CN113004358A - 一种硒或硫代胸腺嘧啶核苷-5’-三磷酸及其合成方法 - Google Patents

一种硒或硫代胸腺嘧啶核苷-5’-三磷酸及其合成方法 Download PDF

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CN113004358A CN202110321200.7A CN202110321200A CN113004358A CN 113004358 A CN113004358 A CN 113004358A CN 202110321200 A CN202110321200 A CN 202110321200A CN 113004358 A CN113004358 A CN 113004358A
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Abstract

本发明公开一种硒或硫代胸腺嘧啶核苷‑5’‑三磷酸及其合成方法，部分合成步骤：化合物3或1与三氯乙酸进行脱保护反应，分别得到SeT即是4Se或ST即是4S；然后，通过一锅合成法将化合物4Se和4S分别转化为化合物5Se和5S，SeTTP即是化合物5Se和STTP即是化合物5S；接下来，将化合物5Se和5S纯化后通过进行表征，以确认其结构和纯度，然后用SeTTP或STTP和DNA聚合酶进行DNA酶促合成，得到化合物6，即是Se‑DNA或S‑DNA或硒硫代Se/S‑DNA；本发明通过创新合成SeTTP和STTP的方法，以及创新DNA聚合酶促合成的方法，建立了硒或硫原子特异性修饰策略SAM,以抑制DNA聚合中的T/G错配，提高碱基配对的特异性，并证明了SAM方法可以提高聚合酶反应、核酸分子识别和分子检测的准确性和灵敏性。

Description

一种硒或硫代胸腺嘧啶核苷-5’-三磷酸及其合成方法
技术领域
本发明涉及修饰三磷酸合成以及核酸分子检测技术领域，尤其涉及一种硒或硫代胸腺嘧啶核苷-5’-三磷酸及其核酸合成以及核酸分子检测运用的方法。
背景技术
核酸分子检测和核酸测序是病原体、肿瘤、疾病和环境检测鉴定和流行病控制的重要基础和依据。其中，碱基配对是核酸分子识别的基础，它们在研究包括核酸诊断、分子序列识别、测序分析、遗传信息存储、DNA复制、RNA转录和蛋白质翻译，等等机制发现和实际应用方面具有重要意义。此外，DNA碱基(T/A和C/G)的正常准确配对和堆叠决定了DNA双链的结构和稳定性。然而，RNA中的非正常碱基对(如U/G)，使RNA结构多样化，增强RNA功能，如核酶和病毒的RNA。但是，在DNA识别和合成中并不欢迎非正常碱基对(如碱基摆动配对T/G，典型的错配)，因为它们会导致突变并降低DNA聚合的特异性。T/G配对的产生是通过胸腺嘧啶碱基上2-氧形成G摆动氢键导致的，而2-氧并不参与T/A碱基对。由于在同族元素中，硒的原子半径
Figure BDA0002992906620000011
比氧的原子半径
Figure BDA0002992906620000012
大得多，而且硒形成的氢键能力很差，2-硒并不参与SeT/A配对，因此，硒修饰后，2-硒胸腺嘧啶碱基不再与G碱基摆动配对，但并不影响2-硒胸腺嘧啶碱基与A碱基配对。
现有技术中，主要使用商业化的RT-PCR或PCR或RT-qPCR或qPCR核酸检测试剂盒进行病原体、肿瘤、疾病和环境核酸的检测。在RNA反转录(RT,reverse transcription)之后，DNA分子检测的基本原理如下所述：以TaqMan探针为例，TaqMan探针是一段寡核苷酸单链，与目标DNA互补，探针两端分别有一个报告基团和一个淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，不会检测到荧光，PCR扩增时，Taq DNA聚合酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，报告基团释放并发出荧光。每合成一条DNA链，就会切断一条探针，并产生一个单位荧光信号，信号的强度与结合到DNA链上的探针成正比，如图1所示。
