JP4895608B2 - 二官能性複合体の合成方法 - Google Patents
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Description
本発明は、ディスプレイ分子部(display molecule part)およびコード部(coding part)を含む二官能性複合体を得る方法に関する。本発明はまた二官能性複合体のライブラリーを生成する方法、予め選ばれた特性を有するディスプレイ分子部およびコード部を識別する方法に関する。
ポリペプチドおよび他の生化学的ポリマーを人工的にコードすることを可能にする方法が開発された。この方法の一例は米国第5723598号に開示されており、それは二官能性複合体のライブラリー生成に関係がある。二官能性複合体の一方の部位はポリペプチドであり、他方の部位はポリペプチド形成に関わるアミノ酸をコード化および識別する一連のヌクレオチドを含む識別オリゴヌクレオチドである。二官能性分子のライブラリーの生成に続いて、標的に対する親和性に関する部分を誘導し、二官能性分子の識別オリゴヌクレオチド部分をPCRによって増幅する。最終的には、PCR増幅物の配列を決定し、標的に対する親和性を有するポリペプチドの同定のために解読する。二官能性複合体のライブラリーを、一般にスプリット・アンド・ミックスとして知られる方法によって生成する。その方法は、リンカー分子を空間的に離れた分画に分配し、各分画のある末端で特定のアミノ酸前駆物質と反応させ、直交化学反応によって他の末端でこの特定のアミノ酸前駆物質をコードする核酸のタグを付加することを含む。その後、様々な分画の内容物を収集(混合)し、アミノ酸前駆物質およびヌクレオチドタグとの交互の反応の新しい周期のために、いくつかの分画に再び分割する。スプリット・アンド・ミックス法は、ポリペプチドが望ましい長さに到達するまで継続する。
鋳型を用いた先行技術の方法は、コード化がアンチコドンおよび鋳型の間の識別に依存するという欠点がある。二つのオリゴヌクレオチドの間のハイブリダイゼーションは、これらの間に十分な相補性が存在する場合に起こりえる。時折、ハイブリダイゼーションは、たとえオリゴヌクレオチド間に完全な適合がみられなくても起こりえる。その効果は、多数の転移単位が存在していて、そのとき時に鋳型のコドン配列が実際に反応する反応単位に一致していない場合である。この望ましくない効果は、多量の鋳型および合成ブロック(building block)が反応媒質において互いを識別するのを支えるので、ライブラリーの形成を行う際によりいっそう強調される。ハイブリダイゼーションの工程が完全に正確でない場合、鋳型上の不正確なコドンによってコード化される分子が生成するであろう。このことは、ライブラリー上で行われる選別工程に二つの主要な効果をもたらす。第一に、結合するリガンドをコード化するコドンの組み合わせをもつ鋳型が、選別工程において失われるであろう。第二に、そしてより重要なことかもしれないが、非結合性のリガンドをコード化する鋳型とコドンの組み合わせが豊富になるであろう。
本発明はディスプレイ分子部およびコード部を含む二官能性複合体を得る方法に関するものであり、該方法においては化学反応部位およびタグの酵素付加の促進部位を含む発生期の二官能性複合体を、一つまたはそれ以上の反応体と化学反応部位で反応させ、一つまたはそれ以上の酵素を用いて促進部位で反応体を識別する各々のタグを提供する。
酵素は一般に基質特異性であり、タグの促進部位への酵素的付加は、ディスプレイ分子が形成されることの妨げとなりにくいようである。従って、発生期のディスプレイ分子と同様にコード部位に保護基を適用することによって、この理由については回避できる。しかしながら、ディスプレイ分子の成長を保護するのは他の理由で望ましいかもしれない。酵素は、水性および有機媒質において活性を有して利用できる。しかしながら、非常に多数の酵素は、有機媒質と比べて水性媒質においてより高い活性を有する。それゆえに、タグの供給に先立ってあるいはその後に、化学反応部位における反応体の反応に適した条件を得るために、媒質を交換することが望ましいかもしれない。
大文字は反応体または化学反応部位を表す。小文字はタグを表す。
骨格「X」はタグ「x」と結合している。反応体は「X」例えば「A」と結合しており、タグも断片、例えば「a」と結合している。適当なことには、タグは独特である。
本発明は、第一の様式において、二官能性複合体に移される化学エンティティの識別性をコード化する方法であって、
a)反応基およびオリゴヌクレオチド識別領域を含む発生期の二官能性複合体を提供し、
b)ハイブリダイゼーションを可能とする識別領域に対して十分に相補的なオリゴヌクレオチド、輸送可能な機能エンティティ、および該機能エンティティを識別するアンチコドンを含む合成ブロックを提供し、
c)発生期の二官能性複合体および合成ブロックをハイブリダイゼーション条件下で混合してハイブリダイゼーション生成物を形成し、
d)合成ブロックの機能エンティティを、発生期の二官能性複合体の反応基の関わる反応を通して、発生期の二官能性複合体に移し、
e)化学エンティティを受け取った二官能性複合体に結合したコドンを得るために、オリゴヌクレオチド識別領域を酵素的に伸長する
工程を含む、方法に関する。
識別領域および相補的識別領域が互いにハイブリダイゼーションして二重らせんを形成した場合のみ、酵素は伸長を行うので、複合体がコドンで与えられる場合には、機能エンティティおよび反応基は極めて近密であることが保証される。従来示唆されてきたハイブリダイゼーション法と比較して、本発明は、非直接的反応を通して機能エンティティを与えられた複合体はコドンを与えられないであろうという利点がある。従って、偽陽性の分子は、コドンがないために容易に見抜くことができる可能性がある。
f)ハイブリダイゼーション生成物および回収複合体の構成成分を分離する
工程をさらに含む、二官能性複合体に輸送される化学エンティティの識別をコード化する方法に関する。
本発明は、単一の機能エンティティおよび対応するコドンのみを発生期の二官能性複合体に移すことによって、行うこともできる。一般に、二つまたはそれより多くの機能エンティティからなる、ディスプレイ分子を合成することが好ましい。従って、本発明の好ましい態様として、方法は、ディスプレイ分子部およびコード部からなる二官能性複合体を得るために考案され、ディスプレイ分子部は機能エンティティの反応生成物および出発複合体の反応基であり、工程c)からf)は適切に反復される。二官能性複合体の調製の最後の周期においては、二本鎖核酸は通常対応する一本鎖オリゴヌクレオチドと比較してより安定であるので、著しく二本鎖識別オリゴヌクレオチドが得られる場合には、工程f)は省略してもよい。識別オリゴヌクレオチドはまた、プライマーをオリゴヌクレオチドの3’末端にアニーリングし、適当なポリメラーゼを用いて伸長する伸長工程によって二本鎖になる可能性がある。一本鎖の核酸は、アプタマーと類似した方法で生物学的標的との相互作用をする可能性があるので、二本鎖であることはその後の選別工程の間好都合である。周期を反復する場合、前の周期において生成した二官能性複合体、すなわち機能エンティティおよびコドンを受け取った発生期の二官能性複合体は、機能エンティティ輸送およびコドン結合の次の周期で発生期の二官能性複合体として用いられる。
a)反応基およびオリゴヌクレオチド識別領域を含む、一つまたはそれ以上の異なる発生期の二官能性複合体を提供し、
b)複数の異なる合成ブロックであって、その各々にてハイブリダイゼーションを可能とする識別領域に対して十分に相補的なオリゴヌクレオチド、輸送可能な機能エンティティ、および該機能エンティティを識別するアンチコドンを含む合成ブロックを提供し、
c)発生期の二官能性複合体および複数の合成ブロックを、ハイブリダイゼーション条件下で混合して、ハイブリダイゼーション生成物を形成し、
d)合成ブロックの機能エンティティを、発生期の二官能性複合体の反応基の関わる反応を通して、発生期の二官能性複合体に輸送し、
e)化学エンティティを受け取った二官能性複合体に結合したコドンを得るために、オリゴヌクレオチド識別領域を酵素的に伸長し、
f)ハイブリダイゼーション生成物を分離し、複合体を回収し、
g)工程c)からf)を適宜一回またはそれ以上反復する
工程を含む、方法に関する。
識別部および合成ブロックの間のアニーリングは、無作為の工程であるか、または識別領域および相補的識別領域中の配列によって導かれ得る。無作為の工程は、あらゆる識別領域および相補的識別領域中の同一の配列を用いることによって、達成され得る。従って、識別部および合成ブロックの混合によって、無作為にまたは準無作為にアニーリングして、機能エンティティの独特の組み合わせを創造するだろう。あるいは、無作為または準無作為の工程は、特定の骨格または反応基の識別をコードする識別部の核酸塩基と向かい合う合成ブロックの位置にユニバーサル塩基を用いることによってなされ得る。識別オリゴヌクレオチドおよび合成ブロックのオリゴヌクレオチドの配列は最大限に利用してよく、アニーリング工程に関わるライブラリー中の配列は、合成ブロックに結合している機能エンティティに関わらず、同程度のアニーリングで集合すると確信できるものである。従って、異なるアニーリングの性質による、特定の合成ブロックを選別する手順におけるバイアスは無いかまたは小さいであろう。加えて、各アニーリング工程およびライブラリー中のハイブリダイゼーションにおけるアニーリングの手順の類似点は、機能エンティティを反応基/骨格に対して等しく与えることを確実にするということである。このことは輸送工程に最適な条件を与えるであろう。
発生期の二官能性複合体はまた成長複合体と称され、出発複合体または中間複合体を本発明の方法に従って処理すると定めている。
識別部はコドンの周りにフランキング領域を含んでいてよい。フランキング領域は、複合体の存在または不在の検出を可能にする蛍光物質または放射活性基のようなシグナル基を取り囲むことができ、またはフランキング領域は、ビオチンのような検出し得る標識を含んでいてよい。識別部がビオチンの部分を含む場合、識別部は容易に回収できる可能性がある。
フランキング領域はまた、PCRのような増幅反応のための促進部位を供給し得る。通常、二官能性複合体の形成の最後の周期には、促進部位の結合を含む。二官能性複合体の識別部位は、通常他の促進部位のために用いられ、それによって二官能性複合体のコード領域のPCR増幅が可能となる。
一般に活性化アンチコドンに先立って一つまたはそれ以上のアンチコドンを含む、相補的識別領域または合成ブロックのオリゴヌクレオチド部分の設計は、無作為または準無作為であり、識別領域についての一つまたはそれ以上の不適当な組み合わせを許容しうる。しかしながら、特にライブラリーについて熟慮した場合、一つまたはそれ以上の非特異的な塩基対をもつ核酸塩基を前述のコドンを補完する領域に含むことは好都合である。非特異的な塩基対をもつ核酸塩基は、主鎖に結合した場合天然に発生する核酸塩基(C、T、G、A、およびU)のうち少なくとも二つと対になることのできる塩基である。好ましくは、二つまたはそれより多くの天然の核酸塩基の間の塩基対および非特異的な塩基対の核酸塩基は、本質的に同じエネルギーで生じる、すなわち形成された結合は同等の力を有する。「非特異的な塩基対の核酸塩基」という用語は、当該明細書で「ユニバーサル塩基」という用語とともに互変的に用いられている。
本発明は、その第二の様式において、ディスプレイ分子部およびコード部を含む複合体を生成する方法であって、化学反応部位およびタグの酵素付加の促進部位を含む発生期の二官能性複合体が、一つまたはそれ以上の反応体とその化学反応部位で反応し、一つまたはそれ以上の酵素を用いて促進部位で一つまたはそれ以上の反応体を識別する各々のタグを提供する、方法に関する。
適切な反応体上の情報を有するオリゴヌクレオチドは、反応体を識別するヌクレオチドの組み合わせは別として、フランキング領域を含んでいてよい。フランキング領域は、発生期の二官能性複合体にハイブリダイズできる結合領域を提供する可能性がある。結合領域は、一つ以上の発生期の二官能性複合体に無差別にハイブリダイズするために、構築されてよい。あるいは、コードオリゴヌクレオチド上の結合領域は、スプリントのオリゴヌクレオチドを調節因子として用いて、発生期の二官能性複合体を結合領域にライゲートさせることができる。
全てのタグを含むコード部は、プライマーがオリゴヌクレオチドの3’末端にアニーリングし、適当なポリメラーゼを用いて伸長するところの伸長工程によって、二本鎖の形に変形し得る。二本鎖であることは、一本鎖の核酸は、アプタマーと類似した方法で生物学的標的との相互作用をする可能性があるので、その後の選別工程の間好都合である。
フランキング領域はまた、PCRのような増幅反応のための促進部位として供することもできる。通常、二官能性複合体の形成における最後の周期は促進部位の組み込みを含む。ディスプレイ分子および骨格分子をコードするコドンの間の核酸配列のような、ディスプレイ分子の近傍の二官能性複合体の領域は、通常他の促進部位のために用いられ、それによって二官能性複合体のコード領域のPCR増幅が可能となる。
本発明のある態様において、上記した様式1および様式2を組み合わせる、すなわち、異なった反応体を異なった周期にて用いる。また、様式1および様式2の範囲で、異なった合成ブロックを異なった周期に用いてよい。
ライブラリーの形成において、各々の様式1および様式2はその価値があるので、ワン−ポット法(様式1)およびスプリット・アンド・ミックス法(様式2)を組み合わせて用いることは、好都合である可能性がある。ワン−ポット法は、反応に先立って極めて近傍に反応基を有する可能性があるので、したがって高い局所濃度および単一の容器という簡便性が得られる。スプリット・アンド・ミックス法は、遊離反応体および非ハイブリダイゼーション反応条件を有する可能性があるので、多目的の反応が与えられる。様々な単一のコード化の酵素的方法を示した図15を参照することが適切である可能性がある。スプリット・アンド・ミックス合成法は、一般に反応体/機能エンティティおよびコドン/アンチコドンの間に共有結合を持たない反応体、すなわち、遊離反応体およびジッパー合成ブロックに対して用いられる。ワン−ポット法は、一般に機能エンティティおよび機能エンティティを識別するコドン/アンチコドンの間に共有結合が存在する反応体、すなわち、E2合成ブロック、環状合成ブロックおよびN合成ブロックに対して用いられる。
多重コード化は、二つまたはそれより多くのコドンが、化学反応部位および二つまたはそれより多くの反応体の間の反応に先立ってまたはその後に、識別部に提供されることを意味する。多重コード化には、様々な利点があり、最初の反応体および化学反応部位の間の中間生成物は安定でないので、三つ(またはそれ以上)の成分の反応によってのみ合成され得る多くの化合物のような、広範な反応を可能にする。他の利点は、ある具体例として、有機溶媒の利用および二つまたはそれより多くの遊離反応体が利用できるようになることに関する。
従って、本発明のある態様として、ディスプレイ分子部およびコード部を含む二官能性複合体を得る方法に関し、ディスプレイ分子は、二つまたはそれより多くの反応体および反応体を識別するタグを含むコード部との化学反応部位の反応によって得られる。
Xは骨格のような化学反応部位を意味する。
例として、XA2は、最後の状態、すなわち断片X、A、および2から完全に集められた状態におけるディスプレイ分子XA2を意味する。
a)最初のオリゴヌクレオチド末端は3’−OH基を含み、第二のオリゴヌクレオチド末端は5’−リン酸−2−イミダゾール基を含む。反応すると、ホスホジエステルヌクレオシド間結合が形成され、
b)3’末端にホスホイミダゾライド基、および5’末端にホスホイミダゾライド基を含む最初のオリゴヌクレオチド末端。ともに反応すると、ホスホジエステルヌクレオシド間結合が形成され、
c)3’チオリン酸基を含む最初のオリゴヌクレオチド末端、および5’ヨウ素を含む第二のオリゴヌクレオチド。二つの基が反応すると、3’−O−P(=O)(OH)−S−5’ヌクレオシド間結合が形成され、および
d)3’チオリン酸基を含む最初のオリゴヌクレオチド末端、および5’トシル基を含む第二のオリゴヌクレオチド。反応すると、3’−O−P(=O)(OH)−S−5’ヌクレオシド間結合が形成される
ことが挙げられる。
太い線はタグを表す。細い線はリンカーまたは結合を表す。★は促進部位を意味する。本発明のある態様として、Xは化学反応部位とみなす。
あるいは、タグは、機能エンティティの反応に先立って、結合している。その過程において、機能エンティティはタグから切断されるか、またはその後に切断される。例えば、
上のスキームの具体例は、タグがヌクレオチドである場合、化学ライゲーションまたは酵素触媒ライゲーションによってタグを組み合わせることを含む。
次の項では、二官能性複合体の反応基に機能エンティティを輸送できる、具体例としての合成ブロックの形成および利用を述べる。太い線は、オリゴヌクレオチドを意味する。
アシル化合成ブロックの形成の一般的な経路およびこれらの利用:
である。
求核基は、Zおよびカルボニル基の間の結合を切断し、それによって化学エンティティ−(C=O)−CE’を求核基に輸送することができる。
アルキル化/ビニル化合成ブロックの形成の一般的経路およびこれらの利用:
アルキル化合成ブロックは、次のような一般的構造を有する:
メチル化合成ブロック(10)と発生期の二官能性複合体を担持するアミンとの反応は、次のように行ってよい:二官能性複合体(1nmol)は、ヘペス緩衝剤(100mMのヘペス20μlおよび1Mの塩化ナトリウム溶液、pH=7.5)および水(39μl)中で、合成ブロック(10)(1nmol)と混合する。オリゴヌクレオチドを、50℃まで加熱して30℃まで冷却する(毎秒2℃)ことによって互いにアニーリングする。混合物は、その後温度を変動させて放置し(10℃一秒間、その後35℃一秒間)、メチルアミン反応生成物(11)を得る。
である。
受け取る基は、ヘテロ原子を含む基のように求核性であり、それによって化学エンティティおよびヘテロ原子の間に単結合を形成してよく、または受け取る基は、負に帯電した炭素原子であり、それによって化学エンティティおよび骨格の間にC−C結合を形成してよい。
アルキル化合成ブロックについて上記したのと同様に、ビニル化合成ブロックを調製し、使用してよい。クロロスルホン酸(上の8)をアルコールと反応させないで、中間生成物のクロロスルホン酸を単離し、フッ化物存在下でまたはその存在なしに、エノラートまたはO−トリアルキルシリルエノラートで処理する。例えば、
である。
緩衝剤50mMMOPSまたはヘペスまたはリン酸pH7.5中のオリゴヌクレオチドを担持するチオールを、DMSO/DMF濃度が5−50%、好ましくは10%であるようなDMSOまたはあるいはDMF中の、有機部分(12)の、1−100mMの、および好ましくは7.5mMの溶液で処理される。混合物は1−16時間、好ましくは2−4時間25℃で放置し、ビニル化合成ブロック(13)を得る。
