ES2677070T3 - Tratamiento de enfermedades relacionadas con el regulador del desarrollo 1 asociado a interferón (ifrd1) mediante inhibición del transcrito antisentido natural al gen ifrd1 - Google Patents

Tratamiento de enfermedades relacionadas con el regulador del desarrollo 1 asociado a interferón (ifrd1) mediante inhibición del transcrito antisentido natural al gen ifrd1 Download PDF

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Abstract

Un oligonucleótido que se dirige a un transcrito antisentido natural del regulador del desarrollo 1 asociado a interferón (IFRD1) para uso como un compuesto terapéutico, donde el oligonucleótido aumenta la expresión del regulador del desarrollo 1 asociado a interferón (IFRD1); donde el transcrito antisentido natural tiene la secuencia de ácido nucleico tal como se expone en las SEQ ID NO: 2 al 6.

Description

DESCRIPCION
Tratamiento de enfermedades relacionadas con el regulador del desarrollo 1 asociado a interferon (ifrd 1) mediante inhibicion del transcrito antisentido natural al gen ifrdl 5
CAMPO DE LA INVENCION
La presente solicitud reivindica la prioridad de la solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/407045, depositada el miercoles, 27 de octubre de 2010.
10
Aspectos de la divulgacion comprenden oligonucleotidos que modulan la expresion y/o la funcion del gen IFRD1 y moleculas asociadas.
ANTECEDENTES
15
La hibridacion ADN-ARN y ARN-ARN son importantes para muchos aspectos de la funcion del acido nucleico incluyendo replicacion, transcripcion y traduccion del ADN. La hibridacion tambien es fundamental para una variedad de tecnologfas que tanto detectan un acido nucleico particular como alteran su expresion. Los nucleotidos antisentido, por ejemplo, alteran la expresion genica hibridandose con ARN diana, interfiriendo asf con el splicing, la 20 transcripcion, la traduccion y la replicacion de ARN. El ADN antisentido tiene la caracterfstica anadida de que los hfbridos de ADN-ARN sirven de sustrato para la digestion por ribonucleasa H, una actividad que esta presente en la mayorfa de los tipos de celulas. Las moleculas antisentido pueden suministrarse al interior de celulas, como es el caso para oligodesoxinucleotidos (ODN), o pueden expresarse a partir de genes endogenos como moleculas de ARN. La FDA recientemente aprobo un farmaco antisentido, VITRAVENE™ (para el tratamiento de retinitis por 25 citomegalovirus), que refleja que el antisentido tiene utilidad terapeutica.
YuanYuan Gu y col., (Nature, Volume 458, No. 7241, pages 1039-1042, 2009) ensena la identificacion del IFRD1 como un gen modificador para la enfermedad de fibrosis qufstica pulmonar.
30 RESUMEN
La invencion se define mediante las reivindicaciones. Aquellos aspectos/casos de la presente divulgacion que constituyen la invencion se definen por las reivindicaciones.
35 Este resumen se proporciona para presentar un resumen de la divulgacion para indicar brevemente la naturaleza y sustancia de la divulgacion. Se presenta en el entendimiento de que no se utilizara para interpretar ni limitar el alcance o significado de las reivindicaciones.
En un aspecto, la divulgacion proporciona procedimientos de inhibicion de la accion de un transcrito antisentido 40 natural usando uno o mas oligonucleotidos antisentido dirigidos a cualquier region del transcrito antisentido natural produciendo la regulacion positiva del gen sentido correspondiente. Tambien esta contemplado en el presente documento que la inhibicion del transcrito antisentido natural pueda conseguirse mediante ARNsi, ribozimas y moleculas pequenas, que se considera que estan dentro del alcance de la presente divulgacion.
45 Un aspecto proporciona un procedimiento de modulacion de la funcion y/o la expresion de un polinucleotido de un gen IFRD1 en sistemas biologicos, incluyendo entre otros, celulas o tejidos del paciente in vivo o in vitro que comprenden poner en contacto dicho sistema biologico o dichas celulas o tejidos con un oligonucleotido antisentido de aproximadamente 5 a 30 nucleotidos de longitud, donde dicho oligonucleotido tiene al menos un 50 % de identidad de secuencia con un complemento inverso de un polinucleotido que comprende de 5 a 30 nucleotidos 50 consecutivos dentro de los nucleotidos 1 a 740 de la SEQ ID NO: 2 o 1 a 418 de la SEQ ID NO: 3 o 1 a 540 de la SEQ ID NO: 4 o 1 a 546 de la SEQ ID NO: 5 o 1 a 429 de la SEQ ID NO: 6 o 1 a 429 de la SEQ ID NO: 7 modulando de este modo la funcion y/o la expresion del polinucleotido del gen IFRD1 en dicho sistema biologico que incluye dichas celulas o tejidos del paciente in vivo o in vitro.
55 En otro aspecto, un oligonucleotido se dirige a una secuencia antisentido natural de polinucleotidos del gen IFRD1 presentes en un sistema biologico, por ejemplo, los nucleotidos expuestos en las SEQ ID NO: 2 a 7, y cualquier variante, alelo, homologo, mutante, derivado, fragmento y secuencia complementaria a los mismos. Ejemplos de oligonucleotidos antisentido se exponen como las SEQ ID NO: 8 al 16.
60 Otro aspecto proporciona un procedimiento de modulacion de la funcion y/o la expresion de un polinucleotido un gen
IFRDI en celulas o tejidos del paciente in vivo o in vitro, que comprende poner en contacto dichas celulas o tejidos con un oligonucleotido antisentido de 5 a 30 nucleotidos de longitud, donde dicho oligonucleotido tiene al menos un 50 % de identidad de secuencia con un complemento inverso del antisentido del polinucleotido del gen IFRD1; modulando de este modo la funcion y/o la expresion del polinucleotido del gen lFRD1 en celulas o tejidos del 5 paciente in vivo o in vitro.
Otro aspecto proporciona un procedimiento de modulacion de la funcion y/o la expresion de un polinucleotido de un gen IFRD1 en celulas o tejidos del paciente in vivo o in vitro, que comprende poner en contacto dichas celulas o tejidos con un oligonucleotido antisentido de 5 a 30 nucleotidos de longitud, donde dicho oligonucleotido tiene al 10 menos un 50 % de identidad de secuencia con un oligonucleotido antisentido con respecto a un polinucleotido del gen IFRD1; modulando de este modo la funcion y/o la expresion del polinucleotido del gen IFRD1 en celulas o tejidos del paciente in vivo o in vitro.
En otro aspecto, la divulgacion comprende un procedimiento para la modulacion de la funcion o expresion de un 15 polinucleotido del gen IFRD1 en un sistema biologico que comprende poner en contacto dicho sistema biologico con al menos un oligonucleotido antisentido dirigido a una transcrito antisentido natural del polinucleotido del gen IFRD1 modulando asf la funcion y/o expresion del polinucleotido del gen IFRD1 en dicho sistema biologico.
En otro aspecto, la divulgacion comprende un procedimiento para la modulacion de la funcion o expresion de un 20 polinucleotido del gen IFRD1 en un sistema biologico que comprende poner en contacto dicho sistema biologico con al menos un oligonucleotido antisentido dirigido a una region de un transcrito antisentido natural del polinucleotido del gen IFRD1 modulando de este modo la funcion y/o expresion del polinucleotido del gen IFRD1 en dicho sistema biologico.
25 En otro aspecto, la divulgacion comprende un procedimiento para aumentar la funcion y/o expresion de un polinucleotido del gen IFRD1 que tiene la SEQ ID NO:1 en un sistema biologico que comprende ponerse en contacto dicho sistema biologico con al menos un oligonucleotido antisentido dirigido a una transcrito antisentido natural de dicho polinucleotido del gen IFRD1 modulando asf la funcion y/o expresion de dicho polinucleotido del gen IFRD1 o expresion producto del mismo.
30
En otro aspecto, la divulgacion comprende un procedimiento para aumentar la funcion y/o expresion de un polinucleotido del gen IFRD1 que tiene la SEQ ID NO: 1 en un sistema biologico que comprende poner en contacto dicho sistema biologico con al menos un oligonucleotido antisentido dirigido a un transcrito antisentido natural de dicho polinucleotido del gen IFRD1 aumentando asf la funcion y/o expresion de dicho polinucleotido del gen IFRD1 o 35 la expresion producto del mismo, donde los transcritos antisentido naturales se seleccionan a partir de las SEQ ID NO: 2 al 7.
En otro aspecto, la divulgacion comprende un procedimiento para aumentar la funcion y/o expresion de un polinucleotido del gen IFRD1 que tiene la SEQ ID No. 1 en un sistema biologico que comprende poner en contacto 40 dicho sistema biologico con al menos un oligonucleotido antisentido dirigido a una transcrito antisentido natural de dicho polinucleotido del gen IFRD1 aumentando asf la funcion y/o expresion de dicho polinucleotido del gen IFRD1 o la expresion producto del mismo, donde los transcritos antisentido naturales se seleccionan a partir de las SEQ ID NO: 2 a 7 y donde los oligonucleotidos antisentido se seleccionan a partir de al menos una de las SEQ ID NO: 8 a 16.
45
En un aspecto, una composicion comprende uno o mas oligonucleotidos antisentido que se unen a polinucleotidos del gen IFRD1 sentido y/o antisentido.
En un aspecto, los oligonucleotidos comprenden uno o mas nucleotidos modificados o sustituidos.
50
En un aspecto, los oligonucleotidos comprenden uno o mas enlaces modificados.
En otro aspecto mas, los nucleotidos modificados comprenden bases modificadas que comprenden fosforotioato, metilfosfonato, acidos nucleicos peptfdicos, 2'-O-metilo, fluoro- o carbono, metileno u otras moleculas de acido 55 nucleico bloqueado (LNA). Preferentemente, los nucleotidos modificados son moleculas de acido nucleico bloqueado, que incluyen a-L-LNA.
En un aspecto, los oligonucleotidos se administran a un paciente por cualquier via de administracion incluyendo, pero sin limitacion, via oral, transdermica, a traves de medios de inhalacion, por via subcutanea, intramuscular, 60 intravenosa o intraperitoneal.
En un aspecto, los oligonucleotidos se administran en una composicion farmaceutica. Un regimen de tratamiento comprende administrar los compuestos antisentido al menos una vez al paciente; sin embargo, este tratamiento puede modificarse para comprender multiples dosis durante un periodo de tiempo. El tratamiento puede combinarse 5 con uno o varios de otros tipos de terapias.
En un aspecto, los oligonucleotidos estan encapsulados en un liposoma o unidos a una molecula portadora (por ejemplo, colesterol, peptido TAT).
10 Otros aspectos se describen infra.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
La figura 1 es un grafico de resultados de PCR en tiempo real que muestra el cambio en veces + la desviacion estandar en ARNm de IFRD1 despues del tratamiento de celulas 518A2 con oligonucleotidos de fosforotioato 15 introducidos usando Lipofectamine 2000, en comparacion con el control. Las barras indicadas como CUR-0498, CUR-0496, CUR-0500, CUR-0484, CUR-0488, CUR-0486, CUR-0492, CUR-0490 y CUR-0494 se corresponden con muestras tratadas con las SEQ ID NO: 15,14,16, 8, 10,9, 12, 11 y 13 respectivamente.
Descripcion del listado de secuencias: SEQ ID NO: 1: 'Regulador del desarrollo 1 asociado a interferon' (IFPD1) de 20 Homo sapiens, variante de transcripcion 3, ARNm (NCBI n.° de acceso: NM_001007245); SEQ ID NO: 2: Secuencia antisentido natural de IFRD1 (Hs.657074); SEQ ID NO: 3: Secuencia antisentido natural de IFRD1 (Hs.642044); SEQ ID NO: 4: Secuencia antisentido natural de IFRD1 (Hs.709100); SEQ ID NO: 5: Secuencia antisentido natural de IFRD1 (Inversa de CD673697); SEQ ID NO: 6: Secuencia antisentido natural de IFRD1 (Inversa de AA625894); SEQ ID No: 7: Secuencia antisentido natural de IFRD1 (Inversa de DB508733); SeQ ID NO: 8 a 16: 25 Oligonucleotidos antisentido y SEQ ID NO: 17 a 25; los oligonucleotidos sentido correspondientes al complemento inverso del oligonucleotido antisentido; SEQ ID NO: 8 al 16. "r" indica ARN
DESCRIPCION DETALLADA
30 Varios aspectos de la divulgacion se describen a continuacion con referencia a aplicaciones de ejemplo para ilustracion. Debe entenderse que los numerosos detalles, relaciones y procedimientos especfficos se exponen para proporcionar un entendimiento completo de la divulgacion. Un experto en la materia relevante, sin embargo, reconocera facilmente que la divulgacion puede ponerse en practica sin uno o mas de los detalles especfficos o con otros procedimientos. La presente divulgacion no esta limitada por el orden de actos o acontecimientos, ya que 35 algunos actos pueden producirse en diferentes ordenes y/o simultaneamente con otros actos o acontecimientos. Ademas, no todos los actos o acontecimientos ilustrados son requeridos para implementar una metodologfa de acuerdo con la presente divulgacion.
Todos los genes, nombres de genes, y productos genicos divulgados en el presente documento pretenden 40 corresponderse a homologos de cualquier especie para la cual las composiciones y procedimientos divulgados en el presente documento son aplicables. De este modo, los terminos incluyen, aunque sin limitarse a, genes y productos genicos de seres humanos y ratones. Se entiende que, cuando se divulga un gen o producto genico de una especie particular, esta divulgacion pretende ser ejemplar solamente, y no se interpreta como una limitacion, a menos que el contexto en el que aparece lo indique claramente. De este modo, por ejemplo, para los genes divulgados en el 45 presente documento que en algunos aspectos se refieren a secuencias de acidos nucleicos y de aminoacidos de mamffero pretenden englobar genes homologos y/u ortologos y productos genicos de otros animales que incluyen, entre otros, a otros mamfferos, peces, anfibios, reptiles y aves. En un aspecto, los genes o secuencias de acidos nucleicos son humanos.
50 Definiciones
La terminologfa usada en el presente documento es con el fin de describir aspectos particulares solamente y no pretende ser limitante de la divulgacion. Tal como se utilizan en este documento, se pretende que las formas en singular “un”, “una”, “el” y “la” incluyan tambien las formas plurales, a menos que el contexto indique claramente lo 55 contrario. Ademas, siempre que las expresiones "que incluye", "incluyen", "que tiene", "tiene", "con", o variantes de los mismos se usan en la descripcion detallada y/o las reivindicaciones, dichas expresiones pretenden ser inclusivas de una manera similar a la expresion "que comprende".
El termino «alrededor de» o «aproximadamente» significa dentro de un intervalo de error aceptable para el valor 60 particular como se ha determinado por un experto habitual en la materia, que dependera en parte de como se mide o
determina el valor, es decir, las limitaciones del sistema de medicion. Por ejemplo, "alrededor de" puede significar 1 o mas de 1 de desviacion estandar, conforme a la practica de la tecnica. Como alternativa, «aproximadamente» puede significar un intervalo de hasta el 20%, preferentemente hasta el 10%, mas preferentemente hasta el 5%, y mas preferentemente todavfa hasta el 1% de un valor dado. De manera alternativa, en particular con respecto a los 5 sistemas o procesos biologicos, el termino puede significar un orden de magnitud de un valor preferentemente comprendido en 5 veces y mas preferentemente, comprendido en 2 veces. En los casos en los que se describen valores particulares en la solicitud y las reivindicaciones, a menos que se exprese lo contrario, el termino «alrededor de» significa que se debe asumir que el valor se encuentra comprendido en un intervalo de error aceptable para el valor particular.
10
Tal como se usa en el presente documento, el termino "ARNm" significa el/los transcrito(s) de ARNm actualmente conocidos de un gen elegido como diana, y cualquier transcrito adicional que pueda ser dilucidado.
Por "oligonucleotidos antisentido" o "compuesto antisentido" se indica una molecula de ARN o de ADN que se une a 15 otro ARN o ADN (ARN, ADN diana). Por ejemplo, si este es un oligonucleotido de ARN, se une a otra diana de ARN por medio de interacciones ARN-ARN y altera la actividad del ADN diana. Un oligonucleotido antisentido puede regular positivamente o regular negativamente la expresion y/o funcion de un polinucleotido particular. La definicion pretende comprender cualquier molecula de ARN o ADN extrana que es util desde un punto de vista terapeutico, de diagnostico u otro. Dichas moleculas incluyen, por ejemplo, moleculas de ARN o ADN antisentido, ARN de 20 interferencia (ARNi), micro ARN, moleculas de ARN senuelo, siRNA, ARN enzimatico, ARN de edicion terapeutica y ARN agonista y antagonista, compuestos oligomericos antisentido, oligonucleotidos antisentido, oligonucleotidos de secuencia gufa externa (EGS), agentes de splicing alternativos, cebadores, sondas y otros compuestos oligomericos que hibridan con al menos una parte del acido nucleico diana. Por lo tanto, estos compuestos pueden introducirse en forma de compuestos oligomericos monocatenarios, bicatenarios, parcialmente monocatenarios, o circulares.
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En el contexto de esta divulgacion, el termino "oligonucleotido" se refiere a un oligomero o polfmero de acido ribonucleico (ARN) o acido desoxirribonucleico (ADN) o mimeticos de los mismos. El termino "oligonucleotido" tambien incluye oligomeros lineales o circulares de monomeros o enlaces naturales y/o modificados, que incluyen desoxirribonucleosidos, ribonucleosidos, formas sustituidas y alfa-anomeras de los mismos, acidos nucleicos 30 peptfdicos (PNA), acidos nucleicos bloqueados (LNA), fosforotioato, metilfosfonato y similares. Los oligonucleotidos son capaces de unirse especfficamente a un polinucleotido diana por medio de un patron regular de interacciones monomero a monomero, tales como tipo de apareamiento de bases de Watson-Crick, tipos de apareamiento de bases de Hoogsteen o Hoogsteen inversa, o similares.
35 El oligonucleotido puede ser "quimerico", es decir, estar compuesto de diferentes regiones. En el contexto de esta divulgacion los compuestos "quimericos" son oligonucleotidos, que contienen dos o mas regiones qufmicas, por ejemplo, una o mas regiones de ADN, una o mas regiones de aRn, una o mas regiones de PNA, etc. Cada region qufmica esta compuesta por al menos una unidad monomerica, es decir, un nucleotido en el caso de un compuesto de oligonucleotidos. Estos oligonucleotidos normalmente comprenden al menos una region donde el oligonucleotido 40 se modifica con el fin de presentar una o mas propiedades deseadas. Las propiedades deseadas del oligonucleotido incluyen, entre otras, por ejemplo, resistencia incrementada a la degradacion por nucleasas, captacion celular incrementada, y/o afinidad de union incrementada para el acido nucleico diana. Las diferentes regiones del oligonucleotido pueden, por lo tanto, tener diferentes propiedades. Los oligonucleotidos quimericos de la presente divulgacion pueden formarse como estructuras mixtas de dos o mas oligonucleotidos, oligonucleotidos modificados, 45 oligonucleosidos y/o analogos de oligonucleotido, tal como se ha descrito anteriormente.
El oligonucleotido puede estar compuesto por regiones que pueden enlazarse en "registro", es decir, cuando los monomeros se enlazan consecutivamente, como en ADN nativo, o se enlazan mediante espaciadores. Se pretende que los espaciadores constituyan un "puente" covalente entre las regiones y tengan, en casos preferidos, una 50 longitud que no supere aproximadamente los 100 atomos de carbono. Los espaciadores pueden portar diferentes funcionalidades, por ejemplo, tener carga positiva o negativa, portar propiedades de union a acido nucleico especiales (intercaladores, ligantes de surcos, toxinas, fluoroforos, etc.), ser lipofilos, inducir estructuras secundarias especiales como, por ejemplo, peptidos que contienen alanina que inducen helices alfa.
55 Tal y como se usan en el presente documento, "IFRD1" y "regulador del desarrollo 1 asociado a interferon" incluyen todos los miembros de la familia, mutantes, alelos, fragmentos, especies, secuencias codificantes y no codificantes, hebras de polinucleotidos sentido y antisentido, etc.
Tal como se usan en el presente documento, los terminos "protefna PC4 inducible por factor de crecimiento 60 nervioso", "PC4", "TIS7", "IFRdl", "regulador del desarrollo 1 asociado a interferon" e "IFRD1" son considerados lo
mismo en la bibliograffa y se usan indistintamente en la presente solicitud.
Tal como se usa en el presente documento, la expresion "oligonucleotido especffico para" u "oligonucleotido que se dirige a" se refiere a un oligonucleotido que tiene una secuencia (i) capaz de formar un complejo estable con una 5 parte del gen elegido como diana, o (ii) capaz de formar un duplex estable con una parte de un transcrito de ARNm del gen elegido como diana. La estabilidad de los complejos y los duplex puede determinarse mediante calculos teoricos y/o ensayos in vitro. Ensayos a modo de ejemplo para determinar la estabilidad de complejos y duplex de hibridacion se describen en los ejemplos mas adelante.
10 Tal como se usa en el presente documento, la expresion “acido nucleico diana” engloba ADN, ARN (que comprende pre-ARNm y ARNm) transcrito a partir de dicho ADN, y tambien ADNc derivado de dicho ARN, secuencias codificantes, no codificantes, polinucleotidos sentido o antisentido. La hibridacion especffica de un compuesto oligomerico con su acido nucleico diana interfiere en la funcion normal del acido nucleico. Esta modulacion de la funcion de un acido nucleico diana por compuestos, que se hibridan especfficamente con el, se denomina 15 generalmente “antisentido”. Las funciones de ADN con las que interferiran incluyen, por ejemplo, la replicacion y transcripcion. Las funciones de ARN con las que interferiran incluyen todas las funciones vitales tales como, por ejemplo, translocalizacion del ARN al sitio de traduccion de protefna, traduccion de protefna desde ARN, splicing del ARN para dar una o mas especies de ARNm, y actividad catalftica que puede acoplarse en o facilitarse por el ARN. El efecto global de dicha interferencia con las funciones del acido nucleico diana es la modulacion de la expresion de 20 un producto codificado u oligonucleotidos.
El ARN de interferencia "ARNi" esta mediada por moleculas de ARN bicatenario (ARNdc) que tienen homologfa especffica de secuencia con sus secuencias de acido nucleico «diana». En ciertos aspectos de la presente divulgacion, los mediadores son duplex de ARN "de interferencia pequena" (siRNA) de 5-25 nucleotidos. Los siRNA 25 se derivan a partir del procesamiento del dsARN mediante una enzima RNasa conocida como Dicer. Los productos duplex son reclutados en un siRNA multiprotefna denominado RISC (complejo de silenciamiento inducido por ARN). Sin desear cenirse a ninguna teorfa particular, se cree entonces que un RlSc es guiado a un acido nucleico diana (adecuadamente ARNm), en el que el duplex de siRNA interactua de una forma especffica de secuencia para mediar en la escision en un modo catalftico. Los ARN de interferencia pequenos que pueden usarse de acuerdo con la
30 presente divulgacion pueden sintetizarse y usarse de acuerdo con procedimientos que son bien conocidos en la
tecnica y que seran familiares para el experto en la materia. Los ARN de interferencia pequenos para su uso en los procedimientos de la presente divulgacion comprenden adecuadamente entre aproximadamente 1 y
aproximadamente 50 nucleotidos (nt). En los ejemplos de aspectos no limitantes, los siRNA pueden comprender de aproximadamente 5 a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 nt, de 35 aproximadamente 10 a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 nt, o
aproximadamente 20-25 nucleotidos.
La seleccion de los oligonucleotidos apropiados se facilita usando programas informaticos que alinean automaticamente secuencias de acido nucleico e indican regiones de identidad u homologfa. Dichos programas se 40 usan para comparar secuencias de acidos nucleicos obtenidas, por ejemplo, buscando en bases de datos tales como GenBank o secuenciando productos de PCR. La comparacion de secuencias de acidos nucleicos de un intervalo de especies permite la seleccion de secuencias de acidos nucleicos que muestran un grado de identidad apropiado entre especies. En el caso de genes que no han sido secuenciados, se realizan Southern blots para permitir una determinacion del grado de identidad entre genes en especies diana y otras especies. Realizando 45 Southern blots a grados de astringencia variables, tal como es muy conocido en la tecnica, es posible obtener una medida aproximada de la identidad. Estos procedimientos permiten la seleccion de oligonucleotidos que muestran un alto grado de complementariedad con secuencias de acido nucleico diana en un sujeto a controlar y un menor grado de complementariedad con secuencias de acido nucleico correspondientes en otras especies. Un experto en la materia se dara cuenta de que hay libertad considerable en la seleccion de regiones apropiadas de genes para su 50 uso en la presente divulgacion.
Por “ARN enzimatico” se indica una molecula de ARN con actividad enzimatica (Cech, (1988) J. American. Med. Assoc. 260, 3030-3035). Los acidos nucleicos enzimaticos (ribozimas) actuan uniendose primero a un ARN diana. Dicha union se produce a traves de la parte de union diana de un acido nucleico enzimatico que se mantiene en 55 estrecha proximidad a una parte enzimatica de la molecula que actua para escindir el ARN diana. De este modo, el acido nucleico enzimatico reconoce primero y luego se une a ARN diana mediante apareamiento de bases, y una vez unido al sitio correcto, actua enzimaticamente para cortar el ARN diana.
Por “ARN senuelo” se indica una molecula de ARN que imita el dominio de union natural para un ligando. El ARN 60 senuelo compite, por lo tanto, con la diana de union natural para la union de un ligando especffico. Por ejemplo, se
ha mostrado que la sobreexpresion de ARN de respuesta de activacion en trans (TAR) de VIH puede actuar como un "senuelo" y se une de forma eficiente a la protefna tat de VIH, impidiendo de este modo que se una a secuencias TAR codificadas por el ARN de VIH. Esto se indica que es un ejemplo especifico. Los expertos en la materia reconoceran que esto es solo un ejemplo, y facilmente pueden generarse otros aspectos usando tecnicas 5 generalmente conocidas en la tecnica.
