CN102058535B - 叶酸受体靶向的新型脂质体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种叶酸受体靶向的新型脂质体,是可以专一抑制神经母细胞瘤细胞生长的脂质体,由二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、1,2-二油酸-3-二甲基酰胺丙烷、聚乙二醇-CerC16、叶酸以及MYCN基因的siRNA组成。所述的脂质体在叶酸受体高表达的神经母细胞瘤细胞内有高投递效率,液体/寡核苷酸最后比例达到0.15-0.25(w/w)。并且这一新型脂质体将目的siRNA在全身给药后在血液循环保持相当长一段时间。本发明研究显示,通过叶酸受体将本发明产品载有siRNA基因的靶向脂质囊泡投递到LA-N-5细胞,明显抑制了MYCN基因表达和细胞生长。本发明所述脂质体对叶酸受体过表达的神经母细胞瘤细胞有很强的抑制能力,所述脂质体可以作为潜在靶向治疗神经母细胞瘤的药物。
Description
技术领域
本发明涉及新型脂质体及其用途。基于神经母细胞瘤中叶酸受体的高表达性与RNA干扰的用途,本发明公开了一种叶酸受体靶向的新型脂质体。并利用细胞生物学技术与免疫学实验对所述脂质体进行了功能验证。
背景技术
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。其机制是双链RNA被特异的核酸酶降解,产生干扰小RNA(siRNA),这些siRNA与同源的靶RNA互补结合,特异性酶降解靶RNA,从而抑制、下调基因表达。在此基础上发展的RNA干扰技术,是指体外人工合成的或体内的双链RNA(dsRNA)在细胞内特异性的将与之同源的mRNA降解成小片段,使相应的基因沉默的技术[Fire A,Xu S,Montgomery MK,et al.Potent and specific genetic interference bydouble-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.Nature.1998;391:806-811]。首次发现dsRNA能够导致基因沉默的线索来源于线虫Caenorhabditiselegans的研究。现已初步阐明RNAi的作用机制。RNAi的第一步是,dsRNA在内切核酸酶作用下加工裂解形成21~25nt的由正义和反义序列组成的干扰性小dsRNA。即siRNA果蝇中RNase III样核酸酶称为Dicer。Dicer含有解旋酶(helicase)活性以及dsRNA结合域和PAZ结构域。已发现在Arabidopsis,C.elegans,Schizosaccharomyces pombe以及哺乳动物中也存在Dicer同类物。RNAi的第二步是,由siRNA中的反义链指导形成一种核蛋白体,该核蛋白体称为RNA诱导的沉默复合体(RNA inducedsilencing complex,RISC),由RISC介导切割靶mRNA分子中与siRNA反义链互补的区域,从而达到干扰基因表达作用。RISC由多种蛋白成分组成,包括内切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源RNA链搜索活性等。
叶酸是维生素B复合体之一,相当于蝶酰谷氨酸(pteroylglutamic acid,PGA),是米切尔从菠菜叶中提取纯化的,故而命名为叶酸。有促进骨髓中幼细胞成熟的作用,人类如缺乏叶酸可引起巨红细胞性贫血以及白细胞减少症,对孕妇尤其重要。叶酸与神经系统疾病紧密相关,叶酸对婴幼儿的神经细胞和脑细胞发育有促进作用;叶酸可作为精神分裂症病人的辅助治疗剂,它对此病有显著的缓解作用。众多的流行病学资料表明,叶酸缺乏与肿瘤发病风险增高相关。叶酸对肿瘤发生有双重调节作用,对已经发生的肿瘤叶酸缺乏可抑制其生长,补充叶酸则促进其发展。叶酸受体(folatereceptor,FR)是一种在肿瘤细胞膜表面高表达的细胞因子,在包括胶质瘤在内的恶性肿瘤细胞膜表面其活性和数量显著高于正常细胞。
