JPH09327298A - 核酸増幅方法 - Google Patents
核酸増幅方法Info
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- JPH09327298A JPH09327298A JP9057599A JP5759997A JPH09327298A JP H09327298 A JPH09327298 A JP H09327298A JP 9057599 A JP9057599 A JP 9057599A JP 5759997 A JP5759997 A JP 5759997A JP H09327298 A JPH09327298 A JP H09327298A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
- C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6865—Promoter-based amplification, e.g. nucleic acid sequence amplification [NASBA], self-sustained sequence replication [3SR] or transcription-based amplification system [TAS]
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ユーザーの介入が少なく操作が少ないうえ
に、増幅が比較的一定の室温で行なわれ、各サイクルで
１つの基質から複数コピーが産生される核酸増幅方法の
開発。 【解決手段】 一重鎖RNA と一重鎖DNA と二重鎖DNA と
を合成することを包含し、ここで前記一重鎖RNA が第１
プライマー用第１鋳型、一重鎖DNA が第２プライマー用
第２鋳型、二重鎖DNA が第１鋳型の複数コピー合成用第
３鋳型として機能し、第１または第２のプライマーの配
列が特定核酸配列の配列に十分に相補的であり、第１ま
たは第２のプライマーの配列が特定核酸配列の配列に十
分に相同であり、かつ第１プライマーの3'末端が相補鎖
上の第２プライマーの3'末端に向かって方向付けされる
ことを特徴とする特定核酸配列の増幅方法、この方法で
増幅された特定核酸配列、および特定核酸配列増幅用キ
ット。
に、増幅が比較的一定の室温で行なわれ、各サイクルで
１つの基質から複数コピーが産生される核酸増幅方法の
開発。 【解決手段】 一重鎖RNA と一重鎖DNA と二重鎖DNA と
を合成することを包含し、ここで前記一重鎖RNA が第１
プライマー用第１鋳型、一重鎖DNA が第２プライマー用
第２鋳型、二重鎖DNA が第１鋳型の複数コピー合成用第
３鋳型として機能し、第１または第２のプライマーの配
列が特定核酸配列の配列に十分に相補的であり、第１ま
たは第２のプライマーの配列が特定核酸配列の配列に十
分に相同であり、かつ第１プライマーの3'末端が相補鎖
上の第２プライマーの3'末端に向かって方向付けされる
ことを特徴とする特定核酸配列の増幅方法、この方法で
増幅された特定核酸配列、および特定核酸配列増幅用キ
ット。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、特定核酸配列の増
幅方法に係る。
幅方法に係る。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】サン
プル中に存在する特定の核酸配列を検出するために核酸
の相補的配列でサンプルをプローブすることは公知の診
断方法で使用されている。核酸と相補的核酸との結合は
高度に特異的であり、従ってサンプル中に特定の核酸が
存在するか否かを有効に判定し得る。このためには、検
出すべき特定核酸配列が既知であり該特定核酸配列に相
補的な核酸配列をもつプローブを構築することが必要で
ある。
プル中に存在する特定の核酸配列を検出するために核酸
の相補的配列でサンプルをプローブすることは公知の診
断方法で使用されている。核酸と相補的核酸との結合は
高度に特異的であり、従ってサンプル中に特定の核酸が
存在するか否かを有効に判定し得る。このためには、検
出すべき特定核酸配列が既知であり該特定核酸配列に相
補的な核酸配列をもつプローブを構築することが必要で
ある。
【０００３】本願において、「特定核酸配列」なる用語
は、増幅させるべき一重鎖または二重鎖の核酸を意味す
る。「サンプル」なる用語は、複数の核酸を含有する混
合物を意味する。「十分に相補的な」なる用語は、２つ
の核酸即ちプライマーと鋳型とが特異的に相互作用でき
所与のイオン強度条件及び温度条件下にプライマー依存
性で鋳型依存性のDNA 合成を有効に行なうことを意味す
る。
は、増幅させるべき一重鎖または二重鎖の核酸を意味す
る。「サンプル」なる用語は、複数の核酸を含有する混
合物を意味する。「十分に相補的な」なる用語は、２つ
の核酸即ちプライマーと鋳型とが特異的に相互作用でき
所与のイオン強度条件及び温度条件下にプライマー依存
性で鋳型依存性のDNA 合成を有効に行なうことを意味す
る。
【０００４】核酸プローブは高度に特異的であるため、
いくつかの場合には、核酸配列によって産生されるタン
パク質よりもむしろ核酸配列自体をプローブするほうが
好ましい。例えば、タンパク質検出だけに基づく診断方
法では、Ｂ型肝炎ウィルスの感染性粒子の存在に関して
信頼できる判断を下すことができない。その理由は、DN
A ゲノムの欠失した非感染性抗原粒子が有意レベルで存
在するからである。別の例では、前癌性または良性の子
宮頸部腫瘍中に検出されるヒト乳頭腫ウイルスの種々の
サブタイプは核酸プローブハイブリダイゼーションを使
用したときにのみ識別できる。またエイズの微生物学的
研究からも、エイズ特異的核酸配列の存在に基づくアッ
セイが最良の診断方法であることが確認された。
いくつかの場合には、核酸配列によって産生されるタン
パク質よりもむしろ核酸配列自体をプローブするほうが
好ましい。例えば、タンパク質検出だけに基づく診断方
法では、Ｂ型肝炎ウィルスの感染性粒子の存在に関して
信頼できる判断を下すことができない。その理由は、DN
A ゲノムの欠失した非感染性抗原粒子が有意レベルで存
在するからである。別の例では、前癌性または良性の子
宮頸部腫瘍中に検出されるヒト乳頭腫ウイルスの種々の
サブタイプは核酸プローブハイブリダイゼーションを使
用したときにのみ識別できる。またエイズの微生物学的
研究からも、エイズ特異的核酸配列の存在に基づくアッ
セイが最良の診断方法であることが確認された。
【０００５】既存の核酸プローブ技術の使用に伴う最大
の困難及び既存のプローブ技術の実用性に限界がある理
由は、コピー数の問題にある。例えば、１つのウイルス
または細胞中に通常は特定遺伝子の単一コピー(single
copy) が存在する。この１つのコピーがRNA またはタン
パク質のごとき遺伝子産生物のコピーを多数生成し得
る。このため、検出すべき核酸の特定配列がタンパク質
の数千ものコピーを生じ得るので、診断方法においては
タンパク質をプローブする技術がしばしば使用されてき
た。
の困難及び既存のプローブ技術の実用性に限界がある理
由は、コピー数の問題にある。例えば、１つのウイルス
または細胞中に通常は特定遺伝子の単一コピー(single
copy) が存在する。この１つのコピーがRNA またはタン
パク質のごとき遺伝子産生物のコピーを多数生成し得
る。このため、検出すべき核酸の特定配列がタンパク質
の数千ものコピーを生じ得るので、診断方法においては
タンパク質をプローブする技術がしばしば使用されてき
た。
【０００６】レジオネラ(Legionella)及びマイコプラズ
マ(Mycoplasma)のごときある種の細菌性病原体の診断を
核酸プローブを用いて容易に行なうために、細胞当たり
100,000 コピーにのぼる多数の天然リボソームRNA が遺
伝子プローブ(GenProbe)法によって使用されてきた。し
かしながら、この戦略は、ウイルスのごとき非細胞性病
原体には使用できない。核酸プローブを用いたエイズウ
イルス検出方法の開発ではコピー数が特に問題になる。
何故ならこの場合、組み込まれたプロウイルスは10,000
個の末梢血リンパ球のうち１個未満のリンパ球中に存在
し得るからである。従って、サンプル中に存在すると予
想される特定核酸配列を増幅できれば、コピー数の問題
が解決されプローブアッセイをより容易に使用できる。
マ(Mycoplasma)のごときある種の細菌性病原体の診断を
核酸プローブを用いて容易に行なうために、細胞当たり
100,000 コピーにのぼる多数の天然リボソームRNA が遺
伝子プローブ(GenProbe)法によって使用されてきた。し
かしながら、この戦略は、ウイルスのごとき非細胞性病
原体には使用できない。核酸プローブを用いたエイズウ
イルス検出方法の開発ではコピー数が特に問題になる。
何故ならこの場合、組み込まれたプロウイルスは10,000
個の末梢血リンパ球のうち１個未満のリンパ球中に存在
し得るからである。従って、サンプル中に存在すると予
想される特定核酸配列を増幅できれば、コピー数の問題
が解決されプローブアッセイをより容易に使用できる。
【０００７】少数の細胞しか含まず従って特定遺伝子の
少数コピーしか含まない正常生物サンプルにおいては、
コピー数の問題を解決するために増幅方法を利用する必
要がある。
少数コピーしか含まない正常生物サンプルにおいては、
コピー数の問題を解決するために増幅方法を利用する必
要がある。
【０００８】１つの増幅方法は、サンプルの「十分な増
殖」を行なうこと、即ちサンプル中に存在する生きた生
物物質が自然に複製できるように条件を整えることであ
る。核酸配列の量を複製によって検出可能レベルまで増
加させる。例えば食品産業では、加工食品の有毒細菌Sa
lmonellaを検査するために、食品サンプルを何日間もイ
ンキュベートして核酸量を増加させる必要がある。臨床
サンプルでは、病原体の数を増加させるためにサンプル
をかなりの期間にわたって増殖させる必要がある。
殖」を行なうこと、即ちサンプル中に存在する生きた生
物物質が自然に複製できるように条件を整えることであ
る。核酸配列の量を複製によって検出可能レベルまで増
加させる。例えば食品産業では、加工食品の有毒細菌Sa
lmonellaを検査するために、食品サンプルを何日間もイ
ンキュベートして核酸量を増加させる必要がある。臨床
サンプルでは、病原体の数を増加させるためにサンプル
をかなりの期間にわたって増殖させる必要がある。
【０００９】1987年7 月28日付けのCetus Corporation
の米国特許第4,683,195 号及び1987年7 月28日付けのCe
tus Corporation の米国特許第4,683,202 号は夫々、サ
ンプル中に含まれる標的核酸配列の増幅方法を開示して
いる。米国特許第4,683,195号に記載された方法は、標
的核酸配列を含有すると予想されるサンプルをオリゴヌ
クレオチドプライマーで処理してプライマー伸長産生物
を合成し、該産生物を鋳型として標的核酸配列を増幅さ
せる方法である。好適実施例では熱変性を用いてプライ
マー伸長産生物を鋳型から分離している。また、米国特
許第4,683,202号に記載の方法は、異なる２つの相補鎖
をもつ標的核酸配列の増幅方法である。この方法では、
鎖をプライマーで処理して伸長産生物を合成し、プライ
マー伸長産生物を鋳型から分離し、次にプライマー伸長
産生物を鋳型として使用する。
の米国特許第4,683,195 号及び1987年7 月28日付けのCe
tus Corporation の米国特許第4,683,202 号は夫々、サ
ンプル中に含まれる標的核酸配列の増幅方法を開示して
いる。米国特許第4,683,195号に記載された方法は、標
的核酸配列を含有すると予想されるサンプルをオリゴヌ
クレオチドプライマーで処理してプライマー伸長産生物
を合成し、該産生物を鋳型として標的核酸配列を増幅さ
せる方法である。好適実施例では熱変性を用いてプライ
マー伸長産生物を鋳型から分離している。また、米国特
許第4,683,202号に記載の方法は、異なる２つの相補鎖
をもつ標的核酸配列の増幅方法である。この方法では、
鎖をプライマーで処理して伸長産生物を合成し、プライ
マー伸長産生物を鋳型から分離し、次にプライマー伸長
産生物を鋳型として使用する。
【００１０】前出の２つの米国特許はいずれも、増幅方
法においてユーザーが手動的または機械的に介入しかつ
多段階操作を行なう必要がある。これらの特許に含まれ
る操作段階では、ユーザーがサンプルを加熱し、冷却
し、適当な酵素を添加し、次いで諸段階を繰り返す必要
がある。温度変化は酵素を失活させる。従ってユーザー
は増幅過程の際に適当な酵素のアリコートを増幅混合物
に繰り返し補充する必要がある。
法においてユーザーが手動的または機械的に介入しかつ
多段階操作を行なう必要がある。これらの特許に含まれ
る操作段階では、ユーザーがサンプルを加熱し、冷却
し、適当な酵素を添加し、次いで諸段階を繰り返す必要
がある。温度変化は酵素を失活させる。従ってユーザー
は増幅過程の際に適当な酵素のアリコートを増幅混合物
に繰り返し補充する必要がある。
【００１１】米国特許第4,683,195 号及び第4,683,202
号によれば更に、増幅方法の各サイクルでは第１鋳型か
ら第２鋳型が合成され、次に第２鋳型を用いて第１鋳型
が合成される。このようにしてこの手順が繰り返される
が、増幅方法の各サイクルは１つの基質からの１つの産
生物の合成に基づいている。
号によれば更に、増幅方法の各サイクルでは第１鋳型か
ら第２鋳型が合成され、次に第２鋳型を用いて第１鋳型
が合成される。このようにしてこの手順が繰り返される
が、増幅方法の各サイクルは１つの基質からの１つの産
生物の合成に基づいている。
【００１２】従来技術に開示された増幅方法にかかわり
なく、増幅方法の改良が必要とされている。ユーザーの
介入が少なく操作が少ない増幅方法が好ましい。更に、
増幅方法に関与する酵素の活性に影響を与えないように
増幅が比較的一定の室温で行なわれるのが有利である。
増幅方法の各サイクル毎に１つの鋳型を使用し１つの基
質から２つ以上の産生物を生成することができれば更に
好都合であろう。
なく、増幅方法の改良が必要とされている。ユーザーの
介入が少なく操作が少ない増幅方法が好ましい。更に、
増幅方法に関与する酵素の活性に影響を与えないように
増幅が比較的一定の室温で行なわれるのが有利である。
増幅方法の各サイクル毎に１つの鋳型を使用し１つの基
質から２つ以上の産生物を生成することができれば更に
好都合であろう。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明は、ユーザーによ
る介入及び操作が従来の増幅方法よりも少ない有利な増
幅方法に係る。増幅が比較的一定の室温で行なわれる。
更に、この方法の各サイクルでは１つの基質からその産
生物の複数コピーが産生される。本発明の増幅方法は、
特定核酸の量を増加させこれによりコピー数の問題を解
決するために使用され得る。従って、プローブアッセイ
の使用がより容易になる。また、特定核酸配列の純度を
向上させるために本発明の増幅方法を従来のクローニン
グ方法に代替して使用することも可能である。
る介入及び操作が従来の増幅方法よりも少ない有利な増
幅方法に係る。増幅が比較的一定の室温で行なわれる。
更に、この方法の各サイクルでは１つの基質からその産
生物の複数コピーが産生される。本発明の増幅方法は、
特定核酸の量を増加させこれによりコピー数の問題を解
決するために使用され得る。従って、プローブアッセイ
の使用がより容易になる。また、特定核酸配列の純度を
向上させるために本発明の増幅方法を従来のクローニン
グ方法に代替して使用することも可能である。
【００１４】本発明の１つの態様に従って特定核酸配列
の増幅方法が使用される。この方法は、一重鎖RNA 、一
重鎖DNA 及び二重鎖DNA の合成を含む。一重鎖RNA は第
１プライマー用第１鋳型である。一重鎖DNA は第２プラ
イマー用第２鋳型である。二重鎖DNA は第１鋳型の複数
コピー合成用第３鋳型である。第１または第２のプライ
マーの配列は特定核酸配列の配列に十分に相補的であ
り、第１または第２のプライマーの配列は特定核酸配列
の配列に十分に相同である。第１プライマーの3'末端は
相補鎖上の第２プライマーの3'末端に向かって方向付け
されている。
の増幅方法が使用される。この方法は、一重鎖RNA 、一
重鎖DNA 及び二重鎖DNA の合成を含む。一重鎖RNA は第
１プライマー用第１鋳型である。一重鎖DNA は第２プラ
イマー用第２鋳型である。二重鎖DNA は第１鋳型の複数
コピー合成用第３鋳型である。第１または第２のプライ
マーの配列は特定核酸配列の配列に十分に相補的であ
り、第１または第２のプライマーの配列は特定核酸配列
の配列に十分に相同である。第１プライマーの3'末端は
相補鎖上の第２プライマーの3'末端に向かって方向付け
されている。
【００１５】本発明の別の態様に従って特定核酸配列の
増幅方法が使用される。この方法は以下の段階を含む。
増幅方法が使用される。この方法は以下の段階を含む。
【００１６】(a) 第１プライマーを第１鋳型にハイブリ
ダイズする。第１プライマーは第１鋳型のRNA 配列に十
分に相補的なDNA 配列をもつ。
ダイズする。第１プライマーは第１鋳型のRNA 配列に十
分に相補的なDNA 配列をもつ。
【００１７】(b) 第１プライマーに共有結合し第１鋳型
のRNA 配列に相補的な第１DNA を合成する。第１DNA 配
列及び第１プライマーが第２鋳型を構成する。
のRNA 配列に相補的な第１DNA を合成する。第１DNA 配
列及び第１プライマーが第２鋳型を構成する。
【００１８】(c) 第２プライマーのハイブリダイゼーシ
ョンを行なわせるために第１鋳型を第２鋳型から分離す
る。
ョンを行なわせるために第１鋳型を第２鋳型から分離す
る。
【００１９】(d) 第２プライマーを第２鋳型にハイブリ
ダイズする。第２プライマーは第２鋳型のDNA 配列に十
分に相補的なDNA 配列をもつ。第２プライマーはまたRN
A ポリメラーゼ用のプロモーターのアンチセンス配列と
転写開始部位のアンチセンス配列とをもつ。
ダイズする。第２プライマーは第２鋳型のDNA 配列に十
分に相補的なDNA 配列をもつ。第２プライマーはまたRN
A ポリメラーゼ用のプロモーターのアンチセンス配列と
転写開始部位のアンチセンス配列とをもつ。
【００２０】(e) 第２プライマーに共有結合し第２鋳型
のDNA 配列に相補的な第２DNA 配列を合成し、第２鋳型
に共有結合し第２プライマーのDNA 配列に相補的な第３
DNA 配列を合成する。第２及び第３のDNA 配列及び第２
プライマー及び第２鋳型が第３鋳型を構成する。
のDNA 配列に相補的な第２DNA 配列を合成し、第２鋳型
に共有結合し第２プライマーのDNA 配列に相補的な第３
DNA 配列を合成する。第２及び第３のDNA 配列及び第２
プライマー及び第２鋳型が第３鋳型を構成する。
【００２１】(f) 第３鋳型から第１鋳型のRNA 配列の複
数コピーを合成する。
数コピーを合成する。
【００２２】第１または第２のプライマーの配列は特定
核酸配列に十分に相補的であり、第１または第２のプラ
イマーの配列は特定核酸配列の配列に十分に相同であ
る。第１プライマーの3'末端は相補鎖上の第２プライマ
ーの3'末端に向かって方向付けされている。
核酸配列に十分に相補的であり、第１または第２のプラ
イマーの配列は特定核酸配列の配列に十分に相同であ
る。第１プライマーの3'末端は相補鎖上の第２プライマ
ーの3'末端に向かって方向付けされている。
【００２３】本発明の別の方法では、第２プライマーDN
A が第２鋳型のDNA 配列に十分に相補的な配列を3'末端
にもつ。第２プライマーは5'末端にRNA ポリメラーゼ用
のプロモーターのアンチセンス配列と転写開始部位のア
ンチセンス配列とをもつ。
A が第２鋳型のDNA 配列に十分に相補的な配列を3'末端
にもつ。第２プライマーは5'末端にRNA ポリメラーゼ用
のプロモーターのアンチセンス配列と転写開始部位のア
ンチセンス配列とをもつ。
【００２４】本発明の更に別の方法では、第２鋳型に共
有結合した第３DNA 配列は第２プライマーの5'末端のDN
A 配列に相補的である。
有結合した第３DNA 配列は第２プライマーの5'末端のDN
A 配列に相補的である。
【００２５】本発明の別の方法においても特定核酸配列
の増幅方法が使用される。該方法では、第１プライマー
と第２プライマーとリボヌクレアーゼＨとRNA 依存性DN
A ポリメラーゼとDNA 依存性DNA ポリメラーゼとRNA ポ
リメラーゼとリボヌクレオシド三リン酸とデオキシリボ
ヌクレオシド三リン酸とをサンプルと混合する。第１プ
ライマーDNA は第１鋳型RNA に十分に相補的な配列をも
つ。第２プライマーDNA は、RNA ポリメラーゼによって
基質として認識される第２鋳型DNA に十分に相補的な配
列とプロモーターのアンチセンス配列と転写開始部位の
アンチセンス配列とをもつ。第１プライマーまたは第２
プライマーの配列は、特定核酸配列の配列に十分に相補
的であり、第１プライマーまたは第２プライマーの配列
は特定核酸配列の配列に十分に相同である。第１プライ
マーの3'末端は相補鎖上の第２プライマーの3'末端に向
かって方向付けされている。
の増幅方法が使用される。該方法では、第１プライマー
と第２プライマーとリボヌクレアーゼＨとRNA 依存性DN
A ポリメラーゼとDNA 依存性DNA ポリメラーゼとRNA ポ
リメラーゼとリボヌクレオシド三リン酸とデオキシリボ
ヌクレオシド三リン酸とをサンプルと混合する。第１プ
ライマーDNA は第１鋳型RNA に十分に相補的な配列をも
つ。第２プライマーDNA は、RNA ポリメラーゼによって
基質として認識される第２鋳型DNA に十分に相補的な配
列とプロモーターのアンチセンス配列と転写開始部位の
アンチセンス配列とをもつ。第１プライマーまたは第２
プライマーの配列は、特定核酸配列の配列に十分に相補
的であり、第１プライマーまたは第２プライマーの配列
は特定核酸配列の配列に十分に相同である。第１プライ
マーの3'末端は相補鎖上の第２プライマーの3'末端に向
かって方向付けされている。
【００２６】本発明の更に別の方法においても特定核酸
配列の増幅方法が使用される。この方法では、第１プラ
イマーと第２プライマーとトリ筋芽細胞腫ウイルスポリ
メラーゼと大腸菌リボヌクレアーゼＨとバクテリオファ
ージT7 RNAポリメラーゼとリボヌクレオシド三リン酸と
デオキシリボヌクレオシド三リン酸とをサンプルに添加
する。第１プライマーDNA は第１鋳型RNA に十分に相補
的な配列をもつ。第２プライマーDNA はT7 RNAポリメラ
ーゼによって基質として認識される第２鋳型DNA に十分
に相補的な配列とプロモーターのアンチセンス配列と転
写開始部位のアンチセンス配列とを含む。第１プライマ
ーまたは第２プライマーの配列は特定核酸配列の配列に
十分に相補的であり、第１プライマーまたは第２プライ
マーの配列は特定核酸配列の配列に十分に相同である。
第１プライマーの3'末端は相補鎖上の第２プライマーの
3'末端に向かって方向付けされている。
配列の増幅方法が使用される。この方法では、第１プラ
イマーと第２プライマーとトリ筋芽細胞腫ウイルスポリ
メラーゼと大腸菌リボヌクレアーゼＨとバクテリオファ
ージT7 RNAポリメラーゼとリボヌクレオシド三リン酸と
デオキシリボヌクレオシド三リン酸とをサンプルに添加
する。第１プライマーDNA は第１鋳型RNA に十分に相補
的な配列をもつ。第２プライマーDNA はT7 RNAポリメラ
ーゼによって基質として認識される第２鋳型DNA に十分
に相補的な配列とプロモーターのアンチセンス配列と転
写開始部位のアンチセンス配列とを含む。第１プライマ
ーまたは第２プライマーの配列は特定核酸配列の配列に
十分に相補的であり、第１プライマーまたは第２プライ
マーの配列は特定核酸配列の配列に十分に相同である。
第１プライマーの3'末端は相補鎖上の第２プライマーの
3'末端に向かって方向付けされている。
【００２７】
【発明の実施の形態】本発明は特定核酸配列の増幅方法
に係る。増幅はDNA 及びRNA の交互合成を含み図１に概
略的に示されている。この方法においては、一重鎖RNA
が一重鎖DNAに変換され、該一重鎖DNA が出発一重鎖RNA
の複数コピー合成用の機能性鋳型に変換される。第１
プライマー及び第２プライマーが増幅方法で使用され
る。第１プライマーまたは第２プライマーの配列は特定
核酸配列の配列に十分に相補的であり、第１プライマー
または第２プライマーの配列は特定核酸配列の配列に十
分に相同である。いくつかの場合、例えば特定核酸配列
が二重鎖DNA の場合には、第１プライマーと第２プライ
マーとの双方が特定核酸配列の配列に十分に相補的で且
つ十分に相同である。
に係る。増幅はDNA 及びRNA の交互合成を含み図１に概
略的に示されている。この方法においては、一重鎖RNA
が一重鎖DNAに変換され、該一重鎖DNA が出発一重鎖RNA
の複数コピー合成用の機能性鋳型に変換される。第１
プライマー及び第２プライマーが増幅方法で使用され
る。第１プライマーまたは第２プライマーの配列は特定
核酸配列の配列に十分に相補的であり、第１プライマー
または第２プライマーの配列は特定核酸配列の配列に十
分に相同である。いくつかの場合、例えば特定核酸配列
が二重鎖DNA の場合には、第１プライマーと第２プライ
マーとの双方が特定核酸配列の配列に十分に相補的で且
つ十分に相同である。
【００２８】RNA はオリゴヌクレオチドプライマー（第
１プライマー）を RNA（第１鋳型）にハイブリダイズさ
せRNA 依存性DNA ポリメラーゼを用いて第１プライマー
から相補鎖 DNA（第１DNA 配列）を合成することによっ
て一重鎖DNA に変換される。例えば第１鋳型の加水分解
とRNA-DNA ハイブリッドに特異的なリボヌクレアーゼ
（例えばリボヌクレアーゼＨ）を使用し、得られた一重
鎖 DNA（第２鋳型）を第１鋳型から分離する。第２鋳型
はRNA 合成可能な形態に変換される。この変換は、第２
鋳型の3'末端に十分に相補的な配列を3'末端に含み5'末
端に向かってプロモーターのアンチセンス鎖と転写開始
部位のアンチセンス配列とを含む配列をもつ合成オリゴ
ヌクレオチド（第２プライマー）をハイブリダイズし、
第２鋳型を鋳型として用いて第２プライマーの3'末端に
共有結合した第２DNA 配列を合成し、DNA 依存性DNA ポ
リメラーゼを用い第２プライマーを鋳型として用いて第
２鋳型の3'末端に共有結合した第３DNA 配列を合成する
ことによって行なわれる。得られた第２鋳型の機能性誘
導体が第３鋳型であり、これを使用し、第２プライマー
によって規定されるプロモーター及び転写開始部位に特
異的なRNA ポリメラーゼを用いて第１鋳型であるRNA の
複数コピーを合成する。サイクルを繰り返すことによっ
て、新しく合成された第１鋳型の各々が更に第２鋳型及
び第３鋳型のコピーに変換され得る。また、サイクルの
繰り返しがユーザーの介入または操作を不要とする。
１プライマー）を RNA（第１鋳型）にハイブリダイズさ
せRNA 依存性DNA ポリメラーゼを用いて第１プライマー
から相補鎖 DNA（第１DNA 配列）を合成することによっ
て一重鎖DNA に変換される。例えば第１鋳型の加水分解
とRNA-DNA ハイブリッドに特異的なリボヌクレアーゼ
（例えばリボヌクレアーゼＨ）を使用し、得られた一重
鎖 DNA（第２鋳型）を第１鋳型から分離する。第２鋳型
はRNA 合成可能な形態に変換される。この変換は、第２
鋳型の3'末端に十分に相補的な配列を3'末端に含み5'末
端に向かってプロモーターのアンチセンス鎖と転写開始
部位のアンチセンス配列とを含む配列をもつ合成オリゴ
ヌクレオチド（第２プライマー）をハイブリダイズし、
第２鋳型を鋳型として用いて第２プライマーの3'末端に
共有結合した第２DNA 配列を合成し、DNA 依存性DNA ポ
リメラーゼを用い第２プライマーを鋳型として用いて第
２鋳型の3'末端に共有結合した第３DNA 配列を合成する
ことによって行なわれる。得られた第２鋳型の機能性誘
導体が第３鋳型であり、これを使用し、第２プライマー
によって規定されるプロモーター及び転写開始部位に特
異的なRNA ポリメラーゼを用いて第１鋳型であるRNA の
複数コピーを合成する。サイクルを繰り返すことによっ
て、新しく合成された第１鋳型の各々が更に第２鋳型及
び第３鋳型のコピーに変換され得る。また、サイクルの
繰り返しがユーザーの介入または操作を不要とする。
【００２９】増幅方法は、適当な反応条件下に適当な酵
素、プライマー及び補因子に適当な鋳型核酸を添加する
ことによって開始される。この鋳型核酸は、均質で連続
的な増幅が可能な形態であり、図１に示すサイクルにお
ける中間体として機能する。増幅方法では前駆体（プラ
イマー、リボヌクレオシド三リン酸及びデオキシリボヌ
クレオシド三リン酸）の正味(net) の消費及び産生物(R
NA及びDNA)の正味の蓄積が生じる。RNA 及びDNA の合成
過程は、検出に十分なレベルの核酸が合成されるまで非
同時的に進行する。増幅過程は例えば標識前駆体からの
標識産生物の合成によって追跡され得る。
素、プライマー及び補因子に適当な鋳型核酸を添加する
ことによって開始される。この鋳型核酸は、均質で連続
的な増幅が可能な形態であり、図１に示すサイクルにお
ける中間体として機能する。増幅方法では前駆体（プラ
イマー、リボヌクレオシド三リン酸及びデオキシリボヌ
クレオシド三リン酸）の正味(net) の消費及び産生物(R
NA及びDNA)の正味の蓄積が生じる。RNA 及びDNA の合成
過程は、検出に十分なレベルの核酸が合成されるまで非
同時的に進行する。増幅過程は例えば標識前駆体からの
標識産生物の合成によって追跡され得る。
【００３０】増幅が、図１に概略的に示すプロセスに付
加または代替して別のプロセスを含んでもよい。また、
ある種の逆産生性(counter productive)酵素反応が許容
できる低速度で発生してもよい。予想される非産生性副
反応の１つは、鋳型核酸の非存在下のRNA 及び／または
DNA の合成である。かかるRNA 及び／またはDNA 産物を
所望産生物から識別するためには、特定核酸配列の２つ
のプライミング部位間にのみ検出される特定配列の有無
を判定すればよい。
加または代替して別のプロセスを含んでもよい。また、
ある種の逆産生性(counter productive)酵素反応が許容
できる低速度で発生してもよい。予想される非産生性副
反応の１つは、鋳型核酸の非存在下のRNA 及び／または
DNA の合成である。かかるRNA 及び／またはDNA 産物を
所望産生物から識別するためには、特定核酸配列の２つ
のプライミング部位間にのみ検出される特定配列の有無
を判定すればよい。
【００３１】第１プライマーは、第１鋳型の3'末端に十
分に相補的な配列を3'末端にもつオリゴデオキシリボヌ
クレオチドである。第１プライマーの3'末端の配列は、
所与のイオン強度条件及び温度条件下に第１DNA 配列を
特異的効率的に合成するために十分な特定の長さ及び塩
基組成をもつ。第１サイクルにおいて第１プライマーは
第１鋳型の3'末端の内部の領域に十分に相補的であり得
る。その後のサイクルにおいて、第１プライマーの5'末
端は第１鋳型の3'末端に相補的であろう。第１プライマ
ーの一部または全部が天然デオキシリボヌクレオチド以
外のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体から構成さ
れてもよいと考えられる。第１サイクルで第１プライマ
ーの5'末端は第１鋳型に相補的でない配列を含んでいて
もよい。非相補的配列は、固定化可能な核酸に相補的で
あってもよく、または検出容易なリポーターのごとき有
用な非核酸成分と結合可能であってもよい。または、非
相補的配列が、プロモーターのアンチセンス配列とRNA
合成に使用できる転写開始部位のアンチセンス配列とを
含んでいてもよい。このRNA は、第１鋳型に相補的であ
り別の増幅サイクルで中間体として使用され得る。
分に相補的な配列を3'末端にもつオリゴデオキシリボヌ
クレオチドである。第１プライマーの3'末端の配列は、
所与のイオン強度条件及び温度条件下に第１DNA 配列を
特異的効率的に合成するために十分な特定の長さ及び塩
基組成をもつ。第１サイクルにおいて第１プライマーは
第１鋳型の3'末端の内部の領域に十分に相補的であり得
る。その後のサイクルにおいて、第１プライマーの5'末
端は第１鋳型の3'末端に相補的であろう。第１プライマ
ーの一部または全部が天然デオキシリボヌクレオチド以
外のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体から構成さ
れてもよいと考えられる。第１サイクルで第１プライマ
ーの5'末端は第１鋳型に相補的でない配列を含んでいて
もよい。非相補的配列は、固定化可能な核酸に相補的で
あってもよく、または検出容易なリポーターのごとき有
用な非核酸成分と結合可能であってもよい。または、非
相補的配列が、プロモーターのアンチセンス配列とRNA
合成に使用できる転写開始部位のアンチセンス配列とを
含んでいてもよい。このRNA は、第１鋳型に相補的であ
り別の増幅サイクルで中間体として使用され得る。
【００３２】第２プライマーは第２鋳型の3'末端に十分
に相補的な配列を3'末端に含むオリゴデオキシリボヌク
レオチドである。第２プライマーは所与のイオン強度条
件及び温度条件下に第２及び第３のDNA 配列を特異的効
率的に合成せしめるに十分な特定の長さ及び塩基組成を
もつ。更に、第２プライマーは機能性プロモーターのア
ンチセンス配列と転写開始部位のアンチセンス配列とを
含む。この配列は、第３DNA 配列の合成用鋳型として使
用されたとき、RNA ポリメラーゼの特異的効率的結合と
所望部位での転写開始とを行なわせるに十分な情報を含
む。プロモーター配列は機能性プロモーターのアンチセ
ンス鎖に由来してもよい。転写開始部位は天然RNA 転写
物の5'末端配列に由来してもよい。好適実施態様におい
ては、第２プライマーの5'末端配列は、AATTCTAATACGAC
TCACTATAGGGAG である。この配列は、T7 RNAポリメラー
ゼ用のプロモーターのアンチセンス配列と転写開始部位
のアンチセンス配列とを含む。または、別のファージRN
A ポリメラーゼ用の転写開始部位とプロモーターとを使
用してもよい。更に、プロモーター機能に関係しない配
列が、第２プライマーの5'末端に含まれるかまたは第２
鋳型にハイブリダイズする3'末端の配列と転写開始部位
との間に含まれていてもよい。第２プライマーの一部ま
たは全部が天然デオキシリボヌクレオチド以外のヌクレ
オチドまたはヌクレオチド類似体から構成されてもよ
い。
に相補的な配列を3'末端に含むオリゴデオキシリボヌク
レオチドである。第２プライマーは所与のイオン強度条
件及び温度条件下に第２及び第３のDNA 配列を特異的効
率的に合成せしめるに十分な特定の長さ及び塩基組成を
もつ。更に、第２プライマーは機能性プロモーターのア
ンチセンス配列と転写開始部位のアンチセンス配列とを
含む。この配列は、第３DNA 配列の合成用鋳型として使
用されたとき、RNA ポリメラーゼの特異的効率的結合と
所望部位での転写開始とを行なわせるに十分な情報を含
む。プロモーター配列は機能性プロモーターのアンチセ
ンス鎖に由来してもよい。転写開始部位は天然RNA 転写
物の5'末端配列に由来してもよい。好適実施態様におい
ては、第２プライマーの5'末端配列は、AATTCTAATACGAC
TCACTATAGGGAG である。この配列は、T7 RNAポリメラー
ゼ用のプロモーターのアンチセンス配列と転写開始部位
のアンチセンス配列とを含む。または、別のファージRN
A ポリメラーゼ用の転写開始部位とプロモーターとを使
用してもよい。更に、プロモーター機能に関係しない配
列が、第２プライマーの5'末端に含まれるかまたは第２
鋳型にハイブリダイズする3'末端の配列と転写開始部位
との間に含まれていてもよい。第２プライマーの一部ま
たは全部が天然デオキシリボヌクレオチド以外のヌクレ
オチドまたはヌクレオチド類似体から構成されてもよ
い。
【００３３】本発明で使用される酵素はすべて、いくつ
かの実用規格を充足させる必要がある。酵素または酵素
調製物の各々は、ある種のDNA ポリメラーゼ及び一重鎖
または二重鎖に特異的なエキソヌクレアーゼまたはエン
ドヌクレアーゼにおいてしばしばみられる5'- または3'
- のエキソヌクレアーゼ活性のような有害なデオキシリ
ボヌクレアーゼ（「DNase 」）活性を有していてはなら
ない。酵素または酵素調製物の各々は、RNA 及びDNA の
ハイブリッドに特異的で好適なリボヌクレアーゼ活性
（例えばリボヌクレアーゼＨ）の添加を除いて、有害な
リボヌクレアーゼ（「RNase 」）活性を有していてはな
らない。更に、各酵素は、その他の酵素過程、及びRNA
またはDNA 鋳型にオリゴヌクレオチドプライマーをハイ
ブリダイズするような非酵素過程で使用される一般的な
反応条件下で適当な程度に活性でなければならない。
かの実用規格を充足させる必要がある。酵素または酵素
調製物の各々は、ある種のDNA ポリメラーゼ及び一重鎖
または二重鎖に特異的なエキソヌクレアーゼまたはエン
ドヌクレアーゼにおいてしばしばみられる5'- または3'
- のエキソヌクレアーゼ活性のような有害なデオキシリ
ボヌクレアーゼ（「DNase 」）活性を有していてはなら
ない。酵素または酵素調製物の各々は、RNA 及びDNA の
ハイブリッドに特異的で好適なリボヌクレアーゼ活性
（例えばリボヌクレアーゼＨ）の添加を除いて、有害な
リボヌクレアーゼ（「RNase 」）活性を有していてはな
らない。更に、各酵素は、その他の酵素過程、及びRNA
またはDNA 鋳型にオリゴヌクレオチドプライマーをハイ
ブリダイズするような非酵素過程で使用される一般的な
反応条件下で適当な程度に活性でなければならない。
【００３４】本発明で使用されるDNA 依存性RNA ポリメ
ラーゼは、プロモーターと指称される特定DNA 配列に結
合できかつプロモーターに極めて近接した所定の開始部
位でRNA のin vitro合成を特異的に開始し得るいかなる
酵素でもよい。プロモーター及び開始部位が第２プライ
マーの一部を形成する。更に、RNA ポリメラーゼは、適
当な時間内に鋳型の機能性コピー当たり数個のRNA コピ
ーを合成し得ることが必要である。好適実施態様では、
バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼが使用される。
更に別のバクテリオファージRNA ポリメラーゼ、例えば
ファージT3、ファージφII、Salmonellaファージsp6 ま
たはPseudomonas ファージgh-1の使用も可能である。ま
た別の実施態様では、原核細胞または真核細胞DNA 依存
性RNA ポリメラーゼを使用してもよい。別のRNA ポリメ
ラーゼを使用する場合には、第２プライマーのプロモー
ター配列及び開始配列を特定RNA ポリメラーゼの鋳型特
異性に従って適宜変更する必要がある。
ラーゼは、プロモーターと指称される特定DNA 配列に結
合できかつプロモーターに極めて近接した所定の開始部
位でRNA のin vitro合成を特異的に開始し得るいかなる
酵素でもよい。プロモーター及び開始部位が第２プライ
マーの一部を形成する。更に、RNA ポリメラーゼは、適
当な時間内に鋳型の機能性コピー当たり数個のRNA コピ
ーを合成し得ることが必要である。好適実施態様では、
バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼが使用される。
更に別のバクテリオファージRNA ポリメラーゼ、例えば
ファージT3、ファージφII、Salmonellaファージsp6 ま
たはPseudomonas ファージgh-1の使用も可能である。ま
た別の実施態様では、原核細胞または真核細胞DNA 依存
性RNA ポリメラーゼを使用してもよい。別のRNA ポリメ
ラーゼを使用する場合には、第２プライマーのプロモー
ター配列及び開始配列を特定RNA ポリメラーゼの鋳型特
異性に従って適宜変更する必要がある。
【００３５】本発明で使用されるRNA 依存性DNA ポリメ
ラーゼはオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー及
びRNA 鋳型からDNA を合成し得るいかなる酵素でもよ
い。この酵素は更に、DNA 依存性DNA ポリメラーゼ活性
及びRNase Ｈ活性を含んでいてもよい。好適実施態様に
おいては、トリ筋芽細胞腫ウイルスポリメラーゼ（「AM
V 逆転写酵素」）が使用される。更に、RNA 依存性DNA
ポリメラーゼが別のレトロウイルス、例えばモロニー(M
aloney) マウス白血病ウイルスに由来してもよい。また
は別の真核細胞RNA 依存性DNA ポリメラーゼを使用して
もよい。
ラーゼはオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー及
びRNA 鋳型からDNA を合成し得るいかなる酵素でもよ
い。この酵素は更に、DNA 依存性DNA ポリメラーゼ活性
及びRNase Ｈ活性を含んでいてもよい。好適実施態様に
おいては、トリ筋芽細胞腫ウイルスポリメラーゼ（「AM
V 逆転写酵素」）が使用される。更に、RNA 依存性DNA
ポリメラーゼが別のレトロウイルス、例えばモロニー(M
aloney) マウス白血病ウイルスに由来してもよい。また
は別の真核細胞RNA 依存性DNA ポリメラーゼを使用して
もよい。
【００３６】本発明で使用されるDNA 依存性DNA ポリメ
ラーゼは、オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー
とDNA 鋳型とからDNA を合成し得るいかなる酵素でもよ
い。この酵素は多くの種類のDNA ポリメラーゼに関連す
る5'- または3'- エキソヌクレアーゼ活性を有していて
はならない。好適実施態様ではAMV 逆転写酵素が使用さ
れるが、5'- または3'- エキソヌクレアーゼ活性が本来
欠如した別のDNA 依存性DNA ポリメラーゼも使用でき
る。このようなポリメラーゼの例は、いくつかの真核細
胞DNA ポリメラーゼ、例えばDNA ポリメラーゼαまたは
β、仔ウシ胸腺のごとき哺乳類組織から単離されるDNA
ポリメラーゼである。普通なら不適当なDNA ポリメラー
ゼも、DNA ポリメラーゼ遺伝子の変性と適当な宿主細胞
中での変性ポリメラーゼの発現とを順次行なうかまたは
DNA ポリメラーゼタンパク質を化学的に修飾することに
よって不要なエキソヌクレアーゼ活性を除去すれば有用
になる。変性型のDNA ポリメラーゼは、大腸菌ポリメラ
ーゼＩのクレノウ(Klenow)フラグメントから調製されて
もよくまたはバクテリオファージT7 DNAポリメラーゼか
ら調製されてもよい。好適実施態様においては、RNA 依
存性DNA ポリメラーゼ活性とDNA 依存性DNA ポリメラー
ゼ活性との双方が同じ酵素によって与えられるので、前
記のごとき変性型のDNA 依存性DNA ポリメラーゼ活性
は、RNA 依存性DNA ポリメラーゼに起因する活性の補足
として付加されることが理解されよう。
ラーゼは、オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー
とDNA 鋳型とからDNA を合成し得るいかなる酵素でもよ
い。この酵素は多くの種類のDNA ポリメラーゼに関連す
る5'- または3'- エキソヌクレアーゼ活性を有していて
はならない。好適実施態様ではAMV 逆転写酵素が使用さ
れるが、5'- または3'- エキソヌクレアーゼ活性が本来
欠如した別のDNA 依存性DNA ポリメラーゼも使用でき
る。このようなポリメラーゼの例は、いくつかの真核細
胞DNA ポリメラーゼ、例えばDNA ポリメラーゼαまたは
β、仔ウシ胸腺のごとき哺乳類組織から単離されるDNA
ポリメラーゼである。普通なら不適当なDNA ポリメラー
ゼも、DNA ポリメラーゼ遺伝子の変性と適当な宿主細胞
中での変性ポリメラーゼの発現とを順次行なうかまたは
DNA ポリメラーゼタンパク質を化学的に修飾することに
よって不要なエキソヌクレアーゼ活性を除去すれば有用
になる。変性型のDNA ポリメラーゼは、大腸菌ポリメラ
ーゼＩのクレノウ(Klenow)フラグメントから調製されて
もよくまたはバクテリオファージT7 DNAポリメラーゼか
ら調製されてもよい。好適実施態様においては、RNA 依
存性DNA ポリメラーゼ活性とDNA 依存性DNA ポリメラー
ゼ活性との双方が同じ酵素によって与えられるので、前
記のごとき変性型のDNA 依存性DNA ポリメラーゼ活性
は、RNA 依存性DNA ポリメラーゼに起因する活性の補足
として付加されることが理解されよう。
【００３７】本発明で使用され得るRNase Ｈは相補的DN
A にアニールされるRNA を加水分解し得るいかなる酵素
でもよい。この酵素は、一重鎖または二重鎖のRNA また
はいかなるDNA も加水分解してはならない。好適実施態
様においては、大腸菌RNaseＨを使用する。更に別のRNa
se Ｈ酵素、例えば仔ウシ胸腺RNase Ｈの使用も可能で
ある。RNase ＨはAMV 逆転写酵素の固有活性であるか
ら、好適実施態様では大腸菌RNase ＨにAMV 逆転写酵素
のRNase Ｈが付加される。または、第１鋳型から第２鋳
型を分離し得る別のいかなる酵素を使用してもよい。
A にアニールされるRNA を加水分解し得るいかなる酵素
でもよい。この酵素は、一重鎖または二重鎖のRNA また
はいかなるDNA も加水分解してはならない。好適実施態
様においては、大腸菌RNaseＨを使用する。更に別のRNa
se Ｈ酵素、例えば仔ウシ胸腺RNase Ｈの使用も可能で
ある。RNase ＨはAMV 逆転写酵素の固有活性であるか
ら、好適実施態様では大腸菌RNase ＨにAMV 逆転写酵素
のRNase Ｈが付加される。または、第１鋳型から第２鋳
型を分離し得る別のいかなる酵素を使用してもよい。
【００３８】DNA 合成及びRNA 合成の双方にとって必要
な緩衝液及び補因子を入れた反応容器で前記酵素とプラ
イマーとを一緒に混合する。更に、当業者に公知のごと
くDNA 及びDNA 鋳型にプライマーを特異的にハイブリダ
イズさせるための適当なイオン条件及び反応温度を与え
る。反応混合物は、増幅方法を妨害する物質、例えば酵
素の活性を大幅に阻害するかプライマーと鋳型とのハイ
ブリダイズを妨害するかまたは核酸中間体及び産生物を
非産生的に分解させる物質を含んでいてはならない。
な緩衝液及び補因子を入れた反応容器で前記酵素とプラ
イマーとを一緒に混合する。更に、当業者に公知のごと
くDNA 及びDNA 鋳型にプライマーを特異的にハイブリダ
イズさせるための適当なイオン条件及び反応温度を与え
る。反応混合物は、増幅方法を妨害する物質、例えば酵
素の活性を大幅に阻害するかプライマーと鋳型とのハイ
ブリダイズを妨害するかまたは核酸中間体及び産生物を
非産生的に分解させる物質を含んでいてはならない。
【００３９】増幅方法の応用に役立つと思われるいくつ
かの検出手順を説明する。本増幅方法で合成された核酸
の検出手順が記載の手順に限定されないこと、別の検出
方法の使用が可能であることが理解されよう。
かの検出手順を説明する。本増幅方法で合成された核酸
の検出手順が記載の手順に限定されないこと、別の検出
方法の使用が可能であることが理解されよう。
【００４０】検出手順の１つの実施態様においては、反
応混合物に標識前駆体を添加し得る。当業者に公知の方
法を用いて標識前駆体から分離できる標識産生物の定量
分析または定性分析によって増幅が検出される。
応混合物に標識前駆体を添加し得る。当業者に公知の方
法を用いて標識前駆体から分離できる標識産生物の定量
分析または定性分析によって増幅が検出される。
【００４１】標識前駆体は、RNA 合成を検出するリボヌ
クレオシド三リン酸でもよく、またはDNA 合成を検出す
るデオキシヌクレオシド三リン酸またはオリゴヌクレオ
チドプライマーでもよい。標識のタイプは放射性同位体
でもよく、またはビオチンのごとき有用な化学基、発色
団、蛍光発色団または抗体に結合し得るハプテンでもよ
く、またはタンパクまたは酵素でもよい。標識産生物は
溶解度、電荷またはサイズに基づいて標識前駆体から分
離されてもよい。更に、標識DNA またはRNA を、相補配
列を含み固定化することが可能な核酸にハイブリダイズ
してもよい。
クレオシド三リン酸でもよく、またはDNA 合成を検出す
るデオキシヌクレオシド三リン酸またはオリゴヌクレオ
チドプライマーでもよい。標識のタイプは放射性同位体
でもよく、またはビオチンのごとき有用な化学基、発色
団、蛍光発色団または抗体に結合し得るハプテンでもよ
く、またはタンパクまたは酵素でもよい。標識産生物は
溶解度、電荷またはサイズに基づいて標識前駆体から分
離されてもよい。更に、標識DNA またはRNA を、相補配
列を含み固定化することが可能な核酸にハイブリダイズ
してもよい。
【００４２】別の実施態様においては、増幅方法の産生
物が固定化担体に結合され、相補配列を含む核酸プロー
ブにハイブリダイズされ、さらに溶液中に残存する非ハ
イブリダイズ核酸プローブから分離され得る。産生物た
るDNA またはRNA は、疎水的、静電的または共有結合的
相互作用のような安定な相互作用によって固体担体に直
接結合されてもよい。更に、産生物は、固定化タンパク
質（例えばアビジンまたはストレプトアビジン）に結合
させるごとき増幅方法では、その産生物中に取り込まれ
得るビオチンのようなある種の化学基を含んでもよい。
更に産生物は、相補配列を含み固定化することが可能な
核酸にハイブリダイズされてもよい。核酸プローブは、
ハイブリダイゼーション条件下に結合を生起しかつ非ハ
イブリダイズ核酸プローブの除去に使用される条件下で
持続的に結合させるために増幅方法の産生物と十分に安
定な相互作用を形成する相補配列を含む。好適実施態様
において、相補配列は第１プライマー配列と第２プライ
マー配列との間に存在する特定核酸配列の配列部分に由
来する。核酸プローブは、一重鎖DNA またはRNA でもよ
く、または一重鎖にできる二重鎖DNA またはRNA でもよ
く、またはデオキシリボヌクレオチド及び／またはリボ
ヌクレオチドから構成され得るオリゴヌクレオチドでも
よい。更に、核酸プローブは、適当な条件下にDNA 産物
またはRNA 産物に共有結合し得る化学基を含んでいても
よい。放射性同位体、ビオチンのごとき有用な化学基、
発色団、蛍光発色団または抗体に結合し得るハプテンで
核酸プローブを標識してもよい。核酸プローブは更に、
タンパク質またはホスファターゼ、ペルオキシダーゼの
ごとき酵素との複合体を形成し得る。核酸プローブは更
にプローブをin vitro 複製し得るある種の配列を含ん
でいてもよい。
物が固定化担体に結合され、相補配列を含む核酸プロー
ブにハイブリダイズされ、さらに溶液中に残存する非ハ
イブリダイズ核酸プローブから分離され得る。産生物た
るDNA またはRNA は、疎水的、静電的または共有結合的
相互作用のような安定な相互作用によって固体担体に直
接結合されてもよい。更に、産生物は、固定化タンパク
質（例えばアビジンまたはストレプトアビジン）に結合
させるごとき増幅方法では、その産生物中に取り込まれ
得るビオチンのようなある種の化学基を含んでもよい。
更に産生物は、相補配列を含み固定化することが可能な
核酸にハイブリダイズされてもよい。核酸プローブは、
ハイブリダイゼーション条件下に結合を生起しかつ非ハ
イブリダイズ核酸プローブの除去に使用される条件下で
持続的に結合させるために増幅方法の産生物と十分に安
定な相互作用を形成する相補配列を含む。好適実施態様
において、相補配列は第１プライマー配列と第２プライ
マー配列との間に存在する特定核酸配列の配列部分に由
来する。核酸プローブは、一重鎖DNA またはRNA でもよ
く、または一重鎖にできる二重鎖DNA またはRNA でもよ
く、またはデオキシリボヌクレオチド及び／またはリボ
ヌクレオチドから構成され得るオリゴヌクレオチドでも
よい。更に、核酸プローブは、適当な条件下にDNA 産物
またはRNA 産物に共有結合し得る化学基を含んでいても
よい。放射性同位体、ビオチンのごとき有用な化学基、
発色団、蛍光発色団または抗体に結合し得るハプテンで
核酸プローブを標識してもよい。核酸プローブは更に、
タンパク質またはホスファターゼ、ペルオキシダーゼの
ごとき酵素との複合体を形成し得る。核酸プローブは更
にプローブをin vitro 複製し得るある種の配列を含ん
でいてもよい。
【００４３】分子クローニング技術によって進歩した典
型的核酸処理方法によって本増幅方法の産生物を分析す
ることが可能である。１つの方法では、合成DNA を制限
エンドヌクレアーゼで分解し、電気泳動法で分離し、当
業界で公知の方法で検出することによって特定DNA 配列
の合成を検出し得る。別の方法では、RNA 依存性DNAポ
リメラーゼと第１プライマーとジデオキシヌクレオシド
三リン酸とを用いたDNA 合成によって、増幅RNA の配列
を決定し得る（Stoflet 等、1988）。更に別の方法で
は、本増幅方法で使用したDNA 依存性RNA ポリメラーゼ
と3'- デオキシリボヌクレオシド三リン酸とを用いたRN
A 合成によって増幅された第３鋳型の配列を決定し得る
（Axelrod & Kramer、1985）。別の方法においては増幅
RNA がin vitro 翻訳され得るポリペプチドをコードする
であろう。in vitro 翻訳されたポリペプチド産生物は
抗体を用いて分析され得る。
型的核酸処理方法によって本増幅方法の産生物を分析す
ることが可能である。１つの方法では、合成DNA を制限
エンドヌクレアーゼで分解し、電気泳動法で分離し、当
業界で公知の方法で検出することによって特定DNA 配列
の合成を検出し得る。別の方法では、RNA 依存性DNAポ
リメラーゼと第１プライマーとジデオキシヌクレオシド
三リン酸とを用いたDNA 合成によって、増幅RNA の配列
を決定し得る（Stoflet 等、1988）。更に別の方法で
は、本増幅方法で使用したDNA 依存性RNA ポリメラーゼ
と3'- デオキシリボヌクレオシド三リン酸とを用いたRN
A 合成によって増幅された第３鋳型の配列を決定し得る
（Axelrod & Kramer、1985）。別の方法においては増幅
RNA がin vitro 翻訳され得るポリペプチドをコードする
であろう。in vitro 翻訳されたポリペプチド産生物は
抗体を用いて分析され得る。
【００４４】特定核酸配列を含有すると予想されるかま
たは含有することが判明しているサンプルを、均質な連
続増幅が可能な鋳型核酸の形態で反応混合物に添加す
る。この反応混合物は図１のサイクル中のいかなる中間
体でもよい。特に、鋳型核酸は、第２プライマーの3'末
端に存在する配列と十分に相同の配列を5'末端に含み、
かつ第１プライマーに十分に相補的な配列を含む一重鎖
RNA でもよい。この形態の鋳型核酸は本増幅方法では第
１鋳型として機能するであろう。または、鋳型核酸は、
第２プライマーの少なくとも3'末端と十分に相補的な配
列を3'末端に含みかつ第１プライマーの3'末端に存在す
る配列に十分に相同の配列を含む一重鎖DNA でもよい。
この形態の鋳型核酸は本増幅方法では第２鋳型として機
能するであろう。または鋳型核酸は、一方の鎖が5'末端
に第２プライマーの完全配列を含みかつ第１プライマー
と十分に相補的な配列を含む二重鎖DNA でもよい。二重
鎖DNA は本増幅方法では第３鋳型として機能する。
たは含有することが判明しているサンプルを、均質な連
続増幅が可能な鋳型核酸の形態で反応混合物に添加す
る。この反応混合物は図１のサイクル中のいかなる中間
体でもよい。特に、鋳型核酸は、第２プライマーの3'末
端に存在する配列と十分に相同の配列を5'末端に含み、
かつ第１プライマーに十分に相補的な配列を含む一重鎖
RNA でもよい。この形態の鋳型核酸は本増幅方法では第
１鋳型として機能するであろう。または、鋳型核酸は、
第２プライマーの少なくとも3'末端と十分に相補的な配
列を3'末端に含みかつ第１プライマーの3'末端に存在す
る配列に十分に相同の配列を含む一重鎖DNA でもよい。
この形態の鋳型核酸は本増幅方法では第２鋳型として機
能するであろう。または鋳型核酸は、一方の鎖が5'末端
に第２プライマーの完全配列を含みかつ第１プライマー
と十分に相補的な配列を含む二重鎖DNA でもよい。二重
鎖DNA は本増幅方法では第３鋳型として機能する。
【００４５】鋳型核酸の調製は本増幅方法の一部を構成
しないが、増幅方法の応用に役立つと思われる鋳型核酸
形成手順の幾つかの例を以下に説明する。しかしながら
鋳型核酸形成手順が記載の種々の手順に限定されること
なく別の方法も使用できることは理解されよう。
しないが、増幅方法の応用に役立つと思われる鋳型核酸
形成手順の幾つかの例を以下に説明する。しかしながら
鋳型核酸形成手順が記載の種々の手順に限定されること
なく別の方法も使用できることは理解されよう。
【００４６】鋳型核酸形成手順の１つの例においては、
第１鋳型として機能し得る鋳型核酸は、天然由来RNA で
あるかまたは当業界で公知の部位特異的加水分解法（Sh
ibahara 等、1987）を用いてより大きいRNA 分子から生
成され得るRNA フラグメントであり得る。
第１鋳型として機能し得る鋳型核酸は、天然由来RNA で
あるかまたは当業界で公知の部位特異的加水分解法（Sh
ibahara 等、1987）を用いてより大きいRNA 分子から生
成され得るRNA フラグメントであり得る。
【００４７】別の例においては、第２鋳型として機能し
得る鋳型核酸は、第２プライマーの3'末端に十分に相補
的な配列に直接つながり(flanking)、制限エンドヌクレ
アーゼで消化し得る部位をもつ二重鎖DNA から調製され
得る。
得る鋳型核酸は、第２プライマーの3'末端に十分に相補
的な配列に直接つながり(flanking)、制限エンドヌクレ
アーゼで消化し得る部位をもつ二重鎖DNA から調製され
得る。
【００４８】更に別の例においては、第２鋳型として機
能し得る鋳型核酸は、DNA 合成を阻止し得るオリゴヌク
レオチドにハイブリダイズさせた一重鎖DNA またはRNA
から調製される。この阻止オリゴヌクレオチドは適当な
条件下に鋳型に共有結合し得る化学基を含んでもよい。
第１プライマーを使用してこの阻止された鋳型からDNA
を合成すると第２鋳型と同じ3'末端をもつ合成DNA が得
られる。出発鋳型がRNA のとき、得られるDNA-RNA ハイ
ブリッドは鋳型核酸として直接使用され得る。出発鋳型
がDNA のとき、得られた第２鋳型のコピーは化学的また
は熱的変性方法によって出発鋳型から分離され得る。
能し得る鋳型核酸は、DNA 合成を阻止し得るオリゴヌク
レオチドにハイブリダイズさせた一重鎖DNA またはRNA
から調製される。この阻止オリゴヌクレオチドは適当な
条件下に鋳型に共有結合し得る化学基を含んでもよい。
第１プライマーを使用してこの阻止された鋳型からDNA
を合成すると第２鋳型と同じ3'末端をもつ合成DNA が得
られる。出発鋳型がRNA のとき、得られるDNA-RNA ハイ
ブリッドは鋳型核酸として直接使用され得る。出発鋳型
がDNA のとき、得られた第２鋳型のコピーは化学的また
は熱的変性方法によって出発鋳型から分離され得る。
【００４９】別の例においては、第３鋳型として機能す
る鋳型核酸は、第２プライマーを用いてDNA またはRNA
鋳型からDNA 合成された一重鎖DNA またはRNA から調製
される。得られた合成DNA を化学的または熱的変性方法
を用いて出発鋳型から分離する。更に、化学的または酵
素的方法を用いてRNA 鋳型を加水分解する。得られた一
重鎖DNA は5'末端に共有結合した第２プライマーの配列
をもちかつ第１プライマーに十分に相補的な配列を含
む。一重鎖DNA に第１プライマーをハイブリダイズし、
さらに第１プライマーに共有結合しかつ一重鎖DNA に相
補的なDNA 配列を合成することによって、この一重鎖DN
A を転写機能をもつ二重鎖DNA に変換し得る。
る鋳型核酸は、第２プライマーを用いてDNA またはRNA
鋳型からDNA 合成された一重鎖DNA またはRNA から調製
される。得られた合成DNA を化学的または熱的変性方法
を用いて出発鋳型から分離する。更に、化学的または酵
素的方法を用いてRNA 鋳型を加水分解する。得られた一
重鎖DNA は5'末端に共有結合した第２プライマーの配列
をもちかつ第１プライマーに十分に相補的な配列を含
む。一重鎖DNA に第１プライマーをハイブリダイズし、
さらに第１プライマーに共有結合しかつ一重鎖DNA に相
補的なDNA 配列を合成することによって、この一重鎖DN
A を転写機能をもつ二重鎖DNA に変換し得る。
【００５０】さらに別の例においては、化学的、熱的ま
たは任意に酵素的方法を用いて二重鎖DNA 、二重鎖RNA
またはDNA-RNA ハイブリッドから一重鎖DNA またはRNA
鋳型を得ることができる。次に、前述の鋳型核酸形成手
順のいずれかを用い、得られた一重鎖DNA またはRNA か
ら第１、第２または第３の鋳型として機能する鋳型核酸
を生成する。また、第１プライマー及び核酸の一方の鎖
が関与する手順と第２プライマー及び核酸の他方の（相
補）鎖が関与する別の手順とを同時に使用して鋳型核酸
を調製することも可能である。
たは任意に酵素的方法を用いて二重鎖DNA 、二重鎖RNA
またはDNA-RNA ハイブリッドから一重鎖DNA またはRNA
鋳型を得ることができる。次に、前述の鋳型核酸形成手
順のいずれかを用い、得られた一重鎖DNA またはRNA か
ら第１、第２または第３の鋳型として機能する鋳型核酸
を生成する。また、第１プライマー及び核酸の一方の鎖
が関与する手順と第２プライマー及び核酸の他方の（相
補）鎖が関与する別の手順とを同時に使用して鋳型核酸
を調製することも可能である。
【００５１】
【実施例】材料及び方法 材料 Applied Biosystems 380A DNA シンセサイザーを使用し
てオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチド
合成に使用したカラム、ホスフォラミジット（phosphor
amidites）及び試薬はTech- nical Marketing Associat
esを介してApplied Biosystems, Inc.から入手した。ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動及びDEAEセルロースクロ
マトグラフィーを順次用いてオリゴヌクレオチドを精製
した。放射性同位体［α-32P］UTP(800Ci/mmol) はAmer
shamから入手した。DNA を分解及び結合させる酵素はNe
w England Biolabs から購入し製造業者の使用説明書通
りに使用した。DNA ポリメラーゼ1(Klenow) の大フラグ
メントを含む調製物もNewEngland Biolabsから購入し
た。RNasin及びT7 RNAポリメラーゼはBio/Can Scientif
ic Inc. を介してPromega Biotecから購入した。逆転写
酵素及びRNase ＨはPharmacia から入手した。プロテイ
ナーゼＫはBoehringer Mannheim Canadaから入手した。
すべての形質転換に大腸菌HB101 株(ATCC33694) を使用
した。プラスミド pUC19（Norrander 等、1983）はBeth
esda Research Laboratoriesから購入した。
てオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチド
合成に使用したカラム、ホスフォラミジット（phosphor
amidites）及び試薬はTech- nical Marketing Associat
esを介してApplied Biosystems, Inc.から入手した。ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動及びDEAEセルロースクロ
マトグラフィーを順次用いてオリゴヌクレオチドを精製
した。放射性同位体［α-32P］UTP(800Ci/mmol) はAmer
shamから入手した。DNA を分解及び結合させる酵素はNe
w England Biolabs から購入し製造業者の使用説明書通
りに使用した。DNA ポリメラーゼ1(Klenow) の大フラグ
メントを含む調製物もNewEngland Biolabsから購入し
た。RNasin及びT7 RNAポリメラーゼはBio/Can Scientif
ic Inc. を介してPromega Biotecから購入した。逆転写
酵素及びRNase ＨはPharmacia から入手した。プロテイ
ナーゼＫはBoehringer Mannheim Canadaから入手した。
すべての形質転換に大腸菌HB101 株(ATCC33694) を使用
した。プラスミド pUC19（Norrander 等、1983）はBeth
esda Research Laboratoriesから購入した。
【００５２】DNA の単離及び配列決定 50μg/mlのアンピシリンを含むYT培地（Miller、1972）
で大腸菌形質転換体を増殖させた。高速沸騰法（Holmes
& Quigley、1981）によってプラススミドDNAを精製し
た。すべての構築に使用したDNA フラグメント及びベク
ターを低融点アガロース電気泳動で分離し、フェノール
抽出及びエタノール沈殿によって溶解アガロースから精
製した(Mania-tis等、1982）。ジデオキシ法（Sanger
等、1977）の修正方法（Hattori 等、1985）を用いてプ
ラスミドDNA を配列決定した。反応開始のために−20ユ
ニバーサルプライマー(New England Biolabs) を使用し
た。
で大腸菌形質転換体を増殖させた。高速沸騰法（Holmes
& Quigley、1981）によってプラススミドDNAを精製し
た。すべての構築に使用したDNA フラグメント及びベク
ターを低融点アガロース電気泳動で分離し、フェノール
抽出及びエタノール沈殿によって溶解アガロースから精
製した(Mania-tis等、1982）。ジデオキシ法（Sanger
等、1977）の修正方法（Hattori 等、1985）を用いてプ
ラスミドDNA を配列決定した。反応開始のために−20ユ
ニバーサルプライマー(New England Biolabs) を使用し
た。
【００５３】TCA 沈殿 増幅反応のアリコート(5μl)を20μl の10mMのEDTA中で
制止し、一定時間おきのすべてのサンプルの収集が終わ
るまで氷上に維持した。次に制止されたサンプルをガラ
スフィルターディスクに塗布し、直ちに氷冷5 ％トリク
ロロ酢酸 (TCA)-1％のピロリン酸ナトリウム中に浸し込
み、10分間ときどき攪拌した。次に氷冷5％TCA で5 分
間ずつ2 回洗浄し、95％エタノールで更に2 回洗浄し、
凍結によって乾固した。液体シンチレーションカウンタ
ーで放射活性を測定した。
制止し、一定時間おきのすべてのサンプルの収集が終わ
るまで氷上に維持した。次に制止されたサンプルをガラ
スフィルターディスクに塗布し、直ちに氷冷5 ％トリク
ロロ酢酸 (TCA)-1％のピロリン酸ナトリウム中に浸し込
み、10分間ときどき攪拌した。次に氷冷5％TCA で5 分
間ずつ2 回洗浄し、95％エタノールで更に2 回洗浄し、
凍結によって乾固した。液体シンチレーションカウンタ
ーで放射活性を測定した。
【００５４】ポリアクリルアミドゲル電気泳動 サンプル(1〜6 μl)を 4〜5 μl のホルムアミド染料
（90％脱イオンホルムアミド、10mMのTrisHCl(pH8.0)、
1mM のEDTA、キシレンシアノール及びブロモフェノール
ブルー）と混合し、電圧印加前(pre-run) の12cm長さの
7％変性ポリアクリルアミドゲルに塗布した。ブロモフ
ェノールブルー染料が底部に到達するまでゲルに350 ボ
ルトを印加した。いくつかの場合にはオートラジオグラ
フィーにかける前にゲルを固定しかつ乾燥した。固定は
10％メタノール-7％酢酸中で15分間洗浄して行った。こ
の方法で分離されたRNA 産物のプロフィルはオートラジ
オグラフィーによって室温で可視化した。
（90％脱イオンホルムアミド、10mMのTrisHCl(pH8.0)、
1mM のEDTA、キシレンシアノール及びブロモフェノール
ブルー）と混合し、電圧印加前(pre-run) の12cm長さの
7％変性ポリアクリルアミドゲルに塗布した。ブロモフ
ェノールブルー染料が底部に到達するまでゲルに350 ボ
ルトを印加した。いくつかの場合にはオートラジオグラ
フィーにかける前にゲルを固定しかつ乾燥した。固定は
10％メタノール-7％酢酸中で15分間洗浄して行った。こ
の方法で分離されたRNA 産物のプロフィルはオートラジ
オグラフィーによって室温で可視化した。
【００５５】実施例１ gag 試験系用オリゴヌクレオチドの設計及び合成 EcoRＩ部位と、T7ファージプロモーターと、T7RNA ポリ
メラーゼによる転写開始に必要な配列と、19bpのハイブ
リダイゼーション領域（ハイブリダイゼーション領域
１）とを含むように合成DNA 配列を設計した（図２の
Ａ）。これらの構成要素のクローニングに関与する47b
のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖（T7H1.GAG）は第
１プライマーとしても機能する。ハイブリダイゼーショ
ン領域2 はハイブリダイゼーション領域1 から53bpを隔
てており長さ20bpである。この領域（H2.GAG）に対して
形成されるプライマーは20b のセンスオリゴヌクレオチ
ド鎖の重複でありクローニングには使用されない。ハイ
ブリダイゼーション領域全体を含む配列はエイズの原因
物質である HTLV-III ゲノムのgag 部分の92bpのセグメ
ントである。この特定遺伝子セグメントを選択した理由
は、プライマーが有効にハイブリダイズすると予想され
たこと及び２つのハイブリダイゼーション領域間の間隔
が比較的短いことにある。更に、クローニングを容易に
するために配列の末端にXba Ｉ部位を配置した。gag 試
験配列はまた、組換え体のスクリーニングを容易にする
Sph Ｉ部位及びPst Ｉ部位を含む。
メラーゼによる転写開始に必要な配列と、19bpのハイブ
リダイゼーション領域（ハイブリダイゼーション領域
１）とを含むように合成DNA 配列を設計した（図２の
Ａ）。これらの構成要素のクローニングに関与する47b
のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖（T7H1.GAG）は第
１プライマーとしても機能する。ハイブリダイゼーショ
ン領域2 はハイブリダイゼーション領域1 から53bpを隔
てており長さ20bpである。この領域（H2.GAG）に対して
形成されるプライマーは20b のセンスオリゴヌクレオチ
ド鎖の重複でありクローニングには使用されない。ハイ
ブリダイゼーション領域全体を含む配列はエイズの原因
物質である HTLV-III ゲノムのgag 部分の92bpのセグメ
ントである。この特定遺伝子セグメントを選択した理由
は、プライマーが有効にハイブリダイズすると予想され
たこと及び２つのハイブリダイゼーション領域間の間隔
が比較的短いことにある。更に、クローニングを容易に
するために配列の末端にXba Ｉ部位を配置した。gag 試
験配列はまた、組換え体のスクリーニングを容易にする
Sph Ｉ部位及びPst Ｉ部位を含む。
【００５６】このフラグメントのクローニングにおいて
は合計４つのオリゴヌクレオチドを使用した。gag 試験
配列及びgag2試験配列の構築に使用したN1.GAGはアンチ
センス鎖を完成させクローニング過程でのみ使用され
る。また、T74.PRO はT7プロモーターのセンス鎖成分で
ある。しかしながら、N2.GAGは双方の試験フラグメント
の構築に使用され、また増幅サイクルの2 つの段階の中
間体（第２鋳型）として使用された。完全にクローニン
グされたgag 試験フラグメントはまた、増幅サイクルの
中間体（第３鋳型）を構成し得る。適当なベクター中で
クローニングされるとgag 試験DNA はT7 RNAポリメラー
ゼによって転写され、３つの段階に関与する増幅中間体
として有用なRNA フラグメント（第１鋳型）を産生す
る。更に、T7H1.GAG及びH2.GAGは試験系のプライマーと
しても機能する。
は合計４つのオリゴヌクレオチドを使用した。gag 試験
配列及びgag2試験配列の構築に使用したN1.GAGはアンチ
センス鎖を完成させクローニング過程でのみ使用され
る。また、T74.PRO はT7プロモーターのセンス鎖成分で
ある。しかしながら、N2.GAGは双方の試験フラグメント
の構築に使用され、また増幅サイクルの2 つの段階の中
間体（第２鋳型）として使用された。完全にクローニン
グされたgag 試験フラグメントはまた、増幅サイクルの
中間体（第３鋳型）を構成し得る。適当なベクター中で
クローニングされるとgag 試験DNA はT7 RNAポリメラー
ゼによって転写され、３つの段階に関与する増幅中間体
として有用なRNA フラグメント（第１鋳型）を産生す
る。更に、T7H1.GAG及びH2.GAGは試験系のプライマーと
しても機能する。
【００５７】gag2試験合成DNA フラグメント（図２の
Ｂ）はT7プロモーターを含まないが配列の残りの部分は
gag 試験配列と同じであり、従ってN1.GAG及びN2.GAGの
双方がその構築に関与した。アンチセンス鎖の完成に必
要なオリゴヌクレオチドをH1.GAGと指称する。一旦クロ
ーニングされると、gag2試験フラグメントはDNA 制限フ
ラグメントを鋳型核酸として用いながら増幅を試験する
鋳型として使用できる。
Ｂ）はT7プロモーターを含まないが配列の残りの部分は
gag 試験配列と同じであり、従ってN1.GAG及びN2.GAGの
双方がその構築に関与した。アンチセンス鎖の完成に必
要なオリゴヌクレオチドをH1.GAGと指称する。一旦クロ
ーニングされると、gag2試験フラグメントはDNA 制限フ
ラグメントを鋳型核酸として用いながら増幅を試験する
鋳型として使用できる。
【００５８】実施例２ gag 試験プラスミドの構築 70mMのTrisHCl(pH7.6)と10mMのMgCl2 と5mM のDTT と0.
5mM のATP と5 単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼとを
含む20μl 反応物中でオリゴヌクレオチドT74.PRO 及び
N1.GAG（各 2μg ）を別々に37℃で30分間リン酸化し
た。リン酸化したT74.PRO 及びN1.GAG（各10μl ）を各
1 μg の非リン酸化T7H1.GAG及びN2.GAGと3 μl の100m
M のTrisHCl(pH7.8)-500mMのNaClと混合しgag 試験アセ
ンブリ用の最終容量29μl にした。gag2試験混合物は10
μl のリン酸化N1.GAGと各1 μg の非リン酸化H1.GAG及
びN2.GAGと1.8 μl の100mM のTrisHCl(pH7.8)-500mMの
NaClとを最終容量18μl 中に含んでいた。90℃で10分間
維持し10〜16時間でゆっくりと室温まで放冷することに
よってオリゴヌクレオチド混合物を別々にハイブリダイ
ズさせた。ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを結
合するために50mMのTrisHCl(pH7.8)と10mMのMgCl2 と20
mMのDTT と1mM のATP と50μl/mlのBSA とを含む60μl
の反応物を使用した。gag 試験反応物には400 単位のT4
DNAリガーゼを添加し15℃で2 時間インキュベートし
た。gag2試験反応物は200 単位のT4 DNAリガーゼと共に
14〜16時間インキュベートした。
5mM のATP と5 単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼとを
含む20μl 反応物中でオリゴヌクレオチドT74.PRO 及び
N1.GAG（各 2μg ）を別々に37℃で30分間リン酸化し
た。リン酸化したT74.PRO 及びN1.GAG（各10μl ）を各
1 μg の非リン酸化T7H1.GAG及びN2.GAGと3 μl の100m
M のTrisHCl(pH7.8)-500mMのNaClと混合しgag 試験アセ
ンブリ用の最終容量29μl にした。gag2試験混合物は10
μl のリン酸化N1.GAGと各1 μg の非リン酸化H1.GAG及
びN2.GAGと1.8 μl の100mM のTrisHCl(pH7.8)-500mMの
NaClとを最終容量18μl 中に含んでいた。90℃で10分間
維持し10〜16時間でゆっくりと室温まで放冷することに
よってオリゴヌクレオチド混合物を別々にハイブリダイ
ズさせた。ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを結
合するために50mMのTrisHCl(pH7.8)と10mMのMgCl2 と20
mMのDTT と1mM のATP と50μl/mlのBSA とを含む60μl
の反応物を使用した。gag 試験反応物には400 単位のT4
DNAリガーゼを添加し15℃で2 時間インキュベートし
た。gag2試験反応物は200 単位のT4 DNAリガーゼと共に
14〜16時間インキュベートした。
【００５９】ポリリンカー領域内部の制限酵素部位で切
断することによって直線化しておいたプラスミドpUC19
と単離し精製した合成DNA セグメントとを混合した。T4
DNAリガーゼを使用してgag 試験配列をpUC19 のEcoRＩ
-XbaＩフラグメントに結合した。またgag2試験配列を S
maＩ-XbaＩフラグメントに結合した。これらの反応後に
得られた形質転換体に由来のプラスミドDNA を使用して
大腸菌を形質転換し、制限分析によってスクリーニング
し、配列解析によって最終プラスミド(pGAG.TEST及びpG
AG2.TEST) が正しいことを決定した。
断することによって直線化しておいたプラスミドpUC19
と単離し精製した合成DNA セグメントとを混合した。T4
DNAリガーゼを使用してgag 試験配列をpUC19 のEcoRＩ
-XbaＩフラグメントに結合した。またgag2試験配列を S
maＩ-XbaＩフラグメントに結合した。これらの反応後に
得られた形質転換体に由来のプラスミドDNA を使用して
大腸菌を形質転換し、制限分析によってスクリーニング
し、配列解析によって最終プラスミド(pGAG.TEST及びpG
AG2.TEST) が正しいことを決定した。
【００６０】実施例３ RNA 増幅に対するプライマー濃度の影響 gag 試験オリゴヌクレオチドから転写されたRNA を増幅
するために使用された反応混合物（25μl ）は50mMのTr
isHCl(pH8.45) と6mM のMgCl2 と40mMのKCl と10mMのジ
チオスレイトールと0.5mM のNTP(ATP,CTP,GTP,UTP)と1m
M のdNTP(dATP,dCTP,dGTP,dTTP) と20単位のRNasinと10
単位のT7 RNAポリメラーゼと10単位の逆転写酵素と0.4
単位のRNase Ｈと10μCiの［α-32P］UTP とを含有して
いた。２つの反応物は0.5ng(0.015pmoles)のN2.GAGを含
み、一方他の２つの反応物は鋳型を含んでいなかった。
プライマーT7H1.GAG及びH2.GAGの各々を最終濃度3.4 μ
Mまたは0.34μM でN2.GAG含有または鋳型非含有の反応
物に添加した。反応物を42℃で2 時間インキュベートし
た。30分毎にTCA 不溶cpm の取込みを測定することによ
ってRNA 総合成量をモニタした。鋳型依存性RNA 合成に
対するプライマー濃度の影響を表Ｉに示す。等量の合成
RNA を含有する各反応のアリコートをPAGE及びオートラ
ジオグラフィーによって分析した（図３、反応と同じ番
号のレーン１〜４）。
するために使用された反応混合物（25μl ）は50mMのTr
isHCl(pH8.45) と6mM のMgCl2 と40mMのKCl と10mMのジ
チオスレイトールと0.5mM のNTP(ATP,CTP,GTP,UTP)と1m
M のdNTP(dATP,dCTP,dGTP,dTTP) と20単位のRNasinと10
単位のT7 RNAポリメラーゼと10単位の逆転写酵素と0.4
単位のRNase Ｈと10μCiの［α-32P］UTP とを含有して
いた。２つの反応物は0.5ng(0.015pmoles)のN2.GAGを含
み、一方他の２つの反応物は鋳型を含んでいなかった。
プライマーT7H1.GAG及びH2.GAGの各々を最終濃度3.4 μ
Mまたは0.34μM でN2.GAG含有または鋳型非含有の反応
物に添加した。反応物を42℃で2 時間インキュベートし
た。30分毎にTCA 不溶cpm の取込みを測定することによ
ってRNA 総合成量をモニタした。鋳型依存性RNA 合成に
対するプライマー濃度の影響を表Ｉに示す。等量の合成
RNA を含有する各反応のアリコートをPAGE及びオートラ
ジオグラフィーによって分析した（図３、反応と同じ番
号のレーン１〜４）。
【００６１】
【表１】
【００６２】反応１は最大量の同位体取込みを示した
が、対照鋳型である反応２も高い取込み率（反応１の73
％）を示し、極めて類似した電気泳動プロフィルを示し
た。従って、高濃度プライマー存在中の増幅においては
鋳型が全く存在しなくても、予想されたサイズと等しい
サイズのRNA 転写物が産生される。1/10のプライマー濃
度のサンプルを使用して得られた結果は顕著な違いを示
した。反応３で産生されたRNA の量は反応４の2.6 倍で
あるが、反応３においては実質的に全部の転写物が予想
されたサイズの単一バンド中に検出され、反応４におい
ては60〜70b を上回るフラグメントは検出されなかっ
た。従ってプライマー濃度はRNA 増幅の正確度及び効率
に重要な役割を果たす。
が、対照鋳型である反応２も高い取込み率（反応１の73
％）を示し、極めて類似した電気泳動プロフィルを示し
た。従って、高濃度プライマー存在中の増幅においては
鋳型が全く存在しなくても、予想されたサイズと等しい
サイズのRNA 転写物が産生される。1/10のプライマー濃
度のサンプルを使用して得られた結果は顕著な違いを示
した。反応３で産生されたRNA の量は反応４の2.6 倍で
あるが、反応３においては実質的に全部の転写物が予想
されたサイズの単一バンド中に検出され、反応４におい
ては60〜70b を上回るフラグメントは検出されなかっ
た。従ってプライマー濃度はRNA 増幅の正確度及び効率
に重要な役割を果たす。
【００６３】増幅系による産生が予想されるフラグメン
トのサイズを示すために試験プラスミドからの転写によ
って対照RNA 転写物を調製した（図３のレーン０）。pG
AG.TEST を XbaＩで切断して直線化し、プロテイナーゼ
Ｋで処理し（Maniatis等、1982）、フェノール抽出し、
エタノール沈殿した。次にT7 RNAポリメラーゼを製造業
者の使用説明書通りに使用し、0.5 μg の得られたフラ
グメントを10μCi［α-32P］UTP を含有する25μl の反
応混合物中で転写した。
トのサイズを示すために試験プラスミドからの転写によ
って対照RNA 転写物を調製した（図３のレーン０）。pG
AG.TEST を XbaＩで切断して直線化し、プロテイナーゼ
Ｋで処理し（Maniatis等、1982）、フェノール抽出し、
エタノール沈殿した。次にT7 RNAポリメラーゼを製造業
者の使用説明書通りに使用し、0.5 μg の得られたフラ
グメントを10μCi［α-32P］UTP を含有する25μl の反
応混合物中で転写した。
【００６４】実施例４ RNA 増幅に対する鋳型濃度の影響 gag 試験オリゴヌクレオチドから転写されたRNA を増幅
するために使用された50μl の標準反応混合物は、0.34
μM のT7H1.GAGと0.34μM のH2.GAGと50mMのTrisHCl(pH
8.45) と6mM のMgCl2 と40mMのKCl と10mMのDTT と0.5m
M のNTP と1mMのdNTPと40単位のRNasinと20単位のT7 RN
Aポリメラーゼと20単位の逆転写酵素と0.8 単位のRNase
Ｈと10〜20μCi［α-32P］UTP とを含有し、１ngから
１fgの範囲の種々の量の鋳型(N2.GAG)を含有し、１つの
反応は鋳型を含有しない。反応を42℃で3 時間インキュ
ベートし、インキュベーションの開始から30分毎にTCA
不溶cpm の取込みを測定することによってRNA 総合成量
をモニタした。表IIに示すように、RNA 総合成量は鋳型
のすべての被検濃度において鋳型非含有の対照より多
い。RNA 総合成量は鋳型濃度の低下に伴って減少する。
この減少は定量的ではない。出発鋳型当たりのRNA の増
幅度は一般に、鋳型濃度が低いほど大きい。1fg のN2.G
AG鋳型から0.8 μg のRNA が合成されると 8×108 倍の
増幅度が得られたことになる。1fg の102-b N2.GAGオリ
ゴヌクレオチドは約 2×104 分子を示す。
するために使用された50μl の標準反応混合物は、0.34
μM のT7H1.GAGと0.34μM のH2.GAGと50mMのTrisHCl(pH
8.45) と6mM のMgCl2 と40mMのKCl と10mMのDTT と0.5m
M のNTP と1mMのdNTPと40単位のRNasinと20単位のT7 RN
Aポリメラーゼと20単位の逆転写酵素と0.8 単位のRNase
Ｈと10〜20μCi［α-32P］UTP とを含有し、１ngから
１fgの範囲の種々の量の鋳型(N2.GAG)を含有し、１つの
反応は鋳型を含有しない。反応を42℃で3 時間インキュ
ベートし、インキュベーションの開始から30分毎にTCA
不溶cpm の取込みを測定することによってRNA 総合成量
をモニタした。表IIに示すように、RNA 総合成量は鋳型
のすべての被検濃度において鋳型非含有の対照より多
い。RNA 総合成量は鋳型濃度の低下に伴って減少する。
この減少は定量的ではない。出発鋳型当たりのRNA の増
幅度は一般に、鋳型濃度が低いほど大きい。1fg のN2.G
AG鋳型から0.8 μg のRNA が合成されると 8×108 倍の
増幅度が得られたことになる。1fg の102-b N2.GAGオリ
ゴヌクレオチドは約 2×104 分子を示す。
【００６５】
【表２】
【００６６】反応3 時間後に合成されたRNA を各鋳型濃
度毎にPAGEで分析した（図４、反応と同じ番号のレーン
１〜８）。約100bのRNA を示す主要バンドが鋳型1fg 含
有及び鋳型非含有の反応を除く全ての反応に存在してい
た。1fg の鋳型を含有する反応では3 時間後に100bの産
生物を多量に含んでいなかったが、RNA 総合成量は鋳型
非含有反応より多く定性的な違いを示した。
度毎にPAGEで分析した（図４、反応と同じ番号のレーン
１〜８）。約100bのRNA を示す主要バンドが鋳型1fg 含
有及び鋳型非含有の反応を除く全ての反応に存在してい
た。1fg の鋳型を含有する反応では3 時間後に100bの産
生物を多量に含んでいなかったが、RNA 総合成量は鋳型
非含有反応より多く定性的な違いを示した。
【００６７】実施例５ RNA 産物のハイブリダイゼーション分析 実施例４の手順の放射性標識UTP だけを削除して 1pg〜
0.1fg の範囲の種々の量のN2.GAG鋳型を含有する増幅反
応を行なった。反応を42℃で3 時間インキュベートし
た。30分毎に各反応からアリコートを採取しナイロン膜
（Amersham）に塗布した。これらの反応アリコートに含
まれていた核酸を紫外線照射によって固定した。最終濃
度50％v/v のホルムアミドと 5×SSC と 5×Denhardt溶
液（Mania-tis 等、1982;Southern 等、1975）とから成
り 100cm2 当たり5 mlに等しい量のプレハイブリダイゼ
ーション緩衝液中で膜を50℃で1 時間プレハイブリダイ
ズし、さらに比活性106 cpm/mlの放射性標識プローブの
ハイブリダイゼーション溶液を用いてハイブリダイズし
た。50％のホルムアミド、 5×SSC 及び 5×Denhardt溶
液（Maniatis等、1982;Southern 等、1975）中でハイブ
リダイゼーションを50℃で16時間行なった。放射性標識
プローブは、T4ポリヌクレオチドキナーゼと（α−32P
）ATP とを用いて5'末端を標識した合成オリゴヌクレ
オチド5'GATCTGGGATAGAGTACATCCA 3' であった。次に、
2×SSC と 0.1％v/v SDS 及び 0.2×SSCと 0.1％v/v S
DS から成る洗浄液を用い（Southern等、1975;Maniatis
等、1982;Szostak等、1979）、50℃で最低 2、3 回以
上は連続して膜を洗浄した。
0.1fg の範囲の種々の量のN2.GAG鋳型を含有する増幅反
応を行なった。反応を42℃で3 時間インキュベートし
た。30分毎に各反応からアリコートを採取しナイロン膜
（Amersham）に塗布した。これらの反応アリコートに含
まれていた核酸を紫外線照射によって固定した。最終濃
度50％v/v のホルムアミドと 5×SSC と 5×Denhardt溶
液（Mania-tis 等、1982;Southern 等、1975）とから成
り 100cm2 当たり5 mlに等しい量のプレハイブリダイゼ
ーション緩衝液中で膜を50℃で1 時間プレハイブリダイ
ズし、さらに比活性106 cpm/mlの放射性標識プローブの
ハイブリダイゼーション溶液を用いてハイブリダイズし
た。50％のホルムアミド、 5×SSC 及び 5×Denhardt溶
液（Maniatis等、1982;Southern 等、1975）中でハイブ
リダイゼーションを50℃で16時間行なった。放射性標識
プローブは、T4ポリヌクレオチドキナーゼと（α−32P
）ATP とを用いて5'末端を標識した合成オリゴヌクレ
オチド5'GATCTGGGATAGAGTACATCCA 3' であった。次に、
2×SSC と 0.1％v/v SDS 及び 0.2×SSCと 0.1％v/v S
DS から成る洗浄液を用い（Southern等、1975;Maniatis
等、1982;Szostak等、1979）、50℃で最低 2、3 回以
上は連続して膜を洗浄した。
【００６８】図５は異なるインキュベーション時間で採
取された種々の量のN2.GAG鋳型を含有する増幅反応で行
ったハイブリダイゼーション分析の結果を示す。
取された種々の量のN2.GAG鋳型を含有する増幅反応で行
ったハイブリダイゼーション分析の結果を示す。
【００６９】図５の縦の列の各々は異なる時点を示し
（1 は30分、2 は60分、3 は90分、4は 120分、5 は 15
0分、6 は 180分）、横の行の各々はN2.GAG鋳型の種々
の添加量を示す（1 は1pg 、2 は100fg 、3 は10fg、4
は1fg 、5 は0.1fg 、6 は鋳型非添加）。行１〜３(1pg
〜10fg) においては標識プローブにハイブリダイズした
核酸の増幅が観察されたが、行４及び５（1fg 及び 0.1
fg）においては特定核酸に対するハイブリダイゼーショ
ンは行６（鋳型非含有）より盛んではなかった。行６の
標識プローブの見掛けの非特異的結合はDNA またはRNA
合成と関連すると推定される。その理由はハイブリダイ
ゼーションシグナルが経時的に増加するからである。
（1 は30分、2 は60分、3 は90分、4は 120分、5 は 15
0分、6 は 180分）、横の行の各々はN2.GAG鋳型の種々
の添加量を示す（1 は1pg 、2 は100fg 、3 は10fg、4
は1fg 、5 は0.1fg 、6 は鋳型非添加）。行１〜３(1pg
〜10fg) においては標識プローブにハイブリダイズした
核酸の増幅が観察されたが、行４及び５（1fg 及び 0.1
fg）においては特定核酸に対するハイブリダイゼーショ
ンは行６（鋳型非含有）より盛んではなかった。行６の
標識プローブの見掛けの非特異的結合はDNA またはRNA
合成と関連すると推定される。その理由はハイブリダイ
ゼーションシグナルが経時的に増加するからである。
【００７０】実施例６ 鋳型としてのDNA 制限フラグメントの使用 プラスミドpGAG2.TESTをMsp Ｉで切断し、プロテイナー
ゼＫで処理し、フェノール抽出及びエタノール沈殿によ
って精製し、5 分間沸騰させて変性した。N2.GAGオリゴ
ヌクレオチドの代わりにMsp Ｉ分解したpGAG2.TESTを鋳
型として使用する以外は実施例４と同じ手順で増幅反応
を行い分析した。各反応に対するプラスミドの添加量は
55ng〜5.5pg の範囲であり、１つの反応には鋳型を添加
しなかった。実際のサンプル中に存在するはずの付加的
DNA をシミュレートするために、同様に切断し精製し変
性した1ng の仔ウシ胸腺DNA を含む別の反応も用意し
た。42℃で3 時間インキュベーション後にTCA 沈殿及び
PAGE分析によってRNA 合成を測定した。表III に示すよ
うに、鋳型のすべての試験濃度でRNA 総合成量は鋳型非
含有対照よりも多かった。実際の鋳型からのRNA 合成が
総プラスミドDNA の1.8 ％に相当することに基づいて増
幅度を計算した。
ゼＫで処理し、フェノール抽出及びエタノール沈殿によ
って精製し、5 分間沸騰させて変性した。N2.GAGオリゴ
ヌクレオチドの代わりにMsp Ｉ分解したpGAG2.TESTを鋳
型として使用する以外は実施例４と同じ手順で増幅反応
を行い分析した。各反応に対するプラスミドの添加量は
55ng〜5.5pg の範囲であり、１つの反応には鋳型を添加
しなかった。実際のサンプル中に存在するはずの付加的
DNA をシミュレートするために、同様に切断し精製し変
性した1ng の仔ウシ胸腺DNA を含む別の反応も用意し
た。42℃で3 時間インキュベーション後にTCA 沈殿及び
PAGE分析によってRNA 合成を測定した。表III に示すよ
うに、鋳型のすべての試験濃度でRNA 総合成量は鋳型非
含有対照よりも多かった。実際の鋳型からのRNA 合成が
総プラスミドDNA の1.8 ％に相当することに基づいて増
幅度を計算した。
【００７１】特定の初期鋳型濃度レベルからのRNA 総合
成量（増幅度）は、合成オリゴヌクレオチド鋳型（表I
I）に比較して制限フラグメント（表III ）が常に低い
値を示した。この理由は、使用条件下において制限フラ
グメントの相補鎖との競合が生じるためであろう。
成量（増幅度）は、合成オリゴヌクレオチド鋳型（表I
I）に比較して制限フラグメント（表III ）が常に低い
値を示した。この理由は、使用条件下において制限フラ
グメントの相補鎖との競合が生じるためであろう。
【００７２】
【表３】
【００７３】3 時間反応後に合成されたRNA をPAGEで分
析した（図６、反応と同じ番号のレーン１〜６、11及び
12）。反応（レーン）１〜６には約100bのRNA を示す主
要バンドが存在していたが鋳型非含有反応（レーン11及
び12）には該バンドが存在していなかった。レーン０の
RNA は実施例３の手順で調製した標準RNA である。1μg
のMsp Ｉ- 分解仔ウシ胸腺DNA を添加した合成 RNA
（レーン２、４及び６）または非添加合成 RNA（レーン
１、３及び５）との間に見掛けの定性的差異はなかっ
た。
析した（図６、反応と同じ番号のレーン１〜６、11及び
12）。反応（レーン）１〜６には約100bのRNA を示す主
要バンドが存在していたが鋳型非含有反応（レーン11及
び12）には該バンドが存在していなかった。レーン０の
RNA は実施例３の手順で調製した標準RNA である。1μg
のMsp Ｉ- 分解仔ウシ胸腺DNA を添加した合成 RNA
（レーン２、４及び６）または非添加合成 RNA（レーン
１、３及び５）との間に見掛けの定性的差異はなかっ
た。
【００７４】実施例７ 鋳型としてのRNA フラグメントの使用 プラスミドpGAG.TEST をXba Ｉで切断し、プロテイナー
ゼＫで処理し、フェノール抽出及びエタノール沈殿によ
って精製した。T7 RNAポリメラーゼを用いて直線化した
pGAG.TEST プラスミドからN2.GAGに相補的な配列のRNA
を転写した。得られたRNA をDNase(Pro Mega BioTec)で
分解し、フェノール抽出及びエタノール沈殿によって精
製した。実施例５の手順に従って精製RNA を増幅反応の
鋳型として使用した。夫々の反応には55ng〜5.5pg の範
囲の種々の量のRNA を添加しまた１つの反応には鋳型を
添加しなかった。42℃で3 時間インキュベーション後、
実施例５の手順に従って標識オリゴヌクレオチドプロー
ブに対するハイブリダイゼーションによって特定RNA の
合成を判定した。
ゼＫで処理し、フェノール抽出及びエタノール沈殿によ
って精製した。T7 RNAポリメラーゼを用いて直線化した
pGAG.TEST プラスミドからN2.GAGに相補的な配列のRNA
を転写した。得られたRNA をDNase(Pro Mega BioTec)で
分解し、フェノール抽出及びエタノール沈殿によって精
製した。実施例５の手順に従って精製RNA を増幅反応の
鋳型として使用した。夫々の反応には55ng〜5.5pg の範
囲の種々の量のRNA を添加しまた１つの反応には鋳型を
添加しなかった。42℃で3 時間インキュベーション後、
実施例５の手順に従って標識オリゴヌクレオチドプロー
ブに対するハイブリダイゼーションによって特定RNA の
合成を判定した。
【００７５】実施例８ 鋳型としてのリボソームRNA の使用 内部配列の増幅 大腸菌16S リボソームRNA(rRNA) の一部に相補的なRNA
配列を増幅するために２つのプライマーを使用した。一
方のプライマーT7H1RIB3.PR2(AATTCTAATACGACTCACTATAG
GGAGTATTACCGCGGCTGCTG)は、T7プロモーターのアンチセ
ンス鎖と開始部位と16S rRNAに相補的な配列とを含む。
他方のプライマーRIB8.PR(AATACCTTTGCTCATTGACG) はプ
ライマーとしてT7H1RIB3.PR2を使用し鋳型として16S rR
NAを使用して合成されたDNA に相補的である。増幅の検
出に使用できる第３の合成オリゴヌクレオチドRIB5.PR
(AGAAGCACCGGCTAAC) は増幅反応のRNA 産物に相補的で
ある。該RNA 産物は出発rRNA鋳型に相補的である。
配列を増幅するために２つのプライマーを使用した。一
方のプライマーT7H1RIB3.PR2(AATTCTAATACGACTCACTATAG
GGAGTATTACCGCGGCTGCTG)は、T7プロモーターのアンチセ
ンス鎖と開始部位と16S rRNAに相補的な配列とを含む。
他方のプライマーRIB8.PR(AATACCTTTGCTCATTGACG) はプ
ライマーとしてT7H1RIB3.PR2を使用し鋳型として16S rR
NAを使用して合成されたDNA に相補的である。増幅の検
出に使用できる第３の合成オリゴヌクレオチドRIB5.PR
(AGAAGCACCGGCTAAC) は増幅反応のRNA 産物に相補的で
ある。該RNA 産物は出発rRNA鋳型に相補的である。
【００７６】反応混合物（25ml）は、50mMのTrisHCl(pH
8.45) と6mM のMgCl2 と40mMのKClと10mMのDTT と0.5mM
のNTP と1mM のdNTPと20単位のRNasinと10単位のT7RNA
ポリメラーゼと10単位のAMV 逆転写酵素と0.4 単位のR
Nase Ｈと0.34μM のT7H1RIB3.PR2と0.34μM のRIB8.PR
とを含有する。
8.45) と6mM のMgCl2 と40mMのKClと10mMのDTT と0.5mM
のNTP と1mM のdNTPと20単位のRNasinと10単位のT7RNA
ポリメラーゼと10単位のAMV 逆転写酵素と0.4 単位のR
Nase Ｈと0.34μM のT7H1RIB3.PR2と0.34μM のRIB8.PR
とを含有する。
【００７７】50ng〜50fgの範囲の種々の量の大腸菌rRNA
を反応物に添加する。１つの反応にはrRNAを添加しな
い。反応物を42℃で3 時間インキュベートし、インキュ
ベーション開始の30分、60分、120 分及び180 分後にア
リコートを採取する。アリコートの反応を制止し、ナイ
ロン膜に固定し、実施例５の手順で32Ｐで5'末端を標識
したRIB5.PR プローブにハイブリダイズする。
を反応物に添加する。１つの反応にはrRNAを添加しな
い。反応物を42℃で3 時間インキュベートし、インキュ
ベーション開始の30分、60分、120 分及び180 分後にア
リコートを採取する。アリコートの反応を制止し、ナイ
ロン膜に固定し、実施例５の手順で32Ｐで5'末端を標識
したRIB5.PR プローブにハイブリダイズする。
【００７８】実施例９ 鋳型としてのリボソームRNA の使用 5'- 末端配列の増幅 ２つのプライマーを使用して大腸菌16S rRNAの一部に相
同のRNA 配列を増幅する。一方のプライマーRIB12.PR(T
TACTCACCCGTCCGCC) は16S rRNAに相補的である。他方の
プライマーT7H1RIB5.PR(AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGA
AATTGAAGAGTTTGATCAT)は、プライマーとしてRIB12.PRを
使用し鋳型として16S rRNAを使用して合成されたDNA の
3'末端に相補的である。増幅の検出に使用できる第３の
合成オリゴヌクレオチドRIB11.PR(GTTCGACTTGCATGTGTTA
GGCCTGCCGCCAGCGTTCAATCTGAGCC)は増幅RNA 産物及び出
発rRNA鋳型の双方に相補的である。
同のRNA 配列を増幅する。一方のプライマーRIB12.PR(T
TACTCACCCGTCCGCC) は16S rRNAに相補的である。他方の
プライマーT7H1RIB5.PR(AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGA
AATTGAAGAGTTTGATCAT)は、プライマーとしてRIB12.PRを
使用し鋳型として16S rRNAを使用して合成されたDNA の
3'末端に相補的である。増幅の検出に使用できる第３の
合成オリゴヌクレオチドRIB11.PR(GTTCGACTTGCATGTGTTA
GGCCTGCCGCCAGCGTTCAATCTGAGCC)は増幅RNA 産物及び出
発rRNA鋳型の双方に相補的である。
【００７９】(T7H1RIB3.PR2 及びRIB8.PR の代わりに)T
7H1RIB5.PR及びRIB12.PRをプライマーとして使用し、(R
IB5.PRの代わりに)RIB11.PR をオリゴヌクレオチドプロ
ーブとして使用する以外は実施例８と同様にしてrRNAの
増幅反応と合成RNA の検出とを行なう。
7H1RIB5.PR及びRIB12.PRをプライマーとして使用し、(R
IB5.PRの代わりに)RIB11.PR をオリゴヌクレオチドプロ
ーブとして使用する以外は実施例８と同様にしてrRNAの
増幅反応と合成RNA の検出とを行なう。
【００８０】上記では本発明を好適実施態様に基づいて
詳細に説明したが、本発明の要旨及び特許請求の範囲に
包含される多様な変更が可能であることは当業者に明ら
かであろう。
詳細に説明したが、本発明の要旨及び特許請求の範囲に
包含される多様な変更が可能であることは当業者に明ら
かであろう。
【００８１】以下に本明細書中で引用した参考文献を記
す。
す。
【００８２】
【表４】
【図１】核酸増幅方法の全体図である。
【図２】増幅方法の試験に使用される合成オリゴヌクレ
オチドDNA 配列を示し、図のＡはgag 試験配列、図のＢ
はgag2試験配列を示す。
オチドDNA 配列を示し、図のＡはgag 試験配列、図のＢ
はgag2試験配列を示す。
【図３】種々のプライマー濃度を使用した増幅反応のPA
GE分析のオートラジオグラムのＸ線写真を示す。
GE分析のオートラジオグラムのＸ線写真を示す。
【図４】種々の鋳型濃度を使用した増幅反応のPAGE分析
のオートラジオグラムのＸ線写真を示す。
のオートラジオグラムのＸ線写真を示す。
【図５】増幅反応に対するドット- ブロットハイブリダ
イゼーションのオートラジオグラムのＸ線写真を示す。
イゼーションのオートラジオグラムのＸ線写真を示す。
【図６】制限フラグメントを鋳型として使用した増幅反
応のPAGE分析のオートラジオグラムのＸ線写真を示す。
応のPAGE分析のオートラジオグラムのＸ線写真を示す。
Claims (42)
- 【請求項１】 一重鎖RNA と一重鎖DNA と二重鎖DNA と
を合成することを包含し、ここで前記一重鎖RNA が第１
プライマー用第１鋳型、前記一重鎖DNA が第２プライマ
ー用第２鋳型、前記二重鎖DNA が第１鋳型の複数コピー
合成用第３鋳型として機能し、第１または第２のプライ
マーの配列が特定核酸配列の配列に十分に相補的であ
り、第１または第２のプライマーの配列が特定核酸配列
の配列に十分に相同であり、かつ第１プライマーの3'末
端が相補鎖上の第２プライマーの3'末端に向かって方向
付けされることを特徴とする特定核酸配列の増幅方法。 - 【請求項２】 第１プライマーが第１鋳型に選択的にハ
イブリダイズし、第１プライマーに共有結合し且つ第１
鋳型に相補的なDNA の合成を促進し、RNA ポリメラーゼ
用のプロモーターのアンチセンス配列及び転写開始部位
のアンチセンス配列をもつ第２プライマーが第２鋳型に
選択的にハイブリダイズし、第２プライマーに共有結合
し第２鋳型に相補的なDNA を合成し得ることを特徴とす
る請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 a)第１鋳型のRNA 配列に十分に相補的な
配列をもつ第１プライマーDNA を第１鋳型にハイブリダ
イズし、(b) 第１プライマーに共有結合し第１鋳型のRN
A 配列に相補的な第１DNA 配列を合成し、該第１DNA 配
列と第１プライマーとが第２鋳型を構成し、(c) 第２プ
ライマーをハイブリダイズせしむべく第２鋳型から第１
鋳型を分離し、(d) 第２鋳型のDNA 配列に十分に相補的
な配列をもち且つRNA ポリメラーゼ用のプロモーターの
アンチセンス配列と転写開始部位のアンチセンス配列と
をもつ第２プライマーDNA を第２鋳型にハイブリダイズ
し、(e) 第２プライマーに共有結合し第２鋳型のDNA 配
列に相補的な第２DNA 配列を合成し、第２鋳型に共有結
合し第２プライマーのDNA 配列に相補的な第３DNA 配列
を合成し、第２及び第３のDNA 配列、第２プライマー及
び第２鋳型が第３鋳型を構成し、(f) 第３鋳型から第１
鋳型のRNA 配列の複数コピーを合成し、ここにおいて、
第１または第２のプライマーの配列が特定核酸配列の配
列に十分に相補的であり、第１または第２のプライマー
の配列が特定核酸配列の配列に十分に相同であり、かつ
第１プライマーの3'末端が相補鎖上の第２プライマーの
3'末端に向かって方向付けされることを特徴とする特定
核酸配列の増幅方法。 - 【請求項４】 第２プライマーが、3'末端に第２鋳型の
DNA 配列に十分に相補的な配列をもちかつ5'末端にRNA
ポリメラーゼ用のプロモーターのアンチセンスDNA 配列
と転写開始部位のアンチセンス配列とをもつことを特徴
とする請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 第２鋳型に共有結合した第３DNA 配列が
第２プライマーの5'末端のDNA 配列に相補的であること
を特徴とする請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】 第１DNA 配列がRNA 依存性DNA ポリメラ
ーゼによって合成されることを特徴とする請求項３に記
載の方法。 - 【請求項７】 第１鋳型がRNA-DNA のハイブリッドに特
異的なリボヌクレアーゼによって第２鋳型から分離され
ることを特徴とする請求項３に記載の方法。 - 【請求項８】 リボヌクレアーゼが大腸菌リボヌクレア
ーゼＨであることを特徴とする請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 リボヌクレアーゼが仔ウシ胸腺リボヌク
レアーゼＨであることを特徴とする請求項７に記載の方
法。 - 【請求項１０】 第２及び第３のDNA 配列がDNA 依存性
DNA ポリメラーゼによって合成されることを特徴とする
請求項３に記載の方法。 - 【請求項１１】 第１鋳型がDNA 依存性RNA ポリメラー
ゼによって第３鋳型から合成されることを特徴とする請
求項３に記載の方法。 - 【請求項１２】 第１プライマーがプロモーターのアン
チセンス配列と転写開始部位のアンチセンス配列とをも
つことを特徴とする請求項３に記載の方法。 - 【請求項１３】 第１プライマーが支持体にハイブリダ
イズする配列をもつことを特徴とする請求項３に記載の
方法。 - 【請求項１４】 第２プライマーが3'末端から5'末端に
向かって十分に相補的な配列と転写開始部位のアンチセ
ンス配列とプロモーターのアンチセンス配列とを含むこ
とを特徴とする請求項３に記載の方法。 - 【請求項１５】 転写開始部位のアンチセンス配列及び
アンチセンスプロモーター配列がバクテリオファージRN
A ポリメラーゼと結合することを特徴とする請求項１４
に記載の方法。 - 【請求項１６】 転写開始部位のアンチセンス配列及び
アンチセンスプロモーター配列がT7 RNAポリメラーゼと
結合することを特徴とする請求項１４に記載の方法。 - 【請求項１７】 転写開始部位のアンチセンス配列及び
プロモーターのアンチセンス配列が AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAG であることを特徴とする請求項１４に記載の方法。 - 【請求項１８】 DNA 依存性RNA ポリメラーゼがT7 RNA
ポリメラーゼであることを特徴とする請求項１１に記載
の方法。 - 【請求項１９】 DNA 依存性RNA ポリメラーゼがバクテ
リオファージRNA ポリメラーゼであることを特徴とする
請求項１１に記載の方法。 - 【請求項２０】 DNA 依存性RNA ポリメラーゼがファー
ジT3ポリメラーゼであることを特徴とする請求項１１に
記載の方法。 - 【請求項２１】 DNA 依存性RNA ポリメラーゼがファー
ジφIIポリメラーゼであることを特徴とする請求項１１
に記載の方法。 - 【請求項２２】 DNA 依存性RNA ポリメラーゼがサルモ
ネラファージsp6 ポリメラーゼであることを特徴とする
請求項１１に記載の方法。 - 【請求項２３】 DNA 依存性RNA ポリメラーゼがPseudo
monas ファージgh-1ポリメラーゼであることを特徴とす
る請求項１１に記載の方法。 - 【請求項２４】 RNA 依存性DNA ポリメラーゼがレトロ
ウイルスポリメラーゼであることを特徴とする請求項６
に記載の方法。 - 【請求項２５】 レトロウイルスポリメラーゼがトリ筋
芽細胞腫ウイルスポリメラーゼであることを特徴とする
請求項２４に記載の方法。 - 【請求項２６】 レトロウイルスポリメラーゼがモロニ
ー(Maloney) マウス白血病ウイルスポリメラーゼである
ことを特徴とする請求項２４に記載の方法。 - 【請求項２７】 ポリメラーゼがエキソヌクレアーゼ活
性またはエンドヌクレアーゼ活性をもたないことを特徴
とする請求項６、１０または１１に記載の方法。 - 【請求項２８】 DNA 依存性DNA ポリメラーゼがトリ筋
芽細胞腫ウイルスポリメラーゼであることを特徴とする
請求項１０に記載の方法。 - 【請求項２９】 第１プライマーと第２プライマーとリ
ボヌクレアーゼＨとRNA 依存性DNA ポリメラーゼとDNA
依存性DNA ポリメラーゼとRNA ポリメラーゼとリボヌク
レオシド三リン酸とデオキシリボヌクレオシド三リン酸
とをサンプルと混合し、ここにおいて第１プライマーDN
A が第１鋳型RNA に十分に相補的な配列をもち、第２プ
ライマーDNA がRNA ポリメラーゼによって基質として認
識される第２鋳型DNA に十分に相補的な配列とプロモー
タのアンチセンス配列と転写開始部位のアンチセンス配
列とを含み、第１または第２のプライマーの配列が特定
核酸配列の配列に十分に相補的であり、第１または第２
のプライマーの配列が特定核酸配列の配列に十分に相同
であり、かつ第１プライマーの3'末端が相補鎖上の第２
プライマーの3'末端に向かって方向付けされていること
を特徴とする特定核酸配列の増幅方法。 - 【請求項３０】 第１プライマーと第２プライマーとト
リ筋芽細胞腫ウイルスポリメラーゼと大腸菌リボヌクレ
アーゼＨとバクテリオファージT7 RNAポリメラーゼとリ
ボヌクレオシド三リン酸とデオキシリボヌクレオシド三
リン酸とをサンプルと混合し、ここにおいて第１プライ
マーが第１鋳型RNA に十分に相補的な配列をもち、第２
プライマーがT7 RNAポリメラーゼによって基質として認
識される第２鋳型DNA に十分に相補的な配列とプロモー
ターのアンチセンス配列と転写開始部位のアンチセンス
配列とを含み、第１または第２のプライマーの配列が特
定核酸配列の配列に十分に相補的であり、第１または第
２のプライマーの配列が特定核酸配列の配列に十分に相
同であり、かつ第１プライマーの3'末端が相補鎖上の第
２プライマーの3'末端に向かって方向付けされているこ
とを特徴とする特定核酸配列の増幅方法。 - 【請求項３１】 更に、核酸配列を含有すると予想され
る第１サンプルの増幅量と核酸配列が存在しない第２サ
ンプルの増幅量とを比較することによって特定核酸配列
の存在を検出することを特徴とする請求項１または３に
記載の方法。 - 【請求項３２】 更に、核酸配列を含有すると予想され
る第１サンプルの増幅量と核酸配列が存在しない第２サ
ンプルの増幅量とを比較することによって特定核酸配列
の存在を検出することを特徴とする請求項２９または３
０に記載の方法。 - 【請求項３３】 更に、特定核酸配列または特定核酸配
列の産生物にハイブリダイズするプローブを用いて特定
核酸配列の存在を検出することを特徴とする請求項１ま
たは３に記載の方法。 - 【請求項３４】 更に、制限エンドヌクレアーゼ及び電
気泳動分離を用いて特定核酸配列の存在を検出すること
を特徴とする請求項１または３に記載の方法。 - 【請求項３５】 更に、制限エンドヌクレアーゼ及び電
気泳動分離を用いて特定核酸配列の存在を検出すること
を特徴とする請求項３１または３２に記載の方法。 - 【請求項３６】 更に、特定核酸配列または特定核酸配
列の産生物にハイブリダイズするプローブを用いて特定
核酸配列の存在を検出することを特徴とする請求項３１
または３２に記載の方法。 - 【請求項３７】 請求項１記載の方法によって増幅され
た特定核酸配列。 - 【請求項３８】 請求項３記載の方法によって増幅され
た特定核酸配列。 - 【請求項３９】 請求項２９記載の方法によって増幅さ
れた特定核酸配列。 - 【請求項４０】 請求項３０記載の方法によって増幅さ
れた特定核酸配列。 - 【請求項４１】 (a) 第１鋳型のRNA 配列に十分に相補
的なDNA 配列をもつ第１プライマーと、(b) 第２鋳型の
DNA 配列に十分に相補的なDNA 配列をもつ第２プライマ
ーと、(c) リボヌクレアーゼＨと、(d)RNA依存性DNA ポ
リメラーゼと、(e)DNA依存性RNA ポリメラーゼと、(f)D
NA依存性DNA ポリメラーゼと、(g) リボヌクレオシド三
リン酸と、(h) デオキシリボヌクレオシド三リン酸とを
含み、第１または第２のプライマーの配列が特定核酸配
列の配列に十分に相補的であり、第１または第２のプラ
イマーの配列が特定核酸配列の配列に十分に相同であ
り、かつ第１プライマーの3'末端が相補鎖上の第２プラ
イマーの3'末端に向かって方向付けされることを特徴と
する特定核酸配列増幅用キット。 - 【請求項４２】 (a) 第１鋳型のRNA 配列に十分に相補
的なDNA 配列をもつ第１プライマーと、(b) 第２鋳型の
DNA 配列に十分に相補的なDNA 配列をもつ第２プライマ
ーと、(c) バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼと、
(d) 大腸菌リボヌクレアーゼＨと、(e) トリ筋芽細胞腫
ウイルスポリメラーゼと、(f) リボヌクレオシド三リン
酸と、(g) デオキシリボヌクレオシド三リン酸とを含
み、第１または第２のプライマーの配列が特定核酸配列
の配列に十分に相補的であり、第１または第２のプライ
マーの配列が特定核酸配列の配列に十分に相同であり、
かつ第１プライマーの3'末端が相補鎖上の第２プライマ
ーの3'末端に向かって方向付けされることを特徴とする
特定核酸配列増幅用キット。
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