KR100809949B1 - 염기 치환의 검출 방법 - Google Patents

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Abstract

유전자중 염기 치환 검출에 유용한 뉴클레오티드, 상기 뉴클레오티드를 사용하여 유전자중 염기 치환을 검출하는 방법. 및 그를 위한 키트.

Description

염기 치환의 검출 방법{Method of detecting nucleotide polymorphism}
본 발명은 유전자중 염기 치환 검출에 유용한 뉴클레오티드 (본 발명의 방법에 사용하고자 하는 올리고뉴클레오티드), 상기 뉴클레오티드를 사용하여 유전자중 염기 치환을 검출하는 방법, 및 이를 위한 키트에 관한 것이다.
동종에 속하는 유기체 개체의 게놈에 포함된 유전자 코드는 서로 일치하지 않고, 다형성이라 불리는 염기 서열상의 차이가 존재한다고 공지되어 있다. 1 내지 10개의 염기(들)가 결실되거나 삽입된 것, 특정 염기 서열이 중복된 것 등이 다형성으로서 공지되어 있다. 하나의 염기가 또다른 염기로 치환된 것은 단일염기변이(single nucleotide polymorphism (SNP))로 명명된다.
수백 내지 일천개의 염기당 약 1개의 비율로 단일염기변이가 존재한다. 따라서, 인간 게놈상에 존재하는 SNPs의 수는 3 내지 1000만개로 추측되고 있다. 질환과 관련된 유전자를 탐색하거나, 질환에 대한 감수성 또는 약물에 대한 민감성(작용 또는 부작용)에서 차이에 대한 정보를 갖는지에 대한 인덱스로서 SNPs가 주목되고 있다. SNPs 검출방법이 연구중이다.
SNPs를 검출하는 방법은 일반적으로 하이브리드제이션에 기초한 것, 프라이머 신장에 기초한 것 및 효소의 기질 특이성을 이용한 것으로 분류된다.
염기 치환의 존재는 하이브리드제이션 방법에서 프로브를 핵산 샘플에 하이브리드제이션시키는 방법에 의해 검출된다. 상기 방법에 따라, 1개의 염기에 의해 하이브리드제이션이 영향을 받도록 프로브 및 하이브리드제이션 조건을 결정하는 것이 필요하다. 따라서, 고도로 재현가능한 검출 시스템을 구축하는 것은 어렵다.
미국특허 5,660,988에 기술된 바 사이클 프로브 반응을 사용하여 돌연변이를 검출하는 방법이 예시된다. 용이하게 개열될 수 있는(cleavable) 결합을 갖는 핵산 프로브가 본 방법에서 관심의 대상이 되는 핵산 분자에 하이브리드된다. 관심의 대상이 되는 핵산 분자가 염기 치환을 갖지 않는 경우 프로브는 개열되는 반면, 핵산 분자가 염기 치환을 갖는 경우 프로브는 개열되지 않는다. 이어서 개열된 프로브로부터 유리된 단편의 발생도를 검출하고 측량하여 염기 치환을 검출한다. 그러나, 미량의 표적 핵산을 이 방법에 따라 검출하고자 하는 경우, 개열 산물의 양이 적기 때문에 프로부터의 개열 산물을 검출할 수 있는 수준까지 도달하기에는 상당한 시간 래그가 존재할 수 있다.
미국 특허 5,210,015 및 5,487,972에 기술된 바와 같은 TaqMan 방법을 사용하여 돌연변이를 검출하는 방법이 또다른 방법을 예시한다. 형광염료 및 소광자(quencher)가 결합되어 있는 TaqMan 프로브를 이 방법에 사용한다. 두개의 프로브(1개의 염기 치환을 포함하는 것 및 염기 치환을 포함하지 않는 것)를 TaqMan 프로브로서 사용한다. 프로브는 관심의 대상이 되는 핵산 분자에 하이브리드되고, 프라이머는 상류(upstream)로부터 신장된다. 관심의 대상이 되는 핵산 분자가 염기 치환을 포함하지 않는 경우에만 DNA 폴리머라제의 5'→3' 엑소뉴클레아 제 활성에 기인하여 프로브는 개열된다. 이어서 방출 형광을 검출하여 염기 치환을 검출한다. 그러나, 이 방법은 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 폴리머라제, 3'-말단에서 차단된 표지된 뉴클레오티드를 사용하는 PCR 및 엄격한 온도 조절을 필요로 하고, 검출 시간인 길기 때문에 이 방법은 문제점을 안고 있다.
효소를 사용하는 방법은 DNA 폴리머라제를 사용하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 추가로 하기 3 그룹으로부터 분류된다: (1) 미국특허 5,137,806에 기술된 바와 같이 검출하고자 하는 염기 치환에 대한 염기 부위에 3'-말단이 어닐링된 프라이머를 사용하는 프라이머 신장 반응의 존재에 기초하여 염기 치환을 검출하는 방법; (2) WO 01/42498에 기술된 바와 같이 검출하고자 하는 염기 치환 부위가 3'-말단으로부터 제 2 뉴클레오티드에 위치하는 프라이머를 사용하는 프라이머 신장 반응의 존재에 기초하여 염기 치환을 검출하는 방법; 및 (3) 검출하고자 하는 염기 치환에 대한 염기에 3' 인접한 염기에 3'-말단이 어닐링된 프라이머를 사용하여 프라이머로 도입된 염기를 식별하여 관심의 대상이 되는 위치에서의 돌연변이 존재 여부 및 상기 위치의 염기를 측정하는 방법.
DNA리가제를 사용하는 방법이 공지되어 있다. 본 발명에 따라, 염기 치환은 인접 프로브에 대한 프로브의 결찰의 존재에 기초하여 검출한다. 프로브의 말단 부위는 검출하고자 하는 염기 치환에 대한 염기 부위와 일치한다.
DNA 폴리머라제 또는 DNA리가제를 사용하는 방법은 염기 치환에 기인한 프라이머(또는 프로브) 및 표적 핵산사이의 미스매치(mismatch)를 정확하게 검출할 수 없다. 특히, 프라이머 또는 프로브가 미스매치를 갖더라도 상기 효소는 잘못된 결과를 제공하면서 효소적 반응을 개시할 수 있다.
표적 핵산과 프라이머 사이의 잘못된 어닐링 또는 사용되는 리가제 또는 폴리머라제에 의해 만들어진 에러에 기인한 가능한 위 양성(false positive) 때문에, 반응 조건(특히, 반응 온도) 등을 매우 엄격하게 조절하여야 하고, 재현성과 관련된 문제가 있다.
최근, 미국특허 5,846,717에 기술된 인베이더 방법(invader method)과 같이 더블-스트랜드 핵산중 특정 구조를 인식하고 개열하는 활성을 갖는 효소를 사용하는 방법이 포함된다. 효소가 클리바제(cleavase)로서 공지되어 있다. 프로브의 개열을 조사하여 염기 치환을 검출할 수 있다. 프로브는 효소에 의해 염기 치환 여부가 인식되는 구조를 형성할 수 있도록 프로브가 작제된다. 그러나, 더블-스트랜드 핵산중 특정 구조를 인식하고 개열하는 활성을 갖는 효소를 사용하는 방법이 그의 민감성과 관련하여 문제점을 안고 있다. 특히, 본 발명에 따라 하나의 시그날은 하나의 표적 핵산 분자로부터 형성되기 때문에 염기 치환 검출에 충분한 시그날을 미량의 핵산 샘플로부터 얻을 수 없다. 강한 시그날을 얻기 위하여 미리 표적 핵산을 증폭시키는 것이 필요하지만, 프로브 절단 반응을 반복하여 시그날을 증가시킬 수 있는 것도 가능하다. 따라서, 본 발명에 따라 미량의 표적 핵산을 검출하고자 하는 경우, 절단 산물이 소량이기 때문에 프로브로부터 절단 산물이 검출가능한 수준에 도달할 때까지 상당히 시간이 지체될 수 있다.
상기 기술된 바와 같이 방법들은 수개의 문제점을 안고 있기 때문에, 염기 치환을 정확하게 검출하기 위하여 사용할 수 있는 방법이 요구되고 있다.
발명의 목적
본 발명의 목적은 상기 언급된 문제를 해결하고, 미량의 핵산 샘플을 사용하더라도 탁월한 재현성으로 염기 치환(예: SNP)을 정확하게 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
발명의 요약
상기 기술된 바와 같은 문제를 해결하기 위하여, 염기 치환을 정확하게 검출하고 강한 시그날로서 결과를 수득하기 위해 사용될 수 있는 방법이 바람직하다.
본 발명자들은 뉴클레오티드를 제조하였다. 뉴클레오티드는 검출하고자 하는 염기 치환에 대한 표적 핵산에 어닐링할 수 있다. DNA 폴리머라제에 의한 3'-말단으로부터의 DNA 신장 반응은 뉴클레오티드가 완전한(intact) 상태인 경우에는 개시되지 않는다. 뉴클레아제에 의한 뉴클레오티드의 절단은 어닐링된 주형 스트랜드의 염기 서열에 영향을 받는다. 또한, 본 발명자들은 뉴클레오티드를 사용하여 고감도로 정확하게 표적핵산중 염기 치환을 검출하기 위하여 사용될 수 있는 방법을 구축하였다. 따라서, 본 발명은 완성되었다.
본 발명은 하기와 같이 요약된다.
본 발명의 제 1면은
(1) 표적 핵산을 포함하는 샘플을 뉴클레오티드와 혼합하고,
(여기에서, 뉴클레오티드는
(A) DNA 폴리머라제에 의해 말단으로부터 신장되지 못하도록 3'-말단에서 변형되고;
(B) 표적 핵산중 특정 염기를 포함하는 영역에 어닐링할 수 있는 염기 서열을 갖고;
(C) 뉴클레오티드 및 표적 핵산으로 구성된 복합체에서 뉴클레오티드중 특정 염기에 상응하는 염기와 특정 염기 사이에 미스매치가 존재하는 경우, 뉴클레오티드는 뉴클레아제에 의해 절단되지 않고, 상기 뉴클레오티드중 특정 염기에 상응하는 염기와 특정 염기 사이에 미스매치가 존재하지 않는 경우, 뉴클레오티드는 뉴클레아제에 의해 절단되어 새로운 3'-말단을 형성하는 서열을 포함한다);
(2) 혼합물을 뉴클레아제 및 DNA 폴리머라제로 처리하고;
(3) 뉴클레아제를 사용한 뉴클레오티드의 절단의 존재를 검출하는 것을 포함하는, 표적 핵산중 특정 염기에서의 염기 치환의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이다.
하기 방법이 제 1면의 염기 치환 검출 방법을 예시한다: 뉴클레아제가 리보뉴클레아제 H이고 뉴클레오티드가 특정 염기에 상응하는 염기를 포함하는 영역중 리보뉴클레오티드를 포함하는 방법; 뉴클레아제가 제한 효소이고 뉴클레오티드가 특정 염기에 상응하는 염기를 포함하는 영역중 제한효소에 대한 인식 서열을 포함하는 방법.
본 발명의 제 2면은
(1) 표적 핵산을 포함하는 샘플을 뉴클레오티드와 혼합하고,
(여기에서, 뉴클레오티드는
(A) DNA 폴리머라제에 의해 말단으로부터 신장되지 못하도록 3'-말단에서 변 형되고;
(B) 표적 핵산중 특정 염기를 포함하는 영역에 어닐링할 수 있는 염기 서열을 갖고;
(C) 뉴클레오티드 및 표적 핵산으로 구성된 복합체에서 뉴클레오티드중 특정 염기에 상응하는 염기와 특정 염기 사이에 미스매치가 존재하지 않는 경우, 뉴클레오티드는 뉴클레아제에 의해 절단되지 않고, 상기 뉴클레오티드중 특정 염기에 상응하는 염기와 특정 염기 사이에 미스매치가 존재하는 경우, 뉴클레오티드는 뉴클레아제에 의해 절단되어 새로운 3'-말단을 형성하는 서열을 포함한다);
(2) 혼합물을 뉴클레아제 및 DNA 폴리머라제로 처리하고;
(3) 뉴클레아제를 사용한 뉴클레오티드의 절단의 존재를 검출하는 것을 포함하는, 표적 핵산중 특정 염기에서의 염기 치환의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이다.
뉴클레아제가 미스매치-특이적 뉴클레아제인 방법인 제 2면의 검출 방법을 예시한다.
제 1면 또는 제 2면의 검출 방법에서 사용되는 뉴클레오티드는 표적 핵산중 염기 치환이 존재하지 않는 경우, 뉴클레오티드 및 표적 핵산으로 구성된 복합체에서 미스매치는 형성되지 않는 서열을 가질 수 있거나, 표적 핵산중 염기 치환이 존재하는 경우, 뉴클레오티드 및 표적 핵산으로 구성된 복합체에서 미스매치는 형성되지 않는 서열을 가질 수 있다.
하기 방법이 제 1면 또는 제 2면의 일례를 예시한다: 염기 치환의 존재 여부 를 DNA 폴리머라제의 작용에 의해 형성된 신장 산물의 존재에 기초하여 결정하는 방법; 및 염기 치환의 존재 여부를 뉴클레아제의 작용에 의해 형성된 뉴클레오티드로부터 유리된 3'측의 단편의 존재에 기초하여 결정하는 방법. 또한, 신장 산물 또는 뉴클레오티드의 3'측의 단편은 뉴클레오티드에 결합된 라벨을 사용하여 검출될 수 있다. 형광 물질을 라벨로서 사용하였다. 추가로, 형광을 소광시킬 수 있는 물질 및 형광 물질이 결합된 뉴클레오티드(여기에서, 형광이 뉴클레아제에 의한 절단시 또는 절단 후 DNA 신장시 방출된다)를 사용할 수 있다. 형광 표지된 뉴클레오티드를 사용하는 일면에서, 형광편광법을 검출을 위해 사용할 수 있다.
제 1면 또는 제 2면의 염기 치환 방법에 사용되는 뉴클레오티드와 관련하여, 3'-말단에서의 뉴클레오티드 변형은 리보오스 3-부위의 하이드록실 그룹의 변형에 의해 예시된다. 본 발명의 염기 치환 방법에 사용되는 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체 및/또는 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명을 제한하는 것은 아니지만, 예를 들면, 데옥시리보이노신 뉴클레오티드, 데옥시리보우라실 뉴클레오티드 등을 바람직하게 뉴클레오티드 유사체로서 사용할 수 있고, (α-S) 리보뉴클레오티드를 바람직하게 변형된 리보뉴클레오티드로서 사용할 수 있다. 또한, 제 1면 또는 제 2면의 방법은 추가로 DNA 폴리머라제의 작용에 의해 형성된 신장 산물을 주형으로 사용하는 핵산 증폭 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 제 3면은 제 1면 또는 제 2면에 따른 염기 치환 검출 방법을 포함하는 대립 형질의 유전형을 분석하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제 4면은
(A) DNA 폴리머라제에 의해 말단으로부터 신장되지 못하도록 3'-말단에서 변형되고;
(B) 표적 핵산중 특정 염기를 포함하는 영역에 어닐링할 수 있는 염기 서열을 갖고;
(C) 뉴클레오티드 및 표적 핵산으로 구성된 복합체에서 뉴클레오티드중 특정 염기에 상응하는 염기와 특정 염기 사이에 미스매치가 존재하는 경우, 뉴클레오티드는 뉴클레아제에 의해 절단되지 않고, 상기 뉴클레오티드중 특정 염기에 상응하는 염기와 특정 염기 사이에 미스매치가 존재하지 않는 경우, 뉴클레오티드는 뉴클레아제에 의해 절단되어 새로운 3'-말단을 형성하는, 표적 핵산중 특정 염기에서의 염기 치환을 검출하기 위하여 사용되는 뉴클레오티드에 관한 것이다.
하기 뉴클레오티드가 제 4면의 뉴클레오티드를 예시한다: 뉴클레오티드 및 표적 핵산으로 구성된 복합체에서 뉴클레오티드중 특정 염기에 상응하는 염기와 특정 염기 사이에 미스매치가 존재하지 않는 경우, 뉴클레오티드는 뉴클레아제 H에 의해 절단되는, 표적 핵산중 특정 염기에 상응하는 염기를 포함하는 영역중 리보뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드; 및 뉴클레오티드 및 표적 핵산으로 구성된 복합체에서 뉴클레오티드중 특정 염기에 상응하는 염기와 특정 염기 사이에 미스매치가 존재하지 않는 경우, 뉴클레오티드는 제한효소에 의해 절단되는, 표적 핵산중 특정 염기에 상응하는 염기를 포함하는 영역중 제한 효소에 대한 인식 서열을 포함하는 뉴클레오티드.