神经母细胞瘤(Neuroblastoma,NB)是一种来源于神经嵴细胞高度恶性的肿瘤细胞,占儿童肿瘤病例的10%,成人患有神经母细胞瘤的癌症死亡比例为50%[Schor NF.Neuroblastoma as a neurobiological disease.JNeurooncol.1999;41:159-166.]。某些遗传变化被确定为这些肿瘤的特点并作为预后的指标。其中包括MYCN原癌基因的扩增,该基因通常定位于染色体2p24[Westermann F,Schwab M.Genetic parameters of neuroblastomas.Cancer Lett.2002;184:127-147.]。MYCN基因是原癌基因MYC基因家族的一员,该家族包括强致癌基因MYC,MYCN和MYCL[Mukherjee B,Morgenbesser SD,DePinho RA.Myc family oncoproteins function through acommon pathway to transform normal cells in culture:cross-interference byMax and trans-acting dominant mutants.Genes Dev.1992;6:1480-1492.]。MYCN基因在神经母细胞瘤的扩增导致的疾病特点类似于其他原癌基因,有MYCN基因扩增的神经母细胞瘤等的患者预后较差,往往对常规治疗产生抗药性[Brodeur GM.Neuroblastoma:biol ogical insights into a clinicalenigma.Nat Rev Cancer.2003;3:203-216.]。尽管有典型IV期疾病的儿童(年龄小于1岁)有很好是预后,但是如果伴有MYCN基因的扩增,则预后效果就会很差。根据上述研究,MYCN基因mRNA的表达下调将是神经母细胞瘤治疗的新策略。
MYCN基因表达下调是非常重要的。siRNA被认为是抑制靶蛋白的有效工具,通过专门消化其靶mRNAs。RNAi技术已被广泛用于诱导序列特异的靶mRNA(10)的降解,作为一种阻止疾病相关基因表达的方法。因此,siRNA作为治疗药物有巨大的潜力。此外,高效的投递寡核苷酸(efficientdelivery of oligonucleotides,ODN)是至关重要的。为此,结合RNAi技术开发出一种高效的投递寡核苷酸系统具有重要的现实意义。
在体内靶向投递siRNA拥有重要的临床应用前景,但目前可用的方法缺乏靶向性,并且存在毒性问题。长期循环的叶酸受体靶向的脂质体可能是一个传递寡核苷酸的新载体。本发明目的旨在探讨叶酸受体靶向的脂质体在LA-N-5细胞中传递包被siRNA的效率,在LA-N-5细胞中MYCN基因被扩增和过表达。因此,我们研究叶酸受体靶向的脂质体包被的siRNA能否在体内外下调MYCN基因的表达。
发明内容
本发明公开了一种新型的脂质体,具有抑制神经母细胞瘤细胞生长的作用。
本发明所述的脂质体为叶酸受体靶向的脂质体,由二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、1,2-二油酸-3-二甲基酰胺丙烷、聚乙二醇-CerC16(N-棕榈酰鞘氨醇-1-琥珀酰聚乙二醇)、叶酸以及MYCN基因的siRNA组成。
所述siRNA的正义链选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:5之一,反义链选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:6之一。
本发明公开了所述的脂质体在制备治疗神经母细胞瘤药物的用途。
本发明还公开了所述脂质体的制备方法,包括以下步骤:
1)脂溶液的制备
将二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、1,2-二油酸-3-二甲基酰胺丙烷、聚乙二醇溶于无水乙醇中,再加入不同剂量的叶酸-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(通过聚乙二醇将二硬脂酰磷脂酰乙醇胺与叶酸连接),调溶液的pH到4.0,然后,将300mM的柠檬酸溶液和40%(v/v)乙醇加入到该溶液中,形成脂溶液。
2)siRNA的制备
