JPH08504083A

JPH08504083A - 合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドとそれらを含む医薬組成物

Info

Publication number: JPH08504083A
Application number: JP5517984A
Authority: JP
Inventors: ソレク，ヘルモナ; ザクト，ハイム; エクスタイン，フリッツ
Original assignee: イシウムリサーチデベロップメントカンパニーオブザヘブリューユニバーシティーオブイエルサレム; マックス − プランク − ゲゼルシャフトツルフェルデルングデルヴイゼンシャフテン，エー．ファウ．
Priority date: 1992-04-15
Filing date: 1993-04-15
Publication date: 1996-05-07
Also published as: DE69308833D1; DE69308833T2; IL101600A; US5891725A; WO1993021202A1; ATE150029T1; AU4039993A; AU665087B2; CA2118235A1; CA2118235C; IL101600A0; EP0636137A1; EP0636137B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、造血性骨髄細胞の発現を選択的に調節することができるホスホロチオエート化された、または部分的にホスホロチオエート化された合成オリゴデオキシヌクレオチドに関する。さらに特別には、本発明は、ヒトＡＣＨＥ、または２ＨＳ遺伝子中のＡＵＧイニシエーションコドンにわたる領域にむけられた、ヌクレオチド塩基間を連結するホスホロチオエート結合を有する合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドに関する。すなわち、本発明は、ヒトＡＣＨＥ遺伝子、２ＨＳ遺伝子、またはＢＣＨＥ遺伝子のＡＵＧイニシエーシヨンコドンにわたる領域、または、ヒトＣＨＥＤ（ｃｄｃ２ホモログ）遺伝子の５′−領域にむけられた、４個の３′−末端ヌクレオチド塩基間を連結するホスホロチオエート結合を有する合成アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。本発明は、活性成分として、本発明による少くとも１つのホスホロチオエート化されたか、または部分的にホスホロチオエート化されたアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを生理学的に受け入れることができる担体、または希釈剤中に含む医薬組成物に関する。本発明のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドと、それらを含む医薬組成物は、異常な造血性細胞増殖を阻害し、異常な血小板の増殖を阻害し、骨髄細胞培養における幹細胞分画を増加させ、マクロファージの産生を増強し、幹細胞数を増加し、移植されるべき器官の免疫応答を抑制し、そして、悪性腫瘍の成長を阻止するのに適している。

Description

【発明の詳細な説明】合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドとそれらを含む医薬組成物発明の背景アセチルコリンを加水分解する酵素であるブチリルコリンエステラーゼ（ＢｕＣＨＥ，ＥＣ３．１．１．８）とアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ，ＥＣ３．１．１．７）をコードするＢＣＨＥとＡＣＨＥの遺伝子は、胚性の〔Layer ，Ｐ．Ｇ．とSporns，Ｏ，Proc．Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ８４：２８４−２８８（１９８７）〕、造血性〔Burstein，Ｓ．Ａ．，ら、Ｊ．Cell Physiol．１２２：１５９−１６５（１９８５）〕および生殖性細胞（Jhonson，Ｃ．Ｄ．，ら、Neuron １：１６５−１７３（１９８８）〕；Malinger，Ｇ．，ら、Mol．Neu rosci．１：７７−８４（１９８９）〕をはじめとする種々の発達中の細胞型において発現される。ＡＣｈＥとＢｕＣｈＥは、ともに、Ｓ／Ｔ−Ｐ−Ｘ−Ｚのペプチドのモチーフを含み、そのため、それらは、細胞周期の一般制御体であるｃｄｃ２キナーゼによるリン酸化に対する潜在的基質となっている〔Lapidot-Lifson，Ｙ．，ら、Pr oc．Natl．Acad．Bci.，ＵＳＡ８９；５７９−５８３（１９９２）〕。ｃａｃ２キナーゼの多くの他の基質は、細胞周期に関連した過程に必要な生物学的機能を遂行する〔Morono，Ｓ．とNurse，Ｐ．，Cell ６１：５４９−５５１（１９９０）〕。したがって、ＣＨＥまたはｃｄｃ２の転写の過程の妨害は、細胞分裂を脇道にそらせるか、そして／または、阻止することが期待され、これらの過程を制御することは、いくつかの医学的に重要な手続きにとって有用となり得る。生化学的、および組織化学的分析は、多数の真核細胞生物種の種々の胎児の組織において、ＡＣｈＥとＢｕＣｈＥが高水準で発現されることを示した〔Rakonc zay，Ｚ．，ら、Subcellular Biochemistry １２：３５５−３７８，Harris，Ｊ．Ｒ．，Ｅｄ．，Plenum Press，Ｎ．Ｙ．（１９８８）〕、その場合、コリンエステラーゼ（ＣｈＥｓ）は、細胞増殖と分化に関して整合的に調節されることが示唆される〔Layer,Ｐ．Ｇ．，ら、Neurochem．４９：１７５−１８２（１９８７）〕。したがって、胎児の発生におけるＣｈＥｓのためとされる特異的役割が、細胞分裂に関連している可能性があり、その結果、これらの組織におけるそれらの生物学的機能は、器官の発生を調節する意味をもっていると仮に考えられる。成熟赤血球の膜中に存在する外に、ＡＣｈＥは、in vivoで〔Paules，J．P. ，ら、Blood ５８：１１００−１１０６（１９８１）〕とin vitro〔Burstein ，Ｓ．Ａ．，ら、Ｊ．Cell Physiol．１０３：２０１−２０８（１９８０）〕の発達中の血液においても多量に産生され、その活性は、発達中のマウスの巨核球に対する容認できるマーカーとして役立つ〔Burs-tein（１９８５）、同上〕。その上、アセチルコリン類縁体ならびにコリンエステラーゼ阻害剤の投与は、マウスにおいて巨核球を誘発し、血小板数を増加することが示され〔Burstein，Ｓ．Ａ．，ら、Clin．Haematol．１２：３−２７（１９８３）、これらの血液造成細胞のかかわり合いと発現におけるこの酵素の関与を意味する。ヒトＢｕＣｈＥ，とＡＣｈＥをコードするＤＮＡｓがクローン化され〔Prody ，Ｃ．，ら、Proc．Natl．Acad．Sci.，ＵＳＡ８６：３５５５−３５５９（１９８７）；Soreqら、Proc．Natl．Acad．Sci.，ＵＳＡ８７；９６８８−９６９２（１９９０）〕、そして、ヒトＣＨＥ１の遺伝子座が異常な巨核球の造成と血小板数を伴う〔Pintado，Ｔ．，ら、Cancer ５５；５３５−５４１（１９８５）〕白血病において異常変化を受け易い３ｑ２６−ｔｅｒ染色体領域にマッピングされた〔Gnatt，Ａ．，ら、Cancer Res．５０：１９８３−１９８７（１９９０）〕。ＡＣＨＥとＢＣＨＥの遺伝子の共増幅が引続いて白血病と血小板の障害において観察された〔Lapidot-Lifson，Ｙ．，ら、Proc．Natl．Acad．Sci.，ＵＳＡ４７１５−４７１７（１９８９）〕；Zakut,Ｈ．ら、MutationResearch ，印刷中（１９９２）〕。したがって、造血システムは、ＣｈＥｓの発現によって影響を受ける発現制御を受け易いようである。発生上重要な遺伝子の発現の阻害は、原理的には、発生的過程をこれらの遺伝子の発現に依存しない方向にそらすはずである。このような発現過程に影響をおよぼす１つの有用なアプローチは、“アンチセンス”技術に基づいている。細胞の遺伝学的過程の邪魔をするオリゴヌクレオチドの使用は、重要な治療的潜在力を担っている。したがって、可能な臨床適用をもったクローン化された遺伝子の発現を阻止する“情報を提供する薬剤”が開発されつつある。それは、増殖しつつある幹細胞を含み、そして、外部の刺戟に対する極端な感受性のために、本造血システムは、遺伝子工学における近年の業績に基づいた新しい治療プロトコールのための最初の論理的標的となる可能性がある〔Wilson，Ｊ．Ｄ．，ら、Harr ison's Principles of Internal Medison，12th Ed.，McGraw-Hill，Inc.，New York，Chapters ２６８−２６９；２８５−２８８（１９９１）〕。幹細胞とは、繰返し複製し、様々な種類の前駆細胞に分化することが出来る細胞として定義づけることが可能である。拘束はその中においてそれが起る分化の選択を徐徐に制限し、遂に前駆細胞が唯一の選択をもって（例えば、赤血球、巨核球、マクロファージ）形成される。したがって、最初の幹細胞は、全能性、すなわち、それらは血液と免疫システムにおいて、選択のすべてをとることが出来ると定義することができる。このような細胞の望ましい方向づけは、造血細胞の特定の亜集団細胞の過剰、または涸渇のような望ましくない変化に打ち勝つために最も有用な筈である。やはり有用であるとはいえ、より限定された多分化能性幹細胞の再方向づけは、有用性が少ない。幹細胞は、骨髄の細胞の≦０．％の細胞を占めている。それらは、免疫細胞化学的方法により、直接的か、または細胞培養における成長と形成されたコロニーのその後の評価によって、遡及的に検出することができる。治療的目的のためには、幹細胞の分化を制御し、全能性幹細胞と多分化能性幹細胞を複製させることが望ましいであろう。健康な個人における骨髄細胞の産生速度は１時間あたり１０¹⁰の血小板と分化した血液細胞に達することができる。これらの細胞の寿命は、あるリンパ球についての数年、赤血球についての１２０日から血小板について１０日、および好中球についての１０時間まで変動する。造血幹細胞の亜集団における変化は、種々の白血病などのような亜性骨髄増殖性疾患に罹っている患者、真性赤血球増加症などのような血液細胞増殖種疾患および血液産生システムに欠陥がある紅斑性狼瘡などのように自己免疫性疾患において見出される。欠陥性造血は、さらに、血液産生システムに障害を与える化学療法、照射のような種々の普通に用いられる治療処置を受ける患者において観察される。このように、すべての癌患者、組織の移植後の人々、または化学薬品のそして／または異なる薬物による中毒を患ったその他の人々は、異常な造血を示し、それぞれのその後の転帰を示す。上記の病理学的条件のいずれかを患った患者における造血細胞分裂を調節できる能力の治療的価値は言うまでもない。その上、造血細胞の細胞分裂、および特に造血幹細胞を増加させることは、骨髄移植の臨床手順にとって特別に有利になることが考えられる。上述の病理学的状態のいずれかを受けている患者において、骨髄細胞を凍結させ、続いてそれらを移植する技術はすでに利用可能である。しかし受容者において生き長らえて増殖し、彼または彼女の状態を改善できる唯一の移植骨髄細胞は幹細胞である。上述の操作は、受容者自身の骨髄を使用する自己移植であるか、適合性のドナーからの骨髄を使用する同種移植である。上に記載したように、造血細胞の拘束と発現には、コリン作動性のシグナルが関与している。最近、in vivoにおけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの組み込みの予備的な評価が行われ、この方法の短期の治療的適用性が明らかになった〔Cohen,ら、Antisense Res.＆Dev.２：１９１（１９９１）〕。１５−２０塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、通常、それらが哺乳動物のゲノムにおいて、唯一の相補性の配列を保証するのに十分な長さである。その上、それらは、標的ｍＲＮＡと十分よくハイブリッド形成をする〔Cohen ら、同上〕。ホスホジエステルバックボーンを修飾することによって、これらのオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼによる分解に対して抵抗性となる〔Spitzer,F．とEckstein，Ｆ. ，Nuc．Ac．Res．１６：１１６９１−１１７０４（１９８８）〕。この目的のために、メチルホスホネートとホスホロチオエート基をともに使用した〔Baker,Ｃ .，ら、Nuc．Ac．Res．１８：３５３７（１９９０）〕。非イオン性なので、メチル−ホスホネート類縁体は、細胞の取り込みの増加を示すことが予知された〔 Blake,ら、Biochem.２４；６１３９（１９８５）〕。しかし、アンチセンスメチル−ホスホネートオリゴマーは、in vitroでＮ−ｒａｓの発現を阻害することができなかったことが示された〔Tidd，ら、Anti-Cancer Drug Design ３：１１７（１９８８）〕。いくつかの癌遺伝子のｍＲＮＡｓのin vitroでの翻訳は、ホスホジエステル、そして／または、ホスホロチオレートアンチセンスオリゴヌクレオチドによって首尾よく遮断された〔ｃ−ｍｙｃ：McManawayら、Lance t ３３５：８０８（１９９０），Watsonら、Cancer Res．５１：３９９６（１９９１）；ｂｃＩ−２：Reedら、Cancer Res．５０：６５６５（１９９０）；ｍｙｂ：Calabrettら、Proc．Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ８８：２３５１（１９９１）：ｂｃｒ−ａｂ：Szczylikら、Science ２５３：５６２（１９９１）〕。これらの試験においては、センス、およびナンセンスオリゴヌクレオチドが対照として使用され、効果がないことが示されたが、一方アンチセンスオリゴヌクレオチドは、それらの標的遺伝子の発現を選択的に阻害した。そして、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、それらの安定性がより大きいために、より活性が高かった〔Woolf,T．Ｍ．ら、Nuc．Ac．Res．１８：１７６３（１９９０）〕。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、興味のある標的蛋白質の合成を特異的に妨害することができる〔Moffat，Science ２５３：５１０（１９９１）〕。これ３、ポリソームの形成の阻害によって、そして／または、標的ｍＲＮＡ内のアンチセンスオリゴヌクレオチドが位置によって機能することによって起る可能性がある。このように、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害のための標的としての翻訳開始コドンを取り巻く配列の頻度の高い選択は、開始複合体の生成を防ぐ目的である。事実、アンチセンスＲＮＡは、翻訳の制御物質として天然に存在している〔Eguchiら、Anm．Rev．Biochem．６０；６３１（１９９１）〕アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害の他の機序には、リボヌクレアーゼＨの活性化が関与し、それは、その後アンチセンスオリゴヌクレオチド−ｍＲＮＡの消化を遂行する〔Chiang，Ｍ．