CN101580881B

CN101580881B - 评价暑热证及中药药效的基因芯片

Info

Publication number: CN101580881B
Application number: CN 200910140954
Authority: CN
Inventors: 刘凤华; 许剑琴; 余进; 杨凯; 董虹; 朱晓宇; 程桂林; 程飞
Original assignee: Beijing University of Agriculture
Current assignee: Most CAS (Beijing) Technology Development Co. Ltd.
Priority date: 2008-05-09
Filing date: 2009-05-11
Publication date: 2012-12-19
Anticipated expiration: 2029-05-11
Also published as: CN101580881A

Abstract

本发明提供了一种用于评价暑热证及中药药效的基因芯片，其包括针对热应激评价指标、行为调节、物质代谢、抗氧化酶、胃肠激素、免疫相关以及应激损伤修复相关基因表达检测的探针。本发明基因芯片对暑热证的检测准确率可达85％以上，为暑热证的快速检测提供了有效手段。

Description

评价暑热证及中药药效的基因芯片

技术领域

本发明涉及评价暑热证的基因芯片，以及利用所述芯片评价中药药效。

发明背景

目前，畜牧业迅速发展，大规模高密度集约化饲养下的畜禽的应激因素大大增加，畜禽发生应激的机率也大大上升。这些应激严重地影响着畜禽的生长发育、生产、繁殖、免疫力及畜禽产品品质等，造成很大的经济损失。随着全球性气候变暖，夏季高温所形成的暑热证，已经成为影响动物生产性能和免疫机能的一个重要因素。高温刺激下动物的激素分泌紊乱、行为改变、呼吸系统、心血管系统以及新陈代谢紊乱、繁殖能力下降，组织损伤，肉奶品质下降，免疫内分泌失调。我国有资料表明，几乎所有规模化猪场在高温环境中都造成母猪临产期、围产期死亡及仔猪死亡；母猪发情率降低20-30％，返情率提高20-30％。窝产仔数、仔猪初生重、成活率也受到不同程度的影响。母猪及仔猪因采食量下降引起的一系列经济损失也达到20％以上。

当前防治暑热证的措施主要是通过改善饲养环境和方式、调整饲料营养比例、添加抗暑热证药物和添加剂等；由于目前在抗动物暑热证中大量使用了一些化学药物、激素、微量元素、饲料添加剂和抗生素等，导致了动物产品中的药物残留，给我国人民身体健康和公共卫生安全带来了巨大危害，也给我国畜牧业产品出口带来了严重影响。此外，国内外对动物用抗生素、激素、化学药品的使用要求越来越严格，以及“绿色”食品的兴起，就需要在畜禽生产中开发和使用无毒、无害、无残留、且可增强动物生产性能和免疫机能的“绿色”药物来取代目前的抗热应激药物。在防治畜禽暑热证过程中，开发中药来预防暑热证逐步引起人们的高度重视。中药在中国传统兽医学理论指导下，在辨证论治基础上按照“君、臣、佐、使”原则进行组方来防治疾病。中药作为一种天然药物，具有资源丰富、价格低廉、毒副作用小、残留少，不易致畸和致癌等独特作用。大量资料表明，中药在防治暑热证方面具有防治效果良好、不易产生耐药性、低发病率、提高动物生产性能、明显促进机体非特异性免疫和特异性免疫、提高机体的抗病力和抵抗力等特点，但当前中草药制剂存在着一些问题，如有效成份不明确、疗效不稳定、剂量较大，尤其是药理作用机制不明确等不足，不利于中药在实际生产中广泛使用，严重阻碍中药产业化及中药产品进入国际市场。因此，在倡导“绿色”动物产品的今天，研制能有效防治动物高温引起的暑热证，且成分和药理作用明确、使用方便的“绿色”新型天然药品已成为亟待解决的问题，业已成为当今药物研制的热点。

基因芯片技术作为基因诊断、相关基因确定、疾病分子机理分析、药物筛选等重要工具，具有高通量、并行性及样品消耗量少的优势，在中药研究尤其是新药的设计筛选开发独具魅力，能够进行大规模筛选，在药物与基因间架起一座桥梁，通过基因表达谱芯片实验可以同时观察成千上万个基因在不同个体、不同组织、不同发育阶段的表达状况，从疾病及药物两个角度对生物体的多个参数同时进行研究，发掘药物靶点并同时获取作用机制的相关信息，改变了传统的一次实验仅对单个或几个基因表达差异进行观察，为多环节药物作用机制的研究提供了有力工具。中药尤其是复方组成成分多样，作用机制复杂，这给中药研究带来很大的困难，以至有学者提出中药可能通过多途径、多靶点发挥作用，而基因芯片高通量筛选的特点恰好满足同时获得大量实验信息的需要。

现有研究中存在的问题分析及本发明拟解决方案

(1)中医证候动物模型的研究是体现中医辨证论治特色的一种理想的方法，但随着数十年来研究的深入，其存在的问题也逐渐显露：客观指标的特异性、重现性等较差；证的动物模型的研究长期停留于造模阶段，致使中药新药药理实验研究仍在借用于西医的病理模型。随着大鼠、小鼠、兔、狗、猪等动物基因组测序的完成，研制实用的基因组芯片，利用基因芯片技术从整体、器官、细胞等水平筛选有关基因的差异表达，获取并归纳与证候相关的关键特征信息，选择功效相对稳定的经典方，进行证属性排比性的药物佐证，进而确定该证的基因表达谱情况，从而建立相应的中医证模型和评价体系对中兽药新药研发非常重要。本发明前期对猪热应激中生产性能相关、免疫机能相关指标体系及其相关性进行了大量的研究，如肠道和脾脏淋巴细胞IL-4/INF-γ、IL-2/IL10蛋白、基因表达变化，但评价指标体系繁杂、工作量巨大，难于实时反映本动物整体相关性、应激调控网络、特别是容易错过某些关键指标。本项目拟利用基因表达谱芯片对猪暑热证的全基因差异表达进行评价，确认暑热证与方剂调控的关系，精确建立暑热证模型。

本发明首次将上述差异表达明显的基因聚类后采用生物芯片技术应用于对中医暑热证的评价，试图并通过一次实时、同步、高通量检测神经-免疫-内分泌指标的变化多层次、多靶点全面评价畜禽在暑热证中上述指标的典型变化。

(2)基因芯片技术目前的在国内人医研究中运用较多，但兽医方面由于其成本太高，未有人涉足。有关机体免疫机能和生产性能指标的评价是所有新药研发的基础指标，通用性极强。中药由于其成分的复杂性及多种成分间可能存在的协同作用，因此，分析、鉴定和筛选其有效成分是中药新药开发中的一个很大难题，如果将基因芯片技术应用到中药活性成分的筛选，不仅可以节省大量的本动物实验，而且这种高通量筛选技术将会大大加快中药新药研发的进程。利用基因芯片技术可从基因水平解释中药的作用机制，为新药的开发提供理论依据，在基因分子水平上确定药物作用的靶目标，进而找出特效治疗作用的药物，同时，由于高通量的基因芯片，可以克服药物作用的单一靶点研究，有助于中药多方面作用机理的揭示，并有助于发现中药的新功能，为将来开发自主知识产权的国标一类新药打下良好的基础。

本发明首次将生产性能与免疫性能差异表达明显的基因聚类后采用生物芯片技术不仅应用于对中医暑热证的评价，同时也实时、同步、高通量检测神经-免疫-内分泌指标的变化多层次、多靶点全面评价开发研制的中兽药治疗畜禽在暑热证中上述指标的典型变化的效果评价。

研究证实中药的药理作用具有多途径、多靶点的特点，其中生产性能、免疫性能的药效学评价在畜禽新药研发中占有至关重要的位置。生产性能作为畜牧生产的前提是经济动物养殖的基础；免疫机能正常是保证畜禽健康及发挥生产性能，为人类提供安全食品和创造经济效益的前提，建立上述两个重要性能的指标评价体系是所有新兽药研发的基石和最终目标。所以，如何利用现代技术建立中药研发的技术平台，对进行中药药效评价、开发新中兽药具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够用于评价暑热证及中药药效的基因芯片。

本发明涉及评价暑热证的基因芯片，具有主要针对以下基因产生的RNA、cRNA或cDNA进行检测的探针：

1)热应激评价指标：HSP70(Hspa1a、Hspa11)、HSP27(Hspb1、Hspb8)、HSP105(Hsph1)、HSP8(Hspa41_predicted、Hspa8)；(HSP70表示HSP70类，括号中表示相应的基因Hspa1a和Hspa11，HSP27、HSP105和HSP8的表示与之类似)