在另一个管中在pH4.0的300mM的柠檬酸溶液和40%(v/v)乙醇溶液中制备siRNA。
3)溶液混合
65℃加热上述两种溶液,然后边轻轻涡旋边将脂溶液加入到siRNA溶液中,加入的比例为150微克的siRNA/umol液体。
4)脂质体的纯化
该混合物通过三层100nm聚碳酸酯过滤器过滤10次。该混合物在300mM pH 4.0的柠檬酸溶液中透析,除去多余的乙醇,并进一步在HBS(20mMHEPES,145mM NaCl,pH 7.6)中透析12h-18h,除去柠檬酸缓冲液,中和DODAP,并释放任何与小泡膜表面相关的siRNA。最后,包含siRNA的叶酸受体靶向脂质体通过琼脂糖凝胶柱CL-4B从自由siRNA中被分离出来。
附图说明
图1叶酸受体靶向脂质体包被的MYCN siRNA的转染效率。平均每pg与MYCN siRNA浓度相关的蛋白MYCN siRNA的量范围为16.7到100nmol/L(*p=0.00012,p=0.00006单独的,F=365.462),但是MYCN siRNA的量并没有增加当MYCN siRNA的浓度升到150nmol/L(P=0.194,F=365.462)。
图2MYCN蛋白表达水平的鉴定。LA-N-5细胞被MYCN siRNA和脂质体转染后72h,MYCN siRNA转染组MYCN基因蛋白表达水平明显低于其他组。*p<0.001.
图3MTT法检测细胞增殖。LA-N-5细胞被MYCN siRNA和脂质体转染后36h、48h、60h、and 72h分析细胞增殖活性。MYCN siRNA转染组细胞活性明显低于脂质体组和对照组。(*p<0.001)。只转染脂质体组和对照组无明显差异。F值是3.802,95.065,232.423,453.009,1039.090,和1472.898。
图4荧光定量RT PCR检测MYCN mRNA在肿瘤组织中的表达。转染了脂质体包被的MYCN siRNA和转染脂质体包被的对照siRNA两组之间MYCNmRNA的表达有明显的差异。(F=42.714,p=0.00038)。其他组之间无明显差异。(F值分别为1.089,13.426,47.072,p>0.05)。
具体实施方式
1.材料和方法
1)细胞系
LA-N-5细胞瘤用含10%胎牛血清的1640培养基培养;2mmol/L的L-谷氨酸;100IU/ml青霉素G;100mg/mL链霉素;37℃,5%CO2孵箱孵育。培养基每3天更换一次。
2)siRNA的构建
siRNA的寡核苷酸针对人MYCN基因,3′端有两个胸苷(DTD)残基,MYCN-siRNA有氰-3荧光标记。序列如下:
MYCN-1-sense:5′-CGG AGA UGC UGC UUG AGA Adtdt-3′(SEQ ID NO:1),
MYCN-1-antisense:5′-UUC UCA AGC AGC AUC UCC Gdtdt-3′(SEQ IDNO:2);(作用起始靶点GI 189234第26碱基)
MYCN-2-sense:5′-GCA GCA GUU GCU AAA GAA Adtdt-3′(SEQ ID NO:3),
MYCN-2-antisense:5′-UUU CUU UAG CAA CUG CUG Cdtdt-3′(SEQ IDNO:4);(作用起始靶点GI 189234第1143碱基)
MYCN-3-sense:5′-CAG CAG UUG CUA AAG AAA Adtdt-3′(SEQ ID NO:5),
MYCN-3-antisense:5′-UUU UCU UUA GCA ACU GCU Gdtdt-3′(SEQ IDNO:6);(作用起始靶点GI 189234第1146碱基)
3)含叶酸受体靶向的脂质体的siRNA的制备
