença de origem genética e/ou virai ou de um tumor. O referido gene é, de preferência, selecionado do grupo que consiste em: genes da família MYC (de preferência MYC, MYCN, MYCL1), genes de survivina (BIRC5), BCL2, PLK4, ALK, PKM2, caspase-8 e RASSF1.
[0062] Em particular, os oligonucleotídeos da presente invenção são direcionados em relação aos genes da família MYC, de preferência em relação ao MYCN.
[0063] Os referidos oligonucleotídeos são, de preferência, selecionados do grupo que
[0064] Em algumas formas de realização, os referidos oligonucleotídeos são oligonucleotídeos de PNA, de preferência, os referidos PNAs são direcionados em relação ao MYCN.
[0065] Em formas de realização preferidas, os PNAs são selecionados do grupo que consiste nas SEQ ID NO: 2-15.
[0066] Em outras formas de realização preferidas, os PNAs são selecionados do grupo que consiste nas SEQ ID NO: 66-84.
[0067] Em outras formas de realização preferidas, os PNAs são selecionados do grupo que consiste nas SEQ ID NO: 2-15, 66-84.
[0068] De preferência, os oligonucleotídeos de PNA são selecionados de um grupo que consiste nas SEQ ID NO: 2-13, ainda mais preferível, nas SEQ ID NO: 2-8, ainda mais preferível nas SEQ ID NO: 2-6. O oligonucleotídeo de PNA, que é particularmente preferido para os fins da presente invenção é a SEQ ID NO: 5.
[0069] De preferência, a SEQ ID NO: 5 é conjugada na extremidade 5' ou 3'com a SEQ ID NO: 47. Ainda mais preferível, a SEQ ID NO: 47 consiste de aminoácidos na forma D.
[0070] Os PNAs, SEQ ID NO: 2-15, são de preferência direcionados em relação ao MYCN e, ainda, mais preferível, os mesmos modulam a expressão do MYCN com uma estratégia antigênica.
[0071] Os PNAs, SEQ ID NO: 66-69, são também, de preferência, direcionados em relação ao MYCN e, ainda mais preferível, os mesmos modulam a expressão do MYCN com uma estratégia antigênica.
[0072] Os PNAs, SEQ ID NO: 70-74, são, de preferência, direcionados em relação ao MYC e, ainda mais preferível, os mesmos modulam a expressão do MYC com uma estratégia antigênica.
[0073] Os PNAs, SEQ ID NO: 75, 76, são, de preferência, direcionados em relação ao BIRC5 e, ainda mais preferível, modulam a expressão do BIRC5, com uma estratégia antigênica
[0074] Os PNAs, SEQ ID NO: 77-79, são, de preferência, direcionados em relação ao ALK e, ainda mais preferível, os mesmos modulam a expressão do ALK com uma estratégia antigênica
[0075] Os PNAs, SEQ ID NO: 80-82 são, de preferência, direcionados em relação ao BCL2 e, ainda mais preferível, os mesmos modulam a expressão do BCL2, com uma estratégia antigênica.
[0076] Os PNAs, SEQ ID NO: 83, 84, são, de preferência, direcionados em relação ao PLK4 e, ainda mais preferível, modulam a expressão do PLK4 com uma estratégia de antigênica
[0077] Em outra forma de realização, os referidos oligonucleotídeos são de fita dupla e, de preferência, compreendem monômeros de RNA. Preferencial mente, os referidos oligonucleotídeos são direcionados em relação ao MYCN.
[0078] Alternativa mente, os referidos oligonucleotídeos de RNA, de fita dupla, são selecionados do grupo que consiste em: o par dos oligonucleotídeos complementares, que tem as SEQ ID NO: 26 e 57, o par dos oligonucleotídeos complementares, que tem as SEQ ID NO: TJ e 58, o par dos oligonucleotídeos complementares, que têm as SEQ ID NO: 28 e 59, o par dos oligonucleotídeos complementares, que tem as SEQ ID NO: 29 e 60 e o par dos oligonucleotídeos complementares, que tem as SEQ ID NO: 30 e 61.
[0079] Os referidos oligonucleotídeos são, de preferência, direcionados em relação ao MYCN. Ainda mais preferível, os mesmos modulam a expressão do gene através de uma estratégia antigênica.
[0080] Em outras formas de realização, os referidos oligonucleotídeos são oligonucleotídeos quiméricos de DNA-LNA e, de preferência, referidos oligonucleotídeos são direcionados em relação ao MYCN.
[0081] Em outras formas de realização preferidas, os referidos oligonucleotídeos quiméricos de DNA-LNA são selecionados do grupo que consiste em: - as SEQ ID NO: 24 e 25; - as SEQ ID NO: 24 e 25 são, de preferência direcionadas em relação ao gene MYCN; - as SEQ ID NO: 24 e 25, de preferência, modulam a expressão do gene, através de uma estratégia de antigênica.
[0082] Em outras formas de realização, referidos oligonucleotídeos são oligonucleotídeos quiméricos, de fita simples, que compreendem monômeros de DNA e/ou, pelo menos, um monômero de DNA fosforotioato. Referidos oligonucleotídeos são, de preferência direcionados em relação ao MYCN.
[0083] Particularmente preferidos, para os fins da presente invenção, são os oligonucleotídeos quiméricos selecionados do grupo que consiste nas SEQ ID NO: 31 e 32 e nas SEQ ID NO: 31 e 32 e estão, de preferência, direcionadas em relação ao gene MYCN; as SEQ ID NO: 31 e 32, de preferência, modulam a expressão do MYCN, através de uma estratégia antigênica.
[0084] Em outras formas de realização, referidos oligonucleotídeos são quiméricos, de fita dupla, que compreendem os monômeros de RNA e, pelo menos, um monómero, de preferência, de 2'-0-(2-metoxietil) ou RNA de 2'-metil. Referidos oligonucleotídeos são, de preferência, direcionados em relação ao MYCN.
[0085] Particularmente preferido, para os fins da presente invenção, é o par de oligonucleotídeos complementares quiméricos que tem as SEQ ID NO: 33 e 62. Referido par de oligonucleotídeos, de preferência, modula a expressão do gene através de um mecanismo antigénico.
[0086] Em outras formas de realização, os referidos oligonucleotídeos são quiméricos, de fita dupla, que compreendem monômeros de RNA e, pelo menos, um monómero, de preferência de RNA de 21-Flúor. De preferência, referidos oligonucleotídeos são direcionados em relação ao MYCN.
[0087] Particularmente preferido, para os fins da presente invenção, é o par dos oligonucleotídeos quiméricos complementares, que tem as SEQ ID NO: 34 e 63. Referido par de oligonucleotídeos ,de preferência, modula a expressão do gene, por meio de um mecanismo antisense.
[0088] Em outras formas de realização, os referidos oligonucleotídeos são quiméricos, de fita dupla, que compreendem monômeros de RNA e, pelo menos, um monómero de LNA. Referidos oligonucleotídeos são, de preferência, direcionados em relação ao MYCN.
