CN104548129A - 一种叶酸受体靶向的干扰Claudin3 基因表达的药物组合物 - Google Patents

一种叶酸受体靶向的干扰Claudin3 基因表达的药物组合物 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物制药领域。本发明所要解决的技术问题是提供一种叶酸受体靶向的干扰Claudin3基因表达的药物组合物及其制备方法和用途。本发明利用可靶向肿瘤细胞表面高表达的叶酸受体成分，将干扰Claudin3基因表达的RNA序列选择性投递到肿瘤部位，可提高Claudin3的干扰效率，且抑制癌细胞增长效果明显，为临床治疗癌症提供了一种新的选择。

Description

一种叶酸受体靶向的干扰Claudin3 基因表达的药物组合物
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及一种叶酸受体靶向的干扰Claudin3 基因表达的药物组合物及其制备方法和用途。
背景技术
癌症是当今世界各国面临的一个主要的公共健康难题。在发达国家，癌症是人口死亡的首要原因；而在发展中国家，癌症也是引起人口死亡的第二位原因。据最新癌症统计学数据，全球癌症患者每年新发病例1266万，死亡病例756万。在发达国家如美国，每年癌症新发病例约166万，因癌症死亡约58万，每4人中就有1人死于癌症。据《2012中国肿瘤登记年报》，我国每年新发癌症病例约350万，因癌症死亡约250万，全国每6分钟就有1人被确证为癌症，每天有8550人成为癌症患者，每7到8人中就有1人死于癌症。
虽然在过去的近20～30年间，传统治疗手段包括放射治疗、化学治疗和手术治疗不断发展，但是新的治疗药物以及新技术的应用依旧未能改进癌症患者生存质量和存活率。因此，新的治疗手段——基因治疗——的开发可能改变癌症的治疗现状。截止目前，肿瘤基因治疗临床试验已开展近20年，仍在开放的临床试验829例，占整个基因治疗临床试验的66.85%（829/1240）。
Claudins家族是上皮细胞间紧密连接的骨架蛋白，参与紧密连接的构成，紧密连接有维持细胞极向排列和屏障功能，其表达异常而导致紧密连接结构和功能的破坏是许多疾病的病例基础。研究表明，多种上皮来源的肿瘤中Claudins家族异常表达，并与这些肿瘤的发生、发展关系密切，在诊断、治疗以及预后的判断等方面有广泛的应用前景，因此Claudins家族成为肿瘤研究的新热点。Claudin3是Claudins家族的一员，分子量为22kDa，其基因定位于人染色体7q11.23，正常表达于导管上皮和腺泡上皮的连接中。近年研究发现，Claudin3在多种肿瘤包括卵巢癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌、子宫癌、脑癌、肝癌、肺癌、头颈部癌以及结直肠癌等异常高表达，在肿瘤的生长、增殖、浸润和转移等方面都具有重要作用，并且与病人的不良预后密切相关。因此，Claudin3是肿瘤治疗的一个重要靶点。研究发现，利用RNA干扰技术（RNAi）干扰Claudin3的表达，能够抑制多种肿瘤的生长，抑制肿瘤细胞的增殖和转移。但是由于已有的RNAi缺乏肿瘤选择性，Claudin3干扰效率低，抗肿瘤的疗效有待提高，因此亟待开发新型的RNAi靶向传递系统。
文献报道，多种上皮来源的肿瘤包括卵巢癌、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌、宫颈癌、脑癌、肺癌、头颈部癌以及结直肠癌等都有叶酸受体的高表达。利用可靶向肿瘤细胞表面高表达的叶酸受体成分投递药物，可以实现肿瘤选择性的靶向给药，提高药物的抗肿瘤效果。