である。
アミノオリゴヌクレオチド(1nmol)またはニトロオリゴヌクレオチド(1nmol)の識別部を、0.1MのTAPS、リン酸塩またはヘペス緩衝剤、および300mM塩化ナトリウム溶液、pH=7.5−8.5好ましくはpH=8.5中で、合成ブロック(1nmol)(13)と混合する。オリゴヌクレオチドは、50℃まで加熱して30℃まで冷却する(毎秒2℃)ことによって鋳型にアニーリングする。混合物は、その後温度を変動させて放置し(10℃一秒間、その後35℃一秒間)、反応生成物(14a/bまたは15a/b)を得る。上記したスルホン酸アルキルおよびスルホン酸ビニルの代わりに、例えば以下に述べる(31)のようなスルホン酸塩(しかしながらアルキルまたはビニルの代わりにR”を持つ)は、同じ程度に有効である可能性があり、(28、アルキル基によって置換されたフェニル基)および(29)から調製される可能性があり、アルキル化試薬およびビニル化試薬として用いてよい。
ヴィティヒおよびHWE合成ブロックの形成の一般的な経路およびこれらの利用:
市販で入手できる化合物(16)は、標準的な方法、すなわちDCCまたはDIC結合によって、NHSエステル(17)に変形してよい。緩衝剤50mMMOPSまたはヘペスまたはリン酸pH7.5中のオリゴヌクレオチドを担持するアミンを、DMSO/DMF濃度が5−50%、好ましくは10%であるようなDMSOまたはあるいはDMF中の、有機化合物の、1−100mMの、および好ましくは7.5mMの溶液で処理される。混合物は、1−16時間、好ましくは2−4時間25℃で放置し、ホスフィン結合前駆体の合成ブロック(18)を得る。この前駆体の合成ブロックを、適切なハロゲン化アルキル、例えばN,N−ジメチル−2−ヨードアセトアミドを、DMSO/DMF濃度が5−50%、好ましくは10%であるようなDMSOまたはDMF中の、1−100mMの、および好ましくは7.5mMの溶液として付加することによって、さらに変形される。混合物は、1−16時間、好ましくは2−4時間25℃で放置し、合成ブロック(19)を得る。これの代わりとして、有機化合物(17)は、ハロゲン化アルキルによってP−アルキル化し、その後オリゴヌクレオチドを担持するアミンとカップリングさせて(19)を得る。
アリール、ヘテロアリールまたはビニル官能基を輸送できる求電子性の合成ブロック(31)は、マレイミド誘導体をSH−運搬オリゴヌクレオチドに結合する手順を利用することによって、有機化合物(28)および(29)から調製してよい。マレイミドの代わりに、NHSエステル誘導体を、例えばカルボキシベンゼンスルホン酸誘導体から調製してよく、オリゴヌクレオチドを担持するアミンにこれらを結合することによって用いてよい。(28)および(29)のR基は、スルホン酸塩の反応性を調節するために用いて、適切な反応性をもたらす。
遷移金属が触媒する架橋結合は、次のように行ってよい:前もって水中に1.4mMのNa2PdCl4および2.8mMのP(p−SO3C6H4)3を混合して15分間放置したものを、pH=5の0.5MのNaOAc緩衝剤および75mMのNaCl(最終パラジウム濃度が0.3mM)中で、識別部(30)および合成ブロック(31)(共に1nmol)の混合物に加えた。混合物は、その後35−65℃で、好ましくは58℃で放置し、反応生成物(32)を得る。
R”=アリール、ヘテロアリールまたはビニル
これは、例えば(33)のようなジオールによって、ホウ酸をエステル化し、続いてNHSエステル誘導体に変形することによって利用できる。NHSエステル誘導体は、その後NHSエステル誘導体を上記したオリゴヌクレオチドを担持するアミンに結合させる手順を用いることによって、オリゴヌクレオチドに結合し、タイプ(37)の合成ブロックを生成する可能性がある。あるいは、マレイミド誘導体は、上記したように調製して、SH−運搬オリゴヌクレオチドに負荷してもよい。
R=アリール、ヘテロアリールまたはビニル
エナミンおよびエノールエーテルを負荷した合成ブロックは、次のように調製してよい:Z=NHR(R=H、アルキル、アリール、ヘテロアリール)については、2−メルカプトエチルアミンはジピリジル二硫化物と反応させ、活性化された二硫化物(40)を生成してよく、その後脱水条件下でケトンまたはアルデヒドに縮合させてエナミン(41)を産出してよい。Z=OHについて、2−メルカプトエタノールはジピリジル二硫化物と反応し、続いてO−トシル化(Z=OTs)する。トシラート(40)は、その後エノラートと直接反応してよく、またはフッ化物存在下でO−トリアルキルシリルエノラートと反応して、エノラート(41)を生成してよい。エナミンまたはエノラート(41)は、その後上記したようにSHを担持するオリゴヌクレオチドに結合して、合成ブロック(42)を与えてよい。
合成ブロック(13)または(48)(1nmol)は、50mMのMOPS、リン酸塩またはヘペス緩衝剤、および2.8M塩化ナトリウム溶液、pH=7.5−8.5好ましくはpH=7.5中で、識別部(49)または(50)または(51)(1nmol)と混合する。反応混合物は、35−65℃で、好ましくは58℃で一晩中放置して、あるいは温度を変動させて放置し(10℃一秒間、その後35℃一秒間)、それぞれ鋳型に結合した(52)、(53)または(54)を得る。
化学エンティティのレシピエントの反応基への輸送を、二つの別々の工程、すなわち架橋工程および切断工程に分割することは、各々の工程を最適化することができるので、遊離でありうる。これら二つの工程の方法についての適当な合成ブロックを、以下に図示する:
ZはO、S、NR4であり、
QはN、CR1であり、
Pは、原子価結合、O、S、NR4、または所望により0−3R4、0−3R5および0−3R9で置換されるC5−7アリーレン基、C1−6アルキレン、C1−6O−アルキレン、C1−6S−アルキレン、NR 1 −アルキレン、C1−6アルキレン−O、C1−6アルキレン−S、または、0−3R9で置換されるC1−C3アルキレン−NR4 2、C1−C3アルキレン−NR4C(O)R8、C1−C3アルキレン−NR4C(O)OR8、C1−C2アルキレン−O−NR4 2、C1−C2アルキレン−O−NR4C(O)R8、C1−C2アルキレン−O−NR4C(O)OR8であり、
Bは、D−E−Fを含む基であり、その中で
Dは、原子価結合、またはC1−6アルキレン、C1−6アルケニレン、C1−6アルキニレン、C5−7アリーレン、またはC5−7ヘテロアリーレンであり、それらの基は所望により1ないし4のR11基で置換されていてよく、
Eは、存在する場合は、原子価結合、O、S、NR4、またはC1−6アルキレン、C1−6アルケニレン、C1−6アルキニレン、C5−7アリーレン、またはC5−7ヘテロアリーレンであり、それらの基は所望により1ないし4のR11基で置換されていてよく、
Fは、存在する場合は、原子価結合、O、S、またはNR4であり、
Aは、化学構造を核酸であってよい相補的要素から隔てるスペース基であり、
FEPは、H、C1−C6アルキル、C2−C6アルケニル、C2−C6アルキニル、C4−C8アルカジエニル、C3−C7シクロアルキル、C3−C7シクロヘテロアルキル、アリール、およびヘテロアリール、0−3R4、0−3R5、および0−3R9で置換されたそれらの基、または0−3のR9で置換されたC1−C3アルキレン−NR4 2、C1−C3アルキレン−NR4C(O)R8、C1−C3アルキレン−NR4C(O)OR8、C1−C2アルキレン−O−NR4 2、C1−C2アルキレン−O−NR4C(O)R8、C1−C2アルキレン−O−NR4C(O)OR8からなる群から選ばれ、
そのR4は、Hであるか、またはC1−C6アルキル、C2−C6アルケニル、C2−C6アルキニル、C 3−C7シクロアルキル、C3−C7シクロヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリール、0−3R9で置換されたそれらの基からなる群から独立して選ばれ、
そのR6は、H、C1−C6アルキル、C3−C7シクロアルキル、アリール、または−F、−Cl、−Br、および−Iから選ばれる0−5のハロゲン原子で置換されたC1−C6アルキレン−アリールから独立に選ばれ;およびR7は、−NO 2 、−COOR6、−COR6、−CN、−OSiR6 3、−OR6、および−NR6 2から独立に選ばれ、
R8は、H、C1−C6アルキル、C2−C6アルケニル、C2−C6アルキニル、C3−C7シクロアルキル、アリール、または−F、−Cl、−NO 2 、−R3、−OR3、−OSiR3 3から独立に選ばれる0−3の置換基によって置換されるC1−C6アルキレン−アリールであり、
R9は、=O、−F、−Cl、−Br、−I、−CN、−NO2、−OR6、−NR6 2、−NR6−C(O)R8、−NR6−C(O)OR8、−SR6、−SOR6、−S(O)2R6、−COOR6、−C(O)NR6 2および−S(O)2NR6 2である。
好ましい具体例として、ZはOまたはSであり、Pは原子価結合であり、QはCHであり、BはCH2であり、R1、R2およびR3はHである。カルボニル基およびZの間の結合は、水性のI2によって切断できる。
切断可能なリンカーは、標的および固体支持体の間に、または潜在的な薬物候補および識別領域に、または結合に成功した複合体由来のコドンを含む核酸配列の、非特異的に結合した複合体から分離を確実にする他のあらゆる位置に、位置付けることができる。切断可能なリンカーは、選択的に切断可能であってよい、すなわち特定のリンカーのみを切断する条件が選択される。
切断可能なリンカーは、非常に多くの化学構造から選択してよい。リンカーの例としては、酵素的に切断可能な部位を有するリンカー、化学分解成分を含むリンカー、電磁放射によって切断可能なリンカーを含むが、それだけに限定されない。
エキソ位でのo−ニトロベンジル
より詳細については、Holmes CP.J.Org.Chem.1997,62,2370−2380を参照
より詳細については、Rajasekharan Pillai,V.N.Synthesis.1980,1−26を参照
ダンシル誘導体
より詳細については、Rajasekharan Pillai,V.N.Synthesis.1980,1−26を参照
より詳細については、R.O.Schoenleber,B.Giese.Synlett 2003,501−504を参照
R3=HまたはOCH3
XがOならば、生成物はカルボン酸であるであろう。
XがNHならば、生成物はカルボキシアミドであるであろう。
DMT=4,4’−ジメトキシトリチル
iPr=イソプロピル
CNEt=シアノエチル
エステルリンカーは、例えば水酸化物イオンを用いた求核性の作用によって切断できる。実際に、これは標的リガンド複合体を短期間塩基に付すことによって達成し得る。
R1およびR2は、それぞれ、潜在的な薬物候補または識別領域のいずれかであってよい。R4−6は、次のいずれでもよい:H、CN、F、NO2、SO 2NR2。
潜在的な薬物候補を識別部と、または固体支持体および標的を結合しているリンカーは、プロテアーゼを用いた特異的切断を可能にするペプチド領域を含み得る。このことは、分子生物学においてよく知られた方法である。部位特異的プロテアーゼおよび同系統の標的アミノ酸配列は、融合タンパクの発現、溶解度、分泌、または精製の向上を容易にする融合タンパク質タグを除去するのにしばしば用いられる。
様々なプロテアーゼが、特異的切断を達成するために用いられ得る。特異性は、切断部位が例えば融合タンパクのような他の配列と共に呈示される場合に、特に重要である。切断効率を高め、特異性を制御するために、様々な条件が最大限に利用されてきた。これらの条件は、当該分野において利用され、知られている。
エンテロキナーゼは、特異的アミノ酸配列を切断する酵素セリンプロテアーゼの一例である。エンテロキナーゼ識別部位は、Asp−Asp−Asp−Asp−Lys(DDDDK)であり、C末端のリシンを切断する。精製した組み換えエンテロキナーゼは、市販で入手でき、広い範囲のpH(pH4.5−9.5)および温度(4−45℃)において高い活性を持つ。
他のよく知られたプロテアーゼは、Leu−Val−Pro−Arg−Gly−Ser(LVPAGS)配列をArg−Glyの間で特異的に切断するトロンビンである。トロンビンはまた、組み換え融合タンパク質の切断に用いられてきた。他の配列はまた、トロンビンの切断に用いられ可能性があり、これらの配列は、トロンビンによる切断よりもより特異的であるかまたは特異的でなく、より効率的であるかまたは効率的でない。トロンビンは、高い活性のプロテアーゼであり、様々な反応条件が業界では知られている。
他のタイプの特異的アミノ酸配列を識別するタンパク質酵素もまた、用いられ得る。加えて、非特異的方法でアミノ酸配列を切断するタンパク質分解酵素はまた、リンカーが複合体分子中でアミノ酸配列を含みさえすれば用いられ得る。
ヌクレオチドの特異的な配列を有する二本鎖の核酸を識別して切断する、様々なエンドヌクレアーゼが利用できる。エンドヌクレアーゼEcoRIは、配列がヌクレオチド配列の長さに近い場合、GAATTC配列を含むヌクレオチド配列リンカーを効果的に切断するヌクレアーゼの一例である。精製した組み換えEcoRIは、市販で入手でき、ある範囲の緩衝剤条件において高い活性をもつ。例として、EcoRIは、以下に示す様々なプロトコール(NE緩衝剤はNew England Biolabsで入手できる)で作用する:
NE緩衝剤1:10mMビストリスプロパン−HCl、10mM塩化マグネシウム、1mMジチオトレイトール(pH7.0、25℃)
NE緩衝剤2:50mM塩化ナトリウム、10mMトリス−HCl、10mM塩化マグネシウム、1mMジチオトレイトール(pH7.9、25℃)
NE緩衝剤3:100mM塩化ナトリウム、50mMトリス−HCl、10mM塩化マグネシウム、1mMジチオトレイトール(pH7.9、25℃)
NE緩衝剤4:50mM酢酸カリウム、20mMトリス酢酸塩、10mM酢酸マグネシウム、1mMジチオトレイトール(pH7.9、25℃)
展開緩衝剤:mM塩化カリウム、20mMトリス−HCl(pH8.8、25℃)、10mM硫酸アンモニウム、2mM硫酸マグネシウム、および0.1%トライトンX−100、および200μMdNTP
本発明で用いられるヌクレオチドは、ヌクレオチド、すなわちオリゴヌクレオチドの配列に結合してよい。各々のヌクレオチド単量体は、通常二つの部分、すなわち核酸塩基部分および主鎖からなる。主鎖は、ある場合においては、糖の部分およびヌクレオシド間のリンカーに再分してよい。
核酸塩基部分は、自然には生じない核酸塩基と同様に自然に生じる核酸塩基から選んでよい。従って、「核酸塩基」は既知のプリンおよびピリミジンヘテロ環だけでなく、ヘテロ環類似物およびそれらの互変異性体も含む。核酸塩基の実例は、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシル、プリン、キサンチン、ジアミノプリン、8−オキソ−N6−メチルアデニン、7−デアザキサンチン、7−デアザグアニン、N4,N4−エタノシトシン、N6,N6−エタノ−2,6−ジアミノプリン、5−メチルシトシン、5−(C3−C6)−アルキニルシトシン、5−フルオロウラシル、5−ブロモウラシル、シュードイソシトシン、2−ヒドロキシ−5−メチル−4−トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシンおよびBennerら、米国特許第5432272号に記述されている「自然には生じない核酸塩基」である。「核酸塩基」という用語は、これらの例に加えて類似物およびそれらの互変異性体も包含することを意図している。特に興味深い核酸塩基は、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、5−メチルシトシン、およびウラシルであり、自然に生じる核酸塩基と考えられている。
好ましい核酸の単量体には、ホスホジエステル結合を介して結合する、RNAファミリーと同様にDNAの一部を形成する自然に生じるヌクレオシドを含む。DNAファミリーを構成するものには、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンおよびデオキシシチジンを含む。RNAファミリーを構成するものには、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジンおよびイノシンを含む。
ライブラリーが当該明細書で開示された方法に従って形成されるとすぐに、前もって決定された望ましい特性を有する化学的化合物についてのライブラリーを選別しなければならない。前もって決定された望ましい特性には、標的への結合、標的の触媒的変化、標的または標的の機能的活性を変化/修飾する方法での標的との化学反応、自殺阻害剤中のような標的に対する共有結合を含め得る。当該明細書の上で開示したように生成したライブラリーに加えて、以下の方法AおよびBに従って調製したライブラリーは、本発明に従って選別してよい。
B.ディスプレイ分子は、化合物の混合物であってよく、最終的な「状態」であるとみなしてよい。これらのディスプレイ分子は、通常個別に別々にタグを付けられる、すなわち化合物の混合物中の各々の単一の化合物は同一のタグを結合してよい。他のタグは、他の化合物の混合物に対して用いてよい。各々の独特のタグは、例えば鋳型上の空間の位置のように、特定の混合物上で情報を保持する。
所定の望ましい特性を有する複合体は、当業者によく知られている様々な方法によって、核酸識別タグに依然として結合している間、ライブラリーの残りから分離し得る。本発明のある具体例として、識別核酸が増幅可能であるような結合した核酸の化学的分解をせずに、望ましい生成物を全ライブラリーから分離する。コドンを含む識別部の部分を増幅し、望ましい化学的化合物に依然として結合しているか、またはその後望ましい化学的化合物から分離してよい。
加えて、標的と反応する化合物は、標的と反応しない生成物と分離し得る。一例として、自殺阻害剤のような標的に共有結合する化合物は、非常にストリンジェントな条件下で洗浄し得る。生じた複合体を、プロテアーゼ、DNAアーゼまたは他の適当な試薬で処理され、リンカーを切断して望ましい化合物と結合している核酸を遊離し得る。
本発明に固有のことは、望ましい機能を基本とした化学エンティティの選別であり、これは望ましい機能および特異性をもつ小さな分子の選別に拡張し得る。特異性は、望ましくない「標的」と相互作用し得る化合物の識別部配列を最初に抽出し(ネガティブセレクション、またはカウンターセレクション)、続いてポジティブセレクションによって望ましい標的を抽出することによる、選別工程の間に必要となり得る。例として、菌類のシトクロムP450の阻害剤が、ある程度哺乳類のシトクロムP450と交差反応する(重大な副作用を引き起こす)ということが知られている。菌類のシトクロムの高い特異性をもつ阻害剤は、哺乳類のシトクロムと相互作用し得る生成物を除去し、続いて菌類のシトクロムと相互作用し得る生成物を保持することによって、ライブラリーから選択し得る。
本発明はまた、各工程:
i)独特の識別タグを化学エンティティに付加することによって、タグを付加した化学エンティティのライブラリーを生成し、
ii)予め選択された特性を持つ化学エンティティまたは化学エンティティの部分集合がライブラリーの残りから分離するところの、条件にライブラリーを付し、
iii)分離したライブラリーからアンチタグを回収し、そのアンチタグが特異的に独特の識別タグと相互作用でき、
iv)アンチタグを解読することによって、予め選択された機能を有する化学エンティティを識別する
ことを含む、予め選択された特性を有する化学エンティティの識別部を決定する方法に関する。
当該方法は、ある具体例として、増幅なしに行ってよい。しかしながら、より大きなライブラリーを目的とした場合、一般に増幅可能なアンチタグを用いることが好ましい。ヌクレオチドの配列を含むアンチタグは、PCRのような標準的技術を用いて増幅してよい。アンチタグがタンパク質の場合、タンパク質は、その合成をコード化したmRNAを結合し、mRNAからcDNAを生成し、mRNAを翻訳系に付すことによって増幅してよい。そのような系は、出典明示によりその内容を当該明細書の一部とするところのWO98/31700に記述されている。タンパク質のタグを増幅する代わりの方法は、ファージの発現するタンパク質を用いることである。
オリゴヌクレオチドのアンチタグは、様々な方法で形成してよい。本発明のある具体例として、アンチタグは酵素的伸長反応のときに形成する。伸長は、最初にプライマーを独特の識別タグにアニーリングし、その後プライマーをポリメラーゼおよびdNTPを用いて伸長することを含む。他のタイプの伸長反応もまた考えられている。例として、リガーゼはジまたはトリヌクレオチド基質から出発してプライマーを作るために用いてよく、伸長は適当なポリメラーゼを用いて行ってよい。
上記したように、アンチタグオリゴヌクレオチドに、ストレプトアビジンまたはアビジンのようなアフィニティーパートナーと結合できる、ビオチンのようなハンドルを提供してもよい。
ハンドルは、分離工程に先立ってまたはその後に、ライブラリーを精製するために利用し得る。本発明のある具体例として、系の乱れを減少させるために、分離工程に先立って精製工程が行われる。他の態様として、ハンドルは、増幅してよい二本鎖の生成物を回収するために、工程ii)の後に分離したライブラリーを精製するために用いられる。
ライブラリーを、条件に敏感な特性を有する化学エンティティを選別するために、ある条件に付す。その条件は、標的に対するライブラリーの曝露、および標的に対する親和性を有する化学エンティティの分離を伴ってよい。他の条件は、ライブラリーを基質に付し、この基質に関する触媒活性を有する化学エンティティを分離することであってよい。
アンチタグがハンドルを含む場合は、ハンドルは分離したライブラリーを精製するために用いられ得る。アンチタグの回収は、その後、分離した二本鎖のライブラリーからアンチタグを溶出することによって行われる。所望により、アンチタグの量を、PCRのような従来の増幅技術によって増幅してよい。
本発明の一つの具体例として、分離したライブラリーを、反復する接触工程に先立った中間過程の工程に付さない。特に、分離したライブラリーを、アンチタグの中間の増幅には付さない。この具体例は、比較的小さなライブラリーを用いる場合に好都合でありうる。
本発明の他の態様として、エンティティは大きな非多重合体分子(分子量が1000Daより大きい)からなる。さらに他の具体例として、エンティティは多重合体分子からなる。
DNAまたはRNAに結合しているアンチタグはまた、それらに結合しているDNA/RNA、例えばファージが提示したまたはポリソームが提示した抗体、ペプチドまたはタンパク質によって、および合成の間DNAに結合している、アンチタグ合成をDNAがコード化するところの、DNAを鋳型としたアンチタグの合成を介してコード化されている。
増幅は、PCRまたはRTPCR技術を用いてよい。アンチタグは、本発明のある態様として、増幅可能である。アンチタグは、例えば、紫外線照射、熱、pH調整剤、特に塩溶液の利用のような、物理的または化学的方法を用いることによって、タグから分離してよい。
単離したタグ付加したエンティティは、そのタグまたはアンチタグのいずれかを介して、識別されてよい。識別は、アンチタグのクローニングおよびそのDNA/RNAの配列決定によって、またはタグ付加したエンティティまたはアンチタグまたはアンチタグ/タグ付加したエンティティの複合体を介して、達成してよい。
タグ付加したエンティティのライブラリーは、10−1020または10−1014または10−102または10−103または102−103または102−104または103−106または103−108または103−1010または103−1014または105−106または105−108または105−1010または105−1014または108−1014または1014−1020のエンティティを含んでいてよい。
ヌクレオチド配列と共に用いられた場合、独特という用語は、少なくとも核酸塩基および/または配列の主鎖エンティティの一つが、異なる化学エンティティと共にはみられないことを意味する。好ましくは、特定の配列は、他の化学エンティティが核酸塩基の同じ配列と結合していないという事実によって、独特である。
一度ライブラリーが形成されると、前もって決定された望ましい特性を有する化合物についてのライブラリーを選別しなければならない。前もって決定された望ましい特性には、標的に対する結合、標的の触媒的変化、標的または標的の機能的活性を変化/修飾する方法での標的との化学反応、または自殺阻害剤中のような標的に対する共有結合を含め得る。
前もって決定された望ましい特性を有する化合物は、当業者に知られた様々な方法によってライブラリーの残りから分離し、一方核酸識別タグには依然として結合したままにできる。本発明のある具体例として、望ましい生成物を、識別部の核酸が増幅可能であるような結合した核酸の化学分解をせずに、全体のライブラリーから分離される。識別タグはその後、望ましい化合物に依然として結合しているか、または望ましい化合物から分離した後、増幅してよい。
本発明に固有のことは、望ましい機能を基本とした化学エンティティの選別であり、これは望ましい機能および特異性をもつ小さな分子の選別に拡張し得る。特異性は、望ましくない「標的」と相互作用し得る化合物の識別部配列を最初に抽出し(ネガティブセレクション、またはカウンターセレクション)、続いてポジティブセレクションによって望ましい標的を抽出することによる、選別工程の間に必要となり得る。例として、菌類のシトクロムP450の阻害剤が、ある程度哺乳類のシトクロムP450と交差反応する(重大な副作用を引き起こす)ということが知られている。菌類のシトクロムの高い特異性をもつ阻害剤は、哺乳類のシトクロムと相互作用し得る生成物を除去し、続いて菌類のシトクロムと相互作用し得る生成物を保持することによって、ライブラリーから選択し得る。
アンチタグ配列の回収後、これらは最初のライブラリーまたはその画分と接触し、濃縮したライブラリーは、アンチタグ配列を同系統の独特の識別タグの配列にハイブリダイゼーションさせることによって、形成することが可能になる。
上記したように、二回目またはさらなる選別工程を実行するための条件は、一般に、最初のまたは先行する工程よりも厳密である。連続した選別周期における条件の厳密さの向上によって、数量に関しては制限されるが望ましい特性に関しては濃縮されるところの化合物の副集団が形成される。
単離した二官能性分子または分離した識別オリゴヌクレオチドに存在する識別配列のコード部は、ディスプレイ分子の形成に与った化学エンティティを識別するために決定される。ディスプレイ分子の合成方法は、機能エンティティ上の情報と共にそれらがディスプレイ分子中に組み込まれる時点が、識別オリゴヌクレオチドから推論される場合、確立してよい。形成の間の構造的制約によって全分子を推論することは、ディスプレイ分子に関係する様々な化学エンティティの化学構造上の情報を得るのには十分である。例として、結合性の異なる種類を用いることは、合成ブロック上の化学エンティティが、骨格上の単一の位置のみに輸送され得ることを保証する可能性がある。他の種類の化学的制限は、骨格分子または輸送される機能エンティティ上の立体障害のために、存在している可能性がある。しかしながら、一般に、情報は、化学エンティティが(発生期の)ディスプレイ分子中に組み込まれていた合成歴における時点と共に、コード化分子の形成に与った各々の化学エンティティの識別を可能にする識別配列から推論し得ることが好ましい。
量が少ない場合には、識別配列に存在するプライマー結合部位に対するPCRプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって、識別配列の量を増加させることは好ましい。
それに加えて、単離した二官能性分子の質は、多様な種類の二官能性分子が、二官能性分子標的に対する結合について類似した能力を持つ長所によって共に単離されるようなものであってよい。一つ以上の種類の二官能性分子が単離される場合は、異なる単離された種類は、識別オリゴヌクレオチドの配列決定に先立って分離しなければならない。
あるいは、二官能性複合体またはPCRで増幅した識別配列は、マイクロアレーにおいて分析し得る、アレーは、識別配列中の単一のコドンまたは複数のコドンの存在を分析するために、設計してよい。
オリゴヌクレオチドは、よく知られている様々な性質によって、合成し得る。3’から5’の方向で基質上にてオリゴヌクレオチドを合成する場合、遊離ヒドロキシ末端は必要に応じて都合よくは遮断したり脱遮断したりされ得ることが必要となる。好ましいヒドロキシ末端遮断基は、ジメキソチルトリチルエーテル(DMT)である。DMTで遮断された末端は、オリゴヌクレオチド合成として知られているジクロロメタン(DCM)中の3%ジクロロ酢酸処理によって最初に脱遮断され、遊離ヒドロキシ末端を形成する。
図1は、識別部および合成ブロックの成分を示す。
図2は、伸長によるコード化の原理を示す。
図3は、合成ブロックの伸長領域を示す。
図4は、識別部および合成ブロックの成分を、内部のコドンと共に示す。
図5は、特異的アニーリングを用いた伸長によるコード化の原理を示す。
図6は、骨格およびポリマー分子のコード化を示す。
図7は、三本鎖集合の原理を用いた伸長によるコード化を示す。
図8は、特異的アニーリングによる三本鎖集合の原理を用いた伸長によるコード化を示す。
図9は、固体相の方法を用いた三本鎖識別部−ディスプレイした分子の合成を示す。
図10は、プラットホーム集合を用いた連続した反応/伸長を示す。
図12は、ライゲーションコード化および遊離反応体を用いたコード化法を開示する。
図13は、続く反応がコード化工程であるところの、ライブラリー生成法を開示する。
図14は、ポリメラーゼコード化を用いたライブラリー生成法を開示する。
図15は、単一のコード化法についての様々な具体例を開示する。
図16は、二重のコード化法を開示する。
図17は、様々な二重のコード化法を開示する。
図18は、環状の合成ブロックを用いたコード化を開示する。
図19は、可変性リンカーが合成ブロック中で用いられる方法を開示する。
図20は、実施例6に従ったゲル表示の実験結果を開示する。
図22は、実施例9に用いられる計画を示す。
図23は、実施例9に用いられるスプリット・アンド・ミックスの構造を示す。
図24は、ライブラリー濃縮、増幅および識別の具体例を開示する。
図25は、識別配列にハイブリダイゼーションしていないアンチタグ配列が二本鎖をなし、それによって不活化する具体例を示す。
図26は、濃縮工程が精製工程の前であるところの、具体例を示す。
図27は、ライブラリー濃縮、増幅および識別の一般的原理を示す。
図28は、連続する濃縮手順の間の中間の増幅工程を省略した、ライブラリー濃縮、増幅および識別の一般的原理を示す。
図29は、最初の一本鎖ライブラリーを、濃縮に先立って二本鎖にするところの、ライブラリー濃縮、増幅および識別の一般的原理を示す。
図30は、アンチタグが一回またはそれより多くの濃縮過程の後まで形成されないところの、ライブラリー濃縮の一般的原理を示す。
図31は、実施例13において報告している二つのゲルを示す。
図32は、実施例14において報告している実験結果を示す。
図33は、実施例14において報告している実験結果を示す。
図1は、パネルAにおいて、発生期の二官能性複合体および合成ブロックの間のハイブリダイゼーション生成物を開示する。発生期の二官能性複合体は、短い識別部について、結合部分によってオリゴヌクレオチド識別領域に結合した結合エンティティを含む。結合エンティティは、機能エンティティを受け取るように適応させた単一のレシピエント反応基であってよく、または一つまたはそれ以上のレシピエント反応基を含む骨格構造であってよい。パネルAにおいて、結合エンティティは、機能エンティティを受け取ることのできる四つの反応基を有する骨格を示している。
合成ブロックは、ハイブリダイゼーション生成物の形成を可能にする識別領域に十分相補的であるところの、オリゴヌクレオチドに結合した機能エンティティを含む。機能エンティティは、化学反応によって、結合エンティティに輸送され得る。相補的識別領域は、さらにその3’または5’末端に独特のコドンを含む。独特のコドンは、明確に機能エンティティを識別する。
図3において、最初の周期において組み込まれるパネルBの独特のコドンは、相補的結合領域中に中性の結合領域を組み込まれた二番目の合成ブロックの近くに向かい合っている。中性の結合領域は、様々な独特のコドンの間の同定ができないが、各々のコドンに対するある種の親和性を示すことができる。通常、中性の結合領域は、一つまたはそれ以上のユニバーサル塩基を含み、より好ましい中性の結合領域は、識別部上のコドン領域の少なくとも一部に向かい合っているユニバーサル塩基の配列を含む。
数回の選別周期が予期される場合、特にコード化分子が先行する周期のPCR生成物から形成する場合、内部のコドンの利用は、特に重要である。合成ブロック中の内部のアンチコドンは、完全にまたは一部識別配列に適合する可能性があり、または親和性を与えるが特異性は与えない、一つまたはそれ以上のユニバーサル塩基を含んでよい。内部の独特のコドンの役割は、識別分子および合成ブロックの分子の間でのアニーリングを導くことのみである。正確なコード化は、伸長過程中で作られる独特のコドンによって導かれる。これらの独特のコドンは、次の分子の生成にまわされ、ディスプレイした分子の合成歴を解読するために用いられる。この系は、正確な遺伝子型を識別分子の次の生成に伝えるために、内部の独特のコドンによる正確なコード化機能に完全には依存していないであろう。
図6に示すコード化法は、モノマーおよびポリマーコード化分子の両方を作ることができる。パネルA:複合体反応生成物は、多数の機能エンティティと反応した結合エンティティを用いて作ることができる。パネルB:ポリマーは、一つの結合エンティティを一つの反応基と共に用いて作ることができ、少なくとも二つの反応基を有する機能エンティティとの結合を可能にする。
上で、スプリット・アンド・ミックスについての一般的原理は開示しており、その中で小さな分子の断片および化学反応部位の反応がコード化工程に先立って起こる。明らかに、反応は逆の順序でまたは同時に起こり得る。
その後、各々のウェルの内容物を結合し、所望により、反応およびコード化の二番目の周期のために再びある範囲のウェルに分割する。最終工程において、結合したウェルの内容物は、当該明細書において開示されているように、選別または分離工程において用いられる。
遊離反応体/ポリメラーゼコード化:発生期の二官能性複合体は、反応基を含む骨格(=化学反応部位)、および骨格を識別するコドンを含むオリゴヌクレオチド部分を含む。コドンは、アンチコドンオリゴヌクレオチドの相補的結合領域とハイブリダイゼーションを形成できるオリゴヌクレオチド結合領域と結合している。ハイブリダイゼーション生成物を伸長反応に付し、その反応で骨格のオリゴヌクレオチドはアンチコドンに及び、それによってコドンを有する骨格のオリゴヌクレオチドが得られる。伸長反応の後に、それと同時にまたはそれに先だって、アンチコドンによってコードされた遊離反応体は、骨格と反応する。
工程6において、工程1において生成したタグ付加した最初のライブラリーは、複合体化および選別のさらなる周期に付してよい、すなわち工程5由来のアンチタグを、工程1のタグ付加したエンティティのライブラリーに加え、その後工程3、工程4および工程5に付してよい。工程6は反復してよい。
工程7において、工程5の単離したアンチタグをクローニングし、その識別部を露出してよい。例えば、DNAの場合は、配列決定を適用してよく、それによってタグ付加したエンティティのライブラリー中で選別した特性を有する特定のエンティティの識別部が露呈されるであろう。
工程2において、タグ付加したエンティティの全てのタグは、(所望により、例えばビオチンのような@−ハンドルを担持する)プライマー、ヌクレオチド三リン酸塩およびポリメラーゼまたは転写酵素を用いることによって二本鎖にされる。残存している一本鎖のDNAまたはRNAは、所望により、ヌクレアーゼを用いることによって消化してよい。
単離したアンチタグは、所望により、PCRまたはRTPCRの利用を介して、工程4において増幅してよい。
工程5において、工程1のタグ付加したライブラリーは、単離した、および所望により増幅した工程3および4のアンチタグと複合体を形成してよい。
工程7において、工程4の単離したアンチタグはクローニングすることができ、その識別部を露出してよく、例えば、DNAの場合は、配列決定を適用してよく、それによってタグ付加したエンティティのライブラリー中で特定のエンティティの識別部が露呈される。
工程2において、タグ付加したエンティティの混合物は、一組の相補的なアンチタグと結合している。アンチタグは、ヌクレオチドの誘導体であってよいが、それだけに限定されない。アンチタグは、所望により、@−ハンドルを担持してもよい。タグおよびアンチタグは、複合体の形成が可能である。複合体形成は、ハイブリダイゼーションであってよいが、それだけに限定されない。いくつかのアンチタグは、タグ付加したエンティティと複合体を形成しないであろうし、いくつかのタグ付加したエンティティは、アンチタグと複合体を形成しないであろう。
工程3の混合物は、例えば特定のタンパク質に対する親和性であるが、それだけに限定しない、工程4の一組の特性についてプロービングされる。そのような場合、特定のタンパク質に結合しないエンティティは除去されるであろう。特定のタンパク質に結合するエンティティと複合体を作るアンチタグは、例えば@−ハンドルの利用を介して、回収/単離してよい。工程4は一回またはそれ以上反復してよい。
単離したアンチタグはクローニングし、その識別部を工程6において露呈してよく、例えば、DNAの場合は、配列決定を適用してよく、それによってタグ付加したエンティティのライブラリー中で特定のエンティティの識別部を露呈するであろう。
工程2において、タグ付加したエンティティの全てのタグは、(所望により、例えばビオチンのような@−ハンドルを担持する)プライマー、ヌクレオチド三リン酸塩およびポリメラーゼまたは転写酵素を用いることによって二本鎖にされる。残存している一本鎖のDNAまたはRNAは、所望により、例えばヌクレアーゼを用いることによって消化してよい。
単離したアンチタグは、工程5においてクローニングしてよく、その識別部を露呈してよく、例えば、DNAの場合は、配列決定を適用してよい。それによってタグ付加したエンティティのライブラリー中で特定のエンティティの識別部を露呈するであろう。
工程2において、混合物は、例えば特定のタンパク質に対する親和性であるが、それだけに限定しない、一組の特性についてプロービングされる。そのような場合、特定のタンパク質に結合しないエンティティは除去されるであろう。工程2は反復してよい。
特定のタンパク質に結合するエンティティのタグと複合体を作るアンチタグは、例えば@−ハンドルの利用を介して、工程4において回収/単離してよい。アンチタグは、所望により、PCRまたはRTPCRの利用を介して増幅してよい。アンチタグはまた、その後図24ないし27に示されるように用いてよい。
単離したアンチタグは、工程5においてクローニングしてよく、その識別部を露呈してよく、例えば、DNAの場合は、配列決定を適用してよく、それによってタグ付加したエンティティのライブラリー中で特定のエンティティの識別部を露呈する。
実施例1:骨格の識別分子上への負荷
アミノ修飾因子C65’−で標的した識別オリゴ(5’−X−TCGTAACGACTGAATGACGT−3’式中Xはグレンリサーチ、カタログ10−1039−90号から得てよい)に、ペプチド骨格(Cys−Phe−Phe−Lys−Lys−Lys,CFFKKK)をSPDP活性化(以下参照)を用いて負荷した。アミノオリゴのSPDP活性化は、100mMヘペス−水酸化カリウム、pH=7.5中の10ナノモルのオリゴ160μl、および40μlの20mMSPDPを用いて行い、30℃で2時間インキュベートした。活性化したアミノオリゴを、500μlの酢酸エチルで三回抽出し、スピードバック(speed-vac)中で10分間乾燥し、100mMのヘペス−水酸化カリウムと平衡にしたマイクロバイオスピンカラムを用いて精製した。骨格の負荷は、その後、100mMの結合エンティティを10μl付加し、30℃で一晩中インキュベートすることによって行った。
合成ブロック上への機能エンティティの負荷は、チオールオリゴ(以下参照)を用いて行い得る。ビオチンで5’標識し、チオ修飾因子C6S−S(グレンリサーチ、カタログ,10−1936−90から得られる)で3’標識した合成ブロックオリゴ(5’−BTGCAGACGTCATTCAGTCGTTACGA−3’)を、NHMを用いてNHSオリゴに変換した。
10nmolのオリゴをスピードバック中で乾燥し、50μlの100mMDTT、100mMのリン酸ナトリウムpH8.0中に再び溶解し、37℃で1時間インキュベートした。チオオリゴは、その後100mMのヘペス−水酸化カリウムpH7.5によって平衡に達したマイクロバイオスピンカラムを用いて精製した。チオオリゴを、100mMのヘペス−水酸化カリウムpH7.5中の100mMNHMを加えることによって、NHSオリゴに変換した。試料を25℃で一晩中インキュベートした。NHSオリゴを、その後にMS等級の水によって平衡に達したマイクロバイオスピンカラムを用いて精製した。
MS分析を、10μlの水中100ピコモルのオリゴが10μlのイオン交換樹脂で処理し、振盪器上で25℃で最低2時間インキュベートした。インキュベーションの後、樹脂を遠心分離によって除去し、15μlの上澄みを7μlの水、2μlのピペリジンおよびイミダゾール(それぞれ625mM)および24μlのアセトニトリルと混合した。試料を、質量分光器(Bluker Daltonics Esquire 3000plus)を用いて分析した。観察された質量は、以下にみられるように、8369.32であり、これは算出された質量の8372.1と一致していた、この実験データは、合成ブロックのオリゴヌクレオチド上への結合エンティティの可能性を例示している。この生成物は、その後、輸送可能な機能エンティティを結合するために用いられ得る。
上記したように合成ブロック分子上へ負荷し得る機能エンティティの他の例は、以下に示す5−ヘキシン酸である。さらに、MS測定に用いる条件において、機能エンティティが不適当な構造であるため、MS分析をこの化合物上で行わない。
次の実験における結合エンティティ(AE)は、例えばペプチドCFFKKKのような、実施例1において調製した識別部上に負荷した骨格、または実施例1において出発物質として用いられるアミノ修飾オリゴヌクレオチドによって例示されるレシピエントの反応基のいずれかである。これらの結合エンティティは、それぞれ三つまたは一つの機能エンティティの輸送を可能にする。
この実験において用いられる識別部は、実施例1において述べたCFFKKKを負荷した識別オリゴヌクレオチドである。この実験における機能エンティティ(FE)は、4−ペンチン酸であり、その負荷は実施例2において述べた。骨格を負荷した識別分子を、結合エンティティおよび機能エンティティを近接にするために、負荷した合成ブロック分子にアニーリングされる。アニーリングは、識別分子中の識別領域および合成ブロック分子中の相補的配列に対するものである。
アニーリングは、0.1MのMES緩衝剤中で25℃で振盪器中で2時間、合成ブロック600ピコモルおよび識別分子400ピコモルを用いて行われた。合成ブロックの反応部(機能エンティティ)を、アニーリングの間、識別分子の結合エンティティのアミノ基の一つに輸送した(以下参照)。アニーリングの後、試料をマイクロスピンゲル濾過によって精製し、MSによって分析した。試料は、同量の試料(約100ピコモル)およびイオン交換樹脂を用いてMS分析のために準備し、最低2時間25℃で振盪器中でインキュベートした。インキュベーション後、樹脂を遠心分離し、上澄み15μlに水7μl、ピペリジンおよびイミダゾールを2μl(それぞれ625mM)およびアセトニトリル24μlを加えた。試料を、質量分光器(Bluker Daltonics Esquire 3000plus)を用いて分析した。観察された質量(以下参照)は、7323.45Daであり、これは算出された質量の7324.00Daとよく一致していた。従って、輸送反応後の識別分子のMSスペクトルは、識別分子上に機能エンティティを輸送したものに一致した質量を示す。
アニーリングは、0.1MのMES緩衝剤中で、合成ブロックおよび識別分子500ピコモルを用いて、25℃で振盪器中で2時間混合物をインキュベーションして行われた。合成ブロックの反応部(機能エンティティ)を、アニーリングの間、識別分子の結合エンティティのアミノ基に輸送した(以下参照)。アニーリングおよび輸送の後、試料をマイクロスピンゲル濾過によって精製し、MSによって分析した。試料は、同量の試料(約100ピコモル)およびイオン交換樹脂を用いてMS分析のために調製し、最低2時間25℃で振盪器中でインキュベートした。インキュベーション後、樹脂を遠心分離によって除去し、上澄み15μlに水7μl、ピペリジンおよびイミダゾールを2μl(それぞれ625mM)およびアセトニトリル24μlを加えた。
アニーリングは、25℃で振盪器中で2時間インキュベートした0.1MのMES緩衝剤中で、合成ブロック500ピコモルおよび識別分子500ピコモルを用いて、行われた。合成ブロックの反応部(機能エンティティ)を、識別分子の結合エンティティのアミノ基に輸送した(以下参照)。アニーリングおよび輸送の後、試料をマイクロスピンゲル濾過によって精製し、MSによって分析した。試料は、同量の試料(約100ピコモル)およびイオン交換樹脂を用いてMS分析のために調製し、最低2時間25℃で振盪器中でインキュベートした。インキュベーション後、樹脂を遠心分離によって除去し、上澄み15μlに水7μl、ピペリジンおよびイミダゾールを2μl(それぞれ625mM)およびアセトニトリル24μlを加えた。
機能エンティティ(FE)を識別分子上の結合エンティティ(AE)を輸送した後、輸送した機能エンティティを識別する独特のコドンを識別分子に輸送するために、識別分子を伸長する。これは、適当なポリメラーゼおよび野生型のヌクレオチド(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)を含むポリメラーゼ緩衝剤を付加することによって達成される。これは3’末端において識別分子を、合成ブロック分子の5’末端に向かって伸長するであろう。独特のアンチコドンを輸送する識別分子の伸長は、好ましくは、以下に示すようなFEの輸送後に行われる。
輸送した4−ペンチン酸による識別分子上の伸長についてのMSデータを以下に示す。
識別分子は、様々な条件下で最適に作用するように構築され得る。しかしながら、それは、その機能にとって不可欠な少しの要素を含んでいるべきである。識別分子は、合成ブロックにアニーリングし得る配列、および様々な機能エンティティを結合し得る結合エンティティを含むべきである。以下は、識別分子が伸長領域においていかにして構築され得るかの例である。各々の輸送およびコード化の工程の間伸長される領域は、様々な方法を用いて構築し得る。重要なこととして、ポリメラーゼを用いた効率的な伸長を可能にするために、合成ブロックおよび識別部の間の塩基対が適合していなければならない。このことは、図3(A)に記述されるような定常の結合領域である領域、または図3(B)に示される何らかの配列に結合することを可能にする領域のいずれかを用いて達成し得る、これらの組み合わせがまた方法に対して用いられ得る。
MS分析を、半分の体積のイオン交換樹脂において約100ピコモルの伸長反応を用いて行い、最低2時間25℃で振盪器中でインキュベートした。インキュベーションの後、樹脂を遠心分離によって除去し、15μlの上澄みを7μlの水、2μlのピペリジンおよびイミダゾール(それぞれ625mM)および24μlのアセトニトリルと混合した。試料を、質量分光器(Bluker Daltonics Esquire 3000plus)を用いて分析した。
コード化過程は、識別分子におけるループアウト領域の形成を可能にするように構築し得る。コード化過程はまた、相補的識別領域および相補的結合領域の間の可変性リンカーを用いて行われ得る。
ループアウト法は、識別領域が相補的識別領域にアニーリングし、結合領域が相補的結合領域にアニーリングするところの、図18に示す。これは、アニーリング過程に直接的には関わらない一続きの一本鎖ヌクレオチドを形成するであろう。このアニーリングは、アンチコドン領域、および好ましくは次の伸長周期に用いられ得る他の結合領域の伸長による輸送を可能にする。結合領域は正確なアニーリングおよび生産的な伸長を保証するのに十分長いべきである。伸長は、もし結合領域が短ければ、不完全であるであろう。それは、結合領域の長さを決定する単純な試行錯誤の実験によって、当業者の知り得るところである。通常5ないし7のヌクレオチドが、結合領域として十分である。
伸長した識別分子の配列を以下に示した。識別領域および相補的識別領域の間の21ヌクレオチドの長さのアニーリングが存在する。その後、前のコード化周期において伸長したコドンを表す42ヌクレオチド領域が存在する。伸長を促進する相補的結合領域は9ヌクレオチドであり、5および14ヌクレオチド領域はまた、伸長について検査した。最後に、伸長を可能にする14ヌクレオチド領域が存在する。
手順の概観
DF:薬剤断片/機能エンティティ
B:ビオチン
SA:ストレプトアビジン
合成ブロックオリゴを調製するために、同一のキャリアオリゴに、一般的な手順2を用いて最初に11の異なる薬剤断片を負荷している。11の負荷したキャリアオリゴは、その後、一般的な手順3を用いて、最初または二番目の周期のアンチコドンオリゴにライゲーションされ、それによって最初の周期の11の合成ブロックおよび二番目の周期の11の合成ブロックを得る。
10μLのトリエタノラミン(TEA)(DMF中0.1M)を、アミン保護基としてペント−4−エナールを有する10μLの合成ブロック(BB)(DMSO中0.1M)と混合した。この混合物6.7μLを取り出し、3.3μLのEDC[1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩](DMF中0.1M)と混合し、30分間25℃でインキュベートした。10μLの合成ブロック−EDC−TEA混合物を、0.1Mのヘペス緩衝剤((4−(2−ヒドロキシル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸、SIGMA)、pH7.5中で、10μLのアミノオリゴに加え、オリゴと共に30分間インキュベートした。
半時間の間、他の6.7μLのBB−TEA混合物を、3.3μLのEDC(DMF中0.1M)と混合し、30分間25℃でインキュベートした。10μLのこの三番目のBB−EDC−TEA混合物を、その後アミノオリゴ混合物に10μLの0.1Mヘペス緩衝剤と共に加え、DMSO/DMF:H2Oの1:1の比率を維持した。その後混合物を30分間インキュベートした。
混合物を、その後水によって平衡に達したスピンカラム(バイオスピンP−6、BioRad)を用いたゲル濾過によって精製した。負荷した識別オリゴをES−MSによって分析した。
N : 5'−アミノ修飾因子5(グレンリサーチ カタログ番号 10−1905−90)
S : スペーサーC3CPG (グレンリサーチ カタログ番号20−2913−01)
P : PCスペーサーホスホルアミダイト(グレンリサーチ カタログ番号 10−491
3−90)
ES−MSによって分析した負荷した識別オリゴ1.1
予期された質量:11709Da
観察された質量:11708Da
識別オリゴ1.2:5'- NSPACCTCAGCTGTGTATCGAGCGGCAGCAGTGCCGTCG-3'
N : 5'−アミノ修飾因子5(グレンリサーチ カタログ番号 10−1905−90)
S : スペーサーC3CPG (グレンリサーチ カタログ番号20−2913−01)
P : PCスペーサーホスホルアミダイト(グレンリサーチ カタログ番号 10−4913−90)
ES−MSによって分析した負荷した識別オリゴ1.2
予期された質量:11647Da
観察された質量:11641Da
識別オリゴ1.3:5'- NSPACCTCAGCTGTGTATCGAGCGGCAGCGCACACGTCG-3'
N : 5'−アミノ修飾因子5(グレンリサーチ カタログ番号 10−1905−90)
S : スペーサーC3CPG (グレンリサーチ カタログ番号20−2913−01)
P : PCスペーサーホスホルアミダイト(グレンリサーチ カタログ番号 10−4913−90)
ES−MSによって分析した負荷した識別オリゴ1.3
予期された質量:11761Da
観察された質量:11759Da
識別オリゴ1.4: 5'- NSPACCTCAGCTGTGTATCGAGCGGCAGCGGATACGTCG-3'
N : 5'−アミノ修飾因子5(グレンリサーチ カタログ番号 10−1905−90)
S : スペーサーC3CPG (グレンリサーチ カタログ番号20−2913−01)
P : PCスペーサーホスホルアミダイト(グレンリサーチ カタログ番号 10−4913−90)
予期された質量:11775Da
観察された質量:11775Da
10−15ナノモルのキャリアオリゴ2を凍結乾燥し、27.5μlの水中に再び溶解した。これに、7.5μlの1MヘペスpH7.5、10μLの2−アミノペント4エナール保護(アリルグリシン)した合成ブロック(ジメチルスルホキシド中0.1M)、および5μlのDMT−MM[4−(4,6−ジメトキシ−1,3,5−チアジン−2−イル)−4−メチルモルホリニウム塩化物](水中0.5M)を加えた。混合物を、4−16時間25−30℃でインキュベートした。オリゴをゲル濾過(バイオスピンP−6、BioRad)によって精製した。合成ブロックのメチルエステル部分をカルボン酸に変換するために、5μlの0.4M水酸化ナトリウムを加え、その混合物を20分間80℃でインキュベートした。混合物を、その後10μlの0.5MヘペスpH7.5および5μlの0.4M塩酸を付加することによって、中和した。負荷した合成ブロックオリゴを、ゲル濾過(バイオスピンP−6、BioRad)によって精製し、ES−MSによって分析した。
キャリアオリゴ2: 3'-2GGAGTCGACACATAGCTCGCp-5'
2:カルボキシdT(グレンリサーチ カタログ番号 10−1035−90)
p:5'リン酸塩
ES−MSによって分析した負荷したキャリアオリゴ2.1
予期された質量:6856Da
観察された質量:6857Da
ES−MSによって分析した負荷したキャリアオリゴ2.2
予期された質量:6944Da
観察された質量:6945Da
ES−MSによって分析した負荷したキャリアオリゴ2.3
予期された質量:6798Da
観察された質量:6800Da
ES−MSによって分析した負荷したキャリアオリゴ2.4
予期された質量:6917Da
観察された質量:6919Da
500ピコモルの負荷したキャリアオリゴを、750ピコモルのアンチコドンオリゴおよび750ピコモルのスプリントオリゴと混合した。混合物を凍結乾燥し、15μlの水中に再び溶解した、オリゴを、加熱してゆっくり20℃まで冷却することによって、アニーリングした。15μlのTaKaRaリガーゼ混合物(TaKaRa Bio inc)を付加し、反応系を20℃で1時間インキュベートした。混合物を、ゲル濾過(バイオスピンP−6、BioRad)によって精製し、ライゲーションの効率を、一部をNovexTBE−UREAゲル(インビトロジェン)上に流すことによって調べた。
実施例7.3.1.1
2:カルボキシdT(グレンリサーチ カタログ番号 10−1035−90)
P:5'リン酸塩
X:5'ビオチン
ライゲーションの効率:>95%
ライゲーションの効率:>95%
実施例7.3.1.3
ライゲーションの効率:>95%
実施例7.3.2.1
合成ブロックオリゴ3.2.1:
ライゲーションの効率:>95%
ライゲーションの効率:>95%
ライゲーションの効率:>95%
実施例7.4.1:ケメティックス(商標)による484の要素の小さな分子のライブラリーのコード化