[0089] Particularmente preferido, para os fins da presente invenção, é o par de oligonucleotídeos quiméricos complementares, que tem aa SEQ ID NO: 35 e 64. Referido par de oligonucleotídeos, de preferência, modula a expressão do gene, por meio de um mecanismo antisense.
[0090] Em outras formas de realização, mencionados oligonucleotídeos são quiméricos, de fita dupla, que compreendem monômeros de RNA e, pelo menos, um monómero de RNA de arabinosido. De preferência, referidos oligonucleotídeos são direcionados em relação ao MYCN.
[0091] Particularmente preferido, para os fins da presente invenção, é o par de oligonucleotídeos quiméricos complementares, que tem as SEQ ID NO: 36 e 65. Referido par de oligonucleotídeos, de preferência, modula a expressão do gene, por meio de um mecanismo antisense.
[0092] Um aspecto adicional da invenção relaciona-se com a utilização dos oligonucleotídeos acima descritos, para fins terapêuticos e/ou de diagnóstico.
[0093] Em particular, os oligonucleotídeos podem ser utilizados individualmente ou combinados, para o tratamento de doenças de origem genética e/ou virai, em especial para o tratamento de doenças genéticas ou causadas tanto pela sobre expressão como pela inibição de um gene, isto é, doenças genéticas, que exigem a modulação da expressão de um gene, o qual está sobre expresso ou inibido.
[0094] Os oligonucleotídeos da invenção são utilizados para o tratamento terapêutico de uma doença genética, de preferência, selecionada dentre o grupo constituído por: síndrome de Gorlin, síndrome de Down, síndrome de Feingold, doença de Hirschsprung, síndrome de Von Hippel Lindau, Ataxia Telangiectasia, síndrome de Li-Fraumeni, síndrome de Turcot, tumores de família e doença de Parkinson.
[0095] Além disso, os oligonucleotídeos da invenção são utilizados para o tratamento terapêutico de patologias tumorais em crianças ou adultos. Em particular, os tumores a que se faz referência são causados, de preferência, por sobre expressão de um gene ou oncogene, selecionado do grupo que consiste em: MYC, MYCN, MYCL1, survivina (BIRC5), BCL2, PLK4, ALK e PKM2. Alternativa mente, os tumores são provocados, de preferência, pela inibição (inativação) de um gene onco-supressor ou antitumoral e, de preferência, selecionado dentre o grupo que consiste em: caspase-8 e RASSF1.
[0096] Os tumores sobre os quais é feita referência são, de preferência selecionados do grupo que consiste em: neuroblastoma, retinoblastoma, meduloblastoma, ependimoma, feocromocitoma, carcinoma embrionário, tumor de células germinativas, rabdomiossarcoma alveolar, rabdomiosarcoma embrionário, tumor de Wilms, sarcoma de células claras de rim, sarcoma sinovial, hepatoblastoma, leucemia linfóide aguda, leucemia linfóide crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfoblástica crónica, linfoma de Burkitt, leucemia mielóide aguda, leucemia mielóide crónica, leucemia megacarioblástica aguda, leucemia linfóide crónica B, leucemia de células T, linfomas, câncer de pulmão de pequenas células (microcitoma), adenocarcinoma de pulmão, carcinoma de pulmão de células escamosas, câncer de pulmão primário típico e atípico, carcinoma de pulmão de células grandes, carcinoma de pulmão neuroendócrino de células grandes, glioblastoma, hepatocarcinoma, carcinoma basocelular, tumor de ovário, tumor de mama e câncer de cólon.
[0097] Particularmente preferidos, para os fins da presente invenção, são os tumores selecionados do grupo que consiste em: neuroblastoma, retinoblastoma, rabdomiossarcoma, tumor de Wilms, meduloblastoma, o câncer de pulmão de pequenas células e carcinoma basocelular.
[0098] O objeto da presente invenção ainda refere-se a uma composição que compreende, pelo menos, um oligonucleotídeo, de acordo com a presente invenção, e pelo menos um excipiente farmacologicamente aceito. De preferência, o referido, pelo menos, um oligonucleotídeo é um PNA, de preferência, selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 2-15, 66-84, de preferência, as SEQ ID NO: 2-13, ainda mais preferível as SEQ ID NO: 2-8, ainda mais preferencial mente as SEQ ID NO: 2-6. O oligonucleotídeo que é particularmente preferido é a SEQ ID NO: 5. De preferência, a SEQ ID NO:5 está conjugada na extremidade 5' ou 3'com a SEQ ID NO: 47. De preferência, a SEQ ID NO: 47 é constituída por aminoácidos na forma D.
[0099] O referido PNA é, preferencialmente, conjugado na sua extremidade 5' ou 3' com um transportador, que é de preferência selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NO: 47-56.
[00100] O objeto da presente invenção refere-se, ainda, a uma combinação que compreende, pelo menos, um oligonucleotídeo, de acordo com a presente invenção, incluindo o oligonucleotídeo que tem a SEQ ID NO: 1, pelo menos um composto, de preferência, pelo menos, um composto com um efeito farmacológico, ainda mais preferível um agente quimioterápico, e, opcionalmente, pelo menos um excipiente farmacologicamente aceito.
[00101] Em formas de realização preferidas, o referido, pelo menos, um composto é, pelo menos, um antígeno adicional e/ou oligonucleotídeo antisense, ou, pelo menos, um agente farmacológico, ou, pelo menos, um composto de origem biológica ou biotecnológica ou derivação de síntese química ou de suas combinações. O referido composto de origem biológica ou biotecnológica ou derivação de síntese química é, de preferência, selecionado do grupo que consiste em: um anticorpo monoclonal, um agente quimioterápico, um agente imunomodulador, um fator de crescimento, uma citocina, um peptídeo, um inibidor de angiogênese, um inibidor de crescimento tumoral, um hormônio esteroidal e/ou um hormônio não esteroidal e vitaminas.
[00102] Exemplos de compostos que são particularmente preferidos, para os fins da presente invenção, são selecionados dentre o grupo constituído por: fator de crescimento do nervo (NGF), somatostatina, ácido retinóico, actinomicina D, asparaginase, bleomicina, bussulfano capecitabina, carboplatina, ciclofosfamida, ciclosporina, cisplatina, citarabina, clorambucil, dacarbazina, daunorubicina, docetaxel, hidroclorido de doxorrubicina, hidroclorido de epirubicina, etoposida, fosfato de fludarabina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroclorido de idarrubicina, hidroxiureia, ifosfamida, hidroclorido de irinotecano, melfalano, mercaptopurina, metotrexato, mitomicina, mitoxantrona, nutlina, oxaliplatina , paclitaxel, procarbazina, raltitrexato, estreptozocina, tegafur-uracila, temozolomida, tioguanina, tiotepa, topotecano, vinblastina, vincristina, vindesina e vinorelbina e as combinações das mesmas.
[00103] Ainda mais preferível, os compostos são selecionados do grupo que consiste em: carboplatina, cisplatina, etoposida, vincristina, ciclofosfamida e as combinações das mesmas.
