KR101992925B1 - 유전자 발현 조절을 위한 올리고뉴클레오타이드 및 그 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유전자의 발현을 조절하기 위한 올리고뉴클레오타이드에 관한 것으로서, 특히 유전적, 종양 또는 바이러스 기원의 병리의 원인이 되는 유전자를 조절하기 위한 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 화학적으로 변형될 수도 있는 상기 올리고뉴클레오타이드의 상기 질병의 치료 및/또는 진단을 위한 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 유전자 발현의 조절, 특히 유전적, 종양 또는 바이러스 기원의 병리의 원인이 되는 유전자를 조절하기 위한 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 질환들의 치료 및/또는 진단을 위한 상기 올리고뉴클레오타이드의 용도에 관한 것으로, 상기 올리고뉴클레오타이드는 화학적으로 변형될 수도 있다.
올리고뉴클레오타이드는 짧은 서열의 천연 RNA 또는 DNA 핵산 또는 합성 핵산, 예컨대 PNA (펩타이드 핵산), LNA (Locked Nucleic Acid) 및 모폴리노 (morpholino)이다.
올리고뉴클레오타이드는 전사 및 번역 두 가지 수준 모두에서 유전자의 발현을 조절하는데 있어 매우 효과적임이 실험적으로 증명되어 왔다. 이러한 능력 때문에, 올리고뉴클레오타이드는 다수의 병리들, 특히 유전적, 종양 또는 바이러스 기원 질병들의 치료에 가치있는 수단을 대표한다.
유전자 발현을 조절한다는 것은 그것을 억제하거나 활성화시키는 것을 의미할 수 있다.
예컨대, 유전자의 안티센스 가닥과 상보적 결합을 형성함으로써 (Helene C, Bioch Bioph Acta 1990, 1049(2):99-125) 또는 관심 대상 유전자의 조절 영역의 염색질 상태를 변형함으로써 (Rossi JJ, Nat Chem Biol 2007, 3(3):136-7) 유전자의 전사를 억제할 수 있는 올리고뉴클레오타이드들이 알려져 있다. 다른 올리고뉴클레오타이드들은 유전자 번역을 억제할 수 있는데, 예컨대 표적 메신저 RNA (mRNA)와 상보적 결합을 통하여 그러하다. 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 경우에 있어서, 이러한 결합은 RNase H 복합체에 의한 mRNA의 효소 분해를 야기한다. 그 올리고뉴클레오타이드가 이중-가닥의 "간섭" RNA인 경우에 있어서는, 상기 올리고뉴클레오타이드의 표적 mRNA와의 상보적 결합은 RISC 복합체의 "슬라이서" 효소에 의한 메신저의 분해를 야기한다. 후자의 경우, 그 올리고뉴클레오타이드는 불완전한 상보성 덕분에 표적 mRNA의 3'UTR 영역 (3' 비번역 영역)과 결합할 수 있는 내인성 마이크로RNA와 균등한 올리고뉴클레오타이드일 수 있으며, 그 mRNA의 번역 차단을 야기한다.
또한, 올리고뉴클레오타이드는, 예컨대 긴 안티센스 비(非)-코딩 RNA와의 상보적 결합을 통하여 (Morris KV, Epigenetics, 2009, 4(5): 296-301), 또는 상보적 마이크로RNA를 억제하여 그 마이크로RNA의 표적 mRNA의 번역을 증가시키는 결과로써 유전자의 활성화 또는 그 전사 증가를 유도할 수 있다.
올리고뉴클레오타이드는 치료적 및/또는 진단적 관점에서 그들의 효율을 증가시키고자 하는 목적으로 화학적으로 변형될 수 있다. 예컨대, 올리고뉴클레오타이드는 그 특이성 및/또는 그것이 짝을 이루는 상보적 서열과의 결합력을 높이기 위하여 변형될 수 있고, 또는 효소 분해에 대하여 덜 민감하게 하기 위하여, 그 약동학적/약력학적 프로파일을 개선하기 위하여, 또는 세포막을 통한 그 이동을 촉진시키기 위하여 변형될 수 있다.
천연 핵산으로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 (즉, DNA 및/또는 RNA로 이루어진 짧은 서열) 이외에도, 합성 핵산, 예컨대 펩타이드 핵산 (PNA) 및 잠금 핵산 (locked nucleic acid, LNA)으로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드가 존재하며, 이들은 무엇보다도 항유전자 전략 수단으로서 유전자의 발현을 조절할 목적으로 (즉, 유전자를 직접 겨냥하여 설계됨) 널리 연구되고 특징지워져 왔다. 모든 변형 올리고뉴클레오타이드와 마찬가지로, PNA 및 LNA 올리고뉴클레오타이드는 일반적으로 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오타이드보다 훨씬 더 화학적으로 안정하다. 키메라 올리고뉴클레오타이드를 합성함으로써 그 안정성은 더욱 향상될 수 있다. 키메라 올리고뉴클레오타이드는, 예컨대 그 안에 고전적인 모노머 (디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드)와 합성 뉴클레오염기 (모노머), 예컨대 LNA 모노머 양자 모두가 삽입된 올리고뉴클레오타이드 서열이다.
LNA는 표적 유전자의 전사체를 억제함으로써 유전자를 침묵시키기 위한 안티센스 전략으로 사용된다 (Braasch DA, Nucl Acids Res, 2002, 30(23):5160-7). 또는, LNA 올리고뉴클레오타이드는, "가닥 침범" 메커니즘을 이용하여 올리고뉴클레오타이드 서열을 핵산의 양 가닥 모두에 상호 작용하고 "Z-형상" 구조를 형성할 수 있는 방식으로 설계한 ("조로" 올리고뉴클레오타이드로 정의됨) 스미스 등 (Ge R, Faseb J, 2007, 1902-14)에 의하여 행하여 진 바와 같이 항유전자 전략으로 사용될 수도 있다.
PNA 올리고뉴클레오타이드는 다른 올리고뉴클레오시드 구조들에 비하여 효소적으로 훨씬 안정하다. PNA는 이중-가닥 DNA (DNAds)에 "가닥 침범"을 통하여 결합할 수 있고, 또는 상보적 방식으로 단일-가닥 DNA (DNAss) 분자와 쌍을 이룰 수 있고, 또는 "호모듀플렉스" 구조 (예컨대, DNA/DNA 이중 가닥)에 비하여 열역학적으로 매우 안정한 혼성 이중-나선 PNA/DNA 또는 PNA/RNA를 형성하면서 RNA 가닥들에 결합할 수도 있다.
PNA는, 무엇보다도 항유전자 전략을 이용하여 유전자의 발현을 조절하기 위한 매우 유리한 시스템을 대표한다. 사실, PNA가 표적 서열에 높은 특이성을 나타내므로, 그에 따라 단백질의 발현을 효과적인 방식으로 억제되도록 할 수 있다는 것이 입증되어 왔다.
그러므로, PNA는 유전적 또는 바이러스 질병 치료를 위한 확실한 치료 접근법을 대표한다.
PNA의 유일한 단점은 그들이 세포막을 통과하는데 있어 제한된 능력을 갖는다는 사실이다. 그러나, 이러한 한계는 일반적인 올리고뉴클레오타이드, 특히 PNA를, 보다 효과적으로 세포막을 통하여 이동할 수 있게 하는 분자들 (캐리어)과 함께 결합시킴으로써 해결되어 왔다.
사실, 올리고뉴클레오타이드, 구체적으로 PNA는 일반적으로 그들과 결합된 캐리어 (또는 "태그"), 예컨대 1 내지 30개의 아미노산을 포함하는 다양한 길이의 펩타이드 서열을 이용하여 투여될 수 있다.
올리고뉴클레오타이드의 한 가지 특정한 활용은 종양에서 활성화되거나 억제된 유전자들의 발현을 조절하는 것이다.
종양이 다양한 유전자들의 이상 조절에 의하여 야기된다는 것은 잘 알려져 있다. 보통, 손상은 MYC 유전자 (예컨대, MYC, MYCN, MYCL1), 서바이빈 (BIRC5), BCL2, PLK4, ALK 및 PKM2와 같은 원암-유전자 (또는, 간단히 발암 유전자)에 영향을 미치는데, 이들은 종양에서 활성화 또는 과발현되어 있다. 게다가, 종양에서는, 카스파아제-8 및 RASSF1과 같은 항종양 유전자 또는 발암억제 유전자들은 또한 보통 불활성화되어 있다.
특히, MYC 패밀리 발암 유전자들은 다수의 인간 종양 발병에 관여되어 있고, 유전자들 중에서 종양의 개시 및 진행의 가장 큰 원인이다. 이들 유전자의 증폭 및/또는 과발현은 거의 항상 종양, 소아 유형 (예컨대, 신경모세포종, 수모세포종 및 횡문근육종) 및 성인 유형 (예컨대 소세포 폐암, 아교 모세포종)과 관련된다 (Pession A, Cur Cancer Drug Target, 2005, 5(4):273-83). 사실, 이들은 세포 증식의 유도, 세포자멸사에 대한 저항성, 전이 형성 및 화학요법 약물에 대한 저항성과 같은 종양 성장에 기본적인 메커니즘이라는 수단에 의하여 작용한다.
항종양 효과를 갖는 많은 올리고뉴클레오타이드들이 문헌에 알려져 있다.
예컨대, 안티센스 전략으로 MYC, MYCN, BCL2, BIRC5 유전자들을 겨냥하는 올리고뉴클레오타이드들이 존재하고 (EV Prochownik, Exp Rev Antic Ther 2004, 4(2):289-302; Felsher DW, Drug News Persp, 2003, 16(6):370-4; CF Bennet, Exp Opin Investig Drugs, 1999, 8(3):237-53) 또는 항유전자 효과로 MYCN 및 MYC을 겨냥하는 올리고뉴클레오타이드들이 존재한다 (LC Boffa, Oligonucleotides 2005, 15(2):85-93).
신경 모세포종 세포에서 MYCN 유전자의 번역을 억제하기 위한 목적으로 DNA계 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드들이 또한 생성되었고 (Burkhart CA, JNCI, 2003, 95(18):1394-403), 신경 모세포종 세포에서 MYCN 유전자의 번역을 억제하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드들이 "작은 간섭 RNA (siRNA)"를 통하여 생성되었다 (Kang JH, Bioch Bioph Res Com, 2006, 351(1):192-197).
그러나, 강력한 치료적 및/또는 항종양 효과를 가질 수 있도록 특이성이 증가되고 선택적인 방식으로 유전자의 발현을 조절할 수 있는 다른 올리고뉴클레오타이드들을 동정할 강한 요구가 여전히 존재한다.
치료적 및/또는 진단 수단으로서 사용될 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 얻기 위하여는, 표적 유전자, 또는 표적 메신저 RNA 및/또는 전사 및 번역 양자 모두의 관점에서 유전자 그 자체의 발현에 유의미하고 선택적인 조절 효과를 결정할 수 있는 그들 각각의 조절 서열들을 동정하는 것이 필요하다.
따라서, 유전자의 서열, 또는 메신저 RNA의 서열 또는 그들의 조절 서열 내에서, 그 유전자 자체의 전사/번역을 조절할 목적으로 가장 확실한 올리고뉴클레오타이드 서열을 동정하는 방법을 지배하고 있는 일반적인 법칙을 정의하여야 할 요구 역시 존재한다.
이 기술 분야의 상술한 요구는 본 발명과 중지를 같이 하는데, 본 발명은, 제1 측면에 따르면, 6-30개 뉴클레오타이드 (모노머), 좋기로는 12-24개 뉴클레오타이드를 포함하는 유전자의 발현을 조절하기 위한 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이고, 상기 올리고뉴클레오타이드는 2개 이상의 연속적 구아닌으로 이루어지는 그룹을 하나 이상 포함하는 서열로 특징지워진다. SEQ ID NO: 1 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 상술한 정의에서 제외되는 것으로 이해된다.
천연 핵산 (DNA 및 RNA)의 경우에, 각 모노머 (뉴클레오타이드)는 질소 염기, 당 및 트리포스페이트로 이루어진다. 상기 염기는 아데닌, 구아닌, 티민, 시토신 및 우라실 (오직 RNA에서만 존재)로부터 선택된다. 상기 당은 DNA의 경우 디옥시리보오스이고, RNA의 경우 리보오스이다. 모노머들은 포스포디에스테르 결합에 의하여 폴리머로 연결된다.
