WO2002064833A1

WO2002064833A1 - Procede de detection de polymorphisme de nucleotide

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Publication number: WO2002064833A1
Application number: PCT/JP2002/001222
Authority: WO
Inventors: Hiroaki Sagawa; Eiji Kobayashi; Ikunoshin Kato
Original assignee: Takara Bio Inc.
Priority date: 2001-02-15
Filing date: 2002-02-14
Publication date: 2002-08-22
Also published as: EA005141B1; KR20030074797A; EA200300880A1; JP2004298200A; US20040137451A1; JP3681729B2; AU2002232177B2; US7135291B2; CA2438574C; CN100351393C; JP2005245465A; KR100809949B1; JPWO2002064833A1; CA2438574A1; EP1367136A4; CN1524127A; EP1367136A1

Description

明細書塩基置換の検出方法技術分野

本発明は遺伝子上の塩基置換の検出に有用なヌクレオチド、該ヌクレオチドを使用する遺伝子上の塩基置換の検出方法、ならびにそのためのキットに関する。背景技術

同一種に属する生物個体のゲノム上に含有される遺伝暗号は同一ではなく、多型（polymorphism) と呼ばれる塩基配列上の差違が存在することが知られている。多型には 1〜数十塩基の欠失ゃ揷入、特定の塩基配列が重複するものなどが知られているが、 1個の塩基が他の塩基に置換されているものは一塩基置換多型

(single nucleotide polymorphism^ SNP) と呼ばれてレヽる。

—塩基置換多型は数百塩基から 1000塩基に 1ケ所程度の割合で存在するといわれ、ヒトのゲノム上には 300万〜 1000万の SNPがあると推定されている。 SNPは疾病に関連する遺伝子の探索、疾病へのかかりやすさ、薬に対する感受性（作用、副作用）の違いを知るための指標として注目されており、その検出方法についても研究が進められている。

従来の SNPの検出手段は、ハイブリダィゼーシヨンに基づくもの、プライマ一伸長に基づくものあるいは酵素の基質特異性を利用するものに大別される。ハイプリダイゼーション法は、塩基置換の有無を核酸試料とプローブとのハイブリダィゼーションによって検出するものである。該方法は一塩基の違いによつてハイブリダイゼーションが左右されるようなプローブ、ならびにハイプリダイゼーション条件を見出す必要があり、高い再現性を有する検出系の構築が困難である。

例えば、米国特許第 5660988号公報記載のサイクルプローブ反応 (c y c 1 e p r o b e r e a c t i o n) を用いた変異検出方法が挙げられる。該方法においては、開裂し易い結合を有する核酸プローブを目的とする核酸分子にハイブリダィズさせる。目的とする核酸分子中に塩基置換がない場合には、当該プローブは開裂し、塩基置換がある場合には、当該プローブは開裂しない。その後、開裂したプローブ由来の遊離断片の発生度合いを検出、定量することにより塩基置換を検出することを特徴とする。しかしながら、該方法では標的核酸が微量の場合、該プローブの開裂化物の量が少ないため開裂ィ匕物量が検出できるレベノレに到達するまでに相当のタイムラグがある。

別法として、米国特許第 5 2 1 0 0 1 5号、第 5 4 8 7 9 7 2号公報記載の T a q M a n法を用いた変異検出方法が挙げられる。該方法では、蛍光色素及びクェンチヤ一が付カ卩した T a q M a nプローブを使用する。該プローブは、塩基置換を含むものと、塩基置換を含まないものの 2種類を使用する。該プローブを目的とする核酸分子にハイプリダイズさせ、その上流からプライマーが伸長してくると、 D N Aポリメラーゼの 5， →3 ' ェキソヌクレアーゼ活性により、目的とする核酸分子が塩基置換を含まない場合のみ、当該プローブが分解され、発生する蛍光を検出することにより塩基置換を検出することを特徴とする。しかしながら、該方法において、 5， →3，ェキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ、ならびに 3，末端がブロックされた標識ヌクレオチドを用いて P C Rを行う必要があり、厳密な温度調整が必要であり、検出するまでに要する時間も長いという問題がある。

酵素を利用する方法としては、まず DN Aポリメラーゼを使用する方法があり、該方法にはさらに（ 1 ) 米国特許第 5 1 3 7 8 0 6号公報記載の塩基置換を検出しょうとする塩基部分に 3 ' 末端がアニーリングするプライマーを使用し、ブライマ一伸長反応の有無から塩基置換を検出する方法、（2 ) 国際公開パンフレツト第 0 1 /4 2 4 9 8号記載の 3，末端から 2番目のヌクレオチドに検出しようとする塩基置換部位が位置するプライマーを使用し、プライマー伸長反応の有無から塩基置換を検出する方法、 ( 3 ) 塩基置換を検出しょうとする塩基の 3，側に隣接する塩基に 3，末端がアニーリングするプライマーを使用し、当該プライマーに取り込まれる塩基を判別して目的部分の変異の有無とその塩基を決定する方法、の 3つがある。

次に、 D NAリガーゼを使用する方法がある。当該方法はプローブの末端部分を塩基置換を検出しょうとする塩基部分に対応させることにより、ここに隣接したプローブとのライゲーションの有無から塩基置換を検出する。

D NAポリメラーゼ、 D NAリガーゼを使用する方法は、塩基置換に基づくプライマーもしくはプローブと標的核酸の間のミスマッチを正確に検出できない可能性がある。すなわち、これらの酵素はミスマッチを有するプライマー、プロ一ブの場合でも酵素反応を開始し、誤った結果を与えることがある。

すなわち、標的核酸と当該プライマーとのアニーリングエラー及び使用するリガーゼあるいはポリメラーゼのエラーに起因する擬陽性の場合があり、反応条件特に反応温度等を非常に厳密にコントロールする必要があり、再現性に問題がある。

最後に、米国特許第 5 8 4 6 7 1 7号記載のィンベーダー（I n v a d e r ) 法のように、ニ本鎮核酸の特殊な構造を認識して切断する活性を有する酵素を利用する方法が挙げられる。このような酵素としては cleavaseが知られており、塩基置換が存在する（あるいは存在しない）場合に当該酵素に認識されるような構造を形成するプローブを設計し、当該プローブの切断を調べることによって塩基置換を検出することが可能である。しかしながら、二本鎖核酸の特殊な構造を認識して切断する活性を有する酵素を使用する方法はその感度に問題を有する。すなわち、当該方法は異分子の標的核酸から 1つのシグナルが生成する方法であり、微量の核酸試料からでは塩基置換の検出に十分なシグナルを得られない。もちろんプローブ切断反応を反復してシグナルを増強することも可能であるが、強いシグナルを得るためには前もって標的核酸を増幅する必要がある。すなわち、該方法では標的核酸が微量の場合、該プローブの切断物の量が少ないため該切断物量が検出できるレベルに到達するまでに相当のタイムラグがある。

以上のように、上記の方法はいくつかの問題点を有しており、塩基置換を正確に検出できる方法が求められていた。発明の目的

従って本発明の目的は、上記方法の問題を解決し、微量の核酸試料を使用して正確、カゝっ再現性に優れた塩基置換、例えば S N Pを検出する手段を提供することにある。発明の概要

上記課題を解決するためには、塩基置換を正確に検出し、かつその結果を強いシグナルとして得ることが可能な方法が望まれている。

本発明者らは、塩基置換を検出しようとする標的核酸にアニーリング可能であり、インタタトな状態ではその 3 ' 末端からは D NAポリメラーゼによる D NA 伸長反応が開始されることがなく、かつ、アニーリングした鍀型鎖の塩基配列に応じてヌクレアーゼによる切断が左右されるようなヌクレオチドを作成した。さらに、当該ヌクレオチドを使用した、標的核酸上の塩基置換を正確、力つ高感度に検出可能な方法を構築し、本発明を完成させた。

本発明を概説すれば、本発明の第 1の発明は標的核酸上の特定の塩基における塩基置換の有無を検出する方法に関し、

( 1 ) 標的核酸を含有する試料とヌクレオチドとを混合する工程：ここで当該ヌクレオチドは、

A) その 3，末端が当該末端からの D NAポリメラーゼによる伸長が起こらないように修飾されており、

B) 標的核酸上の前記特定の塩基を含有する領域にアニーリングしうる塩基配列を有しており、

C) 当該ヌクレオチドと標的核酸とから形成される複合体において、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマツチが存在する場合にはヌクレオチドはヌクレアーゼによる切断を受けず、かつ、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在しない場合にはヌクレオチドがヌクレアーゼにより切断されて新たな 3 ' 末端を生じるような配列を含有しており、

( 2 ) 前記混合物をヌクレアーゼ、および D NAポリメラーゼで処理する工程：および

( 3 ) ヌクレアーゼによるヌクレオチドの切断の有無を検出する工程、を包含することを特徴とする。第 1の発明の塩基置換の検出方法としては、ヌクレアーゼとしてリボヌクレア一ゼヌクレオチドとして特定の塩基に対応する塩基を含有する領域にリポヌクレオチドを含有するヌクレオチドを使用する方法、ヌクレアーゼとして制限酵素、ヌクレオチドとして特定の塩基に対応する塩基を含有する領域に制限酵素の認識配列を含有するヌクレオチドを使用する方法が例示される。

本発明の第 2の発明は標的核酸の塩基置換の検出方法に関し、

A) その 3，末端が当該末端からの D N Aポリメラーゼによる伸長が起こらないように修飾されており、

C) 当該ヌクレオチドと標的核酸とから形成される複合体において、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマツチが存在しない場合にはヌクレオチドはヌクレアーゼによる切断を受けず、かつ、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在する場合にはヌクレオチドがヌクレアーゼにより切断されて新たな 3 ' 末端を生じるような配列を含有しており、

( 3 ) ヌクレアーゼによるヌクレオチドの切断の有無を検出する工程、を包含することを特徴とする。

第 2の発明の検出方法としては、ヌクレアーゼとしてミスマッチ特異的ヌクレァーゼを使用する方法が例示される。，

第 1、第 2の発明の検出方法に使用されるヌクレオチドは、標的核酸に塩基置換が存在しない場合に標的核酸と形成される複合体にミスマッチを生じないような配列を有するヌクレオチド、標的核酸に塩基置換が存在する場合に標的核酸と形成される複合体にミスマッチを生じないような配列を有するヌクレオチドのいずれであってもよい。第 1、第 2の発明の態様としては、 D N Aポリメラーゼの作用によって生成する伸長産物の有無によって塩基置換の有無を判定する方法、ヌクレアーゼの作用によって生成する遊離したヌクレオチドの 3，側断片の有無によって塩基置換の有無を判定する方法が例示される。また、標識されたヌクレオチドを使用し、当該標識を禾 U用して前記伸長産物、もしくは前記のヌクレオチドの 3 ' 側断片を検出することが可能である。前記標識には蛍光物質を使用することができる。さらに、蛍光物質、蛍光を消光しうる物質が付加されており、ヌクレアーゼによる切断、もしくはそれに続く D N Aの伸長によって蛍光を発するヌクレオチドを使用することも可能である。前記蛍光標識されたヌクレオチドを使用する態様においては、検出に蛍光偏光法を利用することができる。

第 1、第 2の発明の塩基置換の検出方法に使用されるヌクレオチドにおいて、 3 ' 末端の修飾としてはリポースの 3位の水酸基の修飾が例示される。また、本発明の塩基置換の検出方法に使用されるヌクレオチドは、ヌクレオチドアナログ及び/又は修飾ヌクレオチドを含有していてもよい。該ヌクレオチドアナログとしては特に限定はされないが例えば、デォキシリポイノシンヌクレオチドあるいはデォキシリボウラシルヌクレオチド等が、修飾リボヌクレオチドとしては（ α — S ) リボヌクレオチドが好適に使用できる。さらに、第 1、第 2の発明の方法には、 D NAポリメラーゼの作用によって生成する伸長産物を铸型とした核酸増幅の工程をさらに包含することができる。

本発明の第 3の発明は、本発明の第 1、第 2の発明の塩基置換の検出方法を用いた対立遺伝子の遺伝子型を解析する方法に関する。

本努明の第 4の発明は標的核酸上の特定の塩基における塩基置換の検出に使用されるヌクレオチドに関し、

Α) その 3 ' 末端が当該末端からの D NAポリメラーゼによる伸長が起こらないように修飾されており、

Β ) 標的核酸上の前記特定の塩基を含有する領域にアニーリングしうる塩基配列を有しており、

C) 当該ヌクレオチドと標的核酸とから形成される複合体において、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマツチが存在する場合にはヌクレオチドはヌクレアーゼによる切断を受けず、かつ、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマツチが存在しない場合にはヌクレオチドがヌクレアーゼにより切断されて新たな 3 ' 末端を生じるような配列を含有する、

