ES2677044T3 - Tratamiento de enfermedades relacionadas con el sustrato 2 del receptor de insulina (IRS2) mediante inhibición de transcrito antisentido natural para el IRS2 y factor de transcripción E3 (TFE3) - Google Patents

Abstract

Un oligonucleótido que se dirige a un transcrito antisentido natural del Sustrato 2 del Receptor de Insulina (IRS2) para uso como un compuesto terapéutico, donde el oligonucleótido modula la expresión del Sustrato 2 del Receptor de Insulina (IRS2), y donde el transcrito antisentido natural tiene la secuencia de ácido nucleico tal como se expone en la SEQ ID NO: 3, o una variante de la misma que retiene la función del transcrito antisentido natural de la SEQ ID NO: 3.

Description

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DESCRIPCION

Tratamiento de enfermedades relacionadas con el sustrato 2 del receptor de insulina (IRS2) mediante inhibicion de transcrito antisentido natural para el IRS2 y factor de transcripcion E3 (TFE3)

CAMPO DE LA DIVULGAClON

La presente solicitud reivindica la prioridad de la solicitud de patente provisional de Estados Unidos N.° 61/291419, presentada el 31 de diciembre de 2009.

Los aspectos de la divulgacion comprenden oligonucleotidos que modulan la expresion y/o la funcion del IRS2 y moleculas asociadas.

ANTECEDENTES

La hibridacion ADN-ARN y ARN-ARN es importante para muchos aspectos de la funcion del acido nucleico incluyendo replicacion, transcripcion y traduccion del ADN. La hibridacion tambien es fundamental para una variedad de tecnologfas que o bien detectan un acido nucleico particular o alteran su expresion. Los nucleotidos antisentido, por ejemplo, alteran la expresion genica hibridandose con ARN diana, interfiriendo asf con el splicing, la transcripcion, la traduccion y la replicacion de ARN. El ADN antisentido tiene la caracterfstica anadida de que los hfbridos de ADN-ARN sirven de sustrato para la digestion por ribonucleasa H, una actividad que esta presente en la mayorfa de los tipos celulares. Las moleculas antisentido pueden suministrarse al interior de celulas, como es el caso para oligodesoxinucleotidos (ODN), o pueden expresarse a partir de genes endogenos como moleculas de ARN. La FDA recientemente aprobo un farmaco antisentido, VITRAVENE™ (para el tratamiento de retinitis por citomegalovirus), que refleja que el antisentido tiene utilidad terapeutica. Nakagawa et al. (Nat. Med. (2006), 12(1):107-113) describen que el TFE3 transcripcionalmente activa el IRS2 hepatico, participa en la senalizacion de la insulina y mejora la diabetes. La publicacion internacional WO 2004/060316 describe los moduladores de IRS. La publicacion internacional WO 02/064840 describe procedimientos para identificar compuestos que inhiben o reducen la expresion de PTP1B.

RESUMEN

La invencion se define por las reivindicaciones. Aquellos aspectos/casos de la presente divulgacion que constituyen la invencion se definen por las reivindicaciones.

Este resumen se proporciona para presentar un resumen de la divulgacion con el proposito de indicar brevemente la naturaleza y sustancia de la divulgacion. Se presenta en el entendimiento de que no se utilizara para interpretar ni limitar el alcance o significado de las reivindicaciones.

En un aspecto, la divulgacion proporciona procedimientos de inhibicion de la accion de un transcrito antisentido natural usando uno o mas oligonucleotidos antisentido dirigidos a cualquier region del transcrito antisentido natural produciendo la regulacion positiva del gen sentido correspondiente. Tambien esta contemplado en el presente documento que la inhibicion del transcrito antisentido natural pueda conseguirse mediante siRNA, ribozimas y moleculas pequenas, que se considera que estan dentro del alcance de la presente divulgacion.

Un aspecto proporciona un procedimiento de modulacion de la funcion y/o expresion de un polinucleotido del IRS2 en celulas o tejidos del paciente in vivo o in vitro que comprende poner en contacto dichas celulas o tejidos con un oligonucleotido antisentido de 5 a 30 nucleotidos de longitud, donde dicho oligonucleotido tiene al menos un 50 % de identidad de secuencia con un complemento inverso de un polinucleotido que comprende de 5 a 30 nucleotidos consecutivos dentro de los nucleotidos 1 a 497 de la SEQ ID NO: 2 o los nucleotidos 1 a 633 de la SEQ ID NO: 3 modulando de este modo la funcion y/o la expresion del polinucleotido del IRS2 en celulas o tejidos del paciente in vivo o in vitro.

En un aspecto, un oligonucleotido se dirige a una secuencia antisentido natural de polinucleotidos del IRS2 o TFE3, por ejemplo, los nucleotidos expuestos en las SEQ ID NO: 2 y 3, y cualquier variante, alelo, homologo, mutante, derivado, fragmento y secuencia complementaria correspondiente. Se exponen ejemplos de oligonucleotidos antisentido como las SEQ ID NO: 4 a 9.

Otro aspecto: proporciona un procedimiento de modulacion de la funcion y/o expresion de un polinucleotido del IRS2

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en celulas o tejidos del paciente in vivo o in vitro, que comprende poner en contacto dichas celulas o tejidos con un oligonucleotido antisentido de 5 a 30 nucleotidos de longitud, donde dicho oligonucleotido tiene al menos un 50 % de identidad de secuencia con un complemento inverso del antisentido del polinucleotido del IRS2 o TFE3; modulando de este modo la funcion y/o expresion del polinucleotido del IRS2 en celulas o tejidos del paciente in vivo o in vitro.

Otro aspecto proporciona un procedimiento de modulacion de la funcion y/o expresion de un polinucleotido del IRS2 en celulas o tejidos del paciente in vivo o in vitro, que comprende poner en contacto dichas celulas o tejidos con un oligonucleotido antisentido de 5 a 30 nucleotidos de longitud donde dicho oligonucleotido tiene al menos un 50 % de identidad de secuencia con un oligonucleotido antisentido para un polinucleotido antisentido del IRS2 o TFE3; modulando de este modo la funcion y/o expresion del polinucleotido del IRS2 en celulas o tejidos del paciente in vivo o in vitro.

En un aspecto, una composicion comprende uno o mas oligonucleotidos antisentido que se unen a polinucleotidos del IRS2 o TFE3 sentido y/o antisentido.

En un aspecto, los oligonucleotidos comprenden uno o mas nucleotidos modificados o sustituidos.

En un aspecto, los oligonucleotidos comprenden uno o mas enlaces modificados.

En otro aspecto mas, los nucleotidos modificados comprenden bases modificadas que comprenden fosforotioato, metilfosfonato, acidos nucleicos peptfdicos, 2'-O-metilo, fluoro- o carbono, metileno u otras moleculas de acido nucleico bloqueado (LNA). Preferentemente, los nucleotidos modificados son moleculas de acido nucleico bloqueado, que incluyen a-L-LNA.

En un aspecto preferido, los oligonucleotidos se administran a un paciente por via subcutanea, por via intramuscular, por via intravenosa o por via intraperitoneal.

En un aspecto, los oligonucleotidos se administran en una composicion farmaceutica. Un regimen de tratamiento comprende administrar los compuestos antisentido al menos una vez al paciente; sin embargo, este tratamiento puede modificarse para comprender multiples dosis durante un periodo de tiempo. El tratamiento puede combinarse con uno o varios de otros tipos de terapias.

En un aspecto, los oligonucleotidos estan encapsulados en un liposoma o unidos a una molecula portadora (por ejemplo, colesterol, peptido TAT).

Otros aspectos se describen mas adelante.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

La figura 1 es un grafico de resultados de PCR en tiempo real que muestra el cambio en veces + la desviacion estandar en ARNm del IRS2 despues del tratamiento de celulas HepG2 y 518A2 con oligonucleotidos de fosforotioato introducidos usando Lipofectamine 2000, en comparacion con el control. Las barras indicadas como 518A2 CUR-0603, 518A2 CUR-0605 se corresponden con muestras de celulas 518A2 tratadas con las SEQ ID NO 4 y 5 respectivamente. Las barras indicadas como HepG2 CUR-0603, HepG2 CUR-0605 se corresponden con muestras de celulas HepG2 tratadas con las SEQ ID NO 4 y 5 respectivamente.

La figura 2 es un grafico de resultados de PCR en tiempo real que muestra el cambio en veces + la desviacion estandar en ARNm del IRS2 despues del tratamiento de celulas Vero76 con oligonucleotidos de fosforotioato introducidos usando Lipofectamine 2000, en comparacion con el control. Las barras indicadas como CUR-0690, CUR-O691, y CUR-0692 corresponden a las SEQ ID NO 6, 7, y 8.

La figura 3 es un grafico de resultados de PCR en tiempo real que muestra el cambio en veces + la desviacion estandar en ARNm del IRS2 despues del tratamiento de celulas MCF7 con oligonucleotidos de fosforotioato introducidos usando Lipofectamine 2000, en comparacion con el control. Las barras indicadas como CUR-0690, CUR-0691, CUR-0692 y CUR-0693 corresponden a las SEQ ID NO 6, 7, 8 y 9.

La figura 4 es un grafico de resultados de PCR en tiempo real que muestra el cambio en veces + la desviacion estandar en ARNm del TFE3 despues del tratamiento de celulas HepG2 con oligonucleotidos de fosforotioato introducidos usando Lipofectamine 2000, en comparacion con el control. Las barras indicadas como CUR-0603 y CUR-0605 corresponden a las SEQ ID NO 4 y 5 respectivamente.

Descripcion del listado de secuencias - SEQ ID NO: 1: Sustrato 2 del receptor de insulina en homo sapiens (IRS2), ARNm (N.° de acceso de NCBI: NM_003749); SEQ ID NO: 2: Secuencia antisentido del TFE3 natural Hs.708291;

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SEQ ID NO: 3: Secuencia antisentido del IRS2 natural Hs. 664616; SEQ ID NO: 4 a 9: Oligonucleotidos antisentido; SEQ ID NO: 10 y 11: Secuencia de complemento inverso del oligonucleotido antisentido de las SEQ ID NO: 4 y 5 respectivamente. * indica enlace de fosfotioato y «r» indica ARN.

DESCRIPCION DETALLADA

A continuacion, se describen varios aspectos de la divulgacion con referencia a aplicaciones de ejemplos para ilustracion. Debe entenderse que los numerosos detalles, relaciones y procedimientos especfficos se exponen para proporcionar un entendimiento completo de la divulgacion. Un experto en la tecnica pertinente, sin embargo, reconocera facilmente que la divulgacion puede ponerse en practica sin uno o mas de los detalles especfficos o con otros procedimientos. La presente divulgacion no esta limitada por el orden de acciones o acontecimientos, ya que algunas acciones pueden producirse en diferentes ordenes y/o simultaneamente con otras acciones o acontecimientos. Ademas, no todos los actos o acontecimientos ilustrados son requeridos para implementar una metodologfa de acuerdo con la presente divulgacion.

Todos los genes, nombres de genes, y productos genicos divulgados en el presente documento pretenden corresponderse a homologos de cualquier especie para la cual las composiciones y procedimientos divulgados en el presente documento son aplicables. De este modo, los terminos incluyen, aunque sin limitarse a, genes y productos genicos de seres humanos y ratones. Se entiende que, cuando se divulga un gen o producto genico de una especie particular, esta divulgacion pretende ser ejemplar solamente, y no se interpreta como una limitacion, a menos que el contexto en el que aparece lo indique claramente. En consecuencia, por ejemplo, los genes divulgados en el presente documento, que en algunos aspectos se refieren a secuencias de aminoacidos y de acidos nucleicos de mamffero pretenden englobar genes homologos y/u ortologos y productos genicos de otros animales que incluyen, sin caracter restrictivo, otros mamfferos, peces, anfibios, reptiles y aves. En un aspecto, los genes o secuencias de acidos nucleicos son humanos.

Definiciones

La terminologfa usada en el presente documento es con el fin de describir aspectos particulares solamente y no pretende ser limitante de la divulgacion. Tal como se utilizan en este documento, se pretende que las formas en singular «un», «una», «el» y «la» incluyan tambien las formas plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Ademas, siempre que las expresiones «que incluye», «incluyen», «que tiene», «tiene», «con», o variantes de los mismos se usen en la descripcion detallada y/o las reivindicaciones, dichas expresiones pretenden ser inclusivas de una manera similar a la expresion «que comprende».

El termino «alrededor de» o «aproximadamente» significa dentro de un intervalo de error aceptable para el valor particular como se ha determinado por un experto habitual en la tecnica, que dependera en parte de como se mide o determina el valor, es decir, las limitaciones del sistema de medicion. Por ejemplo, «alrededor de» puede significar 1 o mas de 1 de desviacion estandar, conforme a la practica de la tecnica. Como alternativa, «aproximadamente» puede significar un intervalo de hasta el 20 %, preferentemente hasta el 10 %, mas preferentemente hasta el 5 %, y mas preferentemente todavfa hasta el 1 % de un valor dado. De manera alternativa, en particular con respecto a los sistemas o procesos biologicos, el termino puede significar un orden de magnitud de un valor preferentemente comprendido en 5 veces y mas preferentemente comprendido en 2 veces. En los casos en los que se describen valores particulares en la solicitud y las reivindicaciones, a menos que se exprese lo contrario, el termino «alrededor de» significa que se debe asumir que el valor se encuentra comprendido en un intervalo de error aceptable para el valor particular.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “ARNm” significa el/los transcrito/transcritos de ARNm actualmente conocidos de un gen elegido como diana, y cualquier transcrito adicional que pueda ser dilucidado.

Por «oligonucleotidos antisentido» o «compuesto antisentido» se hace referencia a una molecula de ARN o de ADN que se une a otro ARN o ADN (ARN, ADN diana). Por ejemplo, si este es un oligonucleotido de ARN, se une a otra diana de ARN por medio de interacciones ARN-ARN y altera la actividad del ADN diana. Un oligonucleotido antisentido puede regular positivamente o regular negativamente la expresion y/o funcion de un polinucleotido particular. La definicion pretende incluir cualquier molecula de ARN o ADN extraha que sea util desde el punto de vista terapeutico, diagnostico u otro. Dichas moleculas incluyen, por ejemplo, moleculas de ARN o ADN antisentido, ARN de interferencia (ARNi), micro ARN, moleculas de ARN sehuelo, siRNA, ARN enzimatico, ARN de edicion terapeutica y ARN agonista y antagonista, compuestos oligomericos antisentido, oligonucleotidos antisentido, oligonucleotidos de secuencia gufa externa (EGS), agentes de splicing alternos, cebadores, sondas y otros compuestos oligomericos que hibridan con al menos una parte del acido nucleico diana. Por lo tanto, estos

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compuestos pueden introducirse en forma de compuestos oligomericos monocatenarios, bicatenarios, parcialmente monocatenarios, o circulares.

En el contexto de esta divulgacion, el termino «oligonucleotido» se refiere a un oligomero o polfmero de acido ribonucleico (ARN) o acido desoxirribonucleico (ADN) o mimeticos de los mismos. El termino “oligonucleotido” tambien incluye oligomeros lineales o circulares de monomeros o enlaces naturales y/o modificados, que incluyen desoxirribonucleosidos, ribonucleosidos, formas sustituidas y alfa-anomericas de los mismos, acidos nucleicos peptfdicos (PNA), acidos nucleicos bloqueados (LNA), fosforotioato, metilfosfonato y similares. Los oligonucleotidos son capaces de unirse especfficamente a un polinucleotido diana por medio de un patron regular de interacciones monomero a monomero, tales como tipo de apareamiento de bases de Watson-Crick, tipos de apareamiento de bases de Hoogsteen o Hoogsteen inversa, o similares.

El oligonucleotido puede ser «quimerico», es decir, estar compuesto de diferentes regiones. En el contexto de esta divulgacion los compuestos «quimericos» son oligonucleotidos, que contienen dos o mas regiones qufmicas, por ejemplo, una o mas regiones de ADN, una o mas regiones de ARN, una o mas regiones de PNA, etc. Cada region qufmica esta compuesta por al menos una unidad monomerica, es decir, un nucleotido en el caso de un compuesto de oligonucleotidos. Estos oligonucleotidos normalmente comprenden al menos una region donde el oligonucleotido se modifica con el fin de presentar una o mas propiedades deseadas. Las propiedades deseadas del oligonucleotido incluyen, entre otras, por ejemplo, resistencia incrementada a la degradacion por nucleasas, captacion celular incrementada, y/o afinidad de union incrementada para el acido nucleico diana. Las diferentes regiones del oligonucleotido pueden, por lo tanto, tener diferentes propiedades. Los oligonucleotidos quimericos de la presente divulgacion pueden formarse como estructuras mixtas de dos o mas oligonucleotidos, oligonucleotidos modificados, oligonucleosidos y/o analogos de oligonucleotido, tal como se ha descrito anteriormente.

El oligonucleotido puede estar compuesto de regiones que pueden enlazarse en «registro», es decir, cuando los monomeros se enlazan consecutivamente, como en ADN nativo, o enlazarse mediante espaciadores. Se pretende que los espaciadores constituyan un «puente» covalente entre las regiones y tengan, en casos preferidos, una longitud que no supere aproximadamente los 100 atomos de carbono. Los espaciadores pueden llevar diferentes funcionalidades, por ejemplo, tener carga positiva o negativa, llevar propiedades de union a acido nucleico especiales (intercaladores, ligantes de surcos, toxinas, fluoroforos, etc.), ser lipofilos, inducir estructuras secundarias especiales como, por ejemplo, peptidos que contienen alanina que inducen helices alfa.

Tal como se usa en el presente documento, «IRS2» y «Sustrato 2 del Receptor de Insulina» son incluyentes de todos los miembros de la familia, mutantes, alelos, fragmentos, especies, secuencias codificantes y no codificantes, cadenas de polinucleotido sentido y antisentido, etc.

Tal como se usa en el presente documento, «TFE3» y «Factor de transcripcion E3» son incluyentes de todos los miembros de la familia, mutantes, alelos, fragmentos, especies, secuencias codificantes y no codificantes, cadenas de polinucleotido sentido y antisentido, etc.

Tal como se usa en el presente documento, los terminos Sustrato 2 del Receptor de Insulina, Sustrato-2 del Receptor de Insulina, IRS-2 e IRS2 se consideran lo mismo en la bibliograffa y se utilizan indistintamente en la presente solicitud.

Tal como se usan en el presente documento, los terminos Factor de transcripcion E3, TFE3, TFE-3, RCCP2 y TFEA son considerados lo mismo en la bibliograffa y se utilizan indistintamente en la presente solicitud.

Tal como se usa en el presente documento, la expresion «oligonucleotido especffico para» u «oligonucleotido que se dirige a» se refiere a un oligonucleotido que tiene una secuencia (i) capaz de formar un complejo estable con una parte del gen elegido como diana, o (ii) capaz de formar un duplex estable con una parte de un transcrito de ARNm del gen elegido como diana. La estabilidad de los complejos y los duplex puede determinarse mediante calculos teoricos y/o ensayos in vitro. Los ensayos a modo de ejemplo para determinar la estabilidad de complejos y duplex de hibridacion se describen en los ejemplos mas adelante.

Tal como se usa en el presente documento, la expresion «acido nucleico diana» engloba ADN, ARN (que comprende pre-ARNm y ARNm) transcritos a partir de dicho ADN, y tambien ADNc derivado de dicho aRn, secuencias codificantes, no codificantes, polinucleotidos sentido o antisentido. La hibridacion especffica de un compuesto oligomerico con su acido nucleico diana interfiere con la funcion normal del acido nucleico. Esta modulacion de la funcion de un acido nucleico diana por compuestos, que se hibridan especfficamente con el, se denomina generalmente «antisentido». Las funciones de ADN con las que interferiran incluyen, por ejemplo, la

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replicacion y transcripcion. Las funciones de ARN con las que interferiran incluyen todas las funciones vitales tales como, por ejemplo, translocalizacion del ARN al sitio de traduccion de protema, traduccion de protema desde ARN, splicing del ARN para dar una o mas especies de ARNm, y actividad catalftica que puede acoplarse en o facilitarse mediante el ARN. El efecto global de dicha interferencia con las funciones del acido nucleico diana es la modulacion de la expresion de un producto codificado u oligonucleotidos.

El ARN de interferencia «ARNi» esta mediado por moleculas de ARN bicatenario (dsARN) que tienen homolog^a espedfica de secuencia con sus secuencias de acidos nucleicos «diana». En ciertos aspectos de la presente divulgacion, los mediadores son duplex de ARN «pequeno de interferencia» (siRNA) de 5-25 nucleotidos. Los siRNA se derivan a partir del procesamiento del dsARN mediante una enzima ARNasa conocida como Dicer. Los productos duplex de siRNA son reclutados en un complejo siRNA multiprotema denominado RISC (complejo de silenciamiento inducido por ARN). Sin desear cenirse a ninguna teona particular, se cree entonces que un RISC es guiado a un acido nucleico diana (adecuadamente ARNm), en el que el duplex de siRNA interactua de una forma espedfica de secuencia para mediar en la escision en un modo catalttico. Los ARN pequenos de interferencia que pueden usarse de acuerdo con la presente divulgacion pueden sintetizarse y usarse de acuerdo con procedimientos que son bien conocidos en la tecnica y que seran familiares para el experto en la tecnica. Los ARN pequenos de interferencia para su uso en los procedimientos de la presente divulgacion comprenden adecuadamente entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 nucleotidos (nt). En los ejemplos de aspectos no restrictivos, los siRNA pueden comprender de aproximadamente 5 a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 nt, o aproximadamente 20-25 nucleotidos.

La seleccion de los oligonucleotidos apropiados se facilita usando programas informaticos que alinean automaticamente secuencias de acidos nucleicos e indican regiones de identidad u homologfa. Dichos programas se usan para comparar secuencias de acidos nucleicos obtenidas, por ejemplo, buscando en bases de datos tales como GenBank o secuenciando productos de PCR. La comparacion de secuencias de acidos nucleicos de un intervalo de especies permite la seleccion de secuencias de acidos nucleicos que muestran un grado de identidad apropiado entre especies. En el caso de genes que no han sido secuenciados, se realizan Southern blots para permitir una determinacion del grado de identidad entre genes en especies diana y otras especies. Realizando Southern blots a grados de astringencia variables, tal como es muy conocido en la tecnica, es posible obtener una medida aproximada de la identidad. Estos procedimientos permiten la seleccion de oligonucleotidos que muestran un alto grado de complementariedad con secuencias de acidos nucleicos diana en un sujeto a controlar y un menor grado de complementariedad con secuencias de acidos nucleicos correspondientes en otras especies. Un experto en la tecnica se dara cuenta de que hay libertad considerable en la seleccion de regiones apropiadas de genes para su uso en la presente divulgacion.

Por «ARN enzimatico» se indica una molecula de ARN con actividad enzimatica (Cech, (1988) J. American. Med. Assoc. 260,3030-3035). Los acidos nucleicos enzimaticos (ribozimas) actuan uniendose primero a un ARN diana. Dicha union se produce a traves de la parte de union diana de un acido nucleico enzimatico que se mantiene en estrecha proximidad a una parte enzimatica de la molecula que actua para escindir el ARN diana. De este modo, el acido nucleico enzimatico reconoce primero y luego se une a ARN diana mediante apareamiento de bases, y una vez unido al sitio correcto, actua enzimaticamente para cortar el ARN diana.

Por «ARN senuelo» se indica una molecula de ARN que imita el dominio de union natural para un ligando. El ARN senuelo compite, por lo tanto, con la diana de union natural para la union de un ligando espedfico. Por ejemplo, se ha mostrado que la sobreexpresion de ARN de respuesta de activacion en trans (TAR) de VIH puede actuar como un «senuelo» y se une de forma eficiente a la protema tat de VIH, impidiendo de este modo que se una a secuencias TAR codificadas en el ARN de VIH. Este pretende ser un ejemplo espedfico. Los expertos en la tecnica reconoceran que este es solo un ejemplo, y facilmente pueden generarse otros aspectos usando tecnicas generalmente conocidas en la tecnica.

