JPH08268A - 連結した２本鎖ｄｎａの製造方法 - Google Patents
連結した２本鎖ｄｎａの製造方法Info
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- JPH08268A JPH08268A JP6134670A JP13467094A JPH08268A JP H08268 A JPH08268 A JP H08268A JP 6134670 A JP6134670 A JP 6134670A JP 13467094 A JP13467094 A JP 13467094A JP H08268 A JPH08268 A JP H08268A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 制限酵素による切断部位の配列による制限が
少ないか、無く、粘着末端の配列及び塩基数を自由に選
んで、自由かつ容易かつ特異的にＤＮＡ断片の結合が可
能な連結した２本鎖ＤＮＡを製造する方法の提供。 【構成】 少なくとも一方のプライマーＤＮＡとして、
リボヌクレオチド基を含み、該リボヌクレオチド基の
３’側の配列がテンプレートＤＮＡのプラス鎖又はマイ
ナス鎖の被増幅領域の端部の少なくとも一部の配列と相
補的であり、前記リボヌクレオチド基の５’側の配列が
粘着末端形成用の配列であるプライマーを用いて、ポリ
メラーゼ連鎖反応により２本鎖ＤＮＡ断片を増幅合成
し、さらにＲＮＡ分解酵素処理又はアルカリ処理し、リ
ン酸化処理して得られた粘着末端を有する２本鎖ＤＮＡ
断片を、該２本鎖ＤＮＡ断片の粘着末端と相補関係にあ
る粘着末端を有する２本鎖ＤＮＡ断片とＤＮＡリガーゼ
で連結する連結した２本鎖ＤＮＡの製造方法。
少ないか、無く、粘着末端の配列及び塩基数を自由に選
んで、自由かつ容易かつ特異的にＤＮＡ断片の結合が可
能な連結した２本鎖ＤＮＡを製造する方法の提供。 【構成】 少なくとも一方のプライマーＤＮＡとして、
リボヌクレオチド基を含み、該リボヌクレオチド基の
３’側の配列がテンプレートＤＮＡのプラス鎖又はマイ
ナス鎖の被増幅領域の端部の少なくとも一部の配列と相
補的であり、前記リボヌクレオチド基の５’側の配列が
粘着末端形成用の配列であるプライマーを用いて、ポリ
メラーゼ連鎖反応により２本鎖ＤＮＡ断片を増幅合成
し、さらにＲＮＡ分解酵素処理又はアルカリ処理し、リ
ン酸化処理して得られた粘着末端を有する２本鎖ＤＮＡ
断片を、該２本鎖ＤＮＡ断片の粘着末端と相補関係にあ
る粘着末端を有する２本鎖ＤＮＡ断片とＤＮＡリガーゼ
で連結する連結した２本鎖ＤＮＡの製造方法。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、連結した２本鎖ＤＮＡ
の製造方法に関する。さらに詳しくは、制限酵素を用い
ることなく、ＰＣＲ法（ポリメラーゼ連鎖反応）を利用
して粘着末端を形成し、次いで、２本鎖ＤＮＡ断片を連
結する、連結した２本鎖ＤＮＡの製造方法に関する。
の製造方法に関する。さらに詳しくは、制限酵素を用い
ることなく、ＰＣＲ法（ポリメラーゼ連鎖反応）を利用
して粘着末端を形成し、次いで、２本鎖ＤＮＡ断片を連
結する、連結した２本鎖ＤＮＡの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子工学において、２つの２本鎖ＤＮ
Ａ断片を連結する技術として、２つの２本鎖ＤＮＡ断片
の連結しようとする末端を相補関係にある粘着末端と
し、次いでＤＮＡリガーゼを作用させることはよく知ら
れたことである。そして、一般には、粘着末端の作製に
は、制限酵素を利用する。
Ａ断片を連結する技術として、２つの２本鎖ＤＮＡ断片
の連結しようとする末端を相補関係にある粘着末端と
し、次いでＤＮＡリガーゼを作用させることはよく知ら
れたことである。そして、一般には、粘着末端の作製に
は、制限酵素を利用する。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】ところが、制限酵素を
利用した粘着末端を有する２本鎖ＤＮＡ断片の作製に
は、制限酵素の認識部位によって、切断される位置が制
限される。また、場合によっては、本来切断したくない
部位まで切断される可能性もある。さらに制限酵素によ
り得られる粘着末端の塩基数は、高々４つ（稀に５つ）
である。ところが、塩基数の少ない粘着末端では不安定
な再結合しか得られない。一方、所望の２本鎖ＤＮＡ断
片の粘着末端同志のみを結合させて副産物を排除するに
は、高温における再結合が有利である。ところが、粘着
末端の塩基数が少ないと再結合が不安定になり、高温に
おける再結合は実質的に不可能である。
利用した粘着末端を有する２本鎖ＤＮＡ断片の作製に
は、制限酵素の認識部位によって、切断される位置が制
限される。また、場合によっては、本来切断したくない
部位まで切断される可能性もある。さらに制限酵素によ
り得られる粘着末端の塩基数は、高々４つ（稀に５つ）
である。ところが、塩基数の少ない粘着末端では不安定
な再結合しか得られない。一方、所望の２本鎖ＤＮＡ断
片の粘着末端同志のみを結合させて副産物を排除するに
は、高温における再結合が有利である。ところが、粘着
末端の塩基数が少ないと再結合が不安定になり、高温に
おける再結合は実質的に不可能である。
【０００４】そこで、本発明の第１の目的は、制限酵素
による切断部位の配列による制限が少なく、粘着末端の
配列及び粘着末端の塩基数を比較的自由に選んで、従来
より自由かつ容易かつ特異的にＤＮＡ断片の結合が可能
な、連結した２本鎖ＤＮＡの製造方法を提供することに
ある。
による切断部位の配列による制限が少なく、粘着末端の
配列及び粘着末端の塩基数を比較的自由に選んで、従来
より自由かつ容易かつ特異的にＤＮＡ断片の結合が可能
な、連結した２本鎖ＤＮＡの製造方法を提供することに
ある。
【０００５】さらに、本発明の第２の目的は、制限酵素
を用いることなく、従って、粘着末端の配列を自由に選
べ、かつ粘着末端の塩基数も自由に選べて、安定な再結
合が可能であり、かつ特異的に高収率で所望の２本鎖Ｄ
ＮＡ断片を連結させることが可能な、連結した２本鎖Ｄ
ＮＡの製造方法を提供することにある。即ち、本発明の
目的は、ＲＲＲ（Restrictoin enzyme-nondependent Re
combination & rearrangement)法を提供することであ
る。
を用いることなく、従って、粘着末端の配列を自由に選
べ、かつ粘着末端の塩基数も自由に選べて、安定な再結
合が可能であり、かつ特異的に高収率で所望の２本鎖Ｄ
ＮＡ断片を連結させることが可能な、連結した２本鎖Ｄ
ＮＡの製造方法を提供することにある。即ち、本発明の
目的は、ＲＲＲ（Restrictoin enzyme-nondependent Re
combination & rearrangement)法を提供することであ
る。
【０００６】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明は、
（１）少なくとも一方のプライマーＤＮＡとして、リボ
ヌクレオチド基を含み、該リボヌクレオチド基の３’側
の配列がテンプレートＤＮＡのプラス鎖又はマイナス鎖
の被増幅領域の端部の少なくとも一部の配列と相補的で
あり、前記リボヌクレオチド基の５’側の配列が粘着末
端形成用の配列であるプライマー（Ａ）を用いてポリメ
ラーゼ連鎖反応により、プラス鎖及びマイナス鎖の少な
くとも一方の５’末端近傍にリボヌクレオチド基を含
み、かつテンプレートＤＮＡの被増幅領域に相当するＤ
ＮＡ配列を含む２本鎖ＤＮＡ断片を増幅合成する工程、
（２）前記工程（１）で合成された２本鎖ＤＮＡ断片を
ＲＮＡ分解酵素処理又はアルカリ処理して、リボヌクレ
オチド基及び該リボヌクレオチド基から５’側のＤＮＡ
配列を除去して、少なくとも一方が粘着末端である２本
鎖ＤＮＡ断片を製造する工程、（３）前記工程（２）で
得られた粘着末端を有する２本鎖ＤＮＡ断片をリン酸化
処理する工程、及び（４）前記工程（３）でリン酸化処
理して得られた粘着末端を有する２本鎖ＤＮＡ断片と、
該粘着末端と相補関係にある粘着末端を有する２本鎖Ｄ
ＮＡ断片とをＤＮＡリガーゼにより連結することを含む
連結した２本鎖ＤＮＡの製造方法（第１の製造方法）に
関する。
（１）少なくとも一方のプライマーＤＮＡとして、リボ
ヌクレオチド基を含み、該リボヌクレオチド基の３’側
の配列がテンプレートＤＮＡのプラス鎖又はマイナス鎖
の被増幅領域の端部の少なくとも一部の配列と相補的で
あり、前記リボヌクレオチド基の５’側の配列が粘着末
端形成用の配列であるプライマー（Ａ）を用いてポリメ
ラーゼ連鎖反応により、プラス鎖及びマイナス鎖の少な
くとも一方の５’末端近傍にリボヌクレオチド基を含
み、かつテンプレートＤＮＡの被増幅領域に相当するＤ
ＮＡ配列を含む２本鎖ＤＮＡ断片を増幅合成する工程、
（２）前記工程（１）で合成された２本鎖ＤＮＡ断片を
ＲＮＡ分解酵素処理又はアルカリ処理して、リボヌクレ
オチド基及び該リボヌクレオチド基から５’側のＤＮＡ
配列を除去して、少なくとも一方が粘着末端である２本
鎖ＤＮＡ断片を製造する工程、（３）前記工程（２）で
得られた粘着末端を有する２本鎖ＤＮＡ断片をリン酸化
処理する工程、及び（４）前記工程（３）でリン酸化処
理して得られた粘着末端を有する２本鎖ＤＮＡ断片と、
該粘着末端と相補関係にある粘着末端を有する２本鎖Ｄ
ＮＡ断片とをＤＮＡリガーゼにより連結することを含む
連結した２本鎖ＤＮＡの製造方法（第１の製造方法）に
関する。
【０００７】さらに本発明は、少なくとも１つのテンプ
レートＤＮＡ上の２種以上の被増幅領域に相当するＤＮ
Ａ配列を含む連結した２本鎖ＤＮＡを製造する方法であ
って、（１）プライマーとして、リボヌクレオチド基を
含み、該リボヌクレオチド基の３’側の配列がテンプレ
ートＤＮＡのプラス鎖又はマイナス鎖の被増幅領域の端
部の少なくとも一部の配列と相補的であり、前記リボヌ
クレオチド基の５’側の配列が粘着末端形成用の配列で
あるプライマー（Ａ） テンプレートＤＮＡのプラス鎖又はマイナス鎖の被増幅
領域の端部の少なくとも一部の配列と相補的であり、
３’末端がリボヌクレオチド基であるプライマー
（Ｂ）、及びテンプレートＤＮＡのプラス鎖又はマイナ
ス鎖の被増幅領域の端部の少なくとも一部の配列と相補
的であるプライマー（Ｃ）の３通りのプライマーＤＮＡ
を用い、連結した２本鎖ＤＮＡ断片の両端部を構成する
２本鎖ＤＮＡ断片の増幅合成にプライマー（Ａ）と
（Ｃ）との組合せ及びプライマー（Ｂ）と（Ｃ）との組
合せを用い、かつ被増幅領域が３つ以上の場合には、連
結した２本鎖ＤＮＡ断片の中間部を構成する２本鎖ＤＮ
Ａ断片の増幅合成にプライマー（Ａ）と（Ｂ）との組合
せの１種又は２種以上を用い、ポリメラーゼ連鎖反応に
より、プラス鎖及びマイナス鎖の一方の５’末端近傍に
リボヌクレオチド基を含み、かつテンプレートＤＮＡの