[00104] A Requerente constatou que a administração de, pelo menos, um oligonucleotídeo, de acordo com a invenção, em concomitância com, pelo menos, um composto, de preferência, pelo menos, um agente quimioterápico, tal como descrito acima, faz com que seja possível reduzir a concentração do referido composto a ser administrado, enquanto que, ao mesmo tempo, garante um aumento da eficácia terapêutica e uma redução da toxicidade.
[00105] A Requerente constatou que, em estas condições, a diminuição da concentração do referido composto depende da patologia específica; em particular, a concentração do composto quimioterápico depende do tipo de tumor.
[00106] Para alguns tumores, tais como, neuroblastoma, retinoblastoma, meduloblastoma, câncer de pulmão de pequenas células, tumor de Wilms, rabdomiossarcoma alveolar e rabdomiosarcoma embrionário, a concentração de, pelo menos, um agente quimioterápico, administrado em combinação com, pelo menos, um oligonucleotídeo, de acordo com a presente invenção, pode reduzir os tumores em até 10 vezes, à medida que garante o mesmo efeito terapêutico de uma dose normal de um agente quimioterápico.
[00107] Particularmente eficaz, como uma combinação farmacêutica (em termos de melhoria do efeito terapêutico), é a combinação de, pelo menos, um PNA, de acordo com a presente invenção, de preferência, pelo menos, um PNA selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1-15, 66-84, de preferência as SEQ ID NO: 1-13, ainda mais preferível as SEQ ID NO: 1-8, ainda mais preferível as SEQ ID NO: 1-6, ainda mais preferível a SEQ ID NO: 1 e/ou 5, e, pelo menos, um composto, de preferência, um agente quimioterápico, de preferência selecionado do grupo que consiste em: etoposida (VP16), carboplatina, cisplatina ou vincristina, ciclofosfamida e as combinações das mesmas.
[00108] Particularmente preferida, para os fins da invenção, é uma combinação selecionada dentre a SEQ ID NO: 1 e carboplatina, ou etoposida ou cisplatina ou vincristina ou a SEQ ID NO: 5 e carboplatina ou etoposídeo ou cisplatina ou vincristina.
[00109] O referido PNA é, preferencial mente, conjugado na sua extremidade 3' e/ou 5', com um transportador, o qual é de preferência selecionado dentre o grupo que consiste nas SEQ ID NO: 47-56.
[00110] O efeito de melhora é, de preferência, para ser encontrado, tanto quando a combinação é administrada simultaneamente como quando o dito, pelo menos, um composto é administrado sucessivas vezes, de preferência, em intervalos, ainda mais preferível, em intervalos regulares de 3, 6, 12, 24, 48 ou 72 horas.
[00111] Em outras formas de realização preferidas, pelo menos, um oligonucleotídeo da invenção, incluindo o oligonucleotídeo que tem a SEQ ID NO: 1, pode ser administrado, conjugado ou complexificado, de preferência com, pelo menos, uma partícula transportadora, pelo menos um polímero transportador ou, pelo menos, um oligonucleotídeo transportador automontado (também conhecido como aptâmeros).
[00112] Em outras formas de realização preferidas, pelo menos um oligonucleotídeo da invenção, incluindo o oligonucleotídeo que tem a SEQ ID NO: 1 pode ser conjugado ou complexificado e administrado com, pelo menos, uma micela liposómica, pelo menos, com uma micropartícula ou, pelo menos, com uma nano partícula, de modo a favorecer a permeação do tecido alvo.
[00113] A referida partícula, geralmente de forma esférica e utilizada como um meio de distribuição específico, pode ser formulada com muitos compostos químicos diferentes. Por exemplo, a referida partícula pode ser uma formulação ou co-formulação de compostos poliméricos, tais como: quitosana, ácido hialurônico, polietileno glicol (PEG), polietilenoimina (PEI), ácido poliláctico (PLA), poli (ácido láctico co-glicólico) (PLGA), hidroxiapatita (HAP), ácidos graxos poliinsaturados, ácidos graxos saturados, lipídios catiônicos, HAP-PLA, HAP- PLA/PGA e seus derivados. De acordo com outras formas de realização preferidas, pelo menos, um oligonucleotídeo da invenção pode ser administrado, conjugado ou complexificado, de preferência, com pelo menos uma partícula do tipo descrito anteriormente e, pelo menos, um ligante ou uma porção de um ligante, para um específico receptor das células alvo (tais como, por exemplo, GD2, ácido fólico, TRAIL, NGF), tanto de origem química como biotecnológica, pode estar presente nas membranas poliméricas como um adjuvante, útil para favorecer a internalização do referido oligonucleotídeo da invenção nas células alvo.
[00114] De acordo com outras formas de realização preferidas, pelo menos, um oligonucleotídeo da invenção pode ser conjugado com, pelo menos, um ligante ou uma porção de um ligante (tais como, por exemplo, GD2 (gangliósido GD2), um ácido fólico, um TRAIL (LIGANTE INDUTOR DE APOPTOSE RELACIONADO - TNF), um NGF (Fator de Crescimento do Nervo), específico para um receptor de células alvo).
[00115] De acordo com outras formas de realização preferidas, pelo menos, um oligonucleotídeo da invenção, incluindo o oligonucleotídeo que tem a SEQ ID NO: 1, pode ser administrado, por si só ou em combinação, em associação com, pelo menos, outra aplicação medicinal, a fim de ampliar a sua eficácia, de preferência também facilitando a permeação das células alvo e/ou dos tecidos.
[00116] A referida aplicação medicinal é, preferencialmente, selecionada do grupo constituído por: terapia de oxigénio, magnetoterapia, termoterapia, eletroestimulação, ultrassom, radioterapia, quimioterapia e fototerapia.
Exemplo 1 Síntese Química dos oligonucleotídeos
[00117] A síntese química dos oligonucleotídeos é baseada na utilização de nucleosídeos fosforoRNAiditas modificados de DNA, com um grupo de proteção, 4, 4'- dimetoxitritilo (DMTr) em 51-OH e β-cianoetilo, no grupo 3'-fosfato; os grupos de proteção são também utilizados para as aminas primárias (heterociclos de núcleo base), que são, por sua vez, muito reativas.
[00118] A síntese química de oligonucleotídeos de DNA ocorre em uma direção 3'-5'. É feito uso de uma resina CPG (acrônimo de vidro de poro controlado) ou um suporte de poliestireno funcionalizado com a primeira base de nucleotídeos. A síntese começa com uma etapa de desproteção do grupo 5'-dimetoxitritilo, utilizando uma solução de 3% de ácido tricloroacético (TCA) em diclorometano (DCM). Isto é seguido pela ativação, usando etiltiotetrazol (ETT) ou benziItiotetrazol (BTT) 0,3M, de fosforamidita que corresponde à segunda base a ser inserida em sequência, a qual irá, então, ser acoplada com o 5' 0H anteriormente desprotegido, formando assim um ligação fosfodiéster.
[00119] O etapa seguinte é o "capping", que serve para acetilar os grupos 5' OH que não tenham reagido. O "capping"é realizado usando duas soluções, uma contendo tetra- hidrofurano (THF) / lutidina / anidrido acético (8:1:1) e a outra contendo 10% de uma solução de metilimidazol em THF. A ligação trivalente instável dos triesteres fosfitos é estabilizada por iodo em uma solução de THF/piridina que os oxida para fosfodiésteres pentavalentes.
