CZ298187B6 - Oligonukleotidový primer schopný párování s nukleotidovou sekvencí a pouzití tohoto oligonukleotidového primeru - Google Patents
Oligonukleotidový primer schopný párování s nukleotidovou sekvencí a pouzití tohoto oligonukleotidového primeru Download PDFInfo
- Publication number
- CZ298187B6 CZ298187B6 CZ0321397A CZ321397A CZ298187B6 CZ 298187 B6 CZ298187 B6 CZ 298187B6 CZ 0321397 A CZ0321397 A CZ 0321397A CZ 321397 A CZ321397 A CZ 321397A CZ 298187 B6 CZ298187 B6 CZ 298187B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- dna
- restriction
- fragments
- primers
- oligonucleotide
- Prior art date
Links
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 title claims abstract description 122
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 121
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 59
- 230000013011 mating Effects 0.000 title abstract 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 299
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 293
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 17
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 10
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 9
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 98
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 claims description 11
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 65
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 65
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 188
- 238000000034 method Methods 0.000 description 86
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 51
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 42
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 34
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 33
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 33
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 31
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 29
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 28
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 27
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 26
- 239000000047 product Substances 0.000 description 26
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 22
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 20
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 19
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 19
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 17
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 13
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 13
- 239000000463 material Substances 0.000 description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 13
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 12
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 12
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 11
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 11
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 11
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 11
- 241000208822 Lactuca Species 0.000 description 10
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 241000894007 species Species 0.000 description 10
- 230000009471 action Effects 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 8
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 101100148606 Caenorhabditis elegans pst-1 gene Proteins 0.000 description 6
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 6
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 6
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 5
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 240000005993 Lactuca saligna Species 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 5
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 5
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 4
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 4
- 241001293495 Lactuca virosa Species 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 3
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 3
- 230000008836 DNA modification Effects 0.000 description 3
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 3
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 3
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 3
- 241000589636 Xanthomonas campestris Species 0.000 description 3
- 208000005652 acute fatty liver of pregnancy Diseases 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000836337 Homo sapiens Probable helicase senataxin Proteins 0.000 description 2
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 2
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 2
- 102100027178 Probable helicase senataxin Human genes 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- BQJCRHHNABKAKU-KBQPJGBKSA-N morphine Chemical compound O([C@H]1[C@H](C=C[C@H]23)O)C4=C5[C@@]12CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C4O BQJCRHHNABKAKU-KBQPJGBKSA-N 0.000 description 2
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 20-hydroxyecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)(O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 101100519161 Arabidopsis thaliana PCR5 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 240000002989 Euphorbia neriifolia Species 0.000 description 1
- 229920006063 Lamide® Polymers 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 101150101654 PSR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 108020005120 Plant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282894 Sus scrofa domesticus Species 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000082085 Verticillium <Phyllachorales> Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid group Chemical group C(C=C)(=O)O NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 238000005266 casting Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000011365 genetic imprinting Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000004922 lacquer Substances 0.000 description 1
- 229940059904 light mineral oil Drugs 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000009149 molecular binding Effects 0.000 description 1
- 229960005181 morphine Drugs 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 235000012045 salad Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
- C12Q1/683—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism involving restriction enzymes, e.g. restriction fragment length polymorphism [RFLP]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Dental Preparations (AREA)
- Purification Treatments By Anaerobic Or Anaerobic And Aerobic Bacteria Or Animals (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Power Conversion In General (AREA)
- Auxiliary Devices For Music (AREA)
- Reverberation, Karaoke And Other Acoustics (AREA)
- Diaphragms For Electromechanical Transducers (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
Abstract
Oligonukletidový primer schopný párování s nukleotidovou sekvencí obsahující (i) konstantní sekvenci obsahující adaptorovou sekvenci, pricemz tento adaptor predstavuje dvouretezcový syntetický oligonukleotid, jehoz jeden konec je kompatibilní pro ligaci s jedním nebo obema konci restrikcního fragmentu získaného stepením výchozí DNA prinejmensím jednou specifickou endonukleázou; a cást rozpoznávací sekvence uvedené specifické restrikcní endonukleázy; (ii) a bezprostredne vedle 3'-konce této rozpoznávací sekvence 1 az 10 selektivních nukleotidu.Do rozsahu resení rovnez nálezí pouzití tohoto oligonukleotidu jako selektivního primeru pro elongaci nebo amplifikaci podskupiny oznacených restrikcních fragmentu získaných z výchozí DNA, nebo pro identifikaci polymorfizmu mezi ruznými výchozími DNA ze stejné skupiny zivých organizmu, pri níz se identifikují rozdíly mezi amplifikovanými restrikcními fragmenty ruzných výchozích DNA, nebo pro identifikaci polymorfizmu DNA genomu mikroorganizmu, rostliny nebo zivocicha, vcetne cloveka, nebo fragmentu této DNA, vzájemne nebo ve vztahu k odpovídající predem stanovené standardní DNA.
Description
Oligonukleotidový primer schopný párování s nukleutidovou sekvencí a použití tohoto oligonukleotidového primerů
Oblast techniky
Vynález sc týká oligonukleotidového primerů schopného párování s nukleotidovou sekvencí a použití tohoto oligonukleotidového primerů jako selektivního primerů pro elongaci nebo amplifikaci podskupiny označených restrikčních fragmentu získaných z výchozí DNA. nebo pro identifikaci polymorfízmu mezi různými výchozími DNA ze stejné skupiny živých organizmů, nebo pro identifikaci polymorfízmu DNA genomu mikroorganizmu, rostliny nebo živočicha nebo fragmentů teto DNA.
Vynález spadá do oboru aplikace otisků DNA a detekce specifického značení DNA v gcnomech od mikroorganismů až k vyšším rostlinám, živočichům a člověku. S vynálezem rovněž souvisí syntetické molekuly DNA a produkty na jejich bázi pro použití v různých oborech.
Dosavadní stav techniky
Využívání otisků DNA, stejně jako další metody pro mapování genů, identifikaci a analýzu DNA se týkají charakterizace podobnosti nebo odlišnosti genetického základu nebo genomu jednotlivce, variety nebo rasy nebo druhu. Obecným pravidlem jc, že čím bližší je genetická příbuznost, tím větší je podobnost genomu, v důsledku toho budou odlišnosti genomů vzájemnější. Tyto podobnosti nebo odlišnosti je možno odhalit analýzou DNA po jejím rozštěpení pomocí restrikčních endonuklcáz. Restrikční endonukleázy jsou enzymy, které rozpoznávají krátké řetězce nukleotidů, obvykle 4 až 8 bází. Jejich působením dochází k rozštěpení obou řetězců DNA za vzniku fragmentů DNA s určitou délkou. Vzhledem k vysoké specifičnosti těchto řetězců je DNA štěpena restrikčními endonukleázami velmi specifickým způsobem. Výsledkem je, že vzniká reprodukovalelná sestava fragmentů. Fragmenty DNA jc možno frakcionovat podle jejich délky na porézních matricích nebo gelech, čímž dochází ke vzniku typických pásů, které tvoří otisk DNA v genetickém základu organismu.
V případě že se porovnávají otisky velmi blízce příbuzných druhů, variet nebo ras mohou být získané otisky totožné nebo velmi podobné. V případě, že jsou pozorovány rozdíly u jinak identických otisků DNA, hovoří se o póly morfii DNA. Jde o nové fragmenty DNA, které sc objevují v otisku. DNA je pak v této poloze polymorfní a nový fragment DNA je možno využít jako DNA markér. Polymorfie DNA detekovaná v otiscích DNA získaných pomocí štěpení restrikčními enzymy může být způsobena kteroukoliv z následujících změn v řetězci DNA: mutace, které odstraní rozpoznávací místo restrikční endonukleázy. mutace, jejichž důsledkem je vznik nových rozpoznávacích míst, inserce, dclccc nebo inverze mezi dvěma restrikčními místy.
Polymorfismus DNA tohoto typu se obecně označuje jako RFLP, polymorfismus délky restrikčních fragmentů (Jlestriction Fragment Lengih Polymorphisms). Takové změny, které jsou důsledkem mutací sc budou chovat jako neškodné genetické markéry v případě, že se budou dědit dědičností Mendelova typu. V důsledku toho je možno polymorfismus DNA využít jako genetické markéry obdobným způsobem jako jakékoli jiné genetické markéry': při průkazu rodičovství, při genetických studiích, týkajících se dědičnosti různých vlastností a také v různých případech identifikace jednotlivců.
V případě téměř všech živých organismů s výjimkou virů vzniká při restrikčním štěpení veškeré DNA genomu organizmu tak velké množství pásů, že není možné vyhodnotit obsah všech těchto pásů. Z tohoto důvodu jsou všechny metody pro detekování DNA založeny na principu, při jehož provádění se vizualizuje jen malá frakce fragmentů DNA, takže vzniklá jednoduchá sestava pásů, která tvoří otisk DNA.
Nej rozšířenější postup spočívá v tom. že se DNA organismu rozštěpí působením restrikčních endonukleáz, restrikční fragmenty se podrobí frakci onač i při použití elektroforézv na gelu, fragmenty frakcionované DNA se přenesou a navážou na membrány, načež se membrána 5 hybrid i zuje specifickým fragmentem DNA (..sonda’'). Fragmenty' DNA vytvoří dvoj řetězcovou molekulu DNA s DNA fragmentem (nebo fragmenty) 11a membráně s obsahem komplementárních nukleotidových řetězců. V případě, že jc sonda opatřena značkou s vizualizovatclným markérem, je možno vizualizovat také fragment DNA, s nímž je sonda spojena. Tento postup sc obvykle označuje jako hybridizace Southcrnova typu nebo Sothern blot. V případě, že jc možno ίο prokázat rozdíly ve velikosti odpovídajících restrikčních fragmentů, na něž se sonda váže v blízce příbuzných molekulách DNA genomu, označují se tyto rozdíly jako polymorfismus. specificky polymorfismus délky restrikčních fragmentů. Rozdíly v délce restrikčních fragmentů odpovídají různým alclovým formám genetického místa, kterc jsou rozpoznávány sondou. Přestože je Southernova methoda otiskována DNA široce používána, je tato metoda velmi pracná a velmi 15 náročná na čas.
Mimoto má tato metoda malou rozlišovací schopnost a je tedy možno ji použít pouze k vyhodnocování jednotlivých míst nebo malého množství míst maximálně v jedné reakci.
Technika PCR (řetězová reakce s použitím polymerázy) je metody pro syntézu specifických fragmentů DNA in vitro. Metoda je založena na použití specifických oligonukleotidú, kterc se mohou vázat na určité specifické řetězce v molekule DNA a na použití DNA-polymerázy, stálé při vyšší teplotě. Oligonukleotid}’ jsou zkonstruovány tak, žc se mohou vázat na opačné konce řetězce DNA a slouží jako primery při syntéze DNA takovým způsobem, žc každý z nich povede 25 k syntéze nových řetězců DNA. To znamená, že v průběhu jednoho cyklu syntézy se vytvoří mezi primery úplná kopie molekuly DNA, přičemž DNA mezi primery je zdvojena. V průběhu každého cyklu syntézy DNA tak dochází ke zdvojení množství DNA, což vede kamplifikace DNA mezi oběma primery. V důsledku toho může technika PCR umožnit syntézu přesného segmentu DNA při použití jen malého množství „substrátové DNA'.
Podstata vynálezu
Podstatou předmětného vynálezu je oligonukleotidový primer schopný párování s nukleotidovou 35 sekvencí obsahující (í) konstantní sekvenci obsahující adaptorovou sekvenci, přičemž tento adaptor představuje dvouřctčzcový syntetický oligonukleotid. jehož jeden konec je kompatibilní pro lígaci sjedním nebo oběma konci 40 restrikčního fragmentu získaného štěpením výchozí DNA přinejmenším jednou specifickou endonukleázou, a část rozpoznávací sekvence uvedené specifické restrikční endonukleázy (ii) a bezprostředně vedle 3'-koncc této rozpoznávací sekvence I až 10 selektivních nukleotidů.
Tento oligonukleotid výhodně obsahuje 10 až 50 nukleotidu, přičemž rozpoznávací sekvence restrikční endonukleázy obsahuje 4 až 8 nukleotidů. Dále je výhodné jestliže konstantní řetězec obsahuje 10 až 30 nukleotidů.
Výhodný je podle předmětného vynálezu oligonukleotid výše uvedeného typu, který obsahuje konstantní sekvenci, která obsahuje na 5'-konci nukleotidovč sekvence schopné párování s částí rozpoznávací sekvence restrikční endonukleázy v restrikčním fragmentu nukleotidovou sekvenci schopnou párování s přinejmenším částí adaptorovc sekvence připojené na konci restrikčního fragmentu.
Dále je výhodný oligonukleotid výše uvedených typů obsahující 1,2 nebo 3 zvolené nukleotidy. Rovněž jc dále výhodný oligonukleotid. který je označen.
Nukleotidová sekvence dvou řetězcového syntetického oligonukleotidového adaptoru je ve výhodném provedení podle předmětného vynálezu konstruována tak. že rozpoznávací místo restrikční endonukleázy není po Iigaci regenerováno.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží použití libovolného výše specifikovaného olígonukleotidu jako selektivního primerů pro elongaci nebo amplifíkaci podskupiny označených restrikčních fragmentů získaných z výchozí DNA.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží použití libovolného výše specifikovaného oligonukleotidu pro identifikaci polvmorfizmu mezi různými výchozími DNA ze stejné skupiny živých organizmů, při níž se identifikují rozdíly mezi amplifikovánými restrikčními fragmenty různých výchozích DNA.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží použití libovolného výše specifikovaného oligonukleotidu pro identifikaci polvmorfizmu DNA genomu mikroorganizmu, rostliny nebo živočicha, včetně člověka, nebo fragmentů této DNA. vzájemně nebo ve vztahu k odpovídající předem stanovené standardní DNA.
Řešení podle vynálezu souvisí se způsobem amplifikace restrikčních fragmentů, které byly získány po rozštěpení DNA určitého organismu pomocí alespoň jednoho restrikčního enzymu, při použití PCR. Při této amplifíkaci metody PCR nejsou použiti nukleotidy namířeny proti známému řetězci DNA, avšak jsou zkonstruovány tak, že rozpoznávají zakončení restrikčního fragmentu. K tomuto účelu je zapotřebí modifikovat lato zakončení restrikčních fragmentů navázáním oligonukleotidových linkerú (adaptorů). Důvodem pro toto opatření jc skutečnost, že konce restrikčních enzymů mají obvykle pouze několik nukleotidů (2 až 8 nukleotidů), což je příliš málo pro použití těchto struktur jako primerů při amplifíkaci pomocí PCR.
Tato metoda amplifikace přinejmenším jednoho restrikčního fragmentu z výchozí DNA spočívá v tom, že se (a) výchozí DNA štěpí přinejmenším jednou restrikční endonukleázou a získají se restrikění fragmenty, (b) získané restrikční fragmenty se ligují s alespoň jedním syntetickým dvou řetězcovým oligonukleotidovým adaptorem, jehož jeden konec je kompatibilní pro ligaci s jedním nebo oběma konci restrikčních fragmentů, čímž se připraví označené restrikční fragmenty, (c) získané označené restrikční fragmenty se za hybridizačních podmínek přivedou do kontaktu s alespoň jedním oligonuklcotidovým primerem, přičemž tento primer nebo primery obsahují nuklcotidovou sekvenci párující s částí rozpoznávací sekvence restrikční endonukleázy přítomné v označeném restrikčním fragmentu a také párující s částí adaplorové sekvence, přičemž alespoň jeden z uvedených primerů obsahuje na svém 3-konci zvolenou sekvenci obsahující přinejmenším jeden nukleotid umístěný bezprostředně vedle nukleotidů účastnících se vytvoření dané rozpoznávací sekvence, (d) označené restrikční fragmenty hybridizované na uvedený primer nebo primery se ampl i fí kují v přítomnosti požadovaných nukleotidů a DNA polymerázy nebo se provede elongace těchto hybridizovaných primerů podél označených restrikčních fragmentů, a (e) amplifikované nebo elongovanc DNA fragmenty získané ve stupni (d) se identifikují nebo izolují.
- .·> CZ 298187 B6
Vynález je založen na použití nové aplikace-PCR-rcakce pro amplifikaci jednoho nebo většího počtu restrikčních fragmentů, získaných z komplexní směsi fragmentů DNA, získaných rozštěpením molekul DNA genomu působením restrikčních endonukleáz. Jednou ze zvláštních výhod vynálezu je umožnění amplifikace restrikčních fragmentů DNA v situacích, v nichž řetězec nukleo5 tidů na 5-konci a 3-konci není stanoven. V takových případech není možno definovat obvyklé řetězce specifických prímerů, hybridizující na každý ze řetězců restrikčního fragmentu, který má být arnplifikován a není tedy také možno použít žádnou ze známých amplifikačních metod.
Tuto metodu amplifikace jc možno použít například dvěma různými způsoby, které vedou ke in dvěma různým typům konečných aplikací těchto postupů:
(1) Metody pro otiskování DNA genomu tak, že se náhodně vybere podskupina jednoho nebo většího počtu restrikčních fragmentu, které mají být amplifikovány metodou použití při prováděni těchto postupu a některé aplikace uvedených metod, kterými mohou být například použily v kriminalistice pro otiskování DNA, identifikace mikroorganismů, identifikace odrůd, analýza i? plemen a vyšetřování DNA markérů vázaných na genetické prvky.
(2) Metody pro identifikaci jednoho nebo většího počtu předem vybraných fragmentů DNA, které mohou být polymorfní, při použití PCR-amplifikace. Vynález tedy zahrnuje specifické synthetické oligonukleotidy použitelné k provádění těchto postupů a některé aplikace těchto metod, kterými mohou být například sériové vyšetřování geneticky podmíněných chorob u lidí, sledováni dědičnosti agronomicky využitelných vlastností u rostlin a u živočichů při chovu a průkaz původce u infekčních onemocnění.
Přehled obrázků na výkresech
Na obr. 1 je obecně graficky znázorněn způsob PCR-amplifikace označených restrikčních fragmentů, získaných štěpením DNA genomu působením restrikčních endonukleáz.
Na obr. 2 je znázorněn způsob ligace adaptorů na odlišné konce restrikčních fragmentů: posunutá 30 zakončení a vyplněná zakončení.
Na obr. 3 je znázorněna PCR-amplifikace označených restrikčních fragmentů. Oblasti, označené orámování, jsou adaptory, které jsou ligo vány na restrikční fragmenty a primery, které jsou použity při provádění PCR-amplifikace. Šipky označují směr syntézy DNA.
Na obr. 4 jc graficky znázorněno provádění PCR-amplifikace na označených restrikčních fragmentech.
