CN113330118A - 靶向card9的反义寡核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及与CARD9前mRNA内含子和外显子序列互补的反义LNA寡核苷酸(寡核苷酸)，它能够抑制CARD9蛋白的表达。抑制CARD9的表达对一系列医学疾病是有益的，包括炎症性肠病、胰腺炎、IgA肾病、原发性硬化性胆管炎、心血管疾病、癌症和糖尿病。

Description

靶向CARD9的反义寡核苷酸
以电子方式提交的序列表的引用
将在本申请中提交的电子提交的序列清单的内容(名称：P35118-WO 02-0499-WOSequence_Listing_CARD9.txt；大小：178,721字节；创建日期：2019年12月16日)参照其全部内容并入本文。
发明领域
本发明涉及与CARD9前mRNA序列互补的、能够抑制CARD9的表达的反义LNA寡核苷酸(寡聚体)。抑制CARD9的表达对一系列医学疾病是有益的，包括炎症性肠病(诸如克罗恩病和溃疡性结肠炎)、胰腺炎、IgA肾病、原发性硬化性胆管炎、心血管疾病、癌症和糖尿病。
背景技术
CARD9(胱天蛋白酶募集域蛋白9)是通过C型凝集素受体的抗真菌固有免疫信号通路的核心元件。它是CARD家族的一个成员，该家族通过激活NF-κB在固有免疫应答中发挥重要作用。CARD9介导促炎症细胞因子的产生，包括TNFα、IL-6和IL-1β，从而调控Th1和Th17细胞的反应。
CARD9与许多疾病和病症有关。例如，已经将CARD9的表达关联到心血管疾病、自身免疫性疾病、癌症和肥胖(Zhong等Cell Death and Disease(2018)9:52)。
此外，CARD9已被确定为与炎症性肠病(IBD)、强直性脊柱炎、原发性硬化性胆管炎和IgA肾病风险相关联的基因(Cao等，Immunity 2015 Oct 20；43(4):715-726)。
小分子抑制剂已被用于直接靶向CARD9，以确定使用小分子抑制剂来重现IBD中与保护作用相关的CARD9突变的抗炎功能的可行性(Leshchiner等，Proc Natl Acad SciUSA.2017 Oct 24；114(43):11392–11397)。
Yamamoto-Furusho表明，CARD9的表达可以差异性地区分活动期和缓解期的溃疡性结肠炎(UC)。因此，CARD9被提议作为用于UC患者中的治疗靶标(Journal ofInflammation(2018)15:13)。
此外，有研究结果表明CARD9的表达在严重急性胰腺炎(SAP)患者中是上调的。小干扰RNA(siRNA)被用来降低牛黄胆酸钠刺激的SAP大鼠中CARD9的表达水平。与未治疗组相比，接受siRNA治疗的队列显示胰腺损伤、中性粒细胞浸润、骨髓过氧化物酶活性和促炎症细胞因子显著减少。因此，CARD9被认为是用于急性胰腺炎治疗的靶标(Yang等J Cell MolMed.2016；21(6):1085-1093).
此外，CARD9被提议作为治疗中性粒细胞性皮肤病的靶点(Tartey等，The Journalof Immunology September 15,2018,201(6)1639-1644)。
我们分析了大量针对人类CARD9的LNA gapmer，并确定了目标位点、寡核苷酸序列和反义化合物，这些都是对CARD9表达的强力和有效的抑制剂。
发明目的
本发明鉴定了CARD9转录物(CARD9)的用于体外或体内反义抑制的区域，并提供了反义寡核苷酸，包括LNA gapmer寡核苷酸，其靶向CARD9前RNA或成熟mRNA的这些区域。本发明鉴定了抑制人CARD9的寡核苷酸，这些寡核苷酸在治疗一系列医学疾病中是有用的，包括炎症性肠病、胰腺炎、IgA肾病、原发性硬化性胆管炎、心血管疾病、癌症和糖尿病。
发明概述
本发明提供了一种反义寡核苷酸，长度为10-30个核苷酸，靶向哺乳动物CARD9(胱天蛋白酶募集域蛋白9)目标核酸，其中该反义寡核苷酸能够抑制哺乳动物CARD9在表达哺乳动物CARD9的细胞中的表达。哺乳动物CARD9靶核酸可以是，例如，人、猴、小鼠或猪的CARD9靶核酸。
因此，本发明提供了一种反义寡核苷酸，长度为10-30个核苷酸，靶向人CARD9目标核酸，其中该反义寡核苷酸能够在表达人CARD9的细胞中抑制人CARD9的表达。
本发明提供了一种反义寡核苷酸，长度为10-30个核苷酸，靶向哺乳动物(如人、猴、小鼠或猪)的CARD9目标核酸，其中所述反义寡核苷酸包括一个长度为10-30个核苷酸的连续核苷酸序列。其中，该连续核苷酸序列与选自由SEQ ID NO 1、2、3、4、5、7、8和9组成的组的序列有至少90％的互补性，例如完全互补。
本发明提供了一种反义寡核苷酸，长度为10-30个核苷酸，靶向人CARD9目标核酸，其中所述反义寡核苷酸包括长度为10-30个核苷酸的连续核苷酸序列，其中该连续核苷酸序列与SEQ ID NO 1至少90％互补，例如完全互补。
本发明提供了一种反义寡核苷酸，长度为10-30个核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包括长度为10-30个核苷酸的连续核苷酸序列，其中该连续核苷酸序列与SEQ ID NO 1至少90％互补，例如完全互补，其中该反义寡核苷酸能够在表达人CARD9的细胞中抑制人CARD9的表达。
本发明提供了一种LNA反义寡核苷酸，长度为10-30个核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包括长度为10-30个核苷酸的连续核苷酸序列，其中该连续核苷酸序列与SEQ ID NO 1至少90％互补，例如完全互补，其中该反义寡核苷酸能够在表达人CARD9的细胞中抑制人CARD9的表达。
本发明提供了一种gapmer反义寡核苷酸，长度为10-30个核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包括长度为10-30个核苷酸的连续核苷酸序列，其中该连续核苷酸序列与SEQ ID NO1至少90％互补，例如完全互补，其中该反义寡核苷酸能够在表达人CARD9的细胞中抑制人CARD9的表达。
本发明提供了一种LNA gapmer反义寡核苷酸，长度为10-30个核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包括长度为10-30个核苷酸的连续核苷酸序列，其中该连续核苷酸序列与SEQID NO 1至少90％互补，例如完全互补，其中该反义寡核苷酸能够在表达人CARD9的细胞中抑制人CARD9的表达。
本发明提供了一种反义寡核苷酸，长度为10-30个核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包括长度为10-30个核苷酸的连续核苷酸序列，其中该连续核苷酸序列与选自SEQ ID NO10至SEQ ID NO:69组成的组的序列至少90％互补，例如完全互补。69，其中反义寡核苷酸能够在表达人CARD9的细胞中抑制人CARD9的表达。
本发明提供了一种LNA反义寡核苷酸，长度为10-30个核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包括长度为10-30个核苷酸的连续核苷酸序列，其中该连续核苷酸序列与选自SEQ IDNO 10至SEQ ID NO.69组成的组的序列至少90％互补，例如完全互补，其中反义寡核苷酸能够在表达人CARD9的细胞中抑制人CARD9的表达。
本发明提供了一种gapmer反义寡核苷酸，长度为10-30个核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包括长度为10-30个核苷酸的连续核苷酸序列，其中该连续核苷酸序列与选自SEQID NO 10至SEQ ID NO.69组成的组的序列至少90％互补，例如完全互补，其中反义寡核苷酸能够在表达人CARD9的细胞中抑制人CARD9的表达。
本发明提供了一种LNA gapmer反义寡核苷酸，长度为10-30个核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包括长度为10-30个核苷酸的连续核苷酸序列，其中该连续核苷酸序列与选自SEQ ID NO 10至SEQ ID NO.69组成的组的序列至少90％互补，例如完全互补，其中反义寡核苷酸能够在表达人CARD9的细胞中抑制人CARD9的表达。
此处提到的或要求的本发明的寡核苷酸可以是药学上可接受的盐的形式。
本发明提供了一种缀合物，其包含本发明的反义寡核苷酸和与所述寡核苷酸共价连接的至少一个缀合物部分。
本发明提供了一种药物组合物，包括本发明的寡核苷酸或缀合物和药学上可接受的稀释剂、溶剂、载体、盐和/或佐剂。
本发明提供了一种用于调节表达CARD9的靶细胞中CARD9表达的体内或体外方法，该方法包括给所述细胞施用有效量的本发明的寡核苷酸或缀合物或药物组合物。
本发明提供了用于治疗或预防疾病的方法，包括向患有或易患该疾病的对象施用治疗或预防有效量的本发明的寡核苷酸、缀合物或药物组合物。
在一些实施方案中，该疾病选自由炎症性肠病、胰腺炎、IgA肾病、原发性硬化性胆管炎、心血管疾病、癌症和糖尿病组成的组。
本发明提供了本发明的寡核苷酸、缀合物或药物组合物用于医学用途。
本发明提供了本发明的寡核苷酸、缀合物或药物组合物用于治疗或预防选自炎症性肠病、胰腺炎、IgA肾病、原发性硬化性胆管炎、心血管疾病、癌症和糖尿病的疾病的用途。
本发明提供了本发明的寡核苷酸、结合物或药物组合物的用途，用于制备用于治疗或预防选自炎症性肠病、胰腺炎、IgA肾病、原发性硬化性胆管炎、心血管疾病、癌症和糖尿病的疾病的药物。
定义
寡核苷酸
如本文所用，将术语“寡核苷酸”定义为本领域技术人员通常理解的包含两个或多个共价连接的核苷的分子。此类共价键合的核苷也可以称作核酸分子或寡聚体。通常在实验室中通过固相化学合成，然后纯化来制备寡核苷酸。当涉及寡核苷酸的序列时，是指共价连接的核苷酸或核苷的核碱基部分的序列或顺序或其修饰。本发明的寡核苷酸是人造的，并且是化学合成的，并且通常是纯化或分离的。本发明的寡核苷酸可以包含一个或多个修饰的核苷或核苷酸。
反义寡核苷酸
如本文所用，将术语“反义寡核苷酸”定义为能够通过与靶核酸，特别是与靶核酸上的连续序列杂交来调节靶基因表达的寡核苷酸。该反义寡核苷酸不一定为双链的并且因此不是siRNA或shRNA。优选地，本发明的反义寡核苷酸为单链的。应当理解，本发明的单链寡核苷酸可以形成发夹或分子间双链体结构(相同寡核苷酸的两个分子之间的双链体)，只要分子内或分子间的自补度低于寡核苷酸全长的50％。
连续核苷酸序列
术语“连续核苷酸序列”是指与靶核酸互补的寡核苷酸区。该术语在本文中与术语“连续核碱基序列”和术语“寡核苷酸基元序列”可以互换使用。在一些实施方案中，寡核苷酸的全部核苷酸构成连续核苷酸序列。在一些实施方案中，寡核苷酸包含连续核苷酸序列，例如F-G-F’gapmer区，并且可以任选包含另外的核苷酸，例如可以用于使官能团连接至连续核苷酸序列的核苷酸接头区。所述核苷酸接头区可以与靶核酸互补，也可以不与之互补。有利地，连续核苷酸序列与靶核酸100％互补。
核苷酸
核苷酸是寡核苷酸和多核苷酸的结构单元，并且对于本发明的目的，其包括天然存在和非天然存在的核苷酸。实际上，核苷酸，例如DNA和RNA核苷酸包含核糖部分、核碱基部分和一个或多个磷酸酯基团(核苷中不存在)。核苷和核苷酸还可以互换地称作“单元”或“单体”。
修饰的核苷
如本文所用，术语“修饰的核苷”或“核苷修饰”是指与等效DNA或RNA核苷相比通过引入一个或多个糖部分或(核)碱基部分修饰而修饰核苷。在优选的实施方案中，修饰的核苷包含修饰的糖部分。术语修饰的核苷在本文中也可以与术语“核苷类似物”或修饰的“单元”或修饰的“单体”互换使用。具有未修饰的DNA或RNA糖部分的核苷在本文中称作DNA或RNA核苷。在DNA或RNA核苷的碱基区中具有修饰的核苷通常仍然称作DNA或RNA，条件是它们允许沃森克里克碱基配对。
修饰的核苷间键
将术语“修饰的核苷间键”定义为本领域技术人员通常理解的非磷酸二酯(PO)键的键，其将两个核苷共价偶联在一起。因此，本发明的寡核苷酸可以包含修饰的核苷间键。在一些实施方案中，修饰的核苷间键与磷酸二酯键相比增加寡核苷酸的核酸酶抗性。对于天然存在的寡核苷酸，核苷间键包括在相邻核苷之间生成磷酸二酯键的磷酸酯基。修饰的核苷间键特别用于稳定寡核苷酸，以便体内应用，并且可以用于防止本发明的寡核苷酸中的DNA或RNA核苷的区上的核酸酶裂解，例如在gapmer寡核苷酸的gap区内，以及在修饰的核苷的区内，例如F和F’区。
在一个实施方案中，寡核苷酸包含由天然磷酸二酯修饰的一个或多个核苷间键，此类一个或多个修饰的核苷间键例如对核酸酶攻击更具有抗性。核酸酶抗性可以通过温育血清中的寡核苷酸或通过使用核酸酶抗性测定法(例如蛇毒磷酸二酯酶(SVPD))来测定，两种方法均为本领域众所周知的。能够增强寡核苷酸核酸酶抗性的核苷间键称作核酸酶抗性核苷间键。在一些实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中至少50％的核苷间键被修饰，例如寡核苷酸或其连续核苷酸序列中至少60％、例如至少70％、例如至少80或例如至少90％的核苷间键为核酸酶抗性核苷间键。在一些实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的全部核苷间键为核酸酶抗性核苷间键。应当认识到，在一些实施方案中，连接本发明的寡核苷酸与非核苷酸官能团例如缀合物的核苷可以为磷酸二酯。
优选的修饰的核苷间键为硫代磷酸酯。
硫代磷酸酯核苷间键是特别有用的，这归因于核酸酶抗性、有益的药代动力学和易于制备。在一些实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中至少50％的核苷间键为硫代磷酸酯，例如寡核苷酸或其连续核苷酸序列中至少60％、例如至少70％、例如至少80％或例如至少90％的核苷间键为硫代磷酸酯。在一些实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的全部核苷间键为硫代磷酸酯。
核酸酶抗性键、例如硫代磷酸酯键特别用于寡核苷酸区，例如gapmer的G区，当与靶核酸形成双链体时，该寡核苷酸区能够募集核酸酶。然而，硫代磷酸酯键还可以用于非核酸酶募集区和/或亲和增强区，例如gapmer的F和F’区。在一些实施方案中，gapmer寡核苷酸可以包含F或F’区或F和F’区中的一个或多个磷酸二酯键，G区中的核苷间键可以完全为硫代磷酸酯。
有利的是，寡核苷酸的连续核苷酸序列中的所有核苷间键为硫代磷酸酯键。
应当认识到，如EP 2 742 135中所公开的，根据EP 2 742 135，反义寡核苷酸可以包含另外的核苷间键(非磷酸二酯和硫代磷酸酯)，例如烷基膦酸酯/甲基膦酸酯核苷间键可以例如在另外的DNA硫代磷酸酯gap区中是耐受的。
核碱基
