EA005141B1

EA005141B1 - Способ детекции нуклеотидного полиморфизма

Info

Publication number: EA005141B1
Application number: EA200300880A
Authority: EA
Inventors: Хироаки Сагава; Еидзи Кобаяси; Икуносин Като
Original assignee: Такара Био Инк.
Priority date: 2001-02-15
Filing date: 2002-02-14
Publication date: 2004-12-30
Also published as: EP1367136A1; KR20030074797A; US20040137451A1; AU2002232177B2; JPWO2002064833A1; WO2002064833A1; JP2004298200A; CA2438574A1; EP1367136A4; CA2438574C; EA200300880A1; JP2005245465A; JP3681729B2; CN1524127A; KR100809949B1; CN100351393C; US7135291B2

Abstract

Описывается нуклеотид, полезный для детекции замены основания в гене, способ детекции замены основания в гене с использованием указанного нуклеотида и набор для указанного способа.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к нуклеотиду (олигонуклеотиду, используемому в способе настоящего изобретения), полезному для детекции замены основания в гене, способу детекции замены основания в гене с использованием указанного нуклеотида и набору для такого способа.

Уровень техники

Известно, что генетические коды, содержащиеся в геномах организмов индивидуумов, принадлежащих к одному и тому же виду, не идентичны друг другу, и существуют различия в последовательностях оснований, называемые полиморфизмами. Различия, когда от одного до десяти оснований делегируются или встраиваются, различия, когда специфическая последовательность оснований дуплицируется, и т.п., известны как полиморфизмы. Когда различие состоит в замене одного основания другим основанием, его называют однонуклеотидным полиморфизмом (8ΝΡ).

Полагают, что однонуклеотидные полиморфизмы существуют на уровне примерно от одного на сотни до одного на миллионы оснований. Соответственно оценивают, что число 8ΝΡ, присутствующих в геноме человека, составляет от трех до десяти миллионов. 8ΝΡ уделяют внимание как показателям для исследования генов, связанных с заболеваниями, или для получения информации о различиях в восприимчивости к заболеваниям и чувствительности к лекарственным средствам (действиям или побочным действиям). Способы детекции 8ΝΡ исследуются.

Обычные способы детекции 8ΝΡ подразделяют на способы на основе гибридизации, способы на основе наращивания с праймеров и способы с использованием ферментов, специфичных в отношении субстратов.

Наличие замены основания в способе на основе гибридизации определяют путем гибридизации зонда с образцом нуклеиновой кислоты. Согласно такому способу необходимо определить зонд и условия гибридизации таким образом, чтобы на гибридизацию влияло различие в одном основании. Поэтому затруднительно создать высоковоспроизводимую систему детекции.

Примером является способ детекции мутации с использованием циклической реакции с зондом, описанной в патенте США № 5660988. В указанном способе полинуклеотидный зонд с легко расщепляемой связью гибридизируют с молекулой нуклеиновой кислоты, представляющей интерес. Если молекула нуклеиновой кислоты, представляющая интерес, не содержит замены основания, зонд расщепляется, в то время как если молекула нуклеиновой кислоты содержит замену основания, зонд не расщепляется. Затем замену основания определяют, детек тируя и количественно определяя степень образования фрагмента, выделенного из расщепленного зонда. Однако если согласно такому способу детектируется следовое количество целевой нуклеиновой кислоты, может произойти значительная задержка по времени до достижения уровня, при котором можно обнаружить продукт расщепления зонда, поскольку количество продукта расщепления мало.

Способ детекции мутации с использованием способа Тас.|Мап. описанного в патентах США №№ 5210015 и 5487972, является примером другого способа. В данном способе используют зонд ТацМап, к которому присоединяют флуоресцентный краситель и тушитель. Два зонда (один, содержащий замену основания, и другой, не содержащий замены основания) используют в качестве зондов Тас.|Мап. Зонд гибридизируют с молекулой нуклеиновой кислоты, представляющей интерес, и с предшествующего участка наращивают праймер. Зонд расщепляется из-за 5'^3'-эндонуклеазной активности ДНКполимеразы только в том случае, если молекула нуклеиновой кислоты, представляющая интерес, не содержит замены основания. Затем определяют замену основания путем детекции испускаемого излучения. Однако способ имеет проблемы, поскольку для него требуется полимераза, обладающая 5'^3'-эндонуклеазной активностью, ПЦР с использованием меченного нуклеотида, блокированного по 3'-концу, и точное регулирование температуры, и способ требует длительного времени для детекции.

Способы, в которых используют фермент, включают способы, в которых используют ДНК-полимеразу. Такие способы также подразделяют на три следующие группы: (1) способы, в которых замену основания определяют на основании наличия реакции наращивания с праймера с использованием праймера, 3'-конец которого отжигается к части оснований, для которой необходимо детектировать замену основания, как описывается в патенте США № 5137806; (2) способы, в которых замену основания определяют на основании наличия реакции наращивания с праймера с использованием праймера, в котором сайт замены основания, который следует обнаружить, располагается во втором нуклеотиде от 3'-конца, как описывается в №О 01/42498; и (3) способ, в котором наличие мутации в месте, представляющем интерес, и основание в указанном месте определяют, узнавая основание, введенное в праймер, с использованием праймера, в котором 3'-конец отжигается к основанию, 3'-соседнему с основанием, для которого следует обнаружить замену основания.

Известны способы, в которых используют ДНК-лигазу. Согласно такому методу замену основания определяют на основании наличия лигирования зонда с соседним зондом. Концевая часть зонда соответствует части оснований, для которой следует обнаружить замену основания.

Способ, в котором используют ДНКполимеразу или ДНК-лигазу, не позволяет точно детектировать ошибочное спаривание между праймером (или зондом) и целевой нуклеиновой кислотой из-за замены основания. Конкретно, такой фермент может инициировать ферментативную реакцию даже в том случае, если праймер или зонд содержит ошибочное спаривание, что приводит к ошибочным результатам.

В силу возможного ложного положительного ответа из-за ошибочного отжига между нуклеиновой кислотой и праймером или ошибки, совершенной используемой лигазой или полимеразой, необходимо регулировать условия реакции (в частности, температуру реакции) и т.п. весьма точно, и существует проблема, касающаяся воспроизводимости.

Наконец, существуют способы, в которых используют фермент, обладающий активностью узнавания и расщепления специфической структуры в двухцепочечной нуклеиновой кислоте, такой как инвадерный (шуайег) способ, описанный в патенте США № 5846717. В качестве такого фермента известна кливаза. Замену основания можно определить, проверяя расщепление зонда. Зонд создают таким, что он образует структуру, узнаваемую ферментом, если замена основания имеется (или отсутствует). Однако такой способ, в котором используют активность узнавания и расщепления специфической структуры в двухцепочечной нуклеиновой кислоте, имеет проблему, касающуюся его чувствительности. Конкретно, сигнал, достаточный для детекции замены основания, нельзя получить от следового количества образца нуклеиновой кислоты, так как, согласно способу, от одной молекулы нуклеиновой кислоты генерируется один сигнал. Естественно, можно усилить сигнал, повторяя реакцию расщепления зонда, хотя целевую нуклеиновую кислоту необходимо амплифицировать заранее для того, чтобы получить интенсивный сигнал. Таким образом, если следует детектировать следовое количество нуклеиновой кислоты согласно указанному способу, может произойти существенная задержка по времени до достижения уровня, при котором можно детектировать продукт расщепления зонда, поскольку количество продукта расщепления мало.

Так как известные способы связаны с проблемами, описанными выше, требуется способ, который можно использовать для точной детекции замены основания.

Цели изобретения

Основной целью настоящего изобретения является решение вышеуказанных проблем и создание средства для точной детекции замены основания (например, 8ΝΡ) с превосходной воспроизводимостью даже в том случае, если используют следовое количество образца нуклеиновой кислоты.

Сущность изобретения

Для того чтобы разрешить описанные выше проблемы, нужен способ, который можно использовать для точной детекции замены основания и получить результаты в виде интенсивных сигналов.

Авторы настоящего изобретения получили нуклеотид. Нуклеотид способен отжигаться к целевой молекуле нуклеиновой кислоты, для которой необходимо определить замену основания. Реакция наращивания ДНК с ее З'-конца не инициируется ДНК-полимеразой, если нуклеотид находится в интактном состоянии. На расщепление нуклеотида нуклеазой влияет последовательность оснований отожженной матричной цепи. Кроме того, авторы настоящего изобретения создали способ с использованием указанного нуклеотида, который можно использовать для точной детекции замены основания в целевой нуклеиновой кислоте с высокой чувствительностью. Таким образом было осуществлено настоящее изобретение.

Настоящее изобретение в общих чертах описывается далее. Первый аспект настоящего изобретения относится к способу детекции наличия замены основания по специфическому основанию в целевой нуклеиновой кислоте, причем способ включает (1) смешивание образца, содержащего целевую нуклеиновую кислоту, с нуклеотидом, где нуклеотид (A) модифицирован по 3'-концу так, что наращивания с указанного конца с помощью ДНК-полимеразы не происходит;

(B) имеет последовательность оснований, способную отжигаться к участку, содержащему специфическое основание в целевой нуклеиновой кислоте; и (C) содержит последовательность, в которой, если имеется ошибочное спаривание между специфическим основанием и основанием, соответствующим специфическому основанию в нуклеотиде, в комплексе, состоящем из нуклеотида и целевой нуклеиновой кислоты, нуклеотид не расщепляется нуклеазой, а если ошибочного спаривания между специфическим основанием и основанием, соответствующим специфическому основанию в нуклеотиде, не имеется, нуклеотид расщепляется нуклеазой с образованием нового З'-конца;

(2) обработку смеси нуклеазой и ДНКполимеразой и (3) детекцию наличия расщепления нуклеотида нуклеазой.

Примерами способа детекции замены основания по первому аспекту являются следующие способы: способ, где нуклеаза представляет собой рибонуклеазу Н, и нуклеотид содержит рибонуклеотид в участке, содержащем основание, соответствующее специфическому основа нию; и способ, где нуклеаза представляет собой рестриктазу, и нуклеотид содержит узнаваемую последовательность для рестриктазы в участке, содержащем основание, соответствующее специфическому основанию.

Второй аспект изобретения относится к способу детекции замены основания в целевой нуклеиновой кислоте, включающему (1) смешивание образца, содержащего целевую нуклеиновую кислоту, с нуклеотидом, где нуклеотид (A) модифицирован по 3'-концу так, что наращивания с указанного конца с помощью ДНК-полимеразы не происходит;

(B) имеет последовательность оснований, способную отжигаться к участку, содержащему специфическое основание в целевой нуклеиновой кислоте; и (C) содержит последовательность, в которой, если ошибочного спаривания между специфическим основанием и основанием, соответствующим специфическому основанию в нуклеотиде, в комплексе, состоящем из нуклеотида и целевой нуклеиновой кислоты, не имеется, нуклеотид не расщепляется нуклеазой, а если ошибочное спаривание между специфическим основанием и основанием, соответствующим специфическому основанию в нуклеотиде, имеет место, нуклеотид расщепляется нуклеазой с образованием нового З'-конца;

Примером способа детекции по второму аспекту является способ, где нуклеаза представляет собой нуклеазу, специфичную в отношении ошибочного спаривания.

Нуклеотид, используемый в способе детекции по первому и второму аспекту, может иметь последовательность, в которой, если замена основания в целевой нуклеиновой кислоте отсутствует, ошибочного спаривания в комплексе, состоящем из нуклеотида и целевой нуклеиновой кислоты, не происходит, или он может иметь последовательность, в которой, если имеется замена основания в целевой нуклеиновой кислоте, ошибочного спаривания в комплексе, состоящем из нуклеотида и целевой нуклеиновой кислоты, не происходит.

Примерами воплощений первого и второго аспектов являются следующие способы: способ, где наличие замены основания определяют на основании наличия продукта наращивания, образовавшегося под действием ДНК-полимеразы; и способ, где наличие замены основания определяют на основании наличия фрагмента 3'части, выделенного из нуклеотида, образовавшегося под действием ДНК-полимеразы. Кроме того, продукт наращивания или фрагмент 3'части нуклеотида можно детектировать с использованием метки, присоединенной к нуклео тиду. В качестве метки можно использовать флуоресцентное вещество. Кроме того, можно использовать нуклеотид, к которому присоединено флуоресцентное вещество и вещество, способное тушить флуоресценцию, где флуоресценция испускается после расщепления нуклеазой, или наращивания ДНК после расщепления. В воплощении, в котором используют нуклеотид с флуоресцентной меткой, для детекции можно использовать метод поляризации флуоресценции.

Что касается нуклеотида, используемого в способе детекции замены основания по первому и второму аспектам, то примером модификации нуклеотида по 3'-концу является модификация гидроксильной группы в положении 3 рибозы. Нуклеотид, используемый в способе детекции замены основания настоящего изобретения, может содержать аналог нуклеотида и/или модифицированный нуклеотид. Не имея ввиду ограничение настоящего изобретения, например, в качестве аналога нуклеотида можно использовать предпочтительно дезоксирибоинозиннуклеотид, дезоксирибоурацилнуклеотид или подобное соединение, и в качестве модифицированного рибонуклеотида можно использовать (а-Б)-рибонуклеотид. Кроме того, способ по первому или второму аспекту также может включать стадию амплификации нуклеиновой кислоты, на которой продукт наращивания, образовавшийся под действием ДНК-полимеразы, используют в качестве матрицы.

Третий аспект настоящего изобретения относится к способу анализа генотипа аллеля, причем способ включает детекцию замены оснований согласно способу по первому или второму аспекту.