좋기로는, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 3개 이상의 연속적 구아닌으로 이루어지는 그룹을 1 이상 포함하는 서열을 포함한다. SEQ ID NO: 1 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 이러한 정의에서 제외되는 것으로 이해된다.
더욱 좋기로는, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 4개 이상의 연속적 구아닌으로 이루어지는 그룹을 1 이상 포함하는 서열을 포함한다.
더더욱 좋기로는, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 5개 이상의 연속적 구아닌으로 이루어지는 그룹을 1 이상 포함하는 서열을 포함한다.
본 발명의 목적상 특히 양호한 것은 6개 이상의 연속적 구아닌으로 이루어지는 그룹을 1 이상 포함하는 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드이다.
본 발명의 몇 가지 구현예에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 2개 내지 6개의 연속적 구아닌으로 이루어지는 그룹을 1 이상 포함하는 서열을 포함한다.
또 다른 구현예에 있어서, 상기 구아닌들로 이루어지는 하나 이상의 그룹은, 좋기로는 2개 이상의 연속적 구아닌으로 이루어지는 그룹을 2 이상 포함한다.
또는, 상기 구아닌들로 이루어지는 하나 이상의 그룹은, 좋기로는 2개 이상의 연속적 구아닌으로 이루어지는 그룹을 1 이상 및 3개 이상의 연속적 구아닌으로 이루어지는 그룹을 1 이상 포함한다.
또 다른 구현예에 있어서, 상기 구아닌들로 이루어지는 하나 이상의 그룹은, 좋기로는 2개 이상의 연속적 구아닌으로 이루어지는 그룹을 3 이상 포함한다.
또 다른 구현예에 있어서, 상기 구아닌들로 이루어지는 하나 이상의 그룹은, 좋기로는 2개 이상의 연속적 구아닌으로 이루어지는 그룹을 4 이상, 5 이상 또는 6 이상 포함한다.
또는, 상기 구아닌들로 이루어지는 하나 이상의 그룹은, 좋기로는 2개 이상의 연속적 구아닌으로 이루어지는 그룹을 1 이상 및 3개 이상의 연속적 구아닌으로 이루어지는 그룹을 2 이상 포함한다.
또는, 상기 구아닌들로 이루어지는 하나 이상의 그룹은, 좋기로는 3개 이상의 연속적 구아닌으로 이루어지는 그룹을 1 이상 및 2개 이상의 연속적 구아닌으로 이루어지는 그룹을 2 이상 포함한다.
또는, 상기 구아닌들로 이루어지는 하나 이상의 그룹은, 좋기로는 2개 이상의 연속적 구아닌으로 이루어지는 그룹을 1 이상, 3개 이상의 연속적 구아닌으로 이루어지는 그룹을 1 이상 및/또는 6개 이상의 연속적 구아닌으로 이루어지는 그룹을 1 이상 포함한다.
일반적으로, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 표적 서열에 완전히 상보적이고, 좋기로는, 연속적 구아닌으로 이루어지는 그룹은 서로 연속적일 수 있으므로, 예컨대 2개의 연속적 구아닌으로 이루어지는 3개의 그룹은 6개의 연속적 구아닌으로 이루어지는 하나의 그룹이다. 또는, 연속적 구아닌으로 이루어지는 그룹들은 하나 이상의 뉴클레오타이드에 의하여 공간적으로 떨어질 수 있다.
일반적으로, 본 발명에 따른 2개 이상의 연속적 구아닌으로 이루어지는 하나 이상의 그룹은 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단 근처에 위치하거나, 그 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단 근처에, 또는 그 올리고뉴클레오타이드 서열의 중앙에 위치할 수 있다.
본 발명의 양호한 구현예에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는, 좋기로는 짧은 아미노산 서열인 캐리어 서열과, 좋기로는 그 3' 및/또는 5' 말단에서 연결된다.
상기 짧은 아미노산 서열 (캐리어)는 좋기로는 1개 내지 30개 범위의, 좋기로는 1개 내지 10개, 더욱 좋기로는 1개 내지 7개 범위의 다수의 아미노산으로 이루어진다. 상기 아미노산들은 L 또는 D형일 수 있고, 좋기로는 D형일 수 있다.
본 발명의 목적상 양호한 캐리어들은 SEQ ID NO: 47 (PKKKRKV); SEQ ID NO: 48 (VKRKKKP); SEQ ID NO: 49 (KKKKKK); SEQ ID NO: 50 (PKRKRKV); SEQ ID NO: 51 (KRKRKRK); SEQ ID NO: 52 (KKKRKV); SEQ ID NO: 53 (PKKKRK); SEQ ID NO: 54 (KKKRK); SEQ ID NO: 55 (RRRR) 및 SEQ ID NO: 56 (PKKKRKVHHHHH)로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 목적상 특히 양호한 캐리어는 SEQ ID NO: 47을 갖는 펩타이드이다.
본 발명의 문맥상, "캐리어"는 올리고뉴클레오타이드의 약동학 및/도는 약력학 프로파일 및/또는 세포 침투 및/또는 핵 침투를 양호하게 변형할 수 있는 펩타이드를 의미한다.
본 발명의 문맥상, "유전자 발현을 조절한다는 것"은 유전자 발현을 억제 또는 활성화 (증가)시킴을 의미한다. 상기 유전자 발현의 억제 또는 활성화 (증가)는 전사 또는 번역 수준에서 일어날 수 있다.
유전자 발현의 억제 또는 활성화는 항유전자 메커니즘 (또는 항유전자 올리고뉴클레오타이드, 즉 그 유전자의 안티센스 가닥을 겨냥한, 다시 말해 항유전자 전략)을 이용하여 작용하는 올리고뉴클레오타이드라는 수단에 의하여 전사 수준에서 이루어질 수 있다.
또는, 유전자 발현의 억제는 안티센스 메커니즘 (또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 즉 메신저를 겨냥한, 다시 말해 안티센스 전략)을 통하여 작용하는 올리고뉴클레오타이드를 이용한 번역 수준에서 이루어질 수 있는 반면, 번역 수준에서의 발현의 증가는 그 메신저 RNA를 분해하는 마이크로RNA를 억제함으로써 달성될 수 있다.
본원의 출원인에 의하여 밝혀지고 전술된, 유전자 발현을 효과적으로 조절하기 위하여 올리고뉴클레오타이드가 충족시켜야만 하는 파라미터 또는 법칙 또는 전제 조건은 그것이 무엇이든 임의의 유전자에 대하여 유효하고, 따라서, 예컨대 유전적 및/또는 바이러스 기원의 질병의 원인이 되는 유전자(들) 또는 종양 병리의 개시와 관련된 유전자들의 발현을 조절할 수 있는 올리고뉴클레오타이드의 서열을 동정하려는 목적으로 적용될 수 있다.
따라서, 동정된 올리고뉴클레오타이드는, 좋기로는 특정 유전적, 바이러스 또는 종양 질병의 치료를 위한 치료적 접근법에 있어서 약물로 사용될 수 있다.
또는, 상기 올리고뉴클레오타이드는 진단 목적으로 사용될 수 있다.
사실, 본 발명의 대상물은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 치료 및/또는 진단 목적을 위한 용도에 대한 것이기도 하며, 상기 올리고뉴클레오타이드는 화학적으로 변형된 것일 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 6-30개, 좋기로는 12-24개 잔기 (뉴클레오타이드 또는 모노머)로 이루어지는 짧은 올리고뉴클레오타이드이다. 상기 올리고뉴클레오타이드는 천연 핵산 염기, 예컨대 DNA 또는 RNA, 또는 합성 핵산 염기, 예컨대 PNA, LNA 또는 모폴리노로 이루어질 수 있다. 또는, 상기 올리고뉴클레오타이드는 DNA, RNA 및/또는 합성 핵산, 좋기로는 PNA 또는 LNA (혼성 또는 키메라 올리고뉴클레오타이드)의 조합을 포함할 수 있다. 게다가, 상기 올리고뉴클레오타이드는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다.
본 발명의 몇 가지 구현예에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는, 예컨대 그들의 치료 및/또는 진단 효과를 향상시키려는 목적으로 화학적으로 변형될 수 있다.
본 발명의 양호한 구현예에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 그 알파 위치의 탄소 (C알파(α))가 통상적인 글리신의 수소 원자 이외의 치환체에 결합된 백본을 갖는 PNA 분자일 수 있다. 예컨대, 글리신의 측쇄를 대신하여, 천연원 또는 합성원의 다른 아미노산의 측쇄가 사용될 수 있는데, 좋기로는 아르기닌, 리신, 히스티딘, 류신, 이소류신, 타이로신, 아스파라긴, 세린, 트레오닌, 글루타민, 발린, 알라닌, 시스테인, 메티오닌, 페닐알라닌, 글루타메이트, 아스파테이트, 프롤린, 트립토판 및 오르니틴으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 상기 아미노산은 우회전성 형태 (D) 또는 좌회전성 형태 (L)일 수 있다.
본 발명의 다른 양호한 구현예에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 상호 상보적인 단일-가닥 또는 이중-가닥 RNA 분자이다 (상호 상보적인 이중-가닥 RNA 분자를 siRNA로 정의하는데, "작은 간섭 RNA"의 두문자이다).
몇 가지 구현예에 있어서, 상기 "작은 간섭 RNA"는 RNA 모노머 (리보뉴클레오타이드) 및 리보오스 2' 위치에서 변형된 모노머, 좋기로는 2'-O-메토시에틸, 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 모노머를 하나 이상 포함하고; 또는 상기 "작은 간섭 RNA"는 RNA 모노머 (리보뉴클레오타이드) 및 합성 핵산, 좋기로는 LNA, 메틸포스포네이트 LNA, BNA (가교 핵산), UNA (비잠금 핵산), ENA (에틸렌-가교 핵산), ANA (아라비노오스 핵산) 및 F-ANA (플루오로-아라비노시드 핵산)으로부터 선택되는 것인 합성 핵산으로 이루어진 모노머를 하나 이상 포함한다.
양호한 구현예에 있어서, 상기 "작은 간섭 RNA"는 그 상보적인 이중 가닥들의 말단에서, 그 두 가닥 중 어느 하나만이 하나 이상의, 좋기로는 2 이상의 돌출된, 즉 쌍을 이루지 않은 천연 또는 합성 핵산의 모노머를 갖는 방식으로 설계된다. 다른 구현예에 있어서, 돌출된 천연 또는 합성 핵산은, 2'-O-메톡시에틸, 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 모노머 또는 LNA, 메틸포스포네이트 LNA, BNA, UNA (비잠금 핵산), ENA (에틸렌-가교 핵산), ANA (아라비노오스 핵산) 및 F-ANA (플루오로-아라비노시드 핵산)의 모노머로부터 선택된다.
또 다른 구현예에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 RNA 모노머 (리보뉴클레오타이드) 및 LNA 모노머를 포함하는, 혼성 또는 키메라인 것이고, 좋기로는 단일-가닥 또는 이중-가닥으로 정의된다 (이 뉴클레오타이드는 RNA/LNA로 나타낸다).
또는, 상기 혼성 올리고뉴클레오타이드는 RNA 모노머 (리보뉴클레오타이드) 및 2'-O-메토시에틸 (MOE) 모노머, 2'-O-메틸 모노머 및 2'-플루오로 모노머로부터 선택되는 RNA 모노머를 하나 이상 포함하거나; 또는 상기 혼성 올리고뉴클레오타이드는 RNA 모노머 (리보뉴클레오타이드) 및 합성 핵산, 좋기로는 LNA, 메틸포스포네이트 LNA, UNA (비잠금 핵산), BNA, ENA (에틸렌-가교 핵산), ANA (아라비노오스 핵산) 및 F-ANA (플루오로-아라비노시드 핵산)로부터 선택되는 합성 핵산의 모노머를 하나 이상 포함한다.
또 다른 구현예에 있어서, 단일-가닥 또는 이중-가닥 RNA에 기초한 상기 올리고뉴클레오타이드는 고전적인 리보뉴클레오타이드 (즉, 화학적으로 변형되지 않은 것) 및 포스포디에스테르 결합 수준에서 변형된 리보뉴클레오타이드 또는 디옥시리보뉴클레오타이드, 예컨대 포스포로티오에이트 결합, 또는 DNG (디옥시리보뉴클레익 구아니딘), RNG (리보뉴클레익 구아니딘), GNA (글리세롤 핵산), G-PNA (감마-PNA) 또는 PMO (모폴리노)을 이용하여 변형된 리보뉴클레오타이드 또는 디옥시리보뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
본 발명의 양호한 구현예에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 DNA 모노머 (디옥시리보뉴클레오타이드) 및 LNA 모노머를 포함하는 키메라 단일-가닥 서열이다.