Na obr. 5 je obecně znázorněna konstrukce selektivních primerů, které je možno použít při 4o uskutečnění PCR-amplifikace označených restrikčních fragmentů. Šipkami jsou označeny obrácené opakující se řetězce na koncích restrikčních fragmentu. Selektivita primerů je ilustrována na dvou příkladech, v jednom z nich dochází k přesnému souladu a ve druhém z nich k úplnému nesouhlasu mezi selektivní sekvencí a sekvencí restrikčního fragmentu matricové DNA.
Na obr. 6 jc znázorněn princip uskutečnění PCR-amplifikace při použití PCR-primeru, který volí molekuly matricové DNA s trinukleotidovým řetězcem, uloženým v bezprostřední blízkosti řetězce adaptoru.
Na obr. 7 je znázorněn průběh selektivní PCR-amplifikace, prováděné na označených 50 restrikčních fragmentech.
Na obr. 8 jc znázorněn princip amplifikace specifické pro fragmenty při použití kombinace dvou PCR-primerů, z nichž každý obsahuje 6 selektivních bází. Každý z primerů vytváří dvouřctčzco-4CZ 298187 B6 vou strukturu v různých řetězcích rcsirikčních fragmentů, takže vzniká komplex primer/matrice. z něhož může být zahájena syntéza DNA. jak je naznačeno šipkami.
Na obr. 9 jsou znázorněny obecné prvky řetězce, které jsou rozpoznávány při provádění ? amplifikace, selektivní pro restrikční fragmenty včetně dvou nukleotidových řetězců, které jsou rozpoznávány a včetně vzdálenosti, která oba tyto řetězce od sebe odděluje.
Na obr. 10 jsou znázorněny typy variací nukleotidových sekvencí, které je možno prokázat při postupu identifikace polymorfismu délky amplifikovaných fragmentů.
Na obr. 11 je znázorněn 1,0% agarozový gel s analýzou výsledků, získaných amplifikací DNA rajčete po rozštěpení restrikčním enzymem Pstl při použiti se zvyšující se selektivitou.
Na obr. 12 je znázorněn 1,0% agarozový gel s analýzou výsledků, získaných specifickou ampli1? fikací tří navzájem odlišných fragmentů DNA rajčete po rozštěpení restrikčním enzymem Pstl pří použití primerů, specifických pro fragmenty.
Na obr. 13 je znázorněn gel, obsahující 2,5% polyakry lamidu a 1 % agarozy s DNA otisky, získanými selektivní amplifikací restrikčních fragmentů u dvou linií rajčat.
Na obr. 14 je znázorněna část 4.5% denaturačního polyakrylamidového gelu s DNA otisky ze 4 linií rajčat při použití SRFA a kombinace restrikčních enzymů Pstl/Msel.
Na obr. 15 jc znázorněna část 4,5% denaturačního polyakrylamidového gelu s DNA otisk 2.5 z 10 linií Lactuca při použití SRFA a kombinace restrikčních enzymů Pstl/Msel.
Na obr. 16 je znázorněna část 4,5% denaturačního polyakrylamidového gelu pro 2 linie kukuřice při použití SRFA a kombinace restrikčních enzymů Pstl/TaqI a EcoRI/Taql.
Na obr. 17 je znázorněna část 4,5% denaturačního polyakrylamidového gelu s DNA otisky ze 26 kmenů Xanthomonas campestris s použití SRFA a kombinace restrikčních enzymů Apal/Taql.
Na obr. 18 je znázorněna část 4,5% denaturačního polyakrylamidového gelu a DNA otisky, odebranými různým jednotlivcům 4 druhů domácích zvířat: použita byla kuřata, vepř, kráva a 35 kůň, postup byl uskutečněn při použití SRFA a kombinace restrikčních enzymů Sscl/Msel.
V popisu předmětného vynálezu a v následujících příkladech je užita celá řada pojmů. Aby bylo možno zajistit jasné porozumění popisné části i patentových nároků včetně rozsahu vynálezu, bude dále osvětlena řada pojmů:
Restrikční endonukleáza nebo restrikční enzym je enzym, který rozpoznává specifickou sekvenci (rozpoznávací sekvence nebo místo) ve dvouřctězcové molekule DNA, přičemž při použití tohoto enzymu dojde ke štěpení obou řetězců molekuly DNA v každém z těchto rozpoznávacích míst.
- Restrikční fragmenty: molekuly DNA, produkované štěpením působením restrikčním endonukleázy sc označují jako restrikční fragmenty. Jakýkoliv daný genom se bude štěpit určitou restrikční endonukleázou na určitou vymezenou skupinu restrikčních fragmentů. Fragmenty DNA, které jsou výsledkem štěpení restrikční endonukleázou jc možno rozdělit a identifikovat pomocí gelové elektroforézy.
Polyrnorfisinus délky restrikčních fragmentů (RFLP): DNA genomu dvou blízce příbuzných organismů, bude vykazovat určité rozdíly mezi složením jednotlivých nukleotidových řetězců na řadě míst. V případě, že se tyto rozdíly vyskytnou v rozpoznávacím místě pro určitou restrikční endonukleázu. nebude se tato modifikovaná rozpoznávací sekvence štěpit v tomto místě. Stejným 55 způsobem ovšem může dojít také k takové modifikaci řetězce, při níž vznikne nová rozpoznávací
- 5 CZ 298187 B6 sekvence, která neexistuje u jiných organismů, a v tomto místě pak dojde ke štěpení řetězce DNA příslušným restrikčním enzymem. Alternativně bude inserce nebo dclece nukleotidů vyskytující se v jednom organizmu mezi dvěma rozpoznávacími místy pro restrikční endonukleázu modifikovat vzdálenost mezi těmito rozpoznávacími místy. V důsledku těchto skutečností může při 5 štěpení DNA dvou organismů dojít ke vzniku rcstrikčních fragmentů s různou délkou. Dojde tedy k polymorfismu v délce restrikčních fragmentů, produkovaných štěpením DNA dvou uvedených organismů.
Gclová elektroforéza: Aby bylo možno prokázat přítomnost restrikčních fragmentů je 10 zapotřebí použít analytické metody pro frakci onač i molekul DNA s dvojitým řetězcem podle rozměrů těchto fragmentů. Nejběžněji užívanou technikou pro dosažení této frakcionacc je elektroforéza na gelu. Rychlost, sniž se fragmenty DNA v takovém gelu pohybují závisí na jejich velikosti. Znamená to. že čím je fragment větší, tím kratší je jeho dráha od společného počátku. Fragmenty DNA frakcionované elektroforézou na gelu jc možno přímo vizualizovat například 15 barvením v případě, že množství odlišných fragmentů ve vzorku není veliké.
Synthetické oligonukleotidy: jednořetězcové molekuly DNA obsahují s výhodou 10 až 50 bází a syntetizovatelné chemickou cestou se označují jako synthetické oligonukleotidy. Obecně jsou tyto synthetické molekuly DNA konstruovány tak, aby obsahovaly jediný nukleotidový 20 řetězec, přestože je možno syntetizovat skupiny molekul, které mají příbuzné řetězce a které současně mají odlišné složení nukleotidů ve specifických polohách v rámci nukleotidového řetězce. Pojem synthetickcho oligonukleotidu tedy bude užíván pro ty molekuly DNA, které mají jedinečnou nukleotidovou sekvenci. Pojem smíšené oligonukleotidy bude dále užíván pro skupiny příbuzných syntetických oligonukleotidu,
Ligace: enzymatická reakce, katalyzovaná enzymem ligázou, při níž jsou dvě dvouřetčzcové molekuly DNA spolu kovalentně spojeny se označuje jako ligace (vazba). Obecně jsou spolu oba řetězce DNA kovalentně spojeny, je však také možné zabránit ligací jednoho z těchto dvouřetězců chemickou nebo enzymatickou modifikací jednoho z obou zakončení. V tomto případě dojde 30 ke kovalentní vazbě pouze na jednom z těchto dvou řetězců DNA.
Adaptory krátké dvouřetčzcové molekuly DNA s omezeným počtem párů bází, například 10 až 30 párů bází, zkonstruované takovým způsobem, aby bylo možno je navázat na konce restrikčních fragmentů. Adaptory jsou složeny zc dvou synthetických oligonukleotidu. jejichž 35 nukleotidové řetězce jsou vzájemně částečně komplementární. V případě, že sc tyto dva syntetické oligonukleotidy smísí, vytvoří strukturu s dvojitým řetězcem v roztoku za příslušných podmínek. Jedno ze zakončení molekuly adaptoru jc konstruováno tak, žc může být navázáno na zakončení rcslrikčního fragmentu, druhé z obou zakončení je konstruováno tak, že není možné je navázat.
PCR-rcakce. řetězová reakce s použitím polymerázy: jde o enzymatickou reakci, při níž jsou fragmenty DNA syntetizovány ze substrátové DNA in vitro. Při reakci se užívá dvou synthetických oligonukleotidu, jejichž řetězce jsou komplementární vzhledem k nukleotidovému řetězci v molekulách DNA, které jsou od sebe odděleny několika sty až několika tisíci párů bází a 45 dále sc užívá DNA-polymcrázy. odolné proti působeni tepla. Řetězová reakce například může být tvořena sérií 10 až 30 cyklů. V každém z těchto cyklu je DNA substrátu nejprve denaturována při vysoké teplotě. Po zchlazení materiálu budou synthetické oligonukleotidy, které jsou přítomny ve velkém přebytku, v roztoku vytvářet dvouřetčzcové struktury' s molekulami substrátové DNA na specifických místech molekul substrátové DNA. které mají komplementární 50 nukleotidové sekvence. Komplexy oligonuklcotid-substrátová DNA pak budou sloužit jako iniciační místa pro další syntézu DNA, katalyzovanou enzymem DNA-polymcrázou. Tímto způsobem je syntetizován nový řetězec DNA. který je komplementárním řetězcem pro původní řetězce substrátové DNA.
-6CZ 298187 B6
Amplifikace DNA: Pod tímto pojmem se označuje způsobem syntézy nových molekul DNA s dvojitým řetězcem in vitro při použití PCR-reakce tak, jak byla vysvětlena v předchozím odstavci. Produkty této PCR-reakce se pak označují jako amplifikované fragmenty7 DNA.
Příměry: Obecně se termín primer užívá pro řetězec DNA, který může podnítit syntézu nového řetězce DNA. DNA-polymeráza nemůže totiž syntetizovat novou DNA bez primerů. Může pouze prodlužovat existující řetězec DNA při reakci, v níž je komplementární řetězec použit jako matrice, která řídí pořadí, v němž budou nukleotidy navázány. Jako příměry budou v následujícím textu označovány molekuly synthetických oligonuklcotidů. které se užívají pří PCR-reakci k zahájení reakce.
Southernova hybridizace: Účelem Southernovy hybridizace, která se často označuje také jako Southcrn blot je fyzikální přenos DNA frakcionované na agarozovem gelu na nosič, například na nylonovou membránu nebo na nitrocelulóžový filtrační papír za současného uchování relativní polohy fragmentů DNA tak. jak k ní došlo v průběhu frakcionaěního postupu. Postupem, jehož se využívá pro přenos z agarozového gelu na nosič je kapilární síla.
Hybridizace nukleových kyselin: Hybridizace nukleových kyselin se užívá k detekci příbuzných řetězců DNA hybridizací jednořctčzcové DNA na nosiči, například na nylonové membráně nebo na nitrocelulózovém filtračním papíru. Molekuly nukleových kyselin, které mají komplementární řetězce budou znovu vytvářet svou strukturu s dvojitým řetězcem v případě, že budou smíseny v roztoku za příslušných podmínek. Dvojitá struktura řetězce se vytvoří mezi dvěma komplementárními nukleovými kyselinami s jednoduchým řetězcem i v případě iniobilizacc na nosič. V průběhu Southernovy hybridizace k této situaci dochází.
- Hybridizační sonda: aby bylo možno detekovat určitý řetězec DNA při Southernově hybridizaci, nechá se reagovat značená molekula DNA neboli hybridizační sonda s frakcionovanou DNA, vázanou na nosič, například na nylonovou membránu nebo na nitrocelu lóžový filtrační papír. Oblasti filtru, které nesou řetězec DNA, komplementární ke značené sondě DNA budou samovolně označeny v důsledku nové vazby. Ty oblasti filtru, které takové značení obsahují je pak možno detekovat v závislosti na typu použitého značení. Hybridizační sonda je obvykle získána molekulárním klonováním specifického řetězce DNA z genomu kukuřice.
Vynález je použitelný pro PCR-reakce pro detekci polymorfismu restrikčních fragmentu (RFP) včetně polymorfismu v jejich délce. Vynález je aplikovatelný na metodu detekce RFPA, synthetické oligonuklcotidy podle vynálezu jsou vhodné pro použití při provádění této metody detekce RFP a kity obsahující prostředky k detekci RFP, přičemž vynález je možno aplikovat při pěstování rostlin a chovu živočichů včetně hospodářských zvířat, dále je možno vynález použít při diagnostice geneticky podmíněných onemocnění, identifikaci organismů, typování v kriminalistice apod.
Vc specifickém provedení poskytuje vynález prostředky pro identifikaci restrikčních fragmentů určitého genomu nebo skupin restrikčních fragmentů z genomů různých organismu, mikroorganismů, rostlin, živočichů nebo lidí v případě, že tyto skupiny genomů jsou určitým způsobem geneticky vázány s určitými vlastnostmi nebo společně vytvářejí typ genomu, který7 je možno využít k identifikaci organismu, variety nebo jednotlivce.
Obecný postup pro produkci a pro identifikaci restrikčních fragmentů zahrnuje použití restrikční endonukleázy, ligaci synthetických oligonukleotidů na tyto restrikční fragmenty a PCR-amplifikaci těchto restrikčních fragmentů, jak je znázorněno na obr, 1. Restrikční endonukleáza štěpí molekuly DNA genomu na specifických místech, rozpoznávacích místech za vzniku restrikčních fragmentů.
PCR-amplifikace restrikčních fragmentů jc možno bez ohledu na to. zda je znám nukleotidový řetězec nebo zakončení restrikčních fragmentů uskutečnit podle vynálezu tak, žc se nejprve na
-7CZ 298187 B6 konce restrikčních fragmentů ligují synthetické oligonuklcotidy (adaptory), takže každý restrikční fragment je opatřen dvěma označenými fragmenty, která slouží jako podklad pro zakotvení příměrů, užitých při PCR-amplifikaci.
Po působení restrikčních enzymů vznikají buď rovná zakončení, v nichž vytvářejí tcrminální nukleotidy obou řetězců pár bází, nebo nepravidelně prodloužená zakončení, v nichž jeden ze dvou řetězců je na krátkou vzdálenost prodloužen (obr. 2). V případě restrikčních fragmentů sc zarovnanými konci se užívají adaptory sjedním zarovnaným koncem. V případě nepravidelně zakončených restrikčních fragmentu se užívají adaptory s prodlouženým jedním řetězcem, komplementárním k prodlouženému řetězci restrikčních fragmentů. Užívají se tedy pro každý typ restrikčního fragmentu specifické adaptory; které se liší pouze na jednom ze zakončení tak. aby adaptor mohl být navázán na restrikční fragment. V typických případech jsou použité adaptory· tvořeny dvěma synthetickými oligonuklcotidy, které jsou částečně komplementární navzájem a které mají délku obvykle přibližně 10 až 30 nukleotidů, s výhodou 12 až 22 nukleotidů a které vytvářejí strukturu s dvojitým řetězcem při vzájemném smísení v roztoku. Při použití enzymu li gázy jsou adaptory ligovány na směs restrikčních fragmentů. V případě, že se užije velkého molámího přebytku adaptoru vc srovnání s množstvím restrikčních fragmentů, je možno zajistil, žc všechny restrikční fragmenty, je možno zajistit, že všechny restrikční fragmenty budou opatřeny adaptory na obou svých koncích. Restrikční fragmenty, připravené tímto způsobem se označují jako označené restrikční fragmenty a postup, jímž se tyto fragmenty získávají, bude dále označován jako označování restrikčních fragmentů.
Adaptory mohou sloužit jako matrice pro primery se svrchu definovanými vlastnostmi, použité při následující PCR amplifikační reakci. Vc výhodném provedení vynálezu nese restrikční fragment na obou svých koncích tentýž adaptor a jc tedy možno při amplifikaci těchto rcslrikčních fragmentů použít jediný přimetu jak je znázorněno na obr. 3. Vzhledem k lomu, že v takovém případě jsou všechny restrikční fragmenty označeny stejným způsobem, je zřejmé, že při PCR-amplifikaci směsi těchto označených restrikčních fragmentů dojde kjejich amplifikaci synchronním způsobem. V dalším možném provedení lze užít ke štěpení DNA dva různé restrikční enzymy, na konce restrikčních fragmentů pak lze ligo vat dva odlišné adaptory. V tomto případě jc možno k amplifikaci uvedených restrikčních fragmentů použít dva různé PCR primery. V dalším výhodném provedení při použití dvou restrikčních enzymů je možno pro jedno ze zakončení použít biotinylovaný adaptor. Tímto způsobem jc pak možno z komplexní směsi restrikčních fragmentů oddělit ty restrikční fragmenty, které alespoň na jednom svém konci nesou zakončení pro tento restrikční enzym při použití obvyklých postupů pro izolaci biotinvlovaných molekul. Tento stupeň zmenšuje složitost výchozí směsi restrikčních fragmentů a tvoří stupeň v němž jc možno směs před PCR amplifikaci obohatit snížením počtu řetězců, které připadají pro amplifikaci v úvahu. Současná amplifikace několika různých fragmentů se často označuje jako mnohočetná PCR-reakce. Princip pro mnohočetnou amplifikaci restrikčních fragmentů je znázorněn na obr. 4.
Vynález jc dále založen na definici specificky konstruovaných primerů a specifických metod pro směrování PCR-amplifikační reakce tak, že je možno dosáhnout řízené amplifikace a ve zvláštním provedení vynálezu může dojít pouze k amplifikaci malé podskupiny označených restrikčních fragmentů z těch fragmentů, které jsou k disposici.