Четвертый аспект настоящего изобретения относится к нуклеотиду, используемому для детекции замены основания по специфическому основанию в целевой нуклеиновой кислоте, который (A) модифицирован по 3'-концу так, что наращивания с указанного конца с помощью ДНК-полимеразы не происходит;

(B) имеет последовательность оснований, способную отжигаться к участку, содержащему специфическое основание в целевой нуклеиновой кислоте; и (C) содержит последовательность, в которой, если ошибочное спаривание между специфическим основанием и основанием, соответствующим специфическому основанию в нуклеотиде, в комплексе, состоящем из нуклеотида и целевой нуклеиновой кислоты, имеет место, нуклеотид не расщепляется нуклеазой, а если ошибочного спаривания между специфическим основанием и основанием, соответствующим специфическому основанию в нуклеотиде, не имеется, нуклеотид расщепляется нуклеазой с образованием нового 3'-конца.

Примерами нуклеотида по четвертому аспекту являются следующие нуклеотиды: нуклеотид, содержащий рибонуклеотид в участке, содержащем основание, соответствующее специфическому основанию в целевой нуклеиновой кислоте, где, если ошибочного спаривания между специфическим основанием и основанием, соответствующим специфическому основанию в нуклеотиде, в комплексе, состоящем из нуклеотида и целевой нуклеиновой кислоты, не имеется, нуклеотид расщепляется рибонуклеазой Н; и нуклеотид, содержащий последовательность, узнаваемую для рестриктазы, в участке, содержащем основание, соответствующее специфическому основанию в целевой нуклеиновой кислоте, где, если ошибочного спаривания между специфическим основанием и основанием, соответствующим специфическому основанию в нуклеотиде, в комплексе, состоящем из нуклеотида и целевой нуклеиновой кислоты, не имеется, нуклеотид расщепляется рестриктазой.

Пятый аспект настоящего изобретения относится к нуклеотиду, используемому для детекции замены основания по специфическому основанию в целевой нуклеиновой кислоте, который (A) модифицирован по 3'-концу так, что наращивания с указанного конца с помощью ДНК-полимеразы не происходит;

(B) имеет последовательность оснований, способную отжигаться к участку, содержащему специфическое основание в целевой нуклеиновой кислоте; и (C) содержит последовательность, в которой, если ошибочного спаривания между специфическим основанием и основанием, соответствующим специфическому основанию в нуклеотиде, в комплексе, состоящем из нуклеотида и целевой нуклеиновой кислоты, не имеется, нуклеотид не расщепляется нуклеазой, а если ошибочное спаривание между определенным основанием и основанием, соответствующим специфическому основанию в нуклеотиде, имеет место, нуклеотид расщепляется нуклеазой с образованием нового З'-конца.

Примером нуклеотида по пятому аспекту является нуклеотид, где, если ошибочное спаривание между определенным основанием и основанием, соответствующим специфическому основанию в нуклеотиде, в комплексе, состоящем из нуклеотида и целевой нуклеиновой кислоты, имеет место, нуклеотид расщепляется нуклеазой, специфичной в отношении ошибочного спаривания.

Нуклеотид по четвертому или пятому аспекту может иметь последовательность, в которой, если замены основания в целевой нуклеиновой кислоте не имеется, ошибочного спаривания в комплексе, состоящем из нуклеотида и целевой нуклеиновой кислоты, не происходит, или он может иметь последовательность, в ко торой, если замена основания в целевой нуклеиновой кислоте имеется, ошибочного спаривания в комплексе, состоящем из нуклеотида и целевой нуклеиновой кислоты, не происходит.

Нуклеотид по четвертому или пятому аспекту может содержать присоединенное соединение-метку. Такая позиция может находиться в части 3' или 5' к сайту расщепления для нуклеазы. Например, в качестве соединения-метки можно использовать флуоресцентное вещество. Присоединяя также вещество, способное тушить флуоресценцию, можно получить нуклеотид, флуоресцирующий после расщепления нуклеазой или наращивания ДНК после расщепления.

Что касается нуклеотида по четвертому или пятому аспекту, то примером модификации нуклеотида по 3'-концу является модификация гидроксильной группы в положении 3 рибозы. Нуклеотид настоящего изобретения может содержать аналог нуклеотида и/или модифицированный нуклеотид. Не имея ввиду ограничение настоящего изобретения, например, в качестве аналога нуклеотида, можно использовать предпочтительно дезоксирибоинозиннуклеотид, дезоксирибоурацилнуклеотид или подобное соединение и в качестве модифицированного рибонуклеотида можно использовать (α-δ)рибонуклеотид.

Шестой аспект изобретения относится к набору, используемому для детекции замены основания в целевой нуклеиновой кислоте, содержащему нуклеотид по четвертому или пятому аспекту.

Примерами набора по шестому аспекту являются следующие наборы: набор, содержащий нуклеазу и/или ДНК-полимеразу; набор, также содержащий реагент для детекции наличия наращивания ДНК; и набор, также содержащий реагент для осуществления способа амплификации нуклеиновой кислоты.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 иллюстрирует результаты детекции замены основания в гене человека согласно способу детекции замены основания настоящего изобретения;

фиг. 2 - результаты детекции замены основания в гене человека согласно способу детекции замены основания настоящего изобретения;

фиг. 3 - результаты детекции замены основания в гене человека согласно способу детекции замены основания настоящего изобретения;

фиг. 4 - результаты детекции замены основания в гене человека согласно способу детекции замены основания настоящего изобретения;

фиг. 5 представляет собой график, иллюстрирующий результаты детекции замены основания в гене человека согласно способу детекции замены основания настоящего изобретения;

фиг. 6 иллюстрирует результаты детекции замены основания в гене человека согласно спо собу детекции замены основания настоящего изобретения;

фиг. 7 - результаты детекции замены основания в гене человека согласно способу детекции замены основания настоящего изобретения;

фиг. 8 - результаты детекции замены основания в гене человека согласно способу детекции замены основания настоящего изобретения.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Используемый в данном описании термин замена основания относится к замене основания в определенном месте в нуклеиновой кислоте на другое основание. Замена основания проявляется в различии в генетической информации среди отдельных организмов. Различие в генетической информации называют полиморфизмом или изменчивостью. Замена основания в данном описании включает замены оснований в случаях полиморфизма и изменчивости. Замена основания также включает замены оснований, искусственно введенные в нуклеиновые кислоты.

Не существует определенного ограничения, касающегося числа замененных оснований при замене основания. Замена может быть одна, или замен может быть несколько.

Настоящее изобретение является особенно подходящим для детекции в гене геномного полиморфизма или изменчивости, в частности, однонуклеотидного полиморфизма (8ΝΡ).

Настоящее изобретение подробно описывается ниже.

(1) Нуклеотид настоящего изобретения.

Нуклеотид настоящего изобретения имеет последовательность оснований, способную отжигаться к участку, содержащему сайт в целевой нуклеиновой кислоте, для которого необходимо детектировать замену основания. Нуклеотид не служит в качестве праймера для наращивания ДНК ДНК-полимеразой, если он находится в интактном состоянии, и он может служить в качестве праймера, только если он расщепляется нуклеазой. Не существует определенного ограничения относительно длины нуклеотида до тех пор, пока он имеет свойства, описанные выше. Согласно настоящему изобретению можно использовать как олигонуклеотид, так и полинуклеотид. В качестве нуклеотида настоящего изобретения, как правило, используют олигонуклеотид, содержащий 8-50 оснований, предпочтительно 10-40 оснований, предпочтительнее 12-30 оснований.

Нуклеотид настоящего изобретения, как правило, представляет собой олигонуклеотид, содержащий дезоксирибонуклеотиды. Необязательно, он может содержать рибонуклеотид или аналог или производное (модификацию) нуклеотида. Например, в качестве аналога нуклеотида можно использовать нуклеотидный аналог с таким основанием, как инозин или 7деазагуанин, в качестве его основной группы, или нуклеотидный аналог с производным рибозы. Примерами модифицированных нуклеотидов являются (а-8)-нуклеотиды, в которых атом кислорода, присоединяемый к фосфатной группе, заменен атомом серы, и нуклеотид, к которому присоединено соединение-метка. Кроме того, нуклеотид настоящего изобретения может содержать пептидную нуклеиновую кислоту (ΡΝΑ), описанную в №11иге. 365:566-568 (1993). Не имея в виду ограничение настоящего изобретения, аналог или производное нуклеотида предпочтительно вводят в сайт, введение в который не влияет на действие используемой нуклеазы. Введение в нуклеотид настоящего изобретения аналога нуклеотида эффективно с точки зрения подавления образования структуры более высокого порядка самого нуклеотида и стабилизации отжига нуклеотида к целевой нуклеиновой кислоте. Таким образом, нуклеотид может содержать аналог нуклеотида и/или модифицированный нуклеотид, если сохраняется функция нуклеотида, которую можно использовать в способе детекции замены основания настоящего изобретения.

Нуклеотид, используемый согласно настоящему изобретению для детекции замены основания в определенном сайте целевой нуклеиновой кислоты, имеет следующие свойства:

(A) модифицирован по 3'-концу так, что наращивания с указанного конца с помощью ДНК-полимеразы не происходит;

(B) имеет последовательность оснований, способную отжигаться к участку, содержащему специфическое основание в целевой нуклеиновой кислоте; и (C) содержит последовательность, в которой, если ошибочное спаривание между специфическим основанием и основанием, соответствующим специфическому основанию (т. е. образующее водородную связь со специфическим основанием) в нуклеотиде, в комплексе, состоящем из нуклеотида и целевой нуклеиновой кислоты, имеет место (или ошибочное спаривание не имеет места), нуклеотид не расщепляется нуклеазой, и если ошибочное спаривание между специфическим основанием и основанием, соответствующим специфическому основанию в нуклеотиде, не имеет места (или если ошибочное спаривание имеет место), нуклеотид расщепляется нуклеазой с образованием нового 3'конца.

Фрагмент 5'-части нуклеотида, расщепленного нуклеазой, может оставаться отожженным к целевой нуклеиновой кислоте. Так как в положении 3 рибозы в 3'-конце фрагмента 5'-части нуклеотида существует гидроксильная группа, ДНК можно наращивать с указанного конца с помощью ДНК-полимеразы. Таким образом, нуклеотид служит в качестве предшественника праймера, если имеет последовательность, которая расщепляется нуклеазой.

Как описано выше, нуклеотид настоящего изобретения модифицируют по 3'-концу так, что его нельзя использовать для реакции наращивания ДНК с помощью ДНК-полимеразы. Не существует определенного ограничения в отношении способа модификации до тех пор, пока можно достичь вышеуказанных целей. Примерами такого способа являются присоединение по 3'-концу дидезоксинуклеотида, нуклеотида, модифицированного по гидроксильной группе в положении 3 рибозы, или нуклеотида с модификацией, препятствующего наращиванию с помощью ДНК-полимеразы из-за пространственного затруднения. В качестве способа модификации гидроксильной группы в положении 3 рибозы нуклеотида можно использовать алкилирование или другие известные способы модификации. Например, реакцию наращивания ДНК можно предотвратить аминоалкилированием.

Нуклеотид настоящего изобретения имеет последовательность, способную отжигаться в данных условиях к участку в целевой нуклеиновой кислоте, для которой следует определить замену основания. Нуклеотид имеет последовательность, по существу, комплементарную целевой нуклеиновой кислоте, и не требуется наличие последовательности оснований, полностью комплементарной целевой нуклеиновой кислоте, до тех пор, пока не нарушается детекция замены основания, представляющего интерес.

Когда нуклеотид настоящего изобретения отжигают к целевой нуклеиновой кислоте и проводят инкубацию в присутствии соответствующей нуклеазы и соответствующей ДНКполимеразы, на расщепление нуклеотида влияет наличие замены основания в целевой нуклеиновой кислоте, т. е. наличие сайта ошибочного спаривания, образованного отжигом нуклеотида к целевой нуклеиновой кислоте. Наращивание ДНК с использованием целевой нуклеиновой кислоты в качестве матрицы происходит только в том случае, если нуклеотид расщепляется с образованием нового 3'-конца. Следовательно, можно получить информацию о наличии ошибочного спаривания или наличии замены основания на основании наличия наращивания ДНК.

Согласно настоящему изобретению можно получить такой нуклеотид, что ошибочное спаривание происходит, если имеется замена основания, которую нужно определить, и также можно получить такой нуклеотид, что ошибочное спаривание не происходит, если имеется замена основания. Кроме того, можно получить информацию о наличии замены основания и одновременно о типе замененного основания следующим образом: получают четыре типа нуклеотидов, причем каждый нуклеотид из четырех типов содержит замену основания в позиции, соответствующей основанию, представляющему интерес; и затем определяют тип ос нования, содержащегося в праймере, с которого происходит наращивание.

Как описано выше, нуклеотид настоящего изобретения превращается в праймер, способный к наращиванию ДНК, в результате расщепления нуклеазой. Часть нуклеотида, 5' к сайту расщепления нуклеазой, служит в качестве праймера для наращивания ДНК. Не существует определенного ограничения относительно нуклеазы, пока она расщепляет (или не расщепляет) нуклеотид в зависимости от наличия ошибочного спаривания в двухцепочечной нуклеиновой кислоте, образовавшейся в результате отжига нуклеотида к целевой нуклеиновой кислоте. Примерами такой нуклеазы являются рибонуклеаза Н, рестриктаза и нуклеаза, специфичная в отношении ошибочного спаривания.

