CN1509292A - 使用c-myc反义寡聚物治疗癌症的结合的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了通过使用包括一种C－MYC的反义寡聚物和一个标准的化疗剂的结合治疗方案治疗癌症的改进的治疗方法。

Description

使用C-MYC反义寡聚物治疗癌症的结合的方法
发明领域
本发明涉及通过应用C-MYC的反义寡聚物与一种传统的癌症化疗剂结合在体内免疫治疗癌症的方法。
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发明背景
癌症的发展是一个复杂的多步骤过程，与细胞内包括原癌基因c-myc的原癌基因的表达水平的变化相关(Denhardt，DT，1999；Pendergast GC，1999)。c-myc调控细胞的生长、分化和凋亡，而且其异常表达与人类很多的癌症包括肺癌、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌、白血病、肺癌、等相关(Dang et al.，1999)。报告提示使用多种途径在多种癌症中存在上调或异常表达碱性一螺旋一环一螺旋核内c-myc，这将导致临床前和临床中研究评估c-myc的抑制效果。
已经表明反义寡聚核苷酸和抗体可以特异地干预特定靶蛋白的合成。由于其疏水的性质，反义寡聚核苷酸与磷脂膜能很好地作用(Akhtaret al.，1991)，而且推测在接下来的与细胞的原生质膜相互作用后，寡聚核苷酸以活化的形式转移进入到活细胞中(Loke et al.，1989；Yakubov etal.，1989；Aanderson et al.，1999)。
已经进行了检测反义化合物的研究，其具有硫代磷酸的骨架，并且可以直接与包括p53，bcl-2，c-raf，H-ras，蛋白激酶C-α，和蛋白激酶A的七种癌症相关基因作用。已经观察到的副作用包括暂时性的血小板减少症，疲劳和发烧，这些副作用归因于硫代磷酸的骨架。此外，确定靶基因表达的抑制是“至多适度”，而且没有观察到确切的临床活性(Yuen et al.，2000)。
进一步的研究采用作用靶为c-myc翻译起始位点的硫代磷酸(PSOs)和N3’-P-5’氨基磷酸酯的反义寡聚核苷酸，据报道其抑制不同肿瘤细胞型的生长(Leonetti et al.，1996；Smith et al.，1998；和Skorskiet al.，1997)。这些研究表明c-myc抑制物可能在治疗增生性的疾病如癌症和心瓣手术后的再狭窄的临床上是适用的。
二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物(PMOs)代表了一个新的反义结构类型，其中磷酸二脂键连接被一个非带电荷的氨基磷酸酯键连接取代而且脱氧核糖被一个吗啉环取代(Summerton et al.，1997)。已经显示PMOs可以抗拒多种核酸酶和蛋白酶(Hudziak et al.，1996)，与RNA具有比同类磷酸酯DNA更高的亲和性(Summerton et al.，1997)，并且作为翻译起始的立体抑制物发挥作用(Ghosh et al.，1999)。
已经显示c-myc反义寡聚物抑制正常的前体mRNA的拼接而得到异常剪接的mRNA(Hudziak et al.，2000)。c-myc的PMO反义已经表明其在癌细胞中是一个序列特异性的c-myc翻译抑制物，引起c-myc蛋白表达的下降和引起细胞被捕获至细胞周期G0/G1中停留，因此建议在癌症的治疗中应用(Hudziak et al.，2000)。
尽管在癌症治疗策略的发展中，缺乏有效性和/或由于目前使用的化疗剂显著的副作用仍是一个重要问题。药物的毒性可能非常严重足以导致危及生命的地步，这样就需要应用其它药物作用于这种副作用，而且这还可以导致化疗剂的还原和/或不连续，其可能会对于病人的治疗和/或生活质量有负面的影响。
已经尝试了基因治疗的策略而且是正在进行临床试验的受验者。而且，与传统的化学治疗相一致，必须克服输送系统缺乏特异性以及由于输送系统带来的毒副作用以使这样的策略具有临床适用性。
因此，仍然需要改进癌症治疗的方案，用于克服目前治疗方法的不足。本发明就是致力于这种需要。
发明概述
因此，本发明的一个方面是提供一个改进的方法来治疗对于化学治疗敏感的癌症，在此的改进涉及包括在癌症病人身上应用c-myc反义寡聚物和化疗剂的治疗方案，其中c-myc反义寡聚物和化疗剂连续应用并且至少间隔一天。
本发明的另一发面是提供c-myc的反义寡聚物和化疗剂在制备治疗对化疗敏感的癌症的药物组合物中的应用其中，c-myc反义寡聚物和化疗剂是连续使用并且至少间隔一天。
本发明的一个相关的方面是提供用于目前正在用化学治疗的病人中治疗癌症的一种寡聚物组分，包括c-myc反义寡聚物，其中该组合物的使用在使用化疗剂之前或之后使用。
然而本发明的另一个方面是提供试剂盒用于治疗对于化学治疗敏感的癌症。这样的试剂盒包括含有c-myc反义寡聚物的第一组分和含有化疗剂的第二组分，其中第一组分和第二组分将连续应用，且至少间隔一天。
优选地，反义寡聚物具有的长度为从大约12到25个碱基，其特征为：
(a)充分去电荷的骨架；
(b)在Tm高于50℃具有与靶RNA互补序列高亲合性杂交的能力；
(c)抗核酸酶；且
(d)具有活性或方便释放至细胞的能力。
优选地，反义寡聚物靶向跨越c-myc的mRNA翻译起始密码子或c-myc mRNA的剪接受体区域的序列。用于本发明实践优选的c-myc反义寡聚物序列的实施例包括具有在SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，和SEQ ID NO：11中列出的序列的寡聚物。
在阅读完以下的详细描述以及附图和实施例以后，本发明的这些和其他的目的和特征将变得更明确。
附图简要说明
图1说明几个优选的适于形成聚合物的具有5-原子(A)，6-原子(B)和7-原子(C-D)连续基因的吗啉型亚基；
图2A-D说明示范性的吗啉代寡聚核苷酸的重复亚基片段，设计为A到D，分别使用图1的A-D亚基构建，
图3A-3G说明在寡聚核苷酸类似物的去电荷连接型的例子。
图4A-C描述反相HPLC色谱，具有LL肿瘤的小鼠的肿瘤组织用单次的i.p.注射盐水或AVI-4126的典型的谱图。该图提供了参考的对照的色谱(图4A)，用盐水(图4B)或300μg的AVI-4126(图4C)处理的来自小鼠肿瘤裂解物的代表色谱。
图5A和B描述了从大的、已经建立的LL肿瘤携带小鼠通过用单一盐水注射处理(道1和2)；100μg的c-myc杂混的对照反义寡聚物(SEQ ID NO：2；道3和4)处理；或者100μg的AVI-4126反义寡聚物(SEQ ID NO：1；道5和6)处理肿瘤裂解物中的c-myc和β-肌动蛋白免疫印迹分析图；其中道7是c-myc的阳性对照。
图6A-C提供的是从盐水(道2-5)和AVI-4126(道6-9)处理小鼠的肿瘤裂解物的Western印迹的图象。道1是一个c-myc的阳性对照，在此，板A用c-myc抗体的N-末端探测，板B用c-myc抗体的C-末端探测，且板C用β-肌动蛋白的抗体为探针，而且作为一种上样对照。
图7A和B提供了典型的从盐水(道1-2)，顺铂(道3-4)和顺铂+AVI-4126(道5-6)处理组的肿瘤裂解物Western印迹的图象。图4A说明用c-myc抗体的N-末端为探针印迹的结果而且图4B说明用β-肌动蛋白抗体为探针作为上样对照的印迹结果。
图8A-D说明如表1所描述的AVI-4126与化疗剂组合使用治疗的效果，其中AVI-4126以一种与顺铂(图8A)，紫杉酚(图8B)，依托泊甙(图8C)和5-FU(图8D)可替代的治疗方式应用。
本发明的详细描述
1.定义
以下的术语，正如在此应用的，除了进行说明，具有以下的含义：
正如在此应用，术语“化合物”、“试剂”、“寡聚物”和“寡聚核苷酸”可以在本发明的反义寡聚核苷酸的方面用于相互交换使用。相似的，术语“化合物”和“试剂”可以在本发明应用的化学治疗的化合物方面可以相互交换使用。
正如在此所用的，术语“反义寡聚核苷酸”和“反义寡聚物”相互交换使用，而且指一段核苷酸碱基和一个亚基-亚基骨架允许反义寡聚物与RNA的目标序列通过Watson-Crick碱基配对方式杂交，在靶序列中形成RNA：寡聚物异源双链。寡聚物可以具有确定的与靶序列互补或者接近互补的序列。这样的反义寡聚物可能阻断或抑制含有靶序列的mRNA的翻译，或者抑制基因转录，可以与双链或单链序列结合，而且可以被称为“介导”与其杂交的序列。
用于本发明的反义寡聚核苷酸的示范性结构包括见于图1A-E的β-吗啉代亚基型，可以理解的是聚合物可以含有超过一个的连接类型。