2)行为调节：Dbp、Per2、Tef、Nrld1、Gprasp1、Apln；

3)物质代谢：Cyp1a2、P4ha1、Angptl4、Ca4、Plod1、Fmo2、Chdh、Pdk4、Lct、Slc2a5、Cyp4a12、Cryab、Lct、Ppara、Neu2、Dgat2；LOC246266、LOC286989、Noxo1_predicted、Scd1、RGD1309798_predicted、Adh1、Haao、Mmp9、Ireb2、Sqle、Prkab1、Aacs、Aldh1a7、Apobec1；

4)酶：TC608617、P4ha1、Gucy2g、Enpep、Ca4、Chka、LOC246266、LOC286989、Scd1、Ripk3、Haao、Cma1；

5)激素：Gnrh1、TC627619、1q52、Abcc2、Fkbp4、Lct、Nr4a3、Fkbp4；Tnfrsf6；

6)免疫相关：Csf2、Il22ra2、LOC301133、Bcl6_predicted、Vegfa；RT1-Bb、Ccl4、Tlr2、Apln、Spn、F3、Ccl5、Ms4a2、RGD1561519_predicted、Tnfrsf6；

7)应激损伤修复：Tnfrsf6、Vegfa、Gnrh1、Bag3、Zbtb16、Cryab、Ank3、Ddit3、Ripk3、Spn、Mmp9、Tnfrsf6、Lcn2。

一种较佳的组合应当具有针对下述基因产生的RNA、cRNA或cDNA进行检测的探针：HSP70、HSP27、HSP105、HSP8、Dbp、Per2、Cyp1a2、P4ha1、Scd1、TC608617、P4ha1、LOC246266、LOC286989、SGLT1、Scd、Csf2、Il22ra2、RT1-Bb、Spn、Lcn2、Ripk3、Dnaja1、和Ddit3。

当然，引入其他检测指标有助于提高预测的准确性，这些指标包括下述基因产生的RNA、cRNA或cDNA进行检测的探针中的一种或多种：Tef、Nrld1、Gprasp1、Apln、Angptl4、Ca4、Plod1、Fmo2、Chdh、Pdk4、Lct、Slc2a5、Cyp4a12、Cryab、Lct、Ppara、Neu2、Dgat2、Noxo1_predicted、RGD1309798_predicted、Adh1、Haao、Mmp9、Ireb2、Sqle、Prkab1、Aacs、Aldh1a7、Apobec1、LOC301133、Bcl6_predicted、Vegfa、Ccl4、Tlr2、Apln、Spn、F3、Ccl5、Ms4a2、RGD1561519_predicted、Tnfrsf6、Bag3、Angptl4、Ank3、Gnrh1、Tesk2、Cryab、Ptdsr、Bcl6_predicted、Fxr1h、Dap、Trib3，Reg1、Apln、Ttk_predicted、Ms4a2、Mmp9、Spn、Tnfrsf6，Reg1、Apln、Ttk_predicted或Ms4a2。

暑热证评判标准

1)热应激评价指标：HSP70、HSP27、HSP105、HSP8 上调2倍以上

2)行为调节：Dbp、Per2、Tef、Nrld1、Gprasp1、Apln 上调2倍以上

3)物质代谢：Cyp1a2、P4ha1、Angptl4、Ca4、Plod1、Fmo2、Chdh、Pdk4、Lct、Slc2a5、Cyp4a12、Cryab、Lct、Ppara、Neu2、Dgat2上调T检验＜0.01；LOC246266、LOC286989、Noxo1_predicted、Scd1、RGD1309798_predicted、Adh1、Haao、Mmp9、Ireb2、Sqle、Prkab1、Aacs、Aldh1a7、Apobec1下调T检验＜0.01

4)酶：TC608617、P4ha1、Gucy2g上调T检验＜0.01；LOC246266、LOC286989、Scd1、下调T检验＜0.01

5)激素：Gnrh1、TC627619上调T检验＜0.01；Tnfrsf6下调T检验＜0.01

6)免疫相关：Csf2、Il22ra2、LOC301133、Bcl6_predicted、Vegfa上调，T检验＜0.01；RT1-Bb、Ccl4、Tlr2、Apln、Spn、F3、Ccl5、Ms4a2、RGD1561519_predicted、Tnfrsf6下调T检验＜0.01

7)应激损伤修复Dnaja1、Ddit3，Bag3、Angptl4、Ank3、Gnrh1、Tesk2、Cryab、Ptdsr、Bcl6_predicted、Fxr1h、Dap、Trib3，Reg1、Apln、Ttk_predicted、Ms4a2上调，T检验＜0.01；Lcn2、Ripk3、Mmp9、Spn、Tnfrsf6，Reg1、Apln、Ttk_predicted、Ms4a2下调，T检验＜0.01

中药效果证评判标准

1)热应激评价指标：HSP70、HSP27、HSP105、HSP8比暑热证组下调，T检验＜0.01

2)行为调节：Dbp、Per2、Tef、Nrld1、Gprasp1、Apln比暑热证组下调，T检验＜0.01

3)酶：TC608617、P4ha1、Gucy2g下调T检验＜0.01；LOC246266、LOC286989、Scd1上调T检验＜0.01

4)激素：Gnrh1、TC627619下调T检验＜0.01；Tnfrsf6上调T检验＜0.01

5)免疫相关：Csf2、Il22ra2、Vegfa比暑热证组下调，T检验＜0.01；RT1-Bb、Ccl4、Tlr2、Apln、Spn、F3、Ccl5、Ms4a2、Tnfrsf6比暑热证组上调，T检验＜0.01

6)应激损伤修复：Dnaja1、Ddit3，Bag3、Angptl4、Ank3、Gnrh1、Tesk2、Cryab、Ptdsr、Fxr1h、Dap、Trib3，Reg1、Apln、Ms4a2比暑热证组下调，T检验＜0.01；Lcn2、Ripk3、Mmp9、Spn、Tnfrsf6，Reg1、Apln、Ms4a2比暑热证组上调，T检验＜0.01

根据目前夏季高温对畜牧生产的影响，本发明设计了评价暑热证及中药药效评价的基因芯片，其中所述评价芯片涉及高温刺激所产生的热应激程度，生产性能和免疫性能方面的DNA片段，其被固定在适于检测反应的固相载体上。

本发明中所述固相载体可选用本领域中众所周知的载体，只要所述载体与所述反应物相容，不会影响检测结果。优选的，本发明所述固相载体为玻璃片、硝酸纤维素膜或硅片等。

本发明所述评价芯片可包含在一个试剂盒中，其中还包括用于评价反应的相应试剂、缓冲液以及说明书。

本发明公开了评价中医暑热证的基因特征性片段的基因芯片，同时该芯片用于抗暑热证中药的药效评价。

在本发明的实施方案中，所述固相载体为玻璃片，玻璃片用多聚赖氨酸进行处理，向其上固定具有本发明所选的基因特征性片断，利用机械手点印芯片，并将芯片重新水合化及快速干燥、UV-交联、封闭及变性，得到评价用基因芯片。同时以荧光素标记待测样品，和芯片进行杂交。

在本发明中，待测样品核酸的抽提可采用异硫氰酸胍稳定法，用分光光度计对RNA定量。

本发明所述评价用基因芯片采用了严格的杂交反应条件。依据本发明所选择的条件，可实现使大量杂交反应中的大多数反应物处于最佳状况中，从而使尽可能多的配对物都不遗漏，即减少假阳性的可能，将错配降到最低。

此外，根据上述内容，本发明还提供一种检测试剂盒，其包括对上述基因产生的RNA或表达产物测定的全部或部分试剂，典型地，测定RNA的试剂包括(荧光定量PCR检测试剂盒，原位杂交及原位RT-PCR，Nouthern检测试剂盒)等，测定蛋白表达产物的试剂包括(ELISA试剂盒、抗体芯片)等。

本发明首次将消化吸收相关的酶和胃肠激素及免疫相关的细胞因子结合起来作为评价暑热证的指标。上述指标对于评价与畜禽生产性能相关指标、与免疫性能相关的指标具有重要的指导意义。而生产性能相关指标是畜牧生产追求的指标，免疫性能是保障动物健康的关键。本发明芯片不仅将在新药研究中体现节省样品，节省时间，同时节省资金。

附图说明

图1显示的是大鼠热刺激温度变化曲线。

图2显示的是动物直肠温度变化，其中图2A，C：常温对照组，S：高温组N＝6；高温组大鼠热刺激回到常温环境恢复22h后测定直肠温度，高温组大鼠平均直肠温度低于对照组但无统计学差异；图2B，B：热刺激前直肠温度，A：热刺激后直肠温度N＝6；在高温刺激前后测定大鼠直肠温度。大鼠天热刺激后直肠温均显著高于热刺激前。

图3显示的是采食量、饮水量变化的曲线，其中图3A，C：常温对照组，S：高温组；平均采食量＝(200g-剩余量)/6，高温组大鼠平均采食量低于对照组，随着应激次数增加采食量逐渐恢复到正常水平；图3B，C：常温对照组，S：高温组；平均饮水量＝(400ml-剩余量)/6，高温组大鼠饮水量高于对照组，随着热应激次数增加饮水量逐渐接近正常水平。