実施例7.4.1.1最初のコード化周期
2ピコモルの負荷した識別オリゴ1.1を、200ピコモルの各々の識別オリゴ1.2、1.3および1.4(総計で602ピコモルの負荷した識別オリゴ)と結合した。これらは、0.7ピコモルの合成ブロックオリゴ3.1.3.、および72.7ピコモルの各々の10の異なる他の最初の周期の合成ブロックオリゴ(例えば、3.1.1および3.1.2;総計で727ピコモルの負荷した合成ブロックオリゴ)と混合した。オリゴを凍結乾燥し、50μlの伸長緩衝剤(EX)[20mMのヘペス、150mMの塩化ナトリウム、8mMの塩化マグネシウム]に再び溶解した。混合物を80℃まで加熱し、20℃までゆっくりと冷却し、識別部および合成ブロックオリゴの効率的なアニーリングを可能にした。5μlの水中0.5MのDMT−MMを加え、混合物を37℃で4時間インキュベートした。
溶出液に、0.36ピコモルの二番目の周期の負荷した合成ブロックオリゴ3.2.2、および36.4ピコモルの各々の10の異なる他の二番目の周期の合成ブロックオリゴ(例えば、3.2.1および3.2.3;総計で364ピコモルの負荷した二番目の周期の合成ブロックオリゴ)を付加し、混合物を凍結乾燥し、50μlのEX緩衝剤中に再び溶解した。コード化は、本質的に7.1.1以降に述べたように行った。
溶出した識別オリゴを凍結乾燥し、50μlのEX緩衝剤中に溶解した。その後、200ピコモルのプライマーE38[5'−XTTTTAGATGGCAGAT−3'、X=CXSビオチン]を加えた。アニーリングを、混合物を80℃まで加熱し、ゆっくりと20℃まで冷却することによって行った。識別オリゴの伸長は、各々のデオキシヌクレオチド三リン酸[dATP、dGTP、dCTP、dTTP]の10mMの混合物3μl、および13単位/μlのシークエナーゼ3μlを付加することによって行った。その後、混合物を30℃で2時間インキュベートした。混合物を、その後ゲル濾過カラム(バイオスピンP−6、Biorad)を通過させることによって精製した。この溶出液を選別のために用いた。一部(試料7.1.3)を、選別手順における投与量の分析のために除去した。
マキシソープELISAのウェル(NUNC A/S、デンマーク)を、PBS緩衝剤[2.8mMのリン酸二水素ナトリウム、7.2mMのリン酸水素二ナトリウム、0.15Mの塩化ナトリウム、pH7.2]中の2μg/mLのインテグリンαVβ3(Bachem)各々100μlで、一晩中4℃で被覆した。その後インテグリン溶液を、200μlの遮断緩衝剤[TBS、0.05%ツゥイーン20(SigmaP−9416)、1%牛血清アルブミン(SigmaA−7030)、1mM塩化マグネシウム]と置換し、それを3時間室温で放置した。その後ウェルを遮断緩衝剤を用いて10回洗浄し、それを遮断緩衝剤を用いて100回希釈した後、コード化したライブラリーをウェルに付加した。室温で2時間インキュベートした後、ウェルを遮断緩衝剤を用いて10回洗浄した。最後の洗浄の後、ウェルから洗浄に用いた緩衝剤を除去し、その後転化して、300−350nmの紫外線光に30秒間曝露した。その後ツゥイーン20を含まない遮断緩衝剤100μlを直ちに各々のウェルに付加し、ウェルを30秒間震とうし、溶出した識別部を含む溶液をPCR分析のために除去した(試料5.1)。
PCRを、(試料7.3.1)のための選別の投与量および(試料5.1)の選別の産出量で、識別オリゴの5'末端に対応するプライマーおよびE38プライマーを用いて行った。PCRを、Ready−To−Go(RTG)PCRビーズ(Amersham Biosciences)および10ピコモルの各々のプライマーを25μlの反応体積で用いて行った。PCR反応は、最初の94℃で2分間の変性工程、続いて30−45周期の、94℃で30秒間の変性工程、58℃で1分間のアニーリングおよび72℃で1分間の伸長からなった。最後に72℃で2分間の伸長工程を含めた。PCR生成物を、アガロースゲル電気泳動によって再び溶解し、予期されたサイズに一致するバンドをゲルから切り出して、QIA迅速ゲル抽出キット(QIAGEN)を用いて精製した。
個別にイー・コリクローンを選び出し、50μlの水を含むPCRウェルに移した。これらのウェルをその後5分間煮沸し、各々のウェルから20μlの混合物を、業者の指示に従った、RTGPCRビーズおよび各々5ピコモルのM13のフォワードおよびリバースプライマーを用いたPCR反応に用いた。各々のPCR生成物の試料を、その後分解した一本鎖のDNAおよびdNTPを除去するためにエキソヌクレアーゼI(USB)およびエビアルカリホスファターゼ(USB)で処理し、業者の指示に従ってDYEnamicET周期配列決定キット(Amersham Biosciences)を用いて配列決定し、反応をMegabace4000細孔配列決定機(Amersham Biosciences)で分析した。配列の産出量を、ContigExpressソフトウェア(Informax社)によって分析した。
ライブラリーは、3★108の識別部のうちの一つから、インテグリンαVβ3リガンドA(FeustonB.Pら、Journal of Medicinal Chemistry 2002年、45、5640−5648中の分子7)をコード化できる可能性があった。
上の表から分かるように、ライブラリーは、3★108の識別部の全て(1×1×1=全ての301×1001×1001〜3★108のうち一つ)から、リガンドAをコード化できる可能性があった。
リガンドAのコード化に適合したコドンの組み合わせは、予期された低量のコドンの組み合わせ(3★108のうちの1)に従った選別の前にコード化したライブラリー由来の28配列にはみられなかった。
リガンドAのコード化に適合したコドンの組み合わせは、インテグリンαVβ3ウェル中の選別後にコード化したライブラリー由来の19配列のうち5つにみられた。
これらの数は、(3★108/(19/7))=8★107の濃縮因子に一致する。
この例は、様々な標的に対する複合体の選別を行うために、カラム選別を用いる可能性を例示する。この例において、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)が用いられるが、標的結合複合体が非結合複合体から分離される他のタイプのクロマトグラフィーも用いられ得る。
複合体を、前もって決定された配列を有するオリゴヌクレオチド配列と結合したビオチン分子によって、この実施例において例示している。従って、識別部のヌクレオチド配列は、合成分子の識別部をビオチンとして指定する。コード化した配列はあらゆる長さを有してよく、当該明細書の他の部分で述べたように、様々な合成ブロックをコード化するための不連続の領域に分割し得る。また、ディスプレイした分子は、鎖状または骨格の構造をもつことができる。
ビオチン−AATTCCGGAACATACTAGTCAACATGA
ビオチンはストレプトアビジンと結合することが知られている。ビオチンのストレプトアビジンとの結合は、識別部を標的分子に連結し、それゆえに識別部を、例えばみかけの分子量のような物理的および化学的特性を変化させるであろう。この変化は、例えばサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、検出できる可能性がある。
二官能性複合体のライブラリーのカラム選別を行う方法には、二つの主要な利点がある。第一に、濃縮した(標的と結合した)複合体を、非結合複合体の前に溶出し、非結合複合体由来のバックグラウンドを劇的に減少させるであろう。第二に、カラムでの濃縮は、基質中の孔における全ての分離工程のために徹底したものになるであろう。
用いられ得る他のタイプのカラム分離の例は、親和性クロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー(HIC)、およびイオン交換クロマトグラフィーである。サイズ排除クロマトグラフィーで用いられ得るカラムの媒質の例は、スーパーデックスの他に、セファクリル、セファロースまたはセファデックスである。
ヒトインテグリン受容体αV/βIIIは、細胞の移行および播種性転移とともに、炎症反応および血栓形成のような多くの生物学的機能に影響を与える。αV/βIIIに対する天然のリガンドは、受容体の結合ポケットと相互作用するRGDトリペプチドコンセンサスモチーフを含む。結果として、多くの医学研究は、αV/βIII受容体に対する親和性を高めた小分子のRGD擬似物の合成および識別に、焦点を当ててきた。ある擬似物、Feuston5(Feustonら、J Med Chem.2002年12月19日;45(26):5640−8)はGDジペプチドに結合したアルギニン生物等配電子体を含み、RGDトリペプチドと比較して、αV/βIIIに対して10倍高くなった親和性(K D =111nM)を示す。
ここに、Feuston5リガンドおよび24の追加の小分子のスプリット・アンド・ミックス手順を含む、25要素の小分子のライブラリーを合成した。ライブラリーを受容体との相互作用について選別し、DNAをPCRによって増幅し、配列決定して、対応する小分子のリガンドを識別した。
ライブラリーの生成
図22および図23は、ライブラリー合成についての一般的スキームを示す。最初に、スペーサーPEG18(グレンリサーチ、カタログ番号10−1918−90)および光で切断可能な(グレンリサーチ、カタログ番号10−4913)スペーサーによって結合した、5'末端のアミノ基(グレンリサーチ、カタログ番号10−1905−90)を含む正味36のオリゴヌクレオチド(ID)
5'−XACCTCAGCTGTGTATCGAGCGGCAGCGGCCTCGTCG
を、標準的ホスホルアミダイト反応によって合成した(DNAテクノロジー A/S デンマークから購入できる)1ナノモルのIDオリゴヌクレオチドを、次の骨格負荷プロトコールAを用いて、ペンテネオイル−Asp(OMe)−OHを負荷した。
5'−TGTGCGACGAGGCCGCTGC
を有する500ピコモルの相補的オリゴにアニーリングした。(効率的なアニーリングおよびライゲーションのために)正味4の突出部を有する二重鎖のオリゴの組(ID−ds)を、次の手順を用いて、以下に概略的に示したスプリット・アンド・ミックス反応プロトコールに用いられた。
の特定の二番目の位置のコドンオリゴヌクレオチド100ピコモルを、各々のウェルに付加し、オリゴをライゲーション緩衝剤[30mMのトリス塩酸(pH7.9)、10mMの塩化マグネシウム、10mMのDTT、1mMのATP]および10単位のT4DNAリガーゼを用いて、20μlの体積で環境温度で1時間ライゲーションした。
N−ペンテネオイルの反応は、IDオリゴを用いてグリシン反応体を保護し、その後ヨウ素を用いて脱保護した。反応系を、37℃で2時間インキュベートした。過剰のヨウ素を、1Mの2−メルカプトエタノール1μlの付加によって排除し、スピン−ゲル濾過(Biorad6)を用いて試料を精製する前に、環境温度で5分間放置した。
p=5’リン酸塩
を用いて、三番目の位置のコドンを付加するために、試料を5つのウェルに分割し、次の例外を持つが、2番目の位置について述べ、図22において示されるように遊離反応体と反応させた:F3反応体は、F3の有機溶媒に対する溶解度が乏しいために、プロトコールAを用いても効果的には反応しなかった。結果として、F3は、次の手順(プロトコールB)を用いて反応させた。ライゲーションし、凍結乾燥した試料を、100mMの水中のF3反応体10μl、および500mMの4−(4,6−ジメトキシ−1,3,5−トリアジン−2−イル)−4メチルモルホリニウム塩化物(DMT−MM、カルボン酸賦活剤)5μlを付加する前に、100mMのホウ酸ナトリウム緩衝剤(pH8.0)35μlに溶解し、25℃で2時間インキュベートした。結合反応に続いて、過剰の反応体、試薬および塩を、プロトコールAにおいて述べたように、ゲル濾過によって除去した。残りの工程は、二番目の位置について述べたように行った。
マキシソープELISAウェル(NUNC A/S、デンマーク)を、PBS緩衝剤[2.8mMのリン酸二水素ナトリウム、7.2mMのリン酸水素二ナトリウム、0.15Mの塩化ナトリウム、pH7.2]中の2μg/mLのインテグリンαVβ3(Bachem)各々100μlで、一晩中4℃で被覆した。その後インテグリン溶液を、200μlの遮断緩衝剤[TBS、0.05%ツゥイーン20(SigmaP−9416)、1%牛血清アルブミン(SigmaA−7030)、1mM塩化マグネシウム]と置換し、それを1時間室温で放置した。その後ウェルを250μlの遮断緩衝剤を用いて2回洗浄し、それを遮断緩衝剤を用いて20回希釈した後、コード化したライブラリー5μlをウェルに付加した。室温で2時間インキュベートした後、ウェルを20×250μlの遮断緩衝剤を用いて洗浄した。
最後の洗浄の後、ウェルから洗浄に用いた緩衝剤を除去し、その後転化して、トランスイルミネーターセットを70%の出力で用いて、300−350nmの紫外線光に30秒間曝露した。
ツゥイーン20を含まない遮断緩衝剤100μlを直ちに各々のウェルに付加し、ウェルを30秒間震とうし、溶出した鋳型を含む溶液をPCR分析のために除去した。
投与量および産出量に基づくPCRは、Frw27オリゴ(ACCTCAGCTGTGTATCGAG)の5'末端に対応するプライマー、およびAH361プライマーを用いる。溶出したDNA5μlをエッペンドルフホットマスターミックス2.5x10μlおよび各々10ピコモルのAH361およびFrw27を用いて、25μlの反応においてPCRのために用いた。PCRを行った:(ENRICH30):94℃で2分、その後[94℃で30秒、58℃で1分、72℃で1分]を30周期、その後72℃で10分。
TOPO−TA(インビトロジェン、カタログ番号K4575−J10)ライゲーションを、PCR生成物4μl、塩溶液1μl、ベクター1μlと反応させた。反応系を室温で30分間インキュベートした。ヒートショック成分TOP10イー・コリ細胞を解凍し、氷上に置いた。5μlの反応系を加えた。氷上に30分置いた後、細胞を42℃の水で30秒間ヒートショックを与え、その後氷上に置いた。250μlのSOCを付加し、LBアンピシリンプレート上に散布して続いて37℃でONインキュベートする前に、細胞を1時間37℃でインキュベートした。
18の成功した配列は、選別工程由来の単離したDNAの情報を与え、以下に示される。
産出量の配列
図22は、独特の1番目の位置のD(アスパラギン酸塩)を負荷したオリゴ、2番目の位置の5つの異なる反応体/オリゴの組、および3番目の位置の5つの異なる反応体/オリゴの組を用いたライブラリー生成の概観を示す。最終的に、各々対応する独特のDNAコードに結合した、1×5×5=25の異なる三量体が集合する。矢印はライゲーション部位を示す。
9.1 4−カルボキシベンズアルデヒドを用いた、骨格オリゴを含むアルデヒドの調製
4−カルボキシベンズアルデヒド(骨格)のDMF溶液(25μL、150mM)を、150mMのEDCのDMF溶液25μLと混合した。混合物を30分間25℃で放置した。100mMのヘペス緩衝剤pH7.5中のアミノオリゴ(10ナノモル)50μLを付加し、反応混合物を20分間25℃で放置した。過剰の骨格を、酢酸エチル(500μL)を用いた抽出によって除去し、残りの酢酸エチルを、真空中でスピードバック中で10分間回転させることによって除去した。混合物を、その後水によって平衡に達したマイクロバイオスピンカラム(バイオスピンP−6、BioRad)を用いたゲル濾過によって精製した。負荷したオリゴをES−MSによって分析した。
L1.1:5’−5CG ATG GTA CGT CCA GGT CGC AX
3’X=3’ビオチン
5’5=5’アミノ−C6(グレンリサーチ、カタログ番号10−1906−90)
9.3節に用いられるアミノオリゴL1.2:分子量=6585
L1.2:5’−GCG ACC TGG AGC ATC CAT CGX
3’X=アミノ−C2−dT−3’−PO4(グレンリサーチ、カタログ番号10−1037−90)
ベンズアルデヒドを負荷したL1.1オリゴ(200ピコモル)溶液を凍結乾燥し、10μlの水中に再び溶解した。メタノール中の2−メトキシエチルアミン(10μL、40mM)、メタノール中の3−フラン−2−イル−アクリル酸(10μL、40mM)、およびメタノール中のシクロヘキシルイソシアニド(10μL、40mM)を付加し、一晩中37℃でインキュベートした。反応混合物を40μLの水で希釈し、水によって平衡に達したスピンカラム(バイオスピンP−6、BioRad)を用いたゲル濾過によって精製した。オリゴ上のMCR生成物を、ES−MSによって分析した。出発物質のL1オリゴを負荷したベンズアルデヒド(A)は、UGI生成物(B)と共に、MSスペクトルにおいて識別された。
ベンズアルデヒドを負荷したL1.2オリゴ(320ピコモル)溶液を凍結乾燥し、10μlの水中に再び溶解した。メタノール中の2−アミノエタノール(10μL、40mM)、メタノール中の3−メトキシ−プロピオン酸(10μL、40mM)、およびメタノール中のエチルイソシアノ酢酸(10μL、40mM)を付加し、一晩中37℃でインキュベートした。反応混合物を40μLの水で希釈し、水によって平衡に達したスピンカラム(バイオスピンP−6、BioRad)を用いたゲル濾過によって精製した。オリゴ上のMCR生成物を、ES−MSによって分析した。出発物質のL1オリゴを負荷したベンズアルデヒド(A)は、三つの生成物、B ジケトピペラジン、C UGI生成物およびH アミン生成物と共に、MSスペクトルにおいて識別された。
過剰の反応体、活性化試薬、溶媒および塩を、Bioradマイクロスピンカラム6を用いた二重のゲル濾過によって除去し、MS等級の水中で溶出し、負荷を、オリゴヌクレオチドL1に結合したディスプレイした分子がコード化される前に、エレクトロスプレーMS(Bruker社)分析によって検証した。
上記したディスプレイした分子を形成する他の三つの成分と反応した、9.2節中のベンズアルデヒドを負荷したオリゴヌクレオチドL1.1を、スプリントオリゴヌクレオチドS1、S2およびS3(以下に示した配列)と共に、コドンオリゴヌクレオチドL2、L3およびL4と混合し、リガーゼ(T4DNAリガーゼ)を用いてライゲーションした。ライゲーションを、次の条件を用いて行った。二本鎖のオリゴヌクレオチドは、コード化する鎖(L1、L2、L3およびL4)をスプリントオリゴヌクレオチド(S1、S2およびS3)と混合することによって達成し、7つのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション生成物を(効率的なアニーリングおよびライゲーションのために)形成した。約50ピコモルの各々の特定のオリゴヌクレオチドを用い、そのオリゴヌクレオチドを、20μlの体積でライゲーション緩衝剤[30mMのトリス塩酸(pH7.9)、10mMの塩化マグネシウム、10mMのDTT、1mMのATP]および10単位のT4−DNAリガーゼを用いて、環境温度で1時間ライゲーションした。