Tal como se usa en el presente documento, el termino "monomeros" normalmente indica monomeros enlazados por enlaces fosfodiester o analogos de los mismos para formar oligonucleotidos que varfan en tamano entre unas pocas unidades monomericas, por ejemplo, entre aproximadamente 3-4, y aproximadamente varios cientos de unidades 10 monomericas. Los analogos de enlaces fosfodiester incluyen: fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonatos, fosforoselenoato, fosforamidato y similares, tal como se describe mas completamente mas adelante.
El termino “nucleotido” cubre nucleotidos de origen natural, asf como nucleotidos no de origen natural. Debe ser evidente para el experto en la materia que diversos nucleotidos que se consideraron anteriormente “no de origen 15 natural” se han descubierto posteriormente en la naturaleza. De este modo, "nucleotidos" incluye no solamente las moleculas que contienen heterociclos de purina y pirimidina conocidas, sino tambien analogos heterocfdiclicos y tautomeros de las mismas. Ejemplos ilustrativos de otros tipos de nucleotidos son moleculas que contienen adenina, guanina, timina, citosina, uracilo, purina, xantina, diaminopurina, 8-oxo- N6-metiladenina, 7-deazaxantina, 7- deazaguanina, N4,N4-etanocitosina, N6,N6-etano-2,6- diaminopurina, 5-metilcitosina, 5-alquinil(C3-C6)-citosina, 520 fluorouracilo, 5-bromouracilo, seudoisocitosina, 2-hidroxi-5-metil-4-triazolopiridina, isocitosina, isoguanina, inosina y los nucleotidos "no de origen natural" descritos en Benner y col., patente de EE.UU. n.° 5.432.272. El termino "nucleotido" pretende cubrir todos y cada uno de estos ejemplos, ademas de analogos y tautomeros de los mismos. Nucleotidos especialmente interesantes son aquellos que contienen adenina, guanina, timina, citosina y uracilo, que se consideran como los nucleotidos de origen natural en relacion con la aplicacion terapeutica y diagnostica en seres 25 humanos. Los nucleotidos incluyen los azucares naturales 2'-desoxi y 2'-hidroxilo, p. ej., como se describe en Kornberg and Baker, DNA Replication, 2nd Ed. (Freeman, San Francisco, 1992) ademas de sus analogos.
"Analogos" en referencia a nucleotidos, incluye nucleotidos sinteticos que tienen restos de bases modificados y/o restos de azucar modificados (vease, por ejemplo, descrito generalmente por Scheit, Nucleotide Analogs, John 30 Wiley, New York, 1980; Freier & Altmann, (1997) Nucl. Acid. Res., 25(22), 4429- 4443,Toulme, J.J., (2001) Nature Biotechnology 19:17-18;Manoharan M., (1999) Biochemica et Biophysica Acta 1489:117-139;Freier S. M., (1997) Nucleic Acid Research, 25:4429-4443,Uhlman, E., (2000) Drug Discovery & Development, 3: 203-213,Herdewin P., (2000) Antisense & Nucleic Acid Drug Dev., 10:297-310); 2'-O, 3'-C-enlazados[3.2.0]bicicloarabinonucleosidos. Dichos analogos incluyen nucleotidos sinteticos disenados para mejorar propiedades de union, p. ej., la estabilidad, 35 especificidad del duplex o el triplex, o similares.
Tal como se usa en el presente documento, "hibridacion” significa el apareamiento de cadenas sustancialmente complementarias de compuestos oligomericos. Un mecanismo de apareamiento implica la formacion de puentes de hidrogeno, que pueden ser puentes de hidrogeno de Watson-Crick, Hoogsteen o de Hoogsteen inverso, entre bases 40 de nucleosidos o de nucleotidos (nucleotidos) complementarias de las cadenas de compuestos oligomericos. Por ejemplo, la adenina y la timina son nucleotidos complementarios que se aparean mediante la formacion de puentes de hidrogeno. La hibridacion puede producirse en circunstancias variables.
Un compuesto antisentido es "especificamente hibridable" cuando la union del compuesto al acido nucleico diana 45 interfiere en la funcion normal del acido nucleico diana para causar una modulacion de la funcion y/o la actividad, y existe un grado de complementariedad suficiente para evitar union inespecifica del compuesto antisentido a secuencias de acido nucleico no diana en condiciones en las que se desea union especifica, es decir, en condiciones fisiologicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapeutico, y en condiciones en las que se realizan ensayos en el caso de ensayos in vitro.
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Tal como se usa en el presente documento, la frase "condiciones de hibridacion astringentes" o "condiciones astringentes" se refiere a condiciones en las que un compuesto de la divulgacion hibridara con su secuencia diana, pero con un numero minimo de otras secuencias. Las condiciones astringentes son dependientes de secuencia y seran diferentes en diferentes circunstancias y en el contexto de esta divulgacion, "condiciones astringentes" en las 55 que compuestos oligomericos hibridan con una secuencia diana se determinan mediante la naturaleza y la composicion de los compuestos oligomericos y los ensayos en los que estan siendo investigados. En general, las condiciones de hibridacion astringentes comprenden bajas concentraciones (<0,15 M) de sales con cationes inorganicos tales como Na+ o K+ (es decir, baja fuerza ionica), temperatura superior a 20 °C - 25 °C por debajo de la Tm del complejo de compuesto oligomerico: secuencia diana, y la presencia de desnaturalizantes tales como 60 formamida, dimetilformamida, dimetilsulfoxido, o el detergente dodecilsulfato de sodio (SDS). Por ejemplo, la tasa de
hibridacion disminuye un 1,1% por cada 1% de formamida. Un ejemplo de una condicion de hibridacion de alta astringencia es 0,1X tampon cloruro sodico-citrato sodico (SSC)/0,1 % (peso/volumen) de SDS a 60 °C durante 30 minutos.
5 “Complementario”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de apareamiento preciso entre dos nucleotidos en una o dos cadenas oligomericas. Por ejemplo, si una nucleobase en cierta posicion de un compuesto antisentido es capaz de formar puentes de hidrogeno con una nucleobase en cierta posicion de un acido nucleico diana, siendo dicho acido nucleico diana un ADN, ARN, o molecula de oligonucleotido, entonces la posicion de la formacion de puentes de hidrogeno entre el oligonucleotido y se considera que el acido nucleico diana es una 10 posicion complementaria. El compuesto oligomerico y el ADN, ARN, o molecula de oligonucleotido, adicional son complementarios entre si cuando un numero suficiente de posiciones complementarias en cada molecula estan ocupadas por nucleotidos que pueden formar puentes de hidrogeno entre si. De este modo, "especfficamente hibridable" y "complementariedad" son expresiones que se usan para indicar un grado suficiente de apareamiento preciso o complementariedad sobre un numero suficiente de nucleotidos de modo que se produzca union estable y 15 especffica entre el compuesto oligomerico y un acido nucleico diana.
Se entiende en la tecnica que no es necesario que la secuencia de un compuesto oligomerico sea un 100 % complementaria a la de su acido nucleico diana para ser especfficamente hibridable. Ademas, un oligonucleotido puede hibridarse sobre uno o mas segmentos, de modo que segmentos intermedios o adyacentes no esten 20 implicados en el acontecimiento de hibridacion (por ejemplo, una estructura en bucle, desapareamiento o estructura de horquilla). Los compuestos oligomericos de la presente divulgacion comprenden al menos aproximadamente el 70%, o al menos aproximadamente el 75%, o al menos aproximadamente el 80%, o al menos aproximadamente el 85%, o al menos aproximadamente el 90%, o al menos aproximadamente el 95%, o al menos aproximadamente el 99%, de complementariedad de secuencia con una region diana dentro de la secuencia de acidos nucleicos diana a 25 la que se dirigen. Por ejemplo, un compuesto antisentido en el que 18 de los 20 nucleotidos del compuesto antisentido son complementarios a una region diana y, por lo tanto, hibridarfan especfficamente, representarfa el 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, los nucleotidos no complementarios restantes pueden agruparse o intercalarse con nucleotidos complementarios y no necesitan ser contiguos entre si o a nucleotidos complementarios. Por lo tanto, un compuesto antisentido que tiene 18 nucleotidos de longitud que tiene 4 (cuatro) 30 nucleotidos no complementarios que estan flanqueados por dos regiones de complementariedad completa con el acido nucleico diana tendrfa el 77,8 % de complementariedad global con el acido nucleico diana y de este modo estarfa dentro del alcance de la presente divulgacion. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una region de un acido nucleico diana puede determinarse rutinariamente usando programas BLAST (herramientas de busqueda de alineamientos locales basicos) y programas PowerBLAST conocidos en la tecnica. El 35 porcentaje de homologfa, identidad de secuencias o complementariedad pueden determinarse por, por ejemplo, el programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), usando parametros por defecto, que usa el algoritmo deSmith y Waterman (Adv. Solic. Math., (1981) 2, 482-489).
40 Tal como se usa en el presente documento, la expresion "punto de fusion termico (Tm)" se refiere a la temperatura, bajo fuerza ionica, pH y concentracion de acido nucleico definidas, a la que el 50% de los oligonucleotidos complementarios a la secuencia diana hibridan con la secuencia diana en equilibrio. Normalmente, condiciones astringentes seran aquellas en las que la concentracion de sales es la concentracion de ion Na (u otras sales) de al menos aproximadamente 0,01 a 1,0 M a pH de 7,0 a 8,3 y la temperatura es al menos aproximadamente 30 °C para 45 oligonucleotidos cortos (p. ej., de 10 a 50 nucleotidos). Las condiciones estrictas pueden lograrse tambien con la adicion de agentes desestabilizadores, tales como formamida.
Tal como se usa en el presente documento, "modulacion" significa un incremento (estimulacion) o una disminucion (inhibicion) de la expresion de un gen.
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El termino "variante", cuando se usa en el contexto de una secuencia de polinucleotidos, puede englobar una secuencia de polinucleotidos relacionada con un gen de tipo silvestre. Esta definicion tambien puede comprender, por ejemplo, variantes "alelicas", de "splicing", de "especie" o "polimorficas". Una variante de corte y empalme puede tener identidad significativa con una molecula de referencia, pero generalmente tendra un mayor o menor numero de 55 polinucleotidos debido al corte y empalme alterno de exones durante el procesamiento de ARNm. El polipeptido correspondiente puede poseer dominios funcionales adicionales o una ausencia de dominios. Las variantes de especie son secuencias polinucleotfdicas que varfan de una especie a otra. Son de particular utilidad en la divulgacion variantes de productos genicos de tipo silvestre (wild type). Las variantes pueden resultar de al menos una mutacion en la secuencia de acidos nucleicos y pueden producir ARNm alterados o polipeptidos cuya estructura 60 o funcion puede o puede no alterarse. Cualquier gen natural o recombinante dado puede tener ninguna, una o
muchas formas alelicas. Cambios mutacionales comunes que dan lugar a variantes se atribuyen generalmente a deleciones, adiciones o sustituciones naturales de nucleotidos. Cada uno de estos tipos de cambios puede producirse solo, o en combinacion con los otros, una o mas veces en una secuencia dada.
5 Los polipeptidos resultantes generalmente tendran identidad significativa de aminoacidos los unos con respecto a los otros. Una variante polimorfica es una variacion en la secuencia de polinucleotidos de un gen particular entre individuos de una especie dada. Las variantes polimorficas tambien pueden englobar "polimorfismos de un solo nucleotido" (SNP), o mutaciones de una sola base en las que la secuencia de polinucleotidos varfa en una base. La presencia de SNP puede ser indicativa de, por ejemplo, una cierta poblacion con una propension por una patologfa, 10 es decir susceptibilidad frente a resistencia.
Los polinucleotidos derivados incluyen acidos nucleicos sometidos a modificacion qufmica, por ejemplo, sustitucion de hidrogeno por un grupo alquilo, acilo o amino. Los derivados, p. ej., oligonucleotidos derivados, pueden comprender partes no de origen natural, tales como restos de azucar alterados o enlaces inter-azucar. A modo de 15 ejemplo, entre estos estan fosforotioato y otras especies que contienen azufre que se conocen en la tecnica. Los acidos nucleicos derivados tambien pueden contener etiquetas, que incluyen radionucleotidos, enzimas, agentes fluorescentes, agentes quimioluminiscentes, agentes cromogenos, sustratos, cofactores, inhibidores, partfculas magneticas y similares.
20 Un polipeptido o peptido "derivado" es uno que se modifica, por ejemplo, por glucosilacion, pegilacion, fosforilacion, sulfatacion, reduccion/alquilacion, acilacion, acoplamiento qufmico o tratamiento suave con formalina. Un derivado tambien puede modificarse para contener una etiqueta detectable, tanto directa como indirectamente, que incluye, aunque no se limita a, un radioisotopo, etiqueta fluorescente y enzimatica.
25 Tal como se usa en el presente documento, el termino "animal" o "paciente" pretende comprender, por ejemplo, seres humanos, ovejas, alces, venados, ciervos mulos, visones, mamfferos, monos, caballos, ganado vacuno, cerdos, cabras, perros, gatos, ratas, ratones, aves, pollos, reptiles, peces, insectos y aracnidos.
"Mamffero" cubre mamfferos de sangre caliente que normalmente estan bajo atencion medica (por ejemplo, seres 30 humanos y animales domesticados). Los ejemplos incluyen felinos, caninos, equinos, bovinos y humanos, ademas de solo humanos.
"Tratar" o "tratamiento" cubre el tratamiento de una patologfa en un mamffero, e incluye: (a) prevenir que se produzca la patologfa en un mamffero, en particular, cuando dicho mamffero tiene predisposicion a la patologfa, pero 35 todavfa no se ha diagnosticado que la tenga; (b) inhibir la patologfa, por ejemplo, detener el desarrollo; y/o (c) aliviar la patologfa, por ejemplo, causando la regresion de la patologfa hasta que se alcance un criterio de valoracion deseado. Tratar tambien incluye la mejora de un sfntoma de una enfermedad (por ejemplo, reducir el dolor o molestia), donde dicha mejora puede o puede no afectar directamente la enfermedad (por ejemplo, causa, transmision, expresion, etc.).
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Tal como se usa en el presente documento "enfermedad o trastorno neurologico" se refiere a cualquier enfermedad o trastorno del sistema nervioso y/o del sistema visual. "Enfermedad o trastorno neurologico" incluye enfermedades o trastornos que implican al sistema nervioso central (cerebro, tronco del encefalo y cerebelo), el sistema nervioso periferico (incluyendo los nervios craneales), y el sistema nervioso autonomo (partes del cual estan ubicadas en el 45 sistema nervioso tanto central como periferico). Una enfermedad o trastorno neurologico incluye, pero sin limitarse a, afasia epileptiforme adquirida; encefalomielitis aguda diseminada; adrenoleucodistrofia; degeneracion macular relacionada con la edad; agenesia del cuerpo calloso; agnosia; sfndrome de Aicardi; enfermedad de Alexander; enfermedad de Alpers; hemiplejia alternante; enfermedad de Alzheimer; demencia vascular; esclerosis lateral amiotrofica; anencefalia; sfndrome de Angelman; angiomatosis; anoxemia; afasia; apraxia; quistes aracnoides; 50 aracnoiditis; malformacion de Anronl-Chiari; malformacion arteriovenosa; sfndrome de Asperger; ataxia- telangiectasia; trastorno por deficit de atencion con hiperactividad; autismo; disfuncion autonoma; dolor de espalda; enfermedad de Batten; enfermedad de Behcet; paralisis de Bell; blefaroespasmo esencial benigno; focal benigna; amiotrofia; hipertension intracraneal benigna; enfermedad de Binswanger; blefaroespasmo; sfndrome de Bloch Sulzberger; lesion del plexo braquial; absceso cerebral; dano cerebral; tumores cerebrales (incluyendo glioblastoma 55 multiforme); tumor espinal; sfndrome de Brown-Sequard; enfermedad de Canavan; sfndrome del tunel carpiano; causalgia; sfndrome de dolor central; mielinolisis pontina central; trastorno cefalico; aneurisma cerebral; arteriosclerosis cerebral; atrofia cerebral; gigantismo cerebral; paralisis cerebral; enfermedad de Charcot-Marie- Tooth; neuropatfa inducida por quimioterapia y dolor neuropatico; malformacion de Chiari; corea; polineuropatfa desmielinizante inflamatoria cronica; dolor cronico; sfndrome de dolor regional cronico; sfndrome de Coffin Lowry ; 60 coma, incluyendo estado vegetativo persistente; diplejfa facial congenita; degeneracion corticobasal; arteritis craneal;
craneosinostosis; enfermedad de Creutzfeldt-Jakob; trastornos traumaticos acumulativos; sfndrome de Cushing; enfermedad del cuerpo de inclusion citomegalica; infeccion por citomegalovirus; sfndrome de los ojos y pies danzantes; sfndrome de Dandy Walker; enfermedad de Dawson; sfndrome de Morsier; paralisis de Dejerine-Klumke; demencia; dermatomiositis; neuropatfa diabetica; esclerosis difusa; disautonomia; disgrafia dislexia; distonias;
5 encefalopatfa epileptica infantil temprana; sfndrome de la silla vacfa; encefalitis; encefaloceles; angiomatosis encefalotrigeminal; epilepsia; paralisis de Erb; temblor esencial; enfermedad de Fabry; sfndrome de Fahr; desmayo; paralisis espastica familiar; convulsiones febriles; sfndrome de Fisher; ataxia de Friedreich; demencia fronto-temporal y otras "tauopatfas"; enfermedad de Gaucher; sfndrome de Gerstmann; arteritis de celulas gigantes; enfermedad de inclusion celular gigante; leucodistrofia de celulas globoides; sfndorme de Guillain-Barre; mielopatfa asociada al Htlv- 10 1; enfermedad de Hallervorden-Spatz; lesion craneal; dolor de cabeza; espasmo hemifacial; paraplejfa espastica hereditaria; heredopatfa atactica polineuritiforme; herpes Zoster otico; infeccion por herpes; sfndrome de Hirayama; demencia y neuropatfa asociada al VIH (tambien manifestaciones neurologicas del sida); holoprosencefalia; enfermedad de Huntington y otras enfermedades de repeticion de poliglutamina; hidranencefalia; hidrocefalia; hipercortisolismo; hipoxia; encefalomielitis mediada por inmunidad; miositis del cuerpo de inclusion; incontinentia 15 pigmenti; enfermedad de almacenamiento de acido fitanico infantil; enfermedad de Refsum infantil; espasmos infantiles; miopatfa inflamatoria; quiste intracraneal; hipertension intracraneal; sfndrome de Joubert; sfndrome de Keams-Sayre; enfermedad de Kennedy sfndrome de Kinsboume; sfndrome de Klippel Feil; enfermedad de Krabbe; enfermedad de Kugelberg-Welander; kuru; enfermedad de Lafora; sfndrome miastenico de Lambert-Eaton; sfndrome de Landau-Kleffner; sfndrome medular lateral (Wallenberg); dificultades de aprendizaje; enfermedad de Leigh; 20 sfndrome de Lennox-Gustaut; sfndrome de Lesch-Nyhan; leucodistrofia; demencia del cuerpo de Lewy; lisencefalia; sfndrome de enclaustramiento; enfermedad de Lou Gehrig (es decir, enfermedad de las neuronas motoras o esclerosis lateral amiotrofica); enfermedad del disco lumbar; enfermedad de Lyme - secuelas neurologicas; enfermedad de Machado-Joseph; macrocefalia; megalencefalia; sfndrome de Melkersson-Rosenthal; l enfermedad de Meniere; meningitis; enfermedad de Menkes; leucodistrofia metacromatica; microcefalia; migrana; sfndrome de 25 Miller Fisher; mini-trazos; miopatfas mitocondriales; sfndrome de Moebius; amiotrofia monomelica; enfermedad de la neuronas motoras; enfermedad de Moyamoya; mucopolisacaridosis; demencia de infarto milti; neuropatfa motora multifocal; esclerosis multiple y otros trastornos desmielinizantes; atrofia de multiples sistemas con hipotension postural; distrofia muscular; miastenia gravis; esclerosis difusa mielinoclastica; encefalopatfa mioclonica de lactantes; mioclono; miopatfa; miotonfa congenita; narcolepsia; neurofibromatosis; sfndrome neuroleptico maligno; 30 manifestaciones neurologicas del sida; secuelas neurologicas del lupus; neuromiotonfa; lipofuscinosis ceroide neuronal; trastornos de migracion neuronal; enfermedad de Niemann-Pick; sfndrome de O'sullivan-Mcleod; neuralgia occipital; secuencia de disrafismo espinal oculto; sfndrome de Ohtahara; atrofia olivopontocerebelosa; opsoclono mioclono; neuritis optica; hipotension ortostatica; sfndrome de sobreuso; parestesias; enfermedad o trastorno neurodegenerativo (enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, esclerosis 35 lateral amiotrofica (ELA), demencia, esclerosis multiple y otras enfermedades y trastornos asociados con la muerte celular neuronal); paramiotonfa congenita; enfermedades paraneoplasicas; ataques paroxfsticos; sfndrome de Parry Romberg; enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher; paralisis periodicas; neuropatfa periferica; neuropatfa dolorosa y dolor neuropatico; estado vegetativo persistente; trastornos profundos del desarrollo; reflejo estornudo fotico; enfermedad de almacenamiento de acido fitanico; enfermedad de Pick; nervio pinzado; tumores pituitarios; 40 polimiositis; porencefalia; sfndrome post-polio; neuralgia postherpetica; encefalomielitis postinfecciosa; hipotension postural; sfndrome de Prader-Willi; esclerosis lateral primaria; enfermedades prionicas; atrofia hemifacial progresiva; leucoencefalopatfa multifocal progresiva; poliodistroffa esclerosante progresiva; paralisis supranuclear progresiva; pseudotumor cerebral; sfndrome de Ramsay-Hunt (tipos I y II); encefalitis de Rasmussen; sfndrome de distrofia simpatica refleja; enfermedad de Refsum; trastornos del movimiento repetitivo; lesiones por estres repetitivo; 45 sfndrome de piernas inquietas; mielopatfa asociada a retrovirus; sfndrome de Rett; sfndrome de Reye; baile de San Vito; enfermedad de Sandhoff; enfermedad de Schilder; esquizencefalia; displasia septo-optica; sfndrome del bebe sacudido; herpes; sfndrome de Shy-Drager; sfndrome de Sjogren; apnea del sueno; sfndrome de Soto; espasticidad; espina bifida; lesion de la medula espinal; tumores de la medula espinal; atrofia muscular en la columna; sfndrome de Stiff-Person; ictus; sfndrome de Sturge-Weber; panencefalitis esclerosante subaguda; encefalopatfa 50 arteriosclerotica subcortical; corea de Sydenham; sfncope; siringomielia; discinesia tardfa; enfermedad de Tay- Sachs; arteritis temporal; sfndrome de la medula espinal atada; enfermedad de Thomsen; sfndrome de la salida toracica; tic doloroso; paralisis de Todd; sfndrome de Tourette; ataque isquemico transitorio; encefalopatfas espongiformes transmisibles; mielitis transversa; lesion cerebral traumatica; temblor; neuralgia trigeminal; paraparesia espastica tropical; esclerosis tuberosa; demencia vascular (demencia de multiples infartos); vasculitis 55 incluyendo arteritis temporal; enfermedad de Von Hippel-Lindau; sfndrome de Wallenberg; enfermedad de Werdnig- Hoffman; sfndrome de West; latigazo; sfndrome de Williams; enfermedad de Wildon; y sfndrome de Zellweger.
Una "inflamacion" se refiere a las condiciones inflamatorias sistemicas y condiciones asociadas con la migracion a nivel local y la atraccion de monocitos, leucocitos y/o neutrofilos. Los ejemplos de la inflamacion incluyen, pero no se 60 limitan a, inflamacion resultante de la infeccion con microorganismos patogenos (incluyendo bacterias gram-positivas
y gram-negativas, virus, hongos y parasitos como protozoos y helmintos), rechazo al trasplante [incluido el rechazo a organos solidos como rinon, hfgado, corazon, pulmon o cornea, asf como rechazo a los trasplantes de medula osea incluyendo enfermedad injerto-contra-huesped (EICH)], o por reacciones alergicas autoinmunitarias localizadas agudas o cronicas. Las enfermedades autoinmunitarias incluyen glomerulonefritis aguda; artritis o artritis reactiva;
5 glomerulonefritis cronica; enfermedad inflamatoria intestinal, como enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa y enterocolitis necrotizante; hepatitis; sepsis; enfermedad hepatica alcoholica, esteatosis hepatica no alcoholica; transfusiones de granulocitos sfndromes asociados; dermatosis inflamatorias como la dermatitis de contacto, dermatitis atopica, psoriasis, lupus eritematoso sistemico (LES), tiroiditis autoinmune, esclerosis multiple, y algunas formas de diabetes autoinmune, o cualquier otro estado donde el ataque del propio sistema inmunologico del sujeto 10 se traduce en la destruccion del tejido patologico. Las reacciones alergicas incluyen asma alergico, bronquitis cronica y aguda de hipersensibilidad retardada. Estados de enfermedad inflamatoria sistemica incluyen inflamacion asociada con trauma, quemaduras, reperfusion tras eventos isquemicos (por ejemplo, eventos tromboticos en el corazon, el cerebro, el intestino o los vasos perifericos, incluyendo infarto de miocardio e ictus), sepsis, sfndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) o sfndrome de disfuncion organica multiple. El reclutamiento de celulas 15 inflamatorias tambien se produce en placas ateroscleroticas. Inflamacion incluye, pero sin limitarse a, linfoma no Hodgkin, enfermedad de Wegener, tiroiditis de Hashimoto, carcinoma hepatocelular, atrofia del timo, pancreatitis cronica, artritis reumatoide, osteoartritis, hiperplasia linfoide reactiva, carcinoma papilar, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, colecistitis aguda, colecistitis cronica, cirrosis, sialoadenitis cronica, peritonitis, pancreatitis aguda, pancreatitis cronica, gastritis cronica, adenomiosis, endometriosis, cervicitis aguda, cervicitis cronica la 20 hiperplasia linfoide, esclerosis multiple, hipertrofia secundaria a la purpura trombocitopenica idiopatica, nefropatfa por IgA primaria, lupus eritematoso sistemico, soriasis, enfisema pulmonar, pielonefritis cronica y cistitis cronica.