术语核碱基包括存在于核苷和核苷酸中的在核酸杂交中形成氢键的嘌呤(例如腺嘌呤和鸟嘌呤)和嘧啶(例如尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)部分。在本发明的上下文中，术语核碱基还涵盖修饰的核碱基，其可以不同于天然存在的核碱基，但是在核酸杂交期间是功能性的。在本文上下文中，“核碱基”是指天然存在的核碱基，例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤，以及非天然存在的变体。此类变体例如描述在Hirao等人(2012)，Accounts of Chemical Research，第45卷，第2055页和Bergstrom(2009)，Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry，增刊，37，1.4.1中。
在一些实施方案中，核碱基部分通过将嘌呤或嘧啶改变成修饰的嘌呤或嘧啶进行修饰，例如取代的嘌呤或取代的嘧啶，例如选自异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑(thiozolo)-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、5-溴脲嘧啶、5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫代-脲嘧啶、2’硫代-胸腺嘧啶、肌苷、二氨基嘌呤、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤的核碱基。
核碱基部分可以用相应核碱基的字母代码表示，例如A、T、G、C或U，其中每个字母可以任选包括等效功能的修饰的核碱基。例如，在示例性的寡核苷酸中，核碱基部分选自A、T、G、C和5-甲基胞嘧啶。任选地，对于LNA gapmer，可以使用5-甲基胞嘧啶LNA核苷。
修饰的寡核苷酸
术语修饰的寡核苷酸描述包含一个或多个糖-修饰的核苷和/或修饰的核苷间键的寡核苷酸。术语“嵌合”寡核苷酸为已在文献中用于描述带有修饰的核苷的寡核苷酸的术语。
互补
术语“互补”描述核苷/核苷酸的沃森-克里克碱基配对的能力。沃森-克里克碱基配对是鸟嘌呤(G)-胞嘧啶(C)和腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。应当理解，寡核苷酸可以包含具有修饰的核碱基的核苷，例如5-甲基胞嘧啶通常用于替代胞嘧啶，并且因此术语互补涵盖未修饰的与修饰的核碱基之间的沃森克里克碱基配对(参见例如Hirao等人(2012)，Accounts of Chemical Research，第45卷，第2055页和Bergstrom(2009)，CurrentProtocols in Nucleic Acid Chemistry，增刊，37，1.4.1)。
本文所用的术语"互补％"是指在一个核酸分子(如寡核苷酸)中的连续核苷酸序列中，在给定的位置上，与单独的核酸分子(如靶核酸或靶序列)的给定位置上的连续核苷酸序列互补(即形成沃森-克里克碱基对)的核苷酸数量，以百分比计。百分比的计算方法是计数在两个序列之间形成配对的比对碱基的数量(当与靶序列5’-3’和寡核苷酸序列3’-5’比对时)，除以寡核苷酸中的核苷酸总数并乘以100。在此类比较中，未比对上(形成碱基对)的核碱基/核苷酸称为错配。
优选地，在计算连续核苷酸序列的互补％时，不允许插入和缺失。
术语“完全互补”是指100％互补。
同一性
如本文所用，术语“同一性”是指与参比序列(例如，序列基元)相同的跨连续核苷酸序列的核酸分子(例如寡核苷酸)中连续核苷酸序列的核苷酸比例(以百分比表示)。因此，同一性百分比通过计数两个序列(例如在本发明化合物的连续核苷酸序列和参比序列中)之间相同(匹配)的比对碱基数除以被比对的区域中的核苷酸总数，再乘以100计算。因此，同一性百分比＝(匹配数×100)/比对区域的长度(例如连续核苷酸序列)。计算连续核苷酸序列的同一性百分比中不允许插入和缺失。应当理解，在测定同一性时，只要保持形成Watson Crick碱基配对的核碱基的功能能力，就可以不考虑核碱基的化学修饰(例如对于计算同一性％，5-甲基胞嘧啶视为与胞嘧啶相同)。
杂交
如本文所用，术语“杂交”或“与……杂交”应理解为在相对链上的碱基对之间形成氢键的两条核酸链(例如寡核苷酸和靶核酸)，从而形成双链体。两条核酸链之间的结合亲和力是杂交的强度。通常用解链温度(Tm)来描述，将解链温度(Tm)定义为一半的寡核苷酸与靶核酸双链化时的温度。在生理条件下，Tm并非与亲和力严格成正比(Mergny和Lacroix，2003，Oligonucleotide，13：515-537)。标准状态的吉布斯自由能ΔG°是结合亲和力的更准确表示，并且通过ΔG°＝-RTln(Kd)与反应的解离常数(Kd)相关，其中R为气体常数，T为绝对温度。因此，寡核苷酸与靶核酸之间的反应的非常低的ΔG°反映了寡核苷酸与靶核酸之间的强杂交。ΔG°是与反应有关的能量，其中水溶液浓度为1M，pH为7，并且温度为37℃。寡核苷酸与靶核酸的杂交为自发反应，并且对于自发反应，ΔG°小于零。ΔG°可以通过试验来测量，例如通过使用如Hansen等人，1965，Chem.Comm.，36-38和Holdgate等人，2005，DrugDiscov Today所述的等温滴定量热(ITC)法。本领域技术人员知晓可用于ΔG°测量的商业设备。ΔG°还可以使用SantaLucia，1998，Proc Natl Acad Sci USA.，95：1460-1465描述的最邻近模型，应用Sugimoto等人，1995，Biochemistry，34：11211-11216和McTigue等人，2004，Biochemistry，43：5388-5405描述的适当推导的热力学参数在数值上估计。为了通过杂交调节其预期的核酸靶标的可能性，本发明的寡核苷酸与靶核酸杂交，对于长度为10-30个核苷酸的寡核苷酸，其ΔG°的估计值低于-10kcal。在一些实施方案中，杂交的程度或强度通过标准状态吉布斯自由能ΔG°测量。寡核苷酸可以与靶核酸杂交，对于长度为8-30个核苷酸的寡核苷酸，估计的ΔG°值低于-10kcal的范围，例如低于-15kcal，例如低于-20kcal，例如低于-25kcal。在一些实施方案中，寡核苷酸与靶核酸杂交，其估计的ΔG°值为-10至-60kcal，例如-12至-40kcal，例如-15至-30kcal或-16至-27kcal，例如-18至-25kcal。
靶核酸(目标核酸)
根据本发明，靶核酸为编码哺乳动物CARD9蛋白的核酸，并且可以例如为基因、RNA、CARD9 mRNA和前-mRNA、成熟mRNA或cDNA序列。因此，目标可以称作CARD9靶核酸。
在一些实施方案中，靶核酸编码人CARD9蛋白，如本文提供的编码人CARD9的基因的前mRNA或mRNA序列为SEQ ID NO 1、2或9。因此，靶核酸可以选自由SEQ ID NO 1、SEQ IDNO 2和SEQ ID NO 9组成的组。
在一些实施方案中，靶核酸编码小鼠CARD9蛋白。合适地，编码小鼠CARD9蛋白的靶核酸包含如SEQ ID NO:5或6所示的序列。
在一些实施方案中，靶核酸编码猪CARD9蛋白。合适地，编码猪CARD9蛋白的靶核酸包含如SEQ ID NO:7或8所示的序列。
在一些实施方案中，靶核酸编码食蟹猴CARD9蛋白。合适地，编码食蟹猴CARD9蛋白的靶核酸包含SEQ ID NO:3或4所示的序列。
如果在研究或诊断中使用本发明的寡核苷酸，则靶核酸可以是衍生自DNA或RNA的cDNA或合成核酸。
对于体内或体外应用，本发明的寡核苷酸通常能够抑制表达CARD9靶核酸的细胞中CARD9靶核酸的表达。本发明的寡核苷酸的核碱基的连续序列通常与CARD9靶核酸互补，正如通过寡核苷酸长度测定的，任选除外一个或两个错配，并且任选排除基于核苷酸的区，该区可以使寡核苷酸连接至任选的官能团，例如缀合物或其它非互补末端核苷酸(例如D’或D”区)。靶核酸是编码哺乳动物CARD9蛋白，诸如人CARD9的信使RNA，如成熟mRNA或前mRNA，例如人CARD9前mRNA序列，诸如公开为SEQ ID NO 1的，或CARD9成熟mRNA，诸如公开为SEQ ID NO 2或9的。此外，靶核酸可以是小鼠CARD9前mRNA序列，诸如公开为SEQ ID NO 5的，或小鼠CARD9成熟mRNA，如公开为SEQ ID NO 6的。此外，靶核酸可以是猪CARD9前mRNA序列，如公开为SEQ ID NO 7的，或猪CARD9成熟mRNA，如公开为SEQ ID NO 8的。此外，靶核酸可以是食蟹猴CARD9前mRNA序列，如公开为SEQ ID NO 3的，或食蟹猴CARD9成熟mRNA，如公开为SEQ ID NO 4的。SEQ ID NO 1-9是DNA序列——应当理解为靶RNA序列用尿嘧啶(U)碱基代替胸腺嘧啶碱基(T)。
Figure BDA0003124835650000111
Figure BDA0003124835650000121
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸靶向SEQ ID NO 1。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸靶向SEQ ID NO 2。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸靶向SEQ ID NO 9。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸靶向SEQ ID NO 3。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸靶向SEQ ID NO 4。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸靶向SEQ ID NO 5。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸靶向SEQ ID NO 6。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸靶向SEQ ID NO 7。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸靶向SEQ ID NO 8。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸靶向SEQ ID NO 1、2和9。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸靶向SEQ ID NO 1和2。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸靶向SEQ ID NO 1和3。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸靶向SEQ ID NO 1和5。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸靶向SEQ ID NO 1和7。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸靶向SEQ ID NO 1和9。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸靶向SEQ ID NO 3和4。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸靶向SEQ ID NO 5和6。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸靶向SEQ ID NO 7和8。
靶序列
如本文所用，术语“靶序列”是指存在于靶核酸中的核苷酸序列，其包含核碱基序列，其与本发明的寡核苷酸互补。在一些实施方案中，靶序列由靶核酸上的区组成，其与本发明的寡核苷酸的连续核苷酸序列互补。
在此提供了许多靶序列区域，如人类CARD9前mRNA(以SEQ ID NO 1为参考)的区域所定义的，这些区域可被本发明的寡核苷酸靶向。
在一些实施方案中，靶序列长于单一寡核苷酸的互补序列，并且可以例如表示由本发明的几种寡核苷酸靶向的靶核酸的优选区。
本发明的寡核苷酸包括一个与靶核酸互补或杂交的连续核苷酸序列，诸如靶核酸的子序列，诸如本文所述的靶序列。
寡核苷酸包括一个与靶核酸分子中存在的靶序列互补的连续核苷酸序列。连续核苷酸序列(并且从而靶序列也)包括至少10个连续的核苷酸，诸如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个连续核苷酸，诸如从12-25，诸如从14-18个连续的核苷酸。
靶序列区域
本发明人已经确定了有效的可被本发明的寡核苷酸靶向的CARD9靶核酸的序列。
可被本发明的寡核苷酸靶向的目标核酸的核酸序列见下表。
表1：合适的靶核酸
Figure BDA0003124835650000131
Figure BDA0003124835650000141
Figure BDA0003124835650000151