항유전자 전략을 위하여, 이것은 전사 수준에서 유전자의 발현을 조절하는 것을 의미하는데, 좋기로는 하기의 것들을 이용할 수 있다:
- PNA계 올리고뉴클레오타이드, 필요에 따라, 좋기로는 3' 말단 및/또는 5'에서 캐리어 (일반적으로 1 내지 30개 잔기로 이루어짐)와 연결되는 것; 또는
- PNA계 올리고뉴클레오타이드, 이 PNA는 일반적으로 여겨지는 글리신의 H 원자 이외의 치환체를 포함하는 백본의 알파 탄소 (C-알파)를 하나 이상 포함하는 것; 또는
- RNA 모노머 (고전적인 리보뉴클레오타이드) 및 필요에 따라 변형 뉴클레오타이드 (모노머)(예컨대, 2'-O-메틸 RNA 모노머 및 2'-플루오로 RNA 모노머)를 하나 이상, 또는 LNA, 메틸포스포네이트 LNA, BNA, UNA, GNA, ANA, FANA, ENA, DNG 및 RNG로부터 선택되는 핵산의 모노머, 또는 포스포디에스테르 결합 수준에서 변형된 리보뉴클레오타이드를 하나 이상 포함하는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드; 또는
- 상호 상보적인 이중-가닥 RNA계 올리고뉴클레오타이드 (siRNA); 또는
- RNA 모노머 (고전적인 리보뉴클레오타이드) 및 LNA 모노머를 하나 이상 포함하는 부분적으로 상보적인 이중-가닥 키메라 올리고뉴클레오타이드; 또는
- RNA 모노머 (고전적인 리보뉴클레오타이드) 및 2'-O-(2-메톡시에틸) RNA 모노머를 하나 이상 포함하는 이중-가닥 키메라 올리고뉴클레오타이드; 또는
- DNA 모노머 (고전적인 디옥시리보뉴클레오타이드) 및 LNA 모노머를 하나 이상 포함하는 단일-가닥 키메라 올리고뉴클레오타이드; 또는
- DNA 모노머 (고전적인 디옥시리보뉴클레오타이드) 및 2'-플루오로 RNA 모노머를 하나 이상, 또는 LNA, 메틸포스포네이트 LNA, BNA, UNA, GNA, ENA, ANA, FANA, DNG 및 RNG로부터 선택되는 핵산의 모노머를 하나 이상 포함하는 올리고뉴클레오타이드.
안티센스 전략을 위하여, 이것은 번역 수준에서 유전자의 발현을 조절하는 것을 의미하는데, 좋기로는 하기의 것들을 이용할 수 있다:
- RNA 모노머 (고전적인 리보뉴클레오타이드)를 포함하는 상호 상보적인 이중-가닥 올리고뉴클레오타이드 (siRNA); 또는
- RNA 모노머 (고전적인 리보뉴클레오타이드) 및 리보오스 수준 및/또는 포스포디에스테르 결합의 수준에서 변형된 RNA 모노머를 하나 이상 포함하는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드; 또는
- DNA 모노머 (고전적인 디옥시리보뉴클레오타이드) 및 포스포로티오에이트 DNA 모노머를 하나 이상 포함하는 단일-가닥 키메라 올리고뉴클레오타이드; 또는
- RNA 모노머 (고전적인 리보뉴클레오타이드) 및 2'-O-(2-메톡시에틸) RNA 모노머를 하나 이상 포함하는 이중-가닥 키메라 올리고뉴클레오타이드; 또는
- RNA 모노머 (고전적인 리보뉴클레오타이드) 및 2'-O-메틸레이트 RNA 모노머를 하나 이상 포함하는 이중-가닥 키메라 올리고뉴클레오타이드; 또는
- RNA 모노머 (고전적인 리보뉴클레오타이드) 및 2'-플루오로 RNA 모노머를 하나 이상 포함하는 이중-가닥 키메라 올리고뉴클레오타이드; 또는
- RNA 모노머 (고전적인 리보뉴클레오타이드) 및 LNA 모노머를 하나 이상 포함하는 이중-가닥 키메라 올리고뉴클레오타이드; 또는
- RNA 모노머 (고전적인 리보뉴클레오타이드) 및 아라비노시드 RNA 모노머를 하나 이상 포함하는 이중-가닥 키메라 올리고뉴클레오타이드; 또는
- DNA 모노머 (고전적인 디옥시리보뉴클레오타이드) 및 LNA 모노머를 하나 이상 포함하는 단일-가닥 키메라 올리고뉴클레오타이드; 또는
- 모폴리노 모노머를 포함하는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드; 또는
- PNA계 올리고뉴클레오타이드로서, 상기 PNA는 일반적으로 여겨지는 글리신의 H 원자 이외의 치환체를 포함하는 백본의 알파 탄소 (C-알파)를 하나 이상 포함하는 것이고; 좋기로는 상기 치환체는 아르기닌 또는 리신의 측쇄인 것; 또는
- DNA 모노머 (고전적인 디옥시리보뉴클레오타이드) 및 PNA, LNA, LNA 메틸포스포네이트, BNA, UNA, GNA, ENA, DNG 및 RNG로부터 선택되는 핵산의 모노머를 하나 이상 포함하는 올리고뉴클레오타이드.
좋기로는, 본 발명의 상기 올리고뉴클레오타이드는 유전적 및/또는 바이러스 기원 또는 종양 질병의 발병과 관련된 유전자를 겨냥한 것이다. 상기 유전자는 좋기로는 MYC 패밀리의 유전자 (좋기로는, MYC, MYCN, MYCL1), 서바이빈 유전자 (BIRC5), BCL2, PLK4, ALK, PKM2, 카스파아제-8 및 RASSF1로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
특히, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 MYC 패밀리의 유전자들, 좋기로는 MYCN을 겨냥한 것이다.
상기 올리고뉴클레오타이드는 좋기로는 SEQ ID NO: 2-15, 66-84, SEQ ID NO: 24, 25, 31 및 32, SEQ ID NO: 26 및 57를 포함하는 상보적 올리고뉴클레오타이드 쌍, SEQ ID NO: 27 및 58을 포함하는 상보적 올리고뉴클레오타이드 쌍, SEQ ID NO: 28 및 59를 포함하는 상보적 올리고뉴클레오타이드 쌍, SEQ ID NO: 29 및 60을 포함하는 상보적 올리고뉴클레오타이드 쌍, SEQ ID NO: 30 및 61을 포함하는 상보적 올리고뉴클레오타이드 쌍, SEQ ID NO: 33 및 62를 포함하는 상보적 올리고뉴클레오타이드 쌍, SEQ ID NO: 34 및 63을 포함하는 상보적 올리고뉴클레오타이드 쌍, SEQ ID NO: 35 및 64를 포함하는 상보적 올리고뉴클레오타이드 쌍 및 SEQ ID NO: 36 및 65를 포함하는 상보적 올리고뉴클레오타이드 쌍으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
몇 가지 구현예에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 PNA 올리고뉴클레오타이드, 좋기로는 상기 PNA는 MYCN을 겨냥한 것이다.
양호한 구현예에 있어서, 상기 PNA는 SEQ ID NO: 2-15로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
또 다른 양호한 구현예에 있어서, 상기 PNA는 SEQ ID NO: 66-84로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
또 다른 양호한 구현예에 있어서, 상기 PNA는 SEQ ID NO: 2-15, 66-84로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
좋기로는, 상기 PNA 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 2-13로 이루어지는 군으로부터 선택, 더욱 좋기로는 SEQ ID NO: 2-8, 더더욱 좋기로는 SEQ ID NO: 2-6로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 본 발명의 목적상 특히 양호한 PNA 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 5이다.
좋기로는, SEQ ID NO: 5는 5' 또는 3' 말단에서 SEQ ID NO: 47과 연결된다. 더욱 좋기로는 SEQ ID NO: 47은 D형 아미노산으로 이루어진다.
PNAs SEQ ID NO: 2-15은 좋기로는 MYCN을 겨냥하고, 더욱 좋기로는 항유전자 전략으로 MYCN의 발현을 조절한다.
PNAs SEQ ID NO: 66-69 또한 좋기로는 MYCN을 겨냥하고, 더욱 좋기로는, 항유전자 전략으로 MYCN의 발현을 조절한다.
PNAs SEQ ID NO: 70-74는 좋기로는 MYC를 겨냥하고, 더욱 좋기로는 항유전자 전략으로 MYC의 발현을 조절한다.
PNAs SEQ ID NO: 75, 76은 좋기로는 BIRC5를 겨냥하고, 더욱 좋기로는 항유전자 전략으로 BIRC5의 발현을 조절한다.
PNAs SEQ ID NO: 77-79는 좋기로는 ALK를 겨냥하고, 더욱 좋기로는 항유전자 전략으로 ALK의 발현을 조절한다.
PNAs SEQ ID NO: 80-82는 좋기로는 BCL2를 겨냥하고, 더욱 좋기로는 항유전자 전략으로 BCL2의 발현을 조절한다.
PNAs SEQ ID NO: 83, 84는 좋기로는 PLK4를 겨냥하고, 더욱 좋기로는 항유전자 전략으로 PLK4의 발현을 조절한다.
또 다른 구현예에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 이중-가닥이고, 좋기로는 RNA 모노머를 포함한다. 좋기로는, 상기 올리고뉴클레오타이드는 MYCN을 겨냥한다.
또는, 상기 이중-가닥 RNA 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 26 및 57을 포함하는 상보적 올리고뉴클레오타이드 쌍, SEQ ID NO: 27 및 58을 포함하는 상보적 올리고뉴클레오타이드 쌍, SEQ ID NO: 28 및 59를 포함하는 상보적 올리고뉴클레오타이드 쌍, SEQ ID NO: 29 및 60을 포함하는 상보적 올리고뉴클레오타이드 쌍 및 SEQ ID NO: 30 및 61을 포함하는 상보적 올리고뉴클레오타이드 쌍으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
상기 올리고뉴클레오타이드들은 좋기로는 MYCN을 겨냥한다.
더욱 좋기로는, 이들은 안티센스 전략을 통하여 그 유전자의 발현을 조절한다.
또 다른 구현예에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 DNA-LNA 키메라 올리고뉴클레오타이드이고, 좋기로는 상기 올리고뉴클레오타이드는 MYCN을 겨냥한다.
양호한 구현예에 있어서, 상기 DNA-LNA 키메라 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 24 및 25로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
SEQ ID NO: 24 및 25는 좋기로는 MYCN 유전자를 겨냥한다.
SEQ ID NO: 24 및 25는 좋기로는 항유전자 전략을 통하여 그 유전자의 발현을 조절한다.
또 다른 구현예에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 DNA 모노머 및/또는 포스포로티오에이트 DNA 모노머를 하나 이상 포함하는 단일-가닥 키메라 올리고뉴클레오타이드이다. 상기 올리고뉴클레오타이드는 좋기로는 MYCN을 겨냥한다.
본 발명의 목적상 특히 양호한 것은 SEQ ID NO: 31 및 32로 이루어지는 군으로부터 선택되는 키메라 올리고뉴클레오타이드이다. SEQ ID NO: 31 및 32는 좋기로는 MYCN 유전자를 겨냥한다. SEQ ID NO: 31 및 32는, 좋기로는, 안티센스 전략을 통하여 MYCN의 발현을 조절한다.
또 다른 구현예에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 RNA 모노머 및 좋기로는 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-메틸 RNA의 모노머를 하나 이상 포함하는 이중-가닥 키메라 올리고뉴클레오타이드이다.
상기 올리고뉴클레오타이드는 좋기로는 MYCN을 겨냥한다.
본 발명의 목적상 특히 양호한 것은 SEQ ID NO: 33 및 62를 포함하는 상보적 키메라 올리고뉴클레오타이드 쌍이다. 상기 올리고뉴클레오타이드 쌍은 좋기로는 안티센스 메커니즘을 통하여 그 유전자의 발현을 조절한다.
또 다른 구현예에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 RNA 모노머 및 좋기로는 2'-플루오로 RNA의 모노머를 하나 이상 포함하는 이중-가닥 키메라 올리고뉴클레오타이드이다.
좋기로는, 상기 올리고뉴클레오타이드는 MYCN을 겨냥한다.