图4显示的是体重增长速度、体重丢失的变化曲线，其中图4A，C：常温对照组，S：高温组；高温组大鼠平均体重的增长速率低于常温组，从第7天开始恢复到正常水平；图4B体重丢失＝(高温刺激前体重-高温刺激后体重)/高温刺激前体重*100％，随着刺激天数增加大鼠体重丢失减少。

图5显示的是血清皮质醇变化，C：常温对照组，S：高温组，N＝6；在第1，3，6天高温组大鼠血清皮质醇浓度显著高于对照组，在第10天与正常组无差异。

图6显示的是甲状腺激素T3和T4变化，其中图6A，C：常温对照组，S：高温组，N＝6；高温组大鼠血清甲状腺激素T3浓度第3天开始低于对照组，第6天和第10天差异显著，p＜0.05；图6B，C：常温对照组，S：高温组，N＝6；高温组大鼠血清甲状腺激素T4浓度第3天开始低于对照组，第10天差异显著，p＜0.05。

图7显示的是小肠组织形态学变化。

图8显示的是小肠组织HSP70mRNA检测结果。

图9显示的是HSPmRNA/β-actin mRNA的检测结果，C：常温对照组，S：高温组，N＝6；高温组十二指肠、空肠、回肠HSPmRNA/β-actin mRNA比值均显著高于对照组。

具体实施方式

实施例1基因芯片制备的通用策略

关于本发明所述基因芯片的制备，可采用如下详述的通用策略

1.载玻片处理：首先充分清洗载玻片，用25×NaOH溶液200mL加300mL95％乙醇配成500mL碱性清洗液，将载玻片彻底浸泡在清洗液中2h，再用清水冲洗5遍并将载玻片泡在水中。接下来就是用多聚-L-赖氨酸溶液浸泡，从而使多聚赖氨酸均匀涂包在玻璃表面，形成一种多聚-L-赖氨酸涂面。具体做法是配成350mL多聚-L-赖氨酸浸泡液，将洗净的载玻片直接浸泡，浸泡期间保持慢速摇晃，1h后取出并在水中浸泡清洗，最后干燥。一般将涂好的载玻片用锡箔纸包好，室温放置1个月，进行熟化，以使表面保持充分的疏水性。这对于以后点DNA样品是十分重要的。

2.基因芯片的点印：点印DNA用机械手。将一组处理好的载玻片固定在一个平台上，将DNA样品(溶在50％DMSO中，0.25-0.75μg/μl)装在96孔或384孔的平板中，并将平板放在支架上。机械手将一组特制的点样吸头插入对应的DNA平板孔中，让每个吸头充上约1μl的DNA溶液。然后机械手轻轻地将吸头移向载玻片，将DNA样品完全一致地点到多聚-L-赖氨酸包被的载玻片面上.每个载玻片上大约点＜0.5μl的DNA溶液。点样的质量要表现在点与点的距离，这取决于点样吸头的尖锐度与多聚-L-赖氨酸表面的疏水性，矩阵24×24，每个样品重复4次，每张芯片上下两个矩阵。

3基因芯片的后加工处理：当基因芯片点成之后，需要对其进行进一步的加工处理，以便能够用于以后的杂交实验。通常进行四步处理，即重新水合化及快速干燥、UV-交联、封闭及变性后备用。

3.1重新水合化：通常点样过程并不能保证DNA在点中均匀一致。为使DNA在所有点中都分布均匀。需要对之进行重新水和化并进行快速干燥。这一过程要求技术条件很高。当重新水合化不充分时，大小不规则的点会影响以后的杂交与分析结果。但当过度水合化时，点与点之间可能会产生融合。因此，要确定一个十分准确的水合条件，本芯片采用的是相对湿度70％环境水合2h，室温干燥0.5h。

3.2UV交联：当重新水合化并立即干燥后，将载玻片放在UV射线下照射，这样可以使DNA交联在载玻片上。这一过程对于DNA浓度低时尤为重要，可以增加可杂交DNA吸附到每一个点上的量.在UV交联时，将载玻片有DNA点的面朝上，照射总能量强度为65MJ/cm。

3.3封闭：封闭主要目的是将游离赖氨酸基团加以修饰，以避免这些基团与以后被标记的DNA结合。如果不对载玻片封闭，那么，将来杂交后就会产生无法分清的非特异杂交斑.而且还会产生过多的背景。一般的封闭办法是用琥珀酸酐进行酰基化，将赖氨酸的氨基转化成酰氨基，使之形成负电荷表面，从而减小与DNA的非特异结合.这一过程一般在15min内结束。

3.4变性处理：当封闭过程完成后，要立即进行变性处理，即将整个载玻片立即浸入沸腾但不冒泡的水中，上下翻3～5次，停留2min，然后立即转到95％的乙醇中，浸泡一会儿后离心干燥，这样便完成了对芯片上DNA的变性处理。此时，整个基因芯片块也就做好了。

实施例2本发明所述基因芯片检测待测样品的通用策略

1.待测样品的标记

依照所检测对象的不同，选择具体的待测样本，依照如下方法提取核酸样品，并对所得待测样品核酸进行生物素标记。

RNA的提取方法：(参见分子克隆：实验指南中文第三版2002年J.萨姆布鲁克等著黄培堂等译518-522页)；对待测样品的核酸进行提取。

生物素标记：以提取的核酸作模板，采用RT-PCR方法进行扩增，RNA/T7-Oligo(dT)作为引物合成双联cDNA，再以cDNA为模板合成cRNA，并用生物素-NTP进行标记。

2.基因芯片与待测样品的杂交

取出芯片平衡芯片至室温，参见下表配制杂交液。根据芯片类型确定需要配制的体积，这已将杂交过程中会损失部分(10-20μL)杂交液考虑在内。将杂交液置于加热块上，99℃温育5min。其间，用一次性吸头通过一个septa(芯片上septa位置)注入相应体积1×Hybridization Buffer将芯片置于杂交炉中，45℃温育10min，60rpm旋转。将99℃已温育5min的杂交液转移到另一加热块上，45℃温育5min。从加热块上取出杂交液，微型离心机最大转速离心5min，以除去杂交混合液中的不溶性物质。从杂交炉中取出芯片，吸出1×Hybridization Buffer，将芯片平衡放置于杂交炉中，45℃，60rpm旋转杂交16h，

表1单链探针阵列杂交液

3.杂交结果的检测

将杂交完毕的芯片用

Scanner 3000(Affymetrix，USA)激光共聚焦扫描仪在适当条件下扫描检测其杂交信号。

实施例3大鼠暑热证芯片

高温是生物适应自然界所要面对的主要环境因素之一，当动物所处环境温度高于其中性温度区时机体产热散热平衡被破坏，动物产生热应激反应。高温应激状态下动物的行为、生理、器官、细胞分子都会发生一系列改变，如高温应激时动物行为异常、激素分泌改变、生产性能和繁殖性能下降、组织器官损伤、基因和蛋白表达改变等。

面对高温逆境动物机体可以在一定程度上通过调节自身生理行为、代谢和激素分泌等进行适应，但是当高温胁迫超过机体调节范围和承受能力时就会造成组织器官损伤。众所周知，小肠是动物营养吸收和黏膜免疫的重要器官，小肠上皮细胞是动物机体与外界间的天然屏障，其结构的完整直接影响到动物生产性能和抗病能力，然而细菌和病毒及其产物，外源化学物质，化学药品，免疫炎性分子、辐射、高温等刺激因子均可导致肠上皮细胞的损伤，造成小肠道屏障机能障碍。

机体通过增加隐窝细胞分裂增殖和热应缴蛋白合成分泌来稳定小肠内在结构和功能。研究高温对动物生理和小肠损伤影响对基础生物学、营养学、药物学都有非常重要的意义，而前人有关高温对大鼠器官损伤研究主要集中在脑，神经、肝脏、心脏等重要器官，高温对小肠损伤的研究报道较少。为此，本实验研究连续10天高温刺激对大鼠行为，体温，采食量，饮水量，体重增长速度，血清激素浓度等生理指标、小肠形态结构及基因表达的影响。

材料方法

1.实验动物分组和饲养

48只体重为200±20g雄性SD(sprague-Dawley)大鼠(购自北京维通利华试验动物技术有限公司)，随机分为常温对照组和高温组，每组24只，每组分4笼(每笼6只)饲养于装有锯末填料的聚丙烯塑料笼子里。所有实验动物饲养于25℃50％RH 12小时昼夜交替的标准实验动物房中，饲喂商品鼠粮(每天定量200g)、饮用自来水(每天定量400ml)。