Obecně je možno uvést, že materiál, získaný rozštěpením, zvláště DNA genomu živočicha, rostliny nebo člověka, restrikční endonukleázou obsahuje velké množství restrikčních fragmentů, počet těchto restrikčních fragmentů závisí na rozměru genomu a na frekvenci výskytu rozpoznávacího místa pro restrikční endonukleázu v genomu, což je opět primárně určováno počtem nukleotidů tomto rozpoznávacím místě. Počet nukleotidů v rozpoznávacích (cílových) místech běžně užívaných restrikčních endonukleáz se pohybuje v rozmezí 4 až 8. Rozměry genomu v organismu se mohou široce měnit od několika milionů párů bází v případě mikroorganismu do několika bilionů párů bází v případě rostlin a živočichů. To znamená, žc se počet restrikčním enzymem může měnit od několika set do několika milionů. Obecně je možno uvést, že počet
-8CZ 298187 B6 rcstrikčních fragmentů Je tak velký, že není možné identifikovat jednotlivé restrikční fragmenty v materiálu, získaném rozštěpením DNA genomu frakcionaci gelovou elektroforézou. 7 takového materiálu se obvykle získá nepřehledná směs překrývajících se pásů, která má vzhled nátěru.
Při PCR-amplifikaci označených restrikčních fragmentů by měla rovněž vzniknout taková nepřehledná směs párů vzhledem k tomu, že by mělo dojít při PCR-reakci k synchronní koamplifikaci všech rcstrikčních fragmentu. Ve výhodném provedení vynálezu, které je možno použít pro DNA genomu velkých rozměrů je možno použít obecného postupu, který' vede k omezení počtu rcstrikčních fragmentů, k jejichž amplifikací má dojít. To je možno uskutečnit předběžným 10 výběrem podskupiny označených (opatřených značkou) restrikčních fragmentů tak. že v průběhu amplifikační reakce PCR bude amplifikován jen relativně malý počet těchto označených rcstrikčních fragmentů.
Selektivní princip, definovaný v tomto provedení spočívá ve zvláštní konstrukci oligonukleotidů, 15 které budou použity jako primery pro PCR-amplifikaci, tak jak je podrobněji znázorněno na obr. 5.
Označené restrikční fragmenty (opatřené značkou) mají následující obecnou strukturu: jde o variabilní řetězec DNA (odpovídající restrikčními fragmentu před jeho označením), který je na 20 obou svých stranách opatřen obráceným řetězcem DNA (kontaktní řetězec). Obráceny řetězec DNA (konstantní řetězec) DNA jc složen zčásti rozpoznávacího (cílového) místa pro restrikční endonukleázu a z řetězce adaptoru, navázaného na oba konce restrikčního fragmentu. Variabilní řetězec restrikčního fragmentu, který' je uložen mezi konstantními řetězci DNA je obvykle neznámý a bude tedy mít náhodné složení řetězce. V důsledku toho bude ve velké směsi 25 restrikčních fragmentů nukleotidovv řetězec, obklopující konstantní řetězce DNA mít zcela náhodné složení.
Z tohoto důvodu se vynález týká rovněž specifických PCR-primeru, které jsou tvořeny konstantní částí nukleotidového řetězce, která se při amplifikací vztahuje k omezené podskupině so získaných restrikčních fragmentů, a variabilní část řetězce. V konstantní části řetězce je řetězec nukleotidů konstruován tak, aby primer měl sekvenci přesně párující s konstantním řetězcem DNA jednoho z řetězců DNA na konci restrikčního fragmentu. Variabilní část řetězce pak jc tvořena náhodně zvoleným nuklcotidovým řetězcem s obsahem 1 až 10 bází.
Pod pojmem „variabilní řetězec se přesněji rozumí řetězec, který je tvořen vybranými nukleotidy, které vytvoří řetězec, který pak zůstane stálý pro účely amplifikace podskupiny restrikčních fragmentů. Ve zvláštním provedení vynálezu jc možno použít několika řetězců vybraných bází tak, aby bylo možno použít několika odlišných primerů. V takovém případě mohou primery mít tentýž stálý řetězec a variabilní řetězce mohou být vytvořeny vybranými bázemi, ktcrc jsou 40 u takto vytvořených primerů od sebe navzájem odlišné.
Je to právě tato adice těchto variabilních (zvolených) řetězců na 3'-zakončení primerů, která řídí předběžnou selekci označených restrikčních fragmentů, které budou amplifikovány v následujícím PCR-stupni; v případě, že sc PCR-reakce uskuteční za příslušných podmínek, zahájí 45 primery' syntézu DNA pouze na těch označených restrikčních fragmentech, v nichž může variabilní řetězec DNA přesně párovat s řetězcem matrice označeného restrikčního fragmentu, jak je znázorněno na obr. 5.
Fato selekce je determinována počtem nukleotidů ve variabilním řetězci primerů. Selektivita 50 primerů se zvyšuje spočteni nukleotidů ve variabilní části řetězce. K označení nukleotidů ve variabilní části řetězce bude také užíván pojem „selektivní báze, aby bylo zřejmé, žc selekce těchto bází činí primer selektivním. Je zřejmé, žc označený restrikční fragment bude amplifikován pouze vtom případě, že selektivní báze použitého primerů bude rozpoznávat oba komplementární řetězce na koncích fragmentu. V případě, že primer odpovídá pouze jednomu 55 zakončení, bud amplifikace spíše lineární než exponenciální a produkt nebude možno prokázat.
-9CZ 298187 B6
Je možné předem stanovit stupeň selektivity, jehož je možno dosáhnout při použití variabilních řetězců s různým počtem selektivních bází, při použití obecného vzorce 42'1. v němž n znamená počet selektivních bází: při použití jedné selektivní baze dojde k amplifikaci jednoho ze 16 prodloužených fragmentů, při použití dvou selektivních bází jednoho z 256 označených fragmentů, při použili tří selektivních bází jednoho ze 4 096 fragmentu, při použití 4 selektivních bází jednoho ze 65 536 fragmentů atd. Jednoho z výhodných provedení vynálezu tudíž umožňuje selektivně amplifikovat náhodnou podskupinu označených rcstrikčních fragmentů z jakéhokoli rozštěpeného vzorku DNA genomu bez ohledu na počet fragmentů, který' vznikne působením restrikčního enzymu.
Ve výhodném provedení jc počet selektivních nukleotidů volen tak, že počet restrikčních fragmentů, které budou amplifikovány jc omezen na 5 až 200. Přestože tento počet je možno vypočítat dělením počtu fragmentů vzorcem 4“, přesná předpověď není možná vzhledem k tomu, že ne všechny restrikční fragmenty je možno amplifikovat sc stejnou účinností. V praxi to znamená, žc po amplifikaci je možno prokázat menši než teoreticky očekávané množství fragmentů. Je také nutno zdůraznit, žc jc možno užít směs dvou nebo většího počtu primerů. To umožní navíc k amplifikaci fragmentu, rozpoznávaných každým primerem, ještě amplifikaci fragmentů, které jsou rozpoznávány oběma primery. Konečně by mělo být zdůrazněno, že selekce, založená na tvorbě párů bází mezi selektivními nukleotidy primeru a komplementární matricí je silně ovlivněna teplotou, která se volí pro vazbu při PCR reakci. V případě, že tato teplota je nižší než nebo příliš blízká teplotě tání komplexu primeru a matrice, budou primery napojovat řetězce matrice, které si přesně neodpovídají, takže v komplexu se objeví místa, v nichž sc nevytvoří správné páry' bází. K tomu by nemělo docházet protože tento stav vede k amplifikaci daleko většího množství fragmentů, než bylo předpokládáno a získají se daleko variabilnější výsledky.
Produkty PCR-reakce, které je možno získat v rámci vynálezu je možno identifikovat s použitím standardních frakcionačních metod pro dělení molekul DNA na základě jejich velkosti s následným barvením molekul DNA příslušnými činidly. Je také možno postupovat tak. že se primery, použité pro PCR-amplifikaci označí vhodnou radioaktivně značenou látkou nebo fluorescenčním chromoforcm lak. aby byla možná identifikace reakčního produktu po írakcionaci na základě velikostí molekul. Vc výhodném provedení podle vynálezu jsou PCR-produkty frakcioiiovány elektroforézou na gelu při použití standardních gelových matricí, jako jsou například agarozy, polyakrylamidový gel nebo směs agarozy a polyakrylamidu. PCR-produkty. získané způsobem podle vynálezu budou dále označovány jako ampliflkované restrikční fragmenty (ARE).
Prostředky a metody podle vy nálezu jc možno použít k produkci skupin ARF z jakéhokoliv složitého genomu po jeho rozštěpení restrikčními enzymy . Vynález umožňuje uvést do souladu počet získaných rcstrikčních fragmentů s frakci on ačním gelovým systémem, jehož bude použito k děleni ARF. Ve specifickém provedení vynálezu jsou selektivní primery' zkonstruovány tak, aby vzniklo 5 až 10 ARF. které se pak dělí elektroforézou na agarozovéin gelu. V dalším specifickém provedení sc užívá selektivních primeru, které jsou konstruovány pro vznik 20 až 50 ARF, které se pak dělí systémem elektroforézy na gelu s vysokou rozlišovací schopností, například na polyakrylamidovém gelu nebo na gelu s obsahem směsi agarozy a polyakrylamidu.
V jednom z výhodných provedení se volí enzym nebo enzymy tak. že se získají restrikční fragmenty s velikostí 20 až 1000 párů bází vzhledem k tomu, že, jak je obecně známo pro PCRamplifikaci. dochází k nejúčínnčjší amplifikaci právě v případě této velikosti fragmentů. Přestože je možno celou řadu fragmentů podrobit írakcionaci na různých standardních gelových matricích, nejlepších výsledků jc možno dosáhnout írakcionaci na denaturačním polyakrylamidovém gelu, tak jak sc běžně používá pro analýzu řetězce DNA.
Podle vynálezu je možno získat různé skupiny ARF pro každý selektivní primer v průběhu PCR-ampliílkační reakce. ARF, identifikované po tomto dělení představují dobře reprodukovatelné otisky DNA genomu. Takovéto otisky mohou mít různé použití, například otisky pro
-10CZ 298187 B6 kriini nalistícké účely, pro diagnostickou identifikaci organismů a také pro identifikaci druhů, ras, variet nebo jednotlivců. Úroveň identifikace jc možno stanovit podle stupně podobnosti (stupně variability) u různých členů specifické skupiny. Variabilita nebo podobnost je určována stupněm variace nukleotidového složení příbuzných genomů. Základním principem, z nějž vynález vychá5 zí je skutečnost, žc v každém amplifikovaném restrikčním fragmentu je možno zjistit dva nukleotidové řetězce, které jsou od sebe odděleny řetězcem s určitou danou délkou, jak je zřejmé z obr. 9. Každý ze dvou nukleotidových řetězců je tvořen dvěma částmi:
(a) rozpoznávacím místem (cílovým místem) pro restrikční endonukleázu, (b) a nukleotidovým řetězcem, přilehlým k rozpoznávacímu místu a nacházejícím se v selektivio ním primerů.
V příbuzných organismech, druzích, varietách, rasách nebo u příbuzných jednotlivců jsou uvedené řetězce a jejich relativní vzdálenosti konzervovány v menší nebo větší míře. To znamená, že uvedené otisky představují bázi pro stanovení stupně příbuznosti mezi řetězci v genomech. Na druhé straně je možno použít rozdíly v ARF ke vzájemnému odlišení genomů. Specifické výhody vynálezu ve srovnání s jinými postupy pro otiskování genomů je vysoká rozlišovací schopnost, jíž je tímto postupem možno dosáhnout: jc totiž možno současně srovnávat několik desítek nebo i stovek ARF.
Další zvláštní možností aplikace je sériová vyšetření nebo identifikace polymorfismu restrikčních fragmentů (RFP). Změny v nukleotidovém složení DNA genomů často vedou k polymorfismu restrikčních fragmentů: navíc zařazené nebo vypuštěné části pak ovlivní velikost restrikčních fragmentů, které jc obsahují, jak je zřejmé z. obr. 8, změna v nukleotidech pak mohou mít za následek zrušení rozpoznávacího (cílového) místa pro působení restrikční endonukleázy nebo 2? vznik nového rozpoznávacího místa pro tento enzym, jak je zřejmé z obr. 1. Nej užívanějším postupem pro identifikaci takových změn je metoda Southern blot. při níž se používá klonovaných sond DNA. jde o techniku, která se často označuje jako detekce polymorfismu délky restrikčních fragmentů. RFLP. Tato metoda zahrnuje extensivní sériové vyšetření náhodně klonovaných fragmentů DNA při provádění Southen blot. tak aby bylo možno prokázat asociaci
RFLP v různých genomech. V souladu s prováděním postupu podle vynálezu je možno RFP identifikoval přímým srovnáním ARF. získaných z různých genomů. V principu jc postup podle vynálezu v případě detekce RFP citlivější vzhledem k tomu, žc nedochází pouze k detekci rozdílů mezi rozpoznávacími místy pro restrikční endonukleázu. nýbrž také k detekci rozdílů v přilehlých nukleotidových řetězcích, obsažených v selektivních PCR-primerech. V důsledku toho představuje postup podle vynálezu v současné době nej výhodnější postup pro detekci RFLP.
RFLP je nyní možno využít pro různé aplikace včetně otisků ke kriminálistickým účelům, ke sledování dědičně podmíněných onemocnění u lidí a ke sledování dědičnosti z agronom ického hlediska sledovaných vlastností u rostlin a při chovu hospodářských a jiných zvířat. Základním •to principem je, že určitý polymorftsmus DNA je úzce spojen sc specifickými genetickými vlastnostmi a je možno jej využil ke sledováni přítomnosti nebo nepřítomnosti specifických genetických vlastností.
V souladu s postupem podle vynálezu je možno analýzu ARF využít k definici genetického 45 spojení polymorfních ARF se specifickými genetickými vlastnostmi. Polymorfní ARF tohoto typu bude dále označovány názvem polymorfismus délky amplifikovaných fragmentů (AFLP) k odlišení těchto fragmentů od polymorfismu DNA typu RFLP, tak jak je možno jek prokázat s použitím metody Southern blot při použití klonovaných sond DNA.
Jedna ze zvláštních aplikací vynálezu spočívá v detekci AFLP ve spojení se specifickými genetickými vlastnostmi. Aplikace zahrnuje analýzu ARF vzorků získaných pří použití odlišných specifických primerů v materiálu, který byl získán působením restrikčních enzymů na DNA genomů blízce příbuzných jednotlivců s odlišnými genetickým vlastnostmi a použití analytických
-IICZ 298187 Β6 postupů, jimiž je možno zjistit korelaci mezi dědičností jednoho nebo většího počtu AFLP a fenotypu, projevujícího se specifickými genetickými vlastnostmi.
Vc druhém výhodném provedení zahrnuje vynález použití postupu podle vynálezu pro identifikaci jednoho nebo většího počtu specifických restrikčních fragmentů. Určitý specifický restrikční fragment je možno amplifikovat z komplexní směsi označených restrikčních fragmentů tak, že se nejprve stanoví nukleotidový řetězec prvních 8 až i2 bází na každém konci restrikčního fragmentu. Na základě těchto sekvenci je pak možno konstruovat dva primery vždy s obsahem 5 až 10 nukleotidů, s řetězcem komplementárním k řetězci v bezprostřední blízkosti místa působení restrikčního enzymu v komplementárním řetězci restrikčního fragmentu. Při použití skupin takových primerů jc po PCR-amplifikace možno získat jediný amplifikovaný fragment. Restrikčním fragmentem, použitým při tomto postupu muže být bud' klonovaný restrikční fragment, nebo amplifikovaný restrikční fragment. Vzhledem k tomu, žc celou řadu restrikčních fragmentů není možno příliš účinně amplifikovat, spočívá výhodný postup podle vynálezu pro identifikaci polvmorfních DNA markérů vtom, že se nejprve amplifikuje náhodně zvolená skupina fragmentů a identifikují sc AFLP, poskytující po PCR-amplifikaci silné pásy. Tyto vzorky je pak možno charakterizovat analýzou řetězce k vytvoření specifických primerů pro restrikčním fragmenty. V typických případech je možno AFLP izolovat vyříznutím odpovídajícího pásu DNA z gelu a pak stanovit nukleotidový řetězec na obou koncích k průkazu řetězce prvních 5 až 10 nukleotidů, bezprostředně přiléhajících k rozpoznávacímu místu restrikční endonukleázy. Jakmile jsou tyto nukleotidové řetězce známy, je možno zkonstruovat specifické primery pro restrikční fragmenty, které budou amplifikovat pouze jediný restrikční fragment z rozštěpené DNA genomu. V tomto specifickém provedení vynálezu je možno použit pro detekci specifického restrikčního fragmentu dvou od sebe odlišných selektivních primerů. V každém ze dvou selektivních primerů se pak selektivní báze volí tak, že jsou komplementární vzhledem k řetězci nukleotidů, který' je bezprostředně vázán na označené místo pro restrikční endonuklcázu, jak jc znázorněno na obr. 8. Počet selektivních bází pro každý primer závisí na komplexnosti směsi fragmentů po působení restrikčních endonukleáz.
Technika PCR se v posledních několika letech nesmírně rozvinula a rychle se stává jednou z nej užívanějších metod v lidském diagnostickém lékařství. Použití tohoto postupu zahrnuje mimo jiné detekci infekčních onemocnění a dědičně podmíněných onemocnění. Každá diagnostická zkouška je založena na použití dvou specifických syntetických oligonukleotidů, které sc užijí jako primery při provádění PCR-reakce za získání jednoho nebo většího počtu fragmentů DNA se specifickou délkou. Při detekci onemocnění je zkouška schopna prokázat existenci i jen jediné molekuly DNA ve vzorku, která poskytuje charakteristicky fragment. V případě geneticky podmíněných onemocnění se primery konstruují tak, že jejich produkty mohou rozlišovat mezi normálními a chorobou pozměněnými alelami. Rozlišení je možné na základě odlišnosti řetězce v segmentu DNA genomu který' je komplementární k primerů nebo na základě odlišné vzdálenosti mezi oběma primery.
Vzhledem ktomu, že primery mají nesmírně vysoký stupeň specifičnosti, přičemž je možné sledovat současně různá onemocnění, se tento postup často označuje jako PCR multiplex. Tento postup však trpí omezením, které spočívá v tom, že je možno současně sledovat jen několik, obvykle 5 až 8 různých onemocnění. Vědeckým podkladem tohoto omezení jc skutečnost, že optimální podmínky pro PCR-amplifikaci (teplota pro vazbu, koncentrace horečnatých iontů, koncentrace primerů) se podstatně mění v závislosti na použitém páru primerů. V případě PCR multiplex je proto často nutné volit kompromisní podmínky, při nichž všechny primery mohou poskytnout zjistitelné produkty. Kromě svrchu uvedeného jevu existuje ještě velký rozdíl mezi účinností amplifikacc různých fragmentů. V důsledku obou uvedených omezení často může dojít k tomu, že produkty některých párů primerů nejsou při provádění PCR multiplex prokazatelné.