在图1的亚基A含有1-原子的含亚磷连接，连接形式显示于图2的A中的5原子的重复单元的骨架，在此的吗啉环通过1-原子的氯化磷酰胺的连接相连。
在图1的亚基B设计为6-原子重复——单体的骨架，如图2B中所显示。在图1的结构B中，与5’吗啉的碳原子与磷酸基团相连的原子Y可以是硫，氮，碳或优选的氧。从磷中的悬垂的X部分可以是以下中的一个：氟；烷基或取代的烷基；烷氧基或取代的烷氧基；一个硫代烷氧基或取代的硫代烷氧基；或一种未取代的，单取代的，或二取代的氮，包括环型结构。
图1的亚基C-E设计为7-原子单元-长度的骨架，见图2从C到E。在图1的结构C中，X部分是如图1的结构B而且Y部分可以是亚甲基，硫，或优选的氧。在图1的结构D中，X部分和Y部分是在图1的结构B中。在图1的结构E中，X是在图1中的结构B，而且Y是O，S，或者NR。在图1A-E中描述的所有亚基中，Z是O或S，且Pi或Pj是腺嘌呤，胞嘧啶，鸟嘌呤或尿嘧啶。
正如在此所用，一个“吗啉寡聚物”指一个具有一个骨架的多聚分子，其所支持的碱基可以用氢键与典型的多聚核苷酸结合，在此的聚合物缺乏一个五元糖的骨架组分，更特异的是以磷酸二脂键连接的核糖骨架，这一结构在核苷酸和核苷中是典型的，代替的是含有一个通过氮环偶联的氮环。优选的“吗啉”寡核苷酸的组成形式是图2B所示的吗啉亚基结构。
其中(i)结构通过含亚磷连接连接在一起，1到3个原子的长度，将一个亚基的吗啉氮与相邻亚基的5’端环外的碳相连，而且(ii)Pi和Pj是嘌呤或嘧啶碱基配对组分，可以有效地通过碱基特异性的氢键结合至多聚核苷酸的一个碱基。
本发明优选的方面见于图2B，其显示了两个通过一个二氨基磷酸酯键相连。在以下的专利中详细描述了吗啉寡聚核苷酸(包括反义寡聚物)，如，同时拥有的美国专利号5,698,685，5,217,866，5,142,047,5,034,506，5,166,315，5,185,444，5,521,063和5,506,337，所有在此引入以供参考。
正如在此所用，一个“核酸酶抗性”寡聚物分子(寡聚物)是一个其骨架是不易于受核酸酶切割的磷酸二酯键，示范性的核酸酶抗性反义寡聚物是寡聚核苷酸类似物，如硫代磷酸酯和磷酸酯一胺DNA(pnDNA)，两者均有带电荷的骨架，和一个甲基-磷酸吗啉，和肽核酸(PNA)寡聚核苷酸，其所有都具有不带电荷的骨架。
正如在此所用，一个寡聚核苷酸或反义寡聚物与靶多聚核苷酸“特异性杂交”，如果在生理条件下寡聚物与靶分子杂交，其Tm温度基本上高于37℃，优选地至少为50℃，而且典型地为60℃-80℃或更高。这样的杂交优选地与严谨的杂交条件相符，对于特定的序列，在特定的离子强度和pH下选择的为低于热融解温度(Tm)的大约10℃，且优选的大约5℃。在给定的离子强度和pH下，Tm的温度是50％与互补的多聚核苷酸的靶序列杂交的温度。
当杂交在反平行的两种单链多聚核苷酸构型间进行时，描述的多聚核苷酸为与另一个多聚核苷酸“互补”。如果杂交可以在第一条多核苷酸链和第二条链之间进行，一个双链多聚核苷酸可以“互补”于其他的多聚核苷酸。互补性(一条多聚核苷酸与另一条相互补的程度)可以通过相对链的碱基的比例量化，按照一般接受的碱基配对原则，通过所期望的互补来相互间形成氢键来理解。
正如在此所使用的术语关于寡聚物“类似物”是指一种物质结构和化学性质这两者与那些参考的寡聚物相类似的物质过程。
正如在此所使用的，第一序列是指一种相对于第二序列方面的“反义序列”，是在生理条件下，如果一个多聚核苷酸的序列是第一序列可以特异地结合于或特异地与第二多聚核苷酸的序列杂交的多核苷酸。
正如在此所使用的，一个“碱基特异性的胞内结合事件包括一个靶RNA”是指在细胞内一段寡聚物与靶RNA序列特异结合的序列。例如，一个单链多聚核苷酸可以特异地与在序列上与其互补的单链多聚核苷酸结合。
正如在此所使用的，“核酸酶抗性的异源杂和双链”是指通过结合其互补目标的一段反义寡聚物形成的异源杂和双链，其可对抗在体内普遍存在的，胞内和胞外的核酸酶的降解。
正如在此所使用的，“c-myc”，是指癌基因或直接引起细胞向癌症或肿瘤发展和生长的基因。“c-myc”曾与在不同型的癌症的基因的扩增相关，进一步的细节描述如下。
正如在此所使用的，术语“c-myc反义寡聚物”指一种抗核酸酶的反义寡聚物对互补的或近似互补的c-myc核酸序列有高的亲和性(如，其“特异杂交”)。
正如在此所使用的，相对于一种寡聚核苷酸的术语的“调节表达”是指一个反义寡聚核苷酸(寡聚物)通过与表达或翻译RNA相互作用既可以增强也可以降低已知蛋白表达的能力。在增强的蛋白的表达的例子中，反义寡聚物可以阻断抑制基因的表达，如，一种肿瘤抑制基因。在降低的蛋白表达的例子中，反义寡聚物可以直接阻断已知基因的表达，或通过加速从该基因转录的RNA的断裂而其作用。
正如在此所使用的，术语“肿瘤”和“癌症”是指一种细胞，其表现为失去生长控制，形成不寻常的大的细胞克隆。肿瘤或癌细胞一般具有失去接触抑制而且可能具有浸染性和/或具有转移的能力。
正如在此所使用的，相对于一个反义寡聚物的“有效量”是指应用于哺乳动物的反义寡聚物的量，既可以作为单一的剂量也可以作为一系列剂量的一部分，而且该剂量有效地抑制所选的靶核酸序列的表达。
正如在此所使用的，一个个体或一个细胞的“治疗”是指应用任何类型的干预来试图改变个体或细胞的天然过程。治疗包括，但不限于，应用如一种药物组合物，而且既可以进行预防，也可以进行随后的病理事件的起始或与病因学因素相接触。
II. 用于实践本发明的反义寡聚核苷酸
A. 反义寡聚核苷酸的类型
15-20个碱基的反义寡聚核苷酸通常足够长，其可能在哺乳动物的基因组中具有一个互补序列。此外具有至少17个核苷酸的长度的反义化合物，已经显示其与一个互补的靶mRNA的序列可以很好地进行杂交(Cohen et al.，1991)。
已经提出两个一般的机制来说明反义寡聚核苷酸对基因表达的抑制(见如，Agrawal et al.，1990；Bonham et al.，1995；和Boudvillain et al.，1997.)。
首先，在寡聚核苷酸和mRNA之间形成的一个异源双链核酸分子是RNase H的底物，引起了对mRNA的切割。寡聚核苷酸属于，或者建议属于包括硫代磷酸，磷酸三酯和磷酸二酯的一类(如，未改变的“天然”寡聚核苷酸)。这样的化合物一般显示出高的活性，而且目前硫代磷酸是最广泛地在反义应用中的寡聚核苷酸。而且，这些化合物倾向于产生因非特异结合于细胞内的蛋白而带来不需要的副作用(Geeet al.，1998)，以及非靶RNA的异源双链核酸分子的不适当的RNase切割(Giles et al.，1993)。
第二类寡聚核苷酸的类似物，术语为“立体的阻断物”或可选择的，“RNase H失活”或者“抗RNase H”，没有观察到其可以作为RNaseH的底物，而且据信通过立体阻断靶RNA的形成、核质运输或翻译而发挥作用。这一类包括甲基磷酸酯(Toulme et al.，1996)，吗啉寡聚核苷酸，肽核酸(PNA’s)，2’-O-丙烯或者2’-O-烷基修饰的寡聚核苷酸(Bonham，1995)，和N3’P5’氨基磷酸酯(Gee，1998)。
天然来源的寡聚核苷酸具有一个磷酸二酯键骨架，其对于核酸酶的降解敏感；可是，骨架的某些修饰增加了天然的寡聚核苷酸对这种降解的抗性(参见，如，Spitzer et al.，1988)。
B. 优选的反义寡聚核苷酸
除了互补于一个选择的核酸靶序列的碱基序列，优选的反义寡聚核苷酸显示了高的特异性地结合于互补的靶序列而且在细胞和无细胞系统中具有阻断靶核酸表达的效力。
在本发明优选的方法应用的反义寡聚物，具有一个或多个特征包括：(1)一个实际上未带电荷的骨架(如，Uhlmann，et al.，1990)，(2)以高亲和力与靶RNA互补的序列可以杂交的能力，Tm实际上高于37℃优选地至少50℃，一般典型的为60-80℃或更高，(3)亚基的长度为至少8个碱基，一般大约8-40个碱基，优选的12-25个碱基的亚基长度，(4)抗核酸酶(Hudziak，et al.，1996)和(5)如以下提供的证据活化或方便运转的能力，(i)竞争性结合一个硫代磷酸反义寡聚物，和/或(ii)转运一个可检测到的报告基因入细胞中的能力。
吗啉寡聚核苷酸尤其是氨基磷酸酯-或与二氨基磷酸酯相偶联的吗啉寡聚核苷酸已经显示出对于互补的或接近互补的核酸具有高亲和性。吗啉寡聚物也显示出小的或没有非特异性的反义活性，有好的水溶性，并且对于核酸酶有免疫作用，而且设计为具有低的生产成本(Summerton et al.，1997)。