发明人拟构建一种叶酸受体靶向的干扰Claudin3 基因表达的药物组合物，利用可靶向肿瘤细胞表面高表达的叶酸受体成分，将干扰Claudin3基因表达的RNA序列选择性投递到肿瘤部位，提高Claudin3的干扰效率，使其具有较好的抗肿瘤效果。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供一种叶酸受体靶向的干扰Claudin3 基因表达的药物组合物，目的在于提高Claudin3的干扰效率，从而提高抗肿瘤效果。
该药物组合物含有叶酸受体靶向成分和干扰Claudin3基因表达的RNA序列，可添加其他药学上可接受的成分，也可不添加其他成分。
该药物组合物中的叶酸受体靶向成分包括但不限于叶酸受体的抗体、叶酸、叶酸衍生物、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤衍生物。其中，叶酸受体的抗体包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体和人源化抗体中的一种或多种，例如：Farletuzumab（MORAb-003）或其他公开的叶酸受体的抗体；叶酸衍生物包括但不限于四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、5,10-亚甲基四氢叶酸、5-甲酰四氢叶酸、10-甲酰四氢叶酸、5,10-二脱氮四氢叶酸中的一种或多种。
该药物组合物中的干扰Claudin3基因表达的RNA序列是针对Claudin3基因的mRNA碱基序列设计的，可以是单链RNA，也可以是双链RNA；具体的干扰序列可以承载于miRNA、siRNA、shRNA等RNA干扰（RNAi）分子结构中。RNAi可以不用载体，直接与叶酸受体靶向成分形成组合物；也可选择性构建在包括但不限于质粒、病毒、噬菌体、脂质体、胶束、纳米粒在内的一种载体或几种载体中。其中，病毒包括但不限于腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒、溶瘤病毒中一种或多种。
该药物组合物中叶酸受体靶向成分与干扰Claudin3基因表达的RNA序列的组装方式包括但不限于以下方式中的一种或多种：叶酸受体靶向成分直接与RNAi偶联，或叶酸受体靶向成分修饰在RNAi载体的表面。
具体地，利用RNA干扰序列设计软件，例如利用 Invitrogen 公司 BLOCK-iT™ RNAi Designer 在线设计软件（http：//rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/）或其他在线设计软件（http://sidirect2.rnai.jp/）设计干扰Claudin3基因表达的RNA序列，再与 GeneBank 序列比较，设计序列不能与人体其他任何 mRNA 存在同源性。利用上述方法，已设计获得了两个RNAi序列，且证实基因沉默效果较好，编号为SEQ1和SEQ2。SEQ1的正义链为：GCAACAUCAU CACGUCGCAT T，反义链为：UGCGACGUGA UGAUGUUGCT T。SEQ2的正义链为：TCCCGCAACA TCATCACGTC GCATTCAAGA CGTGCGACGT GATGATGTTG CTTTTTTG，反义链为：AGCTCAAAAA AGCAACATCA TCACGTCGCA CGTCTTGAAT GCGACGTGAT GATGTTGC。干扰Claudin3基因表达的RNA序列，可以是通过上述原则设计的其他任何序列，并不限于以上所列的RNAi具体序列。
RNAi直接全身给药，存在稳定性差，体内半衰期短的缺点；因此，优选化学修饰的RNAi，包括正义链和反义链的3’端以及正义链的5’端进行封端反应或化学基团修饰、正义链和反义链的第2个碱基引入一个小的疏水基团进行修饰(如2’-OMe 修饰)或在siRNA的两条链上引入硫代磷酸基团而增加其结构稳定性。RNAi的化学修饰可选择任何能增加其稳定性的方式，并不限于以上所列的具体方式。