Composiciones y moleculas de polinucleotidos y oligonucleotidos
25 Objetivos: En un aspecto, las dianas comprenden secuencias de acido nucleico del regulador del desarrollo 1 asociado a interferon (IFRD1), incluyendo, sin limitacion, secuencias no codificantes y/o codificantes, sentido y/o antisentido asociadas al IFRD1.
El IFRD1 humano codifica una protefna prevista de 453 aminoacidos. Las secuencias de humano y rata estan 30 altamente conservadas (con una identidad del 90,2 %). El gen humano conduce al cromosoma 7q22-q31. El IFRD1 influye en la gravedad de la enfermedad letal heredara que obstruye y destruye los pulmones. Un estudio genetico demostro que pequenas variaciones del IFRD1 afectaron a la gravedad de los sfntomas de fibrosis qufstica en casi 3000 pacientes humanos. En ratones con la enfermedad, la eliminacion del gen redujo la inflamacion del pulmon. Los cientfficos descubrieron que la protefna formada por el IFRD1 regula la funcion de los leucocitos denominados 35 neutrofilos; estas celulas, parte del sistema inmunitario, son conocidas por provocar un dano inflamatorio en las vfas respiratorias de las personas con fibrosis qufstica.
En un aspecto, se utilizan oligonucleotidos antisentido para prevenir o tratar enfermedades o trastornos asociados con miembros de la familia IFRD1. A modo de ejemplo, las enfermedades y trastornos mediados por el regulador del 40 desarrollo 1 asociado al interferon (IFRD1) que pueden tratarse con los oligonucleotidos antisentido de la divulgacion y/o con celulas/tejidos regenerados a partir de celulas madre obtenidas mediante el uso y/o teniendo los compuestos antisentido comprenden: una enfermedad o trastorno asociado con la funcion anormal y/o la expresion del 'regulador del desarrollo 1 asociado al interferon'; fibrosis qufstica, enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC); una enfermedad o trastorno asociado con la diferenciacion y regeneracion de tejidos; una enfermedad o trastorno 45 asociado con la regeneracion de musculos; una enfermedad o trastorno asociado con la regeneracion de musculos esqueleticos; una enfermedad o trastorno asociado con la diferenciacion de musculos; una enfermedad o trastorno asociado con la diferenciacion miogenicas; estres oxidativo, una enfermedad o trastorno inflamatorio, inflamacion; un afeccion postoperatoria asociada con el epitelio intestinal; una enfermedad o trastorno del sistema inmunitario; una enfermedad o trastorno asociado con una tasa metabolica anormal, adiposidad y absorcion de trigliceridos 50 intestinales; cancer de pulmon; neuropatfa sensoriomotora; una lesion neuronal asociada a isquemia cerebral; una lesion neuronal y una enfermedad o trastorno neurologico.
En un aspecto, la modulacion de IFRD1 por uno o varios oligonucleotidos antisentido se administra a un paciente que los necesite, para prevenir o tratar cualquier enfermedad o trastorno relacionado con la expresion, funcion o 55 actividad anomalas de IFRD1 en comparacion con un control normal.
En un aspecto, los oligonucleotidos son especfficos para polinucleotidos del gen IFRD1, lo que incluye, sin limitacion regiones no codificantes. La diana IFRD1 incluyen variantes de IFRD1; mutantes de IFRD1, incluidos polimorfismos de un solo nucleotido (SNP); secuencias no codificantes de IFRD1; alelos, fragmentos y similares. Preferentemente, 60 el oligonucleotido es una molecula de ARN antisentido.
De acuerdo con aspectos de la divulgacion, la molecula de acido nucleico diana no esta limitada a polinucleotidos de IFRD1 en solitario, sino que se extiende a cualquiera de las isoformas, receptores, homologos, regiones no codificantes y similares de IFRD1 5
En un aspecto, un oligonucleotido esta dirigido a una secuencia antisentido natural (antisentido natural a las regiones codificantes y no codificantes) de dianas de IFRD1, incluyendo, sin limitacion, variantes, alelos, homologos, mutantes, derivados, fragmentos y secuencias complementarias a estos. Preferentemente el oligonucleotido es una molecula de ARN o ADN antisentido.
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En un aspecto, los compuestos oligomericos de la presente divulgacion tambien incluyen variantes en las que una base diferente esta presente en una o mas de las posiciones de nucleotido en el compuesto. Por ejemplo, si el primer nucleotido es una adenina, pueden producirse variantes que contienen timidina, guanosina, citidina u otros nucleotidos naturales o no naturales en esta posicion. Esto puede hacerse en cualquiera de las posiciones del 15 compuesto antisentido. Estos compuestos se ensayan entonces usando los procedimientos descritos en el presente documento para determinar su capacidad para inhibir la expresion de un acido nucleico diana.
En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencias o complementariedad, entre el compuesto antisentido y la diana, es de aproximadamente el 50% a aproximadamente el 60 %. En algunos aspectos, la homologfa, identidad 20 de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 60% a aproximadamente el 70%. En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 70% a aproximadamente el 80%. En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 80% a aproximadamente el 90%. En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 90%, aproximadamente el 92%, aproximadamente el 94%, 25 aproximadamente el 95%, aproximadamente el 96%, aproximadamente el 97%, aproximadamente el 98%, aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100%.
Un compuesto antisentido es especfficamente hibridable cuando la union del compuesto al acido nucleico diana interfiere en la funcion normal del acido nucleico diana para producir una perdida de actividad, y hay un grado de 30 complementariedad suficiente para evitar la union inespecffica del compuesto antisentido a secuencias de acidos nucleicos no diana en condiciones en las que se desea la union especffica. Tales condiciones incluyen, es decir, condiciones fisiologicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapeutico, y condiciones en las que se realizan los ensayos en el caso de ensayos in vitro.
35 Un compuesto antisentido, ya sea ADN, ARN, quimerico, sustituido, etc., es especfficamente hibridable cuando la union del compuesto a la molecula de ADN o de ARN diana interfiere en la funcion normal del ADN o ARN diana para producir una perdida de utilidad, y hay un grado de complementariedad suficiente para evitar la union inespecffica del compuesto antisentido a secuencias no diana en condiciones en las que se desea la union especffica, es decir, en condiciones fisiologicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapeutico, y en el caso 40 de ensayos in vitro, en condiciones en las que se realizan los ensayos.
En un aspecto, la eleccion como diana de IFRD1, incluyendo sin limitacion, secuencias antisentido que se identifican y se expanden, usando, por ejemplo, PCR, hibridacion etc., una o mas de las secuencias expuestas como las SEQ ID NOS: 2 a 7, y similares, modulan la expresion o funcion del IFRD1. En un aspecto, la expresion o funcion esta 45 regulada positivamente en comparacion con un control. En un aspecto, la expresion o funcion esta regulada negativamente en comparacion con un control.
En un aspecto, los oligonucleotidos comprenden secuencias de acidos nucleicos expuestas como las SEQ ID NO: 8 a 16 incluyendo secuencias antisentido que se identifican y expanden, usando, por ejemplo, PCR, hibridacion, etc. 50 Estos oligonucleotidos pueden comprender uno o mas nucleotidos modificados, fragmentos mas cortos o mas largos, enlaces modificados y similares. Los ejemplos de enlaces modificados o enlaces internucleotfdicos comprenden fosforotioato, fosforoditioato o similares. En un aspecto, los nucleotidos comprenden un derivado de fosforo. El derivado de fosforo (o grupo fosfato modificado) que puede unirse al resto de azucar o de analogo de azucar en los oligonucleotidos modificados de la presente divulgacion puede ser un monofosfato, difosfato, trifosfato, 55 alquilfosfato, alcanofosfato, fosforotioato y similares. La preparacion de los analogos de fosfato indicados anteriormente, y su incorporacion en nucleotidos, nucleotidos modificados y oligonucleotidos, tambien es en sf conocida y no es necesario describirla aquf.
La especificidad y sensibilidad de antisentido tambien es empleada por los expertos en la materia para usos 60 terapeuticos. Se han empleado oligonucleotidos antisentido como restos terapeuticos en el tratamiento de patologfas
en animales y el ser humano. Los oligonucleotidos antisentido se han administrado con seguridad y eficazmente a seres humanos y numerosos ensayos clfnicos estan actualmente en marcha. De este modo, se establece que los oligonucleotidos pueden ser modalidades terapeuticas utiles que pueden configurarse para ser utiles en regfmenes de tratamiento para el tratamiento de celulas, tejidos y animales, especialmente seres humanos.
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En aspectos de la presente divulgacion, los compuestos antisentido oligomericos, particularmente oligonucleotidos, se unen a moleculas de acidos nucleicos diana y modulan la expresion y/o funcion de moleculas codificadas por un gen diana. Las funciones de ADN con las que interferiran comprenden, por ejemplo, replicacion y transcripcion. Las funciones de ARN con las que interferiran comprenden todas las funciones vitales tales como, por ejemplo, 10 translocalizacion del ARN al sitio de traduccion de protefna, traduccion de protefna desde ARN, splicing del ARN para dar una o mas especies de ARNm, y actividad catalftica que puede acoplarse en o facilitarse por el ARN. Las funciones pueden regularse positivamente o inhibirse dependiendo de las funciones deseadas.
Los compuestos antisentido incluyen compuestos antisentido oligomericos, oligonucleotidos antisentido, 15 oligonucleotidos de secuencia de gufa externa (EGS), agentes de splicing alterno, cebadores, sondas, y otros compuestos oligomericos que hibridan con al menos una parte del acido nucleico diana. Por lo tanto, estos compuestos pueden introducirse en forma de compuestos oligomericos monocatenarios, bicatenarios, parcialmente monocatenarios, o circulares.
20 El direccionamiento de un compuesto antisentido a una molecula de acido nucleico particular, en el contexto de esta divulgacion, puede ser un proceso multietapa. El proceso normalmente empieza con la identificacion de un acido nucleico diana cuya funcion va a modularse. Este acido nucleico diana puede ser, por ejemplo, un gen celular (o ARNm transcrito del gen) cuya expresion esta asociada a un trastorno o patologfa particular, o una molecula de acido nucleico de un agente infeccioso. En la presente divulgacion, el acido nucleico diana codifica el regulador del 25 desarrollo 1 asociado a interferon (IFRD1).
El proceso de direccionamiento normalmente tambien incluye la determinacion de al menos una region diana, segmento, o sitio dentro del acido nucleico diana para que la interaccion antisentido se produzca de forma que resulte el efecto deseado, p. ej., la modulacion de la expresion. Dentro del contexto de la presente divulgacion, el 30 termino "region" se define como una parte del acido nucleico diana que tiene al menos una estructura, funcion o caracterfstica identificable. Dentro de las regiones de acidos nucleicos diana estan los segmentos. Los "segmentos" se definen como partes mas pequenas o sub-partes de regiones dentro de un acido nucleico diana. "Sitios", tal como se usa en la presente divulgacion, se define como posiciones dentro de un acido nucleico diana.
35 En un aspecto, los oligonucleotidos antisentido se unen a las secuencias antisentido naturales del regulador del desarrollo 1 asociado a interferon (IFRD1) y modulan la expresion y/o funcion de IFRD1 (SEQ ID NO: 1). Los ejemplos de secuencias antisentido incluyen las SEQ ID NO: 2 al 16.
En un aspecto, los oligonucleotidos antisentido se unen a uno o mas segmentos de polinucleotidos del regulador del 40 desarrollo 1 asociado a interferon (IFRD1) y modulan la expresion y/o funcion del gen IFRD1. Los segmentos comprenden al menos cinco nucleotidos consecutivos de los polinucleotidos sentido o antisentido del gen IFRD1.
En un aspecto, los oligonucleotidos antisentido son especfficos para secuencias antisentido naturales del gen IFRD1 donde la union de los oligonucleotidos a las secuencias antisentido naturales del gen IFRD1 modulan la expresion 45 y/o la funcion del gen IFRD1.
En un aspecto, los compuestos de oligonucleotido comprenden secuencias expuestas como las SEQ ID NO: 8 a 16, secuencias antisentido que se identifican y expanden usando, por ejemplo, PCR, hibridacion etc. Estos oligonucleotidos pueden comprender uno o mas nucleotidos modificados, fragmentos mas cortos o mas largos, 50 enlaces modificados y similares. Los ejemplos de enlaces modificados o enlaces internucleotfdicos comprenden fosforotioato, fosforoditioato o similares. En un aspecto, los nucleotidos comprenden un derivado de fosforo. El derivado de fosforo (o grupo fosfato modificado) que puede unirse al resto de azucar o de analogo de azucar en los oligonucleotidos modificados de la presente divulgacion puede ser un monofosfato, difosfato, trifosfato, alquilfosfato, alcanofosfato, fosforotioato y similares. La preparacion de los analogos de fosfato indicados anteriormente, y su 55 incorporacion en nucleotidos, nucleotidos modificados y oligonucleotidos, tambien es en si conocida y no es necesario describirla aquf.
Ya que, tal como se conoce en la tecnica, el codon de iniciacion de la traduccion normalmente es 5'-AUG (en moleculas de ARNm transcrito; 5'-ATG en la molecula de ADN correspondiente), el codon de iniciacion de la 60 traduccion tambien se denomina el "codon AUG", el "codon de iniciacion" o el "codon de iniciacion AUG". Una
minorfa de genes tiene un codon de iniciacion de la traduccion que tiene la secuencia de ARN 5'-GUG, 5'-UUG o 5'- CUG; y se ha demostrado que 5'-AUA, 5'-ACG y 5'-CUG funcionan in vivo. De este modo, las expresiones "codon de iniciacion de la traduccion" y "codon de iniciacion" pueden englobar muchas secuencias de codon, aun cuando el aminoacido iniciador en cada caso normalmente sea metionina (en eucariotas) o formilmetionina (en procariotas).
5 Los genes eucariotas y procariotas pueden tener dos o mas codones de iniciacion alternativos, uno cualquiera de los cuales puede utilizarse preferencialmente para la iniciacion de la traduccion en un tipo particular de celula o tejido, o en un conjunto particular de condiciones. En el contexto de la divulgacion, "codon de iniciacion" y "codon de iniciacion de la traduccion" se refieren al codon o codones que se usan in vivo para iniciar la traduccion de un ARNm transcrito de un gen que codifica el regulador del desarrollo 1 asociado a interferon (IFRD1), a pesar de la(s) 10 secuencia(s) de dichos codones. Un codon de terminacion de la traduccion (o "codon de terminacion") de un gen puede tener una de tres secuencias, es decir, 5'-UAA, 5'-UAG y 5'-UGA (las secuencias de ADN correspondientes son 5'-TAA, 5'-TAG y 5'-TGA, respectivamente).
Las expresiones "region de codon de iniciacion" y "region de codon de iniciacion de la traduccion" se refieren a una 15 parte de dicho ARNm o gen que engloba de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleotidos contiguos en cualquier direccion (es decir, 5' o 3') desde un codon de iniciacion de la traduccion. Analogamente, las expresiones "region de codon de terminacion" y "region de codon de terminacion de la traduccion" se refieren a una parte de dicho ARNm o gen que engloba de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleotidos contiguos en cualquier direccion (es decir, 5' o 3') desde un codon de terminacion de la traduccion. Por consiguiente, la "region de codon de 20 iniciacion" (o "region de codon de iniciacion de la traduccion") y la "region de codon de terminacion" (o "region de codon de terminacion de la traduccion") son todas las regiones que pueden ser eficazmente elegidas como diana con los compuestos antisentido de la presente divulgacion.
El marco de lectura abierto (ORF) o "region codificante", que se conoce en la tecnica para referirse a la region entre 25 el codon de iniciacion de la traduccion y el codon de terminacion de la traduccion, tambien es una region que puede ser eficazmente elegida como diana. Dentro del contexto de la presente divulgacion, una region elegida como diana es la region intragenica que engloba el codon de iniciacion o de terminacion de la traduccion del marco de lectura abierto (ORF) de un gen.
30 Otra region diana incluye la region no traducida 5' (5'UTR), conocida en la tecnica para referirse a la parte de un ARNm en la direccion 5' desde el codon de iniciacion de la traduccion, y que incluye, por lo tanto, nucleotidos entre el sitio caperuza 5' (5' cap) y el codon de iniciacion de la traduccion de un ARNm (o nucleotidos correspondientes en el gen). Otra region diana mas incluye la region no traducida 3' (3'UTR), conocida en la tecnica para referirse a la parte de un ARNm en la direccion 3' desde el codon de terminacion de la traduccion, y que incluye, por lo tanto, 35 nucleotidos entre el codon de terminacion de la traduccion y el extremo 3' de un ARNm (o nucleotidos
correspondientes en el gen). El sitio caperuza 5' de un ARNm comprende un residuo de guanosina N7-metilado
unido al residuo mas 5' del ARNm mediante un enlace trifosfato 5'-5'. La region caperuza 5' de un ARNm se considera que incluye la propia estructura caperuza 5', ademas de los primeros 50 nucleotidos adyacentes al sitio caperuza. Otra region diana para esta divulgacion es la region caperuza 5'.
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Aunque algunos transcritos de ARNm eucariotas se traducen directamente, muchos contienen una o mas regiones, conocidas como "intrones", que se escinden de un transcrito antes de que se traduzca. Las regiones restantes (y, por tanto, traducidas) se conocen como "exones" y se someten a splicing juntas para formar una secuencia de ARNm continua. En un aspecto, la eleccion como diana de sitios de splicing, es decir, empalmes intron-exon o
45 empalmes exon-intron, es particularmente util en situaciones en las que el splicing aberrante participa en la
enfermedad, o en las que una produccion en exceso de un producto de splicing particular participa en la enfermedad. Un empalme de fusion aberrante debido a la transposicion o delecion es otro aspecto de un sitio diana. Los ARNm transcritos producidos mediante el proceso de splicing de dos (o mas) ARNm de diferentes fuentes de genes se conocen como "transcritos de fusion". Los intrones pueden ser eficazmente elegidos como diana usando 50 compuestos antisentido dirigidos a, por ejemplo, ADN o pre-ARNm.
En un aspecto, los oligonucleotidos antisentido se unen a regiones codificantes y/o no codificantes de un polinucleotido diana y modulan la expresion y/o funcion de la molecula diana.
55 En un aspecto, los oligonucleotidos antisentido se unen a polinucleotidos antisentido naturales y modulan la expresion y/o funcion de la molecula diana.
En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos antisentido se unen a polinucleotidos sentido y modulan la expresion y/o funcion de la molecula diana.
Pueden producirse transcritos de ARN alternatives a partir de la misma region genomica de ADN. Estos transcritos alternatives son generalmente conocidos como "variantes". Mas especfficamente, "variantes de pre-ARNm" son transcritos producidos a partir del mismo ADN genomico que se diferencian de otros transcritos producidos a partir del mismo ADN genomico en su posicion de inicio o de parada y contienen tanto secuencia intronica como exonica.
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Tras la escision de una o mas regiones de exon o intron, o partes de las mismas durante el splicing, las variantes de pre-ARNm producen «variantes de ARNm» mas pequenas. Por consiguiente, las variantes de ARNm son variantes de pre-ARNm procesadas y cada variante de pre-ARNm unica siempre debe producir una variante de ARNm unica como resultado del splicing. Estas variantes de ARNm tambien se conocen como "variantes de splicing alternativas". 10 Si no se produce splicing de la variante de pre-ARNm, entonces la variante de pre-ARNm es identica a la variante de ARNm.
Las variantes pueden producirse mediante el uso de senales alternativas para la transcripcion de inicio o de parada. Los Pre-ARNm y ARNm pueden poseer mas de un codon de iniciacion o codon de terminacion. Las variantes que se 15 originan a partir de un pre-ARNm o ARNm que usan codones de iniciacion alternativos se conocen como "variantes de inicio alternativas" de ese pre-ARNm o ARNm. Aquellos transcritos que usan un codon de terminacion alternativo se conocen como "variantes de parada alternativas" de ese pre-ARNm o ARNm. Un tipo especffico de variante de parada alternativa es la "variante de poliA", en la que los multiples transcritos producidos resultan de la seleccion alternativa de una de las "senales de parada de poliA" por la maquinaria de transcripcion, produciendo de este modo 20 transcritos que terminan en sitios de poliA unicos. Dentro del contexto de la divulgacion, los tipos de variantes descritos en el presente documento tambien son aspectos de acidos nucleicos diana.
Las ubicaciones en el acido nucleico diana con las que los compuestos antisentido hibridan se definen como al menos una parte de 5 nucleotidos de longitud de una region diana a la que se dirige un compuesto antisentido 25 activo.
Aunque las secuencias especfficas de ciertos segmentos diana a modo de ejemplo se exponen en el presente documento, un experto en la materia reconocera que estas sirven para ilustrar y describir aspectos particulares dentro del alcance de la presente divulgacion. Segmentos diana adicionales son facilmente identificables por un 30 experto en la materia en vista de esta divulgacion.
Se considera que segmentos diana de 5-100 nucleotidos de longitud que comprenden un tramo de al menos cinco (5) nucleotidos consecutivos seleccionados de dentro de los segmentos diana preferidos ilustrativos tambien son adecuados para el direccionamiento.
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Los segmentos diana pueden comprender secuencias de ADN o ARN que comprenden al menos los 5 nucleotidos consecutivos desde el extremo 5' de uno de los segmentos diana preferidos ilustrativos (siendo los restantes nucleotidos un tramo consecutivo del mismo ADN o ARN que empieza inmediatamente cadena arriba del extremo 5' del segmento diana y que continua hasta que el ADN o ARN contenga de aproximadamente 5 a aproximadamente 40 100 nucleotidos). Segmentos diana similarmente preferidos se representan por secuencias de ADN o ARN que comprenden al menos los 5 nucleotidos consecutivos desde el extremo 3' de uno de los segmentos diana preferidos ilustrativos (siendo los restantes nucleotidos un tramo consecutivo del mismo ADN o ARN que empieza inmediatamente cadena abajo del extremo 3' del segmento diana y que continua hasta que el ADN o ARN contenga de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 nucleotidos). Un experto en la materia armado con los segmentos 45 diana ilustrados en el presente documento sera capaz, sin excesiva experimentacion, de identificar segmentos diana preferidos adicionales.
Una vez se han identificado una o mas regiones, segmentos o sitios diana, se eligen compuestos antisentido que son suficientemente complementarios a la diana, es decir, hibridan suficientemente bien y con suficiente 50 especificidad, para dar el efecto deseado.
En aspectos de la divulgacion, los oligonucleotidos se unen a una cadena antisentido de una diana particular. Los oligonucleotidos tienen al menos 5 nucleotidos de longitud y pueden sintetizarse de manera que cada oligonucleotido se dirija a secuencias solapantes de forma que los oligonucleotidos se sinteticen para cubrir toda la 55 longitud del polinucleotido diana. Las dianas tambien incluyen regiones codificantes, ademas de no codificantes.
En un aspecto, se prefiere dirigirse a acidos nucleicos especfficos por oligonucleotidos antisentido. El direccionamiento de un compuesto antisentido a un acido nucleico particular es un proceso multietapa. El proceso normalmente empieza con la identificacion de una secuencia de acidos nucleicos cuya funcion va a modularse. Esta 60 puede ser, por ejemplo, un gen celular (o ARNm transcrito a partir del gen) cuya expresion esta asociada a un
trastorno o patologfa particular, o un polinucleotido no codificante tal como, por ejemplo, ARN no codificante (ARNnc).
Los ARN pueden clasificarse en (1) ARN mensajeros (ARNm), que se traducen en protefnas, y (2) ARN no 5 codificantes de protefna (ARNnc). Los ARNnc comprenden microARN, transcritos antisentido y otras unidades transcripcionales (TU) que contienen una alta densidad de codones de terminacion y que carecen de cualquier amplio "marco de lectura abierto". Muchos ARNnc parecen empezar a partir de sitios de iniciacion en regiones no traducidas 3' (3'UTRs) de loci codificantes de protefnas. Los ARNnc son frecuentemente raros y al menos la mitad de los ARNnc que se han secuenciado por el consorcio FANTOM no parecen estar poliadenilados. La mayorfa de 10 los investigadores se han basado, por motivos obvios, en ARNm poliadenilados que se procesan y se exportan al citoplasma. Recientemente, se demostro que el conjunto de aRn nucleares no poliadenilados puede ser muy grande, y que muchos de dichos transcritos surgen de las llamadas regiones intergenicas. El mecanismo por el que los ARNnc pueden regular la expresion genica es por apareamiento de bases con transcritos diana. Los ARN que funcionan por apareamiento de bases pueden agruparse en (1) ARN codificados en cis que estan codificados en la
15 misma ubicacion genetica, pero en la cadena opuesta a los ARN en los que actuan y, por lo tanto, muestran
complementariedad perfecta con su diana, y (2) ARN codificados en trans que estan codificados en una ubicacion cromosomica distinta de los ARN en los que actuan y generalmente no presentan potencial de apareamiento de bases perfecto con sus dianas.
20 Sin desear cenirse a ninguna teorfa, la perturbacion de un polinucleotido antisentido por los oligonucleotidos antisentido descritos en el presente documento puede alterar la expresion de los ARN mensajeros sentido correspondientes. Sin embargo, esta regulacion puede tanto ser discordante (la inactivacion antisentido produce elevacion de ARN mensajero) como concordante (la inactivacion antisentido produce reduccion concomitante de ARN mensajero). En estos casos, los oligonucleotidos antisentido pueden ser dirigidos a partes solapantes o no 25 solapantes del transcrito antisentido que producen su inactivacion o secuestro. El antisentido codificante, ademas de
no codificante, puede ser dirigido de una manera identica y que cualquier categorfa es capaz de regular los
transcritos sentido correspondientes - tanto de una manera concordante como discordante. Las estrategias que se emplean en identificar nuevos oligonucleotidos para su uso contra una diana pueden basarse en la inactivacion de transcritos de ARN antisentido por oligonucleotidos antisentido o cualquier otro medio de modulacion de la diana 30 deseada.
Estrategia 1: En el caso de regulacion discordante, la inactivacion del transcrito antisentido eleva la expresion del gen convencional (sentido). Si el ultimo gen debe codificar un farmaco diana conocido o supuesto, entonces la inactivacion de su homologo antisentido podrfa imitar posiblemente la accion de un agonista receptor o una enzima 35 estimulante.