吗啉寡聚物的合成，结构，和结合特性参考美国专利号5,698,685；5,217,866；5,142,047；5,034,506；5,166,315；5,521.063和5,506,337，每一个在此引入以供参考。
本发明优选的反义寡聚物由以上引用的专利说明形式的吗啉亚基组成，在此(I)吗啉基团通过未带电荷的连接相连，一到三个原子长，将亚基的吗啉的氮连接到相邻亚基的5’端环外的C原子上，而且(ii)连于吗啉基团的碱基是一个通过碱基特异性的氢键有效与聚核苷酸的一个碱基结合的嘌呤或嘧啶碱基——配对的部分多。嘌呤或者嘧啶碱基的配对部分是典型的腺嘌呤，胞嘧啶，鸟嘌呤，尿嘧啶或胸腺嘧啶。每一个寡聚物的制备在美国专利号5,185,444有细节描述(Summertonet al.，1993)，在此一并完整引入作为参考。正如在此参考所示，可能使用几种类型的非离子连接来构建一个吗啉骨架。
用于本发明的反义寡聚核苷酸的示范性的骨架结构包括图1A-E所示的β-吗啉亚基型。预期多聚核苷酸将可能含有大于一种连接类型。
图1的亚基A含有1-原子的含有磷的连接，其形成图2A所示的5个原子的重复单位的骨架，在此的吗啉环通过1-原子磷酰胺键连接。
图1的亚基B设计为6-原子的重复单位的骨架，正如图2的B所示。在结构B中，连接5’吗啉碳和含磷的基团的原子Y可以是硫，氮，碳或优选的氧。从含磷的基团的X部分悬垂物可以是以下所列的任何一个：氟；烷基或取代的烷基；一个烷氧基或取代的烷氧基；硫代烷氧基或取代的硫代烷氧基；或者，一种未取代的，单取代的，或者二取代的氮，包括环行结构。在一个优选的实施方案中，从磷中悬挂的X部分是二甲基氨基基团[N(CH3)2]。
图1的亚基C-E设计为7-原子单位-长度的骨架正如图2的C到E所示。在图1的结构C中，X部分正如图1的结构B中，而且Y部分可能是亚甲基，硫，或优选的是氧。在图1的结构D，X和Y部分正如图1的结构B。在图1的结构E中，X正如结构B中，而且Y是O，S，或者NR。在图1A-E说明的所有的亚基，Z是O或S，且Pi或Pj是腺嘌呤，胞嘧啶，鸟嘌呤，或尿嘧啶。
优选的“吗啉”寡聚核苷酸由图2B所示的吗啉亚基结构组成，在此(i)结构通过含有磷的连接相连，一个到三个原子长，将一个亚基的吗啉的氮和一个邻近亚基的5’环外的碳相连，而且(ii)Pi或Pj是嘌呤或嘧啶，通过碱基特异的氢键的碱基配对部分有效地结合到一个多聚核苷酸的一个碱基。
C优选的反义靶位点
在本发明的实践中，从目的基因的相关区域转录得到的mRNA一般可以作为反义寡聚核苷酸的靶点，然而，单链RNA，双链RNA，单链DNA，或双链DNA也可以作为靶点。例如，使用为序列特异结合于双链DNA大沟处设计的非离子型探针，双链DNA就可以作为靶点。典型的探针在美国专利第5,166,315号(Summerton and Weller，1992)中有描述，在此一并参考。在此提到的这些探针一般是反义寡聚物，它们的作用是阻止靶核苷酸的表达。
在本发明的方法中，反义寡聚物被设计用来在生理条件下杂交到c-myc核苷酸序列的区域上，其Tm基本上高于37℃，例如至少50℃，优选的60℃-80℃。寡聚物被设计成与核苷酸有高度结合的亲和力，可以100％与c-myc靶点序列互补，或者也可以包括一些错配，例如，可以接受的等位基因突变，只有寡聚物与c-myc靶点序列形成的异源双链核酸分子足够稳定，在它从细胞转移到体液的过程中可以经受细胞内核酸酶的作用和其它形式的降解。错配，假如存在的话，朝向杂交双链的末端的错配会比位于中间的错配更不稳定一些。根据对双链稳定性的很好的了解，允许的错配数取决于寡聚物的长度，双链中G∶C碱基对的比例，双链中错配的位置。
虽然这样的反义寡聚物并不需要100％与c-myc靶点序列互补，但是稳定地，特异地结合到靶点序列是高效的，这样c-myc的表达就可以调节。要稳定地，高效地结合，同时有很好的特异性的寡聚物的合适长度是8-40个核苷酸碱基对，优选的大约12-25个核苷酸。假定与靶点的碱基配对的特异性可以保持，也可以考虑允许用靶点碱基简并碱基配对的寡聚物碱基。
在一个优选的方法中，使用本发明的反义方法进行基因表达调节的靶点，包括跨越c-myc的mRNA翻译起始密码子的序列。在一个可替代的优选方法中，c-myc mRNA的剪接受体区域是靶点。也可以理解为c-myc mRNA其它区域也可以是靶点，包括一个或多个起始密码子或启动子位点，一个内含子或外显子连接位点，一个3’-未翻译区域和一个5’-未翻译区域。进一步可以理解为经剪接的和未剪接的RNA都可以作为设计反义寡聚物的模板，在本发明的方法中使用。(见，例如，Hudziak et al.，2000，expressly incorporated by reference herein)。
Hudziak et al.，2000描述了一些c-myc mRNA的反义寡聚物，表现为对转化的人和小鼠成纤维细胞有抗增殖作用(分别为NRK和W1-38)。典型的反义寡聚物在以下的表1中提供。
                       表1   典型的反义寡聚物
 寡聚物#  序列1 长度(碱基)  种类
 92  GMT MMM TMT GTM TMT MGM TGG(SEQID NO：5) 21  R，H
 93  MMG MMM GMT MGM TMM MTM TG(SEQID NO：6) 20  R，H
 25  GGC AUC GUC GUG ACU GUC GGG UUUUCC ACC(SEQ ID NO：7) 30  R
 21  GGG GCA UCG UCG UGA CUG UCU GUUGGA GGG(SEQ ID NO：8) 30  R
 108  CGU CGU GAC UGU CUG UUG GAG(SEQ IDNO：9) 22  R
 111  CGT CGT GAC TGT CTG TTG GAG G(SEQ IDNO：10) 22  R
 37  GGC AUC GUC GCG GGA GGC UGC UGGAGC G(SEQ ID NO：11) 28  H
 26  CCG CGA CAU AGG ACG GAG AGC AGAGCC C(SEQ ID NO：12) 28  R
 126  ACG TTG AGG GGC ATC GTC GC(SEQ IDNO：1) 20  R，H
 174  TTG AGG GGC ATC(SEQ ID NO：13) 12  R，H
在本发明的典型例子中，反义寡聚物是含有见于SEQ ID：1，SEQ ID No：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，或SEQ ID NO：11所示序列的PMO
1所有的序列表示为5’到3’方向；M指5-甲基的胞嘧啶；T指胸腺嘧啶，R指与大鼠的c-myc序列互补的序列，H是指与人的序列互补的序列。
IIIc-myc
c-myc是调节细胞生长，分化，凋亡的原癌基因，在人类癌症中经常可以观察到它的异常表达。c-myc的异常，组成性的，或过度表达与许多人类癌症有关，包括肺癌，结肠癌，乳腺癌，膀胱癌，白血病，肺癌等(见，例如，Bieche et al.，1999)。
原癌基因可以被一些机制激活成为癌基因，包括：(1)启动子插入，(2)增强子插入，(3)染色体易位，(4)基因扩增和(5)点突变。如在此使用的，关于原致癌基因“激活”是指基因的转录增加，例如，从不表达到低水平表达。机制(1)-(4)导致癌基因表达水平的增加，同时(5)导致改变了的基因产物的表达。证据表明-些形式的癌基因的表达与肿瘤抑制基因的失活均对癌症的发展是必须的。
Myc原致基因已经作为转录因子进行了描述，转录因子直接调节其它基因表达。转录因子的例子包括ECA39，p53，鸟氨酸脱羧酶(ODC)，α-原胸腺素和Cdc25A(Ben-Yosef et al.，1998)。
在鸡中，鸡的B-细胞被某种鸟类的白血病病毒感染后，前病毒在myc基因附近整合，其经由病毒的长末端重复(LTR)序列活化，该作用即作为启动子也可以作为增强子，导致myc的表达和B-细胞的形成。相似地，在Burkitt’s淋巴瘤，一段增强子序列转位导致myc的表达(参见，如，Gauwerky et al.，1993)。
c-myc在正常的造血干细胞中表达，并且已经表明其表达可以增加了人上皮干细胞的分化(Gandarillas et al.，1997)。曾经观察到当静止的细胞重新进入细胞循环，c-myc的表达上调，异位表达c-myc对应于生长一抑制信号，分化刺激，或去除促细胞分裂剂阻止细胞周期静息，(见，如，Amati et al.，1998.)进一步，在结肠癌细胞中表达一个凋亡抑制因子，即bc1-2，其与c-myc的表达密切相关。(参见，如，PopescuRA et al.，1998.)