[00120] Após a oxidação, o ciclo é repetido, começando com a destritilação da segunda unidade introduzida e assim por diante. Este ciclo é repetido o número de vezes necessário, dependendo do número de bases que se pretende inserir na sequência. Finalmente, o último grupo 5' -DMTr é removido por meio de um tratamento com um ácido à temperatura ambiente.
[00121] Dependendo dos grupos protetores presentes nas bases (que por sua vez dependem da química das bases selecionadas, PTO, 2' OMe, etc.) podem ser deixadas a 55° C durante 16 horas com hidróxido de amónio ou a 55° C durante 35 minutos, com uma solução de hidróxido de amónio/metilamina (AMA), a fim de desproteger os fósforos por β- eliminação dos grupos de cianoetilo e remover os grupos de proteção dos heterociclos de núcleo de base.
[00122] Alternativa mente, o grupo 5' -DMTr pode ser mantido durante toda a fase de análise (HPLC, MS) e cromatograficamente preparado, para melhor purificar o produto final dos subprodutos e, finalmente, removido por meio de um tratamento com ácido acético.
[00123] A síntese química de oligonucleotídeos de RNA difere daquela dos oligonucleotídeos de DNA, devido ao grupo 2' 0H presente na ribose e, assim, a presença de um grupo de proteção adicional para cada fosforamidita. Em consequência, a síntese de oligonucleotídeos de RNA requer um tempo mais longo de acoplamento e outras etapas para desproteger aquele grupo.
[00124] O mesmo protocolo que o descrito acima é utilizado para a síntese de oligonucleotídeos com monômeros quimicamente modificados, tais como fosforotioatos (PTO), 2' 0-Metil (2' OMe), 2' Flúor (2' -F), ácido nucleico arabinósido (ANA), e ácido nucleico bloqueado (LNA).
[00125] Os detalhes das técnicas específicas para cada base modificada foram providos pela empresa onde as moléculas de monômero são compradas {Link Technologies Ltd.).Os morfolinos foram adquiridos do fabricante {Gene tools, LLC).
[00126] A síntese de oligonucleotídeos de PNA foi realizada em uma escala de 10 micromoles e incluiu uma etapa de purificação e caracterização.
[00127] A síntese da molécula foi realizada na fase sólida, utilizando uma resina Amide- ChemMatrix® de Rink e um sintetizador automático Syro (MultiSynTech). O primeiro monômero de síntese é ligado manualmente à resina. Cada ciclo de síntese automático é dividido em três etapas. A primeira etapa é a desproteção, realizada utilizando 20% de uma solução de piperidina em DMF (dimetilformamida).
[00128] A segunda etapa é a reação de acoplamento entre o monômero de entrada e a cadeia em crescimento. Esta reação é realizada pela adição de equivalentes (eq) 5 0,22M de monômero (FMOC-PNA-G (Bhoc)-OH, FMOC-PNA-A (Bhoc)-OH, FMOC-PNA-C (Bhoc)-OH, FMOC-PNA-T-OH) em NMP (N-metil pirrolidona) e equivalentes 4,5 0,32M de um ativador em DMF (neste caso HATU), em um ambiente alcalino, com 8% de uma solução de 2,6- lutidina e DIPEA (N, N-diisopropiletilamina) em DMF. A reação de acoplamento é repetida, em duplicado, no ponto de ligação do primeiro e segundo monômeros na resina pré- carregada, na passagem da cadeia de peptídeo para aquela de PNA, e no último monômero.
[00129] A terceira etapa é a reação de "capping", que serve para bloquear, por acetilação, os locais que não reagiram durante a etapa de acoplamento. A reação é obtida, utilizando uma solução que contém 6% de 2,6-lutidina e 5% de anidrido acético em DMF. Após a conclusão da síntese, as moléculas são removidas do suporte sólido.
[00130] Esta reação pode ser obtida com uma solução de TFA (ácido trifluoroacético) e meta-cresol, em proporções 4:1.
[00131] A molécula, assim obtida, é recolhida através de precipitação em éter dietílico.
[00132] Uma vez recuperada em água, é purificada em HPLC. A coluna utilizada para a purificação é uma C18 300A 5u Júpiter (© Phenomenex, Inc.). A purificação é realizada utilizando uma gradiente linear desde 100% de A (95% de água, 5% de acetonitrila, 0,1% de TFA) - 0% de B (60% de água; 40% de acetonitrila, 0,1% de TFA) até 60% de A-40% de B, em 30 minutos. A gradiente completa utilizada é de 0-5 minutos 0% de B; 5-35 minutos, 40% de B; 35-37 minutos 100% de B; 37-42 minutos 100% de B; 42-44 minutos 0% de B.
[00133] Finalmente, o produto purificado foi analisado por espectroscopia de massa ESI (© Waters).
Oligonucleotídeos antíoenos para bloquear a transcrição gênica.
[00134] Com o propósito de demostrar que os oligonucleotídeos, selecionados e concebidos de acordo com os parâmetros descritos na presente invenção, trabalham para seletivamente bloquear a transcrição de um gene, oligonucleotídeos baseados em PNA direcionados em relação ao gene MYCN foram concebidos e sintetizados, conforme mostrados na Tabela 1.
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[00135] Os oligonucleotídeos de PNA foram testados tanto individualmente como conjugados com um transportador na extremidade 3' e/ou 5', com o objetivo de favorecer a permeação da membrana celular. Em particular, os oligonucleotídeos foram conjugados, para o terminal carboxilo de 3', com a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 43, ou seja, prolina-lisina-lisina-lisina-arginina-lisina-valina.
[00136] O oligonucleotídeo que tem a SEQ ID NO: 1 é a sequência que foi objeto da patente EP 1.618.195, e representa a sequência de controle e a sequência utilizada para comparação.
[00137] Os oligonucleotídeos que têm as SEQ ID NO: 2-15 contêm um grupo de duas guaninas consecutivas (SEQ ID NO: 14, 15), ou um grupo de três guaninas consecutivas (SEQ ID NO: 13), ou dois grupos de duas guaninas consecutivas (SEQ ID NO: 12), ou um grupo de duas guaninas e um grupo de três guaninas consecutivas (SEQ ID NO: 11, 10, 9, 8 e 7), ou dois grupos de duas guaninas consecutivas e um grupo de três guaninas consecutivas (SEQ ID NO: 6 e 4), ou um grupo de duas guaninas consecutivas e dois grupos de três guaninas consecutivas (SEQ ID NO: 5), ou um grupo de seis guaninas consecutivas (SEQ ID NO: 3), ou um grupo de seis guaninas consecutivas, um grupo de três guaninas consecutivas e um grupo de duas guaninas consecutivas (SEQ ID NO: 2). Os grupos de guaninas consecutivas são mostrados sublinhados na Tabela 1.
[00138] Os oligonucleotídeos que têm as SEQ ID NO: 16-23 não têm grupos de guaninas consecutivas, sendo controles negativos.
