CN116478226A - 一种锁核苷帽类似物和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种锁核苷帽类似物，其在第一糖环和/或第二糖环上含桥环或取代桥环结构，且桥环本身具备至少一个O的同时，取代桥环是含至少一个O的桥环上有OH、NH2、烷基、O‑烷基、烷基‑O‑烷基、N‑烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、卤素等取代基。所述锁核苷帽类似物能在保证甚至进一步提升加帽类似物的加帽效率的同时，提升加帽后mRNA的翻译效率，且降低了肝毒性。

Description

一种锁核苷帽类似物和应用
技术领域
本发明属于mRNA加帽技术领域，具体涉及一种锁核苷帽类似物和应用。
背景技术
在真核细胞中，大多数信使RNA(mRNA)的5'末端被封闭，或“帽化(加帽)”，所述帽包含有在两个核苷部分之间的5'-5'三磷酸键合和远端鸟嘌呤环上的7-甲基，mRNA的帽化促进其在细胞中的正常功能。通过体外转录合成mRNA已经成为引入外源基因并进行表达蛋白的重要工具，并广泛应用于疾病的治疗和预防中，体外转录合成mRNA使得工作人员能够制备在各种生物学应用中表现适当的RNA分子。加帽类似物是mRNA制备过程的关键工艺，同时mRNA的稳定性以及肝毒性也与帽子结构密切相关。
在真核细胞中，除了识别蛋白质合成的起始之外，5’端帽子结构还充当从5’到3’外切核酸酶切割的保护基团，即有抗5'-核酸外切酶的降解作用。同时在蛋白质合成过程中，帽子结构也是募集蛋白质因子以进行前体mRNA剪接、聚腺苷酸化和核输出的唯一标识符，也充当募集起始因子的锚点，有助于核糖体对mRNA的识别和结合，使翻译得以正确起始。
天然结构的帽类似物由于可以被脱帽酶(DCP2)识别并且水解，降低了mRNA在生物体内的稳定性，最终也是降低了目标mRNA的翻译效率。
为了提高mRNA的翻译效率，研究报道有具有未取代的桥环结构的帽类似物，可以提高mRNA的翻译效率，但是该结构具有一定的肝毒性。因此，发明一种新型的帽类似物，增加mRNA的稳定性、翻译效率，同时可以降低肝毒性具有很重要的意义。
发明内容
为了解决现有技术中体外转录产量不高、加帽效率不足、帽结构稳定性、具有一定的肝毒性等问题。本发明提供了一种锁核苷帽类似物和应用。使用本发明所述锁核苷帽类似物，在提升加帽效率、体外转录效率的同时，还具备非常低的肝毒性。
本发明所述锁核苷帽类似物在第一糖环和/或第二糖环上含取代桥环结构，其结构通式如下：
上述结构式中的Ra为含取代桥环的第一糖环；Rb为含取代桥环的第二糖环；
所述Ra及Rb的结构各自独立，其取代桥环位于糖环的氧临位及氧临位隔一个C的位置，所述取代桥环的桥环含至少一个O，至少一个C或N，且O与糖环上的C相连；所述取代桥环的取代基为OH、NH2、烷基、O-烷基、烷基-O-烷基、N-烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、卤素；所述烷基、O-烷基、烷基-O-烷基、N-烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基的C数不大于7。
在第一和第二糖环上具备取代桥环，且桥环本身具备至少一个O的同时，桥环上具备OH、NH2、烷基、O-烷基、烷基-O-烷基、N-烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、卤素等取代基，能在保证甚至进一步提升加帽类似物的加帽效率的同时，提升加帽后mRNA的翻译效率，且降低了肝毒性。
作为优选，所述锁核苷帽类似物的结构通式中：
Rb为或者/>Ra为/>或者/>
且当Rb为时，Ra为/>当Ra为/>是，Rb为/>
其中，R1为H、OH、NH2、烷基、O-烷基、N-烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、卤素；所述烷基、O-烷基、烷基-O-烷基、N-烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基的C数不大于6。
X1为CH2、或者不存在；
X2为C、N；当X1不存在时，X2则与O直接相连
R2、R3分别独立的为H、OH、NH2、烷基、O-烷基、烷基-O-烷基、N-烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、卤素；