RNAi可直接与叶酸受体靶向成分偶联形成组合物。具体地，RNAi的羟基可与叶酸受体靶向成分包括叶酸受体的抗体、叶酸及其衍生物、甲氨蝶呤及其衍生物的羧基直接偶联，形成酯化复合物。或者，RNAi还可通过一定的间隔基与叶酸受体靶向成分连接；具体地，叶酸受体靶向成分可先与生物素偶联，再加入链霉亲和素和RNAi，即形成RNAi与叶酸受体靶向成分的组合物。RNAi与叶酸受体靶向成分直接偶联形成组合物的方法，可包括多种其他任何能让二者相连的方法，并不限于以上所列方法。
干扰Claudin3基因表达的RNA序列可以不用载体，也可以构建于质粒、病毒、噬菌体在内的一种载体，分别记为RNAi-质粒、RNAi-病毒、RNAi-噬菌体。其中，病毒包括但不限于腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒、溶瘤病毒中一种或多种。具体构建方法为常规方法，具体参照分子克隆实验室指南（第三版，科学出版社，2002）中所述方法，或者按照所用试剂盒的生产厂商所建议的条件。由于siRNA大量定制价格高、周期长，故本发明优选采用可大量扩增或生产的质粒、病毒、噬菌体表达载体。具体的质粒、病毒、噬菌体表达载体可以是商品化的载体也可以是构建的新型载体。
干扰Claudin3基因表达的RNA序列也可以构建于脂质体、胶束、纳米粒在内的一种载体或多种载体中。具体装载方式为：脂质体、胶束或纳米粒静电吸附、物理包裹中的一种或多种直接转载RNAi。具体地，脂质体选自阳离子脂质体、中性脂质体、阴性脂质体；胶束载体材料可选用商品化的辅料如泊洛沙姆、磷脂等，或者文献已经报道的载体如PEG与聚酯类的嵌段共聚物（包括：PEG-PCL、PEG-PLA、PEG-PLGA、PEG-PCL-PEG、PEG-PLA-PEG、PEG-PLGA-PEG、PCL-PEG-PCL、PLA-PEG-PLA、PLGA- PEG-PLGA），或者新设计合成的聚合物载体，或新设计的载体以及内源性成分的衍生物中的一种或几种；纳米粒载体材料可选用商品化的辅料如PLGA、PLA、壳聚糖、透明质酸、PEI等，或者文献已经报道的载体如PLGA、PLA、壳聚糖、透明质酸或PEI的衍生物，或者PEG与聚酯类的嵌段共聚物（包括：PEG-PCL、PEG-PLA、PEG-PLGA、PEG-PCL-PEG、PEG-PLA-PEG、PEG-PLGA-PEG、PCL-PEG-PCL、PLA-PEG-PLA、PLGA- PEG-PLGA），或者新设计合成的聚合物载体，或新设计的载体以及内源性成分的衍生物中的一种或几种。
干扰Claudin3基因表达的RNAi-质粒、RNAi-病毒、RNAi-噬菌体中的一种也可进一步构建于脂质体、胶束、纳米粒在内的一种载体或多种载体中，形成复合载体。具体地，通过静电吸附、物理包裹中的一种或多种机制，RNAi-质粒、RNAi-病毒或RNAi-噬菌体中的一种可装载在脂质体、胶束、纳米粒在内的一种载体或多种载体中，形成RNAi-质粒/脂质体、RNAi-质粒/胶束、RNAi-质粒/纳米粒，或RNAi-病毒/脂质体、RNAi-病毒/胶束、RNAi-病毒/纳米粒，或RNAi-噬菌体/脂质体、RNAi-噬菌体/胶束、RNAi-噬菌体/纳米粒，或RNAi-质粒/胶束/脂质体、RNAi-质粒/纳米/脂质体、RNAi-病毒/胶束/脂质体、RNAi-病毒/纳米/脂质体、RNAi-噬菌体/胶束/脂质体、RNAi-噬菌体/纳米/脂质体。
干扰Claudin3基因表达的RNAi-质粒、RNAi-病毒、RNAi-噬菌体中的两种或3种还可进一步构建于脂质体、胶束、纳米粒在内的一种载体或多种载体中，形成复合载体。具体地，RNAi-质粒、RNAi-病毒或RNAi-噬菌体中的两种或3种也可通过静电吸附、物理包裹中的一种或多种机制，装载于脂质体、胶束、纳米粒在内的一种载体或多种载体中，RNAi-质粒和RNAi-病毒两种组合装载于脂质体、胶束、纳米粒在内的一种载体或多种载体中时，具体就包括以下制剂：RNAi-质粒/RNAi-病毒/脂质体、RNAi-质粒/RNAi-病毒/胶束、RNAi-质粒/RNAi-病毒/纳米粒，或RNAi-质粒/RNAi-病毒/胶束/脂质体、RNAi-质粒/RNAi-病毒/纳米/脂质体。