现有技术最大的痛点问题在于针对低拷贝数下，病原体、肿瘤、疾病和环境核酸样本检测的灵敏的不够高，导致假阴性结果的产生。这是因为现有技术在检测过程中，由于有错配的存在(尤其是典型的T/dG和T/rG摆动错配)，会导致低拷贝核酸分子的信号偏弱，背景噪音会将其淹没，无法被仪器准确检测到。由于病原体有可能会快速传播(例如新冠病毒)，因此，解决假阴性的痛点问题显得尤为重要。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种硒或硫代胸腺嘧啶核苷-5’-三磷酸及其合成方法，用硒或硫取代碱基2-氧原子得到的2-Se-胸苷三磷酸(SeTTP)或2-S-胸苷三磷酸(STTP)，可用于DNA聚合过程以抑制T/G错配的产生，同时不会对原有结构造成显著改变，在加入SeTTP或STTP后，可以极大的提高碱基配对的准确性，从而使得反应的准确性和灵敏性得到提高，即使是极低拷贝数的病原体样本也能够被检测到。我们的发明通过创新合成SeTTP和STTP的方法，以及创新DNA聚合酶促合成的方法，建立了硒或硫原子特异性修饰策略(SAM,Selenium or SulfurAtom-specific Modification ofNucleic Acids)，以抑制DNA聚合中的T/G错配，提高碱基配对的特异性，并证明了SAM方法可以提高聚合酶反应、核酸分子识别和分子检测的准确性和灵敏性。
为了实现上述技术方案，本发明提供了一种硒代胸腺嘧啶核苷-5’-三磷酸，该硒代胸腺嘧啶核苷-5’-三磷酸为化合物5Se，即SeTTP，其分子结构为
Figure BDA0002992906620000031
所述化合物5Se由化合物4Se通过一锅合成法转化为SeTTP,所述化合物4Se为2-Se-T核苷，分子结构为
Figure BDA0002992906620000032
所述化合物4Se是通过化合物3与三氯乙酸进行脱保护反应，得到SeT，即化合物4Se,所述化合物3；所述化合物3的分子结构为
Figure BDA0002992906620000041
其中X为Se,Z为O,R2为-CH3,R3为H-，R1为Tr-、MMTr-、DMTr-、TMTr-、TBDMS-、CH3CO-或H-。
为了实现上述技术方案，本发明还提供了一种硫代胸腺嘧啶核苷-5’-三磷酸的创新合成，该硫代胸腺嘧啶核苷-5’-三磷酸为化合物5S，即STTP，其分子结构为
Figure BDA0002992906620000042
所述化合物5S由化合物4S通过一锅合成法转化为STTP,所述化合物4S为2-S-T核苷，分子结构为
Figure BDA0002992906620000043
所述化合物4S是通过化合物1与三氯乙酸进行脱保护反应，得到ST，即化合物4S,所述化合物1；所述化合物1的分子结构为
Figure BDA0002992906620000051
其中X为S,Z为O,R2为-CH3,R3为H-，R1为Tr-、MMTr-、DMTr-、TMTr-、TBDMS-、CH3CO-或H-。
该发明的进一步说明在于:所述化合物3和1为一种嘧啶核苷类似物，其分子结构为
Figure BDA0002992906620000052
其中R1为Tr-、MMTr-、DMTr-、TMTr-、TBDMS-、CH3CO-或H-；
R2为H-、F-、Cl-、Br-、I-、-OH、-SH、-NH2、-CH3、-CH2F、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2I、-CH2CH3、-CH2OH、-CH2SH、-CH2NH2、-CH2OCH3、-CH2SCH3、-CH2NHCH3、CH3COO-、CH3CO-、-CHO或-COOH；
R3为Tr-、MMTr-、DMTr-、TMTr-、TBDMS-、CH3CO-或H-；
Z为Te、Se、S或O；
X为Te、Se、S或O；
X和Z不同时为O。
进一步改进在于:所述化合物3的部分是通过化合物2与NaSeH反应以完成硒取代，并得到化合物3，所述化合物2的分子结构为
Figure BDA0002992906620000061
其中R1为Tr-、MMTr-、DMTr-、TMTr-、TBDMS-、CH3CO-或H-；
R2为H-、F-、Cl-、Br-、I-、-OH、-SH、-NH2、-CH3、-CH2F、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2I、-CH2CH3、-CH2OH、-CH2SH、-CH2NH2、-CH2OCH3、-CH2SCH3、-CH2NHCH3、CH3COO-、CH3CO-、-CHO或-COOH；
R3为Tr-、MMTr-、DMTr-、TMTr-、TBDMS-、CH3CO-或H-；