Postup podle vynálezu v podstatě odstraňuje svrchu uvedená omezení PCR multiplex vzhledem ktomu. žc všechny primery, použité při prováděni tohoto postupu mají podstatnou část svého nukleotidového řetězce společnou. Mimoto dochází při selekci AFLP k selekci DNA markérů, • 12 CZ 298187 B6 k jejíž amplifikaci dochází se stejnou účinností. To znamená, že v případě optimálních podmínek pro uskutečnění PCR-amplifikacc pro různé selektivní příměry dochází k daleko menším variacím, než jakc je možno pozorovat v případě běžně užívaných příměrů, specifických pro určitý řetězec. V podstatě tedy jde o ideální kompromis mezi počtem bází sy ntetického oligonukleotidu, jehož je zapotřebí k dosažení požadované specifičnosti při detekci jediného určitého fragmentu DNA dané velikosti vc složitém genomu. tak, jak bylo svrchu vypočítáno a mezi délkou a složením oligonukleotidu. které jsou optimální pro účinnou PCR-amplifikaci. Postup podle vynálezu proto představuje dosud nejvýhodnější postup pro PCR multiplex.
Vynález tedy poskytuje obecnou metodu izolování DNA markérů z jakéhokoliv genomu a pro použití těchto DNA markérů ve všech myslitelných aplikacích otisků DNA.
Příklady provedení vynálezu
Postup podle vynálezu bude v dalším blíže objasněn s pomocí konkrétních příkladů, které jsou ovšem pouze ilustrativní a nijak neomezují rozsah předmětného vynálezu.
Příklad 1
Selektivní amplifíkace restrikčních fragmentů DNA z rajčete při použití Pstl.
A) Izolace a modifikace DNA
Celková DNA z rajčete (Lycopersicon esculentum c.v. Moneymarker) byla izolována z mladých listů metodou podle publikace Bernaizski a Tanksley, Theor. Appl. Genet. 72, 314 321. Typický výtěžek byl 50 až 100 mikrogramů DNA na 1 gram čerstvých listů. DNA byla rozštěpena při použití enzymu Pstl (Pharmacia) a na získané restrikení fragmenty byly navázány adaptory Pstl s dvojitým řetězcem (ds) dále popsaným způsobem. Tyto adaptory měly následující strukturu:
5- CTCGTAGACTGCGTACATGCA- 3
3- CATCTGACGCATGT - 5
3'-TGCA-přečnivající zakončení v těchto adaptorech sc váže na prodloužená zakončení, vytvořená působením Pstl. Po navázání na tento adaptor nedochází k obnovení rozpoznávacího místa pro Pstl, řetězce CTGCAG vzhledem ktomu, že 5'-C-zakončení je nahrazeno A. Vazná reakce byla navržena takovým způsobem, že konečným výsledkem jc téměř výlučně molekula s vazbou fragmentu DNA na adaptor. Tohoto cíle bylo dosaženo tak, že I) byly užity nefosforylované adaptory, vylučující vzájemnou vazbu adaptoru na adaptor a 2) vazba a restrikení reakce byly provedeny současně. Druhé z uvedených opatření zajistí, že dojde k restrikci jakéhokoliv produktu, který Je vytvořen vazbou dvou restrikčních fragmentů navzájem a tím dojde k téměř úplnému vyloučení tohoto typu produktů. Produkty, vytvořené vazbou adaptoru na restrikení fragment nemohou být restrikčním enzymem rozštěpeny vzhledem k tomu, že u těchto produktů nedochází ke znovuvytvoření místa štěpení pro enzym Pstl. Při vazbě adaptoru byly použity následující reakční podmínky:
mikrogramy Dna z rajčete
0,2 mikrogramy adaptoru jednotek Pstl jednotka '1’4 DNA-ligázy mM trisHAc o pH 7,5. 10 mM MgAc, 50 mM KAc, mM dithiothrciiolu. 0,5 ιηΜ ΛΤΡ
- 13 CZ 298187 B6
Reakce k uskutečnění vazby se provádí v reakčním objemu 20 mikrolitrů celkem 3 hodiny při teplotě 37 °C. Po vazbě adaptoru se navázané řetězce adaptoru odstraní selektivním vysrážením. K tomuto účelu se objem reakční směsi zvýší na 100 mikrolitrů a přidá se NH^AC do konečné koncentrace 2,5 M. pak se přidá ještě 100 mikrolitrů etheru s teplotou 20 °C a směs se inkubuje 5 minut při teplotě místnosti. Pak se DNA oddělí odstředěním celkem 10 minut při 14 000 otáčkách za minutu v chlazené Eppendorfově odstředivce při teplotě 4 °C. Usazenina DNA se pak jednou promyje 0,5 ml 70% ethanolu při teplotě místnosti a pak sc rozpustí ve 40 mikrolitrech ΤΟ,ΙΕ (10 mM Tris.HCI o pH 8,0, 0,1 mM EDTA). DNA se pak skladuje při teplotě -20 °C. Selektivní srážení, tak, jak bylo popsáno, účinně odstraní nenavázané adaptory z reakční směsi, současně však dochází také ke ztrátě malých fragmentů DNA (200 párů bází a menší).
B) Amplifikační reakce
DNA, připravená svrchu uvedeným způsobem byla užita jako matrice pro amplifikaci Pstl-fragmentů. Reakční směs pro PCR-rcakci v tomto případě obsahovala následující složky.
ng matricové DNA
150 ng primerů jednotku Taq DNA-polymerázy (Perkin Elmeer)
200 mikromol všech čtyř dNTP mM Tris.HCI o pH 8,5, 1,5 mM MgCl·, 50 mM KCI
H2O do celkového objemu 50 mikrolitrů
Reakční směs byla převrstvena 20 mikrolitry lehkého minerálního oleje, aby nedošlo k odpařování v průběhu amplifikační reakce. PCR-rcakce byla uskutečněna na zařízení Perkin Elmer Thermal Cycler při použití následujících typů cyklů: I minuta při 94 °C. 1 minuta při 60 °C, pak vzestup teploty od 60 do 72 °C rychlostí 1 °C za 5 sekund a 2,5 minuly při 72 °C. Bylo uskutečněno celkem 33 cyklů. Po ukončení reakce bylo přidáno 20 mikrolitrů chloroformu a 10 mikrolitrů barviva. v tomto případě 50% sacharóza s 0,1 % barviva Oraž G (Měrek). Barvivo bylo důkladně promiseno s reakční směsí a směs byla krátce odstředěna k odstranění organické fáze (minerální olej a chloroform) z reakční směsi, doplněné barvivém. Pak bylo 20 mikrolitrů reakční směsi analyzováno na 0.1% agarozovem gelu.
C) Ampliflkacc DNA z rajčete při použití primerů se zvyšující se selektivitou
DNA rajčete byla rozštěpena působením restrikčního enzymu Pstl a zakončení byla prodloužena při použití Pstl-adaptoru za svrchu uvedených podmínek. Byly zvoleny čtyři odlišné primery s následujícími řetězci:
1. 5-CTCGTAGGGGGGGGGGGGGGGGACTGCGTACA-3
2. 5-GACTGCGTACAtgcagA-3
3. 5-GACTGCGTACA tgcagAO3
4. 5-GACTGCGTACAtgcagACO3
Primer l jc částí horního řetězec adaptoru, použitého pro modifikaci DNA a měl by tedy amplifi kovat všechny Pstl-fragmenty. Primer 2 obsahuje část řetězce adaptoru, rozpoznávací místo působení enzymu Pstl (řetězec, psaný malými písmeny) a jeden selektivní nukleotid (velká písmena) a měl by teoreticky amplifikovat přibližně l/l6 všech Pstl-fragmentů, Primery 3 a 4 jsou podobné primem 2, avšak obsahují 2 a 3 selektivní nukleotidy a je tedy možno očekávat, že budou amplifikovat přibližně 1/256 a 1/4096 Pstl-fragmentů. Část reakční směsi byla analyzována na 1,0% agarozovem gelu, výsledek je znázorněn na obr, 11. Dráhy 1 a 6 na tomto obrázku obsahují značící DNA, jejíž velikost je uvedena vlevo. Dráhy 2, 3, 4 a 5 obsahují produkty PCR, získané při použití primerů 1. 2, 3 a 4. Výsledky prokazují, že pouze v případě primem, obsahujícího 3 selektivní nukleotidy je počet amplifikovaných fragmentů takový, aby by lo možno získat
- 14CZ 298187 B6 zřetelné pásy. V případě ostatních tří primem byly získány pásy, které nebylo možno na agarozovém gelu rozdělit, protože vzniklo příliš mnoho produktů PCR-reakcc. Mezi těmito produkty vždy převazují některé fragmenty a je možno jc pozorovat jako nátěr v pozadí, na němž se jeví další PCR-produkty. Je pravděpodobné, že se tyto produkty vyskytují ve větším počtu kopií v ge5 nomu rajčete nebo dochází k jejich účinnější amplifikaci než v případě dalších produktů. Je nutno uvést, že vzhledem k celkovému počtu fragmentů po štěpení enzymem Pstl v DNA genomu rajčete, 20 000 až 100 000 bylo od začátku předpokládáno, že bude zapotřebí použít primery, obsahující 3 selektivní nukleotidy k získání zřetelně odlišitclných pásů na agarozovém gelu.
ίο D) Analýza amplifikovaných fragmentu pomocí Southern blot
Amplifíkovanc fragmenty byly zkoumány metody Southern blot, aby bylo možno ověřit, zda tyto fragmenty odpovídající restrikéním fragmentům s odpovídajícími rozměr). K tomuto účelu byly čtyři fragmenty, získané při použití primem 4, vyříznuty zagarozovcho gelu. Ze získaných řezů byla čištěna DNA absorpcí na skleněné kuličky (Gene Clean. Bio 101) a část čištěno DNA byla 15 znovu amplifikována, čímž byl získán přibližně 1 mikrogram každého ze čtyř fragmentů DNA.
Produkty remplifikačni reakce pak byly analyzovány elektroforezou na 1,0% preparativním agarozovém gelu a požadované fragmenty DNA byly čištěny. 200 ng každého z fragmentů bylo označeno při použití (alfa-’“P)dATP při použití balíčku pro značení podle návodu výrobce (Boehringer Mannheim). Veškerá DNA rajčete byla rozštěpena Pstl materiál byl podroben 20 elektroforéze na 1,0% agarozovém gelu. Byly použity čtyři zřetelně od sebe oddělené dráhy, na každou z nich byly naneseny přibližně 3 mikrogramy DNA po rozštěpení. Pak byl proveden blot agarozového gelu při použití hybrid i zač ní membrány Genscreenn4 podle návodu výrobce (New England Nuclaar). Po uskutečnění blotu byl gel rozdělen na čtyři podíly, z nichž každý obsahoval jednu dráhu, získanou z DNA rajčete, rozštěpené působením enzymu Pstl. Každý z uvedených 25 čtyř podílů byl hybrid izován na jednu ze čtyř DNA sond způsobem podle publikace KleinI.cnkhorst a další, Thor. Appl. Genet. 81, 661-667. Hybridizovaný materiál byl podroben autoradiografii po dobu 40 hodin při použití filmů Kodak XAR5. Získané výsledky prokazují, že všechny fragmenty DNA genomu byly rozpoznávány uvedenými čtyřmi sondami DNA a měly stejnou délku jako tyto sondy. To znamená, že amplifikované fragmenty, užité jako sondy, 30 pocházely z fragmentů, prokázaných na blotech.
E) Selektivní amplifíkace jediného restrikčního fragmentu
Pro 3 náhodně zvolené Pstl-fragmenty DNA rajčete byly zkonstruovány tři skupiny primerů, šlo o fragmenty, u nichž, byl znám řetězec, těsně sousedící s místem působení enzymu Pstl. Skupiny 35 primerů s obsahem 5 selektivních nukleotidů byly zkonstruovány následujícím způsobem:
Skupina primerů 1
Řetězec 1
5-ctgcagCAGTACCAGC.....CCGGCACCTGctgcag-3
5-TGCGTAACATtgcagCAGTA-3 3-TGGACgacgtACATGCGT-5 primer 1.1 primer 1.2
Skupina primerů 2
Řetězec 2:
5-ctgcagC C GAATCTCT.....AGTGAGTTAGctgcag'3
5-TGCGTACAtgcagCCGAA-3 3-CAATCgacgtACATGCGT-5 primer 2.1 primer 2.2
Skupina primerů 3
Řetězec 3:
5-ctgcagAATACCAAGA.....GCAAGCACAGctgcag-3
5-TGCGTACAtgcagTTATG-3 3-GTGTCgacgtACATGCGT-5 primer 3.1 primer 3.2
DNA rajčete byla rozštěpena enzymem Pstl a na zakončení restrikčních fragmentů byly navázány adaptory- svrchu uvedeným způsobem. Tato DNA byla pak užita jako matrice při PCR-reakci s použitím skupin primerů I, 2 nebo 3 a za svrchu uvedených podmínek. Produkty z každé PCR5 reakce byly analyzovány na 1.0% agarozovém gelu. Výsledek je znázorněn na obr. 12. Na obr.
je znázorněn 13 drah, z nichž, vc drahách 1,2, 12 a 13 sc nachází značící DNA. Velikost molekul této značící DNA (v kilobázích. kb) jc uvedena na obou stranách gelu. Ve drahách 3, 6 a 9 je znázorněna DNA plazmidu s každým ze tří fragmentů po restrikci enzymem Pstl za vzniku fragmentu vektoru, pUC18 (Yanisch-Perron a další. Gene 33. 103-119) a vloženého Pstl-fragio mentu. Vc drahách 4 a 5 je produkt amplifikace při použití skupiny primerů 1. 5 fg odpovídající
DNA plazmidu a 1 ng celkové DNA genornu. Ve drahách 7 a 8 je znázorněna amplifikace při použití skupiny primerů 2. DNA plazmidu a celkové DNA genornu a v druhách 10 a 11 je znázorněna amplifikace při použití skupiny 3 primerů. Znázorněné výsledky prokazují, ze je možné dosáhnout amplifikace jediného Pstl-fragmentu ze směsi alespoň 20 000 fragmentů při použití i? selektivní amplifikace fragmentů s použitím primerů, obsahujících 5 selektivních nukleotidů.
F) Identifikace polymorfismu DNA s použitím SRFA
V předchozích kapitolách bylo jasně prokázáno, žc při použití selektivní amplifikace restrikčn ích fragmentu je tyto fragmenty možno amplifikovat. a to bud1 náhodným způsobem, nebo může jít 20 o amplifikaci specifických restrikčních fragmentů v případě, ze je k disposici informace o složení řetězec. Mělo by tedy být možné prokázat polymorfistnus cílových restrikčních míst mezi dvěma jednotlivci téhož druhu. Tato metoda bude dále popsána pro dvě linie rajčat, které jsou si velmi příbuzné, avšak liší se přítomností gelu pro odolnost proti nematodům a kořenech rostlin, Mí, v jedné z uvedených linií. Tento gen Mi má svůj původ v Tycopersicon pruvianum. což je vzdá25 leně příbuzný druh vzhledem k poživatclným rajčatům Lycopersicon esculentum. Tento gen byl uložen do rajčat L. esculentum křížením a následným dvanáctinásobným zpětným křížením s původní rostlinou L esculentum a pak selekcí na přítomnost genu Mi. Z uvedeného důvodu se
- 16CZ 298187 B6 obě použité linie rajčat od sebe liší pouze malou částí svého genetického materiálu, to znamená genem Mi a oblastí v jeho bezprostřední blízkosti, bylo vypočítáno, žc oblast Mi tvoří méně než 1 % genomu této linie při použití klasických genetických metod.
DNA byla izolována ze dvou linií rajčat (linie 83 Μ-71392. Μ i sensitívn í a linie 83M-71398, Mi-odolná, obě byly získány od DE Riter Seeds, Bleiswij, Nizozemí), tyto linie byly rozštěpeny působením restrikčního enzymu Pstl a opatřeny adaptory svrchu uvedeným způsobem. Pak byl proveden velký počet amolifikačních reakcí při použití primerů, které se od sebe lišily ve svém prodloužení obsahem selektivních nukleotidů. Byly užity tři selektivní nukleotidy a kromč jednotlivých primerů byly použity také kombinace dvou různých primerů. Výsledky reakcí byly analyzovány na gelech se směsí póly akry lam idu a agarozy, bylo užito 2.5 % póly akry lam idu a 1,0% agarozy při poměru akrylamidu k bisakrylamidu 20:1. Analýza byla uskutečněna na gelu, uloženém v jednotce Protean 11 (Biorad) při použití dělicích přepážek 1,5 mm. Bylo užito celkem 16 různých primerů v 16 reakcích, v nichž byl použit vždy jeden primer a vc 120 reakcích, při nichž byly použity všechny možné kombinace dvou primerů. Typický příklad gelu sc šestí těmito kombinacemi je znázorněn na obr. 13. Dráhy I a 14 tohoto gelu obsahují značící DNA, velikost molekul v kilobázích je uvedena na pravé straně gelu. Vc druhách 2 a 3, 4 a 5. 6 a 7 atd. jsou uloženy produkty amplifikace při použití specifického primerů nebo při použití páru primerů při odebrání materiálů ze svrchu uvedených dvou linií rajčat. Při sériovém vyšetřování materiálu na polymorfismus cílových míst pro působení restrikčních enzymů byla získána řada fragmentů, z nichž tři fragmenty byly obsaženy vc velkém množství, tyto fragmenty jsou znázorněny na drahách 9. II a 12 na obr. 13 (znázornění pomocí malého kroužku). Je pravděpodobné, že polymorfní pásy ve drahách 9 a 11 jsou totožné vzhledem k tomu, že při obou reakcích byl použit tentýž primer (rozdíl spočívá pouze v použití druhého primerů ve dráze 11). Oba polymorfní fragmenty v drahách 11 a 12 byly z gelu vyříznuty, gel byl rozrušen protlačením jehlou velikosti 18 a DNA byla z gelu vymyta clucí pomocí difusc ve 200 mikrolitrech 100 mM I ris. HC1 o pH 8,0, lOmM EDTA. 2 mikrolity materiálu byly použity pro rcamplifikaci uvedených fragmentů, jak již bylo svrchu popsáno. Ve 200 ng každého fragmentu by la vy plněna zakončení při použití T4-DNA-polymerázy a pak byl materiál navázán na lOOng plazinidovcho vektoru plJCl 8 (Yanisch-Peroon a další, Gene 33, 103-119 po rozštěpení enzy mem Smál. Směs, získaná vazbou, byla užita k transformaci E. coli a pro každý fragment byl zvolen jeden klon rekombinaniní E. coli pro analýzu řetězce. Všechny uvedené manipulace by ly prováděny při použití standardních postupů podle publikace Sambrook, Fritsch a Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (CoId Spring Harbor Laboratory Press. New York).