RNAi-质粒和RNAi-噬菌体两种组合装载于脂质体、胶束、纳米粒在内的一种载体或多种载体中时，具体就包括以下制剂：RNAi-质粒/ RNAi-噬菌体/脂质体、RNAi-质粒/ RNAi-噬菌体/胶束、RNAi-质粒/ RNAi-噬菌体/纳米粒，或RNAi-质粒/RNAi-噬菌体/胶束/脂质体、RNAi-质粒/RNAi-噬菌体/纳米/脂质体。RNAi-病毒和RNAi-噬菌体两种组合装载于脂质体、胶束、纳米粒在内的一种载体或多种载体中时，具体就包括以下制剂：RNAi-病毒/ RNAi-噬菌体/脂质体、RNAi-病毒/ RNAi-噬菌体/胶束、RNAi-病毒/ RNAi-噬菌体/纳米粒，或RNAi-病毒/RNAi-噬菌体/胶束/脂质体、RNAi-病毒/RNAi-噬菌体/纳米/脂质体。
叶酸受体靶向的干扰Claudin3 基因表达的药物组合物，其叶酸受体靶向成分与干扰Claudin3基因表达的RNA序列的组装方式除叶酸受体靶向成分直接与RNAi偶联外，还包含叶酸受体靶向成分修饰在RNAi载体表面的方式。
叶酸受体靶向成分直接修饰在质粒表面。具体地，质粒表面的氨基可与叶酸受体靶向成分包括叶酸受体的抗体、叶酸及其衍生物、甲氨蝶呤及其衍生物的羧基直接偶联，形成酰胺化复合物。或者，质粒还可通过一定的间隔基与叶酸受体靶向成分连接，间隔基包括聚乙二醇链（分子量200～5000Da的聚乙二醇均可）、氨基己酸等。质粒与叶酸受体靶向成分直接偶联形成组合物的方法，可包括多种其他任何能让二者相连的方法，并不限于以上所列方法。
叶酸受体靶向成分直接修饰在病毒、噬菌体、细菌、真菌表面。具体地，病毒、噬菌体、细菌、真菌表面蛋白的氨基可与叶酸受体靶向成分包括叶酸受体的抗体、叶酸及其衍生物、甲氨蝶呤及其衍生物的羧基直接偶联，形成酰胺化复合物。或者，病毒、噬菌体、细菌、真菌还可通过一定的间隔基与叶酸受体靶向成分连接，间隔基包括聚乙二醇链（分子量200～5000Da的聚乙二醇均可）、氨基己酸等。病毒、噬菌体、细菌、真菌与叶酸受体靶向成分直接偶联形成组合物的方法，可包括多种其他任何能让二者相连的方法，并不限于以上所列方法。
叶酸受体靶向成分直接修饰在脂质体、胶束、纳米粒表面。具体地，脂质体、胶束、纳米粒表面的氨基可与叶酸受体靶向成分包括叶酸受体的抗体、叶酸及其衍生物、甲氨蝶呤及其衍生物的羧基直接偶联，形成酰胺化复合物。或者，脂质体、胶束、纳米粒还可通过一定的间隔基与叶酸受体靶向成分连接，间隔基包括聚乙二醇链（分子量200～5000Da的聚乙二醇均可）、氨基己酸等。脂质体、胶束、纳米粒与叶酸受体靶向成分直接偶联形成组合物的方法，可包括多种其他任何能让二者相连的方法，并不限于以上所列方法。
本发明提供的叶酸受体靶向的干扰Claudin3 基因表达的药物组合物，可以特异性与肿瘤细胞表面高表达的叶酸受体结合，并通过叶酸受体介导的高效内吞作用提高Claudin3的干扰效率，从而提高抗肿瘤效果。
叶酸受体靶向的干扰Claudin3 基因表达的脂质体包含磷脂和胆固醇两类脂质材料，也可添加其他任何药学上可接受的成分。磷脂种类很多，可采用制剂领域常用于制备脂质体的磷脂类型；胆固醇也可采用制剂领域常用于制备脂质体的胆固醇类型。具体地，制备叶酸受体靶向的干扰Claudin3 基因表达的脂质体时，采用的脂质为中性脂质，负电荷脂质或正电荷脂质材料，包括：磷脂、大豆磷脂、卵磷脂、脑磷脂、鞘磷脂、二甲基双十八烷基溴化铵（DDAB）、 sn-甘油1,2 - 二油酰-3 - 磷酸胆碱(DOPC)、1,2 - 二油酰基-3 - 三甲基铵丙烷（氯化物盐）（DOTAP）、1,2 – 二十八烷基-SN-甘油-3 - 磷酸乙醇胺（DSPE）、胆固醇、[N-（N'，N'-二甲基氨基乙烷） - 氨基甲酰基]胆甾醇盐酸盐（DC-胆固醇）。
其中，磷脂（包括磷脂衍生物）与胆固醇 （包括胆固醇衍生物）摩尔比为0.5 : 1～10 : 1，PEG修饰脂质占总脂质摩尔数的0.01～15%，叶酸占总脂质摩尔数的 0.01～2.5%，PEG 分子量为200～5000。