Tal como se usa en el presente documento, el termino «monomeros» normalmente indica monomeros enlazados por enlaces fosfodiester o analogos de los mismos para formar oligonucleotidos que vanan en tamano entre unas pocas unidades monomericas, por ejemplo, entre aproximadamente 3-4, y aproximadamente varios cientos de unidades monomericas. Los analogos de enlaces fosfodiester incluyen: fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonatos, fosforoselenoato, fosforamidato y similares, tal como se describe con mayor detalle mas adelante.

El termino «nucleotido» cubre nucleotidos de origen natural, asf como nucleotidos no de origen natural. Debe ser evidente para el experto en la tecnica que diversos nucleotidos que se consideraron anteriormente “no de origen natural” se han descubierto posteriormente en la naturaleza. De este modo, «nucleotidos» incluye no solamente las

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moleculas que contienen heterociclos de purina y pirimidina conocidas, sino tambien analogos heterocfclicos y tautomeros de las mismas. Ejemplos ilustrativos de otros tipos de nucleotidos son moleculas que contienen adenina, guanina, timina, citosina, uracilo, purina, xantina, diaminopurina, 8-oxo- N6-metiladenina, 7-deazaxantina, 7- deazaguanina, N4,N4-etanocitosina, N6,N6-etano-2,6- diaminopurina, 5-metilcitosina, 5-alquinil(C3-C6)-citosina, 5- fluorouracilo, 5-bromouracilo, seudoisocitosina, 2-hidroxi-5-metil-4-triazolopiridina, isocitosina, isoguanina, inosina y los nucleotidos «no de origen natural» descritos en Benner et al., patente de Estados Unidos N.° 5.432.272. El termino «nucleotido» pretende abarcar cualquiera de y todos estos ejemplos, asf como analogos y tautomeros de estos. Los nucleotidos especialmente interesantes son los que contienen adenina, guanina, timina, citosina y uracilo, que se consideran como los nucleotidos de origen natural en relacion con la aplicacion terapeutica y diagnostica en seres humanos. Los nucleotidos incluyen los azucares naturales 2'-desoxi y 2'-hidroxilo, p. ej., como se describe en Kornberg & Baker, DNA Replication, 2a Ed. (Freeman, San Francisco, 1992), ademas de sus analogos.

«Analogos», en referencia a nucleotidos, incluye nucleotidos sinteticos que tienen restos de bases modificados y/o restos de azucar modificados (vease, por ejemplo, descrito generalmente porScheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, Nueva York, 1980;Freier & Altmann, (1997) Nucl. Acid. Res., 25(22), 4429- 4443,Toulme, J.J., (2001) Nature Biotechnology 19:17-18;Manoharan M., (1999) Biochemica et Biophysica Acta 1489:117-139;Freier S. M., (1997) Nucleic Acid Research, 25:4429-4443,Uhlman, E., (2000) Drug Discovery & Development, 3: 203-213,Herdewin P., (2000) Antisense & Nucleic Acid Drug Dev., 10:297-310); 2'-O, 3'-C-enlazados[3.2.0]bicicloarabinonucleosidos. Dichos analogos incluyen nucleotidos sinteticos disenados para potenciar propiedades de union, p. ej.-, la estabilidad, especificidad del duplex o el triplex, o similares.

Tal como se usa en el presente documento, «hibridacion» significa el apareamiento de cadenas sustancialmente complementarias de compuestos oligomericos. Un mecanismo de apareamiento implica la formacion de puentes de hidrogeno, que pueden ser puentes de hidrogeno de Watson-Crick, Hoogsteen o de Hoogsteen inverso, entre bases de nucleosidos o de nucleotidos (nucleotidos) complementarias de las cadenas de compuestos oligomericos. Por ejemplo, la adenina y la timina son nucleotidos complementarios que se aparean mediante la formacion de puentes de hidrogeno. La hibridacion puede producirse en circunstancias variables.

Un compuesto antisentido es «especificamente hibridable» cuando la union del compuesto al acido nucleico diana interfiere con la funcion normal del acido nucleico diana para causar una modulacion de la funcion y/o la actividad, y existe un grado de complementariedad suficiente para evitar union inespecifica del compuesto antisentido a secuencias de acidos nucleicos no diana en condiciones en las que se desea union especifica, es decir, en condiciones fisiologicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapeutico, y en condiciones en las que se realizan ensayos en el caso de ensayos in vitro.

Tal como se usa en el presente documento, la frase «condiciones de hibridacion astringentes» o «condiciones astringentes» se refiere a condiciones en las que un compuesto de la divulgacion hibridara con su secuencia diana, pero con un numero minimo de otras secuencias. Las condiciones astringentes son dependientes de secuencia y seran diferentes en diferentes circunstancias y en el contexto de esta divulgacion, las «condiciones astringentes» en las que compuestos oligomericos hibridan con una secuencia diana se determinan mediante la naturaleza y la composicion de los compuestos oligomericos y los ensayos en los que estan siendo investigados. En general, las condiciones de hibridacion astringentes comprenden bajas concentraciones (<0,15 M) de sales con cationes inorganicos tales como Na++ o K++ (es decir, baja fuerza ionica), temperatura superior a 20 °C - 25 °C por debajo de la Tm del complejo de compuesto oligomerico: secuencia diana, y la presencia de desnaturalizantes tales como formamida, dimetilformamida, dimetilsulfoxido, o el detergente dodecilsulfato de sodio (SDS). Por ejemplo, la tasa de hibridacion disminuye un 1,1 % por cada 1 % de formamida. Un ejemplo de una condicion de hibridacion de alta astringencia es 0,1X tampon cloruro sodico-citrato sodico (SSC)/0,1 % (peso/volumen) de SDS a 60 °C durante 30 minutos.

«Complementario», tal como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de apareamiento preciso entre dos nucleotidos en una o dos cadenas oligomericas. Por ejemplo, si una nucleobase en cierta posicion de un compuesto antisentido es capaz de formar puentes de hidrogeno con una nucleobase en cierta posicion de un acido nucleico diana, siendo dicho acido nucleico diana un ADN, ARN, o molecula de oligonucleotido, entonces la posicion de la formacion de puentes de hidrogeno entre el oligonucleotido y el acido nucleico diana se considera una posicion complementaria. El compuesto oligomerico y el ADN, ARN, o molecula de oligonucleotido, adicional son complementarios entre si cuando un numero suficiente de posiciones complementarias en cada molecula estan ocupadas por nucleotidos que pueden formar puentes de hidrogeno entre si. De este modo, «especificamente hibridable» y «complementariedad» son expresiones que se usan para indicar un grado suficiente de apareamiento preciso o complementariedad sobre un numero suficiente de nucleotidos de modo que se produzca union estable y especifica entre el compuesto oligomerico y un acido nucleico diana.

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Se entiende en la tecnica que no es necesario que la secuencia de un compuesto oligomerico sea un 100 % complementaria a la de su acido nucleico diana para ser especfficamente hibridable. Ademas, un oligonucleotido puede hibridarse sobre uno o mas segmentos, de modo que segmentos intermedios o adyacentes no esten implicados en el acontecimiento de hibridacion (por ejemplo, una estructura en bucle, desapareamiento o estructura de horquilla). Los compuestos oligomericos de la presente divulgacion comprenden al menos aproximadamente el 70 %, o al menos aproximadamente el 75 %, o al menos aproximadamente el 80 %, o al menos aproximadamente el 85 %, o al menos aproximadamente el 90 %, o al menos aproximadamente el 95 %, o al menos aproximadamente el 99 %, de complementariedad de secuencia con una region diana dentro de la secuencia de acido nucleico diana a la que se dirigen. Por ejemplo, un compuesto antisentido en el que 18 de los 20 nucleotidos del compuesto antisentido son complementarios a una region diana y, por lo tanto, hibridarfan especfficamente, representarfa el 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, los nucleotidos no complementarios restantes pueden agruparse o intercalarse con nucleotidos complementarios y no necesitan ser contiguos entre si o a nucleotidos complementarios. Por lo tanto, un compuesto antisentido que tiene 18 nucleotidos de longitud con 4 (cuatro) nucleotidos no complementarios que estan flanqueados por dos regiones de complementariedad completa con el acido nucleico diana tendrfa el 77,8 % de complementariedad global con el acido nucleico diana y de este modo estarfa dentro del alcance de la presente divulgacion. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una region de un acido nucleico diana puede determinarse rutinariamente usando programas BLAST (herramientas de busqueda de alineamientos locales basicos) y programas PowerBLAST conocidos en la tecnica. El porcentaje de homologfa, identidad de secuencias o complementariedad pueden determinarse mediante, por ejemplo, el programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), usando parametros por defecto, que usa el algoritmo de Smith & Waterman (Avd. Solic. Math., (1981) 2.482-489).

Tal como se usa en el presente documento, la expresion «punto de fusion termico (Tm)» se refiere a la temperatura, bajo fuerza ionica, pH y concentracion de acido nucleico definidos, a la que el 50 % de los oligonucleotidos complementarios a la secuencia diana hibridan con la secuencia diana en equilibrio. Normalmente, condiciones astringentes seran aquellas en las que la concentracion de sales es la concentracion de iones Na (u otras sales) de al menos aproximadamente 0,01 a 1,0 M a pH de 7,0 a 8,3 y la temperatura es al menos aproximadamente 30 °C para oligonucleotidos cortos (p. ej., de 10 a 50 nucleotidos). Las condiciones astringentes tambien pueden lograrse con la adicion de agentes desestabilizantes, tales como formamida.

Tal como se usa en el presente documento, «modulacion» significa un incremento (estimulacion) o una disminucion (inhibicion) de la expresion de un gen.

El termino «variante», cuando se usa en el contexto de una secuencia de polinucleotidos, puede englobar una secuencia de polinucleotidos relacionada con un gen de tipo silvestre. Esta definicion tambien puede comprender, por ejemplo, variantes «alelicas», de «splicing», de «especie» o «polimorficas». Una variante de splicing puede tener identidad significativa con una molecula de referencia, pero generalmente tendra un mayor o menor numero de polinucleotidos debido al splicing alterno de exones durante el procesamiento de ARNm. El polipeptido correspondiente puede poseer dominios funcionales adicionales o una ausencia de dominios. Las variantes de especie son secuencias polinucleotfdicas que varfan de una especie a otra. Son de particular utilidad en la divulgacion variantes de productos genicos de tipo silvestre (wild type). Las variantes pueden resultar de al menos una mutacion en la secuencia de acidos nucleicos y pueden producir ARNm alterados o polipeptidos cuya estructura o funcion puede o puede no alterarse. Cualquier gen natural o recombinante dado puede tener ninguna, una o muchas formas alelicas. Los cambios mutacionales comunes que dan lugar a variantes se atribuyen generalmente a eliminaciones, adiciones o sustituciones naturales de nucleotidos. Cada uno de estos tipos de cambios puede producirse solo, o en combinacion con los otros, una o mas veces en una secuencia dada.

Los polipeptidos resultantes generalmente tendran identidad significativa de aminoacidos los unos con respecto a los otros. Una variante polimorfica es una variacion en la secuencia de polinucleotidos de un gen particular entre individuos de una especie dada. Las variantes polimorficas tambien pueden englobar «polimorfismos de un solo nucleotido» (SNP), o mutaciones de una sola base en las que la secuencia de polinucleotidos varfa en una base. La presencia de SNP puede ser indicativa de, por ejemplo, una cierta poblacion con una propension por una patologfa, es decir susceptibilidad frente a resistencia.

Los polinucleotidos derivados incluyen acidos nucleicos sometidos a modificacion qufmica, por ejemplo, sustitucion de hidrogeno por un grupo alquilo, acilo o amino. Los derivados, p. ej., oligonucleotidos derivados, pueden comprender partes no de origen natural, tales como restos de azucar alterados o enlaces interazucar. A modo de ejemplo, entre estos estan fosforotioato y otras especies que contienen azufre que se conocen en la tecnica. Los

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acidos nucleicos derivados tambien pueden contener etiquetas, que incluyen radionucleotidos, enzimas, agentes fluorescentes, agentes quimioluminiscentes, agentes cromogenos, sustratos, cofactores, inhibidores, partfculas magneticas y similares.

Un polipeptido o peptido «derivado» es uno que se modifica, por ejemplo, por glucosilacion, pegilacion, fosforilacion, sulfatacion, reduccion/alquilacion, acilacion, acoplamiento qufmico o tratamiento suave con formalina. Un derivado tambien puede modificarse para contener una etiqueta detectable, tanto directa como indirectamente, que incluye, aunque no se limita a, un radioisotopo, etiqueta fluorescente y enzimatica.

Tal como se usa en el presente documento, el termino «animal» o «paciente» pretende comprender, por ejemplo, seres humanos, ovejas, alces, venados, ciervos mulos, visones, mamfferos, monos, caballos, ganado vacuno, cerdos, cabras, perros, gatos, ratas, ratones, aves, pollos, reptiles, peces, insectos y aracnidos.

«Mamffero» cubre mamfferos de sangre caliente que normalmente estan bajo atencion medica (p. ej., seres humanos y animales domesticados). Los ejemplos incluyen felinos, caninos, equinos, bovinos y humanos, ademas de solo humanos.

«Tratar» o «tratamiento» cubre el tratamiento de una patologfa en un mamffero, e incluye: (a) prevenir que se produzca la patologfa en un mamffero, en particular, cuando dicho mamffero tiene predisposicion a la patologfa, pero todavfa no se ha diagnosticado que la tenga; (b) inhibir la patologfa, por ejemplo, detener el desarrollo; y/o (c) aliviar la patologfa, por ejemplo, causando la regresion de la patologfa hasta que se alcance un criterio de valoracion deseado. Tratar tambien incluye la mejora de un sfntoma de una enfermedad (por ejemplo, reducir el dolor o molestia), donde dicha mejora puede o puede no afectar directamente la enfermedad (por ejemplo, causa, transmision, expresion, etc.).

Tal como se usa en el presente documento, «cancer» se refiere a todos los tipos de cancer o neoplasia o tumores malignos en mamfferos, incluyendo, pero sin limitarse a: leucemias, linfomas, melanomas, carcinomas y sarcomas. El propio cancer se manifiesta como un «tumor» o tejido que comprende celulas malignas del cancer. Los ejemplos de tumores incluyen sarcomas y carcinomas como tales, sin caracter restrictivo: fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogenico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomisarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cancer pancreatico, cancer de mama, cancer ovarico, cancer de prostata, carcinoma de celulas escamosas, carcinoma de celulas basales, adenocarcinoma, carcinoma de glandula sudorfpara, carcinoma de glandula sebacea, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogenico, carcinoma de celulas renales, hepatoma, carcinoma de conductos biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrional, tumor de Wilms, cancer de cuello uterino, tumor testicular, carcinoma de pulmon, carcinoma de pulmon de celulas pequenas, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimona, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acustico, oligondendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, y retinoblastoma. Otros canceres que pueden tratarse con la composicion divulgada de acuerdo con la divulgacion incluyen, pero sin limitarse a, por ejemplo, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, mieloma multiple, neuroblastoma, cancer de mama, cancer de ovario, cancer de pulmon, rabdomiosarcoma, trombocitosis primaria, macroglobulinemia primaria, tumores de pulmon de celulas pequenas, tumores primarios del cerebro, cancer de estomago, cancer de colon, tumores pancreaticos, insulanoma carcinoide maligno, cancer de vejiga, cancer gastrico, lesiones cutaneas premalignas, cancer testicular, linfomas, cancer de tiroides, neuroblastoma, cancer de esofago, cancer del tracto genitourinario, hipercalcemia maligna, cancer de cuello uterino, cancer endometrial, cancer suprarrenal cortical, y cancer de prostata.

«Enfermedad o trastorno neurologico» se refiere a cualquier enfermedad o trastorno del sistema nervioso y/o sistema visual. «Enfermedad o trastorno neurologico» incluye enfermedades o trastornos que implican al sistema nervioso central (cerebro, tronco del encefalo y cerebelo), el sistema nervioso periferico (incluyendo los nervios craneales), y el sistema nervioso autonomo (partes del cual estan ubicadas en el sistema nervioso tanto central como periferico). Los ejemplos de trastornos neurologicos incluyen, aunque sin limitarse a, cefalea, estupor y coma, demencia, convulsiones, trastornos del sueno, traumatismo, infecciones, neoplasias, neurooftalmologfa, trastornos del movimiento, enfermedades desmielinizantes, trastornos de la medula espinal, y trastornos de los nervios perifericos, el musculo y las uniones neuromusculares. Las adicciones y las enfermedades mentales incluyen, aunque sin limitarse a, trastorno bipolar y esquizofrenia, y tambien se incluyen en la definicion de trastorno neurologico. La siguiente es una lista de varios trastornos, sfntomas, signos y sfndromes neurologicos que pueden ser tratados usando las composiciones y procedimientos de acuerdo con la presente divulgacion: afasia adquirida epileptiforme; encefalomielitis diseminada aguda; adrenoleucodistrofia; degeneracion macular relacionada con la edad; agenesia del cuerpo calloso; agnosia; sfndrome de Aicardi; enfermedad de Alexander; enfermedad de Alpers;

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hemiplejfa alterna; demencia vascular; esclerosis lateral amiotrofica; anencefalia; sfndrome de Angelman; angiomatosis; anoxia; afasia; apraxia; quistes aracnoideos; aracnoiditis; malformacion de Chiari Anronl; malformacion arteriovenosa; sfndrome de Asperger; ataxia telangiectasia; trastorno de hiperactividad y deficit de atencion; autismo; disfuncion autonoma; dolor de espalda; enfermedad de Batten; enfermedad de Behcet; paralisis de Bell; blefaroespasmo esencial benigno; focal benigna; amiotrofia; hipertension intracraneal benigna; enfermedad de Binswanger; blefaroespasmo; sfndrome de Bloch Sulzberger; lesion del plexo braquial; absceso cerebral; lesion cerebral; tumores cerebrales (incluyendo glioblastoma multiforme); tumor medular; sfndrome de Brown-Sequard; enfermedad de Canavan; sfndrome del tunel carpiano; causalgia; sfndrome de dolor central; mielinolisis pontina central; trastorno encefalico; aneurisma cerebral; arteriosclerosis cerebral; atrofia cerebral; gigantismo cerebral; paralisis cerebral; enfermedad de Charcot-Marie-Tooth; neuropatfa inducida por quimioterapia y dolor neuropatico; malformacion de Chiari; corea; polineuropatfa desmielinizante inflamatoria cronica; dolor cronico; sfndrome de dolor cronico regional; sfndrome de Coffin Lowry; coma, incluyendo estado vegetativo persistente; diplejfa facial congenita; degeneracion corticobasal; arteritis craneal; craneosinostosis; enfermedad de Creutzfeldt-Jakob; trastornos por traumatismo acumulativo; sfndrome de Cushing; enfermedad de cuerpos de inclusion citomegalicos; infeccion por citomegalovirus; sfndrome de ojos y pies danzantes; sfndrome de Dandy-Walker; enfermedad de Dawson; sfndrome de Morsier; paralisis de Dejerine-Klumke; demencia; dermatomiositis; neuropatfa diabetica; esclerosis difusa; disautonomfa; disgraffa; dislexia; distomas; encefalopatfa epileptica infantil temprana; sfndrome de la silla vacfa; encefalitis; encefalocele; angiomatosis encefalotrigeminal; epilepsia; paralisis de Erb; temblor esencial; enfermedad de Fabry; sfndrome de Fahr; desmayo; paralisis espastica familiar; convulsiones febriles; sfndrome de Fisher; ataxia de Friedreich; demencia fronto-temporal y otras «tauopatfas»; enfermedad de Gaucher; sfndrome de Gerstmann; arteritis de celulas gigantes; enfermedad de inclusion de celulas gigantes; leucodistrofia de celulas globosas; sfndrome de Guillain-Barre; mielopatfa asociada HTLV-1; enfermedad Hallervorden-Spatz; traumatismo craneoencefalico; cefalea; espasmo hemifacial; paraplejia espastica hereditaria; heredopatfa atactica polineuritiforme; herpes zoster otico; herpes zoster; sfndrome de Hirayama; demencia y neuropatfa asociadas a VIH (tambien manifestaciones neurologicas del SIDA); holoprosencefalia; enfermedad de Huntington y otras enfermedades de repeticion de poliglutamina; hidranencefalia; hidrocefalia; hipercortisolismo; hipoxia; encefalomielitis mediada por inmunidad; miositis por cuerpos de inclusion; incontinencia pigmentaria; enfermedad de almacenamiento de acido fitanico infantil; enfermedad de Refsum infantil; espasmos infantiles; miopatfa inflamatoria; quiste intracraneal; hipertension intracraneal; sfndrome de Joubert; sfndrome de Kearns-Sayre; enfermedad de Kennedy, sfndrome de Kinsboume; sfndrome de Klippel Feil; enfermedad de Krabbe; enfermedad Kugelberg- Welander; kuru; enfermedad de Lafora; sfndrome miastenico de Lambert-Eaton; sfndrome de Landau-Kleffner; sfndrome lateral medular (Wallenberg); dificultades de aprendizaje; enfermedad de Leigh; sfndrome de Lennox- Gustaut; sfndrome de Lesch-Nyhan; leucodistrofia; demencia con cuerpos de Lewy; lisencefalia; sfndrome de enclaustramiento; enfermedad de Lou Gehrig (es decir, enfermedad de las neuronas motoras o esclerosis lateral amiotrofica); enfermedad del disco lumbar; secuelas neurologicas de la enfermedad de Lyme; enfermedad de Machado-Joseph; macrocefalia; megalocefalia; sfndrome de Melkelsson-Rosenthal; enfermedad de Meniere; meningitis; enfermedad de Menkes; leucodistrofia metacromatica; microcefalia; migrana; sfndrome de Miller Fisher; mini derrames; miopatfas mitocondriales; sfndrome de Moebius; amiotrofia monomelica; enfermedad de la neuronas motoras; enfermedad de Moyamoya; mucopolisacaridosis; demencia multiinfarto; neuropatfa motora multifocal; esclerosis multiple y otras enfermedades desmielinizantes; atrofia de multiples sistemas con hipotension postural; distrofia muscular; miastenia grave; esclerosis difusa mielinoclastica; encefalopatfa mioclonica de los lactantes; mioclonfa; miopatfa; miotonfa congenita; narcolepsia; neurofibromatosis; sfndrome neuroleptico maligno; manifestaciones neurologicas del SIDA; secuelas neurologicas del lupus; neuromiotonfa; lipofuscinosis ceroidea; trastornos de la migracion neuronal; enfermedad de Niemann-Pick; sfndrome de McLeod- O'Sullivan; neuralgia occipital; secuencia de espina bifida oculta; sfndrome Ohtahara; atrofia olivopontocerebelosa; opsoclono-mioclono; neuritis optica; hipotension ortostatica; sfndrome de sobreuso; parestesia; enfermedad o trastorno neurodegenerativo (enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrofica (ALS), demencia, esclerosis multiple y otras enfermedades y trastornos asociados con la muerte celular neuronal); paramiotonfa congenita; enfermedades paraneoplasicas; ataques paroxfsticos; sfndrome de Parry Romberg; enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher; paralisis periodicas; neuropatfa periferica; neuropatfa dolorosa y dolor neuropatico; estado vegetativo persistente; trastornos profundos del desarrollo; reflejo de estornudo fotico; enfermedad de almacenamiento de acido fitanico; enfermedad de Pick; nervio pinzado; tumores de la hipofisis; polimiositis; porencefalia; sfndrome post-polio; neuralgia postherpetica; encefalomielitis postinfecciosa; hipotension postural; sfndrome de Prader-Willi; esclerosis lateral primaria; enfermedades prionicas; atrofia hemifacial progresiva; leucoencefalopatfa multifocal progresiva; poliodistrofia esclerosante progresiva; paralisis supranuclear progresiva; seudotumor cerebral; sfndrome de Ramsay-Hunt (tipos I y II); encefalitis de Rasmussen; sfndrome de distrofia simpatica refleja; enfermedad de Refsum; trastornos por movimientos repetitivos; lesiones por esfuerzo repetitivo; sfndrome de piernas inquietas; mielopatfa asociada a retrovirus; sfndrome de Rett; sfndrome de Reye; baile de San Vito; enfermedad de Sandhoff; enfermedad de Schilder; esquizencefalia; displasia septo-optica; sfndrome del bebe zarandeado; herpes; sfndrome de Shy-Drager; sfndrome de Sjogren; apnea del sueno; sfndrome de Soto;

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espasticidad; espina bifida; lesion de la medula espinal; tumores de la medula espinal; atrofia muscular en la columna; sindrome de la persona rigida; accidente cerebrovascular; sindrome de Sturge-Weber; panencefalitis esclerosante subaguda; encefalopatia arteriosclerotica subcortical; corea de Sydenham; sincope; siringomielia; discinesia tardia; enfermedad de Tay-Sachs; arteritis temporal; sindrome de medula espinal anclada; enfermedad de Thomsen; sindrome del operculo toracico; Tic Douloureux; paralisis de Todd; Sindrome de Tourette; ataque isquemico transitorio; encefalopatias espongiformes transmisibles; mielitis transversa; lesion cerebral traumatica; temblor; neuralgia trigeminal; paraparesia espastica tropical; esclerosis tuberosa; demencia vascular (demencia multiinfarto); vasculitis incluyendo arteritis temporal; enfermedad de Von Hippel-Lindau; sindrome de Wallenberg; enfermedad de Werdnig-Hoffman; sindrome de West; latigazo cervical; sindrome de Williams; enfermedad de Wildon; y sindrome de Zellweger.