Byly syntetizovány dvě skupiny primerů s obsahem šesti selektivních nukleotidů na bázi řetězců svrchu uvedených dvou fragmentů. Bylo možno amplifikovat každý fragment specificky při použití uvedených skupin primerů. Byly amplifikovány pouze fragmenty zte linie rajčat, z níž pocházely. To znamená, že u uvedených skupin primerů bylo možno pozorovat tentýž polymorfismus, jaký byl původně prokázán u primerů s obsahem tří selektivních nukleotidů, ktcrc byly užity k průkazu tohoto polymorfismu.
Příklad 2
Selektivní amplifikace restrikčních fragmentů DNA rajčete při použití dvou restrikčních enzymů
V příkladu 1 byl osvětlen princip selektivní amplifikace restrikčních fragmentů (SRDA) při použití DNA rajčete a restrikčního enzymu Pstl V tomto příkladu bude popsána amplifikace typu SRDA při použití dvou restrikčních enzymů. Pstl a Msel.
Izolace a modifikace DNA
Veškerá DNA rajčete byla izolována z malých lístků způsobem, který byl popsán v příkladu 1. Dva páry tak zvaných izogenických linií byly použity jako zdroj DNA a byly označeny Gen/ a GeirT a GCR26 a GCR15I (tyto linie jsou popsány v následujících publikacích: Denby a
- 17CZ 298187 B6
Williams. 1962, Can. J. Planí Sci. 42. 681-685, Smith a Ritchie, 1983, Plant Mol. BioL Rep. 1, 41-45). Dva vzorky Jeden z každého páru izogenických linií jsou geneticky velmi podobné, avšak liší se od sebe přítomností řetězce pro odolnost proti patogenní houbě Verticillium albo-atratum.
Prvním stupněm při modifikaci vzorků DNA bvlo štěpení těchto vzorků při použití dvou restrikčních enzymů, Pstl a Msel. Rozštěpení DNA a také následné navázání adaptorů na fragmenty DNA bylo prováděno v tomtéž pufru, označeném RL pufr (pufr pro restrikci a vazbu), pufr obsahoval následující složky: 10 mM Tris. HAc, 10 mM MgAc. 50 mM KAc, a 5 mM DTT, pH 7.5.
Štěpení DNA restrikěními enzymy Pstl a Msel
Štěpení DNA bylo prováděno při použití následujících materiálů:
2.5 mikrogramů DNA
12.5 jednotek Pstl (Pharmacia. 10 jednotek/mikrolitr)
12.5 jednotek Msel (N.E.Biolabs. 4 jednotky/mikrolitr)
5,0 mikrolitru lOxRL-pufr
H2O do 50 mikrolitru
Inkubace reakční směsi byla prováděna jednu hodinu při teplotě 37 °C.
Následujícím stupněm při modifikaci DNA byla vazba molekul adaptorů na zakončení fragmentů DNA. Nejprve bylo zapotřebí připravit příslušné molekuly adaptorů s dvojitými řetězci dále uvedeným způsobem.
Příprava adaptorů
Adaptor Msel má následující řetězec:
5-GACGATGAGTCCTGAG-3
3-TAC7CAGGACTC AT-5
Pro přípravu roztoku 50 pmol/mikrolitr tohoto adaptoru bylo smíseno 8 mikrogramů, 1430 pmol 16-meru s řetězcem nukleotidů 5-GACGATGAGTCCTGAG-3 se 7 mikrogramy, 1430 pmol 14- meru 5-TACTCAGGACTCAT-3 v celkovém objemu 28,6 mikrolitru vody.
Adaptor Pstl má následující řetězec:
5-bio-CTCGTAGACTGCGTACATGCA-3
3-CATCTGACGCATGT-5
Pro přípravu roztoku 5 pmol/mikrolitr tohoto adaptoru bylo smíseno 5,25 mikrogramů. 7,15 pmol biotinylovaného 21-meru 5-bio-CTCGTAGAC 1GCGTACATGCA-3 s 3,5 mikrogramy, 715 pmol 14-meru 5-TGTACGCAGTCTAC-3 v celkovém objemu 143 mikrolitru vody.
Vazba molekuly adaptoru
K rozštěpené DNA bylo přidáno 10 mikrolitru směsi, která obsahovala následující složky:
mikrolitr Pstl bio-adaploru 5 pmol) mikrolitr Msel adaptoru (= 50 pmol)
1,2 mikrolitru 10 mM Α ΓΡ mikrolitr 10 x RL--pufru jednotka T4 DNA-ligázy (Pharmacia. 5 jednotek/mikrolitr)
ILO do 10 mikrolitrů
- 18CZ 298187 136
Výsledná reakční směs v množství 60 mikrolitrú byla inkubována celkem 3 hodiny při teplotě 37 °C.
Adaptory byly navrženy lakovým způsobem, aby po ukončení vazby nedošlo k opětnému vzniku míst působení restrikčního enzymu, užitého ke štěpení. Tak jc možno zabránit vzájemné vazbě restrikčních fragmentu vzhledem k tomu, že restrikční enzymy si v průběhu vazebné reakce uchovávají svoji účinnost. Vzájemná vazba adaptorů není uskutečnitelná z toho důvodu, že adaptory nejsou fosforylovány. jak jejíž, podrobněji vysvětleno v příkladu 1.
Selekce biotinylovaných fragmentů
Příprava matricové DNA pro SRFA s použitím dvou restrikčních enzymů obvykle zahrnuje ještě další stupeň, který- není užit v případě, že se SRFA provádí s použitím pouze jednoho enzymu. V tomto stupni sc fragmenty DAN. na něž je navázán biotinylovaný adaptor, oddělí od všech 15 zbývajících fragmentů.
Biotiny lované fragmenty sc v tomto stupni oddělí od ncbiotinylovaných fragmentů (fragmenty Msel-Msel) vazbou na paramagnctické streptavidinové kuličky (Dynal). 10 mikrolitrú kuliček se 1 x promyje 100 mikrolitry STEX (100 mM NaCI. 10 mM tris.HO. 1 niM EDTA, OJ % Tritonu 2o X-100 o pH 8.0), a pak se materiál znovu uvede do suspenze ve 140 mikrolitrech STECH. Pak se kuličky přidají ke směsi, v níž proběhla vazba, do konečného objemu 200 mikrolitrú. Směs se pak inkubuje 30 minut za opatrného míchání při teplotě místnosti, aby došlo k vazbě biotinylovaných fragmentů na kuličky. Pak sc kuličky oddělí tak, žc sc zkumavky, které je obsahují, přidrží v blízkosti magnetu. Tak nemohou kuličky být odpipetovány při přenášení supernatantu do jiné 25 zkumavky. Kuličky se Ix promyjí a pak se přenesou do nové zkumavky. Pak se kuličky ještě 3x promyjí při použití 200 mikrolitrú STEX. Nakonec se kuličky znovu uvedou do suspenze vc 200 mikrolitrech TO1.E (lOmM tris. OJ mM EDTA. pH 8,0), a přenesou se do nové zkumavky. DNA sc uchovává při teplotě 4 °C.
DNA. rozštěpená působením restrikčních enzymů a opatřená adaptory, navázaná na para magnetické streptavidinové kuličky a zbavená fragmentů Msel-Msel bude v následujících stupních označována jako matricová DNA.
Amplifikace fragmentu Pstl-Msel
Matricová DNA, připravená svrchu uvedeným způsobem by měla obsahovat všechny fragmenty Pstl-Msel z uvedených linií rajčat a mimoto ještě malé množství fragmentů Pstl-Pstl. prostých vnitřních fragmentů Msel. V tomto pokusu byl větší počet těchto fragmentů Pstl-Msel vizualizován amplifíkací v podstatě způsobem, který byl popsán v příkladu 1: Analýza produktů aniplifikace na gelu byla uskutečněna na denaturačním akry lamidovém gelu podle Maxam a Gilbert, 40 Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74, 560-564, vzhledem k tomu, že fragmenty, získané při uvedeném postupu byly mnohem menší než fragmenty, které byly popsány v příkladu 1. Mimoto tylo typy gelů umožňují oddělení až 100 pásů v jedné dráze, což je přibližně l()x tolik jako v případě agarozových gelů v příkladu I. Fragmenty by ly vizualizovány označením jednoho z. PCRprimerů na 5'-zakončení pomocí (?2P) ATP a póly nuk leotidkinázy.
Značení PCR-primcru
Primer, který byl vybrán pro značení by l 19 mer se vzorcem 5-GATGAGTCCTGAGTAAgaa3, který' byl označen jako Msel-primer-1 a v němž jsou selektivní nukleotidy označeny malými písmeny. Značení bylo uskutečněno při použití následujících materiálů:
3.0 mikrolitrú 18-meru (z roztoku 50ng/mikrolitr - 150 ng) 5,0 mikrolitrú '2P ATP (z roztoku 10 mikroCi/mikrolitr = 50 mikroCi) 3,0 mikrolitrú 250 mM Iris.HO, 100 mM MgCl·, 50 mM
- 19CZ 298187 B6
DTT, Ph 7,5. 0,5 mikrolitrů T4 DNA-kinázy (Pharmacia, 10 jednotck/mikrolitr) 18.0 mi kro litrů vody
Byl získán celkový objem 30 mi kro litrů směsi, která byla inkubována 30 minut při teplotě 37 °C. V každé PCR byl přidán I mikrolitr tohoto 5'-značcného primerů.
Bylo provedeno celkem 28 PCR-reakcí, v nichž byla každá ze 4 matricových DNA amplifikována pomocí sedmi kombinací primerů. Každá kombinace primerů obsahovala tentýž Mscl-primer (svrchu popsaný Msel-primcr-1). avšak měnily se Pstl-primery. Bylo vybráno celkem 7 různých primerů (stejně jako v případě Msel-primcru jsou selektivní nukleotidy označeny pomocí malých písmen):
Pstl-primer-1: 5-GACTGCGTACATGCAGga-3
PstDprimer-2: 5-GACTGCGTACATGCAGgt-3
Pstí-pnmer-3: 5-GACTGCGTACATGCAGgg-3
Pstl-primer-4: 5-GACTGCGTACATGCAGag-3
Pstl-primer-5' 5-GACTGCGTACATGCAGat-3
Pstl-primer-6: 5-GACTGCGTACATGCAGct-3
PstI-primer-7: 5-GACTGCGTACATGCAGta-3
Všechny PCR-primcry byly rozpouštěny ve vodě, v koncentraci 50 ng/mikrolitr.
Amplifikační reakce
Směs pro uskutečnění PCR obsahovala tyto složky :
2,0 mikrolitrů matricové DNA
1.0 mililitrů 5'-značených Msel-primeru (5 ng)
0,5 mikrolitrů neznačeného Mscl-primeru (25 ng)
0,6 mikrolitrů Pstl-prinieru (30 ng)
2,0 mikrolitrů 100 mM tris.HCl. 15 mM MgCl·, 500 mM KCL pH 8,5
0.8 mikrolitrů 5 mM dNTP
0,1 mikrolitrů Taq-polymerázy (Cetus Perkin Ehncr, 5 jednotek na mikrolitr). 13,0 mikrolitrů vody
Všechny reakční složky byly dobře promíseny a podstatná složka PCR. obvykle enzym, byla přidána jako poslední. Pak byla reakce co nejdříve zahájena.
Amplifikace byla uskutečněna při použití zařízení Perkin Elmer k provádění tepelných cyklů. Bylo užito následujícího profilu jednotlivých cyklů:
I cyklus: denaturace: 30 s při 94 °C vazba: 30 s při 65 °C prodloužení: 30 s při 72 °C
II cyklů: denaturace: 30 s při 94 °C vazba: teplota se snižuje o 0,7 °C v každém cyklu
64,3 °C. 63,6 °C, 62.9 °C. 62,2 °C
61.5 °C, 60,8 °C, 61,1 °C, 59,4 °C
58,7 °C. 58,0 °C. 57.3 °C.
Při každé teplotě inkubace 30 sekund.
prodloužení: 60 sekund při 72 :C
-20CZ 298187 Β6 cyklů: denaturace: 30 s při 94 :C vazba: 30 s při 56 °C prodloužení: 60 s při 72 °C
Analýza amplifikovaných fragmentů na gelu
Reakční produkty byly analyzovány na 4,5% denaturačních po lyakryl amidových gelech. Byly použity gely s rozměrem 50 x 38 cm. kazety pro přípravu těchto gelů byly získány od Biorad. Bylo užilo vždy 100 ml roztoku gelu s obsahem 4.5% akrylamidu. 0,0225 % bisakrylamidu.
7,5 M močoviny. 50 mM Iris. 50 mM kyseliny boříte. I mM EDTA, pH 8,3. 100 ml roztoku gelu bylo smíseno s 500 mikrolitry 10% persíranu amonného a 100 mikrolitry TEMED těsně před odlitím gelu. Jako pufr pro elektroforézu byl užit tris pufr s kyselinou boritou a EDTA, obsahující 100 mM tris, 100 mM kyseliny borité a 2 mM EDTA, pH 8.3. Reakční směs byla smíscna se stejným objemem 20 mikrolitrú 98 % formamidu s lOmM EDTA, 0,01 % bromfenolové modři a 0,01 xylenkyanolu. Výsledné směsi byly zahřátý na 3 minuty na 95 °C a pak rychle zchlazeny na ledu. 2 mikrolitry každého ze vzorků byly naneseny na gel a postup byl pak prováděn při napětí 110 W k zajištění stálého vývoje tepla v průběhu elektroforczy. Za těchto podmínek odpovídala síra elektrického pole v gelu hodnotám 40 až 50 voltů/cm.
Výsledky reakcí SREA jsou znázorněny na obr. 14. Dráhy jsou označeny 1 až 28 a obsahují vždy čtyři linie rajčat s jednou ze sedmi kombinací primerů. Pořadí linií rajčat na gelu je následující:
1. GCR26, 2. GCR151, 3. GemR, 4. Gems. Dráhy I až 4 obsahují tyto DNA amplifíkované Msel-primerem 1
Msel-primerem-l
Msel-primerein-l
Msel-primcrcm-1 Msel-primerem-l
Msel-primerem 1
Msel-primerem-l molekuly, avšak v i znal i zo váné fragmenty DNA odpovídají ±200 nukleotidům na spodní straně obrázku a ±500 nukleotidům na jeho horní straně.
a a a a a a a
Pstl-prímercm-l, dráhy
Pstl primerem-2, dráhy
Pstl-primcrem-3, dráhy
Pstl-primerem-4, dráhy
Pstl-primerem-5, dráhy
Pstl-primerem-6 a dráhy 25 až 28 obsahují tyto
Pstl-primerem-7. Gel neobsahuje žádné označení, určující velikost až 8 obsahující tyto DNA. amplifíkované až obsahují tyto DNA, 13 až 16 obsahují tyto 17 až 20 obsahují tyto 21 až 24 obsahují tyto
DNA DNA
DNA
DNA amplifíkované amplifíkované amplifíkované amplifíkované amplifíkované
Příklad 3
Selektivní amplifikace restrikčních fragmentu DNA různých čeledí Lactuca působením dvou restrikčních enzymů
V příkladu 2 je uveden princi selektivní amplifikace restrikčních fragmentů SRFA při použití dvou restrikčních enzymů s použitím DNA rajčete. V tomto přikladu bude prokázáno, žc obdobné výsledky jc možno získat při použití DNA různých čeledí Lactuca při použití týchž restrikčních enzymů, Pstl a Msel.
Izolace a modifikace DNA
DNA se izoluje způsobem, popsaným v příkladu I při použití mladých listů různých čeledí Lactuca. Jak bude ještě dále uvedeno, tyto rostliny zahrnují běžný salát L. sativa a několik jednotlivců ze dvou divokých čeledí Lactuca. L. saligna a L. virosa. Rostliny byly pro účely pokusů označeny následujícími jmény:
1. L. saligna. č. 21, rostlina 1
2. L. saligna, č. 21, rostlina 2
3. L. saligna, č. 22, rostlina I
4. L. saligna, č. 22. rostlina 2
5. L. virosa, č. 01. rostlina 1
6. L. virosa, č. 01, rostlina 2
7. L virosa, č. 02
-21 CZ 298187 B6
8. L. virosa, č. 03. rostlina 1
9. L virosa, č. 03, rostlina 2
10. L. sativa, běžný křehký salát
Analyzovaný genetický materiál tedy představoval 6 odlišných typů rostlin včetně dvou odlišných jednotlivců ze čtyř těchto typů.
Modifikace DNA těchto rostlin Lactuca k vytvoření matric pro SRFA byly prováděny stejným způsobem, jaký byl popsán svrchu v Příkladu 2.
Amplifikace Pstl-Msel-fragmentů
DNA, připravené svrchu uvedeným způsobem byly užity jako matrice pro reakce SRFA. Byly užity kombinace dvou primerů, přičemž, byl použit jeden Msel--primer a dva od sebe odlišné Pstl-primery. Tyto primery (selektivní nukleotidy v nich jsou označeny malými písmeny) je možno charakterizovat jejich dále uvedenými řetězci:
| Msel-primer: | 5-GATGAGTCCTGAGTAAaca-3 |
| Pstl-primeM: | 5-GACTGCGTACATGCAGaa-3 |
| Pstl-primer-2: | 5-GACTGCGTACATGCAGca-3 |
Amplifikace fragmentů Pst KM sel při použití svrchu popsaných primerů byla prováděna přesně způsobem podle příkladu 2 a vytvořené fragmenty byly vizualizovány na denaturačním polyakrylamidovém gelu způsobem podle příkladu 2. Získané pásy jsou znázorněny na obr. 15. Ve drahách 1 až. 10 jsou znázorněny vzorky DNA 1 až 10, amplifikované primerem Mscl v kombinaci s Pstl-primerem-1, ve drahách 11 až 20 jsou znázorněny vzorky DNA 1 až 10, amplifikované primerem Mscl v kombinaci s Pstl-primerem-2 Označení velikosti molekul nukleotidů (na výkrese není viditelné) je uvedeno na pravé straně gelu. Rozdíly v jednotlivých pásech odrážejí rozdíly v příbuznosti zkoumaných rostlin.
Příklad 4
Selektivní amplifikace restrikčních fragmentů v inbredních liniích kukuřice při použití různých kombinací restrikčních enzymů
V příkladech 2 a 3 jc uveden princip selektivní amplifikace restrikčních fragmentů SRFA při použití dvou restrikčních enzymů při použití DNA z rajčete a ze salátu (Lactuca species).
V tomto příkladu bude prokázáno, žc podobných výsledků jc možno dosáhnout také při použití linií kukuřice (Zea mais). Mimoto bude prokázáno, že k typování DNA u těchto linií kukuřice je možno využít různých kombinací restrikčních enzymů.