DMF中の150mMの合成ブロック溶液25μlを、DMF中の150mMのEDC溶液25μlと混合した。混合物を30分間25℃で放置し、100mMのヘペス緩衝剤pH7.5中のアミノオリゴ(10ナノモル)50μLを付加し、反応混合物を20分間25℃で放置した。過剰の合成ブロックを、酢酸エチル(500μL)を用いた抽出によって除去した。過剰の酢酸エチルを、スピードバック中の低下させた圧力で除去した。合成ブロックを負荷したアミノオリゴを、酢酸アンモニウムを用いて二回エタノールで沈殿させ、エレクトロンスプレー質量分光測定法(ES−MS)によって分析した。
次の例は、エンティティのライブラリーから単離した望ましい特性を含む、エンティティを識別するためのタグ付加の原理の利用を例証している。原理を図1に概略的に示す。
インテグリン受容体αV/β3と結合する複合体の識別のためのペプチドのDNAタグ付加
・精製したヒトインテグリンαV/β3(Chemicon社)
・ストレプトアビジンセファロース6B(AmershamPharmacia)
・Nunc免疫修飾分子U8マキシソープ(Biotecline カタログ番号Nun−475078)
・長さをそろえて切断したニシンのDNA(Sigma)
・Taq−ポリメラーゼ(Promega)および10XTaq−ポリメラーゼ緩衝剤
・結合緩衝剤[100mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化マグネシウム、50mMのトリス塩酸、pH7.5]
・UVトランスイルミネーター
・SPDP[N−コハク酸イミジル3(2−ピリジルジチオ)プロピオン酸](Morecular Probe、カタログ:S−1531)
・マイクロBio−spin6(Bio−Radカタログ:732−6221)
式中、X=、ペプチド、小分子またはポリマーのような機能エンティティの結合に適している5'C6アミノ修飾因子(グレンリサーチ、カタログ番号10−1916−90)である。
下線を引いた10のヌクレオチド配列は、各々のタグ付加オリゴヌクレオチドについて独特であり、独特の対の相補的なオリゴヌクレオチドを有する。太線で強調した配列は、クローニングの目的に適している。
・次の組成物を有する6つのペプチド
P#1:GRGDSPC
P#2:GRADSPC
P#3:GRGESPC
P#4:GDGRSPC
P#5:CKKK
P#6:CFFKKK
A=アラニン、G=グリシン、R=アルギニン、D=アスパラギン酸、P=プロリン、F=フェニルアラニン、K=リシンおよびE=グルタミン酸。全てのペプチドが、N−末端カルボキシル化およびC−末端アミド化によって、末端をキャップされている。ペプチドは、Schafer−N A/S、DK−デンマークによって供給された。
工程1:特定のオリゴヌクレオチド(TO番号1−6)を有するペプチド番号1−6のタグ付加
各々のTOオリゴヌクレオチドは、次の反応においてヘテロ二官能性架橋リンカーSPDPを用いて、ペプチドのシステインのチオール基に共有結合し得る、単一の5'末端のアミノ求核基(X)を含む。
5ナノモルのアミノオリゴを乾燥させ、100mMのヘペス−OH(pH7.5)160μl中に再び懸濁する。20mMのSPDP(DMSO中)40μlを付加し、2時間30℃でインキュベートする。試料を3×500μlの酢酸エチルによって抽出し、スピードバック中で10分間乾燥する。試料を、100mMのヘペス−OHによって平衡に達したマイクロバイオスピン6カラムを用いて精製する。1Mのペプチド10μlを付加し、25℃で2時間インキュベートする。2Mの酢酸アンモニウム/エタノールによって、2回沈殿させる。50μlの水中に再び溶解し、エレクトロスプレー−MS分析(Bruker社)によってタグ付加を検証する。
手順:
対応するペプチドを負荷した10ピコモルのTO番号1−6を、結合緩衝剤[100mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化マグネシウム、50mMのヘペス−OH、pH7.5]中で、総体積100μlで20ピコモルの各々のCO番号1−6を含む混合物に付加する。試料を2分間80℃まで加熱し、ゆっくりと室温まで30分以上冷却する。
アニーリングに続いて、相補的なオリゴヌクレオチド配列とアニーリングした、タグ付加した分子は、機能エンティティおよびビオチンハンドル(図1参照)を共に含むであろう。結果として、選別工程において「ノイズ」を減少させるために、一本鎖のタグ付加した分子を、ビオチンハンドルを用いた前選別工程において、ライブラリーから除去し得る。
手順:
50μlのストレプトアビジン−セファロース6Bスラリーを、ビーズを100μlの結合緩衝剤中に再び懸濁する前に、3×1mlの結合緩衝剤中で洗浄する。CO/TO−ペプチドをアニーリングする混合物を、ストレプトアビジンビーズに付加し、攪拌しながら25℃で30分間インキュベートする。その後、ストレプトアビジンビーズをペリットにして、上澄みを廃棄し、ビーズを1mlの結合緩衝剤で三回洗浄する。ビーズを100μlの結合緩衝剤結合緩衝剤中に再び懸濁し、最後にCO/TO−ペプチド複合体が光切断を用いて解放される。光切断反応は、Vilber−LourmatUVトランスイルミネーターTFX−20M上で、30秒間70%の出力で、試料をインキュベートすることによって行う。溶出したCO/TO−ペプチド複合体を、新しい管に除去する。
分子のライブラリーを、プラスチック表面に固定したインテグリンαV/β3受容体に対する結合について検査する。
手順:
単一のウェルのNunc8プレートを、標準リン酸緩衝食塩水(PBS)中で、1μg/mlのインテグリン受容体100μlを用いて、一晩中インキュベートする。ウェルをPBS100μlで5回洗浄し、続いて0.5mg/mlの長さをそろえて切断したニシンのDNA100μlを、PBS緩衝剤中で2時間室温で遮断する。
最後に、ウェルをインテグリン結合緩衝剤[トリス塩酸(pH7.5)、137mMの塩化ナトリウム、1mMの塩化カリウム、1mMの塩化マグネシウム、1mMの塩化カルシウムおよび1mMの塩化マンガン]100μlを用いて、五回洗浄する。
CO/TO−ペプチド複合体を、固定したインテグリンに付加し、37℃で30分間インキュベートする。上澄みを除去し、固定したインテグリンを、100μlのインテグリン結合緩衝剤を用いて、5回洗浄する。CO/TO−リガンド複合体を、試料を80℃まで5分間加熱して溶出する。試料を、室温まで冷却する。試料1μlを、10ピコモルの各々のAO番号1および2を外部のプライマーとして用いた、10mMのトリス塩酸pH9.0、50mMの塩化カリウム、1mMの塩化マグネシウム、0.1%トライトンX−100、各々250mMのdATP、dCTP、dGTPおよびdTTPを含む反応系における、PCR増幅のために用いる。試料を、最初に94℃で2分間変性させ、30周期94℃で30秒間変性し、44℃で30秒間アニーリングして72℃で15秒間伸長することによって、精製する。最後に、試料を沈殿させる。
その後の選別および増幅周期について、増幅したPCR生成物の鋳型でない鎖を除去すべきである。この工程は、ビオチニル化した鋳型のオリゴの特異的精製を用いて行う。
手順:
50μlのストレプトアビジン−セファロース6Bを、結合緩衝剤1mlによって三回洗浄する。洗浄したビーズを、工程4由来のPCR生成物の25μl(<10ピコモル)と共に、100μlの結合緩衝剤中で30分間25℃でインキュベートした。ビーズを収集するために、試料を軽く回転させる。上澄みを除去し、800μlの水を用いて5回洗浄する。ビーズを、2分間室温で10mMの水酸化ナトリウム500μl中に再び懸濁する。上澄みを除去し、ビーズを100μlの水中100mMのビオチンに、再び懸濁する。溶出のために、試料を攪拌しながら95℃で10分間インキュベートする。その後、過剰のビオチンを、マイクロスピンゲル濾過によって除去する。
インテグリンαV/β3受容体に対するリガンドを表す配列を濃縮している、一本鎖の鋳型のオリゴヌクレオチドの新しい集団を、工程2で述べたように工程1由来のタグ付加したペプチドのライブラリーにアニーリングし、さらに他の選別および増幅の周期に付す。
選別および増幅手順(工程2−6)を、5周期反復する。
リガンドエンティティまたはエンティティに対して特異的な、濃縮した二本鎖DNA断片の識別部は、M13mp18プラスミドベクター中でDNAクローニングし、配列の分析によって個別のクローンを検査することによって、確立される。統計の目的のために、30より多くのクローンを、配列決定してクローニングした配列のタグのプールの内の主要な配列を識別する。クローニングした主要なDNA配列はリガンドに対応するので、配列のバイアスは、直接、さらなる実験に適したリガンドの候補を識別する。
次の例は、配列のライブラリーから単離した小分子を表すDNA配列を識別するための、タグ付加の原理の利用を例示する。原理を図中に概略的に示す。
ストレプトアビジンと結合する複合体の識別のための、ビオチンおよびグルタチオンのDNAタグ付加
・ストレプトアビジンセファロース6B(AmershamPharmacia)
・Taq−ポリメラーゼ(Promega)および10XTaq−ポリメラーゼ緩衝剤
・結合緩衝剤[100mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化マグネシウム、50mMのトリス塩酸、pH7.5]
・SPDP[N−コハク酸イミジル3(2−ピリジルジチオ)プロピオン酸](Morecular Probe、カタログ:S−1531)
・N−ヒドロキシコハク酸イミジルエステル−ビオチン(Fluka番号14405)
・グルタチオン(Sigma)
・マイクロバイオスピン6(Bio−Radカタログ番号:732−6221)
・T7エキソヌクレアーゼ(遺伝子6)および5×緩衝剤
式中、X=、ペプチド、小分子またはポリマーのような機能エンティティの結合に適している5'C6アミノ修飾因子(グレンリサーチ、カタログ番号10−1039−90)である。NはG、A、TまたはCである。
式中、Sは、DNA主鎖中のモノチオリン酸塩の位置を意味する。下線を引いた10のヌクレオチド配列は、各々のタグ付加オリゴヌクレオチドまたはタグ付加オリゴヌクレオチドのプールに独特であり、独特の対の相補的なオリゴヌクレオチドを有する。太線で強調した配列は、クローニングの目的に適している。
・PCR増幅のためのオリゴヌクレオチド
式中、Sは、DNA主鎖中のモノチオリン酸塩の位置を意味する。
工程1:TO番号1を用いたビオチンのタグ付加、およびTO番号2を用いたグルタチオンのタグ付加
全てのTOオリゴヌクレオチドは、小分子の共有結合のために用い得る、単一の5'末端のアミノ求核基(X)を含む。ビオチンは、次の反応においてNHS−ビオチン(Merck)を用いて、TO番号1のアミノ基と結合する。
TO番号1を用いたビオチンのタグ付加:
5ナノモルのTO番号1のオリゴヌクレオチドを乾燥させ、100mMのヘペス−OH緩衝剤(pH7.5)80μl中に再び懸濁する。50mMのNHS−ビオチン(DMSO中)20μlをオリゴヌクレオチドに付加し、試料を30℃で2時間インキュベートする。試料を、マイクロスピン6カラム上での精製の前に、200μlの酢酸エチルを用いて2回抽出する。ビオチンのタグ付加を、エレクトロスプレーMSを用いて検証する(Bruker社)。
TO番号2を用いたグルタチオン(GSH)のタグ付加:
5ナノモルのTO番号2を乾燥させ、100mMのヘペス−OH(pH7.5)160μl中に再び懸濁する。20mMのSPDP(DMSO中)40μlを付加し、試料を30℃で2時間インキュベートする。試料を3×500μlの酢酸エチルを用いて抽出し、スピードバック中で10分間乾燥させる。試料を、100mMのヘペス−OHによって平衡に達したマイクロバイオスピン6カラムを用いて精製する。0.1MのGSH10μlを付加し、試料を25℃で2時間インキュベートする。2Mの酢酸アンモニウム/エタノールを用いて2回沈殿させる。50μlの水中に再び溶解し、エレクトロスプレーMS分析(Bruker社)によってタグ付加を検証する。
単一のビオチン配列タグおよび65536の異なるグルタチオン配列タグは、総計65537の異なる配列タグを含む。ライブラリーを、等モル量の各々の配列タグを含むように混合する。結果として、ライブラリーは、タグ付加したビオチンよりも65536倍の過剰の、タグ付加したグルタチオンからなる。
手順:
総計10ピコモルのタグ付加したライブラリー分子を、総体積100μlで、結合緩衝剤[100mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化マグネシウム、50mMのヘペス−OH、pH7.5]中に、CO番号1より65536倍過剰のCO番号2を含む20ピコモルの鋳型分子(CO番号1および2)を含む混合物に付加する。試料を80℃まで2分間加熱し、室温まで30分間以上ゆっくりと冷却する。
アニーリングに続いて、相補的なオリゴヌクレオチド配列にアニーリングしたタグ付加した分子のみが、機能エンティティおよびモノチオリン酸塩主鎖ハンドルを共に含むであろう(図1参照)。結果として、選別工程において「ノイズ」を減少させるために、一本鎖のタグ付加した分子を、モノチオリン酸ハンドルを用いた前選別工程において、ライブラリーから除去し得る。
手順:
50μlの活性化したチオプロピルセファローススラリーを、ビーズを100μlの結合緩衝剤中に再び懸濁する前に、3×1mlの結合緩衝剤中で洗浄する。CO/TOアニーリング混合物を、チオプロピルセファロースビーズに付加し、攪拌しながら30℃で30分間インキュベートする。その後、ビーズをペリットにして、上澄みを廃棄し、ビーズを1mlの結合緩衝剤で三回洗浄する。ビーズを100μlの結合緩衝剤結合緩衝剤中に再び懸濁し、最後にCO/TO複合体が結合緩衝剤中の50mMのDTT100μlによるインキュベーションを用いて解放される。溶出したCO/TO複合体を、新しい管に除去する。
分子のライブラリーを、ストレプトアビジンセファロース6Bに対する結合について検査する。
手順:
50μlのストレプトアビジン−セファロース6Bスラリーを、結合緩衝剤1mlによって3回洗浄する。工程3で溶出したライブラリー分子10μlを、ストレプトアビジンと共に、結合緩衝剤100μl中で、10分間25℃で攪拌しながらインキュベートする。その後、試料を結合緩衝剤1mlを用いて5回洗浄する。リガンドDNAを、試料を100μlの水中で95℃で5分間インキュベートすることによって溶出する。試料を、室温まで冷却する。試料1μlを、10ピコモルの各々のAO番号1および2を外部のプライマーとして用いた、10mMのトリス塩酸pH9.0、50mMの塩化カリウム、1mMの塩化マグネシウム、0.1%トライトンX−100、各々250mMのdATP、dCTP、dGTPおよびdTTPを含む反応系における、PCR増幅のために用いる。試料を、最初に94℃で2分間変性させ、30周期94℃で30秒間変性し、44℃で30秒間アニーリングして72℃で15秒間伸長することによって、精製する。最後に、試料を沈殿させる。
その後の選別および増幅周期のために、増幅したPCR生成物の鋳型でない鎖を除去すべきである。この工程は、モノチオリン酸主鎖を含む鋳型のオリゴ鎖の特異的精製を用いて行う。
手順:
二本鎖のPCR生成物を、ファージT7(遺伝子6)エキソヌクレアーゼを用いた、エキソヌクレアーゼ消化に付す。この酵素は、DNA主鎖中にモノチオリン酸が存在することによって阻害される、二本鎖特異的5'エキソヌクレアーゼである。工程4由来の二本鎖PCR生成物20μlを、50単位のT7エキソヌクレアーゼ酵素を付加する前に、エキソヌクレアーゼT7緩衝剤中でインキュベートする。試料を30℃で10分間インキュベートする。試料を、酢酸アンモニウム/エタノールを用いて沈殿させる前に、100μlのフェノールを用いて一度抽出する。試料を水中に再び懸濁する。
ストレプトアビジンに対するリガンドを表す配列を濃縮している、一本鎖の鋳型のオリゴヌクレオチドの新しい集団を、工程2で述べたように工程1由来のタグ付加した分子のライブラリーにアニーリングし、さらに他の選別および増幅の周期に付す。
選別および増幅手順(工程2−6)を、5周期反復する。
リガンドエンティティまたはエンティティに対して特異的な、濃縮した二本鎖DNA断片の識別部は、M13mp18プラスミドベクター中でDNAクローニングし、配列の分析によって個別のクローンを検査することによって、確立される。統計の目的のために、30より多くのクローンを、配列決定してクローニングした配列のタグのプールの内の主要な配列を識別する。クローニングした主要なDNA配列はリガンドに対応するので、配列のバイアスは、直接、さらなる実験に適したリガンドの候補を識別する。
この例によって、様式1のコード化を用いて得られたコドンを含む識別部の反応体の、様式2のコード化を実行するために用いられる実験条件を述べる。様式1のコード化は、前出の例、特に実施例7において述べたように実行する。本実施例は、コード化様式1および2を組み合わせる一般的原理を例証する。
コード化した識別部の伸長および反応体の輸送を、ジッパー合成ブロックに負荷した機能エンティティをコードする、一つの特定のジッパー合成ブロックおよび一つの特定のアンチコドンオリゴヌクレオチドを混合するところの、別々のウェル中で実行する。この方法はまた、遊離反応体に対して用いられ得る。
この例において、放射線標識した識別オリゴヌクレオチド(E57)を、特定のジッパー合成ブロック(E32)および以下に示すようなアンチコドン配列(アンチコドン1)を有するアンチコドンオリゴヌクレオチド(CD−M−8−0172−0001)を混合する。他の実験において、異なるアンチコドン配列(アンチコドンX)を有する異なるアンチコドンオリゴヌクレオチド(E60)を、参考試料として用いた。
ゲル分析は、識別部が長いアンチコドン1(レーン2)および短いアンチコドンX(レーン3)を共に用いて、完全に伸長されることを示している。結果はまた、混合して伸長する前に最初に識別オリゴヌクレオチドにアニーリングできる場合(レーン4)は、アンチコドンオリゴヌクレオチド間に混合がないことを示している。
様式1でコード化した分子上の試薬の様式2によるコード化は、識別部を三つのコドンおよびディスプレイした分子と共に用いて、検査した。反応体の輸送を、この例ではジッパー合成ブロックの反応体を識別オリゴヌクレオチドのディスプレイした分子に架橋結合することによって、例証している。輸送を、ゲル上での分析を簡単にするために架橋結合によって検査するが、それはこの種の反応に限ったことではない。