当X2为N时，R2、R3仅存其任意一项；当X1不存在且X2为C时，R2、R3不同时为H。
R7、R8分别独立的为H、OH、NH2、烷基、O-烷基、烷基-O-烷基、N-烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、卤素；
R4为H、OH、NH2、烷基、O-烷基、N-烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、卤素；
X3为CH2、或者不存在，
X4为C、N，当X3不存在时，X4则与O直接相连；
R5、R6为H、OH、NH2、烷基、O-烷基、烷基-O-烷基、N-烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、卤素；
当X4为N时，R5、R6仅存其任意一项；当X3不存在且X4为C时，R5、R6不同时为H。
B1、B2、B3独立的为天然的、或修饰的、或非天然的核苷碱基。
在可选的实施方案中，当X1不存在且X2为C时，R2、R3不同时为H。
在可选的实施方案中，当X3不存在且X4为C时，R5、R6不同时为H。
作为较低肝毒性的结构优选，所述锁核苷帽类似物的结构中：当X2为C时，R2和R3可通过化学键连接成环；或者当X4为C时，R5和R6可通过化学键连接成环。
进一步的，所述锁核苷帽类似物的结构为以下三种结构中的任意比例组合：该结构具有抗反转录效果，制备获得的目标mRNA具有更高的稳定性以及较低的肝毒性。
进一步的，作为提升锁核苷帽类似物的加帽效率的同时，进一步降低其肝毒性，所述锁核苷帽类似物的结构中，所述取代桥环的取代基为烷基，且所述烷基的C数不大于3。
作为优选，所述锁核苷帽类似物的结构为以下三种结构中的任意组合：该结构具有较高的翻译效率，具有抗反转录效果，制备获得的目标mRNA具有更高的稳定性以及更低的肝毒性。
进一步的，提升锁核苷帽类似物的加帽效率的同时，提升mRNA翻译稳定性的同时，也同时降低其肝毒性，所述锁核苷帽类似物的结构中，所述取代桥环的取代基为烷氧基，且所述烷基的C数不大于3。
作为优选，所述锁核苷帽类似物为以下三种结构的任意组合：该结构具有更高的翻译效率，具有抗反转录效果，制备获得的目标mRNA具有更高的稳定性以及更低的肝毒性。
所述锁核苷帽类似物的结构为X3不存在且X4为C时，R5、R6同时为H；和/或X1不存在且X2为C，R2、R3同时为H，同时X3不存在且X4为C，R5、R6同时为H。
所述锁核苷帽类似物用于在体外转录反应中将RNA加帽的方法，该方法包括以下步骤：
以上锁核苷帽类似物的应用：用于线性mRNA的体外转录制备；
步骤(1)：制备DNA模板；
步骤(2)：进行体外转录反应，所述反应体系中含有RNA聚合酶、核苷三磷酸和如权利要求所述的加帽类似物。
所述锁核苷帽类似物具有以下优势：
1、抗反转录作用，该锁核苷帽类似物中用桥环结构替换原有的五元糖环结构，替换后由于桥环结构无法作为转录的起始位点，具有很好的mRNA体外转录时抗反转录效果。
2、提高mRNA的稳定性，相比非天然结构的帽类似物无法被脱帽酶的水解(DCP2)识别，提高了mRNA的稳定性。
3、提高目标mRNA的翻译效果，取代的桥环核苷结构更加稳定了五元糖环的构像，更加容易于帽结合蛋白(EIF4E)结合，提高了目标mRNA的翻译效率。
4、相比于未取代的桥环帽类似物，取代的桥环结构可以降低肝毒性，这是由于取代的桥环结构核苷更加容易被肝脏代谢，降低了肝毒性。
附图说明：
图1：实施例1-11及对比例1-3的细胞活性对比柱状图。
具体实施方式
实施例1：以中间体A和B为原料的含2’,4’-锁环结构的起始加帽寡核苷酸引物的合成方法
将中间体A(2.0mol)悬浮在含有ZnCl2(20.0mol)的DMF溶液中，随后将中间体B(1.8mol)加入到反应液中。在室温下搅拌反应24小时后，用10L的0.25M EDTA-Na2溶液终止反应。将混合物装载到DEAE Sephadex柱上。将产物使用0-1.0M的氯化钠水溶液线性梯度洗脱，纳滤除盐，浓缩得目标产物，反应路线流程，如下方程式：
其中，化合物A通过以下步骤得到：