R4为-CH3、-CH2F、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2I、-CH2CH3、-CH2OH、-CH2SH、-CH2NH2、-CH2OCH3、-CH2SCH3、或-CH2NHCH3；
Z为Te、Se、S或O；
X为S或O；
一种硒代胸腺嘧啶核苷-5’-三磷酸的化学合成方法，包括以下合成步骤：
步骤一：采用5′-DMTr-2-硫代胸苷作为化合物1，用CH3I烷基化2-硫基官能团以活化2-硫基部分得到化合物2；
步骤二：化合物2与NaSeH反应以完成硒取代，得到化合物3；
步骤三：化合物3与三氯乙酸进行脱保护反应，得到SeT，即化合物4Se；
步骤四：通过一锅合成法将化合物4Se转化为SeTTP，即化合物5Se；
步骤五：将化合物5Se纯化后通过核磁共振、质谱和高效液相色谱对其进行表征，以确认其结构和纯度，然后用SeTTP和DNA聚合酶进行DNA酶促合成。
进一步改进在于：在步骤一中，将化合物1溶于干燥的二氯甲烷中，然后添加甲苯，在室温下将N,N-二异丙基乙胺和碘甲烷添加到反应混合物中，用薄层色谱板监测反应，反应时间为0.5-1h；再向反应体系中加入甲醇并搅拌5分钟以终止反应；旋干有机相，然后添加二氯甲烷；有机层用去离子水洗涤一次，然后用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤三次；将有机相用无水硫酸镁干燥，旋干，过柱纯化，得到化合物2。
进一步改进在于：在步骤二中，在0℃下，向硒和硼氢化钠中加入无水乙醇得到NaSeH溶液，反应时间为0.5h，反应结束后为透明溶液；再将乙醇溶液添加到化合物2中并且在氩气下搅拌该混合物过夜，旋干，加入乙酸乙酯，再用水洗涤有机相三次，然后用无水硫酸镁干燥，过柱纯化，得到化合物3。
进一步改进在于：在步骤三中，将化合物3置于干燥的圆底烧瓶中，然后添加含有巯基乙醇的二氯甲烷，向烧瓶中逐滴加入三氯乙酸溶液，搅拌10分钟，当有沉淀产生，用TLC板监测反应；待反应完成后，收集沉淀并用DCM洗涤，得到化合物4Se。
进一步改进在于：在步骤四中，在干燥的圆底烧瓶中放入一干燥的磁力搅拌子和SeT，将三丁基焦磷酸胺加入到另一个装有磁力搅拌子的干燥圆底烧瓶中，均用油泵干燥过夜；然后将2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷杂环-4-酮添加到另一个装有磁力搅拌子的干燥圆底烧瓶中，并用真空泵抽干15分钟,氩气置换三次；用注射器注入无水DMF和无水三丁胺以溶解三丁基焦磷酸胺试剂A；将2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷杂环-4-酮溶解于无水DMF中，并转移至三丁基焦磷酸胺的试剂A中，同时在氩气下搅拌30分钟后成为试剂B；将干燥的化合物4Se溶解在无水DMF中，然后用注射器转移到试剂B中，在氩气下搅拌1h，然后向体系中逐滴加入碘的DMF/水溶液，待体系呈现稳定的亮黄色后再搅拌0.5小时，然后添加三乙胺和水，继续搅拌1.5h；反应完毕后将体系转移至50mL EP管中用乙醇沉淀；将离心管置于-80℃或-20℃下1h，再以3000rpm离心30min，去除上清并挥干白色沉淀；重复一次以上沉淀操作，最后，用高效液相色谱法纯化粗产物，得到化合物5Se，也就是SeTTP。
一种硫代胸腺嘧啶核苷-5’-三磷酸的化学合成方法，包括以下合成步骤：
步骤一：化合物1与三氯乙酸进行脱保护反应，得到ST，即化合物4S；
步骤二：通过一锅合成法将化合物4S转化为STTP，即化合物5S；
步骤三：将化合物5S纯化后通过质谱和高效液相色谱对其进行表征，以确认其结构和纯度，然后用STTP和DNA聚合酶进行DNA酶促合成。
进一步改进在于：在步骤一中，将化合物1置于干燥的圆底烧瓶中，然后添加含有巯基乙醇的二氯甲烷，向烧瓶中逐滴加入三氯乙酸溶液，搅拌10分钟，当有沉淀产生，用TLC板监测反应；待反应完成后，收集沉淀并用DCM洗涤，得到化合物4S。