Estrategia 2: En el caso de regulacion concordante, podrfan inactivarse de forma concomitante tanto los transcritos antisentido como sentido y asf lograr una reduccion sinergica de la expresion genica (sentido) convencional. Si, por ejemplo, un oligonucleotido antisentido se usa para lograr la inactivacion, entonces esta estrategia puede usarse 40 para aplicar un oligonucleotido antisentido dirigido al transcrito sentido y otro oligonucleotido antisentido al transcrito antisentido correspondiente, o un unico oligonucleotido antisentido energeticamente simetrico que se dirige simultaneamente a transcritos sentido y antisentido solapantes.
De acuerdo con la presente divulgacion, los compuestos antisentido incluyen oligonucleotidos antisentido, ribozimas, 45 oligonucleotidos de secuencia de gufa externa (EGS), compuestos de siRNA, compuestos de interferencia (ARNi) de ARN mono- o bicatenario tales como compuestos de siRNA, y otros compuestos oligomericos que hibridan con al menos una parte del acido nucleico diana y modulan su funcion. Por lo tanto, pueden ser ADN, ARN, similares a ADN, similares a ARN, o mezclas de los mismos, o pueden ser mimeticos de uno o mas de estos. Estos compuestos pueden ser compuestos oligomericos monocatenarios, bicatenarios, circulares o de horquilla y pueden contener 50 elementos estructurales tales como protuberancias internas o terminales, desapareamientos o bucles. Los compuestos antisentido se preparan de forma rutinaria linealmente, pero pueden unirse o prepararse de otro modo para ser circulares y/o ramificados. Los compuestos antisentido pueden comprender construcciones tales como, por ejemplo, dos cadenas hibridadas para formar un compuesto completan o parcialmente bicatenario o una unica cadena con auto-complementariedad suficiente para permitir la hibridacion y formacion de un compuesto completa o 55 parcialmente bicatenario. Las dos cadenas pueden enlazarse internamente, dejando los extremos 3' o 5' libres o pueden enlazarse para formar una estructura de horquilla continua o bucle. La estructura de horquilla puede contener un nucleotido protuberante en cualquiera de los extremos 5' o 3' que produce una extension del caracter monocatenario. Los compuestos bicatenarios opcionalmente pueden comprender nucleotidos protuberantes en los extremos. Modificaciones adicionales pueden comprender grupos conjugados unidos a uno de los extremos, 60 posiciones de nucleotido seleccionadas, posiciones de azucar o a uno de los enlaces internucleosfdicos. Como
alternativa, las dos cadenas pueden enlazarse mediante un resto no de acido nucleico o grupo conector. Cuando se forma a partir de solo una cadena, el dsARN puede tomar la forma de una molecula tipo horquilla auto- complementaria que se dobla sobre si misma para formar un duplex. De este modo, el ARNds puede ser completa o parcialmente bicatenario. Puede lograrse modulacion especffica de la expresion genica por expresion estable de 5 horquillas de ARNds en lfneas celulares transgenicas, sin embargo, en algunos casos, la expresion o funcion genica esta regulada positivamente. Cuando se forma a partir de dos cadenas, o una unica cadena que adopta la forma de una molecula de tipo horquilla auto-complementaria que se dobla sobre si misma para formar un duplex, las dos cadenas (o regiones formadoras de duplex de una sola cadena) son cadenas de ARN complementarias que se aparean con bases en el modo de Watson-Crick.
10
Una vez introducidos a un sistema, los compuestos de la divulgacion pueden provocar la accion de una o mas enzimas o protefnas estructurales para efectuar la escision u otra modificacion del acido nucleico diana o pueden trabajar mediante mecanismos basados en la ocupacion. En general, los acidos nucleicos (incluyendo oligonucleotidos) pueden describirse como "de tipo ADN” (es decir, que generalmente tienen uno o mas 2'15 desoxiazucares y, generalmente, bases T en vez de U) o "de tipo ARN” (es decir, que generalmente tienen uno o mas 2'-hidroxilo o azucares modificados en 2' y, generalmente bases U en vez de T). Las helices de acido nucleico pueden adoptar mas de un tipo de estructura, mas comunmente las formas A y B. Se cree que, en general, los oligonucleotidos que tienen estructura similar a la forma B son "similares a ADN" y aquellos que tienen estructura similar a la forma A son "similares a ARN". En algunos aspectos (quimericos), un compuesto antisentido puede 20 contener tanto regiones en forma A como B.
En un aspecto, los oligonucleotidos o compuestos antisentido deseados comprenden al menos un ARN antisentido, ADN antisentido, oligonucleotidos antisentido quimericos, oligonucleotidos antisentido que comprenden enlaces modificados, ARN de interferencia (ARNi), ARN de interferencia pequeno (siRNA); un microARN de interferencia 25 (miARN); un ARN temporal pequeno (ARNtp); o un ARN de horquilla corta (ARNhc); activacion genica inducida por ARN pequeno (ARNa); ARN activantes pequenos (ARNap), o combinaciones de los mismos.
Los dsARN tambien pueden activar la expresion genica, un mecanismo que se ha llamado "activacion genica inducida por ARN pequeno" o ARNa. Los promotores genicos que se dirigen a dsARN inducen la potente activacion 30 transcripcional de genes asociados. El ARNa se demostro en celulas humanas usando dsARN sinteticos, llamados "ARN activantes pequenos" (ARNap). No se sabe actualmente si el ARNa esta conservado en otros organismos.
Se ha descubierto que el ARN bicatenario pequeno (dsARN), tal como ARN de interferencia pequeno (siRNA) y microARN (miARN), es el desencadenante de un mecanismo evolutivamente conservado conocido como ARN de 35 interferencia (ARNi). El ARNi conduce invariablemente al silenciamiento genico mediante la remodelacion de cromatina para suprimir de este modo la transcripcion, degradacion de ARNm complementario, o bloqueo de la traduccion de protefnas. Sin embargo, en los aspectos descritos en detalle en la seccion de ejemplos a continuacion, se muestra que los oligonucleotidos aumentan la expresion y/o funcion de los polinucleotidos del regulador del desarrollo 1 asociado a interferon (IFRD1) y productos codificados por los mismos. Los dsARN tambien pueden 40 actuar como ARN activantes pequenos (ARNap). Sin desear quedar ligado por la teorfa, direccionando secuencias a promotores genicos, los ARNap induciran la expresion de genes diana en un fenomeno denominado activacion transcripcional inducida por dsARN (ARNa).
En un aspecto adicional, los "segmentos diana preferidos" identificados en el presente documento pueden 45 emplearse en un cribado para compuestos adicionales que modulan la expresion de polinucleotidos del regulador del desarrollo 1 asociado a interferon (IFRD1). Los "moduladores" son aquellos compuestos que disminuyen o aumentan la expresion de una molecula de acido nucleico que codifica el gen IFRD1 y que comprenden al menos una parte de 5 nucleotidos que es complementaria a un segmento diana preferido. El procedimiento de cribado comprende las etapas de poner en contacto un segmento diana preferido de una molecula de acido nucleico que 50 codifica polinucleotidos sentido o antisentido naturales del gen IFRD1 con uno o mas moduladores candidatos, y seleccionar uno o mas moduladores candidatos que disminuyen o aumentan la expresion de una molecula de acido nucleico que codifica polinucleotidos del gen IFRD1, por ejemplo, las SEQ ID NO: 8 al 16. Una vez que se demuestra que el modulador o moduladores candidatos son capaces de modular (por ejemplo, tanto disminuir como aumentar) la expresion de una molecula de acido nucleico que codifica polinucleotidos del gen IFRD1, el modulador 55 puede entonces emplearse en estudios de investigacion adicionales de la funcion de polinucleotidos del gen IFRD1, o para su uso como un agente de investigacion, diagnostico o terapeutico de acuerdo con la presente divulgacion.
Direccionar la secuencia antisentido natural preferentemente modula la funcion del gen diana. Por ejemplo, el gen IFRD1 (p.ej. con numero de acceso NM_001007245). En un aspecto, la diana es un polinucleotido antisentido del 60 gen IFRD1. En un aspecto, un oligonucleotido antisentido dirigido a secuencias sentido y/o antisentido naturales de
polinucleotidos del gen IFRD1 (p. ej. entrada numero NM_001007245), variantes, alelos, isoformas, homologas, mutantes, derivados, fragmentos y secuencias complementarias correspondientes. Preferentemente, el oligonucleotido es una molecula antisentido y las dianas incluyen regiones codificantes y no codificantes de polinucleotidos antisentido y/o sentido del gen lFRD1.
5
Los segmentos diana preferidos de la presente divulgacion tambien pueden combinarse con sus compuestos antisentido complementarios respectivos de la presente divulgacion para formar oligonucleotidos (duplexados) bicatenarios estabilizados.
10 Se ha demostrado en la materia que dichos restos de oligonucleotido bicatenario modulan la expresion de la diana y regulan la traduccion, ademas del procesamiento de ARN mediante un mecanismo antisentido. Ademas, los restos bicatenarios pueden estar sujetos a modificaciones qufmicas. Por ejemplo, se ha demostrado que dichos restos bicatenarios inhiben la diana por la hibridacion clasica de la cadena antisentido del duplex con la diana, produciendo de este modo la degradacion enzimatica de la diana.
15
En un aspecto, un oligonucleotido antisentido se dirige a polinucleotidos del regulador del desarrollo 1 asociado a interferon (IFRD1) (por ejemplo, con numero de acceso NM_001007245), variantes, alelos, homologos, mutantes, derivados, fragmentos y secuencias complementarias correspondientes. Preferentemente, el oligonucleotido es una molecula antisentido.
20
De acuerdo con los aspectos de la divulgacion, la molecula de acido nucleico diana no esta limitada solo al gen IFRD1, sino que se extiende a cualquier polinucleotido variante del mismo y a cualquier polinucleotido que produzca, afecte, influya o resulte en o se refiera a un producto de expresion del gen IFRD1 y/o cualquier isoforma del mismo.
25 En un aspecto, un oligonucleotido se dirige a una secuencia antisentido natural de polinucleotidos del gen IFRD1, por ejemplo, los polinucleotidos expuestos en las SEQ ID NO: 2 a 7, y cualquier variante, alelo, homologo, mutante, derivado, fragmento y secuencia complementaria a los mismos. Ejemplos de oligonucleotidos antisentido se exponen como las SeQ ID NO: 8 al 16.
30 En un aspecto, los oligonucleotidos son complementarios a, o se unen a, secuencias de acido nucleico de IFRD1 antisentido, incluyendo sin limitacion secuencias sentido y/o antisentido no codificantes asociadas con polinucleotidos de IFRD1 y modulan la expresion y/o funciones de moleculas de IFRD1.
En un aspecto, los oligonucleotidos son complementarios a, o se unen a, secuencias de acido nucleico del 35 antisentido natural del gen IFRD1, expuesto como las SEQ ID NO: 2 a 7 y modula la expresion y/o la funcion de moleculas del gen IFRD1.
En un aspecto, los oligonucleotidos comprenden secuencias de al menos 5 nucleotidos consecutivos de las SEQ ID NO: 8 a 16 y modula la expresion y/o la funcion de moleculas del gen IFRD1.
40
La diana polinuclotfdicas comprende IFRD1; incluyendo miembros de la familia del mismo, variantes de IFRD1, mutantes de IFRD1, incluidos polimorfismos de un solo nucleotido (SNP); secuencias no codificantes de IFRD1; alelos de IFRD1, variantes de especie, fragmentos y similares. Preferentemente, el oligonucleotido es una molecula antisentido.
45
En un aspecto, el oligonucleotido que se dirige a polinucleotidos del gen IFRD1, comprende: ARN antisentido, ARN de interferencia (ARNi), ARN de interferencia pequeno (ARNip); microARN de interferencia (miARN); un ARN temporal pequeno (ARNtp); o un ARN de horquilla corta (ARNhc); activacion genica inducida por ARN pequeno (ARNa); o, ARN activante pequeno (ARNap).
50
En un aspecto, el direccionamiento de los polinucleotidos del regulador del desarrollo 1 asociado a interferon (IFRD1), p. ej., las SEQ ID NO: 2 a 16, modula la expresion o funcion de estas dianas. En un aspecto, la expresion o funcion esta regulada positivamente en comparacion con un control. En un aspecto, la expresion o funcion esta regulada negativamente en comparacion con un control.
55
En un aspecto, los compuestos antisentido comprenden secuencias expuestas como las SEQ ID NO: 8 al 16. Estos oligonucleotidos pueden comprender uno o mas nucleotidos modificados, fragmentos mas cortos o mas largos, enlaces modificados y similares.
60 En un aspecto, las SEQ ID NO: 8 a 16 comprenden uno o mas nucleotidos de LNA. La tabla 1 muestra ejemplos de
oligonucleotidos antisentido utiles en los procedimientos de la divulgacion.
Tabla 1:
ID de secuencia
Nombre de secuencia Tipo de secuencia Secuencia
SEQ ID NO: 8
CUR-0484 Antisentido rGrCrC-rArCrCrUrUrArGrArArUrGrGrArG rArGrUrGrGrArArGrArG
SEQ ID NO:17
CUR-0484 Sentido rCrUrOrCrCrArCrUrCrUrCrCrArUrUrCrU rArArGrGrUrCGC
SEQ ID NO:9
CUR-0486 Antisentido rUrUrUrGrCrCrArUrUrCrUrCrArUrCrCrA rCrCrUrUrArCrArGrUrA
SEQ ID NO:18
CUR-0486 Sentido rCrUrGrUrArArGrGrUrGrGrArUrGrArGrA rArUrGrGrCrAM
SEQ ID NO:10
CUR-0488 Antisentido rArArArUrArArUrUrGrArArUrArUrCrUrA rArGrUrGrCrCrArCrGrU
SEQ ID NO:19
CUR-0488 Sentido rGrUrGrGrCrArCrUrUrArGrArUrArUrUrC rArArUrDrArUTT
SEQ ID NO:11
CUR-0490 Antisentido rurOrurGrUrArlrUrcrArUrOrtlrAtGrUrG rArCrUrUrGrArUrGrUrU
SEQ ID NO:20
CUR-0490 Sentido rCrArUrCrArArGrllrCrArCrUrArArArUrG rArUrUrArCrAAA
SEQ ID NO:12
CUR-0492 Antisentido rUxCrCrUrGrArUrArUrArUrGrArGrGrCrA rGrArCrArUrUrGrCrUrA
SEQ ID NO:21
CUR-0492 Sentido rGrCrArArUxGrUrCrUrGrCrCrUrCrArUxA rUrArUrCrArGGA
SEQ ID NO:13
CUR-0494 Antisentido rUrGrGrArArGrUrUrUrCrUrArGrGrGrArG rUrGrUrGrGrUrCrOrUrU
SEQ ID NO:22
CUR-0494 Sentido rArGrArCrCrArCrArCrUrCrCrCrUrArGrA rArArCrUrUrCCA
SEQ ID NO:14
CUR-0496 Antisentido rUrGrArUrCrCrUrCrGiCrUrArArGrCrUrC rCrGrArCrUrCrUrGrGrG
SEQ ID NO:23
CUR-0496 Sentido rCrArGrArGrUrCrGrGrArGrCrUrUrArGrC rGrArGrGrArUCA
SEQ ID NO:15
CUR-0498 Antisentido rCrArCrUrGrCrArCrUrCrCrArArUrGrUrA rGrGrCrArArCrArGrArG
SEQ ID NO:24
CUR-0498 Sentido rCrOrGrOrUrGrCrCrUrArCrArUrUrGrGrA rGrUrGrCrArGTG
SEQ ID NO:16
CUR-0500 Antisentido rUrUrUrGrGrGrArGrGrCrUrGrArGrGrUrG rGxGrUrGrGrftrUrOrftrO
SEQ ID NO:25
CUR-0500 Sentido rArArUrCrCrArCrCrCrArCrCrUrCrAiGrC rCrUrCrCrCrAM
La modulacion de un acido nucleico diana deseado puede llevarse a cabo de varias formas conocidas en la tecnica. Por ejemplo, oligonucleotidos antisentido, ARNip, etc. Las moleculas de acidos nucleicos enzimaticos (por ejemplo, ribozimas) son moleculas de acidos nucleicos capaces de catalizar una o mas de diversas reacciones, que incluyen 5 la capacidad para escindir repetidamente otras moleculas de acidos nucleicos separadas en un modo especffico de secuencia de bases de nucleotidos. Dichas moleculas de acidos nucleicos enzimaticos pueden usarse, por ejemplo, para dirigirse practicamente a cualquier transcrito de ARN.
Debido a su especificidad de secuencia, las moleculas de acidos nucleicos enzimaticos que se escinden en trans 10 muestran promesa como agentes terapeuticos para enfermedad humana. Las moleculas de acidos nucleicos enzimaticos pueden disenarse para escindir dianas de ARN especfficas dentro del fondo del ARN celular. Un acontecimiento de escision de este tipo convierte el ARNm en no funcional y anula la expresion de protefnas de ese ARN. De este modo puede inhibirse selectivamente la sfntesis de una protefna asociada a una patologfa.
15 En general, los acidos nucleicos enzimaticos con actividad de escision de ARN actuan uniendose primero a un ARN diana. Dicha union se produce a traves de la parte de union diana de un acido nucleico enzimatico que se mantiene en estrecha proximidad a una parte enzimatica de la molecula que actua para escindir el ARN diana. De este modo, el acido nucleico enzimatico se reconoce primero y a continuation se une a ARN diana mediante apareamiento de bases complementario, y una vez se une al sitio correcto, actua enzimaticamente para cortar el ARN diana. La 20 escision estrategica de dicho ARN diana destruira su capacidad para dirigir la sfntesis de una protefna codificada. Despues de unirse un acido nucleico enzimatico y escindir su aRn diana, se libera de ese ARN para buscar otra diana y puede unirse repetidamente y escindir nuevas dianas.
Se han usado varias estrategias como la selection in vitro (evolution) (Orgel, (1979) Proc. R. Soc. London, B 205, 25 435) para desarrollar nuevos catalizadores de acido nucleico capaces de catalizar diversas reacciones, tales como escision y ligamiento de enlaces fosfodiester y enlaces amida.
El desarrollo de ribozimas que son optimas para la actividad catalftica contribuirfa significativamente a cualquier estrategia que empleara ribozimas que escinden ARN con el fin de regular la expresion genica. La ribozima de 30 cabeza de martillo, por ejemplo, funciona con una velocidad catalftica (kcat) de aproximadamente 1 min-1 en presencia de concentraciones saturantes (10 mM) de cofactor de Mg2+. Se ha demostrado que una ribozima de "ligasa de ARN" artificial cataliza la reaction de auto-modificacion correspondiente con una velocidad de aproximadamente 100 min-1. Ademas, se sabe que ciertas ribozimas de cabeza de martillo modificadas que tienen brazos de union al sustrato hechos de ADN catalizan la escision de ARN con multiples velocidades de recuperation 35 que se aproximan a 100 min-1. Finalmente, la sustitucion de un resto especffico dentro del nucleo catalftico de la cabeza de martillo con ciertos analogos de nucleotido da ribozimas modificadas que muestran una mejora de hasta 10 veces en la velocidad catalftica. Estos descubrimientos demuestran que las ribozimas pueden promover transformaciones qufmicas con velocidades catalfticas que son significativamente superiores a aquellas mostradas in vitro por la mayorfa de las ribozimas que se auto-escinden naturales. Entonces es posible que las estructuras de 40 ciertas ribozimas que se auto-escinden puedan optimizarse para dar la maxima actividad catalftica, o que puedan prepararse motivos de ARN completamente nuevos que muestran velocidades significativamente mas rapidas para la escision de fosfodiester de ARN.
La escision intermolecular de un sustrato de ARN por un catalizador de ARN que se ajusta al modelo de "cabeza de martillo" se demostro por primera vez en 1987 (Uhlenbeck, O. C. (1987) Nature, 328: 596-600). Se recupero el catalizador de ARN y se hizo reaccionar con multiples moleculas de ARN, demostrando que era verdaderamente catalftico.
5
Los ARN catalfticos disenados basado en el motivo "hammerhead" han sido utilizados para cortar secuencias diana especfficas haciendo cambios de base apropiado en el ARN catalftico para mantener la base necesaria en el apareamiento con las secuencias diana. Esto ha permitido el uso del ARN catalftico para escindir secuencias diana especfficas e indica que los ARN catalfticos disenados de acuerdo con el modelo de "cabeza de martillo" pueden 10 escindir posiblemente ARN de sustrato especffico in vivo.
El ARN interferencia (ARNi) se ha convertido en una poderosa herramienta para modular la expresion genica en mamfferos y celulas de mamffero. Este enfoque requiere la administracion de ARN interferente pequeno (siRNA) bien como el propio ARN o bien como ADN, usando un plasmido de expresion o virus y la secuencia codificante para 15 ARN de horquilla pequeno que se procesan a siRNA. Este sistema permite el eficaz transporte de los pre-siRNA al citoplasma en el que son activos y permiten el uso de promotores regulados y especfficos de tejido para la expresion genica.
En un aspecto preferido, un oligonucleotido o compuesto antisentido comprende un oligomero o polfmero de acido 20 ribonucleico (ARN) y/o acido desoxirribonucleico (ADN), o un mimetico, quimera, analogo u homologo de los mismos. Este termino incluye oligonucleotidos compuestos de nucleotidos de origen natural, azucares y enlaces internucleosfdicos covalentes (esqueleto), ademas de oligonucleotidos que tienen partes no de origen natural que funcionan similarmente. Dichos oligonucleotidos modificados o sustituidos son frecuentemente deseados con respecto a formas nativas debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, captacion celular potenciada, 25 afinidad potenciada por un acido nucleico diana y elevada estabilidad en presencia de nucleasas.
De acuerdo con la presente divulgacion, los oligonucleotidos o "compuestos antisentido" incluyen oligonucleotidos antisentido (por ejemplo, ARN, ADN, mimetico, quimera, analogo u homologo de los mismos), ribozimas, oligonucleotidos de secuencia de gufa externa (EGS), compuestos de ARNip, compuestos de interferencia (ARNi) de 30 ARN mono- o bicatenario tales como compuestos de ARNip, ARNap, ARNa, y otros compuestos oligomericos que hibridan con al menos una parte del acido nucleico diana y modulan su funcion. Por lo tanto, pueden ser ADN, aRn, similares a ADN, similares a ARN, o mezclas de los mismos, o pueden ser mimeticos de uno o mas de estos. Estos compuestos pueden ser compuestos oligomericos monocatenarios, bicatenarios, circulares o de horquilla y pueden contener elementos estructurales tales como protuberancias internas o terminales, desapareamientos o bucles. Los 35 compuestos antisentido se preparan de forma rutinaria linealmente, pero pueden unirse o prepararse de otro modo para ser circulares y/o ramificados. Los compuestos antisentido pueden comprender construcciones tales como, por ejemplo, dos cadenas hibridadas para formar un compuesto completan o parcialmente bicatenario o una unica cadena con auto-complementariedad suficiente para permitir la hibridacion y formacion de un compuesto completa o parcialmente bicatenario. Las dos cadenas pueden enlazarse internamente, dejando los extremos 3' o 5' libres o 40 pueden enlazarse para formar una estructura de horquilla continua o bucle. La estructura de horquilla puede contener un nucleotido protuberante en cualquiera de los extremos 5' o 3' que produce una extension del caracter monocatenario. Los compuestos bicatenarios opcionalmente pueden comprender nucleotidos protuberantes en los extremos. Modificaciones adicionales pueden comprender grupos conjugados unidos a uno de los extremos, posiciones de nucleotido seleccionadas, posiciones de azucar o a uno de los enlaces internucleosfdicos. Como 45 alternativa, las dos cadenas pueden enlazarse mediante un resto no de acido nucleico o grupo conector. Cuando se forma a partir de solo una cadena, el dsARN puede tomar la forma de una molecula tipo horquilla auto- complementaria que se dobla sobre sf misma para formar un duplex. De este modo, el ARNds puede ser completa o parcialmente bicatenario. Puede lograrse modulacion especffica de la expresion genica por expresion estable de horquillas de dsARN en lfneas celulares transgenicas. Cuando se forma a partir de dos cadenas, o una unica cadena 50 que adopta la forma de una molecula de tipo horquilla auto-complementaria que se dobla sobre sf misma para formar un duplex, las dos cadenas (o regiones formadoras de duplex de una sola cadena) son cadenas de ARN complementarias que se aparean con bases en el modo de Watson-Crick.
Una vez introducidos a un sistema, los compuestos de la divulgacion pueden provocar la accion de una o mas 55 enzimas o protefnas estructurales para efectuar la escision u otra modificacion del acido nucleico diana o pueden trabajar mediante mecanismos basados en la ocupacion. En general, los acidos nucleicos (incluyendo oligonucleotidos) pueden describirse como "de tipo ADN" (es decir, que generalmente tienen uno o mas 2'- desoxiazucares y, generalmente, bases T en vez de U) o "de tipo ARN" (es decir, que generalmente tienen uno o mas 2'-hidroxilo o azucares modificados en 2' y, generalmente bases U en vez de T). Las helices de acido nucleico 60 pueden adoptar mas de un tipo de estructura, mas comunmente las formas A y B. Se cree que, en general, los
oligonucleotidos que tienen estructura similar a la forma B son "de tipo ADN" y aquellos que tienen estructura de tipo forma A son "de tipo ARN". En algunos aspectos (quimericos), un compuesto antisentido puede contener tanto regiones en forma A como en B.
5 Los compuestos antisentido de acuerdo con esta divulgacion pueden comprender una parte antisentido de aproximadamente 5 a aproximadamente 80 nucleotidos (es decir, de aproximadamente 5 a aproximadamente 80 nucleosidos enlazados) de longitud. Esto se refiere a la longitud de la cadena antisentido o parte del compuesto antisentido. En otras palabras, un compuesto antisentido monocatenario de la divulgacion comprende de 5 a aproximadamente 80 nucleotidos, y un compuesto antisentido bicatenario de la divulgacion (tal como un dsARN, por 10 ejemplo) comprende una cadena sentido y antisentido o parte de 5 a aproximadamente 80 nucleotidos de longitud. Un experto habitual en la materia apreciara que este comprenda partes antisentido de 5, 6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,
15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45,
46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76,
77, 78,79, o 80 nucleotidos de longitud, o cualquier intervalo entremedias.