以下に示す(化学構造の)ような機能エンティティをオリゴに結合し、相補的領域を介して識別オリゴヌクレオチドにアニーリングするジッパー合成ブロック(CX−1)を形成する。このジッパー合成ブロックは、以下に示すようなアンチコドン配列(アンチコドン1)を有するアンチコドンオリゴヌクレオチド(CD−M−8−0172−0001)と共に用いられた。他の(対照)実験において、異なるジッパー合成ブロック(E32)は、異なるアンチコドン配列(アンチコドンX)を有する異なるアンチコドンオリゴヌクレオチド(E60)と共に用いられた。
本発明は特定の方法および具体例に関する参考文献と共に記述しているが、様々な修正および変更を本発明の範疇から外れることなく行ってよいことが、理解されるであろう。
実施例14.1L1−RGDおよびL1−cRGDの形成
オリゴヌクレオチドL1−NH2を、500mMのヘペス水酸化カリウム、pH7.580μlの混合物中の4ナノモルのL1−NH2、およびDMSO中25mMのBMPS20μlを混合し、その後2時間30℃でインキュベートすることによって、cRGDペプチドおよびRGDペプチドをそれぞれタグ付加するために用いた。BMPSで活性化したL1−NH2オリゴヌクレオチドを、酢酸エチルで3回洗浄して結合していないBMPSを除去し、過剰の酢酸エチルを真空蒸留法によって蒸発させた。100mMのcRGDまたはRGDペプチド10μlをそれぞれ付加し、反応系を室温で一晩中インキュベートした。インキュベートした後、cRGDまたはRGDタグ付加したオリゴヌクレオチドから、ゲル濾過によって過剰の結合していないペプチドを除去した。ペプチドのタグ付加は、質量分光測定分析によって確認され、タグ付加した生成物は、それぞれL1−cRGDおよびL1−RGDと呼ばれる。
L1−NH2(6−8−CAGCTTGGACACCACGTCATAC、6=LH193、8=PCスペーサー)は、DNA技術、Aarhus、デンマークから得られた。PCスペーサーは、光で切断可能なリンカー(グレンリサーチ、生成物カタログ番号10−4913)である。BMPS(N−[β−マレイミドプロピルオキシ]コハク酸イミドエステル)は、Pierce(カタログ番号22298)から得られた。LH193(ジイソプロピル−ホスホルアミド酸2−シアノ−エチルエステル2−[2−(2−{2−[2−(2−{[(4−メトキシ−フェニル)−ジフェニル−メチル]−アミノ}−エトキシ)−エトキシ]−エトキシ}−エトキシ)−エトキシ]−エチルエステル)を次の方法に従って合成した:
100mMのホウ酸ナトリウムpH8.0の50μl中の、5ナノモルのL1−NH2、50mMのDMTMMおよび10mMのF5の混合物を、一晩中30℃でインキュベーションし、オリゴヌクレオチドタグ付加したF5から、ゲル濾過によって過剰の非結合F5を除去した。その後、負荷したオリゴを、スピード真空蒸留によって乾燥させ、100mMの水酸化ナトリウム50マイクロリットル中に再び懸濁し、F5の分子を脱保護(エステル切断およびN−アセトアミド切断)するために一晩中50℃で放置した。脱保護した後、懸濁液を塩酸で中和し、F5の負荷を質量分光測定分析によって確認した。F5のタグ付加を質量分光測定分析によって確認した。タグ付加した生成物は、L1−F5と呼ばれる。
DMTMM(4−(4,6−ジメトキシ−1,3,5−トリアジン−2−イル)−4−メチルモルホリニウム塩化物)を、Kaminskiら(JOC(1998),63,4248−55)に従って、市販で入手できるN−メチルモルホリンおよび2−クロロ−4,6−ジメトキシ−1,3,5−トリアジンから調製した。
F5(エステルおよびN−アセチル誘導体)を次の方法に従って合成した:
市販で入手できるテトラエチレングリコールを、収率67%で、4−ニトロベンゾイルクロリドを用いて、4−ニトロ安息香酸によって単一保護した。その後、残存した最初のアルコールの対応するカルボン酸への酸化を、TEMPO、亜塩素酸塩および次亜塩素酸塩の混合物を用いて、81%の収率で行った。化合物を、2−クロロトリチルクロリド樹脂に結合させ、その後MeOH−DMF(1:5)中のシアン化カリウムで処理し、4−ニトロベンゾイルエステルを脱保護した。N−(2−ニトロフェニルスルホニル)活性化したβアラニンメチルエステルを、ミツノブプロトコールを用いて結合した。4−ニトロフェニルスルホニル基を、過剰のメルカプトエタノール/DBUによる処理によって除去し、その後形成したアミンを、標準的なFmoc作用を用いて、二つの次の合成ブロックによってアシル化した。最終的な分子を、エーテル−DCM(1:4)中の0.4Mの塩酸による処理によって、樹脂から切断した。[M+H]+(計算上)=595.30。[M+H]+(実測)=595.28。
二本鎖のタグ付加したL1−cRGD(L1−cRGD−T1と呼ばれる)の形成:
200ピコモルのDNA鋳型、T1(GCTAGAGACGTGGTGGAGGAAGTCTTCCTAGAAGCTGGATATCACCACATCTCTAGCAGCTAGTATGACGTGGTGTCCAAGCTG)を、50ピコモルのL1−cRGDにアニーリングした。その後、L1−cRGDオリゴを、DNAポリメラーゼ(シークエナーゼ)によって伸長した。配列は、Upstate Biotechnologyから入手した(カタログ番号70775Y)。
二本鎖のタグ付加したL1−RGD、L1−RGD−T2と呼ばれる:
200ピコモルのT2(GCTAGAGACGTGGTGGAGGAAGTCTTCCTAGAAGCTGGATATCAGGTCTTCTGTCTTCTTCCGTATGACGTGGTGTCCAAGCTG)を、50ピコモルのL1−RGDにアニーリングした。その後、L1−RGDオリゴを、DNAポリメラーゼ(シークエナーゼ)によって上記したように伸長した。
二本鎖のL1−F5、L1−F5−T3と呼ばれる:
200ピコモルのT3(GCTAGAGACGTGGTGGAGGAAGTCTTCCTAGAAGCTGGATATCTTCAGTTCTCGACTCCTGAGTATGACGTGGTGTCCAAGCTG)を、50ピコモルのL1−F5にアニーリングした。その後、L1−F5オリゴを、DNAポリメラーゼ(シークエナーゼ)によって上記したように伸長した。
二本鎖のL1−NH2、L1−NH2−T4と呼ばれる:
50ピコモルのT4(GCTAGAGACGTGGTGGAGGAAGTCTTCCTAGAAGCTGGATATCTGACGTGTTGACGTACACAGTATGACGTGGTGTCCAAGCTG)を、200ピコモルのL1−NH2にアニーリングした。その後、L1−NH2オリゴを、DNAポリメラーゼ(シークエナーゼ)によって上記したように伸長した。
総計50ピコモルの、各々のライブラリーの成分、L1−cRGD−T1、L1−RGD−T2、L1−F5−T3およびL1−NH2−T4を生成した。
インテグリン結合複合体の濃縮を、0.04μg/ウェルのインテグリン受容体αVβ3をNunc免疫修飾分子U8マキシソープ(Biotecline カタログ番号Nun−47507)中で被覆することによって、行った。
ある実験において(図32)、L1−cRGD−T1、L1−RGD−T2、L1−F5−T3およびL1−NH2−T4を、100μlの緩衝剤A(トリス緩衝剤で処理した食塩水、0.05%のツゥイーン、20.1%の牛血清アルブミン、0.1mg/mLのニシンの精子のDNA)中に、L1−NH2−T4複合体1ピコモル、L1−cRGD−T1複合体1/1000000ピコモル、L1−RGD−T2複合体1/100000ピコモルおよびL1−F5−T3複合体1/10000ピコモルの比率で混合した。インテグリンで被覆したウェルのインキュベーションを、90分間25℃で行った。リガンドが結合した後、全てのウェルを250μLの緩衝剤Aで1時間20回洗浄した。その後、100μLの緩衝剤Aを各々のウェルに加え、PCスペーサーを切断し、それによってDNAの鋳型をリガンド分子から切断するために、ウェルを350ナノメーターの紫外線光に30秒間曝露した。紫外線光に曝露した後、溶出液体積を直ちに除去し、定量的ポリメラーゼ連鎖反応(Q−PCR)によって、DNA鎖T1、T2、T3およびT4の存在について分析した。
前もって混合した40.5μLを、各々のウェルに等分し、直接関連する上流のPCRプライマー(FPv2(CAGCTTGGACACCACGTCATAC)(標準曲線について)、または鋳型特異的プライマー、T1に特異的なP1(GTCATACTAGCTGCTAGAGATGTGGTGATA)、T2に特異的なP−2(CATACGGAAGAAGACAGAAGACCTGATA)、T3に特異的なP−3(TCATACTCAGGAGTCGAGAACTGAAGATA)またはT4に特異的なP−4(CATACTGTGTACGTCAACACGTCAGATA)のうち一つ;10ピコモル/μL)4.5μLおよび5μLの試料(ネガティブコントロールについてはウェル中に水)を加えた。
温度の周期変化/蛍光の測定を、Applied BiosystemsABIプリズム7900HTリアルタイム計器上で、周期変化するパラメーター:95℃で10分、95℃で15秒と64℃で1分を40周期を利用して行った。
図33は、L1−cRGD−T1、L1−RGD−T2およびL1−F5−T3それぞれの濃縮を示す。リガンドDNA複合体は異なったように濃縮される。これは、三つの分子の電離定数が異なるためにもっとも起こり得ることである。L1−cRGD−T1、L1−RGD−T2およびL1−F5−T3は、ウェルにおけるインキュベーション後、インテグリン受容体なしでは検出し得なかった。
Claims (160)
- ディスプレイ分子と、ディスプレイ分子の形成に関与している反応体を識別するタグを含む識別オリゴヌクレオチドとを含む二官能性複合体を得る方法であって、
a)化学反応部位とタグの酵素付加の促進部位とを、連続したヌクレオチドの配列の形態で含む発生期の二官能性複合体を提供する工程、
b)化学反応部位を一つまたはそれ以上の反応体と反応させる工程、および
c)促進部位を一つまたはそれ以上の反応体を識別する一つまたはそれ以上のタグと酵素的に反応させる工程を含み、
タグが、酵素的伸長反応を利用して、発生期の二官能性複合体の促進部位に結合し、伸長反応が、ポリメラーゼもしくはリガーゼ、またはその組み合わせにより行われ、そして
反応体および該反応体を識別するタグが、発生期の二官能性複合体の化学反応部位および促進部位との反応前には結合しないところの、方法。 - 発生期の二官能性複合体が、一周期またはそれより多くの化学反応部位での反応体反応および促進部位でのタグ付加に付される、請求項1記載の方法。
- 先の反応周期の反応生成物が、パラレル合成の後の各反応周期の化学反応部位としての機能を果たし、最後に結合したタグが、後の反応周期のさらなるタグの酵素付加を可能にする促進部位を提供する、請求項2記載の方法。
- 一つまたはそれ以上の反応体を化学反応部位と反応させ、個別のタグを促進部位と反応させることにより得られた二官能性複合体が、反応生成物および反応生成物の形成に関与している反応体を識別するタグを含む識別オリゴヌクレオチドを含むさらなる二官能性複合体を生成するために一つまたはそれ以上のさらなる反応体およびさらなる個別のタグと1回またはそれ以上さらに反応する、請求項1記載の方法。
- ディスプレイ分子が、一つ以上の反応体を化学反応部位と反応させることにより形成される、請求項1記載の方法。
- 二官能性複合体の識別オリゴヌクレオチドのタグの配列が、ディスプレイ分子の形成に関与している反応体の構造を解読するために用いられる、請求項1記載の方法。
- タグの順序が、ディスプレイ分子への反応体の結合の順序を決定する、請求項1記載の
方法。 - 単一反応周期において、一つの反応体が化学反応部位と反応する、請求項1記載の方法であって、該反応周期が反応体を識別するタグを促進部位と酵素的に反応させることをさらに含むところの、方法。
- 単一反応周期において、多数の反応体が化学反応部位と反応する、請求項1記載の方法であって、該反応周期が反応体を識別する個別のタグを促進部位と酵素的に反応させることをさらに含むところの、方法。
- 二官能性複合体が、タグの付加と同時に反応体を反応させることにより調製される、請求項1記載の方法。
- 二官能性複合体が、連続的なタグの付加および反応体の反応によって調製される、請求項1記載の方法。
- 化学反応部位での反応体の反応が、促進部位でのタグの付加の後に生じる、請求項1記載の方法。
- 促進部位でのタグの付加が、化学反応部位での反応体の反応の後に生じる、請求項1記載の方法。
- 化学反応部位が、単一の反応基を含む、請求項1記載の方法。
- 化学反応部位が、一つまたはそれ以上の反応基が結合している骨格を含む、請求項1記載の方法。
- 促進部位であって、骨格を識別するタグ「x」に結合した骨格「X」が提供され、反応体「A」が骨格「X」と反応し、該反応が「X」に結合している「A」をもたらし、タグ「a」が骨格タグ「x」に付加する、請求項15記載の方法。
- 骨格が、ベンゾジアゼピン、ステロイド、ヒダントイン、ピペラジン、ジケトピペラジン、モルホリン、トロパン、クマリン、キノリン、インドール、フラン、ピロール、オキサゾール、アミノ酸前駆体およびチアゾールから選択される、請求項15記載の方法。
- 化学反応部位が、一つまたはそれ以上の反応体と反応できる複数の反応基を含む、請求項1記載の方法。
- 反応体が、化学反応部位と反応する一つ、二つまたはそれ以上の反応基を含む化学構造を含む、請求項1記載の方法。
- 一つまたはそれ以上の反応基が、ヒドロキシル基、カルボン酸基、チオール基、イソシアン酸基、アミン基、エステル基およびチオエステル基からなる群より選択される、請求項19記載の方法。
- 反応体が、反応基または活性化可能な反応基前駆体を含む、請求項1記載の方法。
- 反応体および化学反応部位の反応が、反応体および化学反応部位の間の結合を媒介するさらなる反応体の存在下で起こる、請求項1記載の方法。
- 反応体が、ディスプレイ分子に組み込まれた構造エンティティの前駆体である、請求項1記載の方法。
- 反応体の反応基の数が1〜10である、請求項1記載の方法。
- 反応基がアミノ基を含む、請求項24記載の方法。
- 一つまたはそれ以上の反応基がカルボン酸を含む、請求項24記載の方法。
- 一つまたはそれ以上の反応基がチオ基を含む、請求項24記載の方法。
- 一つまたはそれ以上の反応基がアルデヒドを含む、請求項24記載の方法。
- 一つまたはそれ以上の反応基がヒドロキシル基を含む、請求項24記載の方法。
- 一つの反応基のみを特徴づける反応体が、ポリマーまたは骨格の末端の位置において用いられる、請求項1ないし4のいずれか1項に記載の方法。
- 二つの反応基を有する反応体が、さらに反応可能なポリマーまたは骨格の中心部分の形成に用いられる、請求項1ないし4のいずれか1項に記載の方法。
- 二つまたはそれ以上の反応基が、中心構造の形態の骨格上に存在し、異なる反応体と反応して、異なる骨格のディスプレイ分子を生じる、請求項1記載の方法。
- 骨格と反応する反応体が、骨格との結合を形成することができる一つ、二つまたはいくつかの反応基を含む、請求項32記載の方法。
- 発生期の二官能性複合体が、化学反応部位および促進部位を結合するリンカー部分をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 発生期の二官能性複合体のリンカー部分が、化学反応部位の識別に関連する情報を含む、請求項34記載の方法。
- リンカー部分が、相補的オリゴヌクレオチドをハイブリダイズしうる核酸配列である、請求項34記載の方法。
- リンカー部分が、選択的に切断できるリンカーを含むスペーサーによって化学反応部位に結合する、請求項34記載の方法。
- 選択的に切断できるリンカーが切断され、ディスプレイ分子が、最終二官能性複合体の形成の後に二官能性複合体の識別オリゴヌクレオチドから切断される、請求項37記載の方法。
- 選択的に切断できるリンカーが電磁放射によって切断される、請求項37記載の方法。
- 二官能性複合体が、電磁波によって切断されうる選択的に切断できるリンカーを含み、該二官能性複合体が、
R3はHまたはOCH3であり;および
XはOまたはNHである]
からなる群より選択される、請求項1記載の方法。 - 二官能性複合体が、UV照射によって切断されうる選択的に切断できるリンカーを含み、該二官能性複合体が、式:
を有する、請求項1記載の方法。 - R1がディスプレイ分子であり、R2がディスプレイ分子の形成に関与している反応体を識別するタグを含む識別オリゴヌクレオチドである、請求項41記載の方法。
- 二官能性複合体が、化学物質によって切断されうる選択的に切断できるリンカーを含み、該二官能性複合体が、式:
R3、R4、R5およびR6は、H、CN、F、NO2またはSO2NR2から選択される]
を有する、請求項1記載の方法。 - 選択的に切断できるリンカーがジスルフィドリンカーである、請求項37記載の方法。
- 選択的に切断できるリンカーがプロテアーゼによって切断される、請求項37記載の方法。
- 識別オリゴヌクレオチドが、三つ、四つ、五つ、またはそれ以上のタグを含む、請求項1記載の方法。
- 促進部位が、一つ、二つ、またはそれ以上のヌクレオチドを含み、それに相補的なオリゴヌクレオチドがハイブリダイズしうる、請求項1記載の方法。
- 促進部位が、ヌクレオチドの3’−OHまたは5’−リン酸基を含む、請求項47記載の方法。
- 少なくとも一つの識別タグが酵素触媒反応によって結合され、さらなるタグが化学反応または酵素反応を用いて結合されうる、請求項1記載の方法。
- さらなるタグが、直鎖または分岐した識別オリゴヌクレオチドを生成するために先のタグに結合される、請求項2ないし4のいずれか1項に記載の方法。
- 識別オリゴヌクレオチドのすべてのタグが、酵素触媒反応を用いて結合される、請求項50記載の方法。
- タグが独特のタグである、請求項50または51記載の方法。
- 二官能性複合体の識別オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドおよび反応体の間の反応を減少させるために二本鎖オリゴヌクレオチドを含む、請求項1記載の方法。
- 二官能性複合体の識別オリゴヌクレオチドが増幅可能である、請求項1記載の方法。
- 識別オリゴヌクレオチドのヌクレオチドが、DNAおよびRNAから選択される、請求項1記載の方法。
- 識別オリゴヌクレオチドのヌクレオチドが、核酸塩基部分および主鎖の単位からなり、該主鎖の単位が、糖の部分およびヌクレオシド間のリンカーからなる、請求項1記載の方法。
- 識別オリゴヌクレオチド部分のヌクレオチドの核酸塩基が、自然に生じる核酸塩基および自然に生じない核酸塩基から選択される、請求項56記載の方法。
- 核酸塩基が、プリンヘテロ環、ピリミジンヘテロ環およびヘテロ環類似物およびそれらの互変異性体からなる群より選択される、請求項57記載の方法。
- 核酸塩基が、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシル、プリン、キサンチン、ジアミノプリン、8−オキソ−N6−メチルアデニン、7−デアザグアニン、N4,N4−エタノシトシン、N6,N6−エタノ−2,6−ジアミノプリン、5−メチルシトシン、5−(C3−C6)−アルキニルシトシン、5−フルオロウラシル、5−ブロモウラシル、シュードイソシトシン、2−ヒドロキシ−5−メチル−4−トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、およびイノシンからなる群より選択される、請求項58記載の方法。
- 核酸塩基が、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、5−メチルシトシンおよびウラシルからなる群より選択される、請求項58記載の方法。
- 識別オリゴヌクレオチドの主鎖の単位が、
からなる群より選択される、請求項56記載の方法。 - 主鎖の単位の糖の部分が、ペントースである、請求項56記載の方法。
- ペントースが、リボース、2’−デオキシリボース、2’−O−メチルリボース、2’−フルオロ−リボース、および2’−4’−O−メチレンリボース(LNA)からなる群より選択される、請求項62記載の方法。
- ヌクレオチドの核酸塩基が、ペントースの1’位に結合する、請求項62および63のいずれか1項に記載の方法。
- 識別オリゴヌクレオチドの二つの隣接ヌクレオチドを結合するヌクレオシド間のリンカーが、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、メチルホスホン酸結合、ホスホルアミダイト結合、ホスホトリエステル結合およびホスホジチオエート結合からなる群より選択される、請求項56記載の方法。
- 識別オリゴヌクレオチドが、ホスホジエステル結合を介して結合するDNAおよびRNAファミリーの自然に生じるヌクレオシドを含む、請求項56記載の方法。
- デオキシヌクレオシドが、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンおよびデオキシシチジンから選択され、ヌクレオシドが、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジンおよびイノシンから選択される、請求項66記載の方法。
- 各々のタグが異なる反応体をコード化し、ディスプレイ分子の構造が、異なる結合性、立体障害および直交保護基の脱保護を考慮して推測される、請求項2ないし4のいずれか1項に記載の方法。
- 同一のタグが、親油性、分子量および結合性からなる群より選択される共通の性質を共有する反応体の群に用いられる、請求項2ないし4のいずれか1項に記載の方法。
- 各々のタグが独特である、請求項2ないし4のいずれか1項に記載の方法。
- いくつかの異なるタグが、同一の反応体に用いられる、請求項2ないし4のいずれか1項に記載の方法。
- 同一の反応体を識別する二つまたはそれ以上のタグが、該反応体の反応に用いられる異なる反応条件の情報をさらに保有する、請求項2ないし4のいずれか1項に記載の方法。
- 単一のタグが、二つまたはそれ以上の反応体を特定する、請求項2ないし4のいずれか1項に記載の方法。
- 個別のタグが、単一のヌクレオチドのみによって互いを区別する、請求項2ないし4のいずれか1項に記載の方法。
- 二つまたはそれより多くの違いが、一つのタグと他のあらゆるタグとを区別する、請求項2ないし4のいずれか1項に記載の方法。
- タグの長さが5個のヌクレオチドであり、任意の二つのタグの間の二つまたはそれより多くの違いが見られるものとして100以上のヌクレオチドの組み合わせが存在する、請求項2ないし4のいずれか1項に記載の方法。
- タグが、2〜100個のヌクレオチドを有する、請求項2ないし4のいずれか1項に記載の方法。
- タグが3〜50個のヌクレオチドを有する、請求項77記載の方法。
- タグが4〜20個のヌクレオチドを有する、請求項77記載の方法。
- タグが5〜15個のヌクレオチドを有する、請求項77記載の方法。
- 各々のタグが、1〜20個のヌクレオチドの結合領域によって隔てられる、請求項2ないし4のいずれか1項に記載の方法。
- 各々のタグが、識別オリゴヌクレオチド中のタグの位置を識別する、請求項81記載の方法。
- 結合領域が、同族の核酸塩基に対する3つの水素結合を形成する一つまたはそれ以上の核酸塩基を含む、請求項81および82のいずれか1項に記載の方法。
- 該核酸塩基がグアニンおよびシトシンである、請求項83記載の方法。
- 結合領域が、リボースの部分の2’−O−メチル置換、リボースの部分の2’−4’O−メチレン環状化(閉鎖核酸;LNA)、およびペプチド核酸(PNA)からなる群より選択される主鎖の修飾を有する、請求項82および83のいずれか1項に記載の方法。
- 二つまたはそれ以上の反応体が化学反応部位と反応し、識別オリゴヌクレオチドのタグが結合領域によって隔てられる、請求項2ないし4のいずれか1項に記載の方法。
- 結合領域が、ポリメラーゼおよびリガーゼから選択される酵素によって認識される基質である、請求項86記載の方法。
- 各々のタグが、反応体を識別するヌクレオチドおよび反応体の合成歴を識別するフレーム配列を含む、請求項2ないし4のいずれか1項に記載の方法。
- タグが、二官能性複合体の検出を可能にする蛍光物質または放射活性基などのシグナル基を含むフランキング領域をさらに含む、請求項2ないし4のいずれか1項に記載の方法。
- フランキング領域が、ビオチンなどの検出可能な標識を含む、請求項89記載の方法。
- フランキング領域が、PCR増幅のための促進部位を含む、請求項89記載の方法。
- ディスプレイ分子が、二つまたはそれ以上の反応体の反応生成物である、請求項1記載の方法。
- ディスプレイ分子が、一つ以上の反応体および二官能性複合体の化学反応部位の最終生成物である、請求項1記載の方法。
- ディスプレイ分子が、1000Daより小さい分子量を有する非ポリマー性分子である、請求項1記載の方法。
- ディスプレイ分子が、1000Daより大きい分子量を有する非ポリマー性分子である、請求項1記載の方法。
- ディスプレイ分子がポリマー性分子である、請求項1記載の方法。
- 最初の反応体が化学反応部位との反応で中間生成物を形成し、第二の反応体が中間生成物と反応してディスプレイ分子またはその前駆体を得る、請求項2ないし4のいずれか1項に記載の方法。
- 二つまたはそれ以上の反応体が互いに反応して中間生成物を形成し、化学反応部位が該中間生成物と反応して、ディスプレイ分子またはその前駆体を得る、請求項1記載の方法。
- 反応体を識別するタグを含む識別オリゴヌクレオチドが、プライマーが識別オリゴヌクレオチドの3’末端にアニールし、ポリメラーゼを利用して伸長する伸長反応によって二本鎖識別オリゴヌクレオチドに変形される、請求項1記載の方法。
- 伸長反応が、プライマーとしてアンチタグオリゴヌクレオチドを利用する、請求項99記載の方法。
- ポリメラーゼによって用いられる基質が、dATP、dGTP、dTTP、dCTP、rATP、rGTP、rTTP、rCTPおよびrUTPからなる群より選択されるヌクレオチド三リン酸の混合物である、請求項99記載の方法。
- 反応体を識別するアンチタグオリゴヌクレオチドの一本鎖の突出部を発生期の二官能性複合体の識別オリゴヌクレオチドの3’末端にアニーリングするさらなる工程を含む、請求項1記載の方法。
- アンチタグが、発生期の二官能性複合体の識別オリゴヌクレオチドを転写し、二本鎖識別オリゴヌクレオチドを生成するためにプライマーとして用いられ、該転写がポリメラーゼおよびdNTPの混合物を利用する、請求項102記載の方法。
- ポリメラーゼが、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、逆転写酵素、DNAリガーゼ、RNAリガーゼ、TaqDNAポリメラーゼ、Pfuポリメラーゼ、Ventポリメラーゼ、HIV−1逆転写酵素、クレノウ断片から選択される、請求項99ないし103のいずれか1項に記載の方法。
- ポリメラーゼがミスマッチ伸長を可能にするポリメラーゼから選択される、請求項99ないし103のいずれか1項に記載の方法。
- ポリメラーゼが、DNAポリメラーゼηおよびDNAポリメラーゼιからなる群より選択される、請求項105記載の方法。
- 促進部位へのタグの酵素的付加に用いられる酵素がリガーゼである、請求項1記載の方法。
- リガーゼの基質が、二つまたはそれ以上のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである、請求項107記載の方法。
- リガーゼが一本鎖のライゲーションを媒介し、オリゴヌクレオチドタグが発生期の二官能性分子にライゲーションされる、請求項107記載の方法。
- 一本鎖のライゲーションが、促進部位およびオリゴヌクレオチドタグから選択される一つ目の核酸の3’−OH基を、促進部位およびオリゴヌクレオチドタグから選択される二つ目の核酸の5’−リン酸基にライゲートすることにより行われ、ただし、二つの核酸がライゲーション可能な異なる反応基を保有するところの、請求項109記載の方法。
- リガーゼが、二本鎖のライゲーションを媒介し、発生期の二官能性複合体の促進部位が、オリゴヌクレオチドタグへのライゲーションの前に相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする、請求項107記載の方法。
- 二本鎖のライゲーションが、一つ目および二つ目の核酸の3’末端の部分および5’末端の部分に相補的な三番目のオリゴヌクレオチドの存在下で生じ、該一つ目および二つ目の核酸が、促進部位およびオリゴヌクレオチドタグから選択される、請求項107記載の方法。
- 酵素が、TaqDNAリガーゼ、T4DNAリガーゼ、T7DNAリガーゼおよびイー・コリDNAリガーゼからなる群より選択される、請求項107記載の方法。
- ライゲーションされる二本鎖オリゴヌクレオチドが平滑末端を有し、T4RNAリガーゼが該平滑末端をライゲーションするために用いられる、請求項111および112のいずれか1項に記載の方法。
- ライゲーションされる二本鎖オリゴヌクレオチドが付着末端を有し、TaqDNAリガーゼが該付着末端をライゲーションするために用いられる、請求項111および112のいずれか1項に記載の方法。
- ハイブリダイズされた相補的なオリゴヌクレオチドのポリメラーゼ転写およびライゲーション結合の組み合わせが、二本鎖識別オリゴヌクレオチドを生成するために用いられる、請求項107記載の方法。
- 他の二本鎖識別オリゴヌクレオチド中のギャップが、最初にポリメラーゼによって補充され、次いで、リガーゼによって上流オリゴヌクレオチドにライゲーションされて、完全な二本鎖の識別オリゴヌクレオチドを生成する、請求項116記載の方法。
- 酵素反応が水性溶媒中で行われ、反応体および化学反応部位の間の少なくともいくつかの反応が有機溶媒中で行われる、請求項2ないし4のいずれか1項に記載の方法。
- 酵素反応が最初に水性溶媒中で行われ、次いで、反応混合物が凍結乾燥され、次いで、反応生成物が、化学反応部位での反応の前に異なる溶媒中で溶解または分散される、請求項118記載の方法。
- 凍結乾燥ステップが該方法には含まれず、適切な反応条件が、溶媒を水性溶媒に加えることによって得られる、請求項119記載の方法。
- 加えられた溶媒が水性溶媒と混和可能であり、溶媒の添加が均質な反応溶媒を生成する、請求項120記載の方法。
- 加えられた溶媒が水性溶媒と混和不可能であり、溶媒の添加が二相性反応溶媒を生成する、請求項121記載の方法。
- 保護基が、発生期の二官能性複合体の識別オリゴヌクレオチドまたはディスプレイ分子を保護するために用いられない、請求項1記載の方法。
- 発生期の二官能性複合体のディスプレイ分子が保護基によって保護される、請求項1記載の方法。
- 化学反応部位の反応基が、最初に活性化可能な前駆体中に存在し、活性化可能な前駆体の反応基が、反応体との反応前に活性化される、請求項1記載の方法。
- 活性化可能な前駆体の反応基が、反応体との反応を阻害する基で保護される、請求項125記載の方法。
- 異なる二官能性複合体のライブラリーを生成する方法であって、請求項1ないし126のいずれか1項に記載の方法によって異なる二官能性複合体を合成する工程を含み、該ライブラリーの各々の異なる二官能性複合体が、ディスプレイ分子と、個別のディスプレイ分子の形成に関与している反応体を識別するタグを含む識別オリゴヌクレオチドとを含む、方法。
- d)化学反応部位と、タグの酵素的付加の促進部位とを、連続したヌクレオチドの配列の形態で各々含む発生期の二官能性複合体を分離した反応画分に提供する工程、
e)発生期の二官能性複合体の化学反応部位と、該反応画分に提供された一つまたはそれ以上の反応体との間の反応を各々の反応画分で行う工程、および
f)該一つまたはそれ以上の反応体を識別する、該反応画分に提供された一つまたはそれ以上の個別のタグを各々の反応画分中の発生期の二官能性複合体の促進部位に付加する工程をさらに含む請求項127記載の方法であって、工程e)およびf)があらゆる順序で起こりうる、方法。 - 各分離した反応画分中に提供された発生期の二官能性複合体が同一である、請求項128記載の方法。
- 各分離した反応画分中に提供された発生期の二官能性複合体が異なる、請求項128記載の方法。
- 発生期の二官能性複合体が化学反応部位で異なり、発生期の二官能性複合体のいずれも、化学反応部位の構造を識別するタグを含む、請求項126記載の方法。
- 各分離した反応画分において適用される反応体が同一である、請求項128ないし131のいずれか1項に記載の方法。
- 各分離した反応画分において適用される反応体が異なる、請求項128ないし131のいずれか1項に記載の方法。
- 各分離した反応画分中の反応条件が同一である、請求項128ないし133のいずれか1項に記載の方法。
- 各分離した反応画分中の反応条件が異なる、請求項128ないし133のいずれか1項に記載の方法。
- 発生期の二官能性複合体が、単一の反応体より多く反応する、請求項128ないし135のいずれか1項に記載の方法。
- 二つまたはそれ以上の反応画分が、二官能性複合体の各反応画分での形成の後に一緒にプールされ、その後、新しい周期の反応のためのさらなる反応画分の配列にスプリットされる、請求項128ないし136のいずれか1項に記載の方法。
- 1周期以上の二官能性複合体合成を含む請求項137記載の方法であって、先行する合成周期の反応生成物が、ディスプレイ分子と、個別のディスプレイ分子の形成に関与している反応体を識別するタグを含む識別オリゴヌクレオチドとを各々含む異なる二官能性複合体のライブラリーを得るために後の合成周期において発生期の二官能性複合体として用いられるところの、方法。
- 分離した反応画分が一緒に合され、各合成の周期間のさらなる反応画分中にスプリットされる、請求項138記載の方法。
- 二つまたはそれ以上の反応体反応が、タグが促進部位に付加する前に起こる、請求項138記載の方法。
- 二官能性複合体の合成の最終周期が、促進部位を含むオリゴヌクレオチドの組み込みを含む、請求項138記載の方法。
- ライブラリーが103〜106個の異なる二官能性複合体を含有する、請求項127記載の方法。
- ライブラリーが103〜108個の異なる二官能性複合体を含有する、請求項127記載の方法。
- ライブラリーが103〜1010個の異なる二官能性複合体を含有する、請求項127記載の方法。
- ライブラリーが105〜106個の異なる二官能性複合体を含有する、請求項127記載の方法。
- ライブラリーが105〜108個の異なる二官能性複合体を含有する、請求項127記載の方法。
- ライブラリーが105〜1010個の異なる二官能性複合体を含有する、請求項127記載の方法。
- 所定の特性を有するディスプレイ分子を識別する方法であって、
a)請求項127ないし147のいずれか1項に記載の方法によって異なる二官能性複合体のライブラリーを生成し、該ライブラリーの各々の異なる二官能性複合体が、ディスプレイ分子と、個別のディスプレイ分子の形成に関与している反応体を識別するタグを含む識別オリゴヌクレオチドとを含む工程、
b)工程a)で得られたライブラリーを、該所定の特性を有する一つまたはそれ以上のディスプレイ分子を、ライブラリーの残りから分離する選別条件に付す工程、および
c)分離された一つまたはそれ以上の二官能性複合体の識別オリゴヌクレオチドを解読することによって該所定の特性を有する一つまたはそれ以上のディスプレイ分子を識別する工程を含む、方法。 - 選別条件が、二官能性複合体のライブラリーを標的に接触させる工程に関与し、標的に対する親和性を有する二官能性複合体が、標的に対する親和性を有する二官能性複合体から非結合二官能性複合体を除去し、その後、該標的に対する親和性を有する二官能性複合体をよりストリンジェントな選別条件下で溶出することによってライブラリーの残りから分離される、請求項148記載の方法。
- 分離された二官能性複合体の識別オリゴヌクレオチドが、非結合二官能性複合体の除去の後にディスプレイ分子から切断される、請求項148および149のいずれか1項に記載の方法。
- 分離された二官能性複合体の識別オリゴヌクレオチドが、個別のディスプレイ分子を識別するために回収され、そして、解読される、請求項150記載の方法。
- 特定の標的に対する単一周期の選別に次いで、選別された二官能性複合体の変異体の増幅が行われる、請求項148ないし151のいずれか1項に記載の方法。
- 選別された二官能性複合体の変異体が別々にアッセイで検査される、請求項152記載の方法。
- 特定の標的に対するより多くの選別周期に次いで、選別された二官能性複合体の変異体の増幅が行われる、請求項148ないし151のいずれか1項に記載の方法。
- いくつか選別周期がより厳密性を高めた条件を用いる、請求項154記載の方法。
- 選別された複合体の増幅が各々の選別工程の間で行われる、請求項154および155のいずれか1項に記載の方法。
- 識別オリゴヌクレオチドのタグが、PCRおよび二つの独特の切断部位を生成するプライマーを用いて増幅される、請求項152ないし156のいずれか1項に記載の方法。
- 切断部位が、シークエンスするために識別オリゴヌクレオチドのタグを適当なベクターにクローン化することによってタグの多量体形成に用いられる、請求項157記載の方法。
- 増幅から生じるPCR産物が、TAクローニングを用いて適当なベクターに直接クローン化される、請求項157記載の方法。
- 増幅から生じるPCR産物が、ディスプレイ分子を識別するためにマイクロアレーに導入される、請求項157記載の方法。
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