附图说明
图1 叶酸受体靶向的干扰Claudin3 基因表达的药物组合物抗人卵巢癌试验结果（实施例25）。与对照组比较，叶酸受体靶向的干扰Claudin3 基因表达的药物组合物抑瘤率达90%，显著优于非叶酸受体靶向的干扰Claudin3 基因表达的药物组合物（72%）（p<0.001）；Western Blot和免疫组化分析结果显示，叶酸受体靶向的干扰Claudin3 基因表达的药物组合物几乎完全抑制Claudin3在肿瘤细胞的表达。
具体实施方式
以下通过对本发明具体实施方式的描述说明但不限制本发明。
实施例1 干扰Claudin3基因表达的RNA序列设计
利用 Invitrogen 公司 BLOCK-iT™ RNAi Designer 在线设计软件（http：//rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/）设计干扰Claudin3基因表达的RNA序列，再与 GeneBank 序列比较，筛选出不与人体其他任何 mRNA 存在同源性的序列SEQ1，正义链为：GCAACAUCAU CACGUCGCAT T，反义链为：UGCGACGUGA UGAUGUUGCT T。
实施例2 干扰Claudin3基因表达的RNA序列设计
利用在线设计软件（http://sidirect2.rnai.jp/），设计干扰Claudin3基因表达的RNA序列，再与 GeneBank 序列比较，筛选出不与人体其他任何 mRNA 存在同源性的序列SEQ2，正义链为：TCCCGCAACA TCATCACGTC GCATTCAAGA CGTGCGACGT GATGATGTTG CTTTTTTG，反义链为：AGCTCAAAAA AGCAACATCA TCACGTCGCA CGTCTTGAAT GCGACGTGAT GATGTTGC。
实施例3 RNAi表达质粒载体构建
首先设计并合成编码对应靶序列的shRNA的DNA模板上下游引物；分别以30 μL退火缓冲液，溶解引物上下游片段（1 OD）。各取2 μL上述溶液+16 μL退火缓冲液混匀，加热至94℃后自然退火冷却至室温。取1 μL退火产物+99 μL水做100倍稀释。将shRNA质粒表达载体pGenesil-2.1或pGenesil2.4以Eco31I 限制性内切酶进行酶切，酶切产物以1%琼脂糖凝胶电泳，胶回收质粒大片段。CLDN3退火片段与pGenisil-2.1线性化连接。连接产物转化感受态DH5α大肠杆菌，涂布于含卡那霉素抗性（终浓度为50 μg/mL）的LB琼脂糖培养基平板上，37℃恒温培养箱培养过夜。进行小规模质粒抽提，并以SacI做酶切鉴定。挑取酶切电泳初步验证的克隆正确的质粒转化菌液测序。经测序结果分析：均为插入正确的克隆质粒，而且质量均符合设计标准。将成功构建的RNAi表达质粒载体经Qiagen公司大抽试剂盒（Plasmid extraction and purification EndoFree Plasmid Giga Kits）大规模制备，即得，记为pGenesil2.1shRNA或pGenesil2.4shRNA。
实施例4 包装有Claudin3 RNAi的质粒直接与叶酸受体靶向成分偶联形成组合物
将0.05微摩尔NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）和0.1微摩尔EDC（1-乙基-3–(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺）加入1ml叶酸单克隆抗体Farletuzumab溶液（5mg/ml），室温搅拌15分钟；再加入1ml pGenesil2.1shRNA溶液（5mg/ml）中4 ◦C孵育过夜，再置于透析袋中，用10mM磷酸盐缓冲液（pH 7.4）在4 ◦C透析12h，即得Farletuzumab-pGenesil2.1shRNA复合物。