进一步改进在于：在步骤二中，在干燥的圆底烧瓶中放入一干燥的磁力搅拌子和ST，将三丁基焦磷酸胺加入到另一个装有磁力搅拌子的干燥圆底烧瓶中，均用油泵干燥过夜；然后将2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷杂环-4-酮添加到另一个装有磁力搅拌子的干燥圆底烧瓶中，并用真空泵抽干15分钟,氩气置换三次；用注射器注入无水DMF和无水三丁胺以溶解三丁基焦磷酸胺试剂A；将2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷杂环-4-酮溶解于无水DMF中，并转移至三丁基焦磷酸胺的试剂A中，同时在氩气下搅拌30分钟后成为试剂B；将干燥的化合物4S溶解在无水DMF中，然后用注射器转移到试剂B中，在氩气下搅拌1h，然后向体系中逐滴加入碘的DMF/水溶液，待体系呈现稳定的亮黄色后再搅拌0.5小时，然后添加三乙胺和水，继续搅拌1.5h；反应完毕后将体系转移至50mL EP管中用乙醇沉淀；将离心管置于-80℃或-20℃下1h，再以3000rpm离心30min，去除上清并挥干白色沉淀；重复一次以上沉淀操作，最后，用高效液相色谱法纯化粗产物，得到化合物5S，也就是STTP。
本发明的有益效果是：本发明创新设计并且合成了SeTTP，也用创新方法合成了STTP，用SeTTP和STTP与DNA聚合酶进行DNA酶促合成，并通过DNA聚合酶反应合成了Se-DNA或S-DNA或硒硫代Se/S-DNA，发现DNA聚合酶可以像识别TTP那样有效地识别SeTTP和STTP；此外，SeTTP对T/G错配有很强的抑制作用，配对准确性大约比TTP高出1万倍以上，STTP对T/G错配有很强的抑制作用，配对准确性有较大提高；本发明独特的SAM策略在DNA聚合、扩增以及RNA和DNA的分子检测(如RT-qPCR)方面具有高度的准确性、灵敏性、序列完整性和产物纯度；本发明为研究碱基对识别、分子相互作用和核酸聚合(如DNA复制、RNA合成和反转录)提供了一种新的方法；并且本发明的SAM策略可以通过提高核酸检测的准确性和灵敏性,以减少对病原体、肿瘤、疾病和环境检测的误诊，尤其使得本发明它在COVID-19流行病控制和预防中极为有用。
附图说明
图1为现有RT-qPCR核酸检测试剂盒进行病毒核酸检测的核心示意图。
图2为本发明的硒或硫代胸腺嘧啶核苷-5’-三磷酸的合成方法示意图。
图3为本发明的化合物2的合成示意图。
图4为本发明的化合物3的合成示意图。
图5为本发明的化合物4Se的合成示意图。
图6为本发明的化合物5Se的合成示意图。
图7为本发明的SeT的1H-NMR示意图。
图8为本发明的SeT的13C-NMR示意图。
图9为本发明的SeT的质谱图。
图10为本发明的SeTTP的1H-NMR示意图。
图11为本发明的SeTTP的13C-NMR示意图。
图12为本发明的SeTTP的31P-NMR示意图。
图13为本发明的SeTTP的质谱图。
具体实施方式
为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明做进一步详述，本实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。
实施例一
根据图1-13所示，本实施例提供了一种硒代胸腺嘧啶核苷-5’-三磷酸及其合成方法，其特征在于，包括以下合成步骤：
步骤一：采用5′-DMTr-2-硫代胸苷作为化合物1，用CH3I烷基化2-硫基官能团以活化2-硫基部分得到化合物2
步骤二：化合物2与新鲜制备的NaSeH反应以完成硒取代，以80％的产率得到化合物3
步骤三：化合物3与三氯乙酸进行脱保护反应，得到SeT，即化合物4
步骤四：通过一锅合成法将化合物4Se转化为SeTTP，即化合物5Se
步骤五：将化合物5Se纯化后通过核磁共振、质谱和高效液相色谱对其进行表征，以确认其结构和纯度，然后用SeTTP和DNA聚合酶进行DNA酶促合成，所述DNA聚合酶可以采用Klenow和Taq
如图3所示，在步骤一中，将化合物1溶于干燥的二氯甲烷中(DCM，10ml)，然后添加5ml甲苯，在室温下将N,N-二异丙基乙胺(DIEA，0.69g，5.34mmol)和碘甲烷(0.76g，5.35mmol)添加到反应混合物中，用TLC薄层色谱板监测反应(10％甲醇溶于二氯甲烷中，
Figure BDA0002992906620000121
)，反应时间为0.5-1h；再向反应体系中加入5mL甲醇并搅拌5分钟以终止反应；旋干有机相，然后添加50mL二氯甲烷；有机层用50mL的去离子水洗涤一次，然后用50mL饱和碳酸氢钠水溶液洗涤三次；将有机相用无水硫酸镁干燥，旋干；过柱纯化(流动相为含5％甲醇的二氯甲烷)，得到产率为89％的化合物2(0.92g，1.59mmol)，经核磁共振和质谱分析。