Ｙ．ら、Ｊ．Biol．Chem．２６６：１８１６２（１９９１）〕、または、ｍＲＮＡスプライス部位に標的を定めたアンチセンスオリゴヌクレオチドによってスプライシングを妨害することが関与する〔Koleら、Adv．Drug．D eliv．Rev．６；２７１（１９９１）〕。それらのｍＲＮＡ標的に加えて、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、これらのｍＲＮＡｓを発現するゲノム配列に対しても相補的である。培養細胞内に注入されるときに、それらは、核の中に蓄積し〔Leonetti，Ｊ．Ｐ．ら、Proc．Natl ． Acad．Sci．ＵＳＡ８８：２７０２（１９１１）〕、それらは、Ｂ型のＤＮＡデュプレックスの主要な溝と対をなしているHoogsteen塩基によって会合した３番目のＤＮＡストランドの形成を通じて転写を妨害することによっても機能することがあることが示唆される〔Moffat，Science ２５２：１３７４（１９９１）〕。ｃ−ｍｙｃの発現のin vitroの転写阻止は、無細胞系において、この機序によって働くことが示された〔Cooneyら、Science ２４１：４５６（１９８８）〕。最近のポリアミド核酸オリゴマー（ポリアミドバックボーンがＤＮＡのデオキシリボースホスフェートバックボーンに置き換っている）は、２重螺旋ＤＮＡからの相補性ストランドの置換を起すことが示された〔Nielsenら、Science ２５４：１４９７（１９９１）〕。これらの新たにデザインされた薬剤は、転写産物に影響することなしに遺伝子の機能を選択的に妨害する。これと対照的に、リボザイム配列は、ｍＲＮＡ転写と特異的に相互作用することが示された。これらは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが側面に位置したＲＮａｓｅの活性部位を含むリボ核酸の配列である（HaseloffとGerlach，Nature ３：５８５（１９８８）〕。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に標的を定めたときには、それらは、ＨＩＶｍＲＮＡを効果的に破壊する〔Sarverら、Science ２４７：１２２２（１９９０）〕。しかし、オリゴリボヌクレオチドは、ＲＮアーゼの攻撃に対して抵抗性である化学的に修飾した形においては、特に合成することが遙かに困難である〔Pi eKenら、Science ２５３−３１４（１９９１）〕。ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドは、有意な毒性を示さず、動物中で十分な薬力学的半減期を示した〔Agrawal,Ｓ．，ら、Proc．Natl．Ac ad．Sci．ＵＳＡ８８：７５９５（１９９１）〕。アンチセンスで誘発された細胞発現と関連した機能の喪失の表現系は、神経膠星状細胞ニューロンの共培養内で〔Winsteinら、Ｊ．Cell Biol.，１１２：１２０５（１９９１）〕、神経膠星状細胞の成長において関与しているグリアの原線維の酸性蛋白質（ＧＦＡＰ）について、これらの細胞を取り巻く緻密なミエリン鞘の生成の原因となるSchwann 細胞中のミエリン−関連糖蛋白について〔OwensとBunge，Neuron ７：５６（１９９１）〕、海馬のニューロンの極性とアクソンの生成で意味づけられた微小管関連タウ蛋白質について〔CaceresとKosik，Nature ３４３：４６１（１９９０）〕、橈側のグリア細胞に沿った神経の移動について重要なβ₁−インテグリンについて、そしてヒヨコにおける蓋のプレート形成の確立について〔Galileoら、Ｊ．Cel．Biol．１１２：１２８５（１９９１）〕、および神経外胚葉培養における細胞の不均質性の維持の原因となるＮ−ｍｙｃ蛋白質（神経芽細胞に対する上皮細胞、それらは、コロニーの形成能力、癌原性および付着性において異なっている）〔Rosolenら、Cancer Res．５０：６３１６（１９９０）：Whitesellら、Mol．Cell．Biol．１１：１３６０（１９９１）〕について示された。分裂促進および脈管形成の性質を有する塩基性線維芽細胞の成長因子の（ｂＦｇＦ）アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害は、神経膠腫細胞における成長の８０％を〔 Morrison，Ｊ．Biol．Chem．２６６：７２８（１９９１）〕飽和性および特異的な仕方で抑制した。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｂＦｇＦｍRNA中の開始とスプライス部位に標的を設定した。それらは、結果として得られた蛋白質の活性を減少させ、センスオリゴマーは、不活性のままであった。軟寒天培養においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、グリア細胞のコロニーの大きさを減少させ、それらの中に大きめの細胞出現を誘発した〔Ｒ．Morrison，Neur oscience Facts ３：３（１９９２）；ヒト神経膠腫細胞におけるｂＦｇＦの発現）〕疎水性であるために、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リン脂質膜と十分に相互作用する〔Akhtar，Ｓ．，ら、Nuc．Res．１９：５５５１−５５５９（１９９１）〕。それらの細胞原形質膜との相互作用の後、それらは、活溌に生体細胞の中の〔Loke，Ｓ．Ｌ．ら、Proc．Natl．Acad．Sc．ＵＳＡ８６：３４７４（１９８９）〕特異的受容体が関与していることが予知された飽和性機序において輸送される〔Yakubov,Ｌ．Ａ．ら、Proc．Natl．Acad．ＵＳＡ８６：６４５４（１９８９）〕。シグナル伝達の過程に関与するキー分子のアンチセンス阻害は、標的とした鍵となる分子に依存する二次的機序を妨害することが期待されることがある。このように、ｍ₂ムスカリン様のアセチルコリン受容体を通してのコリン作動性シグナルは、百日咳トキシン感受性のＧ蛋白質とアデニルシクラーゼ活性と共軛している。γ−アミノ酪酸型のＢ受容体（ＧＡＢＡ_B）は、このシグナル伝達過程に同様に共軛しており、両受容体は、ともに小脳の顆粒性ニューロンにおいて発現される。ｍ₂受容体ｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、３日以内にこの受容体の合成を完全に遮断した。そして、ＧＡＢＡ_B受容体を、６日以内に４０％だけ減少させた。この後者の効果が、まだクローン化されていないＧＡＢＡ_B受容体においても存在している保持されたオリゴ配列によるのか、遅延効果がｍ₂阻害に対して二次的であったかどうかは、今後示さなければならない〔Morrison Ｒ．，同上〕。造血細胞の拘束と発現におけるコリン作動性シグナルの上述の意味合いの見地から、コリン作動性シグナル伝達の過程を脇道にそらすことができる化合物と方法を提供することが本発明の目的であり、それは、骨髄幹細胞を継続的な複製へと導き、培養においても、in vivoにおいても、ともに造血および免疫システムの単核細胞へのその後の分化を再び方向づけると考えられる。このようにして、本発明のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド、上に記述した骨髄細胞の調節に対する強力な候補であるように思われる。これは、顆粒球コロニー刺戟因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン３，６および１１Ｌｉｆ（白血病誘発因子）、そして、Ｃ−キット前癌遺伝子から作られた受容体と相互作用する最近記述された幹細胞因子のような、すでに特性が解明された効果に対し、上積みするものである。発明の要約本発明は、造血骨髄細胞の発現を選択的に調節することが出来る合成ホスホロチオエート化された、または部分的にホスホロチオエート化されたオリゴヌクレオチドに関する。本発明において使用される調節という用語は、骨髄細胞における巨核球の造成、そして／または、骨髄細胞における赤血球の造成の選択的阻害、そして／または、促進のことを指す。そして、追加的に造血性骨髄幹細胞の発現の巨核球細胞、そして／または、赤血球からマクロファージと単核細胞への選択的方向変換をさせることを指す。さらに特別には、本発明は、巨核球造成、そして／または、赤血球の造成を阻害するか、促進することが出来、そして、造血骨髄幹細胞の発現を、巨核球と赤血球からマクロファージと他の単核細胞の造血細胞へ方向転換することが出来る合成ホスホロチオエート化された、または部分的なホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチドに関する。本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、in vitroにおいて造血性骨髄幹細胞の発達を調節することができる。このような細胞は、移植が必要なときに患者から抜き取った細胞であることができる。本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、望ましい細胞組成が達成され、そして／または、培養物中に生存幹細胞の数を増加することができるまで、培養の細胞組成物に効果的に影響することができる。本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、操作手順を改善し、移植操作手順後の組織の拒絶反応を減少させるために、移植されるべき器官、または組織における細胞分裂の特性も調節することができる。本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、造血システムの特異的幹細胞の造血的骨髄分画を強化するために、提供手順の前に、骨髄、または器官の潜在ドナーに投与することもできる。本発明のオリゴヌクレオチドは、このような細胞を、組織適合抗原がない生存形でこのような細胞を保持するために、それらを細胞バンクに貯蔵する前に、胚または胎児骨髄細胞に適用することができる。その上、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、また、腫瘍組織の急速な細胞分裂を選択的に阻止するために、一方では腫瘍を取り巻く細胞分裂の良性過程は妨害することなく、ある悪性腫瘍の患者の治療にも効果がある筈である。特に、本発明は、ヒトＡＣＨＥ（アセチルコリンエステラーゼ）、または２ＨＳ（ｃｄｃ２キナーゼ）遺伝子におけるＡＵＧ開始コドンにわたる領域に対して向けられたアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドであり、ヌクレオチドのすべての間に、または４つの３’−末端ヌクレオチドのみの間に、ホスホロチオエートヌクレオチド結合を有する合成オリゴデオキシヌクレオチド、およびヒトＢＣＨＥ（ブチルコリンエステラーゼ）遺伝子におけるＡＵＧ開始コドンにわたる領域にむけられた、またはＣＨＥＤ（ｃｄｃ２ホモログ）における開始コドン５ ′領域に対してむけられたアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、４個の３′ −末端ヌクレオチドの間に、ホスホロチオエートのヌクレオチド間結合を有する合成オリゴデオキシヌクレオチドに関する。さらにもっと特別には、本発明は、式：５′−GGTATAATCTTCCAT-３′ を有するヒト２ＨＳ遺伝子におけるイニシエーターＡＵＧコドンにわたる領域にむけられたすべてのヌクレオチド（ＡＳ２ＨＳ−Ｔ_s）の間か、４個の３′− 末端ヌクレオチド（ＡＳ２ＨＳ−Ｓ₃）の間に、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド；式５′−CTGCGGGGGCCTCAT-３′ を有するヒトＡＣＨＥ遺伝子におけるイニシエーターＡＵＧコドンにわたる領域にむけられた、すべてのヌクレオチド（ＡＳＡＣＨ−Ｔ_s）の間か、４個の３ ′−末端ヌクレオチド（ＡＳＡＣＨＥ−Ｓ₃）の間に、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド；式：５′−GACTTTGCTATGCAT-３′ を有するヒトＢＣＨＥ遺伝子におけるイニシエーターＡＵＧコドンにわたる領域にむけられた、４個の３’−末端ヌクレオチド（ＡＳＢＣＨＥ−Ｓ₃）の間に、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド；そして式：５′−TTTTCCCCAGTCAAT-３′ を有するヒトＣＨＥＤ遺伝子における５′−領域にむけられた４個の３′−末端ヌクレオチド（ＡＳＣＨＥＤ−Ｓ₃）の間に、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドに関する。本発明は、生理学的に、または医学的に受け入れられる担体中に、活性成分として、本発明のオリゴヌクレオチドの少くとも１つを活性成分として含み、随意にさらに生理学的に、および医学的に受け入れられる添加物を含む医薬的、または医学的組成物に関する。活性成分は、オリゴデオキシヌクレオチド、またはそれらの混合物から成ることがある。さらに具体的には、本発明の組成物は、造血骨髄幹細胞の発現の調節に適切なことがある。これらの組成物は、異常な造血細胞の増殖を阻害することができる。また、組成物は、マクロファージの産生を増強し、幹細胞数を増加することができる。さらに特別には、本発明の組成物は造血性骨髄幹細胞の発現の調節に適していると考えられる。これらの組成物は、異常な造血細胞増殖を阻害すると考えられる。また、本組成物は、マクロファージ産生を増強し、幹細胞数を増加させるために使用することができる。さらにもっと特別には、本発明は、移植されるべき器官、または組織において、移植操作の後の免疫応答とその結果生ずる組織拒絶を減少させるために、in v itroで細胞分裂特性を調節するのに適していることがある。本組成物は、移植されるべき骨髄細胞においてin vitroで幹細胞の分画を増加するのにも使用することができる。その上、活性成分として本発明のオリゴデオキシヌクレオチドを医薬的に容認できる担体中に含み、または随意に、さらなる生理学的に容認しうる薬剤も含む、本発明の組成物が、組織適合性抗原に欠けている生存形で、細胞バンクに貯蔵される前に、胚または胎児の骨髄細胞を処理するために使用することが出来る。活性成分は、オリゴデオキシヌクレオチドの１つか、またはその混合物から成ることができる。さらに、本発明の組成物は、同種移植の手順において、免疫応答を減少させるために、供与の操作の前に、臓器のドナーと受容者の処置のために、そして、造血系の特異的幹細胞の造血性骨髄分画を強化するために、骨髄の抜き取りの前に、骨髄の潜在性ドナーの処置のために使用できる。なお、さらに、本発明の組成物は、腫瘍の組織における細胞分裂を選択的に停止させ、腫瘍を取り巻く良性細胞には影響せず、悪性腫瘍患者を治療するのに使用できる。これらの組成物は、軟骨肉腫の治療に特に適していると考えられる。本発明は、このような処理が必要な患者において、患者に治療的に効果のある本発明のオリゴデオキシヌクレオチドか組成物を患者に投与することによる造血性骨髄幹細胞の発達を調節する方法にも関する。例えば、本発明の方法によって、異常な造血性細胞の増殖が阻害され、マクロファージ産生の増強と幹細胞数が増加を起すことができる。本発明は、免疫応答とその結果生ずる移植処置後の組織拒絶反応を減少させるために、移植されるべき器官、または組織において、その器官を同種移植に適した培養条件下で効果的な量のオリゴヌクレオチド、または本発明の組成物と接触させることによって、細胞分裂をin vitroで調節する方法に関する。これらの方法は、in vitroで移植されるべき骨髄検体において幹細胞分画を増加するために使用される。さらに、本発明は、検体を適切な培養条件下で本発明のオリゴデオキシヌクレオチド、または組成物と接触させることによって、胚または胎児骨髄細胞を、それらを細胞バンクに貯蔵する前に、組織適合性抗原の欠けている生存形において処理する方法に関する。さらに、本発明の方法は、提供の手順の前に、同種移植の手順において、免疫応答を減少させるために、器官のドナーを処理すること、および造血システムの特異的な幹細胞の造血骨髄分画を強化するために、骨髄の抜き取りの前に、潜在的骨髄ドナーを処置することを包含している。なおさらに、本発明は、選択的に腫瘍組織中の細胞分裂を阻止するが、腫瘍を取り巻く良性細胞には影響せず、このような治療が必要なときに、患者に対して治療効果のある量の本発明のオリゴデオキシヌクレオチド、または組成物を投与することによる悪性腫瘍患者を治療する方法に関する。これらの方法は軟骨肉腫の治療に特に適していると考えられる。図の説明図１。ＣｈＥＲＮＡｓの転写ベクターＡＣｈＥとＢｕＣｈＥをコードするｃＤＮＡｓに相補的な“センス”（ｍＲＮＡ）、または“アンチセンス”（ｃＲＮＡ）ストランズで構成された〔³⁵Ｓ〕− 標識ＲＮＡ転写物を、材料と方法（４）に詳述されたように、ｐＧＥＭ−７Ｚ（＋）とBluescript ＳＫ（＋）プラスミドからＴ７，ＳＰ６またはＴ３ＲＮＡポリメラーゼを使用して調製した。情報提供制限酵素部位は、ｃＤＮＡ挿入部とそれらの境界のポリリンカー領域について顕著である。標識ＲＮＡ産物は、さらに制御されたアルカリ加水分解に付し、in situハイブリッド形成に十分短いプローブを産生した。図２ＡＩＬ₃−処理ネズミの骨髄細胞培養物のＳ₃またはＴ_sオリゴデオキシヌクレオチドでの滴定曲線（アンチセンス−ＡＳ；センス−Ｓ）骨髄細胞は、メチルセルロース／ＬＰＭ（Beit Haemek），１％ＢＳＡ（Sigma ）および１０％ＷＥＨＩ−ＣＭ，ＩＬ−３の源中で生育された。それらは３７℃ で、５％ＣＯ₂において、１０⁵細胞／mlの細胞濃度でインキュベートした。ＡＳ −とＳ−オリゴデオキシヌクレオチドを、１０nMのトリス＋／ｍＭＥＤＴＡ，pH ７．５中で、２−４mMとしたストック濃度において調製され、使用するまで−２０℃で凍結保存した。それらは、その後、ＰＢＳ中で１００μＭに希釈し、０時間において培養物に加え、最終濃度を２．５−１０μＭとした。オリゴデオキシヌクレオチドを、実験中を通じて培養部に保持した。４日目にコロニーを、オプチックファイバー暗視野装置つきのZeissのステレオズーム顕微鏡で計数した。図２Ｂ４日インキュベーションした５μＭの濃度において、Ｔ_sとＳ₃型のセンス、およびアンチセンスＢＣＨＥオリゴデオキシで処理した培養物骨髄細胞についての代表的視野図３ＩＬ３のみの存在（巨核球産生条件）において生育させたセンス、およびアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド−処理巨核球コロニーの細胞組成。４日目に平板の全内容を削り取り、ＰＢＳで１回洗い、細胞を遠心分離した。細胞をMay-Grunwald Giemsaで染色し、与えられた実験条件について、少くとも１，０００の細胞を計数した。細胞を、PatinkinらのMol．cell．Biol.，１０：６０４６（１９９０）の基準にしたがって分類した。図４表には種々のオリゴデオキシヌクレオチドの数種の分子パラメーターのデータとそれらの巨核球産生条件下でのコロニー形成を阻害する変動効果が提出されている。図５ＩＬ３のみを添加した巨核球の条件下およびトランスフェリンとエリスロポイエチン（ＥＰＯ）を加えた赤血球造成条件下で（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）オリゴデオキシヌクレオチドの投与後のコロニー形成の滴定曲線。ＣＦＵ−ＧＥＭＭ条件については、骨髄細胞は、１０−⁴Ｍチオグリセロール（シグマ）、１％ＢＳＡ（シグマ）、１０％ＷＥＨＭ（ＩＬ−３を含む）、２．８×１０^-4Ｍ鉄−飽和ヒトトランスフェリン（Behring，Marburg）および２単位のエリスロポイエチン（ＥＰＯ，１，０００Ｕ／mg）（Terry Fox Labs，Vancou ver,Ｂ．Ｃ）を含むメチルセルローズ／ＬＰＭ（Beit Haemek）中に生育させた。３７℃と５％ＣＯ₂において８日間インキュベートした後、オプティックファイバーによる暗視野装置をつけたZeissのステレオズーム顕微鏡を使用してコロニーを計数した。図６種々のオリゴデオキシヌクレオチドの存在において生育された細胞培養における細胞組成のヒストグラム。（Ａ１）オリゴデオキシヌクレオチド濃度：ＡＳ−とＳ−ＡＣＨＥ−２μＭ；ＡＳ−とＳ−ＢＣＨＥ−４μＭ；赤血球産生条件（ＩＬ−３＋ＥＰＯ）。（Ａ２）オリゴデオキシヌクレオチド：ＡＳ−ＡＣＨＥ。増加濃度、赤血球産生条件。与えられたプレートの直径≧０．５mmのピンクか赤のＣＦＵ−ＧＥＭＭコロニーを、ミクロピペットで拾い上げ、ＰＢＳ中で洗い、細胞を遠心分離した。ＣＦＵ−ＧＥＭＭコロニーは、存在する全コロニーの約９０％を構成していた。細胞は、May-Grunwald Giemsaで染色し、与えられた実験的条件あたり、少くとも１，０００の細胞を計数した。初期の赤芽球と巨核芽球は、極めて大きい核と原形質の極めて狭い縁をもった小さな濃く染色された細胞である。ヒト抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａＡｂ（Bally Ｓ．Celler，Stonybrook，Ｎ．Ｙ．からの贈り物）での間接的イムノ組織化学的染色に続いて、抗−マウスＩｇフルオレッセイン−結合Ａｂ（Amersham International）の１：１００の希釈液による染色を行い、そして、抗−ヒトグリコホリンαＡｂ（Immunoteck，Marseille）で直接染色を行うことによって、それらは一方が他方から区別された。後期の赤芽球は、小さな暗い核を囲む白色か極めて明るい青の原形質によって特徴づけられた。（Ｂ）オリゴデオキシヌクレオチド濃度２μＭ・巨核球産生条件（ＩＬ３）。図７１度腹腔内に２５μｇ／ｇ体重のＡＳ−ＡＣＨＥ，または対照としてリン酸バッファー化食塩水（ＰＢＳ）を注射したマウスの注射後２０日骨髄塗沫の代表的顕微鏡写真。図８ＣｈＥｃＲＮＡの標識化は、巨核球の発達とともに増加する。未処理の雌性マウスからの骨髄塗沫を〔³⁵Ｓ〕−標識ＣｈＥＲＮＡプローブとin situ ハイブリッド形成を行わせた。標識巨核球（ＭＫ）を方法の下で詳細に説明したようにエマルジヨンオートラジオグラフィーにしたがって写真を取った。Ａ：巨核球前駆体；Ｂ：中間細胞：Ｃ：成熟多核巨核球巨核球の発達に伴う細胞あたりの顆粒の数の増加；ＡＣｈＥｍＲＮＡとＢｕＣｈＥｍＲＮＡの標識化の間の差、そして対照（“センス”）プローブとハイブリッド形成を行った細胞上に顆粒が存在しないことに注意。図９巨大球の成熟を通じてのＡＣｈＥｍＲＮＡレベルにおける変動性Ａ：細胞あたりの認められた巨核球の数、プロー（），中間の（）および成熟の段階において細胞あたりの顆粒の平均数が測定された。細胞は、それらの発達の段階とそれらの上の顆粒の数にしたがって（０から２０，２０から４０など）グループに分けた。曲線は巨核球の亜型の各々についての顆粒の密度の分布を表している。中間的及び巨核球前駆体に比べてより広い変動に、そして他のグループと比べて中間的細胞の数が多いことに注意せよ。挿入図：細胞型あたりの顆粒の平均数がヒストグラムで示してある。細胞によって覆われていないスライドの区域上の背景標識は、写真のエマルジョンにおける自発的顆粒の形成は、シグナルの５％を越えず、実験結果から差し引いた。Ｂ：中間的および成熟巨核球上の変動的標識がエマルジョンオートラジオグラフィー写真図において示されている。さまざまな核や細胞が異なる強度で標識されていることに注意。核のクラスターのまわりの空のスペースは、恐らくin sit u ハイブリッド形成手順の前に、調製のステップにおいて後退している原形質のためであろう〔Courtney，Ｍ．ら、Blood ７７：５６０−５６８（１９９１）〕。図１０ in vivoでＡＳ−ＣＨＥオリゴデオキシヌクレオチドを投与したマウスにおける標識変動。方法の下に詳細を説明したように、１度“アンチセンス”ホスホロチオエート、またはＰＢＳで処理した。処理３週間後に、成畜雌性ラットから骨髄塗沫を作製した。in situハイブリッド形成とエマルジョンオートラジオグラフィーを平行して行った。提出された写真は、各処理グループからの１匹のマウスからアンチセンスＡＣｈＥｃＲＮＡ、またはＢＣｈＥｃＲＮＡでハイブリッド形成を行った塗沫を表示している。すべてのマウスにおいて、ＡＣｈＥｃＲＮＡと比較して、ＢｕＣｈＥｃＲＮＡでは、標識の強度が低いこと、そしてＰＢＳ注射マウスに比べて、処理されたマウスにおいては、標識強度の減少に注意すること。図１１．対照とＡＳ−ＣＨＥ処理マウスからの巨核球におけるＣｈＥｍＲＮＡレベルの調節。ＰＢＳ，ＡＳ−ＡＣＨＥとＡＳ−ＢＣＨＥで処理したマウスについて、本文において詳細を述べたように、細胞あたりの顆粒の平均数において、未熟、前駆、中間的と成熟巨核球におけるＣｈＥｍＲＮＡレベルを決定した。“センス”ＡＣｈＥｍＲＮＡとＢｕＣｈＥｍＲＮＡプローブが対照として用いられ、それらとハイブリッドを形成させた骨髄塗沫は、事実上標識されないままであった（頂部の図における空のシンボルを参照のこと）。２つのｃＲＮＡプローブでの標識の発達パターンにおける相違と、ＡＳ−ＣＨＥｓで処理したマウスにおけるこれらの標識化の減少に注意すること。図１２．ＡＳ−ＡＣＨＥとＡＳ−ＢＣＨＥ処理マウスからの巨核球集団における細胞数の変化。各骨髄塗沫についての巨核球の総計数を各処理グループ（Ｎ＝４）内で平均し、それらの標準偏差とともに示されている。偏差は、カラムの頂部に記してある。総巨核球数とＡＳ−ＡＣＨＥについての変化した分別的細胞数に注意せよ。しかし、ＰＢＳ注射対照と比較して、ＡＳ−ＢＣＨＥ処理マウスではそうならないことに注意せよ。図１３．ＣｈＥｍＲＮＡのレベルは、ＡＳ−ＡＣＨＥ−処理マウスにおけるアクチンのｍＲＮＡ転写の正常なレベルによって観察されるように選択性である。１３Ａ：ＡＳ−ＡＣＨＥ−処理、および非処理（ＰＢＳ）マウスからのβ−アクチンｍＲＮＡの選択的ＰＣＲ増幅。総ＲＮＡを、製造者の使用説明書にしたがってＲNasol法を使用して、ＡＳ− ＡＣＨＥホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド、または、ＰＢＳを注射したマウスの骨髄から、総ＲＮＡを抽出した。ランダムヘキサマーをプライマーとして使用し、１μｇのＲＮＡを逆転写した。その結果生じたｃＤＮＡを、マウスのβアクチン特異的プライマー８２２（＋）と９９６（−）を用い、〔Lapi dot-Lifson，Ｙ．，ら、Rroc．Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ８９：５７９−５８３（１９９２）〕製造業者の使用説明書によって、ＲＮＡ−ＰＣＲキット（Perkin Elmer／Cetus）を使用して、ＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲの条件は：変性：９４℃，１分．（最初のサイクル３分）；アニーリング：５５℃、１分：伸長：７２℃，１分．（最後のサイクル５分），３５サイクル．ＰＣＲ産生物（１０％）はエチジウムブロマイドで染色した１．６％アガロースゲル上で分析した。逆転写酵素（＋ＲＴ）の存在下で、ＡＳ−ＡＣＨＥとＰＢＳ注射マウスにおいて、明らかに、同様な量のβ−アクチンＰＣＲ断片（１７５bp）の存在に注意すること。そして、反応混合物中に逆転写酵素が含まれなかった場合は（−ＲＴ）、その不在に注意せよ。Ｍ，分子量マーカー（マーカーＶＩ，Boehringer Mannheim；b p．塩基対。１３Ｂ．マウスアクチン遺伝子の模式図的提示。マウスβ−アクチン遺伝子のエキソン／イントロン構造に関連したアクチンｃＤＮＡのコード領域内のＢ２２（＋）と９６６（−）の位置が示されている。Ｎ′とＣ′は、成熟蛋白質のアミノ及びカルボキシル末端を表している。Ｐ（Ａ），ポリアデニル化シグナル：（）イントロンの位置。長さはkbで示されている。図１４．ＡＳ−オリゴデオキシヌクレオチドの原形質への蓄積。蛍光性ＦＩＴＣtaqに共有結合で結合したＡＳ−ＣＨＥＤを、ＣＦＵ−ＭＥＧ培養物に最終濃度４μＭにおいて加え、２時間後および４時間後に、細胞を遠心分離し、方法の下に詳細に説明したように染色した。Zeiss Axoplan顕微鏡と×１００Plan neofluar lenseを次に使用して、処理細胞内のＡＳ−オリゴデオキシヌクレオチドの細胞下の局在を明らかにした。分析した細胞の型には、成熟巨核球（Ａ）、若く、分裂している巨核球と成熟した多形核細胞（Ｂ）、しかもより小さい、それらの発達の初期の多形核細胞（Ｃ）が含まれる。発明の詳細な説明本発明は、造血性骨髄細胞の発達を調節することができる合成ホスホロチオエート化されたまたは部分的なホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチドに関する。もっと詳細には、本発明は、巨核球造成を阻害するか、促進し、そして、造血性骨髄幹細胞の発達を巨核球と赤血球から、分裂している幹細胞、マクロファージと他の単核細胞へと脇道にそらせることができるホスホロチオエート化された、または部分的にホスホロチオエート化された合成オリゴデオキシヌクレオチドに関する。特に、本発明は、ヒトＡＣＨＥ（アセチルコリンエステラーゼ）、または２ＨＳ（ｃｄｃ２キナーゼ）の遺伝子におけるＡＵＧ開始コドンにわたる領域に対して向けられ、すべてのヌクレオチドの間に、または４つの３′−末端ヌクレオチドのみの間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである合成オリゴヌクレオチドに関し、そして、ヒトＢＣＨＥ（ブチリルコリンエステラーゼ）遺伝子におけるＡＵＧ開始コドンにわたる領域に向けられ、またはＣＨＥＤ（ｃｄｃ２同族体）遺伝子の５′−領域にむけられた、４つの３′−末端ヌクレオチドの間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドである合成オリゴデオキシヌクレオチドに関する。本発明による特異的合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは以下の通りである。 −式５′−GGTATAATCTTCCAT-３′ を有するヒト２ＨＳ遺伝子におけるイニシエーターＡＵＧコドンにわたる領域に向けられたすべてのヌクレオチド（ＡＳ２ＨＳ−Ｔ_s）の間に、または４個の３′−末端ヌクレオチド（ＡＳ２ＨＳ−Ｓ₃）の間に、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチド： −式：５′−CTGCGGGGGCCTCAT-３′ を有するヒトＡＣＨＥ遺伝子におけるイニシエーターＡＵＧコドンにわたる領域にむけられた、すべてのヌクレオチド（ＡＳＡＣＨＥ−Ｔ_s）の間に、または４個の３′−末端ヌクレオチド（ＡＳＡＣＨＥ−Ｓ₃）の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド； −式：５′−GACTTTGCTATGCAT-３′ を有するヒトＢＣＨＥ遺伝子におけるイニシエーターＡＵＧコドンにわたる領域にむけられた４個の３′−末端ヌクレオチド（ＡＳＢＣＨＥ−Ｓ₃）の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド：そして、 −式：５′−TTTTCCCCAGTCAAT-３′ を有するヒトＣＨＥＤの遺伝子における５′の領域にむけられた、４個の３′− 末端ヌクレオチドの間に（ＡＳＣＨＥＤ−Ｓ₃）ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドである。部分的にホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチドの方が望ましい。ホスホロチオエート化された、および部分的にホスホロチオエート化された１５量体オリゴデオキシヌクレオチドは、例えば、以下に続く例においてさらに詳細に記述されるように、例えば、Applied Biosystem ３８０ＢＤＮＡシンセサイザーを使用することによって合成することができる。アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの濃度依存性を検べるために、そしてそれらの毒性レベルを決定するために、巨核球産生骨髄培養を使用して、滴定曲線を、本オリゴヌクレオチドのそれぞれについて得た。実験例１から分るように、完全に（Ｔ_s）、そして部分的（Ｓ₃）にホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチドＡＳ−ＢＣＨＥ，ＡＳ−２ＨＳ，およびＡＳ−ＣＨＥＤは、特異的にコロニー数を減少させた。しかし、Ｓ₃オリゴデオキシヌクレオチドは、それらのＴ_s相当物よりも相当に毒性か弱かった。この例と図１と２から見られるように、巨核球の分画は有意に減少した。そしてマクロファージの対応した増加が、ＡＳ−ＢＣＨＥとＡＳ−ＣＨＥＤについて観察されたが、ＡＳ−２ＨＳ、またはＳ−ＢＣＨＥ処理については観察されなかった。このように、本発明のアンチセンスＢＣＨＥとＣＨＥＤオリゴデオキシヌクレオチドは、巨核球の生産性を減少させ、マクロファージの生成を促進することができる。その上、熱力学的特性、２量体形成、水素結合、分子内ハイブリッド形成のような種々のオリゴデオキシヌクレオチドのいくつかの分子パラメーター、ならびにコロニー形成を阻害するそれらの潜在能力を決定した。結果は、実験例２に与えられている。巨核球産生条件下での細胞培養における本発明のオリゴデオキシヌクレオチドの効果を赤血球造成条件下の細胞培養でのそれらと比較した。注目すべきことに、巨核球の造成は、巨核球造成条件下で、ＡＳ−ＡＣＨＥとＡＳ−ＢＣＨＥの両者によって効率的に阻害されたが、一方、赤血球造成条件では、細胞増殖の促進が、ＡＳ−ＡＣＨＥについて観察され、コロニー数の１０倍の増加を起し、巨核球の分画の増加を伴った。発明者の知る限りでは、in vitroでのオリゴデオキシヌクレオチド処理による細胞増殖の誘発は、出願の期日までには示されていない。結果は、実験例３に与えられている。その上、本発明の異なるオリゴデオキシヌクレオチドは、同等なコロニー数によって検討された特異的な効果を示す。培養において低濃度における（２μＭ）ＡＳ−ＡＣＨＥ処理は、ＣＦＵ−ＭＥＣ（巨核球造成）条件下では、巨核球の選択的減少を、そしてＣＦＵ−ＧＥＭＭ（赤血球産生）条件下では、赤血球の減少を伴った。ＡＳ−ＡＣＨＥでの培養における比較的高い濃度での処理においては（１２μＭ）、培養で観察されたように、赤血球造成条件下では、巨核球の数をさらに増加する。培養における４μＭの濃度でのＡＳ−ＢＣＨＥでの処理は、巨核球造成、および赤血球造成条件下で、ともに巨核球造成を減少したが、Ｓ−ＢＣＨＥではそうならなかった。結果は実験例４に与えられている。 in vivoにおける実験では、ＡＳ−ＡＣＨＥでの処理に続き、望ましい幹細胞を含むリンパ球の増加を示す。その効果は、特異的で濃度依存性であり、ＡＳ− ＡＣＨＥの１回注射後、３、および６週間で観察されたが、Ｓ−ＡＣＨＥオリゴデオキシヌクレオチドではそうならなかった。赤血球の平行的減少が、この骨髄細胞の組成の激しい変化に伴った。これらの重要な結果は、実験例５と８において与えられている。上記の効果は、未処理マウスにおける巨核球の成熟を通じての本発明のオリゴデオキシヌクレオチドで処理した後変化を受けたＣＨＥｍＲＮＡのレベルの増加によってさらに実証される。結果は実験例６と７に与えられている。本発見から、本発明の合成ホスホロチオエート化された、または部分的にホスホロチオエート化されたアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの低量でのin vivo処理が、血小板の産生を調節することができることが示唆される。本発見は、腹腔内注射されたＡＳ−オリゴデオキシヌクレオチドの標的配列ばかりか、他方では、巨核球の組成、そして／または総数に対する長期造血効果を示す。表２において見られるように、他の造血性骨髄細胞の分画も、これらのアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドによって影響される。本発明者らは、in situハイブリッド形成を使用し、次いで、標識化の結果のイメージ分析と統計学的処理を行った。この高分解能アプローチは、巨核球前駆細胞から血小板を造成する成熟巨核球へ、ＡＣｈＥｍＲＮＡの２０倍の増加とＢｕＣｈＥｍＲＮＡのより穏やかな４倍の増加を示した。ＡＣｈＥとＢｕＣｈＥの酵素活性は、これらのすべての発達段階において、共にみることが出来、明らかに未標識の未熟細胞〔Bursteinら、（１９８０）：PatinKinら、（１９９０）〕においてさえみられる。しかし、組織化学的分析によっては定量化できなかった。したかって、以下の例において提出された結果は、巨核球造成過程を通じて種々のＣＨＥ遺伝子が相当な転写活性を受けることを暗示している。哺乳動物の巨核球の造成におけるＣＨＥ遺伝子の複雑な制御からこれらの細胞の発達において、ＡＣｈＥとＢｕＣｈＥについての紛れもない役割りが示唆される。この概念は、ＡＳ−ＣＨＥ処理とそれらの例において示されるように、処理されたマウスにおける巨核球の数と組成に対する効果によって強化される。さらに、これらの知見は、オリゴデオキシヌクレオチドに基づいた治療的調製物を使用したＣＨＥの遺伝子の発現の選択的阻害のためのin vivoの範例の発展にむかっての最初の段階を提供している。最後に、今回の観察によって、in vivoにおける血小板の産生は、コリン作動性のシグナル形成によって制御されていることが示唆される。ＩＬ³−処理細胞培養とin vivoの両方におけるＡＳ−ＢＣＨＥの発達の抑制の程度は、培養と、in vivoで同様でない可能性があるが、培養には存在していなかったエリスロポイエチンは、もっぱらＡＳ−ＢＣＨＥの効果を変更しないことが示唆される。ＡＳ−ＡＣＨＥは、ＢｕＣＨＥｍＲＮＡのレベルには、中程度に影響するが、その標的ｍＲＮＡを選択的に抑制する。対照的に、ＡＳ−ＢＣＨＥはＢｕＣｈＥｍＲＮＡに対しての方がより効率的であるが、ＣＨＥｍＲＮＡとＢｕＣｈＥｍＲＮＡをともに減少させる。以前の培養試験は、ＡＳ−ＢＣＨＥによる巨核球の産出の一般的な阻害を示した〔Patinkinら、（１９９０）〕。しかし、ＡＣｈＥｍＲＮＡに対するその効果は有意である：それは、厳密に特異的なサブグループに属することが測された細胞中に現れたので、ＡＣｈＥｍＲＮＡは、巨核球造成の一般的な減速のためであるとすることはできない。これは、順次、発明者が、成熟巨核球と定義したものにおけるＡＣｈＥｍＲＮＡ標識の変動性をさらに明らかにしている。このように、細胞は、恐らくこれらの細胞では、核の分裂と発達が止ることを確保するために、加齢とともにＡＣｈＥｍＲＮＡ分子を蓄積するように見える。血液と免疫系疾患に対する治療プロトコールを改善するであろう化合物と方法を提供することが、本発明の目的である。移植される骨髄において、幹細胞の分画を増加させることは、移植骨髄が未だ効率的に十分増殖しておらず、受容者が新鮮な血液の輸血を受ける必要があるときに、遅延時間を短縮する可能性がある。受容者自身のあらかじめ凍結しておいた骨髄（例えば、骨髄は化学療法か放射線療法を始める前に患者から抜きとることができる）を、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドで処理すれば、移植操作の後に、免疫抑制を行うという現行の必要性を避けるであろう。現行の手順によれば、移植には、体重Ｋｇあたり２×１０⁸の骨髄細胞が必要である。１回の抜き取りでは、１０−１５mlの骨髄組織が含まれる。このような検体中の増殖幹細胞の数を増加させれば、移植の成績を改善するであろう。その上、小さな種の検体は、このように、かなりな大きさの細胞集団に生育させることができる。このような種培養は、例えば、へその緒から調製することができ、ＨＬＡの型を決定し、必要となるまで凍結保存ができるので、これは、将来の受容者自身の細胞を貯蔵するために役立ちうる。その上、本発明のアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチドは、免疫抑制手順において使用するために、潜在的に重要である。薬理学的薬剤による免疫機能の修飾は、特に、同種移植に必要な臨床手順において、治療の主要な領域として出て来ている。免疫応答の活性化や抑制は、ともに、マクロファージのような貧食細胞による“自己”または“非自己”抗原の処理が含まれていると考えられる〔このトピックの包括的な総説については、Paul，Ｗ．Ｅ．，Fundamental Immu nology，２nd Ed.，Ravan Press，Ｎ．Ｙ．１９８９を参照のこと〕。そのため、造血の合理的な調節は、移植手順にとって価値があるはずである。このように、ＡＳ−２ＨＳの投与の結果生ずる効果のような、マクロファージ産生の抑制は、拒絶反応を選択的に減少させると考えられる。その上、ＡＳ−ＡＣＨＥによる幹細胞産生の誘発は、分化していない細胞の分画を増加させる。これらの細胞のなかには、拒絶反応の原因である組織適合抗原をまだ提示していない細胞がある。したがって、造血一般を抑制するＡＳ−２ＨＳとＡＳ−ＡＣＨＥの併用は、受容者、移植器官または組織のレベルにおいて、そしてこれがあらかじめ知れている場合には、ドナーレベルにおいても有用である。後者の場合では、示唆された処理は、前もってドナーの中に拒絶の過程の原因である表現型に欠けているマクロファージを造り出すと考えられる。様々なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの厳密に調節された量が、これらの混合物処理に必要となろう。すべて治療目的次第で、投与経路、およびin vivoで使用されるときには患者の状態で決まる。したがって、主治医が、最適の治療効果をうるために必要な用量を滴定し、投与経路を修飾することが必要となると思われる。治療の進展は、従来使用されている血液学的検定、または実験室用細胞計数装置によって容易にモニターできる。適当な出発治療用量は、本発明中に記述されたin vitroの効果試験から外挿することができる。本発明の重要な特徴は、オリゴデオキシヌクレオチドが、灌流（器官用に）、または単純な皮下、筋肉内、静脈内、または腹腔内（患者用に）に投与することができ、それらの効果が、少くとも数週間続くということである。Ｓ₃アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの限られた毒性は、それらの治療的使用のために特別重要である。本発明は、本発明のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの少くとも１つ、または該オリゴデオキシヌクレオチドの少くとも２つの混合物、および通常溶液の形で生理学的に容認できる担体、賦形剤、または安定剤を含む医薬組成物を提供する。容認できる担体、賦形剤は、使用される用量と濃度において、受容者にとって毒性がなく、そしてホスフェートバッファー化食塩水、および同様な生理学的に容認できるバッファー、そして、もっと一般的には、この分野の技術で知られているすべての適当な担体を含む。組成物は、随意的にさらに、抗酸化剤、モノ、およびジサッカライド；ナトリウムのような塩形成の対抗イオン、そして／または、非イオン性界面活性剤を含むことがある。徐放性の組成物もこの出願の範囲内で考えられている。これらには、フィルムやマイクロカプセルのような形をもった物質の形で半透過性重合マトリックスが含まれることがある。本発明のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドと組成物は、無菌でなければならない。例 (I) 材料と方法 (1) アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの合成オリゴデオキシヌクレオチドは、製造業者の説明書にしたがって、同じ会社からのホスホロアミダイトを使用して、Applied Biosystem ３８０ＢＤＮＡシンセサイザー上で合成した。それらは、Watersの自動化グレーディエントコントローラーと２６０nmにおいて操作されたモデル４８１ＵＶ分光光度計と組合せたWa tersのdual pump ６０００Ａシステム上で、逆相ＨＰＬＣによって精製した。５ ′位を保護しているジメトキシトリチル基は、未だオリゴデオキシヌクレオチドについていた。これは８０％含水酢酸での標準法による処理によって除去された。得られたオリゴデオキシヌクレオチドは、再びＨＰＬＣによってその純度をチェックした。ホスホロチオエート基を組み込むために、ヨウ素を用いる酸化の工程を３Ｈ−１，１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシドとの反応によって置き換えた〔Iyer，Ｒ．Ｐ．，ら、Ｊ．Org． Chem．５５：４６９３−４６９９（１９９０）〕。この処理は、オリゴデオキシヌクレオチドを、ヌクレアーゼから保護した（Eckstein，F.，Ann．Rev．Bioche m.，５４：３６７−４０２（１９８５）；Spitzer，F．とEckstein，F．Nucleic Acids Res.，１８：１１６９１−１１７０４（１９８８）〕。そして、in vivo におけるそれらの持続性を延長する〔Woolf，Ｔ．Ｍ．，ら、Nucleic Acid Res. ，１８；１７６３−１７６９（１９９０）；Shaw，Ｊ．Ｐ．，ら、Nucleic Acid s Res.，１９：７４７−７５０（１９９１）〕。部分的保護が必要な場合では、３Ｈ−１，２−ベンズチオール−３−オン１，１−ジオキサイドとの反応を最初の３工程のみに行い、その後正規の合成を続けた。その結果得られた部分的に保護されたオリゴデオキシヌクレオチドは、したがって、それらの３’−末端において、最後の３個のヌクレオチド間結合においてのみ、ホスホロチオエート基によってふさがれた。使用されたアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、それぞれＡＣＨＥｍＲＮＡ〔Soreqら（１９９０）同上〕とＢｕＣＨＥｍＲＮＡ〔P rodyら、（１９８７）同上〕におけるイニシエーターＡＵＧ領域を補足するためにデザインされたＡＳ−ＡＣＨＥ（５′−CTGCGGGGCCTCAT−３′）とＡＳ−ＢＣＨＥ（５′−GACTTTGCTATGCAT−３′）であった。やはり使用されたのは、ヒトＣＨＥＤ遺伝子〔Lapidot-Lifson，Ｙ．，ら、Proc．Natl．Acad．Sci.ＵＳＡ８９：５７９−５８３（１９９２）〕の５′領域にむけられたＡＳ−ＣＨＥＤ（５′−TTTTCCCCAGTCAAT-３′）とヒトｃｄＣ２ＨＳキナーゼｍＲＮＡ〔Nurse，N ature（１９８６）〕におけるイニシエーターＡＵＧコドンを補足するためにデザインされたＡＳ−２ＨＳ、（５′−GGTATAATCTTCCAT-３′）であった。アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、−２０℃で４mMの濃度で保たれ、マウスにそれらを投与する前にホスフェートバッファー化食塩水中に希釈した。(2) In vivo投与ＡＳ−ＣＨＥとＡＳ−ｃｄｃ２オリゴデオキシヌクレオチドの腹腔内投与は、ハミルトン注射筒を用いて遂行した。量は、ＡＳ−ＣＨＥｓの最終濃度が５μｇ／gr体重になるように、そして、注射した容量が１０μｇ／gr体重を越えないように、細胞培養の前の実験〔Patinkinら、（１９９０）；Lapidot- Lifsonら、（１９９２）〕によって計算した。注射したマウス上には、毒性効果は観察されず、マウスはすべて正常に挙動し、体重の減少を示さなかった。より高い濃度が使用されたときは何時でも、断り書きをし、投与手順は同じであった。(3) ヒトＡＣｈＥｃＲＮＡとＢｕＣｈＥｃＲＮＡのin vitro合成のための転写ベクターヒトＡＣｈＥｃＲＮＡ（長さ１．５kb;クローンnoｈＥＥＬ，Soreqら、１９９０）を、ＥｃｏＲＩ部位において、Ｔ７とＳＰ６バクテリオファージからのＲＮＡポリメラーゼ結合部位を含むｐＧＥＭ−７ＺＦ（＋）プラスミド（promega）中にサブクローンした。それぞれ、アンチセンスＡＣｈＥｃRNAまたはセンスＡＣｈＥｍＲＮＡを産生するためにＳＰ６またはＴ７ＲＮＡポリメラーゼでのin v itroのＲＮＡ転写を使用した。ヒトＢｕＣｈＥｃＤＮＡ（長さ２．２kb；Soreq ら、１９８９）を、Ｔ７とＴ３のバクテリオファージからのＲＮＡポリメラーゼの結合部位を担っているBluescript ＳＰ（＋）プラスミド（Stratagene）中へＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＶ制限酵素部位においてサブクローンした。Ｔ７とＴ３ＲＮＡポリメラーゼでのin vitroＲＮＡ転写を用いて、このベクターからそれぞれ“ アンチセンス”ＢｕＣｈＥｃＲＮＡと“センス”ＢｕＣｈＥｍＲＮＡを産生した。(4) in situハイブリッド形成のためのリボプローブの調製アマシャムＲＰＮ２００６キットとベーリンガー（マンハイム）のＲＮＡポリメラーゼを用いて、in vitroで、ＲＮＡ転写物を〔³⁵Ｓ〕で標識した。ＡＣｈＥのセンスとアンチセンスＲＮＡプローブに対しては、それぞれ、Hind IIIとＸｈｏＩで消化した線状プラスミドを、ＢｕＣｈＥのセンスとアンチセンスＲＮＡプローブに対しては、それぞれＡｐａＩとＳｍａＩで消化した線状プラスミドを用いた。すべての操作は、製造業者の説明書にしたがって行った。放射線標識プローブのアルカリ加水分解を２０分間行った。その結果得られた２００−４００の塩基の長い断片を組み込まれていないヌクレオチドから〔Wilkinson Ｄ．Ｇ．，ら、Cell，５０：７９−８８（１９８７）〕によるセファデックスカラムクロマトグラフィーによって分離した。図１を参照。(5) 組織の調製とin situハイブリッド形成骨髄を、エーテルで麻酔し、屠殺した６週齢の雌性のマウスの切開した大腿骨からしぼり出し、実験手順〔Rentrop，Ｍ．，ら、Histochemical Journal１８：２７１−２７６（１９８６）〕中の細胞の喪失を防ぐために、３−aminopropylt riethozyシラン（ＴＥＳＰＡ，シグマ）をコートした顕微鏡用スライド上で、単層細胞として塗沫した。スライドを室温で２時間乾燥させ、４％パラホルムアルデヒドで固定し（室温２０分）、３倍で１回、１倍のホスフェートバッファー化食塩水で２回洗浄し、エタノールシリーズを通して脱水し、風乾し、−２０℃で最長２週間まで貯蔵した〔Hogan，Ｂ．，ら、Ａ Laboratory Manual，Cold Spr ing Harbor Laboratory（１９８６）〕。in situハイブリッド形成スライドは、再固定、非特異的プローブ結合を減少させるために、０．２ＭＨＣｌで２０分間のインキュベーション、プロテナーゼＫで処理、アセチル化と記述したように脱水〔Rangini，Ｚ，ら、Mechanisms of Development，３５：１３−２４（１９９１）〕を行った。ハイブリッド形成は、チオ−ＡＴＰを加えなかったことを除けば、Ranginiら（１９９１）にしたがって、〔³⁵Ｓ〕−ＣＨＥＲＮＡ（スライドあたり約１×１０^-7ｃｐｍ）の存在下で行われた。暴露は６時間行われた。対比染色は、May-Grunwald Giemsaで行われた。(6) 顕微鏡によるイメージ分析と統計学的データ処理 in situハイブリッド形成の成績は、単一スライド自動式ステージ、自動的フォーカス、および６０×プランアポ油浸対物レンズを備え、インターフェースを通して、Magiscan Image Analysis顕微鏡コントローラー（Applied Imaging I nternational Ltd．Dukesway,Ｕ．Ｋ．）に連結しているNikon Microphot顕微鏡を使用して分析された。イメージ分析はソフトウェアパッケージ“ＧＥＮＩＡＳ ”によって行われた。それは、銀粒子を計数し、細胞のパラメーターを測定し、そして粒子の細胞との会合を評価する。次に、データ管理を“ＧＥＮＩＡＳ”と対象領域、および種々の統計学的仮説テストに対する視野測定から得られたデータの統計的有意性を検査する（Applied Imaging，Ｕ．Ｋ．）。簡単に述べると、検査した巨核球の単色イメージを、赤のフィルターを使用して捕え、対照を改善した。銀の粒子と細胞は異なる焦点面にあるので、粒子は、それらの最善の分解能が要求されるので、正確にフォーカスされた。粒子の数は、それらと暗さに基づいて自動的に検出された。そして、粒子のイメージに含まれた高頻度のノイズの情報は、自動的に差し引いた。測定されるべき細胞の境界は、手動で描かれ、その後粒子を計数し、各細胞毎に別別に測定した。背景の粒子密度を平行的に測定し、実験結果から差し引いた。集めたデータには、細胞数、パラメーター（細胞の面積の測定）、細胞あたりと単位面積あたりの粒子の数、およびこれらのパラメーターの間の変動の統計的有意差が含まれていた。提出されたデータは、別々のin vivo処理についての平均の結果であり、異なる発達段階にある約４０の巨核球が、処理あたり４匹の異なるマウスからの骨髄調製物においてＣｈＥｃＲＮＡプローブの各々で解析された。(7) アンチセンスオリゴヌクレオチド処理、半固体骨髄培養の分別的細胞解析ＣＦＵ−ＭＥＧコロニーを育てるために、８−１２週齢のエンドトキシン−抵抗性Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスの大腿骨と脛骨からの骨髄細胞を、インターロイキン３（ＩＬ３）の源として、ＷＥＨＩ−３細胞のための１０％のならし培地、１％ＢＳＡ、１０^-4Ｍチオグリセロール、および１％メチルセルロース（巨核球造成条件−ＣＦＵ−ＭＥＧ）を含むＬＰＭ合成培地（Biological Industries，Beit ，HaEmeK，Israel）中で培養した。赤血球造成条件を得て、ＣＦＵ−ＧＥＭＭのコロニーを育てるために、２．８ ×１０^-4Ｍ鉄飽和ヒトトランスフェリンと２単位のエリスロポイエチン（ＥＰＯ，１，０００Ｕ／mg／ml）を加えた（ＣＦＵ−ＧＥＭＭの条件）。両培養型について、０．５−１．０×１０^-5細胞／mlを、３５mmのペトリ皿（ Nunc １００８）、または２４穴細胞培養用Costerプレートに平板を流し込み、３７℃，５％ＣＯ₂下、それぞれＣＦＵ−ＭＥＣとＣＦＵ−ＧＥＭＭ条件については、高湿度で４日または８日間インキュベートした。オリゴデオキシヌクレオチドを、表示最終濃度１−２０μＭにおいて、培養の開始にあたって添加した。センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む血清不在のメチルセルロース培養において生育したコロニーを引き伸ばしたパスツールピペットで拾い上げ、ホスフェートバッファー化食塩水（ＰＢＳ）中でCytospin（Shandon２）によって（×５００ｇにおいて５分間）遠心分離して濃縮し、May-Grunwald Gie msaで染色し、顕微鏡的に分析した。次に、認められた数の独立した実験から回収された総細胞数中で代表された各細胞分画を定量した。首尾良い対照実験から、対照（オリゴなし）培養において観察された場合と本質的に同一である分布が明らかになり、非特異的毒性がないことが示唆された。各データセットに対して少くとも５００の細胞が計数された。また、各実験について、ＣＦＵ−ＧＥＭ、またはＣＦＵ−ＭＥＧＧの総数が検査したオリゴデオキシヌクレオチドの存在下で、４日または８日後に、Zeissステレオズーム双眼顕微鏡において決定された。コロニー数は、直接、または対照、すなわち、未処理の培養の総数の百分率としてプロットされた。データは、特にことわりがない限り、それぞれの場合における３つの独立した実験の平均±平均の標準の評価（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を代表している。(II) 実験と結果 (1) ＡＳ−オリゴデオキシヌクレオチドとそれらの毒性レベルＡＳ−オリゴデオキシヌクレオチドの効果の濃度依存性を検討し、それらの毒性レベルを決定するために、巨核球産生性骨髄培養を使用して、用いられたオリゴデオキシヌクレオチドのそれぞれについて滴定曲線を導いた。本目的のためには、ＩＬ₃で処理したネズミの骨髄細胞培養物は、増加しつつある濃度の完全にホスホロチオエート化されたか、（Ｔ_s）か、最後の３′ヌクレオチド結合（Ｓ₃ ）において部分的に保護されたオリゴデオキシヌクレオチドのいずれかの最終濃度が１０μＭのオリゴデオキシヌクレオチドの存在下で４日間成育させて、コロニー数を記録した。ＣＨＥＤ，ＢＣＨＥ，または２ＨＳをふさいでいるＴ_sオリゴデオキシヌクレオチドは、すべてコロニー数を有意に減少させることが判明した。しかし、いずれの細胞においても、相手のハイブリッドを形成できる鎖がないＳ−ＢＣＨＥオリゴデオキシヌクレオチドも、５μＭより高い濃度において、コロニー数を減少させ、培養におけるコロニー形成に対するこのようなオリゴデオキシヌクレオチドの非特異的阻害効果が示された。これは、順次、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドも非特異的阻害成分を含むかもしれないことを示唆している。この仮説は、同じヌクレオチド配列を有するＳ₃オリゴデオキシヌクレオチドは、一般的に培養のそれぞれにおけるそれらのＴ_s相対物よりもはるかに毒性が弱いという観察によって増強された。非特異的ホスー阻害は、このように、これらのオリゴデオキシヌクレオチドのホスホロチオエート成分に関連していることが示された。Ｓ₃とＴ_sオリゴヌクレオチドの効果を比較するために、分別細胞計数が５μＭの最終濃度で、Ｓ₃とＴ_sＡＳ−ＢＣＨＥオリゴデオキシヌクレオチドについて行われた。巨核球分画における有意な減少とマクロファージの対応する増加が、両オリゴデオキシヌクレオチドについて、同様に観察された。図１Ｂは、このような培養からの代表的な視野を示し、図２は、ヒストグラムの形で５μＭのＴ_s，ＢＣＨＥ，ＣＨＥＤ，または２ＨＳについての分別細胞分画を提示している。分別計数分析は、Ｔ_s、またはＳ₃のいずれにせよ、検討したアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの各々は、巨核球造成過程を調節する能力を保持していることを示した。非特異的毒性効果は、非選択的であるように思われ、すべての細胞系に影響する。このことは、順次、コロニー数に対する減少効果の一部は、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドのホスホロチオエート特性のための非特異的阻害による仮説を強調する。(2) 検討したオリゴデオキシヌクレオチドの分子的パラメーターと毒性検討されたオリゴデオキシヌクレオチドの主要ヌクレオチド配列とそれらの変動する毒性（巨核球造成条件下での骨髄のコロニー形成を阻害する活性）効果の間の相関を探索するために、いくつかの分子パラメーターを決定した。これらには、それらの熔融温度（Ｔ_m）、ヌクレオチドの百分率組成、それらの生理学的条件下でダイマーを形成する傾向、およびこれらのオリゴデオキシヌクレオチドが、それら自身の内部において形成することがある任意のループ構造が含まれていた。特に、発明者は、これらのオリゴデオキシヌクレオチドにおける４個の３ ′−末端ヌクレオチド（したがって、最後の３個のヌクレオチド間結合）が、分子内構造に関与している可能性を検討した。この解析（図３）により、３個の３ ′−末端結合の分子内ループを形成する能力と５− １０μＭの濃度における相当するＡＳ−オリゴデオキシヌクレオチドの相対的な毒性の間の直接的な関係が明らかとなった。このように、それらの３′末端における分子内ルーピングの傾向がないＡＳ−オリゴデオキシヌクレオチドは、毒性が弱い傾向があるが、培養細胞においては同様に効果的であるであろう。この時点で、他の人々の研究によって、ＡＳ−オリゴデオキシヌクレオチドのinvivoでの延長を示したことは、注意することが重要である〔Agarwal，ら、（１９９１）同上〕。恐らく、循環から外来のＡＳ−オリゴヌクレオチドを除く掃除機作として有用なこの過程は、付着したオリゴヌクレオチドの自由な末端の存在に依存している。したかって、この重要な位置における部分的なホスホロチオエートによる保護は、これらのＡＳ−オリゴデオキシヌクレオチドの安定性を確保するに足ると考えられ、その上、ＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドに関与していないときは、これらの化合物の自然の掃除による除去を助けることによってそれらの非特異的毒性効果を減少させることができる。(3) 検討したオリゴデオギシヌクレオチドの巨核球造成と赤血球造成条件下での効果上に詳細を述べた特異的ＡＳ−オリゴデオキシヌクレオチド効果が、コリン作動性シグナル形成の損傷のために起ると仮定し、ＡＣｈＥコード配列における〔 Soreqら、（１９９０）同上〕ＡＵＧコドンの領域にわたる１５′ヌクレオチドにしたがって、平行オリゴデオキシヌクレオチドを調製した。３′−末端をふさいだ３個のヌクレオチド間結合（すなわち、それらのＳ₃型において）を含むように、センスとアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドがともにデザインされ、それらの分子特性が、同様に解析された。分子内ループにおける３′−関与が存在しないことが、デザインしたオリゴデオキシヌクレオチドのコンピューター解析によって確証された。そして、上に述べたＢｕＣｈＥと平行に、細胞培養においてこれらのＡＣｈＥオリゴデオキシヌクレオチドを使用したさらなる実験を、急遽行った。細胞培養のアプローチを深めるために、骨髄細胞をＩＬ₃だけとともに（すなわち、ＣＦＵ−ＭＥＧコロニーのみを誘発する巨核球造成条件）、またはトランスフェリンおよびエリスロポイエチンの添加も行われた。（すなわち、赤血球産生条件、その条件では、ＣＦＵ−ＧＥＭＭも発現すると思われる。但し、ＧＥＭＭは、顆粒球、赤血球マクロファージ、および巨核球を意味する）。この複合実験は、ＡＳ−ＡＣＨＥとＡＳ−ＢＣＨＥはともに巨核球を効率的に阻害したが、しかし、種々の効率においてであった。ＡＳ−ＡＣＨＥ（しかし、Ｓ−ＡＣＨＥではそうならない）は４μＭの濃度ですでに効果があり、コロニーの約５０％を阻害した。これと対照的に、ＡＳ−ＢＣＨＥは、４μＭ以上の濃度では、コロニー形成のわずか３０％のみを阻害した。両方の場合において、センスＳ₃オリゴヌクレオチドは全く毒性がなく、ＡＳ−オリゴデオキシヌクレオチド、ＡＳ−オリゴデオキシヌクレオチドによっておよぼされた阻害効果が選択的で特異的であることが示唆された。ＣＦＵ−ＧＥＭＭ培養においては、ＡＳ−ＡＣＨＥについて反対の効果が観察され、１０μＭの最終濃度では、コロニー数の劇的な３−倍増加が誘発された。それと対照的に、ＡＳ−ＢＣＨＥは、この濃度においては効果がなかった。興味深いことに、ＡＳ−ＡＣＨＥの存在において生育したＣＦＵ−ＧＥＭＭコロニーは、サイズが小さく、対照条件下で生育した平行コロニーよりも多くの小さい細胞から成立っていた。これらのコロニーの全細胞数は、対照と比べてＡＳ−ＡＣＨＥコロニーについての細胞数の２倍の増加が明らかになった。図５は、両条件下での検討されたオリゴデオキシヌクレオチドの滴定効果を提出している。(4) 分別コロニー計数による検討オリゴデオキシヌクレオチドの特異性の決定オリゴデオキシヌクレオチドの効果の特異性は、比較分別計数によってさらに試験された。このようにして、Ｓ−ＡＣＨＥと較べて、ＡＳ−ＡＣＨＥについて観察されたコロニー計数の変化は、ＣＦＵ−ＭＥＧ条件下では、巨核球の選択的減少、両実験条件のセット下では、巨核球と赤血球の減少が伴い、すべては、最終濃度２μＭの極めて低濃度で起った。平行実験においては、ＡＳ−ＢＣＨＥは４μＭの濃度で、両セットの実験的条件下で、巨核球の産生を減少させたが、Ｓ −ＢＣＨＥはこの効果がなかった。オリゴデオキシヌクレオチド（なし）の不在下で生育した培養物は、すべて対照として役立った。図６（Ａ１，Ａ２）は、これらの細胞の分画をヒストグラムの形で提出している。赤血球造成の条件下と１２μＭの濃度では、ＡＳ−ＡＣＨはさらに、細胞培養実験において観察されたように、赤血球と巨核球の数を減少することも注目すべきである。(5) in vivoにおける骨髄細胞に対するＡＳ−ＡＣＨＥの効果これらの研究を、in vivoの状況に拡大するため、実験室で育てた野生のマウスの出生４８時間後に、ＰＢＳに溶解した５、または２５μｇ／grのＴ_sオリゴデオキシヌクレオチドを腹腔内に注射して、３週間後に骨髄を検べた。表１に、この実験の結果が提出されており、図６には、骨髄塗沫の代表的顕微鏡写真図が示されている。赤血球分画はin vivoでも明らかに減少したが、それに対して、リンパ球（幹細胞を含む）は、相当に増加した。Ｓ−ＡＣＨＥは効果がなかった。 in vivoでの数が少ないため、巨核球は計数できなかった。しかし、in vivo効果は、培養条件で測定した場合と比べて、比較的温和であると思われるが、これらの知見は、in vitroで測定したＡＳ−ＡＣＨＥの効果は事実真の効果であり、in vivo条件の下でも、このオリゴデオキシヌクレオチドの効果を反映していることを示している。骨髄塗沫のin vivo分析における“リンパ球”と定義された分画は、増殖している幹細胞を含むことに注意すべきである。しかし、in vivoのアプローチでは、分裂しつつある幹細胞の計数ができない。それと対照的に、培養実験における細胞数と分別細胞組成は、若い、明らかに分裂しつつある細胞の分画の増加を示した。このように、培養実験とin vivo実験は、処理の期間、その効果、およびその特異性についての重要な情報を提供する上で、互に相補的である。特に、ＡＳ−オリゴデオキシヌクレオチドの細胞分裂を増強する能力が重要である。(6) 未処理マウスにおける巨核球を通じてのＣｈＥｍＲＮＡレベルの増加 In situハイブリッド形成は、ｐＧＥＭ−７ＺＦ（＋）ＡＣｈＥｃＤＮＡプラスミドと、Bluescript sk（＋）ＢｕＣｈＥｃＤＮＡプラスミドから転写されたアンチセンスＣｈＥｃＲＮＡプローブとセンスＣｈＥｍＲＮＡプローブを使用して、Sabraマウスからの骨髄塗沫について行った（図１）。骨髄細胞塗沫は、リンパ球様の、および赤血球系の細胞、ならびに異なる発現段階の巨核球を誘発した。アンチセンスプローブでの有意な標識化は、巨核球についてのみ現れ、これらの細胞におけるＣＨＥ遺伝子の集中的発現が示唆された。対照、センスプローブでの標識化は、塗沫全体を通じて無視できる程度であり、ハイブリッド形成反応の特異性が示された。４個までの核をもった未熟な巨核球は、一般的に標識されないで現れた。３つの後期の分化段階におけるマウス巨核球のＣｈＥｍＲＮＡレベルを反映している銀の粒子の分布をMagiscan分類にしたがって決定された。すなわち、以下の (A) (B) (C) への分類である。（A）４−８個の核を有し、細胞の直径１４−２０μＭであり、核より小さい原形質をもつ巨核球；（B）８−１６の核と大きさが核と等しい原形質であり、直径が＞２０μｍの中間細胞；（C）１６−６４個の核と豊富な原形質を有し、細胞直径が＞２０μｍの成熟巨核球〔Courtney，Ｍ．，ら、Blood，７７：５６０−５６８（１９９１）〕図２は、低密度のＢｕＣｈＥｃＲＮＡ標識と未処理動物におけるセンスＡＣｈＥｍＲＮＡ、またはＢｕＣｈＥｍＲＮＡについての無標識と較べた高密度なＡＣｈＥｃＲＮＡの標識化を示している。in situハイブリッド形成の前に、ＲＮアーゼ処理は、この手順（示していない）におけるすべての標識を完全に破壊し、これらの反応がＲＮＡに依存している証拠を提供していることに注目すべきである。上記の亜形の各々に属する巨核球は、それらの放射標識（２０までの粒子、２０と９０の間の粒子など）にしたかって、さらにグループに分けられる。細胞あたりのＡＣｈＥｃＲＮＡの粒子の数の変動は、それらの前駆体と比較して（Mazu r，１９８７）成熟巨核球の生存期間が長いことにしたがって、巨核球の発達とともに増加することが見出された（図３）。(7) アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを注射したマウスにおけるＣＨＥｍＲＮＡレベルの変化ＣＨＥの遺伝子の発現を、選択的に妨害するために、それぞれ、ＡＣｈＥｍＲＮＡまたはＢｕＣｈＥｍＲＮＡのイニシエーターＡＵＧコドン領域に、相補的な１５量体のアンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド５μｇ／gr重量を４匹のマウスに１回、または対照のためにＰＢＳを注射した。注射の３週間後に、骨髄塗沫をこれらのマウスのすべてから調製した。各塗沫は、別々の部分に分け、各部分を２つのＣｈＥｃＲＮＡプローブの１つでハイブリッド形成を起した。エマルジョンオートラジオグラフィに６週間暴露した後、スライドを、ＣｈＥｃＲＮＡを含む細胞について、銀粒子を作り出すように発展させた。標識は、ＡＳ−ＡＣＨＥから調製した骨髄塗沫では減少し、ＡＳ −ＢｕＣＨＥ処理マウスにおいては、減少効果はさらに高かった。図４には、異なった処理をしたマウスにおける変動性ＣｈＥｍＲＮＡ標識を示す代表的な写真を掲げてある。銀粒子数（４匹のマウスのために、少くとも４０細胞／検体と処理あたり２つのプローブ）のコンピューター化イメージ分析と統計処理から、対照のＰＢＳ− 注射マウスと較べて、ＡＳ−ＣＨＥを注射したマウスの２つのＣｈＥｍＲＮＡについての異なる集積パターンが明らかとなった。対照のマウスにおいては、巨核球前駆体から成熟巨核球へと、細胞あたりのＡＣｈＥｍＲＮＡが２０倍増加したが、一方、より低いＢｕＣｈＥｍＲＮＡは、中間的、および成熟巨核球において検出できたに過ぎず、これら２つの巨核球の段階においては、変化しないままであった（図５Ａ）。銀の粒子数（４匹のマウスのために少くとも４０細胞／検体、及び処理あたり２つのプローブ）はＰＢＳを注射した対照マウスと較べて、ＡＳ−ＣＨＥ注射動物中の２つのＣｈＥｍＲＮＡについての発現パターンの異なる抑制を示した。処理の３週間後にＡＣｈＥｍＲＮＡとＢｕＣｈＥｍＲＮＡレベルは、ＡＳ−ＡＣＨＥ−処理マウスからの成熟巨核球においては、それぞれ、約６２と３０％減少した。それと対照的にＡＳ−ＢＣＨ処理は、ＡＣｈＥｍＲＮＡとＢｕＣｈＥｍＲＮＡレベルを、ともに約６６％減少させた（図４Ｂ）。統計学的分析によって、これらの値に対して、５％の有意差レベルにおいて２方向性の分散が明らかとなった〔Hoel，Ｐ．Ｇ．，Elementary Statistics，４th Ed.，John Wiley & Sones ，Inc．New York London（１９７６）〕。その上、発現の異なる段階のｍＲＮＡｓの抑制レベルは、図４Ａの曲線の平均勾配によって示されるように、異なるマウスにおけるＡＳ−オリゴデオキシヌクレオチド処理の性質に有意に依存しているように思われた。したかって、ＡＣｈＥｍＲＮＡは、ＡＳ−ＡＣＨＥが注射されたときは、ＡＳ−ＢＨＥよりもさらに有意に抑制された。そして、ＢｕＣｈＥｍＲＮＡに対するＡＳ−ＢＣＨＥの効果は、ＡＳ−ＡＣＨＥよりもＡＳ−ＢＣＨＥの注射の後の方がより著しかった。全部まとめて、これらのデータは、in vivoの効果、長期持続、及び２つのＡＳ−ＣＨＥの効果の間の相互関係を示している。(8) ＡＳ−ＣＨＥｓは、in vivoにおける巨核球の発現を調節する異なるマウスからの骨髄塗沫のそれぞれにおける巨核球の全数は、ＡＳ−ＡＣＨＥ処理マウス（Ｎ＝７８．２±１８．６）においては、対照マウス（Ｎ＝６６．５±４．４）に較べると幾分高いことが見出された。それと対照的に、ＡＳ− ＢＣＨＥ処理したマウスの塗沫あたりの巨核球の数は、異なるマウス間で（Ｎ＝５７．５±１．１）極めて限られた変動性をもって有意に低かった（Ｎ＝５７．７±１．１）。骨髄の巨核球の分別細胞計数を、さらにMagiscanイメージ分析システムを使用して行った（図６）。中間細胞は、対照マウスにおいての巨核球の全数の約８５％を占め、成熟細胞は約１０％を占め、そして、未熟、および前巨核球が残りのマイナー分画の約１０％を構成している（図６Ａ）。中間細胞数の減少と未熟と成熟巨核球の両方の分画の拡大が、ＡＳ−ＡＣＨＥ処理マウスにおいて観察されたが（図６Ｂ）、一方、ＡＳ−ＢＣＨ処理マウスは、巨核球のサブタイプの明らかに正常な組成を示していた（図１２）。このように、ＡＳ−ＡＣＨＥ処理は、巨核球造成において一般的な増強を誘発し、in vivoにおいては、巨核球造成過程のゆがみを伴った。それと対照的に、ＡＳ−ＢＣＨは、分別細胞数に影響することなく、巨核球造成を抑制し、それが巨核球の造成の早い段階を阻害するか、またはすべての段階を同様に抑制するかのいずれかであると示唆される。(9) ＡＳ−オリゴデオキシヌクレオチドによる１つのＣｈＥｍＲＮＡの一次抑制は、そのCounterpart（かたわれ）ＣｈＥｍＲＮＡ型の２次阻害につながる。ＡＳ−ＡＣＨＥ−処理と、対照、すなわちＰＢＳを注射したマウスからの骨髄のＤＮＡを、マウスアクチンプライマーでポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、直接増幅にかけた。図１３に示されているこの分析によって、処理したマウスと対照マウスには、明らかに同様なレベルの増幅アクチンｃＤＮＡ断片が明示され、ＡＳ−オリゴデオキシヌクレオチド処理は、骨髄における転写を一般的に完全に破壊しないことを示している。分析された骨髄塗沫における分別細胞計数は、さらに約４０％の赤血球細胞、２７％の顆粒球、１７％のリンパ球と幹細胞、１３−１４％の骨髄細胞、および健康な動物の特長で正常な成分である２−３％の抗酸球の明らかに正常な組成物が、ＡＳ−ＡＣＨＥ−処理対照動物について明示された。このようにして、ＡＳ−オリゴデオキシヌクレオチド処理は、この分析が行われたときには、造血性組成にとっては明らかに無害であり、ＡＳ−ＡＣＨＥによるＢｕＣｈＥｍＲＮＡの間接的な抑制、そしてしかもＡＳ− ＢＣＨＣによるＡＣｈＥｍＲＮＡのさらに効率的な抑制は、これらのＡＳ−オリゴデオキシヌクレオチド処理の各々の選択的に誘発された２次効果を反映していることが示唆された。(10) ＡＳ−オリゴデオキシヌクレオチドの原形質への蓄積はそれらの重要な役割としての転写後の調節を示唆する図１４を参照して、輝いた視野と蛍光写真を比較すると、原形質の豊富さと蛍光シグナルとの明らかな関係が浮きぼりにされる。このように、成熟巨核球は比較的多量のＦＩＴＣ−標識ＡＳ−ＣＨＥＤ（Ａ）を蓄積した。それに対して、若い巨核球は、有意に低い強度の蛍光を示した（Ｂ）。そして、多形核細胞は、さらに低い光度の蛍光を示した。若い、及び成熟した巨核球と多形核細胞は、ＦＩＴＣ−ＡＳ−ＣＨＥＤを明らかに同様な効率で取り込むことができ、この取り込みの過程を可能にする仮定上の受容体は、これら両方の細胞型の発現の初期に現れ、その生涯を通じて発現される。最も重要なことであるが、この分析によって蓄積したＦＩＴＣ−ＡＳ−ＣＨＥＤ（それはそのホスホロチオエート組成においてＳ₃であった）の核外放出が起ることが証明された。したがって、取り込まれた化合物の大半は、処理細胞の原形質に蓄積し、そこでそれは、成熟ＣＨＥＤｍＲＮＡ種とハイブリッド形成をすることができたが、ＣＨＥＤ遺伝子、そして／または、その発生期のプロセスにかけていない核ｍＲＮＡの転写物とはハイブリッド形成を行うことができなかった。その上、原形質のＦＩＴＣ蛍光も、巨核球において培養４日後にも検出することができ（Ｄ）、ＡＳ−オリゴデオキシヌクレオチドは、この亜細胞性部位に少くとも数日残っていることが示唆された。蛍光シグナルの特異性は、順次、このようなシグナルが、ＦＩＴＣ−オリゴデオキシヌクレオチドが加えられなかった培養中の若い、そして発達した巨核球、多形核細胞、およびマクロファージにこのようなシグナルが存在しないことによって証明された（Ｅ，Ｆ）。原形質のシグナルに加えて、ＦＩＴＣ−標識ＡＳ−オリゴデオキシヌクレオチドは、細胞表面より大きなシグナルを発する。その結果、細胞の直径は蛍光下での方がbright field photography（輝いた視野の写真）よりも大きく見えた（図１４のＡ−Ｄを比較のこと）。これは、全実験期間中、処理した細胞の表面にわたって存在するすべて利用可能な受容体の絶え間ない占有を意味するのであろう。

【手続補正書】特許法第１８４条の７第１項【提出日】１９９３年９月６日【補正内容】請求の範囲１．造血性骨髄細胞の発現を選択的に調節することができるホスホロチオエート化されたか、または部分的にホスホロチオエート化された合成オリゴデオキシヌクレオチド、その場合、完全にホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチドは、ヒトＡＣＨＥ（アセチルコリンエステラーゼ）遺伝子にむけられている。２．巨核球造成を阻害することができる請求項１に記載のホスホロチオエート化されたか、または部分的にホスホロチオエート化された合成オリゴデオキシヌクレオチド。３．巨核球造成を促進することかできる請求項１に記載のホスホロチオエート化されたか、または部分的にホスホロチオエート化された合成オリゴデオキシヌクレオチド。４．赤血球造成を阻害することができる請求項１に記載のホスホロチオエート化されたか、または部分的にホスホロチオエート化された合成オリゴデオキシヌクレオチド。５．赤血球造成を促進することができる請求項１に記載のホスホロチオエート化されたか、または部分的にホスホロチオエート化された合成オリゴデオキシヌクレオチド。６．血液造成骨髄細胞の発現を、巨核球と赤血球からマクロファージと単核性細胞へと脇道にそらすことができる請求項１に記載のホスホロチオエート化されたか、または部分的にホスホロチオエート化された合成オリゴデオキシヌクレオチド。７．ヒトＡＣＨＥ（アセチルコリンエステラーゼ）遺伝子におけるＡＵＧ開始コドンにわたる領域にむけられたアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドであり、ヌクレオチド塩基間を連絡しているホスホロチオエート結合を有する請求項１〜６のいずれか１つに記載の合成オリゴデオキシヌクレオチド。８．ヒトＡＣＨＥ（アセチルコリントランスフェラーゼ）遺伝子、２ＨＳ（ｃｄｃ２キナーゼ）遺伝子、またはＢＣＨＥ（ブチリルコリンエステラーゼ）遺伝子におけるＡＵＧ開始コドンにわたる領域、またはヒトＣＨＥＤ（ｃｄｃ２ホモログ）における５′−領域にむけられたアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドであり、４つの３′−末端ヌクレオチド塩基の間を連結するホスホロチオエート結合を有する請求項１から６のいずれか１つに記載の合成オリゴデオキシヌクレオチド。９．式：５′−GGTATAATCTTCCAT−３′ を有するヒト２ＨＳ遺伝子におけるイニシエーターＡＵＧコドンにわたる領域にむけられた請求項８に記載の部分的にホスホロチオエート化された合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド。 10．式：５′−CTGCGGGGGCCTCAT−３′ を有するヒトＡＣＨＥ遺伝子におけるＡＵＧ開始コドンにわたる領域にむけられた請求項７に記載のホスホロチオエート化合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド。 11．式：５′−GGTATAATCTTCCAT−３′ を有するヒト２ＨＳ遺伝子におけるＡＵＧ開始コドンにわたる領域にむけられた請求項９に記載の４個の３′−末端ヌクレオチド塩基の間を連結するホスホロチオエート化された合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド。【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年７月７日【補正内容】請求の範囲１．造血性骨髄細胞の発現を選択的に調節することができる部分的にホスホロチオエート化された合成オリゴデオキシヌクレオチド、すなわち、ヒトＡＣＨＥ（アセチルコリントランスフェラーゼ）遺伝子、２ＨＳ（ｃｄｃ２キナーゼ）遺伝子、またはＢＣＨＥ（ブチルコリンエステラーゼ）遺伝子におけるＡＵＧ開始コドンにわたる領域、およびヒトＣＨＥＤ（ｃｄｃ２ホモログ）遺伝子の５′− 領域にもむけられた４個の３′末端ヌクレオチドの間を連結するホスホロチオエート結合を有するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド。２．巨核球の造成を阻害することができる請求項１に記載の部分的にホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチド。３．巨核球の造成を促進することができる請求項１に記載の部分的にホスホロチオエート化された合成オリゴデオキシヌクレオチド。４．赤血球造成を阻害することかできる請求項１に記載の部分的にホスホロチオエート化された合成オリゴデオキシヌクレオチド。５．赤血球造成を促進することができる請求項１に記載の部分的ホスホロチオエート化された合成オリゴデオキシヌクレオチド。６．造血性骨髄細胞の発現を巨核球と赤血球からマクロファージと単核細胞へと脇道にそらせることができる請求項１に記載の部分的にホスホロチオエート化された合成オリゴデオキシヌクレオチド。７．式：５′−GGTATAATCTTCCAT−３′ を有するヒト２ＨＳ遺伝子におけるイニシエーターＡＵＧコドンにわたる領域にむけられた４個の３′−末端ヌクレオチド塩基の間を連結するホスホロチオエート結合を有する部分的にホスホロチオエート化された請求項１に記載の合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド。８．式：５′−CTGCGGGGGCCTCAT−３′ を有するヒトＡＣＨＥ遺伝子におけるイニシエーターＡＵＧコドンにわたる領域にむけられた４個の３′−末端ヌクレオチド塩基の間を連結するホスホロチオエート結合を有する請求項１に記載の部分的にホスホロチオエート化された合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド。９．式：５′−GACTTTGCTATGCAT−３′ を有するヒトＢＣＨＥ遺伝子におけるイニシエーターＡＵＧコドンにわたる４個の３′−末端ヌクレオチド塩基の間を連結するホスホロチオエート結合を有する請求項１に記載の部分的にホスホロチオエート化された合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド。 10．式：５′−TTTTCCCCAGTCAAT−３′ を有するヒトＣＨＥＤ遺伝子における５′−領域にむけられた請求項１に記載の部分的にホスホロチオエート化された合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド。 11．異常な造血性細胞の増殖を阻害することができる請求項７に記載の部分的ホスホロチオエート化された合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド。 12．異常な血小板増殖を阻害することができる請求項１０に記載の部分的にホスホロチオエート化された合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド。 13．骨髄細胞の検体において、幹細胞分画をin vitroで増加させることができる請求項８、または請求項９に記載の部分的にホスホロチオエート化された合成オリゴデオキシヌクレオチド。 14．同種移植されるべき器官の免疫応答を、in vitroで減少することができる請求項８、または９に記載の部分的にホスホロチオエート化された合成オリゴデオキシヌクレオチド。 15．同種移植されるべき器官の免疫応答をin vivoで抑制することができる請求項８、または９に記載の部分的にホスホロチオエート化された合成オリゴデオキシヌクレオチド。 16．同種移植された器官の受容者の免疫応答をin vivoで抑制することが出来る部分的にホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチド。 17．in vivoでマクロファージの産生を増強し、幹細胞を増加させることができる請求項８、または９に記載の部分的にホスホロチオエート化された合成オリゴデオキシヌクレオチド。 18．悪性腫瘍、特に軟骨肉腫の成長を阻止することができる請求項１に記載の部分的にホスホロチオエート化された合成オリゴデオキシヌクレオチド。 19．請求項１に記載の部分的にホスホロチオエート化された少くとも１個の合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを生理学的に容認できる担体、または希釈剤中に含む医薬的、または医学的組成物。 20．該活性成分が、請求項１に記載の部分的にホスホロチオエート化されたアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドである請求項１９に記載の組成物。 21．該活性成分が、式：５′−GGTATAATCTTCCAT−３′ を有するヒト２ＨＳ遺伝子におけるイニシエーターＡＵＧコドンにわたる領域にむけられた４個の３′−末端ヌクレオチド塩基の間を連結するホスホロチオエート結合を有する請求項１に記載の部分的にホスホロチオエート化された合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドである請求項２０に記載の組成物。 22．該活性成分が、式：５′−CTGCGGGGGCCTCAT−３′ を有するヒトＡＣＨＥ遺伝子におけるイニシエーターＡＵＧコドンにわたる領域にむけられ、４個の３′−末端ヌクレオチド塩基間を連結するホスホロチオエート結合を有する請求項１に記載の部分的にホスホロチオエート化された合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドである請求項２０に記載の組成物。 23．該活性成分が、式：５′−GACTTTGCTATGCAT−３′ を有するヒトＢＣＨＥ遺伝子におけるイニシエーターＡＵＧコドンにわたる領域にむけられ、４個の３′−末端ヌクレオチド塩基の間を連結するホスホロチオエート結合を有する請求項１に記載の部分的にホスホロチオエート化された合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドである請求項２０に記載の組成物。 24．該活性成分が、式：５′−TTTTCCCCAGTCAAT−３′ を有するヒトＣＨＥＤ遺伝子における５′−領域にむけられ４個の３′−末端ヌクレオチド塩基の間を連結するホスホロチオエート結合を有する請求項１に記載の部分的にホスホロチオエート化された合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドである請求項２０に記載の組成物。 25．該活性成分が、請求項７に記載の部分的にホスホロチオエート化された合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドである異常な造血性細胞増殖を阻害するための請求項２０に記載の組成物。 26．異常な血小板増殖を阻害するための請求項２５に記載の組成物。 27．該活性成分が、請求項８、または９に記載の部分的にホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチドか、または少くとも２つの該オリゴデオキシヌクレオチドの混合物である骨髄細胞の検体中の幹細胞分画をin vitroで増加させるための請求項２０に記載の組成物。 28．該活性成分が、請求項８、または９に記載の部分的にホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチドか、または少くとも２つの該オリゴデオキシヌクレオチドの混合物である移植されるべき器官の免疫応答をin vitroで減少させるための請求項２０に記載の組成物。 29．該活性成分が、請求項８、または９に記載の部分的にホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチドであるか、少くとも２つの該オリゴデオキシヌクレオチドの混合物である移植されるべき器官の免疫応答を抑制するための請求項２０に記載の組成物。 30．該活性成分か、請求項８か、または９に記載の部分的にホスホロチオエー卜化されたオリゴデオキシヌクレオチドであるか、少くとも２つの該オリゴデオキシヌクレオチドの混合物である同種移植された器官についての受容者の免疫応答を抑制するための請求項２０に記載の組成物。 31．該活性成分が、請求項８、または９に記載の部分的にホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチドであるか、少くとも２つ以上の該オリゴデオキシヌクレオチドの混合物である、マクロファージの産生を増強し、幹細胞数を増加させるための請求項２０に記載の組成物。 32．該活性成分が、請求項１、または７に記載の部分的にホスホロチオエート化された合成オリゴデオキシヌクレオチドであるか、請求項１、または７に記載のオリゴデオキシヌクレオチドの少くとも２つ以上の混合物である悪性腫瘍の成長を阻止するための請求項２０に記載の組成物。 33．該悪性腫瘍が、軟骨肉腫である請求項３２に記載の組成物。 34．このような治療が必要なとき、患者に請求項１に記載のオリゴデオキシヌクレオチドか、またはこのようなオリゴデオキシヌクレオチドの少くとも２つの混合物、または請求項２０に記載の組成物の治療効果のある量を投与することからなる、このような治療が必要な患者における造血性骨髄の幹細胞の発現を調節する方法。 35．異常な造血性細胞増殖を阻害するための請求項３４に記載の方法。 36．マクロファージの産生を増強し、幹細胞数を増加させるための請求項３５に記載の方法。 37．移植操作の後に、免疫応答とその結果生ずる組織の拒否反応を減少するために、その器官を請求項１に記載のオリゴデオキシヌクレオチド、またはこのようなオリゴデオキシヌクレオチドの混合物、または請求項２０に記載の組成物に同種移植に適切で適当な培養条件下で接触させることによって移植されるべき器官、または組織における細胞分裂の特性をin vitroで調節する方法。 38．抜き取った骨髄の検体を、請求項１に記載のオリゴデオキシヌクレオチド、またはこのようなオリゴデオキシヌクレオチドの混合物、または請求項２０に記載の組成物の効果的な量を適当な培養条件下で接触させることによって、移植されることになっている骨髄細胞の検体中の幹細胞の分画を、in vitroで増加させる方法。 39．検体を、請求項１に記載のオリゴデオキシヌクレオチド、またはこのようなオリゴデオキシヌクレオチドの混合物、または請求項２０に記載の組成物の効果的な量と適当な培養条件で接触させることによって、胚または胎児の骨髄細胞を組織適合抗原がない生存状態において、細胞バンクに貯蔵する前に処理する方法。 40．同種移植の操作手順における免疫応答を減少させるために、該ドナー／受容者に、請求項１に記載のオリゴデオキシヌクレオチド、または少くとも２つのこのようなオリゴデオキシヌクレオチドの混合物、または請求項２０に記載の組成物の効果的な量を投与することによって、器官ドナー／受容者を治療する方法。 41．このような治療が必要な患者に、請求項１に記載のオリゴデオキシヌクレオチド、またはこのようなオリゴデオキシヌクレオチドの少くとも２つからなる混合物、または請求項２０に記載の組成物の治療に効果的な量を投与することによって、悪性腫瘍の患者を治療する方法。本治療は、腫瘍組織の細胞分裂を阻止し、腫瘍を取り囲む良性細胞には効果を示さない。 42．軟骨肉腫の治療のための請求項４１に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ソレク，ヘルモナイスラエル国 75 238 リションレジオン，タタボルストリート 10 (72)発明者ザクト，ハイムイスラエル国 56 548 サブヨン，ハシャルバストリート 22 (72)発明者エクスタイン，フリッツドイツ連邦共和国ディー ― 3400 ゲッチンゲン，ホルンデルシュテク６【要約の続き】のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドと、それらを含む医薬組成物は、異常な造血性細胞増殖を阻害し、異常な血小板の増殖を阻害し、骨髄細胞培養における幹細胞分画を増加させ、マクロファージの産生を増強し、幹細胞数を増加し、移植されるべき器官の免疫応答を抑制し、そして、悪性腫瘍の成長を阻止するのに適している。

Claims

