ES2261072B1

ES2261072B1 - Fosforotioatos derivados de analogos a nucleosido para terapia antirretroviral.

Info

Publication number: ES2261072B1
Application number: ES200500800A
Authority: ES
Inventors: Luis Menendez Arias; Tania Matamoros Grande
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority date: 2005-04-06
Filing date: 2005-04-06
Publication date: 2007-12-16
Anticipated expiration: 2025-04-06
Also published as: WO2006106169A1; ES2261072A1

Abstract

Fosforotioatos derivados de análogos a nucleósido para terapia antirretroviral. La invención se refiere al uso de fosforotioatos análogos de nucleósido cíclicos o bien de derivados de nucleósidos acíclicos de fórmula (I) o (IB) que tienen actividad farmacológica como inhibidores de la enzima retrotranscriptasa (RT) y a su uso en terapia, en particular están dirigidos al tratamiento de infecciones causadas por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Estos compuestos son particularmente efectivos cuando la RT presenta combinaciones de mutaciones que confieren al VIH resistencia a los fármacos inhibidores de la RT.

Description

Fosforotioatos derivados de análogos a nucleósido para terapia antirretroviral.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a compuestos fosforotioatos derivados de análogos a nucleósido (tanto cíclicos como acíclicos), que tienen actividad farmacológica como inhibidores de la enzima retrotranscriptasa (RT) y a su uso en terapia, en particular están dirigidos al tratamiento de infecciones causadas por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).

Antecedentes de la invención

El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es un retrovirus de forma esférica, de unos 80-100 nm de diámetro, que presenta una envoltura lipídica en la que se localizan glicoproteínas de superficie. El genoma del VIH está constituido por dos cadenas de ARN monocatenario de polaridad positiva, de 9,8 kilobases [Coffin et al. (ed.). Retroviruses. Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, EE.UU., 1997]. En 1983, se identificó como el virus causante del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), enfermedad que hoy en día causa la muerte a más de 3 millones de personas cada año.

El VIH infecta principalmente células del sistema inmune y para su replicación y propagación requiere una serie de factores celulares aportados por el hospedador, además de proteínas virales que intervienen en diferentes etapas del ciclo vital. Las proteínas del VIH constituyen dianas terapéuticas de gran interés en el desarrollo de fármacos eficaces frente a la infección viral. Una de las dianas más importantes es la retrotranscriptasa (RT), enzima viral frente a la que actúan la mayoría de los fármacos actualmente disponibles en la clínica. La retrotranscriptasa es la enzima responsable de la replicación del ARN genómico del virus [Telesnitsky y Goff. En Retroviruses. Coffin et al. (ed.), p. 121-160, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, EE.UU., 1997]. Se trata de una enzima multifuncional con actividad ADN polimerásica dependiente de ARN y ADN y actividad endonucleasa (RNasa H).

Los inhibidores de la RT cuya utilización clínica frente a la infección por el VIH ha sido aprobada pueden clasificarse en tres grandes grupos de acuerdo a su estructura química: inhibidores análogos a nucleósido, fosfonatos derivados de nucleósidos acíclicos e inhibidores no análogos a nucleósido (para revisiones recientes, véanse Menéndez-Arias. Trends Pharmacol Sci 2002; 23: 381-388; De Clercq. Nature Rev Microbiol 2004; 2: 704-720). Hasta la fecha se ha aprobado la utilización clínica de siete inhibidores análogos a nucleósido: 3'-azido-3'-desoxitimidina (AZT, zidovudina), 2',3'-dideshidro-2',3'-didesoxitimidina (d4T, estavudina), 2',3'-didesoxiinosina (ddI, didanosina), 2',3'-didesoxi-3'-tiacitidina (3TC, lamivudina), 2',3'-didesoxicitidina (ddC, zalcitabina), (1S,4R)-4-[2-amino-6-(ciclopropilamino)-9H-purin-9-il]-2-ciclopenteno-1-metanol (abacavir), y 2',3'-didesoxi-5-fluoro-3'-tiacitidina (FTC, emtricitabina), además de un nucleósido fosfonato acíclico: 9-[2-(fosfonometoxi)propil]adenina (tenofovir), y otros se encuentran en estados preclínicos de desarrollo (De Clercq. Nature Rev Microbiol 2004; 2: 704-720; Sharma et al. Curr Top Med Chem 2004; 4: 895-919; Otto. Curr Opin Pharmacol 2004; 4: 431-436).

Todos estos compuestos han de transformarse en el interior de la célula en sus correspondientes derivados trifosforilados. Los inhibidores de la RT trifosforilados compiten con los sustratos naturales de la reacción de síntesis de ADN (los dNTPs), pero carecen del grupo 3'-OH presente en los dNTPs, por lo que una vez incorporados a cadena de ADN que se está sintetizando, se bloquea la reacción de polimerización.

Algunos de los inhibidores mencionados anteriormente, como el AZT, presentan el inconveniente de tener un cierto grado de toxicidad además de presentar otros efectos secundarios adversos, por lo que se han empleado también otros agentes antirretrovirales como 3'-azido-2',3'-didesoxiuridina y sus derivados mono, di y trifosfato (US 4,916,122) y tiofosfonatos orgánicos de fórmula CH_{3}NH(CH_{2})_{3}NH(CH_{2})_{3}SPO_{3}H_{2} (US 5,824,664) que superaban en parte estos inconvenientes.

Por otra parte, la efectividad terapéutica de los nucleósidos activos depende de la facilidad con la que pasen a través de las células y sufran la fosforilación. En este sentido, en la patente US 5,159,067 se reivindican compuestos de fórmula:

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en los que la característica principal es la presencia de un resto azúcar como grupo terminal R y la posibilidad de sustituir algunos oxígenos de la cadena de difosfato por átomos de azufre (grupos W).

Desde la implantación de terapias antirretrovirales potentes, basadas en la combinación de inhibidores de la RT y de la proteasa, ha disminuido sensiblemente la mortalidad y morbilidad de la infección por el VIH. Sin embargo, la aparición de virus resistentes al tratamiento antirretroviral constituye un problema importante que compromete el tratamiento de los pacientes a largo plazo.

La resistencia a fármacos inhibidores de la RT se adquiere mediante mutaciones en la región del genoma viral que codifica para dicha enzima. En el caso de los análogos a nucleósido y de los fosfonatos derivados de nucleósidos acíclicos, las mutaciones que confieren resistencia a dichos fármacos pueden actuar mediante dos mecanismos diferentes:

a.: Interfiriendo con la capacidad de la RT del VIH para incorporar los derivados trifosforilados del inhibidor, de modo que éste se incorporaría con menor eficacia catalítica que los correspondientes sustratos naturales (Deval et al. Curr Drug Metabol 2004, 5, 305-316).

b.: Aumentando la actividad de rescate de iniciadores bloqueados en su extremo 3' por inhibidores análogos a nucleósido o por fosfonatos derivados de nucleósidos acíclicos.

Entre las mutaciones que actúan a través del primer mecanismo podemos citar además del cambio M184V, a la combinación A62V/V75I/F77L/F116Y/Q151M, que constituye un ejemplo de multirresistencia (Shirasaka et al. Proc Natl Acad Sci USA 1995; 92: 2398-2402). En comparación con la RT silvestre (no mutada), las RTs portadoras de los cambios asociados a Q151M presentan una menor capacidad para incorporar análogos a nucleósido trifosforlidados, tales como AZT-trifosfato, d4T-trifosfato, ddC-trifosfato y ddA-trifosfato (Ueno et al. J Biol Chem 1995; 270: 23605-23611).

Por otro lado, la acumulación de mutaciones de resistencia a análogos a timidina (TAMs), como por ejemplo M41L, D67N, K70R, L210W, T215Y/F y K219Q/E, tiene un impacto clínico sobre la resistencia a AZT, d4T, ddI, abacavir y tenofovir, consistente con la elevada actividad fosforolítica dependiente de ATP sobre iniciadores terminados con inhibidores de la RT análogos a nucleósido, presentada por RTs portadoras de dichas mutaciones (Meyer et al. Mol Cell 1999; 4: 35-43; Meyer et al. Antimicrob Agents Chemother 2000; 44: 3465-3472; Boyer et al. J Virol 2001; 75: 4832-4842; Naeger et al. Antimicrob Agents Chemother 2002; 46: 2179-2184).

Se han identificado aislados del VIH portadores en su RT del cambio de aminoácido T69S, asociado a una inserción de dos aminoácidos (típicamente Ser-Ser, Ser-Gly o Ser-Ala) entre las posiciones 69 y 70 de la RT, y a una o varias TAMs. Estos virus presentan niveles altos de resistencia al AZT y moderados a otros inhibidores de la RT como d4T, ddC, ddI y tenofovir, en ensayos fenotípicos llevados a cabo con virus recombinante (Winters et al. J Clin Invest 1998; 102: 1769-1775; Larder et al. Antimicrob Agents Chemother 1999; 43: 1961-1967; Mas et al. EMBO J 2000; 19: 5752-5761; Lennerstrand et al. Antimicrob Agents Chemother 2001; 45: 2144-2146). Estos datos son consistentes con los niveles de actividad fosforolítica dependiente de ATP presentada por las correspondientes RTs en presencia de iniciadores bloqueados con AZT, d4T, ddA o tenofovir (Mas et al. EMBO J 2000; 19: 5752-5761; Mas et al. J Mol Biol 2002; 323: 181-197; Boyer et al. J Virol 2002; 76: 9143-9151; Meyer et al. J Virol 2003; 77: 3871-3877; White et al. Antimicrob Agents Chemother 2004; 48: 992-1003). Para la detección de dicha actividad se ha demostrado que además de la inserción y de la mutación T69S se requería la presencia de T215Y (Matamoros et al. J Biol Chem 2004; 279: 24569-24577).

Hasta la fecha no se dispone de inhibidores de la actividad fosforolítica dependiente de ATP, que pudieran utilizarse en la práctica clínica, y que pudieran ser utilizados frente a cepas portadoras de complejos de mutaciones de resistencia a análogos a timidina, o cepas multirresistentes portadoras de inserciones entre los codones 69 y 70. Por lo tanto, se hace necesario el disponer de compuestos que permitan bloquear esos mecanismos de resistencia que presentan las RTs portadoras de mutaciones que confieren una elevada actividad fosforolítica dependiente de ATP.

Breve descripción de la invención

La presente invención se basa en el descubrimiento de que derivados trifosforilados inhibidores de la RT derivados de nucleósidos, en los que se ha sustituido un oxígeno por azufre en el fosfato \alpha, son sustratos de la reacción de polimerización de ADN catalizada por la RT del VIH, y bloquean la elongación subsiguiente de la cadena de ADN.

Como característica principal, y al contrario de lo que sucede con derivados trifosforilados no modificados en el fosfato \alpha, estos compuestos no pueden ser eliminados por aquellas RTs resistentes portadoras de mutaciones que confieren una elevada actividad fosforolítica dependiente de ATP, inactivando así uno de los mecanismos de resistencia a inhibidores de la RT de mayor incidencia en la clínica.

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Así, un aspecto de la presente invención lo constituye el uso de un compuesto de fórmula (1) ó (IB)

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donde

n se selecciona de entre 0, 1 y 2;

A es un grupo C_{1}-C_{3} alquilo sustituido o no sustituido,

R es cualquiera de las bases nitrogenadas purinas o pirimidinas; y

R' y R'' se seleccionan independientemente de entre H y un grupo alquilo C_{1}-C_{10},

R''' es hidrógeno, un grupo azida, o no existe cuando entre los carbonos 2' y 3' hay un doble enlace,

la línea punteada entre los carbonos 2' y 3' indica la posibilidad de un doble enlace,

o bien una sal farmacéuticamente aceptable, un profármaco o un solvato del mismo,

para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un paciente infectado por el VIH y/o afectado por el Sindrome de InmunoDeficiencia Adquirida (SIDA).

En una variante preferida R' es hidrógeno. En otra variante preferida R'' es hidrógeno. En otra variante preferida R' es hidrógeno o un grupo azida. También se prefieren compuestos donde ambos R' y R'' son H.

En otra variante el compuesto es acíclico de fórmula (I) y el grupo A es el grupo -CH_{2}CH_{2}- o bien el grupo -CH(CH_{3})CH_{2}-, es decir compuestos análogos al adefovir o al tenofovir.

En otra variante el compuesto de fórmula (IB) es 3'-azido-3'-desoxitimidina-5'-O-(1-tiofosfato) (AZTTP\alphaS).

De forma preferente los compuestos se usan para el tratamiento de pacientes que presentan resistencia a fármacos inhibidores de retrotranscriptasa (RT) del virus de la inmunodeficiencia humana debido a mutaciones de la RT. Así, los pacientes pueden presentar resistencia a cualquiera de los fármacos zidovudina, estavudina, didanosina, lamivudina, zalcitabina, abacavir, emtricitabina, tenofovir, adefovir o a mezclas de los mismos.

En otro aspecto la invención también se dirige a una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de fórmula (I) ó (IB) tal como están definidos anteriormente, o una sal farmacéuticamente aceptable, un profármaco o un solvato del mismo, y al menos un portador, adyuvante, o vehículo farmacéuticamente aceptable, para la administración a un paciente.

Un tercer aspecto de la invención lo constituye un compuesto de fórmula (I)

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donde

n se selecciona de entre 0, 1 y 2;

A es un grupo C_{1}-C_{3} alquilo sustituido o no sustituido,

R es cualquiera de las bases nitrogenadas purinas o pirimidinas; y

R' y R'' se seleccionan independientemente de entre H y un grupo alquilo C_{1}-C_{10}, o bien una sal farmacéuticamente aceptable, un profármaco o un solvato del mismo.

Breve descripción del contenido de las figuras

Figura 1. Modelo que representa el mecanismo de escisión de iniciadores terminados con inhibidores análogos a nucleósido (por ejemplo, AZT).

Figura 2. (A) Complejo molde-iniciador utilizado en el estudio, y posición donde se incorporará el AZT-trifosfato.

(B) Cinética de rescate del iniciador terminado con AZT, en reacciones catalizadas por la RT silvestre (cepa BH10) y una RT resistente a múltiples fármacos antirretrovirales (RT SS). Los carriles P y B corresponden al iniciador antes y después de incorporar el inhibidor. El resto de carriles (de izquierda a derecha) corresponden a alícuotas recogidas a los 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 20 y 30 min tras la adición de 3,2 mM ATP. La actividad fosforolítica de rescate correlaciona con la cantidad de producto totalmente elongado.

(C) Cinética de rescate de iniciadores terminados con AZT, obtenida en presencia de: (\circ) ATP; (\bullet) ATP\gammaS.

Figura 3. (A) Eficacia de incorporación observada con el diastereoisómero S_{p} del AZTTP\alphaS, en comparación con el diastereoisómero R_{p} del mismo compuesto. P indica la posición del iniciador no elongado y los carriles 1 a 7 corresponden a alícuotas de la reacción recogidas tras 10 s, 20 s, 30 s, 1 min, 5 min, 15 min y 30 min de incubación.

(B) Comparación de la eficacia de rescate de la RT SS, en presencia de ATP 3,2 mM, sobre iniciadores terminados con AZT-monofosfato, o con los productos resultantes de la incorporación de los diastereoisómeros S_{p} y R_{p} del AZTTP\alphaS. Los carriles P y B corresponden al iniciador antes y después de incorporar el inhibidor. El resto de carriles (de izquierda a derecha) corresponden a alícuotas recogidas a los 2, 4, 6, 8, 10, 15 y 30 min tras la adición de ATP.

Descripción detallada de la invención

Los compuestos empleados en la presente invención son derivados fosforilados inhibidores de la enzima retrotranscriptasa (RT), responsable de la replicación del ARN genómico del virus VIH causante del SIDA. Presentan una fórmula (I) ó (IB) como se han definido anteriormente y en las reivindicaciones.

Los compuestos se pueden preparar mediante métodos conocidos del estado de la técnica, como por ejemplo los descritos en W093/23415.

El término "sales, solvatos, profármacos farmacéuticamente aceptables" se refiere a cualquier sal, éster, solvato farmacéuticamente aceptable, o cualquier otro compuesto que, cuando se administra a un receptor es capaz de proporcionar (directamente o indirectamente) un compuesto según se describe en el presente documento. Sin embargo, se apreciará que las sales farmacéuticamente no aceptables también están dentro del alcance de la invención ya que éstas pueden ser útiles en la preparación de sales farmacéuticamente aceptables. La preparación de sales, profármacos y derivados puede llevarse a cabo mediante métodos conocidos en la técnica.

Por ejemplo, sales farmacéuticamente aceptables de compuestos previstos en el presente documento, se sintetizan mediante métodos químicos convencionales a partir de un compuesto original que contiene un resto básico ó ácido. Generalmente, tales sales se preparan, por ejemplo, haciendo reaccionar las formas de ácido o base libre de los compuestos con una cantidad estequiométrica de la base o ácido apropiado en agua o en un disolvente orgánico o en una mezcla de los dos. Generalmente, se prefieren medios no acuosos como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. Ejemplos de sales de adición de ácidos incluyen sales de adición de ácido mineral tales como, por ejemplo, clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, sulfato, nitrato, fosfato y sales de adición de ácido orgánico tales como, por ejemplo, acetato, maleato, fumarato, citrato, oxalato, succinato, tartrato, malato, mandelato, metanosulfonato y p-toluensulfonato. Ejemplos de sales de adición de bases incluyen sales inorgánicas tales como, por ejemplo, sales de sodio, potasio, calcio, amonio, magnesio, aluminio y litio, y sales de bases orgánicas tales como, por ejemplo, etilenodiamina, etanolamina, N,N-dialquilenetanolamina, trietanolamina, glucamina y sales de aminoácidos básicos.

Los derivados o profármacos particularmente favoritos son aquellos que aumentan las biodisponibilidad de los compuestos de esta invención cuando se administran tales compuestos a un paciente (por ejemplo, haciendo que un compuesto administrado por vía oral se absorba más fácilmente por la sangre), o que potencia la liberación del compuesto original en un compartimento biológico (por ejemplo, el cerebro o el sistema linfático) con relación a la especie original.

Ejemplo de modificaciones que se pueden hacer a los compuestos usados en la invención son las descritas por ejemplo en US5,159,067, tal como la incorporación de grupos azúcar sobre el fosfato terminal, o bien modificaciones conocidas como las que están presentes en prodrogas conocidas de los fármacos zidovudina, estavudina, didanosina, lamivudina, zalcitabina, abacavir, emtricitabina, tenofovir, adefovir y que se encuentran actualmente en desarrollo preclínico o clínico.

Cualquier compuesto que es un profármaco de un compuesto de fórmula (I) está dentro del alcance de la invención. El término "profármaco" se usa en su sentido más amplio y abarca aquellos derivados que se convierten en vivo en los compuestos de la invención. Tales derivados serán evidentes para los expertos en la técnica, e incluyen, dependiendo de los grupos funcionales presentes en la molécula y sin limitación, los siguientes derivados de los compuestos presentes: ésteres, ésteres de aminoácido, ésteres de fosfato, ésteres de sulfonato de sales metálicas, carbamatos, y amidas. Ejemplos de métodos para producir una prodroga de un compuesto activo dado son conocidos por el experto en la materia y pueden encontrarse por ejemplo en Krogsgaard-Larsen et al. "Textbook of Drug design and Discovery" Taylor & Francis (April 2002).

Los compuestos empleados en la invención pueden estar en forma cristalina como compuestos libres o como solvatos y se pretende que ambas formas están dentro del alcance de la presente invención. Los métodos de solvatación se conocen generalmente dentro de la técnica. Los solvatos adecuados son solvatos farmacéuticamente aceptables. En una realización particular, el solvato es un hidrato.

Los compuestos empleados en la presente invención representados por la fórmula (1) anteriormente descrita pueden incluir enantiómeros, dependiendo de la presencia de centros quirales sobre un C o sobre un P, o isómeros, dependiendo de la presencia de enlaces múltiples (por ejemplo, Z, E). Los isómeros, enantiómeros o diastereoisómeros individuales y las mezclas de los mismos caen dentro del alcance de la presente invención.

Las bases nitrogenadas purinas se refieren a las bases adenina o guanina naturales o sintéticas. Las bases nitrogenadas pirimidinas se refieren a las bases citosina, timina o uracilo naturales o sintéticas.

En una realización preferente de la invención R' es hidrógeno. En otra realización preferente R'' es también hidrógeno cuando n>0.

Los inhibidores de la enzima RT de fórmula (IB) pertenecen a los denominados inhibidores análogos a nucleósido y, dentro de su estructura, hay que destacar dos aspectos fundamentales:

-: la sustitución de un oxígeno por un azufre en el fosfato \alpha; y

-: la ausencia de grupos -OH en la posición 3' de su anillo de ribosa.

Los inhibidores de la RT desarrollados hasta la fecha carecen asimismo del grupo 3'-OH. Se caracterizan porque compiten con los sustratos naturales de la reacción de síntesis de ADN (los dNTPs), pero al carecer del grupo 3'-OH, una vez incorporados a la cadena de ADN, bloquean la reacción de polimerización.

No obstante, se ha observado que puede conseguirse una resistencia a los inhibidores de la RT que presentan esta característica a través de la acumulación de mutaciones en el gen pol del virus VIH. Estas mutaciones pueden dar lugar a RTs que presentan una menor capacidad para incorporar el inhibidor fosforilado en la cadena de ADN que se está sintetizando, o bien pueden actuar confiriendo a la RT una actividad fosforolítica dependiente de ATP que le permite eliminar el inhibidor del extremo 3'.

Mediante el empleo de los compuestos de fórmula (IB) tal como se definieron anteriormente se ha podido ver que la presencia de un azufre en lugar de un oxígeno como sustituyente del fosfato \alpha de un nucleósido-trifosfato, en el que el anillo de ribosa carece del grupo 3'-OH, permite la incorporación del nucleótido en la cadena de ADN sintetizada por la RT, pero evita su eliminación por fosforolisis dependiente de ATP, inactivando así uno de los mecanismos de resistencia a inhibidores de la RT de mayor incidencia en la clínica.

Por lo tanto en una variante preferida de la invención se usan compuestos análogos a cualquiera de los compuestos zidovudina, estavudina, didanosina, lamivudina, zalcitabina, abacavir, emtricitabina, tenofovir, adefovir donde se ha sustituido un oxigeno por un azufre como sustituyente del fosfato \alpha.

Entre las RTs presentes en virus resistentes a fármacos antirretrovirales, se han observado distintos niveles de actividad fosforolítica dependiente de ATP. En la Tabla 1 se recogen aquellas combinaciones de mutaciones que confieren niveles significativos de actividad fosforolítica dependiente de ATP. Los niveles más altos de actividad se han observado con RTs derivadas de aislados clínicos y portadoras de la inserción T69SSS (esto es, del cambio Thr-69 \rightarrow Ser junto con la inserción de dos serinas entre las posiciones 69 y 70 de la RT), acompañadas del cambio Thr-215 \rightarrow Tyr y otros cambios asociados en la clínica a resistencia a AZT (M41L, D67N, L210W, etc).

TABLA 1 Mutaciones y combinaciones de mutaciones que dan lugar a RTs con actividad fosforolítica dependiente de ATP, y para las que se ha demostrado in vitro su capacidad para escindir del extremo 3' del iniciador a los inhibidores indicados en cada caso

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El rescate de iniciadores terminados con un inhibidor análogo de nucleósido, implica la escisión del inhibidor que bloquea el extremo 3' del ADN que se está sintetizando y su posterior elongación (Figura 1). Las RTs que poseen actividad fosforolítica dependiente de ATP son capaces de eliminar los distintos inhibidores utilizados en clínica con eficacia variable. Así, diversos estudios han demostrado que la eliminación es más eficaz sobre iniciadores terminados con AZT-monofosfato, seguida por los terminados por d4T-monofosfato, y en menor medida, ddA-monofosfato (intermediario fisiológico de la didanosina) y tenofovir.

Un buen sistema modelo para estos estudios lo constituye la RT denominada SS, cuya descripción detallada llevamos a cabo con anterioridad (Mas et al. EMBO J 2000; 19: 5752-5761; Mas et al. J Mol Biol 2002; 323: 181-197). Esta enzima se caracteriza por presentar un cambio de aminoácido en la posición 69 (T69S), acompañado por una inserción de dos serinas, y contiene además una serie de mutaciones adicionales entre las que se incluyen los cambios M41L, A62V, K70R, V118I, M184I, L210W y T215Y. Esta RT tiene una actividad fosforolítica dependiente de ATP muy elevada y es capaz de escindir con mucha eficacia los iniciadores terminados con AZT.

El uso de los compuestos según la invención es particularmente efectivo para el caso de RTs portadoras de las siguientes combinaciones de mutaciones:

M41L/A62V/T69S/K70R/V118I/M184I/L210W/T215Y, M41L/A62V/D67N/T69SSS/K70R/V118I/M184I/ L210W/T215Y,

M41L/A62V/T69SSS/K70R/V 118I/M1841/L210W/T215Y,

M41L/D67N/K70R/T215Y/K219Q, M41 L/T69S/L74V/L210W/T215Y,

M41L/T69SAG/L210W/R211 K/L214F/T215Y,

M41L/T69SSG/L210W/R211K/L214F/T215Y, M41L/T69SSS/L74V/L210W/T215Y,

M41L/T69SSS/L210W/R211K/L214F/T215Y, M41L/T69SAG/T215Y,

M41L/T69SSG/T215Y, M41L/T69SSS/T215Y, M41L/T215Y, D67N/K70R,

D67N/K70R/T215F/K219Q, D67N/K70R/T215Y, D67N/K70R/T215Y/K219Q,

T69SSG/T215Y, T69SSS/T215Y, T215F/K219Q y T215Y.

La reacción de rescate implica la formación de un dinucleósido polifosfato que, en el caso de que el ribonucleótido utilizado sea ATP y el iniciador rescatado se encuentre bloqueado con AZT-monofosfato, formaría un dinucleósido tetrafosfato de estructura AppppAZT. Se sabe que la hidrólisis de los enlaces fosfodiéster entre los fosfatos \alpha y \beta y \beta y \gamma del ATP (o ribonucleótido-trifosfato equivalente) no es necesaria para la formación del correspondiente dinucleósido polifosfato (Meyer et al. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95: 13471-13476). Sin embargo, la utilización de adenosina-5'-\gamma-tiotrifosfato (ATP\gammaS) en lugar de ATP en la reacción de rescate de iniciadores bloqueados con AZT-monofosfato nos permitió comprobar que la velocidad de rescate se reducía al 50% aproximadamente (Figura 2C; Ejemplo 1), demostrándose la necesidad de disponer en la reacción de todos los oxígenos sustituyentes del fosfato y del
ATP.

Por otro lado, se sabe que las ADN polimerasas son capaces de incorporar nucleósidos 5'-O-(1-tiotrifosfato) derivados de adenina, timina, guanosina y citosina, si bien la estereoquímica de la reacción juega un papel importante en el proceso. Así, solamente la incorporación del diastereoisómero S_{p} del nucleósido 5'-O-(1-tiotrifosfato) resulta eficaz, siendo mucho menos efectiva la incorporación del diastereoisómero R_{p} (Eckstein. Annu Rev Biochem 1985; 54: 367-402). Además, la incorporación del nucleótido conlleva la inversión de la configuración, de forma que el diastereoisómero S_{p} del nucleósido 5'-O-(1-tiotrifosfato) se convierte en diastereoisómero R_{p} en el fosforotioato terminal del ADN sintetizado (Bartlett y Eckstein. J Biol Chem 1982; 257:8879-8884).

La incorporación de 3'-azido-3'-desoxitimidina-5'-O-(1-tiotrifosfato) (AZTTP\alphaS) por parte de la RT del VIH da lugar a una cadena de ADN bloqueada en su extremo 3', inhibiéndose así el proceso de elongación. El AZTTP\alphaS cuya fórmula responde a la estructura:

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puede adquirirse a la empresa TriLink Biotechnologies (San Diego, California, EE.UU.), cuyas preparaciones contienen el diastereoisómero S_{p} en una relación 2 a 1, con respecto al R_{p}. Ambos diastereoisómeros pueden separarse mediante cinematografía en fase reversa (HPLC) utilizando una columna Vydac C_{18} 218TP54 (4.6 x 250 mm), y eluyéndose en condiciones isocráticas (5% acetonitrilo en tampón acetato de trietilamonio 10 mM, pH 6,8). En estas condiciones, eluye primero el diastereoisómero S_{p} y posteriormente el R_{p}. El catión trietilamonio puede intercambiarse con cationes de sodio haciendo pasar la solución por una resina de intercambio catiónico Dowex 50WX8-200 (Sigma).

El ensayo de incorporación y rescate se puede llevar a cabo con un complejo molde-iniciador, cuyo molde lo formaría un oligonucleótido de ADN (por ejemplo, D38, 5'-GGGTCCTTTCTTACCTGCAAGAATGTATAGCCC
TACCA-3') y el iniciador sería un oligonucleótido más corto, complementario al anterior (por ejemplo, 25PG5A, 5'-TGGTAGGGCTATACATTCTTGCAGG-3') (Figura 2A). El oligonucleótido de menor tamaño se marcará primero en su extremo 5' con [\gamma-^{32}P]ATP y polinucleótido quinasa, y a continuación se formará el complejo molde-iniciador siguiendo procedimientos ya descritos (Mas et al. J Mol Biol 2002; 323: 181-197; Matamoros et al. J Biol Chem 2004; 279: 24569-24577). El ensayo se inicia incubando la RT (a 20-30 nM en concentración de enzima activa) y el complejo molde-iniciador (20-30 nM) durante 10 min a 37ºC. A continuación se añade el sustrato (por ejemplo, AZT-trifosfato o uno de los diastereoisómeros del AZTTP\alphaS) a una concentración suficientemente alta (>20 \muM) como para permitir la adición completa de un nucleótido en el extremo 3' del iniciador. La reacción de rescate se lleva a cabo añadiendo posteriormente una mezcla de los cuatro dNTPs naturales (todos a concentración 100 \muM, salvo el dATP que se suministra a 1 \muM) y ATP (u otro ribonucleótido trifosfato) a 3.2 mM. La baja concentración de dATP es necesaria para evitar la formación de "dead-end complexes", tal como se describe con detalle en trabajos previos de nuestro grupo (Mas et al. EMBO J 2000; 19: 5752-5761; Mas et al. J Mol Biol 2002; 323: 181-197; Matamoros et al. J Biol Chem 2004; 279: 24569-24577). La reacción se detiene añadiendo 10 mM EDTA disuelta en formamida al 90%. Cuando hay rescate, y por tanto escisión del inhibidor del extremo 3' terminal del iniciador, se permite que la síntesis de ADN continúe hasta alcanzar el final del molde, apareciendo productos largos, que se separan en geles desnaturalizantes de poliacrilamida al 20% con urea 8 M. Los resultados se analizan utilizando placas fotoestimulables y un lector de placas (por ejemplo, BAS 1500 scanner, Fuji) con su correspondientes programas de análisis, para la cuantificación de los resultados.

La expresión y purificación de RTs recombinantes utilizadas para demostrar el concepto que justifica la invención se ha descrito con anterioridad (Mas et al. EMBO J 2000; 19: 5752-5761; Mas et al. J Mol Biol 2002; 323: 181-197; Matamoros et al. J Biol Chem 2004; 279: 24569-24577).

Utilizando la metodología anterior se demuestra que tanto en reacciones catalizadas por RTs silvestres (por ejemplo, la de la cepa BH10), como por RTs resistentes a múltiples inhibidores análogos a nucleósido (por ejemplo, RT SS), ambos diastereoisómeros del AZTTP\alphaS (S_{p} y R_{p}) pueden incorporarse a la cadena de ADN que se está sintetizando. Sin embargo, la incorporación del diastereoisómero S_{p} es significativamente más eficiente (Figura 3A), lo que confirma observaciones previas obtenidas con la RT no mutada y con los mutantes D67N/K70R/T215F/K219Q y M41L/L210W/T215Y (Sluis-Cremer y Parniak. Antivir Ther 2004; 9: S29).

Sin embargo y de forma sorprendente, una vez incorporados, ninguno de los diastereoisómeros puede ser eliminado del 3' terminal del iniciador por una RT con elevada actividad fosforolítica dependiente de ATP como es el caso de la RT SS (Figura 3B). Este hecho contrasta con lo observado con el AZT, que en su forma trifosfato es un buen sustrato de la RT SS, pero que una vez incorporado puede escindirse con facilidad en presencia de concentraciones elevadas de ATP (Figura 2B).

Se demuestra por lo tanto que la presencia de un azufre en lugar de oxígeno como sustituyente del fosfato \alpha de un nucleósido-trifosfato, en el que el anillo de ribosa carece de un grupo 3'-OH, permite la incorporación del nucleótido en la cadena de ADN sintetizada por la RT, pero evita su eliminación por fosforolisis dependiente de ATP. Este resultado es extrapolable a fosfonatos de formula (I) derivados de nucleósidos acíclicos, como por ejemplo el tenofovir o el adefovir, en los que se reemplaza uno de los oxígenos sutituyentes del fosfato por azufre.

La presente invención proporciona adicionalmente composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de fórmula (I) o (IB), o una sal, derivado, profármaco, solvato o esteroisómero farmacéuticamente aceptable del mismo junto con un portador, adyuvante, o vehículo farmacéuticamente aceptable, para la administración a un paciente.

Ejemplos de composiciones farmacéuticas incluyen cualquier composición sólida (comprimidos, pastillas, cápsulas, gránulos etc.) o líquida (soluciones, suspensiones o emulsiones) para su administración oral, tópica o parenteral.

En una realización preferida las composiciones farmacéuticas están en forma oral, bien sólida o líquida. Formas farmacéuticas adecuadas para la administración oral pueden ser comprimidos, cápsulas, jarabes o soluciones y pueden contener excipientes convencionales conocidos en la técnica, tales como agentes aglutinantes, por ejemplo sirope, acacia, gelatina, sorbitol, tragacanto, o polivinilpirrolidona; cargas, por ejemplo lactosa, azúcar, almidón de maíz, fosfato cálcico, sorbitol o glicina; lubricantes para la preparación de comprimidos, por ejemplo estearato de magnesio; disgregantes, por ejemplo almidón, polivinilpirrolidona, glicolato sódico de almidón o celulosa microcristalina; o agentes humectantes farmacéuticamente aceptable tales como laurilsulfato sódico.

Las composiciones sólidas orales pueden prepararse mediante métodos convencionales de mezclado, relleno o preparación de comprimidos. Las operaciones de mezclado repetidas pueden usarse para distribuir el principio activo por la totalidad de esas composiciones empleando grandes cantidades de agentes de carga. Tales operaciones son convencionales en la técnica. Los comprimidos pueden prepararse, por ejemplo, mediante granulación en húmedo o en seco, y recubrirse de forma opcional según métodos bien conocidos en la práctica farmacéutica normal, en particular con un recubrimiento entérico.

Las composiciones farmacéuticas, también pueden adaptarse para la administración parenteral, tales como soluciones estériles, suspensiones o productos liofilizados en una forma farmacéutica unitaria apropiada. Pueden usarse excipientes adecuados, tales como agentes de granel, agentes tamponantes o tensioactivos.

Las formulaciones mencionadas se prepararán usando métodos habituales tales como aquellos descritos o referidos en las Farmacopeas Española y de los Estados Unidos y en textos de referencia similares.

La administración de los compuestos o composiciones empleados en la presente invención puede ser mediante cualquier método adecuado, tal como infusión intravenosa, preparaciones orales y administración intraperitoneal e intravenosa. Se prefiere la administración oral debido a la comodidad para el paciente y al carácter crónico de las enfermedades que se van a tratar.

Los compuestos y composiciones empleados en esta invención pueden usarse con otros fármacos para proporcionar una terapia de combinación. Los otros fármacos pueden formar parte de la misma composición o facilitarse como una composición separada para su administración al mismo tiempo o en momentos diferentes.

Los siguientes ejemplos se dan solo como una ilustración adicional de la invención, no deben de ser interpretados como limitantes de la invención tal como está definida en las reivindicaciones.

Ejemplos Ejemplo 1 Rescate de iniciadores terminados con AZT-monofosfato por ATP y adenosina-5'-\gamma-tiotrifosfato (ATP\gammaS)

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Las reacciones de rescate de iniciadores bloqueados con inhibidores análogos a nucleósido se llevaron a cabo utilizando el complejo molde-iniciador D38/25PGA (Figura 2A), en las condiciones descritas previamente (Mas et al. J Mol Biol 2002; 323: 181-197; Matamoros et al. J Biol Chem 2004; 279: 24569-24577). Brevemente, se incubó el complejo D38/25PGA (30 nM) durante 10 min a 37ºC, en presencia de la correspondiente RT (20-30 nM, concentración de enzima activa), en 25 \mul de tampón Hepes pH 7,0 que contenía NaCl 15 mM, acetato magnésico 15 mM, acetato potásico 130 mM, ditiotreitol (DTT) 1 mM y polietilén-glicol 6000 al 5% (peso/volumen). Las reacciones se iniciaron añadiendo 25 \mul de la misma disolución, en la que incluimos AZT-trifosfato (obtenido de Moravek Biochemicals, Brea, California, EE.UU.) a una concentración final de 25 \muM. Tras incubar las muestras durante 30 min a 37ºC, se obtuvo un iniciador elongado hasta 26 nucleótidos (véanse carriles B en la Figura 2B).

La reacción de rescate, que implica la escisión del AZT-monofosfato y la posterior elongación del iniciador, se llevó a cabo añadiendo a continuación una mezcla de todos los dNTPs suministrados a una concentración final de 100 \muM (salvo el dATP, que se suministró a 1 \muM) y ATP 3, 2 mM. Al cabo de 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 20 y 30 min se recogieron alícuotas de 5 \mul que se mezclaron con 5 \mul de una disolución que contenía 10 mM EDTA en formamida al 90% y 3 mg/ml de xilen-cianol FF y 3 mg/ml de Bromofenol Blue. Los productos de reacción se resolvieron en un gel desnaturalizante de poliacrilamida al 20%, que contenía urea 8 M, y los resultados se cuantificaron mediante la utilización de placas fotoestimulables (BAS-IP MS 2040, Fujifilm), empleando un lector BAS 1500 scanner (Fuji) y el programa de análisis de datos Tina versión 2.09 (Raytest Isotopenmessgerate Gmbh, Staubenhardt, Alemania). El porcentaje de iniciador (primer) rescatado se obtiene a partir de la intensidad de la banda de 38 nucleótidos, correspondiente a la elongación total del iniciador, relativa a la suma de ésta y la de 26 nucleótidos.

En la Figura 2B se observa que en presencia de ATP, la RT SS (portadora de los cambios M41L/A62V/D67N/
T69SSS/K70R/V118UM184UL210W/T215Y) tiene una elevada capacidad para rescatar iniciadores terminados con AZT, mientras que dicha actividad es prácticamente nula en el caso de la RT silvestre, derivada de la cepa BH10 del VIH-1. Sin embargo, si uno de los oxígenos sustituyentes del fosfato \gamma del ATP se reemplaza por azufre, la capacidad de rescate presentada por la RT SS disminuye significativamente (alrededor del 50%), tal como puede observarse en la Figura 2C.

Estos resultados demuestran que sustituciones que afecten a oxígenos implicados en la reacción de rescate pueden resultar determinantes de su eficacia de rescate.

Ejemplo 2 Rescate de iniciadores bloqueados como consecuencia de la incorporación de 3'-azido-3'-desoxitimidina-5'-O-(1-tiotrifosfato) (AZTTP\alphaS)

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Las reacciones de rescate se han llevado a cabo en este caso utilizando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1. Aquí la única diferencia radica en la utilización del AZTTP\alphaS, en lugar del AZT-trifosfato en aquellos experimentos en los que se analiza la incorporación de AZTTP\alphaS (Figura 3A), o su rescate (Figura 3B). Se han estudiado por separado los diastereoisómeros S_{p} y R_{p} del AZTTP\alphaS, obtenidos tras separación cromatográfica en HPLC de fase reversa, a partir del producto comercial suministrado por Trilink Biotechnologies. Todos los rescates se han llevado a cabo en presencia de ATP 3,2 mM.

En presencia de una concentración relativamente alta de AZTTP\alphaS (25 \muM), la RT SS es capaz de incorporar tanto su diastereoisómero S_{p} como el diastereoisómero R_{p}, si bien el primero se incorpora con una velocidad 12 veces superior que el segundo, manifestándose como el mejor sustrato de la reacción de polimerización.

El análisis de los resultados de reacciones de rescate llevadas a cabo con la RT SS mostró que esta enzima es capaz de rescatar eficazmente iniciadores bloqueados con AZT, pero no actúa (o actúa muy débilmente) sobre iniciadores bloqueados tras la incorporación de diastereoisómeros del AZTTP\alphaS. Si se compara la cinética de rescate de iniciadores terminados con el producto de incorporación del diastereoisómero S_{p} del AZTTP\alphaS, con los resultados obtenidos en ensayos control realizados en ausencia de ATP, no hay prácticamente diferencias. En el caso del diastereoisómero R_{p} se observa una bajísima actividad cuando se compara con su control correspondiente.

Estos resultados ponen de manifiesto que \alpha-fosforotioatos derivados del AZT no son escindibles por la actividad fosforolítica dependiente de ATP que presentan muchas enzimas resistentes a análogos de timidina.

Claims

1. El uso de un compuesto de fórmula (I) ó (IB)

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donde

n se selecciona de entre 0, 1 y 2;

A es un grupo C_{1}-C_{3} alquilo sustituido o no sustituido,

R es cualquiera de las bases nitrogenadas purinas o pirimidinas; y

R''' es hidrógeno, un grupo azida o no existe cuando entre los carbonos 2' y 3' hay un doble enlace,

para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un paciente infectado por el VIH y/o afectado por el SIDA.

2. Uso según reivindicación 1 donde R' es hidrógeno.

3. Uso según cualquiera de la reivindicaciones 1 ó 2 donde R'' es hidrógeno.

4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde R''' es hidrógeno o un grupo azida.

5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde en el compuesto de fórmula (I) A es el grupo -CH_{2}CH_{2}- o bien el grupo -CH(CH_{3})CH_{2}-.

6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde el compuesto de fórmula (IB) es 3'-azido-3'-desoxitimidina-5'-O-(1-tiofosfato) (AZTTP\alphaS).

7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde el compuesto es un análogo a cualquiera de los compuestos zidovudina, estavudina, didanosina, lamivudina, zalcitabina, abacavir, emtricitabina, tenofovir, o adefovir, donde se ha sustituido un oxígeno por un azufre como sustituyente del fosfato \alpha.

8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde el paciente presenta resistencia a fármacos inhibidores de retrotranscriptasa del virus de la inmunodeficiencia humana.

9. Uso según la reivindicación 8 donde el paciente presenta resistencia a cualquiera de los fármacos zidovudina, estavudina, didanosina, lamivudina, zalcitabina, abacavir, emtricitabina, tenofovir, adefovir o a mezclas de los mismos.

10. Composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de fórmula (1) ó (IB) tal como está definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-7, una sal farmacéuticamente aceptable, un profármaco o un solvato del mismo, y al menos un portador, adyuvante, o vehículo farmacéuticamente aceptable, para la administración a un paciente.

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11. Un compuesto de fórmula (1)

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donde

n se selecciona de entre 0, 1 y 2;

A es un grupo C_{1}-C_{3} alquilo sustituido o no sustituido,

R es cualquiera de las bases nitrogenadas purinas o pirimidinas; y

o bien una sal farmacéuticamente aceptable, un profármaco o un solvato del mismo.

12. Un compuesto según la reivindicación 11 donde R' es hidrógeno.

13. Un compuesto según cualquiera de la reivindicaciones 11 ó 12 donde R'' es hidrógeno.

14. Un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 donde en el compuesto de fórmula (I) A es el grupo -CH_{2}CH_{2}- o bien el grupo -CH(CH_{3})CH_{2}-.