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 10。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 11。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 12。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 13。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 14。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 15。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 16。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 17。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 18。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 19。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 20。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 21。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 22。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 23。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 24。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 25。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 26。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 27。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 28。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 29。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 30。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 31。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 32。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 33。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 34。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 35。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 36。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 37。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 38。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 39。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 40。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 41。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 42。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 43。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 44。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 45。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 46。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 47。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 48。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 49。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 50。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 51。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 52。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 53。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 54。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 55。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 56。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 57。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 58。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 59。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 60。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 61。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 62。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 63。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 64。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 65。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 66。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 67。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 68。
在一些实施方案中，靶序列是SEQ ID NO 69。
在另一个方面，本发明提供了一种反义寡核苷酸，长度为10-30个核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含长度为10-30个核苷酸的连续核苷酸序列，其中该连续核苷酸序列与SEQ ID NO 1的外显子区域至少90％互补，例如完全互补，该外显子区域选自Exon 1-Exon_13组成的组。外显子1至13(Ex_1至Ex_13)的位置在下表中提供。
Figure BDA0003124835650000171
Figure BDA0003124835650000181
在另一个方面，本发明提供了一种反义寡核苷酸，长度为10-30个核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包括长度为10-30个核苷酸的连续核苷酸序列，其中该连续核苷酸序列与SEQ ID NO 1的内含子区域至少90％互补，例如完全互补，该内含子区域选自Intron_1-Intron_12组成的组。内含子1至12(Int_1至Int_12)的位置在下表中提供。
Figure BDA0003124835650000182
在另一个方面，本发明提供了一种反义寡核苷酸，长度为10-30个核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包括长度为10-30个核苷酸的连续核苷酸序列，其中该连续核苷酸序列与SEQ ID NO 1的一个区域至少90％互补，例如完全互补，所述区域选自由以下组成的组：1-16；22-48；51-72；74-86。100-114；123-165；229-274；314-328；330-342；344-360；371-403；432-
471；477-491；495-507；534-548；576-595；610-622；636-664；674-720；756-775；785-798；800-814；818-849；851-865；868-880；896-937；948-978；990-1009；1012-1042；1056-1078；1097-1130；1132-1144；1173-1186；1195-1209；1211-1233；1259-1284；1299-1311；1335-1350；1352-1366；1384-1401；1403-1422；1424-1446；1448-1473；1485-1522；1537-1556；1580-1596；1598-1623；1628-1661；1670-1686；1700-1731；1733-1752；1764-1794；1805-1828；1841-1874；1876-1910；1918-1942；1975-1994；2009-2036；2055-2078；2110-2126；2128-2152；2154-2206；2208-2221；2230-2287；2301-2320；2322-2338；2340-2371；2396-2418；2420-2432；2435-2483；2485-2506；2528-2576；2578-2633；2635-2693；2695-2732；2734-2783；2806-2849；2890-2902；2904-2924；2936-2958；2989-3012；3014-3054；3056-3073；3075-3109；3111-3169；3204-3306；3308-3402；3441-3478；3667-3695；3697-3714；3746-3773；3775-3800；3802-3847；3858-3883；3885-3913；3924-3940；3955-3969；3971-3983；3995-4013；4019-4098；4107-4133；4138-4156；4162-4178；4192-4206；4209-4228；4244-4269；4271-4288；4312-4347；4375-4415；4454-4483；4485-4525；4588-4604；4606-4618；4644-4664；4666-4684；4718-4758；4760-4801；4810-4831；4842-4860；4877-4914；4916-4936；4938-4957；4959-4980；4991-5005；5015-5038；5053-5072；5074-5087；5118-5157；5178-5190；5205-5218；5260-5275；5278-5312；5314-5326；5345-5383；5392-5436；5485-5497；5531-5546；5563-5590；5600-5632；5634-5668；5742-5764；5791-5807；5819-5839；5866-5880；5890-5915；5917-5942；5953-5979；5981-6041；6043-6061；6063-6078；6090-6102；6144-6159；6181-6199；6227-6241；6252-6279；6286-6307；6316-6389；6391-6438；6440-6456；6458-6484；6486-6532；6540-6559；6586-6611；6627-6642；6693-6729；6765-6799；6843-6874；6932-6974；6980-6995；7015-7036；7049-7071；7094-7129；7131-7144；7151-7171；7173-7207；7209-7233；7263-7276；7323-7345；7353-7410；7413-7442；7490-7502；7508-7531；7566-7578；7580-7592；7627-7654；7656-7669；7671-7688；7705-7718；7727-7772；7774-7787；7795-7823；7838-7869；7873-7903；7915-7930；7936-7958；7960-7984；7986-7998；8005-8026；8028-8045；8066-8079；8082-8136；8138-8151；8170-8183；8211-8230；8232-8263；8265-8279；8322-8362；8381-8404；8439-8465；8492-8524；8535-8552；8635-8648；8733-8745；8768-8784；8794-8807；8811-8838；8843-8872；8910-8952；8959-8976；8983-9010；9027-9042；9044-9057；9078-9102；9111-9151；9153-9175；9186-9243；9256-9272；9278-9293；9295-9310；9312-9327；9348-9361；9363-9400；9402-9429；9438-9483；9498-9521；9549-9567；9574-9592；9594-9623；9640-9668；和9701-9726。
在另一个方面，本发明提供了一种反义寡核苷酸，长度为10-30个核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包括长度为10-30个核苷酸的连续核苷酸序列，其中该连续核苷酸序列与SEQ ID NO 1的一个区域至少90％互补，例如完全互补，所述区域选自由以下组成的组：24-39。100-113；991-1003；1223-1236；1625-1639；1718-1752；1754-1776；2020-2032；2219-2248；2250-2269；2271-2299；2337-2356；2563-2576；2578-2603；2638-2655；2674-2693；2702-2717；2740-2753；2812-2837；2889-2901；2995-3018；3020-3039；3047-3078；3083-3099；3125-3145；3284-3300；3334-3348；3353-3368；3819-3847；3862-3880；3891-3914；5953-5966；6458-6473；6829-6844；6865-6888；7263-7275；7771-7783；8537-8549；9153-9175；9186-9201；9318-9331；9348-9367；和9369-9381。
在另一个方面，本发明提供了一种反义寡核苷酸，长度为10-30个核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包括长度为10-30个核苷酸的连续核苷酸序列，其中该连续核苷酸序列与SEQ ID NO 1的一个区域至少90％互补，例如完全互补，所述区域选自由以下组成的组：1035-1052。1364-1376；1610-1623；1625-1640；1642-1656；1709-1724；1736-1752；1762-1776；1778-1794；2223-2242；2247-2305；2307-2320；2335-2348；2563-2575；2584-2602；2642-2657；2669-2693；2697-2713；2721-2734；2741-2753；2755-2772；2807-2819；2827-2845；2989-3025；3028-3055；3057-3117；3125-3140；3143-3156；3262-3282；3284-3308；3341-3360；3811-3824；3826-3847；3855-3897；3899-3917；3921-3934；5128-5144；5168-5180；5863-5882；5893-5914；6009-6032；6040-6053；6458-6472；6852-6879；7201-7213；7996-8008；8452-8465；8915-8928；8948-8960；9117-9134；9161-9175；9186-9201；9288-9305；以及9334-9367。