2.实验处理

实验分适应性实验和正式实验两个阶段：适应性实验为期一周，所有大鼠饲养环境条件恒定为25℃50％RH；正式实验为期10天，对照组饲养环境条件不，高温组每天在光照培养箱中(40℃，50％RH)热刺激两小时后回到25℃50％RH环境饲养。(见图1)

3.样品和指标数据采集

在正式试验的第1、3、6、10天从常温组和高温组中抽取一笼(6只老鼠)，断颈采血，37℃静止1小时后3000g离心10min取血清分装后于-80℃保存。取十二指肠、空肠、回肠用灭菌生理盐水冲洗干净分为4部分①10％甲醛固定②基因芯片检测③④液氮冻透后-80℃保存。

4.动物生理行为

每天上午记录每笼大鼠饲料剩余量、水剩余量、测量每只大鼠的直肠温度和体重；观察热刺激过程中动物行为变化，测量高温组热刺激后直肠温度和体重。

激素指标检测

1血清皮质醇、T3、T4含量

血清皮质醇和甲状腺激素T3、T4浓度用放射免疫试剂盒检测

2小肠组织形态学

十二指肠、空肠、回肠组织10％中性甲醛固定后，常规石蜡切片制作，HE染色，光镜观察小肠形态结构，并应用图象分析系统拍照。

3基因芯片扫描

从第1、3、6、10天中挑选小肠损伤明显天数用作芯片分析

结果

1.动物直肠温度

如图2所示，图2A，C：常温对照组，S：高温组N＝6；高温组大鼠热刺激回到常温环境恢复22h后测定直肠温度，高温组大鼠平均直肠温度低于对照组但无统计学差异。图2B，B：热刺激前直肠温度，A：热刺激后直肠温度N＝6；在高温刺激前后测定大鼠直肠温度。大鼠天热刺激后直肠温均显著高于热刺激前。

2.采食量、饮水量、体重增长速度、体重丢失

结果如图3和图4所示。图3A，C：常温对照组，S：高温组；平均采食量＝(200g-剩余量)/6，高温组大鼠平均采食量低于对照组，随着应激次数增加采食量逐渐恢复到正常水平。图3B，C：常温对照组，S：高温组；平均饮水量＝(400ml-剩余量)/6，高温组大鼠饮水量高于对照组，随着热应激次数增加饮水量逐渐接近正常水平。图4A，C：常温对照组，S：高温组；高温组大鼠平均体重的增长速率低于常温组，从第7天开始恢复到正常水平。图4B，体重丢失＝(高温刺激前体重-高温刺激后体重)/高温刺激前体重*100％，随着刺激天数增加大鼠体重丢失减少。

3.激素变化

结果如图5和图6所示。图5，C：常温对照组，S：高温组，N＝6；在第1，3，6天高温组大鼠血清皮质醇浓度显著高于对照组，在第10天与正常组无差异。图6A，C：常温对照组，S：高温组，N＝6；高温组大鼠血清甲状腺激素T3浓度第3天开始低于对照组，第6天和第10天差异显著，p＜0.05。图6B，C：常温对照组，S：高温组，N＝6；高温组大鼠血清甲状腺激素T4浓度第3天开始低于对照组，第10天差异显著，p＜0.05。

4.小肠组织形态学变化

小肠的组织形态学变化如图7所示。

5.芯片差异基因数据

S vs

T检验基因注册号基因名

Control_Log2Ratio

7.46189 1.46186E-05 NM_031971 Hspala

6.931083 0.000242894 NM_031971 Hspala

3.92618 0.002891954 NM_031970 Hspb1

3.759091 2.00212E-05 NM_001011901 Hsph1

3.370955 0.008678401 NM_012543 Dbp

3.339219 0.00932614 CB327764 CB327764

3.3124 0.003978672 NM_145775 Nrld1

3.242033 0.007281711 TC608617 TC608617

3.214048 0.006665596 BF548548 BF548548

2.90871 0.00990622 NM_012541 Cypla2

2.907594 0.005571028 A_44_P215837 A_44_P215837

2.853205 0.000266453 ENSRNOT00000056837 ENSRNOT00000056837

2.84377 0.005952429 NM_012541 Cypla2

2.77999 1.52324E-05 ENSRNOT00000056855 Ahsa2_predicted

2.67523 1.74915E-05 NM_172062 P4ha1

2.618965 0.003667677 NM_001013181 Zbtb16

2.609209 0.00024788 AA996504 AA996504

2.566324 1.42416E-05 XM_234728 XM_234728

2.56529 0.005369488 XM_342497 Chacl_predicted

2.557476 0.003420444 ENSRNOT00000021746 Gucy2g

2.545487 0.008051479 NM_175760 Cyp4a14

2.509122 0.002899278 NM_020071 Fgb

2.492835 0.008896807 NM_016999 Cyp4b1

2.429562 0.003102213 ENSRNOT00000031873 Etsrp71_predicted

2.412756 0.000146772 XR_008968 LOC498264

2.412398 0.004260074 AW921298 AW921298

2.383788 0.000160131 NM_175761 Hspca

2.378352 0.000547466 XM_235878 Chordcl_predicted

2.37482 0.001117301 A44_P400591 A_44_P400591

2.364461 2.45502E-05 BG668811 BG668811

2.364241 4.92111E-05 AW918633 AW918633

2.363604 2.40176E-06 XR_007019 LOC691091

2.331056 0.001414827 ENSRNOT00000022749 Chst4_predicted

2.328298 0.001293315 XM_001076891 L0C691117

2.328149 0.0001191 NM_001025411 Dnaja4

2.320734 0.000310669 ENSRNOT00000035746 ENSRNOT00000035746

2.295735 0.000740807 NM_001011936 Bag3

2.285169 0.002513853 NM_147210 Nrld2

2.281119 0.001894668 NM_019194 Tef

2.278219 0.000800547 NM_019216 Gdf15

2.274365 0.001471932 ENSRNOT00000034925 Morc4_predicted

2.242177 1.20703E-05 A_44_P384688 A_44_P384688

2.228483 0.000387618 NM_031678 Per2

2.227634 0.007914505 NM_138504 Okl38

2.195953 3.53693E-05 XR_005817 LOC305639

2.190179 0.003764566 A_44_P585834 A_44_P585834

2.189473 0.000401605 ENSRNOT00000030569 Chordc1_predicted

2.180326 3.67079E-05 AW533219 AW533219

2.171974 4.44207E-06 NM_175761 Hspca

2.17193 0.000118735 ENSRNOT00000038879 Dnajb1_predicted

2.170365 0.001944774 XR_006798 LOC307084

2.139124 9.44453E-05 ENSRNO000000004260 RGD1561019_predicted

2.13337 9.47106E-05 XR006580 LOC300332

2.127063 0.001779991 A_44_P744488 A_44_P744488

2.120064 0.003865013 NM_138911 Stip1

2.118307 0.001264817 NM_175761 Hspca

2.116853 0.006282142 NM_182844 Myrip

2.112075 0.000153696 NM_175761 Hspca

2.111511 0.00140815 ENSRNOT00000011384 Mthfr_predicted

2.093398 5.55505E-05 AI231547 AI231547

2.084188 9.54846E-05 XR_006667 LOC310385

2.078899 0.001738088 XM_212821 XM_212821

2.072257 0.001927541 ENSRNOT00000038879 Dnajb1_predicted

2.06989 0.000251107 XM_001054273 RGD1561628_predicted

2.053192 0.002543779 XR007066 LOC691340

2.04876 0.009579936 A_44_P391382 A_44_P391382

2.047197 0.008646221 XR_005725 LOC295698

2.032028 0.004153529 BC079190 MGC125073

2.031386 0.001619338 TC600817 TC600817

2.020532 0.001053855 NM_022251 Enpep

2.007665 0.006562326 XR_007874 RGD1561154_predicted

2.000576 0.000566298 ENSRNOT00000030569 Chordel_predicted

1.990999 0.002123122 XR_007212 LOC310891

1.986164 0.000137282 NM_024351 Hspa8

1.985362 0.007901528 NM_024351 Hspa8

1.963668 6.29794E-05 CB545618 CB545618

1.955555 0.000798132 AI231792 AI231792

1.949518 0.000471396 TC592273 TC592273

1.942592 0.000437503 XR_006475 LOC499479

1.927429 0.002612227 NM_001013904 LOC293989

1.898969 0.000139204 XM_001056105 LOC679385

1.883691 0.007395135 NM_012833 Abcc2

1.869627 0.00767654 NM_199115 Angpt14

1.856993 0.000735479 ENSRNOT00000001210 RGD1310835_predicted

1.83889 0.004329709 XM_231125 RGD1305459_predicted

1.834412 0.000446805 NM_022934 Dnaja1

1.830802 9.72479E-05 NM_024351 Hspa8

1.830546 0.009936351 NM019174 Ca4

1.787437 0.00377477 TC630150 TC630150

1.780141 0.003345646 NM_212546 Hspa11

1.778125 0.00132384 ENSRNOT00000033298 ENSRNOT00000033298

1.754094 0.003326044 AI146186 AI146186

1.748708 4.73265E-05 ENSRNOT00000036995 RGD1305459_predicted

1.74139 0.001077763 AA957618 AA957618

1.740582 0.004853774 TC617060 TC617060

1.713243 0.002129921 NM_198134 Bst2

1.709525 0.000135562 NM_024134 Ddit3

1.672301 0.002727078 NM_001034130 Was1

1.664765 1.28767E-05 XR_006653 LOC289672

1.654371 0.000757544 NM_198134 Bst2

1.650989 0.000313633 ENSRNOT00000059896 RGD1562701_predicted

1.64858 0.002900737 NM_017127 Chka

1.647152 9.59074E-06 XR_008192 LOC299524

1.638668 0.001508783 ENSRNOT00000001750 Slc5a4a_predicted

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1.6292 0.002526492 ENSRNOT00000020563 Dhh

1.618489 1.69406E-05 XR_005982 LOC363224

1.614563 0.002436643 XR_006212 LOC302786

1.613835 0.003503444 NM_013033 Slc5a1

1.604813 0.000445102 NM_001004082 Hspcb

1.59716 0.000245963 XM_213024 XM_213024

1.594704 0.000817965 NM_001007006 Duspl3

1.583517 8.24018E-05 AW918477 AW918477

1.569547 0.000913461 TC596189 TC596189

1.566843 0.002678185 NM_053523 Herpud1

1.564583 0.00158745 U76551 Muc3

1.563972 0.000897889 NM_022251 Enpep

1.556588 0.00319689 A_44_P123704 A_44_P123704

1.555274 0.000237207 A_44_P667548 A_44_P667548

1.546604 0.000278756 NM_001004208 Cacybp

1.538965 0.002l58641 ENSRNOT00000032333 Csf2

1.536545 0.004799016 X77209 X77209

1.536363 0.009611495 NM_012620 Serpine1

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1.53006 0.004461065 NM_144737 Fmo2

1.513979 1.92943E-05 CB544480 CB544480

1.508676 3.57518E-05 A_44_P760299 A_44_P760299

1.50661 0.003537531 ENSRNOT00000028855 ENSRNOT00000028855

1.504209 5.64548E-05 XM_342763 Fkbp4

1.502439 0.002938505 XM_229800 XM_229800

1.500817 0.000465857 XM_340798 P4ha2_predicted

1.497847 0.007764396 ENSRNOT00000009685 Gramdlb_predicted

1.491649 0.005366869 NM_032074 Irs3

1.46774 0.001401984 NM_031148 Slc20a1

1.464999 0.000308866 XR_006708 LOC291871

1.457667 0.001825395 NM_053715 Slc5a3

1.4521 0.000187131 NM_053612 Hspb8

1.450971 0.005500528 NM_053894 Jundp2

1.446222 2.75977E-05 NM_031805 Ank3

1.445843 0.000357707 ENSRNOT00000023287 Spsb1_predicted

1.444086 0.001225251 XR_007989 RGD1562936_predicted

1.440378 0.001276525 NM_134386 Gprasp1

1.437175 0.00597827 NM_198731 Chdh

1.433882 0.003738099 ENSRNOT00000021750 Sdccag33_predicted

1.420107 0.003797369 CB545196 CB545196

1.413789 0.000662667 NM021672 Gdf9

1.411091 0.000532732 BF289404 BF289404

1.405815 0.006793522 NM_053551 Pdk4

1.40558 2.46394E-05 ENSRNOT00000010894 Anxa13_predicted

1.403092 8.64121E-05 XR_005505 LOC499644

1.394362 0.006527364 NM_053318 Hpx

1.379429 0.008838405 ENSRNOT00000004908 Lct

1.374831 2.11299E-05 BF401675 BF401675

1.374214 0.001835821 NM_031148 Slc20a1

1.371081 0.000957053 NM_144739 Fmo5

1.370742 0.001615769 NM_031741 Slc2a5

1.344949 0.001308548 NM_024351 Hspa8

1.340667 0.006173256 BF563517 BF563517

1.338602 0.000319005 ENSRN0T00000023827 RGD1306820_predicted

1.337804 0.000477802 Y00054 Y00054

1.335705 0.000636575 NM_001025682 Cdr2

1.323256 0.005263631 M15527 Gnrh1

1.315379 0.000849273 NM_001007147 Unc84a

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1.311782 0.00136816 NM_133386 Sphk1

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1.309076 0.007506436 DQ268830 Nr4a3

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1.303852 0.007333819 NM_001025751 Blk

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1.294875 0.001270272 AW918578 AW918578

1.294588 0.00736245 TC575886 TC575886

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1.290115 0.009737677 ENSRNOT00000021036 Cda_predicted

1.279494 0.000483843 TC613177 TC613177

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1.271333 0.006158538 NM_053715 Slc5a3

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1.267397 0.001536257 ENSRNOT00000008737 Fkbp4

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1.26093 0.00064629 NM_020071 Fgb

1.25774 0.003323271 ENSRNOT00000042872 ENSRNOT00000042872

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1.242132 0.001862761 NM030852 Mia1

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1.206746 0.00323753 TC627619 TC627619

1.20065 0.000549078 NM_012935 Cryab

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1.183357 0.008626869 ENSRNOT00000004908 Lct

