JP2999267B2 - ２’―デオキシウリジン―５’―三リン酸を含む連鎖停止タイプ核酸配列決定方法 - Google Patents
２’―デオキシウリジン―５’―三リン酸を含む連鎖停止タイプ核酸配列決定方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本出願は、1996年12月５日出願の米国仮特許出願番号
60/032,608号に基づく優先権を主張する。
60/032,608号に基づく優先権を主張する。
発明の分野 本発明は、核酸配列決定のための方法およびキットに
関する。より詳細には、本発明は、連鎖停止タイプのDN
A配列決定の方法およびキットに関し、ここでデオキシ
ヌクレオチドである２′−デオキシチミジン−５′−三
リン酸が２′−デオキシウリジン−５′−三リン酸また
はそのアナログで置換される。
関する。より詳細には、本発明は、連鎖停止タイプのDN
A配列決定の方法およびキットに関し、ここでデオキシ
ヌクレオチドである２′−デオキシチミジン−５′−三
リン酸が２′−デオキシウリジン−５′−三リン酸また
はそのアナログで置換される。
参考文献 ABI PRISMTM 373 DNA Sequencing Systemユーザーズ
マニュアル、p/n 903204（1994年６月） ABI PRISMTM Dye Primer Cycle Sequencing Core Kit
（AmpliTaq DNAポリメラーゼを含む）、FS、プロトコ
ル、改訂版Ｃ、p/n 402114（1996） ABI PRISMTM Dye Terminator Cycle Sequencing Core
Kitプロトコル、PE Applied Biosystems、改訂版Ａ、p
/n 402116（1995） Bergotら，米国特許番号5,366,860（1994） Connellら,Biotechniques,5（４）:342−348（1987） Eckstein編,Oligonucleotides and Analogs,第８章お
よび第９章,IRL Press（1991） Hobbsら，米国特許番号5,151,507（1992） Khanら，米国特許出願番号08/696,808（1996） Leeら、Nucleic Acids Research,20（10）:2471−248
3（1992） Leeら，米国特許出願番号08/726,462（1996） Murray,Nucleic Acids Research,17（21）:8889（198
9） Proberら,Science,238:336−341（1987） Scheit,Nucleotide Analogs,John Wiley（1980） Smithら，米国特許番号5,171,534（1992） Smithら，米国特許番号5,171,534（1992） Trainor,Anal.Chem.,62:418−426（1990） 背景 DNA配列決定は、現在の生物学およびバイオテクノロ
ジーにおいてきわめて重要な技術になってきており、基
本的な生物学的研究から臨床医学の薬物の発見にわたる
分野に重要な情報を提供している。大容量のDNA配列デ
ータを収集しなければならないので、DNA配列決定方法
の効率を増大させ、かつコストを低下させるための自動
化技術が開発されている（Smith;Connell;Trainor）。
マニュアル、p/n 903204（1994年６月） ABI PRISMTM Dye Primer Cycle Sequencing Core Kit
（AmpliTaq DNAポリメラーゼを含む）、FS、プロトコ
ル、改訂版Ｃ、p/n 402114（1996） ABI PRISMTM Dye Terminator Cycle Sequencing Core
Kitプロトコル、PE Applied Biosystems、改訂版Ａ、p
/n 402116（1995） Bergotら，米国特許番号5,366,860（1994） Connellら,Biotechniques,5（４）:342−348（1987） Eckstein編,Oligonucleotides and Analogs,第８章お
よび第９章,IRL Press（1991） Hobbsら，米国特許番号5,151,507（1992） Khanら，米国特許出願番号08/696,808（1996） Leeら、Nucleic Acids Research,20（10）:2471−248
3（1992） Leeら，米国特許出願番号08/726,462（1996） Murray,Nucleic Acids Research,17（21）:8889（198
9） Proberら,Science,238:336−341（1987） Scheit,Nucleotide Analogs,John Wiley（1980） Smithら，米国特許番号5,171,534（1992） Smithら，米国特許番号5,171,534（1992） Trainor,Anal.Chem.,62:418−426（1990） 背景 DNA配列決定は、現在の生物学およびバイオテクノロ
ジーにおいてきわめて重要な技術になってきており、基
本的な生物学的研究から臨床医学の薬物の発見にわたる
分野に重要な情報を提供している。大容量のDNA配列デ
ータを収集しなければならないので、DNA配列決定方法
の効率を増大させ、かつコストを低下させるための自動
化技術が開発されている（Smith;Connell;Trainor）。
好ましい自動化DNA配列決定方法は、Sangerによって
開発された連鎖停止技術を用いる酵素的複製に基づく
（Sanger）。Sangerの連鎖停止技術においては、一本鎖
鋳型DNAのDNA配列がDNAポリメラーゼを用いて決定さ
れ、ポリヌクレオチドフラグメントのセットが合成さ
れ、ここでこれらのフラグメントは、（ｉ）鋳型配列に
相補的な配列を有し、（ii）ヌクレオチド１個分づつ長
さが変化し、そして（iii）既知ヌクレオチド（例え
ば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ）で停止する５′−末端を有
する。この方法において、配列決定されるべき鋳型DNA
の３′−末端にオリゴヌクレオチドプライマーがアニー
ルされ、このプライマーの３′−末端が、ポリメラーゼ
が媒介する相補的ポリヌクレオチドフラグメントの重合
のための開始部位として働く。酵素的重合工程は、鋳型
−プライマーハイブリッドと、４つの２′−デオキシヌ
クレオチド−５′−三リン酸ヌクレオチド、Ａ、Ｇ、
Ｃ、およびＴ（「dNTP」）の各々と、DNAポリメラーゼ
酵素と、２′,3′−ジデオキシヌクレオチド三リン酸
（「ddNTP」）停止剤とを組み合わせることによって行
われる。停止剤を取り込むことで、３′−末端にヒドロ
キシ基を欠き、それゆえポリメラーゼによってさらに延
長され得ないフラグメントが形成される。すなわち、そ
のフラグメントは「停止される（terminated）」。ddNT
Pとその対応するdNTPとの間の、取り込みについての競
合の結果、異なるサイズのフラグメントの分布が生じ、
各フラグメントは、その反応で使用される個々の停止剤
で停止される。鋳型の完全なDNA配列を決定するため
に、４つの平行した反応が行われ、各反応は異なるddNT
P停止剤を使用する。フラグメントのサイズ分布を決定
するために、フラグメントは、１個のヌクレオチドごと
にサイズが異なるフラグメントが分割されるように、電
気泳動で分離される。
開発された連鎖停止技術を用いる酵素的複製に基づく
（Sanger）。Sangerの連鎖停止技術においては、一本鎖
鋳型DNAのDNA配列がDNAポリメラーゼを用いて決定さ
れ、ポリヌクレオチドフラグメントのセットが合成さ
れ、ここでこれらのフラグメントは、（ｉ）鋳型配列に
相補的な配列を有し、（ii）ヌクレオチド１個分づつ長
さが変化し、そして（iii）既知ヌクレオチド（例え
ば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ）で停止する５′−末端を有