【特許請求の範囲】１．造血性骨髄細胞の発現を選択的に調節することができるホスホロチオエート化されたか、または部分的にホスホロチオエート化された合成オリゴデオキシヌクレオチド。２．巨核球造成を阻害することができる請求項１に記載のホスホロチオエート化されたか、または部分的にホスホロチオエート化された合成オリゴデオキシヌクレオチド。３．巨核球造成を促進することができる請求項１に記載のホスホロチオエート化されたか、または部分的にホスホロチオエート化された合成オリゴデオキシヌクレオチド。４．赤血球造成を阻害することができる請求項１に記載のホスホロチオエート化されたか、または部分的にホスホロチオエート化された合成オリゴデオキシヌクレオチド。５．赤血球造成を促進することができる請求項１に記載のホスホロチオエート化されたか、または部分的にホスホロチオエート化された合成オリゴデオキシヌクレオチド。６．血液造成骨髄細胞の発現を、巨核球と赤血球からマクロファージと単核性細胞へと脇道にそらすことができる請求項１に記載のホスホロチオエート化されたか、または部分的にホスホロチオエート化された合成オリゴデオキシヌクレオチド。７．ヒトＡＣＨＥ（アセチルコリンエステラーゼ）、または２ＨＳ（ｃｄｃ２キナーゼ）遺伝子におけるＡＵＧ開始コドンにわたる領域にむけられたアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドであり、ヌクレオチド塩基間を連絡しているホスホロチオエート結合を有する請求項１〜６のいずれか１つに記載の合成オリゴデオキシヌクレオチド。８．ヒトＡＣＨＥ（アセチルコリントランスフェラーゼ）遺伝子、２ＨＳ（ｃｄｃ２キナーゼ）遺伝子、またはＢＣＨＥ（ブチリルコリンエステラーゼ）遺伝子におけるＡＵＧ開始コドンにわたる領域、またはヒトＣＨＥＤ（ｃｄｃ２ホモログ）における５′−領域にむけられたアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドであり、４つの３′−末端ヌクレオチド塩基の間を連結するホスホロチオエート結合を有する請求項１から６のいずれか１つに記載の合成オリゴデオキシヌクレオチド。９．式：５′−GGTATAATCTTCCAT−３′ を有するヒト２ＨＳ遺伝子におけるイニシエーターＡＵＧコドンにわたる領域にむけられた請求項７に記載のホスホロチオエート化された合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド。 10．式：５′−CTGCGGGGGCCTCAT−３′ を有するヒトＡＣＨＥ遺伝子におけるＡＵＧ開始コドンにわたる領域にむけられた請求項７に記載のホスホロチオエート化合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド。 11．式：５′−GGTATAATCTTCCAT−３′ を有するヒト２ＨＳ遺伝子におけるＡＵＧ開始コドンにわたる領域にむけられた請求項８に記載の４個の３′−末端ヌクレオチド塩基の間を連結するホスホロチオエート化された合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド。 12．式：５′−CTGCGGGGGCCTCAT−３′ を有するヒトＡＣＨＥ遺伝子におけるＡＵＧ開始コドンにわたる領域にむけられた請求項８に記載の４個の３′−末端ヌクレオチド塩基の間を連結するホスホロチオエート結合を有する、部分的にホスホロチオエート化された合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド。 13．式：５′−GACTTTGCTATGCAT−３′ を有するヒトＢＣＨＥ遺伝子におけるイニシエーターＡＵＧコドンにわたる領域にむけられた４個の３′−末端ヌクレオチド塩基の間を連結するホスホロチオエート結合を有する請求項８に記載の部分的にホスホロチオエート化された合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド。 14．式：５′−TTTTCCCCAGTCAAT−３′ を有するヒトＣＨＥＤ遺伝子における５′−領域にむけられた４個の３′−末端ヌクレオチド間を連結するホスホロチオエート結合を有する請求項８に記載の部分的にホスホロチオエート化された合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド。 15．異常な造血性細胞増殖を阻害することができるそれぞれ請求項９か１１に記載のホスホロチオエート化された合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド。 16．異常な血小板増殖を阻害することができる請求項１４に記載の部分的にホスホロチオエート化された合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド。 17．骨髄細胞の検体において、in vitroで幹細胞の分画を増加することができる請求項１０に記載の合成ホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチドか、請求項１２、または１３に記載の部分的にホスホロチオエート化された合成オリゴデオキシヌクレオチド。 18．同種移植予定の器官の免疫応答を、in vitroで減少させることができる請求項１０に記載のホスホロチオエート化された合成オリゴデオキシヌクレオチドか、請求項１２、または１３に記載の部分的にホスホロチオエート化された合成オリゴデオキシヌクレオチド。 19．同種移植予定の器官の免疫応答をin vivoで抑制することができる請求項１０記載のホスホロチオエート化された合成オリゴデオキシヌクレオチドか、または請求項１２、または１３に記載の部分的にホスホロチオエート化された合成オリゴデオキシヌクレオチド。 20．同種移植器官の受容者の免疫応答をin vivoで抑制することができる請求項１０に記載のホスホロチオエート化された合成オリゴデオキシヌクレオチドか、または請求項１２か１３に記載の部分的にホスホロチオエート化された合成オリゴデオキシヌクレオチド。 21．in vivoでマクロファージの産生を増強し、幹細胞の数を増加させることができる請求項１０に記載のホスホロチオエート化された合成オリゴデオキシヌクレオチド、または請求項１２、または１３に記載の部分的にホスホロチオエート化された合成オリゴデオキシヌクレオチド。 22．悪性腫瘍、とりわけ軟骨肉腫の成長を阻止することができる請求項１に記載の合成ホスホロチオエート化された、または部分的にホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチド。 23．請求項１に記載のホスホロチオエート化された、または部分的にホスホロチオエート化された少くとも１つの合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを生理学的に容認できる担体、または希釈剤中に活性成分として含む医薬的、または医学的組成物。 24．該活性成分が請求項７に記載のホスホロチオエート化されたアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドである請求項２３に記載の組成物。 25．該活性成分が、式：５′−GGTATAATCTTCCAT−３′ を有するヒト２ＨＳ遺伝子におけるＡＵＧコドンにわたる領域にむけられた請求項７に記載のホスホロチオエート化された合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドである請求項２４に記載の組成物。 26．該活性成分が、式：５′−CTGCGGGGGCCTCAT−３′ を有するヒトＡＣＨＥ遺伝子におけるＡＵＧ開始コドンにわたる領域にむけられた請求項７に記載のホスホロチオエート化された合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドである請求項２４に記載の組成物。 27．該活性成分が、請求項８に記載の部分的にホスホロチオエート化されたアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドである請求項２４に記載の組成物。 28．該活性成分が、式：５′−GGTATAATCTTCCAT−３′ を有するヒト２ＨＳ遺伝子におけるイニシエーターＡＵＧコドンにわたる領域にむけられた４個の３′−末端ヌクレオチド塩基間を連結するホスホロチオエート基を有する請求項８に記載の部分的にホスホロチオエート化された合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドである請求項２７に記載の組成物。 29．該活性成分が、式：５′−CTGCGGGGGCCTCAT−３′ を有するヒトＡＣＨＥ遺伝子におけるイニシエーターＡＵＧコドンにわたる領域にむけられた４個の３′−末端ヌクレオチド塩基の間を連結するホスホロチオエート結合を有する請求項８に記載の部分的にホスホロチオエート化された合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドである請求項２７に記載の組成物。 30．該活性成分が、式：５′−GACTTTGCTATGCAT−３′ を有するヒトＢＣＨＥ遺伝子におけるイニシエーターＡＵＧコドンにわたる領域にむけられた４個の３′−末端のヌクレオチド塩基の間を連結するホスホロチオエート結合を有する請求項８に記載の部分的にホスホロチオエート化された合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドである請求項２７に記載の組成物。 31．該活性成分が、式：５′−TTTTCCCCAGTCAAT−３′ を有するヒトＣＨＥＤ遺伝子の５′−領域にむけられた４個の３′−末端ヌクレオチド塩基の間を連結するホスホロチオエート結合を有する請求項８に記載の部分的にホスホロチオエート化された合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドである請求項２７に記載の組成物。 32．該活性成分が、それぞれ請求項９、または１１に記載のホスホロチオエート化されたか、または部分的にホスホロチオエート化された合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドであるか、または少くとも２つの該オリゴデオキシヌクレオチドの混合物である請求項２３に記載の異常な造血性細胞増殖を阻害するための組成物。 33．異常な血小板の増殖を阻害するための請求項３２に記載の組成物。 34．該活性成分が、請求項１０に記載のホスホロチオエート化された合成オリゴデオキシヌクレオチドであるか、請求項１２、または１３に記載の部分的にホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチド、または該オリゴデオキシヌクレオチドの少くとも２つの混合物である骨髄細胞における幹細胞分画をin vitro で増加させる請求項２３に記載の組成物。 35．該活性化合物が、請求項１０に記載のホスホロエート化された合成オリゴデオキシヌクレオチドであるか、請求項１２、または１３に記載の部分的にホスホロチオエート化された合成オリゴデオキシヌクレオチドであるか、該オリゴデオキシヌクレオチドの少くとも２つの混合物である移植予定の器官についての免疫応答をin vitroで減少させるための請求項２３に記載の組成物。 36．該活性成分が、請求項１０に記載のホスホロチオエート化された合成オリゴデオキシヌクレオチドであるか、請求項１２、または１３に記載の部分的にホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチドであるか、少くとも２つの該オリゴデオキシヌクレオチドの混合物である移植予定の器官についての免疫応答を抑制するための請求項２３に記載の組成物。 37．該活性成分が、請求項１０に記載のホスホロチオエート化された合成オリゴデオキシヌクレオチドか、または請求項１２、または１３に記載の部分的にホスホロチオエート化された合成オリゴデオキシヌクレオチドであるか、少くとも２つの該オリゴデオキシヌクレオチドの混合物である同種移植器官についての受容者の免疫応答を抑制するための請求項２３に記載の組成物。 38．該活性成分が、請求項１０に記載のホスホロチオエート化された合成オリゴデオキシヌクレオチドであるか、請求項１２、または１３に記載の部分的にホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチドであるか、少くとも２つの該オリゴデオキシヌクレオチドの混合物であるマクロファージ産生を増強し、そして、幹細胞数を増加させる請求項２３に記載の組成物。 39．該活性成分が、請求項１から９に記載のホスホロチオエート化されたか、部分的にホスホロチオエート化された合成オリゴデオキシヌクレオチドであるか、請求項１から９に記載の少くとも２つのオリゴデオキシヌクレオチドの混合物である悪性腫瘍の成長を阻止するための請求項２３に記載の組成物。 40．該悪性腫瘍が、軟骨肉腫である請求項３９に記載の組成物。 41．請求項１に記載のオリゴデオキシヌクレオチド、または、少くとも２つのこのようなオリゴデオキシヌクレオチドからなる混合物、または、請求項２３に記載の組成物の治療的効果のある量をこのような処置が必要な患者に投与することからなる、このような処置が必要な患者において造血性骨髄幹細胞を調節する方法。 42．異常な造血性細胞を阻害するための請求項４１に記載の方法。 43．マクロファージの産生を増強し、幹細胞数を増加させるための請求項４１に記載の方法。 44．移植操作の後に、免疫応答とその結果生ずる組織の拒否反応を減少するために、その器官を請求項１に記載のオリゴデオキシヌクレオチド、またはこのようなヌクレオチドの混合物、または請求項２３に記載の組成物の効果的な量を、同種移植の手順に適した培養条件下で接触させることによって、移植させるべき器官と組織における細胞分裂の特性をin vitroで調節する方法。 45．抜き取った骨髄の検体を請求項１に記載のオリゴデオキシヌクレオチド、またはこのようなヌクレオチドの混合物、または請求項２３に記載の組成物の効果的な量を適当な培養条件下で接触させることによって、移植されることになっている骨髄細胞の検体中の幹細胞の分画をin vitroで増加させる方法。 46．検体を、請求項１に記載のオリゴデオキシヌクレオチド、またはこのようなオリゴデオキシヌクレオチドの混合物、または請求項２３に記載の組成物の効果的な量と適当な培養条件で接触させることによって、胚または胎児の骨髄細胞を組織適合抗原がない生存状態において、細胞バンクに貯蔵する前に処理する方法。 47．同種移植の操作手順における免疫応答を減少させるために、該ドナー／受容者に請求項１に記載のオリゴデオキシヌクレオチド、または少くとも２つのこのようなオリゴデオキシヌクレオチドの混合物、または請求項２３に記載の組成物の効果的な量を投与することによって、器官ドナー／受容者を治療する方法。 48．このような治療が必要な患者に、請求項１に記載のオリゴデオキシヌクレオチド、またはこのようなオリゴデオキシヌクレオチドの少くとも２つからなる混合物、または請求項２３に記載の組成物の治療に効果的な量を投与することによって悪性腫瘍の患者を治療する方法。本治療は、腫瘍組織の細胞分裂を阻止し、腫瘍を取り囲む良性細胞には効果を示さない。 49．軟骨肉腫の治療のための請求項４８に記載の方法。