靶细胞
如本文所用，术语“靶细胞”是指表达靶核酸的细胞。在一些实施方案中，靶细胞可以为体内或体外的。在一些实施方案中，靶细胞为哺乳动物细胞，例如啮齿动物细胞，诸如小鼠细胞或大鼠细胞，或灵长类细胞，诸如猴细胞(如食蟹猴细胞)或人细胞，或猪细胞。
在一些优选的实施方案中，靶细胞表达CARD9 mRNA，例如CARD9前-mRNA，诸如SEQID NO 1，或CARD9成熟mRNA(例如SEQ ID NO2或9)。在一些实施方案中，靶细胞表达猴CARD9mRNA，诸如CARD9前mRNA，例如SEQ ID NO 3，或CARD9成熟mRNA(例如SEQ ID NO4)。在一些实施方案中，靶细胞表达小鼠CARD9 mRNA，诸如CARD9pre-mRNA，例如SEQ ID NO 5，或CARD9成熟mRNA(例如SEQ ID NO6)。在一些实施方案中，靶细胞表达猪CARD9 mRNA，如CARD9前mRNA，如SEQ ID NO 6，或CARD9成熟mRNA(如SEQ ID NO 7)。CARD9mRNA的聚腺苷酸尾通常不用于反义寡核苷酸靶向。
天然存在的变体
术语“天然存在的变体”是指ERC1基因或转录物的变体，其来源于与靶核酸相同的遗传基因座，但可能会有所不同，例如由于遗传密码的简并性，导致编码同一氨基酸的密码子的多样性，或由于前-mRNA的替代剪接或多态性的存在，例如单一核苷酸多态性(SNP)和等位基因变体。基于存在与寡核苷酸足够互补序列，因此，本发明的寡核苷酸可以靶向靶核酸及其天然存在的变体。
智人的CARD9基因位于9号染色体，136363956..136373681，互补物(NC_000009.12,Gene ID 64170)。
在一些实施方案中，天然存在的变体与哺乳动物CARD9靶核酸具有至少95％、例如至少98％或至少99％的同源性，所述哺乳动物ERC1靶核酸例如选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8和9(或本文公开的任意其它前-mRNA或mRNA)的靶核酸。在一些实施方案中，天然存在的变体与SEQ ID NO 1的人CARD9靶核酸具有至少99％的同源性
表达的调节
如本文所用，术语“表达的调节”应理解为与寡核苷酸施用之前的CARD9或CARD9mRNA量相比，寡核苷酸改变CARD9蛋白或CARD9mRNA的量的能力的总称。可选择的是，可以通过参比对照试验来确定表达的调节。通常理解为对照是用盐水组合物处理的个体或靶细胞或用非靶向性寡核苷酸(模拟物)处理的个体或靶细胞。
调控的一种类型是寡核苷酸能够抑制、下调、减少、抑制、去除、停止、阻断、防止、减小、降低、避免或终止CARD9的表达，例如通过降解CARD9mRNA。
高亲和力修饰的核苷
高亲和力修饰的核苷为修饰的核苷酸，将其掺入寡核苷酸时可增强寡核苷酸对其互补靶的亲和力，例如通过解链温度(Tm)测定的。本发明的高亲和力修饰的核苷优选导致每个修饰的核苷的解链温度增加+0.5至+12℃，更优选增加+1.5至+10℃，并且最优选增加+3至+8℃。许多高亲和力修饰的核苷是本领域已知的，并且包括例如许多2’取代的核苷以及锁核酸(LNA)(参见例如Freier&Altmann；Nucl.Acid Res.，1997，25，4429-4443，和Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development，2000，3(2)，293-213)。
糖修饰
本发明的寡聚体可以包含一个或多个核苷，其具有修饰的糖部分，即当与在DNA和RNA中发现的核糖部分相比时具有糖部分的修饰。
已经制备了大量具有核糖部分修饰的核苷，主要目的在于改善寡核苷酸的某些性质，例如亲和力和/或核酸酶抗性。
此类修饰包括这样的修饰，其中核糖环结构被修饰，例如通过用己糖环(HNA)或双环替代，其通常具有在核糖环(LNA)上C2与C4碳之间的双基桥；或未连接的核糖环，其通常缺乏C2与C3碳之间的键(例如UNA)。其它的糖修饰的核苷包括例如双环己糖核酸(WO 2011/017521)或三环核酸(WO 2013/154798)。修饰的核苷还包括这样的核苷，其中糖部分被非糖部分替代，例如在肽核酸(PNA)或吗啉代核酸的情况下。
糖修饰还包括通过改变核糖环非氢或天然存在于DNA和RNA核苷中的2’-OH基团的取代基进行的修饰。取代基可以例如在2’、3’、4’或5’位上引入。
2’糖修饰的核苷
2’糖修饰的核苷是2’位上具有非H或-OH的取代基的核苷(2’取代的核苷)，或包含2’连接的双基，其能够在核糖环上的2’碳与第二个碳之间形成桥，例如LNA(2’-4’双基桥连的)核苷。
实际上，大量焦点集中于研发2’糖取代的核苷，并且已经发现大量2’取代的核苷在掺入寡核苷酸时具有有益的性质。例如，2'修饰的糖可以为寡核苷酸提供增强的结合亲和力和/或增加核酸酶的抗性。2’取代的修饰的核苷的实例为2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2’-氨基-DNA、2’-氟-RNA和2’-F-ANA核苷。对于另外的实例，请参见例如Freier&Altmann；Nucl.Acid Res.，1997，25，4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development，2000，3(2)，293-213和Deleavey andDamha，Chemistry and Biology 2012，19，937。下文是某些2’取代的修饰的核苷的示例。
Figure BDA0003124835650000231
就本发明而言，2'取代的分子不包括2'桥接的分子，如LNA。
锁核酸(LNA)
“LNA核苷”是2’-修饰的核苷，其包含连接所述核苷的核糖糖环的C2’和C4’的双基(也称作“2’-4’桥”)，从而限制或锁定了核糖环的构象。这些核苷在文献中也称作桥连核酸或双环核酸(BNA)。当LNA掺入寡核苷酸中用于互补RNA或DNA分子时，核糖构象的锁定与增强的杂交亲和力(双链体稳定化)相关。这可以通过测量寡核苷酸/互补双链体的解链温度常规确定。
非限制性的示例性LNA核苷公开在WO 99/014226、WO 00/66604、WO 98/039352、WO2004/046160、WO 00/047599、WO 2007/134181、WO 2010/077578、WO 2010/036698、WO2007/090071、WO 2009/006478、WO 2011/156202、WO 2008/154401、WO 2009/067647、WO2008/150729；Morita等人，Bioorganic&Med.Chem.Lett.，12，73-76；Seth等人，J.Org.Chem.，2010，第75卷(5)，第1569-81页；和Mitsuoka等人，Nucleic Acids Research，2009，37(4)，1225-1238，以及Wan和Seth,J.Medical Chemistry 2016,59,9645-9667中。
进一步的非限制性的、示例性的LNA核苷在方案1中公开。
方案1
Figure BDA0003124835650000241
特别的LNA核苷为β-D-氧基-LNA，6’-甲基-β-D-氧基LNA，例如(S)-6’-甲基-β-D-氧基-LNA(ScET)和ENA。
一个特别有利的LNA是beta-D-oxy-LNA。
核酸酶介导的降解
核酸酶介导的降解是指与此类序列形成双链体时能够介导互补核苷酸序列降解的寡核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸可能通过核酸酶介导的靶核酸降解而起作用，其中本发明的寡核苷酸能够募集核酸酶，特别是内切核酸酶，优选内切核糖核酸酶(RNase)，例如RNase H。通过核酸酶介导的机制操作的寡核苷酸设计实例为这样的寡核苷酸，其通常包含至少5个或6个DNA核苷的区，并且增强亲和力的核苷例如gapmer、headmer和tailmer位于一侧或两侧侧翼。
RNase H活性和募集
反义寡核苷酸的RNase H活性是指具有互补RNA分子双链体时募集RNase H的能力。WO 01/23613提供了用于确定RNaseH活性的体外方法，其可以用于测定募集RNaseH的能力。通常，当提供互补靶核酸序列时，如果具有为以下初始比例的至少5％、例如至少10％或大于20％的初始比例(正如以pmol/L/分钟测定的)，则寡核苷酸被视为能够募集RNase H：使用与测试的修饰寡核苷酸具有相同碱基序列的寡核苷酸，但仅包含DNA单体和在寡核苷酸中的所有单体之间的硫代磷酸酯键，并且使用通过WO01/23613的实施例91-95提供的方法(作为引用并入本文)。对于测定RHase H活性的用途，重组人RNase H1从Lubio ScienceGmbH,Lucerne，Switzerland可获得。
gapmer
本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列可以为gapmer。反义gapmer通常用于通过RNase H介导的降解来抑制靶核酸。gapmer寡核苷酸包含至少三个不同的结构区5’-侧翼、gap和3’-侧翼，‘5->3’方向的F-G-F’。“gap”区(G)包含连续的DNA核苷酸延伸，使寡核苷酸能够募集RNase H。gap区的侧翼是5’侧翼区(F)，该区包含一个或多个糖修饰的核苷，有利的是高亲和力的糖修饰的核苷，以及3’侧翼区(F’)，其包含一个或多个糖修饰的核苷，有利的是高亲和力的糖修饰的核苷。F和F’区中一个或多个糖修饰的核苷增强寡核苷酸对靶核酸的亲和力(即是增强亲和力的糖修饰的核苷)。在一些实施方案中，F和F’区的一个或多个糖修饰的核苷是2’糖修饰的核苷，例如高亲和力的2’糖修饰，例如独立地选自LNA和2’-MOE。
在gapmer设计中，gap区的5’和3’最末端核苷为DNA核苷，并且分别位于与5’(F)或3’(F’)区的糖修饰的核苷相邻。侧翼可以通过在距gap区最远的末端，即在5’侧翼的5’末端和3’侧翼的3’末端具有至少一个糖修饰的核苷来进一步定义。
F-G-F’区形成连续核苷酸序列。本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列可以包含式F-G-F’的gapmer区。
gapmer设计F-G-F’的总长度可以为例如12-32个核苷，例如13-24，例如14-22个核苷，例如14-17、例如16-18个核苷。
作为实例，本发明的gapmer寡核苷酸可以由下式表示：
F1-8-G5-16-F’1-8，例如
F1-8-G7-16-F’2-8
条件是gapmer区F-G-F’的总长度为至少12个、例如至少14个核苷酸长度。
F、G和F’区还如下定义并且可以并入F-G-F’式。
Gapmer-G区
Gapmer的G区(gap区)是能够使寡核苷酸募集RNaseH，例如人RNase H1的核苷区，通常为DNA核苷。RNaseH是细胞酶，其可识别DNA与RNA之间的双链体，并且酶促切割RNA分子。适合地，gapmer可以具有至少5或6个连续DNA核苷，例如5-16个连续DNA核苷，例如6-15个连续DNA核苷，例如7-14个连续DNA核苷，例如8-12个连续DNA核苷酸，例如8-12个连续DNA核苷酸长度的gap区(G)。在一些实施方案中，gap G区可以由6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个连续DNA核苷组成。在一些情况中，gap区中的一个或多个胞嘧啶(C)DNA可以被甲基化(例如，当一个DNA c后面是一个DNA g)，此类残基也标注为5-甲基-胞嘧啶(meC)。在一些实施方案中，gap G区可以由6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个连续硫代磷酸酯连接的DNA核苷组成。在一些实施方案中，gap中的全部核苷间键为硫代磷酸酯键。
尽管传统的gapmer具有DNA gap区，但存在很多修饰的核苷实例，当它们在gap区内使用时，能够募集RNaseH。据报道当包括在gap区中时能够募集RNaseH的修饰的核苷包括例如α-L-LNA、C4’烷基化DNA(如PCT/EP2009/050349和Vester等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.，18(2008)，2296-2300中所述，两篇文献通过引用并入本文)、阿拉伯糖衍生的核苷如ANA和2’F-ANA(Mangos等人，2003，J.AM.CHEM.SOC.，125，654-661)、UNA(未锁核酸)(如Fluiter等人，Mol.Biosyst.，2009，10，1039中所述，通过引用并入本文)。UNA为未锁核酸，通常其中在核糖的C2与C3之间的键已被除去，形成未锁“糖”残基。用于此类gapmer的修饰核苷可以为这样的核苷，当引入gap区时采用2’内(DNA样)结构，即允许RNaseH募集的修饰。在一些实施方案中，本文所述的DNAGap区(G)可以任选包含1-3个糖修饰的核苷，当引入gap区时，其采用2’内(DNA样)结构。
G区-“Gap-断裂体(breaker)”
可选择的是，存在许多关于插入修饰的核苷的报道，该修饰的核苷赋予3’内构象进入gapmer异构体的gap区，同时保留了一些RNaseH活性。具有包含一个或多个3’内修饰的核苷的gap区的此类gapmer称作“gap-断裂体”或“gap-断裂的”gapmer，参见例如WO 2013/022984。Gap-断裂体寡核苷酸在gap区中保留了足够的DNA核苷区，以允许RNaseH募集。gap断裂体寡核苷酸设计募集RNaseH的能力通常为序列乃至化合物特异性的-参见Rukov等人，2015，Nucl.Acids Res.，第43卷，第8476-8487页，其公开了“gap断裂体”寡核苷酸，其募集RNaseH，在某些情况下可提供靶RNA的更特异性裂解。在gap断裂体寡核苷酸的gap区内使用的修饰的核苷可以为例如修饰的核苷，其赋予3’内构构象，例如2’-O-甲基(OMe)或2’-O-MOE(MOE)核苷或β-D LNA核苷(核苷的核糖糖环的C2’与C4’之间的桥为β构象)，例如β-D-氧基LNA或ScET核苷。