Рибонуклеаза Н представляет собой фермент, который узнает двухцепочечную нуклеиновую кислоту, состоящую из ДНК и РНК, и селективно расщепляет цепочку РНК. Нуклеотид, который расщепляется рибонуклеазой Н только в том случае, если ошибочного спаривания не имеется, можно получить, помещая рибонуклеотид в сайт нуклеотида, соответствующий основанию, для которого надо определить замену.

Не существует определенного ограничения относительно рибонуклеазы, используемой согласно настоящему изобретению, пока она обладает активностью узнавания двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из нуклеотида настоящего изобретения, содержащего рибонуклеотид, и комплементарной ему ДНК, и селективно расщепляет рибонуклеотидную часть. Например, рибонуклеазу Н из ЕкйепсЫа сой или рибонуклеазу Н из термофильной бактерии, принадлежащей к роду ВасШик, бактерии, принадлежащей к роду Тйегтик, бактерии, принадлежащей к роду Ругососсик, бактерии, принадлежащей к роду Тйегто!ода, или бактерии, принадлежащей к роду Агсйаеод1оЬик, можно использовать предпочтительно в качестве такого фермента. Рибонуклеаза Н предпочтительно показывает высокую активность в тех же условиях реакции, которые используют в то же время для ДНК-полимеразы, что не предполагает ограничения настоящего изобретения. Если нуклеотид настоящего изобретения должен использоваться в сочетании с реакцией амплификации нуклеиновой кислоты, предпочтительно использовать рибонуклеазу Н, проявляющую активность в условиях, в которых осуществляют реакцию. Например, выгодно использовать термоустойчивую рибонуклеазу Н, если необходимо использовать реакцию амплификации нуклеиновой кислоты или обработку при высокой температуре (например, ПЦР). Например, в качестве термоустойчивой рибонуклеазы Н можно использовать рибонуклеазу Н из ВасШик са1бо!еиах, Ругососсик Гипокик. Ругососсик йопкокйл,

Тйегтососсик Н1ога118, Т11сгто1ода тапНта, АгсНаеоДоЬик Γιιΐβίάιικ или МеШапососсик )аппа81н.

Рестриктаза представляет собой фермент, который узнает специфическую последовательность оснований (от 4 до 8 оснований) в ДНК и расщепляет ее в позиции в пределах или вблизи указанной последовательности. Если часть оснований, для которой следует определить замену, перекрывается последовательностью, узнаваемой рестриктазой, нуклеотид, полученный с включением такой последовательности, можно использовать для детекции замены основания. Если ошибочное спаривание образуется между нуклеотидом и целевой нуклеиновой кислотой, расщепления рестриктазой не происходит. Можно получить информацию о наличии замены основания на основании таких результатов. Если необходимо использовать такой нуклеотид, необходимо сделать целевую нуклеиновую кислоту невосприимчивой к расщеплению рестриктазой. Устойчивость к конкретной рестриктазе целевой нуклеиновой кислоты можно придать, например, метилированием определенных оснований с использованием модифицирующей метилазы, соответствующей используемой рестриктазе.

Можно использовать фермент, который узнает и расщепляет ошибочное спаривание между целевой нуклеиновой кислотой и нуклеотидом, отличающийся от вышеописанных двух типов нуклеаз. В качестве такого фермента можно использовать Ми! Н или подобный фермент.

Нуклеотид настоящего изобретения расщепляется нуклеазой, образуется новый 3'конец и затем с указанного конца инициируется наращивание ДНК. Не существует определенного ограничения в отношении ДНК-полимеразы, используемой на данной стадии, пока она способна наращивать ДНК с 3'-конца праймера в зависимости от последовательности ДНК как матрицы. Ее примерами являются ДНКполимераза I ЕкНепсЫа сой, фрагмент Кленова, ДНК-полимераза Т7, ДНК-полимеразы из термофильных бактерий, принадлежащих к роду ВасШик (Βδΐ-ДНК-полимераза, Вса-ДНКполимераза), ДНК-полимеразы из бактерий, принадлежащих к роду ТНегтнк (Тас.|-ДНКполимераза, и т.п.), и α-тип ДНК-полимераз из термофильных архабактерий (РГи-ДНКполимераза и т.п.).

Если нуклеотид настоящего изобретения необходимо использовать в сочетании с реакцией амплификации гена, для использования выбирают ДНК-полимеразу, подходящую для реакции амплификации гена.

Фрагмент 3'-части нуклеотида настоящего изобретения, образовавшийся в результате расщепления нуклеазой, может остаться отожженным к целевой нуклеиновой кислоте, если он достаточно длинный, хотя он может отделиться от целевой нуклеиновой кислоты, если он ко роткий. Если используют ДНК-полимеразу, обладающую активностью замещения цепи, фрагмент отделяется от целевой нуклеиновой кислоты после наращивания ДНК под действием ДНК-полимеразы. Если используют ДНКполимеразу, обладающую 5'^3'-экзонуклеазной активностью, фрагмент разрушается под действием ДНК-полимеразы.

Например, но не как ограничение настоящего изобретения, в случае, когда в качестве нуклеазы используют рибонуклеазу Н, в качестве нуклеотида настоящего изобретения можно использовать олигонуклеотид со структурой, представленной приведенной далее общей формулой.

Общая формула: 5'-ά№·ι-Νό-ά№-Ν'-3' (а - целое число, равное 11 или большее; Ь - целое число, равное 1 или большее; с - 0 или целое число, равное 1 или большее; άΝ - дезоксирибонуклеотид; Ν - рибонуклеотид; Ν' - нуклеотид, модифицированный таким образом, что наращивания с помощью ДНК-полимеразы не происходит).

Часть, представленная в общей формуле ΝΚ содержит основание, соответствующее основанию, являющемуся объектом детекции замены. Кроме того, нуклеотид может содержать аналог нуклеотида или производное нуклеотида (модифицированный нуклеотид), пока не нарушается функция нуклеотида.

Примером нуклеотида является нуклеотид, представляющий собой химерный олигонуклеотид, представленный общей формулой, где Ν' представляет собой модифицированный дезоксирибонуклеотид, а равно целому числу - 11 или большему, Ь = 1-3, с = 0-2. Не существует определенного ограничения в отношении основания как объекта детекции замены основания, пока такое основание располагается в части, представленной ΝΚ В одном из воплощений настоящего изобретения, например, можно использовать, предпочтительно, нуклеотид, в котором длина части, представленной (άΝΟ’-Ν'), равна трем основаниям, и основание, соответствующее основанию, для которого следует определить замену основания, располагается в 3'конце части, представленной ΝΚ Такой нуклеотид обнаруживает хорошую специфичность в отношении детекции замены основания.

Детекцию фрагмента 3'-части, выделенного из нуклеотида настоящего изобретения расщеплением нуклеазой или с помощью продукта, образовавшегося после реакции наращивания ДНК после расщепления (продукт наращивания), можно облегчить, и наличие замены основания можно подтвердить обычным образом путем соответствующего мечения нуклеотида.

Не существует определенного ограничения в отношении способа мечения нуклеотида. Например, можно использовать радиоактивные изотопы (³²Р и т.п.), красители, флуоресцентные вещества, люминесцентные вещества, различ ные лиганды (биотин, дигоксигенин и т.п.) и ферменты. Наличие продукта, образовавшегося из меченного нуклеотида, можно подтвердить методом детекции, подходящим для данной метки. Лиганд, который нельзя определить непосредственно, можно использовать в сочетании с лигандсвязывающим веществом, имеющим детектируемую метку. Например, целевую нуклеиновую кислоту можно определить с высокой чувствительностью, используя продукт меченного лигандом нуклеотида в сочетании с меченым ферментом антителом против лиганда и усиливая сигнал.

Примерами воплощений нуклеотидов с флуоресцентными метками являются нуклеотид как с флуоресцентным веществом, так и с веществом, обладающим действием тушения флуоресценции, излучаемой флуоресцентным веществом, на соответствующем расстоянии. Так, праймер не испускает света, если он находится в интактном состоянии. Однако он показывает флуоресценцию, если он расщепляется нуклеазой, и флуоресцентное вещество и тушитель размещаются на некотором расстоянии. Так как нуклеотид испускает излучение в то же время, когда инициируется реакция наращивания ДНК, можно получить информацию о наличии замены основания, непосредственно наблюдая за реакционной смесью во время реакции.

(2) Способ детекции замены основания настоящего изобретения.

Нуклеотид настоящего изобретения, описанный выше в (1), используют в способе детекции замены основания настоящего изобретения, и указанный способ включает (1) смешивание образца, содержащего целевую нуклеиновую кислоту, с нуклеотидом;

(2) обработку смеси нуклеазой и ДНКполимеразой и (3) детекцию наличия расщепления нуклеотида нуклеазой. Наличие замены основания определяют на основании наличия расщепления нуклеотида нуклеазой согласно свойствам нуклеотида настоящего изобретения, описанного выше в (1).

В способе детекции замены основания настоящего изобретения в качестве целевой нуклеиновой кислоты можно использовать одноцепочечную или двухцепочечную нуклеиновую кислоту (ДНК или РНК). В зависимости от используемой нуклеазы, может быть затруднительным использование РНК в качестве целевой нуклеиновой кислоты. В таком случае замену основания в РНК можно определить, получая кДНК с использованием РНК в качестве матрицы и используя кДНК в качестве целевой нуклеиновой кислоты.

Согласно настоящему изобретению для реакции детекции можно использовать образец, содержащий целевую нуклеиновую кислоту.

Любой образец, который может содержать нуклеиновую кислоту, или организм, такой как клетка, ткань (образец биопсии и т.п.), цельную кровь, сыворотку, цереброспинальную жидкость, семенную жидкость, слюну, мокроту, мочу, кал, волос и клеточную культуру можно использовать без ограничений. Не имея в виду ограничение настоящего изобретения, испытываемый образец можно проверять по способу настоящего изобретения предпочтительно после соответствующей обработки, например, после превращения его в форму, с которой можно осуществить реакцию с использованием ДНКполимеразы. Такая переработка включает лизис клетки, а также экстракцию и выделение нуклеиновой кислоты из образца в чистом виде.

Согласно способу детекции замены основания настоящего изобретения, наличие замены основания определяют на основании наличия расщепления используемого нуклеотида и наличия реакции наращивания ДНК после расщепления. Не существует определенного ограничения в отношении способа определения, и можно использовать известные способы анализа нуклеиновой кислоты. Примерами способов определения наличия реакции наращивания ДНК являются следующие: способ, в котором образовавшийся продукт реакции наращивания разделяют для подтверждения методом гельэлектрофореза (агарозный гель, полиакриламидный гель и т.п.) или капиллярного электрофореза; и способ, в котором увеличение длины продукта реакции наращивания измеряют методом масс-спектрометрии. В другом воплощении примером является способ, при котором определяют включение нуклеотида в продукт реакции наращивания. В данном способе можно получить информацию о количестве синтезированного продукта реакции наращивания как количестве нуклеотидтрифосфата с подходящей меткой, включенного в макромолекулярный продукт реакции наращивания. Количество образовавшегося продукта реакции наращивания можно определить, например, после отделения продукта от непрореагировавшего нуклеотида осаждением кислотой или гель-электрофорезом. Кроме того, можно использовать способ, при котором ферментативным способом определяют пирофосфат, образовавшийся после реакции наращивания ДНК.

Согласно способу детекции настоящего изобретения, продукт реакции наращивания затем можно амплифицировать с использованием известной реакции амплификации нуклеиновых кислот. Такое воплощение полезно с учетом высокочувствительной детекции замены основания.

Различные способы амплификации, в которых используют праймер с последовательностью, комплементарной нуклеиновой кислоте как матрице, можно использовать без ограничения в качестве реакции амплификации нуклеиновой кислоты. Например, можно использовать известные способы амплификации, такие как

1Ί полимеразная цепная реакция (ПЦР, патенты США №№ 4683195, 4683202 и 4800159), амплификация с замещением цепи (8ΌΑ, ΙΡ-Β 7114718), самоподдерживающаяся репликация последовательности (38К), амплификация на основе последовательности нуклеиновой кислоты (ΝΑ8ΒΑ, патент Японии № 2650159), амплификация, опосредуемая транскрипцией (ТМА), и изотермическая и инициированная химерным праймером амплификация нуклеиновых кислот (ΚΆΝ, АО 00/56877). Замену основания в целевой нуклеиновой кислоте в таком способе можно определить, используя нуклеотид настоящего изобретения в качестве праймера для синтеза ДНК, комплементарной цепочке ДНК как матрице.

Если способ детекции замены основания настоящего изобретения осуществляют с использованием вышеуказанного способа амплификации нуклеиновой кислоты, нуклеотид настоящего изобретения используют в качестве по меньшей мере одного из праймеров, используемых в способе, и в реакционную систему включают нуклеазу, подходящую для нуклеотида.

Согласно детекции замены основания с использованием реакции амплификации нуклеиновой кислоты, описанной выше, наличие замены основания можно определить на основании образования при реакции специфического продукта амплификации. Например, не подразумевая ограничение настоящего изобретения, для определения образовавшегося продукта амплификации можно использовать гельэлектрофорез, гибридизацию с использованием зонда с последовательностью, комплементарной продукту амплификации, способ флуоресцентной поляризации с использованием нуклеотида с флуоресцентной меткой, способ ТацМап и подобные способы. Кроме того, также можно использовать реакции детекции, подходящие для соответствующих способов амплификации генов.

Если замену основания следует анализировать с использованием способа детекции настоящего изобретения на геномном уровне, объем реакционной системы можно уменьшить и в комбинации можно использовать способ повышения степени интеграции для того, чтобы проанализировать большое число последовательностей оснований. В качестве такого средства в комбинации для получения информации можно использовать микрочип в форме квадрата размером несколько сантиметров на несколько сантиметров, на котором интегрированы основные процессы способа детекции или способа анализа настоящего изобретения (например, экстракция ДНК из клетки, реакция амплификации нуклеиновой кислоты, детекция ДНК, представляющей интерес, и т. п.), с использованием технологии микропереработки ир-Ю-ба1с. Необязательно, можно комбинировать процессы гель- или капиллярного электрофореза и гибридизации с детекцией зонда. Такую систему называют микрочипом, чипом для микрокапиллярного электрофореза (СЕ) или наночипом.

Любую реакцию амплификации нуклеиновой кислоты можно использовать в такой системе до тех пор, пока представляющий интерес фрагмент ДНК амплифицируется с использованием такой реакции. Например, не имея в виду ограничение настоящего изобретения, предпочтительно можно использовать способ, в котором нуклеиновую кислоту можно амплифицировать в изотермических условиях, такой как способ Κ'ΆΝ. Сочетание с таким способом может упростить систему, и его весьма предпочтительно использовать для вышеуказанной интегрированной системы. Кроме того, можно сконструировать систему с более высокой интеграцией с использованием технологий согласно настоящему изобретению.

Специфичность детекции замены основания можно улучшить, включая модифицированный нуклеотид в нуклеотид настоящего изобретения и/или регулируя соответствующим образом температуру реакции в способе настоящего изобретения.

Нуклеотид настоящего изобретения с меткой, описанный выше в (1), может облегчить подтверждение наличия реакции наращивания ДНК и полезен для способа детекции замены основания настоящего изобретения. В таком случае наличие реакции наращивания ДНК подтверждают, определяя вещество-метку, полученное из нуклеотида, способом, подходящим для метки, как описано выше.

Например, если используют нуклеотид настоящего изобретения, к которому присоединено флуоресцентное вещество, и если метка присоединена к части, которую используют в качестве праймера, продукт реакции наращивания можно определить с использованием флуоресценции. Если метка присоединена к части 3' к сайту расщепления для нуклеазы в нуклеотиде, наличие реакции наращивания можно определить на основании отделения фрагмента от целевой нуклеиновой кислоты, конверсии фрагмента в меньшую молекулу из-за 5'^3'экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы и т. п. В случае такого воплощения предпочтительно использовать способ флуоресцентной поляризации, включающий изменение молекулярной массы нуклеотида, меченного флуоресцентным веществом.

Если необходимо использовать нуклеотид настоящего изобретения, помеченный путем присоединения флуоресцентного вещества и вещества, обладающего действием тушения флуоресценции от флуоресцентного вещества, так, что испускания не происходит, флуоресцентное излучение испускается в то же время, когда происходит инициация реакции наращивания. Следовательно, можно очень легко определить замену основания.

В вышеописанных характерных воплощениях, используя нуклеотиды, каждый из которых содержит аденин (А), цитозин (С), гуанин (С), тимин (Т) или урацил (И) в позиции, соответствующей сайту, для которого следует определить замену основания, а также различные различимые метки, можно получить одновременно информацию о наличии замены основания и типе замещенного основания.

Нуклеотид настоящего изобретения можно использовать в ПЦР для детекции замены основания. В таком случае нулеотид настоящего изобретения используют вместо одного из праймеров ПЦР и в обычную реакционную смесь для ПЦР также добавляют нуклеазу, подходящую для нуклеотида. Замену основания можно определить с высокой чувствительностью, выбирая нуклеазу, которая не инактивируется в условиях ПЦР.

Клетки высших животных, включая человека, обычно являются диплоидными и имеют пару хромосом. Поэтому, если замена оснований может иметься для специфического основания в хромосоме, возможны следующие случаи: гомозигота (гомотип), в которой обе хромосомы клетки не имеют замены основания; гомозигота, (гомотип), в которой замены оснований присутствуют в обеих хромосомах; и гетерозигота (гетеротип), в которой только в одной хромосоме имеется замена основания.

Можно проверить, является ли генотип диплоидной клетки или индивидуума, имеющего клетку, гомотипом или гетеротипом для специфического основания в гене, применяя способ детекции замены основания настоящего изобретения к образцу нуклеиновой кислоты, полученной из клетки. Например, не имея в виду ограничение настоящего изобретения, если способ настоящего изобретения осуществляют с использованием нуклеотидов, которые соответствуют четырем типам оснований и расщепляются, если ошибочное спаривание отсутствует, детектируют сигналы как результат расщепления нуклеотидов для двух нуклеотидов в случае образца нуклеиновой кислоты, полученного из клетки, в которой генотип представляет собой гетеротип. С другой стороны, детектируют сигнал только для одного из нуклеотидов в случае образца нуклеиновой кислоты, полученного из клетки, в которой генотип представляет собой гомотип. Кроме того, можно одновременно определить, имеет или не имеет гомотип замену основания. Как описано выше, способ настоящего изобретения полезен для детекции замены основания в аллеле.

(3) Набор, используемый для детекции замены основания по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение относится к набору, используемому для детекции замены основания согласно настоящему изобретению, как описано выше. В одном воплощении набор содержит нуклеотид настоящего изобретения. Он может содержать набор нуклеотидов, каждый из которых содержит четыре типа оснований, которые можно использовать для одновременного определения наличия замены основания и типа замененного основания. Кроме того, набор может содержать нуклеазу, подходящую для нуклеотида, ДНК-полимеразу, субстрат для ДНКполимеразы (6ΝΤΡ), буфер, подходящий для реакции, и т.п. С другой стороны, набор может содержать реагент для детекции продукта наращивания с праймера. Набор, содержащий реагент для получения реакционной смеси, используемой для способа амплификации нуклеиновой кислоты, является предпочтительным набором для детекции замены основания в сочетании со способом амплификации нуклеиновой кислоты.

Примеры

Приведенные далее примеры дополнительно и подробно иллюстрируют настоящее изобретение, но не должны рассматриваться как ограничение его объема.

Ссылочный пример 1. Клонирование гена РНКазы Н11 Ругососсиз Гипощз (1) Получение геномной ДНК из РугососСИ8 ГиТЮЗИЗ.

В двухлитровую колбу для сред загружают 2 л среды, содержащей 1% триптона (ЭКсо ЬаЬога1опез), 0,5% дрожжевого экстракта (Э1Гсо ЬаЬога1опез), 1% растворимого крахмала (Ναса1а1 Те8С|ие). 3,5% 1атаппе 8 8оШ (1атаппе ЬаЬота1огу), 0,5% 1атагше 8 Ыс.|шб (1атагте ЬаЬогаЮгу), 0,003% ΜίΧΚ 0,001% №С1, 0,0001% Ре80₄-7Н₂0, 0,0001% Со80₄, 0,0001% СаС1₂-7Н₂0, 0,0001% Ζη80₄, 0,1 ч./млн

Си80₄-5Н₂0, 0,1 ч./млн КА1(80₄)₂, 0,1 ч./млн Н₃В0₄, 0,1 ч./млн №1₂Мо0₄-2Н₂0 и 0,25 ч./млн №С1₂-6Н₂0, стерилизуют при 120°С в течение 20 мин и барботируют азот для удаления растворенного кислорода. Затем в среду инокулируют Рутососсиз Гитюзиз, закупленную у Эеи1зсйе 8атт1ипд уоп М1кгоогдашзтеп; Ό8Μ3638, и культивируют при 95°С в течение 16 ч без встряхивания. После культивирования клетки собирают центрифугированием.

Затем полученные клетки суспендируют в 4 мл 25% раствора сахарозы в 50 мМ трис-НС1 (рН 8,0). К смеси добавляют 0,4 мл 10 мг/мл водного раствора лизоцимхлорида (№са1а1 Тезсще). Проводят реакцию в смеси при 20°С в течение 1 ч. По завершении реакции к реакционной смеси добавляют 24 мл смеси, содержащей 150 мМ №С1, 1 мМ ЭДТК и 20 мМ трисНС1 (рН 8,0), 0,2 мл 20 мг/мл раствора протеиназы К (Такага 811ихо) и 2 мл 10% водного раствора лаурилсульфата натрия. Смесь инкубируют при 37°С в течение 1 ч.

По завершении реакции смесь подвергают экстракции смесью фенол-хлороформ с последующим осаждением этанолом и получают примерно 1 мг геномной ДНК.

(2) Клонирование гена РНКазы Н11.

Полная геномная последовательность Ругососсик Гипокик опубликована [ΌΝΑ Кекеагсй, 5:55-76 (1998)]. Существование в геноме гена, кодирующего гомолог РНКазы Н11 (РН1650), известно (БЕР ГО N0:1, собственная страница Ναΐίοηαΐ 1пк111и(е оГ Тес1по1оду апй Еуа1иа(юп: ййр ://\\л\л\7ш1е.до ,.)р/).

Проводят поиск гомологии между геном РН1650 (БЕр ГО NО:1) и частично опубликованной геномной последовательностью Ругососсик Гипокик (собственная страница Ишуегкйу оГ Шай, Шай Оепоте Сеп!ег:

ййр ://\у\у\у.депоте.и1а11.ейи/кес.|иепсе.1ит1). В результате находят высокогомологичную последовательность.

На основе гомологичной последовательности синтезируют праймеры 1650Ше (БЕР ГО N0:2) и 1650Ват (БЕр ГО N0:3).

Осуществляют ПЦР в объеме 100 мкл с использованием в качестве матрицы 200 нг геномной ДНК Ругососсик Гипокик, полученной в ссылочном примере 1-(1), и 20 пмоль 165(^йе и 20 пмоль 1650Ват в качестве праймеров. В качестве ДНК-полимеразы используют ТаКаКа Ех Тад (Такага Бкпхо) согласно прилагаемому протоколу. ПЦР осуществляют следующим образом: 30 циклов - 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 1 мин. Амплифицированный фрагмент ДНК примерно в 0,7 т.п.о. расщепляют Ше1 и ВатН1 (обе от Такага Б1шхо). Полученный фрагмент ДНК встраивают между сайтом №е1 и сайтом ВатН1 в плазмидном векторе рЕТ3а (№гадеп) и получают плазмиду рРЕИ220.

(3) Определение последовательности оснований фрагмента ДНК, содержащего ген РНКазы НН.

Последовательность оснований фрагмента ДНК, встроенную в рРЕИ220, полученную в ссылочном примере 1-(2), определяют согласно дидезокси-методу.

Анализ установленной последовательности оснований показывает открытую рамку считывания, предположительно кодирующую РНКазу НП. Последовательность оснований открытой рамки считывания показана в БЕр ГО N0:4. Аминокислотная последовательность РНКазы НП, расшифрованная из последовательности оснований, показана в БЕр ГО N0:5.

Создана ЕкНепсЫа со11 ΙΜ109, трансформированная плазмидой рРЕИ220 и указанная как ЕкйепсЫа сой !М109/рРЕи220, депонирована 5 сентября 2000 в 1пГегпайопа1 Ра1еп1 0гдап1кт Оерокйегу, №1йопа1 ГпкГйиГе оГ Айуапсей 1пйик(г1а1 Бае псе апй Тес1по1оду, А1БТ ТкикиЬа Сепйа1 6, 1-1, Нрак1п 1-СНоте, ТкикиЬа-кЫ, 1Ьагак1-кеп 305-8566, 1арап, под инвентарным номером ЕЕКМ Р-18020, и в 1пГегпаГюпа1 Ра1еп1 0гдаткт Оерокйегу, №1йопа1 ГпкГйиГе оГ Айуапсей 1пйик1па1 Баепсе апй Тес1по1оду под инвентарным номером ЕЕКМ ВР-7654 (дата пере дачи полномочий международному банку 9 июля 2001).

(4) Получение очищенного препарата РНКазы НП.

ЕкйепсЫа сой НМБ174 ГОЕ3) (№гадеп) трансформируют рРЕИ220, полученной в ссылочном примере 1-(2). Полученную ЕкНепсЫа сой НМБ174 (ЭЕ3), содержащую рРЕИ220, инокулируют в 2 л среды ЬВ, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и культивируют при встряхивании при 37°С в течение 16 ч. По завершении культивирования клетки, собранные центрифугированием, суспендируют в 66,0 мл буфера для обработки ультразвуком [50 мМ трис-НС1 (рН 8,0), 1 мМ ЭДТК, 2 мМ фенилметансульфонилфторида] и обрабатывают ультразвуком. Супернатант, полученный центрифугированием обработанной ультразвуком суспензии при 12000 об./мин в течение 10 мин, греют при 60°С в течение 15 мин. Затем его центрифугируют при 12000 об./мин в течение 10 мин и снова собирают супернатант. Таким образом, получают 61,5 мл горячего супернатанта.

Горячий супернатант загружают в колонку с КЕБ0ИКСЕ р (Атегкйат Рйагтааа ВюГесй), уравновешенную буфером А [50 мМ трис-НС1 (рН 8,0), 1 мМ ЭДТК], и хроматографируют с использованием системы ЕРЬС (Атегкйат Рйагтааа ВюГесй). В результате РНКаза Н11 протекает через колонку КЕБ0ИКСЕ р.

Фракцию РНКазы Н11, прошедшую через колонку (60,0 мл), загружают в колонку с КЕБ0ИКСЕ Б (Атегкйат Рйагтааа ВюГесй), уравновешенную буфером А, и элюируют с линейным градиентом от 0 до 500 мМ №1С1 с использованием системы ЕРЬС. Получают фракцию, содержащую РНКазу Н11, элюированную примерно 150 мМ №С1.

Фракцию РНКазы Н11 (2,0 мл) концентрируют ультрафильтрацией с использованием СепГг1соп-10 (Аппсоп). Концентрат (250 мкл) загружают в колонку для гель-фильтрации с супердексом 200 (Атегкйат Рйагтааа ВюГесй), уравновешенную 50 мМ трис-НС1 (рН 8,0), содержащим 100 мМ №1С1 и 0,1 мМ ЭДТК, и элюируют тем же буфером. В результате РНКазу Н11 элюируют в позиции, соответствующей молекулярной массе 17 кДа. Такая молекулярная масса соответствует молекулярной массе РНКазы Н11 в форме мономера.

Элюированную РНКазу Н11 используют как препарат РГи-РНКаза Н11. Активность РНКазы Н измеряют с использованием полученного таким образом препарата РГи-РНКаза Н11 следующим образом.

Смешивают 10 мМ трис-НС1 (рН 8,0), 1 мМ дитиотреитола (№1са1а1 Текдпе), 0,003% бычьего сывороточного альбумина (фракция V, Брта), 4% глицерина, 20 мкг/мл поли(йТ) (Атегкйат Рйагтааа ВюГесй) и 30 мкг/мл поли(гА) (Атегкйат РНагтааа ВюГесй). Смесь инкубируют при 37°С в течение 10 мин и используют в качестве стандартного раствора для измерения активности РНКазы Н.

К 100 мкл раствора субстрата добавляют 1 мкл 1М раствора МпС1₂. Смесь инкубируют при 40°С. К смеси для инициации реакции добавляют препарат РГи-РНКаза II соответствующего разведения. После взаимодействия при 40°С в течение 30 мин к смеси для прекращения реакции добавляют 10 мкл 0,5М ЭДТК. Затем измеряют поглощение при 260 нм.

В результате величина поглощения при 260 нм для реакционной смеси, к которой добавляют препарат РГи-РНКаза II, более высокая, чем для реакционной смеси, к которой перед добавлением препарата РГи-РНКаза II добавляют 0,5М ЭДТК. Таким образом, демонстрируется, что препарат обладает активностью РНКазы Н.

(5) Измерение активности очищенной РНКазы Н.

(a) Получение используемых растворов реагентов.

Реакционная смесь для определения активности. В стерильной воде содержатся перечисленные далее вещества в указанных конечных концентрациях: 40 мМ трис-НС1 (рН 7,7 при 37°С), 4 мМ хлорида магния, 1 мМ ΌΤΤ, 0,003% ВЗА, 4% глицерина и 24 мкМ поли(бТ).

Раствор поли[8-³Н]аденелиновой кислоты: 370 кБк раствора поли[8-³Н]аденелиновой кислоты растворяют в 200 мкл стерильной воды.

Раствор полиаденелиновой кислоты: полиаденелиновую кислоту разбавляют до концентрации 3 мМ стерильной водой высшей степени чистоты.

Разведенный раствор фермента. В стерильной воде содержатся перечисленные далее вещества в указанных конечных концентрациях: 25 мМ трис-НС1 (рН 7,5 при 37°С), 5 мМ 2меркаптоэтанола, 0,5 мМ ЭДТК (рН 7,5 при 37°С), 30 мМ хлорида натрия и 50% глицерина.

Получение денатурированной под действием тепла ДНК тимуса теленка. Суспендируют 200 мг ДНК тимуса теленка и оставляют набухать в 100 мл ТЕ-буфера. Раствор разбавляют до концентрации 1 мг/мл стерильной водой высшей степени чистоты для измерения поглощения в УФ-области при 260 нм. Разбавленный раствор греют при 100°С в течение 10 мин и затем быстро охлаждают на ледяной бане.

(b) Способ измерения активности.

К 985 мкл реакционной смеси для определения активности, полученной выше в (а), добавляют 7 мкл раствора поли[8-³Н]аденелиновой кислоты. Смесь инкубируют при 37°С в течение 10 мин. К смеси добавляют 8 мкл полиаденелиновой кислоты и получают конечную концентрацию 24 мкМ. Затем смесь инкубируют при 37°С в течение 5 мин. Затем получают 1000 мкл реакционной смеси с поли[8-³Н]гАполи-бТ. Затем 200 мкл реакционной смеси инкубируют при 30°С в течение 5 мин. К смеси добавляют 1 мкл раствора фермента соответствующего разведения. Со временем берут образцы реакционной смеси по 50 мкл для последующих измерений. Период времени в минутах от добавления фермента до отбора образца обозначают Υ. Для определения общего срм или для фона получают 50 мкл реакционной смеси, добавляя 1 мкл разведенного раствора фермента вместо раствора фермента. К образцу добавляют 100 мкл 100-мМ раствора пирофосфата натрия, 50 мкл раствора ДНК тимуса теленка, денатурированной под действием тепла, и 300 мкл 10% трифторуксусной кислоты (300 мкл воды высшей степени чистоты для измерения общего срм-чим). Смесь инкубируют при 0°С в течение 5 мин и затем центрифугируют при 10000 об./мин в течение 10 мин. После центрифугирования 250 мкл полученного супернатанта помещают во флакон. Добавляют 10 мл аквазола-2 (ΝΕΝ ЫГс Зое псе РтобисЫ). Измеряют чим в жидкостном сцинтилляционном счетчике.

(с) Вычисление единиц.

Величину единицы для каждого фермента вычисляют согласно следующему уравнению:

Единица/мл = {(измеренное чим - чим фона) х 1,2* х 20 х 1000 х степень разведения}200 (мкл)/(общее чим х Υ (мин) х 50 (мкл) х 9**)

1,2* - количество, в нмоль, поли[8-³Н]гАполи-бТ, содержащегося в общем чим, на 50 мкл;

9** - коэффициент коррекции.

Ссылочный пример 2. Клонирование гена РНКазы НИ из Агсйаеод1оЬи8 Γι.ι1βί6ιΐ5.

(1) Получение геномной ДНК из Атсйаеод1оЬи8 Γι.ι1βί6ιΐ5.

Клетки Агсйаеод1оЬи8 Γι.ι1βί6ιΐ5 (закупленной у ОеиБсйе §ашш1ипд уоп М1ктоогдаш8теп ипб 2е11ки11итеп СтЬН; Ό8Μ4139), собранные из 8 мл культуры, суспендируют в 100 мкл 25% раствора сахарозы в 50 мМ трис-НС1 (рН 8,0). К смеси добавляют 20 мкл 0,5 мМ ЭДТК и 10 мкл 10 мг/мл водного раствора лизоцимхлорида (№1са1;ц Теэдие). Проводят реакцию в смеси при 20°С в течение 1 ч. По завершении реакции к реакционной смеси добавляют 800 мкл смеси, содержащей 150 мМ №С1, 1 мМ ЭДТК и 20 мМ трис-НС1 (рН 8,0), 10 мкл 20 мг/мл раствора протеиназы К (Такага Зйпхо) и 50 мкл 10% водного раствора лаурилсульфата натрия. Смесь инкубируют при 37°С в течение 1 ч. По завершении реакции смесь подвергают экстракции смесью фенол-хлороформ, осаждают этанолом и сушат на воздухе и затем растворяют в 50 мкл ТЕ и получают раствор геномной ДНК.

(2) Клонирование гена РНКазы НИ.

Полная геномная последовательность Агсйаеод1оЬи8 Γι.ι1βί6ιΐ5 опубликована [К1епк Н.Р. е! а1., №11иге. 390:364-370 (1997)]. Существование одного гена, кодирующего гомолог РНКазы НИ (АЕ0621), известно (8ЕО ГО N0:13, йир:/А\л\лу.1щг.ог§/1Ьб/СМК/Ь1т/й1т1к/8р1акйРаде. йбт).

На основе последовательности гена АР0621 (8Е0 ΙΌ N0:13) синтезируют праймеры АГиШе (8ЕО ΙΌ N0:14) и АГиВат (8ЕО ΙΌ N0:15).

Осуществляют ПЦР в объеме 100 мкл с использованием в качестве матрицы 30 нг геномной ДНК Агсйаеод1оЬик ГШщбик, полученной в ссылочном примере 2-(1), и 20 пмоль АГцЫбе и 20 пмоль АГиВат в качестве праймеров. В качестве ДНК-полимеразы для ПЦР используют ДНК-полимеразу РугоЬек! (Такага 8йи/о) согласно прилагаемому протоколу. ПЦР осуществляют следующим образом: 40 циклов 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 1 мин. Амплифицированный фрагмент ДНК примерно в 0,6 т.п.о. расщепляют Ше1 и ВатН1 (обе от Такага 8йи/о). Полученный фрагмент ДНК встраивают между сайтом Νώ;Ι и сайтом ВатН1 в плазмидном векторе ρΈν119Νά (плазмида, в которой сайт №о1 в ρΈν119Ν превращен в сайт Ше1), и получают плазмиду рАЕИ204.

(3) Определение последовательности оснований фрагмента ДНК, содержащего ген РНКазы НИ.

Последовательность оснований фрагмента ДНК, встроенную в рАЕИ204, полученную в ссылочном примере 2-(2), определяют согласно дидезокси-методу.

Анализ установленной последовательности оснований показывает открытую рамку считывания, предположительно, кодирующую РНКазу НП. Последовательность оснований открытой рамки считывания показана в 8Е0 ΙΌ N0:16. Аминокислотная последовательность РНКазы НП, расшифрованная из последовательности оснований, показана в 8Е0 ΙΌ N0:

17.

Создана ЕкйепсЫа со11 БМ109, трансформированная плазмидой рАЕИ204 и указанная как ЕкйепсЫа сой БМ109/рАЕи204, и депонирована 22 февраля 2001 в йИегпаиоги-б Ра1еШ 0гдашкт Оерокйегу, №1Еопа1 ИчкШШе оГ Абгапсеб ШбикЫй 8с1епсе апб Тесйпо1оду, АКТ ТкикиЬа Сеп!га1 6, 1-1, Н1дакй1 1-Сйоте, ТкикиЬа-кЫ, Кагак1-кеп 305-8566, Баран, под инвентарным номером РЕКМ Р-18221, и в йИетайоги-б Ра!еп! 0гдаткт Оерокйегу, №1Еопа1 ШкШШе оГ Абуапсеб ШбикЫй 8аепсе апб Тесйпо1оду, под инвентарным номером РЕКМ ВР-7691 (дата передачи полномочий международному банку 2 августа 2001).

ЕкйепсЫа сой БМ109 трансформируют рАРИ204, полученной в ссылочном примере 2(2). Полученную ЕкйеПсЫа сой БМ109, содержащую рАРИ204, инокулируют в 2 л среды ЬВ, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и культивируют при встряхивании при 37°С в течение 16

ч. По завершении культивирования клетки, собранные центрифугированием, суспендируют в 37,1 мл буфера для обработки ультразвуком [50 мМ трис-НС1 (рН 8,0), 1 мМ ЭДТК, 2 мМ фенилметансульфонилфторида] и обрабатывают ультразвуком. Супернатант, полученный центрифугированием обработанной ультразвуком суспензии при 12000 об./мин в течение 10 мин, греют при 70°С в течение 15 мин. Затем его центрифугируют при 12000 об./мин в течение 10 мин и снова собирают супернатант. Таким образом получают 40,3 мл горячего супернатанта.

Горячий супернатант загружают в колонку с КЕ80ИКСЕ О (Атегкйат Рйагтааа Вю!есй), уравновешенную буфером А [50 мМ трис-НС1 (рН 8,0), 1 мМ ЭДТК], и хроматографируют с использованием системы РРЬС (Атегкйат Рйагтааа Вю!есй). В результате РНКаза НП протекает через колонку с КЕ80ИКСЕ О.

Фракцию РНКазы НП, прошедшую через колонку, загружают в колонку с КЕ80ИКСЕ 8 (Атегкйат Рйагтааа Вю!есй), уравновешенную буфером А, и хроматографируют с использованием системы РРЬС (Атегкйат Рйагтааа Вю!есй). В результате получают РНКазу НП, прошедшую через колонку с КЕ80ИКСЕ 8.

Фракцию РНКазы НП (40,0 мл), прошедшую через колонку, подвергают трем циклам диализа против 2 л буфера В (50 мМ трис-НС1 (рН 7,0), 1 мМ ЭДТК), содержащего 50 мМ №С1, в течение 2 ч. Загружают 40,2 мл диализованного раствора фермента в колонку с Н1Тгаргепарином (Атегкйат Рйагтааа Вю!есй), уравновешенную буфером В, содержащим 50 мМ №С1, и элюируют с линейным градиентом от 50 до 550 нМ №1С1 с использованием системы РРЬС. В результате получают фракцию, содержащую РНКазу НП, элюированную примерно 240 нМ №С1.

Концентрируют 7,8 мл фракции РНКазы НП ультрафильтрацией с использованием Сеп1псоп-10 (АтБсоп). Четыре порции, выделенные из примерно 600 мкл концентрата, загружают в колонку для гель-фильтрации с суперозой 6 (Атегкйат Рйагтааа Вю!есй), уравновешенную 50 мМ трис-НС1 (рН 8,0), содержащим 100 мМ №1С1 и 0,1 мМ ЭДТК, и элюируют тем же буфером. В результате РНКазу НП элюируют в позиции, соответствующей молекулярной массе 30,0 килодальтон. Такая молекулярная масса соответствует молекулярной массе РНКазы НП в форме мономера.

РНКазу НП, элюированную так, как описано выше, используют как препарат АГиРНКаза НИ.

Ферментативную активность измеряют так, как описано в ссылочном примере 1-(5), с использованием полученного таким образом препарата АГи-РНКаза НП. В результате для препарата АГи-РНКаза НП наблюдают активность РНКазы Н.

Величину единицы термоустойчивой РНКазы Н в примерах, приведенных далее, вычисляют следующим образом.

Растворяют 1 мг поли(гА) или поли(йТ) (оба от Атегкйат Рйагтас1а Вю1ес11) в 1 мл 40 мМ трис-НС1 (рН 7,7), содержащем 1 мМ ЭДТК, и получают раствор поли(гА) и поли(йТ).

Затем раствор поли(гА) (до конечной концентрации 20 мкг/мл) и раствор поли(йТ) (до конечной концентрации 30 мкг/мл) добавляют к 40 мМ трис-НС1 (рН 7,7), содержащему 4 мМ МдС1₂, 1 мМ ΌΤΤ, 0,003% В8А и 4% глицерина. Осуществляют взаимодействие в смеси при 37°С в течение 10 мин и затем охлаждают до 4°С, и получают раствор поли(гА)-поли(йТ). К 100 мкл раствора поли(гА)-поли(йТ) добавляют 1 мкл раствора фермента соответствующего разведения. Осуществляют взаимодействие в смеси при 40°С в течение 10 мин. К смеси для прекращения реакции добавляют 10 мкл 0,5М ЭДТК. Затем измеряют поглощение при 260 нм. В качестве контроля к реакционной смеси добавляют 10 мкл 0,5М ЭДТК, осуществляют взаимодействие в полученной смеси при 40°С в течение 10 мин и затем измеряют поглощение. Посредством вычитания поглощения для контроля из поглощения для реакционной смеси в отсутствие ЭДТК получают величину (различие в поглощении). Таким образом, на основании различия в поглощении определяют концентрацию нуклеотида, высвобожденного из гибрида поли(гА)-поли(йТ) ферментативной реакцией. Одну единицу РНКазы определяют как количество фермента, которое повышает А₂₆₀, соответствующее высвобождению 1 нмоль рибонуклеотида за 10 мин, которое вычисляют согласно следующему уравнению:

единица = [различие в поглощении х объем реакционной смеси (мл)]/0,0152 х (110/100) х степень разведения.

Пример 1. Детекция замены основания в гене человека с-К1-гак.

(1) Получение матрицы.

Получают фрагменты ДНК, каждый из которых содержит последовательность СОТ (С1у), СОТ (Агд), ТОТ (Сук) или АСТ (Бег) для кодона 12 в экзоне 1 с-К1-гак человека. Коротко, продукты амплификации, полученные ПЦР с использованием матричной ДНК, соответствующей вышеуказанным кодонам в кодоне 12 гак Ми1ап1 8е1 с-К1-гак (Такага 81ιιιζο) и гак Сепе Рптег 8е! с-К1-гак/12 (Такага 81ΐΓΐζο), клонируют в вектор рТ7-В1ие (Ыоуадеп). Осуществляют ПЦР с использованием полученных таким образом рекомбинантных плазмид в качестве матриц и праймеров М13 М4 и КУ (оба от Такага 81ιιιζο). Полученные амплифицированные фрагменты извлекают и обозначают как матрицы 12С, 12К, 12С и 128 соответственно.

(2) Детекция замены основания.

Три химерных олигонуклеотида с последовательностями оснований 8ЕО ΙΌ Νο:7-9 в качестве прямых нуклеотидов для специфической детекции матрицы 12С синтезируют на основе последовательности оснований экзона 1 с-К1-гак человека. Гидроксильную группу в положении 3 рибозной группы нуклеотида в 3'конце каждого химерного олигонуклеотида модифицируют аминогексилом. Каждый нуклеотид имеет последовательность, комплементарную последовательности оснований экзона 1 сК1-гак человека, в которой кодон 12 кодирует С1у. Олигонуклеотид с последовательностью оснований 8ЕО ΙΌ NО: 6 синтезируют в качестве антисмыслового праймера для амплификации нуклеиновой кислоты.

Получают реакционную смесь общим объемом 5 мкл, содержащую по 50 пмоль прямого праймера и антисмыслового праймера, 1 мкл 0,25% водного раствора пропилендиамина и в качестве матрицы 1 пг одной из матриц 12С, 12К, 12С и 128. Прямой нуклеотид и антисмысловой праймер отжигают к матрице путем нагревания при 98°С в течение 2 мин и затем при 53°С в Т11егта1 Сус1ег Регкопа1 (Такага 81ιιιζο). К нагретой смеси добавляют 20 мкл смеси, содержащей 0,625 мМ смеси άΝΓΡ, 40 мМ буфера Нерек-КОН (рН 7,8), 125 мМ ацетата калия, 5 мМ ацетата магния, 0,0125% бычьего сывороточного альбумина, 1,25% диметилсульфоксида, 16 Е РЕи-РНКазы НИ, описанной в ссылочном примере 1, 5,5 Е ДНК-полимеразы ВсаВек! (Такага 81ιιιζο) и стерильную воду до конечного объема 25 мкл. Реакционную смесь инкубируют при 53°С в течение 1 ч. По завершении реакции по 5 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. Результаты показаны на фиг. 1. Реакционные смеси, в которых используют матрицы 12С, 12К, 12С и 128, наносят на полосы 1-4 в агарозных гелях, как показано на фиг. 1-1, 1-2 и 1-3 соответственно. Фиг. 1-1, 1-2 и 1-3 показывают результаты для реакций, в которых используют нуклеотиды 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 7, 8 и 9 соответственно.

Как видно на фиг. 1, с использованием нуклеотидов 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 7-9 продукты амплификации отмечают только тогда, когда используют матрицу 12С, т. е. когда целевая нуклеиновая кислота кодирует С1у для кодона 12. Такие результаты показывают, что замену основания в целевой нуклеиновой кислоте можно различить, используя нуклеотид настоящего изобретения. Кроме того, подтверждается, что специфическую амплификацию можно улучшить, используя нуклеотид настоящего изобретения, содержащий инозин.

Пример 2. Детекция других аллелей для кодона 12 с-К1-гак.

На основании результатов примера 1, синтезируют химерные олигонуклеотиды с последовательностями оснований 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 10-12 в качестве нуклеотидов, способных специфически различать основания кодона 12 в 12К, 12С и 128, полученных в примере 1-(1). 8ЕЦ ГО N0: 10, 11 и 12 показывают последовательности оснований, соответствующие аллелям, в которых кодон 12 кодирует Сук, Агд и Бег соответственно. Гидроксильную группу в положении 3 рибозной группы нуклеотида в 3'-конце каждого олигонуклеотида модифицируют аминогексилом. Реакции осуществляют с использованием указанных нуклеотидов и антисмыслового праймера 8 ЕС ГО N0: 6 в условиях реакций, описанных в примере 1(2). По завершении реакции по 5 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. Результаты показаны на фиг. 2. Реакционные смеси, в которых используют матрицы 12С, 12К, 12С и 128, наносят на полосы 1-4 в агарозных гелях, как показано на фиг. 2-1, 2-2 и 2-3 соответственно. Фиг. 2-1, 2-2 и 2-3 показывают результаты для реакций, в которых используют нуклеотиды 8ЕЦ ГО N0: 10, 11 и 12 соответственно.

Как видно на фиг. 2, специфические продукты амплификации отмечают только тогда, когда используют нуклеотиды 8ЕЦ ГО N0: 10, 11 и 12 в сочетании с матрицами 12С, 12К и 128 соответственно. Таким образом, нуклеотиды настоящего изобретения могут точно различать основание, представляющее интерес. Кроме того, подтверждается, что специфическую амплификацию можно улучшить, используя олигонуклеотид, содержащий инозин.

Пример 3. Аллельспецифическая ДНКамплификация геномной ДНК.

Осуществляют реакции в условиях, описанных выше в (2). В реакции используют 150 нг и 30 нг геномной ДНК человека (С1оп1ес11). для которой подтверждено, что кодон 12 в экзоне 1 с-Κί-гак кодирует С1у (СОТ), нуклеотиды 8ЕЦ ГО N0: 7, 10, 11 и 12 (соответствующие С1у, Сук, Агд и 8ег в кодоне 12 соответственно), которые, как показано в примерах 1 и 2, способны специфически детектировать четыре аллеля для кодона 12, а также антисмысловой праймер 8ЕЦ ГО N0: 6. По завершении реакции по 5 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. Результаты показаны на фиг. 3.

Реакционные смеси, в которых используют нуклеотиды 8ЕЦ ГО N0: 7, 10, 11 и 12, наносят на полосы 1-4 в агарозных гелях, как показано на фиг. 3-1 и 3-2 соответственно. Фиг. 3-1 и 3-2 показывают результаты для реакций, в которых используют 150 и 30 нг, соответственно, геномной ДНК человека.

Как видно на фиг. 3, амплификацию фрагмента ДНК отмечают только тогда, когда используют нуклеотид 8ЕЦ ГО N0: 7, независимо от количества геномной ДНК человека, в то время как с использованием других нуклеотидов амплификацию фрагмента ДНК не отмечают. Такие результаты подтверждают, что способ детекции замены основания настоящего изобретения можно использовать для детекции специфического аллеля в геномной ДНК.

Пример 4. Детекция с использованием различных РНКаз Н.

Проверяют использование различных РНКаз Н при детекции замены основания, описанной в примере 1.

Конкретно, вместо Ии-РНКазы Н11 используют АГи-РНКазу Н11, описанную в ссылочном примере 2, или М)а-РНКазу Н11 РНКазу Н, полученную из МеФапососсик _)аипакЫ, как описывается в 8!гис!иге, 8:897-904. Реакции осуществляют в условиях, описанных в примере 1, с использованием нуклеотида 8ЕЦ ГО N0: 7 в качестве прямого праймера и олигонуклеотида 8ЕЦ ГО N0: 6 в качестве антисмыслового праймера. По завершении реакции по 5 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. Результаты показаны на фиг. 4. Реакционные смеси, в которых используют матрицы 12С, 12К, 12С и 128, наносят на полосы 1-4 в агарозных гелях, как показано на фиг. 4-1 и 4-2 соответственно. Фиг. 4-1 и 4-2 показывают результаты для реакций, в которых используют АГи-РНКазу Н11 и М)а-РНКазу Н11 соответственно.

Как видно на фиг. 4, с использованием АГи-РНКазы Н11 и М)а-РНКазы Н11 продукты амплификации отмечают только тогда, когда используют матрицу 12С, т.е. когда целевая нуклеиновая кислота кодирует С1у для кодона 12. Такие результаты показывают, что замену основания в целевой нуклеиновой кислоте можно различить с использованием указанных РНКаз.

Пример 5. Детекция 8NΡ с использованием системы реакции амплификации ДНК (ПЦР), для которой требуется стадия денатурации.

Способ настоящего изобретения проверяют с использованием системы реакции амплификации ДНК, для которой требуется стадия денатурации. Синтезируют химерный олигонуклеотид 8ЕЦ ГО N0: 25 в качестве смыслового нуклеотида для специфической детекции матричной 12С на основе последовательности оснований экзона 1 с-Κί-гак человека. Гидроксильную группу в положении 3 рибозной группы нуклеотида в 3'-конце нуклеотида модифицируют аминогексилом. Также синтезируют праймер с последовательностью оснований 8ЕЦ ГО N0: 18 в качестве антисмыслового праймера. Получают реакционную смесь общим объемом 24 мкл, содержащую по 50 пмоль синтетического нуклеотида и праймера (смыслового нуклеотида и антисмыслового праймера), 2,5 мкл буфера Ех Тад (Такага 81ιιιζο), 2 мкл 2,5 мМ смеси 6№ГР, 50 Е АГи-РНКазы Н11 и 0,625 Е Ех Тад ДНК-полимеразы (Такага 81ιιιζο). К реакционной смеси добавляют 1 мкл 10 нг/мл раствора матрицы 12С, 12К, 12С или 128, полученного в примере 1. Осуществляют ПЦР с использовани ем Т11сгша1 Сус1ег (Такага 81ιι.ιζο) следующим образом: 25 или 30 циклов - 94°С в течение 5 с, 59°С в течение 2 мин и 72°С в течение 5 с. По завершении реакции по 1 мкл каждой реакционной смеси анализируют с использованием биоанализатора Ащ1еп1 2100 (Не^1ей-Раскагб). Результаты приводятся на фиг. 5. Фиг. 5 представляет собой график, показывающий количества продуктов амплификации, представляющих интерес, для соответствующих матриц. Вертикальная ось представляет количество продукта, представляющего интерес, и горизонтальная ось представляет число циклов ПЦР. Как видно на фиг. 5, специфическая амплификация ДНК, представляющей интерес, отмечается только тогда, когда используют матрицу 126, аллель которой совместим с праймером, используемым для детекции. Таким образом, подтверждается, что способ настоящего изобретения также эффективен для реакционной системы для амплификации ДНК, для которой требуется стадия денатурации нуклеиновой кислоты как матрицы.

Пример 6. Аллельспецифическая детекция кодона 61 К-гак.

Проверяют детекцию другой замены оснований. Конкретно, фрагменты ДНК, каждый из которых содержит последовательность САА (61и), ААА (Ьук) или 6АА (61п) для кодона 61 в экзоне 2 с-К1-га8 человека, амплифицированные ПЦР с использованием ДНК-праймеров 8ЕР ГО N0: 19 и 20, клонируют в вектор рТ7-В1ие. Векторы, в которые клонируют фрагменты ДНК, очищают согласно обычному способу и называют 61Ц. 61К и 61Е соответственно. Основываясь на результатах примера 1-(2), на основе последовательности оснований экзона 2 с-К1-гак человека синтезируют химерные олигонуклеотиды 61р, 61К и 61Е в качестве нуклеотидов для специфической детекции соответствующих векторов 61р, 61К и 61Е. Гидроксильную группу в положении 3 рибозной группы нуклеотида в 3'-конце каждого нуклеотида модифицируют аминогексилом. Дальнейшую реакцию осуществляют с использованием нуклеотида в качестве смыслового праймера и праймера 8ЕР ГО N0: 24 в качестве антисмыслового праймера. Получают реакционную смесь общим объемом 5 мкл, содержащую по 50 пмоль каждого из синтетических олигонуклеотидных праймеров (смыслового и антисмыслового праймеров), 1 мкл 0,05% водного раствора пропилендиамина и 10 пг одной из матричных ДНК 61р, 61К и 61Е. Праймеры отжигают к матрице нагреванием при 98°С в течение 2 мин и затем при 53°С в Тйегта1 Сус1ег Регаопа1 (Такага δΐιιιζο). К нагретой смеси добавляют 20 мкл смеси, содержащей 0,625 мМ смеси 6№ТР, 40 мМ буфера НерекК0Н (рН 7,8), 125 мМ ацетата калия, 5 мМ ацетата магния, 0,0125% бычьего сывороточного альбумина, 1,25% диметилсульфоксида, 11 Е АТи-РНКазы Н11 (Такага 81υζο), 5,5 Е ДНК полимеразы ВсаБек! (Такага δΐιιιζο) и стерильную воду, до конечного объема 25 мкл. Реакционную смесь инкубируют при 58°С в течение 1

ч. По завершении реакции по 5 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. Результаты показаны на фиг. 6. Фиг. 6А представляет собой картину электрофореза, представляющую результаты детекции с использованием праймера 8 Ер ГО N0: 21 для детекции 61р. Полосы 1, 2 и 3 представляют результаты, полученные с использованием в качестве матриц матриц 61р, 61К и 61Е соответственно. Фиг. 6В представляет собой картину электрофореза, представляющую результаты детекции с использованием праймера 8Ер ГО N0: 22 для детекции 61К. Полосы 1, 2 и 3 представляют результаты, полученные с использованием матриц 61р, 61К и 61Е соответственно. Фиг. 6С представляет собой картину электрофореза, представляющую результаты детекции с использованием праймера 8Ер ГО N0: 23 для детекции 61Е. Полосы 1, 2 и 3 представляют результаты, полученные с использованием матриц 61р, 61К и 61Е соответственно.

Как видно на фиг. 6А, 6В и 6С, подтверждается, что представляющие интерес продукты амплификации получают реакциями IСАN по аллельспецифическому типу с использованием 8Ер ГО N0: 21, 22 и 23. Таким образом, подтверждается, что способ настоящего изобретения эффективен, если изменяют замену основания, являющуюся целью.

Пример 7. Аллельспецифическая детекция СУР2С19(636).

(1) Проверяют способ детекции с целью отличить генетический гомотип от гетеротипа. В качестве объекта выбирают аллель для основания 63611 в СУР2С19 человека. Сначала фрагменты ДНК, в которых основание 6361 в СУР2С19 человека представляет собой 6 или А, амплифицированные ПЦР с использованием праймеров 8Ер ГО N0: 26 и 27, клонируют в вектор рТ7-В1ие. Плазмиды, в которые клонируют указанные фрагменты ДНК, очищают согласно обычному способу и обозначают как плазмиды 6366 и 636А.

Плазмиды 6366 и 636А, как и плазмиду 6366/А, полученную смешиванием 6366 и 636А в соотношении 1:1, используют в качестве матриц. Плазмиды 6366 и 636А служат моделями для генетического гомотипа, в то время как плазмида 6366/А служит моделью для генетического гетеротипа. Далее, синтезируют нуклеотиды 8Ер ГО N0: 28 и 29 как нуклеотиды для специфической детекции 6366 и 636А соответственно. Осуществляют следующие реакции с использованием нуклеотида в качестве смыслового праймера и праймера 8Ер ГО N0: 30 в качестве антисмыслового праймера. Получают реакционную смесь общим объемом 5 мкл, содержащую по 50 пмоль каждого из синтетических олигонуклеотидных праймеров (смыслово го и антисмыслового праймера), 1 мкл 0,05% водного раствора пропилендиамина и 1 пг одной из плазмид 6360, 636А и 6360/А в качестве матрицы. Праймеры отжигают к матрице нагреванием при 98°С в течение 2 мин и затем при 53°С в Т11сгта1 Сус1ег Рег8опа1 (Такага δΐιιιζο). К нагретой смеси добавляют 20 мкл смеси, содержащей 0,625 мМ смеси 6ΝΤΡ, 40 мМ буфера Нерек-КОН (рН 7,8), 125 мМ ацетата калия, 5 мМ ацетата магния, 0,0125% бычьего сывороточного альбумина, 1,25% диметилсульфоксида, 11 Е А£и-РНКазы Н11, 5,5 Е ДНК-полимеразы ВсаВеЧ и стерильную воду, до конечного объема 25 мкл. Реакционную смесь инкубируют при 53°С в течение 1 ч. По завершении реакции по 5 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. Результаты показаны на фиг. 7А и 7В. Фиг. 7А представляет собой картину электрофореза, представляющую результаты детекции с использованием нуклеотида 6360. Полосы 1, 2 и 3 представляют результаты, полученные с использованием в качестве матриц плазмид 6360, 636А и 6360/А соответственно.

Фиг. 7В представляет собой картину электрофореза, представляющую результаты детекции с использованием нуклеотида 636А. Полосы 1, 2 и 3 представляют результаты, полученные с использованием в качестве матриц плазмид 6360, 636А и 6360/А соответственно. Как видно на фиг. 7А и 7В, подтверждается, что детекцию с использованием нуклеотидов можно осуществить по аллельспецифическому типу.

(2) Геномную ДНК человека используют в качестве матрицы для анализа в сравнении с РСК-КЕЬР. Типирование δΝΡ осуществляют так, как описано выше в (1), с использованием 150 нг геномной ДНК человека (С1оп1есй) в качестве матрицы. Результаты показаны на фиг. 7С. Фиг. 7С представляет собой картину электрофореза, представляющую результаты типирования δΝΡ геномной ДНК человека. Полосы 1 и 2 представляют результаты, полученные с использованием нуклеотидов 6360 и 636А соответственно.

Как видно из фиг. 7С, представляющая интерес амплифицированная ДНК детектируется только тогда, когда используют нуклеотид 6360. Определяют, что аллель для основания 63611 в СУР2С19 геномной ДНК представляет собой гомотип (6360/0).

С другой стороны, осуществляют типирование δΝΡ методом РСК-КРЬР с использованием геномной ДНК человека. ПЦР осуществляют с использованием 150 нг геномной ДНК человека и праймеров δΕΟ ГО N0: 26 и 27. Полученный продукт амплификации обрабатывают ВатН1, и реакционную смесь подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. Результаты показаны на фиг. 7Ό. Фиг. 7Ό представляет собой картину электрофореза, представляющую результаты типирования методом РСК-КРЬР с использованием геномной ДНК человека в качестве матрицы. Полосы 1 и 2 представляют результаты, полученные для продукта амплификации и продукта амплификации, расщепленного ВатН1, соответственно.

Как видно из фиг. 7Ό, продукт амплификации полностью расщепляется ВатН1. Таким образом, методом РСК-КРЬР также определяют, что аллель для основания 6361 в СУР2С19 геномной ДНК представляет собой гомотип (6360/0). Подтверждается, что результаты, полученные с использованием способа детекции замены основания настоящего изобретения, согласуются с результатами, полученными с использованием обычного типирования δΝΡ методом РСК-КРЬР.

(3) С использованием плазмид 6360, 636А и 6360/А, полученных выше в (1), проверяют способ детекции, предполагая генотип гомологичной хромосомы. Реакцию осуществляют следующим образом. Сначала синтезируют нуклеотиды 6360 и 636А с флуоресцентными метками Кох (АВ1) и Гат (АВ1), присоединенными к 5'-концам, которые различимы друг для друга. Используют смесь, содержащую равные количества нуклеотидов с флуоресцентными метками. Детекцию осуществляют так, как описано выше в (1). По завершении реакции часть каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле для полного отделения продукта амплификации от непрореагировавшего нуклеотида с флуоресцентной меткой. По завершении электрофореза агарозный гель анализируют с использованием ГМ-ВЮ II Ми111-У1ете (Такага δΐιιιζο). В результате, когда в качестве матрицы используют плазмиду 6360, флуоресцентный сигнал наблюдают только от нуклеотида с флуоресцентной меткой Кох. Когда в качестве матрицы используют плазмиду 636А, флуоресцентный сигнал наблюдают только от нуклеотида с флуоресцентной меткой Гат. Кроме того, когда в качестве матрицы используют плазмиду 6360/А, наблюдают флуоресцентные сигналы в случае как с Кох, так и с Гат. На основании полученных результатов подтверждается, что способ настоящего изобретения полезен в качестве способа, который можно использовать для анализа генотипа (гомотипа или гетеротипа) в гомологичной хромосоме.

Пример 8. Типирование с использованием геномной ДНК, экстрагированной из крови.

Геномную ДНК получают с использованием Όγ. 0епТЬЕ™ (Такага 81и^о) из 200 мкл каждого из образцов 1-6 цельной крови, взятых у здоровых индивидуумов после получения официального согласия. Типирование δΝΡ осуществляют так, как описано в примере 7-(1), с использованием 160 нг полученной геномной ДНК в качестве матрицы, а также нуклеотидов δΕΟ ΙΌ Ν0: 28 и 29 в качестве праймеров для специфической детекции аллелей 6360 и 636А. Ре зультаты приводятся на фиг. 8А-Е. Фиг. 8А-Е представляют собой картины электрофореза, представляющие результаты типирований, осуществленных так, как описано в примере 7-(1), с использованием в качестве матрицы геномной ДНК, экстрагированной из образцов 1-6. Полосы 1 и 2 представляют результаты, полученные с использованием нуклеотидов 8ЕО ΙΌ N0: 28 (для детекции 6360) и 8Е0 ΙΌ N0: 29 (для детекции 636А), соответственно. На основании картин электрофореза продуктов амплификации, показанных на фиг. 8А-Е, видно, что аллели соответствующих образцов крови для основания 636 в СУР2С19 типированы следующим образом: (1: 0/А, 2: 0/0, 3: 0/А, 4: 0/0, 5: 0/0, 6: 0/0). С другой стороны, осуществляют типирование методом РСК-КЕЬР, как описано в примере 7-(2), с использованием той же геномной ДНК в качестве матрицы. Результаты приводятся на фиг. 80. Фиг. 80 представляет собой картину электрофореза, представляющую результаты типирования методом РСЯ-КЕЬР с использованием в качестве матриц геномных ДНК, полученных из образцов крови 1-6. Полосы 1-6 представляют результаты, полученные с использованием в качестве матриц геномных ДНК, экстрагированных из образцов крови 1-6 соответственно. На основании результатов электрофореза, показанных на фиг. 80, показывающей картину расщепления продуктов амплификации ПЦР, полученных с использованием в качестве матриц ДНК, полученных из соответствующих образцов крови, видно, что аллели для основания 636 в СУР2С19 типированы следующим образом: (1: 0/А, 2: 0/0, 3: 0/А, 4: 0/0, 5: 0/0, 6: 0/0), что согласуется с результатами, описанными выше.

Как описано выше, подтверждается, что способ настоящего изобретения также эффективен, когда используют практический клинический образец для испытаний.

Промышленная применимость

Нуклеотид настоящего изобретения и способ детекции замены основания с использованием указанного нуклеотида, описанные выше, полезны для детекции замены основания, встречающейся в природе или введенной искусственно.

Согласно настоящему изобретению,в целевой нуклеиновой кислоте наличие замены основания можно определить удобно и воспроизводимо. Способ настоящего изобретения можно легко сочетать с известным способом амплификации нуклеиновой кислоты и можно использовать для детекции замены основания с высокой чувствительностью. Кроме того, используя в сочетании нуклеотиды с соответствующими последовательностями, можно получить информацию о наличии замены основания и в то же время о типе замены основания.

Настоящее изобретение можно использовать для детекции или идентификации замены основания (например, 8ΝΡ), образовавшейся в геномной ДНК организма, такой как полиморфизм или изменчивость. Таким образом, настоящее изобретение полезно в областях разработки геномных лекарственных средств и геномной медицины для исследования гена болезни у людей, анализа устойчивости к лекарственным средствам или подобного.

Текст списка последовательностей на свободном языке

8Е0 ΙΌ Ν0: 1: ген, кодирующий полипептид с активностью РНКазы Н11 из Ругососсик йопкокйй.

8Е0 ΙΌ Ν0: 2: праймер ПЦР 1650Ше для клонирования гена, кодирующего полипептид с активностью РНКазы Н11 из Ругососсик йопкокЫ1.

8Е0 ΙΌ Ν0: 3: праймер ПЦР 1650Ват для клонирования гена, кодирующего полипептид с активностью РНКазы НИ из Ругососсик йопкокЫк

8Е0 ΙΌ Ν0: 6: химерный олигонуклеотидный праймер для амплификации ДНК части гена с-К1-гак человека, нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ Ν0: 7: химерный олигонуклеотид для детекции замены нуклеотида в гене с-К1-гак человека, нуклеотиды 13-15 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами, и группа 3'-ОН нуклеотида в 3'-конце защищена аминогексильной группой.

8Е0 ΙΌ Ν0: 8: химерный олигонуклеотидный праймер для детекции замены нуклеотида в гене с-К1-гак человека, нуклеотиды 12-15 являются рибонуклеотидами, нуклеотид 17 представляет собой инозин - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами, и группа 3'ОН нуклеотида в 3'-конце защищена аминогексильной группой.

8Е0 ΙΌ Ν0: 9: химерный олигонуклеотид для детекции замены нуклеотида в гене с-К1-гак человека, нуклеотиды 14 и 15 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами, и группа 3'-ОН нуклеотида в 3'-конце защищена аминогексильной группой.

8Е0 ΙΌ Ν0: 10: химерный олигонуклеотид для детекции замены нуклеотида в гене с-К1-гак человека, нуклеотиды 13-15 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами, и группа 3'-ОН нуклеотида в 3'-конце защищена аминогексильной группой.

8Е0 ΙΌ Ν0: 11: химерный олигонуклеотид для детекции замены нуклеотида в гене с-К1-гак человека, нуклеотиды 13-15 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами, и группа 3'-ОН нуклеотида в 3'-конце защищена аминогексильной группой.

ЗЕЦ ΙΌ N0: 12: химерный олигонуклеотид для детекции замены нуклеотида в гене с-К1-га§ человека, нуклеотиды 13-15 являются рибонуклеотидами, нуклеотид 17 представляет собой инозин - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами, и группа 3'-ОН нуклеотида в З'-конце защищена аминогексильной группой.

8Е0 ΙΌ N0: 13: последовательность оснований гена АЕ0621 из Агсйаеод1оЬи8 Ги1щйи5.

ЗЕЦ ΙΌ N0: 14: праймер ПЦР АГиШе для клонирования гена, кодирующего полипептид с активностью РНКазы Н11 из Лгсйаеод1оЬи8 Ги1щйи5.

8ЕЦ ΙΌ N0: 15: праймер ПЦР АГиВат для клонирования гена, кодирующего полипептид с активностью РНКазы Н11 из Агсйаеод1оЬи8 Ги1щйи5.

8ЕЦ ΙΌ N0: 16: последовательность оснований 0КЕ в РНКазе НИ из Агсйаеод1оЬи8 Ги1щйи5.

8ЕЦ ΙΌ N0: 17: аминокислотная последовательность РНКазы НИ из Агсйаеод1оЬи8 Ги1щйи5.

8ЕЦ ΙΌ N0: 18: сконструированный праймер ПЦР для амплификации части экзона 1 онкогена с-к1-га§.

8ЕЦ ΙΌ N0: 19: сконструированный праймер ПЦР для амплификации части экзона 2 онкогена с-кьгак.

8ЕЦ ΙΌ N0: 20: сконструированный праймер ПЦР для амплификации части экзона 2 онкогена с-кьгак.

8ЕЦ ΙΌ N0: 21: химерный олигонуклеотид для детекции замены нуклеотида в гене с-К1-га§ человека, нуклеотиды 13-15 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами, и группа 3'-ОН нуклеотида в 3'-конце защищена аминогексильной группой.

8ЕЦ ΙΌ N0: 22: химерный олигонуклеотид для детекции замены нуклеотида в гене с-К1-га§ человека, нуклеотиды 13-15 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами, и группа 3'-ОН нуклеотида в 3'-конце защищена аминогексильной группой.

8ЕЦ ΙΌ N0: 23: химерный олигонуклеотид для детекции замены нуклеотида в гене с-К1-га§ человека, нуклеотиды 13-15 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами, и группа 3'-ОН нуклеотида в 3'-конце защищена аминогексильной группой.

8ЕЦ ΙΌ N0: 24: химерный олигонуклеотид для детекции замены нуклеотида в гене с-К1-га§ человека, нуклеотиды 17-19 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ЕЦ ΙΌ N0: 25: химерный олигонуклеотид для детекции замены нуклеотида в гене с-К1-га§ человека, нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами, и группа 3'-ОН нуклеотида в 3'-конце защищена аминогексильной группой.

8ЕЦ ΙΌ N0: 26: сконструированный праймер ПЦР для амплификации части гена человека СУР2С19.

8ЕЦ ΙΌ N0: 27: сконструированный праймер ПЦР для амплификации части гена человека СУР2С19.

8ЕЦ ΙΌ N0: 28: химерный олигонуклеотид для детекции замены нуклеотида в гене человека СУР2С19, нуклеотиды 13-15 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами, и группа 3'-ОН нуклеотида в 3'-конце защищена аминогексильной группой.

8ЕЦ ΙΌ N0: 29: химерный олигонуклеотид для детекции замены нуклеотида в гене человека СУР2С19, нуклеотиды 13-15 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами, и группа 3'-ОН нуклеотида в 3'-конце защищена аминогексильной группой.

8ЕЦ ΙΌ N0: 30: химерный олигонуклеотидный праймер для амплификации части гена человека СУР2С19, нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ детекции наличия замены основания по специфическому основанию в целевой нуклеиновой кислоте, включающий (1) смешивание образца, содержащего целевую нуклеиновую кислоту, с нуклеотидом, где нуклеотид (A) модифицирован по 3'-концу так, что наращивания с указанного конца с помощью ДНК-полимеразы не происходит;

(B) имеет последовательность оснований, способную отжигаться к участку, содержащему специфическое основание в целевой нуклеиновой кислоте; и (C) содержит последовательность, в которой, если имеется ошибочное спаривание между специфическим основанием и основанием, соответствующим специфическому основанию в нуклеотиде, в комплексе, состоящем из нуклеотида и целевой нуклеиновой кислоты, нуклеотид не расщепляется нуклеазой, а если ошибочного спаривания между специфическим основанием и основанием, соответствующим специфическому основанию в нуклеотиде, не имеется, нуклеотид расщепляется нуклеазой с образованием нового 3'-конца;

2. Способ по п.1, где нуклеаза представляет собой рибонуклеазу Н и нуклеотид содержит рибонуклеотид в участке, содержащем основание, соответствующее специфическому основанию.

3. Способ по п.1, где нуклеаза представляет собой рестриктазу и нуклеотид содержит узнаваемую последовательность для рестриктазы в участке, содержащем основание, соответствующее специфическому основанию.

4. Способ детекции наличия замены основания по специфическому основанию в целевой нуклеиновой кислоте, включающий (1) смешивание образца, содержащего целевую нуклеиновую кислоту, с нуклеотидом, где нуклеотид (A) модифицирован по 3'-концу так, что наращивания с указанного конца с помощью ДНК-полимеразы не происходит;

5. Способ по п.4, где нуклеаза представляет собой нуклеазу, специфичную в отношении ошибочного спаривания.

6. Способ по п.1 или 4, где нуклеотид содержит последовательность, в которой, если замена основания в целевой нуклеиновой кислоте отсутствует, ошибочного спаривания в комплексе, состоящем из нуклеотида и целевой нуклеиновой кислоты, не происходит.

7. Способ по п.1 или 4, где нуклеотид содержит последовательность, в которой, если имеется замена основания в целевой нуклеиновой кислоте, ошибочного спаривания в комплексе, состоящем из нуклеотида и целевой нуклеиновой кислоты, не происходит.

8. Способ по п.1 или 4, где расщепление нуклеотида определяют на основании наличия продукта наращивания, образовавшегося под действием ДНК-полимеразы.

9. Способ по п.1 или 4, где расщепление нуклеотида определяют на основании наличия фрагмента 3'-части, выделенного из нуклеотида, образовавшегося под действием нуклеазы.

10. Способ по п.1 или 4, где расщепление нуклеотида определяют с использованием со единения-метки, присоединенного к нуклеотиду.

11. Способ по п.10, где соединение-метку присоединяют к нуклеотиду в 3'-части к сайту расщепления нуклеазой.

12. Способ по п.10, где соединение-метку присоединяют к нуклеотиду в 5'-части к сайту расщепления нуклеазой.

13. Способ по п.10, где соединение-метка, присоединенное к нуклеотиду, представляет собой флуоресцентное вещество.

14. Способ по п.13, где к нуклеотиду также присоединяют вещество, способное тушить флуоресценцию, и флуоресценция испускается после расщепления нуклеазой.

15. Способ по п.13, где расщепление нуклеотида определяют методом поляризации флуоресценции.

16. Способ по п.1 или 4, где модификация нуклеотида по 3'-концу является модификацией гидроксильной группы в положении 3 рибозы.

17. Способ по п.1 или 4, где нуклеотид содержит аналог нуклеотида и/или модифицированный нуклеотид.

18. Способ по п.17, где аналог нуклеотида представляет собой дезоксирибоинозиннуклеотид или дезоксирибоурацилнуклеотид и модифицированный рибонуклеотид представляет собой (а-8)-рибонуклеотид.

19. Способ по п.1 или 4, дополнительно включающий стадию амплификации нуклеиновой кислоты, на которой в качестве матрицы используют продукт наращивания, образовавшийся под действием ДНК-полимеразы.

20. Способ анализа генотипа аллеля, включающий детекцию наличия замены основания по специфическому основанию в целевой нуклеиновой кислоте способом по п.19.

21. Нуклеотид, используемый в способе детекции по пп.1-19, отличающийся тем, что (A) модифицирован по 3'-концу так, что наращивания с указанного конца с помощью ДНК-полимеразы не происходит;

22. Нуклеотид по п.21, содержащий рибонуклеотид в участке, содержащем основание, соответствующее специфическому основанию, где, если ошибочного спаривания между специфическим основанием и основанием, соответствующим специфическому основанию в нуклеотиде, в комплексе, состоящем из нуклеотида и целевой нуклеиновой кислоты, не имеется, нуклеотид расщепляется рибонуклеазой Н.

23. Нуклеотид по п.21, содержащий последовательность, узнаваемую для рестриктазы, в участке, содержащем основание, соответствующее специфическому основанию, где, если ошибочного спаривания между специфическим основанием и основанием, соответствующим специфическому основанию в нуклеотиде, в комплексе, состоящем из нуклеотида и целевой нуклеиновой кислоты, не имеется, нуклеотид расщепляется рестриктазой.

24. Нуклеотид, используемый в способе детекции по пп.1-19, отличающийся тем, что (A) модифицирован по 3'-концу так, что наращивания с указанного конца с помощью ДНК-полимеразы не происходит;

(B) имеет последовательность оснований, способную отжигаться к участку, содержащему специфическое основание в целевой нуклеиновой кислоте; и (C) содержит последовательность, в которой, если ошибочного спаривания между специфическим основанием и основанием, соответствующим специфическому основанию в нуклеотиде, в комплексе, состоящем из нуклеотида и целевой нуклеиновой кислоты, не имеется, нуклеотид не расщепляется нуклеазой, а если ошибочное спаривание между определенным основанием и основанием, соответствующим специфическому основанию в нуклеотиде, имеет место, нуклеотид расщепляется нуклеазой с образованием нового 3'-конца.

25. Нуклеотид по п.24, где, если ошибочное спаривание нуклеотидом и целевой нуклеиновой кислотой в комплексе, состоящем из нуклеотида и целевой нуклеиновой кислоты, имеет место, нуклеотид расщепляется нуклеазой, специфичной в отношении ошибочного спаривания.

26. Нуклеотид по п.21 или 24, имеющий последовательность, в которой, если замены основания в целевой нуклеиновой кислоте не имеется, ошибочного спаривания в комплексе, состоящем из нуклеотида и целевой нуклеиновой кислоты, не происходит.

27. Нуклеотид по п.21 или 24, имеющий последовательность, в которой, если замена основания в целевой нуклеиновой кислоте имеется, ошибочного спаривания в комплексе, состоящем из нуклеотида и целевой нуклеиновой кислоты, не происходит.

28. Нуклеотид по п.21 или 24, к которому присоединяют соединение-метку.

29. Нуклеотид по п.28, где соединениеметку присоединяют к нуклеотиду в части 3' к сайту расщепления для нуклеазы.

30. Нуклеотид по п.28, где соединениеметку присоединяют к нуклеотиду в части 5' к сайту расщепления для нуклеазы.

31. Нуклеотид по п.28, где соединениеметка представляет собой флуоресцентное вещество.

32. Нуклеотид по п.31, к которому также присоединяют вещество, способное тушить флуоресценцию, где флуоресценция испускается после расщепления нуклеазой или наращивания ДНК после расщепления.

33. Нуклеотид по п.21 или 24, где модификация нуклеотида по 3'-концу является модификацией гидроксильной группы в положении 3' рибозы.

34. Нуклеотид по п.21 или 24, содержащий аналог нуклеотида и/или модифицированный нуклеотид.

35. Нуклеотид по п.34, где аналог нуклеотида представляет собой дезоксирибоинозиннуклеотид или дезоксирибоурацилнуклеотид, и модифицированный рибонуклеотид представляет собой (а-8)-рибонуклеотид.

36. Набор, используемый для детекции замены основания в целевой нуклеиновой кислоте, содержащий нуклеотид по п.21 или 24.

37. Набор по п.36, содержащий нуклеазу и/или ДНК-полимеразу.

38. Набор по п.36, дополнительно содержащий реагент для детекции наличия наращивания ДНК.

39. Набор по п.36, дополнительно содержащий реагент для осуществления способа амплификации нуклеиновой кислоты.