Composiciones de polinucleotidos y oligonucleotidos y moleculas

Dianas: en un aspecto, las dianas incluyen secuencias de acidos nucleicos del Sustrato 2 del Receptor de Insulina (IRS2) y Factor de transcripcion E3 (TFE3), incluyendo sin limitarse a, secuencias sentido y/o antisentido no codificantes y/o secuencias codificantes asociadas con TFE3.

El TFE3, una protefna helice-bucle-helice basica (bHLH, por su sigla en ingles), como un transactivador de genes metabolicos que se regulan mediante un elemento E-box en sus promotores. La expresion mediada por adenovirus de TFE3 en hepatocitos en cultivo y la expresion de IRS-2 y Akt fuertemente activada in vivo y fosforilacion mejorada de quinasas de senalizacion de la insulina tales como Akt, glicogeno sintasa quinasa 3p y quinasa p70S6. TFE3 es un factor de transcripcion bHLH que activa fuertemente diversas moleculas de senalizacion de la insulina, protegiendo contra el desarrollo de resistencia a la insulina y el sindrome metabolico.

La regulacion del IRS-2 es el sitio primario donde convergen TFE3 en sinergfa con Foxol, y SREBP-1c. En conjunto, TFE3/Foxol y SREBP-1c regulan de manera recfproca regulan la expresion del IRS-2 y la sensibilidad a la insulina en el hfgado.

Los miembros de la familia de protefnas IRS presentan fosforilacion de tirosina mediante los receptores para insulina e IGF-1 asf como determinados receptores de citocinas acoplados a quinasas Janus. Al menos cuatro protefnas IRS se producen en mamfferos: Los IRS-1 e IRS-2 son ampliamente expresados; el IRS-3 se restringe a tejido adiposo, celulas p, y posiblemente el hfgado; y el IRS-4 se expresa en el timo, cerebro y rinon. Las protefnas iRs tienen un extremo amina conservado compuesto por homologfa a la plecstrina adyacente y dominios de union a la fosfotirosina que median el acoplamiento a receptores tirosina quinasas activados.

En un aspecto, se utilizan oligonucleotidos antisentido para prevenir o tratar enfermedades o trastornos asociados con miembros de la familia IRS2. Entre los ejemplos de enfermedades y trastornos mediados por el Sustrato 2 del Receptor de Insulina (IRS2) que se pueden tratar con celulas/tejidos regenerados a partir de celulas madre obtenidas utilizando los compuestos antisentido se incluyen: una enfermedad o trastorno asociado con funcion anormal y/o expresion de IRS2 y/o TFE3, una enfermedad o trastorno neurologico (p. ej. Enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrofica, etc.), una enfermedad o trastorno asociado con resistencia a la insulina, diabetes, un estado no diabetico resistente a la insulina (p. ej., obesidad, intolerancia a la glucosa (IGT, por su sigla en ingles), sindrome metabolico, etc.) una enfermedad o trastorno hepatico, una enfermedad o trastorno asociado a crecimiento y desarrollo del rinon, una enfermedad o trastorno asociado al crecimiento del musculo esqueletico y/o metabolismo, una enfermedad o trastorno asociado con metabolismo de carbohidratos, trastorno de peso, sindrome del ovario poliqufstico, ateroesclerosis, cancer, una enfermedad o trastorno asociado a apoptosis, una enfermedad o trastorno asociado con envejecimiento y senescencia.

En un aspecto, la modulacion del IRS2 por uno o mas oligonucleotidos antisentido se administra a un paciente con necesidad de la misma, para mejora del estado atletico y musculacion.

En un aspecto, la modulacion del IRS2 por uno o varios oligonucleotidos antisentido se administra a un paciente que los necesite, para prevenir o tratar cualquier enfermedad o trastorno relacionado con la expresion, funcion o actividad anomalas del IRS2 o TFE3 en comparacion con un control normal.

En un aspecto, los oligonucleotidos son especfficos para polinucleotidos del gen IRS2, lo que incluye, sin limitacion, regiones no codificantes. Las dianas del |RS2 comprenden variantes del IRS2 y TFE3; mutantes del IRS2 y TFE3, incluyendo SNP; secuencias no codificantes del |RS2 y TFE3; alelos, fragmentos y similares. Preferiblemente, el oligonucleotido es una molecula de ARN antisentido.

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De acuerdo con aspectos de la divulgacion, la molecula de acido nucleico diana no esta limitada a polinucleotidos del IRS2 o TFE3 en solitario, sino que se extiende a cualquiera de las isoformas, receptores, homologos, regiones no codificantes y similares del IRS2 y TFE3.

En un aspecto, un oligonucleotido esta dirigido a una secuencia antisentido natural (antisentido natural a las regiones codificantes y no codificantes) de dianas del IRS2 y TFE3, incluyendo, sin limitacion, variantes, alelos, homologos, mutantes, derivados, fragmentos y secuencias complementarias a estos. Preferiblemente el oligonucleotido es una molecula de ARN o ADN antisentido.

En un aspecto, los compuestos oligomericos de la presente divulgacion tambien incluyen variantes en las que una base diferente esta presente en una o mas de las posiciones de nucleotido en el compuesto. Por ejemplo, si el primer nucleotido es una adenina, pueden producirse variantes que contienen timidina, guanosina, citidina u otros nucleotidos naturales o no naturales en esta posicion. Esto puede hacerse en cualquiera de las posiciones del compuesto antisentido. Estos compuestos se ensayan entonces usando los procedimientos descritos en el presente documento para determinar su capacidad para inhibir la expresion de un acido nucleico diana.

En un aspecto, la homologfa, identidad de secuencias o complementariedad entre el compuesto antisentido y la diana es de aproximadamente el 50 % a aproximadamente el 60 %. En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 60 % a aproximadamente el 70 %. En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 70% a aproximadamente el 80%. En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 80% a aproximadamente el 90%. En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 94 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 %.

Un compuesto antisentido es especfficamente hibridable cuando la union del compuesto al acido nucleico diana interfiere en la funcion normal del acido nucleico diana para producir una perdida de actividad, y hay un grado de complementariedad suficiente para evitar la union inespecffica del compuesto antisentido a secuencias de acidos nucleicos no diana en condiciones en las que se desea la union especffica. Tales condiciones incluyen, es decir, condiciones fisiologicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapeutico, y condiciones en las que se realizan los ensayos en el caso de ensayos in vitro.

Un compuesto antisentido, ya sea ADN, ARN, quimerico, sustituido, etc., es especfficamente hibridable cuando la union del compuesto a la molecula de ADN o de ARN diana interfiere en la funcion normal del ADN o ARN diana para producir una perdida de utilidad, y hay un grado de complementariedad suficiente para evitar la union inespecffica del compuesto antisentido a secuencias no diana en condiciones en las que se desea la union especffica, es decir, en condiciones fisiologicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapeutico, y en el caso de ensayos in vitro, en condiciones en las que se realizan los ensayos.

En un aspecto, la eleccion como diana del IRS2 o TFE3, incluyendo sin limitacion, secuencias antisentido que se identifican y se expanden, usando, por ejemplo, PCR, hibridacion etc., una o mas de las secuencias expuestas como las SEQ ID NO: 2 a 3, y similares, modulan la expresion o funcion del IRS2. En un aspecto, la expresion o funcion esta regulada positivamente en comparacion con un control. En un aspecto, la expresion o funcion esta regulada negativamente en comparacion con un control.

En un aspecto, los oligonucleotidos comprenden secuencias expuestas como las SEQ ID NO: 4 a 9 incluyendo secuencias antisentido que se identifican y expanden, usando, por ejemplo, PCR, hibridacion, etc. Estos oligonucleotidos pueden comprender uno o mas nucleotidos modificados, fragmentos mas cortos o mas largos, enlaces modificados y similares. Los ejemplos de enlaces modificados o enlaces internucleotfdicos comprenden fosforotioato, fosforoditioato o similares. En un aspecto, los nucleotidos comprenden un derivado de fosforo. El derivado de fosforo (o grupo fosfato modificado) que puede unirse al resto de azucar o de analogo de azucar en los oligonucleotidos modificados de la presente divulgacion puede ser un monofosfato, difosfato, trifosfato, alquilfosfato, alcanofosfato, fosforotioato y similares. La preparacion de los analogos de fosfato indicados anteriormente, y su incorporacion en nucleotidos, nucleotidos modificados y oligonucleotidos, tambien es en sf conocida y no es necesario describirla aquf.

La especificidad y sensibilidad de antisentido tambien es empleada por los expertos en la tecnica para usos terapeuticos. Se han empleado oligonucleotidos antisentido como restos terapeuticos en el tratamiento de patologfas en animales y el ser humano. Los oligonucleotidos antisentido se han administrado con seguridad y eficazmente a

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seres humanos y numerosos ensayos clfnicos estan actualmente en marcha. De este modo, se establece que los oligonucleotidos pueden ser modalidades terapeuticas utiles que pueden configurarse para ser utiles en regfmenes de tratamiento para el tratamiento de celulas, tejidos y animales, especialmente seres humanos.

En aspectos de la presente divulgacion, los compuestos antisentido oligomericos, particularmente oligonucleotidos, se unen a moleculas de acidos nucleicos diana y modulan la expresion y/o funcion de moleculas codificadas por un gen diana. Las funciones de ADN con las que interferiran comprenden, por ejemplo, replicacion y transcripcion. Las funciones de ARN con las que interferiran comprenden todas las funciones vitales tales como, por ejemplo, translocalizacion del ARN al sitio de traduccion de protefna, traduccion de protefna desde ARN, splicing del ARN para dar una o mas especies de ARNm, y actividad catalftica que puede acoplarse en o facilitarse mediante el ARN. Las funciones pueden regularse positivamente o inhibirse dependiendo de las funciones deseadas.

Los compuestos antisentido incluyen compuestos antisentido oligomericos, oligonucleotidos antisentido, oligonucleotidos de secuencia de gufa externa (EGS), agentes de splicing alternativos, cebadores, sondas, y otros compuestos oligomericos que hibridan con al menos una parte del acido nucleico diana. Por lo tanto, estos compuestos pueden introducirse en forma de compuestos oligomericos monocatenarios, bicatenarios, parcialmente monocatenarios, o circulares.

El direccionamiento de un compuesto antisentido a una molecula de acido nucleico particular, en el contexto de esta divulgacion, puede ser un proceso multietapa. El proceso normalmente empieza con la identificacion de un acido nucleico diana cuya funcion va a modularse. Este acido nucleico diana puede ser, por ejemplo, un gen celular (o ARNm transcrito del gen) cuya expresion esta asociada a un trastorno o patologfa particular, o una molecula de acido nucleico de un agente infeccioso. En la presente divulgacion, el acido nucleico diana codifica IRS2 o TFE3.

El proceso de direccionamiento normalmente tambien incluye la determinacion de al menos una region diana, segmento, o sitio dentro del acido nucleico diana para que la interaccion antisentido se produzca de forma que resulte el efecto deseado, por ejemplo, la modulacion de la expresion. Dentro del contexto de la presente divulgacion, el termino «region» se define como una parte del acido nucleico diana que tiene al menos una estructura, funcion o caracterfstica identificable. Dentro de las regiones de acidos nucleicos diana estan los segmentos. Los «segmentos» se definen como partes mas pequenas o sub-partes de regiones dentro de un acido nucleico diana. «Sitios», tal como se usa en la presente divulgacion, se define como posiciones dentro de un acido nucleico diana.

En un aspecto, los oligonucleotidos antisentido se unen a las secuencias antisentido naturales del Sustrato 2 del Receptor de Insulina 2 (IRS2) o Factor de transcripcion E3 (TFE3) y modulan la expresion y/o funcion del IRS2 (SEQ ID NO: 1). Los ejemplos de secuencias antisentido incluyen las SEQ ID NO: 2 al 9.

En un aspecto, los oligonucleotidos antisentido se unen a uno o mas segmentos del Sustrato 2 del Receptor de Insulina (IRS2) o polinucleotidos de Factor de transcripcion E3 (TFE3) y modulan la expresion y/o funcion del IRS2. Los segmentos comprenden al menos cinco nucleotidos consecutivos de los polinucleotidos sentido o antisentido del IRS2 o TFE3.

En un aspecto, los oligonucleotidos antisentido son especfficos para secuencias antisentido naturales del IRS2 o TFE3 donde la union de los oligonucleotidos a las secuencias antisentido naturales del IRS2 o TFE3 modulan la expresion y/o funcion del IRS2.

En un aspecto, los compuestos de oligonucleotido comprenden secuencias expuestas como las SEQ ID NO: 4 a 9, secuencias antisentido que se identifican y expanden usando, por ejemplo, PCR, hibridacion etc. Estos oligonucleotidos pueden comprender uno o mas nucleotidos modificados, fragmentos mas cortos o mas largos, enlaces modificados y similares. Los ejemplos de enlaces modificados o enlaces internucleotfdicos comprenden fosforotioato, fosforoditioato o similares. En un aspecto, los nucleotidos comprenden un derivado de fosforo. El derivado de fosforo (o grupo fosfato modificado) que puede unirse al resto de azucar o de analogo de azucar en los oligonucleotidos modificados de la presente divulgacion puede ser un monofosfato, difosfato, trifosfato, alquilfosfato, alcanofosfato, fosforotioato y similares. La preparacion de los analogos de fosfato indicados anteriormente, y su incorporacion en nucleotidos, nucleotidos modificados y oligonucleotidos, tambien es en si conocida y no es necesario describirla aquf.

Ya que, tal como se conoce en la tecnica, el codon de iniciacion de la traduccion normalmente es 5'-AUG (en moleculas de ARNm transcrito; 5'-ATG en la molecula de ADN correspondiente), el codon de iniciacion de la traduccion tambien se denomina el «codon AUG», el «codon de iniciacion» o el «codon de iniciacion AUG». Una

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minorfa de genes tiene un codon de iniciacion de la traduccion que tiene la secuencia de ARN 5'-GUG, 5'-UUG o 5'- CUG; y se ha demostrado que 5'-AUA, 5'-ACG y 5'-CUG funcionan in vivo. De este modo, las expresiones «codon de iniciacion de la traduccion» y «codon de iniciacion» pueden englobar muchas secuencias de codon, aun cuando el aminoacido iniciador en cada caso normalmente sea metionina (en eucariotas) o formilmetionina (en procariotas). Los genes eucariotas y procariotas pueden tener dos o mas codones de iniciacion alternativos, uno cualquiera de los cuales puede utilizarse preferiblemente para la iniciacion de la traduccion en un tipo particular de celula o tejido, o en un conjunto particular de condiciones. En el contexto de la divulgacion, «codon de iniciacion» y «codon de iniciacion de la traduccion» se refieren al codon o codones que se usan in vivo para iniciar la traduccion de un ARNm transcrito de un gen que codifica el Sustrato 2 del Receptor de Insulina (IRS2) o Factor de transcripcion E3 (TFE3), independientemente de la(s) secuencia(s) de dichos codones. Un codon de terminacion de la traduccion (o «codon de terminacion») de un gen puede tener una de tres secuencias, es decir, 5'-UAA, 5'-UAG y 5'-UGA (las secuencias de ADN correspondientes son 5'-TAA, 5'-TAG y 5'-TGA, respectivamente).

Las expresiones «region de codon de iniciacion» y «region de codon de iniciacion de la traduccion» se refieren a una parte de dicho ARNm o gen que engloba de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleotidos contiguos en cualquier direccion (es decir, 5' o 3') desde un codon de iniciacion de la traduccion. Analogamente, las expresiones «region de codon de terminacion» y «region de codon de terminacion de la traduccion» se refieren a una parte de dicho ARNm o gen que engloba de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleotidos contiguos en cualquier direccion (es decir, 5' o 3') desde un codon de terminacion de la traduccion. Por consiguiente, la «region de codon de iniciacion» (o «region de codon de iniciacion de la traduccion» y la «region de codon de terminacion» (o «region de codon de terminacion de la traduccion») son todas las regiones que pueden ser eficazmente elegidas como diana con los compuestos antisentido de la presente divulgacion.

El marco de lectura abierto (ORF, por su sigla en ingles) o «region codificante», que se conoce en la tecnica para referirse a la region entre el codon de iniciacion de la traduccion y el codon de terminacion de la traduccion, tambien es una region que puede ser eficazmente elegida como diana. Dentro del contexto de la presente divulgacion, una region elegida como diana es la region intragenica que engloba el codon de iniciacion o de terminacion de la traduccion del marco de lectura abierto (ORF) de un gen.

Otra region diana incluye la region no traducida 5' (5'UTR), conocida en la tecnica para referirse a la parte de un ARNm en la direccion 5' desde el codon de iniciacion de la traduccion, y que incluye, por lo tanto, nucleotidos entre el sitio caperuza 5' y el codon de iniciacion de la traduccion de un ARNm (o nucleotidos correspondientes en el gen). Otra region diana mas incluye la region no traducida 3' (3'UTR), conocida en la tecnica para referirse a la parte de un ARNm en la direccion 3' desde el codon de terminacion de la traduccion, y que incluye, por lo tanto, nucleotidos entre el codon de terminacion de la traduccion y el extremo 3' de un ARNm (o nucleotidos correspondientes en el gen). El sitio caperuza 5' de un ARNm comprende un residuo de guanosina N7-metilado unido al residuo mas 5' del ARNm mediante un enlace trifosfato 5'-5'. La region caperuza 5' de un ARNm se considera que incluye la propia estructura caperuza 5', ademas de los primeros 50 nucleotidos adyacentes al sitio caperuza. Otra region diana para esta divulgacion es la region caperuza 5'.

Aunque algunos transcritos de ARNm eucariotas se traducen directamente, muchos contienen una o mas regiones, conocidas como «intrones», que se escinden de un transcrito antes de que se traduzca. Las regiones restantes (y, por tanto, traducidas) se conocen como «exones» y se someten a splicing juntas para formar una secuencia de ARNm continua. En un aspecto, la eleccion como diana de sitios de splicing, es decir, empalmes intron-exon o empalmes exon-intron, es particularmente util en situaciones en las que el splicing aberrante participa en la enfermedad, o en las que una produccion en exceso de un producto de splicing particular participa en la enfermedad. Un empalme de fusion aberrante debido al reordenamiento o eliminacion es otro aspecto de un sitio diana. Los ARNm transcritos producidos mediante el proceso de splicing de dos (o mas) ARNm de diferentes fuentes de genes se conocen como «transcritos de fusion». Los intrones pueden ser eficazmente elegidos como diana usando compuestos antisentido dirigidos a, por ejemplo, ADN o pre-ARNm.

En un aspecto, los oligonucleotidos antisentido se unen a regiones codificantes y/o no codificantes de un polinucleotido diana y modulan la expresion y/o funcion de la molecula diana.

En un aspecto, los oligonucleotidos antisentido se unen a polinucleotidos antisentido naturales y modulan la expresion y/o funcion de la molecula diana.

En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos antisentido se unen a polinucleotidos sentido y modulan la expresion y/o funcion de la molecula diana.

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Pueden producirse transcritos de ARN alternatives a partir de la misma region genomica de ADN. Estos transcritos alternatives son generalmente conocidos como «variantes». Mas especfficamente, «variantes de pre-ARNm» son transcritos producidos a partir del mismo ADN genomico que se diferencian de otros transcritos producidos a partir del mismo ADN genomico en su posicion de inicio o de parada y contienen tanto secuencia intronica como exonica.

Tras la escision de una o mas regiones de exon o intron, o partes de las mismas durante el splicing, las variantes de pre-ARNm producen «variantes de ARNm» mas pequenas. Por consiguiente, las variantes de ARNm son variantes de pre-ARNm procesadas y cada variante de pre-ARNm unica siempre debe producir una variante de ARNm unica como resultado del splicing. Estas variantes de ARNm tambien se conocen como «variantes de splicing alternativas». Si no se produce splicing de la variante de pre-ARNm, entonces la variante de pre-ARNm es identica a la variante de ARNm.

Las variantes pueden producirse mediante el uso de senales alternativas para la transcripcion de inicio o de parada. Los Pre-ARNm y ARNm pueden poseer mas de un codon de iniciacion o codon de terminacion. Las variantes que se originan a partir de un pre-ARNm o ARNm que usan codones de iniciacion alternativos se conocen como «variantes de inicio alternativas» de ese pre-ARNm o ARNm. Aquellos transcritos que usan un codon de terminacion alternativo se conocen como «variantes de parada alternativas» de ese pre-ARNm o ARNm. Un tipo especffico de variante de parada alternativa es la «variante de poliA», en la que los multiples transcritos producidos resultan de la seleccion alternativa de una de las «senales de parada de poliA» por la maquinaria de transcripcion, produciendo de este modo transcritos que terminan en sitios de poliA unicos. Dentro del contexto de la divulgacion, los tipos de variantes descritos en el presente documento tambien son aspectos de acidos nucleicos diana.

Las ubicaciones en el acido nucleico diana con las que los compuestos antisentido hibridan se definen como al menos una parte de 5 nucleotidos de longitud de una region diana a la que se dirige un compuesto antisentido activo.

Aunque las secuencias especfficas de ciertos segmentos diana a modo de ejemplo se exponen en el presente documento, un experto en la materia reconocera que estas sirven para ilustrar y describir aspectos particulares dentro del alcance de la presente divulgacion. Los segmentos diana adicionales son facilmente identificables por un experto en la tecnica en vista de esta divulgacion.

Se considera que segmentos diana de 5-100 nucleotidos de longitud que comprenden un tramo de al menos cinco (5) nucleotidos consecutivos seleccionados de dentro de los segmentos diana preferidos ilustrativos tambien son adecuados para el direccionamiento.

Los segmentos diana pueden comprender secuencias de ADN o ARN que comprenden al menos los 5 nucleotidos consecutivos desde el extremo 5' de uno de los segmentos diana preferidos ilustrativos (siendo los restantes nucleotidos un tramo consecutivo del mismo ADN o ARN que empieza inmediatamente cadena arriba del extremo 5' del segmento diana y que continua hasta que el ADN o ARN contenga de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 nucleotidos). Los segmentos diana similarmente preferidos se representan por secuencias de ADN o ARN que comprenden al menos los 5 nucleotidos consecutivos desde el extremo 3 de uno de los segmentos diana preferidos ilustrativos (siendo los restantes nucleotidos un tramo consecutivo del mismo ADN o ARN que empieza inmediatamente cadena abajo del extremo 3 del segmento diana y que continua hasta que el ADN o ARN contenga de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 nucleotidos). Un experto en la tecnica armado con los segmentos diana ilustrados en el presente documento sera capaz, sin excesiva experimentacion, de identificar segmentos diana preferidos adicionales.

Una vez se han identificado una o mas regiones, segmentos o sitios diana, se eligen compuestos antisentido que son suficientemente complementarios a la diana, es decir, hibridan suficientemente bien y con suficiente especificidad, para proporcionar el efecto deseado.

En aspectos de la divulgacion, los oligonucleotidos tienen al menos 5 nucleotidos de longitud y pueden sintetizarse de manera que cada oligonucleotido se dirija a secuencias solapantes de forma que los oligonucleotidos se sinteticen para cubrir toda la longitud del polinucleotido diana. Las dianas tambien incluyen regiones codificantes, ademas de no codificantes.