する。この方法において、配列決定されるべき鋳型DNA
の３′−末端にオリゴヌクレオチドプライマーがアニー
ルされ、このプライマーの３′−末端が、ポリメラーゼ
が媒介する相補的ポリヌクレオチドフラグメントの重合
のための開始部位として働く。酵素的重合工程は、鋳型
−プライマーハイブリッドと、４つの２′−デオキシヌ
クレオチド−５′−三リン酸ヌクレオチド、Ａ、Ｇ、
Ｃ、およびＴ（「dNTP」）の各々と、DNAポリメラーゼ
酵素と、２′,3′−ジデオキシヌクレオチド三リン酸
（「ddNTP」）停止剤とを組み合わせることによって行
われる。停止剤を取り込むことで、３′−末端にヒドロ
キシ基を欠き、それゆえポリメラーゼによってさらに延
長され得ないフラグメントが形成される。すなわち、そ
のフラグメントは「停止される（terminated）」。ddNT
Pとその対応するdNTPとの間の、取り込みについての競
合の結果、異なるサイズのフラグメントの分布が生じ、
各フラグメントは、その反応で使用される個々の停止剤
で停止される。鋳型の完全なDNA配列を決定するため
に、４つの平行した反応が行われ、各反応は異なるddNT
P停止剤を使用する。フラグメントのサイズ分布を決定
するために、フラグメントは、１個のヌクレオチドごと
にサイズが異なるフラグメントが分割されるように、電
気泳動で分離される。
古典的なSangerの連鎖停止技術の近年の変法におい
て、ヌクレオチド停止剤あるいはオリゴヌクレオチドプ
ライマーが蛍光色素で標識される（Prober;Hobbs;Smit
h）。そのような色素標識停止剤を用いることによるい
くつかの利点が認識されており、特に：（ｉ）放射性同
位体の貯蔵、使用および廃棄に関する問題が排除され
る；（ii）色素標識プライマーの合成に対する必要性が
排除される；および（iii）各Ａ、Ｇ、ＣまたはＴヌク
レオチドに対して異なる色素標識を使用する場合、４つ
の全ての反応が同時に単一のチューブ内で行われ得る。
て、ヌクレオチド停止剤あるいはオリゴヌクレオチドプ
ライマーが蛍光色素で標識される（Prober;Hobbs;Smit
h）。そのような色素標識停止剤を用いることによるい
くつかの利点が認識されており、特に：（ｉ）放射性同
位体の貯蔵、使用および廃棄に関する問題が排除され
る；（ii）色素標識プライマーの合成に対する必要性が
排除される；および（iii）各Ａ、Ｇ、ＣまたはＴヌク
レオチドに対して異なる色素標識を使用する場合、４つ
の全ての反応が同時に単一のチューブ内で行われ得る。
Sangerの連鎖停止配列決定方法は非常に有効であるこ
とが実証されているとはいえ、その実施を最適化するこ
とに関していくつかの問題が残っている。そのような問
題のひとつは、特に色素標識停止剤を使用する場合、プ
ライマー延長産物中に取り込まれる標識停止剤の変動性
（variability）が、特にＴ−停止フラグメントの場合
に配列依存的であることである。この取り込みの変動性
は、得られる電気泳動図におけるピーク高さの変動をも
たらす。そのようなピーク高さの変動性は、いくつかの
問題をもたらし得る。第一に、そのような変動性はこの
方法の感度を低下させる（感度は最も弱いピークの検出
能力によって制限される）。第二に、そのような変動性
は、弱いシグナルを有するピークが、連鎖停止剤の取り
込みに起因する真のシグナルなのか、あるいはポリメラ
ーゼが切断したDNA中の中断部位（pause site）に起因
する人工的なシグナルなのかを決定することを困難にす
る。第三に、そのような変動は、近接したバンドの同定
の正確性を低下させる。なぜなら１つのバンドの強力な
シグナルは、その近傍の弱いシグナルをマスクし得るか
らである。これらの問題の各々は、自動化ベースコーリ
ング（base calling）アルゴリズムがデータに適用され
る場合に特に深刻である。
とが実証されているとはいえ、その実施を最適化するこ
とに関していくつかの問題が残っている。そのような問
題のひとつは、特に色素標識停止剤を使用する場合、プ
ライマー延長産物中に取り込まれる標識停止剤の変動性
（variability）が、特にＴ−停止フラグメントの場合
に配列依存的であることである。この取り込みの変動性
は、得られる電気泳動図におけるピーク高さの変動をも
たらす。そのようなピーク高さの変動性は、いくつかの
問題をもたらし得る。第一に、そのような変動性はこの
方法の感度を低下させる（感度は最も弱いピークの検出
能力によって制限される）。第二に、そのような変動性
は、弱いシグナルを有するピークが、連鎖停止剤の取り
込みに起因する真のシグナルなのか、あるいはポリメラ
ーゼが切断したDNA中の中断部位（pause site）に起因
する人工的なシグナルなのかを決定することを困難にす
る。第三に、そのような変動は、近接したバンドの同定
の正確性を低下させる。なぜなら１つのバンドの強力な
シグナルは、その近傍の弱いシグナルをマスクし得るか
らである。これらの問題の各々は、自動化ベースコーリ
ング（base calling）アルゴリズムがデータに適用され
る場合に特に深刻である。
要旨 本発明は、本発明者らの改良されたSanger連鎖停止ポ
リヌクレオチド配列決定方法の発見に関し、ここでデオ
キシヌクレオチドである２′−デオキシチミジン−５′
−三リン酸が２′−デオキシウリジン−５′−三リン酸
またはそのアナログで置換される。
リヌクレオチド配列決定方法の発見に関し、ここでデオ
キシヌクレオチドである２′−デオキシチミジン−５′
−三リン酸が２′−デオキシウリジン−５′−三リン酸
またはそのアナログで置換される。
本発明の目的は、電気泳動図におけるピーク高さの変
動性が実質的に低減される、Sanger連鎖停止ポリヌクレ
オチド配列決定方法を提供することにある。
動性が実質的に低減される、Sanger連鎖停止ポリヌクレ
オチド配列決定方法を提供することにある。
第１の局面において、本発明の上記および他の目的
は、以下の工程を包含する連鎖停止タイプ核酸配列決定
方法によって達成される：（ｉ）鋳型核酸を提供する工
程；（ii）該鋳型核酸の一部に対してオリゴヌクレオチ
ドプライマーをアニールし、それによりプライマー−鋳
型ハイブリッドを形成する工程；（iii）プライマーを
延長し、そしてプライマー延長産物を形成するために、
プライマー−鋳型ハイブリッドにプライマー延長試薬を
添加する工程であって、このプライマー延長試薬が２′
−デオキシウリジン−５′−三リン酸ヌクレオチドを含
む、工程；および（iv）プライマー延長産物の特異的停
止を引き起こすために、プライマー−鋳型ハイブリッド
に停止剤を添加する工程。この方法の好ましい実施態様
において、停止剤は、それに付加した標識（例えば、蛍
光標識）を有する。
は、以下の工程を包含する連鎖停止タイプ核酸配列決定
方法によって達成される：（ｉ）鋳型核酸を提供する工
程；（ii）該鋳型核酸の一部に対してオリゴヌクレオチ
ドプライマーをアニールし、それによりプライマー−鋳
型ハイブリッドを形成する工程；（iii）プライマーを
延長し、そしてプライマー延長産物を形成するために、
プライマー−鋳型ハイブリッドにプライマー延長試薬を
添加する工程であって、このプライマー延長試薬が２′
−デオキシウリジン−５′−三リン酸ヌクレオチドを含
む、工程；および（iv）プライマー延長産物の特異的停
止を引き起こすために、プライマー−鋳型ハイブリッド
に停止剤を添加する工程。この方法の好ましい実施態様
において、停止剤は、それに付加した標識（例えば、蛍
光標識）を有する。
第２の局面において、本発明は、上記の連鎖停止タイ
プ核酸配列決定方法を行うためのキットを包含する。こ
のキットは、（ｉ）オリゴヌクレオチドプライマー；
（ii）プライマーを延長し、そしてプライマー延長産物
を形成するためのプライマー延長試薬であって、２′−
デオキシウリジン−５′−三リン酸ヌクレオチドを含む
プライマー延長試薬；および（iii）プライマー延長産
物の特異的停止を引き起こすための停止剤を含む。この
キットの好ましい実施態様において、停止剤は、それに
付加した標識（例えば、蛍光標識）を有する。
プ核酸配列決定方法を行うためのキットを包含する。こ
のキットは、（ｉ）オリゴヌクレオチドプライマー；
（ii）プライマーを延長し、そしてプライマー延長産物
を形成するためのプライマー延長試薬であって、２′−
デオキシウリジン−５′−三リン酸ヌクレオチドを含む
プライマー延長試薬；および（iii）プライマー延長産
物の特異的停止を引き起こすための停止剤を含む。この
キットの好ましい実施態様において、停止剤は、それに
付加した標識（例えば、蛍光標識）を有する。
本発明の、これらの目的および他の目的、特徴、およ
び利点は、以下の説明、図面、ならびに添付の請求の範
囲を参照することでよりよく理解される。
び利点は、以下の説明、図面、ならびに添付の請求の範
囲を参照することでよりよく理解される。
図面の簡単な説明 図1Aおよび1Bは、エネルギー移動色素のいくつかの例
の構造を示す。
の構造を示す。
図２は、色素標識停止剤ddTTP−EO−6FAM−Ｂ−dTMR2
およびddTTP−EO−5FAM−Ｂ−dTMR2の構造を示す。
およびddTTP−EO−5FAM−Ｂ−dTMR2の構造を示す。
図３および４は、２種の異なる色素標識ジデオキシヌ
クレオチド停止剤を用いた、dTTPまたはdUTPを含む配列
決定反応における、ピーク高さの変動を比較する電気泳
動図を示す。
クレオチド停止剤を用いた、dTTPまたはdUTPを含む配列
決定反応における、ピーク高さの変動を比較する電気泳
動図を示す。
好適な実施態様の詳細な説明 ここから、本発明の好適な実施態様について詳細に参
照し、その例を添付の図面で例示する。本発明を好適な
実施態様に関連して説明するが、これは、本発明をこれ
らの実施態様に限定することを意図しないことが理解さ
れる。その反対に、本発明は、添付の請求の範囲で定義
される通りの本発明に包含され得る、代替、改変、およ
び等価物を包含することを意図する。
照し、その例を添付の図面で例示する。本発明を好適な
実施態様に関連して説明するが、これは、本発明をこれ
らの実施態様に限定することを意図しないことが理解さ
れる。その反対に、本発明は、添付の請求の範囲で定義
される通りの本発明に包含され得る、代替、改変、およ
び等価物を包含することを意図する。
一般に、本発明は、連鎖停止タイプDNA配列決定を行
うための方法およびキットを包含し、ここで２′−デオ
キシチミジン−５′−三リン酸ヌクレオチド（dTTP）が
２′−デオキシウリジン−５′−三リン酸ヌクレオチド
（dUTP）またはそのアナログで置換される。この方法お
よびキットは、ジデオキシヌクレオチド停止剤に標識が
付加した連鎖停止タイプDNA配列決定反応に、特にその
用途を見出す。
うための方法およびキットを包含し、ここで２′−デオ
キシチミジン−５′−三リン酸ヌクレオチド（dTTP）が
２′−デオキシウリジン−５′−三リン酸ヌクレオチド
（dUTP）またはそのアナログで置換される。この方法お
よびキットは、ジデオキシヌクレオチド停止剤に標識が
付加した連鎖停止タイプDNA配列決定反応に、特にその
用途を見出す。
本発明は、連鎖停止タイプDNA配列決定反応において
２′−デオキシチミジン−５′−三リン酸ヌクレオチド
を２′−デオキシウリジン−５′−三リン酸ヌクレオチ
ドで置換することによって、反応産物を電気泳動で分割
する場合に、生成される各反応産物の量における変動が
顕著に少なくなるという発見に部分的に基づく。その結
果、より均一なピーク高さによって特徴付けられる電気
泳動図が得られ、それにより、自動化ベースコーリング
アルゴリズムの適用が促進される。
２′−デオキシチミジン−５′−三リン酸ヌクレオチド
を２′−デオキシウリジン−５′−三リン酸ヌクレオチ
ドで置換することによって、反応産物を電気泳動で分割
する場合に、生成される各反応産物の量における変動が
顕著に少なくなるという発見に部分的に基づく。その結
果、より均一なピーク高さによって特徴付けられる電気
泳動図が得られ、それにより、自動化ベースコーリング
アルゴリズムの適用が促進される。
I.定義 他に断りのない限り、以下の用語および語句は、本明
細書において以下の意味を有することが意図される： 用語「標識」は、本発明のヌクレオシドまたはポリヌ
クレオチドに付加した場合に、そのようなヌクレオシド
またはポリヌクレオチドを既知の検出手段を用いて検出
可能とする部分を意味する。標識の例には、蛍光団、発
色団、放射性同位体、スピン標識、酵素標識、化学発光
標識など（これらは標識された化合物を適切な検出器に
よって、直接検出することを可能とする）、あるいは抗
原またはビオチンのようなリガンド（これらは高い親和
性で、標識化抗体またはアビジンのような検出可能な抗
リガンドに特異的に結合し得る）が挙げられる。好まし
い標識は、フルオレセイン型色素またはローダミン型色
素のような蛍光色素である（Lee;Menchen）。
細書において以下の意味を有することが意図される： 用語「標識」は、本発明のヌクレオシドまたはポリヌ
クレオチドに付加した場合に、そのようなヌクレオシド
またはポリヌクレオチドを既知の検出手段を用いて検出
可能とする部分を意味する。標識の例には、蛍光団、発
色団、放射性同位体、スピン標識、酵素標識、化学発光
標識など（これらは標識された化合物を適切な検出器に
よって、直接検出することを可能とする）、あるいは抗
原またはビオチンのようなリガンド（これらは高い親和
性で、標識化抗体またはアビジンのような検出可能な抗
リガンドに特異的に結合し得る）が挙げられる。好まし
い標識は、フルオレセイン型色素またはローダミン型色
素のような蛍光色素である（Lee;Menchen）。
用語「ヌクレオシド」は、ペントースに１′位で連結
した、プリン、デアザプリン、またはピリミジンヌクレ
オシド塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、
ウラシル、チミン、デアザアデニン、デアザグアノシン
など）から構成される化合物を意味し、２′−デオキシ
体および２′−ヒドロキシ体を包含する（Stryer）。用
語「ヌクレオチド」は、本明細書において、ヌクレオシ
ドのリン酸エステル（例えば、三リン酸エステル）を意
味し、ここで最も一般的なエステル化部位は、ペントー
スのＣ−５位に付加したヒドロキシル基である。本開示
においては多くの場合、用語ヌクレオシドは、ヌクレオ
シドおよびヌクレオチドの両方を包含することを意図す
る。ヌクレオシドに関しての「アナログ」は、修飾され
た塩基部分、修飾された糖部分、および／または修飾さ
れたリン酸エステル部分を有する合成アナログを包含す
る（例えば、他に記載されるようなアナログ（Scheit;E
ckstein））。
した、プリン、デアザプリン、またはピリミジンヌクレ
オシド塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、
ウラシル、チミン、デアザアデニン、デアザグアノシン
など）から構成される化合物を意味し、２′−デオキシ
体および２′−ヒドロキシ体を包含する（Stryer）。用
語「ヌクレオチド」は、本明細書において、ヌクレオシ
ドのリン酸エステル（例えば、三リン酸エステル）を意
味し、ここで最も一般的なエステル化部位は、ペントー
スのＣ−５位に付加したヒドロキシル基である。本開示
においては多くの場合、用語ヌクレオシドは、ヌクレオ
シドおよびヌクレオチドの両方を包含することを意図す
る。ヌクレオシドに関しての「アナログ」は、修飾され
た塩基部分、修飾された糖部分、および／または修飾さ
れたリン酸エステル部分を有する合成アナログを包含す
る（例えば、他に記載されるようなアナログ（Scheit;E
ckstein））。
本明細書において、用語「ポリヌクレオチド」または
「オリゴヌクレオチド」は、天然ヌクレオチドの線状ポ
リマー、モノマーまたはそれらのアナログを意味し、二
本鎖および一本鎖のデオキシリボヌクレオチド、リボヌ
クレオチド、それらのα−アノマー体などを包含する。
通常、ヌクレオシドモノマーはホスホジエステル連結に
よって連結し、ここで本明細書において使用される用語
「ホスホジエステル連結」は、ホスホジエステル結合
（単数または複数）（それらのホスフェートアナログを
包含する）を意味し、会合する対イオン（例えば、Ｈ、
NH4、Naなど）を包含する（そのような対イオンが存在
する場合）。ポリヌクレオチドは、典型的には、数個の
モノマー単位（例えば８〜40）から数千個のモノマー単
位までの範囲の大きさである。ポリヌクレオチドが「AT
GCCTG」のような文字列で表される場合はいつも、他に
断りのない限り、ヌクレオチドは５′−＞３′の順で左
から右に並び、そして「Ａ」はデオキシアデノシンを表
し、「Ｃ」はデオキシシチジンを表し、「Ｇ」はデオキ
シグアノシンを表し、そして「Ｔ」はチミジンを表すこ
とが理解される。
「オリゴヌクレオチド」は、天然ヌクレオチドの線状ポ
リマー、モノマーまたはそれらのアナログを意味し、二
本鎖および一本鎖のデオキシリボヌクレオチド、リボヌ
クレオチド、それらのα−アノマー体などを包含する。
通常、ヌクレオシドモノマーはホスホジエステル連結に
よって連結し、ここで本明細書において使用される用語
「ホスホジエステル連結」は、ホスホジエステル結合
（単数または複数）（それらのホスフェートアナログを
包含する）を意味し、会合する対イオン（例えば、Ｈ、
NH4、Naなど）を包含する（そのような対イオンが存在
する場合）。ポリヌクレオチドは、典型的には、数個の
モノマー単位（例えば８〜40）から数千個のモノマー単
位までの範囲の大きさである。ポリヌクレオチドが「AT
GCCTG」のような文字列で表される場合はいつも、他に
断りのない限り、ヌクレオチドは５′−＞３′の順で左
から右に並び、そして「Ａ」はデオキシアデノシンを表
し、「Ｃ」はデオキシシチジンを表し、「Ｇ」はデオキ
シグアノシンを表し、そして「Ｔ」はチミジンを表すこ
とが理解される。
用語「オリゴヌクレオチドプライマー」は、オリゴヌ
クレオチドまたはポリヌクレオチドを意味し、これは、
鋳型核酸にアニールしたとき、プライマー延長試薬の存
在下で、３′−末端から延長することができる。典型的
には、オリゴヌクレオチドプライマーは３′−末端ヌク
レオチドの３′−位にヒドロキシル基を含む。
クレオチドまたはポリヌクレオチドを意味し、これは、
鋳型核酸にアニールしたとき、プライマー延長試薬の存
在下で、３′−末端から延長することができる。典型的
には、オリゴヌクレオチドプライマーは３′−末端ヌク
レオチドの３′−位にヒドロキシル基を含む。
用語「ホスフェートアナログ」は、リン原子が+5酸化
状態にあり、そして１つまたはそれ以上の酸素原子が非
酸素部分で置換されているホスフェートのアナログを意
味し、アナログの例は、ホスホロチオエート、ホスホロ
ジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレ
ノエート、ホスホロアニロチオエート（phosphoroanilo
thioate）、ホスホルアニリデート（phoshoranilidat
e）、ホスホルアミデート、ボロノホスフェートなどを
包含し、会合する対イオン（例えば、Ｈ、NH4、Naな
ど）を包含する（そのような対イオンが存在する場
合）。
状態にあり、そして１つまたはそれ以上の酸素原子が非
酸素部分で置換されているホスフェートのアナログを意
味し、アナログの例は、ホスホロチオエート、ホスホロ
ジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレ
ノエート、ホスホロアニロチオエート（phosphoroanilo
thioate）、ホスホルアニリデート（phoshoranilidat
e）、ホスホルアミデート、ボロノホスフェートなどを
包含し、会合する対イオン（例えば、Ｈ、NH4、Naな
ど）を包含する（そのような対イオンが存在する場
合）。
本明細書で用いられる用語「プライマー延長試薬」
は、オリゴヌクレオチドプライマーの酵素的鋳型媒介延
長を達成するために必要な成分を含む試薬を意味する。
好ましくは、プライマー延長試薬は、（ｉ）ポリメラー
ゼ酵素（例えば、Taqポリメラーゼのような熱安定性ポ
リメラーゼ酵素）；（ii）緩衝剤；および（iii）２′
−デオキシヌクレオチド三リン酸（例えば、２′−デオ
キシウリジン−５′−三リン酸、２′−デオキシグアノ
シン−５′−三リン酸、２′−デオキシ−７−デアザデ
オキシグアノシン−５′−三リン酸、２′−デオキシア
デノシン−５′−三リン酸、２′−デオキシチミジン−
５′−三リン酸、２′−デオキシシチジン−５′−三リ
ン酸）を含む。
は、オリゴヌクレオチドプライマーの酵素的鋳型媒介延
長を達成するために必要な成分を含む試薬を意味する。
好ましくは、プライマー延長試薬は、（ｉ）ポリメラー
ゼ酵素（例えば、Taqポリメラーゼのような熱安定性ポ
リメラーゼ酵素）；（ii）緩衝剤；および（iii）２′
−デオキシヌクレオチド三リン酸（例えば、２′−デオ
キシウリジン−５′−三リン酸、２′−デオキシグアノ
シン−５′−三リン酸、２′−デオキシ−７−デアザデ
オキシグアノシン−５′−三リン酸、２′−デオキシア
デノシン−５′−三リン酸、２′−デオキシチミジン−
５′−三リン酸、２′−デオキシシチジン−５′−三リ
ン酸）を含む。
本明細書において、用語「停止剤」は、プライマー延
長産物に取り込まれた場合に、産物のさらなる延長を阻
止する種を意味する。停止剤の例には、２′,3′−ジデ
オキシヌクレオチド、例えば、２′,3′−ジデオキシグ
アノシン−５′−三リン酸、７−デアザ−２′,3′−ジ
デオキシグアノシン−５′−三リン酸、２′,3′−ジデ
オキシアデノシン−５′−三リン酸、２′,3′−ジデオ
キシチミジン−５′−三リン酸、および２′,3′−ジデ
オキシシチジン−５′−三リン酸が挙げられる。
長産物に取り込まれた場合に、産物のさらなる延長を阻
止する種を意味する。停止剤の例には、２′,3′−ジデ
オキシヌクレオチド、例えば、２′,3′−ジデオキシグ
アノシン−５′−三リン酸、７−デアザ−２′,3′−ジ
デオキシグアノシン−５′−三リン酸、２′,3′−ジデ
オキシアデノシン−５′−三リン酸、２′,3′−ジデオ
キシチミジン−５′−三リン酸、および２′,3′−ジデ
オキシシチジン−５′−三リン酸が挙げられる。
本明細書において、用語「鋳型核酸」は、一本鎖形態
で存在し得、そしてプライマーオリゴヌクレオチドと共
にアニールし得る任意の核酸を意味する。鋳型核酸の例
には、DNA、RNAが挙げられ、このDNAまたはRNA一本鎖ま
たは二本鎖であり得る。より具体的には、鋳型核酸は、
ゲノムDNA、メッセンジャーRNA、cDNA、PCR反応からのD
NA増幅産物などであり得る。鋳型DNAの調製のための方
法は、他のところで見出され得る（ABI PRISMTM Dye Pr
imer Cycle Sequencing Core Kit Protocol）。
で存在し得、そしてプライマーオリゴヌクレオチドと共
にアニールし得る任意の核酸を意味する。鋳型核酸の例
には、DNA、RNAが挙げられ、このDNAまたはRNA一本鎖ま
たは二本鎖であり得る。より具体的には、鋳型核酸は、
ゲノムDNA、メッセンジャーRNA、cDNA、PCR反応からのD
NA増幅産物などであり得る。鋳型DNAの調製のための方
法は、他のところで見出され得る（ABI PRISMTM Dye Pr
imer Cycle Sequencing Core Kit Protocol）。
用語「フルオレセイン型色素」は、以下の縮合三環系
を含むキサンテン色素分子のクラスを意味する： ここで、各デオキシ環位置において広範囲の置換が可能
である。特に好ましいフルオレセイン型色素のサブセッ
トには、4,7,−ジクロロフルオレセイン（Menchen）が
挙げられる。DNA配列決定方法における蛍光標識として
使用されるフルオレセイン型色素の例は、６−カルボキ
シフルオレセイン（６−FAM）、５−カルボキシフルオ
レセイン（５−FAM）、６−カルボキシ−4,7,2′,7′−
テトラクロロフルオレセイン（TET）、６−カルボキシ
−4,7,2′,4′,5′,7′−ヘキサクロロフルオレセイン
（HEX）、５−（および６）カルボキシ−４′,5′−ジ
クロロ−２′,7′−ジメトキシフルオレセイン（JO
E）、および５−カルボキシ−２′,4′,5′,7′−テト
ラクロロフルオレセイン（ZOE）を包含する。多くの場
合、−１または−２という指示が特定の色素の略称の後
に置かれる（例えば、HEX−１）。この「−１」および
［−２」という指示は、使用される特定の色素異性体を
示す。１および２異性体は、Ｃ−８カラム、および15％
アセトニトリル/85％0.1M酢酸トリエチルアンモニウム
から35％アセトニトリル/65％0.1M酢酸トリエチルアン
モニウムまでの溶出勾配を用いる逆相クロマトグラフ分
離系における遊離色素の溶出順序（１異性体が最初に溶
出する）によって定義される。
を含むキサンテン色素分子のクラスを意味する： ここで、各デオキシ環位置において広範囲の置換が可能
である。特に好ましいフルオレセイン型色素のサブセッ
トには、4,7,−ジクロロフルオレセイン（Menchen）が
挙げられる。DNA配列決定方法における蛍光標識として
使用されるフルオレセイン型色素の例は、６−カルボキ
シフルオレセイン（６−FAM）、５−カルボキシフルオ
レセイン（５−FAM）、６−カルボキシ−4,7,2′,7′−
テトラクロロフルオレセイン（TET）、６−カルボキシ
−4,7,2′,4′,5′,7′−ヘキサクロロフルオレセイン
（HEX）、５−（および６）カルボキシ−４′,5′−ジ
クロロ−２′,7′−ジメトキシフルオレセイン（JO
E）、および５−カルボキシ−２′,4′,5′,7′−テト
ラクロロフルオレセイン（ZOE）を包含する。多くの場
合、−１または−２という指示が特定の色素の略称の後
に置かれる（例えば、HEX−１）。この「−１」および
［−２」という指示は、使用される特定の色素異性体を
示す。１および２異性体は、Ｃ−８カラム、および15％
アセトニトリル/85％0.1M酢酸トリエチルアンモニウム
から35％アセトニトリル/65％0.1M酢酸トリエチルアン
モニウムまでの溶出勾配を用いる逆相クロマトグラフ分
離系における遊離色素の溶出順序（１異性体が最初に溶
出する）によって定義される。
用語「ローダミン型色素」は、以下の縮合三環系を含
むｊキサンテン色素分子のクラスを意味する： ここで、Y1−Y4は、好ましくは独立して水素または低
級アルキルであり、あるいは一緒である場合、Y1および
R2はプロパノであり、そしてY2およびR1はプロパノであ
り、あるいは一緒である場合、Y3およびR3はプロパノで
あり、そしてY4およびR4はプロパノである。R1−R4位を
含む各デオキシ環位置において広範囲の置換が可能であ
る。ヌクレオシド標識として有用なローダミン型色素の
例は、テトラメチルローダミン（TAMRA）、4,7−ジクロ
ロテトラメチルローダミン（DTAMRA）、ローダミンＸ
（ROX）、ローダミン6G（R6G）、ローダミン110（R11
0）などを包含する（Bergot;Lee 1992）。
むｊキサンテン色素分子のクラスを意味する： ここで、Y1−Y4は、好ましくは独立して水素または低
級アルキルであり、あるいは一緒である場合、Y1および
R2はプロパノであり、そしてY2およびR1はプロパノであ
り、あるいは一緒である場合、Y3およびR3はプロパノで
あり、そしてY4およびR4はプロパノである。R1−R4位を
含む各デオキシ環位置において広範囲の置換が可能であ
る。ヌクレオシド標識として有用なローダミン型色素の
例は、テトラメチルローダミン（TAMRA）、4,7−ジクロ
ロテトラメチルローダミン（DTAMRA）、ローダミンＸ
（ROX）、ローダミン6G（R6G）、ローダミン110（R11
0）などを包含する（Bergot;Lee 1992）。
用語「エネルギー移動色素」は、第１の波長で光を吸
収し、そして応答して励起エネルギーを放射するドナー
色素、ドナー色素によって放射された励起エネルギーを
吸収し得、そして応答して第２の波長で蛍光を発し得る
アクセプター色素、およびドナー色素とアクセプター色
素とを連結するリンカーを含む、蛍光色素のクラスを意
味する（Lee 1996）。いくつかのエネルギー移動色素の
構造を図1Aおよび1Bに示す。
収し、そして応答して励起エネルギーを放射するドナー
色素、ドナー色素によって放射された励起エネルギーを
吸収し得、そして応答して第２の波長で蛍光を発し得る
アクセプター色素、およびドナー色素とアクセプター色
素とを連結するリンカーを含む、蛍光色素のクラスを意
味する（Lee 1996）。いくつかのエネルギー移動色素の
構造を図1Aおよび1Bに示す。
II.配列決定方法 第１の局面において、本発明は、２′−デオキシチミ
ジン−５′−三リン酸ヌクレオチドが２′−デオキシウ
リジン−５′−三リン酸ヌクレオチドまたはそのアナロ
グで置換された、改変されたプライマー延長試薬を用い
る、Sanger連鎖停止ポリヌクレオチド配列決定方法を含
む。
ジン−５′−三リン酸ヌクレオチドが２′−デオキシウ
リジン−５′−三リン酸ヌクレオチドまたはそのアナロ
グで置換された、改変されたプライマー延長試薬を用い
る、Sanger連鎖停止ポリヌクレオチド配列決定方法を含
む。
本発明の配列決定方法は、典型的な配列決定反応に用
いられる手順と本質的に同じ手順を用いて行われる（AB
I PRISMTM Dye Terminator Cycle Sequencing Core Ki
t）。一般に、本発明によるSanger連鎖停止反応を行う
ためには、鋳型溶液（例えば、PCR反応産物）および配
列決定プライマーを、緩衝剤、dTTPの代わりにdUTPを含
むデオキシヌクレオチド／標識ジデオキシヌクレオチド
混合物、および２ポリメラーゼ酵素を含むプライマー延
長試薬と混合する。任意に、生産されるプライマー延長
産物の量を線形に増幅するために、反応を熱サイクルさ
せる。好ましいプロトコルのより詳細な説明のために、
実施例１を参照のこと。
いられる手順と本質的に同じ手順を用いて行われる（AB
I PRISMTM Dye Terminator Cycle Sequencing Core Ki
t）。一般に、本発明によるSanger連鎖停止反応を行う
ためには、鋳型溶液（例えば、PCR反応産物）および配
列決定プライマーを、緩衝剤、dTTPの代わりにdUTPを含
むデオキシヌクレオチド／標識ジデオキシヌクレオチド
混合物、および２ポリメラーゼ酵素を含むプライマー延
長試薬と混合する。任意に、生産されるプライマー延長
産物の量を線形に増幅するために、反応を熱サイクルさ
せる。好ましいプロトコルのより詳細な説明のために、
実施例１を参照のこと。
プライマー延長試薬中にdTTPが存在しないことが好ま
しい。もしdTTPとdUTPの両方が存在すると、プライマー
延長産物はＴおよびＵのヌクレオチドの両方の分布を含
む。ＴおよびＵのヌクレオチドはプライマー延長産物の
電気泳動の移動度に異なる寄与をなすので、そのような
混合物は、所与のサイズの各フラグメントに対して複数
のピークが存在するようにさせることによって、フラグ
メントの電気泳動分析を大幅に複雑化させる。例えば、
100のＴを含む500ヌクレオチドのフラグメントは、単一
ピークではなく、おそらく100個までの異なる電気泳動
ピークを生じ得る！ 本方法において使用され得るDNAポリメラーゼの例
は、Taq DNAポリメラーゼ（その変異体を含む）、T4 DN
Aポリメラーゼ、DNAポリメラーゼＩのKlenowフラグメン
ト、Pfu DNAポリメラーゼなどを包含する。好ましく
は、ポリメラーゼはAmpliTaq FS DNAポリメラーゼであ
る。
しい。もしdTTPとdUTPの両方が存在すると、プライマー
延長産物はＴおよびＵのヌクレオチドの両方の分布を含
む。ＴおよびＵのヌクレオチドはプライマー延長産物の
電気泳動の移動度に異なる寄与をなすので、そのような
混合物は、所与のサイズの各フラグメントに対して複数
のピークが存在するようにさせることによって、フラグ
メントの電気泳動分析を大幅に複雑化させる。例えば、
100のＴを含む500ヌクレオチドのフラグメントは、単一
ピークではなく、おそらく100個までの異なる電気泳動
ピークを生じ得る！ 本方法において使用され得るDNAポリメラーゼの例
は、Taq DNAポリメラーゼ（その変異体を含む）、T4 DN
Aポリメラーゼ、DNAポリメラーゼＩのKlenowフラグメン
ト、Pfu DNAポリメラーゼなどを包含する。好ましく
は、ポリメラーゼはAmpliTaq FS DNAポリメラーゼであ
る。
好ましくは、プライマー延長産物を標識するための標
識は、蛍光分子である。より好ましくは、標識は、フル
オレセイン型またはローダミン型の蛍光分子である。最
も好ましくは、標識はエネルギー移動色素である。本発
明の好ましい実施態様において、標識はジデオキシヌク
レオチド停止剤に付加している。
識は、蛍光分子である。より好ましくは、標識は、フル
オレセイン型またはローダミン型の蛍光分子である。最
も好ましくは、標識はエネルギー移動色素である。本発
明の好ましい実施態様において、標識はジデオキシヌク
レオチド停止剤に付加している。
好ましくは、反応産物は、自動化DNA配列決定装置を
用い、刊行されたプロトコルに従って（例えば、ABI PR
ISM Model 373 DNA Sequencer（ABI PRISMTM 373 DNA S
equencing System）を用いて）、電気泳動で分離され、
そしてレーザー励起蛍光で検出される。
用い、刊行されたプロトコルに従って（例えば、ABI PR
ISM Model 373 DNA Sequencer（ABI PRISMTM 373 DNA S
equencing System）を用いて）、電気泳動で分離され、
そしてレーザー励起蛍光で検出される。
III.キット 第２の局面において、本発明は、本発明の方法を便利
に行うためのキットを包含する。キットは、dTTPが除去
され、そしてdUTPが添加されたプライマー延長試薬を含
む。任意に、キットは、またオリゴヌクレオチドプライ
マーを含み得る。好ましい実施態様において、キットは
さらに、プライマー延長試薬の活性を決定するために有
用な標準鋳型核酸を含む。
に行うためのキットを包含する。キットは、dTTPが除去
され、そしてdUTPが添加されたプライマー延長試薬を含
む。任意に、キットは、またオリゴヌクレオチドプライ
マーを含み得る。好ましい実施態様において、キットは
さらに、プライマー延長試薬の活性を決定するために有
用な標準鋳型核酸を含む。
IV.実施例 本発明は、以下の実施例を考慮することによってさら
に明確となる。これらは単に発明の例示を意図し、いか
なる様式においてもその範囲を限定することを意図しな
い。
に明確となる。これらは単に発明の例示を意図し、いか
なる様式においてもその範囲を限定することを意図しな
い。
実施例１ dTTPヌクレオチドおよびdUTPヌクレオチドを用いた反応
間のピーク高さの均一性の比較 dTTPをdUTPで置換することによるプライマー延長反応
の結果に対する影響を試験するために、Ｔ−停止による
色素標識停止剤反応をdTTPまたはdUTPのいずれかを含む
プライマー延長試薬を用いて行い、そして得られる反応
産物の電気泳動図におけるピーク高さの均一性を比較し
た。
間のピーク高さの均一性の比較 dTTPをdUTPで置換することによるプライマー延長反応
の結果に対する影響を試験するために、Ｔ−停止による
色素標識停止剤反応をdTTPまたはdUTPのいずれかを含む
プライマー延長試薬を用いて行い、そして得られる反応
産物の電気泳動図におけるピーク高さの均一性を比較し
た。
色素−停止剤プライマー延長反応を、AmpliTaq DNAポ
リメラーゼ、FSを用いて、ABI PRISMTM Dye Terminator
Cycle Sequencing Core Kitマニュアル（PE Applied B
iosystems p/n 402116）で提供されるプロトコルに従っ
て行った。（FS酵素は、組替えThermus aquaticus DNA
ポリメラーゼであり、２つの点変異G46DおよびF667Yを
有する）。改変dNTP混合物および色素標識停止剤を除く
すべてのプライマーおよびプライマー延長試薬（緩衝剤
およびAmpliTaq DNAポリメラーゼ、FS酵素を含む）は、
ABI PRISMTM Dye Terminator Core Kit（PE Applied Bi
osystems p/n 402117）からのものであった。色素標識
Ｔ−停止剤は、プロパルギルエトキシアミノリンカーを
介してジデオキシＴ−停止剤に連結したエネルギー移動
色素から構成された（Lee,1996;Khan）。反応成分の予
備混合物を、以下の表に示すように調製した。ここです
べての量は１反応当たりを基準として与えられる： 反応系は、Perkin−Elmer 480 DNA Thermal Cycler（PE
Applied Biosystems p/n N801−100）に適合した0.5ml
のチューブ中で組み立てられた。反応容量は20μＬであ
り、15μＬの上記反応予備混合物、１〜1000pmolの色素
標識停止剤、および総反応容量を20μｌまでとするに十
分な量の水を含んでいた。各反応系に添加する色素標識
停止剤の正確な量は、使用される特定の色素停止剤に依
存した。30μＬの鉱物油を各反応系の上部に添加して、
蒸発を防いだ。反応を以下のように熱サイクルした:96
℃で30秒、50℃で15秒、および60℃で４分間、25サイク
ル；次いで４℃でサイクルを維持。
リメラーゼ、FSを用いて、ABI PRISMTM Dye Terminator
Cycle Sequencing Core Kitマニュアル（PE Applied B
iosystems p/n 402116）で提供されるプロトコルに従っ
て行った。（FS酵素は、組替えThermus aquaticus DNA
ポリメラーゼであり、２つの点変異G46DおよびF667Yを
有する）。改変dNTP混合物および色素標識停止剤を除く
すべてのプライマーおよびプライマー延長試薬（緩衝剤
およびAmpliTaq DNAポリメラーゼ、FS酵素を含む）は、
ABI PRISMTM Dye Terminator Core Kit（PE Applied Bi
osystems p/n 402117）からのものであった。色素標識
Ｔ−停止剤は、プロパルギルエトキシアミノリンカーを
介してジデオキシＴ−停止剤に連結したエネルギー移動
色素から構成された（Lee,1996;Khan）。反応成分の予
備混合物を、以下の表に示すように調製した。ここです
べての量は１反応当たりを基準として与えられる： 反応系は、Perkin−Elmer 480 DNA Thermal Cycler（PE
Applied Biosystems p/n N801−100）に適合した0.5ml
のチューブ中で組み立てられた。反応容量は20μＬであ
り、15μＬの上記反応予備混合物、１〜1000pmolの色素
標識停止剤、および総反応容量を20μｌまでとするに十
分な量の水を含んでいた。各反応系に添加する色素標識
停止剤の正確な量は、使用される特定の色素停止剤に依
存した。30μＬの鉱物油を各反応系の上部に添加して、
蒸発を防いだ。反応を以下のように熱サイクルした:96
℃で30秒、50℃で15秒、および60℃で４分間、25サイク
ル；次いで４℃でサイクルを維持。
すべての反応は、Centri−Sepスピンカラムで、製造
者の指示（Princeton Separations p/n CS−901）に従
って、スピン−カラム精製によって精製した。カラム中
のゲル物質を0.8mLの脱イオン水で少なくとも30分間室
温で水和させた。カラムが水和され、そしてゲル物質中
で泡がトラップされないことが確定した後、カラムの上
部および下部のエンドキャップを取り外し、そしてカラ
ムを重力で排水させた。次いで、カラムを、キット中に
備えられた洗浄チューブ内に挿入し、そして可変スピー
ドのマイクロ遠心分離で1300×ｇで２分間遠心分離し、
洗浄チューブから取り出し、そして試料採取チューブ内
に挿入した。反応混合物を油の下から注意深く取り出
し、そしてゲル物質上にロードした。カラムを可変スピ
ードのマイクロ遠心分離で1300×ｇで２分間遠心分離し
た。次いで溶出した試料を真空遠心分離で乾燥した。
者の指示（Princeton Separations p/n CS−901）に従
って、スピン−カラム精製によって精製した。カラム中
のゲル物質を0.8mLの脱イオン水で少なくとも30分間室
温で水和させた。カラムが水和され、そしてゲル物質中
で泡がトラップされないことが確定した後、カラムの上
部および下部のエンドキャップを取り外し、そしてカラ
ムを重力で排水させた。次いで、カラムを、キット中に
備えられた洗浄チューブ内に挿入し、そして可変スピー
ドのマイクロ遠心分離で1300×ｇで２分間遠心分離し、
洗浄チューブから取り出し、そして試料採取チューブ内
に挿入した。反応混合物を油の下から注意深く取り出
し、そしてゲル物質上にロードした。カラムを可変スピ
ードのマイクロ遠心分離で1300×ｇで２分間遠心分離し
た。次いで溶出した試料を真空遠心分離で乾燥した。
配列決定ゲル上にロードする前に、乾燥試料を25μＬ
のTemplate Suppression Reagent（PE Applied Biosyst
ems p/n 401674）中に再懸濁させ、ボルテックスをか
け、95℃で２分間加熱し、氷上で冷却し、再びボルテッ
クスをかけ、そして遠心分離した（13,000×ｇ）。10μ
Ｌの再懸濁した試料を、PE ABI PRISMTM 310 Genetic A
nalyzer（PE Applied Biosystems p/n 310−00−100/12
0）に適合した試料バイアル（PE Applied Biosystems p
/n 401957）内に小分けにした。310 Genetic Analyzer
上での電気泳動を、DNA配列決定分析に特に適合したシ
ービングポリマーおよびキャピラリーを用いて行った
（PE Applied Biosystems p/n 402837（ポリマー）およ
びp/n 402840（キャピラリー））。各場合において、シ
ービングポリマーは核酸変性剤を含んでいた。試料は、
2.5kVで30秒間かけてキャピラリー上に電気運動学的に
注入し、そして12.2kVで２時間稼働させ、キャピラリー
の外壁は50℃に維持した。
のTemplate Suppression Reagent（PE Applied Biosyst
ems p/n 401674）中に再懸濁させ、ボルテックスをか
け、95℃で２分間加熱し、氷上で冷却し、再びボルテッ
クスをかけ、そして遠心分離した（13,000×ｇ）。10μ
Ｌの再懸濁した試料を、PE ABI PRISMTM 310 Genetic A
nalyzer（PE Applied Biosystems p/n 310−00−100/12
0）に適合した試料バイアル（PE Applied Biosystems p
/n 401957）内に小分けにした。310 Genetic Analyzer
上での電気泳動を、DNA配列決定分析に特に適合したシ
ービングポリマーおよびキャピラリーを用いて行った
（PE Applied Biosystems p/n 402837（ポリマー）およ
びp/n 402840（キャピラリー））。各場合において、シ
ービングポリマーは核酸変性剤を含んでいた。試料は、
2.5kVで30秒間かけてキャピラリー上に電気運動学的に
注入し、そして12.2kVで２時間稼働させ、キャピラリー
の外壁は50℃に維持した。
dNTP混合物中でdTTPまたはdUTPを用いた色素−停止剤
プライマー延長反応を、２つの異なる色素標識ジデオキ
シＴ−停止剤:ddTTP−EO−6FAM−Ｂ−dTMR2およびddTTP
−EO−5FAM−Ｂ−dTMR2（これらの構造を図２に示す）
を用いて比較した。（２つの停止剤の違いは、用いられ
るFAM異性体（すなわち、５−FAMまたは６−FAM）のみ
であることに留意）。最初の214ヌクレオチドを各場合
において試験した。比較したパラメーターは、平均ピー
ク高さ、ピーク高さの標準偏差、ピーク高さの相対誤差
（ここで相対誤差は標準偏差を平均ピーク高さで除した
ものとして定義される）、および「ノイズ性（nois
y）」ピークの割合（ここでノイズ性ピークは、ベース
ラインノイズの３〜６倍の間の大きさのピーク高さを有
するピークとして定義される）であった。
プライマー延長反応を、２つの異なる色素標識ジデオキ
シＴ−停止剤:ddTTP−EO−6FAM−Ｂ−dTMR2およびddTTP
−EO−5FAM−Ｂ−dTMR2（これらの構造を図２に示す）
を用いて比較した。（２つの停止剤の違いは、用いられ
るFAM異性体（すなわち、５−FAMまたは６−FAM）のみ
であることに留意）。最初の214ヌクレオチドを各場合
において試験した。比較したパラメーターは、平均ピー
ク高さ、ピーク高さの標準偏差、ピーク高さの相対誤差
（ここで相対誤差は標準偏差を平均ピーク高さで除した
ものとして定義される）、および「ノイズ性（nois
y）」ピークの割合（ここでノイズ性ピークは、ベース
ラインノイズの３〜６倍の間の大きさのピーク高さを有
するピークとして定義される）であった。
ddTTP−EO−6FAM−Ｂ−dTMR2停止剤については、dTTP
の存在下で、平均ピーク高さは631、標準偏差は355、相
対誤差は0.563、およびノイズ性ピークの割合は総検出
ピークの32.7％であった。dUTPの存在下で、平均ピーク
高さは1791、標準偏差は841、相対誤差は0.47、および
ノイズ性ピークの割合は総検出ピークの21.8％であっ
た。ddTTP−EO−6FAM−Ｂ−dTMR2停止剤を用いたdTTP反
応（上）およびdUTP反応（下）の産物の電気泳動図の一
部を図３に示す。図３において、塩基109、119、および
128は、dUTPを用いた場合、隣接ピークと比較して相対
的にピーク高さの増加を示し、その結果、これらのピー
クはもはや最も高いピークの高さの３分の１を下回らな
いようになった。dTTPが存在する場合、これらのピーク
は最も高いピークの高さの25％未満であった。塩基13
7、144、146、および154もまた、dUTPの存在下ではdTTP
と比較すると相対ピーク高さの増加を示したが、その増
加は他のピークほどは大きくなかった。
の存在下で、平均ピーク高さは631、標準偏差は355、相
対誤差は0.563、およびノイズ性ピークの割合は総検出
ピークの32.7％であった。dUTPの存在下で、平均ピーク
高さは1791、標準偏差は841、相対誤差は0.47、および
ノイズ性ピークの割合は総検出ピークの21.8％であっ
た。ddTTP−EO−6FAM−Ｂ−dTMR2停止剤を用いたdTTP反
応（上）およびdUTP反応（下）の産物の電気泳動図の一
部を図３に示す。図３において、塩基109、119、および
128は、dUTPを用いた場合、隣接ピークと比較して相対
的にピーク高さの増加を示し、その結果、これらのピー
クはもはや最も高いピークの高さの３分の１を下回らな
いようになった。dTTPが存在する場合、これらのピーク
は最も高いピークの高さの25％未満であった。塩基13
7、144、146、および154もまた、dUTPの存在下ではdTTP
と比較すると相対ピーク高さの増加を示したが、その増
加は他のピークほどは大きくなかった。
ddTTP−EO−5FAM−Ｂ−dTMR2停止剤については、dTTP
の存在下で、平均ピーク高さは635、標準偏差は319、相
対誤差は0.5、およびノイズ性ピークの割合は総検出ピ
ークの17.6％であった。dUTPの存在下で、平均ピーク高
さは1694、標準偏差は662、相対誤差は0.39であり、そ
して注目すべきことにノイズ性ピークは検出されなかっ
た。ddTTP−EO−5FAM−Ｂ−dTMR2停止剤を用いたdTTP反
応（上）およびdUTP反応（下）の産物の電気泳動図を図
４に示す。図４において、塩基109および119は、dUTPを