(1)称取5.0g 2’,4’-锁-2’-螺环丙烯-鸟苷，溶解在50.0mL的磷酸三甲酯中，反应液冷却至0℃，氮气氛围下缓慢滴加三氯氧磷(1.8eq.)。0℃下搅拌4小时后，加水淬灭反应。用二氯甲烷洗涤两次除去大部分磷酸三甲酯。减压浓缩除去残留有机溶剂后用反相制备液相色谱纯化后浓缩得中间体A1。
(2)将中间体A1，三苯基膦(2.0eq.)，2,2’-二硫二吡啶(2.0eq.)，咪唑(8.0eq.)和三乙胺(1.0eq.)溶解在DMF中氮气氛围下室温搅拌15小时。反应结束后将反应液缓慢加入到4M的高氯酸钠丙酮溶液中，析出固体，抽滤后滤饼用丙酮充分洗涤得中间体A2。
(3)将磷酸三乙胺(3.0eq.)和氯化锌(8.0eq.)悬浮在无水DMF中后室温搅拌5分钟。将中间体A2分批加入到反应液中，室温搅拌5小时。反应结束后用用10倍体积的0.25MEDTA-Na2溶液终止反应。反应液用离子色谱纯化得到中间体A3。
(4)将中间体A3溶解在20倍体积的纯化水中，反应液冷却至4℃，缓慢滴加硫酸二甲酯(6.0eq.)，过程中用2M的氢氧化钠调节pH不超过5，HPLC监测反应，反应结束后用二氯甲烷洗涤后，水相用离子色谱纯化得到中间体A4。
(5)将中间体A4，三苯基膦(2.0eq.)，2,2’-二硫二吡啶(2.0eq.)，咪唑(8.0eq.)和三乙胺(1.0eq.)溶解在DMF中氮气氛围下室温搅拌10小时，反应结束后将反应液缓慢加入到4M的高氯酸钠丙酮溶液中析出固体，抽滤，滤饼用丙酮充分洗涤得中间体A。反应路线流程，如下方程式
化合物A反应路线流程，如下方程式:
其中，化合物B通过以下步骤得到：
(1)称取200.0g的2’OMe-rA亚磷酰胺单体和N2-异丁酰基-2’,3’-乙酰基鸟苷(1.0eq.)于单口瓶中，用2.0L的二氯甲烷溶解。氮气鼓吹下加入四氮唑(2.1eq.)，25℃反应3小时。监测反应结束后，将70％的叔丁基过氧化氢水溶液滴加到反应液中，25℃反应1小时。监测反应结束后，向反应液滴加三氯乙酸(4.0eq.)的二氯甲烷溶液，室温反应1小时。监测反应结束后，反应液分别用10％亚硫酸钠水溶液，10％碳酸氢钠水溶液，饱和食盐水洗涤后，有机相浓缩后用柱层析纯化得到中间体B1。
(2)将中间体B1溶解在乙腈(10V)中，加入1.8eq.的双(2-氰乙基)-N,N-二异丙基亚磷酰胺、1.8eq.的四氮唑后氮气氛围下室温搅拌2小时。反应结束后将70％的叔丁基过氧化氢水溶液(1.2eq.)滴加到反应液中，室温反应1小时。监测反应结束后旋干，在旋瓶中加入甲醇和浓氨水(10V,1:1)，室温反应14小时，监测反应，反应结束后旋干。粗品用离子色谱纯化后浓缩得到中间体B，反应路线流程，如下方程式：
实施例2：以中间体C和D为原料的含2’,4’-锁环结构的起始加帽寡核苷酸引物的合成方法
以中间体C和D为原料，参考实施例1目标产物的合成方法得到实施例2的起始加帽寡核苷酸引物。反应路线流程，如下方程式：
其中，化合物C通过以下步骤得到：
(1)称取5.0g鸟苷，溶解在50.0mL的磷酸三甲酯中，反应液冷却至0℃，氮气氛围下缓慢滴加三氯氧磷(1.8eq.)。0℃下搅拌4小时后，加水淬灭反应。用二氯甲烷洗涤两次除去大部分磷酸三甲酯。减压浓缩除去残留有机溶剂后用反相制备液相色谱纯化后浓缩得中间体C1。
(2)将中间体C1，三苯基膦(2.0eq.)，2,2’-二硫二吡啶(2.0eq.)，咪唑(8.0
eq.)和三乙胺(1.0eq.)溶解在DMF中氮气氛围下室温搅拌15小时。反应结束后将反应液缓慢加入到4M的高氯酸钠丙酮溶液中，析出固体，抽滤后滤饼用丙酮充分洗涤得中间体C2。
(3)将磷酸三乙胺(3.0eq.)和氯化锌(8.0eq.)悬浮在无水DMF中后室温搅拌5分钟。将中间体C2分批加入到反应液中，室温搅拌5小时。反应结束后用用10倍体积的0.25MEDTA-Na2溶液终止反应。反应液用离子色谱纯化得到中间体C3。
(4)将中间体C3溶解在20倍体积的纯化水中，反应液冷却至4℃，缓慢滴加硫酸二甲酯(6.0eq.)，过程中用2M的氢氧化钠调节pH不超过5，HPLC监测反应，反应结束后用二氯甲烷洗涤后，水相用离子色谱纯化得到中间体C4。
(5)将中间体C4，三苯基膦(2.0eq.)，2,2’-二硫二吡啶(2.0eq.)，咪唑(8.0
eq.)和三乙胺(1.0eq.)溶解在DMF中氮气氛围下室温搅拌10小时，反应结束后将反应液缓慢加入到4M的高氯酸钠丙酮溶液中析出固体，抽滤，滤饼用丙酮充分洗涤得中间体C。反应路线流程，如下方程式化合物C反应路线流程，如下方程式:
其中，化合物D通过以下步骤得到：
(1)称取200.0g的2’,4’-锁-2’-螺环丙烯-rA亚磷酰胺单体和N2-异丁酰基-2’,3’
-乙酰基鸟苷(1.0eq.)于单口瓶中，用2.0L的二氯甲烷溶解。氮气鼓吹下加入四氮唑(2.1eq.)，25℃反应3小时。监测反应结束后，将70％的叔丁基过氧化氢水溶液滴加到反应液中，25℃反应1小时。监测反应结束后，向反应液滴加三氯乙酸(4.0eq.)的二氯甲烷溶液，室温反应1小时。监测反应结束后，反应液分别用10％亚硫酸钠水溶液，10％碳酸氢钠水溶液，饱和食盐水洗涤后，有机相浓缩后用柱层析纯化得到中间体D1。
(2)将中间体D1溶解在乙腈(10V)中，加入1.8eq.的双(2-氰乙基)-N,N-二异丙基亚磷酰胺、1.8eq.的四氮唑后氮气氛围下室温搅拌2小时。反应结束后将70％的叔丁基过氧化氢水溶液滴加到反应液中，室温反应1小时。监测反应结束后旋干，在旋瓶中加入甲醇和浓氨水(10V,1:1)，室温反应14小时，监测反应，反应结束后旋干。粗品用离子色谱纯化后浓缩得到中间体D，反应路线流程，如下方程式：
实施例3以中间体A和D为原料的含2’,4’-锁环结构的起始加帽寡核苷酸引物的合成方法
以中间体A和D为原料，参考实施例1目标产物的合成方法得到实施例3的起始加帽寡核苷酸引物。反应路线流程，如下方程式：
实施例4以中间体E和B为原料的含2’,4’-锁环结构的起始加帽寡核苷酸引物的合成方法
以中间体E和B为原料，参考实施例1目标产物的合成方法得到实施例4的起始加帽寡核苷酸引物。反应路线流程，如下方程式：
其中，化合物E通过以下步骤得到：
(1)称取5.0g 2’,4’-锁-2’-乙基-鸟苷，溶解在50.0mL的磷酸三甲酯中，反应液冷却至0℃，氮气氛围下缓慢滴加三氯氧磷(1.8eq.)。0℃下搅拌4小时后，加水淬灭反应。用二氯甲烷洗涤两次除去大部分磷酸三甲酯。减压浓缩除去残留有机溶剂后用反相制备液相色谱纯化后浓缩得中间体E1。
(2)将中间体E1，三苯基膦(2.0eq.)，2,2’-二硫二吡啶(2.0eq.)，咪唑(8.0
eq.)和三乙胺(1.0eq.)溶解在DMF中氮气氛围下室温搅拌15小时。反应结束后将反应液缓慢加入到4M的高氯酸钠丙酮溶液中，析出固体，抽滤后滤饼用丙酮充分洗涤得中间体E2。
(3)将磷酸三乙胺(3.0eq.)和氯化锌(8.0eq.)悬浮在无水DMF中后室温搅拌5分钟。将中间体E2分批加入到反应液中，室温搅拌5小时。反应结束后用用10倍体积的0.25MEDTA-Na2溶液终止反应。反应液用离子色谱纯化得到中间体E3。
(4)将中间体E3溶解在20倍体积的纯化水中，反应液冷却至4℃，缓慢滴加硫酸二甲酯(6.0eq.)，过程中用2M的氢氧化钠调节pH不超过5，HPLC监测反应，反应结束后用二氯甲烷洗涤后，水相用离子色谱纯化得到中间体E4。
(5)将中间体E4，三苯基膦(2.0eq.)，2,2’-二硫二吡啶(2.0eq.)，咪唑(8.0
eq.)和三乙胺(1.0eq.)溶解在DMF中氮气氛围下室温搅拌10小时，反应结束后将反应液缓慢加入到4M的高氯酸钠丙酮溶液中析出固体，抽滤，滤饼用丙酮充分洗涤得中间体E。反应路线流程，如下方程式化合物E反应路线流程，如下方程式:
实施例5以中间体C和F为原料的含2’,4’-锁环结构的起始加帽寡核苷酸引物的合成方法
以中间体C和F为原料，参考实施例1目标产物的合成方法得到实施例5的起始加帽寡核苷酸引物。反应路线流程，如下方程式：
其中，化合物F通过以下步骤得到：
(1)称取200.0g的2’,4’-锁-2’-乙基-rA亚磷酰胺单体和N2-异丁酰基-2’,3’-乙酰基鸟苷(1.0eq.)于单口瓶中，用2.0L的二氯甲烷溶解。氮气鼓吹下加入四氮唑(2.1eq.)，25℃反应3小时。监测反应结束后，将70％的叔丁基过氧化氢水溶液滴加到反应液中，25℃反应1小时。监测反应结束后，向反应液滴加三氯乙酸(4.0eq.)的二氯甲烷溶液，室温反应1小时。监测反应结束后，反应液分别用10％亚硫酸钠水溶液，10％碳酸氢钠水溶液，饱和食盐水洗涤后，有机相浓缩后用柱层析纯化得到中间体F1。
(2)将中间体F1溶解在乙腈(10V)中，加入1.8eq.的双(2-氰乙基)-N,N-二异丙基亚磷酰胺、1.8eq.的四氮唑后氮气氛围下室温搅拌2小时。反应结束后将70％的叔丁基过氧化氢水溶液滴加到反应液中，室温反应1小时。监测反应结束后旋干，在旋瓶中加入甲醇和浓氨水(10V,1:1)，室温反应14小时，监测反应，反应结束后旋干。粗品用离子色谱纯化后浓缩得到中间体F，反应路线流程，如下方程式：
实施例6以中间体E和F为原料的含2’,4’-锁环结构的起始加帽寡核苷酸引物的合成方法
以中间体E和F为原料，参考实施例1目标产物的合成方法得到实施例6的起始加帽寡核苷酸引物。反应路线流程，如下方程式：
实施例7以中间体G和B为原料的含2’,4’-锁环结构的起始加帽寡核苷酸引物的合成方法
以中间体G和B为原料，参考实施例1目标产物的合成方法得到实施例7的起始加帽寡核苷酸引物。反应路线流程，如下方程式：
其中，化合物G通过以下步骤得到：
(1)称取5.0g 2’,4’-锁-2’-甲氧基乙基-鸟苷，溶解在50.0mL的磷酸三甲酯中，反应液冷却至0℃，氮气氛围下缓慢滴加三氯氧磷(1.8eq.)。0℃下搅拌4小时后，加水淬灭反应。用二氯甲烷洗涤两次除去大部分磷酸三甲酯。减压浓缩除去残留有机溶剂后用反相制备液相色谱纯化后浓缩得中间体G1。
(2)将中间体G1，三苯基膦(2.0eq.)，2,2’-二硫二吡啶(2.0eq.)，咪唑(8.0
eq.)和三乙胺(1.0eq.)溶解在DMF中氮气氛围下室温搅拌15小时。反应结束后将反应液缓慢加入到4M的高氯酸钠丙酮溶液中，析出固体，抽滤后滤饼用丙酮充分洗涤得中间体G2。
(3)将磷酸三乙胺(3.0eq.)和氯化锌(8.0eq.)悬浮在无水DMF中后室温搅拌5分钟。将中间体G2分批加入到反应液中，室温搅拌5小时。反应结束后用用10倍体积的0.25MEDTA-Na2溶液终止反应。反应液用离子色谱纯化得到中间体G3。
(4)将中间体G3溶解在20倍体积的纯化水中，反应液冷却至4℃，缓慢滴加硫酸二甲酯(6.0eq.)，过程中用2M的氢氧化钠调节pH不超过5，HPLC监测反应，反应结束后用二氯甲烷洗涤后，水相用离子色谱纯化得到中间体G4。
(5)将中间体G4，三苯基膦(2.0eq.)，2,2’-二硫二吡啶(2.0eq.)，咪唑(8.0
eq.)和三乙胺(1.0eq.)溶解在DMF中氮气氛围下室温搅拌10小时，反应结束后将反应液缓慢加入到4M的高氯酸钠丙酮溶液中析出固体，抽滤，滤饼用丙酮充分洗涤得中间体G。反应路线流程，如下方程式化合物G反应路线流程，如下方程式:
实施例8以中间体C和H为原料的含2’,4’-锁环结构的起始加帽寡核苷酸引物的合成方法
以中间体C和H为原料，参考实施例1目标产物的合成方法得到实施例8的起始加帽寡核苷酸引物。反应路线流程，如下方程式：
其中，化合物H通过以下步骤得到：
(1)称取200.0g的2’,4’-锁-2’-甲氧基乙基-rA亚磷酰胺单体和N2-异丁酰基-2’,3’-乙酰基鸟苷(1.0eq.)于单口瓶中，用2.0L的二氯甲烷溶解。氮气鼓吹下加入四氮唑(2.1eq.)，25℃反应3小时。监测反应结束后，将70％的叔丁基过氧化氢水溶液滴加到反应液中，25℃反应1小时。监测反应结束后，向反应液滴加三氯乙酸(4.0eq.)的二氯甲烷溶液，室温反应1小时。监测反应结束后，反应液分别用10％亚硫酸钠水溶液，10％碳酸氢钠水溶液，饱和食盐水洗涤后，有机相浓缩后用柱层析纯化得到中间体H1。
(2)将中间体H1溶解在乙腈(10V)中，加入1.8eq.的双(2-氰乙基)-N,N-二异丙基亚磷酰胺、1.8eq.的四氮唑后氮气氛围下室温搅拌2小时。反应结束后将70％的叔丁基过氧化氢水溶液滴加到反应液中，室温反应1小时。监测反应结束后旋干，在旋瓶中加入甲醇和浓氨水(10V,1:1)，室温反应14小时，监测反应，反应结束后旋干。粗品用离子色谱纯化后浓缩得到中间体H，反应路线流程，如下方程式：
实施例9以中间体G和H为原料的含2’,4’-锁环结构的起始加帽寡核苷酸引物的合成方法
以中间体G和H为原料，参考实施例1目标产物的合成方法得到实施例9的起始加帽寡核苷酸引物。反应路线流程，如下方程式：
实施例10：以中间体C和I为原料的含2’,4’-锁环结构的起始加帽寡核苷酸引物的合成方法
以中间体C和I为原料，参考实施例1目标产物的合成方法得到实施例10的起始加帽寡核苷酸引物。反应路线流程，如下方程式：
其中，化合物I通过以下步骤得到：
(1)称取200.0g的2’,4’-锁环-rA亚磷酰胺单体和N2-异丁酰基-2’,3’-乙酰基鸟苷(1.0eq.)于单口瓶中，用2.0L的二氯甲烷溶解。氮气鼓吹下加入四氮唑(2.1eq.)，25℃反应3小时。监测反应结束后，将70％的叔丁基过氧化氢水溶液滴加到反应液中，25℃反应1小时。监测反应结束后，向反应液滴加三氯乙酸(4.0eq.)的二氯甲烷溶液，室温反应1小时。监测反应结束后，反应液分别用10％亚硫酸钠水溶液，10％碳酸氢钠水溶液，饱和食盐水洗涤后，有机相浓缩后用柱层析纯化得到中间体I1。
(2)将中间体I1溶解在乙腈(10V)中，加入1.8eq.的双(2-氰乙基)-N,N-二异丙基亚磷酰胺、1.8eq.的四氮唑后氮气氛围下室温搅拌2小时。反应结束后将70％的叔丁基过氧化氢水溶液滴加到反应液中，室温反应1小时。监测反应结束后旋干，在旋瓶中加入甲醇和浓氨水(10V,1:1)，室温反应14小时，监测反应，反应结束后旋干。粗品用离子色谱纯化后浓缩得到中间体I，反应路线流程，如下方程式：
实施例11以中间体J和I为原料的含2’,4’-锁环结构的起始加帽寡核苷酸引物的合成方法
以中间体J和I为原料，参考实施例1目标产物的合成方法得到实施例11的起始加帽寡核苷酸引物。反应路线流程，如下方程式：
其中，化合物J通过以下步骤得到：
(1)称取5.0g 2’,4’-锁环-鸟苷，溶解在50.0mL的磷酸三甲酯中，反应液冷却至0℃，氮气氛围下缓慢滴加三氯氧磷(1.8eq.)。0℃下搅拌4小时后，加水淬灭反应。用二氯甲烷洗涤两次除去大部分磷酸三甲酯。减压浓缩除去残留有机溶剂后用反相制备液相色谱纯化后浓缩得中间体J1。
(2)将中间体J1，三苯基膦(2.0eq.)，2,2’-二硫二吡啶(2.0eq.)，咪唑(8.0eq.)和三乙胺(1.0eq.)溶解在DMF中氮气氛围下室温搅拌15小时。反应结束后将反应液缓慢加入到4M的高氯酸钠丙酮溶液中，析出固体，抽滤后滤饼用丙酮充分洗涤得中间体J2。
(3)将磷酸三乙胺(3.0eq.)和氯化锌(8.0eq.)悬浮在无水DMF中后室温搅拌5分钟。将中间体J2分批加入到反应液中，室温搅拌5小时。反应结束后用用10倍体积的0.25MEDTA-Na2溶液终止反应。反应液用离子色谱纯化得到中间体J3。
(4)将中间体J3溶解在20倍体积的纯化水中，反应液冷却至4℃，缓慢滴加硫酸二甲酯(6.0eq.)，过程中用2M的氢氧化钠调节pH不超过5，HPLC监测反应，反应结束后用二氯甲烷洗涤后，水相用离子色谱纯化得到中间体J4。
(5)将中间体J4，三苯基膦(2.0eq.)，2,2’-二硫二吡啶(2.0eq.)，咪唑(8.0
eq.)和三乙胺(1.0eq.)溶解在DMF中氮气氛围下室温搅拌10小时，反应结束后将反应液缓慢加入到4M的高氯酸钠丙酮溶液中析出固体，抽滤，滤饼用丙酮充分洗涤得中间体J。反应路线流程，如下方程式化合物J反应路线流程，如下方程式:
对比例1以中间体J和B为原料的含2’,4’-锁环结构的起始加帽寡核苷酸引物的合成方法
以中间体J和B为原料，参考实施例1目标产物的合成方法得到对比例1的起始加帽寡核苷酸引物。反应路线流程，如下方程式：
对比例2以中间体C和B为原料的起始加帽寡核苷酸引物的合成方法
以中间体C和B为原料，参考实施例1目标产物的合成方法得到对比例2的起始加帽寡核苷酸引物。反应路线流程，如下方程式：
对比例3
参考实施例1目标产物的合成方法得到对比例3的起始加帽寡核苷酸引物。
应用及生物活性等检测
应用检测例1：mRNA体外转录产量及加帽效率的测定
利用加帽类似物进行mRNA的体外合成：先用质粒线性化酶线性化质粒，4℃酶切过夜；DNA模板抽提；体外转录合成mRNA，分别使用实施例1-11及对比例1-3的加帽类似物作为帽结构。
反应体系如表1：
表1体外转录反应体系
备注：在实验过程中，首先计算好体系所需物料体积，然后进行加样。首先在体系中加入无菌无酶水，随后依次加入10X buffer、NTPs、帽类似物，混匀后轻轻离心，随后加入核酸酶抑制剂、无机焦磷酸酶、T7 RNA聚合酶、线性化DNA模板，充分混匀后轻轻离心，于37℃下孵育。2小时后加入DNase I 1U，37℃继续孵育30分钟以去除DNA模板，然后进行RNA纯化，通常使用磁珠纯化方法。纯化的mRNA用无菌无酶水进行溶解，随后利用Nanodrop One进行定量检测。
液相色谱质谱法(LC-MS)被用来检测不同起始帽类似物的mRNA的IVT加帽率；首先需要设计一段与转录产物mRNA起始碱基匹配的具有标记的DNA探针，通常的标记为biotin标记，将链霉亲和素标记的磁珠清洗后与合成的DNA探针、mRNA及10×RNase H reactionbuffer室温室温孵育30分钟，边孵育边缓慢混匀，随后加入20ul RNase H(5U/ul)孵育37度3h，每半个小时混匀一次。孵育结束后对磁珠进行清洗，清洗完成后的磁珠加入100μL加热到80℃的75％甲醇，混合物在加热板上加热到80℃，保持3分钟，然后放置磁力架上吸取上清，使用蒸发离心机在室温下干燥45分钟至10μl。然后将样品重新悬浮在50μl的100μMEDTA/1％ MeOH中，即可用于LC-MS分析，确定转录反应中RNA的加帽情况。由于加帽与非加帽的碱基在分子量上有明显区别，利用分子质量差别即可判定不同帽类似物起始的mRNA转录的加帽率。
表2mRNA的体外转录产量以及加帽率
结论由表2可知，实施例1-11的锁核苷帽类似物均能转录相应的目标mRNA，实施例1-11的锁核苷帽类似物的产量和加帽率优于对比例1到对比例3
其中在糖环上具有环烷基结构的实施例1-3，在糖环上具有甲基结构的实施例4-6，在糖环上具有-CH2-O-CH3结构的实施例7-9，其产量和加帽率具有逐渐升高的趋势。
测试例2：脱帽酶对帽子结构的稳定性
取经聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE纯化后的30pmol RNAs与50U mRNA脱帽酶(NewEngland Biolabs)、1×MDE缓冲液于37℃酶促反应45min。将酶促反应物进行PAGE电泳、SYBR Green II(Lonza)染色后在Typhoon FLA 7000(GE Healthcare)仪器上观察电泳后的胶图。使用Image Quant(GE Healthcare)软件统计加帽RNA与脱帽RNA电泳条带强度比率，计算得出脱帽酶的脱帽效率。使用KaleidaGraph(Synergy)软件的Dunnett检验进行统计学检验。
表3脱帽酶处理后脱帽率检测
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从表3的数据可知，桥环结构帽类似物实施例1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11相比于对比例2的脱帽酶处理后脱帽率更低；其中在糖环上具有环烷基结构的实施例1-3，在糖环上具有甲基结构的实施例4-6，在糖环上具有-CH2-O-CH3结构的实施例7-9，其DCP2酶脱帽率有降低的趋势。
测试例3：细胞蛋白表达测试
采用eGFP编码序列为DNA模板，利用实施例1-11及对比例1-2的帽类似物为起始进行体外转录。随后将获得的不同的mRNA产物进行293T细胞的转染。293T细胞以(0.5-1)×105个细胞进行铺板(24孔板)，推荐使用在50代以内的细胞进行转染实验。要求在转染前24小时对细胞再次传代，在培养基中加入抗生素对转染效果没有影响。转染时细胞密度一般60-80％为佳，每孔转染2μg mRNA，转染试剂选用Lipofectamine MessengerMAXTransfection Reagent(Invitrogen)并参考其使用方法进行操作。转染后的细胞放置在37℃，CO2孵育箱中，转染4-6小时后，更换为新鲜的完全培养基。在37℃的CO2培养箱箱中孵育24小时以后，荧光显微镜观察其中GFP的荧光强度。
表4细胞内mRNA的翻译表达效率
结果见表4，结果中可以明显的看到本发明的mRNA的表达效率要明显高于对比例，同时均未引起明显的细胞死亡，这一结果表明本发明的加帽类似物具有更高的表达效率；即本发明中的含取代桥环核苷结构的加帽类似物应用于mRNA合成有效蛋白翻译效率明显高于对比例2帽结构的蛋白翻译效率。从表4的数据可知，桥环结构帽类似物实施例1-11相比于对比例2的目标mRNA翻译效率明提高。
测试例4：肝毒性测试
正常人肝细胞(L02细胞)以5000个细胞进行铺板(96孔板)，转染时细胞密度一般60-80％为佳，每孔转染0.5μg mRNA，转染试剂选用Lipofectamine MessengerMAXTransfection Reagent(Invitrogen)并参考其使用方法进行操作。转染后的细胞放置在37℃，CO2孵育箱中，转染4-6小时后，更换为新鲜的完全培养基。在37℃的CO2培养箱箱中孵育48小时以后，加入MTT与细胞共孵育，并且通过酶标仪测定570nm波长的吸光度计算细胞活力；获得细胞活力检测柱状对比，参见附图1.
从附图1可以看出，本发明取代的桥环结构帽类似物相比对比例1-3具有明显的肝细胞毒性，取代的桥环结构帽类似物1-9的肝毒性明显低于对比例1。
实施例及对比例涉及加帽类似物的具体结构参见下述附录。
实施例1
实施例2
实施例3
实施例4
实施例5
实施例6
实施例7
实施例8
实施例9
实施例10
实施例11
对比例1
对比例2
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Claims (10)

1.一种锁核苷帽类似物，其结构通式如下，其特征在于：
在第一糖环和/或第二糖环上含取代桥环结构，
上述结构式中的Ra为含桥环或取代桥环的第一糖环；Rb为含桥环或取代桥环的第二糖环；
所述Ra及Rb的结构各自独立，含桥环或取代桥环的糖环结构；所述取代桥环的桥环含至少一个O，至少一个C或N；所述取代桥环的取代基是OH、NH2、烷基、O-烷基、烷基-O-烷基、N-烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基或卤素；所述烷基、O-烷基、烷基-O-烷基、N-烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基的C数不大于7。
2.根据权利要求1所述锁核苷帽类似物，其特征在于：所述锁核苷帽类似物的结构通式中：
Rb为 或者/>Ra为/>或者/>
且当Rb为时，Ra为/>当Ra为/>是，Rb为/>
其中，R1为H、OH、NH2、烷基、O-烷基、N-烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、卤素；所述烷基、O-烷基、烷基-O-烷基、N-烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基的C数不大于6；
X1为CH2、或者不存在；
X2为C、N；当X1不存在时，X2则与O直接相连；当X2为N时，R2、R3仅存其任意一项；
R2、R3分别独立的为H、OH、NH2、烷基、O-烷基、烷基-O-烷基、N-烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、卤素；
R7、R8分别独立的为H、OH、NH2、烷基、O-烷基、烷基-O-烷基、N-烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、卤素；
R4为H、OH、NH2、烷基、O-烷基、N-烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、卤素；
X3为CH2、或者不存在，
X4为C、N，当X3不存在时，X4则与O直接相连；
R5、R6为H、OH、NH2、烷基、O-烷基、烷基-O-烷基、N-烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、卤素；
当X4为N时，R5、R6仅存其任意一项；
B1、B2、B3独立的为天然的、或修饰的、或非天然的核苷碱基。
3.根据权利要求2所述锁核苷帽类似物，其特征在于：所述锁核苷帽类似物的结构通式中：当X2为C时，R2和R3可通过化学键连接成环；和/或X4为C时，R5和R6可通过化学键连接成环。
4.根据权利要求3所述的锁核苷帽类似物，其特征在于，所述锁核苷帽类似物的结构为以下三种结构的任意比例组合：
5.根据权利要求2所述锁核苷帽类似物，其特征在于：所述锁核苷帽类似物的结构为X3不存在且X4为C时，R5、R6同时为H；和/或X1不存在且X2为C，R2、R3同时为H，同时X3不存在且X4为C，R5、R6同时为H。
6.根据权利要求2所述的锁核苷帽类似物，其特征在于，所述取代桥环的取代基为C数不大于3的链烷基。
7.根据权利要求6所述的锁核苷帽类似物，其特征在于，所述锁核苷帽类似物的结构为以下三种结构的任意比例组合：
8.根据权利要求2所述的锁核苷帽类似物，其特征在于，所述取代桥环的取代基为烷氧基，且所述烷氧基的C数不大于3。
9.根据权利要求8所述的锁核苷帽类似物，其特征在于，其结构为如下三种结构的任意比例组合：
10.权利要求1-9中的任一项所述的锁核苷帽类似物的应用，其特征在于，用于在体外转录反应中将RNA加帽，用于线性mRNA的体外转录制备；步骤如下：
步骤(1)：制备DNA模板；
步骤(2)：进行体外转录反应，所述反应体系中含有RNA聚合酶、核苷三磷酸。
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