1.179341 0.001057803 NM_001008560 Prss35

1.177801 0.000106291 NM_001037192 RGD1307890

1.176258 0.009290628 NM_001047116 MGC124740

1.176079 0.007517011 ENSRNOT00000025894 Banp_predicted

1.174032 0.001632764 NM_053536 Klf15

1.172242 0.008963997 NM_001007673 Mmd

1.171827 0.000980514 ENSRNOT00000026467 ENSRNOT00000026467

1.170096 0.006922114 XR_006039 LOC298615

1.168584 9.41535E-05 ENSRNOT00000023827 RGD1306820_predicted

1.162282 0.004866962 CA512840 CA512840

1.160427 0.007181231 NM_001012143 Ptdsr

1.157412 0.004909795 NM_130415 Slc36a1

1.146194 0.001170489 XM_236794 LOC301133

1.141917 1.0922E-05 XM_001062172 LOC681996

1.132122 0.005943412 TC628144 TC628144

1.131631 0.0091396 ENSRNOT00000015474 Hspa41_predicted

1.129613 0.001770825 XM_345006 XM_345006

1.128091 0.003055827 ENSRNOT00000008737 Fkbp4

1.127741 0.000365978 TC617840 TC617840

1.1246 0.000365649 A_44_P667768 A_44_P667768

1.123181 0.003361174 ENSRNOT00000002522 3cl6_predicted

1.123163 0.005586351 NM_053542 Gna15

1.113587 0.000540149 XM_220913 XM_220913

1.105177 0.000754597 NM_053523 Herpud1

1.103259 0.002169047 NM_019317 Madcam1

1.103211 0.002623958 NM_001014178 RGD1308600

1.103097 0.001694738 ENSRNOT00000014603 ENSRNOT00000014603

1.102932 0.006142927 NM_013196 Ppara

1.100359 0.003398172 AI501854 AI501854

1.090438 0.002867908 NM_001012179 Fxr1h

1.09027 0.004362313 NM_017130 Neu2

1.090155 0.002487505 XM_001056213 LOC680308

1.089279 0.006574114 A_44_P313898 A_44_P313898

1.084903 0.003466342 AW253723 AW253723

1.081649 1.69208E-05 AI030888 AI030888

1.080768 0.006740221 NM_001083122 S1c30a2

1.078735 0.000295616 TC621744 TC621744

1.077552 0.000466661 ENSRNOT00000012203 ENSRNOT00000012203

1.07602 0.000499067 NM_022526 Dap

1.073571 0.004876239 NM_031712 Pdzk1

1.067348 0.002115659 NM_001013076 Dnajb4

1.067226 0.003854562 DN932947 DN932947

1.066543 0.004114683 AW142520 AW142520

1.06531 0.002058151 ENSRNOT0000024749 RGD1561600_predicted

1.064965 0.000754033 NM_053541 Lrp3

1.063956 0.000538278 NM_019242 Ifrd1

1.063185 0.000626214 NM_001012040 Samd8

1.059037 0.00146664 ENSRNOT00000012597 Cdk6

1.053455 0.006396324 ENSRNOT00000061446 LOC498131

1.048277 0.000811707 NM_144755 Trib3

1.044749 0.005314319 XM_342902 XM_342902

1.03492 0.000431519 ENSRNOT00000012061 RGD1563441_predicted

1.029759 0.007314811 NM_001047092 RGD1311314

1.02553 0.000760552 AA900765 AA900765

1.024659 0.002228488 XM_232220 Rybp_predicted

1.024526 0.000172435 NM_001017502 LOC498404

1.023382 0.002242355 DV724669 DV724669

1.021815 0.008931178 NM_001047116 MGC124740

1.021688 0.001619033 BF549332 BF549332

1.021597 0.006285794 NM_001012345 Dgat2

1.018679 0.000290393 ENSRNOT00000044234 Ncoa3

1.018032 0.007731545 NM_001034959 LOC619574

1.016927 0.004956638 NM_031836 Vegfa

1.012915 0.004818419 BF559508 BF559508

1.010972 0.000823991 XM_345918 Slc37a2_predicted

1.009766 0.006108592 NM_053541 Lrp3

1.00699 4.15394E-05 XM_236411 Myo5c_predicted

1.006747 0.005626129 ENSRNOT00000030016 ENSRNOT00000030016

1.004663 0.001690173 ENSRNOT00000038464 RGD1560542_predicted

1.002361 0.000440878 XM_341085 XM_341085

1.001812 0.00091477 ENSRNOT00000014603 ENSRNOT00000014603

-12.28 9.36816E-05 NM_001004084 RT1-Bb

-4.3115 0.002362812 XM_344144 RGD1561854_predicted

-3.67779 0.000804237 ENSRNOT00000019282 RGD1560956_predicted

-3.38708 0.00856507 AI228153 AI228153

-2.34709 0.000116014 NM_017119 Gzmk

-2.27501 0.007635654 NM_053587 S100a9

-2.24407 0.001190621 XM_345741 XM_345741

-2.20889 0.009233663 XM_345742 XM_345742

-2.19996 0.006172011 XM_345743 XM_345743

-2.13274 0.000191375 TC583130 TC583130

-2.06421 0.0000110583 NM_144750 LOC246266

-2.01405 0.004031682 NM_173323 LOC286989

-1.90331 0.006242707 NM_053858 Ccl4

-1.83232 0.004356903 NM_031651 Slc13a1

-1.74611 0.000204144 ENSRNOT00000029652 Noxo1_predicted

-1.70549 0.00452115 NM_198769 Tlr2

-1.69853 0.008524273 NM_012641 Reg1

-1.64315 0.002770811 ENSRNOT00000036996 RGD1560395_predicted

-1.58234 0.004511105 A_44_P107761 A_44_P107761

-1.55609 0.002248924 NM_139192 Scd1

-1.54517 0.006892174 BC098746 LOC500183

-1.52182 0.001235959 NM_130741 Lcn2

-1.47165 9.63608E-05 XM_001054812 LOC679879

-1.44746 0.000640173 ENSRNOT00000031568 RG01309798_predicted

-1.44541 0.001584623 NM_139342 Ripk3

-1.39784 0.006494824 NM_019286 Adh1

-1.39606 0.004643927 ENSRNOT00000028933 ENSRNOT00000028933

-1.38631 0.000318829 ENSRNOT00000026093 Ankrd22_predicted

-1.38479 0.002649331 XM_344305 XM_344305

-1.38002 0.005379857 NM_020076 Haao

-1.37987 0.008132703 A_44_P807424 A_44_P807424

-1.37152 0.003484262 NM_031147 Cirbp

-1.36995 0.002535569 NM_013092 Cma1

-1.36703 0.00677233 ENSRNOT00000060888 Prss22_predicted

-1.36621 0.000269047 TC608485 TC608485

-1.35985 0.000469068 DV715460 DV715460

-1.35296 0.007379681 ENSRNOT00000024494 Irf4_predicted

-1.32147 0.001063368 NM_133537 Expi

-1.29095 0.001445567 NM_032062 Kalrn

-1.28625 0.001266087 NM_031055 Mmp9

-1.28505 0.000590591 NM_022392 Insig1

-1.26985 7.24655E-05 XM_001075770 LOC315676

-1.24968 0.001520663 NM_019257 Sfrs5

-1.24409 0.004374362 TC606746 TC606746

-1.24213 0.006049595 ENSRNOT00000000355 Prdml_predicted

-1.2408 8.60383E-05 BC084708 Wdr6

-1.2373 0.004820156 AI008694 AI008694

-1.23414 0.009462848 AW142773 AW142773

-1.22704 0.006363082 XM_341847 RGD1311142_predicted

-1.22686 0.003797317 NM_013092 Cma1

-1.21981 0.003673368 AI501931 AI501931

-1.21773 0.001807806 XM_001057547 LOC680521

-1.20908 0.009993499 NM_198761 Adamts5

-1.19785 0.006486391 AW143623 AW143623

-1.19567 0.002676576 NM_022392 Insig1

-1.18481 2.86373E-05 TC596776 TC596776

-1.18401 0.006881891 ENSRNOT00000038084 RGD1565847_predicted

-1.16755 0.007302799 AJ224441 AJ224441

-1.16428 0.000882961 NM_022392 Insig1

-1.1617 0.007843637 A_44_P356222 A_44_P356222

-1.1475 0.007020374 NM_022392 Insig1

-1.14298 0.005791512 TC585113 TC585113

-1.14176 0.001994632 XM_001075770 LOC315676

-1.13536 0.006764841 NM_001013114 Hagh1

-1.13191 0.000698653 NM_031612 Apln

-1.12812 0.000854771 XM_224209 RGD1562035_predicted

-1.12617 0.007279174 NM_133521 Fbxo32

-1.11105 0.000190947 NM_053960 Ccr5

-1.10605 0.002093844 NM_022863 Ireb2

-1.10374 0.000570894 TC605419 TC605419

-1.10096 0.003550257 NM_133540 Nkg7

-1.10095 0.003481025 XM_346210 XM_346210

-1.09994 0.000593059 ENSRNOT00000027339 Cd248_predicted

-1.09942 0.009077147 ENSRNOT00000009650 Oit1_predicted

-1.0965 0.001359559 TC576556 TC576556

-1.09641 0.001989181 ENSRNOT00000045948 ENSRNOT00000045948

-1.09577 0.009080899 Y00090 Spn

-1.0953 0.001772815 XM_343404 RGD1565253_predicted

-1.09514 0.002386904 NM_001024326 LOC500088

-1.09424 0.005880418 NM_013057 F3

-1.09393 0.000458768 DY470931 DY470931

-1.09267 0.000959282 TC588677 TC588677

-1.09092 0.001638994 NM_022269 Daf1

-1.08945 0.002699646 TC614444 TC614444

-1.08836 0.000111064 ENSRNOT00000025036 LOC362012

-1.0835 0.005584047 DV725094 DV725094

-1.08252 0.000721795 ENSRNOT00000025036 LOC362012

-1.0807 0.001395509 A_44_P776182 A_44_P776182

-1.08033 0.007250386 NM_053415 Cxcr3

-1.0789 0.001798493 XM_214519 RGD1563437_predicted

-1.07786 0.00867848 C0396111 C0396111

-1.0772 0.002277354 AW917764 AW917764

-1.07425 0.005822728 C0567301 Rap2b

-1.07272 0.001088385 ENSRNOT00000023202 RGD1310800_predicted

-1.07235 0.008117527 NM_031116 Ccl5

-1.06907 0.002236431 NM_030586 Cyb5b

-1.06459 0.003071931 ENSRNOT00000051612 Ttk_predicted

-1.05862 0.004506961 A_44_P217633 A_44_P217633

-1.05616 0.003323004 NM_017136 Sqle

-1.05559 0.002451388 NM_031976 Prkab1

-1.05241 8.58075E-05 NM_012578 Hlf0

-1.04657 0.007199199 ENSRNOT00000043182 Mcnt114

-1.04647 0.000767376 ENSRNOT00000014970 Cpa3

-1.03681 0.0083888 TC596388 TC596388

-1.03478 0.001603907 ENSRNOT00000048256 ENSRNOT00000048256

-1.03313 0.000102229 NM_023104 Aacs

-1.03258 0.002295588 BF555751 BF555751

-1.03124 0.006145413 NM_012845 Ms4a2

-1.03023 0.006854574 ENSRNOT00000046852 ENSRNOT00000046852

-1.02926 0.005311662 XM_573949 RGD1561519_predicted

-1.02773 0.00845091 NM_017272 Aldhla7

-1.02255 0.003875096 TC615466 TC615466

-1.02187 0.00341075 ENSRNOT00000060360 ENSRNOT00000060360

-1.02066 0.005109766 XM_230607 Adam33_predicted

-1.01853 0.008995335 ENSRNOT00000018986 Rab11fip4_predicted

-1.00724 0.004156022 NM_139194 Tnfrsf6

-1.00589 0.00297636 BG666843 BG666843

-1.00267 0.003668109 NM_019321 Mcpt4

-1.00208 0.00094687 AW920064 AW920064

-1.00092 0.006809017 NM_012907 Apobec1

-1.00044 0.002678691 TC624655 TC624655

6.小肠组织HSP70 mRNA

结果如图8和9所示，C：常温对照组，S：高温组，N＝6；高温组十二指肠、空肠、回肠HSPmRNA/β-actin mRNA比值均显著高于对照组。

7.大鼠暑热证芯片预测准确率

通过大鼠生理指标、血清激素指标、肠道形态学观察以及HSPs验证检验大鼠基因芯片预测准确率，结果表明按照以下评价体系其准确率可达达85％以上，单独考察HSP70、HSP27、HSP105、HSP8、Dbp、Per2、Cyp1a2、P4ha1、Scd1、TC608617、P4ha1、LOC246266、LOC286989、SGLT1、Scd、Csf2、Il22ra2、RT1-Bb、Spn、Lcn2、Ripk3、Dnaja1、和Ddit3基因，其准确率达100％。

基因芯片检测结果的评价标准：

暑热证评判标准

1)热应激评价指标：HSP70、HSP27、HSP105、HSP8 上调2倍以上

2)行为调节：Dbp、Per2、Tef、Nrld1、Gprasp1、Apln 上调2倍以上

5)激素：Gnrh1、TC627619上调T检验＜0.01；Tnfrsf6下调T检验＜0.01

7)应激损伤修复Dnaja1、Ddit3，Bag3、Angptl4、Ank3、Gnrh1、Tesk2、Cryab、Ptdsr、Bcl6 predicted、Fxr1h、Dap、Trib3，Reg1、Apln、Ttk_predicted、Ms4a2上调，T检验＜0.01；Lcn2、Ripk3、Mmp9、Spn、Tnfrsf6，Reg1、Apln、Ttk_predicted、Ms4a2下调，T检验＜0.01

序列表

SOD：

1 AGGGCGTCAT TCACTTCGAG CAGAAGGCAA GCGGTGAACC AGTTGTGGTG TCAGGACAGA

61 TTACAGGATT AACTGAAGGC GAGCATGGGT TCCATGTCCA TCAATATGGG GACAATACAC

121 AAGGCTGTAC CACTGCAGGA CCTCATTTTA ATCCTCACTC TAAGAAACAT GGCGGTCCAG

181 CGGATGAAGA GAGGCATGTT GGAGACCTGG GCAATGTGGC TGCTGGAAAG GACGGTGTGG

241 CCAATGTGTC CATTGAAGAT CGTGTGATCT CACTCTCAGG AGAGCATTCC ATCATTGGCC

301 GTACTATGGT GGTCCACGAG AAACAAGATG ACTTGGGCAA AGGTGGAAAT GAAGAAAGTA

361 CAAAGACTGG AAATGCTGGA AGCCGCTTGG CTTGTGGTGT GATTGGGATT GCCCAATAAA

421 CATTCCCTAT GTGGTCTGAG TCTCAGACGT CATCTGCTGT CCTGCTAA

ALP：

1 GTTCTGAGGG CCCAGGTCCC ACAAGAGCCC ACAATGGACA GCCGGCTCCC CTCCCTTTGT

61 GGCCTGCCAC CTGGCCGCCC ACACTCAACG GGGAGGCCCA GGCAACCTCG AGCAGGAACA

121 CAAGTTTGCT ACCTGCCTCA CTTCCGCCCG GAACCCTCCG TGGGTCGGAT TCCTGCTGCC

181 GTTGTTTCTC TATTCACTGC CTTTTGGCCA GCAGGTGGGT TTCTCTTGGG CCGGCAGGAC

241 ACAGACTGCG CAGATTCCCA AAGCACCTTA TTTTTCTACC AAATATACTC TCCAGACCCT

301 GCAACCATCA TGGAACATTC CAGATCTGAC CTTCTCTCCC CfACCCCTTC TCTCTGGAAC

361 ACTGGGTCCC ATAGTCACAG CCAGTCCCTC AACCCAACCC TCCTGGAGAA GACCAGGTCT

421 GCTCAGGGTG AGACTTCCCA GGAA

GPX：

1 TGAATTCCCT CAAGTATGTC CGACCCGGTG GTGGGTTCGA GCCCAACTTT ACATTGTTTG

61 AGAAGTGCGA GGTGAATGGT GAGAAGGCTC ACCCGCTCTT TACCTTCCTG CGGAATGCCT

121 TGCCAGCACC CAGTGACGAT CCCACTGCGC TCATGACCGA CCCCAAGTAC ATCATTTGGT

181 CCCCGGTGTG CCGCAACGAC ATTTCCTGGA ACTTTGAGAA GTTCCTGGTA GGTCCAGACG

241 GTGTTCCAGT GCGCAGATAC AGCAGGCGCT TTCGCACCAT CGACATCGAA CCCGATATAG

301 AAGCCCTGCT GTCCAAGCAG CCTAGCAACC CCTAAGGCAT TCCTGGTATC TGGGCTTGGT

361 GATGGCTGGC TGCCCTCCGG GGGGAGGTTT TTCCATGACG GTGTTTCCTC TAAATTTACA

421 TGGAGAAACA CCTGATTTCC AGAAAAATCC CCTTCAGATG GGCGCTGGTC TCGTCCATTC

481 CCGATGCCTT TACGCCTAAA GAAAGGCGGT TTCACCACTA AGAAT

SGLT1

1 AGTCATGAGG CACCAGGTCT CCTGAGACCC CTTACACTGC CCTCATTGAA GTTATCTCTC

61 AGCCCATGAT TCTAGGAAAG AAAAGTATTT CTAAAATAAA ATCCACGACT TCCAGAGATC

121 CTGTAAGACA GCTCTGAGAG ATCAATGTAA CTGCCAGCAC CTTCTTCATT TCCATGAAGT

181 GAGACACAGA ACAGAAATAG TTTTAAACGT ATGCTCCTGG G

CORT：

1 CCAGGACAGT GTGCAGGATG CCACAGGCGG GAGGAGGACC GGCCTTCTGA CTTTCCTTGC

61 CTGGTGGCAT GAGTGGGCTT CCCAAGACAG CTCCAGCACC GCTTTCGAAG GGGGTACCCC

121 GGAGCTGTCT AAGCGGCAGG AAAGACCACC CCTCCAGCAG CCCCCACACC GGGATAAAAA

181 GCCCTGCAAG AACTTCTTCT GGAAAACCTT CTCCTCGTGC AAGTAGCCCG AGCCTGACCG

241 GAGCCTGACC GGCCACCCTG TGAATGCAGC CGTGGCCTGA ATAAA

HSP70：

1 GAGCGGGTGT GCAACCCGAT CATCAGCGGG CTGTANCAGG GTGCNGGTGC TCCCGGGGCT

61 GGGGGCTTCG GGGCCCAGGC GCCCAAGGGA GGCTCTGGGT CGGGGCCCAC CATCGAGGAG

121 GTGGATTAGA GGCTTTTCTG GCTCTCAGGG TGTTGGCTAG AGACAGACTC TTGATGGCTG

181 CTGGTGCACG ATTCTTATCA AGTTACTCCT TCTCTCCGGA GTTCAGTTTA AAGTTACAGC

241 CTTTTATACG GTAATTGATT TGAGTTTGTT ACATTTTGTA TGCTCGTGGG TTTTTTATAT

301 ATTCAAATTA AGGTTGCATG TTCTTTGCGT TTAATCTAAG TAGCTGTGTA AAAATGGTGT

361 TTCCTTCCTG CGAACACCTC AGCACTGCCA CCCTGTGTAC AGTTTTTTCC TTGCATCCCT

421 ACAAACTGAG A

CCK：

1 GCCGGTAGTC CCTGTAGAAG CTGTGGACCC TATGGAGCAG CGGGCGGAGG AGGCGCCCCG

61 AAGGCAGCTG AGGGCTGTGC TCCGACCGGA CAGCGAGCCC CGAGCGCGCC TGGGCGCACT

121 GCTAGCCCGA TACATCCAGC AGGTCCGCAA AGCTCCCTCT GGCCGCATGT CCGTTCTTAA

181 GAACCTGCAG GGCCTGGACC CTAGCCACAG GATAAGTGAC CGGGACTACA TGGGCTGGAT

241 GGATTTCGGC CGGCGCAGTG CTGAGGACTA CGAATACCCA TCGTAGTGGG CCAGCCTCTC

301 GGCGCTGCTT GGAGGAGGCG GAATGAGAAA ACAACCACGC ACACGACCCC TCGCCTCTAA

361 TGTTTGACAT TTTGAGTTTA TTTATTAAGT CCCCAATGTG AAATCTGTCT GTTCAGAGTG

421 TGCAATGCAG CCACACACCT CAGCCCAGCT GAGCGGTGGG AAGGCAATGT TTCCCTCTGG

481 TGGCTCCCAG ACCTAATGTT GCTAT

SS：

1 ATCGTCCTGG CTTTGGGCGG TGTCACCGGG GCGCCCTCGG ACCCCAGACT CCGTCAGTTT

61 CTGCAGAAGT CTCTGGCGGC TGCCACCGGG AAACAGGAAC TGGCCAAGTA CTTCTTGGCA

121 GAACTGCTGT CCGAGCCCAA CCAGACAGAG AACGATGCCC TGGAGCCTGA GGATTTGCCC