实施例5～10 以α-羧基-ω-氨基聚乙二醇为间隔基制备叶酸修饰脂质
具体投料如下：
具体操作为：取α-羧基-ω-氨基聚乙二醇（氨基末端保护）0.5mmol，脂质材料（胆固醇或磷脂）0.75mmol，4-二甲氨基吡啶0.75mmol和1-乙基-3–(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺0.75mmol溶于100ml二氯甲烷中，反应约72~96h。减压旋蒸除去有机溶剂，真空干燥得氨基聚乙二醇胆固醇粗产品。称取叶酸1mmol、N-羟基琥珀酰亚胺2.5mmol、1-乙基-3–(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺2.5mmol和三乙胺10mmol溶于50ml无水DMSO中，加入约0.5mmol氨基聚乙二醇胆固醇粗产品，25~30℃反应约72~96h，反应液转入透析袋（MWCO=3500 Da），分别以20%（v/v）DMSO和水为透析介质透析，透析7天后，转移透析样品至丝口瓶中，冻干，即得叶酸-聚乙二醇-胆固醇或叶酸-聚乙二醇-磷脂（即叶酸修饰脂质）。叶酸反应、纯化及冻干全程避光，产物避光保存于干燥器中。
实施例11～16 以双氨基聚乙二醇为间隔基制备叶酸修饰脂质
具体投料如下：
具体操作为：将脂质（胆固醇或磷脂）(10 mmol) ，丁二酸酐(50mmol) ，DMAP(5mmol)溶于50 mL 二氯甲烷中，45 ℃剧烈回流，搅拌48 h，得丁二酰化脂质（胆固醇或磷脂）。取丁二酰化脂质（4mmol），1-乙基-3–(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺（10mmol），N-羟基琥珀酰亚胺（10mmol）溶于少量二氯甲烷中，滴加至100ml的双氨基聚乙二醇（5mmol）二氯甲烷溶液中，室温搅拌反应约72h~96h。反应液用60目~80目硅胶拌样，300目~400目硅胶湿法装柱，干法上样。以二氯甲烷-甲醇体系为洗脱剂，比例从80:1，60:1，40:1到20:1（体积比，v/v），收集含有目标产物的洗脱液，合并浓缩除去有机溶剂，得氨基聚乙二醇-胆固醇。将叶酸（0.42mmol）、NHS（0.5mmol）、EDCI（0.5mmol）和三乙胺（4mmol）溶于5ml无水二甲亚砜中，滴加氨基聚乙二醇-胆固醇（0.21mmol）的DMSO溶液。25℃~30℃反应约120h~144h后，将反应液转入透析袋（MWCO=1000Da），分别以20%（v/v）DMSO和水为透析介质透析，透析14天后，转移透析样品至丝口瓶中，冻干，即得叶酸-聚乙二醇-胆固醇或叶酸-聚乙二醇-磷脂（即叶酸修饰脂质）。叶酸反应、纯化及冻干全程避光，产物避光保存于干燥器中。
实施例17～22 叶酸修饰的质粒/脂质体组合物制备
取叶酸修饰脂质，先用5%葡萄糖溶液溶解，制得1mg/ml的叶酸修饰脂质的胶束溶液。再取20mg脂质材料，加入氯仿使溶解，37℃减压除去氯仿，时间为1h，然后于室温、高真空条件下保持6h以上，葡萄糖溶液水化脱膜，水浴温度60℃，时间1h；脱膜后的混悬液转入西林瓶中，趁热水浴超声，水浴温度60℃，超声15min，0.22μm微孔滤膜过滤，滤液与pGenesil2.4 shRNA按质量比混合，室温孵育 30min，记为P-LP/CLDN3。取叶酸修饰脂质的胶束溶液与P-LP/CLDN3按上表摩尔比混合，并置于37℃恒温空气浴振荡器中，100rpm振摇1h后，即得叶酸修饰的质粒/脂质体组合物，记为F-P-LP/CLDN3。
实施例23～28 叶酸修饰的质粒/脂质体组合物制备
取脂质材料于茄形烧瓶中，氯仿-甲醇混合溶剂溶解，37℃减压除去有机溶剂，时间为1h，然后于室温、高真空条件下保持6h以上，葡萄糖溶液水化脱膜，水浴温度60℃，时间1h；脱膜后的混悬液转入西林瓶中，趁热水浴超声，水浴温度60℃，超声1min，0.22μm微孔滤膜过滤，制得叶酸靶向空白脂质体，记为F-P-LP。F-P-LP与pGenesil2.1shRNA按上表质量比混合，室温孵育30min，即制得叶酸修饰的质粒/脂质体组合物，记为F-P-LP/CLDN3。
试验例1 用人卵巢癌腹腔瘤模型评价叶酸受体靶向的干扰Claudin3 基因表达的药物组合物治疗效果
将Balb/C雌性裸鼠饲养于无特定病原体（SPF）屏障环境中。4~6周龄健康小鼠腹腔接种约1×107个SKOV-3细胞/只，接种3天后按照体重随机分组（每组8只）并给药，具体分组为：对照组（Control）、非靶向组（P-LP/CLDN3：制备方法同实施例25，仅将其中的0.25％的叶酸-聚乙二醇-胆固醇用0.25％的单甲氧基聚乙二醇胆固醇酯替代）和叶酸靶向组（F-P-LP/CLDN3：用的是实施例25的组合物）。给药方式为腹腔注射，每三天注射1次，给药剂量为每只小鼠5µg质粒/200µl，连续给药10次。
处死裸鼠，解剖后记录腹水体积、肿瘤结节的个数及肿瘤的重量，结果见图1，叶酸受体靶向的干扰Claudin3 基因表达的药物组合物（F-P-LP/CLDN3）组跟非靶向组相比，显著提高了Claudin3的干扰效率，达到了较为理想的抗肿瘤效果。与对照组比较，叶酸受体靶向的干扰Claudin3 基因表达的药物组合物抑瘤率达90%，显著优于非叶酸受体靶向的干扰Claudin3 基因表达的药物组合物（72%）（p<0.001）；Western Blot和免疫组化分析结果显示，叶酸受体靶向的干扰Claudin3 基因表达的药物组合物几乎完全抑制Claudin3在肿瘤细胞的表达。

Claims (8)

1.一种叶酸受体靶向的干扰Claudin3 基因表达的药物组合物，其特征在于：含有叶酸受体靶向成分和干扰Claudin3基因表达的RNA序列。
2. 根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于所述的叶酸受体靶向成分包括：叶酸受体的抗体、叶酸、叶酸衍生物、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤衍生物。
3. 根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于所述的叶酸衍生物包括四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、5,10-亚甲基四氢叶酸、5-甲酰四氢叶酸、10-甲酰四氢叶酸、5,10-二脱氮四氢叶酸。
4. 根据权利要求1～3所述的药物组合物，其特征在于干扰Claudin3基因表达的RNA序列可以不用载体，也可选择性构建在包括质粒、病毒、噬菌体、细菌、真菌、脂质体、胶束、纳米粒在内的一种载体或几种载体中。
5. 根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于病毒包括腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒、溶瘤病毒、牛痘病毒、改良安卡拉牛痘病毒、仙台病毒、单纯性疱疹病毒、麻疹病毒、新城鸡瘟病毒、脊髓灰质炎病毒、痘病毒、RNA病毒。
6. 根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于细菌包括大肠杆菌、长双歧杆菌、乳酸乳球菌、单核细胞增多性李斯特氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、痢疾杆菌、变异链球菌、霍乱弧菌。
7. 根据权利要求1～6所述的药物组合物，其特征在于叶酸受体靶向成分可以直接与RNA序列偶联，也可修饰在RNA载体的表面。
8. 权利要求1~7任一项所述的药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
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