En un aspecto, se prefiere dirigirse a acidos nucleicos especfficos por oligonucleotidos antisentido. El direccionamiento de un compuesto antisentido a un acido nucleico particular es un proceso multietapa. El proceso normalmente empieza con la identificacion de una secuencia de acido nucleico cuya funcion va a modularse. Esta puede ser, por ejemplo, un gen celular (o ARNm transcrito a partir del gen) cuya expresion esta asociada a un

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trastorno o patologfa particular, o un polinucleotido no codificante tal como, por ejemplo, ARN no codificante (ARNnc).

Los ARN pueden clasificarse en (1) ARN mensajeros (ARNm), que se traducen en protefnas, y (2) ARN no codificantes de protefna (ARNnc). Los ARNnc comprenden microARN, transcritos antisentido y otras unidades transcripcionales (TU) que contienen una alta densidad de codones de terminacion y que carecen de cualquier amplio «marco de lectura abierto». Muchos ARNnc parecen empezar a partir de sitios de iniciacion en regiones no traducidas 3' (3'UTRs) de loci codificantes de protefnas. Los ARNnc son frecuentemente raros y al menos la mitad de los ARNnc que se han secuenciado por el consorcio FANTOM no parecen estar poliadenilados. La mayorfa de los investigadores se han basado, por motivos obvios, en ARNm poliadenilados que se procesan y se exportan al citoplasma. Recientemente, se demostro que el conjunto de aRn nucleares no poliadenilados puede ser muy grande, y que muchos de dichos transcritos surgen de las llamadas regiones alergenicas. El mecanismo por el que los ARNnc pueden regular la expresion genica es por apareamiento de bases con transcritos diana. Los ARN que funcionan por apareamiento de bases pueden agruparse en (1) ARN codificados en cis que estan codificados en la misma ubicacion genetica, pero en la cadena opuesta a los ARN en los que actuan y, por lo tanto, muestran complementariedad perfecta con su diana, y (2) ARN codificados en trans que estan codificados en una ubicacion cromosomica distinta de los ARN en los que actuan y generalmente no presentan potencial de apareamiento de bases perfecto con sus dianas.

Sin desear cenirse a ninguna teorfa, la perturbacion de un polinucleotido antisentido por los oligonucleotidos antisentido descritos en el presente documento puede alterar la expresion de los ARN mensajeros sentido correspondientes. Sin embargo, esta regulacion puede tanto ser discordante (la inactivacion antisentido produce elevacion de ARN mensajero) como concordante (la inactivacion antisentido produce reduccion concomitante de ARN mensajero). En estos casos, los oligonucleotidos antisentido pueden ser dirigidos a partes solapantes o no solapantes del transcrito antisentido que producen su inactivacion o secuestro. El antisentido codificante, asf como no codificante, puede ser dirigido de una manera identica y esa categorfa es capaz de regular los transcritos sentido correspondientes - tanto de una manera concordante como discordante. Las estrategias que se emplean en identificar nuevos oligonucleotidos para su uso contra una diana pueden basarse en la inactivacion de transcritos de ARN antisentido por oligonucleotidos antisentido o cualquier otro medio de modulacion de la diana deseada.

Estrategia 1: En el caso de regulacion discordante, la inactivacion del transcrito antisentido eleva la expresion del gen convencional (sentido). Si el ultimo gen debe codificar un farmaco diana conocido o supuesto, entonces la inactivacion de su homologo antisentido podrfa imitar posiblemente la accion de un agonista receptor o una enzima estimulante.

Estrategia 2: En el caso de regulacion concordante, podrfan inactivarse de forma concomitante tanto los transcritos antisentido como sentido y asf lograr una reduccion sinergica de la expresion genica (sentido) convencional. Si, por ejemplo, un oligonucleotido antisentido se usa para lograr la inactivacion, entonces esta estrategia puede usarse para aplicar un oligonucleotido antisentido dirigido al transcrito sentido y otro oligonucleotido antisentido al transcrito antisentido correspondiente, o un unico oligonucleotido antisentido energeticamente simetrico que se dirige simultaneamente a transcritos sentido y antisentido solapantes.

De acuerdo con la presente divulgacion, los compuestos antisentido incluyen oligonucleotidos antisentido, ribozimas, oligonucleotidos de secuencia de gufa externa (EGS), compuestos de siRNA, compuestos de ARN de interferencia (ARNi) mono- o bicatenario tales como compuestos de siRNA, y otros compuestos oligomericos que hibridan con al menos una parte del acido nucleico diana y modulan su funcion. Por lo tanto, pueden ser ADN, ARN, similares a ADN, similares a ARN, o mezclas de estos, o pueden ser mimeticos de uno o mas de estos. Estos compuestos pueden ser compuestos oligomericos monocatenarios, bicatenarios, circulares o de horquilla y pueden contener elementos estructurales tales como protuberancias internas o terminales, desapareamientos o bucles. Los compuestos antisentido se preparan de forma rutinaria linealmente, pero pueden unirse o prepararse de otro modo para ser circulares y/o ramificados. Los compuestos antisentido pueden comprender constructos tales como, por ejemplo, dos cadenas hibridadas para formar un compuesto completa o parcialmente bicatenario o una unica cadena con auto-complementariedad suficiente para permitir la hibridacion y formacion de un compuesto completa o parcialmente bicatenario. Las dos cadenas pueden enlazarse internamente, dejando los extremos 3' o 5' libres o pueden enlazarse para formar una estructura de horquilla continua o bucle. La estructura de horquilla puede contener un nucleotido protuberante en cualquiera de los extremos 5' o 3' que produce una extension del caracter monocatenario. Los compuestos bicatenarios opcionalmente pueden comprender nucleotidos protuberantes en los extremos. Las modificaciones adicionales pueden comprender grupos conjugados unidos a uno de los extremos, posiciones de nucleotido seleccionadas, posiciones de azucar, o a uno de los enlaces internucleosfdicos. Como alternativa, las dos cadenas pueden enlazarse mediante un resto no de acido nucleico o grupo enlazador. Cuando

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se forma a partir de solo una cadena, el dsARN puede adoptar la forma de una molecula tipo horquilla auto- complementaria que se dobla sobre sf misma para formar un duplex. De este modo, el dsARN puede ser completa o parcialmente bicatenario. Puede lograrse modulacion espedfica de la expresion genica por expresion estable de horquillas de dsARN en lmeas celulares transgenicas, sin embargo, en algunos casos, la expresion o funcion genica esta regulada positivamente. Cuando se forma a partir de dos cadenas, o una unica cadena que adopta la forma de una molecula de tipo horquilla auto-complementaria que se dobla sobre sf misma para formar un duplex, las dos cadenas (o regiones formadoras de duplex de una sola cadena) son cadenas de ARN complementarias que se aparean con bases en el modo de Watson-Crick.

Una vez introducidos en un sistema, los compuestos de la divulgacion pueden provocar la accion de una o mas enzimas o protemas estructurales para realizar la escision u otra modificacion del acido nucleico diana o pueden funcionar a traves de mecanismos basados en la ocupacion. En general, los acidos nucleicos (que incluyen oligonucleotidos) pueden describirse como «de tipo ADN» (es decir, que generalmente tienen uno o mas 2'-desoxi- azucares y, generalmente, bases T en lugar de bases U) o «de tipo ARN» (es decir, que generalmente tienen uno o mas 2'-hidroxilo o azucares modificados en 2' y, en general, bases U en lugar de bases T). Las helices de acido nucleico pueden adoptar mas de un tipo de estructura, mas comunmente las formas A y B. Se cree que, en general, los oligonucleotidos que tienen estructura similar a la forma B son «similares a ADN» y aquellos que tienen estructura similar a la forma A son «similares a ARN». En algunos aspectos (quimericos), un compuesto antisentido puede contener tanto regiones en forma A como B.

En un aspecto, los oligonucleotidos o compuestos antisentido deseados comprenden al menos un ARN antisentido, ADN antisentido, oligonucleotidos antisentido quimericos, oligonucleotidos antisentido que comprenden enlaces modificados, ARN de interferencia (ARNi), ARN pequeno de interferencia (siRNA); un micro ARN de interferencia (miARN); un ARN temporal pequeno (ARNtp); o un ARN de horquilla corta (ARNhc); activacion genica inducida por ARN pequeno (ARNa); ARN activantes pequenos (ARNap), o combinaciones de estos.

Los dsARN tambien pueden activar la expresion genica, un mecanismo que se ha llamado «activacion genica inducida por ARN pequeno» o ARNa. Los promotores genicos que se dirigen a dsARN inducen la potente activacion transcripcional de genes asociados. El ARNa se demostro en celulas humanas usando dsARN sinteticos, llamados «ARN activantes pequenos» (ARNap). No se sabe actualmente si el ARNa se conserva en otros organismos.

Se ha descubierto que el ARN bicatenario pequeno (dsARN), tal como ARN pequeno de interferencia (siRNA) y micro ARN (miARN), es el desencadenante de un mecanismo evolutivamente conservado conocido como ARN de interferencia (ARNi). El ARNi conduce invariablemente al silenciamiento genico mediante la remodelacion de cromatina para suprimir de este modo la transcripcion, degradando el ARNm complementario, o bloqueando la traduccion de protemas. Sin embargo, en los aspectos descritos en detalle en la seccion de ejemplos a continuacion, se muestra que los oligonucleotidos aumentan la expresion y/o funcion de los polinucleotidos del Sustrato 2 del Receptor de Insulina (IRS2) y productos codificados de los mismos. Los dsARN tambien pueden actuar como ARN activantes pequenos (ARNap). Sin animo de cenirse a ninguna teona, direccionando secuencias a promotores genicos, los ARNap inducinan la expresion de genes diana en un fenomeno denominado activacion transcripcional inducida por dsARN (ARNa).

En un aspecto adicional, los «segmentos diana preferidos» identificados en el presente documento pueden emplearse en un cribado para compuestos adicionales que modulan la expresion del Sustrato 2 del Receptor de Insulina (IRS2) o polinucleotidos de Factor de transcripcion E3 (TFE3). Los «moduladores» son aquellos compuestos que disminuyen o aumentan la expresion de una molecula de acido nucleico que codifica el IRS2 y que comprenden al menos una parte de 5 nucleotidos que es complementaria a un segmento diana preferido. El procedimiento de cribado comprende las etapas de poner en contacto un segmento diana preferido de una molecula de acido nucleico que codifica polinucleotidos sentido o antisentido naturales del IRS2 o TFE3 con uno o mas moduladores candidatos, y seleccionar uno o mas moduladores candidatos que disminuyen o aumentan la expresion de una molecula de acido nucleico que codifica polinucleotidos del TRS2, p. ej., las SEQ ID NO 4 a 9: Una vez que se demuestra que el modulador o moduladores candidatos son capaces de modular (por ejemplo, tanto disminuir como aumentar) la expresion de una molecula de acido nucleico que codifica polinucleotidos del TRS2, el modulador puede entonces emplearse en estudios de investigacion adicionales de la funcion de polinucleotidos del IRS2 o para su uso como un agente de investigacion, diagnostico o terapeutico de acuerdo con la presente divulgacion.

Direccionar la secuencia antisentido natural preferentemente modula la funcion del gen diana. Por ejemplo, el gen TRS2 (p.ej. numero de acceso NM003749). En un aspecto, la diana es un polinucleotido antisentido del gen tRS2 o TFE3. En un aspecto, un oligonucleotido antisentido se dirige a secuencias sentido y/o antisentido naturales de polinucleotidos de polinucleotidos del IRS2 o TFE3 (p. ej. numero de acceso NM_003749), variantes, alelos,

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isoformas, homologos, mutantes, derivados, fragmentos y secuencias complementarias correspondientes. Preferentemente, el oligonucleotido es una molecula antisentido y las dianas incluyen regiones codificantes y no codificantes de polinucleotidos antisentido y/o sentido del IRS2 o TFE3.

Los segmentos diana preferidos de la presente divulgacion tambien pueden combinarse con sus compuestos antisentido complementarios respectivos de la presente divulgacion para formar oligonucleotidos (duplexados) bicatenarios estabilizados.

Se ha demostrado en la materia que dichos restos de oligonucleotido bicatenario modulan la expresion de la diana y regulan la traduccion, ademas del procesamiento de ARN mediante un mecanismo antisentido. Ademas, los restos bicatenarios pueden estar sujetos a modificaciones qufmicas. Por ejemplo, se ha demostrado que dichos restos bicatenarios inhiben la diana por la hibridacion clasica de la cadena antisentido del duplex con la diana, produciendo de este modo la degradacion enzimatica de la diana.

En un aspecto, un oligonucleotido antisentido se dirige a polinucleotidos del Sustrato 2 del Receptor de Insulina (IRS2) (p. ej., numero de acceso NM_003749), variantes, alelos, isoformas, homologos, mutantes, derivados, fragmentos y secuencias complementarias correspondientes. Preferentemente, el oligonucleotido es una molecula antisentido.

De acuerdo con aspectos de la divulgacion, la molecula de acido nucleico diana no se limita al Sustrato 2 del Receptor de Insulina (IRS2) y al Factor de transcripcion E3 (TFE3) solamente, sino que se extiende a cualquiera de las isoformas, receptores, homologos y similares de las moleculas del IRS2 y TFE3.

En un aspecto, un oligonucleotido se dirige a una secuencia antisentido natural de polinucleotidos del IRS2 o TFE3, por ejemplo, los polinucleotidos expuestos como SEQ ID NO: 2 y 3, y cualquier variante, alelo, homologo, mutante, derivado, fragmento y secuencia complementaria correspondiente. Se exponen ejemplos de oligonucleotidos antisentido como las SEQ ID NO: 4 a 9.

En un aspecto, los oligonucleotidos son complementarios o se unen a secuencias de acidos nucleicos del IRS2 o TFP3 antisentido, incluyendo, sin limitacion, secuencias sentido y/o antisentido no codificantes asociadas con polinucleotidos del IRS2 o TFE3 y modulan la expresion y/o funcion de moleculas del IRS2.

En un aspecto, los oligonucleotidos son complementarios o se unen a secuencias de acidos nucleicos del antisentido natural del IRS2 o TFE3, expuestas como SEQ ID NO: 2 y 3, y modulan la expresion y/o funcion de moleculas del IRS2.

En un aspecto, los oligonucleotidos comprenden secuencias de al menos 5 nucleotidos consecutivos de las SEQ ID NO: 4 a 9 y modulan la expresion y/o funcion de moleculas del IRS2.

Las dianas de polinucleotido comprenden el IRS2 y el TFE3, que incluyen miembros de la familia de estos, variantes del IRS2 y TFE3, mutantes del IRS2 y TFE3, que incluyen SNP; secuencias no codificantes del IRS2 y TFE3; alelos del IRS2 y TFE3; alelos del IRS2 y TFE3; variantes de especies, fragmentos y similares. Preferentemente, el oligonucleotido es una molecula antisentido.

En un aspecto, el oligonucleotido que se dirige a polinucleotidos del IRS2 o TFE3 comprende: ARN antisentido, ARN de interferencia (ARNi), ARN pequeno de interferencia (siRNA); micro ARN de interferencia (miARN); un ARN temporal pequeno (ARNtp); o un ARN de horquilla corta (ARNhc); activacion genica inducida por ARN pequeno (ARNa); o aRn activante pequeno (ARNap).

En un aspecto, el direccionamiento de los polinucleotidos del IRS2 o TFE3, p. ej., las SEQ ID NO: 2 y 3, modula la expresion o funcion de estas dianas. En un aspecto, la expresion o funcion esta regulada positivamente en comparacion con un control. En un aspecto, la expresion o funcion esta regulada negativamente en comparacion con un control.

En un aspecto, los compuestos antisentido comprenden secuencias expuestas como las SEQ ID NO: 4 a 9. Estos oligonucleotidos pueden comprender uno o mas nucleotidos modificados, fragmentos mas cortos o mas largos, enlaces modificados y similares.

En un aspecto, las SEQ ID NO: 4 a 9 comprenden uno o mas nucleotidos de LNA.

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La modulacion de un acido nucleico diana deseado puede realizarse de varias maneras conocidas en la tecnica, por ejemplo, los oligonucleotidos antisentido, siRNA, etc. Las moleculas de acidos nucleicos enzimaticos (por ejemplo, ribozimas) son moleculas de acidos nucleicos capaces de catalizar una o mas de diversas reacciones, que incluyen la capacidad para escindir repetidamente otras moleculas de acidos nucleicos separadas en un modo especffico de secuencia de bases de nucleotidos. Dichas moleculas de acidos nucleicos enzimaticos pueden usarse, por ejemplo, para dirigirse practicamente a cualquier transcrito de ARN.

Debido a su especificidad de secuencia, las moleculas de acidos nucleicos enzimaticos que se escinden en trans muestran promesa como agentes terapeuticos para enfermedad humana (Usman & McSwiggen, (1995) Ann. Rep. Mod. Chem. 30, 285-294;Christoffersen & Marr, (1995) J. Med. Chem. 38, 2023-2037). Las moleculas de acidos nucleicos enzimaticos pueden disenarse para escindir dianas de ARN especfficas dentro del fondo del ARN celular. Un acontecimiento de escision de este tipo convierte al ARNm en no funcional y anula la expresion de protefnas de ese ARN. De este modo puede inhibirse selectivamente la sfntesis de una protefna asociada a una patologfa.

En general, los acidos nucleicos enzimaticos con actividad de escision de ARN actuan uniendose primero a un ARN diana. Dicha union se produce a traves de la parte de union diana de un acido nucleico enzimatico que se mantiene en estrecha proximidad a una parte enzimatica de la molecula que actua para escindir el ARN diana. De este modo, el acido nucleico enzimatico se reconoce primero y a continuacion se une a un ARN diana mediante apareamiento de bases complementario, y una vez se une al sitio correcto, actua enzimaticamente para cortar el ARN diana. La escision estrategica de dicho ARN diana destruira su capacidad para dirigir la sfntesis de una protefna codificada. Despues de unirse un acido nucleico enzimatico y escindir su aRn diana, se libera de ese ARN para buscar otra diana y puede unirse repetidamente y escindir nuevas dianas.

Se han usado varias estrategias como la seleccion in vitro (evolucion) (Orgel, (1979) Proc. R. Soc. Londres, B 205, 435) para desarrollar nuevos catalizadores de acido nucleico capaces de catalizar diversas reacciones, tales como escision y ligacion de enlaces fosfodiester y enlaces amida.

El desarrollo de ribozimas que son optimas para la actividad catalftica contribuirfa significativamente a cualquier estrategia que empleara ribozimas que escinden ARN con el fin de regular la expresion genica. La ribozima de cabeza de martillo, por ejemplo, funciona con una velocidad catalftica (kcat) de aproximadamente 1 min-1 en presencia de concentraciones saturantes (10 mM) de cofactor Mg2+. Se ha demostrado que una ribozima de «ligasa de ARN» artificial cataliza la reaccion de auto-modificacion correspondiente con una velocidad de aproximadamente 100 min-1. Ademas, se sabe que ciertas ribozimas de cabeza de martillo modificadas que tienen brazos de union al sustrato hechos de ADN catalizan la escision de ARN con multiples velocidades de recuperacion que se aproximan a 100 min-1. Finalmente, la sustitucion de un resto especffico dentro del nucleo catalftico de la cabeza de martillo con ciertos analogos de nucleotido produce ribozimas modificadas que muestran una mejora de hasta 10 veces en la velocidad catalftica. Estos descubrimientos demuestran que las ribozimas pueden promover transformaciones qufmicas con velocidades catalfticas que son significativamente superiores a aquellas mostradas in vitro por la mayorfa de las ribozimas naturales que se auto-escinden. Entonces es posible que las estructuras de ciertas ribozimas que se auto-escinden puedan optimizarse para producir la maxima actividad catalftica, o que puedan prepararse motivos de ARN completamente nuevos que muestran velocidades significativamente mas rapidas para la escision de fosfodiester de ARN.

La escision intermolecular de un sustrato de ARN por un catalizador de ARN que se ajusta al modelo de «cabeza de martillo» se demostro por primera vez en 1987 (Uhlenbeck, O. C. (1987) Nature, 328: 596-600). Se recupero el catalizador de ARN y se hizo reaccionar con multiples moleculas de ARN, demostrando que era verdaderamente catalftico.

Los ARN catalfticos disenados basados en el motivo «cabeza de martillo» han sido utilizados para escindir secuencias diana especfficas haciendo cambios de base apropiados en el ARN catalftico para mantener la base necesaria en el apareamiento con las secuencias diana. Esto ha permitido el uso del ARN catalftico para escindir secuencias diana especfficas e indica que los ARN catalfticos disenados de acuerdo con el modelo de «cabeza de martillo» pueden escindir posiblemente ARN de sustrato especffico in vivo.

El ARN de interferencia (ARNi) se ha convertido en una poderosa herramienta para modular la expresion genica en mamfferos y celulas de mamffero. Este enfoque requiere la administracion de aRn pequeno de interferencia (siRNA) bien como el propio ARN o bien como ADN, usando un plasmido de expresion o virus y la secuencia codificante para ARN de horquilla pequena que se procesan a siRNA. Este sistema permite el transporte eficaz de los pre-siRNA al citoplasma en el que son activos y permiten el uso de promotores regulados y especfficos de tejido para la expresion genica.

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En un aspecto, un oligonucleotido o compuesto antisentido comprende un oligomero o polfmero de acido ribonucleico (ARN) y/o acido desoxirribonucleico (ADN), o un mimetico, quimera, analogo u homologo del mismo. Este termino incluye oligonucleotidos compuestos por nucleotidos de origen natural, azucares y enlaces internucleosfdicos covalentes (cadena principal), asf como oligonucleotidos que tienen porciones no de origen natural que funcionan de manera similar. Dichos oligonucleotidos modificados o sustituidos son frecuentemente deseados con respecto a formas nativas debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, captacion celular potenciada, afinidad potenciada por un acido nucleico diana y elevada estabilidad en presencia de nucleasas.

De acuerdo con la presente divulgacion, los oligonucleotidos o «compuestos antisentido» incluyen oligonucleotidos antisentido (p. ej., ARN, ADN, mimetico, quimera, analogo u homologo de los mismos), ribozimas, oligonucleotidos de secuencia de gufa externa (EGS), compuestos de siRNA, compuestos de ARN de interferencia (ARNi) mono- o bicatenarios tales como compuestos de siRNA, ARNap, ARNa, y otros compuestos oligomericos que hibridan con al menos una parte del acido nucleico diana y modulan su funcion. Por lo tanto, pueden ser ADN, ARN, similares a ADN, similares a ARN, o mezclas de estos, o pueden ser mimeticos de uno o mas de estos. Estos compuestos pueden ser compuestos oligomericos monocatenarios, bicatenarios, circulares o de horquilla y pueden contener elementos estructurales tales como protuberancias internas o terminales, desapareamientos o bucles. Los compuestos antisentido se preparan de forma rutinaria linealmente, pero pueden unirse o prepararse de otro modo para ser circulares y/o ramificados. Los compuestos antisentido pueden comprender constructos tales como, por ejemplo, dos cadenas hibridadas para formar un compuesto completa o parcialmente bicatenario o una unica cadena con auto-complementariedad suficiente para permitir la hibridacion y formacion de un compuesto completa o parcialmente bicatenario. Las dos cadenas pueden enlazarse internamente, dejando los extremos 3' o 5' libres o pueden enlazarse para formar una estructura de horquilla continua o bucle. La estructura de horquilla puede contener un nucleotido protuberante en cualquiera de los extremos 5' o 3' que produce una extension del caracter monocatenario. Los compuestos bicatenarios opcionalmente pueden comprender nucleotidos protuberantes en los extremos. Modificaciones adicionales pueden comprender grupos conjugados unidos a uno de los extremos, posiciones de nucleotido seleccionadas, posiciones de azucar o a uno de los enlaces internucleosfdicos. Como alternativa, las dos cadenas pueden enlazarse mediante un resto no de acido nucleico o grupo enlazador. Cuando se forma a partir de solo una cadena, el dsARN puede adoptar la forma de una molecula tipo horquilla auto- complementaria que se dobla sobre si misma para formar un duplex. De este modo, el dsARN puede ser completa o parcialmente bicatenario. Puede lograrse modulacion especffica de la expresion genica por expresion estable de horquillas de dsARN en lfneas celulares transgenicas. Cuando se forma a partir de dos cadenas, o una unica cadena que adopta la forma de una molecula de tipo horquilla auto-complementaria que se dobla sobre si misma para formar un duplex, las dos cadenas (o regiones formadoras de duplex de una sola cadena) son cadenas de ARN complementarias que se aparean con bases en el modo de Watson-Crick.

Una vez introducidos en un sistema, los compuestos de la divulgacion pueden provocar la accion de una o mas enzimas o protefnas estructurales para efectuar la escision u otra modificacion del acido nucleico diana o pueden trabajar mediante mecanismos basados en la ocupacion. En general, los acidos nucleicos (incluyendo oligonucleotidos) pueden describirse como «similares a ADN» (es decir, que generalmente tienen uno o mas 2'- desoxiazucares y, generalmente, bases T en vez de U) o «similares a ARN» (es decir, que generalmente tienen uno o mas 2'-hidroxilo o azucares modificados en 2' y, generalmente bases U en vez de T). Las helices de acido nucleico pueden adoptar mas de un tipo de estructura, mas comunmente las formas A y B. Se cree que, en general, los oligonucleotidos que tienen estructura similar a la forma B son «similares a ADN» y aquellos que tienen estructura similar a la forma A son «similares a ARN». En algunos aspectos (quimericos), un compuesto antisentido puede contener tanto regiones de forma A como B.

Los compuestos antisentido de acuerdo con esta divulgacion pueden comprender una parte antisentido de aproximadamente 5 a aproximadamente 80 nucleotidos (es decir, de aproximadamente 5 a aproximadamente 80 nucleosidos enlazados) de longitud. Esto se refiere a la longitud de la cadena antisentido o parte del compuesto antisentido. En otras palabras, un compuesto antisentido monocatenario de la divulgacion comprende de 5 a aproximadamente 80 nucleotidos, y un compuesto antisentido bicatenario de la divulgacion (tal como un dsARN, por ejemplo) comprende una cadena sentido y una antisentido o parte de 5 a aproximadamente 80 nucleotidos de

longitud. Un experto habitual en la tecnica apreciara que esta comprenda partes antisentido de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,

12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42,

43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73,

74, 75, 76, 77, 78, 79, u 80 nucleotidos de longitud, o cualquier intervalo entre estos.

En un aspecto, los compuestos antisentido de la divulgacion tienen partes antisentido de 10 a 50 nucleotidos de longitud. Un experto habitual en la tecnica apreciara que estos integran oligonucleotidos que tienen partes

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En un aspecto, los compuestos antisentido o de oligonucleotido de la divulgacion tienen partes antisentido de 12 o 13 a 30 nucleotidos de longitud. Un experto en la tecnica apreciara que estos integran compuestos antisentido que tienen partes antisentido de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleotidos de longitud, o cualquier intervalo entremedias.

En un aspecto, los compuestos oligomericos de la presente divulgacion tambien incluyen variantes en las cuales una base diferente esta presente en una o mas de las posiciones de nucleotido en el compuesto. Por ejemplo, si el primer nucleotido es una adenosina, pueden producirse variantes que contienen timidina, guanosina o citidina en esta posicion. Esto puede hacerse en cualquiera de las posiciones de los compuestos antisentido o de dsARN. Estos compuestos se ensayan entonces usando los procedimientos descritos en el presente documento para determinar su capacidad para inhibir la expresion de un acido nucleico diana.

En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencias o complementariedad entre el compuesto antisentido y la diana es de aproximadamente el 40 % a aproximadamente el 60 %. En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 60 % a aproximadamente el 70 %. En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 70 % a aproximadamente el 80 %. En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 80 % a aproximadamente el 90 %. En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 94 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 %.

En un aspecto, los oligonucleotidos antisentido, como, por ejemplo, las moleculas de acidos nucleicos expuestas en las SEQ ID NO: 2 a 9 comprenden una o mas sustituciones o modificaciones. En un aspecto, los nucleotidos estan sustituidos por acidos nucleicos bloqueados (LNA).

En un aspecto, los oligonucleotidos se dirigen a una o mas regiones de las moleculas de acido nucleico sentido y/o antisentido de secuencias codificantes y/o no codificantes asociadas al IRS2 o TFE3 y las secuencias expuestas como SEQ ID NO: 1 a 3. Los oligonucleotidos tambien se dirigen a regiones solapantes de las SEQ ID NO: 1 a 3.

Ciertos oligonucleotidos preferidos de esta divulgacion son oligonucleotidos quimericos. «Oligonucleotidos quimericos» o «quimeras», en el contexto de esta divulgacion, son oligonucleotidos que contienen dos o mas regiones qufmicamente distintas, cada una constituida por al menos un nucleotido. Estos oligonucleotidos normalmente contienen al menos una region de nucleotidos modificados que confiere una o mas propiedades beneficiosas (tales como, por ejemplo, resistencia a nucleasas incrementada, captacion en celulas incrementada, afinidad de union por la diana incrementada) y una region que es un sustrato para enzimas capaces de escindir hfbridos ARN:ADN o ARN:ARN. A modo de ejemplo, la ARNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de un duplex ARN:ADN. La activacion de RNasa H, por lo tanto, produce la escision de la diana de ARN, potenciando asf enormemente la eficiencia de la modulacion antisentido de la expresion genica. Por consiguiente, frecuentemente pueden obtenerse resultados comparables con oligonucleotidos mas cortos cuando se usan oligonucleotidos quimericos, en comparacion con desoxioligonucleotidos de fosforotioato que hibridan con la misma region diana. La escision de la diana de ARN puede ser detectada de manera rutinaria mediante electroforesis y, si es necesario, tecnicas de hibridacion de acido nucleico asociadas conocidas en la tecnica. En un aspecto, un oligonucleotido quimerico comprende al menos una region modificada para aumentar la afinidad de union de la diana, y, normalmente, una region que actua como sustrato para RNasa H. La afinidad de un oligonucleotido por su diana (en este caso, un acido nucleico que codifica ras) se determina rutinariamente midiendo la Tm de un par de oligonucleotido/diana, que es la temperatura a la que se disocian el oligonucleotido y la diana; la disociacion se detecta por espectrofotometrfa. Cuanto mayor sea la Tm, mayor sera la afinidad del oligonucleotido por la diana.

Se pueden formar compuestos antisentido quimericos de la divulgacion como estructuras compuestas de dos o mas oligonucleotidos, oligonucleotidos modificados, oligonucleosidos y/o mimeticos de oligonucleotidos, tal como se ha descrito anteriormente. Como tales, estos compuestos tambien se han referido en la tecnica como hfbridos o gapmeros. Las patentes representativas de Estados Unidos que ensenan la preparacion de estas estructuras hfbridas comprenden, pero no se limitan a, las patentes de Estados Unidos N.° 5.013.830;5.149.797;5. 220.007;5.256.775;5.366.878;5.403.711;5.491.133;5.565.350;5.623.065;5.652.355;5.652.356; y5.700.922.

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En un aspecto, la region del oligonucleotido que se modifica comprende al menos un nucleotido modificado en la posicion 2' del azucar, de la forma mas preferente un nucleotido modificado con 2'-O-alquilo, 2'-O-alquil-O-alquilo o 2'-fluor. En otro aspecto, las modificaciones de ARN incluyen modificaciones de 2'-fluor, 2'-amino y 2'-O-metilo en la ribosa de pirimidinas, residuos abasicos o una base invertida en el extremo 3' del ARN. Dichas modificaciones se incorporan rutinariamente en oligonucleotidos y se ha demostrado que estos oligonucleotidos tienen una mayor Tm (es decir, mayor afinidad de union a diana) que los 2'-desoxioligonucleotidos contra una diana dada. El efecto de dicha afinidad incrementada es potenciar enormemente la inhibicion por oligonucleotidos de ARNi de la expresion genica. La RNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de los duplex ARN:ADN; por lo tanto, la activacion de esta enzima produce la escision del ARN diana, y de este modo puede potenciar enormemente la eficiencia de inhibicion del ARNi. La escision del ARN diana puede demostrarse rutinariamente por electroforesis en gel. En un aspecto, el oligonucleotido quimerico tambien se modifica para potenciar la resistencia a nucleasas. Las celulas contienen diversas exo- y endo-nucleasas que pueden degradar acidos nucleicos. Se ha demostrado que varias modificaciones de nucleotidos y nucleosidos hacen que el oligonucleotido en el que se incorporan sea mas resistente a la digestion por nucleasa que el oligodesoxinucleotido nativo. La resistencia a nucleasas se mide rutinariamente incubando oligonucleotidos con extractos celulares o soluciones de nucleasa aisladas y midiendo el grado de oligonucleotido intacto que queda con el tiempo, normalmente por electroforesis en gel. Los oligonucleotidos que se han modificado para potenciar su resistencia a nucleasas sobreviven intactos durante mas tiempo que los oligonucleotidos sin modificar. Se ha demostrado que diversas modificaciones de oligonucleotidos potencian o confieren resistencia a nucleasas. Los oligonucleotidos que contienen al menos una modificacion de fosforotioato son actualmente mas preferidos. En algunos casos, las modificaciones de oligonucleotidos que potencian la afinidad de union a diana son, tambien, independientemente, capaces de potenciar la resistencia a nucleasas.

Ejemplos especfficos de algunos oligonucleotidos preferidos concebidos para esta divulgacion incluyen aquellos que comprenden cadenas principales modificadas, por ejemplo, fosforotioatos, fosfotriesteres, metilfosfonatos, enlaces entre azucares de alquilo o cicloalquilo de cadena corta o enlaces entre azucares heteroatomicos o heterocfclicos de cadena corta. Los mas preferidos son oligonucleotidos con cadenas principales de fosforotioato y aquellos con cadenas principales de heteroatomo, particularmente cadenas principales de CH2--NH--O-CH2, cH,--N(CH3)--O-- CH2 [conocida como cadena principal de metilen(metilimino) o MMI], CH2 -O--N (CH3)--CH2, CH2--N (CH3)--N (CH3)--CH2 y O--N (CH3)--CH2 --CH2, donde la cadena principal de fosfodiester nativo se representa como O--P-- O--CH,). Las cadenas principales de amida divulgadas por De Mesmaeker et al. (1995) Acc. Chem. Res. 28:366- 374tambien se prefieren. Tambien se prefieren oligonucleotidos que tienen cadenas principales de morfolino (Summerton & Weller, patente de Estados Unidos N.° 5.034.506). En otro aspecto, tal como la cadena principal de acido nucleico peptfdico (PNA), la cadena principal de fosfodiester del oligonucleotido se sustituye por una cadena principal de poliamida, estando los nucleotidos unidos directamente o indirectamente a los atomos de nitrogeno aza de la cadena principal de poliamida. Los oligonucleotidos tambien pueden comprender uno o mas restos de azucar sustituidos. Los oligonucleotidos preferidos comprenden uno de los siguientes en la posicion 2': OH, SH, SCH3, F, OCN, OCH3 OCH3, OCH3 O(CH2)n CH3, O(CH2)n NH2 o O(CH2)n CH3 en los que n es de 1 a aproximadamente 10; alquilo C1 a C10 inferior, alcoxialcoxi, alquilo, alcarilo o aralquilo inferior sustituido; CI; Br; CN; CF3; OCF3; O--, S--, o N-alquilo; O--, S--, o N-alquenilo; SOCH3; SO2 CH3; ONO2; NO2; N3; NH2; heterocicloalquilo; heterocicloalcarilo; aminoalquilamino; polialquilamino; sililo sustituido; un grupo de escision de ARN; un grupo reportero; un intercalador; un grupo para mejorar las propiedades farmacocineticas de un oligonucleotido; o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinamicas de un oligonucleotido y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Una modificacion preferida incluye 2'-metoxietoxi [2'-O-CH2 CH2 OCH3, tambien conocido como 2'-O-(2- metoxietilo)]. Otras modificaciones preferidas incluyen 2'-metoxi (2'-O--CH3), 2'-propoxi(2'-OCH2 CH2CH3) y 2'-fluor (2'-F). Tambien pueden hacerse modificaciones similares en otras posiciones sobre el oligonucleotido, particularmente la posicion 3' del azucar en el nucleotido del extremo 3' y la posicion 5' del nucleotido del extremo 5'. Los oligonucleotidos tambien pueden tener mimeticos de azucar tales como ciclobutilos en lugar del grupo pentofuranosilo.

Los oligonucleotidos tambien pueden comprender, adicionalmente o como alternativa, modificaciones o sustituciones de nucleobases (frecuentemente denominadas en la tecnica simplemente «base»). Tal como se usa en el presente documento, nucleotidos «no modificados» o «naturales» incluyen adenina (A), guanina (G), timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Los nucleotidos modificados incluyen nucleotidos encontrados solo poco frecuentemente o transitoriamente en acidos nucleicos naturales, por ejemplo, hipoxantina, 6-metiladenina, 5-Me-pirimidinas, particularmente 5-metilcitosina (tambien denominada 5-metil-2'-desoxicitosina y frecuentemente denominada en la tecnica 5-Me-C), 5-hidroximetilcitosina (HMC), glicosil HMC y gentobiosil HMC, ademas de nucleotidos sinteticos, por ejemplo, 2-aminoadenina, 2-(metilamino)adenina, 2-(imidazolilalquil)adenina, 2-(aminoalquilamino)adenina u otras alquiladeninas heterosustituidas, 2-tiouracilo, 2-tiotimina, 5-bromouracilo, 5-hidroximetiluracilo, 8-azaguanina,

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7-deazaguanina, N6(6-aminohexil)adenina y 2,6-diaminopurina. Puede incluirse una base «universal» conocida en la tecnica, por ejemplo, inosina. Se ha demostrado que las sustituciones 5-ME-C aumentan la estabilidad de los duplex de acidos nucleicos en 0,6-1,2 °C, y actualmente son las sustituciones de base preferidas.

Otra modificacion de los oligonucleotidos de la divulgacion implica enlazar qufmicamente al oligonucleotido uno o mas restos o conjugados que potencian la actividad o captacion celular del oligonucleotido. Dichos restos incluyen, pero no se limitan a restos lipfdicos como un resto de colesterol, un resto de colesterilo, una cadena alifatica, p. ej. residuos de dodecandiol o undecilo, una poliamina o una cadena de polietilenglicol, o acido adamantano acetico. Los oligonucleotidos que comprenden restos lipofilos, y procedimientos para preparar dichos oligonucleotidos, son conocidos en la tecnica, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos N.° 5.138.045, 5.218.105 y 5.459.255.

No es necesario que todas las posiciones en un oligonucleotido dado esten uniformemente modificadas, y de hecho mas de una de las modificaciones mencionadas anteriormente puede incorporarse en un unico oligonucleotido o incluso dentro de un unico nucleosido dentro de un oligonucleotido. La presente divulgacion tambien incluye oligonucleotidos que son oligonucleotidos quimericos, tal como se ha definido anteriormente en el presente documento.

En otro aspecto, la molecula de acido nucleico de la presente divulgacion esta conjugada con otro resto que incluye, aunque no se limita a, nucleotidos abasicos, polieter, poliamina, poliamidas, peptidos, hidratos de carbono, lfpido, o compuestos de polihidrocarburo. Los expertos en la tecnica reconoceran que estas moleculas pueden enlazarse a uno o mas de cualquiera de los nucleotidos que comprenden la molecula de acido nucleico en varias posiciones en el azucar, base o grupo fosfato.

Los oligonucleotidos usados de acuerdo con esta divulgacion pueden prepararse comoda y rutinariamente mediante la tecnica muy conocida de sfntesis en fase solida. Los equipos para dicha sfntesis son comercializados por varios proveedores que incluyen Applied Biosystems. Tambien puede emplearse cualquier otro medio para dicha sfntesis; la sfntesis real de los oligonucleotidos esta perfectamente dentro de las aptitudes de un experto en la tecnica. Tambien es muy conocido usar tecnicas similares para preparar otros oligonucleotidos tales como fosforotioatos y derivados alquilados. Tambien es muy conocido usar tecnicas similares y amiditos modificados disponibles en el mercado y productos de vidrio de poro controlado (CPG) tales como biotina, fluorescefna, acridina o amiditos modificados con psoraleno y/o CPG (disponible en Glen Research, Sterling VA) para sintetizar oligonucleotidos etiquetados de forma fluorescente, biotinilados u otros oligonucleotidos modificados tales como oligonucleotidos modificados con colesterol.

De acuerdo con la divulgacion, el uso de modificaciones tales como el uso de monomeros de LNA para mejorar la potencia, especificidad y duracion de la accion y ampliar las vfas de administracion de oligonucleotidos comprende qufmicas actuales tales como MOE, ANA, fAnA, PS, etc. Esto puede lograrse sustituyendo algunos de los monomeros en los oligonucleotidos actuales por monomeros LNA. El oligonucleotido modificado con LNA pueden tener un tamano similar al compuesto parental o puede ser mas grande o preferentemente mas pequeno. Se prefiere que dichos oligonucleotidos modificados con LNA contengan menos de aproximadamente el 70 %, mas preferentemente menos de aproximadamente el 60 %, de la manera mas preferente menos de aproximadamente el 50 % de monomeros de LNA y que sus tamanos esten entre aproximadamente 5 y 25 nucleotidos, mas preferentemente entre aproximadamente 12 y 20 nucleotidos.

Las cadenas principales de oligonucleotidos modificados preferidas comprenden, entre otros, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriesteres, aminoalquilfosfotriesteres, metil y otros alquil fosfonatos que comprenden 3'-alquilenfosfonatos y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos que comprenden 3'-amino fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriesteres y boranofosfatos que tienen enlaces 3'-5' normales, analogos enlazados en 2'-5' de estos, y aquellos que tienen polaridad invertida, donde los pares adyacentes de unidades de nucleosidos estan enlazados 3'-5' a 5'-3' o 2'-5' a 5'2'. Tambien estan incluidas diversas sales, sales mixtas y formas de acido libre.

Las patentes representativas de Estados Unidos que ensenan la preparacion de los enlaces anteriores que contienen fosforo comprenden, pero no se limitan a, las patentes de Estados Unidos N.°

3.687.808;4.469.863;4.476.301;5.023.243;5.177.196;5.188.897;5.264.423;5.276.019;5.278.302;5.286.717;5.321.131 ;5.399.676;5.405.939;5.453.496;5.455.233;5.466.677;5.476.925;5.519.126;5.536.821;5.541.306;5.550.111;5.563. 253;5.571.799;5.587.361; y5.625.050.

Las cadenas principales de oligonucleotidos modificados preferidos que no incluyen un atomo de fosforo en ellos tienen cadenas principales que estan formadas por enlaces internucleosfdicos de alquilo o cicloalquilo de cadena

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corta, enlaces internucleosfdicos de heteroatomo y alquilo o cicloalquilo mixtos, o uno o mas enlaces internucleosfdicos heteroatomicos o heterocfclicos de cadena corta. Estos comprenden aquellos que tienen enlaces morfolino (formados en parte a partir de la parte de azucar de un nucleosido); cadenas principales de siloxano; cadenas principales de sulfuro, sulfoxido y sulfona; cadenas principales de formacetilo y tioformacetilo; cadenas principales de metilenformacetilo y tioformacetilo; cadenas principales que contienen alquenos; cadenas principales de sulfamato; cadenas principales de metilenimino y metilenhidrazino; cadenas principales de sulfonato y sulfonamida; cadenas principales de amida; y otras que tienen partes de componentes de N, O, S y CH2 mixtos.

Las patentes representativas de Estados Unidos que ensenan la preparacion de los oligonucleosidos antes mencionados comprenden, pero no se limitan a, las patentes de Estados Unidos N.° 5.034.506;5.166.315;5.185.444;5.214.134;5.216.141;5.235.033;5.264.562;5.

264.564;5.405.938;5.434.257;5.466.677;5.470.967;5.489.677;5.541.307;5.561.225;5.596.086;5.602.240;5.610.289;5 .602.240;5.608.046;5.610.289;5.618.704;5.623.070;5.663.312;5.633.360;5.677.437; y5.677.439.

En otros mimeticos de oligonucleotidos preferidos, tanto el azucar como el enlace internucleosfdico, es decir, la cadena principal, de las unidades de nucleotido se sustituyen por grupos novedosos. Las unidades de base se mantienen para la hibridacion con un compuesto de acido nucleico diana apropiado. Dicho compuesto oligomerico, un mimetico de oligonucleotido que se ha demostrado que tiene excelentes propiedades de hibridacion, se denomina acido nucleico peptfdico (PNA). En compuestos de PNA, la cadena principal de azucar de un oligonucleotido se sustituye por una cadena principal que contiene amida, en particular una cadena principal de aminoetilglicina. Las nucleobases son retenidas y se unen directa o indirectamente a atomos de nitrogeno aza de la parte de amida de la cadena principal, las patentes representativas de Estados Unidos que ensenan la preparacion de compuestos de PNA comprenden, pero no se limitan a, las patentes de Estados Unidos N.° 5.539.082;5.714.331; y 5.719.262.

Ensenanzas adicionales de compuestos de PNA pueden encontrarse en Nielsen, et al. (1991) Science 254, 14971500.

En un aspecto de la divulgacion, los oligonucleotidos con cadenas principales de fosforotioato y oligonucleosidos con cadenas principales de heteroatomos y en particular -CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2- conocidos como una cadena principal de metileno (metilimino) o MMI, - CH2-O-N (CH3)-CH2-,-CH2N(CH3)-N(CH3) CH2-y-O-N(CH3)- CH2-CH2- donde la cadena principal de fosfodiester nativo se representa como -O-P-O-CH2- de la patente de Estados Unidos N.° 5.489.677, citada anteriormente, y las cadenas principales de amidas de la patente de Estados Unidos N.° 5.602.240, citada anteriormente. Tambien se prefieren oligonucleotidos que tienen cadenas principales de morfolino de la patente de Estados Unidos N.° 5.034.506, citada anteriormente.

Los oligonucleotidos modificados tambien pueden contener uno o mas restos de azucar sustituidos. Los oligonucleotidos preferidos comprenden uno de los siguientes en la posicion 2': OH; F; O-, S- o N-alquilo; O-, S-, o N-alquenilo; O-, S- o N-alquinilo; u O-alquil-O-alquilo, donde el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo C a CO sustituido o sin sustituir o alquenilo y alquinilo C2 a CO. Se prefieren particularmente O(CH2)n OmCH3, O(CH2)n, OCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 y O(CH2nON(CH2)nCH3)2 en las que n y m pueden ser de 1 a aproximadamente 10. Otros oligonucleotidos preferidos comprenden uno de los siguientes en la posicion 2': C a CO, (alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo o O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, CI, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escision de ARN, un grupo reportero, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocineticas de un oligonucleotido, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinamicas de un oligonucleotido, y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Una modificacion preferida comprende 2'-metoxietoxi (2'-O-CH2CH2OCH3, tambien conocido como 2'-O-(2-metoxietilo) o 2'-MOE), es decir un grupo alcoxialcoxi. Otra modificacion preferida comprende 2'-dimetilaminooxietoxi, es decir, un grupo O(CH2)2ON(CH3)2, tambien conocido como 2'-DMAOE, tal como se describe en los ejemplos que se incluyen a continuacion en el presente documento, y 2'-dimetilaminoetoxietoxi (tambien conocido en la tecnica como 2'-O- dimetilaminoetoxietilo o 2'-DMAEOE), es decir, 2'-O-CH2-O-CH2-N(CH2)2.

Otras modificaciones preferidas comprenden 2'-metoxi (2'-O CH3), 2'-aminopropoxi (2'-O CH2CH2CH2NH2) y 2'- fluoro (2'-F). Tambien pueden hacerse modificaciones similares en otras posiciones en el oligonucleotido, particularmente la posicion 3' del azucar en el nucleotido del extremo 3' o en oligonucleotidos enlazados 2'-5' y la posicion 5' del nucleotido del extremo 5'. Los oligonucleotidos tambien pueden tener mimeticos de azucar tales como restos ciclobutilo en lugar del azucar pentofuranosilo. Las patentes representativas de Estados Unidos que ensenan la preparacion de dichas estructuras de azucar modificadas comprenden, pero no se limitan a, las patentes de Estados Unidos N.°

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4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.5 76.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873;5.670.633; y 5.700.920.