如图4所示，在步骤二中，在0℃下，向硒(0.41g，5.19mmol)和硼氢化钠(NaBH4，0.25g，6.61mmol)中加入5mL无水乙醇得到NaSeH溶液，反应时间为0.5h，反应结束后为透明溶液；再将乙醇溶液添加到化合物2(0.5g，0.87mmol)中并且在氩气下搅拌该混合物过夜，旋干，加入5mL乙酸乙酯，再用水洗涤有机相三次(3×30ml)，然后用无水硫酸镁干燥，过柱纯化(流动相为含5％甲醇的二氯甲烷)，得到产率为83％的化合物3(0.44g，0.72mmol)，经核磁共振和质谱分析。
如图5所示，在步骤三中，将化合物3(0.22g，0.38mmol)置于干燥的10mL圆底烧瓶中，然后添加含有巯基乙醇(0.2g，2.56mmol，7当量)的二氯甲烷(5mL，DCM)，向烧瓶中逐滴加入三氯乙酸(TCA)溶液(1mL 10％TCA，DCM，m/v)；搅拌10分钟，当有沉淀产生，用TLC板监测反应(含10％甲醇的二氯甲烷，Rf＝0.3)；待反应完成后，收集沉淀并用少量DCM洗涤，得到产率为95％的化合物4Se(0.10g，0.34mmol)，核磁共振和质谱分析结果如图7-图9所示：
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:13.00(s,1H),8.08(s,1H),6.94(t,J＝6.5Hz,1H),5.28(d,J＝4.1Hz,1H),5.20(t,J＝4.9Hz,1H),4.27(dq,J＝7.4,3.8Hz,1H),3.87(q,J＝3.3Hz,1H),3.66(qdd,J＝12.1,5.0,3.3Hz,2H),2.30(ddd,J＝13.4,6.2,3.7Hz,1H),2.05(dt,J＝13.3,6.5Hz,1H),1.80(d,J＝1.2Hz,3H)；
13C-NMR(101MHz,DMSO-d6)δ:173.62,160.48,137.21,117.45,92.75,88.68,70.25,61.18,13.21。
分子式:C10H14N2O4Se；测量值[M+H+]+:307.0190(计算值.307.0197),误差：2.3ppm；测量值[M+Na+]+:329.0012(计算值.329.0017),误差:1.5ppm.
如图6所示，在步骤四中，在干燥的10ml圆底烧瓶中放入一干燥的磁力搅拌子和SeT(452.3mg，0.17mmol)，将三丁基焦磷酸胺(170.4mg，0.37mmol，2eqv.)加入到另一个装有磁力搅拌子的干燥25mL圆底烧瓶中，均用油泵干燥过夜；然后将2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷杂环-4-酮(40mg，0.2mmol，1.2当量)添加到另一个装有磁力搅拌子的干燥的5mL圆底烧瓶中，并用真空泵抽干15分钟，氩气置换三次后，用注射器注入0.3mL无水DMF和0.6mL无水三丁胺以溶解三丁基焦磷酸胺(试剂1)；将2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷杂环-4-酮溶解于0.6mL无水DMF中，用另一注射器转移至试剂1，在氩气下搅拌30分钟(试剂2)；将干燥的化合物4Se溶解在0.3mL无水DMF中，然后用注射器转移到试剂2中，在氩气下搅拌1h，然后加入溶解在DMF和水(95:5)溶液(5mL)中的碘(30mg，0.12mmol)；待形成稳定的亮黄色溶液后将反应再搅拌0.5小时，然后添加三乙胺(54mg，0.53mmol，3eqv.)和水(5mL)，继续搅拌1.5h，反应完毕后将体系转移至50mL EP管中用乙醇沉淀(例如，对于1mL水溶液，添加0.1mL 3MNaCl，然后添加3mL乙醇)；将离心管置于-80℃或-20℃下1h，再以3000rpm离心30min。去除上清并挥干白色沉淀；重复一次以上沉淀操作，最后，用高效液相色谱法纯化粗产物，得到产率为12％的化合物5Se(11.1mg，0.02mmol),核磁共振和质谱分析结果如图10-图13所示：
本实施例在实验中采用安捷伦1260高效液相色谱仪和月旭液相色谱柱。缓冲液A为：三乙胺乙酸盐溶液,20mM,pH 7.0；缓冲液B为:含有50％乙腈的三乙胺乙酸盐溶液,20mM,pH 7.0。在1mL/min的流速下洗脱30min，程序中缓冲液B的比例从2％变到15％。SeTTP的保留时间约在15分钟。
1H-NMR(400MHz,deuterium oxide)δ:7.99–7.94(m,1H),7.01(t,J＝6.5Hz,1H),4.63(dt,J＝6.8,3.6Hz,1H),4.21(d,J＝11.6Hz,3H),3.14(q,J＝7.3Hz,20H),3.00(d,J＝10.4Hz,1H),2.35–2.24(m,1H),1.92(s,3H),1.38(t,J＝7.3Hz,1H),1.22(t,J＝7.3Hz,28H)；
13C-NMR(101MHz,deuterium oxide)δ:138.05,119.41,92.95,86.39,86.30,70.23,65.08,46.66,42.18,39.11,12.24,8.25；
31P-NMR(162MHz,deuterium oxide)δ:-10.10,-11.74,-23.15；
分子式:C10H17N2O13P3Se；测量值[M-H+]-:544.9031(计算值.544.9036),误差：0.92ppm。
COVID-19rna模板：模板用T7 HighYield RNA Synthesis Kit(购自NEB)转录。从另外两个质粒中克隆了相应的DNA模板，分别含有COVID-19病毒ORF1ab和N基因序列。转录的RNA模板用Monarch RNA Cleanup Kit(购自NEB)纯化。
所述化合物2为5'-DMTr-MeST，分子结构为
Figure BDA0002992906620000151
所述化合物3为5’-DMTr组，分子结构为
Figure BDA0002992906620000161
所述化合物4Se为2-Se-T核苷，分子结构为
Figure BDA0002992906620000162
所述化合物5Se为硒代胸腺嘧啶核苷-5’-三磷酸，即SeTTP，其分子结构为
Figure BDA0002992906620000163
碱基错配会影响DNA聚合反应的准确性，导致DNA复制产生突变和错误的检测结果。为了解决碱基错配问题，本实施例首次合成了2-Se-胸腺嘧啶核苷三磷酸(SeTTP)以抑制DNA聚合中的T/G错配，并证明其可以提高聚合酶反应和检测的特异性和灵敏性。尤其是在低病毒拷贝数下，对临床COVID-19病毒RNA检测的灵敏度相较传统的RT-qPCR试剂盒有显著提升，从而能够从较大程度上解决核酸检测中假阳性和假阴性的技术问题。
本发明的优点在于能够提高核酸检测的准确性，而且使用简单，只需要在原有体系中按照一定比例补加适量化合物SeTTP即可，不需要进行其他方面的任何改动。针对当下的疫情检测，可以有效减少假阴性结果。
本实施例合成了2-Se-三磷酸胸苷(SeTTP)并建立了硒原子特异性修饰(SAM)策略，以抑制DNA聚合中的T/G错配，并证明了SAM方法可以提高聚合酶反应和检测的特异性和灵敏性。我们发现SAM能有效抑制DNA聚合和检测中非特异性产物的形成，使准确性提高约10000倍。同时，向体系中加入SeTTP后可以在低拷贝数下检测到临床COVID-19病毒的RNA，而传统的RT-qPCR试剂盒则不能。
实施例二
如图1所示，本实施例提供了一种硫代胸腺嘧啶核苷-5’-三磷酸化学合成方法，包括以下合成步骤：
步骤一：采用5′-DMTr-2-硫代胸苷作为起始反应物，即化合物1，化合物1与三氯乙酸进行脱保护反应，得到ST，即化合物4S；
步骤二：通过一锅合成法将化合物4S转化为STTP，即化合物5S；
步骤三：将化合物5S纯化后对其进行表征，以确认其结构和纯度，然后用STTP和DNA聚合酶进行DNA酶促合成；本发明通过创新合成三磷酸的方法,例如2-硫代胸腺嘧啶核苷-5’-三磷酸(STTP)建立了硫原子特异性修饰策略(SAM,Sulfur Atom-specificModification of Nucleic Acids)，以抑制DNA聚合中的T/G错配，提高碱基配对的特异性，并证明了SAM方法可以提高聚合酶反应、核酸分子识别和分子检测的准确性和灵敏性。
所述化合物4S的分子结构为
Figure BDA0002992906620000181
所述化合物5S的分子结构为
Figure BDA0002992906620000182
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (19)

1.一种硒代胸腺嘧啶核苷-5’-三磷酸，其特征在于：该2-硒代胸腺嘧啶核苷-5’-三磷酸为化合物5Se，即SeTTP，其分子结构为
Figure FDA0002992906610000011
2.一种硒代胸腺嘧啶核苷，其特征在于：该2-硒代胸腺嘧啶核苷为化合物4Se，即SeT，其分子结构为
Figure FDA0002992906610000012
3.根据权利要求1所述的一种硒代胸腺嘧啶核苷-5’-三磷酸,其特征在于:所述化合物5Se由化合物4Se通过一锅合成法转化为化合物5Se，即SeTTP。
4.根据权利要求3所述的一种硒代胸腺嘧啶核苷-5’-三磷酸,其特征在于:所述化合物4Se是通过化合物3与三氯乙酸进行脱保护反应，得到SeT，即化合物4Se；所述化合物3的分子结构为
Figure FDA0002992906610000013
其中X为Se,Z为O,R2为-CH3,R3为H-，R1为Tr-、MMTr-、DMTr-、TMTr-、TBDMS-、CH3CO-或H-。
5.一种硫代胸腺嘧啶核苷-5’-三磷酸，其特征在于：5S即是STTP，其分子结构为
Figure FDA0002992906610000021
其由化合物4S通过一锅合成法转化为化合物5S，即STTP,所述化合物4S为2-S-T核苷，分子结构为
Figure FDA0002992906610000022
6.根据权利要求5所述的一种硫代胸腺嘧啶核苷-5’-三磷酸,其特征在于:所述化合物4S是通过化合物1与三氯乙酸进行脱保护反应，得到ST，即化合物4S；所述化合物1的分子结构为
Figure FDA0002992906610000023
其中X为S,Z为O,R2为-CH3,R3为H-，R1为Tr-、MMTr-、DMTr-、TMTr-、TBDMS-、CH3CO-或H-。
7.根据权利要求6所述的一种嘧啶核苷类似物，其分子结构为
Figure FDA0002992906610000031
其中R1为Tr-、MMTr-、DMTr-、TMTr-、TBDMS-、CH3CO-或H-；
R2为H-、F-、Cl-、Br-、I-、-OH、-SH、-NH2、-CH3、-CH2F、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2I、-CH2CH3、-CH2OH、-CH2SH、-CH2NH2、-CH2OCH3、-CH2SCH3、-CH2NHCH3、CH3COO-、CH3CO-、-CHO或-COOH；
R3为Tr-、MMTr-、DMTr-、TMTr-、TBDMS-、CH3CO-或H-；
Z为Te、Se、S或O；
X为Te、Se、S或O；
X和Z不同时为O
8.根据权利要求1、2、3、4所述的一种硒代胸腺嘧啶核苷-5’-三磷酸的化学合成方法，其特征在于，包括以下合成步骤：
步骤一：采用5′-DMTr-2-硫代胸苷作为化合物1，用CH3I烷基化2-硫基官能团以活化2-硫基部分得到化合物2；
步骤二：化合物2与NaSeH反应以完成硒取代，得到化合物3；
步骤三：化合物3与三氯乙酸进行脱保护反应，得到SeT，即化合物4Se；
步骤四：通过一锅合成法将化合物4Se转化为SeTTP，即化合物5Se；
步骤五：将化合物5Se纯化后通过核磁共振、质谱和高效液相色谱对其进行表征，以确认其结构和纯度，然后用SeTTP和DNA聚合酶进行DNA酶促合成。
9.根据权利要求8所述的一种硒代胸腺嘧啶核苷-5’-三磷酸的化学合成方法，其特征在于：在步骤一中，将化合物1溶于干燥的二氯甲烷中，然后添加甲苯，在室温下将N,N-二异丙基乙胺和碘甲烷添加到反应混合物中，用薄层色谱板监测反应，反应时间为0.5-1h；再向反应体系中加入甲醇并搅拌5分钟以终止反应；旋干有机相，然后添加二氯甲烷；有机层用去离子水洗涤一次，然后用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤三次；将有机相用无水硫酸镁干燥，旋干，过柱纯化，得到化合物2。
10.根据权利要求8所述的一种硒代胸腺嘧啶核苷-5’-三磷酸的化学合成方法，其特征在于：在步骤二中，在0℃下，向硒和硼氢化钠中加入无水乙醇得到NaSeH溶液，反应时间为0.5h，反应结束后为透明溶液；再将乙醇溶液添加到化合物2中并且在氩气下搅拌该混合物过夜，旋干，加入乙酸乙酯，再用水洗涤有机相三次，然后用无水硫酸镁干燥，过柱纯化，得到化合物3。
11.根据权利要求8所述的一种硒代胸腺嘧啶核苷-5’-三磷酸的化学合成方法，其特征在于：在步骤三中，将化合物3置于干燥的圆底烧瓶中，然后添加含有巯基乙醇的二氯甲烷，向烧瓶中逐滴加入三氯乙酸溶液，搅拌10分钟，当有沉淀产生，用TLC板监测反应；待反应完成后，收集沉淀并用DCM洗涤，得到化合物4Se。
12.根据权利要求8所述的一种硒代胸腺嘧啶核苷-5’-三磷酸的化学合成方法，其特征在于：在步骤四中，在干燥的圆底烧瓶中放入一干燥的磁力搅拌子和SeT，将三丁基焦磷酸胺加入到另一个装有磁力搅拌子的干燥圆底烧瓶中，均用油泵干燥过夜；然后将2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷杂环-4-酮添加到另一个装有磁力搅拌子的干燥圆底烧瓶中，并用真空泵抽干15分钟,氩气置换三次；用注射器注入无水DMF和无水三丁胺以溶解三丁基焦磷酸胺试剂A；将2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷杂环-4-酮溶解于无水DMF中，并转移至三丁基焦磷酸胺的试剂A中，同时在氩气下搅拌30分钟后成为试剂B；将干燥的化合物4溶解在无水DMF中，然后用注射器转移到试剂B中，在氩气下搅拌1h，然后向体系中逐滴加入碘的DMF/水溶液，待体系呈现稳定的亮黄色后再搅拌0.5小时，然后添加三乙胺和水，继续搅拌1.5h；反应完毕后将体系转移至50mL EP管中用乙醇沉淀；将离心管置于-80℃或-20℃下1h，再以3000rpm离心30min，去除上清并挥干白色沉淀；重复一次以上沉淀操作，最后，用高效液相色谱法纯化粗产物，得到化合物5Se，也就是SeTTP。
13.根据权利要求5、6、7所述一种硫代胸腺嘧啶核苷-5’-三磷酸的化学合成方法，其特征在于：包括以下合成步骤：
步骤一：采用5′-DMTr-2-硫代胸苷作为起始反应物，即化合物1，化合物1与三氯乙酸进行脱保护反应，得到ST，即化合物4S；
步骤二：通过一锅合成法将化合物4S转化为STTP，即化合物5S；
步骤三：将化合物5S纯化后对其进行表征，以确认其结构和纯度，然后用STTP和DNA聚合酶进行DNA酶促合成。
14.根据权利要求1或5所述的SeTTP和STTP的应用，其特征在于：用SeTTP和DNA聚合酶进行DNA酶促合成，得到化合物6，即是Se-DNA；通过创新合成SeTTP和STTP的方法，以及创新DNA聚合酶促合成的方法，建立了硒原子特异性修饰策略SAM，以抑制DNA聚合中的T/G错配，提高碱基配对的特异性，大大提高聚合酶反应、核酸分子识别和分子检测的准确性和灵敏性。
15.根据权利要求1或5所述的SeTTP和STTP的应用，其特征在于：用STTP和DNA聚合酶进行DNA酶促合成，得到化合物6，即是S-DNA；通过创新合成SeTTP和STTP的方法，以及创新DNA聚合酶促合成的方法，建立了硫原子特异性修饰策略SAM，以抑制DNA聚合中的T/G错配，提高碱基配对的特异性，大大提高聚合酶反应、核酸分子识别和分子检测的准确性和灵敏性。
16.根据权利要求1或5所述的SeTTP和STTP的应用，其特征在于：用SeTTP和STTP和DNA聚合酶进行DNA酶促合成，得到化合物6，即是硒硫代Se/S-DNA；通过创新合成SeTTP和STTP的方法，以及创新DNA聚合酶促合成的方法，建立了硒和硫原子特异性修饰策略SAM,以抑制DNA聚合中的T/G错配，提高碱基配对的特异性，大大提高聚合酶反应、核酸分子识别和分子检测的准确性和灵敏性。
17.根据权利要求1或5所述的SeTTP和STTP的应用，其特征在于：用SeTTP和DNA聚合酶以及其它dNTPs,进行DNA酶促合成、RT-PCR或PCR或RT-qPCR或qPCR分子检测、LAMP或LAMP分子检测、或其它核酸分子检测，抑制DNA聚合中的T/G错配，提高碱基配对的特异性，大大提高聚合酶反应、核酸分子识别和分子检测的准确性和灵敏性。
18.根据权利要求1或5所述的SeTTP和STTP的应用，其特征在于：用STTP和DNA聚合酶以及其它dNTPs,进行DNA酶促合成、RT-PCR或PCR或RT-qPCR或qPCR分子检测、LAMP或LAMP分子检测，抑制DNA聚合中的T/G错配，提高碱基配对的特异性，大大提高聚合酶反应、核酸分子识别和分子检测的准确性和灵敏性。
19.根据权利要求1或5所述的SeTTP和STTP的应用，其特征在于：用SeTTP和STTP和DNA聚合酶以及其它dNTPs,进行DNA酶促合成、RT-PCR或PCR或RT-qPCR或qPCR分子检测、LAMP或LAMP分子检测，抑制DNA聚合中的T/G错配，提高碱基配对的特异性，大大提高聚合酶反应、核酸分子识别和分子检测的准确性和灵敏性。
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