用いた場合、隣接ピークと比較して相対的にピーク高さ
の増加を示し、その結果、これらのピークはもはや最も
高いピークの高さの３分の１を下回らないようになっ
た。dTTPが存在する場合、これらのピークは最も高いピ
ークの高さの25％未満であった。塩基128、137、144、1
46および154もまた、dUTPの存在下でピーク高さの増加
を示した。この後者のピークのグループは、dUTPを用い
たパターンにおいては明確に同定されるが、他方、dTTP
のパターンにおいては、これらのピークは４色フルカラ
ーDNA配列決定分析で検出するのは恐らく困難である。
の存在下で、平均ピーク高さは635、標準偏差は319、相
対誤差は0.5、およびノイズ性ピークの割合は総検出ピ
ークの17.6％であった。dUTPの存在下で、平均ピーク高
さは1694、標準偏差は662、相対誤差は0.39であり、そ
して注目すべきことにノイズ性ピークは検出されなかっ
た。ddTTP−EO−5FAM−Ｂ−dTMR2停止剤を用いたdTTP反
応（上）およびdUTP反応（下）の産物の電気泳動図を図
４に示す。図４において、塩基109および119は、dUTPを
用いた場合、隣接ピークと比較して相対的にピーク高さ
の増加を示し、その結果、これらのピークはもはや最も
高いピークの高さの３分の１を下回らないようになっ
た。dTTPが存在する場合、これらのピークは最も高いピ
ークの高さの25％未満であった。塩基128、137、144、1
46および154もまた、dUTPの存在下でピーク高さの増加
を示した。この後者のピークのグループは、dUTPを用い
たパターンにおいては明確に同定されるが、他方、dTTP
のパターンにおいては、これらのピークは４色フルカラ
ーDNA配列決定分析で検出するのは恐らく困難である。
上記結果を以下の表にまとめる。
上記色素標識Ｔ−停止剤のいずれかを用いた色素−停
止剤プライマー延長反応においてdTTPをdUTPで置換した
場合に得られる、より低い相対誤差およびノイズ性ピー
クの割合の減少は、ピーク高さの分布がより均一なこと
を示し、その結果、自動DNA配列決定システムにおける
ベースコーリングが改善される。
止剤プライマー延長反応においてdTTPをdUTPで置換した
場合に得られる、より低い相対誤差およびノイズ性ピー
クの割合の減少は、ピーク高さの分布がより均一なこと
を示し、その結果、自動DNA配列決定システムにおける
ベースコーリングが改善される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ローゼンブルム，バーネット ビー. アメリカ合衆国 カリフォルニア 95118，サンノゼ，エステレ アベニュ ー 1521 (56)参考文献 Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ. Ｂｉｏｌ．，３（１），30−34（1994) Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，211, 164−169（1993) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/68
Claims (7)
- 【請求項１】連鎖停止タイプ核酸配列決定方法であっ
て： 鋳型核酸を提供する工程； 該鋳型核酸の一部に対してオリゴヌクレオチドプライマ
ーをアニールし、それによりプライマー−鋳型ハイブリ
ッドを形成する工程； 該プライマーを延長し、そしてプライマー延長産物を形
成するために、該プライマー−鋳型ハイブリッドにプラ
イマー延長試薬を添加する工程であって、該プライマー
延長試薬が２′−デオキシウリジン−５′−三リン酸ヌ
クレオチドを含む、工程；および 該プライマー延長産物の特異的停止を引き起こすため
に、該プライマー−鋳型ハイブリッドに停止剤を添加す
る工程、 を包含する、方法。 - 【請求項２】前記停止剤がそれに付加した標識を有す
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】前記標識が蛍光色素である、請求項２に記
載の方法。 - 【請求項４】連鎖停止タイプ核酸配列決定方法を行うた
めのキットであって： オリゴヌクレオチドプライマー； 該プライマーを延長し、そしてプライマー延長産物を形
成するためのプライマー延長試薬であって、２′−デオ
キシウリジン−５′−三リン酸ヌクレオチドを含むプラ
イマー延長試薬；および 該プライマー延長産物の特異的停止を引き起こすための
停止剤、 を含む、キット。 - 【請求項５】前記停止剤がそれに付加した標識を有す
る、請求項６に記載のキット。 - 【請求項６】前記標識が蛍光色素である、請求項５に記
載のキット。 - 【請求項７】連鎖停止タイプ核酸配列決定方法であっ
て： プライマーを延長し、そしてプライマー延長産物を形成
するために、プライマー−鋳型ハイブリッドに対してプ
ライマー延長試薬を提供する工程であって、該プライマ
ー延長試薬が２′−デオキシウリジン−５′−三リン酸
ヌクレオチドを含む、工程；および 該プライマー延長産物の特異的停止を引き起こすため
に、該プライマー−鋳型ハイブリッドに停止剤を添加す
る工程、 を包含する、方法。
Applications Claiming Priority (7)
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|---|---|---|---|
| US32,608 | 1979-04-23 | ||
| US3260896P | 1996-12-05 | 1996-12-05 | |
| US60/032,608 | 1996-12-05 | ||
| US08/785,581 | 1997-01-21 | ||
| US08/785,581 US6017702A (en) | 1996-12-05 | 1997-01-21 | Chain-termination type nucleic acid sequencing method including 2'-deoxyuridine-5'-triphosphate |
| US785,581 | 1997-01-21 | ||
| PCT/US1997/020443 WO1998024930A1 (en) | 1996-12-05 | 1997-11-12 | Chain-termination type nucleic acid sequencing method including 2'-deoxyuridine-5'-triphosphate |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11506343A JPH11506343A (ja) | 1999-06-08 |
| JP2999267B2 true JP2999267B2 (ja) | 2000-01-17 |
Family
ID=26708657
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10522716A Expired - Lifetime JP2999267B2 (ja) | 1996-12-05 | 1997-11-12 | ２’―デオキシウリジン―５’―三リン酸を含む連鎖停止タイプ核酸配列決定方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6017702A (ja) |
| EP (1) | EP0889973B1 (ja) |
| JP (1) | JP2999267B2 (ja) |
| AT (1) | ATE199100T1 (ja) |
| AU (1) | AU706382B2 (ja) |
| CA (1) | CA2238297C (ja) |
| DE (1) | DE69704055T2 (ja) |
| WO (1) | WO1998024930A1 (ja) |
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