Los oligonucleotidos tambien pueden comprender modificaciones o sustituciones de nucleobases (frecuentemente denominadas en la tecnica simplemente «base»). Tal como se usa en el presente documento, nucleotidos «no modificados» o «naturales» comprenden las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Los nucleotidos modificados comprenden otros nucleotidos sinteticos y naturales tales como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, derivados de 6- metilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, derivados de 2-propilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propiniluracilo y citosina, 6- azouracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudo-uracilo), 4-tiouracilo, 8-halogeno, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8- hidroxilo y otras adeninas y guaninas sustituidas en 8, 5-halogeno, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas sustituidos en 5, 7-metilquanina y 7-metiladenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina.

Ademas, los nucleotidos comprenden los divulgados en la patente de Estados Unidos N.° 3.687.808, aquellos divulgados en «The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineerings paginas 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990, aquellos divulgados por Englisch et al., «Angewandle Chemie, International Edition», 1991, 30, pagina 613, y aquellos divulgados por Sanghvi, Y.S., Capftulo 15, «Antisense Research and Applications», paginas 289-302, Crooke, S.T. y Lebleu, B. ea., CRC Press, 1993. Algunos de estos nucleotidos son particularmente utiles para incrementar la afinidad de union de los compuestos oligomericos de la divulgacion. Estos comprenden pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas sustituidas en N-2, N-6 y 0-6, que comprenden 2- aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Se ha mostrado que las sustituciones de 5-metilcitosina incrementan la estabilidad del duplex de acido nucleico alrededor de 0,6-1,2°C. (Sanghvi, Y. S., in Crooke, S. T. y Lebleu, B., eds., «Antisense Research and Applications», CRC Press, Boca Raton, 1993, paginas 276-278) y actualmente son las sustituciones base preferidas, de manera aun mas particular cuando se combinan con modificaciones de azucar de 2'-Ometoxietilo.

Las patentes representativas de Estados Unidos que ensenan la preparacion de los nucleotidos modificados citados anteriormente, asf como otros nucleotidos modificados, comprenden, pero no se limitan a, las patentes de Estados Unidos N.° 3.687.808, asf como

4.845.205;5.130.302;5.134.066;5.175.273.273;5.367.066;5.432.272;5.457.187;5.459.255;5.484.908;5.502.177; 5.52 5.711;5.552.540;5.587.469;5.596.091;5.614.617;5.750.692, y5.681.941.

Otra modificacion de los oligonucleotidos de la divulgacion implica enlazar qufmicamente al oligonucleotido uno o mas restos o conjugados, que potencian la actividad, distribucion celular o captacion celular del oligonucleotido.

Dichos restos comprenden, aunque no se limitan a, restos de lfpido tales como un resto de colesterol, acido colico, un tioeter, p. ej., hexil-5-tritiltiol, un tiocolesterol, una cadena alifatica, p. ej., residuos de dodecanodiol o undecilo, un fosfolfpido, p. ej., di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio, una poliamina o una cadena de polietilenglicol, o acido adamantano acetico, un resto de palmitilo, o un resto de octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol.

Las patentes representativas de Estados Unidos que ensenan la preparacion de estos conjugados de oligonucleotidos comprenden, pero no se limitan a, las patentes de Estados Unidos N.° 4.828.979;4.948.882; 5.218.105;

5.525.465;5.541.313;5.545.730;5.552.538,;5.578.717,5.580.731;5.580.731;5.591.584,5.109.124;5.118.802;5.138.04

5;5.414.077;5.486.603;5.512.439;5.578.718;5.608.046;4.587.044;4.605.735;4.667.025;4.762.779;4.789.737;4.824.9

41;4.835.263;4.876.335;4.904.582;4.958.013;5.082.830;5.112.963;5.214.136;5.082.830;5.112.963;5.214.136;5.245.

022;5.254.469;5.258.506;5.262.536;5.272.250;5.292.873;5.317.098;5.371.241,5.391.723;5.416.203,5.451.463;5.510

.475;5.512.667;5.514.785;5.565.552;5.567.810;5.574.142;5.585.481;5.587.371;5.595.726;5.597.696;5.599.923;5.59

9.928 y5.688.941.

Descubrimiento de farmacos: Los compuestos de la presente divulgacion tambien pueden aplicarse en las areas del descubrimiento de farmacos y validacion de dianas. La presente divulgacion comprende el uso de los compuestos y segmentos diana preferidos e identificados en el presente documento en un esfuerzo por descubrir farmacos para esclarecer las relaciones que existen entre polinucleotidos del IRS2 y TFE3 y un estado de patologfa, fenotipo o afeccion. Estos procedimientos incluyen detectar o modular los polinucleotidos del IRS2 que comprenden poner en contacto una muestra, tejido, celula u organismo con los compuestos de la presente divulgacion, medir el nivel de acido nucleico o de protefna de los polinucleotidos del IRS2 y/o un criterio de valoracion fenotfpico o qufmico

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relacionado en algun momento despues del tratamiento, y opcionalmente comparar el valor medido con una muestra no tratada o muestra tratada con otro compuesto de la divulgacion. Estos procedimientos tambien pueden realizarse en paralelo o en combinacion con otros experimentos para determinar la funcion de genes desconocidos para el proceso de validacion de dianas o para determinar la validez de un producto genico particular como diana para el tratamiento o prevencion de una enfermedad, afeccion o fenotipo particular.

Evaluation de la regulation positiva o inhibition de la expresion genica:

La transferencia de un acido nucleico exogeno a una celula u organismo huesped puede evaluarse detectando directamente la presencia del acido nucleico en la celula u organismo. Dicha deteccion puede lograrse mediante varios procedimientos bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, la presencia del acido nucleico exogeno puede detectarse por Southern blot o por una tecnica de reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores que amplifican especfficamente secuencias de nucleotidos asociadas al acido nucleico. La expresion de los acidos nucleicos exogenos tambien puede medirse usando procedimientos convencionales que incluyen analisis de expresion genica. Por ejemplo, el ARNm producido a partir de un acido nucleico exogeno puede detectarse y cuantificarse usando una Northern blot y PCR con transcripcion inversa (RT-PCR).

La expresion de ARN del acido nucleico exogeno tambien puede detectarse midiendo una actividad enzimatica o una actividad de protefna reportera. Por ejemplo, puede medirse la actividad moduladora antisentido indirectamente como una disminucion o aumento en la expresion de acido nucleico diana como una indicacion de que el acido nucleico exogeno esta produciendo el ARN efector. Basandose en conservacion de secuencias, pueden disenarse cebadores y usarse para amplificar regiones codificantes de los genes diana. Inicialmente, la region codificante mas altamente expresada de cada gen puede usarse para construir un gen de control modelo, aunque puede usarse cualquier region codificante o no codificante. Cada gen de control se ensambla insertando cada region codificante entre una region codificante reportera y su senal de poli(A). Estos plasmidos producirfan un ARNm con un gen reportero en la parte cadena arriba del gen y una posible diana de ARNi en la region no codificante 3'. La eficacia de oligonucleotidos antisentido individuales se ensayarfa por modulacion del gen reportero. Los genes reporteros utiles en los procedimientos de la presente divulgacion incluyen acetohidroxiacido sintasa (AHAS), fosfatasa alcalina (AP), beta-galactosidasa (LacZ), beta-glucuronidasa (GUS), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), protefna verde fluorescente (GFP), protefna roja fluorescente (RFP), protefna amarilla fluorescente (YFP), protefna cian fluorescente (CFP), peroxidasa de rabano picante (HRP), luciferasa (Luc), nopalina sintasa (NOS), octopina sintasa (OCS), y derivados correspondientes. Estan disponibles multiples marcadores de seleccion que confieren resistencia a ampicilina, bleomicina, cloranfenicol, gentamicina, higromicina, kanamicina, lincomicina, metotrexato, fosfinotricina, puromicina y tetraciclina. Los procedimientos de determinacion de la modulacion de un gen reportero son muy conocidos en la tecnica, e incluyen, aunque no se limitan a, procedimientos fluorimetricos (por ejemplo, espectroscopfa de fluorescencia, clasificacion celular activada por fluorescencia (FACS), microscopfa de fluorescencia), determinacion de la resistencia a antibioticos.

La expresion de la protefna y del ARNm del IRS2 puede controlarse utilizando procedimientos conocidos por los expertos en la tecnica y descritos en este documento. Por ejemplo, pueden usarse inmunoensayos como ELISA para medir los niveles de protefna. Los kits de ensayo ELISA para IRS2 estan disponibles comercialmente, por ejemplo, en R&D Systems (Minneapolis, MN).

En unos aspectos, la expresion del IRS2 (p. ej. ARNm o protefna) en una muestra (por ejemplo, celulas o tejidos in vivo o in vitro) tratados con un oligonucleotido antisentido de la divulgacion se evaluan por comparacion con la expresion del IRS2 en una muestra de control. Por ejemplo, la expresion de la protefna o del acido nucleico puede compararse usando procedimientos conocidos por los expertos en la tecnica, con una muestra tratada de forma simulada y sin tratar. De forma alternativa, puede hacerse una comparacion con una muestra tratada con un oligonucleotido antisentido de control (p. ej., uno que tenga una secuencia modificada o diferente) dependiendo de la informacion deseada. En otro aspecto, una diferencia en la expresion de la protefna del IRS2 o su acido nucleico en una muestra tratada frente a una muestra sin tratar puede compararse con la diferencia en la expresion de un acido nucleico diferente (incluyendo cualquier estandar que el investigador considere apropiado, por ejemplo, un gen de mantenimiento) en una muestra tratada frente a una muestra sin tratar.

Las diferencias observadas pueden expresarse como se desee, por ejemplo, en forma de proporcion o fraccion, para su uso en comparacion con un control. En unos aspectos, el nivel de ARNm o protefna del IRS2, en una muestra tratada con un oligonucleotido antisentido de la presente divulgacion, aumenta o disminuye entre aproximadamente 1,25 veces a aproximadamente 10 veces o mas en relacion con una muestra sin tratar o una muestra tratada con un acido nucleico de control. En unos aspectos, el nivel de ARNm o protefna del IRS2 aumenta o disminuye entre al menos alrededor de 1,25 veces, al menos alrededor de 1,3 veces, al alrededor de 1,4 veces, al menos alrededor de

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1,5 veces; al menos alrededor de 1,6 veces, al menos alrededor de 1,7 veces, al menos alrededor de 1,8 veces, al menos alrededor de 2 veces, al menos alrededor de 2,5 veces, al menos alrededor de 3 veces, al menos alrededor de 3,5 veces, al menos alrededor de 4 veces, al menos alrededor de 4,5 veces, al menos alrededor de 5 veces, al menos alrededor de 5,5 veces, al menos alrededor de 6 veces, al menos alrededor de 6,5 veces, al menos alrededor de 7 veces, al menos alrededor de 7,5 veces, al menos alrededor de 8 veces, al menos alrededor de 8,5 veces, al menos alrededor de 9 veces, al menos alrededor de 9,5 veces, o al menos alrededor de 10 veces o mas.

Kits, reactivos de investigacion, diagnostico y terapeutica

Los compuestos de la presente divulgacion pueden utilizarse para diagnostico, terapeutica y profilaxis, y como reactivos de investigacion y componentes de kits. Ademas, los oligonucleotidos antisentido, que son capaces de inhibir la expresion genica con exquisita especificidad, son usados frecuentemente por los expertos en la tecnica para aclarar la funcion de genes particulares o para distinguir entre funciones de diversos miembros de una via biologica.

Para su uso en kits y diagnosticos y en diversos sistemas biologicos, los compuestos de la presente divulgacion, tanto solos como en combinacion con otros compuestos o terapeutica, son utiles como herramientas en analisis diferenciales y/o combinatorios para aclarar patrones de expresion de una parte o de todo el complemento de genes expresados dentro de celulas y tejidos.

Tal como se usa en el presente documento, la expresion «sistema biologico» o «sistema» se define como cualquier organismo, celula, cultivo celular o tejido que expresa, o se ha hecho competente para expresar productos de los genes IRS2 y TFE3. Estos incluyen, aunque no se limitan a, seres humanos, animales transgenicos, celulas, cultivos celulares, tejidos, xenoinjertos, trasplantes y combinaciones de estos.

Como un ejemplo no limitante, los patrones de expresion dentro de celulas o tejidos tratados con uno o mas compuestos antisentido se comparan con celulas o tejidos de control no tratados con compuestos antisentido y los patrones producidos se analizan en cuanto a niveles diferenciales de expresion genica, ya que estan relacionados, por ejemplo, con asociacion de enfermedad, via de senalizacion, localizacion celular, nivel de expresion, tamano, estructura o funcion de los genes examinados. Estos analisis pueden realizarse en celulas estimuladas o sin estimular y en presencia o ausencia de otros compuestos que afectan los patrones de expresion.

Ejemplos de procedimientos de analisis de expresion genica conocidos en la tecnica incluyen matrices o micromatrices de ADN, SAGE (analisis en serie de expresion genica), LEE (amplificacion de ADNc digerido con enzimas de restriccion), TOGA (analisis de expresion genica total), matrices de protefnas y proteomica, marcador de secuencia expresada (EST), secuenciacion, huella genetica de ARN sustractivos (SuRF), clonacion sustractiva, presentacion diferencial (DD), hibridacion genomica comparativa, FISH (hibridacion fluorescente in situ), tecnicas y procedimientos de espectrometrfa de masas.

Los compuestos de la divulgacion son utiles para investigacion y diagnostico, debido a que estos compuestos hibridan con acidos nucleicos que codifican IRS2 o TFE3. Por ejemplo, los oligonucleotidos que hibridan con dicha eficiencia y en dichas condiciones que se han descrito en el presente documento como moduladores eficaces del IRS2 y TFE3 son cebadores o sondas eficaces en condiciones que favorecen la amplificacion o deteccion genica, respectivamente. Estos cebadores y sondas son utiles en procedimientos que requieren la deteccion especffica de moleculas de acido nucleico que codifican el IRS2 o TFE3 y en la amplificacion de dichas moleculas de acido nucleico para la deteccion o para su uso en estudios adicionales del IRS2 o TFE3. La hibridacion de los oligonucleotidos antisentido, particularmente los cebadores y sondas de la divulgacion con un acido nucleico que codifica el IRS2 o TFE3, puede detectarse por medios conocidos en la tecnica. Dichos medios pueden comprender conjugacion de una enzima con el oligonucleotido, radioetiquetado del oligonucleotido, o cualquier otro medio de deteccion adecuado. Tambien pueden prepararse kits que usan dichos medios de deteccion para detectar el nivel del IRS2 o TFE3 en una muestra.

La especificidad y sensibilidad de antisentido tambien son empleadas por los expertos en la tecnica para usos terapeuticos. Se han empleado oligonucleotidos antisentido como restos terapeuticos en el tratamiento de patologfas en animales, que incluyen seres humanos. Los farmacos de oligonucleotido antisentido se han administrado con seguridad y eficazmente a seres humanos y numerosos ensayos clfnicos estan actualmente en marcha. De este modo, se establece que los compuestos antisentido pueden ser modalidades terapeuticas utiles que pueden configurarse para ser utiles en regfmenes de tratamiento para el tratamiento de celulas, tejidos y animales, especialmente seres humanos.

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Para terapeutica, un animal, preferentemente un ser humano, que se sospecha padece una enfermedad o trastorno que puede tratarse modulando la expresion de polinucleotidos del IRS2 o TFE3 se trata administrando compuestos antisentido de acuerdo con esta divulgacion. Por ejemplo, en un aspecto no limitante, los procedimientos comprenden la etapa de administrar al animal que necesita tratamiento una cantidad terapeuticamente eficaz del modulador del IRS2 o TFE3. Los moduladores del IRS2 o TFE3 de la presente divulgacion modulan de manera eficaz la actividad del IRS2 o modulan la expresion de la protefna del IRS2. En un aspecto, la actividad o expresion del IRS2 en un animal se inhibe aproximadamente el l0 % en comparacion con un control. Preferentemente, la actividad o expresion del IRS2 en un animal se inhibe aproximadamente el 30 %. Mas preferiblemente, la actividad o expresion del IRS2 en un animal se inhibe el 50 % o mas. De este modo, los compuestos oligomericos modulan la expresion del ARNm del IRS2 en al menos el 10 %, al menos el 50 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos

el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85

%, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, o el 100 % en comparacion con un control.

En un aspecto, la actividad o expresion del Sustrato 2 del Receptor de Insulina (IRS2) y/o en un animal aumenta aproximadamente el 10 % en comparacion con un control. Preferentemente, la actividad o expresion del IRS2 en un animal aumenta aproximadamente en alrededor de 30 %. Mas preferiblemente, la actividad o expresion del IRS2 en un animal aumenta el 50 % o mas. De este modo, los compuestos oligomericos modulan la expresion del ARNm del IRS2 en al menos el 10 %, al menos el 50 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50

%, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al

menos el 95 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, o el 100 % en comparacion con un control.

Por ejemplo, se puede medir la reduccion de la expresion del Sustrato 2 del Receptor de Insulina (IRS2) en suero, sangre, tejido adiposo, hfgado o cualquier otro fluido corporal, tejido u organo del animal. Preferentemente, las celulas contenidas dentro de dichos fluidos, tejidos u organos que se analizan contienen una molecula de acido nucleico que codifica peptidos del IRS2 y/o la propia protefna del IRS2.

Los compuestos de la divulgacion pueden utilizarse en composiciones farmaceuticas anadiendo una cantidad eficaz de un compuesto a un diluyente o vehfculo farmaceuticamente aceptable adecuado. El uso de los compuestos y procedimientos de la divulgacion tambien pueden ser utiles profilacticamente.

Conjugados

Otra modificacion de los oligonucleotidos de la divulgacion implica enlazar qufmicamente al oligonucleotido uno o mas restos o conjugados que potencian la actividad, distribucion celular o captacion celular del oligonucleotido. Estos restos o conjugados pueden incluir grupos conjugados unidos de manera covalente a grupos funcionales tales como grupos hidroxilo primarios o secundarios. Los grupos conjugados de la divulgacion incluyen intercal adores, moleculas reporteras, poliaminas, poliamidas, polietilenglicoles, polieteres, grupos que potencian las propiedades farmacodinamicas de oligomeros, y grupos que potencian las propiedades farmacocineticas de oligomeros. Grupos conjugados tfpicos incluyen colesteroles, lfpidos, fosfolfpidos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluorescefnas, rodaminas, cumarinas y colorantes. Entre los grupos que potencian las propiedades farmacodinamicas, en el contexto de esta divulgacion, se incluyen grupos que mejoran la captacion, potencian la resistencia a la degradacion y/o fortalecen la hibridacion especffica de secuencia con el acido nucleico diana. Entre los grupos que potencian las propiedades farmacocineticas, en el contexto de esta divulgacion, se incluyen grupos que mejoran la captacion, distribucion, metabolismo o eliminacion de los compuestos de la presente divulgacion. Los grupos conjugados representativos se describen en la solicitud de patente internacional N.°PCT/US92/09196, presentada el 23 de octubre, 1992, y en la patente de Estados Unidos 6.287.860.

Los restos conjugados incluyen, aunque no se limitan a, restos de lfpidos tales como un resto de colesterol, acido colico, un tioeter, p. ej., hexil-5-tritiltiol, un tiocolesterol, una cadena alifatica, p. ej., residuos de dodecanodiol o undecilo, un fosfolfpido, p. ej., di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio, una poliamina o una cadena de polietilenglicol, o acido adamantano acetico, un resto palmitilo, o un resto de octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol. Los oligonucleotidos de la divulgacion tambien pueden conjugarse con principios activos, por ejemplo, aspirina, warfarina, fenilbutazona, ibuprofeno, suprofeno, fenbufeno, ketoprofeno, (S)-(+)-pranoprofeno, carprofeno, dansilsarcosina, acido 2,3,5-triyodobenzoico, acido flufenamico, acido folfnico, una benzotiadiazida, clorotiazida, una diazepina, indometacina, un barbiturico, una cefalosporina, un farmaco sulfa, un antidiabetico, un antibacteriano o un antibiotico.

Las patentes representativas de Estados Unidos que ensenan la preparacion de estos conjugados de oligonucleotidos incluyen, pero no se limitan a, las patentes de Estados Unidos N.° 4.828.979; 4.948.882; 5.218.105; 5.525.465; 5.541.313; 5.545.730; 5.552.538; 5.578.717, 5.580.731; 5.580.731; 5.5

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Formulaciones

Los compuestos de la divulgacion tambien pueden mezclarse, encapsularse, conjugarse o asociarse de otro modo a otras moleculas, estructuras de molecula o mezclas de compuestos, como, por ejemplo, liposomas, moleculas dirigidas a receptor, formulaciones orales, rectales, topica u otras, para ayudar en la captacion, distribucion y/o absorcion. Las patentes representativas de Estados Unidos que ensenan la preparacion de estas formulaciones de ayuda en la captacion, distribucion y/o absorcion incluyen, pero no se limitan a, las patentes de Estados Unidos N.° 5.108,921; 5.354.844; 5.416.016; 5.459.127; 5.521.291; 5.543.165; 5.547.932; 5.583.020; 5.591.721; 4.426.330; 4.5 34.899; 5.013.556; 5.108.921; 5.213.804; 5.227.170; 5.264.221; 5.356.633; 5.395.619; 5.416.016; 5.417.978; 5.462. 854;5.469.854;5.512.295; 5.527.528; 5.534.259; 5.543.152; 5.556.948; 5.580.575; y 5.595.756.

Aunque los oligonucleotidos antisentido no necesitan administrarse en el contexto de un vector con el fin de modular la expresion y/o funcion de una diana, los aspectos de la divulgacion se refieren a constructos de vector de expresion para la expresion de oligonucleotidos antisentido, que comprenden promotores, secuencias de genes promotores hfbridos y poseen una fuerte actividad promotora constitutiva, o una actividad promotora que puede inducirse en el caso deseado.

En un aspecto, la practica de la divulgacion implica administrar al menos uno de los oligonucleotidos antisentido anteriores con un sistema de administracion de acidos nucleicos adecuado. En un aspecto, ese sistema incluye un vector no viral enlazado operativamente al polinucleotido. Entre los ejemplos de dichos vectores no virales se incluyen el oligonucleotido solo (por ejemplo, una cualquiera o mas de las sEq ID NO: 4 a 9) o en combinacion con una formulacion de protefna, polisacarido o lfpido adecuada.

Los sistemas de administracion de acidos nucleicos adecuados adicionales incluyen vector viral, normalmente secuencia de al menos uno de un adenovirus, virus asociado a adenovirus (AAV), adenovirus dependiente de cooperador, retrovirus, o complejo de virus hemaglutinante de Japon-liposoma (HVJ). Preferiblemente, el vector viral comprende un promotor de eucariota fuerte operativamente enlazado al polinucleotido, p. ej., un promotor del citomegalovirus (CMV).

Entre los vectores preferidos adicionales se incluyen vectores virales, protefnas de fusion y conjugados qufmicos. Los vectores retrovirales incluyen virus de la leucemia murina de Moloney y virus basados en el VIH. Un vector viral basado en VIH preferido comprende al menos dos vectores donde los genes gag y pol son de un genoma del VIH y el gen env es de otro virus. Se prefieren vectores virales de ADN. Estos vectores incluyen vectores de pox tales como vectores de ortopox o avipox, vectores del virus del herpes tales como un vector del virus del herpes simple I (HSV), vectores de adenovirus y vectores de virus asociados a adenovirus.

Los compuestos antisentido de la divulgacion engloban cualquier sal, ester o sal de dichos esteres farmaceuticamente aceptables, o cualquier otro compuesto que, tras la administracion a un animal, que incluye un ser humano, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito biologicamente activo o residuo del mismo.

La expresion «sales farmaceuticamente aceptables» se refiere a sales fisiologicamente y farmaceuticamente aceptables de los compuestos de la divulgacion: es decir, sales que retienen la actividad biologica deseada del compuesto parental y no confieren efectos toxicologicos no deseados al mismo. Para los oligonucleotidos, los ejemplos preferidos de sales farmaceuticamente aceptables y sus usos se describen adicionalmente en la patente de Estados Unidos 6.287.860.

La presente divulgacion tambien incluye composiciones y formulaciones farmaceuticas que incluyen los compuestos antisentido de la divulgacion. Las composiciones farmaceuticas de la presente divulgacion pueden administrarse en varias formas que dependen de si se desea tratamiento local o sistemico y del area que va a tratarse. La administracion puede ser topica (incluyendo oftalmica y a membranas mucosas que incluyen administracion vaginal y rectal), pulmonar, por ejemplo, por inhalacion o insuflacion de polvos o aerosoles, que incluye por nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidermica y transdermica), oral o parenteral. La administracion parenteral incluye inyeccion o infusion intravenosa, intraarterial, subcutanea, intraperitoneal o intramuscular; o administracion intracraneal, por

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ejemplo, intratecal o intraventricular.