将二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、1,2-二油酸-3-二甲基酰胺丙烷、聚乙二醇溶于无水乙醇中,再加入不同剂量的叶酸-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(通过聚乙二醇将二硬脂酰磷脂酰乙醇胺与叶酸连接)。调溶液的pH到4.0,然后,将300mM的柠檬酸溶液和40%(v/v)乙醇加入到该溶液中。同样,在另一个管中在pH4.0的300mM的柠檬酸溶液和40%(v/v)乙醇溶液中制备siRNA。65℃加热该溶液,然后边轻轻涡旋边讲该液体加入到siRNA,加入的比例为150微克的siRNA/umol液体。该混合物通过三层100纳米聚碳酸酯过滤器过滤10次。该混合物在300mM pH 4.0的柠檬酸溶液中透析(12-14kDa的切断)约1h,除去多余的乙醇,并进一步在HBS(20mMHEPES,145mM NaCl,pH 7.6)中透析12-18h,除去柠檬酸缓冲液,中和DODAP,并释放任何与小泡膜表面相关的siRNA。最后,包含FR-靶向的脂质体的siRNA通过琼脂糖凝胶柱CL-4B(1cm×25cm)从自由siRNA中被分离出来。
4)LA-N-5细胞对siRNA的吸收实验
LA-N-5细胞被接种到到24孔板,每孔5×104个细胞,培养过夜。向细胞中加入以下浓度的包含有FR-靶向脂质体的siRNA:16.7、50、100和150nmol/L。37℃下孵育1小时,然后用磷酸盐缓冲液(PBS)(3×3分钟)洗涤细胞。用细胞裂解液裂解缓冲液(0.1%的Triton 100的Tris,乙二胺四乙酸,pH值7.6的X-100)裂解细胞,细胞裂解液14000rpm离心10min。荧光显微镜下检测上清中Cy3标记寡核苷酸。上清中蛋白的含量通过考马斯亮蓝G-250染色法检测。siRNA的吸收的结果表示为pg Cy3标记的siRNA/ug蛋白。LA-N-5对照组FR-靶向的脂质体siRNA的吸收的鉴定方法相同。
5)LA-N-5细胞的转染实验
LA-N-5细胞被接种到到24孔板,每孔5×104个细胞,培养过夜。为四组,分别如下:FR靶向的MYCN siRNA脂质体(siRNA浓度100nmol/L),FR靶向的对照siRNA脂质体(对照siRNA浓度为100nmol/L),MYCNsiRNA无脂质体(MYCN基因siRNA浓度为100nmol/L)和空白对照组(同体积的脂质体)。在24h、48h和72h后,MYCN mRNA基因的表达及LA-N-5细胞的增值根据下面方法进行检测。
6)实时定量RT-PCR检测
定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术SYBR Green I被用于MYCN基因mRNA表达的检测。总RNA在25ul的反应体系中用第一链cDNA合成试剂盒合成。用Oligo-dT进行反转录。该混合物在30℃孵育60分钟,95℃,5min退火,然后储存在-20℃。我们用人类甘油三磷酸脱氢酶(hGAPDH)作为内参。
1μL(20μL)合成的cDNA在25μL的体系中扩增,包括2.5μm dNTPs,10μm的MYCN基因(或hGAPDH)引物,1.25U的Taq DNA聚合酶。MYCN基因PCR扩增条件为95℃,45s;64℃,45s;72℃,45s;40个循环,然后72℃延伸10min。hGAPDH PCR条件为:95℃,25s;58.5℃,25s;72℃,25s;40个循环,然后72℃延伸10min。MYCN基因mRNA的表达的计算MYCN基因拷贝数/GAPDH的拷贝。
7)体外LA-N-5细胞MYCN基因mRNA定量检测
接下来,37℃孵育1h,每组用PBS洗两次(每次2min)。经过24h,48h和72h培养后,收获的细胞进行总RNA提取。MYCN基因mRNA的表达水平用荧光定量RT-PCR使用荧光染料SYBR GREEN I。
8)免疫印迹
细胞用RIPA溶液(含为50mmol/L的pH值7.5的Tris-HCl,150mmol/L的氯化钠,0.5%脱氧胆酸,1%Nonidet的P-40,0.1%的SDS,1mm PMSF,有多种蛋白酶抑制剂:1μg/ml)进行裂解;室温静置15min后,12000rpm,4℃离心20min,BCA法检测上清中蛋白的含量。经SDS变性,80μg蛋白质上清样品进行了SDS-PAGE电泳,转移到聚偏氟乙烯膜上。丽春红S染色后,5%脱脂奶粉封闭,过夜。加1∶100稀释的Myc-N单克隆抗体孵育4h,TBST溶液洗膜3次;加辣根过氧化物酶标记抗羊二抗孵育1h,ECL显色系统显色,然后Alpharmimage 2002系统用于扫描和灰度分析。