15
En un aspecto, los compuestos antisentido de la divulgacion tienen partes antisentido de 10 a 50 nucleotidos de longitud. Un experto habitual en la materia apreciara que estos integran oligonucleotidos que tienen partes antisentido de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36,
37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 nucleotidos de longitud, o cualquier intervalo entremedias. En
20 algunos aspectos, los oligonucleotidos tienen 15 nucleotidos de longitud.
En un aspecto, los compuestos antisentido o de oligonucleotido de la divulgacion tienen partes antisentido de 12 o 13 a 30 nucleotidos de longitud. Un experto en la materia apreciara que estos integran compuestos antisentido que tienen partes antisentido de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleotidos de 25 longitud, o cualquier intervalo entremedias.
En un aspecto, los compuestos oligomericos de la presente divulgacion tambien incluyen variantes en las que una base diferente esta presente en una o mas de las posiciones de nucleotido en el compuesto. Por ejemplo, si el primer nucleotido es una adenosina, pueden producirse variantes que contienen timidina, guanosina o citidina en 30 esta posicion. Esto puede hacerse en cualquiera de las posiciones de los compuestos antisentido o de dsARN. Estos compuestos se ensayan entonces usando los procedimientos descritos en el presente documento para determinar su capacidad para inhibir la expresion de un acido nucleico diana.
En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencias o complementariedad, entre el compuesto antisentido y 35 la diana, es de aproximadamente el 40% a aproximadamente el 60 %. En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 60% a aproximadamente el 70%. En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 70% a aproximadamente el 80%. En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 80% a aproximadamente el 90%. En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencias 40 o complementariedad es de aproximadamente el 90%, aproximadamente el 92%, aproximadamente el 94%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 96%, aproximadamente el 97%, aproximadamente el 98%, aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100%.
En un aspecto, los oligonucleotidos antisentido, como, por ejemplo, las moleculas de acidos nucleicos expuestas en 45 las SEQ ID NO: 8 a 16 comprenden una o mas sustituciones o modificaciones. En un aspecto, los nucleotidos estan sustituidos con acidos nucleicos bloqueados (LNA).
En un aspecto, los oligonucleotidos se dirigen a una o mas regiones de las moleculas de acidos nucleicos sentido y/o antisentido de secuencias codificantes y/o no codificantes asociadas al gen IFRD1 y las secuencias expuestas 50 como las SEQ ID NO: 1 al 7. Los oligonucleotidos tambien se dirigen a regiones solapantes de las SEQ ID NO: 1 a 7.
Ciertos oligonucleotidos preferidos de esta divulgacion son oligonucleotidos quimericos. "Oligonucleotidos quimericos" o "quimeras", en el contexto de esta divulgacion, son oligonucleotidos que contienen dos o mas regiones 55 qufmicamente distintas, cada una constituida por al menos un nucleotido. Estos oligonucleotidos normalmente contienen al menos una region de nucleotidos modificados que confiere una o mas propiedades beneficiosas (tales como, por ejemplo, resistencia a nucleasas incrementada, captacion en celulas incrementada, afinidad de union por la diana incrementada) y una region que es un sustrato para enzimas capaces de escindir hfbridos de ARN:ADN o ARN:ARN. A modo de ejemplo, la ARNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de un 60 duplex de ARN:ADN. La activacion de RNasa H, por lo tanto, produce la escision del ARN diana, potenciando asf
enormemente la eficiencia de la modulacion antisentido de la expresion genica. Por consiguiente, frecuentemente pueden obtenerse resultados comparables con oligonucleotidos mas cortos cuando se usan oligonucleotidos quimericos, en comparacion con desoxioligonucleotidos de fosforotioato que hibridan con la misma region diana. La escision del ARN diana puede detectarse rutinariamente por electroforesis en gel y, si fuera necesario, tecnicas de 5 hibridacion de acidos nucleicos asociadas conocidas en la tecnica. En un aspecto, un oligonucleotido quimerico comprende al menos una region modificada para aumentar la afinidad de union de la diana, y, normalmente, una region que actua de sustrato para ARNasa H. La afinidad de un oligonucleotido por su diana (en este caso, un acido nucleico que codifica ras) se determina rutinariamente midiendo la Tm de un par de oligonucleotido/diana, que es la temperatura a la que se disocian el oligonucleotido y la diana; la disociacion se detecta espectrofotometricamente. 10 Cuanto mayor sea la Tm, mayor sera la afinidad del oligonucleotido por la diana.
Se pueden formar compuestos antisentido quimericos de la divulgacion como estructuras compuestas de dos o mas oligonucleotidos, oligonucleotidos modificados, oligonucleosidos y/o mimeticos de oligonucleotidos, tal como se ha descrito anteriormente. Como tales, estos compuestos tambien se han referido en la tecnica como hfbridos o 15 gapmeros. Las patentes representativas de los Estados Unidos que ensenan la preparacion de estas estructuras hfbridas comprenden, pero no se limitan a, las patentes de los EE. UU. con nos. 5.013.830;5.149.797;5. 220.007;5.256.775;5.366.878;5.403.711;5.491.133;5.565.350;5.623.065;5.652.355;5.652.356; y5.700.922.
En un aspecto, la region del oligonucleotido que se modifica comprende al menos un nucleotido modificado en la 20 posicion 2' del azucar, de la forma mas preferente un nucleotido modificado con 2'-O-alquilo, 2'-O-alquil-O-alquilo o 2'-fluor. En otro aspecto, las modificaciones de ARN incluyen modificaciones de 2'-fluor, 2'-amino y 2'-O-metilo en la ribosa de pirimidinas, residuos abasicos o una base invertida en el extremo 3' del ARN. Dichas modificaciones se incorporan rutinariamente en oligonucleotidos y se ha demostrado que estos oligonucleotidos tienen una mayor Tm (es decir, mayor afinidad de union a diana) que los 2'-desoxioligonucleotidos contra una diana dada. El efecto de 25 dicha afinidad incrementada es potenciar enormemente la inhibicion por oligonucleotidos de ARNi de la expresion genica. La ARNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de los duplex de ARN:ADN; por lo tanto, la activacion de esta enzima produce la escision del ARN diana, y de este modo puede potenciar enormemente la eficiencia de inhibicion de ARNi. La escision del ARN diana puede demostrarse rutinariamente por electroforesis en gel. En un aspecto, el oligonucleotido quimerico tambien se modifica para potenciar la resistencia a 30 nucleasas. Las celulas contienen diversas exo- y endo-nucleasas que pueden degradar acidos nucleicos. Se ha demostrado que varias modificaciones de nucleotidos y nucleosidos hacen que el oligonucleotido en el que se incorporan sea mas resistente a la digestion por nucleasa que el oligodesoxinucleotido nativo. La resistencia a nucleasas se mide rutinariamente incubando oligonucleotidos con extractos celulares o soluciones de nucleasa aisladas y midiendo el grado de oligonucleotido intacto que queda con el tiempo, normalmente por electroforesis en 35 gel. Los oligonucleotidos que se han modificado para potenciar su resistencia a nucleasas sobreviven intactos durante mas tiempo que los oligonucleotidos sin modificar. Se ha demostrado que diversas modificaciones de oligonucleotidos potencian o confieren resistencia a nucleasas. Los oligonucleotidos que contienen al menos una modificacion de fosforotioato son actualmente mas preferidos. En algunos casos, las modificaciones de oligonucleotidos que potencian la afinidad de union a diana son, tambien, independientemente, capaces de potenciar 40 la resistencia a nucleasas.
Ejemplos especfficos de algunos oligonucleotidos preferidos concebidos por esta divulgacion incluyen aquellos que comprenden esqueletos modificados, por ejemplo, fosforotioatos, fosfotriesteres, metilfosfonatos, enlaces entre azucares de alquilo o cicloalquilo de cadena corta o enlaces entre azucares heteroatomicos o heterocfclicos de 45 cadena corta. Los mas preferidos son oligonucleotidos con esqueletos de fosforotioato y aquellos con esqueletos de heteroatomo, particularmente esqueletos de CH2 -NH-O-CH2, CH,-N(CH3)-O-CH2 [conocido como esqueleto de metilen(metilimino) o MMI], CH2 -O-N (CH3)-CH2, CH2 -N (CH3)-N (CH3)-CH2 y O-N (CH3)-CH2 -CH2, donde el esqueleto de fosfodiester nativo se representa como O-P-O-CH,). Los esqueletos de amida divulgados por De Mesmaeker y cols., (1995) Acc. Chem. Res. 28:366-374 tambien se prefieren. Tambien se prefieren oligonucleotidos 50 que tienen esqueletos de morfolino (Summerton y Weller, patente de EE.UU. N.°. 5.034.506. En otro aspecto, tal como el esqueleto de acido nucleico peptfdico (PNA), el esqueleto de fosfodiester del oligonucleotido se sustituye por un esqueleto de poliamida, estando los nucleotidos unidos directamente o indirectamente a los atomos de nitrogeno azo del esqueleto de poliamida. Los oligonucleotidos tambien pueden comprender uno o mas restos de azucar sustituidos. Oligonucleotidos preferidos comprenden uno de los siguientes en la posicion 2': OH, SH, SCH3, 55 F, OCN, OCH3, O(CH2)n CH3, O(CH2)n NH2 o O(CH2)n CH3 en los que n es de 1 a aproximadamente 10; alquilo C1 a C10 inferior, alcoxialcoxi, alquilo, alcarilo o aralquilo inferior sustituido; Cl; Br, CN; CF3; OCF3; O-, S-, o N- alquilo; O--, S-, o N-alquenilo; sOcH3; SO2 CH3; ONO2; NO2; N3; NH2; heterocicloalquilo; heterocicloalcarilo; aminoalquilamino; polialquilamino; sililo sustituido; un grupo de escision de ARN; un grupo reportero; un intercalador; un grupo para mejorar las propiedades farmacocineticas de un oligonucleotido; o un grupo para mejorar las 60 propiedades farmacodinamicas de un oligonucleotido y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Una
modificacion preferida incluye 2'-metoxietoxi [2'-O-CH2 CH2 OCH3, tambien conocido como 2'-O-(2-metoxietilo)]. Otras modificaciones preferidas incluyen 2'-metoxi (2'-O-CH3), 2'-propoxi(2'-OCH2 CH2CH3) y 2'-fluor (2'-F). Tambien pueden hacerse modificaciones similares en otras posiciones sobre el oligonucleotido, particularmente la posicion 3' del azucar en el nucleotido del extremo 3' y la posicion 5' del nucleotido del extremo 5'. Los 5 oligonucleotidos tambien pueden tener mimeticos de azucar tales como ciclobutilos en lugar del grupo pentofuranosilo.
Los oligonucleotidos tambien pueden comprender, adicionalmente o como alternativa, modificaciones o sustituciones de nucleobases (frecuentemente denominadas en la tecnica simplemente "base"). Tal como se usa en el presente 10 documento, nucleotidos "no modificados" o "naturales" incluyen adenina (A), guanina (G), timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Los nucleotidos modificados incluyen nucleotidos encontrados solo poco frecuentemente o transitoriamente en acidos nucleicos naturales, p. ej., hipoxantina, 6-metiladenina, 5-Me-pirimidinas, particularmente 5-metilcitosina (tambien denominada 5-metil-2'-desoxicitosina y frecuentemente denominada en la tecnica 5-Me-C), 5-hidroximetilcitosina (HMC), glicosil HMC y gentobiosil HMC, ademas de nucleotidos sinteticos, p. ej., 215 aminoadenina, 2-(metilamino)adenina, 2-(imidazolilalquil)adenina, 2-(aminoalquilamino)adenina u otras alquiladeninas heterosustituidas, 2-tiouracilo, 2-tiotimina, 5-bromouracilo, 5-hidroximetiluracilo, 8-azaguanina, 7- deazaguanina, N6(6-aminohexil)adenina y 2,6-diaminopurina. Puede incluirse una base "universal" conocida en la tecnica, por ejemplo, inosina. Se ha demostrado que las sustituciones 5-ME-C aumentan la estabilidad de los duplex de acidos nucleicos en 0,6-1,2 °C., y actualmente son las sustituciones de base preferidas.
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Otra modificacion de los oligonucleotidos de la divulgacion implica enlazar qufmicamente al oligonucleotido uno o mas restos o conjugados que potencian la actividad o captacion celular del oligonucleotido. Dichos restos incluyen, pero no se limitan a, restos lipfdicos como restos de colesterol, restos de colesterilo, una cadena alifatica, p. ej. residuos de dodecandiol o undecilo, una poliamina o una cadena de polietilenglicol, o acido adamantano acetico. Los 25 oligonucleotidos que comprenden restos lipofilos, y procedimientos para preparar dichos oligonucleotidos, son conocidos en la tecnica, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.os 5.138.045, 5.218.105 y 5.459.255.
No es necesario que todas las posiciones en un oligonucleotido dado esten uniformemente modificadas, y de hecho mas de una de las modificaciones mencionadas anteriormente puede incorporarse en un unico oligonucleotido o 30 incluso dentro de un unico nucleosido dentro de un oligonucleotido. La presente divulgacion tambien incluye oligonucleotidos que son oligonucleotidos quimericos, tal como se ha definido anteriormente en el presente documento.
En otro aspecto, la molecula de acido nucleico de la presente divulgacion esta conjugada con otro resto que incluye, 35 aunque no se limita a, nucleotidos abasicos, polieter, poliamina, poliamidas, peptidos, hidratos de carbono, lfpido, o compuestos de polihidrocarburo. Los expertos en la materia reconoceran que estas moleculas pueden enlazarse a uno o mas de cualquiera de los nucleotidos que comprenden la molecula de acido nucleico en varias posiciones en el azucar, base o grupo fosfato.
40 Los oligonucleotidos usados de acuerdo con esta divulgacion pueden prepararse comoda y rutinariamente mediante la tecnica muy conocida de sfntesis en fase solida. Equipo para dichas sfntesis es comercializado por varios proveedores que incluyen Applied Biosystems. Tambien puede emplearse cualquier otro medio para dicha sfntesis; la sfntesis real de los oligonucleotidos esta perfectamente dentro de las aptitudes de un experto en la materia. Tambien es muy conocido usar tecnicas similares para preparar otros oligonucleotidos tales como fosforotioatos y 45 derivados alquilados. Tambien es muy conocido usar tecnicas similares y amiditos modificados disponibles en el mercado y productos de vidrio de poro controlado (CPG) tales como biotina, fluorescefna, acridina o amiditos modificados con psoraleno y/o CPG (disponible gracias a Glen Research, Sterling VA) para sintetizar oligonucleotidos marcados de forma fluorescente, biotinilados u otros oligonucleotidos modificados tales como oligonucleotidos modificados con colesterol.
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De acuerdo con la divulgacion, el uso de modificaciones tales como el uso de monomeros de LNA para potenciar la potencia, especificidad y duracion de la accion y ampliar las vfas de administracion de oligonucleotidos comprende qufmicas actuales tales como MOE, ANA, fAnA, PS, etc. Esto puede lograrse sustituyendo algunos de los monomeros en los oligonucleotidos actuales por monomeros LNA. El oligonucleotido modificado con LNA puede 55 tener un tamano similar al compuesto parental o puede ser mas grande o preferentemente mas pequeno. Se prefiere que dichos oligonucleotidos modificados con LNA contengan menos de aproximadamente el 70%, mas preferentemente menos de aproximadamente el 60%, de la manera mas preferente menos de aproximadamente el 50% de monomeros de lNa y que sus tamanos esten entre aproximadamente 5 y 25 nucleotidos, mas preferentemente entre aproximadamente 12 y 20 nucleotidos.
Esqueletos de oligonucleotidos modificados preferidos comprenden, aunque no se limitan a, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriesteres, aminoalquilfosfotriesteres, metil y otros alquil fosfonatos que comprenden 3'-alquilenfosfonatos y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos que comprenden 3'-amino fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriesteres y 5 boranofosfatos que tienen enlaces 3'-5' normales, analogos enlazados en 2'-5' de estos, y aquellos que tienen polaridad invertida, donde los pares adyacentes de unidades de nucleosidos estan enlazados 3'-5' a 5'-3' o 2'-5' a 5'2'. Tambien se incluyen diversas sales, sales mixtas y formas de acido libre.
Las patentes representativas de los Estados Unidos que ensenan la preparacion de los enlaces anteriores que 10 contienen fosforo comprenden, pero no se limitan a, las patentes de eE.UU. n.os 3.687.808; 4.469.863; 4.476.301; 5.023.243; 5.177.196; 5.188.897; 5.264.423; 5.276.019; 5.278.302; 5.286.717; 5.321.131; 5.399.676; 5.405.939;
5.453.496; 5.455.233; 5.466.677; 5.476.925; 5.519.126; 5.536.821; 5,541,306; 5.550.111; 5.563.253; 5.571.799;
5.587.361; y 5.625.050.
15 Esqueletos de oligonucleotido modificados preferidos que no incluyen un atomo de fosforo en ellos tienen esqueletos que se forman por enlaces internucleosfdicos de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, enlaces internucleosfdicos de heteroatomo y alquilo o cicloalquilo mixtos, o uno o mas enlaces internucleosfdicos heteroatomicos o heterocfclicos de cadena corta. Estos comprenden aquellos que tienen enlaces morfolino (formados en parte a partir de la parte de azucar de un nucleosido); esqueletos de siloxano; esqueletos de sulfuro, sulfoxido y sulfona; esqueletos de 20 formacetilo y tioformacetilo; esqueletos de metilenformacetilo y tioformacetilo; esqueletos que contienen alqueno; esqueletos de sulfamato; esqueletos de metilenimino y metilenhidrazino; esqueletos de sulfonato y sulfonamida; esqueletos de amida; y otros que tienen partes de componentes de N, O, S y CH2 mixtos.
Las patentes representativas de los Estados Unidos que ensenan la preparacion de los oligonucleosidos anteriores 25 comprenden, pero no se limitan a, las patentes de EE.UU. n.os 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134;
5.216.141; 5.235.033; 5.264.562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307;
5.561.225; 5.596. 086; 5.602.240; 5.610.289; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623.070; 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; y 5.677.439.
30 En otros mimeticos de oligonucleotidos preferidos, tanto el azucar como el enlace internucleosfdico, es decir, el esqueleto, de las unidades de nucleotido se sustituyen por grupos novedosos. Las unidades de base se mantienen para la hibridacion con un compuesto de acido nucleico diana apropiado. Dicho compuesto oligomerico, un oligonucleotido mimetico que se ha demostrado que tiene excelentes propiedades de hibridacion, se denomina acido nucleico peptfdico (PNA). En compuestos de PNA, el esqueleto de azucar de un oligonucleotido se sustituye por un 35 esqueleto que contiene amida, en particular un esqueleto de aminoetilglicina. Las nucleobases son retenidas y se unen directamente o indirectamente a atomos de nitrogeno azo de la parte de amida del esqueleto. Las patentes representativas de los Estados Unidos que ensenan la preparacion de compuestos de PNA comprenden, pero no se limitan a, las patentes de los EE.UU. n.os 5.539.082; 5.714.331; y 5.719.262.
40 Ensenanzas adicionales de compuestos de PNA pueden encontrarse en Nielsen, y col. (1991) Science 254, 14971500.
En un aspecto de la divulgacion, los oligonucleotidos con esqueletos de fosforotioato y oligonucleosidos con esqueletos de heteroatomo, y en particular -CH2-NH-O-CH2-,-CH2-N (CH3)-O-CH2-, conocidos como un esqueleto 45 de metileno (metilimino) o esqueleto de MMI,- CH2-O-N (CH3)-CH2-,-CH2N(CH3)-N(CH3) CH2-y-O-N(CH3)-CH2- CH2- donde el esqueleto de fosfodiester nativo se representa como -O-P-O-CH2- de la patente de EE.UU. n.° 5.489.677, citada anteriormente, y los esqueletos de amida de la patente de EE.UU. n.° 5.602.240, citada anteriormente. Tambien se prefieren oligonucleotidos que tienen estructuras de esqueletos de morfolino de la patente de EE.UU. n.° 5.034.506, citada anteriormente.
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Los oligonucleotidos modificados tambien pueden contener uno o mas restos de azucar sustituidos. Oligonucleotidos preferidos comprenden uno de los siguientes en la posicion 2': OH; F; O-, S- o N-alquilo; O-, S-, o N-alquenilo; O-, So N-alquinilo; o O-alquil-O-alquilo, donde el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo C1 a C10, o alquenilo y alquinilo C2 a C10 sustituidos o sin sustituir. Se prefieren particularmente O(CH2)n OmCH3, O(CH2)n, OCH3, 55 O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 y O(CH2)nON(CH3)2 donde n y m pueden ser de 1 a aproximadamente 10. Otros oligonucleotidos preferidos comprenden uno de los siguientes en la posicion 2': C a CO, (alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo o O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, CI, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, nH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escision de ARN, un grupo indicador, un intercalador, un grupo para 60 mejorar las propiedades farmacocineticas de un oligonucleotido, o un grupo para mejorar las propiedades
farmacodinamicas de un oligonucleotido, y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Una modificacion preferida comprende 2'-metoxietoxi (2'-O-CH2CH2OCH3, tambien conocido como 2'-O-(2-metoxietilo) o 2'-MOE) es decir, un grupo alcoxialcoxi. Otra modificacion preferida comprende 2'-dimetilaminooxietoxi, es decir, un grupo O(CH2)2ON(CH3)2, tambien conocido como 2-DMAOE, tal como se describe en los ejemplos en el presente 5 documento mas adelante, y 2'-dimetilaminoetoxietoxi (tambien conocido en la tecnica como 2'-O- dimetilaminoetoxietilo o 2'-DMAEOE), es decir, 2'-O-CH2-O-CH2-N (CH2)2.
Otras modificaciones preferidas comprenden 2'-metoxi (2'-O CH3), 2'-aminopropoxi (2'-OCH2CH2CH2NH2) y 2- fluoro (2'-F). Tambien pueden hacerse modificaciones similares en otras posiciones en el oligonucleotido, 10 particularmente la posicion 3' del azucar en el nucleotido del extremo 3' o en oligonucleotidos enlazados 2'-5' y la posicion 5' del nucleotido del extremo 5'. Los oligonucleotidos tambien pueden tener mimeticos de azucar tales como restos ciclobutilo en lugar del azucar pentofuranosilo. Las patentes representativas de los Estados Unidos que ensenan la preparacion de dichas estructuras de azucar modificadas comprenden, pero no se limitan a, las patentes de los EE. UU. n.os. 4.981.957;5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 15 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873; 5.670.633; y 5.700.920.
Los oligonucleotidos tambien pueden comprender modificaciones o sustituciones de nucleobases (frecuentemente denominadas en la tecnica simplemente "base"). Tal como se usa en el presente documento, nucleotidos "no 20 modificados" o "naturales" comprenden las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Los nucleotidos modificados comprenden otros nucleotidos naturales y sinteticos tales como 5-metilcistosina (5-me-C), 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2- aminoadenina, 6-metilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina. 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propiniluracilo y citosina, 6-azouracilo, citosina y timina, 5-uracilo 25 (pseudo-uracilo), 4-tiouracilo, 8-halogeno, 8-amino, 8-tiol, 8-tiol, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas sustituidas en 8, 5-halogeno, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas sustituidos en 5, 7- metilquanina y 7-metiladenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina.
30 Ademas, los nucleotidos comprenden los divulgados en la patente de Estados Unidos n.° 3.687.808, aquellos divulgados en "The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering", paginas 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons,1990, aquellos divulgados por Englisch y col., "Angewandle Chemie, International Edition", 1991, 30, pagina 613, y aquellos divulgados por Sanghvi, Y.S., Capftulo 15, "Antisense Research and Applications", paginas 289-302, Crooke, S.T. y Lebleu, B. ea., CRC Press, 1993. Algunos de estos nucleotidos son particularmente 35 utiles para incrementar la afinidad de union de los compuestos oligomericos de la divulgacion. Estos comprenden pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas sustituidas en N-2, N-6 y O-6, que comprenden 2- aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Se ha demostrado que las sustituciones de 5-metilcitosina incrementan la estabilidad del duplex de acido nucleico alrededor de 0,6-1,2°C. (Sanghvi, Y. S., en Crooke, S. T. y Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, paginas 276-278) y 40 actualmente son las sustituciones base preferidas, de manera aun mas particular cuando se combinan con modificaciones de azucar de 2'-Ometoxietilo.
Las patentes representativas de los Estados Unidos que ensenan la preparacion de los nucleotidos modificados citados anteriormente, asf como otros nucleotidos modificados, comprenden, pero no se limitan a,las patentes de los 45 EE. UU. n.os. 3.687.808, asf como 4.845.205; 5.130.302; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.596.091; 5.614.617; 5.750.692, y 5.681,941.
Otra modificacion de los oligonucleotidos de la divulgacion implica enlazar qufmicamente al oligonucleotido uno o mas restos o conjugados, que mejoran la actividad, distribucion celular o captacion celular del oligonucleotido.
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Dichos restos comprenden, aunque no se limitan a, restos de lfpido tales como un resto colesterol, acido colico, un tioeter, p. ej., hexil-S-tritiltiol, un tiocolesterol, una cadena alifatica, p. ej., residuos de dodecanodiol o undecilo, un fosfolfpido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio, una poliamina o una cadena de polietilenglicol, o acido adamantano acetico, un resto palmitilo, o un resto octadecilamina 55 o hexilamino-carbonil-t oxicolesterol.
Las patentes representativas de los Estados Unidos que ensenan la preparacion de dichos conjugados de oligonucleotidos comprenden, pero no se limitan a, las patentes de los EE.UU n.os. 4.828.979; 4.948.882; 5.218.105; 5.525.465; 5.541.313; 5.545.730; 5.552.538; 5.578.717, 5.580.731; 5.580.731; 5.591.584; 5.109.124; 5.118.802; 60 5.138.045; 5.414.077; 5.486.603; 5.512.439; 5.578.718; 5.608.046; 4.587.044; 4.605.735; 4.667.025;
4.762.779;.4.789.737; 4.824.941; 4.835.263; 4.876.335; 4.904.582; 4.958.013; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5. 245.022; 5.254.469; 5.258.506; 5.262.536; 5.272.250; 5.292.873; 5.317.098; 5.371.241, 5.391.723; 5.416.203, 5.451.463; 5.510.475; 5.512.667; 5.514.785; 5.565.552; 5.567.810; 5.574.142; 5.585.481; 5.587.371; 5.595.726; 5.597.696; 5.599.923; 5.599.928 y 5.688.941.
5
Descubrimientos de farmacos: Los compuestos de la presente divulgacion tambien pueden aplicarse en las areas del descubrimiento de farmacos y validacion de dianas. La presente divulgacion comprende el uso de los compuestos y segmentos diana preferidos e identificados en el presente documento en un esfuerzo por descubrir farmacos para esclarecer las relaciones que existen entre los polinucleotidos del regulador del desarrollo 1 asociado 10 a interferon (IFRD1) y una patologfa, fenotipo o afeccion. Estos procedimientos incluyen detectar o modular los polinucleotidos de IFRD1 que comprenden poner en contacto una muestra, tejido, celula u organismo con los compuestos de la presente divulgacion, medir el nivel de acido nucleico o de protefna de los polinucleotidos de IFRD1 y/o un criterio de valoracion fenotfpico o qufmico relacionado en algun momento despues del tratamiento, y opcionalmente comparar el valor medido con una muestra no tratada o muestra tratada con otro compuesto de la 15 divulgacion. Estos procedimientos tambien pueden realizarse en paralelo o en combinacion con otros experimentos para determinar la funcion de genes desconocidos para el proceso de validacion de dianas o para determinar la validez de un producto genico particular como diana para el tratamiento o prevencion de una enfermedad, afeccion o fenotipo particular.
20 Evaluation de la regulation positiva o inhibition de la expresion genica:
La transferencia de un acido nucleico exogeno a una celula u organismo huesped puede evaluarse detectando directamente la presencia del acido nucleico en la celula u organismo. Dicha deteccion puede lograrse mediante varios procedimientos bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, la presencia del acido nucleico exogeno puede 25 detectarse por Southern blot o por una tecnica de reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores que amplifican especfficamente secuencias de nucleotidos asociadas al acido nucleico. La expresion de los acidos nucleicos exogenos tambien puede medirse usando procedimientos convencionales que incluyen analisis de expresion genica. Por ejemplo, el ARNm producido a partir de un acido nucleico exogeno puede detectarse y cuantificarse usando una Northern blot y PCR con transcripcion inversa (RT-PCR).
30
La expresion de ARN del acido nucleico exogeno tambien puede detectarse midiendo una actividad enzimatica o una actividad de protefna reportera. Por ejemplo, puede medirse la actividad moduladora antisentido indirectamente como una disminucion o aumento en la expresion de acido nucleico diana como una indicacion de que el acido nucleico exogeno esta produciendo el ARN efector. Basandose en conservacion de secuencias, pueden disenarse 35 cebadores y usarse para amplificar regiones codificantes de los genes diana. Inicialmente, la region codificante mas altamente expresada de cada gen puede usarse para construir un gen de control modelo, aunque puede usarse cualquier region codificante o no codificante. Cada gen de control se ensambla insertando cada region codificante entre una region codificante reportera y su senal de poli(A). Estos plasmidos producirfan un ARNm con un gen reportero en la parte cadena arriba del gen y una posible diana de ARNi en la region no codificante 3'. La eficacia de 40 oligonucleotidos antisentido individuales se ensayarfa por modulacion del gen reportero. Los genes reporteros utiles en los procedimientos de la presente divulgacion incluyen acetohidroxiacido sintasa (AHAS), fosfatasa alcalina (AP), beta-galactosidasa (LacZ), beta-glucuronidasa (GUS), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), protefna verde fluorescente (GFP), protefna roja fluorescente (RFP), protefna amarilla fluorescente (YFP), protefna cian fluorescente (CFP), peroxidasa de rabano picante (HRP), luciferasa (Luc), nopalina sintasa (NOS), octopina sintasa (OCS), y 45 derivados de los mismos. Estan disponibles multiples marcadores de seleccion que confieren resistencia a ampicilina, bleomicina, cloranfenicol, gentamicina, higromicina, kanamicina, lincomicina, metotrexato, fosfinotricina, puromicina y tetraciclina. Los procedimientos de determinacion de la modulacion de un gen indicador son muy conocidos en la tecnica, e incluyen, aunque no se limitan a, procedimientos fluorimetricos (por ejemplo, espectroscopfa de fluorescencia, clasificacion celular activada por fluorescencia (FACS), microscopfa de 50 fluorescencia), determinacion de la resistencia a antibioticos.
La expresion de la protefna y del ARNm de IFRD1 puede controlarse utilizando procedimientos conocidos por los expertos en la tecnica y descritos en este documento. Por ejemplo, pueden usarse inmunoensayos como ELISA para medir los niveles de protefna. Los kits de ensayo ELISA para IFRD1 estan disponibles comercialmente, p. ej., 55 en R&D Systems (Minneapolis, MN).
En unos aspectos, la expresion de IFRD1 (p. ej. ARNm o protefna) en una muestra (p. ej., celulas o tejidos in vivo o in vitro) tratados con un oligonucleotido antisentido de la divulgacion se evalua por comparacion con la expresion de IFRD1 en una muestra de control. Por ejemplo, la expresion de la protefna o del acido nucleico puede compararse 60 usando procedimientos conocidos por los expertos en la tecnica, con una muestra tratada de forma simulada y sin
tratar. De forma alternativa, puede hacerse una comparacion con una muestra tratada con un oligonucleotido antisentido control (p. ej., uno que tenga una secuencia modificada o diferente) dependiendo de la informacion deseada. En otro aspecto, una diferencia en la expresion de la protefna IFRD1 o su acido nucleico en una muestra tratada frente a una muestra sin tratar puede compararse con la diferencia en la expresion de un acido nucleico 5 diferente (incluyendo cualquier estandar que el investigador considere apropiado, por ejemplo, un gen de mantenimiento) en una muestra tratada frente a una muestra sin tratar.
Las diferencias observadas pueden expresarse como se desee, p. ej., en forma de proporcion o fraccion, para su uso en comparacion con un control. En unos aspectos, el nivel de ARNm o protefna de IFRD1, en una muestra 10 tratada con un oligonucleotido antisentido de la presente divulgacion, aumenta o disminuye entre aproximadamente
1.25 veces a unas 10 veces o mas en relacion con una muestra sin tratar o una muestra tratada con un acido nucleico de control. En unos aspectos, el nivel de ARNm o protefna de IFRD1 aumenta o disminuye entre al menos
1.25 veces, al menos 1,3 veces, al menos 1,4 veces, al menos 1,5; al menos 1,6 veces, al menos 1,7 veces, al menos 1,8 veces, al menos 2 veces, al menos 2,5 veces, al menos 3 veces, al menos 3,5 veces, al menos 4 veces,
15 al menos 4,5 veces, al menos 5 veces, al menos 5,5 veces, al menos 6 veces, al menos 6,5 veces, al menos 7 veces, al menos 7,5 veces, al menos 8 veces, al menos 8,5 veces, al menos 9 veces, al menos 9,5 veces, o al menos 10 veces o mas.
Kits, reactivos de investigacion, diagnosticos y terapeuticos
20
Los compuestos de la presente divulgacion pueden utilizarse para diagnostico, agentes terapeuticos y profilaxis, y como reactivos de investigacion y componentes de kits. Ademas, los oligonucleotidos antisentido, que son capaces de inhibir la expresion genica con exquisita especificidad, son usados frecuentemente por los expertos en la materia para aclarar la funcion de genes particulares o para distinguir entre funciones de diversos miembros de una via 25 biologica.
Para su uso en kits y diagnosticos y en diversos sistemas biologicos, los compuestos de la presente divulgacion, tanto solos como en combinacion con otros compuestos o terapeuticos, son utiles como herramientas en analisis diferenciales y/o combinatorios para aclarar patrones de expresion de una parte o de todo el complemento de genes 30 expresados dentro de celulas y tejidos.
Tal como se usa en el presente documento, la expresion "sistema biologico" o "sistema" se define como cualquier organismo, celula, cultivo celular o tejido que expresa, o se ha hecho competente para expresar productos de genes del regulador del desarrollo 1 asociado a interferon (IFRD1). Estos incluyen, aunque no se limitan a, seres humanos, 35 animales transgenicos, celulas, cultivos celulares, tejidos, xenoinjertos, trasplantes y combinaciones de los mismos.
Como un ejemplo no limitante, patrones de expresion dentro de celulas o tejidos tratados con uno o mas compuestos antisentido se comparan con celulas o tejidos de control no tratados con compuestos antisentido y los patrones producidos se analizan para niveles diferenciales de expresion genica, ya que estan relacionados, por 40 ejemplo, con asociacion de enfermedad, via de senalizacion, localizacion celular, nivel de expresion, tamano, estructura o funcion de los genes examinados. Estos analisis pueden realizarse en celulas estimuladas o sin estimular y en presencia o ausencia de otros compuestos que afectan los patrones de expresion.
Ejemplos de procedimientos de analisis de expresion genica conocidos en la tecnica incluyen matrices de ADN o 45 microarrays, SAGE (analisis en serie de expresion genica), LEE (amplificacion de ADNc digerido con enzimas de restriccion), TOGA (analisis de expresion genica total), matrices de protefnas y proteomica, etiqueta de secuencia expresada (EST),secuenciacion, huella genetica de ARN sustractivos (SuRF), clonacion sustractiva, presentacion diferencial (DD), hibridacion genomica comparativa, FISH (hibridacion fluorescente in situ), tecnicas y procedimientos de espectrometrfa de masas.
50
Los compuestos de la divulgacion son utiles para investigacion y diagnostico, debido a que estos compuestos hibridan con acidos nucleicos que codifican el regulador de desarrollo 1 asociado a interferon (IFRD1). Por ejemplo, los oligonucleotidos que hibridan con dicha eficiencia y en dichas condiciones que se han descrito en el presente documento como moduladores eficaces del gen IFRD1 son cebadores o sondas eficaces en condiciones que 55 favorecen la amplificacion genica o deteccion, respectivamente. Estos cebadores y sondas son utiles en procedimientos que requieren la deteccion especffica de moleculas de acidos nucleicos que codifican el gen IFRD1 y en la amplificacion de dichas moleculas de acidos nucleicos para la deteccion o para su uso en estudios adicionales del gen IFRD1 La hibridacion de los oligonucleotidos antisentido, particularmente los cebadores y sondas de la divulgacion con un acido nucleico que codifica el gen IFRD1, puede detectarse por medios conocidos en la tecnica. 60 Dichos medios pueden comprender conjugacion de una enzima con el oligonucleotido, radiomarcado del
oligonucleotido, o cualquier otro medio de deteccion adecuado. Tambien pueden prepararse kits que usan dichos medios de deteccion para detectar el nivel del gen IFRD1 en una muestra.
La especificidad y sensibilidad de antisentido tambien son empleadas por los expertos en la materia para usos 5 terapeuticos. Se han empleado oligonucleotidos antisentido como restos terapeuticos en el tratamiento de patologfas en animales, que incluyen seres humanos. Los farmacos de oligonucleotido antisentido se han administrado con seguridad y eficazmente a seres humanos y numerosos ensayos clfnicos estan actualmente en marcha. De este modo, se establece que los compuestos antisentido pueden ser modalidades terapeuticas utiles que pueden configurarse para ser utiles en regfmenes de tratamiento para el tratamiento de celulas, tejidos y animales, 10 especialmente seres humanos.
Para los productos terapeuticos, un animal, preferentemente un ser humano, sospechoso de tener o tiene una enfermedad o trastorno que puede tratarse modulando la expresion de los polinucleotidos del gen IFRD1 se trata administrando compuestos antisentido de acuerdo con esta divulgacion. Por ejemplo, en un aspecto no limitante, los 15 procedimientos comprenden la etapa de administrar al animal que necesita tratamiento una cantidad terapeuticamente eficaz del modulador del gen IFRD1. Los moduladores del gen IFRD1 de la presente divulgacion modulan de manera efectiva la actividad del gen IFRD1 o modulan la expresion de la protefna del gen IFRD1. En un aspecto, la actividad o expresion del gen IFRD1 en un animal se inhibe aproximadamente el 10 % en comparacion con un control. Preferentemente, la actividad o expresion del gen IFRD1 en un animal se inhibe aproximadamente el 20 30 %. Mas preferiblemente, la actividad o expresion del gen IFRD1 en un animal se inhibe el 50 % o mas. De este modo, los compuestos oligomericos modulan la expresion del ARNm del gen regulador del desarrollo 1 asociado a interferon (IFRD1) al menos el 10 %, al menos el 50 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, o el 100 % en comparacion con un control.
25
En un aspecto, la actividad o expresion del gen regulador del desarrollo 1 asociado a interferon (IFRD1) y/o en un animal aumenta aproximadamente el 10 % en comparacion con un control. Preferentemente, la actividad o expresion del gen IFRD1 en un animal se aumenta aproximadamente el 30 %. Mas preferentemente, la actividad o expresion del gen IFRD1 en un animal aumenta el 50 % o mas. De este modo, los compuestos oligomericos 30 modulan la expresion del ARNm del gen IFRD1 al menos el 10 %, al menos el 50 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98%, al menos el 99%, o el 100 % en comparacion con un control.
35 Por ejemplo, se puede medir el aumento o reduccion de la expresion del regulador del desarrollo 1 asociado a interferon (IFRD1) en suero, sangre, tejido adiposo, hfgado o cualquier otro lfquido corporal, tejido u organo del animal. Preferentemente, las celulas contenidas dentro de dichos lfquidos, tejidos u organos que se analizan contienen una molecula de acido nucleico que codifica peptidos de IFRD1 y/o la propia protefna de IFRD1.
40 Los compuestos de la divulgacion pueden utilizarse en composiciones farmaceuticas anadiendo una cantidad eficaz de un compuesto a un diluyente o vehfculo farmaceuticamente aceptable adecuado. El uso de los compuestos y procedimientos de la divulgacion tambien pueden ser utiles profilacticamente.
Conjugados
45
Otra modificacion de los oligonucleotidos de la divulgacion implica enlazar qufmicamente al oligonucleotido uno o mas restos o conjugados que mejoran la actividad, distribucion celular o captacion celular del oligonucleotido. Estos restos o conjugados pueden incluir grupos conjugados unidos de manera covalente a grupos funcionales tal como grupos hidroxilo primarios o secundarios. Grupos conjugados de la divulgacion incluyen intercaladores, moleculas de 50 genes indicadores, poliaminas, poliamidas, polietilenglicoles, polieteres, grupos que potencian las propiedades farmacodinamicas de oligomeros, y grupos que potencian las propiedades farmacocineticas de oligomeros. Grupos conjugados tfpicos incluyen colesteroles, lfpidos, fosfolfpidos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluorescefnas, rodaminas, cumarinas y colorantes. Grupos que potencian las propiedades farmacodinamicas, en el contexto de esta divulgacion, incluyen grupos que mejoran la captacion, potencian la 55 resistencia a la degradacion y/o fortalecen la hibridacion especffica de secuencia con el acido nucleico diana. Grupos que potencian las propiedades farmacocineticas, en el contexto de esta divulgacion, incluyen grupos que mejoran la captacion, distribucion, metabolismo o eliminacion de los compuestos de la presente divulgacion. Grupos conjugados representativos se describen en la solicitud de patente internacional con n.° PCT/US92/09196, depositada el 23 de octubre de 1992, y la patente de EE. UU. n.° 6.287.860.
Restos conjugados incluyen, aunque no se limitan a, restos de lipido tales como un resto colesterol, acido colico, un tioeter, p. ej., hexil-5-tritiltiol, un tiocolesterol, una cadena alifatica, p. ej., residuos de dodecanodiol o undecilo, un fosfolipido, p.ej., di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio, una poliamina o una cadena de polietilenglicol, o acido adamantano acetico, un resto palmitilo, o un resto octadecilamina 5 o hexilamino-carbonil-oxicolesterol. Los oligonucleotidos de la divulgacion tambien pueden conjugarse con principios activos, por ejemplo, aspirina, warfarina, fenilbutazona, ibuprofeno, suprofeno, fenbufeno, ketoprofeno, (S)-(+)- pranoprofeno, carprofeno, dansilsarcosina, acido 2,3,5-triyodobenzoico, acido flufenamico, acido folinico, una benzotiadiazida, clorotiazida, una diazepina, indometacina, un barbiturico, una cefalosporina, un farmaco sulfa, un antidiabetico, un antibacteriano o un antibiotico.
10
Las patentes representativas de los Estados Unidos que ensenan la preparacion de estos conjugados de oligonucleotidos incluyen, pero no se limitan a, las patentes de los EE. UU. con los n.os
4.828.979; 4.948.882; 5.218.105; 5.525.465; 5.541.313; 5.545.730; 5.552.538; 5.578.717, 5.580.731; 5.580.731; 5.5 91.584;5.109.124; 5.118.802; 5.138.045; 5.414.077; 5.486.603; 5.512.439; 5.578.718; 5.608.046; 4.587.044; 4.605.7 15 35; 4.667.025; 4.762.779;4.789.737; 4.824.941; 4.835.263; 4.876.335; 4.904.582; 4.958.013; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.245.022; 5.254.469; 5.258.506; 5.262.536; 5.272.250; 5.292.873; 5.3 17.098; 5.371.241, 5.391.723; 5.416.203. 5.451.463; 5.510.475;5.512.667; 5.514.785; 5.565.552; 5.567.810; 5.574.1 42; 5.585.481; 5.587.371; 5.595.726; 5.597.696; 5.599.923; 5.599.928 y 5.688.941.
20 Formulaciones
Los compuestos de la divulgacion tambien pueden mezclarse, encapsularse, conjugarse o asociarse de otro modo a otras moleculas, estructuras de molecula o mezclas de compuestos, como, por ejemplo, liposomas, moleculas dirigidas a receptor, formulaciones orales, rectales, topicas u otras, para ayudar en la captacion, distribucion y/o 25 absorcion. Las patentes representativas de los Estados Unidos que ensenan la preparacion de estas formulaciones de ayuda en la captacion, distribucion y/o absorcion incluyen, pero no se limitan a, las patentes de EE. UU. con n.os 5.108.921; 5.354.844; 5.416.016; 5.459.127; 5.521.291; 5.543.165; 5.547.932; 5.583.020; 5.591.721; 4.426.330; 4.534.899; 5.013.556; 5.108.921; 5.213.804; 5.227.170; 5.264.221; 5.356.633; 5.395.619; 5.416.016; 5.417.978; 5.462.854; 5.469.854; 5.512.295; 5.527.528; 5.534.259; 5.543.152; 5.556.948; 5.580.575; y 5.595.756.
30
Aunque los oligonucleotidos antisentido no necesitan administrarse en el contexto de un vector con el fin de modular la expresion y/o funcion de una diana, aspectos de la divulgacion se refieren a construcciones de vector de expresion para la expresion de oligonucleotidos antisentido, que comprende promotores, secuencias de genes promotores hibridos y poseen una fuerte actividad promotora constitutiva, o una actividad promotora que puede 35 inducirse en el caso deseado.
En un aspecto, la practica de la divulgacion implica administrar al menos uno de los oligonucleotidos antisentido anteriores con un sistema de administracion de acidos nucleicos adecuado. En un aspecto, ese sistema incluye un vector no viral enlazado operativamente al polinucleotido. Ejemplos de dichos vectores no virales incluyen el 40 oligonucleotido solo (por ejemplo, una cualquiera o mas de las SEQ ID NO: 8 a 16) o en combinacion con una formulacion de protefna, polisacarido o lipido adecuada.
Sistemas de administracion de acidos nucleicos adecuados adicionales incluyen vector viral, normalmente secuencia de al menos uno de un adenovirus, virus asociado a adenovirus (AAV), adenovirus dependiente de cooperador, 45 retrovirus, o complejo de virus hemaglutinante de Japon-liposoma (HVJ). Preferentemente, el vector viral comprende un promotor de eucariota fuerte operativamente enlazado al polinucleotido, por ejemplo, un promotor del citomegalovirus (CMV).
Vectores preferidos adicionales incluyen vectores virales, proteinas de fusion y conjugados quimicos. Los vectores 50 retrovirales incluyen virus de la leucemia murina de Moloney y virus basados en el HIV. Un vector viral basado en el HIV preferido comprende al menos dos vectores donde los genes gag y pol son de un genoma del VIH y el gen env es de otro virus. Se prefieren vectores virales de ADN. Estos vectores incluyen vectores de pox tales como vectores de ortopox o avipox, vectores del virus del herpes tales como un vector del virus del herpes simple I (HSV), vectores de adenovirus y vectores de virus asociados a adenovirus.
55
Los compuestos antisentido de la divulgacion engloban cualquier sal, ester o sal de dichos esteres farmaceuticamente aceptables, o cualquier otro compuesto que, tras la administracion a un animal, que incluye un ser humano, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito biologicamente activo o residuo del mismo.
La expresion "sales farmaceuticamente aceptables" se refiere a sales fisiologicamente y farmaceuticamente aceptables de los compuestos de la divulgacion: es decir, sales que retienen la actividad biologica deseada del compuesto parental y no confieren efectos toxicologicos no deseados al mismo. Para oligonucleotidos, ejemplos preferidos de sales farmaceuticamente aceptables y sus usos se describen adicionalmente en la patente de EE. UU.
5 n.° 6.287.860.
La presente divulgacion tambien incluye composiciones y formulaciones farmaceuticas que incluyen los compuestos antisentido de la divulgacion. Las composiciones farmaceuticas de la presente divulgacion pueden administrarse en varias formas que dependen de si se desea tratamiento local o sistemico y del area que va a tratarse. La 10 administracion puede ser topica (incluyendo oftalmica y a membranas mucosas que incluyen administracion vaginal y rectal), pulmonar, por ejemplo, por inhalacion o insuflacion de polvos o aerosoles, que incluye por nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidermica y transdermica), oral o parenteral. La administracion parenteral incluye inyeccion o infusion intravenosa, intraarterial, subcutanea, intraperitoneal o intramuscular; o administracion intracraneal, por ejemplo, intratecal o intraventricular.
15
Para el tratamiento de los tejidos en el sistema nervioso central, la administracion puede realizarse, p. ej. por inyeccion o perfusion en el lfquido cefalorraqufdeo. La administracion del ARN antisentido en el lfquido cefalorraqufdeo se describe, p. ej., en la publicacion de solicitud de patente de los EE. UU., n.° 2007/0117772, "Methods for slowing familial ALS disease progression"
20
Cuando lo que se pretende es que los oligonucleotidos antisentido de la presente divulgacion pueden administrarse a celulas del sistema nervioso central, la administracion puede ser con uno o mas agentes capaces de facilitar la penetracion de los oligonucleotidos antisentido a traves de la barrera hematoencefalica del sujeto. La inyeccion puede realizarse, por ejemplo, en la corteza entorrinal o en el hipocampo. La aplicacion de factores neurotroficos 25 mediante la administracion de un vector adenovirus en las neuronas motoras del tejido muscular se describe en, p. ej., la patente de EE. UU. con n.° 6.632.427, "Adenoviral-vector-mediated gene transfer into medullary motor neurons". La aplicacion de vectores directamente en el cerebro, p. ej., el cuerpo estriado, el talamo, el hipocampo, o la sustancia negra, es conocida en la tecnica y se describe en, p. ej. La patente de EE. UU. con n.° 6.756.523, "Adenovirus vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system particularly in brain".
30
La administracion puede ser rapida como por inyeccion o realizarse a lo largo de un perfodo de tiempo ya sea por perfusion lenta o mediante la administracion de formulaciones de liberacion lenta.
Los oligonucleotidos antisentido sujeto tambien pueden unirse o conjugarse con agentes que proporcionen unas 35 propiedades farmaceuticas o farmacodinamicas deseables. Por ejemplo, el oligonucleotido antisentido puede acoplarse a cualquier sustancia, conocida en la tecnica por favorecer la penetracion o el transporte a traves de la barrera hematoencefalica, como un anticuerpo contra el receptor de la transferrina, y administrarse por inyeccion intravenosa. El compuesto antisentido puede unirse a un vector viral, por ejemplo, que hace que el compuesto antisentido resulte mas eficaz y/o aumente el transporte del compuesto antisentido a traves de la barrera 40 hematoencefalica. La alteracion de la barrera hematoencefalica osmotica tambien puede llevarse a cabo mediante perfusion, p. ej. de azucares incluyendo, pero sin limitarse a, mesoeritritol, xilitol, D(+)-galactosa, D(+)-lactosa, D(+)- xilosa, dulcitol, mioinositol, L(-)-fructosa, D(-)-manitol, D(+)-glucosa, D(+)-arabinosa, D(-)-arabinosa, celobiosa, D(+)- maltosa, D(+)-rafinosa, L(+)-ramnosa, D(+)melibiosa, D(-)-ribosa, adonitol, D(+)-arabitol, L(-)-arabitol, D(+)-fucosa, L(-)-fucosa, D(-)-lixosa, L(+)-lixosa y L(-)-lixosa o aminoacidos, incluyendo, pero sin limitarse a, glutamina, lisina, 45 arginina, asparagina, cistefna, acido aspartico, acido glutamico, glicina, histidina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, Valina, tirosina y taurina. Los procedimientos y materiales para mejorar la penetracion en la barrera hematoencefalica se describen, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. n.os 4.866.042, "Method for the delivery of genetic material across the blood brain barrier,"6.294.520. "Material for passage through the blood-brain barrier," y 6.936.589, "Parenteral delivery systems."
50
Los compuestos antisentido objeto tambien pueden mezclarse, encapsularse, conjugarse o asociarse de otro modo a otras moleculas, estructuras de molecula o mezclas de compuestos, como, por ejemplo, liposomas, moleculas dirigidas a receptor, formulaciones orales, rectales, topicas u otras, para ayudar en la captacion, distribucion y/o absorcion. Por ejemplo, pueden incluirse lfpidos cationicos en la formulacion para facilitar la captacion de 55 oligonucleotidos. Una de dichas composiciones que se ha demostrado que facilita la absorcion es LIPOFECTIN (disponible en GIBCO BRL, Bethesda, MD).
Se cree que los oligonucleotidos con al menos una modificacion de 2'-O-metoxietilo son particularmente utiles para administracion por via oral. Composiciones y formulaciones farmaceuticas para administracion topica pueden 60 comprender parches transdermicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, esprais, lfquidos y
polvos. Pueden ser necesarios o deseables vehfculos farmaceuticos convencionales, bases acuosas, en polvo o aceitosas, espesantes y similares. Tambien pueden ser utiles preservativos recubiertos, guantes y similares.
Las formulaciones farmaceuticas de la presente divulgacion, que pueden presentarse convenientemente en forma 5 de dosificacion unitaria, pueden prepararse de acuerdo con tecnicas convencionales muy conocidas en la industria farmaceutica. Dichas tecnicas incluyen la etapa de poner en asociacion los principios activos con el (los) vehfculo(s) farmaceutico(s) o excipiente(s). En general, las formulaciones se preparan poniendo en asociacion uniforme e fntimamente los principios activos con vehfculos lfquidos o vehfculos solidos finamente divididos, o ambos, y luego, si fuera necesario, moldeando el producto.
10
Las composiciones de la presente divulgacion pueden formularse en cualquiera de muchas formas de dosificacion posibles tales como, entre otras, comprimidos, capsulas, capsulas de gel, jarabes lfquidos, geles blandos, supositorios y enemas. Las composiciones de la presente divulgacion tambien pueden formularse como suspensiones en medios acuosos, no acuosos o mixtos. Las suspensiones acuosas pueden contener 15 adicionalmente sustancias que aumentan la viscosidad de la suspension que incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa sodica, sorbitol y/o dextrano. La suspension tambien puede contener estabilizantes.
Las composiciones farmaceuticas de la presente divulgacion incluyen, aunque no se limitan a, soluciones, emulsiones, espumas y formulaciones que contienen liposomas. Las composiciones y formulaciones farmaceuticas 20 de la presente divulgacion pueden comprender uno o mas potenciadores de la penetracion, vehfculos, excipientes u otros principios activos o inactivos.
Las emulsiones normalmente son sistemas heterogeneos de un lfquido dispersado en otro en forma de gotitas que normalmente superan 0,1 pm de diametro. Las emulsiones pueden contener componentes adicionales, ademas de 25 las fases dispersas, y el farmaco activo que puede estar presente como una solucion en o bien la fase acuosa, fase oleosa o bien el mismo como una fase independiente. Las microemulsiones estan incluidas como un aspecto de la presente divulgacion. Las emulsiones y sus usos son muy conocidos en la tecnica y se describen adicionalmente en la patente de EE. UU. con n.° 6.287.860.
30 Formulaciones de la presente divulgacion incluyen formulaciones liposomales. Tal como se usa en la presente divulgacion, el termino "liposoma" significa una vesfcula compuesta por lfpidos anfifflicos dispuestos en una bicapa o bicapas esfericas. Los liposomas son vesfculas unilaminares o multilaminares que tienen una membrana formada por un material lipofilo y un interior acuoso que contiene la composicion que va a administrarse. Los liposomas cationicos son liposomas positivamente cargados que se cree que interactuan con moleculas de ADN negativamente 35 cargadas para formar un complejo estable. Se cree que los liposomas que son sensibles al pH o estan cargados negativamente atrapan el ADN en vez de complejarse con el. Se han usado tanto liposomas cationicos como no cationicos para administrar ADN a celulas.
Los liposomas tambien incluyen liposomas "estericamente estabilizados", una expresion que, tal como se usa en el 40 presente documento, se refiere a liposomas que comprenden uno o mas lfpidos especializados. Cuando se incorporan en liposomas, estos lfpidos especializados producen liposomas con vidas en circulacion mejoradas con respecto a los liposomas que carecen de dichos lfpidos especializados. Ejemplos de liposomas estericamente estabilizados son aquellos en los que parte de la parte de lfpido formado de vesfcula del liposoma comprende uno o mas glucolfpidos o se derivatiza con uno o mas polfmeros hidrofilos, tales como un resto de polietilenglicol (PEG). 45 Los liposomas y sus usos se describen adicionalmente en la patente de EE. UU. con n.° 6.287.860.
Las formulaciones y composiciones farmaceuticas de la presente divulgacion tambien pueden comprender tensioactivos. El uso de tensioactivos en medicamentos, formulaciones y en emulsiones es muy conocido en la tecnica. Los agentes tensioactivos y sus usos se describen adicionalmente en la patente de EE. UU. con n.° 50 6.287.860.
En un aspecto, la presente divulgacion emplea diversos mejoradores de la penetracion para efectuar la administracion eficiente de acidos nucleicos, particularmente oligonucleotidos. Ademas de ayudar en la difusion de farmacos no lipofilos a traves de membranas celulares, los potenciadores de la penetracion tambien potencian la 55 permeabilidad de farmacos lipofilos. Los potenciadores de la penetracion pueden clasificarse como pertenecientes a una de cinco amplias categorfas, es decir, tensioactivos, acidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y no tensioactivos no quelantes. Los mejoradores de penetracion y sus usos se describen adicionalmente en la patente de los EE. UU. con n.° 6.287.860.
60 Un experto en la materia reconocera que las formulaciones se disenan rutinariamente de acuerdo con su uso
previsto, es decir, su via de administracion.
Formulaciones preferidas para administracion topica incluyen aquellas en las que los oligonucleotidos de la divulgacion estan en mezcla con un agente de administracion topica tal como lfpidos, liposomas, acidos grasos, 5 esteres de acidos grasos, esteroides, agentes quelantes y tensioactivos. Lfpidos y liposomas preferidos incluyen neutros (por ejemplo, dioleoil-fosfatidiletanolamina DOPE, dimiristoilfosfatidilcolina DMPC, diestearoilfosfatidilcolina) negativos (por ejemplo, dimiristoilfosfatidilglicerol DMPG) y cationicos (por ejemplo, dioleoiltetrametilaminopropilo DOTAP y dioleoil-fosfatidiletanolamina DOTMA).
10 Para administracion topica u otra, los oligonucleotidos de la divulgacion pueden encapsularse dentro de liposomas o pueden formar complejos con los mismos, en particular con liposomas cationicos. Como alternativa, los oligonucleotidos pueden estar complejados con lfpidos, en particular con lfpidos cationicos. Acidos grasos y esteres preferidos, sales farmaceuticamente aceptables de los mismos, y sus usos se describen adicionalmente en la patente de los EE. UU. con n.° 6.287.860.
15
Las composiciones y formulaciones para administracion por via oral incluyen polvos o granulos, micropartfculas, nanopartfculas, suspensiones o soluciones en agua o medios no acuosos, capsulas, capsulas de gel, sobres, comprimidos o minicomprimidos. Pueden ser deseables espesantes, aromatizantes, diluyentes, emulsionantes, adyuvantes de dispersion o aglutinantes. Formulaciones orales preferidas son aquellas en las que los 20 oligonucleotidos de la divulgacion se administran juntamente con uno o mas mejoradores de la penetracion, tensioactivos y quelantes. Tensioactivos preferidos incluyen acidos grasos y/o esteres o sales de los mismos, acidos biliares y/o sales de los mismos. Acidos biliares/sales y acidos grasos preferidos y sus usos se describen adicionalmente en la patente de EE. UU. con n.° 6.287.860. Tambien se prefieren combinaciones de mejoradores de la penetracion, por ejemplo, acidos grasos/sales en combinacion con acidos biliares/sales. Una combinacion 25 particularmente preferida es la sal de sodio de acido laurico, acido caprico y UDCA. Potenciadores de la penetracion adicionales incluyen eter polioxietilen-9-laurflico, eter polioxietilen-20-cetflico. Los oligonucleotidos de la divulgacion pueden administrarse por via oral, en forma granulada que incluye partfculas secadas por pulverizacion, o complejados para formar micro o nanopartfculas. Los agentes complejantes de oligonucleotidos y sus usos se describen adicionalmente en la patente de EE. UU. con n.° 6.287.860.
30
Las composiciones y formulaciones para administracion parenteral, intratecal o intraventricular pueden comprender soluciones acuosas esteriles que tambien pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados tales como, entre otros, mejoradores de la penetracion, compuestos portadores y otros vehfculos o excipientes farmaceuticamente aceptables.
35
Ciertos aspectos de la divulgacion proporcionan composiciones farmaceuticas que contienen uno o mas compuestos oligomericos y uno o mas de otros agentes quimioterapeuticos que funcionan por un mecanismo no antisentido. Ejemplos de dichos agentes quimioterapeuticos incluyen, aunque no se limitan a, farmacos quimioterapeuticos para el cancer tales como daunorrubicina, daunomicina, dactinomicina, doxorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, 40 esorrubicina, bleomicina, mafosfamida, ifosfamida, citosina arabinosido, biscloroetil-nitrosurea, busulfano, mitomicina C, actinomicina D, mitramicina, prednisona, hidroxiprogesterona, testosterona, tamoxifeno, dacarbazina, procarbazina, hexametilmelamina, pentametilmelamina, mitoxantrona, amsacrina, clorambucilo, metilciclohexilnitrosurea, mostazas de nitrogeno, melfalan, ciclofosfamida, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-azacitidina, hidroxiurea, desoxicoformicina, 4-hidroxiperoxiciclo-fosforamida, 5-fluorouracilo (5-FU), 545 fluorodesoxiuridina (5-FUdR), metotrexato (MTX), colchicina, taxol, vincristina, vinblastina, etoposido (VP-16), trimetrexato, irinotecan, topotecan, gemcitabina, teniposido, cisplatino y dietilestilbestrol (DES). Cuando se usan con los compuestos de la divulgacion, dichos agentes quimioterapeuticos pueden usarse individualmente (p. ej., 5-FU y oligonucleotido), secuencialmente (p. ej., 5-FU y oligonucleotido durante un periodo de tiempo seguido de MTX y oligonucleotido), o en combinacion con uno o mas de otros de dichos agentes quimioterapeuticos (p. ej., 5-FU, MTX 50 y oligonucleotido, o 5-FU, radioterapia y oligonucleotido). Farmacos antiinflamatorios, que incluyen, aunque no se limitan a, farmacos antiinflamatorios no esteroideos y corticosteroides, y farmacos antivirales, que incluyen, aunque no se limitan a, ribivirina, vidarabina, aciclovir y ganciclovir, tambien pueden combinarse en composiciones de la divulgacion. Las combinaciones de compuestos antisentido y otros farmacos no antisentido tambien estan dentro del alcance de la presente divulgacion. Pueden usarse dos o mas compuestos combinados juntos o secuencialmente.
55
En otro aspecto relacionado, las composiciones de la divulgacion pueden contener uno o mas compuestos antisentido, particularmente oligonucleotidos, dirigidos a un primer acido nucleico y uno o mas compuestos antisentido adicionales dirigidos a un segundo acido nucleico diana. Por ejemplo, la primera diana puede ser una secuencia antisentido particular del regulador del desarrollo 1 asociado a interferon (IFRD1), y la segunda diana 60 puede ser una region de otra secuencia de nucleotidos. Como alternativa, las composiciones de la divulgacion
pueden contener dos o mas compuestos antisentido dirigidos a diferentes regiones del mismo acido nucleico diana del regulador del desarrollo 1 asociado a interferon (IFRD1). Se ilustran numerosos ejemplos de compuestos antisentido en el presente documento y otros pueden seleccionarse de entre compuestos adecuados conocidos en la tecnica. Pueden usarse dos o mas compuestos combinados juntos o secuencialmente.
5
Dosificacion:
Se cree que la formulacion de composiciones terapeuticas y su posterior administracion (dosificacion) estan dentro de la experiencia de los expertos en la materia. La dosificacion depende de la gravedad y sensibilidad de la 10 patologfa que va a tratarse, durando el ciclo de tratamiento de varios dfas a varios meses, o hasta que se efectue una cura o se logre una disminucion de la patologfa. Pueden calcularse programas de dosificacion optimos a partir de mediciones de acumulacion de farmaco en el cuerpo del paciente. Los expertos pueden determinar facilmente dosificaciones optimas, metodologfas de dosificacion y tasas de repeticion. Las dosificaciones optimas pueden variar dependiendo de la potencia relativa de oligonucleotidos individuales, y generalmente pueden estimarse basandose 15 en las CE50 que se ha descubierto que son eficaces en modelos animales in vitro e in vivo. En general, la dosificacion es de 0,01 pg a 10 mg por kg de peso corporal, y puede administrarse una vez o mas diariamente, semanalmente, mensualmente o anualmente, o incluso una vez cada 2 a 20 anos. Los expertos en la materia pueden estimar facilmente tasas de repeticion para la dosificacion basandose en tiempos de residencia medidos y concentraciones del farmaco en fluidos corporales o tejidos. Tras el tratamiento satisfactorio, puede desearse que el 20 paciente reciba terapia de mantenimiento para prevenir la reaparicion de la patologfa, en el que el oligonucleotido se administra en dosis de mantenimiento, que oscilan de 0,01 pg a 10 mg por kg de peso corporal, una vez o mas diariamente, a una vez cada -20 anos.
En aspectos, un paciente se trata con una dosificacion de farmaco que es al menos aproximadamente 1, al menos 25 aproximadamente 2, al menos aproximadamente 3, al menos aproximadamente 4, al menos aproximadamente 5, al menos aproximadamente 6, al menos aproximadamente 7, al menos aproximadamente 8, al menos aproximadamente 9, al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 35, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 45, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 30 60, al menos aproximadamente 70, al menos aproximadamente 80, al menos aproximadamente 90, o al menos aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal. Ciertas dosis inyectadas de oligonucleotidos antisentido se describen, p. ej., en la patente de EE: UU. con n.° 7.563.884, "Antisense modulation of PTPIB expression,".
MPS-1 (es decir, mucopolisacaridosis tipo 1) es una rara enfermedad de almacenamiento lisosomal. Esta 35 enfermedad tiene tres grupos de pacientes con sfntomas distintos basados en la gravedad de la enfermedad (sfndrome de Hurler, sfndrome de Hurler-Scheie, sfndrome de Scheie). En estudios para determinar y apoyar un procedimiento para determinar y seleccionar el oligonucleotido mas preferido para cualquier paciente individual o grupo de pacientes que padecen la enfermedad, se puede realizar el siguiente protocolo general. Este procedimiento puede, por supuesto, usar cualquier celula o tejido que tenga normalmente polinucleotidos de IFRD1 y productos de 40 expresion derivados de los mismos. Una poblacion de pacientes puede seleccionarse usando los siguientes criterios, 1,2; despues de la aceptacion, se realizan las etapas 3, 4, 5 y 6: (1) Los pacientes que muestran MPS-1 (es decir, mucopolisacaridosis tipo 1) debido a una deficiencia en la actividad de IFRD1. (2) En estos pacientes se definira a partir de un examen medico que tienen un sfndrome de Hurler o un sfndrome de Hurler-Scheie o un sfndrome de Scheie. (3) Despues del consentimiento del paciente/tutor, se tomara una biopsia de piel del paciente; el paciente 45 tambien sera revisado para determinar cualquier otra enfermedad (por ejemplo, enfermedades infecciosas) que requiera precauciones especiales cuando se manejen muestras biologicas del paciente. (4) Despues de la documentacion completa sobre las condiciones del paciente, la biopsia de la piel se procesara para expandir los fibroblastos de la piel in vitro. (5) Los fibroblastos de la piel se dosificaran con diferentes concentraciones de oligos y oligos diferentes; los oligos son un conjunto seleccionado de oligos complementarios con el antisentido natural del 50 IFRD1 humano que se habrfa caracterizado previamente como reguladores ascendentes del IFRD1 (ARNm, protefna y actividad). (6) El aumento del porcentaje en la actividad del IFRD1 es medido a partir del sobrenadante del cultivo celular de fibroblastos de la piel en el NCBI (The National Center for Biotechnology Information) que caracteriza la actividad del IFRD1 en diferentes subconjuntos de pacientes (o controles) como sigue: un paciente con dos alelos del IFRD1 de tipo silvestre (un gen IFRD1 de cada ascendiente es de tipo silvestre, lo que significa 55 que carece de mutacion) la actividad del IFRD1 es del 83-121 %; pacientes con una marcada mutacion en el IFRD1 (heterocigotos), la actividad del IFRD1 es del 19 al 60 %; pacientes con dos mutaciones muy marcadas en el IFRD1, la actividad total del IFRD1 es del 0-3 %. Los heterocigotos son solo portadores de la enfermedad y no muestran sfntomas de la enfermedad. Los oligos que aumentan la actividad del IFRD1 a mas de aproximadamente el 10 % de la actividad total observada en las celulas normales podrfan considerarse candidatos a farmacos activos. 60 Preferiblemente, el porcentaje de aumento estara por encima de aproximadamente el 20 %. El oligonucleotido con el
mayor aumento porcentual en la regulacion ascendente del IFRD1 se selecciona como el farmaco candidato para el paciente individual a partir del cual se realizo la medicion de fibroblastos. El oligonucleotido tambien puede ser util en un subconjunto de pacientes que tienen la misma afeccion de enfermedad o para tratar la enfermedad en todos los pacientes que tienen dicha enfermedad.
5
Aunque diversos aspectos de la presente divulgacion se han descrito anteriormente, debe entenderse que se han presentado a modo de ejemplo solamente, y no de limitacion. Pueden realizarse numerosos cambios a los aspectos descritos de acuerdo con la divulgacion en el presente documento sin alejarse del espfritu o alcance de la divulgacion. Por lo tanto, la amplitud y el alcance de la presente divulgacion no deben estar limitados por ninguno de 10 los aspectos descritos anteriormente.
Por su citacion de diversas referencias en este documento, los solicitantes no admiten que ninguna referencia particular sea "tecnica anterior" a su invencion. Realizaciones de composiciones y procedimientos inventivos se ilustran en los siguientes ejemplos.
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EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos no limitantes sirven para ilustrar realizaciones seleccionadas de la invencion. Se apreciara que variaciones en proporciones y alternativas en elementos de los componentes mostrados seran evidentes para 20 los expertos en la materia y estan dentro del alcance de aspectos de la presente divulgacion.
Ejemplo 1: Diseno de oligonucledtidos antisentido especfficos para una molecula de acido nucleico antisentido a un regulador del desarrollo 1 asociado a interferdn (IFRD1) y/o una cadena sentido de polinucledtido de IFRD1
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Tal como se ha indicado anteriormente, la expresion “oligonucleotido especffico para” o “dianas de oligonucleotido” se refiere a un oligonucleotido que tiene una secuencia (i) capaz de formar un complejo estable con una parte del gen elegido como diana, o (ii) capaz de formar un duplex estable con una parte de un transcrito de ARNm del gen elegido como diana.
30
La seleccion de los oligonucleotidos apropiados se ve facilitada por la utilizacion de programas informaticos (p. ej. IDT AntiSense Design, IDT OligoAnalyzer) que identifican automaticamente en cada secuencia dada, subsecuencias de 19-25 nucleotidos que formaran hfbridos con una secuencia de polinucleotidos diana con una temperatura de fusion deseada (normalmente 50-60 °C) y no formara autodfmeros u otras estructuras secundarias complejas.
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La seleccion de los oligonucleotidos apropiados se facilita aun mas usando programas informaticos que alinean automaticamente secuencias de acido nucleico e indican regiones de identidad u homologfa. Dichos programas se usan para comparar secuencias de acidos nucleicos obtenidas, por ejemplo, buscando en bases de datos tales como GenBank o secuenciando productos de PCR. La comparacion de secuencias de acidos nucleicos de un 40 intervalo de genes y regiones intragenicas de un genoma dado permite la seleccion de secuencias de acidos nucleicos que muestran un grado de especificad respecto al gen de interes. Estos procedimientos permiten la seleccion de oligonucleotidos que muestran un alto grado de complementariedad con secuencias de acido nucleico diana y un menor grado de complementariedad con otras secuencias de acido nucleico en un genoma dado. Un experto en la materia se dara cuenta de que hay libertad considerable en la seleccion de regiones apropiadas de 45 genes para su uso en la presente invencion.
Un compuesto antisentido es "especfficamente hibridable" cuando la union del compuesto al acido nucleico diana interfiere en la funcion normal del acido nucleico diana para causar una modulacion de la funcion y/o la actividad, y existe un grado de complementariedad suficiente para evitar union inespecffica del compuesto antisentido a 50 secuencias de acido nucleico no diana en condiciones en las que se desea union especffica, es decir, en condiciones fisiologicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapeutico, y en condiciones en las que se realizan ensayos en el caso de ensayos in vitro.
Las propiedades de hibridacion de los oligonucleotidos descritos en el presente documento pueden determinarse por 55 uno o mas ensayos in vitro, tal como se conoce en la tecnica. Por ejemplo, las propiedades de los oligonucleotidos descritos en el presente documento pueden obtenerse por determinacion de la intensidad de union entre el antisentido natural diana y una posible molecula de farmaco usando el ensayo de la curva de fusion.
La intensidad de union entre el antisentido natural diana y una posible molecula de farmaco (Molecula) puede 60 estimarse usando cualquiera de los procedimientos establecidos de medicion de la intensidad de interacciones
intermoleculares, por ejemplo, un ensayo de la curva de fusion.
El ensayo de la curva de fusion determina la temperatura a la que se produce una rapida transicion de conformacion bicatenaria a monocatenaria para el complejo de antisentido natural/molecula. Esta temperatura es ampliamente 5 aceptada como una medida fiable de la intensidad de interaccion entre las dos moleculas.
Puede realizarse un ensayo de la curva de fusion usando una copia de ADNc de la molecula de ARN antisentido natural real o un nucleotido de ADN o ARN sintetico correspondiente al sitio de union de la molecula. Estan disponibles multiples kits que contienen todos los reactivos necesarios para realizar este ensayo (por ejemplo, kit 10 MeltDoctor de Applied Biosystems lnc.). Estos kits incluyen una solucion tampon adecuada que contiene uno de los colorantes de union a ADN bicatenario (dsADN) (tales como los colorantes aBi HRM, SYBR Green, SYTO, etc.). Las propiedades de los colorantes de dsADN son tales que casi no emiten fluorescencia en forma libre, pero son altamente fluorescentes cuando se unen a dsADN.
15 Para realizar el ensayo, el ADNc o un oligonucleotido correspondiente se mezclan con la molecula en concentraciones definidas por los protocolos del fabricante particulares. La mezcla se calienta a 95 °C para disociar todos los complejos de ADNdc previamente formados, luego se enfrfa lentamente a temperatura ambiente u otra temperatura menor definida por el fabricante del kit para permitir que se hibriden las moleculas de ADN. Entonces, los complejos recientemente formados se calientan lentamente a 95 °C con recopilacion de datos continua 20 simultanea sobre la cantidad de fluorescencia que se produce por la reaccion. La intensidad de fluorescencia es inversamente proporcional a las cantidades de dsADN presentes en la reaccion. Los datos pueden recogerse usando un instrumento de PCR en tiempo real compatible con el kit (p. ej., sistema de PCR en tiempo real StepOne Plus de ABI o el instrumento LightTyper, Roche Diagnostics, Lewes, Reino Unido).
25 Los picos de fusion se construyen representando la derivada negativa de la fluorescencia con respecto a la temperatura (-d(Fluorescencia)/dT) sobre el eje y) contra la temperatura (eje x) usando software apropiado (por ejemplo, LightTyper (Roche) o SDS Dissociation Curve, ABI). Los datos se analizan para identificar la temperatura de la rapida transicion del complejo de dsADN a moleculas monocatenarias. Esta temperatura se llama Tm y es directamente proporcional a la intensidad de la interaccion entre las dos moleculas. Normalmente, la Tm superara 30 los 40 °C.
Ejemplo 2: Modulacion de polinucleotidos de IFRD1
Todos los oligonucleotidos antisentido utilizados en el Ejemplo 2 se disenaron como se describe en el Ejemplo 1. Se 35 encargo al fabricante (IDT Inc. de Coralville, IA) que fabricara los oligonucleotidos con el enlace fosfotioato disenados y se proporcionaron los analogos de fosfotioato mostrados en la Tabla 1. La denominacion asterisco entre nucleotidos indica la presencia u enlace fosfotioato. Los oligonucleotidos requeridos para el experimento del Ejemplo 2 pueden sintetizarse utilizando cualquier procedimiento apropiado del estado de la tecnica, por ejemplo el procedimiento utilizado por IDT: sobre soporte solido, como microperlas de vidrio de poro controlado (CPG) de 5 40 micrometros, usando monomeros de fosforamidita (nucleotidos normales con todos los grupos activos protegidos con grupos de proteccion, p. ej., grupo tritilo en el azucar, grupo benzoilo en A y C, y N-2-isobutirilo en G). Los grupos de proteccion impiden las reacciones no deseadas durante la sfntesis de oligonucleotidos. Los grupos de proteccion se eliminan al final del proceso de sfntesis. El nucleotido inicial esta unido a un soporte solido a traves del carbono 3' y la sfntesis continua en direccion 3' - 5'. La adicion de una nueva base a una cadena de oligonucleotidos 45 en elongacion se realiza en cuatro etapas: 1) el grupo de proteccion se elimina del oxfgeno 5' del nucleotido inmovilizado con acido tricloroacetico; 2) el nucleotido inmovilizado y el siguiente en la secuencia se unen utilizando tetrazol; la reaccion continua a traves de un intermediario tetrazoilfosforamidita; 3) se lavan los nucleotidos libres que no hayan reaccionado y otros subproductos de reaccion, y los oligonucleotidos inmovilizados que no hayan reaccionado se tapan para evitar su participacion en la proxima ronda de sfntesis; el tapado se logra acetilando el 50 hidroxilo 5' libre utilizando anhfdrido acetico y N-metil-imidazol; 4) para estabilizar el enlace entre los nucleotidos, el fosforo se oxida con yodo y agua, si se va a producir un enlace fosfodiester, o reactivo Beaucage (3H-1,2- benzoditiol-3-ona-1,1-dioxido), si se desea un enlace fosfotioato. Alternando las dos agentes oxidantes, se puede construir un esqueleto quimerico. Se repite el ciclo de cuatro etapas descrito anteriormente para cada nucleotido de la secuencia. Cuando la secuencia completa este sintetizada, si el oligonucleotido escinde sobre un soporte solido y 55 se desprotege utilizando hidroxido de amonio a alta temperatura. Los grupos de proteccion se lavan mediante desalinizacion y el resto de los oligonucleotidos se liofilizan.
Tratamiento de celulas 518A2 con oligonucleotidos antisentido
60 Para realizar el experimento disenado en el Ejemplo 2, se obtuvieron celulas 518A2 del Albert Einstein-Montefiore
Cancer Center, NY, cultivadas en medio de crecimiento [MEM/EBSS (Hyclone n.° de cat. SH30024, o Mediatech n.° de cat. MT-10-010-CV) +10 % de FBS (Mediatech n.° de cat. MT35-011-CV)+ penicilina/estreptomicina (Mediatech n.° de cat. MT30-002-CI)] a 37 °C y con el 5 % de CO2. Un dfa antes del experimento, las celulas volvieron a sembrarse a la densidad de 1,5 x 105/ml en placas de 6 pocillos y se incubaron a 37 °C y el 5 % de CO2. El dfa del 5 experimento, el medio en las placas de 6 pocillos se cambio a medio de cultivo fresco. Todos los oligonucleotidos antisentido se diluyeron a la concentracion de 20 pM. Se incubaron dos pI de esta solucion con 400 pI de medio Opti-MEM (Gibco, n° de cat 31985-070) y 4 pI de Lipofectamine 2000 (lnvitrogen, n° de cat 11668019) a temperatura ambiente durante 20 min y se aplicaron a cada pocillo de las placas de 6 pocillos con celulas 518A2. Se uso una mezcla similar, que incluye 2 pI de agua en lugar de la solucion de oligonucleotido, para los controles transfectados 10 con vector simulado. Despues de 3-18 horas de incubacion a 37 °C y con el 5 % de CO2, el medio se cambio a medio fresco de crecimiento. 48 h despues de la adicion de oligonucleotidos antisentido, el medio se elimino y se extrajo ARN de las celulas usando el sistema de aislamiento de ARN SV Total de Promega (n° de cat Z3105) o el kit de aislamiento de ARN RNeasy Total de Qiagen (n° de cat 74181) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se anadieron 600 ng de ARN a la reaccion de transcripcion inversa realizada usando el kit de ADNc Verso de Thermo 15 Scientific (cat #AB1453B) o el kit High Capacity cdNa Reverse Transcription (cat #4368813) tal como se describe en el protocolo del fabricante. El ADNc de esta reaccion de transcripcion inversa se uso para monitorizar la expresion genica por PCR en tiempo real usando la mezcla de expresion genica Taqman de ABI (n° de cat 4369510) y cebadores/sondas disenados por ABI (ensayo de expresion genica Taqman de Applied Biosystems: Hs00155477_ml de Applied Biosystems Inc., Foster City CA). Se uso el siguiente ciclo de PCR: 50 °C durante 2 min, 95 °C durante 20 10 min, 40 ciclos de (95 °C durante 15 segundos, 60 °C durante 1 min) usando la maquina de PCR en tiempo real StepOne Plus (Applied Biosystems). El cambio de veces en la expresion genica despues del tratamiento con oligonucleotidos antisentido se calculo basandose en la diferente de valores de dCt normalizados contra 18S entre las muestras tratadas y las transfectadas de forma simulada.
Resultados: Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm del IFRD1 en celulas 518A2 25 se incrementan significativamente 48 h despues del tratamiento con los oligonucleotidos antisentido para IFRD1 (Fig.1).
Ademas, aunque se ha descrito una caracterfstica particular de la divulgacion con respecto a solo una de varias implementaciones, dicha caracterfstica puede combinarse con una o mas de otras caracterfsticas de las otras 30 implementaciones, ya que puede desearse y ser ventajoso para cualquier aplicacion dada o particular.
El resumen de la divulgacion permitira al lector determinar rapidamente la naturaleza de la divulgacion tecnica. Esta se presenta con la comprension de que no se usara para interpretar o limitar el alcance o el significado de las siguientes reivindicaciones.
35
LISTADO DE SECUENCIAS <110> OPKO CURNA LLC
40 <120> TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES RELACIONADAS CON EL 'REGULADOR DEL DESARROLLO 1 ASOCIADO A INTERFERON' (IFRD1) POR INHIBICION DEL TRANSCRITO ANTISENTIDO NATURAL A IFRD1
<130> IFRD1
45 <150> US61/407045 <151> 2010-10-27
<160> 25
50 <170> PatentIn version 35
<210> 1 <211> 2487 <212> ADN
55 <213> Homo sapiens <400> 1

Claims (14)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un oligonucleotido que se dirige a un transcrito antisentido natural del regulador del desarrollo 1 asociado a interferon (IFRD1) para uso como un compuesto terapeutico, donde el oligonucleotido aumenta la
    5 expresion del regulador del desarrollo 1 asociado a interferon (IFRD1); donde el transcrito antisentido natural tiene la secuencia de acido nucleico tal como se expone en las SEQ ID NO: 2 al 6.
  2. 2. Un oligonucleotido que se dirige a un transcrito antisentido natural del regulador del desarrollo 1 asociado a interferon (IFRD1) para uso en la prevencion o el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado al
    10 regulador del desarrollo 1 asociado a interferon (IFRD1), donde dicho oligonucleotido aumenta la expresion del regulador del desarrollo 1 asociado a interferon (IFRD1); donde el transcrito antisentido natural tiene la secuencia de acido nucleico tal como se expone en una de las SEQ ID NO: 2 al 6.
  3. 3. El oligonucleotido para uso de acuerdo con la reivindicacion 2, donde la enfermedad o trastorno se 15 selecciona de entre el grupo que consiste en una enfermedad o trastorno asociado con la funcion anormal y/o la
    expresion del 'regulador del desarrollo 1 asociado al interferon'; fibrosis qufstica, enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC); una enfermedad o trastorno asociado con la diferenciacion y regeneracion de tejidos; una enfermedad o trastorno asociado con la regeneracion de musculos; una enfermedad o trastorno asociado con la regeneracion de musculos esqueleticos; una enfermedad o trastorno asociado con la diferenciacion de musculos; 20 una enfermedad o trastorno asociado con la diferenciacion miogenicas; estres oxidativo, una enfermedad o trastorno inflamatorio, inflamacion; una afeccion postoperatoria asociada con el epitelio intestinal; una enfermedad o trastorno del sistema inmunitario; una enfermedad o trastorno asociado con una tasa metabolica anormal, adiposidad y absorcion de trigliceridos intestinales; cancer de pulmon; neuropatfa sensoriomotora; una lesion neuronal asociada a isquemia cerebral; una lesion neuronal y una enfermedad o trastorno neurologico.
    25
  4. 4. El oligonucleotido para uso de acuerdo con la reivindicacion 3, donde la enfermedad o trastorno es fibrosis qufstica.
  5. 5. El oligonucleotido para uso de acuerdo con la reivindicacion 3, donde la enfermedad o trastorno es 30 una enfermedad o trastorno asociado con la regeneracion muscular.
  6. 6. Un procedimiento in vitro de aumento de la expresion del regulador del desarrollo 1 asociado a interferon (IFRD1) en celulas o tejidos de un paciente que comprende: poner en contacto dichas celulas o tejidos con un oligonucleotido que se dirige a un transcrito antisentido natural del regulador del desarrollo 1 asociado a
    35 interferon (IFRD1); aumentando de este modo la expresion del regulador del desarrollo 1 asociado a interferon (IFRD1); donde el transcrito antisentido natural tiene la secuencia de acido nucleico tal como se expone en una de las SEQ ID NO: 2 al 6.
  7. 7. Un oligonucleotido que se dirige a un transcrito antisentido natural del gen regulador del desarrollo 1 40 asociado a interferon (IFRD1), donde dicho oligonucleotido aumenta la expresion del gen regulador del desarrollo 1
    asociado a interferon (IFRD1); donde el transcrito antisentido natural tiene la secuencia de acido nucleico tal como se expone en una de las SEQ ID NO: 2 al 6.
  8. 8. El oligonucleotido para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o el 45 procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 6, o el oligonucleotido de acuerdo con la reivindicacion 7, donde el
    oligonucleotido tiene entre 10 y 30 nucleotidos de longitud.
  9. 9. El oligonucleotido para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, u 8, o el procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 6 o la reivindicacion 8, o el oligonucleotido de acuerdo con la
    50 reivindicacion 7 o la reivindicacion 8, donde el oligonucleotido tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con un complemento de un transcrito antisentido natural del regulador del desarrollo 1 asociado a interferon (IFRD1).
  10. 10. El oligonucleotido para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, 8 o 9, o el procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6, 8 o 9, o el oligonucleotido de acuerdo con
    55 una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, donde el oligonucleotido es monocatenario.
  11. 11. El oligonucleotido para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, 8 o 9, o el procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6, 8 o 9, o el oligonucleotido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, donde el oligonucleotido es un compuesto de siRNA.
  12. 12. El oligonucleotido para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 u 8 a 11, o
    el procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 u 8 a 11, o el oligonucleotido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, donde el oligonucleotido comprende la SEQ ID NO: 9.
    5 13. El oligonucleotido para uso de acuerdo con la reivindicacion 11, o el procedimiento de acuerdo con la
    reivindicacion 11, o el oligonucleotido de acuerdo con la reivindicacion 11, donde el compuesto de siRNA comprende
    un oligonucleotido como se expone en la SEQ ID NO: 9 y una secuencia complemento inversa de dicho oligonucleotido como se expone en la SEQ ID NO: 18.
    10 14. El oligonucleotido para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 u 8 a 13, o el
    procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 u 8 a 13, o el oligonucleotido de acuerdo con
    una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, donde la expresion del regulador del desarrollo 1 asociado a interferon (IFRD1) aumenta al menos un 10 %.
    15 15. El oligonucleotido para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 u 8 a 14, o el
    procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 u 8 a 14, o un oligonucleotido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14, donde el oligonucleotido comprende ademas una o mas modificaciones que comprenden:
    20 a. al menos un enlace internucleosfdico modificado seleccionado de entre: un fosforotioato, alquilfosfonato, fosforoditioato, alquilfosfonotioato, fosforamidato, carbamato, carbonato, triester de fosfato, acetamidata, ester carboximetflico, y combinaciones de los mismos;
    b. al menos un nucleotido modificado seleccionado de entre: un acido nucleico peptfdico (PNA), un acido nucleico bloqueado (LNA), un acido arabino-nucleico, un analogo, un derivado, y combinaciones de los mismos; o
    25 c. al menos un resto de azucar modificado seleccionado de: un resto de azucar modificado con 2'-O-metoxietilo, un resto de azucar modificado con 2'-fluoro, un resto de azucar modificado con 2'-metoxi, un resto de azucar modificado con 2'-O-alquilo, un resto de azucar bicfclico, y combinaciones de los mismos.
  13. 16. Una composicion farmaceutica que comprende un oligonucleotido de acuerdo con una cualquiera de
    30 las reivindicaciones 7 a 15 y un excipiente farmaceuticamente aceptable.
    imagen1
    Figura 1
    Diferencia en veces en el n.° de copias de ARNm en comparacion al control
    OiFROl
    P~ 0,00000000003
  14. 0.02
    T,,l jwyn
    Mpt
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Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3702460A1 (en) 2010-11-12 2020-09-02 The General Hospital Corporation Polycomb-associated non-coding rnas
US9920317B2 (en) 2010-11-12 2018-03-20 The General Hospital Corporation Polycomb-associated non-coding RNAs
WO2013173645A1 (en) 2012-05-16 2013-11-21 Rana Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating utrn expression
US10837014B2 (en) 2012-05-16 2020-11-17 Translate Bio Ma, Inc. Compositions and methods for modulating SMN gene family expression
CN104583401A (zh) 2012-05-16 2015-04-29 Rana医疗有限公司 用于调节atp2a2表达的组合物和方法
KR20150030205A (ko) 2012-05-16 2015-03-19 라나 테라퓨틱스, 인크. Smn 유전자 패밀리 발현을 조절하기 위한 조성물 및 방법
CA2873769A1 (en) 2012-05-16 2013-11-21 Rana Therapeutics Inc. Compositions and methods for modulating hemoglobin gene family expression
US20150152410A1 (en) 2012-05-16 2015-06-04 Rana Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating mecp2 expression
US10174328B2 (en) 2013-10-04 2019-01-08 Translate Bio Ma, Inc. Compositions and methods for treating amyotrophic lateral sclerosis
CA2946719C (en) 2014-03-25 2023-09-26 Arcturus Therapeutics, Inc. Una oligomers having reduced off-target effects in gene silencing
US10858650B2 (en) 2014-10-30 2020-12-08 The General Hospital Corporation Methods for modulating ATRX-dependent gene repression
EP3271460A4 (en) 2015-03-17 2019-03-13 The General Hospital Corporation INTERACTOME RNA OF COMPLEX REPRESSIVE POLYCOMB 1 (PRC1)
MX2017012982A (es) 2015-04-10 2018-07-06 Univ Jefferson Metodos y composiciones para tratar el cancer e incrementar la inmunidad terapeutica reduciendo selectivamente los monocitos m2 inmunomoduladores.
EP3389670A4 (en) * 2015-12-04 2020-01-08 Ionis Pharmaceuticals, Inc. METHODS OF TREATING BREAST CANCER
CN110832068A (zh) * 2017-03-09 2020-02-21 托马斯杰弗逊大学 使用反义分子治疗癌症的方法和组合物
TW201934129A (zh) * 2018-01-15 2019-09-01 美商Ionis製藥公司 Ｄｎｍ２表現之調節劑

Family Cites Families (187)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US568194A (en) 1896-09-22 Skylight-support
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US4534899A (en) 1981-07-20 1985-08-13 Lipid Specialties, Inc. Synthetic phospholipid compounds
US4426330A (en) 1981-07-20 1984-01-17 Lipid Specialties, Inc. Synthetic phospholipid compounds
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
FR2540122B1 (fr) 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
US4605735A (en) 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4824941A (en) 1983-03-10 1989-04-25 Julian Gordon Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems
US4587044A (en) 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US5118802A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US5258506A (en) 1984-10-16 1993-11-02 Chiron Corporation Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains
US4828979A (en) 1984-11-08 1989-05-09 Life Technologies, Inc. Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US4762779A (en) 1985-06-13 1988-08-09 Amgen Inc. Compositions and methods for functionalizing nucleic acids
US5317098A (en) 1986-03-17 1994-05-31 Hiroaki Shizuya Non-radioisotope tagging of fragments
JPS638396A (ja) 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体
DE3788914T2 (de) 1986-09-08 1994-08-25 Ajinomoto Kk Verbindungen zur Spaltung von RNS an eine spezifische Position, Oligomere, verwendet bei der Herstellung dieser Verbindungen und Ausgangsprodukte für die Synthese dieser Oligomere.
JPS63195816A (ja) 1987-02-09 1988-08-12 Sumitomo Special Metals Co Ltd 薄膜ヘツドの製造方法
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
WO1988010264A1 (en) 1987-06-24 1988-12-29 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology Nucleoside derivatives
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
US4866042A (en) 1987-11-18 1989-09-12 Neuwelt Edward A Method for the delivery of genetic material across the blood brain barrier
WO1989005358A1 (en) 1987-11-30 1989-06-15 University Of Iowa Research Foundation Dna and rna molecules stabilized by modifications of the 3'-terminal phosphodiester linkage and their use as nucleic acid probes and as therapeutic agents to block the expression of specifically targeted genes
US5403711A (en) 1987-11-30 1995-04-04 University Of Iowa Research Foundation Nucleic acid hybridization and amplification method for detection of specific sequences in which a complementary labeled nucleic acid probe is cleaved
US5082830A (en) 1988-02-26 1992-01-21 Enzo Biochem, Inc. End labeled nucleotide probe
WO1989009221A1 (en) 1988-03-25 1989-10-05 University Of Virginia Alumni Patents Foundation Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5109124A (en) 1988-06-01 1992-04-28 Biogen, Inc. Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5262536A (en) 1988-09-15 1993-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US5599923A (en) 1989-03-06 1997-02-04 Board Of Regents, University Of Tx Texaphyrin metal complexes having improved functionalization
US5457183A (en) 1989-03-06 1995-10-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Hydroxylated texaphyrins
US5354844A (en) 1989-03-16 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Protein-polycation conjugates
US6294520B1 (en) 1989-03-27 2001-09-25 Albert T. Naito Material for passage through the blood-brain barrier
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US5256775A (en) 1989-06-05 1993-10-26 Gilead Sciences, Inc. Exonuclease-resistant oligonucleotides
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5227170A (en) 1989-06-22 1993-07-13 Vestar, Inc. Encapsulation process
US5451463A (en) 1989-08-28 1995-09-19 Clontech Laboratories, Inc. Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
US5527528A (en) 1989-10-20 1996-06-18 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Solid-tumor treatment method
US5356633A (en) 1989-10-20 1994-10-18 Liposome Technology, Inc. Method of treatment of inflamed tissues
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5264562A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
ATE269870T1 (de) 1989-10-24 2004-07-15 Isis Pharmaceuticals Inc 2'-modifizierte oligonukleotide
US5292873A (en) 1989-11-29 1994-03-08 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
US5130302A (en) 1989-12-20 1992-07-14 Boron Bilogicals, Inc. Boronated nucleoside, nucleotide and oligonucleotide compounds, compositions and methods for using same
US5469854A (en) 1989-12-22 1995-11-28 Imarx Pharmaceutical Corp. Methods of preparing gas-filled liposomes
US5580575A (en) 1989-12-22 1996-12-03 Imarx Pharmaceutical Corp. Therapeutic drug delivery systems
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US5578718A (en) 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5623065A (en) 1990-08-13 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped 2' modified oligonucleotides
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5149797A (en) 1990-02-15 1992-09-22 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of rna and production of encoded polypeptides
US5220007A (en) 1990-02-15 1993-06-15 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of RNA and production of encoded polypeptides
AU7579991A (en) 1990-02-20 1991-09-18 Gilead Sciences, Inc. Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers
US5214136A (en) 1990-02-20 1993-05-25 Gilead Sciences, Inc. Anthraquinone-derivatives oligonucleotides
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
EP0745689A3 (en) 1990-05-11 1996-12-11 Microprobe Corporation A dipstick for a nucleic acid hybridization assay
DE69126530T2 (de) 1990-07-27 1998-02-05 Isis Pharmaceutical, Inc., Carlsbad, Calif. Nuklease resistente, pyrimidin modifizierte oligonukleotide, die die gen-expression detektieren und modulieren
US5218105A (en) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5688941A (en) 1990-07-27 1997-11-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
BR9106729A (pt) 1990-08-03 1993-07-20 Sterling Winthrop Inc Composto,processos para inibir a degradacao por nuclease de compostos e para estabilizar sequencias de nicleotideos ou oligonucleosideos,composicao utilizavel para inibir expressao de genes e processo para inibir expressao de genes em um mamifero necessitando de tal tratamento
US5177196A (en) 1990-08-16 1993-01-05 Microprobe Corporation Oligo (α-arabinofuranosyl nucleotides) and α-arabinofuranosyl precursors thereof
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
CA2092002A1 (en) 1990-09-20 1992-03-21 Mark Matteucci Modified internucleoside linkages
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
KR930702373A (ko) 1990-11-08 1993-09-08 안토니 제이. 페이네 합성 올리고누클레오티드에 대한 다중 리포터(Reporter)그룹의 첨합
JP3220180B2 (ja) 1991-05-23 2001-10-22 三菱化学株式会社 薬剤含有タンパク質結合リポソーム
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5371241A (en) 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
US5521291A (en) 1991-09-30 1996-05-28 Boehringer Ingelheim International, Gmbh Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells
NZ244306A (en) 1991-09-30 1995-07-26 Boehringer Ingelheim Int Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation
DE59208572D1 (de) 1991-10-17 1997-07-10 Ciba Geigy Ag Bicyclische Nukleoside, Oligonukleotide, Verfahren zu deren Herstellung und Zwischenprodukte
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
US5700922A (en) 1991-12-24 1997-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
US5565552A (en) 1992-01-21 1996-10-15 Pharmacyclics, Inc. Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis
US5595726A (en) 1992-01-21 1997-01-21 Pharmacyclics, Inc. Chromophore probe for detection of nucleic acid
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
US5272250A (en) 1992-07-10 1993-12-21 Spielvogel Bernard F Boronated phosphoramidate compounds
US5652355A (en) 1992-07-23 1997-07-29 Worcester Foundation For Experimental Biology Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
WO1994008026A1 (en) 1992-09-25 1994-04-14 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Adenovirus vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system, particularly in brain
US5583020A (en) 1992-11-24 1996-12-10 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Permeability enhancers for negatively charged polynucleotides
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
JP3351476B2 (ja) 1993-01-22 2002-11-25 三菱化学株式会社 リン脂質誘導体及びそれを含有するリポソーム
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
US5395619A (en) 1993-03-03 1995-03-07 Liposome Technology, Inc. Lipid-polymer conjugates and liposomes
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
WO1994022864A1 (en) 1993-03-30 1994-10-13 Sterling Winthrop Inc. Acyclic nucleoside analogs and oligonucleotide sequences containing them
AU6412794A (en) 1993-03-31 1994-10-24 Sterling Winthrop Inc. Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
DE4311944A1 (de) 1993-04-10 1994-10-13 Degussa Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen
US5462854A (en) 1993-04-19 1995-10-31 Beckman Instruments, Inc. Inverse linkage oligonucleotides for chemical and enzymatic processes
US5534259A (en) 1993-07-08 1996-07-09 Liposome Technology, Inc. Polymer compound and coated particle composition
US5417978A (en) 1993-07-29 1995-05-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Liposomal antisense methyl phosphonate oligonucleotides and methods for their preparation and use
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
AU691550B2 (en) 1993-12-09 1998-05-21 Thomas Jefferson University Compounds and methods for site-directed mutations in eukaryotic cells
US5595756A (en) 1993-12-22 1997-01-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5543152A (en) 1994-06-20 1996-08-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
US5597696A (en) 1994-07-18 1997-01-28 Becton Dickinson And Company Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
US5597909A (en) 1994-08-25 1997-01-28 Chiron Corporation Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use
US5591721A (en) 1994-10-25 1997-01-07 Hybridon, Inc. Method of down-regulating gene expression
US5512295A (en) 1994-11-10 1996-04-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Synthetic liposomes for enhanced uptake and delivery
FR2727867B1 (fr) 1994-12-13 1997-01-31 Rhone Poulenc Rorer Sa Transfert de genes dans les motoneurones medullaires au moyen de vecteurs adenoviraux
US5543165A (en) 1995-06-06 1996-08-06 Hill; Julie B. Process of making a soluble tea product with champagne-like properties
US5652356A (en) 1995-08-17 1997-07-29 Hybridon, Inc. Inverted chimeric and hybrid oligonucleotides
US20040171564A1 (en) * 1997-11-20 2004-09-02 Honkanen Richard E. Antisense oligonucleotide modulation of human serine/threonine protein phosphatase gene expression
US20020055479A1 (en) 2000-01-18 2002-05-09 Cowsert Lex M. Antisense modulation of PTP1B expression
US6287860B1 (en) 2000-01-20 2001-09-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of MEKK2 expression
US20050019915A1 (en) 2001-06-21 2005-01-27 Bennett C. Frank Antisense modulation of superoxide dismutase 1, soluble expression
US6936589B2 (en) 2001-09-28 2005-08-30 Albert T. Naito Parenteral delivery systems
EP1592795A2 (en) * 2003-02-10 2005-11-09 Santaris Pharma A/S Oligomeric compounds for the modulation of ras expression
WO2005047546A2 (en) * 2003-11-05 2005-05-26 Wisconsin Alumni Research Foundation Diagnostic and prognostic methods and compositions for seizure- and plasticity-related disorders
EP2990410A1 (en) * 2004-08-10 2016-03-02 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Chemically modified oligonucleotides
US20070213292A1 (en) * 2005-08-10 2007-09-13 The Rockefeller University Chemically modified oligonucleotides for use in modulating micro RNA and uses thereof
EP1933880A4 (en) * 2005-09-09 2009-11-18 Quark Pharmaceuticals Inc OLIGORIBONUCLEOTIDES AND METHODS OF USE IN THE TREATMENT OF CARDIOVASCULAR DISEASES
WO2007048046A2 (en) * 2005-10-20 2007-04-26 Protiva Biotherapeutics, Inc. Sirna silencing of filovirus gene expression
WO2007087113A2 (en) * 2005-12-28 2007-08-02 The Scripps Research Institute Natural antisense and non-coding rna transcripts as drug targets
US20110150897A1 (en) * 2006-10-11 2011-06-23 Meyer Thomas F Influenza targets
JP2010519910A (ja) * 2007-03-02 2010-06-10 エムディーアールエヌエー，インコーポレイテッド Ｂｃｌ２遺伝子の発現を抑制するための核酸化合物およびその使用
JP2010528613A (ja) * 2007-05-29 2010-08-26 クリストファー ビー． リード， 多能細胞集団を産生する方法およびその使用
CN101580881B (zh) * 2008-05-09 2012-12-19 北京农学院 评价暑热证及中药药效的基因芯片
WO2010039778A2 (en) * 2008-09-30 2010-04-08 Zirus, Inc. Mammalian genes involved in infection
EP2396408B1 (en) * 2009-02-12 2017-09-20 CuRNA, Inc. Treatment of glial cell derived neurotrophic factor (gdnf) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to gdnf
US9708604B2 (en) * 2009-03-17 2017-07-18 Curna, Inc. Treatment of delta-like 1 homolog (DLK1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to DLK1
US9209196B2 (en) 2011-11-30 2015-12-08 Sharp Kabushiki Kaisha Memory circuit, method of driving the same, nonvolatile storage device using the same, and liquid crystal display device

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JP6073795B2 (ja) 2017-02-01
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JP2013545450A (ja) 2013-12-26
US20150368644A1 (en) 2015-12-24
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