Izolace a modifikace DNA
Byly užity dvě inbrední linie kukuřice, které byly označeny I a 2. Zdroj těchto linií jc irelevantní vzhledem k tomu, žc podle získaných zkušeností jc možné z jakékoliv zvolené linie získat s použitím SRFA dobré typování DNA. DNA zc zkoumaných linií byla získána z mladých listů, z nichž byla izolována způsobem podle publikace Saghai-Mahoof a další. 1984, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81, 8014-8018. Pro přípravu matrice DNA byly užity následující kombinace restrikčních enzymů (EK): Pstl/Taql, EcoRI/Taql Asel/Taql a Sse8387-1/Taql. Všechny enzymy byly získány od Pharmacia s výjimkou enzymu Ascl. který byl získán od New England Biolabs a enzymu Sse8387-1, který byl získán od Amersham. Matricové DNA byly připraveny v podstatě podle příkladů 2 a 3 s následujícími výjimkami:
Restrikce DNA byla uskutečněna tak, že nejprve byla DNA inkubována s enzymem Taql jednu hodinu pří teplotě 65 °C a pak byla inkubována s druhým enzymem, Pstl, Ascl, EcoRI nebo
Sse8387—I další hodinu při teplotě 37 °C. Vazba adaptorů byla prováděna stejně jako u příkladu 2 při použití následujících adaptorů:
Taql-adaptor: 5-GACGATGAGTCCTGAC-3
- TACTCAGGACTGGC-5
Pstl a Sse8387-l-adaptor:
5-bio-CTCGTAGACTGCGTACATGCA-3
-CATCTGACGCATGT - 5
Asel-adaptor: 5-bio-CTCGTAGACTGCGTACC-3
-CTGACGCATGGAT-5
EcoRI-adaptor: 5-bio-CTCGTAGACTGCGTACC-3
3-CTGACGCATGGTTAA-5
Amplifikace restrikčních fragmentů
Amplifikace restrikčních fragmentů byla uskutečněna způsobem, popsaným v příkladu 2. Primery, zvolené pro označení amplifikačních produktů byly následující Taql-primery s třemi selektivními nukleotidy (tyto nukleotidy jsou opět označeny malými písmeny:
l aql-pruncry (5-značené):
1. 5-TGAGTCCTGACCGAaco3
2. 5-TGAGTCCTGACCGAaca-3
3. 5-TGAGTCCTGACCGAcaa-3
4. 5-TGAGTCCTGACCGAcac-3
Uvedené čtyři primery byly použity pro detekci amplifikačních produktů. získaných při použití všech čtyř kombinací enzymů. Pro každou kombinaci enzymů byly užity 4 primery pro jiný enzym za vzniku celkem 16 kombinací pro každý z enzymů. Uvedené primery budou dále znázorněny svými řetězci (selektivní nukleotidy jsou označeny malými písmeny). Pro primery 15 EcoRl a Ascl byly vybrány primery se třemi selektivními nukleotidy, pro Pstl primery se dvěma selektivními nukleotidy a pro enzym Sse byly zvoleny primery, obsahující jeden selektivní nukleotid. Pro enzymy, které štěpí DNA genomu kukuřice na malém počtu míst byly zvoleny primery', obsahující prodloužení s menším počtem selektivních nukleotidů.
EcoRl-primery: 1. 5-CTGCGTTACCAATTCcaa-3
2. 5-CTGCGTTACCAATTCaca-3
3. 5-CTGCGTTACCAATTCaac-3
4. 5-CTGCGTTACCAATTCcag-3
Asel-primery: 1. 5-GACTGCGTACCTAATaac-3
2. 5-GACTGCGTACCTAATaag-3
3. 5-GACTGCGTACCTAATacc-3
4. 5-GACTGCGTACCTAATgaa-3
Pstl-primery: 1. 5-GACTGCGTACATGCAGac-3
2. 5-GACTGCGTACATGCAGaa-3
3. 5-GACTGCGTACATGCAGca-3
4. 5-GACTGCGTACATGCAGcc-3
Sse8387-l-primery: 1. 5-GACTGCGTACATGCAGGa-3
2. 5-GACTGCGTACATGCAGGg-3
3. 5-GACTGCGTACATGCAGGc-3
4. 5-GACTGCGTACATGCAGGt-3
Bylo provedeno eelkem 128 PCR-reakeí (2 DNA x 4 kombinace enzymů x I6 kombinací primerů) způsobem, uvedeným v příkladu 2. Reakční produkty těchto PCR byly analyzovány na 3 gelech (s obsahem 48 drah/gel) způsobem, popsaným v příkladu 2, Všechny kombinace příměrů poskytovaly mapy DNA v rozsahu 50 až 100 pásů v jedné dráze, s výjimkou kombinace SSel/Taql. kde bylo získáno pouze 10 až 15 pásů v jedné dráze. Příklad jednoho z gelů je znázorněn na obr. 16. Je znázorněn část gelu s analýzou mapy, získaná při použití kombinace enzymů Pstl/Taql a EcoRl/Taql. V drahách l až 8 jsou znázorněny mapy dvou vzorců DNA kukuřice získaných pomocí SRP A a Taql-primeru -3 a Pstl-primerů-1, -2. -3 a -4, v drahách 9 až 16 jsou znázorněny mapy DNA ze dvou vzorků kukuřice, získaných pomocí SRFA při použití Taqlprimcru-4 a Pstl-primerů-1, 2. -3 a -4, v dráze I7 je uvedena lambda DNA po rozštěpení enzymem Psrl pro označení, velikost některých fragmentů řetězce nukleotidů je uvedena vpravo a ve drahách 18 až 25 jsou znázorněny mapy pro DNA ze dvou vzorků DNA kukuřice, získaných pomocí SRFA při použití Taql-primeru-l a EcoRI-primerů-l, -2, -3 a -4.
Příklad 5
Selektivní amplifikace restrikčních fragmentů bakteriální DNA
V příkladech 2, 3 a 4 byl vysvětlen princip selektivní amplifikace restrikčních fragmentů SRFA při použití dvou restrikčních enzymů u rajčete, salátu (Lactuca species) a u kukuřice. V tomto příkladu bude prokázáno, že uvedený postup jc možno použít také k charakterizaci bakteriální
-24CZ 29X1X7 B6
DNA. Velký počet kmenů „Xanthomonas Campestris byl získán z Laboratory of Microbiology, Ghent. Belgie a uvedené kmeny byly zvoleny k průkazu použitelnosti postupu u bakterií.
Izolace a modifikace DNA
Všechny vzorky DNA byly připraveny z kmenů Xanthomonas campestris, izolovaných z různých zdrojů, převážně z infikovaných rostlin. Tyto kmeny byly označeny čísly 1 až 26 tak, jak jsou dále uvedeny, a je možno je získat z Laboratory of Microbiology, Ghent, Gclgie.
| DNA 1. | podčeled1 albilineas | pat ho var | izolát 494 |
| Ί | fragariae | 708 | |
| J. | oryzae | oryzae | 5047 |
| 4. | oryzae | populi | 5743 |
| 5. | maltophi lia | 958 | |
| 6. | campestris | campestris | 568 |
| 7. | campestris | alfalfae | 497 |
| 8. | campestris | coracanac | 686 |
| 9. | campestris | citri | 8655 |
| 10. | campestris | citri | 9658 |
| 11. | campestris | citri | 9181 |
| 12. | campestris | citri | 8657 |
| 13. | campestris | citri | 8654 |
| 14. | campestris | citri | 8650 |
| 15. | campestris | citri | 682 |
| 16. | campestris | citri | 681 |
| 17. | campestris | citri | 9325 |
| 18. | campestris | citri | 9321 |
| 19. | campestris | citri | 9176 |
| 20. | campestris | citri | 9671 |
| 21. | campestris | citri | 9665 |
| 22. | campestris | citri | 9182 |
| 23. | campestris | citri | 568 |
| 24. | campestris | citri | 9167 |
| 25. | campestris | citri | 9175 |
| 26. | campestris | citri | 9160 |
io DNA těchto bakteriálních kmenů byla izolována způsobem, popsaným v publikaci Marmur,
J. Mol. Biol. 3, str. 208 až 218, Vzorky DNA byly rozštěpeny restrikčními enzymy v podstatě způsobem podle příkladu 4 s tím rozdílem, že jako restrikční enzymy byly použity enzymy Taql a Apal. Vazba adaptorů byla uskutečněna způsobem podle příkladu 4 při použití následujících řetězců adaptorů:
Taql- adaptor: 5-GACGATGAGTCCTGAC-3
- TACTCAGGACTGGC-5
Apaí- adaptor: 5-bio-TCGTAGACTGCGTACAGGCC-3
3- CATCTGACGCATGT-5
Amplifikace restrikčních fragmentů
Amplifikace restrikčních fragmentů byla uskutečněna způsobem, popsaným v příkladu 2. Příměry, které byly zvoleny pro SRFA byly Taql-primer 5-CGATGAGTCCTGACCGAg-3 sjedním selektivním nukleotidem, označeným malým písmenem a Apal-primer 5-GACTGCGTACAGGCCC'g-j sjedním selektivním nukleotidem, rovněž označeným malým písmenem. Apal-primer byl označen na 5-zakončení pro detekci amplifikovaných fragmentů způsobem, popsaným v příkladu 2.
Každá ze 26 DNA byla amplifíkována při použití svrchu popsané sestavy primerů. Podmínky amplifikace byly stejné jako v příkladu 2 s tím rozdílem, že posledních 9 cyklů PCR bylo vynecháno vzhledem k menší složitosti DNA ve srovnání s rostlinnou DNA z příkladů 2. 3 a 4.
Typování DNA, kterého bylo dosaženo při použité bakteriální DNA podle tohoto příkladu je znázorněno na obr. 17. Dráhy I až 26 představují bakteriální DNA 1 až 26, Velikost DNA. použité pro označení (na gelu není viditelná) je v počtech nukleotidů uvedena na pravé straně gelu, lato čísla jasně prokazují že příbuznost bakteriálních kmenů se odráží na podobnosti získaných pásů.
Příklad 6
Selektivní amplifikace restrikčních fragmentů DNA různých živočichů při použití dvou restrikčních enzymů
V předchozích příkladech byla popsána selektivní amplifikace restrikčních fragmentů SRFA pro DNA z různých rostlinných zdrojů. Nyní bude osvětlena činnost způsobu při použití náhodně odebraných vzorků DNA z různých domácích zvířat. Byly použity: Gailus domesticus (kuře), SUSSCROFA DOMESTICA 1. (vepř), bos taurus (kráva), Equus caballus (kůň). Použitými restrikčními enzymy byly Ssc83 8771 a Msel.
Izolace a modifikace DNA
DNA byla izolována ze vzorků krve způsobem podle publikace Maniatis a další, 1982. Vzorky DNA 1 až 3 (kuře), 4 až 7 (vepř), 8 až 11 (kráva) a 12 až 15 (kůň) byly rozštěpeny restrikčními enzymy Sse83871 a Msel. Fragmenty DNA byly navázány na adaptory způsobem podle příkladu
2. Vzhledem ktomu. žc při použití restrikčních enzymů Sse83871 a Pstl vznikají kompatibilní 3' prodloužená zakončení, bylo možno použít Pstl-adaptor i Msel adaptor, popsané v příkladu 2.
Amplifikace restrikčních fragmentů
Matricová DNA, popsaná svrchu a připravená způsobem podle příkladu 2 byla použita jako matrice při uskutečnění reakcí SRFA. Použití kombinace primerů byly tvořeny jedním Msel-primerem a odlišnými Ssel-primery:
Msel-primer:
5-GATGAGTCCTGAGTAAtac-3
Sse8387l-primer-1:
5-GACTGCGTACATGCAGGaa-3 Sse33871-prímer-2:
5-GACTGCGTACATGCAGGag-3
Amplifikace fragmentů Sse8387l-Msel při použití párů primerů, lak, jak byly svrchu popsány byla prováděna způsobem podle příkladu 2. Reakční produkty byly podrobeny elektroforéze na denaturačním polyakrylamidovém gelu, rovněž popsaném v příkladu 2, Auloradiografický záznam, znázorňující typováni uvedených vzorkuje uveden na obr. I8. Ve drahách 1 až 15 jc
-26CZ. 298187 B6 uvedeno typování pro DNA 1 až 15 po amplifikací při použití Msel-primeru. párovaného s Sse83871-prirncrcm-l. vc drahách 16 až 30 je uvedeno obdobné typování při použití primerů Msel v kombinaci s Sse837l-primercm-l, ve drahách 16 až 30 je uvedeno obdobné typování při použití primerů Msel v kombinaci sSse83871-primerem-2. Rozdíly mezi jednotlivými jedinci 5 určitého živočišného druhu odrážejí heterogenitu živočišné populace. Celkové typování jc charakteristické pro určitý živočišný druh.
Vc zvláštním provedení tvoří podstatu vynálezu způsob řízení amplifikace alespoň části výchozí DNA, která obsahuje větší počet restrikčních míst pro určité specifické restrikční endonukleázy, to přičemž alespoň část řetězce nukleových kyselin je známá, postup spočívá v tom. že se
a) výchozí DNA rozštěpí specifickou restrikční endonukleázou za vzniku odpovídajícího počtu restrikčních fragmentů, opatřených zakončeními 5' a 3',
b) pokud 5'- 3-adaptory již nebyly k dispozici v oddělených formách, rozštěpí se toutéž specifickou restrikční endonukleázou také určený oligonukleotidový vazný řetězec s dvojitým řetězcem, obsahujícím v nukleotidovém řetězci jediné místo působení pro použitou restrikční endonukleázu za rozštěpení na 5'- a 3-adaptor,
c) vzájemně se naváží restrikční fragmenty; získané z výchozí DNA na svých 5' - a 3'zakončeních a 3'-a 5-adaptory za vzniku restrikčních fragmentů výchozí DNA s prodlouženými zakončeními, přičemž tyto fragmenty obsahují na svém 5'- a 3'- zakončení prodlužující řetězce.
2o jejichž nukleotidovými řetězci jsou řetězce 3'- a 5 - adaptorů včetně nukleotidů za specifického restrikčního místa.
d) pokud neběží o vhodné matrice pro primery; prodlouží se uvedené 5'- a 3'- adaptory před svrchu uvedenou vazbou přidáním oligonukleotidových segmentů sc stanoveným stálým řetězcem na odpovídající 5'- a 3 - zakončení, přičemž se v případě potřeby z téhož důvodu prodlouží odpovídající konce prodloužených restrikčních fragmentů oligonukleotidovými segmenty za vzniku restrikčních fragmentů, prodloužených na obou koncích uvedených konstantním řetězcem.
c) prodloužené, popřípadě elongované restrikční fragmenty se za hybridizačních podmínek uvedou do reakce s dvěma oligonukleotidovými primery;
f) primery zahrnují řetězce, odpovídající týmž nukleotidovým řetězcům, jaké obsahují 5'- a 3'zakončení prodloužených nebo popřípadě elongováných restrikčních fragmentů, které jsou komplementární k řetězcům, které mají funkci matricových řetězců pro uvedené primery; přičemž primery selektivně obsahují nukleotidy; komplementární k nukleotidům, účastnícím se tvorby místa působení specifické restrikční endonukleázy v řetězci matrice,
g) elongované restrikční fragmenty; hybridizovaně uvedenými primery sc amplifikují PCR nebo podobnými postupy v přítomnosti požadovaných nukleotidů a polymerázy za další elongace hybridizovaných primerů podél rcstrikčních fragmentů výchozí DNA, s níž primery na počátku hybridizovaly po celé své délce, načež se
h) identifikují nebo izolují výsledné restrikční fragmenty.
Ve specifickém provedení tohoto postupu odpovídá terminální nukleotid alespoň jednoho z uvedených primerů ve směru elongace poslednímu nukleotidu místa působení restrikční endonukleázy; postup zahrnuje identifikaci a izolaci restrikčních fragmentů výchozí DNA, které byly amplifikovány.
V dalším specifickém provedení tohoto postupu zahrnuje alespoň jeden z uvedených primerů řetězec určitého počtu nukleotidů (jeden nebo několik nukleotidu), který zahrnuje za poslední nukleotid, účastnící se tvorby místa působení specifické endonukleázy ve směru sve vlastní elongace v rozsahu odpovídajících restrikčních fragmentů v průběhu amplifikačního stupně.
-27CZ 298187 B6
Ve specifickém provedení uvedeného postupu obsahuje vazný řetězec s dvojitým řetězcem nukleotidů několik míst působení specifických restrikčních endonuklcáz, které se navzájem od sebe liší, postup spočívá v opakování stupňů svrchu uvedeného postupu při použití téže výchozí DNA, avšak při použití jiné restrikční endonukleázy a při použití příměrů, jejichž nukleotidový 5 řetězec je definován stejným způsobem jako svrchu, avšak je specifický pro tuto odlišnou použitou restrikční endonukleázu.
Svrchu popsaný postup je vhodný pro použití k identifikaci polymorfismu určitých DNA, pocházejících z téhož živočišného druhu například může jít o DNA genomu mikroorganismu, rostliny io nebo živočicha včetně lidí nebo může také jít o fragmenty této DNA. K témuž účelu je možno využít i oligonukleotidy podle vynálezu. Postupuje se tak, že se zkoumaná DNA podrobí způsobu podle vynálezu nebo se uvede do styku s oligonukleotidem podle vy nálezu za podmínek, při nichž může docházet k amplifikaci nebo k elongační reakci, mapy získaných restrikčních míst se srovnávají po každou jednotlivou DNA a popřípadě se lokalizuje místo, v němž dochází k poly15 morfismu podle rozdílu, pozorovaných mezi velikostí restrikčních fragmentů, které byly získány z různých DNA.
Vynález se rovněž týká fragmentované DNA, jejíž různé fragmenty obsahují řetězce, které všechny odpovídají počátečním štěpným produktům nc fragmentované výchozí DNA, z níž byly 20 získány působením též specifické endonukleázy. přičemž všechny fragmenty byly prodlouženy na svých 5'-a 3'- zakončeních při použití příslušných 3- a 5'- adaptorů, odpovídajících rozštěpené části téhož výchozího vazného řetězce DNA, který' na začátku obsahoval jediné místo působení uvedené specifické endonukleázy, popřípadě prodloužené předem určenými stálými řetězci. Fragmentovaná DNA může mít formu skupiny putujících pásů na vhodném nosiči, například 25 gelu, v němž byly fragmenty na začátku uvedeny do pohy bu působením elektrického pole.