9)MTT法分析LA-N-5细胞的增殖
LA-N-5细胞的生长情况通过MTT法进行检测。简单地说,5×103个细胞每孔接种于96孔板和培养过夜。然后于不同孔中分别加入以下试剂:100nmol/L的包含FR靶向脂质体的MYCN siRNA,或相同体积包埋脂质体的对照siRNA。接着3℃下孵育1h后,用PBS洗(2×2分钟)。经过12h、24h、36h、48h、60h、72h孵育后,每孔加20μL MTT(5g/L),培养。吸取含有MTT的培养基,甲臜晶体溶解在200μL二甲基亚砜(DMSO)中。490nm处测定其吸光度值。
10)皮下移植瘤模型和基因治疗
六周龄雌性重症联合免疫缺陷病(SCID)小鼠均购自解放军总医院动物中心,分别放在独立的微隔离器通气的笼子里,有水和鼠粮。所有的实验过程都是按照规定和解放军总医院和北京市科学技术委员会内部生物安全生物伦理准则进行的。四组,每组有五个动物,每个小鼠右前肢皮下注射5×106LA-N-5细胞。两个星期后,在每个鼠标右前肢,可见一移植后的肿瘤。治疗组每日腹腔注射如下:脂质体包裹MYCN基因的siRNA(MYCN基因的siRNA125μg/kg/d),脂质体包裹对照siRNA(125μg/kg/d),相同质量的MYCN siRNA无脂质体包裹(在相同的体积1640中)和同体积的脂质体。打针历时5天。最后一次注射后24h将动物处死,收集每组的肿瘤组织,用以SYBR GREEN I为荧光染料的定量RT-PCR检测各组MYCN基因mRNA的水平。
11)统计分析
所有的实验进行了至少一式三份并记录了结果。SPSS10.0统计软件包被用来进行统计分析。数据的显示是平均值加上标准差(SD)。单向方差分析(ANOVA)及χ2检验分析来分析各组之间的意义。统计学意义,确定在P<0.05水平。
2.实验结果
1)MYCN siRNA的定量
LA-N-5细胞经不同浓度的Cy3标记的包装入叶酸受体靶向脂质体的MYCN siRNA(16.7、50、100和150nmol/L)转染。在100nmol/L的那组,每毫克蛋白有1808.5±140.2皮克的MYCN siRNA,这个值与150nmol/L组相似(P>0.05时,f=89.930)。但是,此值明显高在低浓度组(p<0.05,F=916.527),这表明转染的较佳浓度为100nmol/L(图1)。
2)MYCN siRNA敲除的定量
叶酸受体靶向脂质体导致的MYCN基因沉默结果如图2。结果表明,第一组中LA-N-5细胞被转染72h后,MYCN mRNA表达水平明显降低,79.2%的抑制率(p<0.001)。但是,在其他组(F=1155.456,1136.317,1545.815,892.008)MYCN mRNA表达水平没有受到抑制。第二组中LA-N-5细胞被转染72h后,MYCN mRNA表达水平无明显变化,表明了MYCN敲除的特异性。
3)MYCN基因蛋白表达的检测
结果表明,第一组中LA-N-5细胞被转染72h后,MYCN蛋白表达水平明显降低,71.3%的抑制率(p<0.001)。但是,在其他组(F=1155.456,1136.317,1545.815,892.008)MYCN蛋白表达水平没有受到抑制。第二组中LA-N-5细胞被转染72h后,MYCN蛋白表达水平无明显变化,表明了MYCN敲除的特异性(表1)。
表1不同脂质体转染后MYCN基因蛋白表达的变化
4)MTT法分析LA-N-5细胞增殖
在LA-N-5细胞中MYCN基因沉默的相应的生物效应见图3。结果表明,在培养72h后,LA-N-5细胞的增值降低66.2%(p<0.001),而任一个对照组均没有明显变化(P=0.073)。
5)注射siRNA的SCID小鼠肿瘤组织中的基因表达
包装到叶酸受体靶向脂质体的MYCN siRNA的功效在SCID小鼠肿瘤模型上进行了研究。最后一次注射24小时后,所有动物被处死。正如定量RT-PCR技术检测的结果,与对照组siRNA脂质体相比,MYCN mRNA在皮下神经母细胞瘤组织的表达明显下降,53.1%的抑制,(F=42.714,p=0.00038)(图4)。其他组的肿瘤组织MYCN mRNA表达没有被下调。(F值1.089,13.426,47.072,p>0.05).