본 발명의 목적상 특히 양호한 것은 SEQ ID NO: 34 및 63을 포함하는 상보적 키메라 올리고뉴클레오타이드의 쌍이다. 상기 올리고뉴클레오타이드 쌍은 좋기로는 안티센스 메커니즘을 통하여 그 유전자의 발현을 조절한다.
또 다른 구현예에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 RNA 모노머 및 LNA 모노머를 하나 이상 포함하는 이중-가닥 키메라 올리고뉴클레오타이드이다.
상기 올리고뉴클레오타이드는 좋기로는 MYCN을 겨냥한다.
본 발명의 목적상 특히 양호한 것은 SEQ ID NO: 35 및 64를 포함하는 상보적 키메라 올리고뉴클레오타이드의 쌍이다. 상기 올리고뉴클레오타이드 쌍은 좋기로는 안티센스 메커니즘을 통하여 그 유전자의 발현을 조절한다.
또 다른 구현예에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 RNA 모노머 및 아라비노시드 RNA 모노머를 하나 이상 포함하는 이중-가닥 키메라 올리고뉴클레오타이드이다.
좋기로는 상기 올리고뉴클레오타이드는 MYCN을 겨냥한다.
본 발명의 목적상 특히 양호한 것은 SEQ ID NO: 36 및 65를 포함하는 상보적 키메라 올리고뉴클레오타이드의 쌍이다. 상기 올리고뉴클레오타이드 쌍은 좋기로는 안티센스 메커니즘을 통하여 그 유전자의 발현을 조절한다.
본 발명의 또 다른 측면은 전술한 올리고뉴클레오타이드의 치료 및/또는 진단 목적을 위한 용도에 관한 것이다.
특히, 상기 올리고뉴클레오타이드는 유전적 및/또는 바이러스 기원의 질병 치료를 위하여, 특히 유전자의 과발현 또는 억제로 인하여 야기되는 유전적 질병, 즉 과발현되거나 억제된 유전자의 발현 조절이 요구되는 유전적 질병의 치료를 위하여 개별적으로 또는 함께 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 유전적 질병, 좋기로는 골린 증후군, 다운 증후군, 페인골드 증후군, 히르슈슈프룽병, 폰 히펠 린다우 증후군, 모세혈관확장성운동실조증, 리-프라우메니증후군, 투르콧 증후군, 가족성 종양 및 파킨슨병으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질병의 치료를 위하여 사용된다.
또한, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 어린이 또는 성인의 종양 병리 치료를 위하여 사용된다. 특히, 상기 종양은 좋기로는 MYC, MYCN, MYCL1, 서바이빈 (BIRC5), BCL2, PLK4, ALK 및 PKM2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자 또는 발암 유전자의 과발현에 의하여 야기되는 것으로 알려지고 있다. 또는, 종양은, 좋기로는 카스파아제-8 및 RASSF1으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 발암-억제 또는 항-종양 유전자의 억제 (불활성화)에 의하여 야기된다. 상기 종양은 좋기로는 신경모세포종, 망막모세포종, 수모세포종, 상의세포종, 갈색 세포종, 배아 종양, 생식 세포 종양, 폐포 횡문근육종, 배아 횡문근육종, 윌름스 종양, 신장의 투명 세포 육종, 활막 육종, 간 모세포종, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 급성 림프아세포성 백혈병, 만성 림프아세포성 백혈병, 버킷 림프종, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 거핵아구성 백혈병, B 만성 림프구성 백혈병, T-세포 백혈병, 림프종, 소세포 폐암 (microcytoma), 폐 선암종, 편평 세포 폐암, 전형적 및 비정형 원발성 폐암, 대 세포 폐 암종, 대 세포 폐암 신경 내분비 암, 교아세포종, 간암, 기저 세포 암종, 난소 종양, 유방 종양 및 대장암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것으로 본다.
본 발명의 목적상 특히 양호한 것은 신경모세포종, 망막모세포종, 횡문근육종, 윌름스 종양, 수모세포종, 소세포 폐암 및 기저 세포 암종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 종양이다.
또한, 본 발명의 대상물은 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 1종 이상과 약학적으로 허용되는 첨가제 1종 이상을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 좋기로는, 상기 1종 이상의 올리고뉴클레오타이드는 PNA, SEQ ID NO: 2-15, 66-84, 좋기로는 SEQ ID NO: 2-13, 더욱 좋기로는 SEQ ID NO: 2-8, 더더욱 좋기로는 SEQ ID NO: 2-6로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 좋다. 특히 양호한 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 5이다. 좋기로는, SEQ ID NO: 5는 5' 또는 3' 말단에서 SEQ ID NO: 47과 연결된다. 더욱 좋기로는 SEQ ID NO: 47은 D형 아미노산으로 이루어진다.
상기 PNA는 좋기로는 그 5' 또는 3' 말단에서, 좋기로는 SEQ ID NO: 47-56로 이루어지는 군으로부터 선택되는 캐리어와 연결된다.
또한, 본 발명의 대상물은 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 1종 이상, 예컨대, SEQ ID NO: 1을 갖는 올리고뉴클레오타이드, 화합물 1종 이상, 좋기로는 약리학적 효과를 갖는 화합물 1종 이상, 더욱 좋기로는 화학치료 제제 1종 이상 및 필요에 따라 약학적으로 허용되는 첨가제 1종 이상을 포함하는 배합물에 관한 것이다.
양호한 구현예에 있어서, 상기 1종 이상의 화합물은 1종 이상의 추가적인 항유전자 및/또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 또는 1종 이상의 약리학적 제제, 또는 1종 이상의 생물학적 또는 생물공학적 기원의 또는 화학 합성으로부터 유도되는 화합물 또는 이들의 조합이다. 상기 생물학적 또는 생물공학적 기원의 또는 화학 합성으로부터 유도되는 화합물은, 좋기로는 모노클로날 항체, 화학치료 제제, 면역 조절 제제, 성장 인자, 사이토카인, 펩타이드, 신생혈관형성 억제제, 종양 성장 억제제, 스테로이드 호르몬 및/또는 비-스테로이드 호르몬 및 비타민으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 목적상 특히 양호한 화합물들의 예시는 신경 성장 인자 (NGF), 소마토스타틴 (somatostatin), 레티노산, 악티노마이신 D, 아스파라기나제, 블레오 마이신, 부술판 카페시타빈, 카보플라틴, 사이클로포스파미드, 사이클로스포린, 시스플라틴, 시타라빈, 클로람부실, 다카바진, 다우노루비신, 도세탁셀, 독소루비신 하이드로클로라이드, 에피루비신 하이드로클로라이드, 에토포시드, 플루다라빈 포스페이트, 플루오로우라실, 젬시타빈, 이다루비신 하이드로클로라이드, 수산화우레아, 이포포스파마이드, 이리노테칸 하이드로클로라이드, 멜팔란, 머캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미토마이신, 미톡산트론, 뉴틀린, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 프로카바진, 랄티트렉세드, 스트렙토조신, 테가푸르-우라실, 테모졸로마이드, 티오구아닌, 티오테페, 토포테칸, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신 및 비노렐빈 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
더욱 좋기로는, 상기 화합물들은 카보플라틴, 시스플라틴, 에토포시드, 빈크리스틴, 사이클로포스파미드 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
본원의 출원인은 본 발명에 따른 1종 이상의 올리고뉴클레오타이드를 1종 이상의 화합물, 좋기로는 전술한 1종 이상의 화학치료 제제와 함께 투여하는 것이 상기 투여되는 화합물의 농도를 낮추는 것을 가능하게 하지만 동시에 치료 효과에 있어서의 증진 및 낮은 독성을 보장한다는 것을 발견하였다.
이러한 조건하에서, 본원의 출원인은 상기 화합물 농도의 저감이 특정한 병리에 의존하고; 특히 화학치료 화합물의 농도는 종양 유형에 의존한다는 것을 발견하였다.
몇 가지 종양에 대하여, 예컨대: 신경모세포종, 망막모세포종, 수모세포종, 소세포 폐암, 윌름스 종양, 폐포 횡문근육종 및 배아 횡문근육종에 대하여는, 본 발명에 따른 1종 이상의 올리고뉴클레오타이드와 조합하여 투여되는 상기 1종 이상의 화학치료 제제의 농도는 10 배까지 감소될 수 있으면서도 화학치료 제제의 일반적인 투여량과 동일한 치료 효과를 보장한다.
약학적 조합으로서 특히 효과적인 것은 (치료 효과 개선 관점에 있어서) 본 발명에 따른 1종 이상의 PNA와, 좋기로는 SEQ ID NO: 1-15, 66-84, 좋기로는 SEQ ID NO: 1-13, 더욱 좋기로는 SEQ ID NO: 1-8, 더욱 좋기로는 SEQ ID NO: 1-6, 더더욱 좋기로는 SEQ ID NO: 1 및/또는 5로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 PNA와, 1종 이상의 화합물, 좋기로는 화학치료 제제, 더욱 좋기로는 에토포사이드 (VP16), 카보플라틴, 시스플라틴 또는 빈크리스틴, 사이클로포스파미드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것들의 조합이다.
본 발명의 목적상 특히 양호한 것은 SEQ ID NO: 1과 카보플라틴, 또는 에토포사이드 또는 시스플라틴 또는 빈크리스틴; 또는 SEQ ID NO: 5와 카보플라틴 또는 에토포사이드 또는 시스플라틴 또는 빈크리스틴으로부터 선택되는 조합이다.
좋기로는, 상기 PNA는 그 3' 및/또는 5' 말단에서 캐리어와 연결되는데, 상기 캐리어는 SEQ ID NO: 47-56으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 좋다.
개선 효과는, 좋기로는 상기 조합이 동시에 투여되는 경우 및 상기 1종 이상의 화합물이 연속적인 회차로 투여되는 경우, 좋기로는 인터벌로, 더욱 좋기로는 3 시간, 6시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간 또는 72 시간의 일정한 인터벌로 연속적 회차로 투여되는 경우의 양자 모두에서 발견된다.
다른 양호한 구현예에 있어서, 본 발명의 1종 이상의 올리고뉴클레오타이드, 예컨대 SEQ ID NO: 1을 갖는 올리고뉴클레오타이드는, 좋기로는 1종 이상의 비히클 입자, 1종 이상의 비히클 폴리머 또는 1종 이상의 자기-조합 비히클 올리고뉴클레오타이드 (압타머라고도 알려짐)와 함께 결합되거나 복합체를 이루어 투여될 수 있다.
또 다른 양호한 구현예에 있어서, 본 발명의 1종 이상의 올리고뉴클레오타이드드, 예컨대 SEQ ID NO: 1을 갖는 올리고뉴클레오타이드는, 표적 조직에의 침투를 용이하게 하기 위하여 1종 이상의 리포좀 미셀, 1종 이상의 마이크로-입자 또는 1종 이상의 나노입자와 함께 결합되거나 복합체를 이루어 투여될 수 있다.
상기 입자, 보통 구형이고 특이적인 전달 수단으로서 사용되는 상기 입자는 많은 상이한 화학적 화합물과 함께 제제화될 수 있다. 예컨대, 상기 입자는 키토산, 히알루론산, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리에틸렌 이민 (PEI), 폴리락트산 (PLA), 폴리(락트산-코-글리콜 산) (PLGA), 하이드록시 아파타이트 (HAP), 폴리불포화 지방산, 포화 지방산, 양이온성 지질 , HAP-PLA, HAP-PLA/PGA 및 그들의 유도체 등의 폴리머 화합물들의 제제 또는 공-제제일 수 있다. 또 다른 양호한 구현예에 있어서, 본 발명의 1종 이상의 올리고뉴클레오타이드는, 좋기로는 전술한 유형의 1종 이상의 입자와 함께 결합되거나 복합체를 이루어 투여될 수 있고, 화학적 또는 생물공학적 기원의, 표적 세포의 특이적 수용체에 대한 1종 이상의 리간드 (예컨대, GD2, 폴린산, TRAIL, NGF) 또는 1종 이상의 리간드의 일부분은 아쥬방트로서 폴리머 막에 존재할 수 있으며, 본 발명의 상기 올리고뉴클레오타이드가 상기 표적 세포에서 내재화되는 것을 돕는데 유용하다.
또 다른 양호한 구현예에 있어서, 본 발명의 1종 이상의 올리고뉴클레오타이드는 표적 페포의 수용체에 특이적인 1종 이상의 리간드 (예컨대, GD2 (강글리오사이드 GD2), 폴린산, TRAIL (TNF-관련 세포자멸사-유도 리간드), NGF (신경 성장 인자)또는 리간드의 일부분과 결합될 수 있다.