Fragmentovaná DNA může také obsahovat koncové části včetně nukleotidů, charakterizovaných následujícím složením, počínaje od 5'- zakončení:
i) nukleotidový řetězec (konstantní řetězec) alespoň 10 bází, avšak nc více než 30 bází, 30 komplementární k určenému řetězci DNA. který jc užit jako adaptor, okamžitě následovaný:
ii) nukleotidovým řetězcem, komplementárním k místu působení specifické restrikční endonukleázy, použité ve stupni a) přičemž řetězec tohoto místa ani jeho části nejsou obsaženy v řetězci ii). okamžitě následovaný iii) nukleotidovým řetězcem s obsahem alespoň jednoho nukleotidu, avšak méně než
10 nukleotidů, s délkou například 1 až 5 nukleotidů.
Vynález se rovněž týká sestavy pro fragmentaci DNA při použití alespoň jedné restrikční endonukleázy s následnou analýzou získaných fragmentů, sestava obsahuje:
specifickou restrikční endonukleázu,
- oligonukleotidový vazný řetězec s dvojitým řetězcem DNA, který sám o sobě obsahuje ve svém nukleotidovém řetězci jediné místo působení uvedené specifické restrikční endonukleázy pro rozštěpení na odpovídající 5' - a 3'- adaptory, přičemž uvedený vazná řetězec s obsahem DNA s dvojitým řetězcem má dostatečnou velikost pro vznik 5'- a 3' části, které mohou sloužit jako matrice pro PCR-primcry v této sestavě,
- PCR primery. obsahující tytéž sekvence jako řetězce 5- a 3- adaptorů, komplementární k řetězcům, použitým jako matrice pro uvedené primery', přičemž primery dále obsahují nukleotidy, komplementární k nukleotidům, které se účastní tvorby místa působení určené specifické restrikční endonukleázy v řetězci matrice, popřípadě oligonukieotidové segmenty stanovených (stálých) řetězců pro tvorbu míst 50 s dostatečnou délkou pro hybridizaci s uvedenými primery pro elongaci 5- zakončení 5'adaptorů nebo 3f-z.akončení 3'- adaptorů nebo obou zakončení před rozštěpením vazného řetězce
-28CZ 298187 B6 působením specifické restrikční endonukleázy za vzniku 5 - a 3 - adaptorů nebo pro clongaci prodloužených fragmentů získaných po vazbě 5'- a 3' adaptoru na konce fragmentů výchozí DNA.
popřípadě fragmentovanou DNA. odpovídající určené DNA. jejíž fragmentace je sledována, přičemž fragmenty uvedeného standardu DNA byly získány rozštěpením této DNA při použití uvedené specifické restrikční endonukleázy.
Vc zvláštním provedení teto sestavy mají oligonukleotidové segmenty pro elongaci 5- a 3'adaptoru nebo pro 5- a 3- zakončení prodloužených fragmentů DNA identické řetězce.
V dalším specifickém provedení obsahuje vazný řetězec sestavy několik míst působení specifické endonukleázy. od sebe navzájem odlišných a sestavy dále obsahuje primery, odpovídající 3 - a 5'- adaptorům, vytvořených rozštěpením vazného řetězce uvedenými specifickými endonuklcázami, přičemž primery odpovídají typu, který' je uveden v nároku 8, pokud je o 3- a 5adaptory, vznikající v tomto vazném řetězci rozštěpením každou z uvedených specifických endonukleáz.
V dalším zvláštním provedení může sestava obsahovat fragmentovaná standardy DNA, odpovídající specifickým restrikčním endonukleázám přičemž určitý standard odpovídá vždy určité specifické restrikční endonukleáze.
Claims (10)
1. Oligonuklcolidový primer schopný párování s nukleotidovou sekvencí obsahující (i) konstantní sekvenci obsahující adaptorovou sekvenci, přičemž tento adaptor představuje dvouřetězcový syntetický oligonukleotid. jehož jeden konec je kompatibilní pro ligaci sjedním nebo oběma konci restrikčního fragmentu získaného štěpením výchozí DNA přinejmenším jednou specifickou endonukleázou, a část rozpoznávací sekvence uvedené specifické restrikční endonukleázy (ii) a bezprostředně vedle 3' konce této rozpoznávací sekvence 1 až 10 selektivních nukleotidů.
2. Oligonukleotid podle nároku 1. který obsahuje 10 až 50 nukleotidů, přičemž rozpoznávací sekvence restrikční endonukleázy obsahuje 4 až 8 nukleotidů.
3. Oligonukleotid podle nároku 1 nebo 2, ve kterém konstantní řetězec obsahuje 10 až. 30 nukleotidů.
4. Oligonukleotid podle některého z nároků 1 až 3, který obsahuje konstantní sekvenci, která obsahuje na 5-konci nuklcotidové sekvence schopné párování s částí rozpoznávací sekvence restrikční endonukleázy v restrikčním fragmentu nukleotidovou sekvenci schopnou párování s přinejmenším částí adaptorové sekvence připojené na konce restrikčního fragmentu.
5. Oligonukleotid podle některého z nároků 1 až 4, obsahující 1, 2 nebo 3 zvolené nukleotidy.
6. Oligonukleotid podle některého z nároků 1 až 5, který jc označen.
-29CZ 298187 B6
7. Oligonukleotidový primer podle některého z nároku 1 až 6, kde nukleotidová sekvence dvouřetězcového syntetického oligonukleotidového adaptoru je konstruována tak. že rozpoznávací místo restrikčni endonukleázy není po ligaci regenerováno.
s
8. Použití oligonuklcotidu podle některého z nároků 1 až 6 jako selektivního primeru pro elongaci nebo amplifikaci podskupiny označených restrikčních fragmentů získaných z výchozí DNA.
9. Použití oligonuklcotidu podle některého z nároků 1 až 7. pro identifikaci polymorfizmu mezi různými výchozími DNA ze stejné skupiny živých organizmů, při níž se identifikují rozdíly mezi ίο amplifikovanými restrikčními fragmenty různých výchozích DNA.
10. Použití oligonukleotidu podle některého z nároků I až 7. pro identifikaci polymorfizmu DNA genomu mikroorganizmu, rostliny nebo živočicha, včetně člověka, nebo fragmentů této DNA, vzájemně nebo vc vztahu k odpovídající předem stanovené standardní DNA.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP91402542 | 1991-09-24 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ298187B6 true CZ298187B6 (cs) | 2007-07-18 |
Family
ID=8208616
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ1994669A CZ291877B6 (cs) | 1991-09-24 | 1992-09-24 | Způsob amplifikace přinejmenším jednoho restrikčního fragmentu z výchozí DNA a způsob přípravy sestavy amplifikovaných restrikčních fragmentů |
| CZ0321397A CZ298187B6 (cs) | 1991-09-24 | 1992-09-24 | Oligonukleotidový primer schopný párování s nukleotidovou sekvencí a pouzití tohoto oligonukleotidového primeru |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ1994669A CZ291877B6 (cs) | 1991-09-24 | 1992-09-24 | Způsob amplifikace přinejmenším jednoho restrikčního fragmentu z výchozí DNA a způsob přípravy sestavy amplifikovaných restrikčních fragmentů |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6045994A (cs) |
| EP (2) | EP0534858B2 (cs) |
| JP (3) | JP3236295B2 (cs) |
| KR (1) | KR100321510B1 (cs) |
| AT (2) | ATE382094T1 (cs) |
| AU (1) | AU672760B2 (cs) |
| CA (1) | CA2119557C (cs) |
| CZ (2) | CZ291877B6 (cs) |
| DE (2) | DE69230873T3 (cs) |
| DK (2) | DK0969102T3 (cs) |
| ES (2) | ES2299229T3 (cs) |
| FI (2) | FI113184B (cs) |
| GR (1) | GR3033895T3 (cs) |
| HU (1) | HU223760B1 (cs) |
| IL (1) | IL103267A (cs) |
| NO (1) | NO318016B1 (cs) |
| PT (2) | PT969102E (cs) |
| RU (1) | RU2182176C2 (cs) |
| WO (1) | WO1993006239A1 (cs) |
| ZA (1) | ZA927323B (cs) |
Families Citing this family (285)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6074818A (en) * | 1990-08-24 | 2000-06-13 | The University Of Tennessee Research Corporation | Fingerprinting of nucleic acids, products and methods |
| US7026115B1 (en) * | 1991-09-24 | 2006-04-11 | Keygene N.V. | Selective restriction fragment amplification: fingerprinting |
| US20100267023A1 (en) | 1992-09-24 | 2010-10-21 | Keygene N.V. | Selective restriction fragment amplification: fingerprinting |
| ZA929319B (en) * | 1991-12-11 | 1993-05-24 | Igen Inc | Method for exponential amplification of nucleic acid by a single unpaired primer. |
| EP1382386A3 (en) * | 1992-02-19 | 2004-12-01 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Novel oligonucleotide arrays and their use for sorting, isolating, sequencing, and manipulating nucleic acids |
| GB9301776D0 (en) * | 1993-01-29 | 1993-03-17 | Univ Alberta | Method for detecting genomic variation |
| US5422252A (en) * | 1993-06-04 | 1995-06-06 | Becton, Dickinson And Company | Simultaneous amplification of multiple targets |
| US5470723A (en) * | 1993-05-05 | 1995-11-28 | Becton, Dickinson And Company | Detection of mycobacteria by multiplex nucleic acid amplification |
| US5650274A (en) * | 1993-06-25 | 1997-07-22 | Hitachi, Ltd. | DNA analyzing method |
| GB2283568B (en) * | 1993-10-13 | 1997-12-24 | Mini Agriculture & Fisheries | Identification of fruit juice components |
| RU2111254C1 (ru) * | 1994-07-11 | 1998-05-20 | Институт молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН | СПОСОБ ДЕТЕКЦИИ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО ЭКСПРЕССИРУЮЩИХСЯ МАТРИЧНЫХ РНК И КЛОНИРОВАНИЯ СООТВЕТСТВУЮЩИХ ИМ ФРАГМЕНТОВ кДНК |
| US5710000A (en) | 1994-09-16 | 1998-01-20 | Affymetrix, Inc. | Capturing sequences adjacent to Type-IIs restriction sites for genomic library mapping |
| GB2295228A (en) * | 1994-11-10 | 1996-05-22 | Unilever Plc | Selective amplification of DNA having a plurality of sites for a specific endonuclease |
| GB2295011A (en) * | 1994-11-10 | 1996-05-15 | Unilever Plc | Selection of DNA markers using adaptor molecules |
| DE69507646T2 (de) * | 1994-11-28 | 1999-09-16 | E.I. Du Pont De Nemours And Co., Wilmington | Mikrosatelliteverbindung für detektion genetisches polymorphismen |
| EP0718409A3 (en) * | 1994-12-22 | 1999-02-03 | Hitachi, Ltd. | DNA preparation method |
| EP0721987A1 (en) * | 1995-01-16 | 1996-07-17 | Keygene N.V. | Amplification of simple sequence repeats |
| US6031153A (en) * | 1995-01-23 | 2000-02-29 | Novartis Ag | Method for protecting plants |
| US5565340A (en) * | 1995-01-27 | 1996-10-15 | Clontech Laboratories, Inc. | Method for suppressing DNA fragment amplification during PCR |
| DE69621507T2 (de) * | 1995-03-28 | 2003-01-09 | Japan Science And Technology Corp., Kawaguchi | Verfahren zur molekularen Indexierung von Genen unter Verwendung von Restriktionsenzymen |
| US5712126A (en) * | 1995-08-01 | 1998-01-27 | Yale University | Analysis of gene expression by display of 3-end restriction fragments of CDNA |
| US6395887B1 (en) | 1995-08-01 | 2002-05-28 | Yale University | Analysis of gene expression by display of 3'-end fragments of CDNAS |
| IL122973A0 (en) * | 1995-08-07 | 1998-08-16 | Keygene Nv | Nucleic acid and its use in conferring resistance against wilt inducing fungi |
| US5871697A (en) * | 1995-10-24 | 1999-02-16 | Curagen Corporation | Method and apparatus for identifying, classifying, or quantifying DNA sequences in a sample without sequencing |
| US5972693A (en) * | 1995-10-24 | 1999-10-26 | Curagen Corporation | Apparatus for identifying, classifying, or quantifying DNA sequences in a sample without sequencing |
| US6418382B2 (en) | 1995-10-24 | 2002-07-09 | Curagen Corporation | Method and apparatus for identifying, classifying, or quantifying DNA sequences in a sample without sequencing |
| US6218119B1 (en) | 1996-01-16 | 2001-04-17 | Keygene, N. V. | Amplification of simple sequence repeats |
| WO1997029211A1 (en) * | 1996-02-09 | 1997-08-14 | The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | RESTRICTION DISPLAY (RD-PCR) OF DIFFERENTIALLY EXPRESSED mRNAs |
| US6091004A (en) * | 1996-06-21 | 2000-07-18 | Novartis Finance Corporation | Gene encoding a protein involved in the signal transduction cascade leading to systemic acquired resistance in plants |
| ATE279523T1 (de) | 1996-08-09 | 2004-10-15 | Keygene Nv | Resistenz gegen nematoden und/oder blattläuse |
| EP0823481A1 (en) | 1996-08-09 | 1998-02-11 | Keygene N.V. | Resistance against nematodes |
| WO1998006736A1 (en) | 1996-08-14 | 1998-02-19 | Life Technologies, Inc. | Stable compositions for nucleic acid amplification and sequencing |
| WO1998008981A1 (en) * | 1996-08-30 | 1998-03-05 | Life Technologies, Inc. | METHODS FOR IDENTIFICATION AND ISOLATION OF SPECIFIC NUCLEOTIDE SEQUENCES IN cDNA AND GENOMIC DNA |
| US20040142327A1 (en) * | 1996-11-22 | 2004-07-22 | Jhy-Jhu Lin | Methods for identifying and isolating DNA polymorphisms or genetic markers |
| US5986082A (en) * | 1996-12-13 | 1999-11-16 | Novartis Ag | Altered forms of the NIM1 gene conferring disease resistance in plants |
| US5861295A (en) | 1997-01-02 | 1999-01-19 | Life Technologies, Inc. | Nucleic acid-free thermostable enzymes and methods of production thereof |
| AU6024598A (en) * | 1997-01-10 | 1998-08-03 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Hybridization-based genetic amplification and analysis |
| US6306588B1 (en) | 1997-02-07 | 2001-10-23 | Invitrogen Corporation | Polymerases for analyzing or typing polymorphic nucleic acid fragments and uses thereof |
| AU6846698A (en) | 1997-04-01 | 1998-10-22 | Glaxo Group Limited | Method of nucleic acid amplification |
| US6090556A (en) * | 1997-04-07 | 2000-07-18 | Japan Science & Technology Corporation | Method for quantitatively determining the expression of a gene |
| CA2287542A1 (en) | 1997-04-22 | 1998-10-29 | Life Technologies, Inc. | Methods for the production of aslv reverse transcriptases composed of multiple subunits |
| CA2298140A1 (en) | 1997-08-07 | 1999-02-18 | Curagen Corporation | Detection and confirmation of nucleic acid sequences by use of oligonucleotides comprising a subsequence hybridizing exactly to a known terminal sequence and a subsequence hybridizing to an unidentified sequence |
| US6673577B1 (en) * | 1997-08-07 | 2004-01-06 | Curagen Corporation | Detection and confirmation of nucleic acid sequences by use of poisoning oligonucleotides |
| US6833242B2 (en) * | 1997-09-23 | 2004-12-21 | California Institute Of Technology | Methods for detecting and sorting polynucleotides based on size |
| AU753505B2 (en) * | 1997-10-30 | 2002-10-17 | Cold Spring Harbor Laboratory | Probe arrays and methods of using probe arrays for distinguishing DNA |
| US6280954B1 (en) * | 1998-02-02 | 2001-08-28 | Amersham Pharmacia Biotech Ab | Arrayed primer extension technique for nucleic acid analysis |
| WO1999053100A2 (en) | 1998-04-16 | 1999-10-21 | Case Western Reserve University | Method for finding genetic markers of somaclonal variation |
| US6324479B1 (en) | 1998-05-08 | 2001-11-27 | Rosetta Impharmatics, Inc. | Methods of determining protein activity levels using gene expression profiles |
| US6218122B1 (en) | 1998-06-19 | 2001-04-17 | Rosetta Inpharmatics, Inc. | Methods of monitoring disease states and therapies using gene expression profiles |
| EP0974672B1 (en) * | 1998-07-21 | 2003-04-09 | Keygene N.V. | Improved primers for AFLP amplification |
| ATE244771T1 (de) | 1998-07-29 | 2003-07-15 | Keygene Nv | Verfahren zur erkennung von nukleinsäuremethylierungen durch aflp |
| US6306593B1 (en) * | 1998-09-17 | 2001-10-23 | Union Camp Corporation | Selective AFLP primers for reduction of complexity of maker genotyping and DNA markers for loblolly pine identified using the AFLP primers |
| US6146830A (en) | 1998-09-23 | 2000-11-14 | Rosetta Inpharmatics, Inc. | Method for determining the presence of a number of primary targets of a drug |
| US6703228B1 (en) * | 1998-09-25 | 2004-03-09 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and products related to genotyping and DNA analysis |
| JP3855492B2 (ja) * | 1998-10-08 | 2006-12-13 | 株式会社日立製作所 | 混合核酸断片分析法 |
| AU6074999A (en) | 1998-10-14 | 2000-05-01 | Agriculture And Agrifood Canada | Hybrid alfalfa ((medicago sativa)) |
| US6950752B1 (en) | 1998-10-27 | 2005-09-27 | Rosetta Inpharmatics Llc | Methods for removing artifact from biological profiles |
| US6203987B1 (en) | 1998-10-27 | 2001-03-20 | Rosetta Inpharmatics, Inc. | Methods for using co-regulated genesets to enhance detection and classification of gene expression patterns |
| US6468476B1 (en) | 1998-10-27 | 2002-10-22 | Rosetta Inpharmatics, Inc. | Methods for using-co-regulated genesets to enhance detection and classification of gene expression patterns |
| AU2144000A (en) | 1998-10-27 | 2000-05-15 | Affymetrix, Inc. | Complexity management and analysis of genomic dna |
| AU1402900A (en) * | 1998-11-09 | 2000-05-29 | Methexis N.V. | Restricted amplicon analysis |
| US6801859B1 (en) | 1998-12-23 | 2004-10-05 | Rosetta Inpharmatics Llc | Methods of characterizing drug activities using consensus profiles |