ことを特徴とするヌクレオチドに関する。

第 4の発明のヌクレオチドとしては、標的核酸上の特定の塩基に対応する塩基を含有する領域にリボヌクレオチドを含有し、当該ヌクレオチドと標的核酸とから形成される複合体において、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在しなレ、場合にはリポヌクレアーゼ Hによって切断されるもの、標的核酸上の特定の塩基にに対応する塩基を含有する領域に制限酵素の認識配列を含有し、当該ヌクレオチドと標的核酸とから形成される複合体において、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在しない場合には制限酵素によって切断されるものが例示される。本発明の第 5の発明は標的核酸上の特定の塩基における塩基置換の検出に使用されるヌクレオチドであって、

A) その 3 ' 末端が当該末端からの D NAポリメラーゼによる伸長が起こらないように修飾されており、

B ) 標的核酸上の前記特定の塩基を含有する領域にアニーリングしうる塩基配列を有しており、

C ) 当該ヌクレオチドと標的核酸とから形成される複合体において、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマツチが存在しなレヽ場合にはヌクレオチドはヌクレアーゼによる切断を受けず、かつ、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマツチが存在する場合にはヌクレオチドがヌクレアーゼにより切断されて新たな 3 ' 末端を生じるような配列を含有する、

ことを特徴とするヌクレオチド。

第 5の発明のヌクレオチドとしては、標的核酸と形成される複合体において標的核酸との間にミスマツチが存在する場合にミスマツチ特異的ヌクレアーゼにより切断されるヌクレオチドが例示される。第 4、第 5の発明のヌクレオチドは、標的核酸に塩基置換が存在しない場合に、標的核酸と形成される複合体にミスマッチを生じないような配列を有するもの、標的核酸に塩基置換が存在する場合に、標的核酸と形成される複合体にミスマツチを生じないような配列を有するもののいずれであってもよい。

また、第 4、第 5の発明のヌクレオチドは標識化合物が付加されたものでもよく、その位置はヌクレアーゼによる切断箇所の 3，側部分あるいは 5，側部分のいずれであってもよい。前記標識化合物としては、例えば蛍光物質を使用することができ、さらに、蛍光を消光しうる物質が付加することにより、ヌクレアーゼによる切断、もしくはそれに続く D N Aの伸長によつて蛍光を発するヌクレオチドとすることができる。

第 4、第 5の発明のヌクレオチドにおいて、 3，末端の修飾としてはリポースの 3位の水酸基の修飾が例示される。また、本発明のヌクレオチドは、ヌクレオチドアナログ及び Z又は修飾ヌクレオチドを含有していてもよい。該ヌクレオチドアナログとしては特に限定はされないが例えば、デォキシリボイノシンヌクレォチドあるいはデォキシリボウラシルヌクレオチド等が、修飾ヌクレオチドとしては（a— S) リボヌクレオチドが好適に使用できる。

本発明の第 6の発明は標的核酸上の塩基置換の検出に使用されるキットに関し、第 4、第 5の発明のヌクレオチドを含有することを特徴とする。

第 6の発明のキットとしては、ヌクレアーゼおよび Ζまたは D NAポリメラーゼを含有するもの、 D N Α伸長の有無を検出するための試薬をさらに含有するもの、核酸増幅法を実施するための試薬をさらに含有するものが挙げられる。図面の簡単な説明

図 1 ：本発明の塩基置換の検出方法による、ヒト遺伝子上の塩基置換の検出の結果を示す図である。

図 2 ：本発明の塩基置換の検出方法による、ヒト遺伝子上の塩基置換の検出の結果を示す図である。

図 3 ：本発明の塩基置換の検出方法による、ヒト遺伝子上の塩基置換の検出の結果を示す図である。図 4 ：本発明の塩基置換の検出方法による、ヒト遺伝子上の塩基置換の検出の結果を示す図である。

図 5 ：本発明の塩基置換の検出方法による、ヒト遺伝子上の塩基置換の検出の結果を示すグラフである。

図 6 ：本発明の塩基置換の検出方法による、ヒト遺伝子上の塩基置換の検出の結果を示す図である。

図 7 ：本発明の塩基置換の検出方法による、ヒト遺伝子上の塩基置換の検出の結果を示す図である。

図 8 ：本発明の塩基置換の検出方法による、ヒト遺伝子上の塩基置換の検出の結果を示す図である。発明の詳細な説明

本明細書に記載の「塩基置換」とは、核酸上の特定の部位において、その一部の塩基が他の塩基に置換されていることを指す。「塩基置換」により生物個体間の遺伝情報の違いが生じ、この遺伝情報の違いは多型 (polymorphism) 、もしくはバリエーション（variation) と呼ばれている。本明細書において「塩基置換」とは、上記の多型、ノリエーシヨンにおける塩基置換を包含する。また、核酸に人為的に導入された塩基置換も本明細書における「塩基置換」に含まれる。本明細書に記載の「塩基置換」において、置換されている塩基の数には特に限定はなく、 1塩基もしくはそれ以上の置換が存在してもよい。

本発明は、ゲノム多型やバリエーションの検出、特に、遺伝子上の S N P (— 塩基置換多型）の検出に特に好適である。

以下に本発明を詳細に説明する。

( 1 ) 本発明のヌクレオチド

本発明のヌクレオチドは標的核酸上の塩基置換を検出しようとする箇所を含む領域にアニーリングしうる塩基配列を有している。インタクトな状態では D NA ポリメラーゼによる D NA伸長のプライマーとして機能することはないが、ヌクレアーゼによって切断を受けた後に初めてプライマーとして機能することができる。上記のような性質を有するものであればその鎖長には特に限定はなく、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドのいずれもが本発明に使用できる。通常、 8 〜5 0塩基、好ましくは 1 0〜4 0塩基、特に好ましくは 1 2〜3 0塩基のオリゴヌクレオチドが本発明のヌクレオチドとして使用される。

本発明のヌクレオチドは、通常、デォキシリボヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドである。必要に応じ、リボヌクレオチド、ヌクレオチドのアナログや誘導体（修飾物）を含有することができる。ヌクレオチドのアナ口グとしては、例えば塩基部分にィノシン、 7—デァザグァニン等の塩基を有するヌクレオチドアナログあるいはリボースの誘導体を有するヌクレオチドアナログを使用することができる。また、修飾ヌクレオチドとしてはリン酸基に結合する酸素原子が硫黄原子に置換された（ひ一 S ) ヌクレオチドや標識ィ匕合物が付加されたヌクレオチド等が例示される。さらに、本発明のヌクレオチドはペプチド核酸 [P NA、 Peptide Nucleic Acid, ネイチヤー（Nature) 、第 3 6 5卷、第 5 6 6〜 5 6 8 頁（1 9 9 3 ) ] を含有するものであってもよい。本発明を特に限定するものではないが、好ましくは、上記のヌクレオチドのアナ口グゃ誘導体等は使用されるヌクレアーゼの作用に影響を与えない部位に導入される。本発明のヌクレオチドへのヌクレオチドアナ口グの導入は、ヌクレオチド自身の高次構造形成の抑制、標的核酸とヌクレオチドとのアニーリングの安定化の観点から有効である。すなわち、本発明の塩基置換の検出方法に用いることのできるヌクレオチドとしての機能を保持する範囲で、ヌクレオチドアナログ及び/又は修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。

本発明において使用されるヌクレオチドは、標的核酸上の特定の塩基における塩基置換を検出するために、下記に示すような性質を有している。

A) その 3 ' 末端が当該末端からの D NAポリメラーゼによる伸長が起こらないように修飾されている。

B ) 標的核酸上の前記特定の塩基を含有する領域にアニーリングしうる塩基配列を有している。

C) 当該ヌクレオチドと標的核酸とから形成される複合体において、前記特定の塩基と該塩基に対応する、すなわち該塩基と水素結合を形成するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在する（または存在しない）場合にはヌクレオチドはヌクレアーゼによる切断を受けず、かつ、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在しない（または存在する）場合にはヌクレオチドがヌクレアーゼにより切断されて新たな 3 ' 末端を生じるような配列を含有している。

ここで、ヌクレアーゼにより切断されたヌクレオチドの 5 ' 側断片は標的核酸とアニーリングした状態を保持することができる。また、このヌクレオチドの

5，側断片の 3 ' 末端ではリポースまたはデォキシリポースの 3位に水酸基が存在しており、該末端からの D NAポリメラーゼによる DNA伸長が可能である。すなわち、上記ヌクレオチドはヌクレアーゼによって切断される塩基配列を有する場合にはプライマーの前駆体として機能する。

上記のように、本発明のヌクレオチドはその 3，末端が D NAポリメラーゼによる D N A伸長反応に使用できなレ、形に修飾されている。上記目的を達成可能であればその修飾手段には特に限定はないが、例えば、 3 ' 末端にジデォキシヌクレオチド、リボースの 3位の水酸基が修飾されたヌクレオチド、 DNAポリメラーゼによる伸長が立体障害により妨害されるような修飾を付されたヌクレオチド等を付加することがあげられる。上記のヌクレオチドのリボースの 3位の水酸基の修飾方法としては、アルキル化やその他の公知の修飾方法を利用することができ、例えばアミノアルキルイ匕することにより、 D NA伸長反応を防ぐことができる。

また、本発明のヌクレオチドは、使用される条件において標的核酸の塩基置換を検出しようとする領域にアニーリングしうる塩基配列を有している。すなわち、標的核酸と実質的に相補的な配列を有していればよく、目的とする塩基における置換の検出に支障をきたさない範囲であれば標的核酸に完全に相補的な塩基配列を有している必要はない。

上記の本発明のヌクレオチドを標的核酸とアニーリングさせ、適切なヌクレアーゼと DN Aポリメラーゼの存在下にィンキュベートを行った場合、標的核酸に塩基置換が存在するか否か、すなわち当該ヌクレオチドと標的核酸とがァニーリングして形成されたニ本鎖核酸にミスマツチ部位が存在するか否かでヌクレオチドの切断が左右される。ヌクレオチドが切断されて新たな 3 ' 末端が生じた場合にのみ標的核酸を錶型とした D NA伸長が起こることから、 D NA伸長の有無によってミスマッチの有無、すなわち塩基置換の有無を知ることができる。

本発明においては、検出しょうとする塩基置換が存在する場合にミスマッチが生じるように前記ヌクレオチドを作成すること、逆に塩基置換が存在した場合にはミスマッチが生じないように作成することのどちらも可能である。さらに、目的の塩基に対応する位置に 4種の塩基のいずれかを配置した 4種のヌクレオチドを作成して使用し、どの塩基を有するプライマーで伸長が起こるかを調べることにより、塩基置換の存在と置換している塩基の種類とを同時に知ることもできる。本発明のヌクレオチドは、上記のようにヌクレアーゼによる切断によって D N A伸長が可能なプライマーに変換される。ここで、ヌクレオチドのヌクレアーゼによる切断箇所より 5，側の部分が D NA伸長におけるプライマーとして機能する。当該ヌクレアーゼとしては、ヌクレオチドと標的核酸とがアニーリングして形成された二本鎖核酸中のミスマッチの存在に対応して前記ヌクレオチドを切断もしくは切断しないものであれば特に限定はないが、例えば、リボヌクレアーゼ H、制限酵素、ミスマッチ特異的ヌクレアーゼ等があげられる。

リボヌクレアーゼ H (R N a s e H) は D NAと R NAから形成された二本鎖核酸を認識し、 R NA鎖を選択的に切断する酵素である。本発明のヌクレオチドの置換を検出しようとする塩基に対応する部分にリボヌクレオチドを配置しておくことにより、ミスマッチが存在しない場合にのみリボヌクレアーゼ Hで切断されるヌクレオチドとすることができる。

本発明に使用されるリボヌクレアーゼとしては、上記のリボヌクレオチドを含有する本発明のヌクレオチドと、これと相補的な D N Aから形成された二本鎖核酸を認識し、当該リボヌクレオチド部分を選択的に切断する活性を有していれば特に限定はない。このような酵素としては、例えば、大腸菌由来のリポヌクレアーゼ Hの他、好熱性バチルス属細菌、サーマス属細菌、ピロコッカス属細菌、サーモトガ属細菌あるいはアルカェォグロバス属細菌等由来のリポヌクレアーゼ H 等も好適に使用できる。リボヌクレアーゼ Hは、同時に使用される D NAポリメラーゼと同じ反応条件で高い活性を示すものが好ましいが、特に限定されるものではない。本発明のヌクレオチドを核酸増幅反応と組み合わせて使用する場合には、当該反応の実施される条件において活性を示すリボヌクレアーゼ Hを使用することが好ましく、例えば、 P C R法のような高温での反応、処理を含む核酸増幅反応を利用する場合には耐熱性リボヌクレアーゼ Hを使用することが有利である。耐熱性リボヌクレアーゼ Hとしては、例えばバチルス ·カルドテナクス (Bacillus caldotenax) 、ピロコッカス - フリオサス (Pyrococcus furiosus) 、ピロコッカス，ホリコシィ (Pyrococcus horikoshii) 、サーモコッカス · リトフリス (Thermococcus litoralis)、 rーモトガ ·マリテマ (Thermotoga maritima) 、アルカェォグロノス · フルギダス (Archaeoglobus fulgidus) 、メタノコッカス .ャナシ（Methanococcus jannashi) 由来のリボヌクレアーゼ H等を使用することができる。

制限酵素は D NAの特定の塩基配列（4〜8塩基）を認識し、当該配列内部、もしくはその周辺部を切断する酵素である。置換を検出しようとする塩基部分が制限酵素の認識配列と重複する場合には、当該配列を含むヌクレオチドを作成し、塩基置換の検出に使用することができる。ヌクレオチドと標的核酸との間にミスマッチが生じる場合には制限酵素による切断が起こらず、これによつて塩基置換の有無を知ることができる。このようなヌクレオチドを使用するにあたっては標的核酸側が制限酵素によって切断を受けないようにする必要があるが、使用する制限酵素に対応する修飾メチラーゼを使用して特定の塩基をメチルイヒするなどの方法により、標的核酸特異的に制限酵素への耐性を付与することが可能である。上記の 2種のヌクレアーゼとは逆に、標的核酸とヌクレオチドとの間のミスマツチを認識して切断するような酵素を使用してもよい。このような酵素としては M u t H等を使用することができる。

本発明のヌクレオチドが上記のヌクレアーゼによる切断を受け、新たな 3，末端が生じると、当該末端より D NAの伸長が開始される。この工程に使用される D NAポリメラーゼとしては、铸型 D NAの配列に依存してプライマーの 3，末端より D NA伸長が可能なものであれば特に限定はなレ、。例えば、大腸菌 D NA ポリメラーゼ I、タレノウ .フラグメント、 T 7 D NAポリメラーゼ、好熱性バチルス属細菌由来 D NAポリメラーゼ（B s t D NAポリメラーゼ、 B e a D NAポリメラーゼ）、サーマス属細菌由来 D NAポリメラーゼ（T a q D N Aポリメラーゼ等）、好熱性古細菌由来ひ型 DN Aポリメラーゼ（P f u DN Aポリメラーゼ等）が挙げられる。

本発明のヌクレオチドを遺伝子増幅反応と組み合わせて使用する場合には、それぞれの遺伝子増幅反応に適した DN Aポリメラーゼを選択して使用すればよい。本発明のヌクレオチドがヌクレアーゼにより切断されて生じる 3，側部分の断片は、その鎖長が短い場合には標的核酸から遊離する力十分な鎖長を有している場合には標的核酸とのアニーリングを維持することが可能である。 DNAポリメラーゼとして鎖置換活性を有するものを使用した場合には、当該断片は DNA ポリメラーゼによる DNAの伸長とともに標的核酸から解離させられる。また、 5， →3，ェキソヌクレアーゼ活性を有する DNAポリメラーゼを使用した場合には、当該断片は DNAポリメラーゼによって分解される。

上記の、ヌクレアーゼとしてリポヌクレアーゼ Hを使用する本発明のヌクレオチドとしては、特に限定するものではないが、例えば、下記一般式で表す構造をもつオリゴヌクレオチドを本発明に使用することができる。

一般式： 5' -dN_a-Nb-dN_c-N' 一 3'

(a ： 11以上の整数、 b ： 1以上の整数、 c ： 0または 1以上の整数、 dN：デォキシリボヌクレオチド、 N：リボヌクレオチド、 N' ： DNAポリメラーゼによる伸長が起こらないように修飾されたヌクレオチド。 )

上記一般式において、 Nbで表される部位は置換の検出の対象となる塩基に対応する塩基を含んでいる。また、上記の各ヌクレオチドはその機能を損なわない範囲でヌクレオチドのアナ口グゃ誘導体（修飾ヌクレオチド）を含有していてもよい。

例えば、上記一般式において、 N，が修飾デォキシリボヌクレオチドであり、 aが 11以上の任意の整数、 b = l〜3、 c = 0〜2のキメラオリゴヌクレオチドであるヌクレオチドが例示される。塩基置換の検出の対象となる塩基に対応する塩基は、 Nbで表される部分に位置していれば特に限定はない。本発明の実施態様の一つとしては、例えば（dNc— N' ) で表される部分の長さが 3塩基であり、塩基置換を検出しょうとする塩基に対応する塩基を Nbで表される部分の最も 3，側に設定したヌクレオチドが好適に使用でき、該ヌクレオチドは塩基置換の検出に関する良好な特異性を示す。

本発明のヌクレオチドに適切な標識を施すことにより、ヌクレアーゼによる切断、あるいはそれに続く DNA伸長反応により生じる産物（伸長産物）によってヌクレオチドから分離した 3，側断片の検出を容易にし、塩基置換の存在を簡便に確認することができる。

ヌクレオチドの標識方法には限定はなく、例えば放射性同位体（^{3 2} P等）、色素、蛍光物質、発光物質、種々のリガンド（ピオチン、ジゴキシゲニン等) 、酵素等が使用できる。標識されたヌクレオチド由来の産物は当該標識に応じた検出方法でその存在を確認することができる。直接検出できないリガンドの場合には、検出可能な標識を付されたリガンド結合性の物質と組み合わせればよレ、。例えば、リガンド標識したヌクレオチド由来の産物と酵素標識した抗リガンド抗体とを組み合せ、シグナルを増幅することによって標的核酸を高感度に検出することが可能である。

ヌクレオチドを蛍光標識する態様としては、例えば当該ヌクレオチドを蛍光物質と該蛍光物質の発する蛍光を消光する作用を有する物質の両者で、適当な間隔をとつて標識したものが包含される。このようなプライマーはインタクトな状態では蛍光を発することはないが、ヌクレアーゼにより切断されて蛍光物質と消光物質との距離が離れた場合には蛍光を発するようになる。このようなヌクレオチドは D NA伸長反応の開始と同時に蛍光が発せられるため、反応中の反応液を直接観察することによって塩基置換の有無を知ることができる。

( 2 ) 本発明の塩基置換の検出方法

本発明の塩基置換の検出方法は、上記（1 ) に記載された本発明のヌクレオチドを使用し、下記の工程；

1 ) 標的核酸を含有する試料と前記ヌクレオチドとを混合する工程：

2 ) 前記混合物をヌクレアーゼ、および DN Aポリメラーゼで処理する工程：おょぴ

3 ) ヌクレアーゼによるヌクレオチドの切断の有無を検出する工程、

により実施されることを特徴とする。上記（1 ) に記載された本発明のヌクレオチドの特徴に従い、ヌクレアーゼによるその切断の有無から塩基置換が存在するカゝ否かを判定する。

本発明の塩基置換の検出方法に使用される標的核酸としては一本鎖、二本鎖の核酸、すなわち D NA、 RNAを使用することができる。使用するヌクレアーゼによっては R NAを標的核酸とすることが困難な場合もあるが、その場合には当該 R NAを铸型として調製した c DNAを標的核酸として使用することにより、 R N A上の塩基置換を検出することが可能である。

本発明においては、標的核酸を含有する試料を検出反応に使用することができる。

上記試料には特に限定はなく、核酸、もしくは生物を含む可能性のあるあらゆる試料、例えば、細胞、組織（生検試料等）、全血、血清、脳脊髄液、精液、唾液、喀痰、尿、糞便、毛髪、細胞培養物等を使用することができる。上記の検体は、特に限定するものではないが、好ましくは適切な処理によって、例えば D N Aポリメラーゼの反応を実施が可能な形態としたうえ、本発明の方法に供することができる。このような処理には細胞の溶解や試料からの核酸の抽出、精製が包含される。

本発明の塩基置換の検出方法においては、使用されるヌクレオチドの切断の有無、ならぴにそれに続いて起こる DN A伸長反応の有無から塩基置換の存在が判定される。その方法には特に限定はなく、公知の核酸分析手法を使用することができる。例えば、 D N A伸長反応の有無を調べる方法としては、生成した伸長産物をゲル電気泳動法（ァガ口一スゲル、ポリアクリルアミドゲル等）あるいはキャビラリ一電気泳動法によって分離して確認する方法、伸長産物の鎖長の増加をマススペクトルによって測定する方法等を挙げることができる。また、別の態様としては、例えば、伸長産物へのヌクレオチドの取り込みを調べる方法がある。当該方法では、適切な標識を付加したヌクレオチド 3リン酸が高分子の伸長産物に取り込まれる量として伸長産物の合成量を知ることができる。伸長産物は、例えば酸による沈殿処理やゲル電気泳動によつて未反応のヌクレオチドと分離し、その生成量を測定することができる。さらに、 D N A伸長反応によって生成するピロリン酸を酵素的に検出する方法を使用してもよい。

本発明の検出方法において、さらに公知の核酸増幅反応を用いて当該伸長産物を増幅してもよい。このような態様は、高感度に塩基置換を検出する観点から有用である。

上記の核酸増幅反応には特に限定はなく、錶型核酸に相補的な配列を有するプライマーが使用される種々の核酸増幅方法が使用できる。例えばポリメラーゼ連鎖反応法（P C R； polymerase chain reaction, 米国特許第 4， 683， 195号、第 4， 683， 202号おょぴ第 4, 800， 159号）、鎖置換型増幅法（S D A ; strand displacement amplification, 特公平 7- 114718号）、自立複製法（3 S R； self-sustained sequence replication) 、 I A S B A法 (nucleic acid sequence based amplification, 特許第 2650159号）、 TMA法

(transcription-mediated amplification) 、 I C AN法 (Isothermal and

Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids、国際公開第 00/56877号パンフレット）等の公知の増幅方法を使用することができる。これらの方法において、铸型 D NA鎖に相捕的な D NAを合成する際のプライマーとして本発明のヌクレオチドを使用することにより、標的核酸上の塩基置換を検出することができる。

上記のような核酸増幅法を利用して本発明の塩基置換の検出方法を実施する場合には、各方法に使用されるプライマーの少なくとも一つとして本発明のヌクレォチドを使用し、さらに反応系中に当該ヌクレオチドに適したヌクレア一ゼを共存させればよい。

上記のような、核酸増幅反応を利用した塩基置換の検出においては、当該反応による特異的な増幅産物の生成から塩基置換の存在を判定することができる。増幅産物の生成は、特に限定するものではないが、例えばゲル電気泳動、増幅産物に相補的な配列を有するプローブを使用したハイブリダイゼーション法、蛍光標識ヌクレオチドを利用した蛍光偏光法、タックマン法等が使用でき、さらに各遺伝子増幅方法に特有の検出反応も利用することができる。

本発明の検出方法を用いてゲノムレベルでの塩基置換を解析する場合には、大量の塩基配列を解析するために反応系を微量化し、さらに集積度を高める手段を組み合わせてもよい。その手段の一つとして、最先端の超微細加工技術を駆使して、本発明の検出方法あるいは解析方法の基本プロセス、例えば、 D NAの細胞力らの抽出、核酸増幅反応、目的 DNAの検出等のプロセスを数 cm角〜指先大のマイクロチップ上に集積ィ匕したものを組み合わせてもよい。さらに、必要に応じてゲル或いはキヤビラリ一電気泳動、検出用プローブとのハイブリダィゼーシヨンのプロセスを組み合わせてもよレ、。該システムは、マイクロチップ、マイク口 CE (c a p i l l a r y e l e c t o ph o r e s i s) チップあるレヽはナノチップとも呼ばれている。

このようなシステムにおける核酸増幅反応としては目的の DNA断片が増幅されるものであればいずれの核酸増幅反応も利用することができる。特に限定はされないが例えば、 I CAN法のような等温条件下で核酸を増幅できる方法が好適に使用できる。該方法を組み合わせることにより、当該システムの単純化が可能となり、上記のような集積ィ匕されたシステムでの利用に非常に好適である。さらに、本発明の技術を利用してさらに高い集積度のシステムの構築が可能となる。本発明の方法において、本発明のヌクレオチドに修飾ヌクレオチドを含ませること及び Z又は反応温度を適宜調整することにより塩基置換の検出の特異性を向上させることができる。

上記 (1) に記載された、標識が付加された本発明のヌクレオチドは、 DNA 伸長反応の有無の確認を容易にすることができ、本発明の塩基置換の検出方法に有用である。この場合、当該ヌクレオチド由来の標識物質を上記のような各標識に適した方法で検出し、伸長反応の有無を確認すればよい。

例えば、蛍光物質が付加された本発明のヌクレオチドを使用する場合、標識がプライマーとして利用される部分に付加されていれば、伸長産物をその蛍光を利用して検出することができる。また、ヌクレオチドのヌクレアーゼによる切断箇所よりも 3，側に付加されていれば、 3，側断片の標的核酸からの解離や DN A ポリメラーゼの有する 5，→3，ェキソヌクレアーゼによる該断片の低分子化等に基づいて伸長反応の有無を検出することができる。このような、蛍光標識されたヌクレオチドの分子量の変化を伴う態様においては蛍光偏光法の利用が好適である。

また、蛍光物質と該蛍光物質の発する蛍光を消光する作用を有する物質とを付加して蛍光を発することのないように標識した本発明のヌクレオチドを使用する場合、伸長反応が起こると同時に蛍光が発せられるようになるため、極めて容易に塩基置換を検出することができる。

上記の各態様において、塩基置換を検出しょうとする位置に対応してアデニン

(A) 、シトシン（C) 、グァニン（G) 、チミン（T) あるいはゥラシノレ (U) のそれぞれを有し、かつそれぞれが互いに区別可能な異なる標識を付されたヌクレオチドを利用することにより、塩基置換の存在とともに、塩基置換がある場合には置換している塩基の種類を同時に知ることができる。

本発明のヌクレオチドを使用し、 P C R法によって塩基置換を使用することもできる。この場合、 P C R法の一方のプライマーのかわりに本発明のヌクレオチドを使用し、通常の P C R用反応液にさらに前記ヌクレオチドに応じたヌクレアーゼを添加すればよい。この場合、ヌクレアーゼとして P C Rの条件において失活しないものを選択することにより、高感度に塩基置換を検出することができる。ヒトを含む高等動物の細胞は、通常 1対の染色体を有する二倍体である。そのため、染色体上の特定の塩基について塩基置換が存在する可能性がある場合、当該細胞は両染色体ともに塩基置換を有しないホモ接合体（ホモ型）、両染色体ともに塩基置換が存在するホモ接合体（ホモ型）、あるいは一方の染色体のみに塩基置換を有するヘテロ接合体（ヘテロ型）の 3通りの可能性がある。

二倍体の細胞より調製した核酸試料について本発明の塩基置換の検出方法を適用することにより、遺伝子上の任意の塩基について当該細胞、すなわち当該細胞を有する個体の遺伝子型がホモ型あるいはヘテロ型のいずれかであるかを調べることができる。特に限定はないが例えば、 4通りの塩基のそれぞれに対応し、ミスマッチが存在しない場合に切断を受けるタイプのヌクレオチドを使用して本発明の方法を実施した場合、遺伝子型がヘテロ型である細胞由来の核酸試料では 2 種のヌクレオチドについてヌクレオチドの切断にともなうシグナルが検出される。一方、遺伝子型がホモ型である細胞由来の核酸試料では 1種のヌクレオチドのみでシグナルが検出され、さらにこのホモ型が塩基置換を有する、あるいは有しないことも同時に判定することができる。このように、本発明の方法は、上記のような対立遺伝子上の塩基置換の検出にも有用である。

( 3 ) 本発明の塩基置換の検出に使用されるキット本発明は、上記の本発明の塩基置換の検出に使用されるキットを提供する。 1 つの実施態様において、該キットは本発明のヌクレオチドを含有することを特徴とする。塩基置換の有無と同時に置換した塩基を特定できるような、 4種の塩基それぞれを含有するヌクレオチドのセットを含有するものでもよい。さらに、当該ヌクレオチドに適したヌクレアーゼ、 DN Aポリメラーゼやその基質 (dNT P) 、反応に適した緩衝液等を含有するものやプライマー伸長産物の検出のための試薬を含有するものであってもよい。核酸増幅法と組み合わせて塩基置換を検出するためのキットとしては、当該増幅法に使用される反応液を調製するための試薬を含有するものが好適である。

実施例

以下に実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。

参考例 1 ピロコッカスフリオサスの RNa s eH I I遺伝子のクローニング

(1) ピロコッカスフリオサスゲノム DNAの調製

トリプトン（ディフコラボラトリーズ社製） 1%、酵母エキス（ディフコラボラトリーズ社製） 0. 5 %、可溶性でんぷん（ナカライテスク社製） 1%、ジャマリン S · ソリッド（ジャマリンラボラトリー社製） 3. 5%、ジャマリン3 · リキッド（ジャマリンラボラトリー社製） 0. 5%、 Mg S〇₄ 0. 003%, N a C 1 0. 001 %、 F e S O₄ · 7 H₂ O 0. 0001%、

C o S0₄ 0. 0001%, C a C 1₂ - 7H₂ O 0. 0001%、 ZnS 0₄ 0. 0001%, Cu S0₄ · 5H₂ O 0. 1 p pm、 KA l (SO₄ ) 2 0. 1 p pm、 H₃ BO₄ 0. l p pm, Na₂ Mo0₄ - 2H₂ O 0. 1 pm_s N i C 1₂ · 6H₂ O 0. 25 p p mの組成の培地 2リットルを 2 リットル容のメジユウムボトルにいれ、 120°C、 20分間殺菌した後、窒素ガスを吹き込み、溶存酸素を除去し、これにピロコッカスフリオサス

(Pyrococcus furiosus, ドイツチェザムノレンクフォンミクロオノレガニスメンより購入： D SM3638) を接種して、 95°C、 16時間静置培養した後、遠心分離によつて菌体を得た。次に、得られた菌体を 4m 1の 25%ショ糖、 50mM Tr i s _HC 1 (pH8. 0) に懸濁し、 0. 4mlの 1 Omg/ml塩化リゾチーム（ナカラィテスク社製）水溶液を加えて、 20°Cで 1時間反応させた。反応終了後、この反応液に 24m 1の 15 OmM Na C l、 1 mM EDTA、 2 OmM Tr i s— HC 1 (pH8. 0) 、 0. 2mlの S OmgZml プロティナーゼ K

(宝酒造社製）及び 2 m 1の 10 %ラウリル硫酸ナトリゥム水溶液を加え、 3 7°Cで 1時間保温した。

反応終了後、フエノール一クロ口ホルム抽出、続いてエタノール沈殿を行い、約 1 m gのゲノム D N Aを調製した。

(2) RNa s eH I I遺伝子のクローニング

ピロコッカスホリコシ（Pyrococcus horikoshii) の全ゲノム配列が公開されており〔DNA リサーチ（DNA Research) 、第 5卷、第 55— 76頁（19 98) 〕、 RNa s eHI Iのホモログをコードする遺伝子（PH1650) が 1つ存在することが明らかになつている（配列番号 1、独立行政法人製品評価技術基盤機構ホームページ： http：〃 www. nite. go. jp/) 。

そこで、この PHI 650遺伝子（配列番号 1) と一部公開されているピロコッカスフリオサス（Pyrococcus furiosus)のゲノム配列（University of Utah, Utah Genome Center ホームへ¹ ~ン：

http: //www. genome. Utah, edu/sequence. html) でホモロジー検索をおこなった。その結果、非常にホモロジ一の高い配列が見つかった。

得られた配列をもとにプライマー 165 ONd e (配列番号 2) 及び 1650 B am (配列番号 3) を合成した。

参考例 1_ (1) で得たピロコッカスフリオサスゲノム DNA 200η gを鎳型にして、 20 pmo 1の 1650Nd e及ぴ 20 pmo lの 1650B amをプライマーに用い、 100 μ 1の容量で P C Rを行った。 PCRでの DN

Αポリメラーゼはタカラ Exタック（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従つて用い、 PCRは 94°Cで 30秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 1分を 1サイクルとし、 30サイクル行った。増幅した約 0. 7 k bの DNA断片を Nd e I及ぴ B amHI (ともに宝酒造社製）で消化し、得られた D NA断片をプラスミドべクター p E T 3 a (ノバジェン社製）の N d e I及ぴ B a mH I間に組込んだプラスミド P PFU220を作製した。

(3) RNa s eHI I遺伝子を含む DN A断片の塩基配列の決定

参考例 1- (2) で得られた p P F U 220の挿入 D N A断片の塩基配列をジデォキシ法によって決定した。

得られた塩基配列の結果を解析したところ、 RNa s eHI Iをコードすると考えられるオープンリーディングフレーム（open resding frame ； 0RF)が見出された。このオープンリ一ディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号 4に示す。また、該塩基配列から推定される RNa s eHI Iのアミノ酸配列を配列表の配列番号 5に示す。

なお、プラスミド PPFU220で形質転換された大腸菌 J M 109は、 Escherichia coli J1109/pPFU220と命名、表示され、平成 12年 9月 5日より日本国〒 305-8566茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号 F ERM P— 180 20として寄託され、また前記独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号 FERM BP-7654 [国際寄託への移管請求日：平成 1 3年 7月 9日] として寄託されている。

(4) 精製 RNa s eHI I標品の調製

参考例 1一 (2) で得られた p PFU220を大腸菌 HMS 174 (DE3) (ノバジェン社製）に形質転換し、得られた p P F U 220を含む大腸菌 HM S

174 (DE 3) を 100 μ g/m 1のアンピシリンを含む 2リットルの LB培地に植菌し、 37 °Cで 16時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を 66. Om 1のソニケーシヨンバッファー〔5 OmM T r i s— H C I (pH8. 0) 、 ImM EDTA、 2mM フエニルメタンスルフォニルフルオラィド〕に懸濁し、超音波破枠機にかけた。この破枠液を 12◦ 00 r p mで 10分間の遠心分離を行い、得られた上清を 60°C、 15分間の熱処理にかけた。その後、再度 12000 r pmで 10分の遠心分離を行い、上清を集め、 61. 5m lの熱処理上清液を得た。

この熱処理上清液をバッファー A 〔50mM T r i s—HC 1 (DH8. 0) 、 ImM EDTA] で平衡ィ匕した RE S OUR S E Qカラム（アマシャムフアルマシアバイオテク社製）に供し、 F PLCシステム（アマシャムフアルマシアバイオテク社製）を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、 RNa s eHI Iは RE SOURS E Qカラムを素通りした。

素通りした RNa s eH I I画分 60. 0m 1をバッファー Aで平衡化した R

ESOURSE Sカラム（アマシャムフアルマシアバイオテク社製）に供し、 FPLCシステムを用いて 0〜50 OmM N a C 1直線濃度勾配により溶出し、約 15 OmM Na C 1のところに溶出された RN a s eHI I画分を得た。

この RNa s eHI I画分 2. 0 m 1をセントリコンー 10 (アミコン社製）を用いた限外ろ過により濃縮し、 250 1の濃縮液を 10 OmM NaC l、 0. ImM EDTAを含む 5 OmM T r i s— HC 1 (pH8. 0) で平衡ィ匕した S u p e r d e x 200ゲルろ過カラム（アマシャムフアルマシアバィォテク社製）に供し、同じバッファーで溶出を行った結果、 RNa s eHI I は、 17キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。この分子量は、 R N a s e H I Iが 1量体として存在する場合に相当する。

こうして溶出された RNa s eHI Iを P f u RNa s eHI I標品とした。上記で得られた P f u RNa s eH I I標品を用いて下記の方法により RN a s eH活性を測定した。

1 OmM Tr i s—HC l (pH8. 0) 、 ImM ジチオスレィトール

(ナカライテスタ社製）、 0. 003 %ゥシ血清アルプミン（フラクション V、シグマネ： ti¾ 、 4%グリセロール、 20 g/ml ポリ（dT) (アマシャムブアルマシアバイオテク社製） , 30 g/m 1 ポリ（rA) (アマシャムファルマシァバイォテク社製）を混合し、 37 で 10分間保温した。これを RNa s e H活性を測定するための基質液として使用した。

100 A 1の基質液に 1 μ 1の 1 M Mn C 1₂ を加えて 40°Cで保温し、これに上記の P f u RNa s eH I I標品を適当に希釈したものを加えて反応を開始した。 40°Cで 30分間反応を行った後、 Ι θ ί Ιの 0. 5Μ EDTAを加えて反応を停止し、 260 nmにおける吸光度を測定した。その結果、上記の P f u RNa s eH I I標品を添カ卩した反応液では、先に Ι Ο μ Ιの 0. 5Μ EDTAを加えた後にこれを添加したものに比べて 260 nmにおける吸光度の値が高かった。よって、当該標品が RNa s eH活性を有することが明らかになった。

( 5 ) 精製 R N a s e H活性の測定

a) 使用する試薬液の調製

力価測定用反応液：最終濃度がそれぞれ 4 OmM T r i s— HC 1 (pH7. 7、 37。C) 、 4mM 塩化マグネシウム、 1 mM DTT、 0. 003% B SA、 4%グリセロール、 24 μΜ ポリ（dT) になるように滅菌水で調製した。

ポリ [8— ³H] アデ-ル酸溶液： 370 kB qのポリ [8—³H] ァデュル酸溶液を 200 1の滅菌水に溶解した。

ポリアデニル酸溶液：ポリアデ二ル酸を 3 mMになるように滅菌超純水で希釈した。

酵素希釈液：最終濃度がそれぞれ 25 mM T r i s -HC 1 (pH7. 5、

37°C) 、 5mM 2—メルカプトエタノール、 0. 5mM EDTA (pH7. 5、 3 7°C) 、 3 OmM 塩ィ匕ナトリウム、 50 %グリセロールになるように滅菌水で調製した。

熱変性子牛胸腺 D N Aの調製：子牛胸腺 D NA 200mgを TEバッファー 1 00m lに懸濁し、膨潤させた。該溶液の UV 260 nmの吸光度を測定し、 lmg/m 1の濃度に滅菌超純水で希釈した。次に、該溶液を 1 00°Cで 1 0分間加熱後、氷浴中で急冷した。

b) 活性測定方法

上記 a) で調製した力価測定用反応液 985 μ 1にポリ [8—³Η] アデ二ル酸溶液 7 μ 1を加え 37°Cで 1 0分間保持した。次にポリアデ二ル酸を最終濃度が 24 μΜになるように 8 μ 1加え、さらに 3 7°Cで 5分間保持した。このようにしてポリ [8—³ H] rA—ポリ dT反応液 1000 /i lを調製した。次に、該反応液 200 μ 1を分取し、 30°Cで 5分間保持した後、任意の希釈系列で希釈した酵素液 1 w 1をカロえ、これらの反応液を経時的に 50 1ずつサンプリングして、後の測定に用いた。酵素添加からサンプリングまでの間の時間を Y分とした。また、全 C PM用反応液 50 1およびブランク用反応 ί夜 50 1は、酵素液の代わりに酵素希釈液を 1 μ 1加えて調製した。該サンプリング溶液に 1 00 mM ピロリン酸ナトリウム 1 00 μ 1、熱変性子牛胸腺 D ΝΑ溶液 5 0 μ 1および 1 0 %トリクロ口酢酸 3 00 μ 1 (全 C ΡΜ測定の場合は、超純水 300 μ 1 ) を加え、 0°Cで 5分間保持後、 l O O O O r pm で 1 0分間遠心した。遠心後、得られた上清 2 5 0 μ 1をバイアルに入れ、ァクァゾル _2 (ΝΕΝライフサイエンスプロダクツ社製） 10mlを加え、液体シンチレーシヨンカウンターで C P Mを測定した。

c) ュニット計算

各酵素のユニット（Unit) 数は、以下の計算式で算出した。

Unit/ml ={ (測定した C PM—ブランク C PM) X I . 2* X 20 X 1 000 X 希釈率 } Χ 200 (μ I ) / (全 C PMXY分 Χ 50 (μ 1 ) X 9**)

1. 2* ：全 C PM中に含まれるポリ [8—³ H] r A—ポリ d Tの 50 μ 1当たりの nmo 1数

9** ：補正係数

参考例 2 アルカェォグロバスフルギダスの RN a s e H I I遺伝子のクロ一ユング

(1) アルカェォグロバスフルギダスゲノム DNAの調製

アルカェォグロバスフルギダス（Archaeoglobus fulgidus、ドイツチェザムノレンクフォンミクロオノレガニスメンゥントツエノレクルツレン Gmb Hより購入： DSM4 1 3 9) 8 m 1相当分の菌体を集め、 Ι Ο Ο μ Ιの 2 5%ショ糖、 50mM T r i s _HC l (pH8. 0) に懸濁し、 20 1の 0. 5M EDTA、 1 0 μ 1の 1 OmgZrn 1 塩ィ匕リゾチーム（ナカラィテスク社製）水溶液を加えて、 20°Cで 1時間反応させた。反応終了後、この反応液に 8 00 μ 1の 1 5 OmM N a C l、 1 mM EDTA、 2 OmM T r i s— HC 1 (pH8. 0) 、 Ι Ο μ Ιの 20mgZml プロティナーゼ K (宝酒造社製）及び 50 1の 1 0%ラウリル硫酸ナトリウム水溶液を加え、 3 7 °C で 1時間保温した。反応終了後、フエノールークロロホルム抽出、エタノール沈殿、風乾した後に 50 μ 1の ΤΕに溶解してゲノム DNA溶液を得た。

(2) RNa s eH I I遺伝子のクローニング

アルカェォグロバスフルギダス（Archaeoglobus fulgidus) は全ゲノム配列が公開されており〔K 1 e n k， HPら、ネイチヤー（Nature) 、第 390卷、第 364— 370頁（1 997) 〕、 RNa s eH I Iのホモログをコードする遺伝子 (AF 062 1) が 1つ存在することが明らかになつている（配列番号 1 a、 http://www. tigr. org/tdb/CMR/btm/htmls/SplashPage. html) 。

そこで、この AF O 621遺伝子（配列番号 1 3) の配列をもとにプライマー A f uNd e (配列番号 14 ) 及ぴ A f u B a m (配列番号 1 5 ) を合成した。参考例 2— (1) で得たアルカェォグロバスフルギダスゲノム DNA 3

0 n gを铸型にして、 20 p m o 1の A f uNd e及び 20 p m o 1の A f u B amをプライマーに用い、 1 00 μ 1の容量で PCRを行なった。 PCRでの D NAポリメラーゼはパイ口べスト DNAポリメラーゼ（宝酒造社製）を添付のプ口トコールに従って用レヽ、 P C Rは 94でで 30秒、 55 で 30秒、 72 °Cで 1分を 1サイクノレとし、 40サイクル行った。増幅した約 0. 6 kbの DNA断片を Nd e I及び B amH I (ともに宝酒造社製）で消化し、得られた DNA断片をプラスミドベクター p TV 1 1 9Nd (p TV 1 1 9NのNc o Iサイトを N d e Iサイトに変換したもの）の Nd e I及び B a mH I間に,祖込んだプラスミド p AFU204を作製した。

(3) RNa s eH I I遺伝子を含む DNA断片の塩基配列の決定

参考例 2— (2) で得られた p AFU204の挿入 DNA断片の塩基配列をジデォキシ法によつて決定した。

得られた塩基配列の結果を解析したところ、 RNa s eH I Iをコードすると考えられるオープンリ一ディングフレームが見出された。このオープンリ一ディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号 1 6に示す。また、該塩基配列から推定される RN a s eHI Iのァミノ酸配列を配列表の配列番号 17に示す。なお、プラスミド pAFU204で形質転換された大腸菌 J M 10 9は、 Escherichia coli JM109/pAFU204と命名、表示され、平成 1 3年 2月 22日より日本国〒 305— 8 566茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号 F ERM P— 18 221として寄託され、また前記独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号 FERM BP— 7691 [国際寄託への移管請求 Θ ：平成 13年 8月 2日] として寄託されている。

(4) 精製 RNa s eHI I標品の調製

参考例 2— （2) で得られた p AFU204で大腸菌 JM109を形質転換し、得られた p AFU204を含む大腸菌 JM109を 100 g/m 1のアンピシリンを含む 2リットルの LB培地に植菌し、 37。Cで 16時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を 37. lmlのソニケーシヨンバッファー〔5 OmM T r i s _HC 1 (pH8. 0) 、 1 mM EDTA、 2mM フエ-ルメタンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破石にかけた。この破碎液を 12000 r pmで 10分間の遠心分離を行い、得られた上清を 7 0°C、 15分間の熱処理にかけた。その後、再度 12000 r 111で10分の遠心分離を行い、上清を集め、 40. 3 m 1の熱処理上清液を得た。

この熱処理上清液をバッファー A 〔5 OmM Tr i s— HC 1 (pH8.

0) 、 ImM EDTA〕で平衡ィ匕した R E S OUR S E Qカラム（アマシャムフアルマシアバイオテク社製）に供し、 F PLCシステム（アマシャムフアルマシアバイオテク社製）を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、 RNa s eHI Iは RE SOURS E Qカラムを素通りした。

ノッファー Aで平衡ィ匕した RE SOURS E Sカラム（アマシャムフアルマシアバイオテク社製）に供し、 F PLCシステム（アマシャムフアルマシァバイオテク社製）を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、 RN a s eH I Iは RE SOUR SE Sカラムを素通りした。

素通りした RN a s e H I I画分 40. Omlを 5 OmM N a C 1を含むバッファー B [5 OmM Tr i s— HC 1 (pH7. 0) 、 ImM EDT

A] 2リットノレを外液として、 2時間の透析を 3回行なった。透析後の酵素液 40. 2mlを 5 OmM N a C 1を含むバッファー Bで平衡ィ匕した H i T r a p-h e p a r i nカラム (アマシャムフアルマシアバイオテク社製）に供し、 F PLCシステムを用いて 50〜55 OmM N a C 1直線濃度勾配により溶出した。その結果、約 240mM Na C 1のところに溶出された RNa s e H I I画分を得た。

この RNa s eH I I画分 7. 8 m 1をセントリコンー 10 (アミコン社製）を用いた限外ろ過により濃縮し、約 600 μ 1の濃縮液を 4回に分けて 10 Om M Na C l、 0. 1 mM EDTAを含む 50mM T r i s— HC 1 (pH 7. 0) で平衡化した Sup e r o s e 6ゲルろ過カラム（アマシャムフアルマシアバイオテク社製）に供し、同じバッファーで溶出を行った結果、 RNa s eHI Iは、 30. 0キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。この分子量は、 RNa s eHI Iが 1量体として存在する場合に相当する。

こうして溶出された RNa s e H I Iを A f u RN a s e H I I標品とした。上記で得られた A f u RNa s eHI I標品を用いて、参考例 1 _ ( 5 ) に記載の方法により酵素活性を測定した結果、 A f u RN a s e H I I標品に RN a s eH¾†生が認められた。

以下の実施例における耐熱性 RNa s 6^1の11 ₁1 i t数は、以下の方法により算出し 7こ。

ポリ（rA) 及びポリ（dT) (ともにアマシャムフアルマシアバイオテク製） lmgをそれぞれ ImM EDTAを含む 4 OmM トリス一 HC 1 (p H7. 7) 1mlに溶解し、ポリ（rA) 溶液及ぴポリ（dT) 溶液を調製した。次に、 4mM MgC l₂、 ImM DTT、 0. 003%BSA、 4⁰/。グリセロールを含む 40mM トリス— HC 1 (pH7. 7) に、終濃度 20 8 mlとなるポリ（rA) 溶液、終濃度 30μ g/mlとなるポリ（dT) 溶液を加え、 37°Cで 10分間反応後、 4°Cに冷却し、ポリ（rA) —ポリ（dT) 溶液を調製した。このポリ（rA) —ポリ（dT) 溶液 100 1に任意に希釈した酵素液 Ι μ ΐを加え、 40°Cで 10分間反応させ、 0. 5M EDTA 10 μ 1を加えて反応を停止させた後、 260 nmの吸光度を測定した。対照として、上記反応液に 0. 5 M EDTA 10 1を加えた後、 40 °Cで 10分間反応させ、吸光度を測定した。その後、 EDTA非存在下で反応させ求めた吸光度から対照の吸光度を引いた値（吸光度差）を求めた。すなわち、酵素反応によってポリ（rA) —ポリ（dT) ハイブリッドから遊離したヌクレオチドの濃度を吸光度差から求めた。 R N a s e Hの 1単位は、 1 n m o 1のリボヌクレオチドが遊離したのに相当する A₂₆。を 10分間に増加させる酵素量とし、下記の式に従つて算出した。

単位 (unit) = 〔吸光度差 X反応液量（ml) 〕 0. 0152X (1 10 /100) X希釈率

実施例 1 ヒト c— K i— r a s遺伝子上の塩基置換の検出

(1) テンプレートの作成

ヒト c— K i— r a sェクソン 1のコドン 12にそれぞれ GGT (G 1 y) 、 CGT (Ar g) 、 TGT (Cy s) 、 AGT (S e r ) の配列を有した DNA 断片を調製した。すなわち、ラス · ミュータント ·セット（ras Mutant Set c -

Ki-ras codon 12、宝酒造社製）中の上記のコドンに対応するテンプレート DN Aとラス ·ジーン ·プライマーセッ卜（ras Gene Primer Set c- i-ras/12, 宝酒造社製）を用いた PCRによって得られた増幅産物を pT 7— B 1 u eベクタ一（ノバジェン社製）にクローユングした。こうして得られた組換えプラスミドを鏡型とし、 M13プラィマーM4、 RV (いずれも宝酒造社製）を用いた PC Rを実施し、得られた増幅断片を回収してそれぞれテンプレート 12G、 12R、 12 C、 12 Sとした。

(2) 塩基置換の検出

ヒト c -K i— r a sエタソン 1の塩基配列に従って、上記テンプレート 12 Gを特異的に検出するためのフォヮ一ド側ヌクレオチドとして、それぞれ配列番号 7〜 9記載の塩基配列を有する 3種のキメラオリゴヌクレオチドを合成した。これらは 3，末端のヌクレオチドのリポース部分の 3位の水酸基がァミノへキシル化されたキメラオリゴヌクレオチドである。また、該ヌクレオチドは、コドン 12が G 1 yをコードしているヒト c_K i— r a sェクソン 1の塩基配列に相補的な配列を有している。また、核酸増幅のためのアンチセンスプライマーとして配列番号 6の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。

それぞれ 50 pmo 1のフォヮ一ド側ヌクレオチドとアンチセンスプライマー、 1〃 1の 0. 25 %プロピレンジァミン水溶液、铸型としてテンプレート 12 G、 12C、 1 2R、 12 Sのいずれか 1 p gを含む全量 5 1の反応液を調製し、サーマルサイクラ一パーソナル（宝酒造ネ ±$¾ で 98 °C、 2分間加熱処理の後、 53 °Cの加熱処理を行って鎵型にプライマー側ヌクレオチドならびにアンチセンスプライマーをアニーリングさせた。上言口熱処理を行った各溶液に 0. 625 mM dNTP混合液、 40mM H e p e s—KOH緩衝溶液（p H 7. 8) 、 125mM 酢酸カリウム、 5mM 酢酸マグネシウム、 0. 0125%ゥシ血清アルブミン、 1. 25 %ジメチルスルホキシド、 16 Uの参考例 1に記載の P f u RNa s eHI I及び、 5. 511の：0。 & 8 6 3 七 DNAポリメラーゼ (宝酒造社製）及び滅菌水を含む全液量 20 μ 1を添加し、最終容量を 25 μ 1とした。該反応液は 53°C、 1時間保持した。反応終了後、該反応液 5 μ 1 を 3. 0%ァガロースゲル電気泳動に供した。この結果を図 1に示す。図 1—1 〜 3に示されたァガロースゲルにおいて、レーン 1〜 4はそれぞれテンプレート 12G、 12C、 12R、 12 Sを用いた場合の反応液がアプライされている。また、図 1一 1、 2、 3は、それぞれ配列番号 7、 8、 9のヌクレオチドを使用した反応の結果を示す。

図 1に示されるように、配列番号 7〜 9記載のヌクレオチドを用いた場合には、いずれもテンプレート 12 Gを使用した場合のみ、すなわち標的核酸がコドン 1 2に G l yをコードしている場合のみに増幅産物が観察された。このこと力、ら、本発明のヌクレオチドを使用することにより、標的核酸上の塩基置換の判別が可能であることが示された。さらに、イノシンを含有したヌクレオチドを用いることにより、特異的増幅を向上させることができることを確認した。

実施例 2 c— K i— r a sコドン 12の他のアレルの検出

実施例 1の結果を基に、実施例 1— ( 1 ) で調製した、 12R、 12C、 12 S上のコドン 12の塩基を特異的に判別可能なヌクレオチドとして、それぞれ配列番号 10〜 12に示す塩基配列をするキメラオリゴヌクレオチドを合成した。配列番号 10、 1 1、 12はそれぞれコドン 12が Cy s、 Ar g、 S e rであるアレルに対応する塩基配列を有している。また、これらはいずれも 3，末端のヌクレオチドのリボース部分の 3位の水酸基がァミノへキシル化されたヌクレオチドである。これらのヌクレオチドと酉 S列番号 6記載のアンチセンスプライマーとを使用し、実施例 1— (2) と同一反応条件下、反応を行なった。反応終了後、該反応液 5 1を 3. 0%ァガロースゲル電気泳動に供した。この結果を図 2に示す。図 2— 1〜 3に示されたァガロースゲルにおいて、レーン 1〜4はそれぞれテンプレート 12G、 12C、 12 R、 12 Sを用いた場合の反応液がァプラィされている。また、図 2— 1、 2、 3は、それぞれ配列番号 10、 11、 12 のヌクレオチドを使用した反応の結果を示す。

図 2に示されるように、配列番号 10、 1 1、 12のヌクレオチドを用いた場合には、それぞれテンプレート 12C、 12R、 12 Sと組み合わせた場合のみに特異的な増幅産物が認められた。すなわち、本発明のヌクレオチドは目的とする塩基を正確に判別する能力を有していた。さらに、イノシンを含有したオリゴヌクレオチドを用いる事により、特異的増幅を向上させることができることを確認した。

実施例 3 ゲノム DNA上のアレル特異的な DNA増幅

c _K i一 r a sェクソン 1のコドン 12が G 1 y (GGT) である事を確認されている、ヒトゲノム DNA (クロンテック社製） 150n g、または 3 O n gを用い、実施例 1、 2においてコドン 12の 4種のアレルを特異的に検出する事が示された配列番号 7、 10、 1 1、 12記載のヌクレオチド（それぞれコドン 12が G l y、 Cy s、 Ar g、 S e rの場合に対応）、ならびに配列番号 6 記載のアンチセンスプライマーを使用し（2) と同一条件下、反応を行った。反応終了後、該反応液 5// 1を 3. 0°/。ァガロースゲル電気泳動に供した。その結果を図 3に示す。

図 3—1、 2に示されたァガロースゲルにおいて、レーン 1〜4はそれぞれ配列番号 7、 10、 1 1、 12記載のヌクレオチドを用いた場合の反応液がァプラィされている。また、図 3— 1、 2は、それぞれ 150 n g、 30n gのヒトゲノム DNAを使用した反応の結果を示す。

図 3に示されるように、上記のヒトゲノム DNAの使用量にかかわらず、配列番号 7のヌクレオチドのみにおいて DN A断片の増幅が認められ、他のヌクレオチドでの DN A断片の増幅は見られなかった。このことから、本発明の塩基置換の検出方法により、ゲノム DNA上の特定のァレルを検出可能であることが確認された。実施例 4 種々の RNa s eHを用いた検出

実施例 1に示された塩基置換の検出を、種々の RN a s e Hを使用して試みた。すなわち、 P f u RNa s eHI Iにかえて参考例 2に記載の Af u RN a s e H I I、ストラクチャ一（Structure) 、第 8卷、第 897〜 904頁に記載の方法で調製したメタノコッカス ·ャナシ（Methanococcus jannashi) 由来の RNa s eHである Mj a RNa s eH I Iをそれぞれ使用した。フォヮ一ド側ヌクレオチドとして配列番号 7のヌクレオチド、ァンチセンスプライマーとして配列番号 6のオリゴヌクレオチドを使用し、実施例 1と同じ条件で反応を行なった。反応終了後、該反応液 5 μ 1を 3. 0%ァガロースゲル電気泳動に供した。この結果を図 4に示す。図 4 _ 1〜2に示されたァガロースゲルにおいて、レーン 1〜4はそれぞれテンプレート 12G、 12C、 12R、 12Sを用いた場合の反応液がアプライされている。また、図 4— 1、 2は、それぞれ Au f RNa s eH I M j a RNa s e H I Iを使用した反応の結果を示す。図 4に示されるように、 Au f RNa s e H I I , M j a RNa s eH I Iを用いた場合には、いずれもテンプレート 12 Gを使用した場合のみ、すなわち標的核酸がコドン 12に G 1 yをコードしている場合のみに増幅産物が観察されており、これらの RNa s eHによって標的核酸上の塩基置換の判別が可能であることが示された。

実施例 5 変性操作の必要な DN A増幅反応系（PCR) を用いた SNPの検出

変性操作の必要な DNA増幅反応系における本発明の方法について検討した。まず、ヒト c一 K i— r a s ェクソン 1の塩基配列に従って、上記テンプレート 12 Gを特異的に検出するためのセンス側ヌクレオチドとして配列表の配列番号 25記載のキメラオリゴヌクレオチドを合成した。該ヌクレオチドは、 3，末 ' 端のヌクレオチドのリボース部分の 3位の水酸基がァミノへキシル化されたヌクレオチドである。また、同様にアンチセンスプライマーとして配列番号 18の塩基配列を有するプライマーを合成した。上記各 50 pmo 1の上記合成ヌクレオチド及ぴプライマー（センス方向ヌクレオチドとアンチセンス方向プライマー）と 2. 5 μ 1の Ex T a qバッファー（宝酒造ネ環）、 2μ 1の 2. 5 mM dNTP混合液、 5011の £ 11 RNa s eHI I、 0. 625Uの Ex T a q DNAポリメラーゼ（宝酒造社製）を含む全量 24 μ 1の反応液を調製した。この反応液に、実施例 1で調製したテンプレート 12G、 12C、 12R、 12Sの l On gZ z 1溶液をそれぞれ 1 1添カ卩し、サーマノレサィクラ一（宝酒造社製）を用い、 94°C 5秒、 59°C 2分、 72°C 5秒の PCR反応を 25、 30サイクル行った。反応終了後、得られた各反応液 1 μ 1をアジレント 2100バイオアナライザ（ヒユーレツトパッカード社製）で分析した。その結果を図 5に示す。図 5は、各テンプレートにおける目的の増幅産物量を示すダラフであり、縦軸は目的の増幅産物量、横軸は PC Rのサイクル数を示す。図 5に示した用に、検出に用いたプライマーと a 1 1 e 1 eの一致するテンプレート 1 2 Gを用いた場合にのみ特異的に目的の DNAの増幅が確認された。すなわち、本発明の方法が、鎳型となる核酸の変性操作が必要な DNA増幅反応系においても有効であることが確認できた。

実施例 6 K_ r a sコドン 61のァレル特異的な検出

別の塩基置換の検出の場合について検討した。すなわち、ヒト c— K i一 r a s ェクソン 2のコドン 61にそれぞれ CAA (G 1 u) 、 AAA (Ly s) 、 GAA (G i n) の配列を有した DNA断片を、配列表の配列番号 19、 20に記載の DNAプライマーを用いて PCRで増幅し、 pT7— B 1 ueベクターにクローニングした。これらの DNA断片がクローニングされたベクターのそれぞれを常法で精製し、それぞれ 61 Q、 61 K、 61 Εとした。次に実施例 1— (2) の結果を基に、ヒト c— K i一 r a s ェクソン 2の塩基配列に基いて 6 1Q、 61K、 61 Εの各ベクターを特異的に検出するヌクレオチドとして、それぞれ配列表の配列番号 21、 22、 23記載のキメラオリゴヌクレオチドを合成した。これらはいずれも 3，末端のヌクレオチドのリボース部分の 3位の水酸基がァミノへキシルイ匕されたヌクレオチドである。これらのヌクレオチドをセンスプライマーとして、配列表の配列番号 24記載のプライマーをアンチセンスプライマーとして用いて以下の反応を行った。上記各 50 pmo 1の合成オリゴヌクレオチドプライマ一（センス方向とアンチセンス方向プライマ^") と Ι μ ΐの 0. 05 %プロピレンジァミン水溶液、 61 Q、 61 K、 61 Εの各テンプレート DNA 10 p gを含む全量 5 μ 1の反応液をサーマルイクラーパーソナル (宝酒造社製）で 98°Cで 2分間の後、 53°Cの加熱処理により铸型にプライマ一を了ニーリングさせた。上記熱処理をした各溶液に 0. 625 mM dNTP 混合液、 4 OmM He p e s— KOH緩衝溶液 (pH7. 8) 、 125mM 酢酸カリウム、 5mM 酢酸マグネシウム、 ◦. 0125%ゥシ血清ァノレブミン、

1. 25%ジメチルスルホキシド、 1111の £ \1 RNa s eHI I (宝酒造社製）及び、 5. 5Uの B e a B e s t DNAポリメラーゼ（宝酒造社製）及ぴ滅菌水を含む全液量 20 I 1を添加し、最終容量を 25 1とした。該反応液は 58°C、 1時間保持した。反応終了後、該反応液 5 μ 1を 3. 0%ァガロースゲル電気泳動に供した。その結果を図 6に示す。すなわち、図 6 Αは、配列番号 21記載の 61 Q検出用プライマーを用いた場合の検出結果を示す電気泳動バターンであり、レーン 1はテンプレート 61 Q、レーン 2はテンプレート 61 K：、レーン 3はテンプレート 61 Eをそれぞれ踌型に用いた場合を示す。また、図 6 Bは、配列番号 22記載の 61K検出用プライマーを用いた場合の検出結果を示す電気泳動パターンであり、レーン 1はテンプレート 61 Q、レーン 2はテンプレート 61K、レーン 3はテンプレート 61 Εをそれぞれ用いた場合を示す。さらに、図 6Cは、配列番号 23記載の 61 Ε検出用プライマーを用いた場合の検出結果を示す電気泳動パターンであり、レーン 1はテンプレート 61 Q、レーン 2はテンプレート 61K、レーン 3はテンプレート 61Eをそれぞれ用いた場合を示す。

図 6 Α、 Β、 Cに示したように配列表の配列番号 21, 22， 23を用レヽた場合に各 a 1 1 e 1 e特異的に I CAN反応によって目的の DNA増幅産物が得られる事を確認した。すなわち、塩基置換の対象が変わっても本発明の方法が有効であることを確認した。

実施例 7 CYP2C19 (636) のァレル特異的な検出

(1) 遺伝子的にホモ型あるいはヘテロ型であるかの検出方法について検討した。対象として、ヒト CYP 2C 19の 636番目の塩基の a 1 1 e 1 eを選択した。まず、ヒト CYP 2 C 19の 636番目の塩基が Gあるいは Aである DN A断片を、配列表の配列番号 26、 27に記載の DNAプライマーを用いた PC R反応で増幅し、 p T 7— B 1 u eベクターにクローニングした。これら DNA 断片がクローユングされたプラスミドをそれぞれ常法で精製し、それぞれプラスミド 6 3 6 G、 6 3 6Aとした。

上記プラスミド 6 3 6 G、 6 3 6 Aならびにプラスミド6 3 60と 6 3 6八を 1 ： 1に混合したプラスミド 6 3 6 G/Aを铸型として用いた。すなわち、ブラスミド 6 3 6 Gならびにプラスミド 6 3 6 Aは遺伝子的にホモ型、プラスミド 6 3 6 G/Aが遺伝子的にヘテロ型のモデである。次に、上記 6 3 6 Gならびに 6 36 Αを特異的に検出するヌクレオチドとして、それぞれ配列表の配列番号 2 8、 2 9記載のヌクレオチドを合成した。これらのヌクレオチドをセンスプライマー、配列表の配列番号 30記載のプライマーをアンチセンスプライマーとして用レ、、以下の反応を行った。上記各 5 0 p m o 1の合成オリゴヌクレオチドプライマ一（センス方向とアンチセンス方向プライマー）と 1 1の 0. 05%プロピレンジァミン水溶液、プラスミド 6 3 6 G、 6 3 6 Aならびに 6 3 6 G/Aの各テンプレート DNA 1 g含む全量 5 μ 1の反応液をサーマルサイクラーパ一ソナル（宝酒造社製）で 9 8°Cで 2分間の後、 5 3 °Cの加熱処理により铸型にプライマーをアニーリングさせた。上記熱処理をした各溶液に 0 , 6 25mM dNTP混合液、 4 OmM H e p e s— KOH緩衝溶液（p H 7. 8) 、 1 2 5mM 酢酸カリウム、 5mM 酢酸マグネシウム、 0. 0 1 25%ゥシ血清ァルブミン、 1. 2 5%ジメチルスルホキシド、 1 111の八£ 11 RN a s e H I 1 , 5. 5 Uの B c a B e s t DNAポリメラーゼおよび滅菌水を含む全液量

20 μ Iを添加し、最終容量を 2 5 μ 1 とした。該反応液は、 5 3°C、 1時間保持した。反応終了後、該反応液 5 μ 1を 3. 0%ァガロースゲル電気泳動に供した。その結果を図 7 Α及び 7 Βに示す。すなわち、図 7 Aは、ヌクレオチド 6 3 6 Gを用いた場合の検出結果を示す電気泳動パターンであり、レ^ "ン 1はテンプレートがプラスミド 6 3 6 Gの場合、レーン 2はプラスミド 6 3 6 Aの場合、レーン 3はプラスミド 6 36 G/Aを用いた場合を示す。

また、図 7 Bは、ヌクレオチド 6 3 6 Aを用いた場合の検出結果を示す電気泳動パターンであり、レーン 1はテンプレートがプラスミド 6 3 6 Gの場合、レーン 2はプラスミド 6 3 6 Aの場合、レーン 3はプラスミド 6 3 6 G/Aを用いた場合を示す。図 7 A及び 7 Bに示したように、いずれのヌクレオチドを用いた場合でも a 1 1 e 1 e特異的な検出が行えることが確認できた。

(2) ヒトゲノム DNAをテンプレートに用いた場合について、 PCR— RF LP法と解析の比較を行った。まず、ヒトゲノム DNA (クローンテック社製）を 150 n gを鎳型として上記（1) と同様の方法で SNPタイピングを行った。その結果を図 7Cに示す。すなわち、図 7Cは、ヒトゲノム DNAの SNPタイビングした結果を示す電気泳動パターンであり、レーン 1はヌクレオチド 636 Gを用いた場合、レーン 2はヌクレオチド 636 Aを用いた場合である。

図 7 Cに示したようにヌクレオチド 636 Gを用いた場合にのみ目的の増幅 D NAが検出され、このゲノム DNAの CYP 2 C 19 636塩基目の& 1 1 6

1 eは、（636 G/G) のホモ型であると判断された。

一方、上記ヒトゲノム DNAを用いて PCR— RFLP法によるタイピングを行った。まず、ゲノム DNA 150n gを用いて、配列表の配列番号 26およぴ 27のプライマーを用いて PCR反応を行った。得られた PCR増幅産物を^ am lで処理した後、該反応液を 3. 0 %ァガロースゲル電気泳動に供した。その結果を図 7Dに示す。すなわち、図 7Dは、ヒトゲノム DNAを錶型とし P CR— RFLP法によりタイビングを行った結果を示す電気泳動パターンであり、レーン 1は PC R増幅産物、レーン 2は該 PC R増幅産物を B amH Iで処理した場合である。

図 7 Dに示したように、 PCR増幅産物が^ a H Iにより完全消化されたことから、 PCR—RF LP法においてもこのゲノム DNAの CYP 2 C 19 6 36塩基目の a 1 1 e 1 eは（636 G/G) のホモ型であると判断された。

また、本発明の塩基置換の検出方法と従来の PCR— RFLP法による SNPタィビングの結果が一致することが確認できた。

(3) 上記（1) で調製したプラスミド 636 G、 636 A、 636G/Aを用いて相同染色体上のジエノタイプを想定した検出方法を検討した。反応は、以下のようにして行った。まず、ヌクレオチド 636 Gならびにヌクレオチド 63 6 Aの 5，末端にお互いに識別可能な蛍光標識 R o X (AB I社製）、 F a m (AB I社製）をそれぞれ結合させたものを合成した。当該蛍光標識ヌクレオチドは等量づっ混合して用いた。検出方法は、上記 (1) と同様の方法で行った。反応終了後、該反応液の一部を 3. 0%ァガロースゲル電気泳動に供し、増幅産物と未反応の蛍光標識ヌクレオチドが十分に分離するまで泳動を行った。電気泳動後のァガロースゲルを FM— B I O I I Mu l t i— V i ew (宝酒造社製）にて解析した。その結果、鍚型がプラスミド 636 Gの場合は蛍光標識 R o Xの蛍光シグナルのみが確認できた。また、鎳型がプラスミド 636 Aの場合は蛍光標識 F a mの蛍光シグナルのみが確認できた。さらに、鎳型がプラスミド 636 G/Aの場合は R o X及び F a mの両方の蛍光シグナルが確認できた。以上のことから、本発明の方法が相同染色体上のジエノタイプ（ホモ型あるいはへテロ型）を解析できる方法として有用であることを確認した。

実施例 8 全血から抽出したゲノム DNAを用いたタイピング

インフォームドコンセントの得られた健常人全血 20 1 (サンプル番号 1 〜6) より Ge nとるくん ^ΤΜ (宝酒造ネ： ) を用いて、ゲノム DNAを調製した。調製したゲノム DNA160 n gを铸型として、 636 G、 636Aの各 a 1 1 e 1 eを特異的に検出するプライマーとして、それぞれ配列番号 28、 29 記載のヌクレオチドを用い、実施例 7— (1) と同様の方法で SNPタイピングを行った。その結果を図 8 A〜Fに示す。すなわち図 8の A〜Fは、それぞれ血液サンプル 1〜 6から抽出したゲノム DNAを錶型とし実施例 7— (1) の方法でタイピングした結果を示す電気泳動パターンであり、各図のレーン 1は配列番号 28 (636G検出用）、レーン 2は配列番号 29 (636A検出用）をそれぞれヌクレオチドとして用いた場合である。図 8の A〜Fに示した増幅産物のパターンから、各血液サンプルの CYP 2 C 19 636塩基目の a 1 1 e 1 eは (サンプノレ 1 ： G/A、 2 ： G/G、 3 ： G/A、 4 ： G/G、 5 ： G/G、 6 ： G/G) とタイピングされた。一方、同じゲノム DNAを鎳型に、実施例 7 - (2) と同様の方法で PCR— RF LP法によりタイピングを行った。その結果を図 7 Gに示す。すなわち図 7 Gは血液サンプ〜 6から調製したゲノム D Ν Αを錶型とし、 P C R— R F L Ρ法によりタイピングを行った結果を示す電気泳動パターンであり、レーン 1〜 6はそれぞれ血液サンプノレ 1〜 6から抽出したゲノム DNAを鎵型とした場合である。図 8 Gに示す電気泳動結果から、これら各血液サンプルから調製した D NAを铸型とした P C R増幅産物の切断パターンより C Y P 2 C 1 9 6 3 6塩基目の a 1 1 e 1 eは（サンプル 1 ： G/A, 2 ： G/G、 3 ： GZA、 4 ： G/G、 5 ： G/G、 6 ： G/G) とタイピングされ、前記の結果と一致した。

以上のことから、本発明の方法が実際の臨床検体を用いた場合においても有効であることを確認した。産業上の利用の可能性

上記の、本発明のヌクレオチド、ならびに該ヌクレオチドを使用する塩基置換の検出方法は、天然に存在する、あるいは人為的に導入された塩基置換の検出に有用である。

本発明によれば、標的核酸上の塩基置換の有無を簡便、力つ再現性よく検出することができる。本発明の方法は公知の核酸増幅方法と容易に組み合せることができ、高感度に塩基置換を検出することが可能である。さらに、適切な配列のヌクレオチドを組み合わせて使用することにより、塩基置換の有無と同時にどのような塩基への置換が起こつているかを知ることもできる。

本発明は、多型やバリエーションのような生物のゲノム D N A上に生じた塩基置換、例えば S N Pの検出、同定に使用することができ、ヒトにおける疾患遺伝子の検索、薬剤感受性の解析など、ゲノム創薬、ゲノム医療の分野においても有用である。配列表フリーテキスト

SEQ ID NO: 1： a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Pyrococcus horikoshii

SEQ ID NO: 2 : PCR primer 1650Nde for cloning a gene encoding a

polypeptide having a RNaseHII activity from Pyrococcus furiosus

SEQ ID NO: 3 : PCR primer 1650Bam for cloning a gene encoding a

polypeptide having a RNaseHII activity from Pyrococcus furiosus

SEQ ID NO: 6 : Chimeric oligonucleotide primer to amplify the DNA of a portion of human c-Ki-ras gene, "nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides"

SEQ ID NO: 7 : Chimeric oligonucleotide to detect the nucleotide

substitution on human c-Ki-ras gene, "nucleotides 13 to 15 are

ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides and the 3 OH group of the nucleotide at 3' end is protected with amino hexyl group" SEQ ID NO: 8 : Chimeric oligonucleotide primer precursor to detect the nucleotide substitution on human c-Ki-ras gene, "nucleotides 12 to 15 are ribonucleotides, nucleotide 17 is inosine— other nucleotides are deoxyribonucleotides and the 3 OH group of the nucleotide at 3' ena is protected with amino hexyl group"

SEQ ID N0:9 : Chimeric oligonucleotide to detect the nucleotide

substitution on human c-Ki-ras gene, "nucleotides 14 and 15 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides and the 3' -OH group of the nucleotide at 3' end is protected with amino hexyl group"

SEQ ID NO: 10 : Chimeric oligonucleotide to detect the nucleotide substitution on human c-Ki-ras gene, "nucleotides 13 to 15 are

ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides and the 3' -OH group of the nucleotide at 3' end is protected with amino hexyl group" SEQ ID NO: 11 : Chimeric oligonucleotide to detect the nucleotide substitution on human c-Ki-ras gene, "nucleotides 13 to 15 are

ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides and the 3' -OH group of the nucleotide at 3' end is protected with amino hexyl group" SEQ ID NO: 12 : Chimeric oligonucleotide to detect the nucleotide substitution on human c-Ki-ras gene, "nucleotides 13 to 15 are

ribonucleotides, nucleotide 17 is inosine - other nucleotides are deoxyribonucleotides and the 3' -OH group of the nucleotide at 3， end is protected with amino hexyl group"

SEQ ID NO: 13 : Nucleotide sequence of AF0621 gene from Archaeoglobus fulgidus.

SEQ ID NO: 14: PCR primer AfuNde for cloning a gene encoding a

polypeptide having a RNaseHII activity from Archaeoglobus fulgidus.

SEQ ID NO: 15 : PCR primer AfuBam for cloning a gene encoding a

polypeptide having a RNaseHII activity from Archaeoglobus fulgidus.

SEQ ID NO: 16: Nucleotide sequence of ORF in RnaseHII from Archaeoglobus fulgidus.

SEQ ID NO: 17 : Amino acid sequence of RNaseHII from Archaeoglobus fulgidus.

SEQ ID NO: 18 : Designed PCR primer to amplify a portion of c-ki-ras oncogene exon 1

SEQ ID NO: 19 Designed PCR primer to amplify a portion of human c- ki- ras oncogene exon 2

SEQ ID NO: 20 : Designed PCR primer to amplify a portion of human c-ki-ras oncogene exon 2

SEQ ID NO : 21 : Chimeric oligonucleotide to detect the nucleotide substitution on human c-Ki- ras gene, "nucleotides 13 to 15 are

ribonucleotides - other nucleotides are deoxyribonucleotides and the 3' -OH group of the nucleotide at 3' end is protected with amino hexyl group" SEQ ID NO : 22 : Chimeric oligonucleotide to detect the nucleotide substitution on human c-Ki- ras gene, "nucleotides 13 to 15 are

ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides and the 3' -OH group of the nucleotide at 3' end is protected with amino hexyl group" SEQ ID NO : 23 : Chimeric oligonucleotide to detect the nucleotide substitution on human c-Ki- ras gene, "nucleotides 13 to 15 are

ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides and the 3' -OH group of the nucleotide at 3' end is protected with amino . hexyl group" SEQ ID NO: 24: Chimeric oligonucleotide to detect the nucleotide substitution on human c—Ki— ras gene, "nucleotides 17 to 19 are o oyoxrlb nuc etre aeoncc

Claims

請求の範囲

1 . 標的核酸上の特定の塩基における塩基置換の有無を検出する方法であって、

B ) 標的核酸上の前記特定の塩基を含有する領域にァニーリングしうる塩基配列を有しており、

C ) 当該ヌクレオチドと標的核酸とから形成される複合体において、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在する場合にはヌクレオチドはヌクレアーゼによる切断を受けず、かつ、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在しなレヽ場合にはヌクレオチドがヌクレアーゼにより切断されて新たな 3，末端を生じるような配列を含有しており、

( 3 ) ヌクレアーゼによるヌクレオチドの切断の有無を検出する工程、

を包含することを特徴とする塩基置換の検出方法。

2 . ヌクレアーゼとしてリボヌクレアーゼ H、ヌクレオチドとして特定の塩基に対応する塩基を含有する領域にリボヌクレオチドを含有するヌクレオチドを使用する請求項 1記載の塩基置換の検出方法。

3 . ヌクレアーゼとして制限酵素、ヌクレオチドとして特定の塩基に対応する塩基を含有する領域に制限酵素の認識配列を含有するヌクレオチドを使用する請求項 1記載の塩基置換の検出方法。

4 . 標的核酸上の特定の塩基における塩基置換の有無を検出する方法であって、 ( 1 ) 標的核酸を含有する試料とヌクレオチドとを混合する工程：ここで当該ヌクレオチドは、

C) 当該ヌクレオチドと標的核酸とから形成される複合体において、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマツチが存在しない場合にはヌクレオチドはヌクレアーゼによる切断を受けず、かつ、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマツチが存在する場合にはヌクレオチドがヌクレアーゼにより切断されて新たな 3 ' 末端を生じるような配列を含有しており、

( 3 ) ヌクレアーゼによるヌクレオチドの切断の有無を検出する工程、を包含することを特徴とする塩基置換の検出方法。

5 . ヌクレアーゼとしてミスマッチ特異的ヌクレアーゼが使用される請求項 4 記載の塩基置換の検出方法。

6 . 標的核酸に塩基置換が存在しない場合に、標的核酸と形成される複合体にミスマツチを生じないような配列を有するヌクレオチドが使用される請求項 1または 4記載の塩基置換の検出方法。

7. 標的核酸に塩基置換が存在する場合に、標的核酸と形成される複合体にミスマッチを生じないような配列を有するヌクレオチドが使用される請求項 1または 4記載の塩基置換の検出方法。

8 . D NAポリメラーゼの作用によって生成する伸長産物の有無によってヌクレオチドの切断が検出される請求項 1または 4記載の塩基置換の検出方法。

9 . ヌクレアーゼの作用によって生成する遊離したヌクレオチドの 3 ' 側断片の有無によってヌクレオチドの切断が検出される請求項 1または 4記載の塩基置換の検出方法。

1 0 . ヌクレオチドに標識化合物が付加されており、該標識を用いてヌクレオチドの切断が検出される請求項 1または 4記載の塩基置換の検出方法。

1 1 . 標識化合物が、ヌクレオチドのヌクレアーゼによる切断箇所の 3，側部分に付加されていることを特徴とする請求項 1 0記載の塩基置換の検出方法。

1 2. 標識化合物が、ヌクレオチドのヌクレアーゼによる切断箇所の 5，側部分に付加されていることを特徴とする請求項 1 0記載の塩基置換の検出方法。

1 3 . ヌクレオチドに標識化合物として蛍光物質が付加されている請求項 1 0 記載の塩基置換の検出方法。

1 4 . さらに、蛍光を消光しうる物質がヌクレオチドに付加されており、ヌクレアーゼによる切断に伴って蛍光が発生する請求項 1 3記載の塩基置換の検出方法。

1 5 . 蛍光偏光法によってヌクレオチドの切断を検出することを特徴とする請求項 1 3記載の塩基置換の検出方法。

1 6 . ヌクレオチドの 3 ' 末端の修飾が、リボースの 3位の水酸基の修飾である請求項 1または 4記載の塩基置換の検出方法。

1 7 . ヌクレオチドが、ヌクレオチドアナログ及ぴ Z又は修飾ヌクレオチドを含有することを特徴とする請求項 1または 4記載の塩基置換の検出方法。

1 8 . ヌクレオチドアナログが、デォキシリポイノシンヌクレオチドあるいはデォキシリボウラシヌクレオチドであり、修飾リボヌクレオチドが（一 S ) リボヌクレオチドである請求項 1 7記載の核酸の増幅方法。

1 9 . D NAポリメラーゼの作用によって生成する伸長産物を鎳型とした核酸増幅の工程をさらに包含する請求項 1または 4記載の塩基置換の検出方法。

2 0 . 請求項 1 9 ff己載の塩基置換の検出方法を用いた対立遺伝子の遺伝子型を解析する方法。

2 1 . 標的核酸上の特定の塩基における塩基置換の検出に使用されるヌクレオチドであって、

A) その 3 ' 末端が当該末端からの D N Aポリメラーゼによる伸長が起こらないように修飾されており、

C) 当該ヌクレオチドと標的核酸とから形成される複合体において、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマツチが存在する場合にはヌクレオチドはヌクレアーゼによる切断を受けず、かつ、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在しない場合にはヌクレオチドがヌクレアーゼにより切断されて新たな 3 ' 末端を生じるような配列を含有する、

ことを特徴とするヌクレオチド。

2 2 . 特定の塩基に対応する塩基を含有する領域にリボヌクレオチドを含有する請求項 2 1記載のヌクレオチドであって、当該ヌクレオチドと標的核酸とから形成される複合体において、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在しない場合にはリボヌクレアーゼ Hによって切断されることを特@ [とするヌクレオチド。

2 3 . 特定の塩基に対応する塩基を含有する領域に制限酵素の認識配列を含有する請求項 2 1記載のヌクレオチドであって、当該ヌクレオチドと標的核酸とから形成される複合体において、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在しなレ、場合には制限酵素によって切断されることを特徴とするヌクレオチド。

2 4 . 標的核酸上の特定の塩基における塩基置換の検出に使用されるヌクレオチドであって、

C) 当該ヌクレオチドと標的核酸とから形成される複合体において、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在しない場合にはヌクレオチドはヌクレアーゼによる切断を受けず、かつ、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在する場合にはヌクレオチドがヌクレアーゼにより切断されて新たな 3 ' 末端を生じるような配列を含有する、

ことを特徴とするヌクレオチド。

2 5 . 標的核酸と形成される複合体において標的核酸との間にミスマッチが存在する場合にミスマッチ特異的ヌクレアーゼにより切断される請求項 2 4記載のヌクレオチド。

2 6 . 標的核酸に塩基置換が存在しない場合に、標的核酸と形成される複合体にミスマッチを生じないような配列を有する請求項 2 1または 2 4記載のヌクレォチド。

2 7 . 標的核酸に塩基置換が存在する場合に、標的核酸と形成される複合体にミスマッチを生じないような配列を有する請求項 2 1または 2 4記載のヌクレオチド。

2 8 . 標識ィヒ合物が付カ卩されている請求項 2 1または 2 4記載のヌクレオチド。

2 9 . 標識化合物が、ヌクレアーゼによる切断箇所の 3，側部分に付加されていることを特徴とする請求項 2 8記載のヌクレオチド。

3 0. 標識化合物が、ヌクレアーゼによる切断箇所の 5，側部分に付加されていることを特徴とする請求項 2 8記載のヌクレオチド。

3 1 . 標識化合物として蛍光物質が付加されている請求項 2 8記載のヌクレオチド。

3 2. さらに、蛍光を消光しうる物質が付加されており、ヌクレアーゼによる切断、もしくはそれに続く D NAの伸長によって蛍光を発する請求項 3 1記載のヌクレオチド。

3 3 . 3，末端の修飾が、リボースの 3位の水酸基の修飾である請求項 2 1または 2 4記載のヌクレオチド。

3 4 . ヌクレオチドが、ヌクレオチドアナ口グ及び/又は修飾ヌクレオチドを含有することを特徴とする請求項請求項 2 1または 2 4記載のヌクレオチド。

3 5 . ヌクレオチドアナログが、デォキシリボイノシンヌクレオチドあるいはデォキシリポゥラシルヌクレオチドであり、修飾リボヌクレオチドが（ α— S ) リポヌクレオチドである請求項 3 4記載のヌクレオチド。

3 6 . 標的核酸上の塩基置換の検出に使用されるキットであって、請求項 2 1 または 2 4記載のヌクレオチドを含有することを特徴とするキット。

3 7 . ヌクレアーゼおよび Ζまたは DNAポリメラーゼを含有することを特徴とする請求項 3 6記載のキット。

38. DN A伸長の有無を検出するための試薬をさらに含有する請求項 36記載のキット。 .

39. 核酸増幅法を実施するための試薬をさらに含有する請求項 36記載のキッ卜。