또 다른 양호한 구현예에 있어서, 본 발명의 1종 이상의 올리고뉴클레오타이드, 예컨대 SEQ ID NO: 1을 갖는 올리고뉴클레오타이드는, 그 효과를 향상시키기 위하여, 좋기로는 표적 세포 및/또는 조직의 투과를 용이하게 하는 것에 의하여 1종 이상의 추가적인 의학적 응용법과 함께, 그 자체로 또는 조합하여 투여될 수 있다.
상기 의학적 응용법은, 좋기로는 산소 요법, 자기요법, 열요법, 전기자극, 초음파, 방사선요법, 화학요법 및 광선요법으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
실시예
1
올리고뉴클레오타이드의 화학적 합성
올리고뉴클레오타이드의 화학적 합성은 보호기, 5'-OH에 4,4'-디메톡시트리틸 (DMTr) 및 3'-포스페이트기에 β-시아노에틸로 변형된 DNA 뉴클레오시드 포스포로아미다이트를 이용하는 것에 기초하고 있으며; 보호기는 또한 1차 아민 (뉴클레오염기 헤테로사이클)에 대하여도 사용되는데, 그렇지 않으면 이들은 지나치게 반응성이다.
DNA 올리고뉴클레오타이드의 화학적 합성은 3'-5' 방향으로 일어난다. 첫번째 뉴클레오타이드 염기로 관능화된 CPG (controlled pore glass의 약어) 레진이나 폴리스티렌 기질을 사용한다. 합성은 디클로로메탄 (DCM) 중의 3% 트리클로로아세트산 (TCA) 용액을 사용하여 5'-디메톡시트리틸기를 탈보호화하는 단계로 시작한다. 이에 뒤이어 에킬티오테트라졸 (ETT) 또는 벤질티오테트라졸 (BTT)를 이용한 활성화가 뒤따르고, 0.3 M의 서열에 삽입될 두번째 염기에 해당하는 포스포로아미다이트가 그 후 미리 탈보호화된 5'OH와 커플링됨으로써 포스포디에스테르 결합을 형성한다.
다음 단계는 "캡핑"인데, 이것은 반응하지 않은 5'OH기를 아세틸화하는 기능을 한다. 캡핑은 2 가지 용액을 이용하여 수행되는데, 하나는 테트라하이드로퓨란 (THF)/루티딘/아세트산무수물 (8:1:1)을 함유하고 다른 하나는 THF 중 메틸이미다졸 10% 용액을 함유한다. 포스파이트 트리에스테르의 불안정한 3가 결합은 그들을 5가의 포스포디에스테르로 산화시키는 TFH/피리딘 용액 중의 요오드에 의하여 안정화된다.
산화 후, 도입되는 제2 단위 등등의 탈트리틸화로 시작하여 상기 사이클이 반복된다.
이 사이클은 서열 내에 얼마나 많은 염기가 삽입되기를 원하는지에 따라 필요한 많은 횟수로 반복된다. 마지막으로, 실온에서 산 처리함으로써 마지막 5'-DMTr기가 제거된다.
염기상에 존재하는 보호기에 따라 (이는 차례로 선택된 염기의 화학, PTO, 2'OMe 등에 의존한다), 시아노에틸기의 β-제거에 의하여 인을 탈보호화하고 뉴클레오염기 헤테로사이클 상의 보호기를 제거하기 위하여 수산화암모늄을 이용하여 55℃에서 16 시간 방치하거나 수산화암모늄/메틸아민 (AMA) 용액을 이용하여 55℃에서 35 분간 방치할 수 있다.
또는, 5'-DMTr기는 최종 산물을 부산물로부터 더욱 순수하게 얻기 위하여 분석 (HPLC, MS) 및 제조 크로마토그래피 상 내내 유지되고 최종적으로 아세트산 처리로 제거될 수 있다.
RNA 올리고뉴클레오타이드의 화학적 합성은 리보오스 상에 존재하는 2'OH기와 그에 따른 각 포스포로아미다이트에 추가적인 보호기가 존재하므로 DNA 올리고뉴클레오타이드의 합성과는 상이하다.
결과적으로, RNA 올리고뉴클레오타이드의 합성은 더 긴 커플링 시간과 상기 기능기를 탈보호화하는 추가의 단계들을 요구한다.
화학적으로 변형된 모노머, 예컨대 포스포로티오에이트 (PTO), 2'O-메틸 (2'OMe), 2'플루오로 (2'-F), 아라비노시드 핵산 (ANA) 및 잠금 핵산 (LNA)를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 합성에도 전술한 것과 동일한 프로토콜이 사용된다.
각각의 변형된 염기를 위한 구체적인 기법의 상세는 그 모노머 분자를 구입한 제조사로부터 제공된다 (Link Technologies Ltd.).
모폴리노는 제조자로부터 구입하였다 (Gene Tools, LLC).
PNA 올리고뉴클레오타이드의 합성은 10 마이크로몰 규모로 수행되고, 정제 및 특성 규명 단계를 포함하였다.
상기 분자의 합성은 Rink Amide-Chemmatrix® 레진 및 Syro 자동 합성기 (MultiSynTech)를 이용하여 고상에서 수행되었다. 합성의 첫번째 모노머는 수동으로 상기 레진에 결합된다. 각 자동 합성 사이클은 3개의 단계로 나뉜다. 첫번째 단계는 DMF (디메틸포름아마이드) 중의 20% 피페리딘 용액을 이용하여 이루어지는 탈보호화이다.
두번째 단계는 들어오는 모노머와 성장 중인 사슬 사이의 커플링 반응이다. 이 반응은 NMP (N-메틸피롤리돈) 중의 0.22 M의 모노머 (FMOC-PNA-G(Bhoc)-OH, FMOC-PNA-A(Bhoc)-OH, FMOC-PNA-C(Bhoc)-OH, FMOC-PNA-T-OH) 5 당량 (eq) 및 DMF 중의 0.32 M의 활성화제 (이 경우 HATU) 4.5 당량을, DMF 중의 8% 2,6-루티딘과 DIPEA (N,N-디이소프로필에틸아민) 용액을 포함하는 알칼리 환경에서 첨가함으로써 수행된다. 펩타이드 사슬로부터 PNA로의 과정 중에, 상기 커플링 반응은 미리 로드된 레진 상의 첫번째 및 두번째 모노머 부착 부분에서 마지막 모노머 상에 2회 반복된다.
세번째 단계는 "캡핑" 반응으로, 이것은, 아세틸화에 의하여 상기 커플링 단계 중에 반응하지 않은 위치를 차단하는 역할을 한다. 상기 반응은 DMF 중의 6% 2,6-루티딘과 5% 아세트산무수물을 함유하는 용액을 이용하여 달성된다. 합성이 완료되면, 상기 분자들은 고체 기질로부터 제거된다.
이 반응은 4:1의 비율로 TFA (트리플루오로아세트산) 및 메타-크레졸로 이루어진 용액을 이용하여 이루어진다.
따라서, 얻어진 분자는 디에틸 에테르에서 침전시킴으로써 회수된다.
일단 물 안에 회복되면, HPLC로 정제된다. 정제에 사용되는 컬럼은 C18 300A 5u Jupiter (ⓒPhenomenex, Inc.)이다. 정제는 30 분 내에 100% A (물 95%; 아세토니트릴 5%; 0.1% TFA)- 0% B (물 60%; 아세토니트릴 40%; 0.1% TFA)로부터 60% A-40% B로의 선형 구배를 이용하여 수행된다. 사용된 완전 구배 (complete gradient)는 0-5 분 0% B; 5-35 분 40% B; 35-37 100% B; 37-42 100% B; 42-44 0%B이다.
마지막으로, 정제된 산물을 ESI 질량분석기 (ⓒ Waters)로 분석한다.
유전자 전사를 차단하기 위한 항유전자 올리고뉴클레오타이드
본 발명에서 개시하는 파라미터에 따라 선별되고 설계된 본 발명의 올리고뉴클레오타이드들이 유전자의 전사를 선택적으로 차단하는 기능을 하는지 입증하기 위한 목적으로, MYCN 유전자를 겨냥한 PNA계 올리고뉴클레오타이드를 설계 및 합성하였다: 이들을 표 1에 나타내었다.
표 1
세포막 투과가 용이한가의 목적으로, 상기 PNA 올리고뉴클레오타이드를 개별적으로 및 3' 및/또는 5'에서 캐리어와 결합시켜 두 가지 모두를 시험하였다. 특히, 상기 올리고뉴클레오타이드들을 3'에서 카복시 말단에 아미노산 서열 SEQ ID NO: 43과, 즉 프롤린-리신-리신-리신-아르기닌-리신-발린과 결합시켰다.
SEQ ID NO: 1을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 특허 EP 1618195의 대상인 서열이고 대조군 서열 및 비교를 위하여 사용된 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO: 2-15를 갖는 올리고뉴클레오타이드들은 2개의 연속적인 구아닌으로 이루어지는 하나의 그룹을 함유하거나 (SEQ ID NO: 14, 15), 3개의 연속적인 구아닌으로 이루어지는 하나의 그룹을 함유하거나 (SEQ ID NO: 13), 2개의 연속적인 구아닌으로 이루어지는 2개의 그룹을 함유하거나 (SEQ ID NO: 12), 2개의 구아닌으로 이루어지는 하나의 그룹과 3개의 연속적인 구아닌으로 이루어지는 하나의 그룹을 함유하거나 (SEQ ID NO: 11, 10, 9, 8 및 7), 2개의 연속적 구아닌으로 이루어지는 2개의 그룹과 3개의 연속적인 구아닌으로 이루어지는 하나의 그룹을 함유하거나 (SEQ ID NO: 6 및 4), 2개의 연속적인 구아닌으로 이루어지는 하나의 그룹과 3개의 연속적인 구아닌으로 이루어지는 2개의 그룹을 함유하거나 (SEQ ID NO: 5), 6개의 연속적인 구아닌으로 이루어지는 하나의 그룹을 함유하거나 (SEQ ID NO: 3), 6개의 연속적인 구아닌으로 이루어지는 하나의 그룹, 3개의 연속적인 구아닌으로 이루어지는 하나의 그룹 및 2개의 연속적인 구아닌으로 이루어지는 하나의 그룹을 함유한다.
연속적인 구아닌들로 이루어지는 그룹을 표 1에 밑줄로 나타내었다.
SEQ ID NO: 16-23을 갖는 올리고뉴클레오타이드들은 연속적인 구아닌으로 이루어지는 그룹을 포함하지 않으며, 음성 대조군이다.
게다가, 유전자의 전사를 선택적으로 조절할 목적으로, SEQ ID NO: 24-25를 갖는 올리고뉴클레오타이드 역시 설계되고 합성되었다; 이들을 표 2에 나타내었다.
표 2
특히, DNA 모노머 및 LNA 모노머를 포함하는 단일-가닥 키메라 올리고뉴클레오타이드들 (SEQ ID NO: 24 및 25)가 설계되고 합성되었다.
상기 올리고뉴클레오타이드 서열 중 DNA 염기들은 굵은 글자의 염기로 나타낸 반면, LNA 모노머들은 밑줄을 그었다. 각 키메라 올리고뉴클레오타이드 분자는 문헌에 보고된 바와 같이 (Koch T, Biochem J 2001, 354 (Pt 3):481-4; Koji Nagahama, Bioorg Med Chem Lett, 2009, 19(10):2707-9) 내인성 핵산분해효소에 의한 빠른 분해를 피하기 위하여 1, 2 또는 3개의 DNA 염기들로 공간적으로 떨어뜨린 LNA 모노머들을 삽입함으로써 설계 및 합성되었다.
유전자 번역을 차단하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드
본 발명에서 개시하는 파라미터에 따라 선별되고 설계된 본 발명의 올리고뉴클레오타이드들이 표적 유전자의 번역 선택적으로 차단하는 기능을 하는지 입증하기 위한 목적으로, MYCN 유전자를 겨냥한 SEQ ID NO: 26-36를 갖는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 설계 및 합성하였고 시험관 내에서 실험적으로 분석하였다: 이들을 표 3에 나타내었다.
표 3
표적 유전자, MYCN의 번역을 선택적으로 조절하기 위하여 RNA (작은 간섭 RNA (siRNA)(SEQ ID NO: 26-30))에 기반한 상보적 이중-가닥 올리고뉴클레오타이드를 제조하였다.