与上述含有G区的gapmer一样，gap-断裂体或gap-断裂的gapmer的gap区具有gap的5’端DNA核苷(与F区的3’核苷相邻)和gap的3’端DNA核苷(与F’区的5’核苷相邻)。包含断裂的gap的Gapmer通常在gap区的5’端或3’端保留至少3或4个连续的DNA核苷区。
gap-断裂体寡核苷酸的示例性设计包括：
F1-8-[D3-4-E1-D3-4]-F’1-8
F1-8-[D1-4-E1-D3-4]-F’1-8
F1-8-[D3-4-E1-D1-4]-F’1-8
其中G区在括号[Dn-Er-Dm]内，D为DNA核苷的连续序列，E为修饰的核苷(gap-断裂体或gap-断裂的核苷)，并且F和F’为本文所定义的侧翼区，并且条件是gapmer区F-G-F’的总长度为至少12个、例如至少14个核苷酸长度。
在一些实施方案中，gap断裂的gapmer的G区包含至少6个DNA核苷，例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个DNA核苷。如上所述，DNA核苷可以为连续的或可以任选与一个或多个修饰的核苷间插，条件是gap G区能够介导RnaseH募集。
Gapmer-侧翼区，F和F’
F区的位置紧邻G区的5’DNA核苷。F区中3’的最末端核苷为糖修饰的核苷，例如高亲和力的糖修饰的核苷，例如2’取代的核苷，例如MOE核苷或LNA核苷。
F’区的位置紧邻G区的3’DNA核苷。F’区的5’最末端核苷为糖修饰的核苷，例如高亲和力的糖修饰的核苷，例如2’取代的核苷，例如MOE核苷或LNA核苷。
F区为1-8个连续核苷酸长度，例如2-6个、例如3-4个连续核苷酸长度。有利的是，F区的5’最末端核苷为糖修饰的核苷。在一些实施方案中，F区的两个5’最末端核苷为糖修饰的核苷。在一些实施方案中，F区的5’最末端核苷为LNA核苷。在一些实施方案中，F区的两个5’最末端核苷为LNA核苷。在一些实施方案中，F区的两个5’最末端核苷为2’取代的核苷，例如两个3’MOE核苷。在一些实施方案中，F区的5’最末端核苷为2’取代的核苷，例如MOE核苷。
F’区为2-8个连续核苷酸长度，例如3-6个、例如4-5个连续核苷酸长度。有利的是，实施方案为F’区的3’最末端核苷为糖修饰的核苷。在一些实施方案中，F’区的两个3’最末端核苷为糖修饰的核苷。在一些实施方案中，F’区的两个3’最末端核苷为LNA核苷。在一些实施方案中，F’区的3’最末端核苷为LNA核苷。在一些实施方案中，F’区的两个3’最末端核苷为2’取代的核苷，例如两个3’MOE核苷。在一些实施方案中，F’区的3’最末端核苷为2’取代的核苷，例如MOE核苷。
应当理解，当F或F’区的长度为1时，有利地为LNA核苷。
在一些实施方案中，F或F’区独立地由糖修饰的核苷的连续序列组成或包含它们。在一些实施方案中，F区的糖修饰的核苷可以独立地选自2’-O-烷基-RNA单元、2’-O-甲基-RNA、2’-氨基-DNA单元、2’-氟-DNA单元、2’-烷氧基-RNA、MOE单元、LNA单元、阿拉伯糖(arabino)核酸(ANA)单元和2’-氟-ANA单元。
在一些实施方案中，F或F’区独立地包含LNA和2’取代的修饰的核苷(混合翼设计)。
在一些实施方案中，F或F’区仅由一种类型的糖修饰的核苷组成，例如仅MOE或仅β-D-氧基LNA或仅ScET。此类设计也称作均匀的侧翼或均匀的gapmer设计。
在一些实施方案中，F或F’或F和F’区的所有核苷为LNA核苷，例如独立地选自β-D-氧基LNA、ENA或ScET核苷。
在一些实施方案中，F或F’或F和F’区的所有核苷为2’取代的核苷，例如OMe或MOE核苷。在一些实施方案中，F区由1、2、3、4、5、6、7或8个连续OMe或MOE核苷组成。在一些实施方案中，侧翼区中仅一个可以由2’取代的核苷组成，例如OMe或MOE核苷。在一些实施方案中，其为5’(F)侧翼区，由2’取代的核苷组成，例如OMe或MOE核苷，而3’(F’)侧翼区包含至少一个LNA核苷，例如β-D-氧基LNA核苷或cET核苷。在一些实施方案中，其为3’(F’)侧翼区，由2’取代的核苷组成，例如OMe或MOE核苷，而5’(F)侧翼区包含至少一个LNA核苷，例如β-D-氧基LNA核苷或cET核苷。
在一些实施方案中，F和F’区的所有修饰的核苷为LNA核苷，例如独立地选自β-D-氧基LNA、ENA或ScET核苷，其中F或F’或F和F’区可以任选包含DNA核苷(交替侧翼，更详细描述参见它们的定义)。在一些实施方案中，F和F’区的所有修饰的核苷为β-D-氧基LNA核苷，其中F或F’或F和F’区可以任选包含DNA核苷(交替侧翼，更详细描述参见它们的定义)。
在一些实施方案中，F和F’区的5’最末端和3’最末端核苷为LNA核苷，例如β-D-氧基LNA核苷或ScET核苷。
在一些实施方案中，F区与G区之间的核苷间键为硫代磷酸酯核苷间键。在一些实施方案中，F’区与G区之间的核苷间键为硫代磷酸酯核苷间键。在一些实施方案中，在F或F’、F和F’区的核苷之间的核苷间键为硫代磷酸酯核苷间键。
LNAGapmer
LNAgapmer为其中F和F’区中的任一个或它们两者包含LNA核苷或由其组成的gapmer。β-D-氧基gapmer为其中F和F’区中的任一个或它们两者包含β-D-氧基LNA核苷或由其组成的gapmer。
在一些实施方案中，LNAgapmer具有下式：[LNA]1-5-[G区]-[LNA]1-5，其中G区如Gapmer G区定义中所定义。
MOE Gapmer
MOE gapmer为其中F和F’区由MOE核苷组成的gapmer。在一些实施方案中，MOEgapmer具有设计[MOE]1-8-[G区]-[MOE]1-8，例如[MOE]2-7-[G区]5-16-[MOE]2-7，例如[MOE]3-6-[G区]-[MOE]3-6，其中G区如Gapmer定义中所定义。具有5-10-5设计(MOE-DNA-MOE)的MOEgapmer在本领域中广泛应用。
混合翼Gapmer
混合翼gapmer为LNAgapmer，其中F和F’区之一或它们两者包含2’取代的核苷，例如2’取代的核苷独立地选自2’-O-烷基-RNA单元、2’-O-甲基-RNA、2’-氨基-DNA单元、2’-氟-DNA单元、2’-烷氧基-RNA、MOE单元、阿拉伯糖核酸(ANA)单元和2’-氟-ANA单元，例如MOE核苷。在一些实施方案中，其中F和F’区的至少一个或F和F’区两者包含至少一个LNA核苷，F和F’区的其余的核苷独立地选自MOE和LNA。在一些实施方案中，其中F和F’区的至少一个或F和F’区两者包含至少两个LNA核苷，F和F’区的其余的核苷独立地选自MOE和LNA。在一些混合翼实施方案中，F和F’区之一或它们两者还可以包含一个或多个DNA核苷。
混合翼gapmer设计公开在WO 2008/049085和WO2012/109395中，两篇文献通过引用并入本文。
交替侧翼Gapmer
具有交替侧翼的寡核苷酸为LNAgapmer寡核苷酸，其中侧翼的至少一个(F或F’)除了LNA核苷，还包含DNA。在一些实施方案中，F或F’区的至少一个或F和F’区两者包含LNA核苷和DNA核苷。在此类实施方案中，侧翼F或F’区或F和F’区包含至少三个核苷，其中F和/或F’区的5’和3’最末端核苷为LNA核苷。
在一些实施方案中，F或F’区的至少一个或F和F’区两者包含LNA核苷和DNA核苷。在此类实施方案中，侧翼F或F’或F和F’区包含至少三个核苷，其中F和/或F’区的5’和3’最末端核苷为LNA核苷。并且至少有一种DNA核苷放置于区域F或F'(或F区和F'区两者)的5'和3'最末端LNA核苷之间。
寡核苷酸中的D’或D”区
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸可以包含与靶核酸互补的寡核苷酸的连续核苷酸序列，例如gapmer F-G-F’，以及另外的5’和/或3’核苷，或由其组成。另外的5’和/或3’个核苷可以与靶核酸完全互补，也可以不与之完全互补。此类另外的5’和/或3’核苷在本文中称作D’和D”区。
D’或D”区的添加可用于将连续核苷酸序列(例如gapmer)连接至缀合物部分或另外的官能团的目的。当用于将连续核苷酸序列与缀合物部分连接时，可以用作可生物裂解的接头。可选择的是，它可用于提供外切核酸酶保护或易于合成或制造。
D’和D”区可以分别连接至F区的5’端或F’区的3’端，从而生成下式D’-F-G-F’、F-G-F’-D”或D’-F-G-F’-D”的设计。在这种情况下，F-G-F’为寡核苷酸的gapmer部分，并且D’或D”区构成寡核苷酸的单独部分。
D’或D”区可以独立地包含1、2、3、4或5个额外的核苷酸或由其组成，所述额外的核苷酸可以与靶核酸互补或不与之互补。与F或F’区相邻的核苷酸不为糖-修饰的核苷酸，例如它们的DNA或RNA或碱基修饰的形式。D’或D”区可以用作核酸酶敏感的可生物裂解的接头(参见接头的定义)。在一些实施方案中，另外的5’和/或3’末端核苷酸与磷酸二酯键连接，并且为DNA或RNA。适合用作D’或D”区的基于核苷酸的可生物裂解的接头公开在WO 2014/076195中，作为实例，其包括磷酸二酯连接的DNA二核苷酸。可生物裂解的接头在多-寡核苷酸构建体中的用途公开在WO 2015/113922中，其中它们用于在单一寡核苷酸内连接多个反义构建体(例如，gapmer区)。
在一个实施方案中，本发明的寡核苷酸除了构成gapmer的连续核苷酸序列，还包含D’和/或D”区。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸可以由下式表示：
F-G-F’；特别是F1-8-G5-16-F’2-8
D’-F-G-F’，特别是D’1-3-F1-8-G5-16-F’2-8
F-G-F’-D”，特别是F1-8-G5-16-F’2-8-D”1-3
D’-F-G-F’-D”，特别是D’1-3-F1-8-G5-16-F’2-8-D”1-3
在一些实施方案中，位于D’区与F区之间的核苷间键为磷酸二酯键。在一些实施方案中，位于F’区与D”区之间的核苷间键为磷酸二酯键。
缀合物
如本文所用，术语缀合物是指共价连接至非核苷酸部分(缀合物部分或C区或第三区)的寡核苷酸。
本发明的寡核苷酸与一个或多个非核苷酸部分缀合可以改善寡核苷酸的药理学特性，例如通过影响寡核苷酸的活性、细胞分布、细胞摄取或稳定性。在一些实施方案中，缀合物部分通过改善寡核苷酸的细胞分布、生物利用度、代谢、排泄、通透性和/或细胞摄取来改变或增强寡核苷酸的药代动力学性质。特别的是，缀合物可以将寡核苷酸靶向特定的器官、组织或细胞类型，从而增强寡核苷酸在该器官、组织或细胞类型中的有效性。同时，缀合物可以用于降低寡核苷酸在非靶细胞类型、组织或器官中的活性，例如脱靶活性或在非靶细胞类型、组织或器官中的活性。
在一个实施方案中，非核苷酸部分(缀合物部分)选自碳水化合物、细胞表面受体配体、药物物质、激素、亲脂性物质、聚合物、蛋白质、肽、毒素(例如细菌毒素)、维生素、病毒蛋白(例如衣壳)或其组合。
接头
键或接头为两个原子之间的连接，其通过一个或多个共价键使一个关注的化学基团或片段连接至另一个关注的化学基团或片段上。缀合物部分可以直接或通过连接部分(例如接头或连接)连接至寡核苷酸。接头用于共价连接第三区，例如缀合物部分(C区)至第一区，例如寡核苷酸或连续核苷酸序列或gapmer区F-G-F’(A区)。
在本发明的一些实施方案中，本发明的缀合物或寡核苷酸缀合物可以任选包含接头区(第二区或B区和/或Y区，其位于与靶核酸互补的寡核苷酸或连续核苷酸序列(A区或第一区)与缀合物部分(C区第三区)之间。
B区是指可生物裂解的接头，其包含在哺乳动物体内通常遇到或与之相似的条件下可裂解的生理学不稳定的键或由其组成。生理学不稳定的接头经历化学转化(例如裂解)的条件包括与哺乳动物细胞中发现或所遇到的那些类似的化学条件，例如pH、温度、氧化或还原条件或试剂，以及盐浓度。哺乳动物胞内条件还包括通常存在于哺乳动物细胞中例如来自蛋白水解酶或水解酶或核酸酶的酶活性的存在。在一个实施方案中，可生物裂解的接头易受S1核酸酶裂解的影响。包含DNA磷酸二酯的可生物裂解的接头在WO2014/076195中有更详细的描述(通过引用并入本文)——另请参见本文的D’或D”区。
Y区指不一定是可生物裂解的、但主要用于使缀合物部分(C区或第三区)共价连接至寡核苷酸(A区或第一区)的接头。Y区接头可以包含链结构或重复单元的寡聚体，所述重复单元例如乙二醇、氨基酸单元或氨基烷基。本发明的寡核苷酸缀合物可以由以下区元件A-C、A-B-C、A-B-Y-C、A-Y-B-C或A-Y-C构成。在一些实施方案中，接头(Y区)为氨基烷基，例如C2-C36氨基烷基，包括，例如C6-C12氨基烷基。在优选的实施方案中，接头(Y区)为C6氨基烷基。
治疗
如本文所用，术语“治疗”是指既包括存在的疾病(例如本文所涉及的疾病或障碍)的治疗，也包括疾病的预防(即预防)。因此，将认识到，在一些实施方案中，本文涉及的治疗可以是预防性的。
发明详述
本发明涉及靶向CARD9表达的寡核苷酸，诸如反义寡核苷酸。
本发明的靶向CARD9的寡核苷酸能够与正在表达CARD9靶核酸的细胞中的CARD9靶核酸杂交并抑制其表达。
CARD9靶核酸可以是哺乳动物的CARD9 mRNA或前mRNA，如人、小鼠、猪或猴的CARD9mRNA或前mRNA。在一些实施方案中，CARD9靶核酸是CARD9 mRNA或前mRNA，例如源自智人(CARD9)的前mRNA或mRNA，RefSeqGene位于9号染色体上，以NCBI参考序列(ReferenceSequence)NG_021197.1(SEQ ID NO 1)为例。
人类CARD9前mRNA在智人9号染色体NC_000009.12(136363956...136373681，互补物)上编码。GENE ID＝64170(CARD9)。
成熟的人类mRNA靶序列在此由cDNA序列SEQ ID NO 2和9说明。成熟的猴mRNA靶序列在此由SEQ ID NO 4所示的cDNA序列说明。成熟的小鼠mRNA靶序列在此由SEQ ID NO 6所示的cDNA序列说明。成熟的猪mRNA靶序列在此由SEQ ID NO 8所示的cDNA序列说明。
本发明的寡核苷酸能够在表达靶核酸，诸如CARD9 mRNA的细胞(例如人、猴、小鼠或猪细胞)中抑制CARD9靶核酸，诸如CARD9 mRNA的表达。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸能够抑制CARD9靶核酸在表达靶核酸的细胞中的表达，从而使CARD9靶核酸(例如，mRNA)的水平相比于CARD9靶核酸(如mRNA)在细胞中的表达水平减少了，通过至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的抑制。适当地，该细胞选自由人类细胞、猴子细胞、小鼠细胞和猪细胞组成的组。在一些实施方案中，该细胞是人类细胞，诸如THP-1细胞。THP-1是一种来自急性单核细胞白血病患者的人类单核细胞系。实施例1提供了评估本发明的寡核苷酸抑制靶核酸表达的能力的合适的测定方法。适当地，对化合物抑制靶核酸表达的能力的评价是在体外进行的，这样的体外gymnotic测定，例如根据实施例1的方法。
本发明的一个方面涉及一种反义寡核苷酸，例如LNA反义寡核苷酸gapmer，其包括长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，具有与SEQ ID NO 1.2、3、4、5、6、7、8或9(例如SEQ ID NO 1、2和9)至少90％的互补性，诸如完全互补。
在一些实施方案中，该寡核苷酸包括10-30个核苷酸的连续序列，其与靶核酸或靶序列的一个区域至少有90％的互补性，诸如至少91％，诸如至少92％，诸如至少93％，诸如至少94％，诸如至少95％，诸如至少96％，诸如至少97％，诸如至少98％，或100％互补。合适的靶核酸的序列在本文上文所描述(见表1)。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含长度为12-24，诸如13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23的连续核苷酸序列，其中该连续核苷酸序列与上述表1中提供的靶核酸(即与SEQ ID NO 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68或69)完全互补。
在一些实施方案中，本发明的反义寡核苷酸包括长度为12-15，诸如13，或14，15个连续核苷酸的连续核苷酸序列，其中该连续核苷酸序列与上述表1中提供的靶核酸完全互补。
通常，本发明的反义寡核苷酸或其连续的核苷酸序列是一个gapmer，如LNAgapmer、混合翼gapmer或交替侧翼gapmer。
在一些实施方案中，根据本发明的反义寡核苷酸，包括至少10个连续的核苷酸，如至少12个连续的核苷酸，诸如至少13个连续的核苷酸，诸如至少14个连续的核苷酸。诸如至少15个连续核苷酸，其与SEQ NO 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68或69完全互补。
在一些实施方案中，根据本发明的反义寡核苷酸的连续核苷酸序列的长度小于20个核苷酸。在一些实施方案中，根据本发明的反义寡核苷酸的连续核苷酸序列的长度为12-24个核苷酸。在一些实施方案中，根据本发明的反义寡核苷酸的连续核苷酸序列的长度为12-22个核苷酸。在一些实施方案中，根据本发明的反义寡核苷酸的连续核苷酸序列的长度为12-20个核苷酸。在一些实施方案中，根据本发明的反义寡核苷酸的连续核苷酸序列的长度为12-18个核苷酸。在一些实施方案中，根据本发明的反义寡核苷酸的连续核苷酸序列的长度为12-16个核苷酸。
有利的是，在一些实施方案中，连续核苷序列的核苷之间的所有核苷间连接都是硫代磷酸酯核苷内连接。
在一些实施方案中，连续的核苷酸序列与SEQ NO 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68或69完全互补。。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸是gapmer寡核苷酸，其包含符合式5'-F-G-F'-3'的连续核苷酸序列的，其中区域F和F'独立地包含1-8个糖修饰的核苷，G是5-16个核苷之间的区域，其能够招募RNaseH。
在一些实施方案中，区域F和F'的糖修饰的核苷独立地选自由2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA、2’-氨基-DNA、2’-氟-DNA、阿拉伯糖核酸(ANA)、2’-氟-ANA和LNA核苷组成的组。
在一些实施方案中，G区包含5-16个连续的DNA核苷。
在一些实施方案中，其中反义寡核苷酸是gapmer寡核苷酸，如LNA gapmer寡核苷酸。
在一些实施方案中，LNA核苷是β-D-氧基LNA核苷。
在一些实施方案中，连续的核苷序列之间的核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接。
本发明优选的序列基序和反义寡核苷酸见表2所示。
表2：本发明的序列基序和化合物
Figure BDA0003124835650000371
Figure BDA0003124835650000381
Figure BDA0003124835650000391
Figure BDA0003124835650000401
Figure BDA0003124835650000411
Figure BDA0003124835650000421
Figure BDA0003124835650000431
Figure BDA0003124835650000441
Figure BDA0003124835650000451
Figure BDA0003124835650000461
Figure BDA0003124835650000471
Figure BDA0003124835650000481
Figure BDA0003124835650000491
Figure BDA0003124835650000501
Figure BDA0003124835650000511
在测试的具体化合物中(见"寡核苷酸化合物"一栏)，大写字母是β-D-氧基LNA核苷，所有LNA C是β-D-氧基-LNA 5-甲基胞嘧啶，小写字母是DNA核苷，小写c前的上标m代表5-甲基胞嘧啶DNA核苷，否则DNA c核苷是胞嘧啶核苷，所有核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接。表中提供的化合物的胞嘧啶DNA核苷的甲基化是一个可选的特征。胞嘧啶DNA核苷也可能是未甲基化的。
本发明提供了根据本发明的反义寡核苷酸，诸如长度为12-24，诸如12-18的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸包含存在于表2中所列的任何一个序列基序(见"序列基序"一栏)中的至少12，诸如至少14，诸如至少15个连续的核苷酸。
本文提供的反义寡核苷酸通常包含选自SEQ ID NO 70-577的连续核苷酸序列或由其组成。例如，反义寡核苷酸是包含选自SEQ ID NO 70-577的连续核苷酸序列的或由其组成的LNA gapmers。
本发明提供了选自由表2"寡核苷化合物"一栏中所列反义寡核苷组成的组的反义寡核苷酸，其中大写字母是LNA核苷，小写字母是DNA核苷。在一些实施方案中，连续的核苷序列中的所有核苷间连接都是硫代磷酸酯核苷间连接。可选地，LNA胞嘧啶可以是5-甲基胞嘧啶。可选地，DNA胞嘧啶可以是5-甲基胞嘧啶。
本发明提供了选自由表2"寡核苷化合物"一栏中所列反义寡核苷组成的组的反义寡核苷酸，其中大写字母是β-D-氧基-LNA核苷，小写字母是DNA核苷。在一些实施方案中，连续的核苷序列中的所有核苷间连接都是硫代磷酸酯核苷间连接。可选地，LNA胞嘧啶可以是5-甲基胞嘧啶。可选地，DNA胞嘧啶可以是5-甲基胞嘧啶。
本发明提供了选自由表2"寡核苷化合物"一栏中所列反义寡核苷组成的组的反义寡核苷酸，其中大写字母是β-D-氧基-LNA核苷，其中所有的LNA胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。小写字母是DNA核苷。在一些实施方案中，连续的核苷序列中的所有核苷间连接都是硫代磷酸酯核苷间连接。可选地，LNA胞嘧啶可以是5-甲基胞嘧啶。可选地，DNA胞嘧啶可以是5-甲基胞嘧啶。
制备方法
在另一个方面，本发明提供了用于制备本发明的寡核苷酸的方法，包括使核苷酸单元反应，从而形成包含在寡核苷酸中的共价连接的连续核苷酸单元。优选的是，该方法使用亚磷酰胺化学方法(参见，例如Caruthers等人，1987，Methods in Enzymology，第154卷，第287-313页)。在另一个实施方案中，该方法还包含使连续核苷酸序列与缀合部分(配体)反应，使缀合物部分共价地连接到寡核苷酸。在另一个方面，提供用于制备本发明组合物的方法，包括将本发明的寡核苷酸或缀合的寡核苷酸与药学上可接受的稀释剂、溶剂、载体、盐和/或佐剂混合。
药物组合物
在另一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含任何上述寡核苷酸和/或寡核苷酸缀合物或其盐和药学上可接受的稀释剂、载体、盐和/或佐剂。药学上可接受的稀释剂包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)，并且药学上可接受的盐包括但不限于钠盐和钾盐。在一些实施方案中，药学上可接受的稀释剂为无菌磷酸盐缓冲盐水。在一些实施方案中，寡核苷酸以50-300μM溶液的浓度用于药学上可解释的稀释剂中。
根据本发明的化合物可以以其药学上可接受的盐的形式存在。术语"药学上可接受的盐"是指常规的酸加成盐或碱加成盐，其保留了本发明化合物的生物学效力和特性，并由合适的无毒有机或无机酸或有机或无机碱形成。酸加成盐包括例如那些源自无机酸(诸如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸和硝酸)的，以及那些来自有机酸(诸如对甲苯磺酸、水杨酸、甲磺酸、草酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸，等等)的盐。碱加成盐包括那些来自铵、钾、钠和季铵碱(例如氢氧化四甲铵)的盐。为了获得化合物的更好的物理和化学稳定性、吸湿性、流动性和可溶性，将药物化合物化学修饰为盐，是药物化学家公知的技术。例如，在以下中描述了：Bastin,Organic Process Research&Development 2000,4,427-435或Ansel,In:Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,第六版(1995),196和1456-1457页。例如，本文提供的化合物的药学上可接受的盐可以是钠盐。
用于本发明的适合的制剂可以在Remington’s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Company，Philadelphia，Pa.，第17版，1985中找到。有关药物递送方法的简单综述，参见例如Langer(Science 249：1527-1533，1990)。WO 2007/031091进一步提供了药学上可接受的稀释剂、载体和佐剂的适合的和优选的实例(通过引用并入本文)。WO 2007/031091中还提供了适合的剂量、制剂、施用途径、组合物、剂型、与另外的治疗剂的组合、前药制剂。
可以将本发明的寡核苷酸或寡核苷酸缀合物与药学上可接受的活性或惰性物质混合，用于制备药物组合物或制剂。用于配制药物组合物的组合物和方法取决于多个标准，包括但不限于施用途径、疾病程度或施用剂量。
可以通过常规灭菌技术给这些组合物灭菌，或可以将它们无菌过滤。可以将得到的水溶液包装应用或冻干，将冻干的制剂与无菌水性载体合并，然后施用。制剂的pH通常为3-11，更优选5-9或6-8，并且最优选7-8，例如7-7.5。可以将得到的固体形式的组合物包装在多个单剂量单元中，每个包含固定量的上述一种或多种活性剂，例如在密封的片剂或胶囊剂包装中。还可以将固体形式的组合物以灵活的量包装在容器中，例如在设计用于局部施用的乳膏剂或软膏剂的可挤压管中。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸或寡核苷酸缀合物为前药。特别在寡核苷酸缀合物方面，一旦前药被递送至作用部位，例如靶细胞，则缀合物部分从寡核苷酸上裂解。
应用
本发明的寡核苷酸可以用作例如用于诊断、治疗和预防的研究试剂。
在研究中，此类寡核苷酸可以用于特异性地调节细胞(例如体外细胞培养物)和试验动物中CARD9蛋白的合成，从而有利于其作为治疗性干预的靶的有用性的靶或评估的功能分析。通常，靶调节通过降解或抑制产生蛋白质的mRNA，从而防止蛋白质形成，或者通过降解或抑制产生蛋白质的基因或mRNA的调节剂来实现。
如果在研究或诊断中使用本发明的寡核苷酸，则靶核酸可以为衍生自DNA或RNA的cDNA或合成核酸。
本发明提供了用于调节靶细胞中CARD9表达的体内或体外方法，所述靶细胞表达CARD9，所述方法包括给所述细胞施用有效量的本发明的寡核苷酸。
在一些实施方案中，靶细胞为哺乳动物细胞，特别是人细胞。靶细胞可以为体外细胞培养物或体内形成哺乳动物组织的组成部分的细胞。
在诊断中，寡核苷酸可以用于通过northern印迹、原位杂交或类似技术检测和定量细胞和组织中的CARD9表达。
对于治疗疑似患有疾病或障碍的动物或人，可以通过调节CARD9的表达治疗。
本发明提供了用于治疗或预防疾病的方法，包括给患有该疾病或易感该疾病的个体施用治疗或预防有效量的本发明的寡核苷酸、寡核苷酸缀合物或药物组合物。
本发明还涉及如本文所定义的寡核苷酸、组合物或缀合物，其用作药物。
本发明的寡核苷酸、寡核苷酸缀合物或药物组合物通常以有效量施用。
本发明还提供了如所述的本发明的寡核苷酸或寡核苷酸缀合物在制备用于治疗如本文所涉及的障碍的药物中或在如本文所涉及的障碍的治疗方法中的用途。
如本文所涉及的疾病或障碍与CARD9的表达相关。在一些实施方案中，疾病或障碍可能与CARD9基因的突变有关。因此，在一些实施方案中，靶核酸是CARD9序列的突变形式。
本发明的方法优选用于治疗或预防因CARD9的异常水平和/或活性导致的疾病。
本发明还涉及如本文所定义的寡核苷酸、寡核苷酸缀合物或药物组合物在制备用于治疗CARD9的异常水平和/或活性的药物中的用途。
在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗疾病或障碍的寡核苷酸、寡核苷酸缀合物或药物组合物，所述疾病或障碍选自炎症性肠病、胰腺炎、IgA肾病、原发性硬化性胆管炎、心血管疾病、癌症和糖尿病。
在一些实施方案中，该疾病是炎症性肠病。例如，炎症性肠病是克罗恩病。或者，炎症性肠病是溃疡性结肠炎。
在一些实施方案中，该疾病是糖尿病，诸如2型糖尿病。
在一些实施方案中，该疾病是胰腺炎，如急性胰腺炎。
施用
本发明的寡核苷酸或药物组合物可以局部或肠内施用或非肠道施用(例如静脉内、皮下、肌内、大脑内、脑室内或鞘内)。在一个优选的实施方案中，本发明的寡核苷酸或药物组合物通过非肠道途径施用，包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注，鞘内或颅内，例如脑内或脑室内、玻璃体内给药。
在一个实施方案中，活性寡核苷酸或寡核苷酸缀合物通过静脉内施用。
在另一个实施方案中，活性寡核苷酸或寡核苷酸缀合物通过皮下施用。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸、寡核苷酸缀合物或药物组合物以0.1-15mg/kg的剂量施用，例如0.2-10mg/kg，例如0.25-5mg/kg。施用可以每周1次，每2周1次，每3周1次，乃至每个月1次。
组合治疗
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸、寡核苷酸缀合物或药物组合物用于与其它治疗剂组合治疗。该治疗剂可以为例如上述疾病或障碍的护理标准。