3.讨论
实施例证明了传递的效率通过检测每微克LA-N-5细胞裂解液的荧光强度,它反映了siRNA浓度。我们得到每毫克蛋白有1808.5±140.2pg的MYCNsiRNA,证明了MYCN基因的siRNA被LA-N-5吸收。在150nmol/L MYCNsiRNA组荧光强度并没有增强,表明MYCN siRNA转染的最佳浓度为100nmol/L左右。基因转染的神经细胞,尤其是用传统的方法如钙,磷或脂质体转染,转染效率往往表现不佳。我们的数据表明,我们建立的这种新型脂质体剂型,是在LA-N-5细胞中投递siRNA的良好载体,我们达到了79.2%的敲除。
叶酸受体是有前景的靶点,是由于其高特异性,在恶性肿瘤组织中过度表达,和其结合并内化叶酸结合物的能力。由于掺入了靶向配体,与非靶向载体相比,FR靶向的载体向KB细胞投递寡核苷酸的效率更高。这种改良的剂型对FR过表达的肿瘤可能有潜在的寡核苷酸靶向治疗的作用。在我们的研究中,我们使用FR靶向的脂质体向LA-N-5细胞投递MYCN siRNA。在FR靶向的脂质体将MYCN siRNA转染到LA-N-5细胞后72h,MYCNmRNA表达的抑制率为79.2%,肿瘤细胞增殖的抑制率为66.2%。这些抑制效果比以前用非靶向脂质体投递MYCN基因反义寡核苷酸和MYCN siRNA的研究更显著。我们的数据表明,FR靶向的脂质体可能是在体内传递基因的有效策略。在这项研究中,免疫缺陷小鼠注射经FR靶向的脂质体包被的MYCN siRNA处理的LA-N-5细胞,各实验组MYCN mRNA在肿瘤组织的表达最多下降53.1%。因此,我们FR靶向的脂质体的MYCN基因沉默的策略是治疗MYCN基因扩增的神经母细胞瘤的一种更有效和更有针对性的方法。
我们的发明研究表明,FR靶向的脂质体在体内作为投递基因的载体的策略,是神经母细胞瘤的基因治疗潜在工具。
Claims (3)
1.叶酸受体靶向的脂质体,其特征在于,所述脂质体由二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、1,2-二油酸-3-二甲基酰胺丙烷、叶酸-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺以及MYCN基因的siRNA组成。
2.根据权利要求1所述的叶酸受体靶向的脂质体,其特征在于,所述的MYCN基因的siRNA的正义链选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:5之一,反义链选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:6之一。
3.权利要求1所述的脂质体,可以应用于制备治疗神经母细胞瘤药物。
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CN1617710A (zh) * | 2001-12-12 | 2005-05-18 | 阿尔扎公司 | 递送核酸的脂质体组合物 |
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