CN87108073A - 采用杂交测定人体t细胞白血病病毒i和ii - Google Patents

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Abstract

在含有一个或一个以上核酸的样品中，是否存在HTLVI和HTLVII两者分离体或HTLVI或HTLVII的分离体的核酸顺序，以及怀疑含有这样的顺序可通过下述方法来测定，即采用引物扩增顺序以形成延长产物作为模板和测定扩增的产物，如果它是存在的话。这可以通过把一种附加的标记杂交探针加到已扩增的产物上，或者游离于溶液中或固定在载体上来实现。

Description

本发明涉及一种测定病毒中的核苷酸顺序是否存在的方法，该病毒涉及人体T细胞白血病病毒Ⅰ型和Ⅱ型（HTLVⅠ和Ⅱ）。本发明还涉及一种用于在引物和标记的杂交探针存在下的这样测定的装置。
人们已知道，某些T细胞肿瘤的发病机理中涉及到一族T细胞热带还原病毒，称为人体T细胞白血病病毒（HTLV）。目前，已知道有三种类型的HTLV。第一，Ⅰ型（HTLVⅠ）是一种肿瘤病毒，它和在日本、加勒比海地区和非洲所发现的人类成年人T细胞白血病淋巴细胞瘤（ATLL）有密切的联系。第二，Ⅱ型（HTLVⅡ）是一种肿瘤病毒，它是从具有毛发状细胞白血病的T细胞变株的两个病人中分离出来的。参见M.Popovic等，《Science》224卷497～500页（1984）和Rosenblatt，J.D等，New    Eng.J.of    Med.，8月号（1986）。第三，Ⅲ型（HTLVⅢ）是一种慢病毒，是一种引起艾滋病（AIDS）的病原体，艾滋病是一种会传染的细胞免疫系统的疾病，会引起常是致命的感染。
用对付HTLV相关病毒，如艾滋病的抗体鉴定血清的免疫诊断试验（参见美国专利第4，520，113号，Gallo等）正在血库中被用于排除潜在感染的血液。也可参见WO86/01834，1986年3月27日公布（加利福尼亚大学），它是用在制备单克隆抗体中有用的还原病毒多肽去测定HTLV族中的还原病毒。因为这种病毒属于一种不产生有效数量病毒颗粒的DNA复制品，一种测定HTLVⅠ和Ⅱ型有关的病毒的直接免疫方法用于很大部分的无征状个体持久感染被证明是不成功的。因为在感染组织和血液中病毒颗粒的数量可能是很少的（因为病毒的休眠），病毒颗粒或RNA/DNA的直接测定可能是相当困难的，如果不是办不到的话，不要把感染细胞与合适的T细胞系进行共同培养。
美国专利第4，683，202号（1987年7月28日公布）中，K.Mullis描述了一种通过采用一种标记的RNA或DNA杂交探针放大核酸顺序以促进测定的方法。在这个方法中，引物被用于得到引物延长产物，该延长产物用作核苷酸存在下合成附加的互补链的模板。该专利申请案中也描述了一种技术，即：在探针被杂交至所需要的顺序上以后，再加上一种限制性内切酶以使在所需要的顺序内的某一位置上裂解杂化物，然后对限制性消化进行分析以了解标记片断。美国专利第4，683，194（1987年7月28日公布），以及《生物技术》第3卷1008～1012页（1985）中H.Erlich等和Saiki等写的文章中，更详细地描述了这一后种技术。两个专利申请案中都列举了测定遗传病，如镰状细胞贪血和β-地中海贪血症的方法的应用。这些方法和用于扩增核酸顺序的方法在《Science》第230卷。1350～1354页（1985）中，Saiki等著的文章中也揭示过。
《Clin.Lab.Med》（1985）第五期。513～529页上Landry等写的综述文章中描述了核酸杂交领域用于病毒测定。WO86/01535（1986年3月13日公告）和欧洲专利173，529号（1986年3月5日公告）中都揭示3HTLVⅢ的分子的克隆和利用克隆作为探针测定艾滋病。更进一步地，欧洲专利公告173，339号（1986年3月5日公告）中，揭示了用DNA探针测定被外来微生物感染的遗传分析。欧洲专利185，444号（1986年6月25日公告）中，揭示了一种重组肽作为探针用于测定细胞溶解产物中的HTLVⅢ病毒。翁苏公司（Qncor    Inc.）在1986年9月宣布它发展了一种放射血液试验测定艾滋病毒。
用于测定肿瘤病毒HTLVⅠ和Ⅱ的杂交探针可能鉴定被持久感染，但不产生病毒的那些个人，也可能鉴定抗体阴性，但培养物阳性的个人，而且测定感染的细胞不需要培养病毒。用扩增法增加病毒的核酸的复制数将有利于鉴定在被感染个体中病毒的核酸。
本发明包括一种测定或检验核酸顺序是否存在的方法，所述核酸顺序是指大量存在于HTLVⅠ或HTLVⅡ核酸的分离体中，或大量存在于HTLVⅠ和HTLVⅡ核酸两者的分离体中，这种方法对于测定HTLVⅠ或HTLVⅡ的核酸或HTLV和HTLVⅡ两者分离体中的核酸是特别有效的，该方法包括：
（a）.用核酸顺序的每条链的寡核苷酸引物、四种不同的核苷三磷酸和一种聚合作用剂在杂交条件下，一起或分别处理样品，对核苷顺序的每条链，合成每个引物的延长物，它是与每条核酸链互补的，其中所说的引物基本上与待测定或检验的核酸顺序的每一链互补，以每一个引物合成的延长物，当它从它的补体中分离时，可作为其他引物的延长产物合成的模板;
（b）.在变性条件下处理样品;
（c）.用寡核苷酸引物处理步骤（b）中的产物，将步骤（b）中所产生的单链作为模板合成引物延长产物，结果扩增了一个或多个特定核苷顺序，如果它或它们是存在的话;和
（d）.测定样品中的待测的顺序是否存在。
测定产物的一种方法是向步骤（c）的产物中加入一种能与扩增的核酸顺序杂交的标记探针;并测定探针是否已经与核酸样品的扩增顺序杂交了。在一个具体实施例中，这样的测定可以以下列方式来进行：
（1）.用一种可识别在探针中的核酸顺序中的某一位置的限制性内切酶消化杂交的混合物;和
（2）.测定限制性消化物是否有与HTLVⅠ或HTLVⅡ顺序的存在相关的限制性片断。
在步骤（a）以前，病人样品中的核酸可能被抽出来，因此，待处理的样品实际上是一种抽提出的核酸的混合物。另外，步骤（a）中的待处理的样品不要预先进行这样的过程，即：样品中的病毒是在培养。
在另一个实施例中，本发明涉及了一种测定或检验核酸顺序是否存在的装置，所述的核酸是大量存在于HTLVⅠ或HTLVⅡ核酸分离体中，或大量存在于HTLVⅠ和HTLVⅡ两者的分离体中的核酸，该装置对于HTLVⅠ或HTLVⅡ的核酸或HTLVⅠ和HTLVⅡ两者的分离体中核酸是有效的，核酸顺序被怀疑是包含在样品中，该装置包括：
（a）.对于待测核酸顺序的每一条链，有一个寡核苷酸引物，一种或多种引物基本上是与每个特殊的核酸顺序的每条链互补，因此，从一种引物合成的一种延长产物，当延长产物从补体中分离出来时，可作为合成其它引物的延长产物的模板;和
（b）.一种能与核酸顺序杂交的标记探针。
最好是，该装置也包含一种聚合作用剂，四种不同的核苷酯和一种用于测定探针和核酸顺序是否杂交的工具。
这里的试验装置也可用于研究试验，临床试验和其他的诊断应用。另外，它也可以用于测定感染细胞而无需培养病毒，它在检查用于消除传染的各种治疗剂治疗病人也是有用的。
本发明涉及测定或检验核酸顺序的一种方法和一种装置，所述核酸顺序与被怀疑含有该顺序的核酸样品中的HTLVⅠ和HTLVⅡ病毒的任一种或两种是相关的。对HTLVⅠ和HTLVⅡ病毒的分离体已被定好顺序。待扩增的顺序必定对HTLVⅠ和HTLVⅡ病毒是特异的，即不与HTLVⅢ或其他的非HTLVⅠ或Ⅱ病毒起反应。
HTLVⅠ病毒的完整基因组已为Seiki等在《Proc    Natl    Acad    Sci》美国第80卷3618～3622页（1983）中描述过。HTLVⅡ病毒的完整基因组则由Shimotohno等在《Proc    Natl    Acad    Sci》美国第82卷3101～3105（1985）中描述过。
“大量存在于”一词应用于待测顺序意味着该核酸顺序一定是足够地与待测的病毒的核酸互补，以至少在室温，聚合作用剂和四种核苷三磷酸存在下激发聚合作用。
所使用的引物是一种任意长度和顺序的寡核苷酸，目的是在HTLVⅠ和Ⅱ或HTLVⅠ或Ⅱ病毒中的显著数量的核酸上专门激发聚合作用。尤其是，这里所使用的“引物”一词是一种由两个或两个以上脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子，最好是三个以上，当处在一些条件下，它能起着合成激发点的作用，在一定条件下，即：在核苷三磷酸和聚合作用剂（如DNA聚合酶）存在下，在适当温度和PH下，它可诱发基本与核酸链互补的引物延长产物的合成。引物最好是单链的，以扩增得到最高的效率，但也可采用双链。如果是双链的，引物在被用于制备延长产物以前，首先要自行处理，以把它的链分开。最好是，引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物必须有足够长以在聚合诱导剂的存在下触发延长产物的合成。引物的确切长度将取决于很多因素：包括温度、缓冲液、核苷酸组份和引物来源。为了达到发明的目的，寡核苷酸引物较典型的是含有15～25或更多的核苷酸，尽管它可能包含较少的核苷酸。
这里，所选择的引物基本上是与被扩增的特殊顺序的每条链互补的。这就意味着引物必须是可足够互补的，以在一定的条件下，允许聚合作用剂起作用，能和它们各自的链杂交，也就是说，引物必须与要扩增的链的顺序足够互补，以此杂交和形成一种用于合成其他引物的延长产物的模板。引物可能含有一些与链的错误配段。
可以选择被扩增的顺序是取自大量存在于HTLVⅠ和HTLVⅡ病毒的区。因此，引物和探针可以用任何适宜的装置加以鉴定和选择。这种步骤可用人工方法比较HTLVⅠ和HTLV病毒基因组的核苷酸顺序的区来进行。在HTLVⅠ和HTLVⅡ病毒的X区之间的核苷酸顺序同源性已在Shimotohno等《Proc    Natl    Acad    Sci》美国第81卷6657～6661（1984）著的文中描述过。另一个方法是用计算机程序比较所述核酸顺序。为了达到目的，可以方便地应用国立生物医学研究基金会所提供的基础计算机算的商业程序，使用点阵式模型。这种程序包括输入HTLVⅠ和Ⅱ病毒的核苷酸顺序和规定碱基对同源性窗尺寸。该程序使用了图解法来比较不同轴上的核酸顺序，一个点出现在哪里，那里至少是实际的同源性。最好是，窗的尺寸大于6个碱基。
基因组中的X区大多数存在于两种病毒的密码区之中。因为这个X区大多数存在于密码区之中，它是最好区，从中可选择引物和用于测定顺序的探针。不为蛋白质编码的病毒基因组的区也可以用于确定被用的引物的顺序。为了达到最高灵敏度和最大的专一性的目的，待测定的顺序与长度足够允许专一接触抗原并大量存在于有关病毒中的顺序是同源的，如果应用一种探针和限制性内切酶，尤其是在限制裂解部位的情况是这样的。
用于扩增和此后测定产物的技术已在上述美国专利第4，683，201号和第4，683，194中详细描述过，Saiki等《Biotechnology，supra》和Saiki等，《Sciene    supra》中也描述过。通常，扩增过程包括一个酶促链反应，以所涉及反应步骤数相对应的指数增长速率制备一种特定的核酸顺序，对所要求的顺序的末端情况应足够详细地知道，以使寡核苷酸引物可以被合成，并杂交到顺序的末端，少量的链顺序可有效地引发链反应。一种引物是与负（-）链互补的，另一引物是与正（+）链互补的，用酶，如DNA聚合酶Ⅰ（klenow）的大片断和核苷酸将引物退火到变性的核酸后延长，结果得到新合成的含有靶的正（+）和负（-）链。因为这些新合成的顺序也是引物的模板，周期性地重复变性、引物退火和延长，结果引起由引物所限定的区指数累积。链反应的产物将是一个独立的核酸双链，它的终端是与所使用的特定的引物的终端相对应的。
扩增过程可用图解法说明，在那里，由互补链[S+]和[S-]组成的含有所需要的顺序[S]的双链DNA可被用作核酸。在第一和每一个后面的反应周期内，在原先模板上的每个寡核苷酸的延长将产生一新的无限长度的SSDNA分子产物，这一DNA分子产物长度是以引物的一个引物中止。这些产物此后称为“延长产物”，将以线性方式累积;即任意次周期后存在的数量将与周期数成正比。
由此所产生的长产物在随后的周期中可作为寡核苷酸引物的一种或另一种的模板，并将产生所需要的顺序[S+]或[S-]的分子。这些分子也可以起着寡核苷酸引物的一种或另一种的模板作用，继续产生[S+]或[S-]的分子。这些分子也可以起着寡核苷酸引物的一种或另一种的模板作用，继续产生[S+]和[S-]，因此，链反应可以维持，它将以与周期数相对的指数速度累积。
由寡核苷酸杂交作用所形成的副产物不同于想要的产物，它们是不能自我催化，因此，它们是以线性速度累积的。
要扩增的特定顺序[S]可以用图解表示：
[S+] 5′AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCC 3′
[S-] 3′TTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGG 5′
适当的寡核苷酸引物是：
引物1    3′GGGGGGGGGG    5′
引物2    5′AAAAAAAAAA    3′
因此，如果含[S]的DNA
....ZZZZZZZZZZZZZZZZAAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzzzzzz....
....ZZZZZZZZZZZZZZZZTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGGzzzzzzzzzzzzzzzz....
被分离为单链和它的单链被杂交到引物1和2上，下列的延长反应可以在四种脱氧核糖核苷三磷酸存在下，由DNA聚合酶催化而进行：
3′    5′
延长物←GGGGGGGGGG    引物1
....zzzzzzzzzzzzzzzzAAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzzzzzz....
初始模板链+
初始模板链-
....zzzzzzzzzzzzzzzzTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGGzzzzzzzzzzzzzzzz....
引物2    AAAAAAAAAA→延长物
5′    3′
在形成的双链的变性作用时，产物是：
3′    5′
....zzzzzzzzzzzzzzzzTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGG
新合成的长的产物1
5′    3′
....zzzzzzzzzzzzzzzzAAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzzzzzz....
初始模板链+
3′    5′
....zzzzzzzzzzzzzzzzTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGGzzzzzzzzzzzzzzzz....
初始模板链-
5′    3′
AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzzzzzz....
新合成的长产物2
如果这四种链被允许在下一个周期中与引物1和2重新杂交的话，那么聚合作用剂将催化下面的反应：
引物2    5′AAAAAAAAAA→延长到此
3′....zzzzzzzzzzzzzzzzTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGG    5′
新合成的长产物1
延长物←GGGGGGGGGG    5′    引物1
5′....zzzzzzzzzzzzzzAAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzzzz....3′
初始模板链+
引物2    5′AAAAAAAAAA→延长物
3′....zzzzzzzzzzzzzzzzzzzTTTTTTTTTTYYYYYYYYYGGGGGGGGGGzzzzzzzzzz....5′
初始模板链-
延长到此←GGGGGGGGGG    5′    引物1
5′AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzzzzzz..3′
新合成的长产物2
如果上述四种双链可被分离，就将发现下面的链：
5′AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCC    3′
新合成的[S+]
3′....zzzzzzzzzzzzzzzzzzzTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGG    5′
第1个周期中合成的长产物1
3′....zzzzzzzzzzzzzzzzzzzTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGG    5′
新合成的长产物1
5′....zzzzzzzzzzzzzzzzzzzAAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzz....3′
初始模板链+
5′AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzzzzzz...3′
新合成的长产物2
3′..zzzzzzzzzzzzzzzTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGGzzzzzzzzzzzzzzzz...5′
初始模板链-
3′TTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGG    5′
新合成的[S-]
5′AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzzzzz...3′
第一周期中合成的长产物2
可见，以一个引物的寡核苷酸顺序和另一引物的互补顺序中止的每条链是被生产的所需要的特定核酸顺序[S]。
这个工艺的步骤可以无限地重复，它仅由引物1和2，诱导物和核苷酸存在的数量所限制。初始的核酸数量在整个过程中保持恒定，因为它不被复制。长产物的数量呈线性增加，因为它们只从初始核酸中产生。特定顺序的数量呈指数增长。因此，特定的顺序将变为主要的种类，这在下面的表中加以说明，它表示在几个周期后，理论上存在的这一特别顺序种类的相对量，假定每个周期中效率为100%：
在0～n次周期后的双链数目
周期数    模板    长产物    特殊顺序[S]
0    -    1    -
1    1    1    0
2    2    1    1
3    3    1    4
5    5    1    26
10    10    1    1013
15    15    1    32，752
20    20    1    1，048，555
n n 1. （2n-n-1）
当把一个单链核酸用作为模板时，每个周期中只形成一个长产物。
这里所用的术语“核酸限制性内切酶”和“限制性内切酶”系指一些细菌酶，它们能在或靠近一特定核苷酸顺序上切断双链DNA。
这里的引物可能由下列指标来选择，它们是供考虑的因素，但不是唯一的或决定的因素。首先，引物可以从存在于HTLVⅠ和HTLVⅡ基因组的区中选择。X区是存在于密码区，因此，X区被选出来作初始研究。其次，引物缺乏与可能影响试验的病毒基因组的任何顺序的同源性，例如，HTLVⅢ中的顺序已在《Science》第227卷538～540页（1985）中，由Starcich等描述的。
第三，引物最好是在扩增的核酸中缺乏二级结构形成，二级结构可能干扰通过扩增酶，如大肠杆菌DNA聚合酶的延长，DNA聚合酶的部分最好是Klenow片断。这可以通过在扩增培养基中应用约15%（按重量计），最好是5～10%（按重量计）的二甲基氧化硫（DMSO）和把扩增温度提高到30～40℃，最好为35～40℃或把扩增温度提高到30～40℃，最好为35～40℃来实现。
第四，引物最好具有约50%含量的鸟嘌呤和胞嘧啶，在引物的3′末端不含有多位相连的腺嘌呤和胸腺嘧啶基，它们可能引起杂交不稳定。最后，如果扩增产物是用限制性内切酶来测定，探针必须有一个内部的（不是末端）限制性部位。
寡核苷酸引物可采用任何适当的方法来制备，如采用上面描述的磷酸三酯和磷酸二酯法，或自动实施法。自动实施法中，二乙基磷酰胺亚酯被用作原材料，并用Beaucage等在《Tetrahedron    Letters》第22卷，1859～1862页中描述的方法合成，在改进的载体上合成寡核苷酸的一种方法已在美国专利第4，458，066号中描述过。也可以采用一种生物源（如核酸限制内切酶消化物）分离出来的引物。
任何纯化或非纯化形式的核酸源可以被用于启动一个或多个核酸，使核酸源含有或被怀疑含有与HTLVⅠ和HTLVⅡ或HTLVⅠ或HTLVⅡ有关的特定核酸顺序。因此，这个过程也可以应用如含信使RNA的DNA或RNA，其中DNA或RNA可以是单链或双链的。在这过程中，RNA可被用作模板，用于把模板逆转录到DNA的制备，酶和/或最佳条件也被应用。此外，也可采用含有每条链中一条链的DNA-RNA杂种体。也可使用这些核酸的任何的混合物，用相同的引物或不同的引物从先前的扩增反应生产核酸也可应用。待扩增的特定核酸顺序可能只是大分子的一部分或初步可被看作一个个别分子，因此，特定的顺序组成了完整的核酸。要扩增的顺序最初不需要是纯的形式;它可能是复杂的混合物中的一个极小的部分，如在整个人DNA中所含的病毒编码基因的一部分。启动核酸可能含有一种以上所需要的特定核酸顺序，它们可能是相同的，也可以不同。因此，本方法不仅对于一种特定核酸顺序的大量产生是有用的，而且对位于相同或不同的核酸分子上同时扩增一种以上不同的特定核苷酸顺序也是有用的。
核酸可以得自任何来源，如从高等有机体，象动物体中的自然DNA或RNA。DNA或RNA可以用Maniatis等在《Molecular    Cloning∶A    Laboratory    Manual》（纽约：Cold    Spring    Harbor    Laboratory    1982），280～281页中描述的各种技术，从体内样品，如血液、组织材料，如绒膜-绒毛、或羊膜细胞抽提得到。
如果样品是不纯的，如血浆、血清或血液，在扩增以前，要用可有效地打开样品的细胞，液体，组织，病毒衣壳或动物细胞膜，并可有效地暴露和/或分离核酸链的一定量的试剂处理。该暴露和分离链的细胞素和核酸变性步骤将使扩增更迅速进行。此外，在用扩增试剂处理样品以前，HTLVⅠ和HTLVⅡ病毒不需要放在样品中培养。样品可能被离心分离以得到淡黄色的外壳，然后再通过一根柱以得到白细胞。然后对白细胞再进行处理以提取核酸，用作被扩增的样品。
任何特定的核酸顺序都可以用这个方法得到。必须做到的是：顺序的两个末端的碱基数要有足够详细了解，使得两个寡核苷酸引物可以被制备，然后杂交到所需要的顺序的不同链上并处在沿着顺序的相对位置上，当它从它的模板（互补体）分离时，从一个引物合成的一个延长产物，它可以作为把另一个引物延长至一定长度核酸的模板。关于顺序末端的碱基了解得越彻底，引物对于靶核酸顺序的专一性就越强，因此，方法的效率也就越高。我们可以了解，在下文中所使用的引物是一个以上的，尤其是，在有关要扩增的顺序末端的资料还有一些不明确的情况下。例如，如果核酸顺序是从蛋白质顺序信息中推论得到的话，那么含有代表以遗传密码简并为基础的所有可能的密码变化的顺序的引物的收集物将被用于每条链。这种收集物的一个引物实际上将连接至要扩增的需要的顺序的末端。
通过采用含有那个顺序的核酸所生产的特定核酸顺序作为模板。如果样品的靶核酸顺序含有两股链，那么，在它被用作模板之前，或者作为独立的步骤或与合成引物延长产物同时进行时，必须将核酸链分离。这种链分离可以采用任何适宜的变性条件进行，包括物理的、化学的或酶方法，这里使用的词“变性”包括所有上述条件下的变性，分离核酸链的一种物理方法是把核酸加热至它变性。典型的热变性包括温度范围约为“80～105℃”，时间约为1～10分钟。链分离也可以由一种酶促使，这种酶是从称为解螺旋酶或RecA酶中选出来的，后者具有解螺旋酶的活性，在核糖ATP的存在下可使DNA变性。用解螺旋酶分离核酸链的合适的反应条件已由Kuhn    Hoffmann-Berling在《CSH-Quentitative    Biology》第43卷63页（1978）中描述过，而采用RecA的技术则由C.Radding在《Ann.Rev.Genetics》第16卷，405～437页（1982）中作过综述。
如果含有要扩增的顺序的最初的核酸是单链的话，它的补体可通过向那里加入一或二个寡核苷酸引物来合成。如果一个合适的单个引物被加入，在下面描述的引物、聚合作用剂和四种核苷三磷酸存在下，就可合成引物的延长产物。该产物将与单链的核酸互补，并与该核酸链杂交形成链不等长的双链，然后，它们可再被分离为单链，象如上描述的那样，产生两条单一的独立的互补链。另一种方法是，两种合适的引物被加到单链核酸上，再进行反应。
如最初的核酸构成要扩增的顺序，那么，所产生的引物延长产物将完全地或基本上完全地与最初的核酸链互补，并杂交形成等长的双链，等长的两条链再被分离为独立的链分子。
当一种核酸或几种核酸的互补链被分离时，不管核酸最初是双链还是单链的，这些链都准备用作为附加的核酸链合成的模板。这种合成是在允许引物与模板杂交的条件下进行的。通常，这种合成是在较佳PH为7～9，最佳PH为8的缓冲溶液中进行。最好是，两种寡核苷酸引物以克子过量（用于基因组核酸时，引物与模板比例约为108∶1）的量被加入含有分离的模板链的缓冲液中。我们应该知道，如果这样的方法被用于诊断的话，互补链的数量不可能了解，因此，与互补链数量相对的引物的量也不能确切地确定。但是，从实践来看，当要扩增的顺序包含在一条复杂的长链核酸链的混合物时，加入引物的量通常是克分子过量于互补链模板的量，克分子过量大，可提高这种方法的效率。
脱氧核糖核苷三磷酸dATP，dCTP，dGTP和TTP也被加到合成的混合物之中，可以与引物一起加入或分开加入，加入的量要合适，这样所得到的溶液再被加热到约90～100℃，约1～10分钟，最佳为1～4分钟。在这一加热时间后，溶液再冷却至适于引物杂交的室温。往冷却的混合物中加入可促进引物延长反应的一种合适的作用剂（该作用剂称为聚合作用剂），这种反应可在已知技术的条件下进行。如果聚合作用剂是热稳定的，则它可和其它的试剂一起加入。这种合成反应可以在室温到某一温度下进行，超过某一温度，聚合作用剂不再起作用。例如，如果DNA聚合酶作为作用剂，温度通常不高于40℃。最合适的是，反应在室温下进行。
聚合作用剂可以是任何的化合物或体系，它能促进完成引物延长产物的合成，聚合作用剂包括酶类。用于此目的合适的酶包括：大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片断、T4    DNA聚合酶，其它有效的DNA聚合酶、聚合酶突变蛋自、逆转录酶和其它的酶，包括热稳定酶（即：这些酶在温度提高到足够引起变性后，还可促使引物延长），它们将促使核苷酸以合适的方式组合，以形成与每一个核酸单链互补的引物延长产物。通常，该合成反应是在每一个引物的3′末端开始，然后沿着模板链的5′末端进行，直至合成终端，产生了不同长度的分子。采用上述同样的方法，可能还有些聚合作用剂参与，但合成反应是在5′末端开始，沿另一方向进行。
在上述的杂交条件下，如果靶顺序存在下，新合成的链和它的补体核酸链将形成一个双链分子，该杂交物被用于该方法的以后的步骤。在下一步，在杂交条件下处理的样品被置于变性条件下，使用任何上面描述的方法，在靶顺序存在下，可提供单链的分子。
新的核酸是在单链分子上被合成。如果必要的话，可以加入另外的聚合作用剂、核苷酸和引物，以使反应在如上描述的条件下进行。同样，合成反应可在每个寡核苷酸引物和一个末端开始，沿着模板单链进行以产生附加的核酸。在这步以后，延长产物的一半将由两个引物结合的特定核酸顺序组成。
在需要将靶核酸扩增到用于测定所必需的程度时，变性和延长产物合成的步骤常常可以重复。如以下将进一步详细描述的那样，所产生特定核酸顺序的数量将以指数方式累积。
当希望从第一个核酸或核酸混合物产生一个以上的核酸顺序时，可以采用适当数量的不同的寡核苷酸引物。例如，如果产生两种不同的特定核酸时，要使用四种引物。其中两种引物对于特定核酸顺序中的一个顺序是专一的，另外两种引物对于第二个特定核顺序是专一的。以这种方式，两种不同特定顺序中的每一种都可以用本发明方法指数方式累积。
本发明也可以分步的方式进行，每一步后加入新试剂，或同步进行，所有的试剂在初始步骤中一步加入，或部分分步和部分同时进行，即在一定数目的步骤后，加入新试剂。如果一种变性方法，如加热法被使用，它将使聚合作用剂失效，正如用热不稳定酶作聚合作用剂就是这样;这样一来就有必要在每一个链分离步骤之后，补充聚合作用剂。当一个酶的方法被用于链分离步骤时，可使用同时进行法。在同时进行法中，除了含有所需要的顺序的核酸链外，反应混合物还可能含有链分解酶（如：解螺旋酶），用于链分解酶的适当的能源，如r    ATP，四种核苷三磷酸、克分子过量的寡核苷酸引物以及聚合作用剂，如大肠杆菌DNA聚合酶1的Klenow片断。
如果在同时进行法中，把热用于变性，则热稳定剂，如热稳定的聚合酶可以使用，它在高的温度下使用，最好采用50～105℃，视作用剂而定，在该温度下，核酸将由处于平衡态的单链和双链组成。如果核酸长度较短，那么，较低的温度，如40～50℃就可以了。温度的提高取决于在该温度下，酶是否降解或超过该温度，不足水平的引物杂交是否发生。这样的热稳定性酶曾被描述过，例如，A·S.Kaledin等在《Biokhimiya》，第45卷，644～651页（1980）中描述过。在该恒定的温度下，反应进行了，引物在每条链的6～8碱基对中具有它们的3′末端。尽管所有反应试剂在初始时都存在，该方法的每一步还是连续地发生的。必要时，可以添加其他物质。在适当长的时间以产生所需要的特定的核酸顺序后，反应可以通过任何已知的方式使酶失话，或将反应的组份分开使其停止。
扩增作用也可以采用温度周期反应来实现，此时，温度逐渐地增高以允许使用热稳定酶用于延长、退火和变性。
本发明的方法可以连续地进行。在一个自动法实施例中，反应可能通过一个变性区，一个试剂添加区和一个反应区循环。在另一个实施例中，用于引物延长产物合成的酶可以被固定在一柱中。其它的反应组份可以用一个泵使之连续地循环通过柱，和一个串连的旋管，因此，所产生的核酸可以重复地变性而不会使酶失话。
扩增产物可以不采用放射性探针，而用Southern    blots分析法对它分析来测定。例如，该法中，从含极少量的HTLVⅠ和Ⅱ或HTLVⅠ或HTLVⅡ顺序的周围血液淋巴细胞中得到的DNA少量样品被扩增并用Southen    blotting技术分析。非放射性探针的应用是由高水平的放大信号来促进的。
另一种测定方法包括使用一种能与扩增的核酸顺序杂交的标记探针来测定和确定探针是否发生杂交。这样的探针必须含有一种来自HTLVⅠ和HTLVⅡ或HTLVⅠ或HTLVⅡ病毒基因组中的大量存在的核酸顺序，用如上描述的方法，它被选来用于引物和扩增顺序。最好是，该探针选自HTLVⅠ和HTLVⅡ或HTLVⅠ或HTLVⅡ基因组的X区。
这样一种探针法包括在美国专利第4，683，194号Supra中描述过的寡聚体限制技术。在该方法中，扩增了的核酸被变性，并在溶液中杂交到标记的寡核苷酸探针上，它可专一性地杂交到靶顺序（跨越引物所含有的一特殊的区）上，并至少跨越一个感头趣的限制性部位。在靶和探针之间所形成的双链将重新构成限制部位，当用限制性内切酶，如BglⅠ，PvuⅡ，或HinfⅠ裂解时，就释放出一个标记探针片断，它可以用凝胶电泳法从整个长度的探针中分离出来。然后，所得的凝胶被放射自显影照相。用这个方法分析扩增产物是快速的，即：结果可以在几小时内得到。最好的情况是，探针是30～45碱基长，并被标记，同样，BglⅠ，PvuⅡ或HinfⅠ是优先选用的限制性内切酶。可用于分析扩增产物的另一种方法是涂点法（dot bot method）。在这个方法中，扩增的样品直接涂点在膜上，并和标记探针杂交。这种标记物可用光谱学，光化学或用生物化学，免疫化学或化学方法测定。这些实例包括酶，如碱基磷酸酶、放射性标记物如32P、荧光标记物或生物素。在一个实施例中，探针是一种含生物素的探针，其中的生物素被结合到分子结构的间隔壁（Spacer arm）上：
Figure 87108073_IMG1
其中：Y为0，NH或N-CHO，
x是1～4的数，
y是2～4的数。
间隔壁反过来结合到分子的普索拉灵（Psoralen）一部分上：
Figure 87108073_IMG2
普索拉灵（Psoralen）一部分插入和穿过交叉为一“裂口环”探针，如Courage-Tabbe等在《Boichim    Biophys    Acta，第697卷1～5页（1982）中描述的，这里，裂口环的单链杂交区跨越两种引物之间所包含的区。这种生物素化作用（bioti    nylatin）的详细说明和涂点法在美国专利第4，582，789和4，617，261号中更详细和完全地描述了。生物素化探针可避免对放射性同位素的需要
另一种方法是，如果需要的话，在预杂交的条件下，探针首先被涂点在膜上，然后，在杂交条件下，把扩增产物以反向涂点方式，加到预处理的膜上。
涂点方法所费时间要大于上述描述的寡聚体限制法，因为膜首先必须预杂交，然后再杂交到探针上。但是，对于迅速突变的病毒，它具有这样的优点：含有有限碱基失配的顺序仍可在一合适的杂交条件下测定，采用寡聚体限制法时，任何可引起限制性内部位取消的突变株病毒，由于病毒的变异性，将难以被检测出来。
本发明也涉及一种装置的形式，它是一种包装了多个容器的装置，每个容器各盛有要使用的引物和探针。该装置也具有一个盛有用于合成引物延长产物的聚合作用剂，如酶的容器和一盛有四个核苷三磷酸的每种容器和一个用于测定标记物（如，若标记物是生物素时的一种抗生物素蛋白-酶复合物）的容器。此外，该装置还备有一个容器，它包括含有一种或一种以上具有HTLVⅠ和HTLVⅡ或HTLVⅠ或HTLVⅡ病毒基因组的顺序的核酸正控制器，和包括没有这样核酸的负控制器的容器。此外，该装置备有装盛每种限制酶的容器，限制酶能够在探针中一个顺序所含有的部位下裂解含有靶顺序的核酸。
下面的例子列举了本发明的各种实施例，但不受这些实施的限制。在实例中，除了指出外，所有部分和百分比，如果是固体，以重量百分比表示，如果是液体，以体积百分数表示，温度皆指摄氏温度。
实施例1
被扩增的所需要的顺序包含11个编码的DNA样品中，所述DNA样品是从地区肿瘤学中心，SUNY北部医学中心，Syracuse，纽约13210，Bernard    Poiesz博士处得到的，它们被鉴定为：194BK，342，367，361，368H，207，307，308B，323，326和340。引物和探针是用HTLVⅠ病毒和具有少数错误配段的HTLVⅡ病毒的X区选择出来的，由Shimotohno等在《Proc    Natl    Acad    Sci》美国，第81卷，6657～6661页（1984）鉴定。
密码样本首先在白细胞间素2（inleukin-2）存在下培养，Poiesz博士用于测定病毒的存在。然后，DNA以下列方法从样品中抽提出来。
1、1～2×108个培养细胞置于盛有20ml十二烷基硫酸钠溶胞缓冲液（1% SDS，150m M Na Cl，25m M Na2EDTA）的试管中进行溶胞。
2、400ml    5mg/μl的蛋白酶K溶液加入到每一个试管中，在37℃保温过夜。
3、DNA用酚和CHCl：异戊醇连续抽提，再用乙醇沉淀。
4、DNA用玻璃棒挑出，再置于1×TE缓冲液（10mM Tris，lmM Na2EDTA，PH为7.5）中，并用1×TE缓冲液完全渗析。
Ⅰ、引物的合成
下列两种寡脱氧核糖核苷酸引物，被命名为SK43和SK44，分别用下面描述的方法制备：
5′-CGGATACCCAGTCTACGTGT-3′（SK43）
5′-GAGCCGATAACGCGTCCATCG-3′（SK44）
A.自动合成方法：由Beaucage和Caruthers[《Tetrahadron
    Letters》第22卷，1859～1862页（1981）]合成的二乙基磷酰胺亚酯被连续地缩合到一个核苷上，这种核苷是从使用Bioserch    SAM-1可控的孔玻璃载体取得的。该方法包括用在二氯甲烷中的三氯醋酸进行脱三苯甲基作用，使用苯并三唑作为激活质子供体进行浓缩，并用在四氢呋喃和吡啶中的醋酸酐和双甲基氨基吡啶覆盖。循环时间约为30分钟。每一步骤的产量基本上是定量的，并通过收集和在脱三苯甲基作用过程所释放的二甲氧基三苯甲醇的光谱检验测定。
B.寡脱氧核糖核苷酸去保护和纯化方法：载体从柱中移出，在室温下，暴露到密闭试管中1ml浓的氢氧化铵中保持4小时。然后，载体可通过过滤去除，含有部分保护的寡脱氧核苷酸的溶液加热至55℃保持5小时。然后，去除氨，残余物被置于预先制备的聚丙烯酰胺凝胶中。在30伏/cm下电泳90分钟，之后，含有该产物的带用荧光板的紫外投影法来鉴定。这个带切下来，并且用1ml蒸馏水在4℃过夜洗提。这种溶液置于Altech    RP18柱中，并在PH6.0，用1%醋酸铵缓冲液中的7～13%梯度的乙腈洗提。洗提结果通过用260nm紫外吸光率监视，并收集合适的级分，用在固定体积的紫外吸光率定量，在真空离心机中在室温下蒸发干燥。
C.寡脱氧核糖核苷酸的特性：纯的寡核苷酸试验整份部分是由聚核苷酸激酶和γ-32P-ATP标记的32P。这些标记的化合物在50伏/cm下电泳45分钟后，通过14～20%聚丙烯酰胺凝胶的放射自显影法检定。这个方式可测定分子量。碱基组分可通过采用蛇毒液双酯酶和细菌碱性磷酸酶，把寡脱氧核糖核苷酸消化为核苷酸来确定，随后用逆相高压液相色谱柱（HPLC）和10%乙腈，1%醋酸铵流动相对所得到的核苷酸进行分离和定量。
Ⅱ、扩增反应
从来自Poiesz博士的每个11个编码的DNA样品得到的一微克DNA被加入到100ml缓冲液中，缓冲液是由10m M Tris-HCl，PH 7.5，50mM氯化钠和10m M氯化镁组成，并含有100×10-12M的引物SK43，100×10-12M引物SK44和浓度皆为150×10-9M的d ATP，dCTP，dGTP和TTP。
所得到的溶液再加热至100℃保持10分钟，并冷却至室温，保持2分钟，随后，2μl含有大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片断的一个单位加入溶液。反应在室温下进行两分钟，然后加热至95℃2分钟使酶失活。变性，引物退火，用Klenow片断延长（每个步骤为2分钟）和加入聚合酶，重复19次。
Ⅲ.寡脱氧核糖核苷酸探针的合成和磷酸化作用
顺序的一个标记的DNA探针SK45：
5′-＊ACGCCCTACTGGCCACCTGTCCAGAGCATCAGATCCCTG-3′，
其中：＊表示标记，是根据第一部分描述的方法合成的。探针是这样标记的：将探针10×10-12M与在40μl反应溶液中的4个单位T聚核苷酸激酶和50×10-12Mγ32P-ATP（约7200居里/毫克分子）接触90分钟温度为37℃，反应溶液含有70m M Tris缓冲液（PH7.6）、10m MMg Cl、1.5mM精胺和2.5mM二硫代苏糖醇。然后，全部反应液用25m MEDTA调节到100μl，取出整份部分，用于通过TCA沉淀法测定比活性。标记的探针用高速真空器浓缩，并在Tris-硼酸-EDTA（TBE）缓冲液（89mM三羟甲基氨基甲烷，89mM硼酸，2.5mM乙二胺四乙酸，PH8.9）中，在18%聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺与BIS比例为19∶1）电泳纯化500 Vhr。在放射自显影照相法定位后，含有标记探针的凝胶部分被切下来，压碎并于0.2ml TE缓冲液中，在4℃过夜以洗提）。反应产物的TCA沉淀物显示比活性是2居里/毫克分子，最终浓度是20p M/ml。
Ⅳ、带有探针和BglⅠ的扩增基因组DNA的杂交/消化。
A、溶液中的测定
10μl（微升）扩增的DNA（含有71纳克（ng）基因组DNA的预扩增等效物）被放入一个1.5ml的微逐出管（Microfuge tube），将20μl TE缓冲液加入至最终体积为30μl。样品在95℃下变性，历时100分钟。将含有0.02PM SK45探针的10m10.6M Na Cl加入试管，轻轻地晃动混合，在上面铺盖矿物油，并立即转移到56℃的加热块上一小时。加入10μl 50m M的Mg Cl2和1μl BglⅠ（8个单位），重复退火的DNA在56℃消化30分钟。通过加入4μl 75m MEDTA和6μl径迹染料（tracking dye）至最终体积为60μl，使反应停止。
无机油用0.2ml三氯甲烷提取，13μl反应混合物（约15纳克基因组DNA）掺入在Hoeffer    SE200容器中的30%聚丙烯酰胺小凝胶中。凝胶在约300伏的电压下电泳1小时，直到溴酚兰染料从起点朝前移开3.0cm为止。凝胶顶端1.5cm被取出，其余部分凝胶暴露在-70℃的两个强化筛（intensification）中，至少过夜。
B.用涂点法测定
扩增的DNA被加至Na OH和Na2EDTA的缓冲液中，最后的浓度为400mM Na OH和25m M Na2EDTA，最终体积为200μl。
将一离子膜在水中浸湿，放入到一个Bio-Rad免疫点真空器械中。然后抽真空，使器械保持平衡，上述的DNA样品置于膜上。然后，用20×SSPE洗涤膜，这果SSPE是一种含有Na    Cl，磷酸钠，EDTA和Na    OH组成的标准缓冲液。然后将膜取出，放于20×SSPE之中，搅拌2～5分钟。然后对膜涂点干燥，在紫外光中暴露6分钟，使DNA交联到膜上。
然后，将膜置于预杂交溶液中[预杂交溶液含有3×SSPE，5×Denhardt′s溶液，0.5%十二烷基硫酸钠（SDS），30%甲酰胺，用玻璃杯蒸馏水（glass-distilled water）加到10ml]，在42℃下，搅拌30分钟。然后将预杂交溶液排出，再加入5ml杂交溶液（与加入0.5×10-12MSK45一样）。然后在搅拌下，在42℃保温1小时。
在杂交后，膜放在2×SSPE，0.1%    SDS的溶液在室温、搅拌条件下冲洗二次，历时15分钟。然后再用0.2×SSPE，0.1%    SDS溶液在50℃，搅拌下冲洗10分钟。膜被涂点干燥和暴露到胶片上。
Ⅴ、结果讨论
在溶液中和膜上测定的放射自显影照相表明，HTLVⅠ和ⅡDNA顺序只存在在下列样品：342（HTLVⅠ）367（HTLVⅠ）、361（HTLVⅠ）、307（HTLVⅠ）、308B（HTLVⅠ）、323（HTLVⅡ）和326（HTLVⅠ）。所有后来发现这些标本，是HTLVⅠ或HTLVⅡDNA正链。另外四种样品如下：194BK＝来自白血病病人的DNA（没有分离到病毒），207＝进行性白血病病人（不涉及皮肤），340＝进行性白血病病人（不同于207），368H＝HTLVⅢ。
因此，所采用的引物可用于扩增DNA以允许探针可准确地测定顺序。在10%    DMSO（最小亚结构分子式）存在下，在37℃扩增也指出，HTLVⅠ和HTLVⅡ样品是正样品。
实施例2
HTLVⅠ
上述实施例1中的扩增或杂交或消化实验可用扩增Pol区3365～3483的HTLVⅠ专一的引物重复，这些引物是：
5′-CTTCACAGTCTCTACTGTGC-3′（SK54）and
5′-CGGCAGTTCTGTGACAGGG-3′（SK55）.
下面的探针SK56与限制性内切酶PvuⅡ一道使用：
5′-CCGCAGCTGCACTAATGATTGAACTTGAGAAGGAT-3′（SK56）.
放射自显影照相表明：HTLVⅠDNA顺序只存在于后来鉴定为HTLVⅠ正DNAs的样品之中。
HTLVⅡ
例1中的扩增或杂交或消化实验可用扩增Pol区4198～4300HTLVⅡ专一的引物进行重复，这些引物是：
5′-ATCTACCTCCACCATGTCCG-3′（SK58）
5′-TCAGGGGAACAAGGGGAGCT-3′（SK59）.
下面的探针SK60可与限制性内切酶Hinf    Ⅰ一道使用：
5′-TAAGGGAGTCTGTGTATTCATTGAAGGTGGAAATTGGGTC-3′（SK60）.
放射自显影照相表明，HTLVⅡDNA顺序只存在于后来鉴定为HTLVⅡ正DNA的样品323之中。

Claims (10)

1、一种测定或检验核酸顺序是否存在的方法，所述核酸顺序大量存在于HTLVⅠ或HTLVⅡ核酸，或HTLVⅠ和HTLVⅡ两者的核酸分离体之中，特别适于HTLVⅠ或HTLVⅡ或HTLVⅠ和HTLVⅡ两者分离体中的核酸，其核酸顺序被怀疑是包含在样品中，其特征在于该方法包括：
a、用核酸顺序的每一链的寡核苷酸引物、四种不同的核苷三磷酸、一种聚合作用剂在杂交的条件下，一起或分别处理样品，对于每一核酸顺序链，每一引物的延长产物被合成，它与要测定或检验的核酸顺序的每一链互补，这样，一种引物合成的延长产物，当延长产物从它的补体中分离出来时，可作为合成其他引物的延长产物的模板；
(b)、在变性条件下处理样品以将引物延长产物从它们的模板中分离出来，如果待测的顺序是存在的；
(c)、用寡核苷酸引物处理步骤(b)中的产物，将步骤(b)中所产生的每一条单链作为模板合成引物延长产物，结果扩增了要测定的顺序，如果它是存在的话；和
(d)、确定要测的顺序是否存在于样品之中。
2、如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（d）包括如下几步：
（1）向步骤（c）的产物加入一个可与扩增的核酸顺序杂交的标记探针;和
（2）确定探针是否已经与核酸样品中的扩增的顺序杂交。
3、如权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤（b）和（c）至少重复一次，而且引物是从HTLVⅠ和HTLVⅡ基因组中的X区中选出的。
4、如权利要求1～3的任一权利要求所述的方法，其特征在于所述的聚合作用剂是从下列酶中选出的一种酶：大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片断，反转录酶、或一种在暴露到足够使核酸变性的温度下仍保持其酶活性以在步骤（a）和（c）的反应温度下，形成所述的延长产物的酶。
5、如权利要求1～4中任一权利要求所述的方法，其特征在于在步骤（a）之前，样品用可使样品中所含有的核酸链裸露的试剂处理，所述链可同时或随后分离。
6、如权利要求2所述的方法，其特征在于步骤（2）包括下列几步：
（1）用对探针顺序内某一位置有识别的限制性内切酶消化步骤（d）中的杂交了的混合物;和
（2）确定限制消化物中是否含有与待测定的HTLVⅠ和HTLVⅡ顺序或HTLVⅠ或HTLVⅡ顺序存在有关的限制片断。
7、如权利要求6所述的方法，其特征在于步骤（1）和（2）使用了一种含有一个或一个以上具HTLVⅠ和HTLVⅡ病毒基因组或HTLVⅠ或HTLVⅡ病毒基因组的顺序的核酸的正控制和/或不含有任何具从HTLVⅠ和HTLVⅡ病毒或HTLVⅠ或HTLVⅡ病毒中得到的核酸的负控制。
8、一种含有扩增核酸顺序的组成，所述顺序大量存在于HTLVⅠ或HTLVⅡ核酸分离体或HTLVⅠ或HTLVⅡ两者的核酸分离体中，特别是HTLVⅠ或HTLVⅡ或HTLVⅠ和HTLVⅡ两者的分离体中的核酸，其特征在于，该组成是这样产生的：
（a）、用核酸顺序每条链的寡核苷酸先导物、四种不同的核苷三磷酸和一种聚合作用剂在杂交条件下，一起或分别处理含有所述核酸顺序的非扩增形式的样品，对每一核酸顺序，每一引物的延长产物被合成，延长产物基本上是与所要测定或检验的核酸顺序的每一链互补，这样，从一个引物合成的延长产物，当延长产物从它的补体上分离出来时，可以作为合成其他引物延长产物的模板;
（b）、将引物延长产物从模板分离出来，在模板上，延长产物被合成以产生单链分子;和
（c）、用寡核苷酸引物处理步骤（b）中的产物，这样，用步骤（b）中所产生的每一条单链作为模板合成引物延长产物，结果导致了核酸顺序的扩增。
9、一种测定和检验核酸顺序是否存在的装置，所述核酸顺序大量存在于HTLVⅠ或HTLVⅡ核酸或HTLVⅠ和HTLVⅡ两者核酸的分离体中，特别适于HTLVⅠ或HTLVⅡ或HTLVⅠ和HTLVⅡ两者的分离体中的核酸，核酸顺序被怀疑包含在样品中，其特征在于该装置包括：
（a）、一种用于要检测的核酸顺序的每链的寡核苷酸引物，它的一种或多种引物基本上与每条特定核酸顺序的每条链互补，这样，从一个引物合成的一种延长产物，当延长产物从它的补体中分离出来时，可以作为合成其它引物延长产物的模板;和
（b）、一种能与核酸顺序杂交的标记探针。
10、如权利要求9所述的装置，其特征在于它进一步包括一种聚合作用剂，四种不同的核苷三磷酸中的一种和测定所述探针和所述顺序杂交物的手段。
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