181 CAGGCAGCTG AGCAGGACGA GATGAGGCTG GAGCTGCAGA GGTCTGCCAA CTCGAACCCA

241 GCCATGGCAC CCCGGGAACG CAAAGCTGGC TGCAAGAACT TCTTCTGGAA GACATTCACA

301 TCCTGTTAGC TTTAATATTG TTGTCTCAGC CAGACCTCTG ATCCCTCTCC TCCAAATCCC

361 ATATCTCTTC CTTAACTCCC AGCCCCCCCC CCNAATGCTC AACTAGACCC TGCGTTAGAA

GAS

1 GACAAGATGC CTCGACTGTG TGTGTGCATG CTAGTCTTAG TGCTGGCTCT AGCTACCTTC

61 TCGGAAGCTT CTTGGAAACC TCGCTCCCAG CTACAGGATG CATCCTCTGG ACCAAGGACC

121 AATGGGGCCC TGGAACAGCA CCAGCTAGAA AAGCTGGGCC CAGCCTCTCA CCATCGGAGA

181 CAGCTGGGGC CCCAAGGTCC GCAACACTTC ATAGCAGATC TGTCCAAGAA ACAGAGGCCA

241 CCAATGGAGG AAGAAGAGGA AGCATACGGA TGGATGGACT TTGGTCGCCG TAGCNCTGAG

301 GAAGAAGACC AGTATAACTA GCAATGCTCT TCCAGAGCCC AGCCATCTCC AGCCACCCCC

361 AGCTCAGTCC TTACAAAACA TA

GIP

1 ATGGTGGCTT TGAAGACCTG CTCTCTGCTG CTGGTGCTCC TGTTCCTGGC TGTCGGGCTG

61 GGAGAAAAAG AAGAGGTTGA GTTCCGATCC CATGCTAAAT TTGCTGGCCC CCGACCACGA

121 GGCCCAAGGT ATGCAGAGGG GACTTTCATC AGTGATTACA GCATCGCCAT GGACAAGATC

181 CGCCAACAAG ACTTTGTGAA CTGGCTTCTG GCCCAGAAGG GGAAGAAGAA TGACTGGAAA

241 CACAACCTCA CCCAGAGAGA GGCCCGGGCT TTGGAGCTGG CAGGACAATC TCAGAGAAAC

301 GAGGAGAAAG AGGCACAGGG GAGCTCTTTG CCCAAGAGCC TCAGTGATGA AGATGTGCTG

361 AGGGACCTTC TGATTCAAGA GCTACTGGCC TGGATGGCGG ACCAAGCAGA GCTCTGTCGA

421 CTGAGGTCCC AGTGACCGAC CTACCCCGGA GCAGGACTGG ACTCTGACCT TAGCTTGCTC

481 AGATCCTGCT TCTGCCCTGG TCCAAAGTCT CTGAGAGA

EGF

1 GACTGTTGGG CTCTTTTCCT TGTTGTCTCA GAAGAAATGG GTTAAAGCAG GCGATCANAT

61 GCTTTGTTGA TTGCACAGTA GATGATATGA TCTACATAGA TCTTAGCTCA CTCTCACGGA

121 AAGGCTGGAA CATTATAGAT GCTGCTAAGA TACACTGCAA GTGTGGCCCC TGCTCATAAT

181 TTTGCCTTCT GAATTGTGAT TAGTGAAAAT AATTGTAACT TAGAGTCCGA TTTATTCAGA

241 ATCAGAGCAT TTATTTTTAT ACTATGAAAA TCNTTGAATG AAGATATTTA ACTTTAAAAA

301 CATTTCCTAA GAGACAACAG TGTTTCTTAA TCATTGTCTT TTCTTCTTGC AGTCTTTCCC

361 AGTGAAAACG GTAAATTCTG CTGTTTGCAT A

IL-2：

1 AACTCGGAGC TCTGCAGCGT GTGTTGGATT TGACTCAAAG CAAAAGCTTT CACTTGGAAG

61 ACGCTGGAAA TTTCATCAGC AATATCAGAG TAACTGTTGT AAAACTAAAG GGCTCTGAAA

121 ACAAATTTGA GTGCCAATTC GATGATGAGC CAGCAACTGT GGTGGAATTT CTGAGGAGAT

181 GGATAGCCAT CTGTCAAAGC ATCATCTCAA CAATGACTCA GTAATTATGT GCCTCCTACT

241 TATAACACAC AAG

IL-4

1 GTTTGTACCA GACGTCCTTA CGGCAACAAG GAACACCACG GAGAACGAGC TCATCTGCAG

61 GGCTTCCAGG GTGCTTCGCA AATTTTACTT CCCACGTGAT GTACCTCCGT GCTTGAAGAA

121 CAAGTCTGGG GTTCTCGGTG AACTGAGGAA ACTCTGTAGA GGTGTCAGCG GTCTGAACTC

181 ACTGAGAAGC TGCACCGTGA ATGAGTCCAC GCTCACAACA CTGAA

IL-10

1 CAGAAATGAT CAAGTTTTAC CTGGTAGAAG TGATGCCCCA GGCAGAGAAC CATGGCCCAG

61 AAATCAAGGA GCATTTGAAT TCCCTGGGAG AGAAGCTGAA GACCCTCTGG ATACAGCTGC

121 GACGCTGTCA TCGATTTCTC CCCTGTGAGA ATAAAAGCAA GGCAGTGGAG CAGGTGAAGA

181 ATGATTTTAA TAAGCTCCAA GACAAAGGTG TCTACAAGGC CATGAATGAG TTTGACATCT

241 TCATCAACTG CATAGAAGCC TACGTGACAC TCAAAATGAA AAATTGAACC ACCCGGCNTC

301 TACTGGACTG CAGGACATAA ATAGAGCTTC TAAATCTGAT CCAGAGATCT TAGCTAACGG

361 GAGCAACTCC TTGGAAAACC TCGTTTGTAC CTCTCTCCAA AATATTTATT ACCTCTGATA

421 CCTCAG

IFN-γ

1 AAGGACGGTA ACACGAAAAT ACTTGAGAGC CAGATTATCT CTTTCTACCT CAGACTCTTT

61 GAAGTCTTGA AAGACAACCA GGCCATCAGC AACAACATAA GTGTCATCGA ATCGCACCTG

121 ATCACTAACT TCTTCAGCAA CAGTAAAGCA AAAAAGGATG CATTCATGAG CATCGCCAAG

181 TTCGAGGTGA ACAACCCACA GATCCAGCAC AAAGCTGTCA ATGAACTCAT CAGAGTGATT

241 CACCAGCTGT CACCAGAATC TAGCCTAAG

Claims

1.一种用于评价暑热证及中药药效的基因芯片，其特征在于其具有针对下述基因产生的RNA、cRNA或cDNA进行检测的探针：

1)热应激评价指标：HSP70、HSP27、HSP105、HSP8；

2)行为调节：Dbp、Per2、Tef、Nr1d1、Gprasp1、Apln；

3)物质代谢：Cyp1a2、P4ha1、Angptl4、Ca4、Plod1、Fmo2、Chdh、Pdk4、Lct、Slc2a5、Cyp4a12、Cryab、Lct、Ppara、Neu2、Dgat2；LOC246266、LOC286989、Noxo1_predicted、Scd1、Adh1、Haao、Mmp9、Ireb2、Sqle、Prkab1、Aacs、Aldh1a7、Apobec1：

4)酶：TC608617、P4ha1、Gucy2g、Enpep、Ca4、Chka、LOC246266、LOC286989、Scd1、Ripk3、Haao、Cma1

5)胃肠激素：Gnrh1、TC627619、1q52、Abcc2、Fkbp4、Lct、Nr4a3、Fkbp4；Tnfrsf6：

2.如权利要求1所述基因芯片，其特征在于，所述探针为相应基因的核酸序列、其互补序列，或者它们的片段。

3.一种试剂盒，其特征在于包括针对下述基因产生的RNA或表达产物测定的试剂：

1)热应激评价指标：HSP70、HSP27、HSP105、HSP8；

2)行为调节：Dbp、Per2、Tef、Nr1d1、Gprasp1、Apln；

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的盒为：

a)检测RNA的试剂盒：荧光定量PCR检测试剂盒，原位杂交及原位RT-PCR,Nouthern检测试剂盒；或

b)检测表达产物的试剂盒：ELISA试剂盒或抗体芯片试剂盒。