Para el tratamiento de los tejidos en el sistema nervioso central, la administracion puede realizarse, p. ej. por inyeccion o infusion en el lfquido cefalorraqufdeo. La administracion de ARN antisentido en el lfquido cefalorraqufdeo se describe, p. ej., en la solicitud de patente de Estados Unidos N.° 2007/0117772. «Methods for slowing familial ALS disease progressions

Cuando lo que se pretende es que los oligonucleotidos antisentido de la presente divulgacion puedan administrarse a celulas del sistema nervioso central, la administracion puede ser con uno o mas agentes capaces de facilitar la penetracion de los oligonucleotidos antisentido a traves de la barrera hematoencefalica del sujeto. La inyeccion puede realizarse, por ejemplo, en la corteza entorrinal o en el hipocampo. La aplicacion de factores neurotroficos mediante la administracion de un vector adenovirus en las neuronas motoras del tejido muscular se describe en, p. ej., la patente de Estados Unidos N.° 6.632.427, «Adenoviral-vector-mediated gene transfer into medullary motor neurons». La aplicacion de vectores directamente al cerebro, p. ej., el cuerpo estriado, el talamo, el hipocampo, o la sustancia negra es conocida en la tecnica y se describe, p. ej. en la patente de Estados Unidos N.° 6.756.523, «Adenovirus vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system particularly in brain». La administracion puede ser rapida como por inyeccion o realizarse a lo largo de un perfodo de tiempo ya sea por infusion lenta o mediante la administracion de formulaciones de liberacion lenta.

Los oligonucleotidos antisentido sujeto tambien pueden unirse o conjugarse con agentes que proporcionen unas propiedades farmaceuticas o farmacodinamicas deseables. Por ejemplo, el oligonucleotido antisentido puede acoplarse a cualquier sustancia, conocida en la tecnica por favorecer la penetracion o el transporte a traves de la barrera hematoencefalica, como un anticuerpo contra el receptor de la transferrina, y administrarse por inyeccion intravenosa. El compuesto antisentido puede unirse a un vector viral, por ejemplo, que hace que el compuesto antisentido resulte mas eficaz y/o aumente el transporte del compuesto antisentido a traves de la barrera hematoencefalica. La alteracion osmotica de la barrera hematoencefalica tambien se puede lograr mediante, p. ej., infusion de azucares que incluyen, pero no se limitan a, meso eritritol, xilitol, D(+) galactosa, D(+) lactosa, D(+) xilosa, dulcitol, mio-inositol L(-) fructosa, D(-) manitol, D(+) glucosa, D(+) arabinosa, D(-) arabinosa, celobiosa, D(+) maltosa, D(+) rafinosa, L(+) ramnosa, D(+) melibiosa, D(-) ribosa, adonitol, D(+) arabitol, L(-) arabitol, D(+) fucosa, L(-) fucosa, D(-) lyxosa, L(+) lyxosa, y L(-) lyxosa, o aminoacidos que incluyen, pero no se limitan a, glutamina, lisina, arginina, asparagina, acido aspartico, cistefna, acido glutamico, glicina, histidina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, tirosina , valina y taurina. Los procedimientos y materiales para aumentar la penetracion en la barrera hematoencefalica se describen, p. ej., en las patentes de Estados Unidos N.° 4.866.042, «Method for the delivery of genetic material across the blood brain barrier,» 6.294.520, «Material for passage through the blood-brain barrier,» y6.936.589, «Parenteral delivery systems».

Los compuestos antisentido sujetos tambien pueden mezclarse, encapsularse, conjugarse o asociarse de otro modo a otras moleculas, estructuras de molecula o mezclas de compuestos, como, por ejemplo, liposomas, moleculas dirigidas a receptor, formulaciones orales, rectales, topica u otras, para ayudar en la captacion, distribucion y/o absorcion. Por ejemplo, pueden incluirse lfpidos cationicos en la formulacion para facilitar la absorcion de oligonucleotidos. Una de dichas composiciones que se ha demostrado que facilita la absorcion es LIPOFECTIN (disponible en GIBCO BRL, Bethesda, MD).

Se cree que los oligonucleotidos con al menos una modificacion de 2'-O-metoxietilo son particularmente utiles para administracion por via oral. Las composiciones y formulaciones farmaceuticas para administracion topica pueden comprender parches transdermicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, aerosoles, lfquidos y polvos. Pueden ser necesarios o deseables vehfculos farmaceuticos convencionales, bases acuosas, en polvo o aceitosas, espesantes y similares. Tambien pueden ser utiles preservativos recubiertos, guantes y similares.

Las formulaciones farmaceuticas de la presente divulgacion, que pueden presentarse convenientemente en forma de dosificacion unitaria, pueden prepararse de acuerdo con tecnicas convencionales muy conocidas en la industria farmaceutica. Dichas tecnicas incluyen la etapa de poner en asociacion los principios activos con el (los) vehfculo(s) farmaceutico(s) o excipiente(s). En general, las formulaciones se preparan poniendo en asociacion uniforme y de manera estrecha los principios activos con vehfculos lfquidos o vehfculos solidos finamente divididos, o ambos, y luego, si fuera necesario, moldeando el producto.

Las composiciones de la presente divulgacion pueden formularse en cualquiera de muchas formas de dosificacion posibles tales como, entre otros, comprimidos, capsulas, capsulas de gel, jarabes lfquidos, geles blandos, supositorios y enemas. Las composiciones de la presente divulgacion tambien pueden formularse como suspensiones en medios acuosos, no acuosos o mixtos. Las suspensiones acuosas pueden contener

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adicionalmente sustancias que aumentan la viscosidad de la suspension que incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa sodica, sorbitol y/o dextrano. La suspension tambien puede contener estabilizantes.

Las composiciones farmaceuticas de la presente divulgacion incluyen, aunque no se limitan a, disoluciones, emulsiones, espumas y formulaciones que contienen liposomas. Las composiciones y formulaciones farmaceuticas de la presente divulgacion pueden comprender uno o mas potenciadores de la penetracion, vehfculos, excipientes u otros principios activos o inactivos.

Las emulsiones normalmente son sistemas heterogeneos de un lfquido dispersado en otro en forma de gotas que normalmente superan 0,1 Urn de diametro. Las emulsiones pueden contener componentes adicionales, ademas de las fases dispersas, y el farmaco activo que puede estar presente como una disolucion en o bien la fase acuosa, fase oleosa o bien el mismo como una fase independiente. Las microemulsiones estan incluidas como una realizacion de la presente invencion. Las emulsiones y sus usos son muy conocidos en la tecnica y se describen adicionalmente en la patente de Estados Unidos N.° 6.187.860.

Las formulaciones de la presente divulgacion incluyen formulaciones liposomales. Tal como se usa en la presente divulgacion, el termino «liposoma» significa una vesfcula compuesta por lfpidos anfifflicos dispuestos en una bicapa o bicapas esfericas. Los liposomas son vesfculas unilaminares o multilaminares que tienen una membrana formada por un material lipofilo y un interior acuoso que contiene la composicion que va a administrarse. Los liposomas cationicos son liposomas con carga positiva que se cree que interaction con moleculas de ADN negativamente cargadas para formar un complejo estable. Se cree que los liposomas que son sensibles al pH o tienen carga negativa atrapan el ADN en vez de complejarse con el. Se han usado tanto liposomas cationicos como no cationicos para administrar ADN a celulas.

Los liposomas tambien incluyen liposomas «estericamente estabilizados», una expresion que, tal como se usa en el presente documento, se refiere a liposomas que comprenden uno o mas lfpidos especializados. Cuando se incorporan en liposomas, estos lfpidos especializados producen liposomas con vidas en circulacion mejoradas con respecto a los liposomas que carecen de dichos lfpidos especializados. Entre los ejemplos de liposomas estericamente estabilizados se encuentran aquellos en los que parte de la porcion de lfpido que forma la vesfcula del liposoma comprende uno o mas glucolfpidos o se derivatiza con uno o mas polfmeros hidrofilos, tales como un resto de polietilenglicol (PEG). Los liposomas y sus usos se describen adicionalmente en la patente de Estados Unidos N.° 6.287.860.

Las formulaciones y composiciones farmaceuticas de la presente divulgacion tambien pueden comprender tensioactivos. El uso de tensioactivos en productos farmacologicos, formulaciones y en emulsiones es bien conocido en la tecnica. Los tensioactivos y sus usos se describen adicionalmente en la patente de Estados Unidos 6.287.860.

En un aspecto, la presente divulgacion emplea diversos potenciadores de la penetracion para efectuar la administracion eficiente de acidos nucleicos, particularmente oligonucleotidos. Ademas de ayudar en la difusion de farmacos no lipofilos a traves de membranas celulares, los potenciadores de la penetracion tambien potencian la permeabilidad de farmacos lipofilos. Los potenciadores de la penetracion pueden clasificarse como pertenecientes a una de cinco amplias categorfas, es decir, tensioactivos, acidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y no tensioactivos no quelantes. Los mejoradores de penetracion y sus usos se describen adicionalmente en la patente de Estados Unidos N.° 6.287.860.

Un experto en la tecnica reconocera que las formulaciones se disenan rutinariamente segun su uso previsto, es decir, su via de administracion.

Entre las formulaciones preferidas para administracion topica se incluyen aquellas en las que los oligonucleotidos de la divulgacion estan en mezcla con un agente de administracion topica tal como lfpidos, liposomas, acidos grasos, esteres de acidos grasos, esteroides, agentes quelantes y tensioactivos. Los lfpidos y liposomas preferidos incluyen neutros (por ejemplo, dioleoil-fosfatidiletanolamina DOPE, dimiristoilfosfatidilcolina DMPC, diestearoilfosfatidilcolina) negativos (por ejemplo, dimiristoilfosfatidilglicerol DMPG) y cationicos (por ejemplo, dioleoiltetrametilaminopropilo DOTAP y dioleoil-fosfatidiletanolamina DOTMA).

Para administracion topica u otra, los oligonucleotidos de la divulgacion pueden encapsularse dentro de liposomas o pueden formar complejos con los mismos, en particular con liposomas cationicos. Como alternativa, los oligonucleotidos pueden estar complejados con lfpidos, en particular con lfpidos cationicos. Los acidos grasos y esteres preferidos, sales farmaceuticamente aceptables de los mismos, y sus usos se describen adicionalmente en la patente de Estados Unidos N.° 6.287.860.

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Las composiciones y formulaciones para administracion por via oral incluyen polvos o granulos, micropartfculas, nanopartfculas, suspensiones o disoluciones en agua o medios no acuosos, capsulas, capsulas de gel, sobres, comprimidos o minicomprimidos. Pueden ser deseables espesantes, aromatizantes, diluyentes, emulsionantes, adyuvantes de dispersion o aglutinantes. Las formulaciones orales preferidas son aquellas en las que los oligonucleotidos de la divulgacion se administran conjuntamente con uno o mas potenciadores de la penetracion, tensioactivos y quelantes. Entre los tensioactivos preferidos se incluyen acidos grasos y/o esteres o sales de los mismos, acidos biliares y/o sales de los mismos. Los acidos biliares/sales y acidos grasos preferidos y sus usos se describen adicionalmente en la patente de Estados Unidos N.° 6.287.860. Tambien se prefieren combinaciones de potenciadores de la penetracion, por ejemplo, acidos grasos/sales en combinacion con acidos biliares/sales. Una combinacion particularmente preferida es la sal de sodio de acido laurico, acido caprico y UDCA. Los potenciadores de la penetracion adicionales incluyen eter polioxietilen-9-laurflico, eter polioxietilen-20-cetflico. Los oligonucleotidos de la divulgacion pueden administrarse por via oral, en forma granulada que incluye partfculas secadas por pulverizacion, o complejados para formar micro o nanopartfculas. Los agentes complejantes de oligonucleotidos y sus usos se describen adicionalmente en la patente de Estados Unidos N.° 6.287.860.

Las composiciones y formulaciones para administracion parenteral, intratecal o intraventricular pueden comprender disoluciones acuosas esteriles que tambien pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados tales como, entre otros, potenciadores de la penetracion, compuestos portadores y otros vehfculos o excipientes farmaceuticamente aceptables

Ciertos aspectos de la divulgacion proporcionan composiciones farmaceuticas que contienen uno o mas compuestos oligomericos y uno o mas de otros agentes quimioterapeuticos que funcionan por un mecanismo no antisentido. Entre los ejemplos de dichos agentes quimioterapeuticos se incluyen, aunque no se limitan a, farmacos quimioterapeuticos para el cancer tales como daunorrubicina, daunomicina, dactinomicina, doxorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, esorrubicina, bleomicina, mafosfamida, ifosfamida, citosina arabinosido, biscloroetil- nitrosurea, busulfano, mitomicina C, actinomicina D, mitramicina, prednisona, hidroxiprogesterona, testosterona, tamoxifeno, dacarbazina, procarbazina, hexametilmelamina, pentametilmelamina, mitoxantrona, amsacrina, clorambucilo, metilciclohexilnitrosurea, mostazas de nitrogeno, melfalan, ciclofosfamida, 6-mercaptopurina, 6- tioguanina, citarabina, 5-azacitidina, hidroxiurea, deoxicoformicina, 4-hidroxiperoxiciclo-fosforamida, 5-fluorouracilo (5-FU), 5-fluorodeoxiuridina (5-FUdR), metotrexato (MTX), colchicina, taxol, vincristina, vinblastina, etoposido (VP- 16), trimetrexato, irinotecan, topotecan, gemcitabina, teniposido, cisplatino y dietilestilbestrol (DES). Cuando se usan con los compuestos de la divulgacion, dichos agentes quimioterapeuticos pueden usarse individualmente (p. ej., 5- FU y oligonucleotido), secuencialmente (p. ej., 5-FU y oligonucleotido durante un periodo de tiempo seguido de MTX y oligonucleotido), o en combinacion con uno o mas de otros de dichos agentes quimioterapeuticos (p. ej., 5-FU, MTX y oligonucleotido, o 5-FU, radioterapia y oligonucleotido). Los farmacos antiinflamatorios, que incluyen, aunque no se limitan a, farmacos antiinflamatorios no esteroideos y corticosteroides, y farmacos antivirales, que incluyen, aunque no se limitan a, ribivirina, vidarabina, aciclovir y ganciclovir, tambien pueden combinarse en composiciones de la divulgacion. Las combinaciones de compuestos antisentido y otros farmacos no antisentido tambien estan dentro del alcance de la presente divulgacion. Pueden usarse dos o mas compuestos combinados juntos o secuencialmente.

En otro aspecto relacionado, las composiciones de la divulgacion pueden contener uno o mas compuestos

antisentido, particularmente oligonucleotidos, dirigidos a un primer acido nucleico y uno o mas compuestos

antisentido adicionales dirigidos a un segundo acido nucleico diana. Por ejemplo, la primera diana puede ser una secuencia antisentido particular del IRS2 o TFE3, y la segunda diana puede ser una region de otra secuencia de

nucleotidos. Como alternativa, las composiciones de la divulgacion pueden contener dos o mas compuestos

antisentido dirigidos a diferentes regiones de la misma diana de acido nucleico del IRS2 o TFE3. Se ilustran numerosos ejemplos de compuestos antisentido en el presente documento y otros pueden seleccionarse de entre compuestos adecuados conocidos en la tecnica. Pueden usarse dos o mas compuestos combinados juntos o secuencialmente.

Dosificacion:

Se cree que los expertos en la tecnica dominan la formulacion de composiciones terapeuticas y su posterior administracion (dosificacion). La dosificacion depende de la gravedad y sensibilidad de la patologfa que va a tratarse, durando el ciclo de tratamiento de varios dfas a varios meses, o hasta que se efectue una cura o se logre una disminucion de la patologfa. La dosificacion optima se puede calcular a partir de mediciones de acumulacion de farmaco en el cuerpo del paciente. Los expertos en la tecnica pueden determinar facilmente las dosificaciones, metodologfas de dosificacion y frecuencias de repeticion optimas. Las dosificaciones optimas pueden variar

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dependiendo de la potencia relativa de oligonucleotidos individuales, y generalmente pueden estimarse basandose en las CE50 que se ha descubierto que son eficaces en modelos animales in vitro e in vivo. En general, la dosificacion es de 0,01 pg a 100 g por kg de peso corporal, y puede administrate una vez o mas diariamente, semanalmente, mensualmente o anualmente, o incluso una vez cada 2 a 20 anos. Los expertos en la tecnica

pueden estimar facilmente tasas de repeticion para la dosificacion basandose en tiempos de residencia medidos y

concentraciones del farmaco en fluidos corporales o tejidos. Tras el tratamiento satisfactorio, puede desearse que el paciente reciba terapia de mantenimiento para prevenir la reaparicion de la patologfa, en el que el oligonucleotido se administra en dosis de mantenimiento, que oscilan de 0,01 pg a 100 g por kg de peso corporal, una vez o mas diariamente, a una vez cada 20 anos.

En algunos aspectos, un paciente se trata con una dosificacion de farmaco que es al menos aproximadamente 1, al menos aproximadamente 2, al menos aproximadamente 3, al menos aproximadamente 4, al menos

aproximadamente 5, al menos aproximadamente 6, al menos aproximadamente 7, al menos aproximadamente 8, al menos aproximadamente 9, al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 15, al menos

aproximadamente 20, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 35, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 45, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 60, al menos aproximadamente 70, al menos aproximadamente 80, al menos aproximadamente 90, o al menos aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. Ciertas dosis inyectadas de oligonucleotidos antisentido se describen, p. ej., en la patente de Estados Unidos N.° 7.563.884, «Antisense modulation of PTP1B expressions

Aunque diversos aspectos de la presente divulgacion se han descrito anteriormente, debe entenderse que se han presentado a modo de ejemplo solamente, y no de limitacion. Pueden realizarse numerosos cambios a los aspectos descritos de acuerdo con la divulgacion en el presente documento sin alejarse del espfritu o alcance de la divulgacion. Por lo tanto, la amplitud y el alcance de la presente divulgacion no deben estar limitados por ninguno de los aspectos descritos anteriormente.

Por su citacion de diversas referencias en este documento, los solicitantes no admiten que ninguna referencia particular sea «tecnica anterior» a su invencion. En los siguientes ejemplos se ilustran realizaciones de composiciones y procedimientos inventivos.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos no limitantes sirven para ilustrar realizaciones seleccionadas de la invencion. Se apreciara que variaciones en proporciones y alternativas en elementos de los componentes mostrados seran evidentes para los expertos en la tecnica y estan dentro del alcance de aspectos de la presente divulgacion.

Ejemplo 1: Diseno de oligonucleotidos antisentido especificos para una molecula de acido nucleico antisentido a y/o una hebra sentido del polinucleotido del Sustrato 2 del Receptor de Insulina (IRS2) o Factor de transcripcion E3 (TFE3).

Tal como se ha indicado anteriormente, las expresiones «oligonucleotido especffico para» o «dianas de oligonucleotido» se refieren a un oligonucleotido que tiene una secuencia (i) capaz de formar un complejo estable con una parte del gen elegido como diana, o (ii) capaz de formar un duplex estable con una parte de un transcrito de ARNm del gen elegido como diana.

La seleccion de los oligonucleotidos apropiados se facilita usando programas informaticos que alinean automaticamente secuencias de acidos nucleicos e indican regiones de identidad u homologfa. Dichos programas se usan para comparar secuencias de acidos nucleicos obtenidas, por ejemplo, buscando en bases de datos tales como GenBank o secuenciando productos de PCR. La comparacion de secuencias de acidos nucleicos de un intervalo de especies permite la seleccion de secuencias de acidos nucleicos que muestran un grado de identidad apropiado entre especies. En el caso de genes que no han sido secuenciados, se realizan Southern blots para permitir una determinacion del grado de identidad entre genes en especies diana y otras especies. Realizando Southern blots a grados de astringencia variables, tal como es muy conocido en la tecnica, es posible obtener una medida aproximada de la identidad. Estos procedimientos permiten la seleccion de oligonucleotidos que muestran un alto grado de complementariedad con secuencias de acidos nucleicos diana en un sujeto a controlar y un menor grado de complementariedad con secuencias de acidos nucleicos correspondientes en otras especies. Un experto en la tecnica se dara cuenta de que hay libertad considerable en la seleccion de regiones apropiadas de genes para su uso en la presente divulgacion.

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Un compuesto antisentido es «especfficamente hibridable» cuando la union del compuesto al acido nucleico diana interfiere en la funcion normal del acido nucleico diana para causar una modulacion de la funcion y/o la actividad, y existe un grado de complementariedad suficiente para evitar union inespecffica del compuesto antisentido a secuencias de acidos nucleicos no diana en condiciones en las que se desea union especffica, es decir, en condiciones fisiologicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapeutico, y en condiciones en las que se realizan ensayos en el caso de ensayos in vitro.

Las propiedades de hibridacion de los oligonucleotidos descritos en el presente documento pueden determinarse por uno o mas ensayos in vitro, tal como se conoce en la tecnica. Por ejemplo, las propiedades de los oligonucleotidos descritos en el presente documento pueden obtenerse por determinacion de la intensidad de union entre el antisentido natural diana y una posible molecula de farmaco usando el ensayo de la curva de fusion.

La intensidad de union entre el antisentido natural diana y una posible molecula de farmaco (Molecula) puede estimarse usando cualquiera de los procedimientos establecidos de medicion de la intensidad de interacciones intermoleculares, por ejemplo, un ensayo de la curva de fusion.

El ensayo de la curva de fusion determina la temperatura a la que se produce una rapida transicion de conformacion bicatenaria a monocatenaria para el complejo de antisentido natural/molecula. Esta temperatura es ampliamente aceptada como una medida fiable de la intensidad de interaccion entre las dos moleculas.

Puede realizarse un ensayo de la curva de fusion usando una copia de ADNc de la molecula de ARN antisentido natural real o un nucleotido de ADN o ARN sintetico correspondiente al sitio de union de la molecula. Estan disponibles multiples kits que contienen todos los reactivos necesarios para realizar este ensayo (por ejemplo, kit MeltDoctor de Applied Biosystems lnc.). Estos kits incluyen una disolucion tampon adecuada que contiene uno de los colorantes de union a aDn bicatenario (dsADN) (tales como los colorantes ABI HRM, SYBR Green, SYTO, etc.). Las propiedades de los colorantes de dsADN son tales que casi no emiten fluorescencia en forma libre, pero son altamente fluorescentes cuando se unen a dsADN.

Para realizar el ensayo, el ADNc o un oligonucleotido correspondiente se mezclan con la molecula en concentraciones definidas por los protocolos especfficos del fabricante. La mezcla se calienta a 95 °C para disociar todos los complejos de dsADN previamente formados, luego se enfrfa lentamente a temperatura ambiente u otra temperatura menor definida por el fabricante del kit para permitir que se hibriden las moleculas de ADN. Entonces, los complejos recientemente formados se calientan lentamente a 95 °C con recopilacion de datos continua simultanea sobre la cantidad de fluorescencia que se produce por la reaccion. La intensidad de fluorescencia es inversamente proporcional a las cantidades de dsADN presentes en la reaccion. Los datos pueden recogerse usando un instrumento de PCR en tiempo real compatible con el kit (p. ej., sistema de PCR en tiempo real StepOne Plus de ABI o el instrumento LightTyper, Roche Diagnostics, Lewes, Reino Unido).

Los picos de fusion se construyen representando la derivada negativa de la fluorescencia con respecto a la temperatura (-d(Fluorescencia)/dT) sobre el eje y) contra la temperatura (eje x) usando software apropiado (por ejemplo, LightTyper (Roche) o SDS Dissociation Curve, ABI). Los datos se analizan para identificar la temperatura de la rapida transicion del complejo de dsADN a moleculas monocatenarias. Esta temperatura se llama Tm y es directamente proporcional a la intensidad de la interaccion entre las dos moleculas. Normalmente, la Tm superara los 40 °C.

Ejemplo 2: Modulacion de polinucleotidos del IRS2 y TFE3 Tratamiento de celulas HepG2 con oligonucleotidos antisentido

Se cultivaron celulas HepG2 de ATCC (N.° de cat HB-8065) en medio de cultivo (MEM/EBSS (Hyclone N.° de cat SH30024, o Mediatech N.° de cat MT-10-010-CV) +10 % FBS (Mediatech n.° de cat MT35-011-CV)+ penicilina/estreptomicina (Mediatech n.° de cat MT30-002-CI)) a 37 °C y 5 % de CO2. Un dfa antes del experimento las celulas se volvieron a colocar en placas a la densidad de 1,5 x 105/ml en placas de 6 pocillos y se incubaron a 37 °C y 5 % de CO2. El dfa del experimento, se cambio el medio en las placas de 6 pocillos y se coloco medio de cultivo nuevo. Todos los oligonucleotidos antisentido se diluyeron a la concentracion de 20 pM. Se incubaron dos pI de esta disolucion con 400 pI de medio Opti-MEM (Gibco, N.° de cat 31985-070) y 4 pI de Lipofectamine 2000 (lnvitrogen, N.° de cat 11668019) a temperatura ambiente durante 20 min y se aplicaron a cada pocillo de las placas de 6 pocillos con celulas HepG2. Se uso una mezcla similar que incluye 2 pI de agua en lugar de la disolucion de oligonucleotido para los controles transfectados de forma simulada. Despues de 3-18 horas de incubacion a 37 °C y con 5 % de CO2, el medio se cambio por medio de cultivo nuevo. 48 h despues de la adicion de oligonucleotidos

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antisentido, el medio se elimino y se extrajo ARN de las celulas usando el sistema de aislamiento de ARN total SV de Promega (N.° de cat Z3105) o el kit de aislamiento de ARN total RNeasy de Qiagen (N.° de cat 74181) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se anadieron 600 ng de ARN a la reaccion de transcripcion inversa realizada usando el kit de ADNc Verso de Thermo Scientific (N.° de cat AB1453B) o el kit de transcripcion inversa de ADNc de alta capacidad (N.° de cat 4368813) tal como se describe en el protocolo del fabricante. El ADNc de esta reaccion de transcripcion inversa se uso para monitorizar la expresion genica por PCR en tiempo real usando la mezcla de expresion genica Taqman de ABI (N.° de cat 4369510) y cebadores/sondas disenados por ABI (ensayo de expresion genica Taqman de Applied Biosystems: Hs00275843_s1 (IRS2) y Hs00232406_m1 (TfE3) de Applied Biosystems Inc., Foster City CA). Se uso el siguiente ciclo de PCR: 50 °C durante 2 min, 95 °C durante 10 min, 40 ciclos de (95 °C durante 15 segundos, 60 °C durante 1 min) usando una maquina de PCR en tiempo real StepOne Plus (Applied Biosystems). El cambio de veces en la expresion genica despues del tratamiento con oligonucleotidos antisentido se calculo basandose en la diferencia de valores de dCt normalizados contra 18S entre las muestras tratadas y las transfectadas de forma simulada.

Resultados:

Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm del IRS2 en celulas HepG2 se incrementan significativamente 48 h despues del tratamiento con siRNA para Hs.708291 antisentido de TFE3 (Fig. 1).

Los resultados de PCR en tiempo real muestran el cambio en veces + la desviacion estandar en ARNm del TFE3 despues del tratamiento de celulas HepG2 con oligonucleotidos de siRNA introducidos usando Lipofectamine 2000, en comparacion con el control (Fig. 4).

Tratamiento de celulas 518A2 con oligonucleotidos antisentido:

Se cultivaron celulas 518A2 obtenidas del Albert Einstein-Montefiore Cancer Center, Nueva York, en medio de cultivo (MEM/EBSS (Hyclone N.° de cat SH30024, o Mediatech N.° de cat MT-10-010-CV) +10 % FBS (Mediatech N.° de cat MT35-011-CV)+ penicilina/estreptomicina (Mediatech N.° de cat MT30-002-CI)) a 37°C y 5 % de CO2. Un dfa antes del experimento, las celulas volvieron a colocarse en placas a la densidad de 15 x 105/ml en placas de 6 pocillos y se incubaron a 37 °C y 5 % de CO2. El dfa del experimento, el medio en las placas de 6 pocillos se cambio a medio de cultivo nuevo. Todos los oligonucleotidos antisentido se diluyeron a la concentracion de 20 pM. Se incubaron dos pI de esta disolucion con 400 pI de medio Opti-MEM (Gibco, N.° de cat 31985-070) y 4 pI de Lipofectamine 2000 (lnvitrogen, N.° de cat 11668019) a temperatura ambiente durante 20 min y se aplicaron a cada pocillo de las placas de 6 pocillos con celulas 518A2. Se uso una mezcla similar que incluye 2 pI de agua en lugar de la disolucion de oligonucleotido para los controles transfectados con vector simulado. Despues de 3-18 horas de incubacion a 37 °C y con 5 % de CO2, el medio se cambio por medio de cultivo nuevo. 48 h despues de la adicion de oligonucleotidos antisentido, el medio se elimino y se extrajo ARN de las celulas usando el sistema de aislamiento de ARN total SV de Promega (N.° de cat Z3105) o el kit de aislamiento de ARN total RNeasy de Qiagen (N.° de cat 74181) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se anadieron 600 ng de ARN a la reaccion de transcripcion inversa realizada usando el kit de ADNc Verso de Thermo Scientific (N.° de cat AB1453B) o el kit de transcripcion inversa de ADNc de alta capacidad (N.° de cat 4368813) tal como se describe en el protocolo del fabricante. El ADNc de esta reaccion de transcripcion inversa se uso para monitorizar la expresion genica por PCR en tiempo real usando la mezcla de expresion genica Taqman de ABI (N.° de cat 4369510) y cebadores/sondas disenados por ABI (ensayo de expresion genica Taqman de Applied Biosystems: Hs00275843_s1 (IRS2) y Hs0023206_m1 (TFE3) de Applied Biosystems Inc., Foster City CA). Se uso el siguiente ciclo de PCR: 50 °C durante 2 min, 95 °C durante 10 min, 40 ciclos de (95 °C durante 15 segundos, 60 °C durante 1 min) usando la maquina de PCR en tiempo real StepOne Plus (Applied Biosystems). El cambio de veces en la expresion genica despues del tratamiento con oligonucleotidos antisentido se calculo basandose en la diferencia de valores de dCt normalizados contra 18S entre las muestras tratadas y las transfectadas de forma simulada.

Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm del IRS2 en celulas 518A2 se incrementan significativamente 48 h despues del tratamiento con siRNA para Hs.708291 antisentido de TFE3 (Fig. 1).

Tratamiento de celulas Vero76 con oligonucleotidos antisentido

Se cultivaron celulas Vero76 de ATCC (N.° de cat CRL-1587) en medio de cultivo (MEM/EBSS (Hyclone N.° de cat SH30024, o Mediatech N.° de cat MT-10-010-CV) +10 % FBS (Mediatech N.° de cat MT35-011-CV)+ penicilina/estreptomicina (Mediatech N.° de cat MT30-002-CI)) a 37 °C y 5 % de CO2. Un dfa antes del experimento,

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las celulas volvieron a colocarse en placas a la densidad de 1,5 x 105/ml en placas de 6 pocillos y se incubaron a 37 °C y 5 % de CO2. El dfa del experimento, el medio de las placas de 6 pocillos se cambio por medio de cultivo nuevo. Todos los oligonucleotidos antisentido se diluyeron a la concentracion de 20 pM. Se incubaron 2 pI de esta disolucion con 400 pI de medio Opti-MEM (Gibco, N.° de cat 31985-070) y 4 pI de Lipofectamine 2000 (lnvitrogen, N.° de cat 11668019) a temperatura ambiente durante 20 min y se aplicaron a cada pocillo de las placas de 6 pocillos con celulas Vero76. Se uso una mezcla similar que incluye 2 pI de agua en lugar de la disolucion de oligonucleotido para los controles transfectados de forma simulada. Despues de 3-18 horas de incubacion a 37 °C y con 5 % de CO2, el medio se cambio por medio de cultivo nuevo. 48 h despues de la adicion de oligonucleotidos antisentido, el medio se elimino y se extrajo ARN de las celulas usando el sistema de aislamiento de ARN total SV de Promega (N.° de cat Z3105) o el kit de aislamiento de ARN total RNeasy de Qiagen (N.° de cat 74181) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se anadieron 600 ng de ARN a la reaccion de transcripcion inversa realizada usando el kit de ADNc Verso de Thermo Scientific (N.° de cat AB1453B) tal como se describe en el protocolo del fabricante. El ADNc de esta reaccion de transcripcion inversa se uso para monitorizar la expresion genica por PCR en tiempo real usando la mezcla de expresion genica Taqman de ABI (N.° de cat 4369510) y cebadores/sondas disenados por ABI (ensayo de expresion genica Taqman de Applied Biosystems: Hs00275843_s1 (IRS2) y Hs00232406_m1 (TFE3) de Applied Biosystems Inc., Foster City CA). Se uso el siguiente ciclo de PcR: 50 °C durante 2 min, 95 °C durante 10 min, 40 ciclos de (95 °C durante 15 segundos, 60 °C durante 1 min) usando la maquina de PCR en tiempo real StepOne Plus (Applied Biosystems). El cambio de veces en la expresion genica despues del tratamiento con oligonucleotidos antisentido se calculo basandose en la diferencia de valores de dCt normalizados contra 18S entre las muestras tratadas y las transfectadas de forma simulada.

Los resultados de PCR en tiempo real muestran el cambio en veces + la desviacion estandar en ARNm del IRS2 despues del tratamiento de celulas Vero76 con oligonucleotidos de fosforotioato introducidos usando Lipofectamine 2000, en comparacion con el control (Fig. 2).

Tratamiento de celulas MCF-7 con oligonucleotidos antisentido:

Se cultivaron celulas MCF-7 de ATCC (N.° de cat HTB-22) en medio de cultivo (MEM/EBSS (Hyclone N.° de cat SH30024, o Mediatech N.° de cat MT-10-010-CV) + 10 % FBS (Mediatech N.° de cat MT35-011-CV)+ penicilina/estreptomicina (Mediatech N.° de cat MT30-002-CI)) a 37°C y 5 % de CO2. Un dfa antes del experimento, las celulas volvieron a colocarse en placas a la densidad de 1,5 x 105/ml en placas de 6 pocillos y se incubaron a 37 °C y 5 % de CO2. El dfa del experimento, el medio de las placas de 6 pocillos se cambio por medio de cultivo nuevo. Todos los oligonucleotidos antisentido se diluyeron a la concentracion de 20 pM. Se incubaron dos pI de esta disolucion con 400 pI de medio Opti-MEM (Gibco, N.° de cat 31985-070) y 4 pI de Lipofectamine 2000 (lnvitrogen, N.° de cat 11668019) a temperatura ambiente durante 20 min y se aplicaron a cada pocillo de las placas de 6 pocillos con celulas MCF-7. Se uso una mezcla similar que incluye 2 pI de agua en lugar de la disolucion de oligonucleotido para los controles transfectados con vector simulado. Despues de 3-18 horas de incubacion a 37 °C y con 5 % de CO2, el medio se cambio por medio de cultivo nuevo. 48 h despues de la adicion de oligonucleotidos antisentido, el medio se elimino y se extrajo ARN de las celulas usando el sistema de aislamiento de ARN total SV de Promega (N.° de cat Z3105) o el kit de aislamiento de ARN total RNeasy de Qiagen (N.° de cat 74181) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se anadieron 600 ng de ARN a la reaccion de transcripcion inversa realizada usando el kit de ADNc Verso de Thermo Scientific (N.° de cat AB1453B) o el kit de transcripcion inversa de ADNc de alta capacidad (N.° de cat 4368813) tal como se describe en el protocolo del fabricante. El ADNc de esta reaccion de transcripcion inversa se uso para monitorizar la expresion genica por PCR en tiempo real usando la mezcla de expresion genica Taqman de ABI (N.° de cat 4369510) y cebadores/sondas disenados por ABI (ensayo de expresion genica Taqman de Applied Biosystems: Hs00275843_s1 (IRS2) y Hs00232406_m1 (TfE3) de Applied Biosystems Inc., Foster City CA). Se uso el siguiente ciclo de PCR: 50 °C durante 2 min, 95 °C durante 10 min, 40 ciclos de (95 °C durante 15 segundos, 60 °C durante 1 min) usando la maquina de PCR en tiempo real StepOne Plus (Applied Biosystems). El cambio de veces en la expresion genica despues del tratamiento con oligonucleotidos antisentido se calculo basandose en la diferencia de valores de dCt normalizados contra 18S entre las muestras tratadas y las transfectadas de forma simulada.

Los resultados de PCR en tiempo real muestran el cambio en veces + la desviacion estandar en ARNm del IRS2 despues del tratamiento de celulas MCF7 con oligonucleotidos de fosforotioato introducidos usando Lipofectamine 2000, en comparacion con el control (Fig. 3).

Ademas, aunque se ha descrito una caractenstica particular de la divulgacion con respecto a solo una de varias implementaciones, dicha caractenstica puede combinarse con una o mas de otras caractensticas de las otras implementaciones, como puede desearse y ser ventajoso para cualquier aplicacion dada o particular.

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El resumen de la divulgacion permitira al lector determinar rapidamente la naturaleza de la divulgacion tecnica. Se presenta entendiendo que no se usara para interpretar o limitar el alcance o el significado de las siguientes reivindicaciones.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> CuRNA, Inc.

<120> TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES RELACIONADAS CON EL SUSTRATO 2 DEL RECEPTOR DE INSULINA (IRS2) MEDIANTE INHIBICION DEL TRANSCRITO ANTISENTIDO NATURAL PARA EL IRS2 y FACTOR DE TRANSCRIPCION E3 (TFE3)

<130> P39053EP-PCT <140>EP10841707.2 <141> 30/12/2010 <150> US 61/291.419 <151> 31/12/2009 <160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7014

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<300>

<308> NM_003749 <309> 25/12/2010 <313> (1)..(7014)

<400> 1

cggggaccgc

gacgagcccg ggtcgccgtt ggcagcagca gcagcaacac cagcagcagc 60

agcagccGcg

gcggcggcgc ggaccccgag cgcccgggcg caGGGGggGt tcccggagcg 120

cgacgcggcg

gcagcagccc cggtgcggcc gcgcgcgcct taggctcggc cccgcggctc 180

ggggaccccg

actcccggcc cagcgagcgc gtccceeggc gccgcccgag agcccgagga 240

ggcagcggcc

gcaggcagcc ggggaggggg gcggccaccg cccgcgccgg gcatcctcag 300

gagccccaga

gcgcggaggg cgcggcgccg ccgagcggtg ctggcccccg cgggcctccc 360

cggaccttcc

ccaccgcctg ggcccgaggg acgcgtgatc gggcgggcgg ccgggcgcaa 420

gggtgggagg

gagccgcccc cgcccgcgcc ccctccgccc ctcgccccaa cccctgggcg 480

ccgggcccgg

gccgcgcggc ctgaagcgcc cgcgatggcg agcccgccgc ggcacgggcc 540

gcccgggccg

gcgagcggag acggccccaa cctcaacaac aacaacaaca acaacaacca 600

cagcgtgcgc

aagtgcggct acctgcgcaa gcagaagcat ggccacaagc gcttcttcgt 660

gctgcgcgga

cccggcgcgg gcggcgacga ggcgacggcg ggcggggggt cggcgccgca 720

accgccgcgg

ctcgagtact acgagagcga gaaaaagtgg cggagcaagg caggcgcgcc 780

gaaacgggtg

atcgctctcg actgctgcct gaacatcaac aagcgcgccg acgccaagca 840

caagtacctg

atcgccctct acaccaagga cgagtacttc gccgtggccg ccgagaacga 900

gcaggagcag

gagggctggt accgcgcgct caccgacctg gtcagcgagg gccgcgcggc 960

cgccggagac

gcgccccccg ccgccgcgcc cgccgcgtcc tgcagcgcct ccctgcccgg 1020

Claims (15)

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   REIVINDICACIONES

   1. Un oligonucleotido que se dirige a un transcrito antisentido natural del Sustrato 2 del Receptor de Insulina (IRS2) para uso como un compuesto terapeutico, donde el oligonucleotido modula la expresion del Sustrato 2 del Receptor de Insulina (IRS2), y donde el transcrito antisentido natural tiene la secuencia de acido nucleico tal como se expone en la SEQ ID NO: 3, o una variante de la misma que retiene la funcion del transcrito antisentido natural de la SEQ ID NO: 3.
2. 2. Un oligonucleotido que se dirige a un transcrito antisentido natural del Sustrato 2 del Receptor de Insulina (IRS2) para uso en la prevencion o el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado al Sustrato 2 del Receptor de Insulina (IRS2), donde el oligonucleotido modula la expresion del Sustrato 2 del Receptor de Insulina (IRS2), y donde el transcrito antisentido natural tiene la secuencia de acido nucleico tal como se expone en la SEQ ID NO: 3, o una variante de la misma que retiene la funcion del transcrito antisentido natural de la SEQ ID NO: 3.
3. 3. Uso de un oligonucleotido que se dirige a un transcrito antisentido natural del Sustrato 2 del Receptor de Insulina (IRS2) para la fabricacion de un medicamento para uso en la prevencion o el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado al Sustrato 2 del Receptor de Insulina (IRS2) donde dicho oligonucleotido modula la expresion del Sustrato 2 del Receptor de Insulina (IRS2), y donde el transcrito antisentido natural tiene la secuencia de acido nucleico tal como se expone en la SEQ ID NO: 3, o una variante de la misma que retiene la funcion del transcrito antisentido natural de la SEQ ID NO: 3.
4. 4. Uso de acuerdo con la reivindicacion 3, o un oligonucleotido para uso de acuerdo con la reivindicacion 2 donde la enfermedad o trastorno se selecciona de entre el grupo compuesto por diabetes, una enfermedad o trastorno asociado con resistencia a la insulina, una enfermedad o trastorno asociado con metabolismo de carbohidratos, un trastorno de peso, un estado no diabetico resistente a la insulina (p. ej., obesidad, intolerancia a la glucosa (IGT, por su sigla en ingles), sfndrome metabolico, etc.), una enfermedad o trastorno hepatico, una enfermedad o trastorno asociado a crecimiento y desarrollo del rinon, una enfermedad o trastorno asociado a funcion y/o expresion anormal del IRS2, una enfermedad o trastorno neurologico (p. ej. enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrofica, etc.), una enfermedad o trastorno asociado al crecimiento del musculo esqueletico y/o metabolismo, sfndrome del ovario poliqufstico, ateroesclerosis, cancer, una enfermedad o trastorno asociado a apoptosis, una enfermedad o trastorno asociado con envejecimiento y senescencia.
5. 5. Un procedimiento in vitro para modular la expresion del Sustrato 2 del Receptor de Insulina (IRS2) en celulas o tejidos de un paciente que comprende: poner en contacto dichas celulas o tejidos con un oligonucleotido que se dirige a un transcrito antisentido natural del Sustrato 2 del Receptor de Insulina (IRS2); modulando de este modo la expresion del Sustrato 2 del Receptor de Insulina (IRS2), y donde el transcrito antisentido natural tiene la secuencia de acido nucleico tal como se expone en la SEQ ID NO: 3, o una variante de la misma que retiene la funcion del transcrito antisentido natural de la SEQ ID NO: 3.
6. 6. Uso de acuerdo con la reivindicacion 3o 4, oun oligonucleotido para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 4, o un procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 5, donde el oligonucleotido aumenta la expresion del Sustrato 2 del Receptor de Insulina (IRS2).
7. 7. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 o 6, o un oligonucleotido para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 o 6, o un procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 5 o 6, donde el oligonucleotido es monocatenario.
8. 8. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 o 6, o un oligonucleotido para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 o 6, o un procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 5 o 6, donde el oligonucleotido es un compuesto de siRNA.
9. 9. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 o 6 a 8, o un oligonucleotido para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 o 6 a 8, o un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, donde el oligonucleotido comprende al menos una de las SEQ ID NO: 6 a 9.
10. 10. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 o 6 a 9, o un oligonucleotido para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4, o 6 a 9, o un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, donde la expresion del Sustrato 2 del Receptor de Insulina (IRS2) aumenta al menos un 10 %.

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11. 11. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 o 6 a 10, o un oligonucleotido para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 o 6 a 10, o un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, donde el oligonucleotido comprende ademas una o mas modificaciones que comprenden:

    a. al menos un enlace internucleosfdico modificado seleccionado de entre: un fosforotioato, alquilfosfonato, fosforoditioato, alquilfosfonotioato, fosforamidato, carbamato, carbonato, triester de fosfato, acetamidato, ester carboximetflico y combinaciones de los mismos;

    b. al menos un nucleotido modificado seleccionado de entre: un acido nucleico peptfdico (PNA), un acido nucleico bloqueado (LNA), un acido arabino-nucleico, un analogo, un derivado, y combinaciones de los mismos; o

    c. al menos un resto de azucar modificado seleccionado de entre: un resto de azucar modificado con 2'-O- metoxietilo, un resto de azucar modificado con 2'-metoxi, un resto de azucar modificado con 2'-O-alquilo, un resto de azucar bicfclico, un resto de 2'-fluoro, y combinaciones de los mismos.
12. 12. Un oligonucleotido que es especfficamente hibridable a un transcrito antisentido natural de la SEQ ID NO: 3, o una variante de la misma que retiene la funcion del transcrito antisentido natural de la SEQ ID NO: 3, donde:

    a. el oligonucleotido es un compuesto de siRNA, que comprende opcionalmente al menos una de las SEQ ID NO: 69; o

    b. el oligonucleotido es un oligonucleotido monocatenario que comprende al menos una de las SEQ ID NO: 6-9; y donde, opcionalmente, el oligonucleotido tiene entre 10 y 30 nucleotidos de longitud.
13. 13. Un oligonucleotido de acuerdo con la reivindicacion 12, donde el oligonucleotido comprende, ademas, una o mas modificaciones que comprenden:

    a. al menos un enlace internucleosfdico modificado seleccionado de: un fosforotioato, alquilfosfonato, fosforoditioato, alquilfosfonotioato, fosforamidato, carbamato, carbonato, triester de fosfato, acetamidata, ester carboximetflico, y combinaciones de los mismos;

    b. al menos un nucleotido modificado seleccionado de entre: un acido nucleico peptfdico (PNA), un acido nucleico bloqueado (LNA), un acido arabino-nucleico, un analogo, un derivado, y combinaciones de los mismos; o

    c. al menos un resto de azucar modificado seleccionado de entre: un resto de azucar modificado con 2'-O- metoxietilo, un resto de azucar modificado con 2'-metoxi, un resto de azucar modificado con 2'-O-alquilo, un resto de azucar bicfclico, un resto de 2'-fluoro, y combinaciones de los mismos.
14. 14. Una composicion farmaceutica que comprende al menos un oligonucleotido que es especfficamente hibridable a un transcrito antisentido natural de la SEQ ID NO: 3, o una variante de la misma que retiene la funcion del transcrito antisentido natural de la SEQ ID NO: 3 y un excipiente farmaceuticamente aceptable; donde, opcionalmente, el oligonucleotido comprende una o mas modificaciones que comprenden:

    a. al menos un enlace internucleosfdico modificado seleccionado de: un fosforotioato, alquilfosfonato, fosforoditioato, alquilfosfonotioato, fosforamidato, carbamato, carbonato, triester de fosfato, acetamidata, ester carboximetflico, y combinaciones de los mismos;

    b. al menos un nucleotido modificado seleccionado de entre: un acido nucleico peptfdico (PNA), un acido nucleico bloqueado (LNA), un acido arabino-nucleico, un analogo, un derivado, y combinaciones de los mismos; o

    c. al menos un resto de azucar modificado seleccionado de entre: un resto de azucar modificado con 2'-O- metoxietilo, un resto de azucar modificado con 2'-metoxi, un resto de azucar modificado con 2'-O-alquilo, un resto de azucar bicfclico, un resto de 2'-fluoro, y combinaciones de los mismos.
15. 15. Una composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 14, donde el al menos un oligonucleotido:

    a. tiene entre 10 y 30 nucleotidos de longitud; y/o

    B. es un oligonucleotido de acuerdo con la reivindicacion 12 o 13.

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