본 발명의 제 5면은
(A) DNA 폴리머라제에 의해 말단으로부터 신장되지 못하도록 3'-말단에서 변형되고;
(B) 표적 핵산중 특정 염기를 포함하는 영역에 어닐링할 수 있는 염기 서열을 갖고;
(C) 뉴클레오티드 및 표적 핵산으로 구성된 복합체에서 뉴클레오티드중 특정 염기에 상응하는 염기와 특정 염기 사이에 미스매치가 존재하지 않는 경우, 뉴클레오티드는 뉴클레아제에 의해 절단되지 않고, 상기 뉴클레오티드중 특정 염기에 상응하는 염기와 특정 염기 사이에 미스매치가 존재하는 경우, 뉴클레오티드는 뉴클레아제에 의해 절단되어 새로운 3'-말단을 형성하는, 표적 핵산중 특정 염기에서 염기 치환 존재를 검출하기 위하여 사용되는 뉴클레오티드에 관한 것이다.
뉴클레오티드 및 표적 핵산으로 구성된 복합체에서 뉴클레오티드 및 표적 핵산과 미스매치하는 경우, 뉴클레오티드는 미스매치-특이적 뉴클레아제에 의해 절단되는 뉴클레오티드가 의해 제 5면의 뉴클레오티드를 예시한다.
제 4면 또는 제 5면의 뉴클레오티드는 표적 핵산중 염기 치환이 존재하지 않는 경우, 뉴클레오티드 및 표적 핵산으로 구성된 복합체에서에서 미스매치는 형성되지 않는 서열을 가질 수 있거나, 염기 치환이 표적 핵산중에 존재하는 경우, 뉴클레오티드 및 표적 핵산으로 구성된 복합체에서에서 미스매치는 형성되지 않는 서열을 가질 수 있다.
제 4면 또는 제 5면의 뉴클레오티드는 결합된 표지 화합물을 가질 수 있다. 위치는 뉴클레아제에 대한 절단 부위에 대하여 3' 또는 5'측 일 수 있다. 예를 들면, 형광 물질을 표지 화합물로서 사용할 수 있다. 형광을 소광시킬 수 있는 물질을 추가로 결합시켜 형광이 뉴클레아제에 의한 절단시 또는 절단 후 DNA 신장시 방출하는 뉴클레오티드를 제조할 수 있다.
제 4면 또는 제 5면의 뉴클레오티드와 관련하여, 3'-말단에서의 뉴클레오티드 변형은 리보오스 3-부위의 하이드록실 그룹의 변형에 의해 예시된다. 본 발명의 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체 및/또는 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 발명을 제한하는 것은 아니지만, 예를 들면, 데옥시리보이노신 뉴클레오티드, 데옥시리보우라실 뉴클레오티드 등을 바람직하게 뉴클레오티드 유사체로서 사용할 수 있고, (α-S) 리보뉴클레오티드를 바람직하게 변형된 리보뉴클레오티드로서 사용할 수 있다.
본 발명의 제 6면은 제 4면 또는 제 5면의 뉴클레오티드를 포함하는 표적 핵산중 염기 치환을 검출하기 위하여 사용되는 키트에 관한 것이다.
하기 키트는 제 6면의 키트를 예시한다: 뉴클레아제 및/또는 DNA 폴리머라제를 포함하는 키트; DNA 신장의 존재를 검출하기 위한 시약을 추가로 포함하는 키트; 및 핵산 증폭 방법을 수행하기 위한 시약을 추가로 포함하는 키트.
도면의 간단한 설명
도 1은 본 발명의 염기 치환을 검출하는 본 방법에 따른 인간 유전자중 염기 치환 검출 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 염기 치환을 검출하는 본 방법에 따른 인간 유전자중 염기 치환 검출 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 염기 치환을 검출하는 본 방법에 따른 인간 유전자중 염기 치환 검출 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 염기 치환을 검출하는 본 방법에 따른 인간 유전자중 염기 치환 검출 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 염기 치환을 검출하는 본 방법에 따른 인간 유전자중 염기 치환 검출 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 염기 치환을 검출하는 본 방법에 따른 인간 유전자중 염기 치환 검출 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 염기 치환을 검출하는 본 방법에 따른 인간 유전자중 염기 치환 검출 결과를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 염기 치환을 검출하는 본 방법에 따른 인간 유전자중 염기 치환 검출 결과를 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바, "염기 치환"은 핵산중 특정 위치의 염기가 또다른 염기로 치환되는 것을 언급한다. 염기 치환에 의해 유기체 개체중 유전자 정보상의 차가 생긴다. 유전자 정보의 차이는 다형성 또는 변이로 언급된다. 본 명세서에서 사용되는 염기 치환은 다형성 및 변이중 염기 치환을 포함한다. 염기 치환은 또한 인위적으로 핵산내로 도입된 염기 치환을 포함한다.
염기 치환중 치환되는 염기의 갯수와 관련하여 특별히 제한되지 않는다.
본 발명은 유전자중 게놈 다형성 또는 변이, 특히 단일염기변이(SNP)의 검출에 적절하다.
본 발명을 하기에 상세히 설명한다.
(1) 본 발명의 뉴클레오티드
본 발명의 뉴클레오티드는 검출하고자 하는 염기 치환에 대한 표적 핵산중의 위치를 포함하는 영역에 어닐링할 수 있는 염기 서열을 갖는다. 뉴클레오티드는 뉴클레오티드가 완전한(intact) 상태인 경우에는 DNA 폴리머라제에 의한 DNA 신장에 대한 프라이머로서 사용되지 않고, 뉴클레아제에 의해 절단된 경우에만 프라이머로서 사용된다. 상기 기술한 특성을 갖는 한 뉴클레오티드 길이와 관련하여 특별히 제한하지 않는다. 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드를 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 통상 8 내지 50 염기, 바람직하게 10 내지 40 염기, 더욱 바람직하게 12 내지 30 염기의 올리고뉴클레오티드를 본 발명의 뉴클레오티드로서 사용할 수 있다.
본 발명의 뉴클레오티드는 일반적으로 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드이다. 임의로, 리보뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드의 유사체 또는 뉴클레오티드의 유도체(변형)이다. 예를 들면, 그의 염기 부위로서 이노신 또는 7-데아자구아닌과 같은 염기를 같는 뉴클레오티드 유사체 또는 리보오스 유도체를 갖는 뉴클레오티드 유도체를 뉴클레오티드 유사체로서 사용할 수 있다. 변형된 뉴클레오티드의 예로서 인산 그룹에 결합된 산소가 황 원자로 대체된 (α-S) 뉴클레오티드, 및 표지 화합물이 결합된 뉴클레오티드를 포함한다. 또한, 본 발명의 뉴클레오티드는 [Nature, 365:566-568 (1993)]에 기술된 펩티드 핵산 (PNA)를 포함할 수 있다. 본 발명을 제한하는 것은 아니지만, 뉴클레오티드 유사체 또는 유도체는바람직하게 사용하고자 하는 뉴클레아제의 작용에 영향을 주지 않는 위치에 도입된다. 본 발명의 뉴클레오티드로의 뉴클레오티드 유사체의 도입은 뉴클레오티드 자체의 고차 구조 형성을 억제시키고 표적 핵산에 대한 뉴클레오티드의 어닐링을 안정화시키는 것과 관련하여 유효하다. 따라서, 뉴클레오티드는 본 발명의 염기 치환 검출 방법에 사용될 수 있는 뉴클레오티드로서의 작용이 유지되는 한 뉴클레오티드 유사체 및/또는 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 뉴클레오티드는 표적 핵산중 특정 염기에서의 염기 치환을 검출하기 위한 하기와 같은 특성을 갖는다:
(A) DNA 폴리머라제에 의해 말단으로부터 신장되지 못하도록 3'-말단에서 변형되고;
(B) 표적 핵산중 특정 염기를 포함하는 영역에 어닐링할 수 있는 염기 서열을 갖고;
(C) 뉴클레오티드 및 표적 핵산으로 구성된 복합체에서 뉴클레오티드중 특정 염기에 상응하는(즉, 특정 염기 사이에 수소 결합을 형성하는) 염기와 특정 염기 사이에 미스매치(또는 일치)하는 경우, 뉴클레오티드는 뉴클레아제에 의해 절단되지 않고, 상기 뉴클레오티드중 특정 염기에 상응하는 염기와 특정 염기 사이가 일치(또는 미스매치)하는 경우, 뉴클레오티드는 뉴클레아제에 의해 절단되어 새로운 3'-말단을 형성하는 서열을 포함한다.
뉴클레아제로 절단된 뉴클레오티드의 5'측의 단편은 표적 핵산에 어닐된 상태로 남아있을 수 있다. 하이드록실 그룹이 뉴클레오티드의 5'측의 단편의 3'-말단의 리보오스 또는 데옥시리보오스의 3번 부위에 존재하기 때문에, DNA는 DNA 폴리머라제에 의해 말단으로부터 신장될 수 있다. 따라서, 뉴클레아제로 절단될 수 있는 염기 서열을 갖는 경우 상기 뉴클레오티드가 프라이머의 전구체로서 작용한다.
상기 기술한 바와 같이, 본 발명의 뉴클레오티드는 3'-말단에서 변형되어 DNA 폴리머라제에 의한 DNA 신장 반응에 사용할 수 없다. 상기-언급된 목적을 달성할 수 있는 한 변형 방법과 관련하여 특별히 제한하지 않는다. 그의 예로서 디데옥시 뉴클레오티드, 리보오스 3번 위치의 하이드록실 그룹에서 변형된 뉴클레오티드, 또는 입체구조적 간섭에 기인한 DNA 폴리머라제에 의한 신장을 간섭하는 변형을 갖는 뉴클레오티드의 3'-말단에서의 첨가를 포함한다. 알킬화 또는 다른 공지된 변형 방법이 리보오스 3번 위치의 하이드록실 그룹을 변형시키기 위한 방법으로서 사용할 수 있다. 예를 들면, DNA 신장 반응은 아미노알킬화에 의해 방해할 수 있다.
본 발명의 뉴클레오티드는 사용된 조건하에서 검출하고자 하는 염기 치환에 대한 표적 핵산중의 영역에 어닐링할 수 있는 염기 서열을 갖는다. 뉴클레오티드는 표적 핵산에 실질적으로 상보적인 서열을 갖고, 관심의 대상이 되는 염기 치환의 검출을 방해하지 않는 한 표적 핵산에 완전하게 상보적인 염기 서열을 가질 필요는 없다.
본 발명의 뉴클레오티드를 표적 핵산에 어닐링하고 적절한 뉴클레아제 및 적절한 DNA 폴리머라제의 존재하에 인큐베이션시키는 경우, 뉴클레오티드의 절단은 표적 핵산중 염기 치환의 존재, 즉 뉴클레오티드가 표적 핵산에 어닐링하여 형성된 더블-스트랜드 핵산중 미스매치하는 위치의 존재에 의해 영향을 받는다. 단지 뉴클레오티드가 절단되어 새로운 3'-말단이 형성되는 경우에만 주형으로서 표적 핵산을 사용하여 DNA가 신장된다. 따라서, 미스매치 존재 여부, 또는 DNA 신장에 기초한 염기 치환의 존재에 대한 정보를 가질 수 있다.
본 발명에 따라, 검출하고자 하는 염기 치환이 존재하는 경우 미스매치가 형성되도록 뉴클레오티드를 제조할 수 있고, 또한 염기 치환이 존재하는 경우 미스매치가 형성되지 않도록 뉴클레오티드를 제조할 수 있다. 추가로, 염기 치환의 존재 여부 및 동시에 하기와 같이 치화된 염기 유형에 대한 정보를 가질 수 있고: 관심의 대상이 되는 염기에 상응하는 위치에 배치된 4가지 유형의 염기중 각각 1개를 갖는 4가지 유형의 뉴클레오티드를 제조하고; 이어서 프라이머에 포함된 4가지 유형의 염기를 신장시키고 조사한다.
상기 기술한 바와 같이, 본 발명의 뉴클레오티드는 뉴클레아제를 사용한 절단의 결과로서 DNA 신장시킬 수 있는 프라이머로 전환된다. 뉴클레아제에 대한 절단 부위에 대한 뉴클레오티드 5'측가 DNA 신장에 대하여 프라이머로서 작용한다. 표적 핵산에 대한 뉴클레오티드의 어닐링의 결과로서 형성된 더블-스트랜드 핵산중 미스매치의 존재에 따라 뉴클레오티드를 절단시키는(절단시키지 않는) 한 뉴클레아제와 관련하여 특별히 제한하지 않는다. 그의 예로서 리보뉴클레아제 H, 제한 효소 및 미스매치-특이적 뉴클레아제를 포함한다.
리보뉴클레아제 H (RNase H)는 DNA 및 RNA로 구성된 더블-스트랜드 핵산을 인식하고 선택적으로 RNA 스트랜드를 절단하는 효소이다. 일치하는 경우만 리보뉴클레아제 H로 절단되는 뉴클레오티드는 검출하고자 하는 치환에 대한 염기에 상응하는 뉴클레오티드중의 위치에서 리보뉴클레오티드를 대체하여 제조될 수 있다.
리보뉴클레오티드 및 그에 상보적인 DNA를 포함하고 리보뉴클레오티드 부위에서 선택적으로 절단되는 본 발명의 뉴클레오티드로 구성된 더블-스트랜드 핵산을 인식하는 활성을 갖는 한 본 발명에 따라 사용되는 리보뉴클레아제에 관련하여 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 리보뉴클레아제 H, 또는 바실러스(Bacillus) 속에 속하는 고온성 세균, 피로코쿠스(Pyrococcus) 속에 속하는 세균, 써무스(Thermus)속에 속하는 세균, 써모토가(Thermotoga)속에 속하는 세균 또는 아키오글로부스(Archaeoglobus) 속에 속하는 세균으로부터의 리보뉴클레아제 H를 효소로서 바람직하게 사용할 수 있다.본 발명을 제한하는 것은 아니지만, 리보뉴클레아제 H는 바람직하게 동시에 사용하고자 하는 DNA 폴리머라제에 대한 것과 동일한 반응 조건하에서 고도의 활성을 보인다. 본 발명의 뉴클레오티드가 핵산 증폭 반응과 조합되어 사용되는 경우, 반응이 수행되는 조건하에서 그의 활성을 나타내는 리보뉴클레아제 H를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 리보뉴클레아제 H 고온에서의 반응 또는 처리를 포함하는 핵산 증폭 반응(예: PCR)을 사용하는 경우 열-내성 리보뉴클레아제 H를 사용하는 것이 이롭다. 예를 들면, 바실러스 칼도테낙스(Bacillus caldotenax), 피로코쿠스 후리오수스(Pyrococcus furiosus), 피로코쿠스 호리코시이(Pyrococcus horikoshii), 써모코쿠스 리토라리스(Thermococcus litoralis) 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima), 아키오글로부스 훌기두스(Archaeoglobus fulgidus) 또는 메타노코쿠스 잔나시(Methanococcus jannashi)로부터의 리보뉴클레아제 H를 열-내성 리보뉴클레아제 H로서 사용할 수 있다.
제한 효소는 DNA중 (4 내지 8개의 염기의 )특정 염기 서열을 인식하고 상기 서열 내 또는 주변 위치에서 절단하는 효소이다. 검출하고자 하는 치환에 대한 염기 부위가 제한 효소에 대한 인식 서열과 오버랩되는 경우, 서열을 포함하도록 제조된 뉴클레오티드를 염기 치환의 검출에 사용할 수 있다. 뉴클레오티드 및 표적 핵산사이에 미스매치가 형성되는 경우, 제한 효소에 의해 절단되지 않는다. 이 결과에 기초하여 염기 치환의 존재 여부에 대한 정보를 가질 수 있다. 그러한 뉴클레오티드를 사용하고자 하는 경우, 표적 핵산이 제한 효소에 의해 절단되지 못하도록 하는 것이 필요하다. 예를 들면, 사용하는 제한 효조에 상응하는 변형 메틸라아제를 사용하여 특정 염기를 메틸화하여, 표적 핵산에 대하여 특이적으로 제한 효소에 내성을 부여할 수 있다.
상기 언급된 두가지 유형의 뉴클레아제와는 상이한 표적 핵산 및 뉴클레오티드 사이의 미스매치를 인식하고 절단하는 효소를 사용할 수 있다. Mut H 등을 효소로서 사용할 수 있다.
본 발명의 뉴클레오티드가 뉴클레아제에 의해 절단되고, 새로운 3'-말단이 형성된 후 말단으로부터의 DNA 신장이 개시된다. 주형으로서 DNA 서열에 따라 3'-말단으로부터 DNA 신장이 가능한 한 이 단계에서 사용되는 DNA 폴리머라제와 관련하여 특별히 제한하지 않는다. 그의 예로 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) DNA 폴리머라제 I, Klenow 단편, 바실러스(Bacillus) 속에 속하는 고온성 세균으로부터의 DNA 폴리머라제(Bst DNA 폴리머라제, BcaDNA 폴리머라제), 써무스(Thermus) 속에 속하는 세균으로부터의 DNA 폴리머라제(Taq DNA 폴리머라제, 등) 및 고온성 아르카에박테리아(archaebacteria)로부터의 α-형 DNA 폴리머라제(Pfu DNA 폴리머라제, 등)를 포함한다.
본 발명의 뉴클레오티드를 유전자 증폭 반응과 조합하여 사용하는 경우, 유전자 증폭 반응에 적절한 DNA 폴리머라제를 용도에 따라 선별한다.
짧다면 표적 핵산으로부터 유리될 수 있지만, 충분히 길다면 뉴클레아제를 사용하여 절단된 결과로서 형성되는 본 발명의 뉴클레오티드의 3'측의 단편은 표적 핵산에 계속하여 어닐링된 상태일 수 있다. 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 사용하는 경우, DNA 폴리머라제에 의해 DNA가 신장될 때 단편은 표적 핵산으로부터 해리된다. 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 사용하는 경우, 단편으로 DNA 폴리머라제에 의해 분해된다.
본 발명을 제한하는 것은 아니지만, 예를 들면, 리보뉴클레아제 H를 뉴클레아제로서 사용하는 경우 하기 일반식의 구조를 갖는 올리고뉴클레오티드를 본 발명의 뉴클레오티드로서 사용할 수 있다:
일반식: 5'-dNa-Nb-dNc-N'-3'
(a: 11이상의 정수; b: 1이상의 정수; c: 0 또는 1이상의 정수; dN: 데옥시리보뉴클레오티드; N: 리보뉴클레오티드; N': DNA 폴리머라제의 의한 DNA 신장이 발생하지 않도록 변형된 리보뉴클레오티드)
일반식중 Nb로 표시되는 부분은 치환 검출의 표적으로서의 염기에 상응하는 염기를 포함한다. 또한, 뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 기능이 손상되지 않는 한 뉴클레오티드 유사체 또는 유사체(변형된 뉴클레오티드)를 포함할 수 있다.
뉴클레오티드는 N'는 변형된 데옥시리보뉴클레오티드이고, a는 11 이상의 정수이고, b은 1 내지 3이고, c는 0 내지 2인 일반식의 키메라성 올리고뉴클레오티드가 예시된다. Nb로 표시되는 부분에 위치하는 한 염기 치환 검출의 표적으로서의 염기에 상응하는 염기에 관하여 특별히 제한하지 않는다. 본 발명의 일면으로, 예를 들면, (dNc-N')로 표시되는 부분의 길이가 3개의 염기이고 검출하고자 하는 염기 치환에 대한 염기에 상응하는 염기가 Nb로 표시되는 부분의 3' 말단에 위치하는 뉴클레오티드가 바람직하게 사용될 수 있다. 그러한 뉴클레오티드는 염기 치환 검출과 관련하여 우수한 특이성을 나타낸다.
뉴클레아제로의 절단에 의해 본 발명의 뉴클레오티드로부터 유리된 3'측의 단편 또는 절단 후 DNA 신장 반응에 의해 형성된 산물(신장 산물)의 검출은 용이하게 진행될 수 있고 염기 치환의 존재 여부는 뉴클레오티드를 적절하게 표지화하여 용이하게 확인할 수 있다.
뉴클레오티드를 표지화하는 방법과 관련하여 특별시 제한하지 않는다. 예를 들면, 방사선동위원소 (32P 등), 염료, 형광물질, 방출 물질, 다양한 리간드 (바이오틴, 디곡시게닌 등), 효소 등을 사용할 수 있다. 라벨에 적절한 검출 방법을 사 용하여 표지된 프로브의 존재를 확인할 수 있다. 직접 검출할 수 없는 리간드의 경우, 검출가능한 라벨을 갖고 리간드-결합 물질을 배합하여 사용할 수 있다. 예를 들면, 표적 핵산을 리간드-표지된 프로브 및 효소-표지된 항-리간드 항체를 배합하여 사용하여 시그날을 증폭시켜 고감도로 검출할 수 있다.
형광 표지된 뉴클레오티드의 일례로 형광 물질 및 적절한 간격(spacing)으로 형광 물질로부터 방출되는 형광을 소광시키는 작용을 갖는 물질 모두로 표지된 뉴클레오티드를 포함한다. 그러한 프라이머는 완전한 상태인 경우 형광을 방광하지 않는다. 그러나 뉴클레아제로 절단되는 경우 형광을 방출하고, 형광 물질 소광 물질은 간격을 두고 위치한다. DNA 신장 반응이 개시됨과 동시에 상기 뉴클레오티드가 형광을 방출하기 때문에 반응하는 동안 반응 혼합물을 직접 관찰하여 염기 치환 존재 여부에 대한 정보를 가질 수 있다.
(2) 본 발명의 염기 치환 검출 방법.
상기 (1)에 기술된 바와 같은 본 발명의 뉴클레오티드가 본 발명의 염기 치환 검출 방법에 사용되고, 상기 방법은
(1) 표적 핵산을 포함하는 샘플을 뉴클레오티드와 혼합하고,
(2) 혼합물을 뉴클레아제 및 DNA 폴리머라제로 처리하고;
(3) 뉴클레아제를 사용한 뉴클레오티드의 절단의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 염기 치환 존재 여부는 상기 (1)에 기술된 본 발명의 뉴클레오티드의 특성에 따른 뉴클레아제로의 뉴클레오티드 절단 여부에 기초하여 결정된다.
본 발명의 염기 치환 검출 방법에서 싱글-스트랜드 또는 더블-스트랜드 핵산 (DNA 또는 RNA)을 표적 핵산으로서 사용할 수 있다. 사용되는 뉴클레아제에 따라, 표적 핵산으로서 RNA를 사용하는 것이 어려울 수 있다. 이러한 경우, RNA중 염기 치환은 주형으로서 RNA를 사용하여 cDNA를 제조하고 표적 핵산으로서 cDNA를 사용하여 검출할 수 있다.
본 발명에 따라, 표적 핵산을 포함하는 샘플을 검출 반응을 위해 사용할 수 있다.
가능한 핵산 또는 유기체 예를 들면, 세포, 조직(생검 샘플 등), 전체 혈액, 혈청, 뇌척수액, 정액, 침, 가래, 뇨, 대변, 모발 및 세포 배양을 포함할 수 있는 샘플을 제한없이 사용할 수 있다. 본 발명을 제한하는 것은 아니지만, 시험 샘플은 적절하게 공정된 후, 예를 들면, DNA 폴리머라제를 사용하여 반응을 수행할 수 있는 형태로 전환된 후 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 상기 공정은 세포 용혈 및 샘플로부터 핵산의 추출 및 정제를 포함한다.
본 발명의 염기 치환 검출 방법에 따라, 염기 치환 존재 여부는 사용된 뉴클레오티드의 절단 존재 여부 및 절단 후 DNA 신장 반응 존재 여부에 기초하여 결정한다. 결정 방법과 관련하여 특별히 제한하지 않고, 공지된 핵산 분석 방법을 사용할 수 있다. DNA 신장 반응의 존재 여부를 결정하는 방법은 하기를 포함한다: 전기 영동 (아가로스 겔, 폴리아크릴아미드 겔, 등) 또는 모세관 전기영동에 의해 확인하기 위해 형성된 신장 산물을 분리하는 방법; 및 질량분광분석법에 의해 증가된 신장 산물의 길이를 측정하는 방법. 또다른 일면으로, 뉴클레오티드를 신장 산물 내로의 도입을 측정하는 방법이 예시된다. 이 방법에서, 고분자 신장 산물내로 도 입된, 적절한 라벨을 갖는 뉴클레오티드 트리포스페이트의 양으로서 합성된 신장 산물의 양에 대한 정보를 가질 수 있다. 예를 들면, 산 침전 또는 전기 영동에 의해 비반응성 뉴클레오티드로부터 산물을 분리한 후, 형성된 신장 산물의 양을 측정할 수 있다. 또한, DNA 신장 반응시 형성된 피로포스페이트를 효소적 수단에 의해 측정하는 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 검출 방법에 따라, 신장 산물은 추가로 공지된 핵산 증폭 반응을 사용하여 증폭될 수 있다. 고감도 염기 치환 검출과 관련하여 상기 일면이 유용하다.
핵산에 상보적인 서열을 갖는 프라이머를 주형으로서 사용하는 다양한 핵산 증폭 방법을 제한하지 않고 핵산 증폭 반응으로서 사용할 수 있다. 예를 들면, 공지된 증폭 반응, 예를 들면, 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 방법 (미국 특허 Nos. 4,683,195, 4,683,202 및 4,800,159); JP-B 7-114718호에 기재된 스트랜드 치환 증폭(SDA) 방법, 자립복제(self-sustained sequence replicaiotn(3SR)) 방법, 일본 특허 제 2650159 호에 기재된 핵산서열 기초 증폭(NASBA) 방법, 전사-매개 증폭(transcription-mediated amplification(TMA)) 방법, 및 등온성 키메라성 프라이머-개시 핵산 증폭 방법(ICAN)(WO 00/56877)을 사용할 수 있다. 상기 방법에서 주형으로서 DNA 스트랜드에 상보적인 DNA 합성을 위한 프라이머로서 본 발명의 뉴클레오티드를 사용하여 표적 핵산중 염기 치환을 검출할 수 있다.
상기-언급된 핵산 증폭 방법을 사용하여 본 발명의 염기 치환 검출 방법을 수행하는 경우, 본 발명의 뉴클레오티드는 본 발명에 사용되는 적어도 하나의 프라 이머로서 사용되고, 뉴클레오티드에 적절한 뉴클레아제가 반응 시스템에 포함된다.
상기 기술한 바와 같이 핵산 증폭 반응을 사용하여 염기 치환 검출하는 방법에 따라, 상기 반응에 의한 특정 증폭 산물의 형성에 기초하여 염기 치환 존재 여부를 결정할 수 있다. 본 발명을 제한하는 것은 아니지만, 예를 들면, 겔(gel) 전기 영동, 증폭 산물에 상보적인 서열을 갖는 프로브를 사용하는 하이브리드제이션, 형광 표지된 뉴클레오티드를 사용하는 형광편광법, TaqMan 방법 등을 형성된 증폭 산물에 대하여 사용할 수 있다. 또한, 각각의 유전자 증폭 방법에 적절한 검출 방법 또한 사용할 수 있다.
염기 치환을 게놈 수준으로 본 발명의 검출 방법을 사용하여 분석하고자 하는 경우, 반응 시스템의 용적은 축소될 수 있고 다수의 염기 서열을 분석하기 위해 집적도를 증가시키는 방법을 조합하여 사용할 수 있다. 본 발명의 검출 방법 또는 분석 방법(예: 세포로부터의 DNA 추출, 핵산 증폭 반응, 관심의 대상이 되는 DNA 검출 등)의 기본 공정이 최신 초미세제조술 (microfabrication technique)을 사용하여 집적된 즉시 이용가능한 수 센티미터 스퀘어의 여러가지 크기의 마이크로칩은 상기 수단의 조합으로 사용할 수 있다. 임의로, 겔 또는 모세관 전기영동 및 검출 프로브와의 하이브리드제이션 공정을 조합할 수 있다. 그런한 시스템을 마이크로칩, 마이크로-모세관 전기영동 (CE) 칩 또는 나노칩으로 명명한다.
관심의 대상이 되는 DNA 단편이 상기 반응을 사용하여 증폭되는 한 상기 시스템에서 모든 핵산 증폭 반응을 사용할 수 있다. 본 발명을 제한하는 것은 아니지만, 예를 들면, 등온 조건하에 핵산을 증폭시킬 수 있는 방법, 예로서 ICAN 방법을 바람직하게 사용할 수 있다. 상기 방법과의 조합법이 시스템을 단순화시킬 수 있고 상기 언급된 집적화된 시스템에 매우 바람직하게 사용된다. 또한, 본 발명에 따른 기술을 사용하여 더욱 고도로 집적화된 시스템을 구축할 수 있다.
본 발명의 방법에서 본 발명의 뉴클레오티드에 변형된 뉴클레오티드를 포함시키고/거나 반응 온도를 적절하게 조절하여 염기 치환의 검출 특이성을 개선시킬 수 있다.
상기 (1)에 기술된 바와 같은 라벨을 갖는 본 발명의 뉴클레오티드는 DNA 신장 반응의 존재 여부를 용이하게 확인할 수 있도록 할 수 있고 본 발명의 염기 치환 검출 방법에 유용하다. 이러한 경우, 신장 반응의 존재 여부는 상기 기술된 바와 같은 라벨에 적절한 방법에 의해 뉴클레오티드로부터 유도된 표지된 물질을 검출하여 확인한다.
예를 들면, 형광 물질이 결합된 본 발명의 뉴클레오티드를 사용하고 라벨이 프라이머로서 사용되는 부분에 결합된 경우 형광을 사용하여 신장 산물을 검출할 수 있다. 라벨이 뉴클레오티드중 뉴클레아제에 대한 결합 부위의 3' 부분에 결합되어 있는 경우, 신장 반응 존재 여부는 표적 핵산으로부터의 3' 단편의 해리, DNA 폴리머라제의 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성에 기인한 단편의 소분자로의 전환 등에 기초하여 검출할 수 있다. 형광편광법은 바람직하게 형광 표지된 뉴클레오티드의 분자량의 변화를 포함하는 일례을 위해 사용한다.
형광 물질 및 형광 물질로부터 방출되는 형광을 소광시켜 형광이 방출되지 못하도록 하는 작용을 갖는 물질을 결합시켜 표지화된 본 발명의 뉴클레오티드를 사용하는 경우, 형광은 신장 반응 개시와 동시에 방출된다. 따라서, 염기 치환은 매우 용이하게 검출될 수 있다.
상기-언급된 각각의 일면에서, 검출하고자 하는 염기 치환 부위에 상응하는 위치에 각각 아데닌 (A), 시토신 (C), 구아닌 (G), 티민 (T) 또는 우라실 (U) 및 식별가능한 상이한 라벨을 갖는 뉴클레오티드를 사용하여, 염기 치환 존재 여부 및 동시에 치환된 염기 유형에 대한 정보를 가질 수 있다.
본 발명의 뉴클레오티드를 염기 치환 검출용 PCR에서 사용할 수 있다. 이러한 경우, 본 발명의 뉴클레오티드가 PCR 프라이머중 하나를 대신하여 사용되고 뉴클레오티드에 적절한 뉴클레아제가 추가로 PCR용의 일반 반응 혼합물에 첨가된다. 염기 치환은 PCR을 위한 조건하에서도 불활성화되지 않는 뉴클레아제를 선별하여 고감도로 검출될 수 있다.
인간을 포함하는 고등 동물의 세포는 일반적으로 한쌍의 염색체를 갖는 2배체이다. 따라서, 염기 치환이 하나의 염색체상의 특정 염기에 존재할 수 있다면, 하기와 같이 3가지 경우가 존재할 수 있다: 세포의 2개 염색체 모두 염기 치환을 갖지 않는 동형접합자 (호모형); 염기 치환이 염색체 모두에 존재하는 동형접합자 (호모형); 및 염색체중 하나만이 염기 치환을 갖는 이형접합체(헤테로형). 세포로부터 제조된 핵산 샘플에 본 발명의 염기 치환 검출 방법을 적용시켜 2배체 세포 또는 상기 세포를 갖는 개체의 유전형이 유전자중 특정 염기에 대하여 호모형 또는 헤테로형인지를 조사할 수 있다. 본 발명을 제한하는 것은 아니지만, 예를 들면, 4가지 형태의 염기에 상응하고 일치하는 경우 절단되는 뉴클레오티드를 사용하여 본 발며의 방법을 수행하는 경우, 유전자형이 헤테로형인 세포로부터 유래된 핵산 샘플에 대한 2기의 뉴클레오티드에 대한 뉴클레오티드 절단의 결과로서 시그날을 검출한다. 한편, 유전자형이 호모형인 세포로부터 유래된 핵산 샘플에 대한 뉴클레오티드중 하나만에 대하여 시그날이 검출된다. 또한, 호모형이 염기 치환을 갖는지 여부를 동시에 결정할 수 있다. 상기 기술한 바와 같이, 본 발명의 방법은 대립 형질중 염기 치환 검출에 유용하다.
(3) 본 발명의 염기 치환 검출에 사용되는 키트
본 발명은 상기 기술된 바와 같은 본 발명에 따른 염기 치환 검출 방법에 사용되는 키트를 제공한다. 일면으로, 키트는 본 발명의 뉴클레오티드를 포함한다. 뉴클레오티드 염기 치환 존재 여부 및 동시에 치환된 염기 형태를 결정하기 위하여 사용될 수 있는 4가지 유형의 염기중 하나를 각각 포함하는 한 세트의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 키트는 뉴클레오티드에 적절한 뉴클레아제, DNA 폴리머라제, DNA 폴리머라제에 대한 기질(dNTP), 반응에 적절한 완충액 등을 포함할 수 있다. 다르게, 키트는 프라이머-신장 산물 검출용 시약을 포함할 수 있다. 핵산 증폭 방법을 위해 사용되는 반응 혼합물을 제조하기 위한 시약을 포함하는 키트가 핵산 증폭 방법과 조합된 염기 치환 검출을 위한 키트로서 바람직할 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 더욱 상세히 설명하나, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되는 것은 아니다.
참고예 1: 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus) RNase H II 유전자의 클로닝
(1) 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)로부터 게놈 DNA의 제조
1% 트립톤(Difco Laboratories), 0.5% 효모 추출물(Difco Laboratories), 1% 가용성 전분(Nacalai Tesque), 3.5% Jamarine S Solid(Jamarine Laboratory), 0.5% Jamarine S Liquid(Jamarine Laboratory), 0.003% MgSO4, 0.001% NaCl, 0.0001% FeSO4·7H20, 0.0001% CoSO4, 0.0001% CaCl2·7H2 0, 0.0001% ZnSO4, 0.1 ppm CuSO4·5H20, 0.1 ppm KAI(SO4)2, 0.1 ppm H3BO 4, 0.1 ppm Na2MoO4·2H20 및 0.25 ppm NiCl2·6H20를 함유하는 2L 배지를 2L 배지용 병에 넣고, 120 ℃에서 20 분간 멸균하고, 질소 가스로 버블링하여 용해된 산소를 제거한 다음 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)(Deutsche Sammlung von Migrooranismen; DSM3638)를 배지내 접종하고 진탕하지 않고 95 ℃에서 16 시간동안 배양하였다. 배양 후 세포를 원심분리에 의해 회수하였다.
형성된 세포를 4㎖의 25% 수크로오스, 및 50 mM tris-HCl(pH 8.0)에 현탁시켰다. 여기에 10 ㎎/㎖의 수중 리소자임 클로라이드(Nacalai Tesque) 0.4 ㎖를 가하였다. 이 혼합물을 20 ℃에서 1 시간동안 반응시켰다. 반응 후, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA 및 20 mM tris-HCl(pH 8.0)을 함유하는 혼합물 24 ㎖, 20 ㎎/㎖ 프로테이나제 K(Takara Shuzo) 0.2 ㎖ 및 10% 소듐 라우릴 설페이트 수용액 2 ㎖를 반응 혼합물에 가하였다. 혼합물을 37 ℃에서 1 시간동안 인큐베이션시켰다.
반응 후 혼합물을 페놀-클로로포름 추출후 에탄올 침전시켜 1 ㎎의 게놈 DNA를 제조하였다.
(2) RNase HII 유전자의 클로닝
피로코쿠스 호리코시이(Pyrococcus horikoshii)의 전장 게놈 서열이 공개되어 있다[DNA Research, 5:55-76 (1998)]. 게놈중 RNase HII의 동족체를 코딩하는 하나의 유전자(PH1650)의 존재가 공지되어 있다(서열번호:1, the home page of National Institute of Technology and Evaluation: http://www.nite.go.jp/).
PH1650 유전자 및 일부 공개된 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)의 게놈 서열(the home page of University of Utah, Utah Genome Center: http://www.genome.utah.edu/sequence.html)의 상동성을 조사하였다. 그 결과, 고도의 상동성 서열을 발견하였다.
프라이머 1650Nde (서열번호:2) 및 1650Bam (서열번호:3)을 상동 서열에 기초하여 합성하였다.
주형으로서 (1)에서 수득한 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus) 게놈 DNA 200 ng을, 프라이머로서 20 pmol 1650Nde 및 20 pmol 1650Bam을 사용하여 100 ㎕의 용량으로 PCR을 수행하였다. Takara EX Taq(Takara Shuzo)를 첨부된 프로토콜에 따라 PCR를 위한 DNA 폴리머라제로서 사용하였다. PCR을 하기와 같이 수행하였다: 94 ℃에서 30 초간, 55 ℃에서 30 초간 및 72 ℃에서 1 분간의 30 싸이클. 약 0.7 kb의 증폭 DNA 단편을 NdeI 및 BamHI(모두 Takara Shuzo로부터 입수)로 분해하였다. 형성된 DNA 단편을 플라스미드 벡터 pET3a(Novagen)중 NdeI 및 BamHI 사이트 사이에 삽입하여 플라스미드 pPFU220을 제조하였다.
(3) RNase HII 유전자를 포함하는 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열의 확인
참고예 1-(2)에서 수득한 pPFU220 내로 삽입된 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열을 디데옥시 방법에 따라 확인하였다.
확인된 뉴클레오티드 서열을 분석하여 RNase HII를 코딩할 것으로 가정된 오픈 리딩 프레임을 밝혀냈다. 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오티드 서열을 서열번호 4에 나타내었다. 뉴클레오티드 서열로부터 유도된 RNase HII의 아미노산 서열을 서열번호 5에 나타내었다.
플라스미드 pPFU220으로 형질전환된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109를 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109/pPFU220으로 명명하여 2000년 9월 5일(원기탁일)에 기탁번호 FERM P-18020하에 International Patent Organism Depositary, National Institute of advanced Industrial Science and Technology, AIST Tsukuba Central(6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566, Japan)에 기탁하고, 부다페스트 조약하에 수탁 번호 BP-7654하에 2001년 7월 9일(국제 기탁 기관으로의 이관일)에 International Patent Organism Depositary, National Institute of advanced Industrial Science and Technology에 이관하였다.
(4) 정제 RNase HII 샘플의 제조
에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) HMS174(DE3) (Novagen)를 참고예 1-(2)에서 수득한 pPFU220으로 형질전환시켰다. pPFU220을 포함하는 형성된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) HMS174(DE3)를 100 ㎍/㎖의 앰피실린을 포함하는 2L의 LB 배지내로 접종하고 37 ℃에서 16 시간동안 진탕시키면서 배양하였다. 배양후, 원심분리에 의해 회수한 세포를 66.0㎖의 초음파 처리 완충액[50mM tris-HCl(pH 8.0), 1 mM EDTA, 2 mM 페닐메탄설포닐 플루오라이드]에 현탁시키고 초음파처리하였다. 10 분간 12000 rpm에서 초음파 처리된 현탁액을 원심분리하여 수득한 상층액을 60 ℃에서 15 분간 가열하였다. 이어, 12000 rpm에서 10 분간 다시 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 따라서, 61.5㎖의 가열된 상층액을 수득하였다.
가열된 상층액을 완충액 A[50 mM tris-HCl(pH 8.0), 1 mM EDTA]으로 평형화된 RESOURSE Q 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용하고 FPLC 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 크로마토그래피하였다. 그 결과, RNase HII는 RESOURSE Q 칼럼을 통해 이동하였다.
60.0 ㎖의 이동(flow-through) RNase HII 분획을 완충액 A로 평형화된 RESOURSE S 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용시키고 FPLC 시스템을 사용하여 0 내지 500 mM NaCl의 선형 구배로 용출시켰다. 약 150 mM NaCl로 용출된 RNase HII를 포함하는 분획을 수득하였다.
2.0 ㎖의 RNase HII 분획을 Centricon-10(Amicon)을 사용하여 한외여과에 의해 농축하였다. 농축액 250 ㎕를 100 mM NaCl 및 0.1 mM EDTA를 함유하는 50 mM tris-HCl(pH 8.0)로 평형화된 Superdex 200 겔 여과 컬럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용시키고 동일한 완충액으로 용출시켰다. 그 결과, RNase HII가 분자량 17 킬로달톤에 상응하는 위치에서 용출되었다. 이 분자량은 모노머 형태의 RNase HII의 분자량에 상응한다.
용리된 RNase HII를 Pfu RNase HII 샘플로서 사용하였다. 수득한 Pfu RNase HII 샘플의 RNase H 활성을 다음과 같이 측정하였다.
10mM tris-HCl(pH 8.0), 1 mM 디티오트레이톨(Nacalai Tesque), 0.003% 소 혈청 알부민(분획 V, Sigma), 4% 글리세롤, 20 ㎍/㎖ 폴리(dT)(Amersham Pharmacia Biotech) 및 30 ㎍/㎖ 폴리(rA)(Amersham Pharmacia Biotech)를 함께 혼합하였다. 이 혼합물을 37 ℃에서 10 분간 인큐베이션시키고 RNase H 활성 측정을 위한 기질 용액으로서 사용하였다.
1 ㎕의 1 M MnCl2를 100 ㎕의 기질 용액에 가하였다. 이 혼합물을 40℃에서 인큐베이션시켰다. Pfu RNase HII 샘플의 적합한 희석액을 혼합물에 첨가하여 반응을 개시하였다. 40 ℃에서 30 분간 반응시킨 후, 10 ㎕의 0.5 M EDTA를 가하여 반응을 종결시켰다. 260 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, Pfu RNase HII 샘플이 첨가된 반응 혼합물에 대하여 측정된 260㎚에서의 흡광도가 샘플 및 이어 10 ㎕의 0.5 M EDTA가 첨가된 반응 혼합물에 대하여 측정된 260㎚에서의 흡광도보다 높았다. 따라서, 샘플이 RNase H 활성을 가진다는 것이 입증되었다.
(5) 정제된 RNase H의 활성 측정
(a) 사용하는 시약 용액의 제조
활성 측정용 반응 혼합물 : 지적된 최종농도로 하기 물질을 멸균에 함유시켰다: 40 mM Tris-염산(pH 7.7, 37 ℃), 4 mM 염화마그네슘, 1 mM DTT, 0.003% BSA, 4% 글리세롤 및 24 μM 폴리(dT).
폴리[8-3H]아데닐산 용액 : 370 kBq의 폴리(8-3H)아데닐산 용액을 200 ㎕의 멸균수에 희석하였다.
폴리아데닐산 용액 : 폴리아데닐산을 초순수의 멸균수(sterile ultraqure water)를 사용하여 3 mM의 농도로 희석시켰다.
효소 희석액 : 지적된 최종농도로 하기 물질을 멸균수에 함유시켰다: 25 mM tris-염산(pH 7.5, 37 ℃), 5 mM 2-머캅토에탄올, 0.5 mM EDTA(pH 7.5, 37 ℃), 30 mM 염화나트륨 및 50% 글리세롤.
열변성 송아지 흉선 DNA의 제조 : 송아지 흉선 DNA 200 ㎎을 TE 완충액 100 ㎖에 현탁하여 팽윤시켰다. 이 용액을 UV 260 ㎚에서 측정된 흡광도에 기초하여 1 ㎎/㎖의 농도가 되도록 멸균 초순수로 희석하였다. 희석시킨 용액을 100 ℃에서 10 분간 가열한 후 얼음조에서 급냉하였다.
(b) 활성 측정 방법
상기 (1)에서 제조한 활성측정용 반응 혼합물 985 ㎕에 폴리[8-3H]아데닐산 용액 7 ㎕를 가하였다. 상기 혼합물을 37 ℃에서 10 분간 인큐베이션시켰다. 이 반응 혼합물에 최종농도가 24 μM이 되도록 8 ㎕의 폴리아데닐산을 가하였다. 추가로 37 ℃에서 5 분간 인큐베이션시켰다. 이렇게 하여 폴리[8-3H]rA-폴리-dT 반응 혼합물 1000 ㎕를 제조하였다. 그 후, 이 반응 혼합물 200 ㎕를 30 ℃에서 5 분간 인큐베이션시켰다. 적절하게 희석된 일련의 효소액 1 ㎕를 가하였다. 시간동안 이들 반응액을 50 ㎕씩 샘플링하여, 다음 측정에 사용하였다. 효소첨가로부터 샘플링까지의 시간을 Y분으로 하였다. 또, 총 CPM용 반응 혼합물 50 ㎕ 또는 블랭크용 반응 혼합물 50 ㎕를 효소액 대신에 효소 희석액 1 ㎕ 가하여 제조하였다. 이 샘플에 100 mM 피로인산 나트륨 100 ㎕, 열변성 송아지 흉선 DNA 용액 50 ㎕ 및 10% 트리클로로아세트산 300 ㎕(총 CPM 측정의 경우는, 초순수 300 ㎕)를 가하였다. 혼합물을 0 ℃에서 5 분간 인큐베이션시킨 후, 10000 rpm에서 10 분간 원심분리하였다. 원심분리후, 수득된 상층액 250 ㎕를 바이얼에 넣었다. 여기에 Aquasol-2(NEN Life Science Products) 10 ㎖를 가하였다. 액체 신틸레이션 카운터(Scintillation counter)로 CPM을 측정하였다.
(c) 유니트 계산
각 효소의 유니트 값을 이하의 계산식으로 산출하였다.
유니트/㎖ = {(측정된 CPM-블랭크 CPM) x 1.2* x 20 x 1000 x 희석율}200(㎕)/(총 CPM x Y(분) x 50(㎕) x 9**)
1.2* : 50 ㎕당 총 CPM중에 함유된 폴리[8-3H]rA-폴리dT의 양(nmol)
9** : 보정계수
참고 실시예 2: 아키오글로부스 풀기두스( Archaeoglobus fulgidus )로부터 RNase HII 유전자의 클로닝
(1) 아키오글로부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus)로부터 게놈 DNA의 제조
8 ㎖의 배양액으로부터 회수된 아키오글로부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus)(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen로부터 구입; DSM4139) 세포를 100 ㎕의 25% 수크로오스, 50 mM tris-HCl(pH 8.0)에 현탁시켰다. 여기에 수중 20 ㎕의 0.5 M EDTA 및 10 ㎕의 10 ㎎/㎖ 리소자임 클로라이드(Nacalai Tesque)를 가하였다. 혼합물을 20 ℃에서 1 시간동안 반응시켰다. 반응 후, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA 및 20 mM tris-HCl(pH 8.0)의 혼합물 800 ㎕, 20 ㎎/㎖ 프로테이나제 K(Takara Shuzo) 10 ㎕ 및 10% 소듐 라우릴 설페이트 수용액 50 ㎕를 반응 혼합물에 가하였다. 혼합물을 37 ℃에서 1 시간동안 인큐베이션시켰다. 반응 후, 혼합물을 페놀-클로로포름 추출, 에탄올 침전 및 공기-건조시킨 후 50 ㎕의 TE에 용해시켜 게놈 DNA 용액을 수득하였다.
(2) RNase HII 유전자 클로닝
아키오글로부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus)의 전장 게놈 서열이 공개되어 있다[Klenk, HP et al., Nature, 390: 364-370(1997)]. RNase HII의 동족체를 코딩하는 하나의 유전자(AF0621)의 존재가 공지되어 있다(서열번호: 13, http://www.tigr.org/tdb/CMR/btm/htmls/SplashPage.htlm).
프라이머 AfuNde(서열번호: 14) 및 AfuBam(서열번호: 15)을 Af0621 유전자(서열번호: 13)에 기초하여 합성하였다.
주형으로서 참고 실시예 2-(1)에서 제조한 아키오글로부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus) 게놈 DNA 30 ng을, 프라이머로서 각각 20 pmol의 AfuNde 및 AfuBam을 사용하여 100 ㎕의 용량으로 수행하였다. Pyrobest DNA 폴 리머라제(Takara Shuzo)를 첨부된 프로토콜에 따라 PCR를 위한 DNA 폴리머라제로서 사용하였다. PCR을 하기와 같이 수행하였다: 94 ℃에서 30 초간, 55 ℃에서 30 초간, 72 ℃에서 1 분간의 40 싸이클. 약 0.6kb의 증폭 DNA 단편을 NdeI 및 BamHI(둘다 Takara Shuzo로부터 입수)로 분해하였다. 이어서, 플라스미드 pAFU204를 플라스미드 벡터 pTV119Nd중 NdeI 및 BamHI 사이의 형성된 DNA 단편에 삽입하여 작제하였다(pTV119중 NcoI 사이트가 NdeI 사이트로 전환된 플라스미드).
(3) RNase HII 유전자를 포함하는 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열의 확인
참고 실시예 2-(2)에서 수득한 pAFU204 내로 삽입된 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열을 디데옥시 방법에 의해 확인하였다.
확인된 뉴클레오티드 서열을 분석하여 RNase HII를 코딩하는 것으로 가정된 오픈 리딩 프레임의 존재를 밝혀냈다. 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오티드 서열을 서열번호 16에 나타내었다. 뉴클레오티드 서열로부터 유도된 RNase HII의 아미노산 서열을 서열번호 17에 나타내었다.
플라스미드 pAFU204로 형질전환된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109를 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109/pAFU204로 명명하여 2001년 2월 22일(원기탁일)에 기탁번호 FERM P-18221하에 International Patent Organism Depositary, National Institute of advanced Industrial Science and Technology, AIST Tsukuba Central(6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566, Japan)에 기탁하고, 부다페스트 조약하에 수탁 번호 BP-7691하에 2001년 8월 2일(국제 기탁 기관으로의 이관일)에 International Patent Organism Depositary, National Institute of advanced Industrial Science and Technology에 이관하였다.
(4) 정제 RNase HII 샘플 제조
에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)를 참고 실시예 2-(2)에서 수득한 pAFU204로 형질전환시켰다. pAFU204를 포함하는 형성된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109를 100 ㎍/㎖의 앰피실린을 포함하는 2L의 LB 배지내로 접종하고 37 ℃에서 16 시간동안 진탕시키면서 배양하였다. 배양후, 원심분리에 의해 회수한 세포를 37.1 ㎖의 초음파 처리 완충액[50mM tris-HCl(pH 8.0), 1 mM EDTA, 2 mM 페닐메탄설포닐 플루오라이드]에 현탁시키고 초음파처리하였다. 12000 rpm에서 10 분간 초음파 처리된 현탁액을 원심분리하여 수득한 상층액을 70 ℃에서 15 분간 가열하였다. 그 후, 12000 rpm에서 10 분간 다시 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 따라서, 40.3 ㎖의 가열된 상층액을 수득하였다.
가열된 상층액을 완충액 A[50 mM tris-HCl(pH 8.0), 1 mM EDTA]으로 평형화된 RESOURSE Q 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용하고 FPLC 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 크로마토그래피하였다. 그 결과, RNase HII는 RESOURSE Q 칼럼을 통해 이동하였다.
이동(flow-through) RNnase HII 분획을 완충액 A로 평형화된 RESOURSE S 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용하고 FPLC 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 크로마토그래피하였다. 그 결과, RNase HII는 RESOURSE S 칼럼을 통해 이동하였다.
40.0㎖의 이동 RNnase HII 분획을 50 mM NaCl을 포함하는 2L의 완충액 B[50 mM tris-HCl(pH 7.0), 1 mM EDTA]을 2 시간동안 투석하였다. 투석을 2 회 더 반복하였다. 40.2 ㎖의 투석 효소 용액을 50 mM NaCl를 포함하는 완충액 B로 평형화된 HiTrap-heparin 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용시키고 FPLC 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 50 내지 550 mM NaCl의 선형 구배로 용출시켰다. 약 240 mM NaCl로 용출된 RNase HII를 포함하는 분획을 수득하였다.
7.8㎖의 RNase HIII 분획을 Centricon-10(Amicon)을 사용하여 한외여과에 의해 농축시켰다. 약 600 ㎕의 농축액으로부터 각각 분리된 4 개의 분량을 100 mM NaCl 및 0.1 mM EDTA를 포함하는 50 mM Tris-HCl(pH 7.0)로 평형화된 Superose 6 겔 여과 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용시키고 동일한 완충액으로 용출시켰다. 그 결과, RNase HII가 분자량 30.0 킬로달톤에 상응하는 위치에서 용출되었다. 이 분자량은 모노머 형태의 RNase HII의 분자량과 일치한다.
상술한 바와 같이 용출된 RNase HII를 Afu RNase HII 샘플로서 사용하였다.
수득한 Afu RNase HII 샘플의 효소 활성을 참고 실시예 1-(5)에 기술된 바와 같이 측정하였다. 그 결과, Afu RNase HII 샘플에 대한 RNase H 활성을 관찰하였다.
하기 실시예에 사용된 열-내성 RNase H의 유니트 값을 다음과 같이 산출하였다.
1 ㎎의 폴리(rA) 또는 폴리(dT) (모두 Amersham Pharmacia Biotech로부터 입 수)를 1 mM EDTA를 포함하는 1 ml의 40 mM tris-HCl(pH 7.7)에 용해시켜 폴리(rA) 용액 및 폴리(dT) 용액을 제조하였다.
그 후, 폴리(rA) 용액(20 ㎍/㎖의 최종 농도) 및 폴리(dT) 용액(30 ㎍/㎖의 최종 농도)을 4 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0.003% BSA 및 4% 글리세롤을 함유하는 40 mM tris-HCl(pH 7.7)에 가하였다. 이 혼합물을 37 ℃에서 10 분간 반응시킨 후 4 ℃로 냉각시켜 폴리(rA)-폴리(dT) 용액을 제조하였다. 적절히 희석시킨 효소 용액 1 ㎕을 100 ㎕의 폴리(rA)-폴리(dT) 용액에 가하였다. 이 혼합물을 40 ℃에서 10 분간 반응시켰다. 10 ㎕의 0.5 M EDTA를 가하여 반응을 종결시켰다. 260 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로서, 10 ㎕의 0.05 M EDTA를 반응 혼합물에 가하고 형성된 혼합물을 40 ℃에서 10 분간 반응시킨 후 흡광도를 측정하였다. EDTA가 존재하지 않은 반응에서의 흡광도로부터 대조군의 흡광도를 감하여 값(흡광도 차)을 수득하였다. 따라서, 효소 반응에 의한 폴리(rA)-폴리(dT) 하이브리드로부터 유리된 뉴클레오티드의 농도를 흡광도 차에 기초하여 측정하였다. 1 유니트의 RNase H는 하기 식에 따라 산출되는 10 분후 1 nmol의 리보뉴클레오티드의 유리에 상응하여 A260를 증가시키는 효소의 양으로 정의된다.
유니트 = [흡광도 차 x 반응 용량(㎖)] / 0.0152 x (110/100) x 희석율
실시예 1: 인간 c-Ki-ras 유전자중 염기 치환 검출
(1) 주형의 제조
인간 c-Ki-ras 엑손 1중 코돈 12에 대하여 각각 서열 GGT (Gly), CGT (Arg), TGT (Cys) 또는 AGT (Ser)을 갖는 DNA 단편을 제조하였다. 간단하게 ras Mutant Set c-Ki-ras 코돈 12 (Takara Shuzo) 및 ras Gene 프라이머 Set c-Ki-ras/12 (Takara Shuzo)중 상기 언급된 코돈에 상응하는 주형 DNAs를 사용하여 PCRs에 의해 수득한 증폭 산물을 벡터 pT7-Blue (Novagen)내로 클로닝하였다. 주형으로서 수득한 재조합 플라스미드 및 M13 프라이머 M4 및 RV (모두 Takara Shuzo로부터 입수)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 형성된 증폭 단편을 회수하고 각각 주형으로서 12G, 12R, 12C 및 12S로 명명하였다.
(2) 염기 치환 검출
인간 c-Ki-ras 엑손 1의 염기 서열에 기초하여 주형 12G를 특이적으로 검출하기 위한 전향 뉴클레오티드로서 서열번호:7 내지 9의 염기 서열을 갖는 3개의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 각 키메라성 올리고뉴클레오티드의 3' 말단의 뉴클레오티드의 리보오스 부위의 3번 위치의 하이드록실 그룹을 아미노헥실로 변형시켰다. 각각의 뉴클레오티드는 코돈 12가 Gly를 코딩하는 인간 c-Ki-ras 엑손 1의 염기 서열에 상보적인 서열을 가졌다. 서열번호 6의 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 핵산 증폭용 안티센스 프라이머로서 합성하였다. 50 pmol의 각각의 전향 뉴클레오티드 및 안티센스 프라이머, 1 ㎕의 0.25% 프로필렌디아민 수용액 및 주형으로서 1 pg의 주형 12G, 12C, 12R 및 12S중 하나를 포함하는 총량 5 ㎕의 반응 혼합물을 제조하였다. 전향 뉴클레오티드 및 안티센스 프라이머를 Thermal Cycler Personal (Takara Shuzo)에서 98℃에서 2분 이어서 53℃에서 가열하여 주형에 어닐링하였다. 0.625 mM dNTP 믹스, 40 mM Hepes-KOH 완충액 (pH 7.8), 125 mM 포타슘 아세테이트, 5 mM 마그네슘 아세테이트, 0.0125% 소 혈청 알부민, 1.25% 디메틸 설폭시드, 참고 실시예 1에 기술된 바와 같은 16 U의 Pfu RNase HII, 5.5 U의 BcaBest DNA 폴리머라제 (Takara Shuzo) 및 멸균수를 포함하는 20 ㎕의 혼합물을 가열된 혼합물에 가하여 최종 부피를 25 ㎕로 만들었다. 반응 혼합물을 53℃에서 1시간동안 인큐베이션하였다. 반응후, 5 ㎕의 각 반응 혼합물을 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 결과를 도 1에 나타낸다. 주형 12G, 12C, 12R 및 12S를 사용한 반응 혼합물을 각각 도 1-1, 1-2 및 1-3에 나타낸 바와 같이 아가로스 겔중 레인 1 내지 4에 적용시켰다. 도 1-1, 1-2 및 1-3이 서열번호:7, 8 및 9의 뉴클레오티드를 사용하는 반응에 대한 결과를 나타낸다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 서열번호:7-9의 뉴클레오티드를 사용하여 단지 주형 12G를 사용하였을 때만, 즉 표적 핵산인 코돈 12에 대한 Gly를 코딩하는 경우에만 증폭 산물이 관찰되었다. 이 결과는 표적 핵산중 염기 치환은 본 발명의 뉴클레오티드를 사용하여 식별될 수 있음을 나타낸다. 또한, 이노신을 포함하는 뉴클레오티드를 사용하여 특정 증폭을 개선시킬 수 있음을 확인하였다.
실시예 2: c-Ki-ras 코돈 12에 대한 다른 대립 형질의 검출
실시예 1의 결과에 기초하여, 실시예 1-(1)에서 제조된 12R, 12C 및 12S중 코돈 12의 염기를 특이적으로 식별할 수 있는 뉴클레오티드로서 서열번호:10 내지 12의 염기 서열을 갖는 3개의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 서열번호:10, 11 및 12는 코돈 12가 각각 Cys, Arg 및 Ser을 코딩하는 대립 형질에 상응하는 염기 서열을 나타낸다. 각 키메라성 올리고뉴클레오티드의 3' 말단의 뉴클레오티드의 리 보오스 부위의 3번 위치의 하이드록실 그룹을 아미노헥실로 변형시켰다. 실시예 1-(2)에 기술된 바와 같은 반응 조건하에 각각의 서열번호: 6의 안티센스 프라이머 및 이들 뉴클레오티드를 사용하여 반응을 수행하였다. 반응후, 5 ㎕의 각 반응 혼합물을 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 결과를 도 2에 나타낸다. 주형 12G, 12C, 12R 및 12S를 사용한 반응 혼합물을 각각 도 2-1, 2-2 및 2-3에 나타낸 바와 같이 아가로스 겔중 레인 1 내지 4에 적용시켰다. 도 2-1, 2-2 및 2-3이 서열번호:10, 11 및 12의 뉴클레오티드를 사용하는 반응에 대한 결과를 나타낸다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 각각 서열번호:10, 11 및 12의 뉴클레오티드를 주형 12C, 12R 및 12S와 배합하여 사용하였을 때만 특정 증폭 산물이 관찰되었다. 따라서 본 발명의 뉴클레오티드를 관심의 대상이 되는 염기를 정확하게 식별할 수 있다. 또한, 이노신을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 특정 증폭을 개선시킬 수 있다고 확인하였다.
실시예 3: 게놈 DNA의 대립 형질-특이성 DNA 증폭
상기 (2)에 기술된 조건하에 반응을 수행하였다. 반응에서, c-Ki-ras 엑손 1중 코돈 12가 Gly(GGT)를 코딩함을 입증하기 위한 150 ng 또는 30 ng의 인간 게놈 DNA (Clontech), 실시예 1 및 2에서 코돈 12에 대한 4개의 대립 형질을 특이적으로 검출할 수 있음을 입증하는 (각각 코돈 12에서 Gly, Cys, Arg 및 Ser에 상응하는) 서열번호:7, 10, 11 및 12의 뉴클레오티드, 및 서열번호6의 안티센스 프라이머를 사용하였다. 반응후, 5 ㎕의 각 반응 혼합물을 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 결과를 도 3에 나타낸다.
서열번호: 7, 10, 11 및 12의 뉴클레오티드를 사용하는 반응 혼합물을 각각 도 3-1 및 3-2에 나타낸 바와 같이 아가로스 겔중 레인 1 내지 4에 적용시켰다. 도 3-1 및 3-2는 각각 150 ng 및 30 ng의 인간 게놈 DNA를 사용한 결과를 나타낸다.
도 3에 나타낸 바, DNA 단편의 증폭은 서열번호:7의 뉴클레오티드를 인간 게놈 DNA의 양과 상관없이 사용한 경우에만 관찰된 반면, 다른 뉴클레오티드를 사용할 때 DNA 단편의 증폭은 관찰되지 않았다. 이 결과로 본 발명의 염기 치환 방법이 게놈 DNA중 특정 대립 형질을 검출하기 위하여 사용할 수 있음이 입증되었다.
실시예 4: 다양한 RNase H's를 사용한 검출
실시예 1에 기술된 바와 같은 염기 치환의 검출에서 다양한 RNase H's의 사용을 조사하였다.
특히, 참고 실시예 2에서 기술된 바와 같은 Afu RNase HII 또는 Mja RNase HII, 메타노코쿠스 잔나시(Methanococcus jannashi)로부터 제조된 RNase H(Structure, 8:897-904에 기술된 바와 같이 제조)를 Pfu RNase HII 대신 사용하였다. 실시예 1에 기술된 바와 같은 조건하에 서열번호:7의 뉴클레오티드를 전향 뉴클레오티드 및 서열번호:6의 올리고뉴클레오티드를 안티센스 프라이머로서 사용하여 반응을 수행하였다. 반응후, 5 ㎕의 각 반응 혼합물을 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 결과를 도 4에 나타낸다. 주형 12G, 12C, 12R 및 12S를 사용한 반응 혼합물을 각각 도 4-1 및 4-2에 나타낸 바와 같이 아가로스 겔중 레인 1 내지 4에 적용시켰다. 도 4-1 및 4-2가 각각 Afu RNase HII 및 Mja RNase HII를 사용한 반응에 대한 결과를 나타낸다.
도 4에 나타낸 바와 같이, Afu RNase HII 및 Mja RNase HII 사용하여 단지 주형 12G를 사용하였을 때만, 즉 표적 핵산인 코돈 12에 대한 Gly를 코딩하는 경우에만 증폭 산물이 관찰되었다. 이 결과는 표적 핵산중 염기 치환은 이들 RNase H's를 사용하여 식별될 수 있음을 나타낸다.
실시예 5: 변성 단계를 요하는 DNA 증폭 반응 시스템 (PCR)을 사용하는 SNP 검출
변성 단계를 요하는 DNA 증폭 반응 시스템을 사용하여 본 발명의 방법을 조사하였다. 서열번호:25의 키메라성 올리고뉴클레오티드를 인간 c-Ki-ras 엑손 1의 염기 서열에 기초하여 주형 12G를 특이적으로 검출하기 위한 센스 뉴클레오티드로서 합성하였다. 각 키메라성 올리고뉴클레오티드의 3' 말단의 뉴클레오티드의 리보오스 부위의 3번 위치의 하이드록실 그룹을 아미노헥실로 변형시켰다. 서열번호 18의 염기 서열을 갖는 프라이머를 안티센스 프라이머로서 합성하였다. 50 pmol의 각각의 합성 뉴클레오티드 및 프라이머(센스 프라이머 및 안티센스 프라이머), 2.5 ㎕의 Ex Taq 완충액(Takara Shuzo), 2㎕의 2.5 mM dNTP 믹스, 50U의 Afu RNase HII 및 0.625U의 Ex Taq DNA 폴리머라제(Takara Shuzo)를 포함하는 총량 24 ㎕의 반응 혼합물을 제조하였다. 실시예 1에서 제조된 10ng/㎕의 주형 12G, 12C, 12R 또는 12S 1㎕을 바는 혼합물에 가하였다. Thermal Cycler Personal (Takara Shuzo)을 사용하여 하기와 같이 PCR을 수행하였다: 5초동안 94℃, 2분동안 59℃ 및 5초동안 72℃에서 25 또는 30회 싸이클. 반응 후 1 ㎕의 각 반응 혼합물을 Agilent 2100 Bioanalyzer (Hewlett-Packard)을 사용하여 분석하였다. 도 5에 결과를 나타낸다. 도 5는 각 주형에 대한 관심의 대상이 되는 증폭 산물의 양을 나타내는 그래프이다. 세로축은 관심의 대상이 되는 증폭 산물의 양을 나타내고 수직선은 PCR 사이클 수를 나타낸다. 도 5에 나타낸 바, 관심의 대상이 되는 DNA의 특정 증폭은 대립 형질이 검출을 위해 사용되는 프라이머와 일치하는 주형 12G를 사용할 때만 관찰되었다. 따라서, 본 발명의 방법이 주형으로서 핵산을 변성시키는 단계를 요구하는 DNA 증폭 반응 시스템에 유효하였다.
실시예 6: K-ras 코돈 61의 대립 형질-특이 검출
또다른 염기 치환의 검출을 조사하였다. 특히, 서열번호:19 및 20의 DNA 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭된 인간 c-Ki-ras 엑손 2중 코돈 61에 대하여 각각 서열 CAA (Glu), AAA (Lys) 또는 GAA (Gln)을 갖는 DNA 단편을 벡터 pT7-Blue로 클로닝하였다. DNA 단편이 클로닝된 벡터를 통상의 방법에 따라 정제하고 각각 61Q, 61K 및 61E로 명명하였다. 실시예 1-(2)의 결과에 기초하여, 서열번호:21, 22 및 23의 키메라성 올리고뉴클레오티드를 인간 c-Ki-ras 엑손 2의 염기 서열에 기초하여 각각의 벡터 61Q, 61K 및 61E를 특이적으로 검출하기 위한 뉴클레오티드로서 합성하였다. 각 키메라성 올리고뉴클레오티드의 3' 말단의 뉴클레오티드의 리보오스 부위의 3번 위치의 하이드록실 그룹을 아미노헥실로 변형시켰다. 하기 반응을 센스 프라이머로서 뉴클레오티드 및 안티센스 프라이머로서 서열번호:24의 프라이머를 사용하여 하기 반응을 수행하였다. 50 pmol의 각각의 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머 (센스 및 안티센스 프라이머), 1 ㎕의 0.05% 프로필렌디아민 수용액 및 10 pg의 주형 DNA 61Q, 61K 및 61E중 하나를 포함하는 총량 5 ㎕의 반응 혼합물 을 제조하였다. 프라이머를 Thermal Cycler Personal (Takara Shuzo)에서 98℃에서 2분 이어서 53℃에서 가열하여 주형에 어닐링하였다. 0.625 mM dNTP 믹스, 40 mM Hepes-KOH 완충액 (pH 7.8), 125 mM 포타슘 아세테이트, 5 mM 마그네슘 아세테이트, 0.0125% 소 혈청 알부민, 1.25% 디메틸 설폭시드, 11 U의 Afu RNase HII (Takara Shuzo), 5.5 U의 BcaBest DNA 폴리머라제 (Takara Shuzo) 및 멸균수를 멸균수를 포함하는 20 ㎕의 혼합물을 가열된 혼합물에 가하여 최종 부피를 25 ㎕로 만들었다. 반응 혼합물을 58℃에서 1시간동안 인큐베이션하였다. 반응후, 5 ㎕의 각 반응 혼합물을 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 결과를 도 6에 나타낸다. 도 6A는 61Q을 검출하기 위한 서열번호:21의 프라이머를 사용하여 검출하는 결과를 나타내는 전기영동 패턴이다. 레인 1, 2 및 3은 각각 주형으로서 주형 61Q, 61K 및 61E을 사용하여 수득한 결과를 나타낸다. 도 6B는 61K을 검출하기 위한 서열번호:22의 프라이머를 사용하여 검출하는 결과를 나타내는 전기영동 패턴이다. 레인 1, 2 및 3은 각각 주형으로서 주형 61Q, 61K 및 61E을 사용하여 수득한 결과를 나타낸다. 도 6C는 61E을 검출하기 위한 서열번호:23의 프라이머를 사용하여 검출하는 결과를 나타내는 전기영동 패턴이다. 레인 1, 2 및 3은 각각 주형으로서 주형 61Q, 61K 및 61E을 사용하여 수득한 결과를 나타낸다.
도 6A, 6B 및 6C에 나타낸 바와 같이, 관심의 대상이 되는 DNA 증폭 산물은 서열번호:21, 22 및 23을 사용하는 대립 형질-특이 방식으로 ICAN 반응에 의해 수득된다는 것이 입증되었다. 따라서, 본 발명의 방법은 목적 염기 치환을 변화되는 경우 유효함이 입증되었다.
실시예 7: CYP2C19(636)의 대립 형질-특이 검출
(1) 헤테로형으로부터 유전자 호모형을 식별하는 검출 방법을 조사하였다. 인간 CYP2C19중 636번째 대립 형질을표적으로서 선별하였다. 우선, 인간 CYP2C19중 636번째 유전자가 G 또는 A인, 서열번호 26 및 27의 DNA 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭된 DNA 단편을 벡터 pT7-Blue로 클로닝하였다. 이들 DNA 단편이 클로닝된 플라스미드를 통상의 방법에 따라 정제하고 플라스미드 636G 및 636A로 명명하였다.
플라스미드 636G 및 636A 플라스미드 636G 및 636A를 1:1로 혼합하여 제조된 플라스미드 636G/A를 주형으로서 사용하였다. 플라스미드 636G 및 636A가 유전자적 호모형의 모델로 사용된 반면, 플라스미드 636G/A는 유전자적 헤테로형의 모델로 사용되었다. 이후, 서열번호:28 및 29의 뉴클레오티드를 각각 636G 및 636A를 특이적으로 검출하기 위한 뉴클레오티드로서 합성하였다. 센스 프라이머로서 뉴클레오티드 및 안티센스 프라이머로서 서열번호:30의 프라이머를 사용하여 이후 반응을 수행하였다. 50 pmol의 각각의 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머(센스 및 안티센스 프라이머), 1 ㎕의 0.05% 프로필렌디아민 수용액 및 주형 DNA로서 1 pg의 플라스미드 636G, 636A, 636G/A중 하나를 포함하는 총량 5 ㎕의 반응 혼합물을 제조하였다. 프라이머를 Thermal Cycler Personal (Takara Shuzo)에서 98℃에서 2분 이어서 53℃에서 가열하여 주형에 어닐링하였다. 0.625 mM dNTP 믹스, 40 mM Hepes-KOH 완충액 (pH 7.8), 125 mM 포타슘 아세테이트, 5 mM 마그네슘 아세테이트, 0.0125% 소 혈청 알부민, 1.25% 디메틸 설폭시드, 11 U의 Afu RNase HII, 5.5 U의 BcaBest DNA 폴리머라제 및 멸균수를 포함하는 20 ㎕의 혼합물을 가열된 혼합물에 가하여 최종 부피를 25 ㎕로 만들었다. 반응 혼합물을 53℃에서 1시간동안 인큐베이션하였다. 반응후, 5 ㎕의 각 반응 혼합물을 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 결과를 도 7A 및 7B에 나타낸다. 도 7A는 뉴클레오티드 636G를 사용한 검출 결과를 나타내는 전기영동 패턴이다. 레인 1, 2 및 3은 각각 주형으로서 플라스미드 636G, 636A, 636G/A를 사용하여 수득한 결과를 나타낸다.
도 7B는 뉴클레오티드 636A를 사용한 검출 결과를 나타내는 전기영동 패턴이다. 레인 1, 2 및 3은 각각 주형으로서 라스미드 636G, 636A, 636G/A를 사용하여 수득한 결과를 나타낸다. 도 7A 및 7B에 나타낸 바와 같이, 뉴클레오티드를 사용하여 대립 형질-특이 방식으로 검출을 수행할 수 있음을 확인하였다.
(2) 인간 게놈 DNA를 분석을 위한 PCR-RFLP과의 비교에서 주형으로서 사용하였다. 150 ng의 인간 게놈 DNA (Clontech)을 주형으로서 사용하여 상기 (1)에 기술된 바와 같이 SNP 타이핑을 수행하였다. 결과를 도 7C에 나타낸다. 도 7C는 인간 게놈 DNA의 SNP 타이핑에 대한 결과를 나타낸 전기영동 패턴이다. 레인 1 및 2는 각각 뉴클레오티드 636G 및 636A를 사용하여 수득한 결과를 나타낸다.
도 7C에 나타낸 바와 같이, 관심의 대상이 되는 증폭된 DNA는 뉴클레오티드 636G를 사용한 경우에만 검출되었다. CYP2C19의 게놈 DNA중 636번째 대립 형질은 호모형(636G/G)인 것으로 측정되었다.
반면, 인간 게놈 DNA를 사용하여 PCR-RFLP에 의해 타이핑을 수행하였다. 150 ng의 게놈 DNA 및 서열번호:26 및 27의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 형 성된 PCR 증폭 산물을 BamHI로 처리하고 반응 혼합물을 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 결과를 도 7D에 나타낸다. 도 7D는 주형으로서 인간 게놈 DNA를 사용하여 PCR-RFLP에 의해 타이핑에 대한 결과를 나타낸 전기영동 패턴이다. 레인 1 및 2는 PCR 증폭 산물 및 BamHI로 분해된 PCR 증폭 산물에 대한 결과를 나타낸다.
도 7D에 나타낸 바와 같이, PCR 증폭 산물은 BamHI에 의해 완전히 분해되었다. 따라서, 게놈 DNA중 CYP2C19의 636번째 대립 형질 또한 PCR-RFLP에 의해 호모형(636G/G)인 것으로 측정되었다. 본 발명의 염기 치환 방법을 사용하여 수득한 결과가 PCR-RFLP에 의해 통상의 SNP 타이핑을 사용하여 수득한 것과 일치한다는 것을 확인하였다.
(3) 상기 (1)에서 제조한 플라스미드 636G, 636A, 636G/A를 사용하여, 상동성 염색체의 유전자형을 가정하고 검출 방법을 조사하였다. 반응을 하기와 같이 수행하였다. 우선, 서로 식별가능할 수 있는 5'-말단에 결합된 형광 라벨 Rox (ABI) 및 Fam (ABI)을 갖는 뉴클레오티드 636G 및 636A를 합성하였다. 동량의 형광 표지된 뉴클레오티드를 포함하는 혼합물을 사용하였다. 상기 (1)에 기술된 바와 같이 검출을 수행하였다. 반응후, 각 반응 혼합물의 일부를 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켜 반응하지 않는 형광 표지된 뉴클레오티드로부터 증폭 산물을 완전하게 분리시켰다. 전기영동후, 아가로스 겔을 FM-BIO II Multi-View (Takara Shuzo)를 사용하여 분석하였다. 결과, 플라스미드 636G를 주형으로서 사용하였을 때, 오직 형광 라벨 Rox로부터의 형광 시그날만 관찰되었다. 플라스미드 636A를 주형으로서 사용하였을 때, 오직 형광 라벨 Fam으로부터의 형광 시그날만 관찰되었다. 또한, 플라스미드 636G/A를 주형으로서 사용하였을 때, Rox 및 Fam 둘 모두로부터 형광 시그날이 관찰되었다. 이들 결과에 기초하여, 상동 염색체상의 유전자형(호모형 또는 헤테로형)을 분석하기 위하여 사용할 수 있는 방법으로서 본 발명의 방법이 유용함을 확인하였다.
실시예 8: 전체 혈액으로부터 추출된 게놈 DNA을 사용한 타이핑
동의서를 받은 후 건강한 개체로부터 채취한 200㎕의 각 혈액 샘플 1-6으로부터 Dr. GenTLETM (Takara Shuzo)을 사용하여 게놈 DNA를 제조하였다. 대립 형질 636G 및 636A을 특이적으로 검출하기 위한 프라이머로서 서열번호 28 및 29의 뉴클레오티드 및 주형으로서 160ng의 제조된 게놈 DNA을 사용하여 실시예 7-(1)에 기술된 바와 같이 SNP 타이핑을 수행하였다. 결과를 도 8A-F에 나타낸다. 도 8A-F는 주형으로서 혈액 샘플 1-6으로부터 추출된 게놈 DNAs을 사용하여 실시예 7-(1)에 기술된 바와 같이 수행되는 타이핑에 대한 결과를 나타내는 전기영동 패턴이다. 레인 1 및 2는 각각 서열번호:28 (636G 검출용) 및 서열번호:29 (636A 검출용)의 뉴클레오티드를 사용하여 수득한 결과를 나타낸다. 도 8A-F에 나타낸 증폭 산물의 패턴에 기초하여, CYP2C19중 636번째 염기에 대한 각 혈액 샘플의 대립 형질은 하기와 같았다(1: G/A, 2: G/G, 3: G/A, 4: G/G, 5: G/G, 6: G/G). 반면, 주형으로서 동일한 게놈 DNA를 사용하여 실시예 7-(2)에 기술된 바와 같이 PCR-RFLP에 의한 타이핑을 수행하였다. 결과를 도 8G에 나타낸다. 도 8G는 주형으로서 혈액 샘플 1-6으로부터 추출된 게놈 DNAs을 사용하여 PCR-RFLP에 의한 타이핑에 대한 결과를 나타내는 전기영동 패턴이다. 레인 1-6은 각각 혈액 샘플 1-6으로부터 추출된 게놈 DNAs를 사용하여 수득한 결과를 나타낸다. 각 혈액 샘플로부터 제조된 DNAs를 주형으로서 사용하여 수득한 PCR 증폭 산물의 절단 패턴을 나타내는 도 8G에 나타낸 전기영동 결과에 기초하여 CYP2C19중 636번째 대립 형질을 하기와 같이 타이핑하였고(1: G/A, 2: G/G, 3: G/A, 4: G/G, 5: G/G, 6: G/G), 이는 상기 기술된 것과 일치하였다.
상기 기술한 바와 같이, 실제 임상 시험 샘플을 사용하였을 때 본 발명의 방법 또한 유효함을 확인하였다.
산업상 이용가능성
본 발명의 뉴클레오티드 및 상기 기술된 바와 같은 언급된 뉴클레오티드를 사용하여 염기 치환을 검출하는 방법이 자연발생하거나 인공적으로 도입된 염기 치환을 검출하는데 유용하다.
본 발명에 따라, 표적 핵산중 염기 치환의 존재 여부는 재현성을 갖고 용이하게 검출될 수 있다. 본 발명의 방법은 공지된 핵산 증폭 방법과 용이하게 조합될 수 있고, 고감도로 염기 치환을 검출하기 위하여 사용될 수 있다. 또한, 배합물중 적절한 서열을 갖는 뉴클레오티드를 사용하여, 염기 치환의 존재 여부 및 동시에 치환된 염기의 유형에 대한 정도를 가질 수 있다. 본 발명을 다형 또는 변이와 같이 유기체의 게놈 DNA에서 형성되는 염기 치환(예: SNP)을 검출하거나 동정하기 위하여 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 인간에서 질환 유전자를 검색하기 위한 게놈 의약 및 게놈 약물 개발, 약물 내성 분석 분야에서 유용하다.
서열 목록 프리 텍스트
서열 번호:1: 피로코쿠스 호리코시이(Pyrococcus horikoshii)로부터 RNaseHII 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자
서열 번호:2: 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)로부터 RNaseHII 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 1650Nde
서열 번호:3: 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)로부터 RNaseHII 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 1650Bam
서열 번호:6: 일부의 인간 c-Ki-ras 유전자의 DNA를 증폭시키기 위한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호:7: 인간 c-Ki-ras 유전자상의 뉴클레오티드 치환을 검출하기 위한 키메라성 올리고뉴클레오티드. "뉴클레오티드 13 내지 15는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이고 3'말단의 뉴클레오티드 3'-OH는 아미노헥실 그룹으로 보호된다"
서열번호:8: 인간 c-Ki-ras 유전자상의 뉴클레오티드 치환을 검출하기 위한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 전구체. "뉴클레오티드 12 내지 15는 리보뉴클레오티드이고- 뉴클레오티드 17은 이노신이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이고 3'말단의 뉴클레오티드 3'-OH는 아미노헥실 그룹으로 보호된다"
서열번호:9: 인간 c-Ki-ras 유전자상의 뉴클레오티드 치환을 검출하기 위한 키메라성 올리고뉴클레오티드. "뉴클레오티드 14 및 15는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이고 3'말단의 뉴클레오티드 3'-OH는 아미노헥실 그룹으로 보호된다"
서열번호:10: 인간 c-Ki-ras 유전자상의 뉴클레오티드 치환을 검출하기 위한 키메라성 올리고뉴클레오티드. "뉴클레오티드 13 내지 15는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이고 3'말단의 뉴클레오티드 3'-OH는 아미노헥실 그룹으로 보호된다"
서열번호:11: 인간 c-Ki-ras 유전자상의 뉴클레오티드 치환을 검출하기 위한 키메라성 올리고뉴클레오티드. "뉴클레오티드 13 내지 15는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이고 3'말단의 뉴클레오티드 3'-OH는 아미노헥실 그룹으로 보호된다"
서열번호:12: 인간 c-Ki-ras 유전자상의 뉴클레오티드 치환을 검출하기 위한 키메라성 올리고뉴클레오티드. "뉴클레오티드 13 내지 15는 리보뉴클레오티드이고, 뉴클레오티드 17은 이노신이고 다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이고 3'말단의 뉴클레오티드 3'-OH는 아미노헥실 그룹으로 보호된다"
서열번호:13: 아키오글로부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus)로부터의 AF0621 유전자의 염기 서열.
서열번호:14: 아키오글로부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus)로부터의 RNaseHII 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 AfuNde.
서열번호:15: 아키오글로부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus)로부터의 RNaseHII 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 AfuBam.
서열번호:16: 아키오글로부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus)로부터의 RnaseHII중 ORF의 염기 서열.
서열번호:17: 아키오글로부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus)로부터의 RNaseHII의 아미노산 서열.
서열번호:18: c-ki-ras 온코진 엑손 1 일부를 증폭시키기 위한 작제된 PCR 프라이머
서열번호:19 c-ki-ras 온코진 엑손 2 일부를 증폭시키기 위한 작제된 PCR 프라이머
서열번호:20: c-ki-ras 온코진 엑손 2 일부를 증폭시키기 위한 작제된 PCR 프라이머
서열번호:21: 인간 c-Ki-ras 유전자상의 뉴클레오티드 치환을 검출하기 위한 키메라성 올리고뉴클레오티드. "뉴클레오티드 13 내지 15는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이고 3'말단의 뉴클레오티드 3'-OH는 아미노헥실 그룹으로 보호된다"
서열번호:22: 인간 c-Ki-ras 유전자상의 뉴클레오티드 치환을 검출하기 위한 키메라성 올리고뉴클레오티드. "뉴클레오티드 13 내지 15는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이고 3'말단의 뉴클레오티드 3'-OH는 아미노헥실 그룹으로 보호된다"
서열번호:23: 인간 c-Ki-ras 유전자상의 뉴클레오티드 치환을 검출하기 위한 키메라성 올리고뉴클레오티드. "뉴클레오티드 13 내지 15는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이고 3'말단의 뉴클레오티드 3'-OH는 아미노헥실 그룹으로 보호된다"
서열번호:24: 인간 c-Ki-ras 유전자상의 뉴클레오티드 치환을 검출하기 위한 키메라성 올리고뉴클레오티드. "뉴클레오티드 17 내지 19는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호:25: 인간 c-Ki-ras 유전자상의 뉴클레오티드 치환을 검출하기 위한 키메라성 올리고뉴클레오티드. "뉴클레오티드 16 내지 18은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이고 3'말단의 뉴클레오티드 3'-OH는 아미노헥실 그룹으로 보호된다"
서열번호:26: 인간 CYP2C19 유전자의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 PCR 프라이머
서열번호:27: 인간 CYP2C19 유전자의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 PCR 프라이머
서열번호:28: 인간 CYP2C19 유전자상의 뉴클레오티드 치환을 검출하기 위한 키메라성 올리고뉴클레오티드. "뉴클레오티드 13 내지 15는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이고 3'말단의 뉴클레오티드 3'-OH는 아미노헥실 그룹으로 보호된다"
서열번호:29: 인간 CYP2C19 유전자상의 뉴클레오티드 치환을 검출하기 위한 키메라성 올리고뉴클레오티드. "뉴클레오티드 13 내지 15는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이고 3'말단의 뉴클레오티드 3'-OH는 아미노헥실 그룹으로 보호된다"
서열번호:30: 인간 CYP2C19 유전자상의 뉴클레오티드 치환을 검출하기 위한 키메라성 올리고뉴클레오티드. "뉴클레오티드 19 내지 21은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
<110> Takara Shuzo Co., Ltd. <120> Method for detection of nucleotide substitution <130> 663051 <150> JP 2001-39268 <151> 2001-02-15 <150> JP 2001-40721 <151> 2001-02-16 <150> JP 2001-101055 <151> 2001-03-30 <150> JP 2001-177381 <151> 2001-06-12 <150> JP 2001-290384 <151> 2001-09-25 <150> JP 2001-338440 <151> 2001-11-02 <150> JP 2001-368929 <151> 2001-12-03 <160> 30 <210> 1 <211> 663 <212> DNA <213> Pyrococcus horikoshii <400> 1 atgaaggttg ctggagttga tgaagcgggg agggggccgg taattggccc gttagtaatt 60 ggagtagccg ttatagatga gaaaaatatt gagaggttac gtgacattgg ggttaaagac 120 tccaaacaat taactcctgg gcaacgtgaa aaactattta gcaaattaat agatatccta 180 gacgattatt atgttcttct cgttaccccc aaggaaatag atgagaggca tcattctatg 240 aatgaactag aagctgagaa attcgttgta gccttgaatt ctttaaggat caagccgcag 300 aagatatatg tggactctgc cgatgtagat cctaagaggt ttgctagtct aataaaggct 360 gggttgaaat atgaagccac ggttatcgcc gagcataaag ccgatgcaaa gtatgagata 420 gtatcggcag catcaataat tgcaaaggtc actagggata gagagataga gaagctaaag 480 caaaagtatg gggaatttgg ttctggctat ccgagtgatc cgagaactaa ggagtggctt 540 gaagaatatt acaaacaata tggtgacttt cctccaatag ttaggagaac ttgggaaacc 600 gctaggaaga tagaggaaag gtttagaaaa aatcagctaa cgcttgataa attccttaag 660 tga 663 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer 1650Nde for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Pyrococcus furiosus <400> 2 caggaggaga gacatatgaa aataggggga att 33 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer 1650Bam for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Pyrococcus furiosus <400> 3 gaaggttgtg gatccacttt ctaaggtttc tta 33 <210> 4 <211> 672 <212> DNA <213> Pyrococcus furiosus <400> 4 atgaaaatag ggggaattga cgaagcagga agaggaccag cgatagggcc attagtagta 60 gctactgtcg tcgttgatga gaaaaacatt gagaagctca gaaacattgg agtaaaagac 120 tccaaacaac taacacccca tgaaaggaag aatttatttt cccagataac ctcaatagcg 180 gatgattaca aaatagtgat agtatcccca gaagaaatcg acaatagatc aggaacaatg 240 aacgagttag aggtagagaa gtttgctctc gccttaaatt cgcttcagat aaaaccagct 300 cttatatacg ctgatgcagc ggatgtagat gccaatagat ttgcaagctt gatagagaga 360 agactcaatt ataaggcgaa gattattgcc gaacacaagg ccgatgcaaa gtatccagta 420 gtttcagcag cttcaatact tgcaaaggtt gttagggatg aggaaattga aaaattaaaa 480 aagcaatatg gagactttgg ctctgggtat ccaagtgatc caaaaaccaa gaaatggctt 540 gaagagtact acaaaaaaca caactctttc cctccaatag tcagacgaac ctgggaaact 600 gtaagaaaaa tagaggaaag cattaaagcc aaaaaatccc agctaacgct tgataaattc 660 tttaagaaac ct 672 <210> 5 <211> 224 <212> PRT <213> Pyrococcus furiosus <400> 5 Met Lys Ile Gly Gly Ile Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Ala Ile 1 5 10 15 Gly Pro Leu Val Val Ala Thr Val Val Val Asp Glu Lys Asn Ile 20 25 30 Glu Lys Leu Arg Asn Ile Gly Val Lys Asp Ser Lys Gln Leu Thr 35 40 45 Pro His Glu Arg Lys Asn Leu Phe Ser Gln Ile Thr Ser Ile Ala 50 55 60 Asp Asp Tyr Lys Ile Val Ile Val Ser Pro Glu Glu Ile Asp Asn 65 70 75 Arg Ser Gly Thr Met Asn Glu Leu Glu Val Glu Lys Phe Ala Leu 80 85 90 Ala Leu Asn Ser Leu Gln Ile Lys Pro Ala Leu Ile Tyr Ala Asp 95 100 105 Ala Ala Asp Val Asp Ala Asn Arg Phe Ala Ser Leu Ile Glu Arg 110 115 120 Arg Leu Asn Tyr Lys Ala Lys Ile Ile Ala Glu His Lys Ala Asp 125 130 135 Ala Lys Tyr Pro Val Val Ser Ala Ala Ser Ile Leu Ala Lys Val 140 145 150 Val Arg Asp Glu Glu Ile Glu Lys Leu Lys Lys Gln Tyr Gly Asp 155 160 165 Phe Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Lys Thr Lys Lys Trp Leu 170 175 180 Glu Glu Tyr Tyr Lys Lys His Asn Ser Phe Pro Pro Ile Val Arg 185 190 195 Arg Thr Trp Glu Thr Val Arg Lys Ile Glu Glu Ser Ile Lys Ala 200 205 210 Lys Lys Ser Gln Leu Thr Leu Asp Lys Phe Phe Lys Lys Pro 215 220 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric oligonucleotide primer to amplify the DNA of a portion of human c-Ki-ras gene. “nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 6 ctattgttgg atcatatucg 20 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric oligonucleotide to detect the nucleotide substitution on human c-Ki-ras gene. “nucleotides 13 to 15 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides and the 3'-OH group of the nucleotide at 3'end is protected with amino hexyl group” <400> 7 tggtagttgg agcuggtg 18 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric oligonucleotide to detect the nucleotide substitution on human c-Ki-ras gene. “nucleotides 12 to 15 are ribonucleotides, nucleotide 17 is inosine-other nucleotides are deoxyribonucleotides and the 3'-OH group of the nucleotide at 3'end is protected with amino hexyl group” <400> 8 tggtagttgg agcuggng 18 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric oligonucleotide to detect the nucleotide substitution on human c-Ki-ras gene. “nucleotides 14 and 15 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides and the 3'-OH group of the nucleotide at 3'end is protected with amino hexyl group” <400> 9 tggtagttgg agcuggtg 18 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric oligonucleotide to detect the nucleotide substitution on human c-Ki-ras gene. “nucleotides 13 to 15 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides and the 3'-OH group of the nucleotide at 3'end is protected with amino hexyl group” <400> 10 tggtagttgg agcuugtg 18 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric oligonucleotide to detect the nucleotide substitution on human c-Ki-ras gene. “nucleotides 13 to 15 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides and the 3'-OH group of the nucleotide at 3'end is protected with amino hexyl group” <400> 11 tggtagttgg agcucgtg 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric oligonucleotide to detect the nucleotide substitution on human c-Ki-ras gene. “nucleotides 13 to 15 are ribonucleotides, nucleotide 17 is inosine-other nucleotides are deoxyribonucleotides and the 3'-OH group of the nucleotide at 3'end is protected with amino hexyl group” <400> 12 tggtagttgg agcuagng 18 <210> 13 <211> 626 <212> DNA <213> Archaeoglobus fulgidus <400> 13 atgaaggcag gcatcgatga ggctggaaag ggctgcgtca tcggcccact ggttgttgca 60 ggagtggctt gcagcgatga ggataggctg agaaagcttg gtgtgaaaga ctccaaaaag 120 ctaagtcagg ggaggagaga ggaactagcc gaggaaataa ggaaaatctg cagaacggag 180 gttttgaaag tttctcccga aaatctcgac gaaaggatgg ctgctaaaac cataaacgag 240 attttgaagg agtgctacgc tgaaataatt ctcaggctga agccggaaat tgcttatgtt 300 gacagtcctg atgtgattcc cgagagactt tcgagggagc ttgaggagat tacggggttg 360 agagttgtgg ccgagcacaa ggcggacgag aagtatcccc tggtagctgc ggcttcaatc 420 atcgcaaagg tggaaaggga gcgggagatt gagaggctga aagaaaaatt cggggatttc 480 ggcagcggct atgcgagcga tccgaggaca agagaagtgc tgaaggagtg gatagcttca 540 ggcagaattc cgagctgcgt gagaatgcgc tggaagacgg tgtcaaatct gaggcagaag 600 acgcttgacg atttctaaac gaaacc 626 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer AfuNde for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Archaeoglobus fulgidus <400> 14 aagctgggtt tcatatgaag gcaggcatcg 30 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer AfuBam for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Archaeoglobus fulgidus <400> 15 tggtaataac ggatccgttt agaaatcgtc 30 <210> 16 <211> 638 <212> DNA <213> Archaeoglobus fulgidus <400> 16 catatgaagg caggcatcga tgaggctgga aagggctgcg tcatcggccc actggttgtt 60 gcaggagtgg cttgcagcga tgaggatagg ctgagaaagc ttggtgtgaa agactccaaa 120 aagctaagtc aggggaggag agaggaacta gccgaggaaa taaggaaaat ctgcagaacg 180 gaggttttga aagtttctcc cgaaaatctc gacgaaagga tggctgctaa aaccataaac 240 gagattttga aggagtgcta cgctgaaata attctcaggc tgaagccgga aattgcttat 300 gttgacagtc ctgatgtgat tcccgagaga ctttcgaggg agcttgagga gattacgggg 360 ttgagagttg tggccgagca caaggcggac gagaagtatc ccctggtagc tgcggcttca 420 atcatcgcaa aggtggaaag ggagcgggag attgagaggc tgaaagaaaa attcggggat 480 ttcggcagcg gctatgcgag cgatccgagg acaagagaag tgctgaagga gtggatagct 540 tcaggcagaa ttccgagctg cgtgagaatg cgctggaaga cggtgtcaaa tctgaggcag 600 aagacgcttg acgatttcta aacggatccc cgggtacc 638 <210> 17 <211> 205 <212> PRT <213> Archaeoglobus fulgidus <400> 17 Met Lys Ala Gly Ile Asp Glu Ala Gly Lys Gly Cys Val Ile Gly 1 5 10 15 Pro Leu Val Val Ala Gly Val Ala Cys Ser Asp Glu Asp Arg Leu 20 25 30 Arg Lys Leu Gly Val Lys Asp Ser Lys Lys Leu Ser Gln Gly Arg 35 40 45 Arg Glu Glu Leu Ala Glu Glu Ile Arg Lys Ile Cys Arg Thr Glu 50 55 60 Val Leu Lys Val Ser Pro Glu Asn Leu Asp Glu Arg Met Ala Ala 65 70 75 Lys Thr Ile Asn Glu Ile Leu Lys Glu Cys Tyr Ala Glu Ile Ile 80 85 90 Leu Arg Leu Lys Pro Glu Ile Ala Tyr Val Asp Ser Pro Asp Val 95 100 105 Ile Pro Glu Arg Leu Ser Arg Glu Leu Glu Glu Ile Thr Gly Leu 110 115 120 Arg Val Val Ala Glu HisLys Ala Asp Glu Lys Tyr Pro Leu Val 125 130 135 Ala Ala Ala Ser Ile Ile Ala Lys Val Glu Arg Glu Arg Glu Ile 140 145 150 Glu Arg Leu Lys Glu Lys Phe Gly Asp Phe Gly Ser Gly Tyr Ala 155 160 165 Ser Asp Pro Arg Thr Arg Glu Val Leu Lys Glu Trp Ile Ala Ser 170 175 180 Gly Arg Ile Pro Ser Cys Val Arg Met Arg Trp Lys Thr Val Ser 185 190 195 Asn Leu Arg Gln Lys Thr Leu Asp Asp Phe 200 205 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed PCR primer to amplify a portion of c-ki-ras oncogene exon 1 <400> 18 ctattgttgg atcatattcg 20 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed PCR primer to amplify a portion of human c-ki-ras oncogene exon 2 <400> 19 ttcctacgga agcaagtag 19 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed PCR primer to amplify a portion of human c-ki-ras oncogene exon 2 <400> 20 cacaaagaaa gccctcccca 20 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric oligonucleotide to detect the nucleotide substitution on human c-Ki-ras gene. “nucleotides 13 to 15 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides and the 3'-OH group of the nucleotide at 3'end is protected with amino hexyl group” <400> 21 tcgacacagc aggucaag 18 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric oligonucleotide to detect the nucleotide substitution on human c-Ki-ras gene. “nucleotides 13 to 15 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides and the 3'-OH group of the nucleotide at 3'end is protected with amino hexyl group” <400> 22 tcgacacagc agguaaag 18 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric oligonucleotide to detect the nucleotide substitution on human c-Ki-ras gene. “nucleotides 13 to 15 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides and the 3'-OH group of the nucleotide at 3'end is protected with amino hexyl group” <400> 23 tcgacacagc aggugaag 18 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric oligonucleotide to detect the nucleotide substitution on human c-Ki-ras gene. “nucleotides 17 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 24 acaaagaaag ccctcccca 19 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric oligonucleotide to detect the nucleotide substitution on human c-Ki-ras gene. “nucleotides 16 to 18 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides and the 3'-OH group of the nucleotide at 3'end is protected with amino hexyl group” <400> 25 ttgtggtagt tggagcuggt g 21 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed PCR primer to amplify a portion of human CYP2C19 gene <400> 26 tattatctgt taactaatat ga 22 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed PCR primer to amplify a portion of human CYP2C19 gene <400> 27 acttcagggc ttggtcaata 20 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric oligonucleotide to detect the nucleotide substitution on human CYP2C19 gene. “nucleotides 13 to 15 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides and the 3'-OH group of the nucleotide at 3'end is protected with amino hexyl group” <400> 28 gtaagcaccc ccuggatc 18 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric oligonucleotide to detect the nucleotide substitution on human CYP2C19 gene. “nucleotides 13 to 15 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides and the 3'-OH group of the nucleotide at 3'end is protected with amino hexyl group <400> 29 gtaagcaccc ccugaatc 18 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of human CYP2C19 gene. “nucleotides 19 to 21 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 30 ttggtcaata tagaatttug g 21 18/17

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  40. (1) 표적 핵산을 포함하는 샘플을 뉴클레오티드와 혼합하고,
    (여기에서, 뉴클레오티드는
    (A) DNA 폴리머라제에 의해 말단으로부터 신장되지 못하도록 3'-말단에서 변형되고;
    (B) 표적 핵산중 특정 염기를 포함하는 영역에 어닐링할 수 있는 염기 서열을 갖고;
    (C) 뉴클레오티드 및 표적 핵산으로 구성된 복합체에서 뉴클레오티드중 특정 염기에 상응하는 염기와 특정 염기 사이에 미스매치가 존재하는 경우, 뉴클레오티드는 뉴클레아제에 의해 절단되지 않고, 상기 뉴클레오티드중 특정 염기에 상응하는 염기와 특정 염기 사이에 미스매치가 존재하지 않는 경우, 뉴클레오티드는 뉴클레아제에 의해 절단되어 새로운 3'-말단을 형성하는 서열을 포함한다);
    (2) 혼합물을 뉴클레아제 및 DNA 폴리머라제로 처리하고;
    (3) 뉴클레아제를 사용한 뉴클레오티드의 절단의 존재를 검출하는 것을 포함하는, 표적 핵산중 특정 염기에서의 염기 치환의 존재를 검출하는 방법.
  41. 제 40항에 있어서, 뉴클레아제는 리보뉴클레아제 H이고 뉴클레오티드는 특정 염기에 상응하는 염기를 포함하는 영역내 리보뉴클레오티드를 포함하는 방법.
  42. 제 40항에 있어서, 뉴클레아제가 제한 효소이고 뉴클레오티드는 특정 염기에 상응하는 염기를 포함하는 영역내 제한 효소에 대한 인식 서열을 포함하는 방법.
  43. 제 40항에 있어서, 추가로 DNA 폴리머라제의 작용에 의해 형성된 신장 산물을 주형으로 사용하는 핵산 증폭 단계를 포함하는 방법.
  44. 제 43항의 방법에 따라 표적 핵산중 특정 염기에서의 염기 치환 존재를 검출하는 것을 포함하는, 대립 형질의 유전형을 분석하는 방법.
  45. (I) 뉴클레아제;
    (II) 스트랜드 변위(displacement) 활성을 가진 DNA 폴리머라제; 및
    (III) 표적 핵산중 특정 염기에서 염기 치환을 감지하기 위하여 사용되는 뉴클레오티드;
    (여기에서, 뉴클레오티드는
    (A) DNA 폴리머라제에 의해 말단으로부터 신장되지 못하도록 3'-말단에서 변형되고;
    (B) 표적 핵산중 특정 염기를 포함하는 영역에 어닐링할 수 있는 염기 서열을 갖고;
    (C) 뉴클레오티드 및 표적 핵산으로 구성된 복합체에서 뉴클레오티드중 특정 염기에 상응하는 염기와 특정 염기 사이에 미스매치가 존재하는 경우, 뉴클레오티드는 뉴클레아제에 의해 절단되지 않고, 상기 뉴클레오티드중 특정 염기에 상응하는 염기와 특정 염기 사이에 미스매치가 존재하지 않는 경우, 뉴클레오티드는 뉴클레아제에 의해 절단되어 새로운 3'-말단을 형성하는 서열을 포함한다);
    를 포함하는, 표적 핵산중 염기 치환의 존재를 검출하기 위해 사용하는 키트.
  46. 제 45항에 있어서, 추가로 DNA 신장의 존재를 검출하기 위한 시약을 포함하는 키트.
  47. 제 45항에 있어서, 추가로 핵산 증폭 방법을 수행하기 위한 시약을 포함하는 키트.
  48. (I) 뉴클레아제;
    (II) 스트랜드 변위(displacement) 활성을 가진 DNA 폴리머라제; 및
    (III) 표적 핵산중 특정 염기에서 염기 치환을 감지하기 위하여 사용되는 뉴클레오티드;
    (여기에서, 뉴클레오티드는
    (A) DNA 폴리머라제에 의해 말단으로부터 신장되지 못하도록 3'-말단에서 변형되고;
    (B) 표적 핵산중 특정 염기를 포함하는 영역에 어닐링할 수 있는 염기 서열을 갖고;
    (C) 뉴클레오티드 및 표적 핵산으로 구성된 복합체에서 뉴클레오티드중 특정 염기에 상응하는 염기와 특정 염기 사이에 미스매치가 존재하는 경우, 뉴클레오티드는 뉴클레아제에 의해 절단되지 않고, 상기 뉴클레오티드중 특정 염기에 상응하는 염기와 특정 염기 사이에 미스매치가 존재하지 않는 경우, 뉴클레오티드는 뉴클레아제에 의해 절단되어 새로운 3'-말단을 형성하는 서열을 포함한다);
    를 포함하는, 표적 핵산중 염기 치환의 존재를 검출하기 위해 사용하는 조성물.
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Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW200404889A (en) * 2002-05-31 2004-04-01 Takara Bio Inc Method of typing gene polymorphisms
ATE557105T1 (de) * 2005-06-23 2012-05-15 Keygene Nv Strategien für eine hohe durchsatzidentifikation und erkennung von polymorphismen
EP2644709B1 (en) 2008-04-30 2014-12-17 Integrated Dna Technologies, Inc. RNase-H-based assays utilizing modified RNA monomers
US8911948B2 (en) * 2008-04-30 2014-12-16 Integrated Dna Technologies, Inc. RNase H-based assays utilizing modified RNA monomers
US10227641B2 (en) 2008-04-30 2019-03-12 Integrated Dna Technologies, Inc. RNase H-based assays utilizing modified RNA monomers
EP2333109B1 (en) * 2008-09-03 2013-08-07 Takara Bio, Inc. Composition for detection of rna
CA2740913C (en) 2008-10-20 2015-02-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Improved allele-specific amplification
US20110117559A1 (en) * 2009-11-13 2011-05-19 Integrated Dna Technologies, Inc. Small rna detection assays
US9238832B2 (en) 2009-12-11 2016-01-19 Roche Molecular Systems, Inc. Allele-specific amplification of nucleic acids
US8614071B2 (en) 2009-12-11 2013-12-24 Roche Molecular Systems, Inc. Preferential amplification of mRNA over DNA using chemically modified primers
WO2012135053A2 (en) 2011-03-25 2012-10-04 Integrated Dna Technologies, Inc. Rnase h-based assays utilizing modified rna monomers
CA2881200A1 (en) 2012-02-14 2013-08-22 Great Basin Scientific Methods of isothermal amplification using blocked primers
KR102213886B1 (ko) 2013-03-14 2021-02-05 다카라 바이오 가부시키가이샤 내열성 미스매치 엔도뉴클레아제의 이용방법
SG11201507512QA (en) * 2013-03-15 2015-10-29 Integrated Dna Tech Inc Rnase h-based assays utilizing modified rna monomers
CA2930595C (en) 2013-11-14 2023-09-19 Integrated Dna Technologies, Inc. Dna polymerase mutants having enhanced template discrimination activity
WO2015195949A2 (en) 2014-06-18 2015-12-23 Clear Gene, Inc. Methods, compositions, and devices for rapid analysis of biological markers
JP6550649B2 (ja) 2014-09-11 2019-07-31 タカラバイオ株式会社 耐熱性のミスマッチエンドヌクレアーゼの利用方法
US9909169B2 (en) 2014-12-17 2018-03-06 Roche Molecular Systems, Inc. Allele-specific amplification of nucleic acids using blocking oligonucleotides for wild type suppression
CN107614681A (zh) * 2015-03-20 2018-01-19 宝生物工程株式会社 用于检测靶核酸的高灵敏度方法
CA3008273A1 (en) 2015-12-18 2017-06-22 Clear Gene, Inc. Methods, compositions, kits and devices for rapid analysis of biological markers
CN108148895A (zh) * 2017-12-29 2018-06-12 星阵（广州）基因科技有限公司 用于检测突变的人akt1基因的引物、试剂盒及方法
CN113215163B (zh) * 2021-05-12 2023-05-12 苏州海苗生物科技有限公司 一种特异性扩增目的基因的分子锁及应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06500021A (ja) * 1990-08-06 1994-01-06 エフ．ホフマン　―　ラ　ロシュ　アーゲー 均質検定システム

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4521509A (en) * 1982-11-24 1985-06-04 Research Corporation Method for degrading DNA
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5011769A (en) * 1985-12-05 1991-04-30 Meiogenics U.S. Limited Partnership Methods for detecting nucleic acid sequences
US4876187A (en) * 1985-12-05 1989-10-24 Meiogenics, Inc. Nucleic acid compositions with scissile linkage useful for detecting nucleic acid sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
JP2650159B2 (ja) 1988-02-24 1997-09-03 アクゾ・ノベル・エヌ・ベー 核酸増幅方法
CA1340807C (en) 1988-02-24 1999-11-02 Lawrence T. Malek Nucleic acid amplification process
US5639611A (en) * 1988-12-12 1997-06-17 City Of Hope Allele specific polymerase chain reaction
US5137806A (en) 1989-12-11 1992-08-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for the detection of sequences in selected DNA molecules
US5455166A (en) 1991-01-31 1995-10-03 Becton, Dickinson And Company Strand displacement amplification
US5846717A (en) 1996-01-24 1998-12-08 Third Wave Technologies, Inc. Detection of nucleic acid sequences by invader-directed cleavage
WO1995014106A2 (en) 1993-11-17 1995-05-26 Id Biomedical Corporation Cycling probe cleavage detection of nucleic acid sequences
ATE206764T1 (de) 1994-07-16 2001-10-15 Roche Diagnostics Gmbh Verfahren zum sensitiven nachweis von nukleinsäuren
ATE414793T1 (de) * 1996-01-24 2008-12-15 Third Wave Tech Inc Invasive spaltung von nukleinsäuren
NL1002427C2 (nl) * 1996-02-23 1997-08-26 Akzo Nobel Nv Bekledingssamenstelling omvattende een bicyclo- of spiroorthoester functionele verbinding.
US5808108A (en) * 1997-01-15 1998-09-15 Chappelow; Cecil C. Polymeric compositions and composites prepared from spiroorthocarbonates and epoxy monomers
DE19733619C1 (de) * 1997-08-04 2000-02-24 Markus Schuermann CASE-PCR, ein hochselektives Verfahren zum Nachweis von Onkogenmutationen und Allelvarianten
JP3433929B2 (ja) 1999-03-19 2003-08-04 タカラバイオ株式会社 核酸配列の増幅方法
GB9915200D0 (en) * 1999-06-29 1999-09-01 Janssen Pharmaceutica Nv Neurotrophic factor receptor
DE60029225T2 (de) 1999-07-02 2007-07-05 Invitrogen Corp., Carlsbad Zusammensetzungen und verfahren zu höhere empfindlichkeit und spezifität von nukleinsäuresynthese
GB9918150D0 (en) * 1999-08-03 1999-10-06 Univ Sheffield Nuclease variant
US6274353B1 (en) * 1999-09-22 2001-08-14 Genecopoeia, Inc. Method and compositions for improved polynucleotide synthesis
JP2001136965A (ja) * 1999-11-12 2001-05-22 Takara Shuzo Co Ltd 核酸配列の増幅方法
WO2001042498A1 (fr) * 1999-12-10 2001-06-14 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Procede de detection de polymorphisme nucleotidique
CA2412721A1 (en) 2000-06-26 2002-01-03 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for transcription-based nucleic acid amplification
US6773885B1 (en) * 2000-09-29 2004-08-10 Integrated Dna Technologies, Inc. Compositions and methods for visual ribonuclease detection assays
US20020142336A1 (en) * 2001-02-02 2002-10-03 Genome Therapeutics Corporation Methods for determining a nucleotide at a specific location within a nucleic acid molecule
DE60235491D1 (de) * 2001-11-28 2010-04-08 Bio Rad Laboratories Paralleles scoring von polymorphismen mittels amplifikation und fehlerkorrektur

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06500021A (ja) * 1990-08-06 1994-01-06 エフ．ホフマン　―　ラ　ロシュ　アーゲー 均質検定システム

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Proc.Natl.Acad.Sci.USA., Voil88(16), pp.7276-7280(1991)

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