[00139] Além disso, para o propósito de modular seletivamente a transcrição de um gene, os oligonucleotídeos que têm as SEQ ID NO: 24-25 foram também concebidos e sintetizados, os quais são mostrados na Tabela 2.
Figure img0003
[00140] Em particular, os oligonucleotídeos quiméricos de fita simples, compreendendo monômeros de DNA e monômeros de LNA (SEQ ID NO: 24 e 25), foram concebidos e sintetizados.
[00141] As bases de DNA na sequência de oligonucleotídeo são mostradas em negrito, enquanto que os monômeros de LNA estão sublinhados. Cada molécula de oligonucleotídeo quimérico foi concebida e sintetizada, através da inserção dos monômeros LNA espaçados por 1, 2 ou 3 bases de DNA, a fim de evitar a degradação rápida pelas nucleases endógenas, como foi relatado na literatura (Koch t, Biochem J2001, 354 (Pt3) :481-4; Koji Nagahama, Bioorg Med Chem Lett, 2009, 19 (10) :2707-9).
Oligonucleotídeos antisense para bloquear a tradução de genes,
[00142] Para o propósito de demonstrar que os oligonucleotídeos, selecionados e concebidos de acordo com os parâmetros descritos na presente invenção, trabalham para bloquear seletivamente a tradução do gene alvo, oligonucleotídeos antisense, que têm as SEQ ID NO: 26-36, direcionadas em relação ao gene MYCN, foram concebidos, sintetizados e experimentalmente analisados in vitro, os quais estão indicados na Tabela 3.
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[00143] Oligonucleotídeos complementares de fita dupla, com base em RNA (RNA interferente pequeno (siRNA) (SEQ ID NO: 26-30), foram produzidos para seletivamente modular a tradução do gene-alvo, o MYCN).
[00144] Além disso, foram produzidos oligonucleotídeos com base em DNA, SEQ ID NO: 31 e 32, em que a ligação fosfodiéster foi modificada para fosforotioato.
[00145] Também foram produzidos oligonucleotídeos quiméricos, de fita dupla, com base em monômeros de RNA e monômeros de 2'0-metil (SEQ ID NO: 33); em monômeros de RNA e monômeros 2' flúor (SEQ ID NO: 34); em monômeros de RNA e monômeros de LNA (SEQ ID NO: 35) e em monômeros de RNA e monômeros de RNA arabinósidos (SEQ ID NO: 36). Nas sequências de oligonucleotídeo, SEQ ID NO: 33-36, os monômeros 2' 0- metil, 2' flúor, LNA e arabinósido (ANA) são mostrados em negrito, enquanto que cada grupo de, pelo menos, duas guaninas consecutivas está sublinhado.
[00146] Como o siRNA dos oligonucleotídeos é de fita dupla, a quimera foi concebida e sintetizada, de tal modo a deixar dois monômeros de 2'0-Metil ou dois monômeros de 2' flúor, ou dois monômeros de LNA, ou dois monômeros de RNA arabinósido , ambos em 3' e em 5', não formando par com cadeia complementar e, assim, evitar a rápida degradação pelas enzimas celulares.
Tratamentos com oligonucleotídeos - QT-PCR.
[00147] Para a finalidade de avaliar a capacidade dos oligonucleotídeos, da presente invenção, de modular a expressão dos genes alvo e a sua capacidade de reduzir a quantidade do mensageiro de RNA, estes aspectos foram analisados usando a técnica do PCR, em tempo real.
[00148] Para esta finalidade, foi feito uso de placas de 24 poços, os quais foram semeados com células 5,0x104, com 0,3 ml de OPTI-MEM médio (GIBCO BRL}, 4% de FBS e 2 mm de L-glutamina (experiências em triplicado), por poço.
[00149] As células foram incubadas durante 24 horas a 37° C, em uma atmosfera contendo 5% de CO2, para permitir a aderência à base dos poços.
[00150] Cada oligonucleotídeo analisado, com exceção dos oligonucleotídeos de PNA, foi previamente incubado com 2 pl de Lipofectamine 2000 (Invitrogen), com 0,3 ml de OPTI- MEM médio, isento de soro, (JGIBCO BRB).
[00151] Para cada poço, os oligonucleotídeos foram analisados nas seguintes concentrações finais: • foram usados, em 200 Nm, oligonucleotídeos antisense e siRNA e 0 gapmer siRNA (isto é, os oligonucleotídeos que contêm um ou mais monômeros de ácidos nucleicos quimicamente modificados na extremidade 3' ou 5', enquanto que, na parte central, têm monômeros de ácidos nucleicos que não foram modificados ou que foram modificados no nível da ligação fosfodiéster como uma ligação de fosforotioato); • foram usados, em 10 pM, oligonucleotídeos antisense que têm monômeros de DNA fosforotioatos, oligonucleotídeos de RNA antígenos (agRNA) e oligonucleotídeos que têm monômeros de DNA e monômeros LNA; • os oligonucleotídeos morfolinos foram utilizados em uma concentração de 1 pM, e • os oligonucleotídeos de PNA foram administrados em uma concentração de 1 pM.
[00152] As células foram tratadas com os oligonucleotídeos, adicionando até 4% de FBS, 6 horas após a administração dos mesmos. Após 24 horas, o RNA total foi extraído de cada poço e purificado utilizando o mini kit RNeasy {QIAGEN).
[00153] Os ensaios foram realizados em oito linhagens de células, obtidas de 5 tumores humanos diferentes, que estão correlacionados com a expressão do MYCN, isto é: • como um modelo de neuroblastoma, foi feito uso das linhagens de células Kelly, IMR-32 (em que o gene MYCN é amplificado e superexpressado) e SKNBE2c e LAN1 (onde o gene MYCN é amplificado e superexpressado e o gene p53 é mutado); • como um modelo de rabdomiosarcoma, foi feito uso da linhagem de células RH30, onde o gene MYCN é amplificado e superexpressado; • como um modelo de tumor de Wilms, foi feito uso da linhagem de células WÍT49, onde o gene MYCN é amplificado e superexpressado; • como um modelo de retinoblastoma, foi feito uso da linhagem de células Y79, onde o gene MYCN é amplificado e superexpressado; e • como um modelo câncer de pulmão de pequenas células, foi feito uso da linhagem de células H69 onde o gene MYCN é amplificado e superexpressado.
[00154] Como controle, foi feito uso das mesmas linhagens de células, conforme acima mencionadas, tratadas com água estéril, em vez dos oligonucleotídeos. Cada amostra de RNA foi quantificada (em duplicado), utilizando um espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 {NanoDrop Technologies).
[00155] A primeira cadeia de cDNA foi produzida utilizando o kit de síntese de cDNA para RT-PCR (Roche). Para a reação de síntese de cDNA, foi utilizado um total de 1 pg de RNA. Para a PCR em tempo real foram utilizadas 10 ng de cDNA em um volume final de 20 pl, com SYBR Green Master Mix 2X (Applied Biosystems) (3 ensaios foram realizados em triplicado). As sequências e as concentrações do primer utilizado para realizar as PCRs em tempo real são mostradas na Tabela 4. Dois genes de manutenção foram utilizados como controles positivos: GAPDH e beta-actina (ACTB).
[00156] As condições da reação do QT-PCR foram as seguintes: 10 minutos a 95° C, 20 segundos a 95° C, e 30 segundos a 60° C, para 50 ciclos.
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Tratamentos com oligonucleotídeos - ensaio de proliferação celular.
[00157] Para a finalidade de avaliar a capacidade de modulação de gene dos oligonucleotídeos, da presente invenção, foi determinado o efeito da sua administração na viabilidade sobre as células.
[00158] Para este propósito, células de 5xl03 por poço, foram cultivadas em placas de cultura de células de 96 poços (experiências conduzidas em triplicado) com 100 pl de médio OPTI-MEM (GIBCO BRL), contendo 4% de FBS e 2 mm de L-glutamina.
[00159] Os oligonucleotídeos de PNA foram administrados em diferentes concentrações (lpM, 2, 5 pM, 5 pM, 10 pM), a fim de observar uma relação dose-efeito.
[00160] No que diz respeito a todos os outros oligonucleotídeos, as concentrações em que foram administradas estão listadas no item: Tratamentos com Oligonucleotídeos - QT- PCR.
[00161] A viabilidade das células tratadas foi determinada em 48, 72, 96 e 168 horas após o tratamento.
[00162] A viabilidade celular foi avaliada através de um ensaio de ATP-Lite {Luminescence ATP Detection Assay System, PerkinEime?) e é reportada como a taxa entre o sinal médio dos poços tratados em comparação com o valor médio dos poços das células de controle não tratadas. As células foram processadas seguindo as instruções fornecidas com o kit.
[00163] Os ensaios foram realizados nas mesmas linhagens de células utilizadas para determinar os níveis do mensageiro do gene MYCN e relacionados no item: Tratamentos com Oligonucleotídeos - QT-PCR.
RESULTADOS
[00164] No que se refere aos oligonucleotídeos de PNA, os resultados em relação à sua capacidade de inibir a transcrição do gene MYCN e proliferação das células Kelly estão apresentados na Tabela 1. A Tabela 6 mostra os valores (em termos percentuais) da proliferação das células Kelly, nas diferentes concentrações do PNA analisadas.
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[00165] Os resultados demonstram que o efeito de inibição destes PNAs na proteína traduzida dos genes alvo é altamente seletivo e específico. Além disso, observou-se que a detenção do crescimento das células tumorais utilizadas como modelo (caracterizado por amplificação do gene MYCN) foi imediatamente seguida pela apoptose após a administração do PNA antígeno.
[00166] Em geral, os oligonucleotídeos de PNA antígeno, que têm a SEQ ID: 2-SEQ ID NO: 13 (contendo um ou mais grupos de Gs) têm uma maior eficácia antígena (isto é, a inibição do MYCN RNAm e da proliferação de células tumorais com a expressão de MYCN), em comparação com oligonucleotídeos de PNA desprovidos de grupos de Gs (SEQ ID NO: 16-SEQ ID NO: 23).
[00167] Em particular, os resultados mostrados na Tabela 1 e na Tabela 5 demonstram que as sequências SEQ ID NO: 2-SEQ ID NO: 13, têm uma maior eficácia antígena do que a sequência SEQ ID NO: 1, objeto da patente EP 1618195.
[00168] As sequências SEQ ID NO: 7-SEQ ID NO: 12 (que contém dois grupos de dois ou três Gs consecutivos) mostram uma maior eficácia antígena do que as sequências SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 (contendo apenas um grupo de dois ou três Gs consecutivos).
[00169] As sequências SEQ ID NO: 4-SEQ ID NO: 6 (que contém três grupos de dois ou três Gs consecutivos) mostram uma maior eficácia antígena do que as sequências SEQ ID NO: 7-SEQ ID NO: 12 (que contém dois grupos de dois ou três Gs consecutivos).
[00170] A SEQ ID NO: 3, que contém um grupo de seis Gs consecutivos, mostra uma maior eficácia antígena do que a sequência SEQ ID NO: 1 e as sequências SEQ ID NO: 4- SEQ ID NO: 12, contendo um, dois ou três grupos de Gs (em que cada grupo é composto por, no máximo, dois ou três Gs consecutivos).
[00171] A sequência SEQ ID NO: 2, contendo três grupos de Gs consecutivos, a qual, adicional mente a dois grupos de dois e três Gs consecutivos, compreende também um grupo de seis Gs consecutivos, mostra uma maior eficácia antígena do que a SEQ ID NO: 3, que contém apenas um grupo de seis Gs, a sequências SEQ ID NO: 1 e as sequências SEQ ID NO: 4-SEQ ID NO: 12, que contém um, dois ou três grupos de Gs (em que cada grupo é constituído por, no máximo, dois ou três Gs consecutivos).
[00172] Além disso, os oligonucleotídeos que têm as SEQ ID NO: 1-23 foram administrados em linhagens de células do tipo fibroblastóide (NIH-3T3 e Phoenix) e os resultados são mostrados na Tabela 1 (últimas duas colunas).
[00173] Os resultados demonstram claramente que os oligonucleotídeos analisados não são especifica mente eficazes e não são tóxicos para as células (isto é, células que não expressam o gene alvo, que neste caso é o MYCN).
[00174] Na verdade, não foram observadas alterações na proliferação de células nestas duas linhagens de fibroblastos não-tumorais, e este resultado significa que os oligonucleotídeos de PNA agem com um efeito específico de inibir a expressão do MYCN, visto que os mesmos não têm um efeito tóxico não-específico em células que não expressam o MYCN.
[00175] Portanto, pode-se deduzir que os oligonucleotídeos de PNA, concebidos com base nos parâmetros descritos na presente invenção, atuam especifica mente e eficazmente no gene alvo e, por conseguinte, nas células que expressam/superexpressam este gene.
[00176] Os PNAs que têm as sequências SEQ ID NO: 1-12 também foram testados em diferentes linhagens de células que sobre expressam o MYCN (Kelly, SKNBE2c, RH30, WiT49, Weri-Rbl 1 e H69). Os resultados são apresentados na Tabela 6 e confirmam a seletividade e especificidade do efeito de inibição dos PNAs no produto da tradução da proteína do gene MYCN.
Figure img0008
Figure img0009
[00177] O oligonucleotídeo de PNA antígeno, que tem a SEQ ID NO: 5 foi analisado de uma maneira mais pormenorizada.
[00178] Em particular, os oligonucleotídeos modificados, em que foram modificados os grupos de guaninas consecutivas presentes na sequência (os grupos de guaninas consecutivas estão sublinhadas, enquanto que os nucleotídeos modificados estão em negrito), de modo a interromper o consecutividade das guaninas, foram sintetizados e analisados in vitro, em células Kelly (as quais sobre expressam o MYCN).
[00179] Os resultados (sumarizados na Tabela 7) demonstram claramente que o fato de as guaninas serem consecutivas é de importância fundamental para os propósitos da atividade de modulação da expressão de gene. De fato, os PNAs que têm a SEQ ID NO: 43, em que todos os grupos de guaninas consecutivas dos PNAs que têm a SEQ ID NO: 5 foram mutados, faz com que a atividade inibidora do PNA seja perdida, enquanto que a mutação de um ou dois dos três grupos de guaninas consecutivas compromete consideravelmente, mas não suprime completamente a atividade inibidora da molécula.
Figure img0010
[00180] Os oligonucleotídeos quiméricos que compreendem monômeros de DNA e monômeros de LNA e que têm o gene MYCN como alvo, foram testados in vitro em células de rabdomiossarcoma alveolar (RH30). Os resultados estão resumidos na Tabela 8 e demonstram que estes oligonucleotídeos têm uma atividade antígena específica e intensa.
Figure img0011
[00181] Os oligonucleotídeos antisense concebidos e sintetizados pela requerente, de acordo com os parâmetros descritos no presente invenção, foram analisados in vitro em células de rabdomiossarcoma (RH30). Os resultados estão resumidos na Tabela 9 e mostram que os oligonucleotídeos são capazes de inibir a transcrição de MYCN de uma forma específica e eficaz. Além disso, os oligonucleotídeos também são capazes de inibir seletivamente a proliferação de células tumorais de uma forma mais eficaz do que os oligonucleotídeos antisense padrões, presentemente disponíveis para o gene MYCN {Chung DH, Bioch Bioph Res Common, 2006, 351 (1) :192-7).
[00182] Em particular, o siRNA identificado pela Requerente e direcionado em relação ao MYCN RNAm, mencionado na Tabela 11, exercer uma atividade antisense, com uma inibição do MYCN RNAm que varia de um mínimo de 70% e um máximo de 85%.
Figure img0012
Figure img0013
[00183] Com o propósito de verificar se os oligonucleotídeos da presente invenção são capazes de reduzir as concentrações de agentes quimioterápicos utilizados atualmente nos protocolos terapêuticos contra o câncer, os mesmos foram administrados em concomitância com medicamentos de quimioterapia.
[00184] Estudos foram realizados sobre o efeito da associação entre PNA e os medicamentos quimioterápicos (carboplatina, etoposida (VP16), cisplatina e vincristina), em diferentes linhagens de células tumorais de neuroblastoma humano e no rato (SMS-KAN, LAN 1, IMR-32, SMS-KCN, Kelly, NH02A, SKNBE2c).
[00185] O esquema terapêutico utilizado nos tratamentos realizados envolveu células a serem tratadas com PNA e, depois de um tempo pré-estabelecido (que poderia ser de 6 ou 12 horas), foi administrado o agente quimioterápico.
[00186] Os resultados demonstraram que a associação destes compostos com os oligonucleotídeos da presente invenção determina, em variações de concentração específicas, um maior efeito terapêutico do que os tratamentos individuais, com os mesmos compostos.
[00187] Em particular, pode ser observado que o tratamento - feito concomitante e simultaneamente ou em diferentes intervalos de tempo (3 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 4 8 horas, 7 2 horas, etc.) - com uma combinação que consiste em os oligonucleotídeos da invenção e outros compostos com um efeito farmacológico, serve para melhorar o efeito terapêutico desejado.
[00188] Por conseguinte, combinando um ou mais dos oligonucleotídeos identificados pela Requerente com medicamentos quimioterápicos, permite reduzir a concentração do medicamento quimioterápico como umas 10 vezes, em comparação com o presente padrão de concentração terapêutica e ainda obter o mesmo efeito.
[00189] Em particular, os resultados deste estudo demonstram que a SEQ ID NO: 1 tem um efeito sinérgico, em termos de inibição de proliferação de células, quando é administrada em combinação com vincristina ou etopósida, ou carboplatina ou cisplatina, comparado aos efeitos obtidos em tratamentos com o oligonucleotídeo ou com os acima mencionados agentes quimioterápicos.
Exemplo 2
[00190] Com o propósito de dar suporte à presente invenção, os oligonucleotídeos sumarizados na Tabela 10 foram também sintetizados. Em particular, a Tabela 10 mostra as sequências de oligonucleotídeos, SEQ ID NO, a percentagem do conteúdo (G+C) e o gene ao qual os oligonucleotídeos sintetizados estão direcionados. A síntese de oligonucleotídeos foi realizada como no exemplo 1.
Figure img0014
Figure img0015
[00191] A seguir, em particular, foram sintetizadas: as SEQ ID NO: 66-69 direcionadas em relação ao MYCN, as SEQ ID NO: 70-74 direcionadas em relação ao MYC, as SEQ ID NO: 75, 76 direcionadas em relação ao BIRC5, as SEQ ID NO: 77-79 direcionadas em relação ao ALK, as SEQ ID NO: 80-82 direcionadas em relação ao BCL2 e as SEQ ID NO: 83, 84 direcionadas em relação ao PLK4.
[00192] Os oligonucleotídeos foram testados in vitro (a uma concentração de 2,5 pM), para determinar a sua capacidade para inibir a transcrição do gene, ao qual estão direcionados, medindo os níveis do mensageiro do gene em modelos de células, nos quais o gene de interesse é sobre expressado. Os métodos utilizados são os descritos no exemplo 1.
[00193] Em particular, as SEQ ID NO: 66-69 (direcionadas em relação ao MYCN) foram testadas in vitro nas linhagens das células Kelly e H69; as SEQ ID NO: 70-74 (direcionadas em relação ao MYC) foram testadas in vitro nas linhagens de células H82 e RD; as SEQ ID NO: 75 e 76 (direcionadas em relação ao BIRC5) foram testadas in vitro na linhagem de células Kelly; as SEQ ID NO: 77-79 (direcionadas em relação ao ALK) foram testadas in vitro na linhagem de células Kelly; as SEQ ID NO: 80-82 (direcionadas em relação ao BCL2) foram testadas in vitro na linhagem de células Kelly e as SEQ ID NO: 83 e 84 (direcionadas em relação ao PLK4) foram testadas in vitro na linhagem de células Kelly.
[00194] A capacidade dos oligonucleotídeos testados em inibir o mensageiro do gene de interesse foi medida e a capacidade proliferativa das células, após a administração dos oligonucleotídeos, foi também avaliada. Os resultados estão sumarizados na Tabela 11.
[00195] Os dados mostram uma potente atividade inibidora em relação ao mRNA do gene alvo e uma inibição da proliferação de células, que cresce com o aumento do número de grupos de Gs presentes na sequência do oligonucleotídeo.
Figure img0016
Figure img0017
[00196] Finalmente, os oligonucleotídeos que têm as SEQ ID NO: 66-84 foram administrados em linhagens de células de um tipo fibroblastóide (Phoenix e NIH-3T3). Em estas células, os oligonucleotídeos testados não se mostraram serem tóxicos.
[00197] Estes resultados indicam que os oligonucleotídeos de PNA atuam, através de um efeito de inibição específico, sobre a expressão do gene de interesse, uma vez que os mesmos não têm qualquer efeito tóxico não específico em células que não expressam o gene.
[00198] Assim, pode-se deduzir que os oligonucleotídeos de PNA, concebidos com base nos parâmetros descritos na presente invenção, atuam especifica mente e eficazmente no gene alvo e, por conseguinte, nas células que expressam/superexpressam este gene.

Claims (16)

1. Oligonucleotídeo anti-gene de cadeia única, complementar a uma cadeia de DNA anti-senso de um gene alvo, que compreende de 6-30 nucleotídeos, de preferência de 12- 24 nucleotídeos, sendo o referido oligonucleotídeo caracterizado por uma sequência que compreende, pelo menos, três grupos de, pelo menos, duas guaninas consecutivas.
2. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os grupos de, pelo menos, duas guaninas consecutivas serem contínuas uma a outra, ou estarem espaçados por, pelo menos, um nucleotídeo, não sendo o referido nucleotídeo uma guanina.
3. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por os grupos de, pelo menos, duas guaninas consecutivas, serem, pelo menos, em número de quatro, cinco ou seis.
4. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por o referido oligonucleotídeo ser conjugado com uma sequência de transportador na extremidade 3' e/ou 5' do referido oligonucleotídeo, de preferência, um transportador selecionado do grupo que consiste das sequências: SEQ ID NO: 47-56.
5. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por o referido oligonucleotídeo ser, pelo menos, uma molécula de ácido nucleico natural, de preferência, de DNA ou RNA, possivelmente quimicamente modificado ou ácido nucleico sintético, de preferência, PNA, LNA ou morfolino, possivelmente quimicamente modificado, ou uma combinação do referido ácido nucleico natural e o referido ácido nucleico sintético.
6. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a referida, pelo menos, uma molécula de DNA compreende, pelo menos, LNA, LNA metilfosfonato, BNA, RNG, DNG, GNA, UNA, ENA, ANA, F-ANA, PNA, G-PNA ou nucleotídeo morfolino; ou compreende nucleotídeos de RNA de 2' 0-metil, 2' 0-metoxietil ou 2'-flúor ou a referida, pelo menos, uma molécula de RNA compreende, pelo menos, um nucleotídeo de RNA selecionado dentre: um nucleotídeo 2' 0-metil, um nucleotídeo 2' 0-metoxietil, um nucleotídeo 2'-flúor ou, pelo menos, um nucleotídeo de um ácido nucleico selecionado dentre: LNA, LNA metilfosfonato, BNA, RNG, DNG, GNA, UNA, ENA, ANA, F-ANA, PNA, G- PNA ou morfolino.
7. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a referida, pelo menos, uma molécula de DNA ou a referida, pelo menos, uma molécula de RNA compreende, pelo menos, um nucleotídeo modificado, no nível da ligação fosfodiéster, como uma ligação de fosforotioato.
8. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o referido PNA ter uma estrutura modificada em que o carbono alfa tem a cadeia lateral da arginina ou lisina como um substituinte.
9. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por o referido oligonucleotídeo ser direcionado contra, pelo menos, um gene responsável por uma doença de origem genética ou virai ou contra, pelo menos, um gene tumoral em que o referido gene é selecionado dentre o grupo que consiste em, pelo menos, um gene que pertence à família MYC, de preferência, MYC, MYCN ou MYCL1, BIRC5, BCL2, PLK4, ALK, PKM2, CASP8 e RASSF1.
10. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por o referido oligonucleotídeo ser selecionado dentre: SEQ ID: 2, 4, 5, 6, 46 e SEQ ID NO: 68-84.
11. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por as SEQ ID NO: 2, 4, 5, 6, 68 e 69 serem direcionadas em relação ao gene MYCN.
12. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por as SEQ ID NO: 70-74 serem direcionadas em relação ao gene MYC; as SEQ ID NO: 75, 76 são direcionadas em relação ao gene BIRC5; as SEQ ID NO: 77-79 são direcionadas em relação ao gene ALK; as SEQ ID NO: 80-82 são direcionadas em relação ao gene BCL2; as SEQ ID NO: 83, 84 são direcionadas em relação ao gene PLK4.
13. Composição caracterizada por compreender, pelo menos, um oligonucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 e, pelo menos, um excipiente farmacologicamente aceitável.
14. Composição caracterizada por compreender pelo menos um oligonucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, em combinação com um composto selecionado com ação farmacológica, de preferência, do grupo que consiste em: NGF, somatostatina, o ácido retinóico, actinomicina D, asparaginase, bleomicina, bussulfano capecitabina, carboplatina, ciclofosfamida, ciclosporina, cisplatina, citarabina, clorambucil, dacarbazina, daunorubicina, docetaxel, cloridrato de doxorrubicina, cloridrato de epirubicina, etopósido, fosfato de fludarabina, fluorouracil, gemcitabina, cloridrato de idarrubicina, hidroxiureia, ifosfamida, cloridrato de irinotecano, melfalano, mercaptopurina, metotrexato, mitomicina, mitoxantrona, oxaliplatina, paclitaxel, procarbazina, raltitrexato, estreptozocina, tegafur-uracilo, a temozolomida, tioguanina, tiotepa, topotecano, vinblastina, sulfato de vincristina, vindesina e vinorelbina em que a referida combinação é preferencialmente: SEQ ID NO: 5 e carboplatina, ou etoposida ou cisplatina ou vincristina.
15. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12 ou a composição, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado por serem para uso como medicamento.
16. Oligonucleotídeo ou composição, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por ser para uso no tratamento de um tumor, sendo o referido tumor ser um tumor pediátrico ou de adulto, de preferência, selecionado do grupo que consiste em: neuroblastoma, retinoblastoma, meduloblastoma, ependimoma, feocromocitoma, carcinoma embrionário, tumor de células germinativas, rabdomiossarcoma alveolar, rabdomiossarcoma embrionário, tumor de Wilms, sarcoma de células claras de rim, sarcoma sinovial, hepatoblastoma, leucemia linfóide aguda, leucemia linfóide crônica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfoblástica crônica, linfoma de Burkitt, leucemia mielóide aguda, leucemia mielóide crônica, leucemia megacirioblástica aguda, leucemia linfóide crônica B, leucemia de células T, linfomas, câncer de pulmão de pequenas células (microcitoma), adenocarcinoma de pulmão, carcinoma pulmonar de células escamosas, câncer de pulmão primário típico e atípico, carcinoma de pulmão de células grandes, carcinoma neuroendócrino de pulmão de grandes células, glioblastoma, hepatocarcinoma, carcinoma basocelular, tumor de ovário, tumor de mama e câncer de cólon.
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Free format text: DE ACORDO COM O ARTIGO 229-C DA LEI NO 10196/2001, QUE MODIFICOU A LEI NO 9279/96, A CONCESSAO DA PATENTE ESTA CONDICIONADA A ANUENCIA PREVIA DA ANVISA. CONSIDERANDO A APROVACAO DOS TERMOS DO PARECER NO 337/PGF/EA/2010, BEM COMO A PORTARIA INTERMINISTERIAL NO 1065 DE 24/05/2012, ENCAMINHA-SE O PRESENTE PEDIDO PARA AS PROVIDENCIAS CABIVEIS.

B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]
B06U Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 21/02/2013, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS.