CN104650170B - 荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法 - Google Patents
荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104650170B CN104650170B CN201310580357.7A CN201310580357A CN104650170B CN 104650170 B CN104650170 B CN 104650170B CN 201310580357 A CN201310580357 A CN 201310580357A CN 104650170 B CN104650170 B CN 104650170B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- formula
- compound
- fluorescent dye
- nucleotides
- base
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 0 CCC(N)=C(C(*C)=C(C=C[N+](C*(C)(C)NCN=C)[O-])N)C(C(CCC(*(C)C)=*1)=C1O)=*(C=C1)*=CCC1=*([*+])*C Chemical compound CCC(N)=C(C(*C)=C(C=C[N+](C*(C)(C)NCN=C)[O-])N)C(C(CCC(*(C)C)=*1)=C1O)=*(C=C1)*=CCC1=*([*+])*C 0.000 description 4
- KVYJZMPCUIQNTI-UHFFFAOYSA-N CN(C1OC1N=C1N)C=C1I Chemical compound CN(C1OC1N=C1N)C=C1I KVYJZMPCUIQNTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LGQREYFTDRLOJV-UHFFFAOYSA-N C[n](cc1I)c(N=C(N)N2)c1C2=O Chemical compound C[n](cc1I)c(N=C(N)N2)c1C2=O LGQREYFTDRLOJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VNFSLRASQZPDFQ-UHFFFAOYSA-N C[n](cc1I)c2c1c(N)ncn2 Chemical compound C[n](cc1I)c2c1c(N)ncn2 VNFSLRASQZPDFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/06—Pyrimidine radicals
- C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/14—Pyrrolo-pyrimidine radicals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
- C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
- C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
- C09K2211/1003—Carbocyclic compounds
- C09K2211/1011—Condensed systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
- C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
- C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
- C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
- C09K2211/1044—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing two nitrogen atoms as heteroatoms
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法本发明涉及荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法。
Description
技术领域
本发明涉及荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法。
背景技术
荧光染料修饰的核苷酸及类似物广泛应用于生物分析,DNA序列分析和临床诊断等领域。荧光染料修饰的核苷酸及类似物一般在水中溶解度高,极性大。液相合成的方法一般操作繁琐,分离比较困难,分离纯化需要结合反相色谱和离子色谱去除反应体系中残余的游离的荧光染料和核苷酸,难以大量生产。
美国化学家Merrifield(Merrifeld,R.B.J.Am.Chem.Soc.1963,85,2149.)在1963年首先用树脂负载法合成了四肽化合物以来,固相有机合成已经从最初的肽合成扩展到各类有机小分子,复杂天然产物的合成和DNA合成等领域。固相合成的特点是简化了多步骤的合成,可避免因手工操作和物料重复转移而产生的损失;固相载体共价相联的肽链处于适宜的物理状态,可通过快速的抽滤、洗涤未完成中间的纯化。使用过量反应物,使目标反应完全,使最终产物得到较高的产率。
本发明的目的在于提供荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法,解决荧光染料修饰的核苷酸及类似物液相合成分离困难导致难以大量生产的技术问题。
发明内容
本发明提供了一种制备式(1)荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法,
其中取代基具有以下的含义:
M是H,Na或K
R1为H或OH
R2为H或OH
R3为C1-C8直链烷基(CH2)n
Base为具有下列结构的碱基或碱基类似物取代基:
Dye为具有下列结构的荧光染料取代基团:
其中取代基具有以下的含义:
R4为OH,NH2,N(Me)2或N(Et)2,N(Pr)2
R5为O,或NH2 +,N(Me)2 +或N(Et)2 +,N(Pr)2 +
R6为H,F,Cl,Br或I
R7和R8为H或CH2NH2,或者具有以下结构的取代基:
R9为H,CH3或CH2CH3
其特征是包括以下步骤:
a.将式(II)化合物
用DMF溶解,再加入氢氧化钠和树脂,搅拌均匀,振荡反应;再分别用N,N’-二甲基甲酰胺,二氯甲烷,醋酸水溶液和甲醇洗涤后,得到式(III)化合物
b.将式(IV)化合物
其中FMOC为芴甲氧羰基
与式(III)化合物碘化铜以及无水DMF混合,在氦气保护下,注入无水三乙胺,反应10-20min后,在惰性气体的保护下,迅速投入四(三苯基膦)钯,反应结束后再分别用N,N’-二甲基甲酰胺,二氯甲烷,醋酸水溶液和甲醇洗涤后,再加入六氢吡啶的N,N’-二甲基甲酰胺溶液,去掉芴甲氧羰基,得到式(V)化合物
c.将式(VI)化合物
R10和R11为H或芴甲氧羰基氨基甲基,或者具有以下结构的取代基:
与式(V)混合,加入羟基苯并三唑,N,N'-二异丙基碳二亚胺和4-二甲氨 基吡啶,经酰胺化反应后,再分别用N,N’-二甲基甲酰胺,二氯甲烷,醋酸水溶液和甲醇洗涤,获得式(VII)化合物;R10和R11为芴甲氧羰基氨基甲基时,树脂洗涤后加入六氢吡啶的N,N’-二甲基甲酰胺溶液,去掉芴甲氧羰基后获得式(VII)化合物
d.在所得的式(VII)化合物中加入盐酸,振荡后过滤,取滤液洗涤后冻干得到式(I)化合物。
步骤a中的树脂为Merrifield树脂或者王树脂;式(II)化合物与树脂混合时,式(II)化合物与树脂的摩尔比是1.5-3;步骤a中在90-130℃下反应的时间为3-6小时;步骤b和c中六氢吡啶的N,N’-二甲基甲酰胺溶液浓度为15-40%(v/v);步骤c中酰胺化反应,羟基苯并三唑与式(VI)化合物的摩尔比为0.05-0.2,N,N'-二异丙基碳二亚胺与式(VI)化合物的摩尔比为0.05-0.2,4-二甲氨基吡啶与式(VI)化合物的摩尔比为0.05-0.2;步骤a,b和c中,反应结束后洗涤树脂的溶剂为N,N’-二甲基甲酰胺,二氯甲烷,醋酸水溶液和甲醇,醋酸水溶液的浓度为5-10%(w/v);步骤d中在室温下用盐酸使式(I)化合物从树脂上脱离下来,盐酸与式(VII)化合物的摩尔比为1.5-4.5,洗涤所用的洗涤液为乙酸乙酯。
具体实施方式
本实施例中一些缩写具有以下含义:
MR:Merrifield树脂
DMF:N,N'-二甲基甲酰胺
5-IDUTP:5-碘代-2'-脱氧尿嘧啶核苷三磷酸四钠盐
MR-5-IDUTP:5-碘代-2'-脱氧尿嘧啶核苷三磷酸树脂
FMOC-NPY:芴甲氧羰酰基胺基-1-戊炔
MR-NPYDUTP:5-胺基-1-戊炔基-2'-脱氧尿嘧啶核苷三磷酸树脂
HOBt:羟基苯并三唑
DIC:N,N'-二异丙基碳二亚胺
DMAP:4-二甲氨基吡啶
FMOC-CAMF:二芴甲氧羰酰基-5-羧基-5’-氨基甲基荧光素
MR-NPYDUTP-CAMF:5-羧基-5’-氨基甲基荧光素修饰的1-戊炔基-2'-脱氧尿嘧啶核苷三磷酸树脂
NPYDUTP-CAMF:5-羧基-5’-氨基甲基荧光素修饰的1-戊炔基-2'-脱氧尿嘧啶核苷三磷酸
实施例1
1.将5-IDUTP6.66g(10mmol)分散到100mL DMF中,加入NaOH 0.60g(15mmol),室温搅拌2h,加入Merrifield树脂6.25g(5mmol),90℃下反应6h,分别用40mL DMF,40mL CH2Cl2,40mL 5%醋酸水溶液和40mL甲醇洗涤,真空干燥得MR-5-IDUTP 9.1g。
2.将MR-5-IDUTP(9.1g,4.8mmol),FMOC-NP(2.2g,7.2mmol),碘化铜(0.19g,1mmol)投入到100mL单口烧瓶中,加无水DMF 100mL.氮气保护下,注人无水三乙胺(1.7mL,12mmol),反应10min后,迅速投入四 (三苯基膦)钯(0.46g,4mmol),反应烧瓶用锡箔纸包裹。室温反应20小时后,分别用40mL DMF,40mL CH2Cl2,40mL 5%醋酸水溶液和40mL CH3OH洗涤;然后再加入六氢吡啶的N,N’-二甲基甲酰胺溶液,去掉芴甲氧羰基后获得真空干燥得MR-NPYDUTP 7.8g。
3.将MR-NPYDUTP(7.8g,4.2mmol)溶于100mL DMF中,再加入FMOC-CAMF(3.15g,5mmol),搅拌均匀后加入羟基苯并三唑N,N'-二异丙基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶各0.6g,通氮气室温下反应2小时,分别用40mL DMF,40mL CH2Cl2,40mL 5%醋酸水溶液和40mLCH3OH洗涤;然后再加入六氢吡啶的N,N’-二甲基甲酰胺溶液,去掉芴甲氧羰基后获得MR-NPYDUTP-CAMF 8.5g。
将MR-NPYDUTP-CAMF放入烧瓶中,加入盐酸60mL(1mol/L)振荡12小时后过滤,取滤液用3倍体积的乙酸乙酯洗涤后冻干得到NPYDUTP-CAMF 3.3g。
Claims (6)
1.制备式(I)荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法,
其中取代基具有以下的含义:
M是H,Na或K
R1为H或OH
R2为H或OH
R3为C1-C8直链烷基(CH2)n
Base为具有下列结构的碱基或碱基类似物取代基:
Dye为具有下列结构的荧光染料取代基团:
其中取代基具有以下的含义:
R4为OH,NH2,N(Me)2或N(Et)2,N(Pr)2
R5为O,或NH2 +,N(Me)2 +或N(Et)2 +,N(Pr)2 +
R6为H,F,Cl,Br或I
R7和R8为H或CH2NH2,或者具有以下结构的取代基:
R9为H,CH3或CH2CH3
其特征是包括以下步骤:
a.将式(II)化合物
Base为具有下列结构的碱基或碱基类似物取代基:
用DMF溶解,再加入氢氧化钠和树脂,搅拌均匀,振荡反应;再分别用N,N’-二甲基甲酰胺,二氯甲烷,醋酸水溶液和甲醇洗涤后,得到式(III)化合物
步骤a中所述树脂为Merrifield树脂;
b.将式(IV)化合物
其中FMOC为芴甲氧羰基
与式(III)化合物,碘化铜以及无水DMF混合,在氦气保护下,注入无水三乙胺,投入四(三苯基膦)钯,反应结束后,再分别用N,N’-二甲基甲酰胺,二氯甲烷,醋酸水溶液和甲醇洗涤后,再加入六氢吡啶的N,N’-二甲基甲酰胺溶液,去掉芴甲氧羰基,得到式(V)化合物
c.将式(VI)化合物
R10和R11为H或芴甲氧羰基氨基甲基,或者具有以下结构的取代基:
与式(V)混合于N,N’-二甲基甲酰胺中,加入羟基苯并三唑,N,N'-二异丙基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶,经酰胺化反应后,再分别用N,N’-二甲基甲酰胺,二氯甲烷,醋酸水溶液和甲醇洗涤,获得式(VII)化合物;R10和R11为芴甲氧羰基氨基甲基时,树脂洗涤后加入六氢吡啶的N,N’-二甲基甲酰胺溶液,去掉芴甲氧羰基后获得式(VII)化合物
d.在所得的式(VII)化合物中加入盐酸,振荡后过滤,取滤液洗涤后冻干得到式(I)化合物。
2.根据权利要求1所述的荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法,其特征是步骤a中式(II)化合物与Merrifield树脂混合时,式(II)化合物与Merrifield树脂的摩尔比是1.5-3。
3.根据权利要求1所述的荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法,其特征是步骤a,b和c中,反应结束后洗涤树脂的溶剂为N,N’-二甲基甲酰胺,二氯甲烷,醋酸水溶液和甲醇,醋酸水溶液的浓度为5-10%。
4.根据权利要求1所述的荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法,其特征是步骤b和c中六氢吡啶的N,N’-二甲基甲酰胺溶液的浓度为15-40%。
5.根据权利要求1所述的荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法,其特征是步骤c中的酰胺化反应中,羟基苯并三唑与式(VI)化合物的摩尔比为0.05-0.2,N,N'-二异丙基碳二亚胺与式(VI)化合物的摩尔比为0.05-0.2,4-二甲氨基吡啶与式(VI)化合物的摩尔比为0.05-0.2。
6.根据权利要求1所述的荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法,其特征是步骤d中盐酸的浓度为0.5-3mol/L,盐酸与式(VII)化合物的摩尔比为1.5-4.5,洗涤所用的洗涤液为乙酸乙酯。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201310580357.7A CN104650170B (zh) | 2013-11-20 | 2013-11-20 | 荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201310580357.7A CN104650170B (zh) | 2013-11-20 | 2013-11-20 | 荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104650170A CN104650170A (zh) | 2015-05-27 |
CN104650170B true CN104650170B (zh) | 2017-07-07 |
Family
ID=53241856
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201310580357.7A Active CN104650170B (zh) | 2013-11-20 | 2013-11-20 | 荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN104650170B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107973831A (zh) * | 2017-12-01 | 2018-05-01 | 江南大学 | 一种扩展型荧光胞苷类似物及其制备方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1998006732A1 (en) * | 1996-08-13 | 1998-02-19 | The Perkin-Elmer Corporation | Propargylethoxyamino nucleotides |
WO2003087302A2 (en) * | 2002-04-12 | 2003-10-23 | Stratagene | Dual-labeled nucleotides |
WO2004018712A1 (en) * | 2002-08-23 | 2004-03-04 | Amersham Biosciences Corp | OLIGONUCLEOTIDE TAGGED NUCLEOSIDE TRIPHOSPHATES (OTNTPs) FOR GENETIC ANALYSIS |
CN102030792A (zh) * | 2009-09-29 | 2011-04-27 | 韩国科学技术研究院 | 3'-o-荧光修饰的核苷酸及其用途 |
-
2013
- 2013-11-20 CN CN201310580357.7A patent/CN104650170B/zh active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1998006732A1 (en) * | 1996-08-13 | 1998-02-19 | The Perkin-Elmer Corporation | Propargylethoxyamino nucleotides |
WO2003087302A2 (en) * | 2002-04-12 | 2003-10-23 | Stratagene | Dual-labeled nucleotides |
WO2004018712A1 (en) * | 2002-08-23 | 2004-03-04 | Amersham Biosciences Corp | OLIGONUCLEOTIDE TAGGED NUCLEOSIDE TRIPHOSPHATES (OTNTPs) FOR GENETIC ANALYSIS |
CN102030792A (zh) * | 2009-09-29 | 2011-04-27 | 韩国科学技术研究院 | 3'-o-荧光修饰的核苷酸及其用途 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Merrifield 树脂在固相有机合成中的应用研究;孙孟展 等;《有机化学》;20071231;第27卷(第9期);第1069-1077页 * |
王树脂固相法人工合成生长抑素;刘华 等;《贵阳医学院学报》;20101031;第35卷(第5期);第481-482,486页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN104650170A (zh) | 2015-05-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6713983B2 (ja) | ペプチド合成方法 | |
CN103242431B (zh) | 一种比伐卢定的制备方法 | |
CN105777871B (zh) | 一种环五肽的合成方法 | |
CN103641890A (zh) | 一种卡非佐米的合成方法 | |
CN108440654B (zh) | 一种抗菌活性环六肽Thermoactinoamide A的合成方法 | |
JP2017521487A (ja) | ガニレリクス前駆体、及びそれを用いた酢酸ガニレリクスの製造方法 | |
CN106589071B (zh) | 一种地加瑞克的合成方法 | |
CN111978369B (zh) | 一种制备多肽的方法 | |
CN110964085A (zh) | 一种卡非佐米及其衍生物的制备方法 | |
CN104710507B (zh) | 一种卡非佐米的制备方法 | |
CN102875648A (zh) | 一种制备特拉匹韦的方法 | |
CN104650170B (zh) | 荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法 | |
CN103936828A (zh) | 卡非佐米中间体及卡非佐米的制备方法 | |
CN107922435A (zh) | 由7‑氨基头孢烷酸(7‑aca)制备头孢洛扎的方法 | |
CN108484735B (zh) | 一类广泛活性环七肽Reniochalistatin A-D的合成方法 | |
JP7278775B2 (ja) | 長鎖化合物の製造方法 | |
CN103965293B (zh) | 一种高纯度比伐卢定及其工业化制备方法 | |
CN102532347A (zh) | 三(三联吡啶钌)β-环糊精化合物的合成方法 | |
CN109988213A (zh) | 一种用于多肽液相合成载体的化合物及其制备方法和用途 | |
JPWO2007060860A1 (ja) | ピロールイミダゾールポリアミドの固相自動合成 | |
CN102241746B (zh) | 恩夫韦肽的制备方法 | |
CN107857796A (zh) | 一种三氟乙酰三肽‑2的合成方法 | |
CN103601778A (zh) | 7-去氮-7-取代鸟嘌呤核苷的合成方法 | |
KR101171095B1 (ko) | 루프로라이드의 제조방법 | |
KR20200001546A (ko) | Pna 올리고머의 제조방법 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |