JPH025864A - 核酸増幅方法 - Google Patents
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
１１へ１４
本発明は、特定核酸配列の増幅方法に係る。
ｌ朋１弓Ｌ１
標本中に存在する特定の核酸配列を検出するために核酸
の相補的配列で標本をプローブすることは公知の診断方
法で使用されている。核酸と相補的核酸との結合は高度
に特異的であり、従って標本中に特定の核酸が存在する
か否かを有効に判定し得る。このためには、検出すべき
特定核酸配列が既知であり該特定核酸配列に相補的な核
酸配列をもつプローブを構築することが必要である。
の相補的配列で標本をプローブすることは公知の診断方
法で使用されている。核酸と相補的核酸との結合は高度
に特異的であり、従って標本中に特定の核酸が存在する
か否かを有効に判定し得る。このためには、検出すべき
特定核酸配列が既知であり該特定核酸配列に相補的な核
酸配列をもつプローブを構築することが必要である。
本願において、「特定核酸配列」なる用語は、増幅させ
るべき一重鎖または二重鎖の核酸を意味する。「標本」
なる用語は、複数の核酸を含有する混合物を意味する。
るべき一重鎖または二重鎖の核酸を意味する。「標本」
なる用語は、複数の核酸を含有する混合物を意味する。
「十分に相補的な」なる用語は、２つの核酸即ちプライ
マーと鋳型とが特異的に相互作用でき所与のイオン強度
条件及び温度条件下にプライマー依存性で鋳型依存性の
ＤＮＡ合成を有効に行なうことを意味する。
マーと鋳型とが特異的に相互作用でき所与のイオン強度
条件及び温度条件下にプライマー依存性で鋳型依存性の
ＤＮＡ合成を有効に行なうことを意味する。
核酸プローブは高度に特異的であるため、いくっかの場
合には、核酸配列によって産生される。タンパク質より
もむしろ核酸配列自体をプローブするほうが好ましい。
合には、核酸配列によって産生される。タンパク質より
もむしろ核酸配列自体をプローブするほうが好ましい。
例えば、タンパク質検出だけに基づく診断方法では、Ｂ
型肝炎ウィルスの感染性粒子の存在に関して信頼できる
判断を下すことができない。その理由は、ＤＮ八へノム
の欠失した非感染性抗原粒子が有意レベルで存在するか
らである。別の例では、前癌性または良性の子宮頚部腫
瘍中に検出されるヒト乳頭腫ウィルスの種々のサブタイ
プは核酸プローブハイブリダイゼーションを使用したど
きにのみ識別できる。またエイズの微生物学的研究から
も、エイズ特異的核酸配列の存在に基づくアッセイが最
良の診断方法であることが確認された。
型肝炎ウィルスの感染性粒子の存在に関して信頼できる
判断を下すことができない。その理由は、ＤＮ八へノム
の欠失した非感染性抗原粒子が有意レベルで存在するか
らである。別の例では、前癌性または良性の子宮頚部腫
瘍中に検出されるヒト乳頭腫ウィルスの種々のサブタイ
プは核酸プローブハイブリダイゼーションを使用したど
きにのみ識別できる。またエイズの微生物学的研究から
も、エイズ特異的核酸配列の存在に基づくアッセイが最
良の診断方法であることが確認された。
既存の核酸プローブ技術の使用に伴う最大の困難及び既
存のプローブ技術の実用性に限界がある理由は、コピー
数の問題にある０例えば、１つのウィルスまたは細胞中
に通常は特定遺伝子の単一コピー（ｓｉｎｇｌｅ ｃｏ
ｐｙ）が存在する。この１つのコピーがＲＮＡまたはタ
ンパク質のごとき遺伝子産生物のコピーを多数生成し得
る。このため、検出すべき核酸の特定配列がタンパク質
の数千ものコピーを生じ得るので、診断方法においては
タンパク質をプローブする技術がしばしば使用されてき
た。
存のプローブ技術の実用性に限界がある理由は、コピー
数の問題にある０例えば、１つのウィルスまたは細胞中
に通常は特定遺伝子の単一コピー（ｓｉｎｇｌｅ ｃｏ
ｐｙ）が存在する。この１つのコピーがＲＮＡまたはタ
ンパク質のごとき遺伝子産生物のコピーを多数生成し得
る。このため、検出すべき核酸の特定配列がタンパク質
の数千ものコピーを生じ得るので、診断方法においては
タンパク質をプローブする技術がしばしば使用されてき
た。
レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）及びマイコプラズ
マ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）のごときある種の細菌性病
原体の診断を核酸プローブを用いて容易に行なうために
、細泡化たり１００．０００コピーにのぼる多数の天然
リポソームＲＮＡが遺伝子プローブ（ＧｅｎＰｒｏｂｅ
）法によって使用されてきた。しかしながら、この戦略
は、ウィルスのごとき非細胞性病原体には使用できない
、核酸プローブを用いたエイズウィルス検出方法の開発
ではコピー数が特に問題になる。何故ならこの場合、組
み込まれたプロウィルスは１０，０００個の末梢血リン
パ球のうち１個未満のリンパ球中に存在し得るからであ
る。従って、標本中に存在すると予想される特定核酸配
列を増幅できれば、コピー数の問題が解決されプローブ
アッセイをより容易に使用できる。
マ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）のごときある種の細菌性病
原体の診断を核酸プローブを用いて容易に行なうために
、細泡化たり１００．０００コピーにのぼる多数の天然
リポソームＲＮＡが遺伝子プローブ（ＧｅｎＰｒｏｂｅ
）法によって使用されてきた。しかしながら、この戦略
は、ウィルスのごとき非細胞性病原体には使用できない
、核酸プローブを用いたエイズウィルス検出方法の開発
ではコピー数が特に問題になる。何故ならこの場合、組
み込まれたプロウィルスは１０，０００個の末梢血リン
パ球のうち１個未満のリンパ球中に存在し得るからであ
る。従って、標本中に存在すると予想される特定核酸配
列を増幅できれば、コピー数の問題が解決されプローブ
アッセイをより容易に使用できる。
少数の細胞しか含まず従って特定遺伝子の少数コピーし
か含まない正常生物標本においては、コピー数の問題を
解決するために増幅方法を利用する必要がある。
か含まない正常生物標本においては、コピー数の問題を
解決するために増幅方法を利用する必要がある。
１つの増幅方法は、標本の「十分な増殖」を行なうこと
、即ち、標本中に存在する生きた生物物質が自然に複製
できるように条件を整えることである。核酸配列の量を
複製によって検出可能レベルまで増加させる０例えば食
品産業では、加工食品の有毒細菌Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａ
を検査するために、食品原本を何日間もインキュベート
して核酸量を増加させる必要がある。臨床標本では、病
原体の数を増加させるために標本をかなりの期間にわた
って増殖させる必要がある。
、即ち、標本中に存在する生きた生物物質が自然に複製
できるように条件を整えることである。核酸配列の量を
複製によって検出可能レベルまで増加させる０例えば食
品産業では、加工食品の有毒細菌Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａ
を検査するために、食品原本を何日間もインキュベート
して核酸量を増加させる必要がある。臨床標本では、病
原体の数を増加させるために標本をかなりの期間にわた
って増殖させる必要がある。
１９８７年７月２８日付けのＣｅｔｕｓ Ｃｏｒｐｏｒ
ａｔｉｏｎの米国特許筒４，６８３，１９５号及び１９
８７年７月２８日付けのＣｅｔｕｓＣｏｒｐｏｒａｔ
ｉｏｎの米国特許筒４，６８３，２０２号は夫々、標本
中に含まれる標的核酸配列の増幅方法を開示している。
ａｔｉｏｎの米国特許筒４，６８３，１９５号及び１９
８７年７月２８日付けのＣｅｔｕｓＣｏｒｐｏｒａｔ
ｉｏｎの米国特許筒４，６８３，２０２号は夫々、標本
中に含まれる標的核酸配列の増幅方法を開示している。
米ＵＢ特許第４．６８３４９５号に記載された方法は、
標的核酸配列を含有すると予想される標本をオリゴヌク
レオチドプライマーで処理してプライマー伸長産生物を
合成し、該産生物・を鋳型として標的核酸配列を増幅さ
せる方法である。好適実施例では熱変性を用いてプライ
マー伸長産生物を鋳型から分離している。また、米国特
許筒４．６８３２０２号に記載の方法は、異なる２つの
相補鎖をもつ標的核酸配列の増幅方法である。この方法
では、鎖をプライマーで処理して伸長産生物を合成し、
プライマー伸長産生物を鋳型から分離し、次にプライマ
ー伸長産生物を鋳型として使用する。
標的核酸配列を含有すると予想される標本をオリゴヌク
レオチドプライマーで処理してプライマー伸長産生物を
合成し、該産生物・を鋳型として標的核酸配列を増幅さ
せる方法である。好適実施例では熱変性を用いてプライ
マー伸長産生物を鋳型から分離している。また、米国特
許筒４．６８３２０２号に記載の方法は、異なる２つの
相補鎖をもつ標的核酸配列の増幅方法である。この方法
では、鎖をプライマーで処理して伸長産生物を合成し、
プライマー伸長産生物を鋳型から分離し、次にプライマ
ー伸長産生物を鋳型として使用する。
段階操作を行なう必要がある。これらの特許に含よれる
操作段階では、ユーザーが標本を加熱し、冷却し、適当
な酵素を添加し、次いで諸段階を繰り返す必要がある。
操作段階では、ユーザーが標本を加熱し、冷却し、適当
な酵素を添加し、次いで諸段階を繰り返す必要がある。
温度変化は酵素を失活させる。
従ってユーザーは増幅過程の際に適当な酵素のアリコー
トを増幅混合物に繰り返し補充する必要がある。
トを増幅混合物に繰り返し補充する必要がある。
米国特許第４，６８３，１９５号及び第４，６８３，２
０２号によれば更に、増幅方法の各サイクルでは第１鋳
型から第２鋳型が合成され、次に第２鋳型を用いて第１
鋳型が合成される。このようにしてこの手順が繰り返さ
れるが、増幅方法の各サイクルは１つの基質からの１つ
の産生物の合成に基づいている。
０２号によれば更に、増幅方法の各サイクルでは第１鋳
型から第２鋳型が合成され、次に第２鋳型を用いて第１
鋳型が合成される。このようにしてこの手順が繰り返さ
れるが、増幅方法の各サイクルは１つの基質からの１つ
の産生物の合成に基づいている。
従来技術に開示された増幅方法にかかわりなく、増幅方
法の改良が必要とされている。ユーザーの介入が少なく
操作が少ない増幅方法が好ましい。
法の改良が必要とされている。ユーザーの介入が少なく
操作が少ない増幅方法が好ましい。
更に、増幅方法に関与する酵素の活性に影響を与えない
ように増幅が比較的一定の室温で行なわれるのが有利で
ある。増幅方法の各サイクル毎に１つの鋳型を使用し１
つの基質から２つ以上の産生物を生成することができれ
ば更に好都合であろう。
ように増幅が比較的一定の室温で行なわれるのが有利で
ある。増幅方法の各サイクル毎に１つの鋳型を使用し１
つの基質から２つ以上の産生物を生成することができれ
ば更に好都合であろう。
１ｉαＵ
本発明は、ユーザーによる介入及び操作が従来の増幅方
法よりも少ない有利な増幅方法に係る。
法よりも少ない有利な増幅方法に係る。
増幅が比較的一定の室温で行なわれる。更に、この方法
の各サイクルでは１つの基質からその産生物の複数コピ
ーが産生される。本発明の増幅方法は、特定核酸の量を
増加させこれによりコピー数の問題を解決するために使
用され得る。従って、プローブアッセイの使用がより容
易になる。また、特定核酸配列の純度を向上させるなめ
に本発明の増幅方法を従来のクローニング方法に代替し
て使用することも可能である。
の各サイクルでは１つの基質からその産生物の複数コピ
ーが産生される。本発明の増幅方法は、特定核酸の量を
増加させこれによりコピー数の問題を解決するために使
用され得る。従って、プローブアッセイの使用がより容
易になる。また、特定核酸配列の純度を向上させるなめ
に本発明の増幅方法を従来のクローニング方法に代替し
て使用することも可能である。
本発明の１つのＲａ！に従って特定核酸配列の増幅方法
が使用される。この方法は、一重鎖ＲＮΔ、一重鎖ＤＮ
Ａ及び二重ｇ［ＤＮＡの合成を含む。一重鎖ＲＮＡは第
１プライマー用第１鋳型である。−重ｇ ＤＮＡは第２
プライマー用第２鋳型である。二重ｇ（ＤＮＡは第１鋳
型の複数コピー合成用第３鋳型である。
が使用される。この方法は、一重鎖ＲＮΔ、一重鎖ＤＮ
Ａ及び二重ｇ［ＤＮＡの合成を含む。一重鎖ＲＮＡは第
１プライマー用第１鋳型である。−重ｇ ＤＮＡは第２
プライマー用第２鋳型である。二重ｇ（ＤＮＡは第１鋳
型の複数コピー合成用第３鋳型である。
第１または第２のプライマーの配列は特定核酸配列の配
列に十分に相補的であり、第１または第２のプライマー
の配列は特定核酸配列の配列に十分に相同である。第１
プライマーの３′末端は相補鎧上の第２プライマーの３
″末端に向がって方向付けされている。
列に十分に相補的であり、第１または第２のプライマー
の配列は特定核酸配列の配列に十分に相同である。第１
プライマーの３′末端は相補鎧上の第２プライマーの３
″末端に向がって方向付けされている。
本発明の別のＢ様に従って特定核酸配列の増幅方法が使
用される。この方法は以下の段階を含む。
用される。この方法は以下の段階を含む。
（ａ）第１プライマーを第１！２ｉ型にハイブリダイズ
する。第１プライマーは第１鋳型のＲＮΔ配列に十分に
相補的なＤＮＡ配列をもつ。
する。第１プライマーは第１鋳型のＲＮΔ配列に十分に
相補的なＤＮＡ配列をもつ。
（ｂ）第１プライマーに共有結合し第１鋳型のＲＮＡ配
列に相補的な第１ ＤＮＡを合成する。第１ＤＮＡ配列
及び第１プライマーが第２鋳型を構成する。
列に相補的な第１ ＤＮＡを合成する。第１ＤＮＡ配列
及び第１プライマーが第２鋳型を構成する。
（ｅ）第２プライマーのハイブリダイゼーションを行な
わせるために第１鋳型を第２鋳型がら分離する。
わせるために第１鋳型を第２鋳型がら分離する。
（ｄ）第２プライマーを第２鋳型にハイブリダイズする
。第２プライマーは第２鋳型のＤＮＡ配列に十分に相補
的なＤＮＡ配列をもつ。第２プライマーはよたＲＮＡポ
リメラーゼ用のプロモーターのアンチセンス配列と転写
開始部位のアンチセンス配列とをもつ。
。第２プライマーは第２鋳型のＤＮＡ配列に十分に相補
的なＤＮＡ配列をもつ。第２プライマーはよたＲＮＡポ
リメラーゼ用のプロモーターのアンチセンス配列と転写
開始部位のアンチセンス配列とをもつ。
（ｅ）第２プライマーに共有結合し第２鋳型のＤＮＡ配
列に相補的な第２ＤＮＡ配列を合成し、第２鋳型に共有
結合し第２プライマーのＤＮＡ配列に相補的な第３ＤＮ
Ａ配列を合成する。第２及び第３のαＮ八へ列及び第２
プライマー及び第２鋳型が第３鋳型を構成する。
列に相補的な第２ＤＮＡ配列を合成し、第２鋳型に共有
結合し第２プライマーのＤＮＡ配列に相補的な第３ＤＮ
Ａ配列を合成する。第２及び第３のαＮ八へ列及び第２
プライマー及び第２鋳型が第３鋳型を構成する。
（ｆ）第３鋳型から第１鋳型のＲＮΔ配列の複数コピー
を合成する。
を合成する。
第１または第２のプライマーの配列は特定核酸配列に十
分に相補的であり、第１または第２のプライマーの配列
は特定核酸配列の配列に十分に相同である。第１プライ
マーの３′末端は相補鎖上の第２プライマーの３゛末端
に向かって方向付けされている。
分に相補的であり、第１または第２のプライマーの配列
は特定核酸配列の配列に十分に相同である。第１プライ
マーの３′末端は相補鎖上の第２プライマーの３゛末端
に向かって方向付けされている。
本発明の別の方法では、第２プライマーＤＮＡが第２鋳
型のＤＮＡ配列に十分に相補的な配列を３′末端にもつ
。第２プライマーは５′末端にＲＮＡポリメラーゼ用の
プロモーターのアンチセンス配列と転写開始部位のアン
チセンス配列とをもつ。
型のＤＮＡ配列に十分に相補的な配列を３′末端にもつ
。第２プライマーは５′末端にＲＮＡポリメラーゼ用の
プロモーターのアンチセンス配列と転写開始部位のアン
チセンス配列とをもつ。
本発明の更に別の方法では、第２鋳型に共有結合した第
３ ＤＮＡ配列は第２プライマーの５°末端のＤＮＡ配
列に相補的である。
３ ＤＮＡ配列は第２プライマーの５°末端のＤＮＡ配
列に相補的である。
本発明の別の方法においても特定核酸配列の増幅方法が
使用される。該方法では、第１プライマーと第２プライ
マーとリボヌクレアーゼＨとＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメ
ラーゼとＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとＲＮＡポリ
メラーゼとリボヌクレオシド三リン酸とデオキシリボヌ
クレオシド三リン酸とを標本と混合する。第１プライマ
ーＤＮＡは第１鋳型ＲＮＡに十分に相補的な配列をもつ
、第２プライマーＤＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼによっ
て基質として認識される第２鋳型ＤＮＡに十分に相補的
な配列とプロモーターのアンチセンス配列と転写開始部
°位のアンチセンス配列とをもつ、第１プライマーまた
は第２プライマーの配列は、特定核酸配列の配列に十分
に相補的であり、第１プライマーまたは第２プライマー
の配列は特定核酸配列の配列に十分に相同である。第１
プライマーの３′末端は相補鎖上の第２プライマーの３
”末端に向かって方向付けされている。
使用される。該方法では、第１プライマーと第２プライ
マーとリボヌクレアーゼＨとＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメ
ラーゼとＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとＲＮＡポリ
メラーゼとリボヌクレオシド三リン酸とデオキシリボヌ
クレオシド三リン酸とを標本と混合する。第１プライマ
ーＤＮＡは第１鋳型ＲＮＡに十分に相補的な配列をもつ
、第２プライマーＤＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼによっ
て基質として認識される第２鋳型ＤＮＡに十分に相補的
な配列とプロモーターのアンチセンス配列と転写開始部
°位のアンチセンス配列とをもつ、第１プライマーまた
は第２プライマーの配列は、特定核酸配列の配列に十分
に相補的であり、第１プライマーまたは第２プライマー
の配列は特定核酸配列の配列に十分に相同である。第１
プライマーの３′末端は相補鎖上の第２プライマーの３
”末端に向かって方向付けされている。
本発明の更に別の方法においても特定核酸配列の増幅方
法が使用される。この方法では、第１プライマーと第２
プライマーとトリ筋芽細胞腫ウィルスポリメラーゼと大
腸菌リボヌクレアーゼ■］とバクテリオファージＴ７
ＲＮＡポリメラーゼとリボヌクレオシド三リン酸とデオ
キシリボヌクレオシド三リン酸とを標本に添加する。第
１プライマーＤＮＡは第１鋳型ＲＮＡに十分に相補的な
配列をもつ、第２プライマーＤＮＡはＴ７ ＲＮＡポリ
メラーゼによって基質として認識される第２鋳型ＤＮＡ
に十分に相補的な配列とプロモーターのアンチセンス配
列と転写開始部位のアンチセンス配列とを含む。第１プ
ライマーまたは第２プライマーの配列は特定核酸配列の
配列に十分に相補的であり、第１プライマーまたは第２
プライマーの配列は特定核酸配列の配列に十分に相同で
ある。第１プライマーの３′末端は相補鎖上の第２プラ
イマーの３°末端に向かって方向付けされている。
法が使用される。この方法では、第１プライマーと第２
プライマーとトリ筋芽細胞腫ウィルスポリメラーゼと大
腸菌リボヌクレアーゼ■］とバクテリオファージＴ７
ＲＮＡポリメラーゼとリボヌクレオシド三リン酸とデオ
キシリボヌクレオシド三リン酸とを標本に添加する。第
１プライマーＤＮＡは第１鋳型ＲＮＡに十分に相補的な
配列をもつ、第２プライマーＤＮＡはＴ７ ＲＮＡポリ
メラーゼによって基質として認識される第２鋳型ＤＮＡ
に十分に相補的な配列とプロモーターのアンチセンス配
列と転写開始部位のアンチセンス配列とを含む。第１プ
ライマーまたは第２プライマーの配列は特定核酸配列の
配列に十分に相補的であり、第１プライマーまたは第２
プライマーの配列は特定核酸配列の配列に十分に相同で
ある。第１プライマーの３′末端は相補鎖上の第２プラ
イマーの３°末端に向かって方向付けされている。
え木１
本発明は特定核酸配列の増幅方法に係る。増幅はＤＮＡ
及びＲＮへの交互合成を含み第１図に概略的に示されて
いる。この方法においては、一重鎖ＲＮＡが一重鎖ＤＮ
Ａに変換され、該一重鎖ＤＮＡが出発一重鎖ＲＮＡの複
数コピー合成用の機能性鋳型に変換される。第１プライ
マー及び第２プライマーが増幅方法で使用される。第１
プライマーまたは第２プライマーの配列は特定核酸配列
の配列に十分に相補的であり、第１プライマーまたは第
２プライマーの配列は特定核酸配列の配列に十分に相同
である。いくつかの場合、例えば特定核酸配列が二重鎖
ＤＮＡの場合には、第１プライマーと第２プライマーと
の双方が特定核酸配列の配列に十分に相補的で且つ十分
に相同である。
及びＲＮへの交互合成を含み第１図に概略的に示されて
いる。この方法においては、一重鎖ＲＮＡが一重鎖ＤＮ
Ａに変換され、該一重鎖ＤＮＡが出発一重鎖ＲＮＡの複
数コピー合成用の機能性鋳型に変換される。第１プライ
マー及び第２プライマーが増幅方法で使用される。第１
プライマーまたは第２プライマーの配列は特定核酸配列
の配列に十分に相補的であり、第１プライマーまたは第
２プライマーの配列は特定核酸配列の配列に十分に相同
である。いくつかの場合、例えば特定核酸配列が二重鎖
ＤＮＡの場合には、第１プライマーと第２プライマーと
の双方が特定核酸配列の配列に十分に相補的で且つ十分
に相同である。
ＲＮＡはオリゴヌクレオチドプライマー（第１プライマ
ー）をＲＮＡ （第１鋳型）にハイブリダイズさせＲＮ
Ａ依存性ＤＮ＾ボ、リメラーゼを用いて第１プライマー
から相補鎖叶＾（第１ＯＮ＾配列）を合成することによ
って一重鎖ＤＮＡに変換される。例えば第１鋳型の加水
分解とＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに特異的なリボヌク
レアーゼ（例えばリボヌクレアーゼＨ）を使用し、得ら
れた一重鎖ＤＮＡ（第２鋳型）を第１鋳型から分雛する
。第２鋳型はＲＮＡ合成可能な彩態に変換される。この
変換は、第２鋳型の３′末端に十分に相補的な配列を３
゛末端に含み５′末端に向かってプロモーターのアンチ
センス鎖と転写開始部位のアンチセンス配列とを含む配
列をもつ合成オリゴヌクレオチド（第２プライマー）を
ハイブリダイズし、第２鋳型を鋳型として用いて第２１
ライマーの３゛末端に共有結合した第２ＤＮＡ配列を合
成し、ＤＮＡ依存性ＯＮ＾ポリメラーゼを用い第２１ラ
イマーを鋳型と°して用いて第２鋳型の３°末端に共有
結合した第３ＤＮＡ配列を合成することによって行なわ
れる。
ー）をＲＮＡ （第１鋳型）にハイブリダイズさせＲＮ
Ａ依存性ＤＮ＾ボ、リメラーゼを用いて第１プライマー
から相補鎖叶＾（第１ＯＮ＾配列）を合成することによ
って一重鎖ＤＮＡに変換される。例えば第１鋳型の加水
分解とＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに特異的なリボヌク
レアーゼ（例えばリボヌクレアーゼＨ）を使用し、得ら
れた一重鎖ＤＮＡ（第２鋳型）を第１鋳型から分雛する
。第２鋳型はＲＮＡ合成可能な彩態に変換される。この
変換は、第２鋳型の３′末端に十分に相補的な配列を３
゛末端に含み５′末端に向かってプロモーターのアンチ
センス鎖と転写開始部位のアンチセンス配列とを含む配
列をもつ合成オリゴヌクレオチド（第２プライマー）を
ハイブリダイズし、第２鋳型を鋳型として用いて第２１
ライマーの３゛末端に共有結合した第２ＤＮＡ配列を合
成し、ＤＮＡ依存性ＯＮ＾ポリメラーゼを用い第２１ラ
イマーを鋳型と°して用いて第２鋳型の３°末端に共有
結合した第３ＤＮＡ配列を合成することによって行なわ
れる。
得られた第２鋳型の機能性誘導体が第３鋳型で゛あり、
これを使用し、第２プライマーによって規定されるプロ
モーター及び転２写開始部位に特異的なＲＮＡポリメラ
ーゼを用いて第１鋳型であるＲＮＡの複数コピーを合成
する。サイクルを繰り返すことによって、新しく合成さ
れた第１鋳型の各々が更に第２鋳型及び第３鋳型のコピ
ーに変換され得る。
これを使用し、第２プライマーによって規定されるプロ
モーター及び転２写開始部位に特異的なＲＮＡポリメラ
ーゼを用いて第１鋳型であるＲＮＡの複数コピーを合成
する。サイクルを繰り返すことによって、新しく合成さ
れた第１鋳型の各々が更に第２鋳型及び第３鋳型のコピ
ーに変換され得る。
また、サイクルの繰り返しがユーザーの介入または操作
を不要とする。
を不要とする。
増幅方法は、適当な反応条件下に適当な酵素、プライマ
ー及び補因子に適当な鋳型核酸を添加することによって
開始される。この鋳型核酸は、均質で連続的な増幅が可
能な形層であり、第１図に示すサイクルにおける中間体
として機能する。増幅方法では前駆体（プライマー、リ
ボヌクレオシド三リン酸及びデオキシリボヌクレオシド
三リン酸）の正味（ｎｅｔ）の消費及び産生物（ＲＮＡ
及びＤＮＡ）の正味の蓄積が生じる。 ＲＮＡ及びＤＮ
Ａの合成過程は、検出に十分なレベルの核酸が合成され
るまで非同時的に進行する。増幅過程は例えば標識前駆
体からの標識産生物の合成によって追跡され得る。
ー及び補因子に適当な鋳型核酸を添加することによって
開始される。この鋳型核酸は、均質で連続的な増幅が可
能な形層であり、第１図に示すサイクルにおける中間体
として機能する。増幅方法では前駆体（プライマー、リ
ボヌクレオシド三リン酸及びデオキシリボヌクレオシド
三リン酸）の正味（ｎｅｔ）の消費及び産生物（ＲＮＡ
及びＤＮＡ）の正味の蓄積が生じる。 ＲＮＡ及びＤＮ
Ａの合成過程は、検出に十分なレベルの核酸が合成され
るまで非同時的に進行する。増幅過程は例えば標識前駆
体からの標識産生物の合成によって追跡され得る。
増幅が、第１図に概略的に示すプロセスに付加または代
替して別のプロセスを含んでもよい。また、ある種の通
産生性（ｃｏｕｎｔｅｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ）酵素
反応が許容できる低速度で発生してもよい。予想される
非産生性副反応の１つは、鋳型核酸の非存在下のＲＮＡ
及び／またはＤＮＡの合成である。かかる１１ＮＡ及び
／またはＤＮＡ産物を所望産生物から識別するためには
、特定核酸配列の２つのプライミング部位間にのみ検出
される特定配列の有無を判定すればよい。
替して別のプロセスを含んでもよい。また、ある種の通
産生性（ｃｏｕｎｔｅｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ）酵素
反応が許容できる低速度で発生してもよい。予想される
非産生性副反応の１つは、鋳型核酸の非存在下のＲＮＡ
及び／またはＤＮＡの合成である。かかる１１ＮＡ及び
／またはＤＮＡ産物を所望産生物から識別するためには
、特定核酸配列の２つのプライミング部位間にのみ検出
される特定配列の有無を判定すればよい。
第１プライマーは、第１鋳型の３′末端に十分に相補的
な配列を３′末端にもつオリゴデオキシリボヌクレオチ
ドである。第１プライマーの３°末端の配列は、所与の
イオン強度条件及び温度条件下に第１ＤＮＡ配列を特異
的効率的に合成するために十分な特定の長さ及び塩基組
成をもつ。ｍｌサイクルにおいて第１プライマーは第１
鋳型の３′末端の内部の領域に十分に相補的であり得る
。その後のサイクルにおいて、第１プライマーの５°末
端は第１鋳型の３°末端に相補的であろう、第１プライ
マーの一部または全部が天然デオキシリボヌクレオチド
以外のヌクレオチドまたはヌクレオチド預似体から構成
されてもよいと考えられる。第１サイクルで第１プライ
マーの５°末端は第１鋳型に相補的でない配列を含んで
いてもよい、非相補的配列は、固定化可能な核酸に相補
的であってもよく、または検出容易なリポータ−のごと
き有用な非核酸成分と結合可能であってもよい。または
、非相補的配列が、プロモーターのアンチセンス配列と
ＲＮＡ合成に使用できる転写開始部位のアンチセンス配
列とを含んでいてもよい。このＲＮＡ４よ、第１鋳型に
相補的であり別の増幅サイクルで中間体として使用され
得る。
な配列を３′末端にもつオリゴデオキシリボヌクレオチ
ドである。第１プライマーの３°末端の配列は、所与の
イオン強度条件及び温度条件下に第１ＤＮＡ配列を特異
的効率的に合成するために十分な特定の長さ及び塩基組
成をもつ。ｍｌサイクルにおいて第１プライマーは第１
鋳型の３′末端の内部の領域に十分に相補的であり得る
。その後のサイクルにおいて、第１プライマーの５°末
端は第１鋳型の３°末端に相補的であろう、第１プライ
マーの一部または全部が天然デオキシリボヌクレオチド
以外のヌクレオチドまたはヌクレオチド預似体から構成
されてもよいと考えられる。第１サイクルで第１プライ
マーの５°末端は第１鋳型に相補的でない配列を含んで
いてもよい、非相補的配列は、固定化可能な核酸に相補
的であってもよく、または検出容易なリポータ−のごと
き有用な非核酸成分と結合可能であってもよい。または
、非相補的配列が、プロモーターのアンチセンス配列と
ＲＮＡ合成に使用できる転写開始部位のアンチセンス配
列とを含んでいてもよい。このＲＮＡ４よ、第１鋳型に
相補的であり別の増幅サイクルで中間体として使用され
得る。
第２プライマーは第２鋳型の３゛末端に十分に相補的な
配列を３°末端に含むオリゴデオキシリボヌクレオチド
である。第２プライマーは所与のイオン強度条件及び温
度条件下に第２及び第３のＤＮＡ配列を特異的効率的に
合成せしめるに十分な特定の長さ及び塩基組成をもつ。
配列を３°末端に含むオリゴデオキシリボヌクレオチド
である。第２プライマーは所与のイオン強度条件及び温
度条件下に第２及び第３のＤＮＡ配列を特異的効率的に
合成せしめるに十分な特定の長さ及び塩基組成をもつ。
更に、第２プライマーは機能性プロモーターのアンチセ
ンス配列と転写開始部位のアンチセンス配列とを含む。
ンス配列と転写開始部位のアンチセンス配列とを含む。
この配列は、第３ＤＮＡ配列の合成用鋳型として使用さ
れたとき、ＲＮＡポリメラーゼの特異的効率的結合と所
望部位での転写開始とを行なわせるに十分な情報を含む
。プロモーター配列は機能性プロモーターのアンチセン
ス類に由来してもよい、転写開始部位は天然ＲＮ八へ写
物の５°末端配列に由来してもよい。好適実施態様にお
いては、第２プライマーの５′末端配列は、＾＾ＴＴＣ
Ｔ＾ΔＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧである
。この配列は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモー
ターのアンチセンス配列と転写開始部位のアンチセンス
配列とを含む。または、別のファージＲＮＡポリメラー
ゼ用の転写開始部位とプロモーターとを使用してもよい
。更に、プロモーター機能に関係しない配列が、第２プ
ライマーの５′末端に含まれるかまたは第２鋳型にハイ
ブリダイズする３′末端の配列と転写開始部位との間に
含まれていてもよい。第２プライマーの一部または全部
が天然デオキシリボヌクレオチド以外のヌクレオチドま
たはヌクレオチド類似体から構成されてもよい。
れたとき、ＲＮＡポリメラーゼの特異的効率的結合と所
望部位での転写開始とを行なわせるに十分な情報を含む
。プロモーター配列は機能性プロモーターのアンチセン
ス類に由来してもよい、転写開始部位は天然ＲＮ八へ写
物の５°末端配列に由来してもよい。好適実施態様にお
いては、第２プライマーの５′末端配列は、＾＾ＴＴＣ
Ｔ＾ΔＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧである
。この配列は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモー
ターのアンチセンス配列と転写開始部位のアンチセンス
配列とを含む。または、別のファージＲＮＡポリメラー
ゼ用の転写開始部位とプロモーターとを使用してもよい
。更に、プロモーター機能に関係しない配列が、第２プ
ライマーの５′末端に含まれるかまたは第２鋳型にハイ
ブリダイズする３′末端の配列と転写開始部位との間に
含まれていてもよい。第２プライマーの一部または全部
が天然デオキシリボヌクレオチド以外のヌクレオチドま
たはヌクレオチド類似体から構成されてもよい。
本発明で使用される酵素はすべて、いくつかの実用瓜格
を充足させる必要がある。酵素または酵素調製物の各々
は、ある種のＤＮＡポリメラーゼ及び−重鎮または二重
鎖に特異的なエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレア
ーゼにおいてしばしばみられる５′−または３″−のエ
キソヌクレアーゼ活性のような有害なデオキシリボヌク
レアーゼ（「ＤＮａｓす）活性を有していてはならない
。酵素または酵素調製物の各々は、ＲＮＡ及びＤＮへの
ハイブリッドに特異的で好適なリボヌクレアーゼ活性（
例えばリボヌクレアーゼＨ）の添加を除いて、有害なリ
ボヌクレアーゼ（ｒＲＮａｓす）活性を有していてはな
らない。
を充足させる必要がある。酵素または酵素調製物の各々
は、ある種のＤＮＡポリメラーゼ及び−重鎮または二重
鎖に特異的なエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレア
ーゼにおいてしばしばみられる５′−または３″−のエ
キソヌクレアーゼ活性のような有害なデオキシリボヌク
レアーゼ（「ＤＮａｓす）活性を有していてはならない
。酵素または酵素調製物の各々は、ＲＮＡ及びＤＮへの
ハイブリッドに特異的で好適なリボヌクレアーゼ活性（
例えばリボヌクレアーゼＨ）の添加を除いて、有害なリ
ボヌクレアーゼ（ｒＲＮａｓす）活性を有していてはな
らない。
更に、各酵素は、その他の酵素過程、及びＲＮＡまたは
ＤＮＡ鋳型にオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリ
ダイズするような非酵素過程で使用される一般的な反応
条件下で適当な程度に活性でなければならない。
ＤＮＡ鋳型にオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリ
ダイズするような非酵素過程で使用される一般的な反応
条件下で適当な程度に活性でなければならない。
本発明で使用されるＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは
、プロモーターと指称される特定ＤＮＡ配列に結合でき
かつプロモーターに極めて近接した所定の開始部位でＲ
Ｎへのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成を特異的に開始し得るいか
なる酵素でもよい、プロモーター及び開始部位が第２プ
ライマーの一部を形成する。更に、ＲＮＡポリメラーゼ
は、適当な時間内に鋳型の機能性コピー当たり数個のＲ
ＮΔコピーを合成し得ることが必要である。好適実施態
様では、バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ
が使用される。更に別のバクテリオファージＲＮＡポリ
メラーゼ、例えばファージＴ３、ファージφＨ、Ｓａ１
ｍｏｎｅｌｌａファージｓｐａまたはＰｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓファージｇｈ−１の使用も可能である。また別の
実施Ｒ様では、原核細胞または真核細胞ＤＮＡ依存性Ｄ
ＮＡポリメラーゼを使用してもよい。別のＲＮＡポリメ
ラーゼを使用する場合には、第２プライマーのプロモー
ター配列及び開始配列を特定ＲＮＡポリメラーゼの鋳型
特異性に従って適宜変更する必要がある。
、プロモーターと指称される特定ＤＮＡ配列に結合でき
かつプロモーターに極めて近接した所定の開始部位でＲ
Ｎへのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成を特異的に開始し得るいか
なる酵素でもよい、プロモーター及び開始部位が第２プ
ライマーの一部を形成する。更に、ＲＮＡポリメラーゼ
は、適当な時間内に鋳型の機能性コピー当たり数個のＲ
ＮΔコピーを合成し得ることが必要である。好適実施態
様では、バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ
が使用される。更に別のバクテリオファージＲＮＡポリ
メラーゼ、例えばファージＴ３、ファージφＨ、Ｓａ１
ｍｏｎｅｌｌａファージｓｐａまたはＰｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓファージｇｈ−１の使用も可能である。また別の
実施Ｒ様では、原核細胞または真核細胞ＤＮＡ依存性Ｄ
ＮＡポリメラーゼを使用してもよい。別のＲＮＡポリメ
ラーゼを使用する場合には、第２プライマーのプロモー
ター配列及び開始配列を特定ＲＮＡポリメラーゼの鋳型
特異性に従って適宜変更する必要がある。
本発明で使用されるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは
オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー及びＲＮＡ
鋳型からＤＮＡを合成し得るいかなる酵素でもよい。こ
の酵素は更に、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性及
びＲＮａｓｅ Ｈ活性を含んでいてもよい。好適実施態
様においては、１・り筋芽細胞腫ウィルスポリメラーゼ
（「＾ＭＶ逆転写酵素」）が使用される。
オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー及びＲＮＡ
鋳型からＤＮＡを合成し得るいかなる酵素でもよい。こ
の酵素は更に、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性及
びＲＮａｓｅ Ｈ活性を含んでいてもよい。好適実施態
様においては、１・り筋芽細胞腫ウィルスポリメラーゼ
（「＾ＭＶ逆転写酵素」）が使用される。
更に、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが別のしＩ・ロ
ウイルス、例えばモロニー（Ｍａｌｏｎｅｙ）マウス白
血病ウィルスに由来してもよい。または別の真核細胞Ｒ
ＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用してもよい。
ウイルス、例えばモロニー（Ｍａｌｏｎｅｙ）マウス白
血病ウィルスに由来してもよい。または別の真核細胞Ｒ
ＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用してもよい。
本発明で使用されるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは
、オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーとＤＮＡ
鋳型とからＤＮＡを合成し得るいがなる酵素でもよい。
、オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーとＤＮＡ
鋳型とからＤＮＡを合成し得るいがなる酵素でもよい。
この酵素は多くの種類のＤＮＡポリメラーゼに関連する
５°−または３゛−エキソヌクレアーゼ活性を有してい
てはならない。好適実施態様ではＡＭＶ逆転写酵素が使
用されるが、５′−または３゛−エキソヌクレアーゼ活
性が本来欠如した別のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ
も使用できる。このようなポリメラーゼの例は、いくっ
がの真核側ＩＩＩＤＮ＾ポリメラーゼ、例えばＤＮ＾ポ
リメラーゼαまたはβ、子ウシ胸腺のごとき冊乳類組識
から単離されるＤＮＡポリメラーゼである。普通なら不
適当なＤＮＡポリメラーゼも、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝
子の変性と適当な宿主細胞中での変性ポリメラーゼの発
現とを順次行なうかまたはＤＮＡポリメラーゼタンパク
質ＤＮ＾ポリメラーゼは、大腸菌ポリメラーゼＩのフレ
ノウ（ＫＩｅｎｏｕ＋）フラグメントから調製されても
よくまたはバクテリオファージＴ７ ＤＮＡポリメラー
ゼから調製されてもよい。好適実施態様においては、Ｒ
ＮＡ依存性ＤＮ＾ポリメラーゼ活性とＤＮＡ依存性ＤＮ
Ａポリメラーゼ活性との双方が同じ酵素によって与えリ
メラーゼ活性は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼに起
因する活性の補足として付加されることが理解されよう
。
５°−または３゛−エキソヌクレアーゼ活性を有してい
てはならない。好適実施態様ではＡＭＶ逆転写酵素が使
用されるが、５′−または３゛−エキソヌクレアーゼ活
性が本来欠如した別のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ
も使用できる。このようなポリメラーゼの例は、いくっ
がの真核側ＩＩＩＤＮ＾ポリメラーゼ、例えばＤＮ＾ポ
リメラーゼαまたはβ、子ウシ胸腺のごとき冊乳類組識
から単離されるＤＮＡポリメラーゼである。普通なら不
適当なＤＮＡポリメラーゼも、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝
子の変性と適当な宿主細胞中での変性ポリメラーゼの発
現とを順次行なうかまたはＤＮＡポリメラーゼタンパク
質ＤＮ＾ポリメラーゼは、大腸菌ポリメラーゼＩのフレ
ノウ（ＫＩｅｎｏｕ＋）フラグメントから調製されても
よくまたはバクテリオファージＴ７ ＤＮＡポリメラー
ゼから調製されてもよい。好適実施態様においては、Ｒ
ＮＡ依存性ＤＮ＾ポリメラーゼ活性とＤＮＡ依存性ＤＮ
Ａポリメラーゼ活性との双方が同じ酵素によって与えリ
メラーゼ活性は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼに起
因する活性の補足として付加されることが理解されよう
。
本発明で使用され得るＲ Ｎ ａ ｓ ｅ Ｈは相補的
ＤＮＡにアニールされるＩＩＮ八を加水分解し得るいか
なる酵素でもよい。この酵素は、−重鎮または二重鎖の
ＲＮＡまたはいかなるＤＮＡも加水分解してはならない
。
ＤＮＡにアニールされるＩＩＮ八を加水分解し得るいか
なる酵素でもよい。この酵素は、−重鎮または二重鎖の
ＲＮＡまたはいかなるＤＮＡも加水分解してはならない
。
好適実施態様においては、大腸菌ＲＮａｓｅ Ｈを使用
する。更に別のＲＮ ａ ｓ ｅ Ｈ酵素、例えば子ウ
シ胸腺ＲＮａｓｅ Ｈの使用も可能である。ＲＮａｓｅ
Ｈは＾ＭＶ逆転写酵素の固有活性であるから、好適実
施態様では大腸菌ＲＮａｓｅ ＨにＡＭＶ逆転写酵素の
ＲＮａｓｅ Ｈが付加される。または、第１鋳型から第
２ＩｊＪ型を分離し得る別のいかなる酵素を使用しても
よい。
する。更に別のＲＮ ａ ｓ ｅ Ｈ酵素、例えば子ウ
シ胸腺ＲＮａｓｅ Ｈの使用も可能である。ＲＮａｓｅ
Ｈは＾ＭＶ逆転写酵素の固有活性であるから、好適実
施態様では大腸菌ＲＮａｓｅ ＨにＡＭＶ逆転写酵素の
ＲＮａｓｅ Ｈが付加される。または、第１鋳型から第
２ＩｊＪ型を分離し得る別のいかなる酵素を使用しても
よい。
ＤＮＡ合成及びＲＮＡ合成の双方にとって必要な緩衝液
及び補因子を入れた反応容器で前記酵素とプライマーと
を一緒に混合する。更に、当業者に公知のごと＜ＤＮＡ
及びＤＮＡ鋳型にプライマーを特異的にハイブリダイズ
させるための適当なイオン条件及び反応温度を与える。
及び補因子を入れた反応容器で前記酵素とプライマーと
を一緒に混合する。更に、当業者に公知のごと＜ＤＮＡ
及びＤＮＡ鋳型にプライマーを特異的にハイブリダイズ
させるための適当なイオン条件及び反応温度を与える。
反応混合物は、増幅方法を妨害する物質、例えば酵素の
活性を大幅に阻害するかプライマーと鋳型とのハイブリ
ダイズを妨害するかまたは核酸中間体及び産生物を非産
生的に分解させる物質を含んでいてはならない。
活性を大幅に阻害するかプライマーと鋳型とのハイブリ
ダイズを妨害するかまたは核酸中間体及び産生物を非産
生的に分解させる物質を含んでいてはならない。
増幅方法の応用に役立つと思われるいくつかの検出手順
を説明する。本増幅方法で合成された核酸の検出手順が
記載の手順に限定されないこと、別の検出方法の使用が
可能であることが理解されよう。
を説明する。本増幅方法で合成された核酸の検出手順が
記載の手順に限定されないこと、別の検出方法の使用が
可能であることが理解されよう。
検出手順の１つの実施態様においては、反応混合物に標
識前駆体を添加し得る。当業者に公知の方法を用いてｔ
ｇ、識前駆体から分離できる標識産生物の定量分析また
は定性分析によって増幅が検出される。
識前駆体を添加し得る。当業者に公知の方法を用いてｔ
ｇ、識前駆体から分離できる標識産生物の定量分析また
は定性分析によって増幅が検出される。
標識前駆体は、ＲＮ Ａ 合成を検出するリボヌクレオ
シド三リン酸でもよく、またはＤＮＡ合成を検出するデ
オキシヌクレオシ牢三リン酸またはオリゴヌクレオチド
プライマーでもよい。標識のタイプは放射性同位体でも
よく、またはビオチンのごとき有用な化学基、発色団、
蛍光発色団または抗体に結合し得るハプテンでもよく、
またはタンパクまたは酵素でもよい。標識産生物は溶解
度、電荷またはサイズに基づいて標識前駆体から分離さ
れてもよい。更に、標識ＤＮＡまたはＲＮＡを、相補配
列を含み固定化することが可能な核酸にハイブリダイズ
してもよい。
シド三リン酸でもよく、またはＤＮＡ合成を検出するデ
オキシヌクレオシ牢三リン酸またはオリゴヌクレオチド
プライマーでもよい。標識のタイプは放射性同位体でも
よく、またはビオチンのごとき有用な化学基、発色団、
蛍光発色団または抗体に結合し得るハプテンでもよく、
またはタンパクまたは酵素でもよい。標識産生物は溶解
度、電荷またはサイズに基づいて標識前駆体から分離さ
れてもよい。更に、標識ＤＮＡまたはＲＮＡを、相補配
列を含み固定化することが可能な核酸にハイブリダイズ
してもよい。
別の実施態様においては、増幅方法の産生物が固定化担
体に結合され、相補配列を含む核酸プローブにハイブリ
ダイズされ、さらに溶液中に残存する非ハイブリダイズ
核酸１０−ブから分離され得る。産生物たるＤＮＡまた
はＲＮＡ４よ、疎水的、静電的または共有結合的相互作
用のような安定な相互作用によって固体担体に直接結合
されてもよい。
体に結合され、相補配列を含む核酸プローブにハイブリ
ダイズされ、さらに溶液中に残存する非ハイブリダイズ
核酸１０−ブから分離され得る。産生物たるＤＮＡまた
はＲＮＡ４よ、疎水的、静電的または共有結合的相互作
用のような安定な相互作用によって固体担体に直接結合
されてもよい。
更に、産生物は、固定化タンパク質（例えばアビチンの
ようなある種の化学基を３んでもよい。更に産生物は、
相補配列を含み固定化することが可能な核酸にハイブリ
ダイズされてもよい、核酸プローブは、ハイブリダイゼ
ーション条件下に結合を生起しかつ非ハイブリダイズ核
酸プローブの除去に使用される条件下で持続的に結合さ
せるために増幅方法の産生物と十分に安定な相互作用を
形成する相補配列、を含む。好適実施態様において、相
補配列は第１プラ、イマー配列と第２プライマー配列と
の間に存在する特定核酸配列の配列部分に由来する。核
酸プローブは、−重ｊｉ ＤＮＡまたはＲＮＡでもよく
、または−雷銀にできる二重ｆｉ ＤＮＡまたはＲＮ八
でもよく、またはデオキシリボヌクレオチド及び／また
はりボヌクレオチドから構成され得るオリゴヌクレオチ
ドでもよい。更に、核酸プローブは、適当な条件下にＤ
ＮＡ産物またはＲＮ八へ物に共有結合し得る化学基を含
んでいてもよい。放射性同位体、ビオチンのごとき有用
な化学基、発色団、蛍光発色団または抗体に結合し得る
ハブテンで核酸プローブを標識してもよい。核酸プロー
ブは更に、タンパク質またはホスファターゼ、ペルオキ
シダーゼのごとき酵素との複合体を形成し得る。核酸プ
ローブは更にプローブを江畦幻！複製し得るある種の配
列を含んでいてもよい。
ようなある種の化学基を３んでもよい。更に産生物は、
相補配列を含み固定化することが可能な核酸にハイブリ
ダイズされてもよい、核酸プローブは、ハイブリダイゼ
ーション条件下に結合を生起しかつ非ハイブリダイズ核
酸プローブの除去に使用される条件下で持続的に結合さ
せるために増幅方法の産生物と十分に安定な相互作用を
形成する相補配列、を含む。好適実施態様において、相
補配列は第１プラ、イマー配列と第２プライマー配列と
の間に存在する特定核酸配列の配列部分に由来する。核
酸プローブは、−重ｊｉ ＤＮＡまたはＲＮＡでもよく
、または−雷銀にできる二重ｆｉ ＤＮＡまたはＲＮ八
でもよく、またはデオキシリボヌクレオチド及び／また
はりボヌクレオチドから構成され得るオリゴヌクレオチ
ドでもよい。更に、核酸プローブは、適当な条件下にＤ
ＮＡ産物またはＲＮ八へ物に共有結合し得る化学基を含
んでいてもよい。放射性同位体、ビオチンのごとき有用
な化学基、発色団、蛍光発色団または抗体に結合し得る
ハブテンで核酸プローブを標識してもよい。核酸プロー
ブは更に、タンパク質またはホスファターゼ、ペルオキ
シダーゼのごとき酵素との複合体を形成し得る。核酸プ
ローブは更にプローブを江畦幻！複製し得るある種の配
列を含んでいてもよい。
分子クローニング技術によって進歩した典型的核酸処理
方法によって本増幅方法の産生物を分析することが可能
である。１つの方法では、合成ＤＮＡを制限エンドヌク
レアーゼで分解し、電気泳動法で？離し、当業界で公知
の方法で検出することによって特定ＤＮＡ配列の合成を
検出し得る。別の方法では、ＲＮΔ依存性ＤＮＡポリメ
ラーゼと第１プライマーとジデオキシヌクレオシド三リ
ン酸とを用いたＤＮＡ合成によって、増幅ＲＮＡの配列
を決定し得る（Ｓｔｏｒｌｅｔ等、１９８８）。更に別
の方法では、本増幅方法で使用したＤＮＡ依存性ＲＮＡ
ポリメラーゼと３゛−デオキシリボヌクレオシド三リン
酸とを用いたＲＮＡ合成によって増幅された第３鋳型の
配列を決定し得る（Ａｘｅｌｒｏｄ ＆ Ｋｒａｍｅｒ
、１９８５）。別の方法においては増幅ＲＮ八がｉｎ
ｖｉｔｒｏ翻訳され得るポリペプチドをコードするであ
ろう、 ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳されたポリペプチド産生
物は抗体を用いて分析され得る。
方法によって本増幅方法の産生物を分析することが可能
である。１つの方法では、合成ＤＮＡを制限エンドヌク
レアーゼで分解し、電気泳動法で？離し、当業界で公知
の方法で検出することによって特定ＤＮＡ配列の合成を
検出し得る。別の方法では、ＲＮΔ依存性ＤＮＡポリメ
ラーゼと第１プライマーとジデオキシヌクレオシド三リ
ン酸とを用いたＤＮＡ合成によって、増幅ＲＮＡの配列
を決定し得る（Ｓｔｏｒｌｅｔ等、１９８８）。更に別
の方法では、本増幅方法で使用したＤＮＡ依存性ＲＮＡ
ポリメラーゼと３゛−デオキシリボヌクレオシド三リン
酸とを用いたＲＮＡ合成によって増幅された第３鋳型の
配列を決定し得る（Ａｘｅｌｒｏｄ ＆ Ｋｒａｍｅｒ
、１９８５）。別の方法においては増幅ＲＮ八がｉｎ
ｖｉｔｒｏ翻訳され得るポリペプチドをコードするであ
ろう、 ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳されたポリペプチド産生
物は抗体を用いて分析され得る。
特定核酸配列を含有すると予想されるかまたは含有する
ことが判明している標本を、均質な連続増幅が可能な鋳
型核酸の形態で反応混合物に添加する。この反応混合物
は第１図のサイクル中のいかなる中間体でもよい。特に
、鋳型核酸は、第２プライマーの３゛末端に存在する配
列と十分に相同の配列を５°末端に含み、かつ第１プラ
イマーに十分に相補的な配列を含む一重ｇＲＮＡでもよ
い。この形態の鋳型核酸は本増幅方法では第１鋳型とし
て機能するであろう、または、鋳型核酸は、第２プライ
マーの少なくとも３°末端と十分に相補的な配列を３゛
末端に含みかつ第１プライマーの３°末端に存在する配
列に十分に相同の配列を含む一重鎖ＤＮＡでもよい、こ
の形態の鋳型核酸は本増幅方法では第２鋳型として機能
するであろう。または鋳型核酸は、一方の鎖が５゛末端
に第２プライマーの完全配列をよみかつ第１プライマー
と十分に相補的な配列を含む二重ｊＩＤＮ八でもよい。
ことが判明している標本を、均質な連続増幅が可能な鋳
型核酸の形態で反応混合物に添加する。この反応混合物
は第１図のサイクル中のいかなる中間体でもよい。特に
、鋳型核酸は、第２プライマーの３゛末端に存在する配
列と十分に相同の配列を５°末端に含み、かつ第１プラ
イマーに十分に相補的な配列を含む一重ｇＲＮＡでもよ
い。この形態の鋳型核酸は本増幅方法では第１鋳型とし
て機能するであろう、または、鋳型核酸は、第２プライ
マーの少なくとも３°末端と十分に相補的な配列を３゛
末端に含みかつ第１プライマーの３°末端に存在する配
列に十分に相同の配列を含む一重鎖ＤＮＡでもよい、こ
の形態の鋳型核酸は本増幅方法では第２鋳型として機能
するであろう。または鋳型核酸は、一方の鎖が５゛末端
に第２プライマーの完全配列をよみかつ第１プライマー
と十分に相補的な配列を含む二重ｊＩＤＮ八でもよい。
二重ｇ ＤＮＡは本増幅方法では第３鋳型として機能す
る。
る。
鋳型核酸の調製は本増幅方法の一部を構成しないが、増
幅方法の応用に役立つと思われる鋳型核酸形成手順の幾
つかの例を以下に説明する。しかしながら鋳型核酸形成
手順が記載の種々の手順に限定されることなく別の方法
も使用できることは理解されよう。
幅方法の応用に役立つと思われる鋳型核酸形成手順の幾
つかの例を以下に説明する。しかしながら鋳型核酸形成
手順が記載の種々の手順に限定されることなく別の方法
も使用できることは理解されよう。
鋳型核酸形成手順の１つの例においては、第１鋳型とし
て機能し得る鋳型核酸は、天然由来ＲＮＡであるかまた
は当業界で公知の部位特異的加水分解法（Ｓｈｉｂａｈ
ａｒａ等、１９８７）を用いてより大きいＲＮＡ分子か
ら生成され得るＲＮＡフラグメントであり得る。
て機能し得る鋳型核酸は、天然由来ＲＮＡであるかまた
は当業界で公知の部位特異的加水分解法（Ｓｈｉｂａｈ
ａｒａ等、１９８７）を用いてより大きいＲＮＡ分子か
ら生成され得るＲＮＡフラグメントであり得る。
別の例においては、第２鋳型として機能し得る鋳型核酸
は、第２プライマーの３′末端に十分に相補的な配列に
直接つながり（ｆｌａｎｋｉＢ）、制限エンドヌクレア
ーゼで消化し得る部位をもつ二重ｌＤＮＡから調製され
得る。
は、第２プライマーの３′末端に十分に相補的な配列に
直接つながり（ｆｌａｎｋｉＢ）、制限エンドヌクレア
ーゼで消化し得る部位をもつ二重ｌＤＮＡから調製され
得る。
更に別の例においては、第２鋳型として機能し得る鋳型
核酸は、ＤＮＡ合成を阻止し得るオリゴヌクレオチドに
ハイブリダイズさせた一重ｌＤＮＡまたはＲＮＡから調
製される。この阻止オリゴヌクレオチドは適当な条件下
に鋳型に共有結合し得る化学基を含んでもよい。第１プ
ライマーを使用してこの阻止された鋳型からＤＮＡを合
成すると第２鋳型と同じ３″末端をもつ合成ＤＮＡが得
られる。出発鋳型がＲＮＡのとき、得られるＤＮＡ−Ｒ
ＮＡハイブリッドは鋳型核酸として直接使用され得る。
核酸は、ＤＮＡ合成を阻止し得るオリゴヌクレオチドに
ハイブリダイズさせた一重ｌＤＮＡまたはＲＮＡから調
製される。この阻止オリゴヌクレオチドは適当な条件下
に鋳型に共有結合し得る化学基を含んでもよい。第１プ
ライマーを使用してこの阻止された鋳型からＤＮＡを合
成すると第２鋳型と同じ３″末端をもつ合成ＤＮＡが得
られる。出発鋳型がＲＮＡのとき、得られるＤＮＡ−Ｒ
ＮＡハイブリッドは鋳型核酸として直接使用され得る。
出発鋳型がＤＮＡのとき、得られた第２鋳型のコピーは
化学的または熱的変性方法によって出発鋳型から分離さ
れ得る。
化学的または熱的変性方法によって出発鋳型から分離さ
れ得る。
別の例においては、第３鋳型として機能する鋳型核酸は
、第２プライマーを用いてＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型から
ＤＮＡ合成された一重ｌＤＮＡまたはＲＮＡから調製さ
れる。得られた合成ＤＮＡを化学的または熱的変性方法
を用いて出発鋳型から分離する。更に、化学的または酵
素的方法を用いてＲＮＡ１型を加水分解する。得られた
一重鎖ＤＮＡは５′末端に共有結合した第２プライマー
の配列をもちかつ第１プライマーに十分に相補的な配列
を含む。一重鎖ＤＮＡに第１プライマーをハイブリダイ
ズし、さらに第１プライマーに共有結合しかつ一重ｌＤ
ＮＡこ相補的なＤＮＡ配列を合成することによって、こ
の−重鎮ＤＮＡを転写機能をもつ二重鎖ＤＮＡに変換し
得る。
、第２プライマーを用いてＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型から
ＤＮＡ合成された一重ｌＤＮＡまたはＲＮＡから調製さ
れる。得られた合成ＤＮＡを化学的または熱的変性方法
を用いて出発鋳型から分離する。更に、化学的または酵
素的方法を用いてＲＮＡ１型を加水分解する。得られた
一重鎖ＤＮＡは５′末端に共有結合した第２プライマー
の配列をもちかつ第１プライマーに十分に相補的な配列
を含む。一重鎖ＤＮＡに第１プライマーをハイブリダイ
ズし、さらに第１プライマーに共有結合しかつ一重ｌＤ
ＮＡこ相補的なＤＮＡ配列を合成することによって、こ
の−重鎮ＤＮＡを転写機能をもつ二重鎖ＤＮＡに変換し
得る。
さらに別の例においては、化学的、熱的または任意に酵
素的方法を用いて二重鎖ＤＮＡ、二重鎖ＲＮＡまたはＤ
ＮＡ−ＲＮＡハイブリッドから一重鎖ＤＮＡまたはＲＮ
Ａ１型を得ることができる。次に、前述の鋳型核酸形成
手順のいずれかを用い、得られた一重鎖ＤＮＡまたはＲ
ＮＡから第１、第２または第３の鋳型として機能する鋳
型核酸を生成する。また、第１プライマー及び核酸の一
方の鎖が関与する手順と第２プライマー及び核酸の他方
の（相補）鎖が関与する別の手順とを同時に使用して鋳
型核酸を調製することも可能である。
素的方法を用いて二重鎖ＤＮＡ、二重鎖ＲＮＡまたはＤ
ＮＡ−ＲＮＡハイブリッドから一重鎖ＤＮＡまたはＲＮ
Ａ１型を得ることができる。次に、前述の鋳型核酸形成
手順のいずれかを用い、得られた一重鎖ＤＮＡまたはＲ
ＮＡから第１、第２または第３の鋳型として機能する鋳
型核酸を生成する。また、第１プライマー及び核酸の一
方の鎖が関与する手順と第２プライマー及び核酸の他方
の（相補）鎖が関与する別の手順とを同時に使用して鋳
型核酸を調製することも可能である。
＾ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３８０八ＤＮ
Δシンセサイザーを使用してオリゴヌクレオチドを合成
した。オリゴヌクレオチド合成に使用したカラム、ホス
フォラミジット（ｐｂｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ）
及び試薬はＴｅｃｈ−ｎｉｃａｌ Ｍａｒｋｅｔｉｎｇ
八５ｓｏｃｉａｔｅｓを介してΔｐｐｌｉｅｄ［１ｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ、 Ｉｎｃ、から入手しな。ポリアク
リルアミドゲル電気泳動及びＤＥＡＥセルロースクロマ
トグラフィーを顆次用いてオリゴヌクレオチドを精製し
た。放射性同位体［ａ −３２Ｐ］ＵＴＰ（８００Ｃｉ
／ｍｍｏｉ’）は八ｍｅｒｓｈａｍから入手した。ＤＮ
Ａを分解及び結合させる酵素はＮｅｕｈ Ｅｎｇｌａｎ
ｄ Ｂｉｏｌａｂｓから購入し製造業者の使用説明書道
りに使用した。ＤＮＡポリメラーゼ１（ＫＩｅｎｏｕ＋
）の大フラグメントを含む調製物もＮｅｗＥｎｇｌａｎ
ｄ Ｂｉｏｌａｂｓから購入した。ＲＮａｓｉｎ及びＴ
７ ＲＮＡポリメラーゼはＢｉｏ／Ｃａｎ ５ｃｉｅｎ
ｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ、を介してＰｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏ
ｔｅｃから購入した。逆転写酵素及びＲＮａｓｅ ＩＩ
はＰｈａｒｍａｃｉａから入手した。プロテイナーゼに
はＢｏｅｈｒｉｎＨｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃａｎａ
ｄａから入手した。すべての形質転換に大腸菌０８１０
１株（＾ＴＣＣ３３６９４）を使用した。プラスミドｐ
Ｕｃ１９（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ等、１９８３）はｌ１ｅ
ｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓから購入した。
Δシンセサイザーを使用してオリゴヌクレオチドを合成
した。オリゴヌクレオチド合成に使用したカラム、ホス
フォラミジット（ｐｂｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ）
及び試薬はＴｅｃｈ−ｎｉｃａｌ Ｍａｒｋｅｔｉｎｇ
八５ｓｏｃｉａｔｅｓを介してΔｐｐｌｉｅｄ［１ｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ、 Ｉｎｃ、から入手しな。ポリアク
リルアミドゲル電気泳動及びＤＥＡＥセルロースクロマ
トグラフィーを顆次用いてオリゴヌクレオチドを精製し
た。放射性同位体［ａ −３２Ｐ］ＵＴＰ（８００Ｃｉ
／ｍｍｏｉ’）は八ｍｅｒｓｈａｍから入手した。ＤＮ
Ａを分解及び結合させる酵素はＮｅｕｈ Ｅｎｇｌａｎ
ｄ Ｂｉｏｌａｂｓから購入し製造業者の使用説明書道
りに使用した。ＤＮＡポリメラーゼ１（ＫＩｅｎｏｕ＋
）の大フラグメントを含む調製物もＮｅｗＥｎｇｌａｎ
ｄ Ｂｉｏｌａｂｓから購入した。ＲＮａｓｉｎ及びＴ
７ ＲＮＡポリメラーゼはＢｉｏ／Ｃａｎ ５ｃｉｅｎ
ｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ、を介してＰｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏ
ｔｅｃから購入した。逆転写酵素及びＲＮａｓｅ ＩＩ
はＰｈａｒｍａｃｉａから入手した。プロテイナーゼに
はＢｏｅｈｒｉｎＨｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃａｎａ
ｄａから入手した。すべての形質転換に大腸菌０８１０
１株（＾ＴＣＣ３３６９４）を使用した。プラスミドｐ
Ｕｃ１９（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ等、１９８３）はｌ１ｅ
ｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓから購入した。
ＤＮへの単 び酊Ｂ
５０μｙ＃＋ｆのアンピシリンを含むＹＴ培地（Ｍｉｌ
ｌｅｒ、１９７２）で大腸菌形質転換体を増殖させた。
ｌｅｒ、１９７２）で大腸菌形質転換体を増殖させた。
高速沸騰法（Ｈｏｌｍｅｓ ＆ Ｑｕｉｇｌｅｙ、１９
８１）によってプラスミドＤＮＡを精製した。すべての
構築に使用したＤＮＡフラグメント及びベクターを低融
点アガロース電気泳動で分離し、フェノール抽出及びエ
タノール沈殿によって溶解アガロースから精製した（Ｍ
ａｎｉａ−ｔｉｓ等、１９８２）。ジデオキシ法（Ｓａ
ｎｇｅｒ等、１９７７）の修正方法（Ｈａｔｔｏｒｉ等
、１９８５）を用いてプラスミドＤＮＡを配列決定した
０反応開始のために一２０ユニバーサルプライマー（Ｎ
ｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用した。
８１）によってプラスミドＤＮＡを精製した。すべての
構築に使用したＤＮＡフラグメント及びベクターを低融
点アガロース電気泳動で分離し、フェノール抽出及びエ
タノール沈殿によって溶解アガロースから精製した（Ｍ
ａｎｉａ−ｔｉｓ等、１９８２）。ジデオキシ法（Ｓａ
ｎｇｅｒ等、１９７７）の修正方法（Ｈａｔｔｏｒｉ等
、１９８５）を用いてプラスミドＤＮＡを配列決定した
０反応開始のために一２０ユニバーサルプライマー（Ｎ
ｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用した。
ＴＣ＾沈殿
増幅反応のアリコート（５μＮ）をｚｏｌｌｇの１０ｍ
ＭのＥ［ｌＴ八へで制止し、一定時間おきのすべての標
本の収集が終わるまで氷上に維持した。次に制止された
標本をガラスフィルターディスクに塗布し、直ちに水冷
５％トリクロロ酢酸（ＴＣ＾）−１％のどロリン酸ナト
リウム中に浸し込み、１０分間ときどき攪拌した。
ＭのＥ［ｌＴ八へで制止し、一定時間おきのすべての標
本の収集が終わるまで氷上に維持した。次に制止された
標本をガラスフィルターディスクに塗布し、直ちに水冷
５％トリクロロ酢酸（ＴＣ＾）−１％のどロリン酸ナト
リウム中に浸し込み、１０分間ときどき攪拌した。
次に水冷５％ＴＣΔで５分間ずつ２回洗浄し、９５％エ
タノールで更に２回洗浄し、凍結によって乾固した。
タノールで更に２回洗浄し、凍結によって乾固した。
液体シンチレーションカウンターで放射活性を測定した
。
。
ポリアクリルアミドゲル 動
標本（１〜６μｌ）を４〜５μｌのホルムアミド染料（
９０％脱イオンホルムアミド、１０ｍＭのＴｒｉｓｌｌ
Ｃ４（ｐＨ８，ｏ＞、１ｍＨのＥＤＴ＾、キシレンシア
ツール及びブロモフェノールブルー）と混合し、電圧印
加前（ｐｒｅ−ｒｕｎ）の１２ｃｍ長さの７％変性ポリ
アクリルアミドゲルに塗布した。ブロモフェノールブル
ー染料が底部に到達するまでゲルに３５０ボルトを印加
した。いくつかの場合にはオートラジオグラフィーにか
Ｇ−）る前にゲルを固定しかつ乾燥した。固定は１０％
メタノール−７％酢酸中で１５分間洗浄して行った。こ
の方法で分離されたＲＮＡ産物のプロフィルはオートラ
ジオグラフィーによって室温で可視化した。
９０％脱イオンホルムアミド、１０ｍＭのＴｒｉｓｌｌ
Ｃ４（ｐＨ８，ｏ＞、１ｍＨのＥＤＴ＾、キシレンシア
ツール及びブロモフェノールブルー）と混合し、電圧印
加前（ｐｒｅ−ｒｕｎ）の１２ｃｍ長さの７％変性ポリ
アクリルアミドゲルに塗布した。ブロモフェノールブル
ー染料が底部に到達するまでゲルに３５０ボルトを印加
した。いくつかの場合にはオートラジオグラフィーにか
Ｇ−）る前にゲルを固定しかつ乾燥した。固定は１０％
メタノール−７％酢酸中で１５分間洗浄して行った。こ
の方法で分離されたＲＮＡ産物のプロフィルはオートラ
ジオグラフィーによって室温で可視化した。
１１剖」−
ａ−用オリゴヌクレオチドの：ＦＬ舌十 びムＥｃｏＲ
１部位と、Ｔ７フアージプロモーターと、Ｔ７ＲＮＡポ
リメラーゼによる転写開始に必要な配列と、１９ｂｐの
ハイブリダイゼーション領域（ハイブリダイゼーション
領域１）とを含むように合成ＤＮＡ配列を設計したく第
２八図）。これらの構成要素のクローニングに関与する
４７ｂのアンチセンスオリゴヌクレオチド３Ｍ （Ｔ７
１１１．ＧＡＧ）は第１プライマーとしても機能する。
１部位と、Ｔ７フアージプロモーターと、Ｔ７ＲＮＡポ
リメラーゼによる転写開始に必要な配列と、１９ｂｐの
ハイブリダイゼーション領域（ハイブリダイゼーション
領域１）とを含むように合成ＤＮＡ配列を設計したく第
２八図）。これらの構成要素のクローニングに関与する
４７ｂのアンチセンスオリゴヌクレオチド３Ｍ （Ｔ７
１１１．ＧＡＧ）は第１プライマーとしても機能する。
ハイブリダイゼーション領域２はハイブリダイゼーショ
ン領域１から５３ｂｐを隔てており長さ２◇ｂｐである
。この領域（Ｉ！２．ＧＡＧ）に対して形成されるプラ
イマーは２０ｂのセンスオリゴヌクレオチド頒の重複で
ありクローニングには使用されない。ハイブリダイゼー
ション領域全体を含む配列はエイズの原因物質であるＩ
ＩＴＬＶ−１１１ゲノムのｇａｇ部分の９２ｂ、のセグ
メンＩ・である。この特定遺伝子セグメントを選択した
理由は、プライマーが有効にハイブリダイズすると予想
されたこと及び２つのハイブリダイゼーション領域間の
間隔が比較的短いことにある。更に、クローニングを容
易にするために配列の末端にＸｂａ ｉ部位を配置した
。ｇａｇ試験配列はまた、組換え体のスクリーニングを
容易にするｓｐｈ ｉ部位及びｒ’ｓｔ １部位を含む
。
ン領域１から５３ｂｐを隔てており長さ２◇ｂｐである
。この領域（Ｉ！２．ＧＡＧ）に対して形成されるプラ
イマーは２０ｂのセンスオリゴヌクレオチド頒の重複で
ありクローニングには使用されない。ハイブリダイゼー
ション領域全体を含む配列はエイズの原因物質であるＩ
ＩＴＬＶ−１１１ゲノムのｇａｇ部分の９２ｂ、のセグ
メンＩ・である。この特定遺伝子セグメントを選択した
理由は、プライマーが有効にハイブリダイズすると予想
されたこと及び２つのハイブリダイゼーション領域間の
間隔が比較的短いことにある。更に、クローニングを容
易にするために配列の末端にＸｂａ ｉ部位を配置した
。ｇａｇ試験配列はまた、組換え体のスクリーニングを
容易にするｓｐｈ ｉ部位及びｒ’ｓｔ １部位を含む
。
このフラグメントのクローニングにおいては合計４つの
オリゴヌクレオチドを使用した。ｇａｇ試験配列及びｇ
ａｇ２試験配列の構築に使用したＮ１．ＧＡＧはアンチ
センス鎖を完成させクローニング過程でのみ使用される
。また、Ｔ７４．ＰＲＯはＴ７プロモーターのセンス頒
成分である。しかしながら、Ｎ２．ＧＡＧは双方の試験
フラグメントの構築に使用され、また増幅サイクルの２
つの段階の中間体（第２鋳型）として使用された。完全
にクローニングされたｇａｇ試験フラグメントはまた、
増幅サイクルの中間体（第３鋳型）を構成し得る。適当
なベクター中でクローニングされるとｇａｇ試験ＤＮＡ
はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによって転写され、３つの
段諧に関与する増幅中間体として有用なＲＮＡフラグメ
ント（第１鋳型）を産生する。更に、Ｔ７１１１．ＧＡ
Ｇ及びｌＩ２．ＧＡＧは試験系のプライマーとしても機
能する。
オリゴヌクレオチドを使用した。ｇａｇ試験配列及びｇ
ａｇ２試験配列の構築に使用したＮ１．ＧＡＧはアンチ
センス鎖を完成させクローニング過程でのみ使用される
。また、Ｔ７４．ＰＲＯはＴ７プロモーターのセンス頒
成分である。しかしながら、Ｎ２．ＧＡＧは双方の試験
フラグメントの構築に使用され、また増幅サイクルの２
つの段階の中間体（第２鋳型）として使用された。完全
にクローニングされたｇａｇ試験フラグメントはまた、
増幅サイクルの中間体（第３鋳型）を構成し得る。適当
なベクター中でクローニングされるとｇａｇ試験ＤＮＡ
はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによって転写され、３つの
段諧に関与する増幅中間体として有用なＲＮＡフラグメ
ント（第１鋳型）を産生する。更に、Ｔ７１１１．ＧＡ
Ｇ及びｌＩ２．ＧＡＧは試験系のプライマーとしても機
能する。
）（ａｇ２試験合成ＤＮＡフラグメント（第２Ｂ図）は
Ｔ７プロモーターを含まないが配列の残りの部分はｇａ
ｇ試験配列と同じであり、従ってＮ１．ＧＡＧ及びＮＺ
、ＣＡＧの双方がその構築に関与した。アンチセンス頷
の完成に必要なオリゴヌクレオチドをＩ＋ １ 、 Ｃ
ＡＧと指体する。−旦クローニングされると、ｇａｇ２
試験フラグメントはＤＮ＾制限フラグメントを鋳型核酸
として用いながら増幅を試験する鋳型として使用できる
。
Ｔ７プロモーターを含まないが配列の残りの部分はｇａ
ｇ試験配列と同じであり、従ってＮ１．ＧＡＧ及びＮＺ
、ＣＡＧの双方がその構築に関与した。アンチセンス頷
の完成に必要なオリゴヌクレオチドをＩ＋ １ 、 Ｃ
ＡＧと指体する。−旦クローニングされると、ｇａｇ２
試験フラグメントはＤＮ＾制限フラグメントを鋳型核酸
として用いながら増幅を試験する鋳型として使用できる
。
Ｘ片％Ｉ ２
ａ： プラスミドの 築
７０ｍＭのＴｒｉｓｔ１１ｊ！（ｐＨ７，６）と１０ｍ
ＭのＩｈｆＪ’２と５ｍＭのＤＴＴと０．５ｎ＋ＭのＡ
ＴＰと５単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼとを含む
２０μｌ反応物中でオリゴヌクレオチドＴ７４．ＰＲＯ
及びＮ１．ＧＡＧ（各２μ＋？）を別々に３７℃で３０
分間リン酸化した。リン酸１ヒしたＴ７４．ＰＲＯ及び
Ｎｌ 、囲Ｇ（各１０μｍ）を各１μｇの非リン酸化７
７＋１１．にへＧ及びＮＺ、ＧＡＧと３μｍの１００ｍ
ＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７，８）−５００ｍＭのＮａ
Ｃ１と混合しｇａｇ試験アセンブリ用の最終容量２９μ
ｌにした。
ＭのＩｈｆＪ’２と５ｍＭのＤＴＴと０．５ｎ＋ＭのＡ
ＴＰと５単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼとを含む
２０μｌ反応物中でオリゴヌクレオチドＴ７４．ＰＲＯ
及びＮ１．ＧＡＧ（各２μ＋？）を別々に３７℃で３０
分間リン酸化した。リン酸１ヒしたＴ７４．ＰＲＯ及び
Ｎｌ 、囲Ｇ（各１０μｍ）を各１μｇの非リン酸化７
７＋１１．にへＧ及びＮＺ、ＧＡＧと３μｍの１００ｍ
ＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７，８）−５００ｍＭのＮａ
Ｃ１と混合しｇａｇ試験アセンブリ用の最終容量２９μ
ｌにした。
ｇａｇ２試験混合物は１０μｌのリン酸化Ｎ１．ＧＡＧ
と各１μｇの非リン酸化１１１．ＧＡＧ及びＮ２．ＧＡ
Ｇと１．８μｐの１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐ１１
７．８）−５００ｍＭのＮａＣＮとを最終容量１８μｆ
中に含んでいた。 ９０℃で１０分間維持し１０〜１６
時間でゆっくりと室温まで放冷することによってオリゴ
ヌクレオチド混合物を別々にハイブリダイズさせた。ハ
イブリダイズしたオリゴ−ヌクレオチドをＲ古合するた
めに５０ ＋ｎ ＭのＴｒｉｓｌｌＣｌ（ｐＨ１７，８
）と１０ ｍ ＭのＭｇＣＮ２と２０ ＋ｎ ＭのＤＴ
Ｔと１１の八ＴＰと５０μｇ＃ｆのＢＳＡとをきむ６０
μｒの反応物を使用した。ｇａｇ試験反応物には４００
単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを添加し１５℃で２時間イ
ンキュベートした。ｇａｇ２試験反応物は２００単位の
Ｔ４ＤＮΔリガーゼと共に１４〜１６時間インキュベー
トした。
と各１μｇの非リン酸化１１１．ＧＡＧ及びＮ２．ＧＡ
Ｇと１．８μｐの１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐ１１
７．８）−５００ｍＭのＮａＣＮとを最終容量１８μｆ
中に含んでいた。 ９０℃で１０分間維持し１０〜１６
時間でゆっくりと室温まで放冷することによってオリゴ
ヌクレオチド混合物を別々にハイブリダイズさせた。ハ
イブリダイズしたオリゴ−ヌクレオチドをＲ古合するた
めに５０ ＋ｎ ＭのＴｒｉｓｌｌＣｌ（ｐＨ１７，８
）と１０ ｍ ＭのＭｇＣＮ２と２０ ＋ｎ ＭのＤＴ
Ｔと１１の八ＴＰと５０μｇ＃ｆのＢＳＡとをきむ６０
μｒの反応物を使用した。ｇａｇ試験反応物には４００
単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを添加し１５℃で２時間イ
ンキュベートした。ｇａｇ２試験反応物は２００単位の
Ｔ４ＤＮΔリガーゼと共に１４〜１６時間インキュベー
トした。
ポリリンカー領域内部の制限酵素部位で切断することに
よって直線化しておいたプラスミドｐＵｃ１９と車前し
精製した合成ＤＮＡ上セグメントを混合した。Ｔ４ Ｄ
ＮＡリガーゼを使用してｇａｇ試験配列をｐＵＣ１９の
ＥｃｏＲＩ −Ｘｂａ Ｉフラグメントに結合した。ま
たｇａｇ２試験配列をＳｍａ Ｉ −Ｘｂａ Ｉフラグ
メントに結合した。これらの反応後に得られた形質転換
体に由来のプラスミドＤＮ＾を使用して大腸菌を形質転
換し、制限分析によってスクリーニングし、配列解析に
よって最終プラスミド（ｐＧＣＡＧＴＥＳＴ及びｐｃ八
へＺ。
よって直線化しておいたプラスミドｐＵｃ１９と車前し
精製した合成ＤＮＡ上セグメントを混合した。Ｔ４ Ｄ
ＮＡリガーゼを使用してｇａｇ試験配列をｐＵＣ１９の
ＥｃｏＲＩ −Ｘｂａ Ｉフラグメントに結合した。ま
たｇａｇ２試験配列をＳｍａ Ｉ −Ｘｂａ Ｉフラグ
メントに結合した。これらの反応後に得られた形質転換
体に由来のプラスミドＤＮ＾を使用して大腸菌を形質転
換し、制限分析によってスクリーニングし、配列解析に
よって最終プラスミド（ｐＧＣＡＧＴＥＳＴ及びｐｃ八
へＺ。
ＴＥＳＴ）が正しいことを決定した。
ｇＦＬｇ試験オリゴヌクレオチドから転写されたＲＮ八
を増幅するために使用された反応混合物（２５μｌ）は
５０ｍＭのＴｒｉｓ１１Ｃｊｌ’（ｐＨ８，４５）と６
ｍＭのＨｇＣｈと４０ｍＭのＫＣＮと１０＋ｎＭのジチ
オスレイトールと０．５ｍＭのＮＴＰ （ＡＴＰ。
を増幅するために使用された反応混合物（２５μｌ）は
５０ｍＭのＴｒｉｓ１１Ｃｊｌ’（ｐＨ８，４５）と６
ｍＭのＨｇＣｈと４０ｍＭのＫＣＮと１０＋ｎＭのジチ
オスレイトールと０．５ｍＭのＮＴＰ （ＡＴＰ。
ＣＴＰ、ＧＴＩ’、ＵＴＰ）と１ｍＭのｄＮＴＰ（ｄＡ
ＴＩ’、ｄＣＴＰ ；ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）と２０単位
のＲＮａｓｉｎと１０単位のＴ７ ＲＮ八へリメラーゼ
と１０単位の逆転写酵素と０．４単位のＲＮａｓｅ Ｔ
（と１０μＣｉの［α−３２Ｐ］υＴＰとをき有してい
た。２つの反応物は０．５ｎｆＨ０，Ｏ１５ｐｍｏｌｅ
ｓ）のＮ２．ＣＡＧを含み、−万能の２つの反応物は鋳
型を含んでいなかった。プライマーＴ７１１１．ＧＡＧ
及び１１２．ＧＡＧの各々を最終濃度３．４μＨまたは
０．３４μＮでＮＺ、ＧＡＧ含有または鋳型非含有の反
応物に添加した。反応物を４２°Ｃで２時間インキュベ
ートした。３０分毎にＴＣ＾不溶ｃｐｍの取込みを測定
することによってＲＮ八へ合成量をモニタした。鋳型依
存性ＲＮ八へ成に対するプライマー濃度の影響を表Ｉに
示す。等量の合成ＲＮ八を含有する各反応のアリコート
をＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィーによって分析し
たく第３図、反応と同じ番号のレーン１〜４）。
ＴＩ’、ｄＣＴＰ ；ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）と２０単位
のＲＮａｓｉｎと１０単位のＴ７ ＲＮ八へリメラーゼ
と１０単位の逆転写酵素と０．４単位のＲＮａｓｅ Ｔ
（と１０μＣｉの［α−３２Ｐ］υＴＰとをき有してい
た。２つの反応物は０．５ｎｆＨ０，Ｏ１５ｐｍｏｌｅ
ｓ）のＮ２．ＣＡＧを含み、−万能の２つの反応物は鋳
型を含んでいなかった。プライマーＴ７１１１．ＧＡＧ
及び１１２．ＧＡＧの各々を最終濃度３．４μＨまたは
０．３４μＮでＮＺ、ＧＡＧ含有または鋳型非含有の反
応物に添加した。反応物を４２°Ｃで２時間インキュベ
ートした。３０分毎にＴＣ＾不溶ｃｐｍの取込みを測定
することによってＲＮ八へ合成量をモニタした。鋳型依
存性ＲＮ八へ成に対するプライマー濃度の影響を表Ｉに
示す。等量の合成ＲＮ八を含有する各反応のアリコート
をＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィーによって分析し
たく第３図、反応と同じ番号のレーン１〜４）。
前二Ｌ
１ ３．４ ０．５
２．８２ ３．４
２．１３ ０．３４
０．５ １．８４
０．３４ ０
．７反応１は最大量の同位体取込みを示したが、対照鋳
型である反応２も高い取込み率（反応１の７３％）を示
し、極めて類似した電気泳動プロフィルを示した。従っ
て、高濃度プライマー存在中の増幅においては鋳型が全
く存在しなくても、予想されたサイズと等しいサイズの
ＲＮＡ転写物が産生される。１／１０のプライマー濃度
の標本を使用して得られた結果はｍ著な違いを示した。
２．８２ ３．４
２．１３ ０．３４
０．５ １．８４
０．３４ ０
．７反応１は最大量の同位体取込みを示したが、対照鋳
型である反応２も高い取込み率（反応１の７３％）を示
し、極めて類似した電気泳動プロフィルを示した。従っ
て、高濃度プライマー存在中の増幅においては鋳型が全
く存在しなくても、予想されたサイズと等しいサイズの
ＲＮＡ転写物が産生される。１／１０のプライマー濃度
の標本を使用して得られた結果はｍ著な違いを示した。
反応３で産生されたＲＮＡの量は反応４の２．６倍であ
るが、反応３においては実質的に全部の転写物が予想さ
れたサイズの単一バンド中に検出され、反応４において
は６０〜７０ｂを上回るフラグメントは検出されなかっ
た。従ってプライマー濃度はＲＮ八へ幅の正確度及び効
率に重要な役割を果たす。
るが、反応３においては実質的に全部の転写物が予想さ
れたサイズの単一バンド中に検出され、反応４において
は６０〜７０ｂを上回るフラグメントは検出されなかっ
た。従ってプライマー濃度はＲＮ八へ幅の正確度及び効
率に重要な役割を果たす。
増幅系による産生が予想されるフラグメンＩ・のサイズ
を示すために試験プラスミドからの転写によって対照Ｒ
ＮＡ転写物を調製した（第３図のレーンＯ）。ｐＧＡＧ
、ＴＥＳＴをＸｂａ Ｉで切断して直線化し、プロテイ
ナーゼにで処理しくＭａｎｉａｔｉｓ等、１９８２）、
フェノール抽出し、エタノール沈殿した。次にＴ７ Ｒ
ＮＡポリメラーゼを製造業者の使用説明書道りに使用し
、０．５μｇの得られたフラグメンＩ・を１０，１ｌｃ
ｉ［α−３２Ｐ］ＵＴＰを含有する２５μ４の反応混合
物中で転写した。
を示すために試験プラスミドからの転写によって対照Ｒ
ＮＡ転写物を調製した（第３図のレーンＯ）。ｐＧＡＧ
、ＴＥＳＴをＸｂａ Ｉで切断して直線化し、プロテイ
ナーゼにで処理しくＭａｎｉａｔｉｓ等、１９８２）、
フェノール抽出し、エタノール沈殿した。次にＴ７ Ｒ
ＮＡポリメラーゼを製造業者の使用説明書道りに使用し
、０．５μｇの得られたフラグメンＩ・を１０，１ｌｃ
ｉ［α−３２Ｐ］ＵＴＰを含有する２５μ４の反応混合
物中で転写した。
ｇａｇ試験オリゴヌクレオチドから転写されたＲＮ八を
増幅するために使用された５０μｌの標準反応混合物は
、０．３４μＭのＴ７）１１．ＧＡＧと０．３４μＭの
ｌＩ２．ＧＡＧと５０ｍＭのＴｒｉｓｌＩＣｌ（ｐＨ８
，４５）と６ｍＭのＨｇＣｌ２と４０ｍＭのＫＣｔ’と
１０ｍＭのＤＴＴと０．５ｍＭのＮＴＰと１ｍＭのｄＮ
ＴＰと４０単位のＲＮａｓｉｎと２０単位のＴ７ ＲＮ
Ａポリメラーゼと２０単位の逆転写酵素と０．８単位の
ＲＮａｓｅ Ｈと１０−２０μＣｉ［α−３２Ｐ］ＵＴ
Ｐとを含有し、ｌｎｇから１１ｇの範囲の種々の量の鋳
型（Ｎ２．ＧＡＧ）を含有し、１つの反応は鋳型を含有
しない。反応を４２℃で３時間インキュベートし、イン
キュベーションの開始から３０分毎にＴＣＡ不溶ｅｐｍ
の取込みを測定することによってＲＮＡ総合総合全量ニ
タした。表Ｈに示すように、ＲＮ八へ合成量は鋳型のす
べての被検濃度において鋳型非・３有の対照より多い。
増幅するために使用された５０μｌの標準反応混合物は
、０．３４μＭのＴ７）１１．ＧＡＧと０．３４μＭの
ｌＩ２．ＧＡＧと５０ｍＭのＴｒｉｓｌＩＣｌ（ｐＨ８
，４５）と６ｍＭのＨｇＣｌ２と４０ｍＭのＫＣｔ’と
１０ｍＭのＤＴＴと０．５ｍＭのＮＴＰと１ｍＭのｄＮ
ＴＰと４０単位のＲＮａｓｉｎと２０単位のＴ７ ＲＮ
Ａポリメラーゼと２０単位の逆転写酵素と０．８単位の
ＲＮａｓｅ Ｈと１０−２０μＣｉ［α−３２Ｐ］ＵＴ
Ｐとを含有し、ｌｎｇから１１ｇの範囲の種々の量の鋳
型（Ｎ２．ＧＡＧ）を含有し、１つの反応は鋳型を含有
しない。反応を４２℃で３時間インキュベートし、イン
キュベーションの開始から３０分毎にＴＣＡ不溶ｅｐｍ
の取込みを測定することによってＲＮＡ総合総合全量ニ
タした。表Ｈに示すように、ＲＮ八へ合成量は鋳型のす
べての被検濃度において鋳型非・３有の対照より多い。
ＲＮＡ総合成呈は鋳型濃度の低下に伴って減少する。こ
の減少は定量的ではない。出発鋳型当たりのＲＮＡの増
幅度は一般に、鋳型濃度が低いほど大きい。１ｆｇのＮ
Ｚ、ＧＡＧ鋳型から０．８μｇのＲＮ八が合成されると
８Ｘ１０”倍の増幅度が得られたことになる。ｔｒｇの
１０２−ｂ Ｎ２．ＧへＧオリゴヌクレオチドは約２ｘ
１０’分子を示す。
の減少は定量的ではない。出発鋳型当たりのＲＮＡの増
幅度は一般に、鋳型濃度が低いほど大きい。１ｆｇのＮ
Ｚ、ＧＡＧ鋳型から０．８μｇのＲＮ八が合成されると
８Ｘ１０”倍の増幅度が得られたことになる。ｔｒｇの
１０２−ｂ Ｎ２．ＧへＧオリゴヌクレオチドは約２ｘ
１０’分子を示す。
宍」し
１ Ｌｏｇ ３．５ ３．５
×１０３２ １００ｐｌＦ ４．４
４．４×１０’３ １０ｐｆＩ
４．１ ４．１×１０５４ １ｐｙ
３．０ ３．０×１０’５ １
１００ｆ ２．７ ２．７×１０’６
１０ｈ １．９ １．９×
１０”７ ｔｒ！？ ０．７８
７．８×１０８８ − ０．０
４６反応３時間後に合成されたＲＮＡを各鋳型濃度毎に
ＰＡＧＥで分析した（第４図、反応と同じ番号のレーン
１〜８）、約１００ｂのＲＮＡを示す主要バンドが鋳型
１ｆｇ含有及び鋳型非含有の反応を除く全ての反応に存
在していた。１ｆｇの鋳型を含有する反応では３時間後
に１００ｂの産生物を多量に倉んでいなかったが、ＲＮ
Ａ総合総合全量型非含有反応より多く定性的な違いを示
した。
×１０３２ １００ｐｌＦ ４．４
４．４×１０’３ １０ｐｆＩ
４．１ ４．１×１０５４ １ｐｙ
３．０ ３．０×１０’５ １
１００ｆ ２．７ ２．７×１０’６
１０ｈ １．９ １．９×
１０”７ ｔｒ！？ ０．７８
７．８×１０８８ − ０．０
４６反応３時間後に合成されたＲＮＡを各鋳型濃度毎に
ＰＡＧＥで分析した（第４図、反応と同じ番号のレーン
１〜８）、約１００ｂのＲＮＡを示す主要バンドが鋳型
１ｆｇ含有及び鋳型非含有の反応を除く全ての反応に存
在していた。１ｆｇの鋳型を含有する反応では３時間後
に１００ｂの産生物を多量に倉んでいなかったが、ＲＮ
Ａ総合総合全量型非含有反応より多く定性的な違いを示
した。
実施例４の手順の放射性標識ＵＴＰだけを削除してｌｐ
ｇ〜ｏ、ｔｒｌ？の範囲の種々の星のＮ２．ＧＡＧ鋳型
を含有する増幅反応を行なった。反応を４２℃で３時間
インキュベートした。３０分毎に各反応からアリコート
を採取しナイロン膜（八ｍｅｒｓｂａｍ）に塗布した。
ｇ〜ｏ、ｔｒｌ？の範囲の種々の星のＮ２．ＧＡＧ鋳型
を含有する増幅反応を行なった。反応を４２℃で３時間
インキュベートした。３０分毎に各反応からアリコート
を採取しナイロン膜（八ｍｅｒｓｂａｍ）に塗布した。
これらの反応アリコートに含まれていた核酸を紫外線照
射によって固定した。最終イ虚度５０％ｖ／ｖのホルム
アミドと５ｘＳＳＣと５ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液（Ｍ
ａｎｉａ−ｔｉｓ等、１９８２；５ｏｕｔｌ＋ｅｒｎ等
、１９７５）とから成り１００ｃｍ２当たり５ｚｎに等
しい量のブレハイブリダイゼーション緩衝液中で膜を５
０℃で１時間プレハイブリダイズし、さらに比活性１０
’ｃｐｍ／ｚｉ！の放射性標識プローブのハイブリダイ
ゼーション溶液を用いてハイブリダイズした。５０％の
ホルムアミド、５ＸＳＳＣ及び５ Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄ
ｔ溶液（Ｍａｎｉａｔｉｓ等、１９８２；５ｏｕｔｈｅ
ｒｎ等、１９７５）中でハイブリダイゼーションを５０
℃で１６時間行なった。放射性標識プローブは、Ｔ４ポ
リヌクレオチドキナーゼと（α−３２Ｐ）＾ＴＰとを用
いて５°末端を標識した合成オリゴヌクレオチド５°Ｇ
ＡＴＣＴＧＧ（：ＡＴＡＧＡＧＴ八ＣΔＴＣＣへ３′で
あっへ０次に、２ＸＳＳＣと０゜１％ｖ／ｖ ＳＤＳ及
び０．２ＸＳＳＣと０．１％ｖ／ｖ ＳＤＳから成る洗
浄液を用い（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ等、１９〕５；Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ等、１９８２；５ｚｏｓｔａｋ等、１９７９）
、５０℃で最低２．３回以上は連続して膜を洗浄した。
射によって固定した。最終イ虚度５０％ｖ／ｖのホルム
アミドと５ｘＳＳＣと５ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液（Ｍ
ａｎｉａ−ｔｉｓ等、１９８２；５ｏｕｔｌ＋ｅｒｎ等
、１９７５）とから成り１００ｃｍ２当たり５ｚｎに等
しい量のブレハイブリダイゼーション緩衝液中で膜を５
０℃で１時間プレハイブリダイズし、さらに比活性１０
’ｃｐｍ／ｚｉ！の放射性標識プローブのハイブリダイ
ゼーション溶液を用いてハイブリダイズした。５０％の
ホルムアミド、５ＸＳＳＣ及び５ Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄ
ｔ溶液（Ｍａｎｉａｔｉｓ等、１９８２；５ｏｕｔｈｅ
ｒｎ等、１９７５）中でハイブリダイゼーションを５０
℃で１６時間行なった。放射性標識プローブは、Ｔ４ポ
リヌクレオチドキナーゼと（α−３２Ｐ）＾ＴＰとを用
いて５°末端を標識した合成オリゴヌクレオチド５°Ｇ
ＡＴＣＴＧＧ（：ＡＴＡＧＡＧＴ八ＣΔＴＣＣへ３′で
あっへ０次に、２ＸＳＳＣと０゜１％ｖ／ｖ ＳＤＳ及
び０．２ＸＳＳＣと０．１％ｖ／ｖ ＳＤＳから成る洗
浄液を用い（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ等、１９〕５；Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ等、１９８２；５ｚｏｓｔａｋ等、１９７９）
、５０℃で最低２．３回以上は連続して膜を洗浄した。
第５図は異なるインキュベーション時間で採取された種
々の量の８２．ＧＡＧｌ型を含有する増幅反応で行った
ハイブリダイゼーション分析の結果を示す。
々の量の８２．ＧＡＧｌ型を含有する増幅反応で行った
ハイブリダイゼーション分析の結果を示す。
第５図の縦の列の各々は異なる時点を示しく１は３０分
、２は６０分、３は９０分、４は１２０分、５は１５０
分、６は１８０分）、横の行の各々はＮ２．ＧへＧ鋳型
の種々の添加量を示す（１は１ｐＦＩ、２は１００ｆ、
、３は１０℃ｇ、４は１ｒｇ、５は０．１ｈ、６は鋳型
非添加）。行１〜３ （ｌｐＦＩ〜１０ｆｙ）において
は標識プローブにハイブリダイズした核酸の増幅が観察
されたが、行４及び５ （ｔｒｙ及びｏ、ｉｒｇ）にお
いては特定核酸に対するハイブリダイゼーションは行６
（鋳型非含有）より盛んではなかった。行６の標識プロ
ーブの見掛けの非特異的結合はＤＮＡまたはＲＮＡ合成
と関連すると推定される。その理由はハイブリダイゼー
ションシグナルが経時的に増加するからである。
、２は６０分、３は９０分、４は１２０分、５は１５０
分、６は１８０分）、横の行の各々はＮ２．ＧへＧ鋳型
の種々の添加量を示す（１は１ｐＦＩ、２は１００ｆ、
、３は１０℃ｇ、４は１ｒｇ、５は０．１ｈ、６は鋳型
非添加）。行１〜３ （ｌｐＦＩ〜１０ｆｙ）において
は標識プローブにハイブリダイズした核酸の増幅が観察
されたが、行４及び５ （ｔｒｙ及びｏ、ｉｒｇ）にお
いては特定核酸に対するハイブリダイゼーションは行６
（鋳型非含有）より盛んではなかった。行６の標識プロ
ーブの見掛けの非特異的結合はＤＮＡまたはＲＮＡ合成
と関連すると推定される。その理由はハイブリダイゼー
ションシグナルが経時的に増加するからである。
実施例６
鋳型としてのＤＮＡ制限フラグメントの使用プラスミド
ｐ（：八Ｇ２．ＴＥＳＴをＭｓｐ ｌで切断し、プロテ
イナーゼにで処理し、フェノール抽出及びエタノール沈
殿によって精製し、５分間沸騰させて変性した。Ｎ２．
ＧＡＧオリゴヌクレオチドの代わりにＭｓｐ １分解し
゛たｐＧＡＧ２．ＴＥｓＴを鋳型として使用する以外は
実施例４と同じ手順で増幅反応を行い分析した。各反応
に対するプラスミドの添加量は５５ｎ２〜５．５ｐｇの
範囲であり、１つの反応には鋳型を添加しなかった。実
際の標本中に存在するはずの付加的ＤＮＡをシミュレー
トするために、同様に切断し精製し変性した１ｎ１Ｆの
子ウシ胸腺ＤＮ＾を含む別の反応も用意した。４２℃で
３時間インキュベーション後にＴＣΔ沈殿及びｒ’ＡＧ
Ｅ分析によってＲＮ八へ成を測定した。表■に示すよう
に、鋳型のすべての試験濃度でＲＮＡ総合成量は鋳型非
含有対照よりも多かった。実際の鋳型からのＲＮ八へ成
が総プラスミドＤＮＡの１．８％に相当することに基づ
いて増幅度を計算した。
ｐ（：八Ｇ２．ＴＥＳＴをＭｓｐ ｌで切断し、プロテ
イナーゼにで処理し、フェノール抽出及びエタノール沈
殿によって精製し、５分間沸騰させて変性した。Ｎ２．
ＧＡＧオリゴヌクレオチドの代わりにＭｓｐ １分解し
゛たｐＧＡＧ２．ＴＥｓＴを鋳型として使用する以外は
実施例４と同じ手順で増幅反応を行い分析した。各反応
に対するプラスミドの添加量は５５ｎ２〜５．５ｐｇの
範囲であり、１つの反応には鋳型を添加しなかった。実
際の標本中に存在するはずの付加的ＤＮＡをシミュレー
トするために、同様に切断し精製し変性した１ｎ１Ｆの
子ウシ胸腺ＤＮ＾を含む別の反応も用意した。４２℃で
３時間インキュベーション後にＴＣΔ沈殿及びｒ’ＡＧ
Ｅ分析によってＲＮ八へ成を測定した。表■に示すよう
に、鋳型のすべての試験濃度でＲＮＡ総合成量は鋳型非
含有対照よりも多かった。実際の鋳型からのＲＮ八へ成
が総プラスミドＤＮＡの１．８％に相当することに基づ
いて増幅度を計算した。
特定の初期鋳型濃度レベルからのＲＮＡ総合成量（増幅
度）は、合成オリゴヌクレオチド鋳型（表■）に比較し
て制限フラグメンｌ−（表■）が常に低い値を示した。
度）は、合成オリゴヌクレオチド鋳型（表■）に比較し
て制限フラグメンｌ−（表■）が常に低い値を示した。
この理由は、使用条件下において制限フラグメントの相
補鎖との競合が生じるためであろう。
補鎖との競合が生じるためであろう。
宍」し
１ ５５．Ｏｎｙ［ｌｎｇ］ ３．６５２
（４，０５）３ ５
．５ｎｇ［１１００ｐ］ ３．５４４
（３，１６）５ ５５０、Ｏ
ｐｙ［１０ｐｙ］ ２．２９６
（２，７９）７ ５５、Ｏｎｙ［１
ｐｌＦ］ ２．６２８
（０，６７）９ ５．５ｐＦＩ［１００ｆ
ｙ］ １．３７１０
（２，２６）１１
１．２５１２
（０，０８）本カギ括弧内の数値はＮ２．ＧＡＧ均等量
を示す。
（４，０５）３ ５
．５ｎｇ［１１００ｐ］ ３．５４４
（３，１６）５ ５５０、Ｏ
ｐｙ［１０ｐｙ］ ２．２９６
（２，７９）７ ５５、Ｏｎｙ［１
ｐｌＦ］ ２．６２８
（０，６７）９ ５．５ｐＦＩ［１００ｆ
ｙ］ １．３７１０
（２，２６）１１
１．２５１２
（０，０８）本カギ括弧内の数値はＮ２．ＧＡＧ均等量
を示す。
■括弧内の数値は１μｇのＭｓｐ ■−分解子ウつ胸腺
ＤＮ＾の存在下のＲＮＡ合成を示す。
ＤＮ＾の存在下のＲＮＡ合成を示す。
３．７Ｘ１０’
（４，１×１０３）
３．５Ｘ１０’
（３，２Ｘ１０４）
２．３・１０５
（２，８Ｘ１０５）
２．６×１０’
（０，７Ｘ１０６）
１．４×１０’
（２，３Ｘ１０’）
３峙間反応後に合成されたＩＩＮ八をＰＡＧＥで分析し
たく第６図、反応と同じ番号のレーン１〜６．１１及び
１２）。反応（レーン）１〜６には約１００ｂのＲＮＡ
を示す主要バンドが存在していたが鋳型非含有反応（レ
ーン１１及び１２）には該バンドが存在していなかった
。レーン０のＲＮＡは実施例３の手順で調製した標準Ｒ
ＮＡである。１μｇのＭｓｐ ｌ−分解子ウシ胸腺ＤＮ
＾を添加した合成ＲＮＡ（レーン２．４及び６）または
非添加合成ＲＮ屓レーン１．３及び５）との間に見掛け
の定性的差異はなかった。
たく第６図、反応と同じ番号のレーン１〜６．１１及び
１２）。反応（レーン）１〜６には約１００ｂのＲＮＡ
を示す主要バンドが存在していたが鋳型非含有反応（レ
ーン１１及び１２）には該バンドが存在していなかった
。レーン０のＲＮＡは実施例３の手順で調製した標準Ｒ
ＮＡである。１μｇのＭｓｐ ｌ−分解子ウシ胸腺ＤＮ
＾を添加した合成ＲＮＡ（レーン２．４及び６）または
非添加合成ＲＮ屓レーン１．３及び５）との間に見掛け
の定性的差異はなかった。
プラスミドｐＧＡＧ、ＴＥｓＴをＸｂａ Ｉで切断し、
プロテイナーゼにで処理し、フェノール抽出及びエタノ
ール沈殿によって精製した。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
を用いて直線化したｐＧＡＧ、ＴＥＳＴプラスミドから
Ｎ２゜ＧＡＧに相補的な配列のＲＮＡを転写した。得ら
れたＲＮＡをＤＮａｓｅ（Ｐｒｏ Ｍｅｇａ ＢｉｏＴ
ｅｃ）で分解し、フェノール抽出及びエタノール沈殿に
よって精製した。実施例５の手順に従って精製ＲＮＡを
増幅反応の鋳型として使用した。夫々の反応には５５１
ｇ〜５．５ｐｇの範囲の種々の量のＲＮＡを添加しまた
１つの反応には鋳型を添加しなかった。４２℃で３時間
インキュベーション後、実施例５の手順に従って標識オ
リゴヌクレオチドプローブに対するハイブリダイゼーシ
ョンによって特定ＲＮＡの合成を判定した。
プロテイナーゼにで処理し、フェノール抽出及びエタノ
ール沈殿によって精製した。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
を用いて直線化したｐＧＡＧ、ＴＥＳＴプラスミドから
Ｎ２゜ＧＡＧに相補的な配列のＲＮＡを転写した。得ら
れたＲＮＡをＤＮａｓｅ（Ｐｒｏ Ｍｅｇａ ＢｉｏＴ
ｅｃ）で分解し、フェノール抽出及びエタノール沈殿に
よって精製した。実施例５の手順に従って精製ＲＮＡを
増幅反応の鋳型として使用した。夫々の反応には５５１
ｇ〜５．５ｐｇの範囲の種々の量のＲＮＡを添加しまた
１つの反応には鋳型を添加しなかった。４２℃で３時間
インキュベーション後、実施例５の手順に従って標識オ
リゴヌクレオチドプローブに対するハイブリダイゼーシ
ョンによって特定ＲＮＡの合成を判定した。
大腸菌１６ＳリポソームＲＮＡ（ｒＲＮ八）の一部に相
補的なＲＮＡ配列を増幅するために２つのプライマーを
使用した。一方のプライマーエフ１ＩＩＲＩＢ３．ＰＲ
２（ＡＡＴＴＣ、１ Ｔ＾＾ＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ（：ＧＧＡＧＴＡ
ＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧ）は、Ｔ７プロモータ
ーのアンチセンス鎮と開始部位と１６Ｓ ｒＲＮ八に相
補的な配列とを含む。他方のプライマーＲＩＢ８．ＰＲ
（＾＾ＴＡＣＣＴＴＴＧＣＴＣ“八ＴＴＧＡＣＧ）はプ
ライマーとしテＴ７ＨＩＲＩＢ３．ＰＲ２を使用し鋳型
とし”ｌ（１６ＳｒＲＮＡを使用して合成されたＤＮＡ
に相補的である。
補的なＲＮＡ配列を増幅するために２つのプライマーを
使用した。一方のプライマーエフ１ＩＩＲＩＢ３．ＰＲ
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ＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧ）は、Ｔ７プロモータ
ーのアンチセンス鎮と開始部位と１６Ｓ ｒＲＮ八に相
補的な配列とを含む。他方のプライマーＲＩＢ８．ＰＲ
（＾＾ＴＡＣＣＴＴＴＧＣＴＣ“八ＴＴＧＡＣＧ）はプ
ライマーとしテＴ７ＨＩＲＩＢ３．ＰＲ２を使用し鋳型
とし”ｌ（１６ＳｒＲＮＡを使用して合成されたＤＮＡ
に相補的である。
増幅の検出に使用できる第３の合成オリゴヌクレ、！”
チトＲＩＢ５．ＰＲ（ＡＧＡＡにＣＡＣＣＧＧＣＴ＾
＾Ｃ）は増幅反応のＲＮＡ産物に相補的である。該ＲＮ
Ａ産物は出発ｒＲＮＡＲＮＡ相補的である。
チトＲＩＢ５．ＰＲ（ＡＧＡＡにＣＡＣＣＧＧＣＴ＾
＾Ｃ）は増幅反応のＲＮＡ産物に相補的である。該ＲＮ
Ａ産物は出発ｒＲＮＡＲＮＡ相補的である。
反応混合物（２５μＮ）は、５０１ＩＩＭのＴｒｉｓＨ
（Ｊ’（ｐＨ８，４５）と６ｍＭのＭｇｅｔ’２と４０
ｍＭのＫＣｌと１Ｏｎ＋ＭのＤＴＴと０．５ｍＭのＮＴ
ｒ’と１ｍＭのｄＮＴＰと２０単位のＲＮａｓｉｎと１
０単位のＴ７ＲＮＡポリメラーゼと１０単位のＡＭＶ逆
転写酵素と０．４単位のＲＮａｓｅ Ｈと０．３４μＭ
のＴ７ＨＩＲＩＢ３．ＰＲ２と０．３４μＭのＲＩＢＢ
、ＰＲとを含有−する。
（Ｊ’（ｐＨ８，４５）と６ｍＭのＭｇｅｔ’２と４０
ｍＭのＫＣｌと１Ｏｎ＋ＭのＤＴＴと０．５ｍＭのＮＴ
ｒ’と１ｍＭのｄＮＴＰと２０単位のＲＮａｓｉｎと１
０単位のＴ７ＲＮＡポリメラーゼと１０単位のＡＭＶ逆
転写酵素と０．４単位のＲＮａｓｅ Ｈと０．３４μＭ
のＴ７ＨＩＲＩＢ３．ＰＲ２と０．３４μＭのＲＩＢＢ
、ＰＲとを含有−する。
５０ｎｙ〜５０ｆ、の範囲の種々の１の大賜菌ｒＲＮへ
を反応物に添加する。１つの反応にはｒＲＮ八を添加し
ない０反応物を４２℃で３時間インキュベートし、イン
キュベーション開始の３０分、６０分、１２０分及び１
ωＪ ８０分後にアリコートを採取する。アリコート反応を制
止し、ナイロン膜に固定し、実施例５の手順で３２ｐで
５゛末端を標識したＲＩＢ５．ＰＲプローブにハイブリ
ダイズする。
を反応物に添加する。１つの反応にはｒＲＮ八を添加し
ない０反応物を４２℃で３時間インキュベートし、イン
キュベーション開始の３０分、６０分、１２０分及び１
ωＪ ８０分後にアリコートを採取する。アリコート反応を制
止し、ナイロン膜に固定し、実施例５の手順で３２ｐで
５゛末端を標識したＲＩＢ５．ＰＲプローブにハイブリ
ダイズする。
２つのプライマーを使用して大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡの
一部に相同のＲＮΔ配列を増幅する。一方のプライマー
ＲＩＢ１２．ＰＲ（ＴＴ八へＴＣＡＣＣＣＧＴＣＣＧＣ
Ｃ）は１６Ｓ ｒＲＮＡに相補的である。他方のプライ
マー７７）１１１’１ｌ１３５．ＰＲ（＾＾ＴＴＣＴΔ
＾Ｔ八ＣＧＡＣＴＣ八へＴ八ＴＡＧＧへ八Ｇへ八八ＴＴ
Ｇへ八へへへＴＴＴへへＴへΔＴ）は、へライマーとし
てＲＩＩｌ１１２．！’Ｒを使用し鋳型として１６Ｓ
ｒＲＮＡを使用して合成されたＤＮＡの３′末端に相補
的である。増幅の検出に使用できる第３の合成オリゴヌ
クレオチドＲＩＢ１１．ＰＲ（ＧＴＴＣＧＡＣＴＴＧＣ
ＡＴＧＴＧＴＴ八ＧＧＣＣＴＧＣＣＧＣＣＡＧＣ（：へ
ＴＣ＾＾ＴＣＴＧＡＧＣＣ）は増幅ＲＮ八へ物及び出発
ｒＲＮＡ鋳型の双方に相補的である。
一部に相同のＲＮΔ配列を増幅する。一方のプライマー
ＲＩＢ１２．ＰＲ（ＴＴ八へＴＣＡＣＣＣＧＴＣＣＧＣ
Ｃ）は１６Ｓ ｒＲＮＡに相補的である。他方のプライ
マー７７）１１１’１ｌ１３５．ＰＲ（＾＾ＴＴＣＴΔ
＾Ｔ八ＣＧＡＣＴＣ八へＴ八ＴＡＧＧへ八Ｇへ八八ＴＴ
Ｇへ八へへへＴＴＴへへＴへΔＴ）は、へライマーとし
てＲＩＩｌ１１２．！’Ｒを使用し鋳型として１６Ｓ
ｒＲＮＡを使用して合成されたＤＮＡの３′末端に相補
的である。増幅の検出に使用できる第３の合成オリゴヌ
クレオチドＲＩＢ１１．ＰＲ（ＧＴＴＣＧＡＣＴＴＧＣ
ＡＴＧＴＧＴＴ八ＧＧＣＣＴＧＣＣＧＣＣＡＧＣ（：へ
ＴＣ＾＾ＴＣＴＧＡＧＣＣ）は増幅ＲＮ八へ物及び出発
ｒＲＮＡ鋳型の双方に相補的である。
（Ｔ７１１１ＲＩＢ３．ＰＲ２及びＲＩＢ８．ＰＲの代
わりに）７７ＨＩＲＩＢ５゜ＰＲ及びＲＩＢ１２．ＰＲ
をプライマーとして使用し、（ＲＩＢ５、ｒ’Ｈの代わ
りに）ＲＩ１３１１．ＰＲをオリゴヌクレオチドプロー
ブとして使用する以外は実施例８と同様にしてｒＲＮへ
の増幅反応と合成ＲＮＡの検出とを行なう。
わりに）７７ＨＩＲＩＢ５゜ＰＲ及びＲＩＢ１２．ＰＲ
をプライマーとして使用し、（ＲＩＢ５、ｒ’Ｈの代わ
りに）ＲＩ１３１１．ＰＲをオリゴヌクレオチドプロー
ブとして使用する以外は実施例８と同様にしてｒＲＮへ
の増幅反応と合成ＲＮＡの検出とを行なう。
上記では本発明を好適実施態様に基づいて詳細に説明し
たが、本発明の要旨及び特許請求の範囲に包含される多
様な変更が可能であることは当業者に明らかであろう。
たが、本発明の要旨及び特許請求の範囲に包含される多
様な変更が可能であることは当業者に明らかであろう。
（以１・゛余白）
第１図は核酸増幅方法の全体図である。
第２図は増幅方法の試験に使用される合成オリゴヌクレ
オチドＤＮＡ配列を示し、第２八図はｇａｇ試験配列、
第２Ｂ図はｇａＨ２試験配列を示す。 第３図は種々の１ライマ一濃度を使用した増幅反応のＰ
ＡＧＥ分析のオートラジオグラムのＸ線写真を示す。 第４図は種々の鋳型濃度を使用した増幅反応の１’八へ
Ｅ分析のオー１〜ラジオダラムのＸ線写真を示す。 第５図は増幅反応に対するドツト−プロットハイブリダ
イゼーションのオー１〜ラジオダラムのＸ線写真を示す
。 第６図は制限フラグメントを鋳型として使用した増幅反
応のｒ’ＡＧＥ分析のオートラジオグラムのＸＦＩＧ、
４ 図面の浮身（内容に変更なし〕 ＦＩＧ。 図面の浄吉（内容に変更な二） ＦＩＧ、５． 手続ネｉ１３正書 平成元年３月２０日 特 、事件の表示 平成１年特許願第１４９３４号 、発明の名称 核Ｉ！！増幅方法 、補正をする者 事件との関係
オチドＤＮＡ配列を示し、第２八図はｇａｇ試験配列、
第２Ｂ図はｇａＨ２試験配列を示す。 第３図は種々の１ライマ一濃度を使用した増幅反応のＰ
ＡＧＥ分析のオートラジオグラムのＸ線写真を示す。 第４図は種々の鋳型濃度を使用した増幅反応の１’八へ
Ｅ分析のオー１〜ラジオダラムのＸ線写真を示す。 第５図は増幅反応に対するドツト−プロットハイブリダ
イゼーションのオー１〜ラジオダラムのＸ線写真を示す
。 第６図は制限フラグメントを鋳型として使用した増幅反
応のｒ’ＡＧＥ分析のオートラジオグラムのＸＦＩＧ、
４ 図面の浮身（内容に変更なし〕 ＦＩＧ。 図面の浄吉（内容に変更な二） ＦＩＧ、５． 手続ネｉ１３正書 平成元年３月２０日 特 、事件の表示 平成１年特許願第１４９３４号 、発明の名称 核Ｉ！！増幅方法 、補正をする者 事件との関係
Claims (42)
- （１）一重鎖ＲＮＡと一重鎖ＤＮＡと二重鎖ＤＮＡとを
合成し前記一重鎖ＲＮＡが第１プライマー用第１鋳型、
前記一重鎖ＤＮＡが第２プライマー用第２鋳型、前記二
重鎖ＤＮＡが第１鋳型の複数コピー合成用第３鋳型とし
て機能し、第１または第２のプライマーの配列が特定核
酸配列の配列に十分に相補的であり、第１または第２の
プライマーの配列が特定核酸配列の配列に十分に相同で
あり、かつ第１プライマーの３’末端が相補鎖上の第２
プライマーの３’末端に向かって方向付けされることを
特徴とする特定核酸配列の増幅方法。 - （２）第１プライマーが第１鋳型に選択的にハイブリダ
イズし、第１プライマーに共有結合し且つ第１鋳型に相
補的なＤＮＡの合成を促進し、ＲＮＡポリメラーゼ用の
プロモーターのアンチセンス配列及び転写開始部位のア
ンチセンス配列をもつ第２プライマーが第２鋳型に選択
的にハイブリダイズし、第２プライマーに共有結合し第
２鋳型に相補的なＤＮＡを合成し得ることを特徴とする
請求項１に記載の方法。 - （３）（ａ）第１鋳型のＲＮＡ配列に十分に相補的な配
列をもつ第１プライマーＤＮＡを第１鋳型にハイブリダ
イズし、 （ｂ）第１プライマーに共有結合し第１鋳型のＲＮＡ配
列に相補的な第１ＤＮＡ配列を合成し、該第１ＤＮＡ配
列と第１プライマーとが第２鋳型を構成し、 （ｃ）第２プライマーをハイブリダイズせしむべく第２
鋳型から第１鋳型を分離し、 （ｄ）第２鋳型のＤＮＡ配列に十分に相補的な配列をも
ち且つＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターのアンチセ
ンス配列と転写開始部位のアンチセンス配列とをもつ第
２プライマーＤＮＡを第２鋳型にハイブリダイズし、 （ｅ）第２プライマーに共有結合し第２鋳型のＤＮＡ配
列に相補的な第２ＤＮＡ配列を合成し、第２鋳型に共有
結合し第２プライマーのＤＮＡ配列に相補的な第３ＤＮ
Ａ配列を合成し、第２及び第３のＤＮＡ配列、第２プラ
イマー及び第２鋳型が第３鋳型を構成し、 （ｆ）第３鋳型から第１鋳型のＲＮＡ配列の複数コピー
を合成し、 ここにおいて、第１または第２のプライマーの配列が特
定核酸配列の配列に十分に相補的であり、第１または第
２のプライマーの配列が特定核酸配列の配列に十分に相
同であり、かつ第１プライマーの３’末端が相補鎖上の
第２プライマーの３’末端に向かって方向付けされるこ
とを特徴とする特定核酸配列の増幅方法。 - （４）第２プライマーが、３’末端に第２鋳型のＤＮＡ
配列に十分に相補的な配列をもちかつ５’末端にＲＮＡ
ポリメラーゼ用のプロモーターのアンチセンスＤＮＡ配
列と転写開始部位のアンチセンス配列とをもつことを特
徴とする請求項３に記載の方法。 - （５）第２鋳型に共有結合した第３ＤＮＡ配列が第２プ
ライマーの５’末端のＤＮＡ配列に相補的であることを
特徴とする請求項４に記載の方法。 - （６）第１ＤＮＡ配列がＲＮＡ依存性ＤＮ＾ポリメラー
ゼによって合成されることを特徴とする請求項３に記載
の方法。 - （７）第１鋳型がＲＮＡ−ＤＮＡのハイブリッドに特異
的なリボヌクレアーゼによって第２鋳型から分離される
ことを特徴とする請求項３に記載の方法。 - （８）リボヌクレアーゼが大腸菌リボヌクレアーゼＨで
あることを特徴とする請求項７に記載の方法。 - （９）リボヌクレアーゼが子ウシ胸腺リボヌクレアーゼ
Ｈであることを特徴とする請求項７に記載の方法。 - （１０）第２及び第３のＤＮＡ配列がＤＮＡ依存性ＤＮ
Ａポリメラーゼによって合成されることを特徴とする請
求項３に記載の方法。 - （１１）第１鋳型がＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに
よって第３鋳型から合成されることを特徴とする請求項
３に記載の方法。 - （１２）第１プライマーがプロモーターのアンチセンス
配列と転写開始部位のアンチセンス配列とをもつことを
特徴とする請求項３に記載の方法。 - （１３）第１プライマーが支持体にハイブリダイズする
配列をもつことを特徴とする請求項３に記載の方法。 - （１４）第２プライマーが３’末端から５’末端に向か
って十分に相補的な配列と転写開始部位のアンチセンス
配列とプロモーターのアンチセンス配列とを含むことを
特徴とする請求項３に記載の方法。 - （１５）転写開始部位のアンチセンス配列及びアンチセ
ンスプロモーター配列がバクテリオファージＲＮＡポリ
メラーゼと結合することを特徴とする請求項１４に記載
の方法。 - （１６）転写開始部位のアンチセンス配列及びアンチセ
ンスプロモーター配列がＴ７ＲＮＡポリメラーゼと結合
することを特徴とする請求項１４に記載の方法。 - （１７）転写開始部位のアンチセンス配列及びプロモー
ターのアンチセンス配列が 【遺伝子配列があります】 であることを特徴とする請求項１４に記載の方法。 - （１８）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがＴ７ＲＮＡ
ポリメラーゼであることを特徴とする請求項１１に記載
の方法。 - （１９）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがバクテリオ
ファージＲＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請
求項１１に記載の方法。 - （２０）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがファージＴ
３ポリメラーゼであることを特徴とする請求項１１に記
載の方法。 - （２１）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがファージφ
IIポリメラーゼであることを特徴とする請求項１１に記
載の方法。 - （２２）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがサルモネラ
ファージｓｐ６ポリメラーゼであることを特徴とする請
求項１１に記載の方法。 - （２３）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが￥Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ￥ファージｇｈ−１ポリメラーゼである
ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。 - （２４）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼがレトロウイ
ルスポリメラーゼであることを特徴とする請求項６に記
載の方法。 - （２５）レトロウイルスポリメラーゼがトリ筋芽細胞腫
ウィルスポリメラーゼであることを特徴とする請求項２
４に記載の方法。 - （２６）レトロウイルスポリメラーゼがモロニー（Ｍａ
ｌｏｎｅｙ）マウス白血病ウィルスポリメラーゼである
ことを特徴とする請求項２４に記載の方法。 - （２７）ポリメラーゼがエキソヌクレアーゼ活性または
エンドヌクレアーゼ活性をもたないことを特徴とする請
求項６、１０または１１に記載の方法。 - （２８）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼがトリ筋芽細
胞腫ウィルスポリメラーゼであることを特徴とする請求
項１０に記載の方法。 - （２９）第１プライマーと第２プライマーとリボヌクレ
アーゼＨとＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとＤＮＡ依
存性ＤＮＡポリメラーゼとＲＮＡポリメラーゼとリボヌ
クレオシド三リン酸とデオキシリボヌクレオシド三リン
酸とを標本と混合し、ここにおいて第１プライマーＤＮ
Ａが第１鋳型ＲＮＡに十分に相補的な配列をもち、第２
プライマーＤＮＡがＲＮＡポリメラーゼによって基質と
して認識される第２鋳型ＤＮＡに十分に相補的な配列と
プロモータのアンチセンス配列と転写開始部位のアンチ
センス配列とを含み、第１または第２のプライマーの配
列が特定核酸配列の配列に十分に相補的であり、第１ま
たは第２のプライマーの配列が特定核酸配列の配列に十
分に相同であり、かつ第１プライマーの３’末端が相補
鎖上の第２プライマーの３’末端に向かって方向付けさ
れていることを特徴とする特定核酸配列の増幅方法。 - （３０）第１プライマーと第２プライマーとトリ筋芽細
胞腫ウィルスポリメラーゼと大腸菌リボヌクレアーゼＨ
とバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼとリボヌ
クレオシド三リン酸とデオキシリボヌクレオシド三リン
酸とを標本と混合し、ここにおいて第１プライマーが第
１鋳型ＲＮＡに十分に相補的な配列をもち、第２プライ
マーがＴ７ＲＮＡポリメラーゼによって基質として認識
される第２鋳型ＤＮＡに十分に相補的な配列とプロモー
ターのアンチセンス配列と転写開始部位のアンチセンス
配列とを含み、第１または第２のプライマーの配列が特
定核酸配列の配列に十分に相補的であり、第１または第
２のプライマーの配列が特定核酸配列の配列に十分に相
同であり、かつ第１プライマーの３’末端が相補鎖上の
第２プライマーの３’末端に向かって方向付けされてい
ることを特徴とする特定核酸配列の増幅方法。 - （３１）更に、核酸配列を含有すると予想される第１標
本の増幅量と核酸配列が存在しない第２標本の増幅量と
を比較することによって特定核酸配列の存在を検出する
ことを特徴とする請求項１または３に記載の方法。 - （３２）更に、核酸配列を含有すると予想される第１標
本の増幅量と核酸配列が存在しない第２標本の増幅量と
を比較することによって特定核酸配列の存在を検出する
ことを特徴とする請求項２９または３０に記載の方法。 - （３３）更に、特定核酸配列または特定核酸配列の産生
物にハイブリダイズするプローブを用いて特定核酸配列
の存在を検出することを特徴とする請求項１または３に
記載の方法。 - （３４）更に、制限エンドヌクレアーゼ及び電気泳動分
離を用いて特定核酸配列の存在を検出することを特徴と
する請求項１または３に記載の方法。 - （３５）更に、制限エンドヌクレアーゼ及び電気泳動分
離を用いて特定核酸配列の存在を検出することを特徴と
する請求項３１または３２に記載の方法。 - （３６）更に、特定核酸配列または特定核酸配列の産生
物にハイブリダイズするプローブを用いて特定核酸配列
の存在を検出することを特徴とする請求項３１または３
２に記載の方法。 - （３７）請求項１の方法によって増幅された特定核酸配
列。 - （３８）請求項３の方法によって増幅された特定核酸配
列。 - （３９）請求項２９の方法によって増幅された特定核酸
配列。 - （４０）請求項３０の方法によって増幅された特定核酸
配列。 - （４１）（ａ）第１鋳型のＲＮＡ配列に十分に相補的な
ＤＮＡ配列をもつ第１プライマーと、 （ｂ）第２鋳型のＤＮＡ配列に十分に相補的なＤＮＡ配
列をもつ第２プライマーと、 （ｃ）リボヌクレアーゼＨと、 （ｄ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと、 （ｅ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと、 （ｆ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと、 （ｇ）リボヌクレオシド三リン酸と、 （ｈ）デオキシリボヌクレオシド三リン酸とを含み、第
１または第２のプライマーの配列が特定核酸配列の配列
に十分に相補的であり、第１または第２のプライマーの
配列が特定核酸配列の配列に十分に相同であり、かつ第
１プライマーの３’末端が相補鎖上の第２プライマーの
３’末端に向かって方向付けされていることを特徴とす
る特定核酸配列増幅用キット。 - （４２）（ａ）第１鋳型のＲＮＡ配列に十分に相補的な
ＤＮＡ配列をもつ第１プライマーと、 （ｂ）第２鋳型のＤＮＡ配列に十分に相補的なＤＮＡ配
列をもつ第２プライマーと、 （ｃ）バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼと、 （ｄ）大腸菌リボヌクレアーゼＨと、 （ｅ）トリ筋芽細胞腫ウィルスポリメラーゼと、 （ｆ）リボヌクレオシド三リン酸と、 （ｇ）デオキシリボヌクレオシド三リン酸とを含み、第
１または第２のプライマーの配列が特定核酸配列の配列
に十分に相補的であり、第１または第２のプライマーの
配列が特定核酸配列の配列に十分に相同であり、かつ第
１プライマーの３’末端が相補鎖上の第２プライマーの
３’末端に向かって方向付けされていることを特徴とす
る特定核酸配列増幅用キット。
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1996
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1997
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