또한, 그 포스포디에스테르 결합이 포스포로티오에이트로 변형된 DNA SEQ ID NO: 31 및 32에 기초한 올리고뉴클레오타이드가 제조되었다.
RNA 모노머 및 모노머 2'O-메틸에 기초한 (SEQ ID NO: 33); RNA 모노머 및 2'-플루오로 모노머에 기초한 (SEQ ID NO: 34); RNA 모노머 및 LNA 모노머에 기초한 (SEQ ID NO: 35) 그리고 RNA 모노머 및 아라비노시드 RNA 모노머에 기초한 (SEQ ID NO: 36) 이중-가닥 키메라 올리고뉴클레오타이드들 또한 제조되었다. 올리고뉴클레오타이드 서열 SEQ ID NO: 33-36에서, 2'O-메틸, 2'-플루오로, LNA 및 아라비노시드 (ANA) 모노머들은 굵은 글자로 나타낸 반면, 2개 이상의 연속적인 구아닌으로 이루어진 각 그룹은 밑줄로 나타내었다.
상기 올리고뉴클레오타이드의 siRNA는 이중-가닥이기 때문에, 키메라는 3' 및 5' 양자 모두에, 상보적 가닥과 쌍을 이루지 않는 2개의 2'O-메틸 모노머, 2개의 2'-플루오로 모노머, 2개의 LNA 모노머 또는 2개의 RNA 아라비노시드 모노머를 남길 수 있는 방식으로 설계 및 합성되었고, 그로써 세포의 효소에 의한 빠른 분해를 회피한다.
올리고뉴클레오타이드를 이용한 처리 - QT-PCR
본 발명 올리고뉴클레오타이드의 표적 유전자의 발현을 조절하는 능력을 평가하기 위한 목적으로, 메신저 RNA의 양을 감소시키는 그들의 능력을 실시간 PCR 기법을 이용하여 분석하였다.
이 목적을 위하여, 24-웰 플레이트가 사용되었고, 플레이트는 웰당 0.3 ml의 OPTI-MEM (GIBCO BRL) 배지, 4% FBS 및 2mM L-글루타민과 함께 5.0x104 세포로 씨딩되었다 (3회 반복 실험).
세포가 웰의 바닥에 부착될 수 있도록 5% CO2를 함유하는 조건에서, 세포를 24 시간 동안 37℃에서 배양하였다.
PNA 올리고뉴클레오타이드를 제외한, 분석되는 각 올리고뉴클레오타이드를 0.3 mL의 세럼-무함유 OPTI-MEM (GIBCO BRL) 배지와 함께, 2 μl의 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)으로 사전 배양하였다.
각 웰에서, 각 올리고뉴클레오타이드들을 다음과 같은 최종 농도로 분석하였다:
- 안티센스 올리고뉴클레오타이드 siRNA 및 siRNA 갭머 (즉, 그 3' 또는 5' 말단에서 화학적으로 변형된 핵산의 모노머를 하나 이상 함유하지만, 중앙 부분에서는 변형되지 않거나 또는 포스포디에스테르 결합의 수준에서 포스포로티오에이트 결합으로 변형된 것인 올리고뉴클레오타이드)는 200 nM로 사용;
- 포스포로티오에이트 DNA 모노머를 함유하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, RNA 항유전자 올리고뉴클레오타이드 (agRNA) 및 DNA 모노머 및 LNA 모노머를 함유하는 올리고뉴클레오타이드는 10 μM로 사용;
- 모폴리노 올리고뉴클레오타이드는 1 μM의 농도로 사용, 및
- PNA 올리고뉴클레오타이드는 1 μM의 농도로 투여.
세포를 상기 올리고뉴클레오타이드로 처리하고, 그 투여 6 시간 후 FBS를 4%까지 첨가하였다. 24 시간 후, 총RNA를 각 웰로부터 추출하여 RNeasy Mini Kit (QIAGEN)를 이용하여 정제하였다.
MYCN 발현과 연관된 5종의 상이한 인간 종양으로부터 얻은 8 종의 세포주에 대하여 분석을 수행하였다, 즉:
- 신경모세포종 모델로서, 세포주 Kelly, IMR-32 (여기서 MYCN 유전자는 증폭 및 과발현된다) 및 SKNBE2c 및 LAN1 (여기서 MYCN 유전자는 증폭 및 과발현되고 p53 유전자는 돌연변이된다);
- 횡문근육종 모델로서, 세포주 RH30가 사용되고, 여기서 MYCN 유전자는 증폭 및 과발현된다;
- 윌름씨 종양 모델로서, 세포주 WiT49가 사용되고, 여기서 MYCN 유전자는 증폭 및 과발현된다;
- 망막모세포종 모델로서, 세포주 Y79가 사용되고, 여기서 MYCN 유전자는 증폭 및 과발현된다; 및
- 소세포폐암 모델로서, 세포주 H69가 사용되고, 여기서 MYCN 유전자는 증폭 및 과발현된다.
대조군으로서, 상기 열거된 동일한 세포주들을 올리고뉴클레오타이드 대신 멸균수로 처리하여 사용하였다. 각 RNA 시료를 NanoDrop ND-1000 분광광도계 (NanoDrop Technologies)를 이용하여 정량하였다 (2회 반복).
cDNA의 제1 가닥을 RT-PCR용 cDNA Synthesis Kit (Roche)를 이용하여 제조하였다. cDNA 합성 반응을 위하여, 총 1 μg의 RNA가 사용되었다. 실시간 PCR을 위하여, 최종 부피 20 μl 중 10 ng의 cDNA가 SYBR Green Master Mix 2X (Applied Biosystems)와 함께 사용되었다 (3회의 동일한 실험이 3회 반복으로 수행되었다). 실시간 PCR을 수행하기 위하여 사용된 프라이머의 서열 및 농도를 표 4에 나타내었다. 2개의 하우스키핑 유전자들이 양성 대조군으로 사용되었다: GAPDH 및 베타-액틴 (ACTB).
QT-PCR 반응의 조건은: 95℃에서 10 분, 95℃에서 20 초, 및 60℃에서 30 초, 50 사이클이다.
표 4
올리고뉴클레오타이드로의 처리 - 세포 증식 시험
본 발명 올리고뉴클레오타이드의 유전자 조절 능력을 평가하려는 목적으로, 세포 생존에 대한 그들의 투여 효과를 측정하였다.
이러한 목적을 위하여, 4% FBS 및 2mM의 L-글루타민을 함유하는 OPTI-MEM (GIBCO BRL) 배지 100 μl로 채워진 96-웰 세포 배양 플레이트에 5x103의 세포를 씨딩하였다 (실험은 3회 반복으로 수행되었다).
투여량-효과 관계를 관찰하기 위하여 PNA 올리고뉴클레오타이드를 여러 가지 농도로 투여하였다 (1 μM-2.5 μM-5 μM-10 μM).
다른 모든 올리고뉴클레오타이드들에 대하여, 투여된 농도는 단락: 올리고뉴클레오타이드를 이용한 처리 - QT-PCR에 나타나 있다.
처리된 세포들의 생존을 처리 48 시간, 72 시간, 96 시간 및 168 시간 후에 측정하였다.
세포 생존을 ATP-Lite 시험 (Luminescence ATP Detection Assay System, PerkinElmer)을 이용하여 평가하고, 비처리 대조군 세포들의 웰에 대한 평균값과 비교한 처리 웰의 평균 신호와의 비율로 보고한다. 세포는 키트에서 제공되는 지침에 따라 처리되었다. MYCN 유전자 메신저의 수준을 측정하는데 사용되고 단락: 올리고뉴클레오타이드를 이용한 처리 - QT-PCR에 나열된 동일한 세포주에 대하여 시험이 수행되었다.
결과
PNA 올리고뉴클레오타이드에 관하여, 그들의 MYCN 유전자에 대한 전사 억제 능력과 Kelly 세포 증식 억제 능력에 관한 결과를 표 1에 나타내었다. 표 6은 분석된 PNA의 여러 농도에서 Kelly 세포 증식에 대한 값 (백분율 형태)를 보여준다.
표 5
그 결과는 이들 PNA들의 표적 유전자의 번역된 단백질에 대한 억제 효과가 매우 선택적이고 특이적이라는 것을 입증한다. 게다가, 상기 항유전자 PNA들의 투여 후 모델로서 사용된 종양 세포들의 성장 어레스트 (MYCN 유전자의 증폭으로 특징지워짐)는 세포 자멸사로 직접적으로 이어짐이 관찰되었다.
일반적으로, SEQ ID: 2-SEQ ID NO: 13을 갖는 PNA 항유전자 올리고뉴클레오타이드들 (구아닌으로 이루어지는 그룹을 하나 이상 함유)은 G으로 이루어진 그룹이 없는 PNA 올리고뉴클레오타이드 (SEQ ID NO: 16-SEQ ID NO: 23)에 비하여 항유전자 효과 (즉, MYCN mRNA 및 MYCN 발현이 있는 종양 세포들의 증식에 대한 억제)가 높다.
특히, 표 1 및 표 5에 나타난 결과들은 서열 SEQ ID NO: 2-SEQ ID NO: 13이 특허 EP 1618195의 대상물인 서열 SEQ ID NO: 1보다 항유전자 효과가 높다는 것을 입증한다.
서열 SEQ ID NO: 7-SEQ ID NO: 12 (2개 또는 3개의 연속적인 구아닌으로 이루어지는 그룹을 2개 함유)는 서열 SEQ ID NO: 1, 및 SEQ ID NO: 13-SEQ ID NO: 15 (2개 또는 3개의 연속적인 구아닌으로 이루어지는 그룹을 하나만 함유)보다 더 큰 항유전자 효과를 보여준다.
서열 SEQ ID NO: 4-SEQ ID NO: 6 (2개 또는 3개의 연속적인 구아닌으로 이루어지는 그룹을 3개 함유)는 서열 SEQ ID NO: 7-SEQ ID NO: 12 (2개 또는 3개의 연속적인 구아닌으로 이루어지는 그룹을 2개 함유)보다 더 큰 항유전자 효과를 보여준다.
6개의 연속적인 구아닌으로 이루어지는 그룹을 함유하는 SEQ ID NO: 3은, 하나 또는 2개 또는 3개의 G으로 이루어진 그룹 (각 그룹은 최대 2개 또는 3개의 연속적 구아닌으로 이루어진다)을 함유하는 SEQ ID NO: 1 및 서열 SEQ ID NO: 4-SEQ ID NO: 12보다 더 큰 항유전자 효과를 보여준다.
연속적인 구아닌으로 이루어지는 그룹 3개를 함유하고, 더하여 2개 및 3개의 연속적인 구아닌으로 이루어지는 2개의 그룹을 함유하는 서열 SEQ ID NO: 2는 또한 6개의 연속적 구아닌으로 이루어지는 그룹을 포함하는데, 6개 구아닌으로 이루어지는 그룹 하나만을 함유하는 SEQ ID NO: 3, 및 구아닌으로 이루어지는 그룹 (여기서 각 그룹은 최대 2개 또는 3개의 연속적 구아닌으로 이루어진다)을 하나 또는 2개 또는 3개 함유하는 서열 SEQ ID NO: 1 및 서열 SEQ ID NO: 4-SEQ ID NO: 12보다 더 큰 항유전자 효과를 나타낸다.
게다가, SEQ ID NO 1-23을 갖는 올리고뉴클레오타이드들을 섬유아세포-유형 세포주들 (NIH-3T3 및 Phoenix)에 투여하였고, 그 결과를 표 1에 나타내었다 (마지막 두 컬럼).
그 결과는 분석된 올리고뉴클레오타이드들이 이들 세포 (즉, 표적 유전자, 이 경우에는 MYCN을 발현하지 않는 세포들)에 대하여 특이적으로 효과적이거나 독성이 있지는 않다는 것을 입증한다.
사실, 이들 비-종양 섬유아세포 세포주에서 세포 증식에 있어 어떠한 변화도 관찰되지 않았고, 이러한 결과는 상기 PNA 올리고뉴클레오타이드들이 MYCN의 발현을 억제하는 특이적인 효과를 갖지만, MYCN을 발현하지 않는 세포들에서는 비특이적, 독성 효과를 갖지 않는다는 것을 의미한다.
그러므로, 본 발명에서 개시되는 파라미터들에 기초하여 설계된 PNA 올리고뉴클레오타이드들이 표적 유전자에 특이적으로 효과적으로 작용하고, 그러므로 이 유전자를 발현/과발현하는 세포들에 작용한다는 것을 추론할 수 있다.
SEQ ID NO: 1-12를 갖는 PNA들을 MYCN을 과발현하는 다른 세포주들 (Kelly, SKNBE2c, RH30, WiT49, WERI-Rb1 1 및 H69)에 대하여도 시험하였다. 그 결과를 표 6에 나타내고 MYCN 유전자의 단백질 번역 산물에 대한 PNA들의 억제 효과의 선택성과 특이성을 확인하였다.
표 6
SEQ ID NO: 5를 갖는 항유전자 PNA 올리고뉴클레오타이드를 보다 상세하게 분석하였다.
특히, 변형된 올리고뉴클레오타이드들, 여기서 그 서열 내 존재하는 연속적 구아닌들로 이루어지는 그룹은 구아닌들의 연속성을 교란하기 위하여 변형된 것으로 (연속적 구아닌들로 이루어지는 그룹들을 밑줄긋고, 변형된 뉴클레오타이드들을 굵게 나타냄), 이러한 올리고뉴클레오타이드들을 합성하여 Kelly 세포 (MYCN 과발현)에 대하여 시험관 내 분석하였다.
그 결과 (표 7에 요약됨)는 연속된 구아닌들이 유전자 발현 조절 활성이라는 목적에 대하여 본질적으로 중요한 것이라는 사실을 명백히 입증한다. 사실, SEQ ID NO: 43를 갖는 PNA가, 이것은 SEQ ID NO: 5를 갖는 PNA가 그 연속적 구아닌으로 이루어지는 모든 그룹들이 돌연변이된 것으로, 이 SEQ ID NO: 43를 갖는 PNA가 PNA의 억제 활성 상실을 야기하지만, 연속적 구아닌으로 이루어지는 그룹 3개 중 하나나 2개 그룹에 대한 돌연변이는 그 분자의 억제 활성을 상당히 줄이기는 하지만 완전히 억제하지는 않는다.
표 7
DNA 모노머 및 LNA 모노머를 포함하고, 그 표적으로서 MYCN 유전자를 표적하는 키메라 올리고뉴클레오타이드를 폐포 횡문근육종 세포 (RH30)에 대하여 시험관 내 시험하였다. 그 결과를 표 8에 요약하였고 이들 올리고뉴클레오타이드들이 강력한, 특이적인 항유전자 활성을 가짐을 입증한다.
표 8
본 발명에 개시되는 파라미터들에 따라 본원 출원인에 의하여 설계되고 합성된 안티센스 올리고뉴클레오타이드들이 횡문근육종 세포 (RH 30)에 대하여 시험관 내 분석되었다. 그 결과를 표 9에 요약하였고, 그 올리고뉴클레오타이드들이 특이적으로 효과적인 방식으로 MYCN 전사체를 억제할 수 있고; 게다가, 이들은 또한 MYCN 유전자에 대하여 현존하는 표준 안티센스 올리고뉴클레오타이드들 (Chung DH, Bioch Bioph Res Commun, 2006, 351(1):192-7)보다 더욱 효과적인 방식으로 종양 세포 증식을 선택적으로 억제할 수 있다는 것을 보여주고 있다.
특히, 표 11에 개시되는 본원 출원인에 의하여 동정된, MYCN mRNA를 겨냥하는 siRNA는 최소 70%에서 최대 85% 범위로 MYCN mRNA를 억제하는 안티센스 활성을 행사한다.
표 9
본 발명의 올리고뉴클레오타이드들이 암에 대한 치료 프로토콜에서 현재 사용되는 화학치료 제제들의 농도를 낮출 수 있는지를 확인할 목적으로, 이를 화학요법 약물들과 병행하여 투여하였다.
연구는, 여러 가지 인간 및 마우스의 신경모세포 종양 세포주 (SMS-KAN, LAN 1, IMR-32, SMS-KCN, Kelly, NHO2A, SKNBE2c)에 대하여, PNA와 화학요법 약물들 (카보플라틴, 에토포사이드 (VP16), 시스플라틴 및 빈크리스틴) 간의 결합 효과에 대하여 수행되었다.
치료에 이용된 치료 스케쥴은 PNA로 치료되는 세포들에, 그 후 소정의 시간에 (6 시간 또는 12 시간일 수 있다) 화학치료 제제를 투여하는 조건으로 수행되었다.
그 결과는 이들 화합물들의 본 발명의 올리고뉴클레오타이드와의 결합이, 특정 농도 범위에서, 그 동일한 화합물들을 이용한 각각의 치료에 비하여 더 큰 치료 효과를 갖는다는 것을 입증한다.
특히, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드와 약리 효과를 갖는 다른 화합물들로 이루어지는 조합을 이용한 상기 치료 - 동시에 병행되거나 여러 상이한 시간 인터벌 (3 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간 72 시간 등등)일 수 있는 - 가 원하는 치료 효과를 강화하는데 기여한다는 것이 관찰될 수 있다.
그러므로, 본원 출원인에 의하여 동정된 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드들을 화합요법 약물들과 조합하면 현재의 표준 치료 농도에 비하여 10 배에 상당하는 화학요법 약물 농도 감소가 가능하지만 여전히 동일한 효과를 얻을 수 있다.
특히, 이 연구 결과는 SEQ ID NO: 1이, 빈크리스틴 또는 에토포사이드, 또는 카보플라틴, 또는 시스플라틴과 조합하여 투여되는 경우, 상기 올리고뉴클레오타이드를 이용하거나 전술한 화학요법 제제들을 단독으로 이용하는 치료에서 얻어지는 효과에 비하여 세포 증식 억제의 관점에서 시너지 효과를 갖는다는 것을 입증한다.
실시예
2
본 발명을 뒷받침할 목적으로, 표 10에 요약된 올리고뉴클레오타이드들이 또한 합성되었다. 특히, 표 10은 올리고뉴클레오타이드 서열, SEQ ID NO, (G+C) 함량의 백분율값 및 그 합성된 올리고뉴클레오타이드가 겨냥하는 유전자를 나타낸다. 올리고뉴클레오타이드들의 합성은 실시예 1에서와 같이 이루어졌다.
표 10
특히, 다음의 것들이 합성되었다: MYCN을 겨냥한 SEQ ID NO: 66-69, MYC를 겨냥한 SEQ ID NO: 70-74, BIRC5를 겨냥한 SEQ ID NO: 75, 76, ALK를 겨냥한 SEQ ID NO: 77-79, BCL2를 겨냥한 SEQ ID NO: 80-82 및 PLK4를 겨냥한 SEQ ID NO: 83, 84.
관심 대상 유전자가 과발현되는 세포 모델에서 그 유전자 메신저의 수준을 측정함으로써 그들이 겨냥하는 유전자의 전사를 억제하는 능력을 측정하기 위하여 상기 올리고뉴클레오타이드들을 시험관 내 (2.5 μM의 농도에서) 시험하였다. 그 방법은 실시예 1에 기술된 것들을 이용하였다.
특히, SEQ ID NO: 66-69 (MYCN을 겨냥)를 Kelly 및 H69 세포주에서 시험관 내 시험; SEQ ID NO: 70-74 (MYC를 겨냥)를 H82 및 RD 세포주에서 시험관 내 시험, SEQ ID NO: 75, 76 (BIRC5를 겨냥)를 Kelly 세포주에서 시험관 내 시험, SEQ ID NO: 77-79 (ALK를 겨냥)를 Kelly 세포주에서 시험관 내 시험, SEQ ID NO: 80-82 (BCL2를 겨냥)를 Kelly 세포주에서 시험관 내 시험 및 SEQ ID NO: 83, 84 (PLK4를 겨냥)를 Kelly 세포주에서 시험관 내 시험하였다.
상기 시험된 올리고뉴클레오타이드들의 관심 대상 유전자의 메신저를 억제하는 능력이 측정되었고 상기 올리고뉴클레오타이드들의 투여 후 상기 세포들의 증식능 역시 평가되었다. 그 결과를 표 11에 요약하였다.
결과는 상기 올리고뉴클레오타이드들의 서열 중 존재하는 구아닌들로 이루어지는 그룹의 수가 증가함에 따라 증가하는 세포 증식 억제 및 표적 유전자의 mRNA를 겨냥한 강력한 억제 활성을 보여준다.
표 11
마지막으로, SEQ ID NO 66-84를 갖는 올리고뉴클레오타이드들을 섬유아세포 유형 세포주 (Phoenix 및 NIH-3T3)에 투여하였다. 이들 세포에서, 시험된 상기 올리고뉴클레오타이드들은 독성을 보이지 않았다.
이러한 결과는 상기 PNA 올리고뉴클레오타이드들이 관심 대상 유전자의 발현에 특이적인 억제 효과를 통하여 작용하지만 그 유전자를 발현하지 않는 세포들에서 어떠한 비특이적, 독성 효과를 나타내지 않는다는 것을 나타낸다.
따라서, 본 발명에 개시된 파라미터들에 기초하여 설계된 상기 PNA 올리고뉴클레오타이드들이 표적 유전자에 특이적이고 효과적으로 작용하고, 그러므로 이러한 유전자를 발현/과발현하는 세포들에 특이적이고 효과적으로 작용한다는 것이 추론될 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> Biogenera srl
Tonelli, Roberto
Venturelli, Leonardo
Tortori, Andrea
Montemurro, Luca
<120> Oligonucleotides for the modulation of gene expression and uses
thereof
<130> 21.B0278.12.IT.2
<160> 84
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ANTI MYCN PNA
<400> 1
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ANTI MYCN PNA
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<211> 16
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
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<223> ANTI MYCN PNA
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<211> 16
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<220>
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<211> 16
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<213> Artificial
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<211> 16
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<211> 16
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<213> Artificial
<220>
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<211> 16
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<213> Artificial
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<211> 16
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<213> Artificial
<220>
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<220>
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<213> Artificial
<220>
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ANTI MYCN PNA
<400> 18
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ANTI MYCN PNA
<400> 19
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ANTI MYCN PNA
<400> 20
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<213> Artificial
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ANTI MYCN PNA
<400> 22
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<210> 23
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ANTI MYCN PNA
<400> 23
atatcccccg agcttc 16
<210> 24
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ANTI MYCN DNA/LNA
<400> 24
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<210> 25
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ANTI MYCN DNA/LNA
<400> 25
atgccgggca tgatct 16
<210> 26
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
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<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial
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<223> SENSE OLIGONUCLEOTIDE siMYCN (801)
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ugaugaagag gaagaugaa 19
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> SENSE OLIGONUCLEOTIDE siMYCN (808)
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> SENSE OLIGONUCLEOTIDE siMYCN (810)
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<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE MYCN-PTO (1)
<400> 31
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<210> 32
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE MYCN-PTO (763)
<400> 32
cagggtgtcc tctccgga 18
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> SENSE OLIGONUCLEOTIDE siRNA-2'-OMe-RNA 808
<400> 33
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<210> 34
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> SENSE OLIGONUCLEOTIDE siRNA-2'F-RNA 808
<400> 34
caggaagaug aagaggaagu u 21
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> SENSE OLIGONUCLEOTIDE siRNA-LNA 808
<400> 35
gaggaagaug aagaggaagt t 21
<210> 36
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> SENSE OLIGONUCLEOTIDE siRNA-ANA 808
<400> 36
caggaagaug aagaggaaga a 21
<210> 37
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PRIMER MYCN SENSE
<400> 37
cgaccacaag gccctcagt 19
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PRIMER MYCN ANTISENSE
<400> 38
tgaccacgtc gatttcttcc t 21
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PRIMER ACTB SENSE
<400> 39
gagcacagag cctcgccttt g 21
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PRIMER ACTB ANTISENSE
<400> 40
accatcacgc cctggtgcct g 21
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PRIMER GAPDH SENSE
<400> 41
ccaatatgat tccacccatg gc 22
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PRIMER GAPDH ANTISENSE
<400> 42
cttgattttg gagggatctc gc 22
<210> 43
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> MODIFIED SEQ ID NO: 5
<400> 43
gctgagtcga tgcgtg 16
<210> 44
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> MODIFIED SEQ ID NO: 5
<400> 44
gctgagtgga tgcgtg 16
<210> 45
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> MODIFIED SEQ ID NO: 5
<400> 45
gctgggtcga tgcggg 16
<210> 46
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> MODIFIED SEQ ID NO: 5
<400> 46
gttgggtgga tgtggg 16
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CARRIER PEPTIDE
<400> 47
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
1 5
<210> 48
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CARRIER PEPTIDE
<400> 48
Val Lys Arg Lys Lys Lys Pro
1 5
<210> 49
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CARRIER PEPTIDE
<400> 49
Lys Lys Lys Lys Lys Lys
1 5
<210> 50
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CARRIER PEPTIDE
<400> 50
Pro Lys Arg Lys Arg Lys Val
1 5
<210> 51
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CARRIER PEPTIDE
<400> 51
Lys Arg Lys Arg Lys Arg Lys
1 5
<210> 52
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CARRIER PEPTIDE
<400> 52
Lys Lys Lys Arg Lys Val
1 5
<210> 53
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CARRIER PEPTIDE
<400> 53
Pro Lys Lys Lys Arg Lys
1 5
<210> 54
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CARRIER PEPTIDE
<400> 54
Lys Lys Lys Arg Lys
1 5
<210> 55
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CARRIER PEPTIDE
<400> 55
Arg Arg Arg Arg
1
<210> 56
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CARRIER PEPTIDE
<400> 56
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val His His His His His
1 5 10
<210> 57
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE siMYCN (795)
<400> 57
uuccucuuca ucaucuuca 19
<210> 58
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE siMYCN (799)
<400> 58
caucuuccuc uucaucauc 19
<210> 59
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE siMYCN (801)
<400> 59
uucaucuucc ucuucauca 19
<210> 60
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> SENSE OLIGONUCLEOTIDE siMYCN (808)
<400> 60
cuuccucuuc aucuuccuc 19
<210> 61
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE siMYCN (810)
<400> 61
uucuuccucu ucaucuucc 19
<210> 62
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE siRNA-2'-OMe-RNA 808
<400> 62
cuuccucuuc aucuuccuct t 21
<210> 63
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE siRNA-2'F-RNA 808
<400> 63
guuccucuuc aucuuccucu u 21
<210> 64
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE siRNA-LNA 808
<400> 64
cuuccucuuc aucuuccuct t 21
<210> 65
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE siRNA-ANA 808
<400> 65
guuccucuuc aucuuccuca a 21
<210> 66
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ANTI MYCN PNA
<400> 66
tcgggagcag tgggca 16
<210> 67
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ANTI MYCN PNA
<400> 67
gcgggtcgcg ggcacg 16
<210> 68
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ANTI MYCN PNA
<400> 68
tggaggtcgg cgccgg 16
<210> 69
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ANTI MYCN PNA
<400> 69
tcggcgggag gtaagg 16
<210> 70
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ANTI MYC PNA
<400> 70
ctcagaggct tggcgg 16
<210> 71
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ANTI MYC PNA
<400> 71
gcggccggct agggtg 16
<210> 72
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ANTI MYC PNA
<400> 72
cggccggcta gggtgg 16
<210> 73
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ANTI MYC PNA
<400> 73
cgacggcggt ggcggg 16
<210> 74
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ANTI MYC PNA
<400> 74
ggacgggggc ggtgga 16
<210> 75
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ANTI BIRC5 PNA
<400> 75
gcggcggcat gggtgc 16
<210> 76
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ANTI BIRC5 PNA
<400> 76
ggcggcggca tgggtg 16
<210> 77
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ANTI ALK PNA
<400> 77
gcaggagagg acggta 16
<210> 78
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ANTI ALK PNA
<400> 78
caggagagga cggtac 16
<210> 79
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ANTI ALK PNA
<400> 79
ggcaggagag gacggt 16
<210> 80
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ANTI BCL2 PNA
<400> 80
ggatggcgca cgctgg 16
<210> 81
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ANTI BCL2 PNA
<400> 81
gggaaggatg gcgcac 16
<210> 82
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ANTI BCL2 PNA
<400> 82
ccacggtggt ggagga 16
<210> 83
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ANTI PLK4 PNA
<400> 83
acggcaagcg gcggga 16
<210> 84
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ANTI PLK4 PNA
<400> 84
ggacggcaag cggcgg 16
Claims (30)
- 6-30개 뉴클레오타이드를 포함하는, 표적 유전자의 안티-센스 DNA 가닥에 상보적인 단일 가닥 항유전자 (anti-gene) 올리고뉴클레오타이드로서,
상기 올리고뉴클레오타이드는 2개 이상의 연속적 구아닌으로 이루어지는 그룹을 3개 이상 포함하는 서열에 의하여 특징지워지는 것인 올리고뉴클레오타이드. - 제1항에 있어서, 상기 2개 이상의 연속적 구아닌으로 이루어지는 그룹은,
서로 연속적이거나 또는
구아닌이 아닌 하나 이상의 뉴클레오타이드에 의하여 공간적으로 분리되는 것인 올리고뉴클레오타이드. - 제2항에 있어서, 상기 2개 이상의 연속적 구아닌으로 이루어지는 그룹은 숫자상 4개, 5개 또는 6개 이상인 것인 올리고뉴클레오타이드.
- 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 그 올리고뉴클레오타이드의 3' 및/또는 5' 말단에서 캐리어 서열과 연결되는 것인 올리고뉴클레오타이드.
- 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는,
천연 핵산 또는
합성 핵산, 또는
상기 천연 핵산과 상기 합성 핵산의 조합
중 하나 이상의 분자인 것인 올리고뉴클레오타이드. - 제5항에 있어서,
상기 천연 핵산은 DNA 또는 RNA이고,
상기 합성 핵산은 PNA, LNA 또는 모폴리노 (morpholino)인 것인 올리고뉴클레오타이드. - 제6항에 있어서,
1) 하나 이상의 상기 DNA 분자는, 하나 이상의 LNA, 메틸포스포네이트-LNA, BNA, RNG, DNG, GNA, UNA, ENA, ANA, F-ANA, PNA, G-PNA 또는 모폴리노 뉴클레오타이드를 포함하거나; 또는 2'O-메틸, 2'O-메톡시에틸 또는 2'-플루오로 RNA 뉴클레오타이드를 포함하거나; 또는
2) 하나 이상의 상기 RNA 분자는, 2'O-메틸 뉴클레오타이드, 2'O-메톡시에틸 뉴클레오타이드 또는 2'-플루오로 뉴클레오타이드 중에서 선택되는 하나 이상의 RNA 뉴클레오타이드; 또는 LNA, 메틸포스포네이트 LNA, BNA, RNG, DNG, GNA, UNA, ENA, ANA, F-ANA, PNA, G-PNA 또는 모폴리노 중에서 선택되는 핵산으로 이루어지는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 것인 올리고뉴클레오타이드. - 제7항에 있어서, 하나 이상의 상기 DNA 분자 또는 하나 이상의 상기 RNA 분자는 포스포디에스테르 결합의 수준에서 포스포로티오에이트 결합으로 변형된 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 것인 올리고뉴클레오타이드.
- 제6항에 있어서, 상기 PNA는 그 알파 탄소가 치환체로서 아르기닌 또는 리신의 측쇄를 갖는 변형된 백본을 갖는 것인 올리고뉴클레오타이드.
- 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는, 유전적 또는 바이러스 기원의 질병의 원인이 되는 하나 이상의 유전자 또는 하나 이상의 종양 유전자를 겨냥하고,
상기 유전자는, MYC 패밀리에 속하는 하나 이상의 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 것인 올리고뉴클레오타이드. - 제10항에 있어서, 상기 유전자는 MYC, MYCN 또는 MYCL1, BIRC5, BCL2, PLK4, ALK, PKM2, CASP8 및 RASSF로부터 선택되는 것인 올리고뉴클레오타이드.
- 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는, SEQ ID NO: 2, 4, 5, 6, 46, 및 SEQ ID NO: 68-84 중에서 선택되는 것인 올리고뉴클레오타이드.
- 제12항에 있어서, SEQ ID NO: 2, 4, 5, 6, 68 및 69는 MYCN 유전자를 겨냥하는 것인 올리고뉴클레오타이드.
- 제12항에 있어서, SEQ ID NO: 70-74는 MYC 유전자를 겨냥하는 것이고,
SEQ ID NO: 75, 76는 BIRC5 유전자를 겨냥하는 것이고,
SEQ ID NO: 77-79는 ALK 유전자를 겨냥하는 것이고,
SEQ ID NO: 80-82는 BCL2 유전자를 겨냥하는 것이고,
SEQ ID NO: 83, 84는 PLK4 유전자를 겨냥하는 것인 올리고뉴클레오타이드. - 제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 기재된 올리고뉴클레오타이드 1종 이상 및 약학적으로 허용되는 첨가제 1종 이상을 포함하는, 종양의 치료를 위한 약학적 조성물.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 기재된 올리고뉴클레오타이드 1종 이상을,
NGF, 소마토스타틴, 레티노산, 악티노마이신 D, 아스파라기나제, 블레오 마이신, 부술판 카페시타빈, 카보플라틴, 사이클로포스파미드, 사이클로스포린, 시스플라틴, 시타라빈, 클로람부실, 다카바진, 다우노루비신, 도세탁셀, 독소루비신 하이드로클로라이드, 에피루비신 하이드로클로라이드, 에토포시드, 플루다라빈 포스페이트, 플루오로우라실, 젬시타빈, 이다루비신 하이드로클로라이드, 수산화우레아, 이포포스파마이드, 이리노테칸 하이드로클로라이드, 멜팔란, 머캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미토마이신, 미톡산트론, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 프로카바진, 랄티트렉세드, 스트렙토조신, 테가푸르-우라실, 테모졸로마이드, 티오구아닌, 티오테페, 토포테칸, 빈블라스틴, 빈크리스틴 술페이트, 빈데신 및 비노렐빈으로 이루어지는 군에서 선택된 약리적 작용을 갖는 화합물과 조합하여 포함하는, 종양의 치료를 위한 약학적 조성물. - 의약으로 사용하기 위한, 제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 기재된 올리고뉴클레오타이드.
- 제15항에 있어서,
상기 종양은, 신경모세포종, 망막모세포종, 수모세포종, 상의세포종, 갈색 세포종, 배아 종양, 생식 세포 종양, 폐포 횡문근육종, 배아 횡문근육종, 윌름스 종양, 신장의 투명 세포 육종, 활막 육종, 간 모세포종, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 급성 림프아세포성 백혈병, 만성 림프아세포성 백혈병, 버킷 림프종, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 거핵아구성 백혈병, B 만성 림프구성 백혈병, T-세포 백혈병, 림프종, 소세포 폐암 (microcytoma), 폐 선암종, 편평 세포 폐암, 전형적 및 비정형 원발성 폐암, 대 세포 폐 암종, 대 세포 폐암 신경 내분비 암, 교아세포종, 간암, 기저 세포 암종, 난소 종양, 유방 종양 및 대장암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 성인 또는 어린이의 종양인 것인 약학적 조성물. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
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- 삭제
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- 삭제
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| ITMI20030860A1 (it) | 2003-04-29 | 2004-10-30 | Univ Bologna | Metodo per l'inibizione selettiva del gene n-myc |
| WO2005045032A2 (en) | 2003-10-20 | 2005-05-19 | Sima Therapeutics, Inc. | RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF EARLY GROWTH RESPONSE GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA) |
| GB0415263D0 (en) * | 2004-07-07 | 2004-08-11 | Norwegian Radium Hospital Res | Method |
| WO2007040550A2 (en) * | 2004-10-25 | 2007-04-12 | Novartis Ag | Torc polynucleotides and polypeptides, and methods of use |
| US7625874B2 (en) * | 2006-04-11 | 2009-12-01 | The Regents Of The University Of California | Compositions and methods for treating diseases associated with T-box and N-Myc |
| US20080038783A1 (en) * | 2006-06-29 | 2008-02-14 | Applera Corporation | Compositions and Methods Pertaining to Guanylation of PNA Oligomers |
| WO2009009739A2 (en) * | 2007-07-12 | 2009-01-15 | Theracrine, Inc. | Methods and compositions for facilitating cell death of cancer stem cells and for treating cancer |
| CA2745811C (en) * | 2008-12-04 | 2021-07-13 | Joseph Collard | Treatment of tumor suppressor gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to the gene |
| CN102058535B (zh) * | 2010-12-21 | 2013-05-01 | 中国人民解放军总医院 | 叶酸受体靶向的新型脂质体 |
| ITMI20120275A1 (it) * | 2012-02-24 | 2013-08-25 | Biogenera Societa A Responsabilita Limitata | Oligonucleotidi per la modulazione dell'espressione genica e loro usi |
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