实施方案列表
1.一种反义寡核苷酸，长度为10-30个核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含长度为10-30个核苷酸的连续核苷酸序列，其中该连续核苷酸序列与SEQ ID NO 1至少90％互补，例如完全互补，其中该反义寡核苷酸能够在表达人CARD9的细胞中抑制人CARD9的表达；或其药学上可接受的盐。
2.根据实施方案1的反义寡核苷酸，其中该连续的核苷酸序列与SEQ ID NO 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68或69至少90％互补。
3.根据实施方案1的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68或69完全互补。
4.根据实施方案1至3中任一项的反义寡核苷酸，其中连续的核苷酸序列与SEQ IDNO 1的一个区域完全互补，所述区域选自1-16。22-48；51-72；74-86；100-114；123-165；229-274；314-328；330-342；344-360；371-403；432-471；477-491；495-507；534-548；576-595；610-622；636-664；674-720；756-775；785-798；800-814；818-849；851-865；868-880；896-937；948-978；990-1009；1012-1042；1056-1078；1097-1130；1132-1144；1173-1186；1195-1209；1211-1233；1259-1284；1299-1311；1335-1350；1352-1366；1384-1401；1403-1422；1424-1446；1448-1473；1485-1522；1537-1556；1580-1596；1598-1623；1628-1661；1670-1686；1700-1731；1733-1752；1764-1794；1805-1828；1841-1874；1876-1910；1918-1942；1975-1994；2009-2036；2055-2078；2110-2126；2128-2152；2154-2206；2208-2221；2230-2287；2301-2320；2322-2338；2340-2371；2396-2418；2420-2432；2435-2483；2485-2506；2528-2576；2578-2633；2635-2693；2695-2732；2734-2783；2806-2849；2890-2902；2904-2924；2936-2958；2989-3012；3014-3054；3056-3073；3075-3109；3111-3169；3204-3306；3308-3402；3441-3478；3667-3695；3697-3714；3746-3773；3775-3800；3802-3847；3858-3883；3885-3913；3924-3940；3955-3969；3971-3983；3995-4013；4019-4098；4107-4133；4138-4156；4162-4178；4192-4206；4209-4228；4244-4269；4271-4288；4312-4347；4375-4415；4454-4483；4485-4525；4588-4604；4606-4618；4644-4664；4666-4684；4718-4758；4760-4801；4810-4831；4842-4860；4877-4914；4916-4936；4938-4957；4959-4980；4991-5005；5015-5038；5053-5072；5074-5087；5118-5157；5178-5190；5205-5218；5260-5275；5278-5312；5314-5326；5345-5383；5392-5436；5485-5497；5531-5546；5563-5590；5600-5632；5634-5668；5742-5764；5791-5807；5819-5839；5866-5880；5890-5915；5917-5942；5953-5979；5981-6041；6043-6061；6063-6078；6090-6102；6144-6159；6181-6199；6227-6241；6252-6279；6286-6307；6316-6389；6391-6438；6440-6456；6458-6484；6486-6532；6540-6559；6586-6611；6627-6642；6693-6729；6765-6799；6843-6874；6932-6974；6980-6995；7015-7036；7049-7071；7094-7129；7131-7144；7151-7171；7173-7207；7209-7233；7263-7276；7323-7345；7353-7410；7413-7442；7490-7502；7508-7531；7566-7578；7580-7592；7627-7654；7656-7669；7671-7688；7705-7718；7727-7772；7774-7787；7795-7823；7838-7869；7873-7903；7915-7930；7936-7958；7960-7984；7986-7998；8005-8026；8028-8045；8066-8079；8082-8136；8138-8151；8170-8183；8211-8230；8232-8263；8265-8279；8322-8362；8381-8404；8439-8465；8492-8524；8535-8552；8635-8648；8733-8745；8768-8784；8794-8807；8811-8838；8843-8872；8910-8952；8959-8976；8983-9010；9027-9042；9044-9057；9078-9102；9111-9151；9153-9175；9186-9243；9256-9272；9278-9293；9295-9310；9312-9327；9348-9361；9363-9400；9402-9429；9438-9483；9498-9521；9549-9567；9574-9592；9594-9623；9640-9668；和9701-9726。
5.根据实施方案1-4中任一项的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸是一种gapmer寡核苷酸，其包含式5'-F-G-F'-3'的连续核苷酸序列，其中区域F和F'独立地包含1-8个糖修饰的核苷，而G是5-16个核苷之间的区域，其能够招募RNaseH。
6.根据实施方案5的反义寡核苷酸，其中区域F和F'的糖修饰的核苷独立地选自由2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA、2’-氨基-DNA、2’-氟-DNA、阿拉伯糖核酸(ANA)、2’-氟-ANA和LNA核苷组成的组。
7.根据实施方案5或6的反义寡核苷酸，其中G区包含5-16个连续的DNA核苷。
8.根据实施方案1-7中任一项的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸是LNA gapmer寡核苷酸。
9.根据实施方案5-8中任一项的反义寡核苷，其中LNA核苷是β-D-氧基LNA核苷。
10.根据实施方案1-9中任一项的反义寡核苷酸，其中连续核苷酸序列之间的核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接。
11.根据实施方案1-10中任一项的反义寡核苷酸，其中该寡核苷酸包含选自由SEQID NO 70至SEQ ID NO:577组成的组的连续核苷酸序列。
12.根据实施方案1-11中任一项的反义寡核苷酸，其中该寡核苷酸是选自表2所示的寡核苷酸化合物的寡核苷酸化合物，其中大写字母代表LNA核苷，小写字母代表DNA核苷。
13.根据实施方案1-12中任一项的反义寡核苷酸，其中该寡核苷酸是是选自表2所示的寡核苷酸化合物的寡核苷酸化合物，其中一个大写字母代表一个β-D-氧基LNA核苷。小写字母代表DNA核苷，其中每个LNA胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶，而且其中核苷之间的核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接。
14.一种缀合物，包括根据实施方案1-13中任一项的寡核苷酸，以及至少一个共价连接到所述寡核苷酸的缀合物部分。
15.一种药物组合物，包含实施方案1-14的寡核苷酸或实施方案14的缀合物，以及药学上可接受的稀释剂、溶剂、载体、盐和/或佐剂。
16.一种用于调节表达CARD9的靶细胞中CARD9表达的体内或体外方法，所述方法包括以有效量向所述细胞施用实施方案1-13中任一项的寡核苷酸、根据实施方案14的缀合物或实施方案15的药物组合物。
17.一种治疗或预防疾病的方法，包括向患有或易患该疾病的受试者施用治疗或预防有效量的实施方案1-13中任何一项的寡核苷酸或根据实施方案14的缀合物或实施方案15的药物组合物。
18.实施方案17的方法，其中该疾病选自由炎症性肠病、胰腺炎、IgA肾病、原发性硬化性胆管炎、心血管疾病、癌症和糖尿病组成的组。
19.实施方案1-13中任何一项的寡核苷酸或根据实施方案14的缀合物或实施方案15的药物组合物，用于药物。
20.根据实施方案1-13中任一项的寡核苷酸或根据实施方案15的缀合物或实施方案15的药物组合物，用于选自由炎症性肠病、胰腺炎、IgA肾病、原发性硬化性胆管炎、心血管疾病、癌症和糖尿病组成的组的疾病的治疗或预防。
21.实施方案1-13的寡核苷酸或根据实施方案14的缀合物或实施方案15的药物组合物的用途，用于制备治疗或预防选自由炎症性肠病、胰腺炎、IgA肾病、原发性硬化性胆管炎、心血管疾病、癌症和糖尿病组成的组的疾病的药物。
项目清单
1.一种LNA反义寡核苷酸，长度为12-24个核苷，其中所述LNA反义寡核苷酸包含连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列包含存在于SEQ ID NO 70至SEQ ID NO：577中任一项中的至少10个连续核苷酸，其中该反义寡核苷酸能够在表达人CARD9的细胞中抑制人CARD9的表达；或其药学上可接受的盐。
2.根据第1项的LNA反义寡核苷酸，其中所述LNA反义寡核苷酸包含由至少12个存在于SEQ ID NO 70至SEQ ID NO:577中任一项中的连续核苷酸序列。
3.根据第1项的LNA反义寡核苷酸，其中所述LNA反义寡核苷酸包含由至少14个存在于SEQ ID NO 70至SEQ ID NO:577中任一项中的连续核苷酸序列。
4.根据第1-3项中任一项的LNA反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸是一种gapmer寡核苷酸，包括式5'-F-G-F'-3'的连续核苷酸序列，其中区域F和F'独立地包括1-8个糖修饰的核苷，而G是5-16个核苷之间的区域，能够招募RNaseH。
5.根据第4项的LNA反义寡核苷酸，其中区域F和F'的糖修饰的核苷独立地选自由2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA、2’-氨基-DNA、2’-氟-DNA、阿拉伯糖核酸(ANA)、2’-氟-ANA和LNA核苷组成的组。
6.根据第4或5项的LNA反义寡核苷酸，其中G区包含5-16个连续的DNA核苷。
7.根据第1-6项中任何一项的LNA反义寡核苷酸，其中该反义寡核苷酸是LNAgapmer寡核苷酸。
8.根据第4-7项中任何一项的LNA反义寡核苷，其中LNA核苷是β-D-氧基LNA核苷。
9.根据第1-8项中任何一项的LNA反义寡核苷酸，其中连续核苷酸序列之间的核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接。
10.根据第1-9项中任何一项的LNA反义寡核苷酸，其中该寡核苷酸包含选自由SEQID NO 70至SEQ ID NO:577组成的组的连续核苷酸序列。
11.根据第1-10项中任一项的LNA反义寡核苷酸，其中LNA反义寡核苷酸是选自表2所示寡核苷酸化合物的寡核苷酸化合物，其中大写字母代表LNA核苷，小写字母代表DNA核苷。
12.根据第1-11项中任一项的LNA反义寡核苷酸，其中LNA反义寡核苷酸是选自表2所示寡核苷酸化合物的寡核苷酸化合物，其中大写字母代表β-D-氧基LNA核苷。小写字母代表DNA核苷，其中每个LNA胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶，而核苷之间的核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接。
13.一种缀合物，包括根据第1-12项中任何一项的寡核苷酸，以及至少一个共价连接到所述寡核苷酸的缀合物部分。
14.一种药物组合物，包括项目1-12的寡核苷酸或项目13的缀合物和药学上可接受的稀释剂、溶剂、载体、盐和/或佐剂。
15.一种用于调节表达CARD9的靶细胞中CARD9表达的体内或体外方法，所述方法包括以有效量向所述细胞施用项目1-12中任一项的寡核苷酸、根据项目13的缀合物或项目14的药物组合物。
16.一种治疗或预防疾病的方法，包括向患有或易患该疾病的受试者施用治疗或预防有效量的第1-12项中任何一项的寡核苷酸或根据第13项的缀合物或第14项的药物组合物。
17.第16项的方法，其中该疾病选自由炎症性肠病、胰腺炎、IgA肾病、原发性硬化性胆管炎、心血管疾病、癌症和糖尿病组成的组。
18.第1-12项中任一项的寡核苷酸或根据第13项的缀合物或第14项的药物组合物，用于医药。
19.第1-12项中任何一项的寡核苷酸或根据第13项的结合物或第14项的药物组合物，用于治疗或预防选自炎症性肠病、胰腺炎、IgA肾病、原发性硬化性胆管炎、心血管疾病、癌症和糖尿病的疾病。
20.第1-12项的寡核苷酸或根据第13项的缀合物或第14项的药物组合物的用途，用于制备用于治疗或预防选自炎症性肠病、胰腺炎、IgA肾病、原发性硬化性胆管炎、心血管疾病、癌症和糖尿病的疾病的药物。
21.第17项的方法，第19项的寡核苷酸，或第20项的用途，其中该疾病是炎症性肠病。
实施例1测试LNA寡核苷酸以5μM和25μM在THP-1细胞系中的体外功效
使用表2中的LNA寡核苷酸(见"寡核苷酸化合物"一栏中列出的化合物)在人类细胞系中进行寡核苷酸筛选，靶向SEQ ID NO:1的不同区域(见表1)。人类细胞系THP-1购自ECACC(目录号：88081201，见表4)，按照供应商的建议保持在37℃、有5％CO2的湿润培养箱中。在筛选试验中，将细胞接种在圆底96多孔板中，使用供应商推荐的培养基(见表4)。细胞/孔的数量被优化为每孔50.000个细胞。
接种细胞并加入浓度为5或25μM的寡核苷酸(溶于PBS)。加入寡核苷酸三天后收获细胞。
使用Qiagen RNeasy 96kit(74182)根据包括DNase处理步骤的制造商的说明提取RNA。使用qScript XLT一步式RT-qPCR ToughMix Low ROX，95134-100(QuantaBiosciences)进行cDNA合成和qPCR。使用Integrated DNA Technologies的FAM标记的qPCR检测，与Thermo Fischer Scientific公司的VIC标记的GAPDH对照进行多重反应。对目的CARD9(Hs.Pt.58.19155478，FAM)和管家基因GAPDH(4326137E VIC-MGB探针)的的靶标转录物进行qPCR引物检测。使用的是技术性重复组设置，n＝1个生物学重复。
表3显示了相对CARD9 mRNA表达水平与对照组(PBS处理的细胞)的百分比，即数值越低，抑制作用越大。"Gene exp.5"和"Gene exp.25"是用5μM或25μM化合物处理后的CARD9mRNA表达水平。
表3:测试的寡核苷酸化合物的结果(关于化合物的更多信息，见表2)。
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细胞系
表4与实施例1中使用的细胞系有关的细节
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*所有培养基和添加剂均购自Sigma Aldrich。
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Claims (22)

1.一种反义寡核苷酸，长度为12-24个核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列包含存在于SEQ ID NO 70至SEQ ID NO：577任一项中的至少10个连续的核苷酸，其中，所述反义寡核苷酸能够在表达人CARD9的细胞中抑制人CARD9的表达；或其药学上可接受的盐。
2.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列包含存在于SEQ ID NO 70至SEQ ID NO:577任一项中的至少12个连续的核苷酸。
3.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列包含存在于SEQ ID NO 70至SEQ ID NO:577任一项中的至少14个连续的核苷酸。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸是一种gapmer寡核苷酸，所述gapmer寡核苷酸包含式5'-F-G-F'-3'的连续核苷酸序列，其中区域F和F'独立地包括1-8个糖修饰的核苷，并且G是5-16个核苷之间的区域，其能够招募RNaseH。
5.根据权利要求4的反义寡核苷酸，其中区域F和F'的糖修饰的核苷独立地选自由2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA、2’-氨基-DNA、2’-氟-DNA、阿拉伯糖核酸(ANA)、2’-氟-ANA和LNA核苷组成的组。
6.根据权利要求4或5所述的反义寡核苷酸，其中区域G包含5-16个连续的DNA核苷。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸是LNA反义寡核苷酸。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸是LNA gapmer寡核苷酸。
9.根据权利要求4-8中任一项的反义寡核苷，其中LNA核苷是β-D-氧基LNA核苷。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的反义寡核苷酸，其中连续的核苷酸序列之间的核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接。
11.根据权利要求1-10中任一项的反义寡核苷酸，其中该寡核苷酸包含连续的核苷酸序列，所述连续的核苷酸序列选自由SEQ ID NO 70至SEQ ID NO:577组成的组。
12.根据权利要求1-11中任一项的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸是选自表2所示寡核苷酸化合物的寡核苷酸化合物，其中大写字母代表核苷，小写字母代表DNA核苷。
13.根据权利要求1-12中任一项的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸是选自表2所示寡核苷酸化合物的寡核苷酸化合物，其中大写字母代表β-D-氧基LNA核苷，小写字母代表DNA核苷，小写c前的上标m代表5-甲基胞嘧啶DNA核苷，其中每个LNA胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶，核苷之间的核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接。
14.一种缀合物，包括根据权利要求1-13中任一项的寡核苷酸，以及至少一个共价连接到所述寡核苷酸的缀合物部分。
15.一种药物组合物，包括权利要求1-13的寡核苷酸或权利要求14的缀合物和药学上可接受的稀释剂、溶剂、载体、盐和/或佐剂。
16.一种体内或体外用于调节表达CARD9的靶细胞中CARD9表达的方法，所述方法包括以有效量向所述细胞施用权利要求1-13中任一项的寡核苷酸、根据权利要求14的缀合物或权利要求15的药物组合物。
17.一种治疗或预防疾病的方法，包括向患有或易患该疾病的受试者施用治疗或预防有效量的权利要求1-13中任一项的寡核苷酸或根据权利要求14的缀合物或权利要求15的药物组合物。
18.根据权利要求17的方法，其中该疾病选自由炎症性肠病、胰腺炎、IgA肾病、原发性硬化性胆管炎、心血管疾病、癌症和糖尿病组成的组。
19.权利要求1-13中任何一项的寡核苷酸或根据权利要求14的缀合物或权利要求15的药物组合物，用于医药。
20.权利要求1-13中任一项的寡核苷酸或根据权利要求14的缀合物或权利要求15的药物组合物，用于选自由炎症性肠病、胰腺炎、IgA肾病、原发性硬化性胆管炎、心血管疾病、癌症和糖尿病组成的组的疾病的治疗或预防。
21.权利要求1-13的寡核苷酸或根据权利要求14的缀合物或权利要求15的药物组合物的用途，用于制备治疗或预防选自由炎症性肠病、胰腺炎、IgA肾病、原发性硬化性胆管炎、心血管疾病、癌症和糖尿病组成的组的疾病的药物。
22.权利要求18的方法，权利要求20的寡核苷酸，或权利要求21的用途，其中所述疾病是炎症性肠病。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2023526096A (ja) * 2020-05-22 2023-06-20 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー Ｃａｒｄ９のスプライス調節のためのオリゴヌクレオチド

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
NZ503765A (en) 1997-09-12 2002-04-26 Exiqon As Bi-cyclic and tri-cyclic nucleotide analogues
BRPI0008131B8 (pt) 1999-02-12 2021-05-25 Daiichi Sankyo Co Ltd composto ou um sal deste, análogo de oligonucleotídeo, composição farmacêutica, sonda para um gene,iniciador para começar a amplificação, uso de um análogo de oligonucleotídeo ou de um sal deste farmacologicamente aceitável, agente antisentido, e, agente antígeno
CA2372085C (en) 1999-05-04 2009-10-27 Exiqon A/S L-ribo-lna analogues
US6617442B1 (en) 1999-09-30 2003-09-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Human Rnase H1 and oligonucleotide compositions thereof
US20030109428A1 (en) * 1999-12-01 2003-06-12 John Bertin Novel molecules of the card-related protein family and uses thereof
CA2994089A1 (en) 2002-11-18 2004-06-03 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense gapmer oligonucleotides
WO2007031091A2 (en) 2005-09-15 2007-03-22 Santaris Pharma A/S Rna antagonist compounds for the modulation of p21 ras expression
EP1984381B1 (en) 2006-01-27 2010-09-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-modified bicyclic nucleic acid analogs
ES2389737T3 (es) 2006-05-11 2012-10-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos modificados en 5'
US7666854B2 (en) 2006-05-11 2010-02-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bis-modified bicyclic nucleic acid analogs
DK2410053T4 (da) 2006-10-18 2020-08-31 Ionis Pharmaceuticals Inc Antisense-forbindelser
CA2688321A1 (en) 2007-05-30 2008-12-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs
WO2008154401A2 (en) 2007-06-08 2008-12-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbocyclic bicyclic nucleic acid analogs
ATE538127T1 (de) 2007-07-05 2012-01-15 Isis Pharmaceuticals Inc 6-disubstituierte bicyclische nukleinsäureanaloga
WO2009067647A1 (en) 2007-11-21 2009-05-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbocyclic alpha-l-bicyclic nucleic acid analogs
EP2356129B1 (en) 2008-09-24 2013-04-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted alpha-l-bicyclic nucleosides
EP2462153B1 (en) 2009-08-06 2015-07-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexose nucleic acid analogs
EP2580228B1 (en) 2010-06-08 2016-03-23 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Substituted 2'-amino and 2'-thio-bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
EP3467109A1 (en) 2011-02-08 2019-04-10 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising bicyclic nucleotides and uses thereof
EP4269584A3 (en) 2011-08-11 2024-03-27 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Selective antisense compounds and uses thereof
EP2850092B1 (en) 2012-04-09 2017-03-01 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Tricyclic nucleic acid analogs
KR20160074368A (ko) * 2012-05-16 2016-06-28 라나 테라퓨틱스, 인크. Utrn 발현을 조절하기 위한 조성물 및 방법
CA2889596C (en) 2012-11-15 2022-08-23 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotide conjugates
CA2935426C (en) 2014-01-30 2023-07-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Polyoligomer compound with biocleavable conjugates for reducing or inhibiting expression of a nucleic acid target
EP3568477A1 (en) * 2017-01-13 2019-11-20 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligonucleotides for modulating rela expression

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