被増幅領域に相当するＤＮＡ配列を含む２種の２本鎖Ｄ
ＮＡ断片と、被増幅領域が３つ以上の場合には、プラス
鎖及びマイナス鎖の両方の５’末端近傍にリボヌクレオ
チド基を含み、かつテンプレートＤＮＡの被増幅領域に
相当するＤＮＡ配列を含む１種以上の２本鎖ＤＮＡ断片
とを増幅合成する工程、（２）前記工程（１）で増幅合
成された２本鎖ＤＮＡ断片をＲＮＡ分解酵素処理又はア
ルカリ処理して、リボヌクレオチド基及び該リボヌクレ
オチド基から５’側のＤＮＡ配列を除去して、一方又は
両方が粘着末端である２本鎖ＤＮＡ断片を製造する工
程、（３）前記工程（２）で得られた粘着末端を有する
２本鎖ＤＮＡ断片をリン酸化処理する工程、及び（４）
前記工程（３）でリン酸化処理して得られた粘着末端を
有する２種以上の２本鎖ＤＮＡ断片同士をＤＮＡリガー
ゼにより連結することを含む連結した２本鎖ＤＮＡの製
造方法（第２の製造方法）に関する。
レートＤＮＡ上の２種以上の被増幅領域に相当するＤＮ
Ａ配列を含む連結した２本鎖ＤＮＡを製造する方法であ
って、（１）プライマーとして、リボヌクレオチド基を
含み、該リボヌクレオチド基の３’側の配列がテンプレ
ートＤＮＡのプラス鎖又はマイナス鎖の被増幅領域の端
部の少なくとも一部の配列と相補的であり、前記リボヌ
クレオチド基の５’側の配列が粘着末端形成用の配列で
あるプライマー（Ａ） テンプレートＤＮＡのプラス鎖又はマイナス鎖の被増幅
領域の端部の少なくとも一部の配列と相補的であり、
３’末端がリボヌクレオチド基であるプライマー
（Ｂ）、及びテンプレートＤＮＡのプラス鎖又はマイナ
ス鎖の被増幅領域の端部の少なくとも一部の配列と相補
的であるプライマー（Ｃ）の３通りのプライマーＤＮＡ
を用い、連結した２本鎖ＤＮＡ断片の両端部を構成する
２本鎖ＤＮＡ断片の増幅合成にプライマー（Ａ）と
（Ｃ）との組合せ及びプライマー（Ｂ）と（Ｃ）との組
合せを用い、かつ被増幅領域が３つ以上の場合には、連
結した２本鎖ＤＮＡ断片の中間部を構成する２本鎖ＤＮ
Ａ断片の増幅合成にプライマー（Ａ）と（Ｂ）との組合
せの１種又は２種以上を用い、ポリメラーゼ連鎖反応に
より、プラス鎖及びマイナス鎖の一方の５’末端近傍に
リボヌクレオチド基を含み、かつテンプレートＤＮＡの
被増幅領域に相当するＤＮＡ配列を含む２種の２本鎖Ｄ
ＮＡ断片と、被増幅領域が３つ以上の場合には、プラス
鎖及びマイナス鎖の両方の５’末端近傍にリボヌクレオ
チド基を含み、かつテンプレートＤＮＡの被増幅領域に
相当するＤＮＡ配列を含む１種以上の２本鎖ＤＮＡ断片
とを増幅合成する工程、（２）前記工程（１）で増幅合
成された２本鎖ＤＮＡ断片をＲＮＡ分解酵素処理又はア
ルカリ処理して、リボヌクレオチド基及び該リボヌクレ
オチド基から５’側のＤＮＡ配列を除去して、一方又は
両方が粘着末端である２本鎖ＤＮＡ断片を製造する工
程、（３）前記工程（２）で得られた粘着末端を有する
２本鎖ＤＮＡ断片をリン酸化処理する工程、及び（４）
前記工程（３）でリン酸化処理して得られた粘着末端を
有する２種以上の２本鎖ＤＮＡ断片同士をＤＮＡリガー
ゼにより連結することを含む連結した２本鎖ＤＮＡの製
造方法（第２の製造方法）に関する。
【０００８】本発明の第１の製造方法について、図１及
び２により説明する。図１は、テンプレートＤＮＡか
ら、一方の末端が粘着末端である２本鎖ＤＮＡ断片Ａを
作成し、次いで２本鎖ＤＮＡ断片Ｂと連結することによ
り、連結した２本鎖ＤＮＡ（Ａ−Ｂ）を製造する方法を
示すスキームである。この場合、プライマーとしては、
リボヌクレオチド基を含み、該リボヌクレオチド基の
３’側の配列がテンプレートＤＮＡのプラス鎖又はマイ
ナス鎖の被増幅領域の５’側端部の配列と相補的であ
り、前記リボヌクレオチド基の５’側の配列が粘着末端
形成用の配列であるプライマー（Ａ）とテンプレートＤ
ＮＡのプラス鎖又はマイナス鎖の被増幅領域の５’側端
部の配列と相補的であるプライマー（Ｃ）とを用いる。
び２により説明する。図１は、テンプレートＤＮＡか
ら、一方の末端が粘着末端である２本鎖ＤＮＡ断片Ａを
作成し、次いで２本鎖ＤＮＡ断片Ｂと連結することによ
り、連結した２本鎖ＤＮＡ（Ａ−Ｂ）を製造する方法を
示すスキームである。この場合、プライマーとしては、
リボヌクレオチド基を含み、該リボヌクレオチド基の
３’側の配列がテンプレートＤＮＡのプラス鎖又はマイ
ナス鎖の被増幅領域の５’側端部の配列と相補的であ
り、前記リボヌクレオチド基の５’側の配列が粘着末端
形成用の配列であるプライマー（Ａ）とテンプレートＤ
ＮＡのプラス鎖又はマイナス鎖の被増幅領域の５’側端
部の配列と相補的であるプライマー（Ｃ）とを用いる。
【０００９】本発明の製造方法において用いるプライマ
ー（Ｃ）は、一般にプライマーとして使用されている、
テンプレートＤＮＡのプラス鎖又はマイナス鎖の被増幅
領域の５’側端部の配列と相補的配列を有するものであ
る。プライマー（Ｃ）は、例えば、化学合成法等により
合成されるそのまま使用することができる。プライマー
（Ｃ）は、プライマーの機能としての観点から、ＰＣＲ
によって製造されるべき２本鎖ＤＮＡ断片の末端部分を
構成するＤＮＡ配列を有するものであればよい。このプ
ライマー（Ｃ）は、テンプレートＤＮＡとの再結合性等
を考慮すると、例えば塩基数が８〜３０であることが適
当である。
ー（Ｃ）は、一般にプライマーとして使用されている、
テンプレートＤＮＡのプラス鎖又はマイナス鎖の被増幅
領域の５’側端部の配列と相補的配列を有するものであ
る。プライマー（Ｃ）は、例えば、化学合成法等により
合成されるそのまま使用することができる。プライマー
（Ｃ）は、プライマーの機能としての観点から、ＰＣＲ
によって製造されるべき２本鎖ＤＮＡ断片の末端部分を
構成するＤＮＡ配列を有するものであればよい。このプ
ライマー（Ｃ）は、テンプレートＤＮＡとの再結合性等
を考慮すると、例えば塩基数が８〜３０であることが適
当である。
【００１０】また、プライマー（Ａ）は、リボヌクレオ
チド基を含む。リボヌクレオチド基を含むことで、工程
（２）における処理により、粘着末端となる１本鎖ＤＮ
Ａ部を形成することができる。さらに、プライマー
（Ａ）のリボヌクレオチド基の３’側の配列はテンプレ
ートＤＮＡのプラス鎖又はマイナス鎖の被増幅領域の端
部の少なくとも一部の配列と相補的であり、ＰＣＲにお
いて被増幅領域と再結合してプライマーとして機能す
る。また、プライマー（Ａ）のリボヌクレオチド基の
５’側の配列は、粘着末端形成用の配列であり、後に連
結される２本鎖ＤＮＡ断片の粘着末端の配列と少なくと
も一部が同一である。ＰＣＲで増幅合成された２本鎖Ｄ
ＮＡ断片から、工程（２）においてリボヌクレオチド基
及びその５’側の配列が除去されることで、後に連結さ
れる２本鎖ＤＮＡ断片の粘着末端の配列と相補関係にあ
る粘着末端を有する２本鎖ＤＮＡ断片を得ることができ
る。
チド基を含む。リボヌクレオチド基を含むことで、工程
（２）における処理により、粘着末端となる１本鎖ＤＮ
Ａ部を形成することができる。さらに、プライマー
（Ａ）のリボヌクレオチド基の３’側の配列はテンプレ
ートＤＮＡのプラス鎖又はマイナス鎖の被増幅領域の端
部の少なくとも一部の配列と相補的であり、ＰＣＲにお
いて被増幅領域と再結合してプライマーとして機能す
る。また、プライマー（Ａ）のリボヌクレオチド基の
５’側の配列は、粘着末端形成用の配列であり、後に連
結される２本鎖ＤＮＡ断片の粘着末端の配列と少なくと
も一部が同一である。ＰＣＲで増幅合成された２本鎖Ｄ
ＮＡ断片から、工程（２）においてリボヌクレオチド基
及びその５’側の配列が除去されることで、後に連結さ
れる２本鎖ＤＮＡ断片の粘着末端の配列と相補関係にあ
る粘着末端を有する２本鎖ＤＮＡ断片を得ることができ
る。
【００１１】このようなプライマー（Ａ）及び第２の製
造方法で用いるプライマー（Ｂ）は、例えば特開平５−
２９２９６７号に記載のオリゴヌクレオチドの酵素的合
成法により製造することができる。図５に示すように、
まず、オリゴヌクレオチド（白丸の列）の３’側にリボ
ヌクレオチドを結合することで、ヘッドリボタイプのプ
ライマー（Ｂ）が得られる。さらに、センターリボタイ
プのプライマー（Ａ）は、５’側をリン酸化したオリゴ
ヌクレオチド（黒丸の列）を上記プライマー（Ｂ）と連
結することにより得られる。また、プライマー（Ａ）及
び（Ｂ）は、ＤＮＡ合成機を用いても合成することがで
きる。尚、プライマー（Ａ）及びプライマー（Ｂ）の配
列及びその長さは、上記オリゴヌクレオチド（白丸の
列）及びオリゴヌクレオチド（黒丸の列）を適宜選ぶこ
とで変化させることができる。
造方法で用いるプライマー（Ｂ）は、例えば特開平５−
２９２９６７号に記載のオリゴヌクレオチドの酵素的合
成法により製造することができる。図５に示すように、
まず、オリゴヌクレオチド（白丸の列）の３’側にリボ
ヌクレオチドを結合することで、ヘッドリボタイプのプ
ライマー（Ｂ）が得られる。さらに、センターリボタイ
プのプライマー（Ａ）は、５’側をリン酸化したオリゴ
ヌクレオチド（黒丸の列）を上記プライマー（Ｂ）と連
結することにより得られる。また、プライマー（Ａ）及
び（Ｂ）は、ＤＮＡ合成機を用いても合成することがで
きる。尚、プライマー（Ａ）及びプライマー（Ｂ）の配
列及びその長さは、上記オリゴヌクレオチド（白丸の
列）及びオリゴヌクレオチド（黒丸の列）を適宜選ぶこ
とで変化させることができる。
【００１２】本発明の方法に用いられるテンプレートＤ
ＮＡには、特に制限はない。テンプレートＤＮＡは、１
本鎖ＤＮＡであっても、２本鎖ＤＮＡであっても良い。
また、１本鎖ＤＮＡはプラス鎖でもマイナス鎖であって
も良い。テンプレートＤＮＡとしては、例えばゲノムＤ
ＮＡ及びその断片並びにプラスミドＤＮＡ及びその誘導
体を挙げることができる。また、これらのＤＮＡの起源
には特に制限はなく、例えば、ヒトを含む動物、植物、
細菌、ウイルス等を挙げることができる。
ＮＡには、特に制限はない。テンプレートＤＮＡは、１
本鎖ＤＮＡであっても、２本鎖ＤＮＡであっても良い。
また、１本鎖ＤＮＡはプラス鎖でもマイナス鎖であって
も良い。テンプレートＤＮＡとしては、例えばゲノムＤ
ＮＡ及びその断片並びにプラスミドＤＮＡ及びその誘導
体を挙げることができる。また、これらのＤＮＡの起源
には特に制限はなく、例えば、ヒトを含む動物、植物、
細菌、ウイルス等を挙げることができる。
【００１３】工程（１）のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）は、常法により実施できる。例えば熱変性、アニー
リング、及びポリメラーゼによる反応を繰り返すことに
より行う。各処理の温度条件及び時間は、被増幅領域に
関するプライマーの熱安定性や特異性、さらには被増幅
領域の長さ等を考慮して適宜決定することができる。
Ｒ）は、常法により実施できる。例えば熱変性、アニー
リング、及びポリメラーゼによる反応を繰り返すことに
より行う。各処理の温度条件及び時間は、被増幅領域に
関するプライマーの熱安定性や特異性、さらには被増幅
領域の長さ等を考慮して適宜決定することができる。
【００１４】工程（２）のＲＮＡ分解酵素処理及びアル
カリ処理は、ＰＣＲ法により得られた２本鎖ＤＡＮ断片
の末端付近のリボヌクレオチド基の３’側の３’，５’
ホスホジエステル結合を切断することを目的とするもの
である。ＲＮＡ分解酵素処理は、ＲＮＡ分解酵素とし
て、例えばポリヌクレアーゼＡを用い、例えば約５０℃
で１０〜６０分間反応させ、次いで約７０℃で５〜２０
分間熱処理して切断した２本鎖ＤＡＮの末端付近のオリ
ゴマーを外すことにより行うことができる。アルカリ処
理は、例えば、０．１ＮのＮａＯＨ水溶液中で８０〜１
００℃で５〜２０分間加熱し、中和後、８０〜１００℃
に加熱し、室温付近まで徐冷することにより行うことが
できる。
カリ処理は、ＰＣＲ法により得られた２本鎖ＤＡＮ断片
の末端付近のリボヌクレオチド基の３’側の３’，５’
ホスホジエステル結合を切断することを目的とするもの
である。ＲＮＡ分解酵素処理は、ＲＮＡ分解酵素とし
て、例えばポリヌクレアーゼＡを用い、例えば約５０℃
で１０〜６０分間反応させ、次いで約７０℃で５〜２０
分間熱処理して切断した２本鎖ＤＡＮの末端付近のオリ
ゴマーを外すことにより行うことができる。アルカリ処
理は、例えば、０．１ＮのＮａＯＨ水溶液中で８０〜１
００℃で５〜２０分間加熱し、中和後、８０〜１００℃
に加熱し、室温付近まで徐冷することにより行うことが
できる。
【００１５】工程（３）のリン酸化処理は、ＲＮＡ分解
酵素処理又はアルカリ処理により得られた２本鎖ＤＡＮ
断片のオリゴマーが外れた部分の５’側をリン酸化する
目的で行う。このリン酸化処理は、緩衝液中、ポリヌク
レオチドキナーゼ、アデノシン三リン酸、マグネシウム
イオン、ポリエチレングリコール等の存在下で行うこと
ができる。処理条件は、例えば約３７℃で１０〜６０分
間とすることができる。
酵素処理又はアルカリ処理により得られた２本鎖ＤＡＮ
断片のオリゴマーが外れた部分の５’側をリン酸化する
目的で行う。このリン酸化処理は、緩衝液中、ポリヌク
レオチドキナーゼ、アデノシン三リン酸、マグネシウム
イオン、ポリエチレングリコール等の存在下で行うこと
ができる。処理条件は、例えば約３７℃で１０〜６０分
間とすることができる。
【００１６】工程（４）では、このようにして得られた
粘着末端を有する２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ）を、該粘着末
端と相補関係にある粘着末端を有する２本鎖ＤＮＡ断片
（Ｂ）とＤＮＡリガーゼにより連結する。連結されるべ
き２本鎖ＤＮＡ断片（Ｂ）は、特に制限はない。２本鎖
ＤＮＡ断片（Ｂ）の粘着末端に合わせて、２本鎖ＤＮＡ
断片（Ａ）を適宜変化させることができるからである。
２本鎖ＤＮＡ断片（Ｂ）としては、例えば、制限酵素を
用いて切断することによって粘着末端を形成されたもの
であることができる。また、２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ）と
同様に本発明の方法により製造した２本鎖ＤＮＡ断片を
２本鎖ＤＮＡ断片（Ｂ）とすることもできる。尚、２本
鎖ＤＮＡ断片（Ａ）の粘着末端の長さは、少なくとも２
本鎖ＤＮＡ断片（Ｂ）の粘着末端と同じかそれよりもよ
り長ければよい。また、２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ）の粘着
末端の配列は、一本鎖となっている３’末端側の配列の
少なくともが、２本鎖ＤＮＡ断片（Ｂ）の粘着末端と相
補関係にあれば良い。
粘着末端を有する２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ）を、該粘着末
端と相補関係にある粘着末端を有する２本鎖ＤＮＡ断片
（Ｂ）とＤＮＡリガーゼにより連結する。連結されるべ
き２本鎖ＤＮＡ断片（Ｂ）は、特に制限はない。２本鎖
ＤＮＡ断片（Ｂ）の粘着末端に合わせて、２本鎖ＤＮＡ
断片（Ａ）を適宜変化させることができるからである。
２本鎖ＤＮＡ断片（Ｂ）としては、例えば、制限酵素を
用いて切断することによって粘着末端を形成されたもの
であることができる。また、２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ）と
同様に本発明の方法により製造した２本鎖ＤＮＡ断片を
２本鎖ＤＮＡ断片（Ｂ）とすることもできる。尚、２本
鎖ＤＮＡ断片（Ａ）の粘着末端の長さは、少なくとも２
本鎖ＤＮＡ断片（Ｂ）の粘着末端と同じかそれよりもよ
り長ければよい。また、２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ）の粘着
末端の配列は、一本鎖となっている３’末端側の配列の
少なくともが、２本鎖ＤＮＡ断片（Ｂ）の粘着末端と相
補関係にあれば良い。
【００１７】さらに図２に示すように、工程（１）の増
幅合成において用いるプライマーのいずれもプライマー
（Ａ）として、両末端が粘着末端である２本鎖ＤＮＡ断
片（Ａ）を得て、これを、例えば２本鎖ＤＮＡ断片
（Ｃ）と連結することもできる。図２では、２本鎖ＤＮ
Ａ断片（Ｃ）として、制限酵素により切断された両末端
ともに粘着末端であるプラスミドＤＮＡの断片を示し
た。この方法では、プラスミドＤＮＡに所望の箇所のＤ
ＮＡ断片を挿入することが可能である。但し、両末端が
粘着末端である２本鎖ＤＮＡ断片は、プラスミドＤＮＡ
断片に限定されるものではない。また、両末端が粘着末
端であるプラスミドＤＮＡ断片等の両末端が粘着末端で
ある２本鎖ＤＮＡ断片は、本発明の製造方法を利用して
も得ることができる。この場合には、粘着末端の配列及
び長さを適宜選んで、より特異的に所望のプラスミドＤ
ＮＡを製造することができる。また、テンプレートＤＮ
Ａとして、環状のプラスミドＤＮＡをそのまま用いるこ
ともできるし、環状のプラスミドＤＮＡを制限酵素等に
より切断して用いることもできる。さらに、２本鎖ＤＮ
Ａ断片（Ｃ）の代わりに、異なる粘着末端を有する２本
の２本鎖ＤＮＡ断片を両側から両末端が粘着末端である
２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ）と結合することも可能である。
幅合成において用いるプライマーのいずれもプライマー
（Ａ）として、両末端が粘着末端である２本鎖ＤＮＡ断
片（Ａ）を得て、これを、例えば２本鎖ＤＮＡ断片
（Ｃ）と連結することもできる。図２では、２本鎖ＤＮ
Ａ断片（Ｃ）として、制限酵素により切断された両末端
ともに粘着末端であるプラスミドＤＮＡの断片を示し
た。この方法では、プラスミドＤＮＡに所望の箇所のＤ
ＮＡ断片を挿入することが可能である。但し、両末端が
粘着末端である２本鎖ＤＮＡ断片は、プラスミドＤＮＡ
断片に限定されるものではない。また、両末端が粘着末
端であるプラスミドＤＮＡ断片等の両末端が粘着末端で
ある２本鎖ＤＮＡ断片は、本発明の製造方法を利用して
も得ることができる。この場合には、粘着末端の配列及
び長さを適宜選んで、より特異的に所望のプラスミドＤ
ＮＡを製造することができる。また、テンプレートＤＮ
Ａとして、環状のプラスミドＤＮＡをそのまま用いるこ
ともできるし、環状のプラスミドＤＮＡを制限酵素等に
より切断して用いることもできる。さらに、２本鎖ＤＮ
Ａ断片（Ｃ）の代わりに、異なる粘着末端を有する２本
の２本鎖ＤＮＡ断片を両側から両末端が粘着末端である
２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ）と結合することも可能である。
【００１８】ＤＮＡリガーゼにより連結方法は、種々の
リガーゼを用いて行うことができ、例えばＴａｑリガー
ゼやＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて行うことができる。連
結しようとする粘着末端を有する複数の２本鎖ＤＮＡ断
片を、アニール部分の二次構造を壊す目的で、約７０℃
で５〜２０分間熱処理し、次いで緩衝液中でリガーゼを
添加してライゲーションを行う。ライゲーションの条件
は、リガーゼの種類により異なるが、例えばＴａｑリガ
ーゼの場合、約４５℃で３０分間〜２時間、またＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼの場合、約２５℃で３０分間〜２時間とす
ることが適当である。
リガーゼを用いて行うことができ、例えばＴａｑリガー
ゼやＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて行うことができる。連
結しようとする粘着末端を有する複数の２本鎖ＤＮＡ断
片を、アニール部分の二次構造を壊す目的で、約７０℃
で５〜２０分間熱処理し、次いで緩衝液中でリガーゼを
添加してライゲーションを行う。ライゲーションの条件
は、リガーゼの種類により異なるが、例えばＴａｑリガ
ーゼの場合、約４５℃で３０分間〜２時間、またＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼの場合、約２５℃で３０分間〜２時間とす
ることが適当である。
【００１９】本発明の第２の製造方法は、図３に基づい
て説明する。第２の製造方法に用いるプライマー（Ａ）
及び（Ｃ）は第１の製造方法において用いたものと同様
のものである。さらに工程（１）〜（４）の条件等も第
１の製造方法において用いたものと同様である。プライ
マー（Ｂ）は、テンプレートＤＮＡのプラス鎖又はマイ
ナス鎖の被増幅領域の端部の少なくとも一部の配列と相
補的であり、３’末端がリボヌクレオチド基である。プ
ライマー（Ｂ）は、プラス鎖又はマイナス鎖の被増幅領
域の５’末端付近の配列と相補関係にあるので、ＰＣＲ
において被増幅領域と再結合してプライマーとして機能
する。さらに、リボヌクレオチド基を含むことで、工程
（２）における処理により、該リボヌクレオチド基及び
その５’側が除去されて、粘着末端となる１本鎖ＤＮＡ
部を形成する。
て説明する。第２の製造方法に用いるプライマー（Ａ）
及び（Ｃ）は第１の製造方法において用いたものと同様
のものである。さらに工程（１）〜（４）の条件等も第
１の製造方法において用いたものと同様である。プライ
マー（Ｂ）は、テンプレートＤＮＡのプラス鎖又はマイ
ナス鎖の被増幅領域の端部の少なくとも一部の配列と相
補的であり、３’末端がリボヌクレオチド基である。プ
ライマー（Ｂ）は、プラス鎖又はマイナス鎖の被増幅領
域の５’末端付近の配列と相補関係にあるので、ＰＣＲ
において被増幅領域と再結合してプライマーとして機能
する。さらに、リボヌクレオチド基を含むことで、工程
（２）における処理により、該リボヌクレオチド基及び
その５’側が除去されて、粘着末端となる１本鎖ＤＮＡ
部を形成する。
【００２０】図３では、テンプレートＤＮＡ上に２種の
被増幅領域がある場合について説明する。この場合、連
結した２本鎖ＤＮＡ断片の両端部を構成する２本鎖ＤＮ
Ａ断片（Ａ）及び（Ｄ）の増幅合成に、プライマー
（Ａ）と（Ｃ）との組合せ及びプライマー（Ｂ）と
（Ｃ）との組合せをそれぞれ用いる。但し、２本鎖ＤＮ
Ａ断片（Ａ）のプライマー（Ｃ）と２本鎖ＤＮＡ断片
（Ｄ）のプライマー（Ｃ）の配列は、それぞれ、被増幅
領域（Ａ）及び（Ｄ）の末端の配列により決定され、通
常は異なる配列を有する。また、プライマー（Ａ）のリ
ボヌクレオチド基の５’側の配列とプライマー（Ｂ）の
リボヌクレオチド基の５’側の配列とは、少なくとも末
端の配列が相補関係にある。それにより、２本鎖ＤＮＡ
断片（Ａ）と（Ｄ）の粘着末端が、相補関係になり、後
に連結することが可能となる。
被増幅領域がある場合について説明する。この場合、連
結した２本鎖ＤＮＡ断片の両端部を構成する２本鎖ＤＮ
Ａ断片（Ａ）及び（Ｄ）の増幅合成に、プライマー
（Ａ）と（Ｃ）との組合せ及びプライマー（Ｂ）と
（Ｃ）との組合せをそれぞれ用いる。但し、２本鎖ＤＮ
Ａ断片（Ａ）のプライマー（Ｃ）と２本鎖ＤＮＡ断片
（Ｄ）のプライマー（Ｃ）の配列は、それぞれ、被増幅
領域（Ａ）及び（Ｄ）の末端の配列により決定され、通
常は異なる配列を有する。また、プライマー（Ａ）のリ
ボヌクレオチド基の５’側の配列とプライマー（Ｂ）の
リボヌクレオチド基の５’側の配列とは、少なくとも末
端の配列が相補関係にある。それにより、２本鎖ＤＮＡ
断片（Ａ）と（Ｄ）の粘着末端が、相補関係になり、後
に連結することが可能となる。
【００２１】被増幅領域が３つ以上の場合には、上記両
端部の２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ）と（Ｄ）の合成以外に、
連結した２本鎖ＤＮＡ断片の中間部を構成する２本鎖Ｄ
ＮＡ断片の増幅合成にプライマー（Ａ）と（Ｂ）との組
合せを２種類用いる。例えば、２つのテンプレートＤＮ
Ａに被増幅領域が各２ヵ所、合計４つ以上の場合を図４
に示す。図４では、上記両端部の２本鎖ＤＮＡ断片
（Ａ）と（Ｄ）の合成以外に、連結した２本鎖ＤＮＡ断
片の中間部を構成する２本鎖ＤＮＡ断片（Ｅ）及び
（Ｆ）の増幅合成にプライマー（Ａ）と（Ｂ）との組合
せを２種類用いて、２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ）と（Ｄ）以
外に、２本鎖ＤＮＡ断片（Ｅ）及び（Ｆ）も合成する。
それにより、両方の５’末端近傍にリボヌクレオチド基
を含み、かつテンプレートＤＮＡの被増幅領域に相当す
るＤＮＡ配列を含む２種の２本鎖ＤＮＡ断片（Ｅ）及び
（Ｆ）とを増幅合成する。但し、２本鎖ＤＮＡ断片
（Ｅ）及び（Ｆ）の増幅合成用のプライマー（Ａ）及び
（Ｂ）の配列は、２本鎖ＤＮＡ断片（Ｅ）及び（Ｆ）の
端部の配列及び粘着末端の配列を考慮して適宜決定す
る。尚、２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ）及び（Ｅ）と２本鎖Ｄ
ＮＡ断片（Ｄ）及び（Ｆ）とは、１つの反応器中で同時
に合成してもよいし、或いは別々に合成した後に、工程
（２）〜（４）のいずれかの工程で統合して、連結した
２本鎖ＤＮＡ（Ａ−Ｆ−Ｅ−Ｄ）を得ても良い。
端部の２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ）と（Ｄ）の合成以外に、
連結した２本鎖ＤＮＡ断片の中間部を構成する２本鎖Ｄ
ＮＡ断片の増幅合成にプライマー（Ａ）と（Ｂ）との組
合せを２種類用いる。例えば、２つのテンプレートＤＮ
Ａに被増幅領域が各２ヵ所、合計４つ以上の場合を図４
に示す。図４では、上記両端部の２本鎖ＤＮＡ断片
（Ａ）と（Ｄ）の合成以外に、連結した２本鎖ＤＮＡ断
片の中間部を構成する２本鎖ＤＮＡ断片（Ｅ）及び
（Ｆ）の増幅合成にプライマー（Ａ）と（Ｂ）との組合
せを２種類用いて、２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ）と（Ｄ）以
外に、２本鎖ＤＮＡ断片（Ｅ）及び（Ｆ）も合成する。
それにより、両方の５’末端近傍にリボヌクレオチド基
を含み、かつテンプレートＤＮＡの被増幅領域に相当す
るＤＮＡ配列を含む２種の２本鎖ＤＮＡ断片（Ｅ）及び
（Ｆ）とを増幅合成する。但し、２本鎖ＤＮＡ断片
（Ｅ）及び（Ｆ）の増幅合成用のプライマー（Ａ）及び
（Ｂ）の配列は、２本鎖ＤＮＡ断片（Ｅ）及び（Ｆ）の
端部の配列及び粘着末端の配列を考慮して適宜決定す
る。尚、２本鎖ＤＮＡ断片（Ａ）及び（Ｅ）と２本鎖Ｄ
ＮＡ断片（Ｄ）及び（Ｆ）とは、１つの反応器中で同時
に合成してもよいし、或いは別々に合成した後に、工程
（２）〜（４）のいずれかの工程で統合して、連結した
２本鎖ＤＮＡ（Ａ−Ｆ−Ｅ−Ｄ）を得ても良い。
【００２２】
【発明の効果】本発明によれば、制限酵素による切断部
位の配列による制限が少なく、粘着末端の配列及び粘着
末端の塩基数を比較的自由に選んで、従来より自由に、
容易に、かつ特異的にＤＮＡ断片を結合して、連結した
２本鎖ＤＮＡの製造方法を提供することができる。例え
ば、本発明の方法によれば、連結したい２本の２本鎖Ｄ
ＮＡ断片の内、いずれか一方または両方に適当な制限酵
素により切断される配列が含まれていない場合、又は制
限酵素切断部位が複数あり、所望の配列を有する長さの
断片が得られない場合でも、連結した２本鎖ＤＮＡを容
易に製造することが可能である。
位の配列による制限が少なく、粘着末端の配列及び粘着
末端の塩基数を比較的自由に選んで、従来より自由に、
容易に、かつ特異的にＤＮＡ断片を結合して、連結した
２本鎖ＤＮＡの製造方法を提供することができる。例え
ば、本発明の方法によれば、連結したい２本の２本鎖Ｄ
ＮＡ断片の内、いずれか一方または両方に適当な制限酵
素により切断される配列が含まれていない場合、又は制
限酵素切断部位が複数あり、所望の配列を有する長さの
断片が得られない場合でも、連結した２本鎖ＤＮＡを容
易に製造することが可能である。
【００２３】さらに、本発明によれば、制限酵素を用い
ることなく、粘着末端の配列及び粘着末端の塩基数を自
由に選び、安定な再結合により、１又は２つ以上のテン
プレートＤＮＡ上の所望の配列のみを連結させて、高収
率で所望の２本鎖ＤＮＡ断片を連結させた、２本鎖ＤＮ
Ａを製造することができる。さらに、本発明の方法は、
エクソンシャッフリングに適用できるという利点もあ
る。
ることなく、粘着末端の配列及び粘着末端の塩基数を自
由に選び、安定な再結合により、１又は２つ以上のテン
プレートＤＮＡ上の所望の配列のみを連結させて、高収
率で所望の２本鎖ＤＮＡ断片を連結させた、２本鎖ＤＮ
Ａを製造することができる。さらに、本発明の方法は、
エクソンシャッフリングに適用できるという利点もあ
る。
【００２４】
【実施例】以下本発明を実施例によりさらに説明する。 実験方法 以下に示す条件により、プライマーの酵素的合成、ＰＣ
Ｒ、ＰＣＲ断片のライゲーション及び生成物の確認を行
った。 （１）オリゴマードッキング反応によるプライマーの酵
素的合成 ２断片組替え：No.30-NO.28 リボNo.31 の作成 ３断片組替え：No.30-No.5 リボNo.31 No.43-No28 リ
ボNo.44 の作成 ５’リン酸化 〜反応液組成〜 オリゴマー 250pmol １μ１（No.28 No.5) ライゲーション緩衝液 ５μ１ rATP 1mM １μ１ DTT 0.1M １μ１ H2O １μ１ T4 ポリヌクレオチドキナーゼ １μ１(10U) 全量 10 μ１ エッペンドルフチューブ内で上記の溶液を調製し、３７
℃の恒温層で１時間反応させる。その後、酵素を失活さ
せるための７０℃の熱を１０分間かける。
Ｒ、ＰＣＲ断片のライゲーション及び生成物の確認を行
った。 （１）オリゴマードッキング反応によるプライマーの酵
素的合成 ２断片組替え：No.30-NO.28 リボNo.31 の作成 ３断片組替え：No.30-No.5 リボNo.31 No.43-No28 リ
ボNo.44 の作成 ５’リン酸化 〜反応液組成〜 オリゴマー 250pmol １μ１（No.28 No.5) ライゲーション緩衝液 ５μ１ rATP 1mM １μ１ DTT 0.1M １μ１ H2O １μ１ T4 ポリヌクレオチドキナーゼ １μ１(10U) 全量 10 μ１ エッペンドルフチューブ内で上記の溶液を調製し、３７
℃の恒温層で１時間反応させる。その後、酵素を失活さ
せるための７０℃の熱を１０分間かける。
【００２５】 ３’リボ化 〜反応液組成〜 オリゴマー 250pmol １μ１（No.30 No.31 No.43 No.44) ライゲーション 緩衝液 ５μ１ rCTP 1mM １μ１ DTT 0.1M １μ１ H2O １μ１ TdT １μ１(12U) 全量 10 μ１ エッペンドルフチューブ内で上記の溶液を調製し、３７
℃の恒温層で３０分間反応させる。その後、酵素を失活
させるため７０℃の熱を１０分間かける。
℃の恒温層で３０分間反応させる。その後、酵素を失活
させるため７０℃の熱を１０分間かける。
【００２６】 ライゲーション 〜反応液組成〜 ５’リン酸化オリゴマー 50pmol ２μ１(No.28 No.5) ３’リボ化オリゴマー 225pmol ９μ１(No.30 No.43) ライゲーション 緩衝液 ２μ１ rATP 1mM １μ１ T4 RNA リガーゼ １μ１(50U) 全量 15 μ１ ５’リン酸化したものと３’リボ化したものを混ぜて上
記の組成にし、２５℃の恒温層で１０時間（以上）反応
させる。
記の組成にし、２５℃の恒温層で１０時間（以上）反応
させる。
【００２７】（２）ＰＣＲによる各断片の組成 試料の調整 〜反応溶液組成〜 dNTPs 各20 nmol PFU ポリメラーゼ 1μ１(2.5U) 10*PFU 緩衝液#1 5 μ１ プライマー それぞれ 20pmol テンプレート fd ssDNA 10fmol H2O 全量 50 μ１になるよう
にする ミネラルオイル（後に上にのせる） ３滴 ＰＣＲ ＰＣＲ装置（サーモプロセッサＴＲ−１００〔＋冷却ユ
ニットＴＲ−８０〕：タイテック社）を用いて次のサイ
クル条件でＰＣＲを行った。 プレメルト 94℃ 30秒 変性 94 ℃ 30秒 アニーリング 30℃又は37℃※ 2分 エクステンション 55℃ 1分 ポスト 72℃ 2分 変性、アニーリング及びエクステンションを３０回繰り
返しおこなった。 ※３断片シャフリング用の遺伝子Ｖの部分は30℃で行
い、他は全て37℃で行った。
にする ミネラルオイル（後に上にのせる） ３滴 ＰＣＲ ＰＣＲ装置（サーモプロセッサＴＲ−１００〔＋冷却ユ
ニットＴＲ−８０〕：タイテック社）を用いて次のサイ
クル条件でＰＣＲを行った。 プレメルト 94℃ 30秒 変性 94 ℃ 30秒 アニーリング 30℃又は37℃※ 2分 エクステンション 55℃ 1分 ポスト 72℃ 2分 変性、アニーリング及びエクステンションを３０回繰り
返しおこなった。 ※３断片シャフリング用の遺伝子Ｖの部分は30℃で行
い、他は全て37℃で行った。
【００２８】（３）ＰＣＲ断片どうしのライゲーション RNaseA処理（リボ核酸の３’，５’ホスホジエステル
結合切断） 1)ＰＣＲ産物をフェノール抽出、エタノール沈殿を行う
ことによって10μ１にし、そのうち８μ１を用いる。 2)０．３％RNaseA 1μ1 、1*SSC １μ１を加え、全部で
10μ１にする。 3)50℃にて30分反応させ、70℃で10分間熱をかけて切断
したオリゴマーをはずす。 4)エタノール沈殿 断片の５’リン酸化 1)エタノール沈殿したものに４μ１のH2O を加える。 2)更に次の物を加えて全部で10μ１にしてよく混ぜる。 0.5M トリス(pH 9.5) １μ１ 0.1M Mgcl2 １μ１ 0.1M DTT １μ１ 4 mM rATP １μ１ 50 % グリセリン １μ１ T4 ポリヌクレオチド キナーゼ １μ１ 3)37℃で30分間反応させた後、さらにキナーゼを１μ１
加え37℃で30分反応させる。 4)フェノール抽出、エタノール沈殿
結合切断） 1)ＰＣＲ産物をフェノール抽出、エタノール沈殿を行う
ことによって10μ１にし、そのうち８μ１を用いる。 2)０．３％RNaseA 1μ1 、1*SSC １μ１を加え、全部で
10μ１にする。 3)50℃にて30分反応させ、70℃で10分間熱をかけて切断
したオリゴマーをはずす。 4)エタノール沈殿 断片の５’リン酸化 1)エタノール沈殿したものに４μ１のH2O を加える。 2)更に次の物を加えて全部で10μ１にしてよく混ぜる。 0.5M トリス(pH 9.5) １μ１ 0.1M Mgcl2 １μ１ 0.1M DTT １μ１ 4 mM rATP １μ１ 50 % グリセリン １μ１ T4 ポリヌクレオチド キナーゼ １μ１ 3)37℃で30分間反応させた後、さらにキナーゼを１μ１
加え37℃で30分反応させる。 4)フェノール抽出、エタノール沈殿
【００２９】ライゲーション(Taq リガーゼ を用い
た場合） 1)、の処理を施したＰＣＲ各断片をほぼ等量用意
し、H2O で８μ１にする。 2)アニール部分の二次構造を１度壊すため70℃で10分間
熱をかける。 3)Taq リガーゼ用10* 緩衝液 1μ1 とTaq リガーゼ 1U
を加えて全部で10μ１にする。 4)45℃で１時間反応させてアニーリングとライゲーショ
ンを行う。 ’ライゲーション(T4 DNA リガーゼを用いた場合） 1)、の処理を施したＰＣＲ各断片をほぼ等量用意
し、H2O で６μ１にする。 2)4mM rATP 1μ１、ライゲーション 緩衝液( ここでは
66mM Tris-HC1(ph7.6)、6.6 mM MgCl2) １μ１を加え
る。 3)アニール部分の二次構造を１度壊すため70℃で１０分
間熱をかける。 4)アニーリングを45℃で１時間行わせる。 5)0.1M DTT 1μ１と T4 DNA リガーゼ 1μ１(400U)加え
て全部で10μ１にし、よく攪拌する。 6)25℃でライゲーション反応を行う。
た場合） 1)、の処理を施したＰＣＲ各断片をほぼ等量用意
し、H2O で８μ１にする。 2)アニール部分の二次構造を１度壊すため70℃で10分間
熱をかける。 3)Taq リガーゼ用10* 緩衝液 1μ1 とTaq リガーゼ 1U
を加えて全部で10μ１にする。 4)45℃で１時間反応させてアニーリングとライゲーショ
ンを行う。 ’ライゲーション(T4 DNA リガーゼを用いた場合） 1)、の処理を施したＰＣＲ各断片をほぼ等量用意
し、H2O で６μ１にする。 2)4mM rATP 1μ１、ライゲーション 緩衝液( ここでは
66mM Tris-HC1(ph7.6)、6.6 mM MgCl2) １μ１を加え
る。 3)アニール部分の二次構造を１度壊すため70℃で１０分
間熱をかける。 4)アニーリングを45℃で１時間行わせる。 5)0.1M DTT 1μ１と T4 DNA リガーゼ 1μ１(400U)加え
て全部で10μ１にし、よく攪拌する。 6)25℃でライゲーション反応を行う。
【００３０】（４）確認 組換えの操作によって入れ替わった物をテンプレート
とし、適したプライマーを用いてＰＣＲを行う。 でＰＣＲ産物が得られたエタノール沈殿の後に1/10
量（約サブpmol）を制限酵素による切断に用いる。切断
されたバンドの長さを見ることによって完全に確認する
ことができる。 用いる制限酵素─Hae III(10*M緩衝液使用） Hpa II(10*L 緩衝液使用） Alu Ｉ(10*L 緩衝液使用） Taq Ｉ(TaqＩ用10*NE 緩衝液使用） 全部で10μ1 にして、37℃で１時間反応させる。Taq Ｉ
の場合65℃で１時間反応させる。
とし、適したプライマーを用いてＰＣＲを行う。 でＰＣＲ産物が得られたエタノール沈殿の後に1/10
量（約サブpmol）を制限酵素による切断に用いる。切断
されたバンドの長さを見ることによって完全に確認する
ことができる。 用いる制限酵素─Hae III(10*M緩衝液使用） Hpa II(10*L 緩衝液使用） Alu Ｉ(10*L 緩衝液使用） Taq Ｉ(TaqＩ用10*NE 緩衝液使用） 全部で10μ1 にして、37℃で１時間反応させる。Taq Ｉ
の場合65℃で１時間反応させる。
【００３１】実施例１２つのＤＮＡ断片の組換え 上記実験条件により、ｆｄファージの遺伝子Ｖと遺伝子
ＶＩＩ、ＩＸ、ＶＩＩＩとを図６に示すように組換えた
（２断片組換え）。組換えの詳細を図７に示す。また、
使用プライマーの配列等を下記の表１に示す。
ＶＩＩ、ＩＸ、ＶＩＩＩとを図６に示すように組換えた
（２断片組換え）。組換えの詳細を図７に示す。また、
使用プライマーの配列等を下記の表１に示す。
【００３２】
【表１】
【００３３】プライマーの作成 図７の設計図に基づいて、上記表１に示すプライマーを
反応させて得られた生成物（プライマー）の泳動結果を
図８に示す。図８の各レーンの説明及び電気泳動条件は
以下の通りである。各レーンの説明 No.28 (12 マー) 、No.28 リン酸化、No.30, 28
ライゲーション、No.30 リボ化、 No.30 (9 マー)
、No.31 リボ化、No.31 (9マー)電気泳動条件 １５％アクリルアミド（１９：１）、８Ｍ尿素 電圧：３００Ｖ、電流：１３０ｍＡ、ＳＡＥ緩衝液、泳
動時間：７０分、温度：６０℃
反応させて得られた生成物（プライマー）の泳動結果を
図８に示す。図８の各レーンの説明及び電気泳動条件は
以下の通りである。各レーンの説明 No.28 (12 マー) 、No.28 リン酸化、No.30, 28
ライゲーション、No.30 リボ化、 No.30 (9 マー)
、No.31 リボ化、No.31 (9マー)電気泳動条件 １５％アクリルアミド（１９：１）、８Ｍ尿素 電圧：３００Ｖ、電流：１３０ｍＡ、ＳＡＥ緩衝液、泳
動時間：７０分、温度：６０℃
【００３４】オリゴマーはリン酸化されると移動度が上
がりバンドが１段下にずれるが、図８より、No. 28のオ
リゴマー（、）は約８割がリン酸化されている。ま
たリボ化はリボヌクレオチドが１つ付加することになる
のでバンドがやや上にずれるが、No.30 、No.31 のオリ
ゴマー（、、、）ともにリボ化はなされてい
る。更にリボ化No.3０とリン酸化No.28 のライゲーショ
ンでは10マーと12マーのライゲーションなのでより高い
位置にバンドが得られる(22 マー) が、図８のより６
割はこの反応が起こっていると見ることができる。な
お、下に速い移動度のバンドが見えるが、これはドナー
の５’にアデノシンの付加した中間生成物であると思わ
れる。
がりバンドが１段下にずれるが、図８より、No. 28のオ
リゴマー（、）は約８割がリン酸化されている。ま
たリボ化はリボヌクレオチドが１つ付加することになる
のでバンドがやや上にずれるが、No.30 、No.31 のオリ
ゴマー（、、、）ともにリボ化はなされてい
る。更にリボ化No.3０とリン酸化No.28 のライゲーショ
ンでは10マーと12マーのライゲーションなのでより高い
位置にバンドが得られる(22 マー) が、図８のより６
割はこの反応が起こっていると見ることができる。な
お、下に速い移動度のバンドが見えるが、これはドナー
の５’にアデノシンの付加した中間生成物であると思わ
れる。
【００３５】ＰＣＲ ＰＣＲによる各断片の泳動結果を図９に示す。図９の各
レーンの説明及び電気泳動条件は以下の通りである。各レーンの説明 遺伝子Ｖ断片、ｆｄｓｓＤＮＡ ＨａｅＩＩＩ切断
断片、遺伝子（ VII・IX・VIII）断片電気泳動条件 ４％アクリルアミド（１９：１）、８Ｍ尿素 電圧：２５０Ｖ、電流：１５０ｍＡ、ＳＡＥ緩衝液、泳
動時間：６０分、温度：６０℃
レーンの説明及び電気泳動条件は以下の通りである。各レーンの説明 遺伝子Ｖ断片、ｆｄｓｓＤＮＡ ＨａｅＩＩＩ切断
断片、遺伝子（ VII・IX・VIII）断片電気泳動条件 ４％アクリルアミド（１９：１）、８Ｍ尿素 電圧：２５０Ｖ、電流：１５０ｍＡ、ＳＡＥ緩衝液、泳
動時間：６０分、温度：６０℃
【００３６】上記で得られたプライマーを用いてＰＣＲ
を行った結果が、である。ライゲ−ションプライマ
ーによるＰＣＲ（）では279bp(269+10) の断片を、ま
たリボ化プライマーを用いたＰＣＲ（）では408bp の
断片を比較的きれいに得ることができた。
を行った結果が、である。ライゲ−ションプライマ
ーによるＰＣＲ（）では279bp(269+10) の断片を、ま
たリボ化プライマーを用いたＰＣＲ（）では408bp の
断片を比較的きれいに得ることができた。
【００３７】ライゲーション ライゲーションで用いた又は生成した各断片の泳動結果
を図１０に示す。図１０の各レーンの説明及び電気泳動
条件は以下の通りである。各レーンの説明 ｆｄｓｓＤＮＡ ＨａｅＩＩＩ切断断片、組換え産
物ＡｌｕＩ切断、組換え産物ＨｐａＩＩ切断、組換
え産物ＨａｅＩＩＩ切断、組換えＰＣＲ産物、ライ
ゲーション物、遺伝子Ｖ断片、遺伝子（ VII・IX・
VIII）断片電気泳動条件 ４％アクリルアミド（１９：１）、８Ｍ尿素 電圧：２５０Ｖ、電流：１４０ｍＡ、ＳＡＥ緩衝液、泳
動時間：６０分、温度：６０℃ RNaseA処理、リン酸化、Taq リガーゼによるライゲーシ
ョンを行ったものが図１０のである。279bp 、408bp
のバンドの上に、細いが677bp 相当のバンドが見える。
これが組換えのなされた断片のバンドであると思われ
る。
を図１０に示す。図１０の各レーンの説明及び電気泳動
条件は以下の通りである。各レーンの説明 ｆｄｓｓＤＮＡ ＨａｅＩＩＩ切断断片、組換え産
物ＡｌｕＩ切断、組換え産物ＨｐａＩＩ切断、組換
え産物ＨａｅＩＩＩ切断、組換えＰＣＲ産物、ライ
ゲーション物、遺伝子Ｖ断片、遺伝子（ VII・IX・
VIII）断片電気泳動条件 ４％アクリルアミド（１９：１）、８Ｍ尿素 電圧：２５０Ｖ、電流：１４０ｍＡ、ＳＡＥ緩衝液、泳
動時間：６０分、温度：６０℃ RNaseA処理、リン酸化、Taq リガーゼによるライゲーシ
ョンを行ったものが図１０のである。279bp 、408bp
のバンドの上に、細いが677bp 相当のバンドが見える。
これが組換えのなされた断片のバンドであると思われ
る。
【００３８】ＰＣＲによる確認 図１０のの 100倍希釈溶液をテンプレートにしてＰＣ
Ｒを行ったものがである。組換えのなされたテンプレ
ートでないと増幅されない組み合わせのプライマー（図
７ののNo.5、No.8）を用いてＰＣＲを行ったが677bp
付近にバンドが見える。なお他の部分にもラダーとなっ
てバンドが見えているが、これはランダムＰＣＲ産物を
与えやすいNo.5のプライマーを用いたためであろう。
Ｒを行ったものがである。組換えのなされたテンプレ
ートでないと増幅されない組み合わせのプライマー（図
７ののNo.5、No.8）を用いてＰＣＲを行ったが677bp
付近にバンドが見える。なお他の部分にもラダーとなっ
てバンドが見えているが、これはランダムＰＣＲ産物を
与えやすいNo.5のプライマーを用いたためであろう。
【００３９】制限酵素による確認 この677bp のバンドを制限酵素Alu Ｉ、Hpa II、Hae II
I で切断したものがそれぞれ図１０の、、であ
る。遺伝子Ｖから遺伝子VIIIまでの間のそれぞれの制限
酵素の認識部位を表したものを図１１に示す。図１１よ
り、２断片組換えがなされているとすると、それぞれ以
下の長さのバンドが見えるはずである。 HaeIII …391bp 、286bp HpaII…537bp(539bp)、129bp 、11bp AluＩ…378bp 、171bp 、128bp
I で切断したものがそれぞれ図１０の、、であ
る。遺伝子Ｖから遺伝子VIIIまでの間のそれぞれの制限
酵素の認識部位を表したものを図１１に示す。図１１よ
り、２断片組換えがなされているとすると、それぞれ以
下の長さのバンドが見えるはずである。 HaeIII …391bp 、286bp HpaII…537bp(539bp)、129bp 、11bp AluＩ…378bp 、171bp 、128bp
【００４０】HaeIII 切断（）では677bp （切れ残
り）と391 、286bp 付近にはっきりとバンドがみられ
る。 HpaII切断（）でも537(539)bp付近と129bp 付近
に濃いバンドがみられる（11bpの断片は小さすぎて見え
ない）。 AluＩ切断（）についてであるが、677bP(切
れ残り）と378bp 、 171bpの断片ははっきり見える。し
かし128bp 付近の断片はあまり見えず、代わりに408bp
付近と269bp 付近にバンドが見える。これは各々のＰＣ
Ｒ断片と同じ長さである。組換えによってできる結合部
位の配列はＡＧＣＴであり、これは AluＩの認識配列な
のでこの部位も切断してるため各々のＰＣＲ断片と同じ
長さの位置にバンドがでるのである。(AluＩに対する結
果は、この酵素の活性が不十分であったか、ＤＮＡに変
異が生じたかのいずれかと思われる。）
り）と391 、286bp 付近にはっきりとバンドがみられ
る。 HpaII切断（）でも537(539)bp付近と129bp 付近
に濃いバンドがみられる（11bpの断片は小さすぎて見え
ない）。 AluＩ切断（）についてであるが、677bP(切
れ残り）と378bp 、 171bpの断片ははっきり見える。し
かし128bp 付近の断片はあまり見えず、代わりに408bp
付近と269bp 付近にバンドが見える。これは各々のＰＣ
Ｒ断片と同じ長さである。組換えによってできる結合部
位の配列はＡＧＣＴであり、これは AluＩの認識配列な
のでこの部位も切断してるため各々のＰＣＲ断片と同じ
長さの位置にバンドがでるのである。(AluＩに対する結
果は、この酵素の活性が不十分であったか、ＤＮＡに変
異が生じたかのいずれかと思われる。）
【００４１】実施例２３つのＤＮＡ断片の組換え 前記実験条件により、ｆｄファージの遺伝子Ｖと遺伝子
ＶＩＩ及びＩＸと遺伝子ＶＩＩＩとを図６に示すように
組換えた。組換えの詳細を図１２に示す。また、使用プ
ライマーの配列等を下記の表２に示す。
ＶＩＩ及びＩＸと遺伝子ＶＩＩＩとを図６に示すように
組換えた。組換えの詳細を図１２に示す。また、使用プ
ライマーの配列等を下記の表２に示す。
【００４２】
【表２】
【００４３】プライマーの作成 図１２の設計図に基づいて、上記表１に示すプライマー
を反応させて得られた生成物（プライマー）の泳動結果
を図１３に示す。図１３の各レーンの説明及び電気泳動
条件は以下の通りである。各レーンの説明 No.31 (9マー) 、No.31 リボ化、No.44 (10 マ
ー) 、No.44 リボ化、 No.30リボ化、 No.30, 5
ライゲーション、 No.5 リン酸化、No.5 (12 マ
ー) 、No.43 (10 マー) 、(10)No.43 リボ化、(11)N
o.43, 28 ライゲーション、(12)No.28 リン酸化、(13)N
o.28 (12 マー)電気泳動条件 １５％アクリルアミド（１９：１）、８Ｍ尿素 電圧：３００Ｖ、電流：１３０ｍＡ、ＳＡＥ緩衝液、泳
動時間：７５分、温度：６０℃
を反応させて得られた生成物（プライマー）の泳動結果
を図１３に示す。図１３の各レーンの説明及び電気泳動
条件は以下の通りである。各レーンの説明 No.31 (9マー) 、No.31 リボ化、No.44 (10 マ
ー) 、No.44 リボ化、 No.30リボ化、 No.30, 5
ライゲーション、 No.5 リン酸化、No.5 (12 マ
ー) 、No.43 (10 マー) 、(10)No.43 リボ化、(11)N
o.43, 28 ライゲーション、(12)No.28 リン酸化、(13)N
o.28 (12 マー)電気泳動条件 １５％アクリルアミド（１９：１）、８Ｍ尿素 電圧：３００Ｖ、電流：１３０ｍＡ、ＳＡＥ緩衝液、泳
動時間：７５分、温度：６０℃
【００４４】リボNo.31(）、リボNo.44 （）はバン
ドがやや上にずれているためリボ化がなされているとい
える。No.30-No.5（）、No.43-No.28 （(11)）はライ
ゲーション反応によって長い断片（それぞれ22マー 、
23マー) となったオリゴマーのバンドを得ることができ
ている。反応効率は図１２より７割程度と思われる。ＰＣＲ ＰＣＲによる各断片の泳動結果を図１４に示す。図１４
の各レーンの説明及び電気泳動条件は以下の通りであ
る。各レーンの説明 ｆｄｓｓＤＮＡ ＨａｅＩＩＩ切断断片、遺伝子Ｖ
断片、遺伝子（ VII・IX）断片、遺伝子VIII断片、
ライゲーション物電気泳動条件 ４％アクリルアミド（１９：１）、８Ｍ尿素 電圧：２５０Ｖ、電流：１１５ｍＡ、ＳＡＥ緩衝液、泳
動時間：６５分、温度：６０℃
ドがやや上にずれているためリボ化がなされているとい
える。No.30-No.5（）、No.43-No.28 （(11)）はライ
ゲーション反応によって長い断片（それぞれ22マー 、
23マー) となったオリゴマーのバンドを得ることができ
ている。反応効率は図１２より７割程度と思われる。ＰＣＲ ＰＣＲによる各断片の泳動結果を図１４に示す。図１４
の各レーンの説明及び電気泳動条件は以下の通りであ
る。各レーンの説明 ｆｄｓｓＤＮＡ ＨａｅＩＩＩ切断断片、遺伝子Ｖ
断片、遺伝子（ VII・IX）断片、遺伝子VIII断片、
ライゲーション物電気泳動条件 ４％アクリルアミド（１９：１）、８Ｍ尿素 電圧：２５０Ｖ、電流：１１５ｍＡ、ＳＡＥ緩衝液、泳
動時間：６５分、温度：６０℃
【００４５】遺伝子Ｖ、VII ・IX、VIIIの各ＰＣＲ断片
を、RNaseA処理、リン酸化を施して活性化したものを示
す（、、）。それぞれの断片は、２本鎖の一方
（プライマーを含む側）がリボヌクレオチドの位置で切
断されて短くなっているためｓｓＤＮＡとしてはバンド
が２本になる。遺伝子Ｖはアニーリング30℃であるが、
280bp(269bp)のバンドが得られた。遺伝子 VII・IXも19
9bp(189bp)のバンドが得られた。遺伝子VIIIにおいては
特異的に219bp(209bp)のバンドが得られた。
を、RNaseA処理、リン酸化を施して活性化したものを示
す（、、）。それぞれの断片は、２本鎖の一方
（プライマーを含む側）がリボヌクレオチドの位置で切
断されて短くなっているためｓｓＤＮＡとしてはバンド
が２本になる。遺伝子Ｖはアニーリング30℃であるが、
280bp(269bp)のバンドが得られた。遺伝子 VII・IXも19
9bp(189bp)のバンドが得られた。遺伝子VIIIにおいては
特異的に219bp(209bp)のバンドが得られた。
【００４６】ライゲーション 活性化後の断片３種を混合しTaq リガーゼを用いてライ
ゲーションしたものが図１４である。各断片の泳動結
果には見られないバンドが１本浮きでている。これが 6
77bpにはライゲーションされたオリゴマーのバンドであ
ると思われる。遺伝子Ｖはライゲーションにほとんど使
われたのであろうか、バンドがあまりはっきり見えな
い。ＰＣＲによる確認 図１４の50倍希釈溶液をテンプレートにしてＰＣＲを
行ったものが図１５である。予定の長さである 677bp
相当の位置に明瞭なバンドを得ることができた。
ゲーションしたものが図１４である。各断片の泳動結
果には見られないバンドが１本浮きでている。これが 6
77bpにはライゲーションされたオリゴマーのバンドであ
ると思われる。遺伝子Ｖはライゲーションにほとんど使
われたのであろうか、バンドがあまりはっきり見えな
い。ＰＣＲによる確認 図１４の50倍希釈溶液をテンプレートにしてＰＣＲを
行ったものが図１５である。予定の長さである 677bp
相当の位置に明瞭なバンドを得ることができた。
【００４７】制限酵素による確認 この 677bp相当のバンドを種々の制限酵素で切断した各
断片の泳動写真を図１５に示す。図１５の各レーンの説
明及び電気泳動条件は以下の通りである。各レーンの説明 ｆｄｓｓＤＮＡ ＨａｅＩＩＩ切断断片、組換えＰ
ＣＲ産物、組換え産物ＨａｅＩＩＩ切断、組換え産
物ＨｐａＩＩ切断、組換え産物ＴａｑＩ切断、組換
え産物ＡｌｕＩ切断、電気泳動条件 ４％アクリルアミド（１９：１）、８Ｍ尿素 電圧：２５０Ｖ、電流：１３０ｍＡ、ＳＡＥ緩衝液、泳
動時間：６０分、温度：６０℃
断片の泳動写真を図１５に示す。図１５の各レーンの説
明及び電気泳動条件は以下の通りである。各レーンの説明 ｆｄｓｓＤＮＡ ＨａｅＩＩＩ切断断片、組換えＰ
ＣＲ産物、組換え産物ＨａｅＩＩＩ切断、組換え産
物ＨｐａＩＩ切断、組換え産物ＴａｑＩ切断、組換
え産物ＡｌｕＩ切断、電気泳動条件 ４％アクリルアミド（１９：１）、８Ｍ尿素 電圧：２５０Ｖ、電流：１３０ｍＡ、ＳＡＥ緩衝液、泳
動時間：６０分、温度：６０℃
【００４８】制限酵素 HaeIII 、 HpaII、Taq Ｉ、Alu
Ｉで切断した各断片の泳動写真が、それぞれ、、
、である。図１１より３断片組換えがなされている
とすると、以下の長さのバンドが見えるはずである。 Hae III … 580bp、97bp Hpa II… 537bp(539bp) 、129bp 、11bp Taq Ｉ… 324bp、208bp 、118bp 、27bp Alu Ｉ… 317bp、189bp 、171bp Hae III 切断（ 580bpと97bp）、Hpa II切断（ 537
bpと129bp ）ともに予定の長さの切断であることを示す
バンドを確認することができる。Taq Ｉ切断（）、Al
u Ｉ切断（）についてもほぼ予定の長さの断片である
ことを示すバンドが得られているが、リファレンスと長
さの比較を行うと原因は不明だが全体的に予定より10bp
〜20bp程度短めの断片になっているようである。
Ｉで切断した各断片の泳動写真が、それぞれ、、
、である。図１１より３断片組換えがなされている
とすると、以下の長さのバンドが見えるはずである。 Hae III … 580bp、97bp Hpa II… 537bp(539bp) 、129bp 、11bp Taq Ｉ… 324bp、208bp 、118bp 、27bp Alu Ｉ… 317bp、189bp 、171bp Hae III 切断（ 580bpと97bp）、Hpa II切断（ 537
bpと129bp ）ともに予定の長さの切断であることを示す
バンドを確認することができる。Taq Ｉ切断（）、Al
u Ｉ切断（）についてもほぼ予定の長さの断片である
ことを示すバンドが得られているが、リファレンスと長
さの比較を行うと原因は不明だが全体的に予定より10bp
〜20bp程度短めの断片になっているようである。
【００４９】実施例３ライゲーションにおける最適条件 断片どうしのライゲーションにおける反応効率を高める
ために反応条件の検討を行った。酵素量と反応時間につ
いては表３に様に条件を設定して検討した。
ために反応条件の検討を行った。酵素量と反応時間につ
いては表３に様に条件を設定して検討した。
【００５０】
【表３】
【００５１】Taq リガーゼとT4 DNAリガーゼの比較もあ
わせて行った。また反応温度を45℃、50℃、55℃と変化
させて反応効率を比較した。結果は図１６、１７に示
す。なお、T4 DNAリガーゼを用いた反応は、前記実験条
件のＰＣＲ断片どうしのライゲーション’の項に記し
た方法であった。図１６及び１７に示す各レーンの説明
及び電気泳動条件は以下の通りである。図１６の各レーンの説明 Ｔａｑリガーゼ１Ｕ、１時間、Ｔａｑリガーゼ１
Ｕ、３時間、Ｔａｑリガーゼ１Ｕ、１０時間、Ｔａ
ｑリガーゼ１０Ｕ、１時間、Ｔａｑリガーゼ１０Ｕ、
３時間、Ｔａｑリガーゼ１０Ｕ、１０時間、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼ、１時間、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、３時
間、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、１０時間、(10)Ｔａｑリガ
ーゼ４０Ｕ、１時間、(11)Ｔａｑリガーゼ４Ｕ、１時間図１７の各レーンの説明 ４５℃、５０℃、５５℃図１６及び１７の電気泳動条件 ４％アクリルアミド（１９：１）、８Ｍ尿素 電圧：２５０Ｖ、電流：１３５ｍＡ、ＳＡＥ緩衝液、泳
動時間：６０分、温度：６０℃
わせて行った。また反応温度を45℃、50℃、55℃と変化
させて反応効率を比較した。結果は図１６、１７に示
す。なお、T4 DNAリガーゼを用いた反応は、前記実験条
件のＰＣＲ断片どうしのライゲーション’の項に記し
た方法であった。図１６及び１７に示す各レーンの説明
及び電気泳動条件は以下の通りである。図１６の各レーンの説明 Ｔａｑリガーゼ１Ｕ、１時間、Ｔａｑリガーゼ１
Ｕ、３時間、Ｔａｑリガーゼ１Ｕ、１０時間、Ｔａ
ｑリガーゼ１０Ｕ、１時間、Ｔａｑリガーゼ１０Ｕ、
３時間、Ｔａｑリガーゼ１０Ｕ、１０時間、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼ、１時間、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、３時
間、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、１０時間、(10)Ｔａｑリガ
ーゼ４０Ｕ、１時間、(11)Ｔａｑリガーゼ４Ｕ、１時間図１７の各レーンの説明 ４５℃、５０℃、５５℃図１６及び１７の電気泳動条件 ４％アクリルアミド（１９：１）、８Ｍ尿素 電圧：２５０Ｖ、電流：１３５ｍＡ、ＳＡＥ緩衝液、泳
動時間：６０分、温度：６０℃
【００５２】Taq リガーゼ 1U では時間による変化がそ
れほど認められないが、10U では10時間反応させたもの
が比較的反応効率がよい。T4 DNAリガーゼによる産物も
時間経過にともなってやや増加している思われる。一方
Taq リガーゼ 4U と40U を１時間反応させたものを比較
してみるとそれほど差があるとは言えない。また Taqリ
ガーゼとT4 DNAリガーゼを比較してみると Taqリガーゼ
の方が高温で特異的に反応を行うことができるため副産
物が少なくなってる。温度を変えて反応を行った実験で
は、比較によって差を見いだすことはできなかった。
尚、 Taqリガーゼを用いることはT4 DNAリガーゼを用い
るよりも高温処理が可能であり不安定な構造に由来する
ライゲーション産物を排除することが可能であり、その
結果副産物を減らすことができるという観点から有効で
ある。
れほど認められないが、10U では10時間反応させたもの
が比較的反応効率がよい。T4 DNAリガーゼによる産物も
時間経過にともなってやや増加している思われる。一方
Taq リガーゼ 4U と40U を１時間反応させたものを比較
してみるとそれほど差があるとは言えない。また Taqリ
ガーゼとT4 DNAリガーゼを比較してみると Taqリガーゼ
の方が高温で特異的に反応を行うことができるため副産
物が少なくなってる。温度を変えて反応を行った実験で
は、比較によって差を見いだすことはできなかった。
尚、 Taqリガーゼを用いることはT4 DNAリガーゼを用い
るよりも高温処理が可能であり不安定な構造に由来する
ライゲーション産物を排除することが可能であり、その
結果副産物を減らすことができるという観点から有効で
ある。
【図１】 本発明の製造方法を示すスキーム。
【図２】 本発明の製造方法を示すスキーム。
【図３】 本発明の製造方法を示すスキーム。
【図４】 本発明の製造方法を示すスキーム。
【図５】 プライマーの製造方法を示すスキーム。
【図６】 実施例１及び２における、ｆｄファージの各
遺伝子の様子を示す図。
遺伝子の様子を示す図。
【図７】 実施例１の組換えの詳細及び使用プライマー
の配列を示す図。
の配列を示す図。
【図８】 実施例１に用いたプライマーの電気泳動結果
を示す図面に代わる写真。
を示す図面に代わる写真。
【図９】 実施例１においてＰＣＲにより作成した各断
片の電気泳動結果を示す図面に代わる写真。
片の電気泳動結果を示す図面に代わる写真。
【図１０】 実施例１においてライゲーションより得ら
れた各断片の電気泳動結果を示す図面に代わる写真。
れた各断片の電気泳動結果を示す図面に代わる写真。
【図１１】 制限酵素の認識部位と組換えとの関係を示
す図。
す図。
【図１２】 実施例２の組換えの詳細及び使用プライマ
ーの配列を示す図。
ーの配列を示す図。
【図１３】 実施例２に用いたプライマーの電気泳動結
果を示す図面に代わる写真。
果を示す図面に代わる写真。
【図１４】 実施例２においてＰＣＲにより作成した各
断片の電気泳動結果を示す図面に代わる写真。
断片の電気泳動結果を示す図面に代わる写真。
【図１５】 実施例２においてライゲーションより得ら
れた各断片の電気泳動結果を示す図面に代わる写真。
れた各断片の電気泳動結果を示す図面に代わる写真。
【図１６】 実施例３において条件の異なるライゲーシ
ョンより得られた各断片の電気泳動結果を示す図面に代
わる写真。
ョンより得られた各断片の電気泳動結果を示す図面に代
わる写真。
【図１７】 実施例３において条件の異なるライゲーシ
ョンより得られた各断片の電気泳動結果を示す図面に代
わる写真。
ョンより得られた各断片の電気泳動結果を示す図面に代
わる写真。
Claims (10)
- 【請求項１】（１）少なくとも一方のプライマーＤＮＡ
として、リボヌクレオチド基を含み、該リボヌクレオチ
ド基の３’側の配列がテンプレートＤＮＡのプラス鎖又
はマイナス鎖の被増幅領域の端部の少なくとも一部の配
列と相補的であり、前記リボヌクレオチド基の５’側の
配列が粘着末端形成用の配列であるプライマー（Ａ）を
用いてポリメラーゼ連鎖反応により、プラス鎖及びマイ
ナス鎖の少なくとも一方の５’末端近傍にリボヌクレオ
チド基を含み、かつテンプレートＤＮＡの被増幅領域に
相当するＤＮＡ配列を含む２本鎖ＤＮＡ断片を増幅合成
する工程、（２）前記工程（１）で合成された２本鎖Ｄ
ＮＡ断片をＲＮＡ分解酵素処理又はアルカリ処理して、
リボヌクレオチド基及び該リボヌクレオチド基から５’
側のＤＮＡ配列を除去して、少なくとも一方が粘着末端
である２本鎖ＤＮＡ断片を製造する工程、（３）前記工
程（２）で得られた粘着末端を有する２本鎖ＤＮＡ断片
をリン酸化処理する工程、及び（４）前記工程（３）で
リン酸化処理して得られた粘着末端を有する２本鎖ＤＮ
Ａ断片と、該粘着末端と相補関係にある粘着末端を有す
る２本鎖ＤＮＡ断片とをＤＮＡリガーゼにより連結する
ことを含む連結した２本鎖ＤＮＡの製造方法。 - 【請求項２】 工程（３）で得られた２本鎖ＤＮＡ断片
の粘着末端と少なくとも一部が相補関係にある工程
（４）で連結される２本鎖ＤＮＡ断片の粘着末端が、制
限酵素を用いて切断することによって形成されたもので
ある請求項１記載の製造方法。 - 【請求項３】 工程（３）で得られた２本鎖ＤＮＡ断片
の粘着末端と少なくとも一部が相補関係にある工程
（４）で連結される２本鎖ＤＮＡ断片が、請求項１記載
の方法を用いて製造された粘着末端を有する別の２本鎖
ＤＮＡ断片である請求項１記載の製造方法。 - 【請求項４】 工程（１）の増幅合成において用いたプ
ライマーＤＮＡのいずれもが前記プライマー（Ａ）であ
り、かつ一方のプライマーＤＮＡのリボヌクレオチド基
の３’側の配列がテンプレートＤＮＡのプラス鎖の被増
幅領域の端部の少なくとも一部の配列と相補的であり、
他方のプライマーＤＮＡのリボヌクレオチド基の３’側
の配列がテンプレートＤＮＡのマイナス鎖の被増幅領域
の端部の少なくとも一部の配列と相補的であり、 工程（３）で得られた２本鎖ＤＮＡ断片の両末端ともが
粘着末端である請求項１記載の製造方法。 - 【請求項５】 工程（４）において、工程（３）で得ら
れた２本鎖ＤＮＡ断片と連結する粘着末端を有する２本
鎖ＤＮＡ断片が、制限酵素により切断された両末端とも
に粘着末端であるプラスミドＤＮＡの断片である請求項
４記載の製造方法。 - 【請求項６】 少なくとも１つのテンプレートＤＮＡ上
の２種以上の被増幅領域に相当するＤＮＡ配列を含む連
結した２本鎖ＤＮＡを製造する方法であって、（１）プ
ライマーとして、リボヌクレオチド基を含み、該リボヌ
クレオチド基の３’側の配列がテンプレートＤＮＡのプ
ラス鎖又はマイナス鎖の被増幅領域の端部の少なくとも
一部の配列と相補的であり、前記リボヌクレオチド基の
５’側の配列が粘着末端形成用の配列であるプライマー
（Ａ） テンプレートＤＮＡのプラス鎖又はマイナス鎖の被増幅
領域の端部の少なくとも一部の配列と相補的であり、
３’末端がリボヌクレオチド基であるプライマー
（Ｂ）、及びテンプレートＤＮＡのプラス鎖又はマイナ
ス鎖の被増幅領域の端部の少なくとも一部の配列と相補
的であるプライマー（Ｃ）の３通りのプライマーＤＮＡ
を用い、 連結した２本鎖ＤＮＡ断片の両端部を構成する２本鎖Ｄ
ＮＡ断片の増幅合成にプライマー（Ａ）と（Ｃ）との組
合せ及びプライマー（Ｂ）と（Ｃ）との組合せを用い、
かつ被増幅領域が３つ以上の場合には、連結した２本鎖
ＤＮＡ断片の中間部を構成する２本鎖ＤＮＡ断片の増幅
合成にプライマー（Ａ）と（Ｂ）との組合せの１種又は
２種以上を用い、 ポリメラーゼ連鎖反応により、プラス鎖及びマイナス鎖
の一方の５’末端近傍にリボヌクレオチド基を含み、か
つテンプレートＤＮＡの被増幅領域に相当するＤＮＡ配
列を含む２種の２本鎖ＤＮＡ断片と、被増幅領域が３つ
以上の場合には、プラス鎖及びマイナス鎖の両方の５’
末端近傍にリボヌクレオチド基を含み、かつテンプレー
トＤＮＡの被増幅領域に相当するＤＮＡ配列を含む１種
以上の２本鎖ＤＮＡ断片とを増幅合成する工程、（２）
前記工程（１）で増幅合成された２本鎖ＤＮＡ断片をＲ
ＮＡ分解酵素処理又はアルカリ処理して、リボヌクレオ
チド基及び該リボヌクレオチド基から５’側のＤＮＡ配
列を除去して、一方又は両方が粘着末端である２本鎖Ｄ
ＮＡ断片を製造する工程、（３）前記工程（２）で得ら
れた粘着末端を有する２本鎖ＤＮＡ断片をリン酸化処理
する工程、及び（４）前記工程（３）でリン酸化処理し
て得られた粘着末端を有する２種以上の２本鎖ＤＮＡ断
片同士をＤＮＡリガーゼにより連結することを含む連結
した２本鎖ＤＮＡの製造方法。 - 【請求項７】 被増幅領域が異なるテンプレートＤＮＡ
上にある請求項６記載の製造方法。 - 【請求項８】 プライマー（Ａ）のリボヌクレオチド基
の３’側の配列がヌクレオチド数８〜３０の範囲にある
請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法。 - 【請求項９】 プライマー（Ａ）のリボヌクレオチド基
の５’側の配列がヌクレオチド数３〜２０の範囲にある
請求項１〜８のいずれか１項に記載の製造方法。 - 【請求項１０】 プライマー（Ｂ）のリボヌクレオチド
基以外の配列がヌクレオチド数８〜３０の範囲にある請
求項６〜９のいずれか１項に記載の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6134670A JPH08268A (ja) | 1994-06-16 | 1994-06-16 | 連結した２本鎖ｄｎａの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6134670A JPH08268A (ja) | 1994-06-16 | 1994-06-16 | 連結した２本鎖ｄｎａの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08268A true JPH08268A (ja) | 1996-01-09 |
Family
ID=15133823
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6134670A Pending JPH08268A (ja) | 1994-06-16 | 1994-06-16 | 連結した２本鎖ｄｎａの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08268A (ja) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10077440B2 (en) | 2002-10-30 | 2018-09-18 | Nuevolution A/S | Method for the synthesis of a bifunctional complex |
| US10669538B2 (en) | 2001-06-20 | 2020-06-02 | Nuevolution A/S | Templated molecules and methods for using such molecules |
| US10730906B2 (en) | 2002-08-01 | 2020-08-04 | Nuevolutions A/S | Multi-step synthesis of templated molecules |
| US10865409B2 (en) | 2011-09-07 | 2020-12-15 | X-Chem, Inc. | Methods for tagging DNA-encoded libraries |
| US11118215B2 (en) | 2003-09-18 | 2021-09-14 | Nuevolution A/S | Method for obtaining structural information concerning an encoded molecule and method for selecting compounds |
| US11168321B2 (en) | 2009-02-13 | 2021-11-09 | X-Chem, Inc. | Methods of creating and screening DNA-encoded libraries |
| US11225655B2 (en) | 2010-04-16 | 2022-01-18 | Nuevolution A/S | Bi-functional complexes and methods for making and using such complexes |
| EP3929205A4 (en) * | 2019-02-18 | 2022-11-16 | Ajinomoto Co., Inc. | METHOD FOR PRODUCING A MODIFIED OLIGONUCLEOTIDE COMPRISING A COMPLEMENTARY SEQUENCE |
| US11674135B2 (en) | 2012-07-13 | 2023-06-13 | X-Chem, Inc. | DNA-encoded libraries having encoding oligonucleotide linkages not readable by polymerases |
-
1994
- 1994-06-16 JP JP6134670A patent/JPH08268A/ja active Pending
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10669538B2 (en) | 2001-06-20 | 2020-06-02 | Nuevolution A/S | Templated molecules and methods for using such molecules |
| US10730906B2 (en) | 2002-08-01 | 2020-08-04 | Nuevolutions A/S | Multi-step synthesis of templated molecules |
| US10077440B2 (en) | 2002-10-30 | 2018-09-18 | Nuevolution A/S | Method for the synthesis of a bifunctional complex |
| US11118215B2 (en) | 2003-09-18 | 2021-09-14 | Nuevolution A/S | Method for obtaining structural information concerning an encoded molecule and method for selecting compounds |
| US11965209B2 (en) | 2003-09-18 | 2024-04-23 | Nuevolution A/S | Method for obtaining structural information concerning an encoded molecule and method for selecting compounds |
| US11168321B2 (en) | 2009-02-13 | 2021-11-09 | X-Chem, Inc. | Methods of creating and screening DNA-encoded libraries |
| US11225655B2 (en) | 2010-04-16 | 2022-01-18 | Nuevolution A/S | Bi-functional complexes and methods for making and using such complexes |
| US10865409B2 (en) | 2011-09-07 | 2020-12-15 | X-Chem, Inc. | Methods for tagging DNA-encoded libraries |
| US11674135B2 (en) | 2012-07-13 | 2023-06-13 | X-Chem, Inc. | DNA-encoded libraries having encoding oligonucleotide linkages not readable by polymerases |
| EP3929205A4 (en) * | 2019-02-18 | 2022-11-16 | Ajinomoto Co., Inc. | METHOD FOR PRODUCING A MODIFIED OLIGONUCLEOTIDE COMPRISING A COMPLEMENTARY SEQUENCE |
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