在用c-myc反义硫代磷酸寡聚物处理c-myc过表达的白血病和结肠癌细胞系，使用一个竞争性的RT-PCR反应来观察到在白血病和结肠癌细胞系中对于细胞增殖的抑制，同时检测到c-myc的mRNA分别下降20-到100-倍(Li et al.，1995.也参见，McGuffie et al.，2000；Skorski et al.，1997和Huang et al.，1995)。此外，与c-myc的mRNA的蛋白结合靶位点反义的寡聚脱氧核糖核酸，表明通过序列特异性的方式抑制了RNA结合的75％。用这样的c-myc反义寡聚核苷酸处理K562细胞显示，在c-myc的mRNA和蛋白水平上，具有浓度依赖性的降低。作为对比，一个c-myc反义寡聚核苷酸靶向于翻译起始密码子，反义寡聚核苷酸显示出降低了c-myc蛋白水平但是却增加mRNA水平(Coulis et al.，2000)。
此外，在猴子中对硫代磷酸寡聚脱氧核糖核酸的肾脏效应的研究表明了非特异性和毒性的证据。表明化合物聚集在肾脏中，高剂量时诱导近曲小管退化(Monteith et al.，1999)。这可能归因于硫代磷酸寡聚核苷酸的电荷性质，导致了其与化疗剂共沉淀，并且聚集并沉淀于肾脏。作为对比，与带电荷的硫代磷酸寡聚核苷酸不同，本发明的PMOs实际上不带电荷而且因此缺乏一个和诸如cispaltin的化疗剂的相互作用或者共沉淀的位点。
令人惊奇的是，当c-myc反义寡聚物用于治疗一种造血干细胞数目的富集群时，如在共同拥有的美国专利序列号09/679,475(PCT出版号，WO 01/25405)中描述的调整了造血干细胞的数目。
本发明反映了令人惊奇的发现，当一个与c-myc反义的寡聚物与几个广泛应用的化疗剂组合应用时，增加了抗癌效果。得到的结果列于实施例1中，使用一个用来自C57BL小鼠肿瘤的Lewis肺细胞的模型，再用与c-myc(AVI-4126，SEQ ID NO：1)反义的寡聚物处理肿瘤抑制c-myc的表达，发现该抑制依赖于相对于cispaltin处理的反义寡聚物的应用时间。此外，显示出c-myc反义的寡聚物显著增加了cispaltin，依托泊甙和紫杉酚，但不可以是5-FU的抗肿瘤的活性。(见图8A-D)
IV.传统的癌症治疗方式
目前的癌症治疗方式具有许多缺陷，其中最重要的是缺乏效率并且常有毒副效应。癌症治疗剂用于临床的一个主要限制是对治疗抗性的发展。对于许多化疗剂已经观察到药物抗性的问题，包括用于治疗实体瘤和白血病的cispaltin型化合物。这些抗性一般是被在化学治疗后的肿瘤的复发所证实。结果，大多数治疗方式包括两种或更多的不同的药物作为避免抗性的方法。此外，一般需要高剂量的化疗剂来进行有效的治疗。这样的高剂量伴随有毒的副作用。
在本发明实践中使用的化疗剂包括任何的许多在癌症治疗上使用的已经建立起的试剂。在本发明的示范性使用的化疗剂是抗代谢物，引起氧化应激反应的化合物，和拓扑异构酶的抑制物。并不限制于任何一种特定的理论，据信化疗剂对较小分化的细胞更具毒性，而且更多高分化的癌症细胞的数量在使用化学治疗后，仍用化疗剂是难治的。这些细胞可能更分化而且相应的对抑制剂更敏感的，或者经过c-myc反义的寡聚物导致细胞死亡。
示范性的抗癌药物包括，但不限于：(1)抗代谢药如叶酸类似物和氨甲喋呤，(MTX)；嘧啶类似物如5-氟尿嘧啶，(5-FU)，氟脱氧尿嘧啶，胞嘧啶阿拉伯糖苷和阿糖胞苷；嘌呤类似物如6-巯基嘌呤，(6-MP)和6-硫鸟嘌呤，(6-TG)；(2)烷基化试剂如氮芥，甲二氯二乙胺，环磷酰胺(CytoxanR)，苯丙氨酸氮芥，和苯丁酸氮芥；(3)天然产物包括，但不限于长春碱，长春新碱(OncovinR)，长春花碱(VelbanR)，vinorelbine(NavelbineR)，epipodophylotoxins，etoposide(VePesidR，VP-16)和紫杉酚(PaclitaxelR)；(4)特征为抗肿瘤抗生素的化合物，包括，但不限于蒽环类抗生素，亚德里亚霉素盐酸盐，(adriamycinR)，红必霉素，去甲柔红霉素，米托蒽醌，博莱霉素，(blenoxaneR)，放线菌素D(actinomycin D)，丝裂霉素C，plycamycin和(mithramycin)；以及(5)杂项试剂包括，但不限于顺铂，卡铂，门冬酰胺酶，羟基脲，米托坦(o，p’-DDD；Lysodren)，他莫芬和强的松。
顺铂(也叫做顺-铂，platinol；顺-二氨基二氯铂；和cDDP)是代表一个广泛的水溶性，铂配位化合物经常用于治疗睾丸癌，卵巢癌，和各种其他癌。(参见，如Blumenreich et al.，1985；Forastiere et al.，2001)。
临床使用cDDP的方法对于本领域技术人员比较简单。例如，已经一天超过6小时应用cDDP，每月一次，通过缓慢的静脉滴注。对于局步的损伤，cDDP可以通过局部注射来进行应用。也可以使用腹腔内滴注。如果是多药物方案的一部分，或者如果病人对于一个较高剂量具有抗性反应，CDDP的应用剂量可以低至每一次治疗10mg/m2。总体上，临床量是每一治疗从大约30到大约120或150mg/m2。
典型地，一个含铂的化疗剂在肠胃外的应用，例如通过缓慢的静脉滴注，或通过局部的注射，如上面所讨论的。损伤内(肿瘤内)和IP应用顺铂的效果说明于Nagase et al.，1997和Theon et al.，1993。
尽管顺铂广泛使用，报道的应用顺铂(cDDP或者Platinol)后的副作用，是普遍的且包括毛发变稀少变脆，食欲和/或体重下降，腹泻，恶心和呕吐，以及在手指或脚趾麻木或发麻。总的来说，顺铂的副作用是非特异的和应用顺铂导致对所有快速生长的组织的损伤。参见，如，Gandara et al.，1991；Peters et al.，2000；Jones et al.，1995；和ByhardtRW，1995)。
此外，顺铂是有效对抗窄范围的肿瘤而且已经报道了抗性的发展(Onoda et al.，1988)。
紫杉酚(Paclitaxel)是一个复杂的双萜类，最初少量分离自不同种类的红豆杉的树皮(Taxaceare)。目前的紫杉酚可以通过化学合成的方法制备。(参见，如，Nicolaou et al.，1994)
紫杉酚组成在癌症化学治疗的一种强效药并且经过FDA批准用于治疗卵巢和乳腺癌而且在肺癌，皮肤和头/颈癌症的治疗上有强效。
紫杉酚和相关药物的临床应用由于成本，受限的生物利用度(归因于低的水溶性)，以及发展的抗多种抗毒性细胞曾经受限。已经表明，增溶剂，如Cremophor(聚醚氧化的蓖麻油)和乙醇可以提高溶解性和形成微囊化。(参见，如，WO 93/18751)
总的来说，对于紫杉酚(Paclitaxel)的副作用的报道，包括白细胞和红细胞计数的下降，感染，恶心和呕吐，食欲下降，味觉改变，毛发脱落，关节和肌肉疼痛，肢端麻木和腹泻。
依托泊甙(依托泊甙(VP-16，VePesid Oral)目前应用于治疗不同的癌症，包括睾丸癌，肺癌，淋巴癌，成神经细胞瘤，非-何杰金氏恶性淋巴瘤，卡波济氏皮肤多发性出血性肉瘤，韦尔姆斯氏瘤，各种类型的白血病以及其他。
依托泊甙一般口服或者静脉注射使用。与应用依托泊甙口服(VP-16，VePesid Oral)相联系的副作用包括恶心和呕吐，食欲下降，腹泻，胃疼，疲乏和毛发脱落。依托泊甙最初的剂量限制副作用和相关的化合物是中性粒细胞减少，这往往非常严重，尤其是在用过量的化疗剂或放射治疗以后的病人。
5-FU，(氟尿嘧啶商标为：5-FU，Adrucil)已经用于化学治疗各种癌症，包括结肠癌，直肠癌乳腺癌，胃癌，胰腺癌，卵巢癌，宫颈膏剂癌，膀胱癌，阴道瘤，和光化性角化病(一种癌前皮肤病变)。5-FU一般静脉应用(IV)，注射，IV灌注(滴注)，口服，或者直接用于皮肤的膏剂。5-FU与大量的记载的副作用有关包括毛发脱落，头疼，体弱，疼痛不止，皮肤对阳光敏感，皮肤痤疮或起皮，食欲和/或体重下降而且手或脚发麻。
目前的化学治疗方法存在已知的广泛的副作用和缺乏长效，降低或去除这些副作用和/或表现出增强的治疗效果的新的改进的癌症治疗方法对于医药界具有显著的价值。
V使用本发明的方法治疗癌症
本发明提供方法使用一种反义寡聚核苷酸介导的编码c-nyc的核酸序列，结合一种传统的癌症治疗方法如，化学治疗和/或放射治疗来治疗癌症。
本发明的基础是发现一种稳定的实际上不带电荷的反义寡聚核苷酸，其具有高的Tm，可以活化或便于释放至细胞，而且可以以高亲和力结合于互补或接近互补的c-myc核酸序列，可以应用于癌症病人，来抑制细胞表达c-myc，当与一种传统的化疗剂共同使用，结果可以调节肿瘤的生长。
癌症的治疗
在体内与一种传统的癌症治疗方法一起应用c-myc反义寡聚物于一个受体，应用在此说明的方法对病人可以得到改善的治疗效果，依赖的许多因素包括(1)治疗期限，剂量和c-myc反义寡聚物的应用频率，(2)治疗期限，剂量和频率以及应用于化学治疗的化合物，(3)相对于应用化疗剂的c-myc反义寡聚物的治疗期限和时间，以及(4)受验者的总体状况。
总的来说，对于一个癌症病人来说一个改进的治疗结果是指使癌细胞或实性肿瘤的生长变慢或者变小，或者使癌细胞的总数量或者总的肿瘤负荷变少。
在一个本方法优选的应用中，受验者是人类。受验者也可以是一个癌症病人，尤其是一个诊断为具有白血病，淋巴瘤，成神经细胞瘤，乳腺癌，直肠癌，肺癌，或任何一种癌症的病人，该病人曾经用或者正在使用化学治疗或放射治疗进行治疗。该方法也可以应用于治疗急性或慢性粒细胞性白血病，肝胆管型肝癌，黑素瘤，多发性骨髓瘤，骨肉瘤，胃瘤，神经胶质瘤，膀胱，宫颈，结肠直肠的，卵巢的，胰腺，前列腺和胃癌。
化学治疗和/或放射治疗单独或者与干细胞移植一起对于大多数恶性肿瘤，包括急性淋巴细胞白血病，慢性粒细胞性白血病，成神经细胞瘤，淋巴瘤，乳腺癌，直肠癌，肺癌，卵巢癌，胸腺瘤，生殖细胞肿瘤，多发性骨髓瘤，黑色素瘤，睾丸癌，肺癌，和脑癌是标准的治疗方法。
很多癌症的治疗方法导致病人的免疫抑制，病人出现贫血，血小板减少(低的血小板计数)，和/或中性白细胞减少(低的中性粒细胞计数)。在这样的癌症治疗后，病人一般不能抵御感染。对于免疫抑制的支持性护理可以包括保护性地隔离病人，以便使病人不暴露于感染性制剂；应用：抗生素，如。抗病毒制剂和抗真菌制剂；和/或周期性的输血来治疗贫血，血小板减少和/或中性白细胞减少。
一种增加造血干细胞(HSC)数目的方法是通过将包含HSC的细胞群与c-myc反义寡聚物接触，以一种方式有效地增加造血干细胞的数目以用于治疗人类癌症病人，该方法已经在共有的美国申请序列号09/679，475(PCT出版号，WO 01/25405)中有说明，在此一并作为参考。该参考说明的是使用c-myc治疗方法，依赖于培养条件(WO01/25405)来增加HSC的数目而且增加来自HSC的特定谱系的定型祖细胞的数目。
由于机制并不是本发明的部分，已经在以前说明了癌基因通路之间的增效，而且已经提出下调c-myc表达用于优选的第二个癌基因通路(D’Cruz et al.，2001)的选择。在此说明的该结果表明，尽管c-myc水平的降低是通过反义处理肿瘤来实现的，c-myc反义寡聚物的处理并不改变生长速率。这与c-myc表达影响转化过程的模型相一致，但是这不是涉及保持转化表型唯一的因素。在与一种传统的化疗剂组合应用c-myc反义寡聚物之后观察到的令人惊奇和意想不到的结果表明c-myc可能在保持转化表型中也是非常重要的。在此所列的结果(实施例1)表明，LLC1肿瘤，其固有地抗顺铂，在用包括一段c-myc(AV1-4126，SEQ ID NO：1)的反义寡聚物的处理表现出对顺铂的敏感性提高。当在化学治疗后，用c-myc反义寡聚物处理，肿瘤对顺铂和紫杉酚处理的敏感性显著提高，而且对依托泊甙的程度较低。
发现在此说明的治疗方法和相关的组合传统化学治疗与应用c-myc反义寡聚物的治疗方案在治疗多囊肾病和治疗心血管疾病中也有效。尤其令人感兴趣的治疗方案是组合应用顺铂或紫杉酚与应用c-myc反义寡聚物。在这一治疗方案中，化疗剂的应用可以先于，同时，或后于反义寡聚物的应用。
治疗方案
本发明提供了用于癌症治疗的方法，其中与c-myc反义寡聚物和一种或多种化疗剂应用于病人中。在此描述的方法优选的方面，c-myc的反义寡聚物的应用先于或者后于，但不能同时一种或多种化疗剂的应用。
在一个优选的实施方案中，顺铂的应用于病人先于，或后于，但不能同时与c-myc反义寡聚物的应用。
在一个示范性的实施方案中，顺铂(cDDP，Platinol)，紫杉酚(Paclitaxel)或依托泊甙(VFP-16，VePesid Oral)每天应用从1-5，且优选的是3个连续日，然后通过一天或多天不进行抗癌治疗的时间间隔，然后应用c-myc的反义寡聚物从2到7天而且优选是5个连续日，化学治疗和反义寡聚物应用的周期重复至少2次。
在另一个示范性的实施方案中，顺铂(cDDP，Platinol)，紫杉酚(Paclitaxel)或依托泊甙(VFP-16，VePesid Oral)每天应用从1-5，且优选的是3个连续日，然后应用c-myc的反义寡聚物从2到7天而且优选是5个连续日，化学治疗和反义寡聚物应用的周期重复至少2次。
在另一个优选的实施方案中，连续应用与c-myc反义的寡聚物和化疗剂，而且时间间隔至少一天。优选地，每天使用与c-myc反义的寡聚物应用至少两天，然后应用一种化疗剂一天或几天，轮换应用与c-myc反义的寡聚物和化疗剂，重复至少两次。应用两种化合物的时间间隔优选地至少是三倍于最后应用的一种化合物半衰期的三倍，来保证在应用另一化合物之前最后应用的化合物大部分从病人体中清除。
一般地，化疗剂化合物的清除的半衰期时间是2到6个小时，因此应当留出6-24小时用于从病人的体内的清除。与c-myc反义的寡聚物一般的清除半衰期是18-24小时，因此应当留出2-3天的期限用于从病人体内清除。
本领域技术人员应当懂得，最佳的治疗方案可以有所变化，在化学治疗和反义寡聚物应用前和进行了一轮或多轮的化学治疗和反义寡聚物应用后评估在治疗条件下疾病的状态和病人总体的健康状态来确定是否需要进一步轮次的化学治疗和反义寡聚物的应用，这也属于本发明的治疗方法的范围。这一评估一般是通过使用一般传统的癌症化学治疗的测定方法来进行，在以下的题目为“检测治疗”部分进行进一步的描述。
在本发明实践中应用的优选的治疗方案一般包括在应用c-myc反义的寡聚物前应用一种或更多种化疗剂。因为机制并不是本发明的部分，在化学治疗后，许多对于化学治疗有抗性的许多癌细胞仍然存活，而且这些细胞可能有更高程度的分化因此易受化学治疗后应用的c-myc反义寡聚物影响改变。
正如以上的细节描述，优选的在这些方法中应用的反义寡聚核苷酸实际上是不带电荷的二氨基磷酸酯吗啉寡聚物(POMs)，其特征是稳定、具有高的Tm值，而且能够活化或者便于释放，证据为：(I)竞争性地结合于硫代磷酸反义寡聚物，和/或(ii)转移一个可以检测到的报告基因进入细胞的能力。
在这一实施方案的一个优选的方面，寡聚物是一个选自包含于SEQ ID NO：1 SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，和SEQ IDNO：11中序列的PMO。
化疗剂的释放
本发明的一个重要方面是用药学上可以接受的载体来有效地释放一种或多种化疗剂。
与本发明的一个方面一致，选择化疗剂和相应的治疗方法以及释放的时间可以利用一种或多种优点：(1)在治疗条件下对于特定类型癌症的治疗已经建立的用法(ii)当与c-myc反义寡聚物组合应用时选择的化疗剂来获得改善治疗的能力；和(iii)通过一种有效地局部释放化疗剂的应用模式来获得足够的试剂与癌细胞接触。
在本发明的实践中，通过一种技术治疗方法应用化疗剂而且使用一种在癌症化学治疗建立用法的治疗方案。正如前述，理想的治疗方法应当随着化疗剂变化。然而，优选的治疗方法一般包括缓慢的静脉注射(IV滴注)，口服和局部注射。配方以不同的剂量形式如可注射的溶液，药物释放胶囊，移植或与载体如脂质体或微胶囊组合使用而易于应用。
对于大量的化疗剂，推荐的剂量和剂量形式已经建立而且可以通过传统的来源，如Physicians Desk Reference，Published bv MedicalEconomics Company，Inc.，Oradell，N.J.来获得如果必要，这些参数可以通过每一个系统按照建立好的程序和分析来决定，如，用临床试验。
例如，当口服应用时，活性化合物可以与一种惰性稀释剂组合或者在一种可以吃的载体中，或者包绕于硬的或软的外壳明胶胶囊，压缩成片剂，直接装配于食物中，装配于赋形剂而且以可吸收的片剂，颊含片，片剂，胶囊，酏剂，混悬液，糖浆剂，糯米纸囊和类似物的形式使用。适当量的活性化合物是特异地特定的化疗剂，而且一般是本领域常识。在这一治疗性有用的组合物的活性化合物的量将获得合适的剂量。
胃肠外用药的应用可以使用一种合适的缓冲的水溶液和液体稀释剂完成，其使用盐水或葡萄糖等渗形式制备。这样的水合溶液适于静脉注射，肌肉注射，皮下注射，和腹腔内注射。(参见，例如，“Remington’s Pharmaceutical Sciences”，15th Edition，p1035-1038和1570-1580页)，灭菌的注射溶液通过包含其它成分的需要量的合适的溶剂混合化疗剂制备，然后过滤灭菌。溶于无菌的可注射溶液所用的无菌的粉末可以通过真空干燥或冻干技术或者其他的方法制备，得到的具有活性的化疗剂的粉末加上另外所需的在以前制备的无菌溶液组分。
可以理解本发明试图进行包括应用一种或更多种化疗剂和应用c-myc反义寡聚物的治疗方式化学治疗癌症的治疗方案。这一治疗方式可以在另外的癌症治疗如放射治疗，进一步的化学治疗和/或免疫治疗前，同时，或者之后进行。
本发明提供的优点是，当在进行包括相对于不包括c-myc反义寡聚物的治疗方案，包括c-myc反义寡聚物的治疗方案进行时，一种或更多种化疗剂的剂量可以降低。这样的组合治疗对于那些年龄小或年龄大或者那些其癌症抗拒不包括应用c-myc反义的寡聚物的治疗方法是有利的。
反义寡聚物释放至病人中
有效地传送反义寡聚物至靶c-myc核酸序列是本发明方法的一个重要方面。依照本发明的一方面，在下面讨论的药物应用方式利用一个或更多种主要特征：(I)应用一种细胞高效率吸收的反义化合物，(ii)反义化合物干扰c-myc的mRNA形成和mRNA翻译的能力，和(iii)通过一种有效的应用方式释放反义寡聚物得到在癌细胞的该化合物的局部的高浓度。
按照本发明，有效地传送c-myc反义寡聚物可能包括，但不限于，不同的系统性的治疗方法，包括口服和肠道外给药治疗方法，如，静脉，皮下，腹腔内注射和肌肉注射；以及吸入法和经过皮肤释放。
可以理解的是也可以考虑任何有效c-myc反义寡聚物至受验者血流中的任何方法。
经过皮肤传送反义寡聚物可以通过使用一个药物学上可接受的载体，该载体适用于如，局部应用的载体。在PCT的专利申请WO97/40854说明的吗啉寡聚物释放的一个例子，在此一并作为参考。
应用的c-myc反义寡聚核苷酸和化疗剂的量是组合两种类型的制剂的治疗有效性。剂量将随着病人的年龄，健康状况，性别，大小和体重，用药的方法，药物的毒性，癌症的对于寡聚核苷酸和化疗剂的相对易感性这些因素而改变。
一般地，应用一种或多种剂量的反义寡聚物，一般为有规律的大约一至两周的间隔期。优选的用于口服的是从大约1mg寡聚物/病人至大约25mg寡聚物/病人的剂量(以一个成人的体重是70kg计算)。在一些情况下，超过25mg寡聚物/病人的量可能是需要的。对于应用IV优选的剂量从大约0.5mg寡聚物/病人至大约10mg寡聚物/病人的剂量(以一个成人的体重是70kg计算)。一般应用的反义化合物应用的量足够得到一个峰值的血浓度至少为200-400nM的反义寡聚物。按照需要可以应用较高或较低寡聚核苷酸的量而且保持的剂量可以较低。
总的来说，所述的方法包括对于受验者以一种适合的药物载体，应用一定量的可以有效抑制c-myc核酸靶序列表达的反义寡聚核苷酸。
反义寡聚核苷酸组合物可以任何生理上可以接受的方便的载体进行应用。这样的一种寡聚核苷酸组合物可能包括任何本领域技术人员应用的各种标准的生理上可接受的载体。这些药物载体的实施例包括但不限于，盐水，磷酸盐缓冲液(PBS)，水，水合乙醇，乳剂如油/水乳剂，甘油三酸酯乳状液，湿润剂，片剂和胶囊。可以理解选择合适的生理上接受的载体将依赖于施药方式的选择。
在一些例子中可以应用脂质体来便于反义寡聚核苷酸进入到细胞。(见，如，Williams AS，1996；Lappalainen et al.，1994；Nakamura et al.，2001；和Lou et al.，2001.)
也可以应用水凝胶作为应用反义寡聚物的载体，例如，正如在WO93/01286说明的。可以选择的，寡聚核苷酸可以以微球或者微粒的方式给药。(参见，如，Wu et al.，1999.)
持续释放组合物也属于本申请的范围。它们可以包括半渗透的聚合物基质，其为如薄膜或微囊的定型的粒子。
可以理解为，本发明方法中应用的c-myc反义寡聚核苷酸的在体内的有效剂量按照应用方法和应用频率以及在治疗中受验者的状况而变化的。因此，这种体内的治疗一般需要通过测试评估治疗的状况来监测，而且随之进行剂量和治疗方案的相应的调整来达到最佳的治疗结果。
在一个优选的实施方案中，寡聚物是包含于药学上接受的载体中的二氨基磷酸酯吗啉寡聚物(PMO)，并且口服释放。在该实施方案的进一步方面，以常规的间隔应用一个吗啉c-myc反义寡聚核苷酸一段时间，如，每天服用进行两周或更短的时间。然而，在一些情况下，可以间歇应用反义寡聚物进行更长的一段时间。
在一些情况下，治疗方案将包括干预如放射治疗，免疫治疗，和/或另外的化学治疗。这些治疗可以先于，同时或者后于应用化疗剂和c-myc反义寡聚物的治疗。
VI反义寡聚物效果评价
A 反义寡聚物治疗效果的分析
根据熟知的方法，评估候选的反义寡聚物的急性和慢性的细胞毒性，例如分别结合3H-亮氨酸和3H-胸腺嘧啶脱氧核苷测定对蛋白质和对DNA合成的效果。另外，为了确证候选反义寡聚物结合特异性，几种对照寡聚核苷，例如，有义，无义或不规则的反义序列或含有错配碱基的序列。这样的检验的结果对于把基因表达的反义抑制的特异效果与不加选择的抑制加以区别是重要的(见，例如，Bennett et al.，1995)。相应的，序列可以根据需要加以修饰以限制反义寡聚物与非靶点序列的非特异性结合。
特定的反义寡聚物分子在与靶mRNA形成异源双链核酸分子的有效性可以用已知的筛选法来测定。例如，寡聚物可以孵育在表达c-myc的细胞培养基中，通过监测(1)双链核酸分子形成，使用那些熟练的技术人员已知的方法，寡聚物与目标序列和非目标序列形成异源双链核酸分子，(2)c-myc mRNA的量，使用标准的技术，例如RT-PCR或Northern blot确定或(3)c-myc蛋白质的量，使用标准技术例如ELISA或Westem blot确定，根据有信号或无信号来评价寡聚物对目标RNA的效果。
B. 动物模型
为了评估抗癌治疗，常规地被那些专业技术人员采用的动物模型，用于阐明本发明方法的效能。例子在Smith et al.，2000中有描述。模型以Lewis肺细胞(LLC1)，高度致肿瘤的肺癌细胞系，移植进入同源C57-blk小小鼠为基础。当200,000个细胞皮下移植入C57-BL小小鼠的右侧腹部，四天后LLC1产生可辨其它肿瘤。每天用卡钳测量肿瘤的长宽，在25天研究后测量肿瘤的重量，以此为基础评估治疗的效果。一个20个碱基的c-myc mRNA PMO反义链(AVI-4126，SEQ ID NO：1)在模型中评估其效能。以300μg/小鼠/天ip注射后，在肿瘤组织中发现完整的AVI-4126，AVI-4126降低c-myc表达，但不能极大的降低肿瘤的生长。AVI-4126ip注射(300μg/小鼠/天)也与化学治疗相结合。在2-4天和13-15天注射顺铂(83μg/小鼠/天)，同时在2-8天和13-19天注射AVI-4126，这种共注射与单独注射顺铂相比较对于肿瘤生长抑制没有附加作用(实施例1)。在2-4天和13-15天注射顺铂，然后在6-12天和17-23天注射AVI-4126，这种的组合方法抑制肿瘤的生长，大大地高于单独使用顺铂，显示抗肿瘤效能要求分开的顺铂和AVI-4126治疗的剂量日程(图8A)。与紫杉酚合并表明抗肿瘤活性增加，比依托泊甙程度降低。
在实施例1中描述的结果进一步说明用AVI-4126治疗抑制LLC1肿瘤中c-myc表达，与化疗合并AVI-4126有作为有效的抗肿瘤剂的潜力。
VII监测治疗
特定的治疗剂，包括在此描述的方法，其效能可以受到监测，例如，使用在治疗情况下使用适于癌症类型的诊断技术。
以这些诊断实验的结果为基础，如所指出的，一种评估方法的确切性质将不同程度的取决于治疗的条件并且治疗剂可以进行调节(剂量，频率，治疗方法，等)。
可以理解使用本发明的反义寡聚核苷体内治疗方式的有效性将根据给药的频率和路径，同时治疗中受验者的情况(例如，预防性给药与相应的局部或系统感染给药对比)而改变。相应地，为了获得最佳的治疗效果，在治疗情况并且相应在剂量或治疗方式上加以调节，这样的体内治疗一般要求由合适于特定类型情况，即癌症，的检验来监测。
癌症的诊断和监测一般包括一种或多种(1)活组织切片检查，(2)超声波，(3)X-光，(4)磁共振成像，(5)核酸检测方法，(6)血清学的检测方法，例如，传统的免疫测定和(7)其它生化方法。这样的方法可以是定性的或定量的。
可以通过例如，如以上进一步描述的治疗中疾病情况的一般指征来监测包括在此讨论的方法的特定的治疗方案。
治疗中核酸探针可以基于c-myc或与特定的癌症相关的其它核酸序列设计。核酸扩增检验(例如PCR)也可以在这些检测方法中使用。
可以理解诊断检验和疾病情况的其它生理因子指征的确切特性将依赖被治疗的和是否治疗是预防的或治疗的特定情况而改变。
在受验者被诊断为有特定类型的癌症的情况下，癌症的状况也可以使用一般由技术熟练人员使用的诊断技术监测治疗中癌症的特定类型。
如所显示的，以治疗中受验者的免疫测定，其它生化检验和生理检验的结果为基础调节反义寡聚物治疗方案。
VIII本发明应用/实用性
如在此所讨论的，用c-myc反义寡聚核苷酸治疗癌症加上传统的癌症治疗例如化学治疗和/或放射治疗发现在减缓或降低癌症生长和/或蔓延方面有效用。例如，本方明的方法可以：(1)抑制或使癌细胞的生长静息；(2)允许低剂量的和/或短期的化疗给药，这样可以降低毒副作用；(3)允许低剂量的或短期的化疗剂给药，可以降低对化疗试剂的抗性的发展的可能性；(4)提供一种反义寡聚物(例如一种PMO)，其不带电荷，不会与化疗试剂产生沉淀；(5)当以缺少c-myc反义寡聚物给药的治疗方案给药时，给不能耐受为了使化疗有效的化疗试剂的患者人群提供一种可替代的和有效的治疗方式。
在本说明书中引用的所有专利和参考文献在此一并引入以供参考。
以下实施例阐明本发明但并不意谓着在任何方面限制本方明。
材料和方法
吗啉寡聚物的合成。与c-myc转录起始位点(AVI-4126；SEQ IDNO：1)序列互补的吗啉磷酸二酰胺寡聚物(PMOs)，小鼠p21序列(SEQID NO：3)，小鼠RAD51序列(SEQ ID NO：4)和混杂的对照(SEQ IDNO：2)由AVI-BioPharma，Inc.Corvallis，OR)合成并纯化。通过反相HPLC和MALDI TOF质谱确定纯度大于90％。冻干的PMOs溶解于无菌盐水中用于注射。
肿瘤细胞。在此描述的用于研究的Lewis肺细胞系(LLC1)从Lewis肺癌中获得，1951年由Dr.M.R.Lewis建立，并且用于评估癌症化疗试剂Mayo；1972；Bertram et al.，1980)。Lewis肺癌细胞保持在DMEF-12培养基中，添加10％小牛血清，青霉素(100单位/ml)，链霉素(100μg/ml)，两性霉素(0.25μg/ml)，37℃，5％CO2/95％空气的增湿培养箱中培养。移植时细胞作为对数生长期大约70％汇合收获培养的细胞，以培养基中细胞悬液的方式注射，浓度为200,000细胞/100μl注射液。
同基因小小鼠。重22到24克的C57BL/6J小小鼠(Simonsen，Gilroy，CA)被置于Laboratory Animal Resources Facility at Oregon StateUniversity(OSU)，Corvallis，OR的无菌塑料笼里。小小鼠任意的获得啮齿动物的食物和自来水，并且12小时光/暗循环。所有的动物程序都符合1975年赫尔辛基宣言的道德原则，并且得到OSU的‘InstitutionalAnimal Care and Use Committee’的批准。
c-myc蛋白的免疫印迹分析。所有的抗体都从Santa CruzBiotechnology(Santa Cruz，CA)获得。三百微克的LLC1蛋白溶胞产物用5％的SDS/丙烯酰胺浓缩胶，12％v/v十二磺酸钠(SDS)/丙烯酰胺分离胶分析。根据标准的Western印迹程序进行凝胶印迹，探针标记，观察。兔抗小鼠c-myc多克隆抗体N-262(sc-764)或C-19(sc-788)，用阻断缓冲液(Genotech)1∶2000稀释，对膜进行探针标记，然后用羊抗兔HRP-结合的抗体(sc-2054)进行显色。c-myc和肌动蛋白的相对量用ECLplus(Amersham，Piscataway，NJ)测定，在Kodak440成像站上用1D成像分析软件分析(Kodak，Rochester NY)。然后膜浸入脱色缓冲液(Genotech)中20分钟，25℃，再用1∶2000稀释的羊抗小鼠β-肌动蛋白多克隆抗体(sc-1616)再次探针标记，羊抗小鼠β-肌动蛋白多克隆抗体可以作为蛋白上样对照，然后用驴抗羊HRP结合的抗体(sc-2056)显色。
在LLC1肿瘤组织中HPLC检测AVI-4126。在肿瘤组织溶胞产物(单次注射100μg AVI-4126入带肿瘤小小鼠中后4小时制备)AVI-4126的存在通过AVI BioPharma(Corvallis，OR)发展的5’-荧光素基DNA：AVI-4126(FDNA：AVI-4126)双链检测方法进行确定。简单地，与FDNA探针互补的15mer内PMO标(5’-GAGGGGCATCGTCGC-3’(SEQ ID NO：14))的500ng内标(10μl的2.29mg的PMO/ml的0.025M的Tris缓冲液，pH＝8)加入到每个肿瘤组织溶胞产物中。溶胞产物与250μl甲醇混合并彻底混匀。样品15,000Xg离心10分钟，去上清，加热到70℃，10分钟。样品离心10分钟，上清在Savant SC110加速真空装置中低热1小时干燥。干燥的样品在干净的小管中与100μl的Tris缓冲液混合，冻干。每个冻干样品用与AVI-4126序列互补的1.0 OD/ml 5’-荧光素标记的DNA探针(FDNA，5’-荧光素-GCGACGATGCCCCTCAACGT-3’(SEQ ID NO：15))的100μl的等分试样再水化。
然后全部样品使用有荧光检测的反相HPLC分析FDNA：AVI-4126双链的存在。使用装备有荧光检测器和AI-2000自动取样器(100μl注射器loop体积)的Varian HPLC泵，样品注射入Dionex DNA Pac-100柱(4×250)。使用前把HPLC分级溶剂通过一个0.2微米的滤器过滤制备流动相(A：0.025M Tris，pH＝8和：0.025Tris/1M NaCl pH＝8)。泵的梯度程序是90％A+10％B(0分钟)和55％A+45％B(20分钟)。流速1.5毫升/分钟，494nm(激发)，518nm发射波长荧光检测。
白金/顺铂ICP-MS检测和定量。组织溶胞产物(40mg的LLC1肿瘤组织)的200μl等分试样溶解于1.33ml王水中，然后稀释10倍。然后根据Anatek实验室(莫斯科，ID)Long等人(16)的方法样品用ICP-MS技术分析Pt的存在。
统计学分析
所有报告的数据的形式为平均值±标准方差，该数值是通过计算机程序InStat2(GraphPad，San Diego)得到。P值的计算由InStat2使用ANOVA和Tukery的多路比较测试完成。图，线性回归和斜率使用Prismv2.0得到。
                             实施例1
使用AVI-4126和化疗剂进行肿瘤研究
在5天的适应期后，如以上所述饲养的C57BL/6J小鼠(Simonsen，Gilroy，CA)，将其用异氟烷麻醉，刮毛，在右侧背面皮下注射大约200,000活细胞LLC1(研究日期0)。每天监测注射位点来保证在LLC1细胞注射4天后实体的，均质的瘤的生长是一致的。每天在i.p.注射(参见表1)前新鲜制备的化学治疗注射。所有PMO’s和顺铂(Sigma，St.Louis，MO)溶解于无菌的不致热的盐水(Sigma)调整注射体积为0.1ml。紫杉酚贮液(6mg/ml在Cremophore EL和乙醇，Bristol MyersSquibb，Syracuse，NY)在注射前用1XPBS稀释至1mg/ml。依托泊甙(Sigma)贮液通过溶解于70％乙醇以11mg/ml制备，然后通过用盐水稀释至终浓度为5mg/ml。5-FU(Calbiochem)溶解于盐水终浓度为12.5mg/ml。
如以上阐明的合成并纯化吗啉二氨基磷酸酯寡聚物(PMOs)，其序列与c-myc的翻译起始位点(AVl-4126；SEQ ID NO：1)互补，一个小鼠p21序列(SEQ ID NO：3)，一个小鼠RAD51序列(SEQ ID NO：4)和一个杂混对照(SEQ ID NO：2)。
进行了起始的研究在肿瘤中来确定AVI-4126的水平，而且来评价序列特异的c-myc蛋白水平的抑制。在LLCl移植后24天带有肿瘤的小鼠注射每一种盐水，AVI-4126或杂混的对照(100μg/小鼠IP)。4小时后切除肿瘤而且评估AVI-4126以及通过免疫印迹分析c-myc蛋白，正如以下说明。
在三个研究中应用的治疗组(A，B，和C)总结于表1。如所描述的方法治疗动物。以每天测定肿瘤的面积为基础来评价治疗效果(长度x宽度，cm2)通过数字式测径计测量，而且在处死时测定肿瘤的质量。所有用于研究的小鼠在PMO治疗的最后一天通过用二氧化碳窒息处死。迅速去除肿瘤，称重，大约0.25g的肿瘤组织在1.0ml的含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒片剂  (Complete TM Mini EDTA-free，Boehringer-Mannheim)的组织-PE裂解缓冲液(Genotech，St.Louis，MO)中匀浆，蛋白酶抑制剂鸡尾酒片剂在组织匀浆以前溶解于裂解缓冲液30分钟。裂解物4℃以15,000Xg离心15分钟，而且150μl上清部分以1∶1与电荷泳样品缓冲液混合，然后100℃煮沸5分钟。
                   表2   组合化学治疗方案
研究     治疗
A     (1)盐水(2)顺铂(83μg/小鼠/天IP)2-4，14-16天(3)AVI-4126(300μg/小鼠/天IP)2-8，14-21天(4)顺铂(83μg/小鼠/天IP)2-4，14-16天和AVI-4126(300μg/小鼠/天IP)6-12，18-23天(5)顺铂(83μg/小鼠/天IP)2-4，14-16天和AVI-4126(300μg/小鼠/天IP)2-8，13-19天
B     (1)盐水(2)依托泊甙(375μg/小鼠/天IP)2-4，14-16天(3)依托泊甙(375μg/小鼠/天IP)2-4，14-16天和AVI-4126(300μg/小鼠/天IP)6-12，18-23天
C     (1)盐水(2)紫杉酚(125μg/小鼠/天IP)2-4，14-16天(3)紫杉酚(125μg/小鼠/天IP)2-4，14-16天和AVI-4126(300μg/小鼠/天IP)6-12，18-23天
D     (1)盐水(2)5-FU(1250μg/小鼠/天IP)2-4，14-16天(3)5-FU(1250μg/小鼠/天IP)2-4，14-16天和AVI-4126(300μg/小鼠/天IP)6-12，18-23天
A. 在LLC1的肿瘤组织可检测到AVI-4126。从用AVI-4126或盐水处理的小鼠中，在肿瘤组织裂解物进行HPLC荧光检测AVI-4126。一个典型的HPLC分析显示出一个荧光峰，其代表了FDNA：AVI-4126二聚物，该峰只是在用AVI-4126处理的小鼠中检测到(图4C)。没有观察到AVI-4126降解的证据。应用AVI-4126并不影响肿瘤组织的铂水平(资料未显示)。
B. 在LLC1的肿瘤组织中AVI-4126降低了c-myc的水平
免疫印迹分析的进行来确定在肿瘤组织中的c-myc的水平。一个单一的注射AVI-4126降低c-myc的水平相对于在盐水和混杂的PMO对照(图5A)中检测的水平分别为77％和63％。相对于在用盐水，单独用AVI-4126，顺铂，或者在表2A，组(5)中说明的AVI-4126和顺铂组合处理肿瘤，收获的裂解物的对照而言(参见图7和8A)，c-myc水平具有相似程度的降低。
用AVI-4126和顺铂处理的动物，其中是分别给剂量，其并不能得到足够的肿瘤组织来进行免疫印迹。从用盐水或AVI-4126处理的组中，代表动物组中的四个肿瘤结果见图6A和B，其中显示的是用N-末端和C-末端特异的c-myc的抗体为探针进行的免疫印迹的图象结果。用β-actin蛋白(图6C)水平校正的条带的深度分析表明与盐水对照组相比，单独的从用盐水或单独用AVI-4126处理的动物中的代表肿瘤显示74％(n-末端抗体，图6A)和61％(c-末端抗体，图6B)c-myc水平的抑制。条带的位置看起来在大约66kD的位置，没有证据表明在人细胞中有AVI-4126单独引起的38kD的位置有条带代表c-myc的剪切变异体(13)。免疫印迹分析的结果参见图7A，该结果表明，对小鼠应用顺铂+AVI-4126使得c-myc下降(相比盐水组下降72％)。在用顺铂处理的组与使用盐水处理的组相比，c-myc水平没有统计学上的差异。
C. 用AVI-4126和顺铂的组合的化疗剂抗肿瘤效应是时间表 依赖性的。
对于所有的处理组每天的肿瘤面积列于图8A-C。用组合研究分析肿瘤的生长，其中顺铂单独应用，与AVI-4126共同应用或者以轮流的方式进行应用AVI-4126的处理。当具有肿瘤的小鼠进行了两轮治疗后，在研究最后，其中的治疗，AVI-4126与顺铂共同应用(参见表2A，组5)的肿瘤的生长速率和质量与单独用顺铂处理没有差异(资料未列出)。然而，在用接受顺铂的组中肿瘤的生长速率显著低于单独用AVI-4126处理或用盐水处理的组(p＜0.01)。
当含有肿瘤的小鼠应用两轮交错进行应用顺铂和AVI-4126的治疗方案(表2A，组4)，肿瘤的生长速度相对于单独应用两轮顺铂(p＜0.01)或者盐水(p＜0.01)(图8道A和表3)有显著的下降。从交错进行应用顺铂和AVI-4126的治疗方案中对肿瘤的解剖结果表明，单独应用顺铂的肿瘤非常小，并且是不具有侵染性的小球瘤，顺铂与AVI-4126共同应用处理小鼠的肿瘤具有高的侵染性并且具血管化。
另外的研究通过与AVI-4126共同交错应用依托泊甙，紫杉酚，或5-FU，结果表明增强的效果依赖于化疗剂，顺铂是最有效的，然后是依托泊甙和紫杉酚。所有三种制剂的效果通过加入AVI-4126到治疗方案而显著增加(相对于分别用一种制剂的治疗方案或者用TGR表示的盐水，对于所有三种治疗p＜0.01。5-FU不管单独应用或与AVI-4126组合应用都是相对无效的(参见表3和图8D)。
对于AVI-4126的对照PMO寡聚物已经进行了深入的研究而且在以前已经有过报道(Hudziak et al.，2000)。
混杂的对照PMO(SEQ ID NO：2)对于c-myc的水平没有影响。以与AVI-4126相同的方法检测PMO的骨架，利用两个PMOs，如上所述合成p21AS(SEQ ID NO：3)和RAD51AS(SEQ ID NO：4)，并且在这一模型使用相同的方案检测，该方案对于AVI-4126有效。这些序列当与顺铂组合时不能产生增强效应。在研究的最后，对于这些分子的肿瘤生长速度和质量参见表3。
总而言之，列于表3的结果表明一个治疗方案应用c-myc反义寡聚物，轮换应用顺铂，依托泊甙，或者紫杉酚，结果导致肿瘤的生长速度(TGR)和肿瘤大小显著下降，分别为18.6％，36.8％，50.9％。
      表3   不同组合治疗肿瘤的质量和生长速率的总结
治疗 N  肿瘤的质量(gm±STE) 肿瘤生长速率*(TGR) 盐水％TGF
盐水 29  1.508±0.181 0.204±0.014 100.0
 AVI-4126  6  1.788±0.651  0.212±0.031  103.9
 顺铂  26  0.550±0.081  0.101±0.011  49.5
 顺铂+AVI-4126  6  0.112±0.059  0.038±0.011  18.6
 P21AS  6  1.260±0.389  0.184±0.030  90.2
 顺铂+P21AS  6  0.607±0.194  0.108±0.018  50.9
 RAD51AS  6  1.193±0.166  0.198±0.017  97.1
 顺铂+RAD51AS  6  0.322±0.076  0.089±0.012  43.6
 依托泊甙  5  0.970±0.244  0.153±0.025  75.0
 依托泊甙+AVI-4126  5  0.560±0.258  0.075±0.016  36.8
 紫杉酚  6  1.827±0.210  0.234±0.023  114.7
 紫杉酚+AVI-4126  6  0.558±0.279  0.104±0.022  50.9
 5-FU  6  2.720±0.991  0.234±0.044  114.7
 5-FU+AVI-4126  6  1.018±0.224  0.180±0.018  88.2
*当肿瘤面积改变是线性时，使用线性回归计算肿瘤生长速率分析14天到25天肿瘤面积的改变。所示的数据是斜率±标准偏差
                      表4   为支持发明提供的序列
种类  SEQ ID NO
针对c-mycAUG；AVI4126的反义链：ACG TTG AGG GGC ATC GTC GC  1
c-myc反义链混杂对照AVI4144：ACT GTG AGG GCG ATG GCT GC  2
c-myc反义链对照：小鼠p21：CAT CAC CAG GAT TGG ACA TGG  3
c-myc反义链对照：小鼠RAD51：CAA GCT GCA TTT GCA TAG CCA T  4
针对c-myc，AV1#92的反义链：GMT MMM TMT GTM TMT MGM TGG  5
针对c-myc，AV1#93的反义链：MMG MMM GMT MGM TMM MTMTG  6
针对c-myc，AV1#25的反义链：GGC AUC GUC GUG ACU GUC GGGUUU UCC ACC  7
针对c-myc，AV1#21的反义链：GGG GCA UCG UCG UGA CUG UCUGUU GGA GGG  8
针对c-myc，AV1#108的反义链：CGU CGU GAC UGU CUG UUG GAG  9
针对c-myc，AV1#111的反义链：CGT CGT GAC TGT CTG TTG GAG G  10
针对c-myc，AV1#137的反义链：GGC AUC GUC GCG GGA GGC UGCUGG AGC G  11
针对c-myc，AV1#26的反义链：CCG CGA CAU AGG ACG GAG AGCAGA GCC C  12
针对c-myc，AV14174的反义链：TTG AGG GGC ATC  13
                        序列表
<110>AVI生物制药公司
<120>使用C-MYC反义寡聚物治疗癌症的结合的方法
<130>04508042WO00
<140>没有被转让
<141>此处提交
<150>US 60/291,727
<151>2001-05-17
<160>15
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>与c-myc反义
<400>1
acgttgaggg gcatcgtcgc                                                 20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>c-myc反义混杂对照
<400>2
actgtgaggg cgatcgctgc                                                 20
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>c-myc反义对照
<400>3
catcaccagg attggacatg g                                               21
<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>c-myc反义对照
<400>4
caagctgcat ttgcatagcc at                                              22
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>与c-myc反义
<400>5
gmtmmmtmtg tmtmtmgmtg g                                               21
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>与c-myc反义
<400>6
mmgmmmgmtm gmtmmmtmtg                                                 20
<210>7
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>与c-myc反义
<400>7
ggcaucgucg ugacugucgg guuuuccacc                                      30
<210>8
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>与c-myc反义
<400>8
ggggcaucgu cgugacuguc uguuggaggg                                      30
<210>9
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>与c-myc反义
<400>9
cgucgugacu gucuguugga g                                               21
<210>10
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>与c-myc反义
<400>10
cgtcgtgact gtctgttgga gg                                              22
<210>11
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>与c-myc反义
<400>11
ggcaucgucg cgggaggcug cuggagcg                                        28
<210>12
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>与c-myc反义
<400>12
ccgcgacaua ggacggagag cagagccc                                        28
<210>13
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>与c-myc反义
<400>13
ttgaggggca tc                                                         12
<210>14
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>14
gaggggcatc gtcgc                                                      15
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<221>misc_feature
<222>(1)...(1)
<223>修饰的5′核苷酸含有荧光素
<400>15
gcgacgatgc ccctcaacgt                                                 20

Claims (18)

1.一种治疗对于化学治疗敏感癌症的试剂盒，包括包含与c-myc反义的寡聚物的第一组合物和包含有化疗剂的第二组合物，其中第一组合物和第二组合物按次序应用，间隔的时间是在应用第一组合物后至少一天，和在第二组合物应用后的几个小时。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中对c-myc反义的寡聚物的长度是在12到25个碱基之间，而且含有的序列选自SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，和SEQ ID NO：11。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述的反义寡聚物的特征在于，
(a)充分去电荷的骨架；
(b)在Tm高于50℃具有与靶RNA互补序列高亲合性杂交的能力；
(c)核酸酶抗性；且
(d)具有活性或方便转运进细胞的能力。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中所述的反义寡聚物的骨架具有的结构是选自
Figure A0281007100021
和
      结构A                        结构B                        结构C           结构D
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述的化疗剂选自顺铂、依托泊甙(VP-16)、紫杉酚及其类似物和衍生物。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其中开始应用c-myc的反义寡聚物在应用所述化疗剂后至少一天进行。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中应用所述寡聚物组合物，是在应用化疗剂组合物至少一天以后开始，这代表了一个治疗周期，该周期可以重复多次，每一循环的间隔期至少是一天。
8.一种用于治疗在目前正在进行化学治疗的病人的癌症治疗的寡聚物组合物，包括一种对c-myc反义的寡聚物，其中该组合物的应用先于或后于化疗剂的应用。
9.根据权利要求9所述的寡聚物组合物，具有的长度为大约12到25个碱基含有的序列选自SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：8，SEQID NO：9，SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11。
10.根据权利要求8所述的寡聚物，其特征在于，
(a)充分去电荷的骨架；
(b)在Tm高于50℃具有与靶RNA互补序列高亲合性杂交的能力；
(c)核酸酶抗性；且
(d)具有活性或方便转运进细胞的能力。
11.根据权利要求10所述的寡聚物组合物，其中其具有的结构选自
和
      结构A                         结构B                         结构C           结构D
12.c-myc反义寡聚物和化疗剂在用于制备对于化学治疗敏感的癌症病人的治疗的药物组合物中的用途，其中所述的与c-myc反义的寡聚物和化疗剂连续进行应用，间隔的时间是在化疗剂应用后的几个小时，以及在应用反义寡聚物后至少一天。
13.根据权利要求12所述的用途，其中与c-myc反义的寡聚物长度为大约12到25个碱基含有的序列选自SEQ ID NO：1，SEQID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，和SEQ ID NO：11。
14.根据权利要求12所述的用途，其中所述的反义寡聚物的特征在于，
(a)充分去电荷的骨架；
(b)在Tm高于50℃具有与靶RNA互补序列高亲合性杂交的能力；
(c)核酸酶抗性；且
(d)具有活性或方便转运进细胞的能力。
15.根据权利要求12所述的用途，其中所述的化疗剂选自
Figure A0281007100041
和
Figure A0281007100042
    结构A                       结构B                           结构C             结构D
16.根据权利要求12所述的用途，其中所述的化疗剂选自顺铂、依托泊甙(VP-16)、紫杉酚及其类似物和衍生物。
17.根据权利要求16所述的用途，其中开始应用对c-myc反义的寡聚物是在应用化疗剂后至少一天后进行。
18.根据权利要求17所述的用途，其中应用所述寡聚物组合物，是在应用化疗剂组合物至少一天以后开始，这代表了一个治疗周期，该周期可以重复多次，每一循环的间隔期至少是一天。
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