| US6222093B1 (en) | 1998-12-28 | 2001-04-24 | Rosetta Inpharmatics, Inc. | Methods for determining therapeutic index from gene expression profiles |
| US6370478B1 (en) | 1998-12-28 | 2002-04-09 | Rosetta Inpharmatics, Inc. | Methods for drug interaction prediction using biological response profiles |
| US6605432B1 (en) * | 1999-02-05 | 2003-08-12 | Curators Of The University Of Missouri | High-throughput methods for detecting DNA methylation |
| US6630333B1 (en) | 1999-03-23 | 2003-10-07 | Invitrogen Corporation | Substantially pure reverse transriptases and methods of production thereof |
| WO2000061801A2 (en) * | 1999-04-09 | 2000-10-19 | Keygene N.V. | METHOD FOR THE DETECTION AND/OR ANALYSIS, BY MEANS OF PRIMER EXTENSION TECHNIQUES, OF SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS IN RESTRICTION FRAGMENTS, IN PARTICULAR IN AMPLIFIED RESTRICTION FRAGMENTS GENERATED USING AFLP$m(3) |
| US6994969B1 (en) | 1999-04-30 | 2006-02-07 | Methexis Genomics, N.V. | Diagnostic sequencing by a combination of specific cleavage and mass spectrometry |
| US20020119448A1 (en) * | 1999-06-23 | 2002-08-29 | Joseph A. Sorge | Methods of enriching for and identifying polymorphisms |
| WO2000078464A1 (fr) | 1999-06-23 | 2000-12-28 | Hitachi, Ltd. | Separateur centrifuge et dispositif de preparation d'echantillons mettant en oeuvre ce separateur |
| US6420117B1 (en) | 1999-09-14 | 2002-07-16 | The University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Miniature inverted repeat transposable elements and methods of use |
| US6221600B1 (en) | 1999-10-08 | 2001-04-24 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Combinatorial oligonucleotide PCR: a method for rapid, global expression analysis |
| US6958225B2 (en) | 1999-10-27 | 2005-10-25 | Affymetrix, Inc. | Complexity management of genomic DNA |
| AUPQ439699A0 (en) * | 1999-12-01 | 1999-12-23 | University Of Sydney, The | Detection of nucleic acid fragments |
| WO2001049882A2 (en) * | 1999-12-29 | 2001-07-12 | Keygene N.V. | METHOD FOR GENERATING OLIGONUCLEOTIDES, IN PARTICULAR FOR THE DETECTION OF AMPLIFIED RESTRICTION FRAGMENTS OBTAINED USING AFLP$m(3) |
| AU2001254670A1 (en) * | 2000-03-02 | 2001-09-12 | Akzo Nobel N.V. | Detection of hepatitis b virus rna |
| NZ521626A (en) | 2000-03-29 | 2005-09-30 | Cambia | Methods for genotyping by hybridization analysis |
| US7217516B2 (en) * | 2000-05-15 | 2007-05-15 | Keygene N.V. | Methods and kits comprising AFLP primers, and ramp primers with a part complementary to a compound microsatellite repeat and an anchor part complementary to nucleotides adjacent to the repeat |
| EP2295551B1 (en) | 2000-05-26 | 2016-04-06 | Life Technologies Corporation | Thermostable reverse transcriptases and uses thereof |
| US7078208B2 (en) | 2000-05-26 | 2006-07-18 | Invitrogen Corporation | Thermostable reverse transcriptases and uses thereof |
| AU2001271720A1 (en) | 2000-07-05 | 2002-01-14 | Rosetta Inpharmatics, Inc. | Methods and compositions for determining gene function |
| US6984522B2 (en) | 2000-08-03 | 2006-01-10 | Regents Of The University Of Michigan | Isolation and use of solid tumor stem cells |
| US7198924B2 (en) | 2000-12-11 | 2007-04-03 | Invitrogen Corporation | Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites |
| AR031640A1 (es) * | 2000-12-08 | 2003-09-24 | Applied Research Systems | Amplificacion isotermica de acidos nucleicos en un soporte solido |
| US20030143554A1 (en) * | 2001-03-31 | 2003-07-31 | Berres Mark E. | Method of genotyping by determination of allele copy number |
| US6960437B2 (en) * | 2001-04-06 | 2005-11-01 | California Institute Of Technology | Nucleic acid amplification utilizing microfluidic devices |
| CA2443999A1 (en) * | 2001-04-16 | 2002-10-24 | Applera Corporation | Methods and compositions for nucleotide analysis |
| WO2002086169A1 (en) * | 2001-04-23 | 2002-10-31 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Methods for rapid screening of polymorphisms, mutations and methylation |
| US20030044785A1 (en) * | 2001-05-01 | 2003-03-06 | American Type Culture Collection | Method for identifying and genotyping microorganisms |
| CA2449782C (en) | 2001-06-07 | 2011-01-04 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Qtl controlling sclerotinia stem rot resistance in soybean |
| GB0114853D0 (en) * | 2001-06-18 | 2001-08-08 | Medical Res Council | Happier Mapping |
| WO2003002716A2 (en) | 2001-06-28 | 2003-01-09 | Mountain View Pharmaceuticals, Inc. | Polymer stabilized proteinases |
| US20030170661A1 (en) * | 2001-07-23 | 2003-09-11 | Yi Liu | Method for identifying a nucleic acid sequence |
| US6872529B2 (en) * | 2001-07-25 | 2005-03-29 | Affymetrix, Inc. | Complexity management of genomic DNA |
| ATE425263T1 (de) * | 2001-11-19 | 2009-03-15 | Parallele Bioscience Inc | Multiplex-oligonukleotidaddition und zielamplifikation |
| US20110151438A9 (en) | 2001-11-19 | 2011-06-23 | Affymetrix, Inc. | Methods of Analysis of Methylation |
| SI1458888T1 (sl) * | 2001-12-10 | 2011-07-29 | Novartis Ag | Metode zdravljenja psihoze in shizofrenije na osnovi polimorfizmov gena cntf |
| US7418351B2 (en) | 2002-01-31 | 2008-08-26 | Rosetta Inpharmatics Llc | Methods for analysis of measurement errors in measured signals |
| US7035739B2 (en) | 2002-02-01 | 2006-04-25 | Rosetta Inpharmatics Llc | Computer systems and methods for identifying genes and determining pathways associated with traits |
| JP2005518811A (ja) * | 2002-03-05 | 2005-06-30 | ソレックサ リミテッド | 表現型に関連するゲノム全域での配列変化を決定するための方法 |
| US20040110166A1 (en) * | 2002-03-07 | 2004-06-10 | Macevicz Stephen C. | Genome-wide scanning of genetic polymorphisms |
| WO2003085379A2 (en) | 2002-04-01 | 2003-10-16 | Fluidigm Corporation | Microfluidic particle-analysis systems |
| AU2003224978A1 (en) | 2002-04-12 | 2003-10-27 | Curators Of The University Of Missouri | ECIST microarrays for dual screening of DNA hypermethylation and gene silencing |
| US7115370B2 (en) * | 2002-06-05 | 2006-10-03 | Capital Genomix, Inc. | Combinatorial oligonucleotide PCR |
| US9388459B2 (en) | 2002-06-17 | 2016-07-12 | Affymetrix, Inc. | Methods for genotyping |
| US20040072217A1 (en) * | 2002-06-17 | 2004-04-15 | Affymetrix, Inc. | Methods of analysis of linkage disequilibrium |
| ATE546547T1 (de) | 2002-08-22 | 2012-03-15 | Novartis Pharma Gmbh | Diagnose der chronischen abstossung |
| EP2325303B1 (en) | 2002-09-13 | 2013-11-06 | Life Technologies Corporation | Thermostable reverse transcriptases and uses thereof |
| US7143785B2 (en) | 2002-09-25 | 2006-12-05 | California Institute Of Technology | Microfluidic large scale integration |
| WO2004040001A2 (en) | 2002-10-02 | 2004-05-13 | California Institute Of Technology | Microfluidic nucleic acid analysis |
| US7459273B2 (en) * | 2002-10-04 | 2008-12-02 | Affymetrix, Inc. | Methods for genotyping selected polymorphism |
| US20040219565A1 (en) | 2002-10-21 | 2004-11-04 | Sakari Kauppinen | Oligonucleotides useful for detecting and analyzing nucleic acids of interest |
| EP1581661B1 (en) * | 2003-01-10 | 2012-09-12 | Keygene N.V. | Aflp-based method for integrating physical and genetic maps |
| US7996155B2 (en) | 2003-01-22 | 2011-08-09 | Microsoft Corporation | ANOVA method for data analysis |
| EP2159285B1 (en) * | 2003-01-29 | 2012-09-26 | 454 Life Sciences Corporation | Methods of amplifying and sequencing nucleic acids |
| CN1791682B (zh) | 2003-02-26 | 2013-05-22 | 凯利达基因组股份有限公司 | 通过杂交进行的随机阵列dna分析 |
| DE602004029560D1 (de) * | 2003-03-07 | 2010-11-25 | Rubicon Genomics Inc | Amplifikation und analyse von gesamtgenom- und gesamttranskriptom- bibliotheken, die durch ein dns-polymerisierungsverfahren produziert wurden |
| US8206913B1 (en) | 2003-03-07 | 2012-06-26 | Rubicon Genomics, Inc. | Amplification and analysis of whole genome and whole transcriptome libraries generated by a DNA polymerization process |
| WO2005018534A2 (en) | 2003-05-16 | 2005-03-03 | Rosetta Inpharmatics, Llc | Methods and compositions for rna interference |
| CA2526810A1 (en) | 2003-05-23 | 2005-04-21 | Cold Spring Harbor Laboratory | Virtual representations of nucleotide sequences |
| US20050053980A1 (en) | 2003-06-20 | 2005-03-10 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for whole genome amplification and genotyping |
| US20040259100A1 (en) * | 2003-06-20 | 2004-12-23 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for whole genome amplification and genotyping |
| US20050181394A1 (en) * | 2003-06-20 | 2005-08-18 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for whole genome amplification and genotyping |
| JP2007521003A (ja) * | 2003-07-02 | 2007-08-02 | ケイヘーネ・エヌ・ブイ | スプライス部位ａｆｌｐ |
| US20050032102A1 (en) * | 2003-07-22 | 2005-02-10 | Affymetrix, Inc. | Mapping genomic rearrangements |
| US8114978B2 (en) | 2003-08-05 | 2012-02-14 | Affymetrix, Inc. | Methods for genotyping selected polymorphism |
| US7269517B2 (en) | 2003-09-05 | 2007-09-11 | Rosetta Inpharmatics Llc | Computer systems and methods for analyzing experiment design |
| US9394565B2 (en) | 2003-09-05 | 2016-07-19 | Agena Bioscience, Inc. | Allele-specific sequence variation analysis |
| JP2007507770A (ja) | 2003-09-29 | 2007-03-29 | パスワーク インフォーマティクス，インコーポレーテッド | 生物学的特徴を検出するためのシステムおよび方法 |
| CA2559209C (en) | 2004-03-08 | 2016-06-07 | Rubicon Genomics, Inc. | Methods and compositions for generating and amplifying dna libraries for sensitive detection and analysis of dna methylation |
| EP1574585A1 (en) * | 2004-03-12 | 2005-09-14 | Plant Research International B.V. | Method for selective amplification of DNA fragments for genetic fingerprinting |
| US9249456B2 (en) | 2004-03-26 | 2016-02-02 | Agena Bioscience, Inc. | Base specific cleavage of methylation-specific amplification products in combination with mass analysis |
| US8192937B2 (en) * | 2004-04-07 | 2012-06-05 | Exiqon A/S | Methods for quantification of microRNAs and small interfering RNAs |
| US8135595B2 (en) | 2004-05-14 | 2012-03-13 | H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. | Computer systems and methods for providing health care |
| US7618778B2 (en) * | 2004-06-02 | 2009-11-17 | Kaufman Joseph C | Producing, cataloging and classifying sequence tags |
| EP1623996A1 (en) * | 2004-08-06 | 2006-02-08 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts | Improved method of selecting a desired protein from a library |
| FR2876378B1 (fr) * | 2004-10-08 | 2007-01-05 | Univ Joseph Fourier Etablissem | Amorces universelles et leur utilisation pour la detection et l'identification de vegetaux dans des melanges complexes |
| US7335760B2 (en) | 2004-12-22 | 2008-02-26 | Ceres, Inc. | Nucleic acid sequences encoding zinc finger proteins |
| US9505846B2 (en) | 2005-01-28 | 2016-11-29 | Life Technologies Corporation | Multi-component inhibitors of nucleic acid polymerases |
| WO2006094774A2 (en) | 2005-03-03 | 2006-09-14 | Rijk Zwaan Zaadteelt En Zaadhandel B.V. | Reverse progeny mapping |
| AU2006222150B2 (en) | 2005-03-03 | 2010-12-23 | Rijk Zwaan Zaadteelt En Zaadhandel B.V. | Near reverse breeding |
| US20060223066A1 (en) | 2005-03-29 | 2006-10-05 | Applera Corporation | Methods for normalizing and for identifying small nucleic acids |
| US7452671B2 (en) | 2005-04-29 | 2008-11-18 | Affymetrix, Inc. | Methods for genotyping with selective adaptor ligation |
| DK1885882T3 (da) * | 2005-05-10 | 2011-04-11 | State Of Oregon Acting By & Through The State Board Of Higher Eduction On Behalf Of The University O | Fremgangsmåder til kortlægning af polymorfier og polymorfi-mikroarray |
| US7709197B2 (en) | 2005-06-15 | 2010-05-04 | Callida Genomics, Inc. | Nucleic acid analysis by random mixtures of non-overlapping fragments |
| ES2387878T3 (es) | 2005-06-23 | 2012-10-03 | Keygene N.V. | Estrategias para la identificación de alto rendimiento y la detección de polimorfismos |
| DE602006013831D1 (de) * | 2005-06-23 | 2010-06-02 | Keygene Nv | Verbesserte strategien zur sequenzierung komplexer genome unter verwendung von sequenziertechniken mit hohem durchsatz |
| GB0514910D0 (en) | 2005-07-20 | 2005-08-24 | Solexa Ltd | Method for sequencing a polynucleotide template |
| GB0514935D0 (en) | 2005-07-20 | 2005-08-24 | Solexa Ltd | Methods for sequencing a polynucleotide template |
| EP1924705A1 (en) | 2005-08-02 | 2008-05-28 | Rubicon Genomics, Inc. | Isolation of cpg islands by thermal segregation and enzymatic selection-amplification method |
| ATE510930T1 (de) * | 2005-08-02 | 2011-06-15 | Rubicon Genomics Inc | Zusammensetzungen und verfahren zur bearbeitung und amplifikation von dna mit verwendung mehrerer enzyme in einer einzigen reaktion |
| US7622121B2 (en) | 2005-09-21 | 2009-11-24 | New York University | Heat shock proteins from Mycobacterium leprae and uses thereof |
| US10316364B2 (en) | 2005-09-29 | 2019-06-11 | Keygene N.V. | Method for identifying the source of an amplicon |
| CA2623539C (en) | 2005-09-29 | 2015-12-15 | Keygene N.V. | High throughput screening of mutagenized populations |
| EP2546360A1 (en) | 2005-10-07 | 2013-01-16 | Callida Genomics, Inc. | Self-assembled single molecule arrays and uses thereof |
| US7960104B2 (en) * | 2005-10-07 | 2011-06-14 | Callida Genomics, Inc. | Self-assembled single molecule arrays and uses thereof |
| GB0522310D0 (en) | 2005-11-01 | 2005-12-07 | Solexa Ltd | Methods of preparing libraries of template polynucleotides |
| EP1952147A2 (en) | 2005-11-16 | 2008-08-06 | Novartis AG | Biomarkers for anti-nogo-a antibody treatment in spinal cord injury |
| GB0524069D0 (en) * | 2005-11-25 | 2006-01-04 | Solexa Ltd | Preparation of templates for solid phase amplification |
| US8137936B2 (en) * | 2005-11-29 | 2012-03-20 | Macevicz Stephen C | Selected amplification of polynucleotides |
| US11306351B2 (en) | 2005-12-21 | 2022-04-19 | Affymetrix, Inc. | Methods for genotyping |
| JP5452021B2 (ja) | 2005-12-22 | 2014-03-26 | キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ | ハイスループットａｆｌｐ系多型検出法 |
| US8222482B2 (en) | 2006-01-26 | 2012-07-17 | Ceres, Inc. | Modulating plant oil levels |
| CA2641851A1 (en) | 2006-02-08 | 2007-08-16 | Eric Hans Vermaas | Method for sequencing a polynucleotide template |
| JP5180845B2 (ja) | 2006-02-24 | 2013-04-10 | カリダ・ジェノミックス・インコーポレイテッド | Ｄｎａアレイ上でのハイスループットゲノム配列決定 |
| SG10201405158QA (en) * | 2006-02-24 | 2014-10-30 | Callida Genomics Inc | High throughput genome sequencing on dna arrays |
| ES2301342B1 (es) * | 2006-03-14 | 2009-05-01 | Oryzon Genomics, S.A. | "metodo de analisis de acidos nucleicos". |
| WO2007107710A1 (en) * | 2006-03-17 | 2007-09-27 | Solexa Limited | Isothermal methods for creating clonal single molecule arrays |
| EP2002017B1 (en) * | 2006-04-04 | 2015-06-10 | Keygene N.V. | High throughput detection of molecular markers based on restriction fragments |
| US20130191941A1 (en) | 2006-07-05 | 2013-07-25 | Shing Kwok | Modulating light response pathways in plants, increasing light-related tolerances in plants, and increasing biomass in plants |
| ATE481506T1 (de) | 2006-07-12 | 2010-10-15 | Keygene Nv | Genomische kartierung mit hohem durchsatz unter verwendung von aflp |
| US9328378B2 (en) * | 2006-07-31 | 2016-05-03 | Illumina Cambridge Limited | Method of library preparation avoiding the formation of adaptor dimers |
| US7754429B2 (en) | 2006-10-06 | 2010-07-13 | Illumina Cambridge Limited | Method for pair-wise sequencing a plurity of target polynucleotides |
| EP2063701A2 (en) | 2006-10-18 | 2009-06-03 | Seminis Vegetable Seeds, Inc. | Carrots having increased lycopene content |
| US7910302B2 (en) * | 2006-10-27 | 2011-03-22 | Complete Genomics, Inc. | Efficient arrays of amplified polynucleotides |
| US20090105961A1 (en) * | 2006-11-09 | 2009-04-23 | Complete Genomics, Inc. | Methods of nucleic acid identification in large-scale sequencing |
| US20090111705A1 (en) * | 2006-11-09 | 2009-04-30 | Complete Genomics, Inc. | Selection of dna adaptor orientation by hybrid capture |
| EP2121983A2 (en) | 2007-02-02 | 2009-11-25 | Illumina Cambridge Limited | Methods for indexing samples and sequencing multiple nucleotide templates |
| WO2008111453A1 (ja) * | 2007-03-07 | 2008-09-18 | The University Of Tokyo | Dna断片の増幅方法 |
| US20080293589A1 (en) * | 2007-05-24 | 2008-11-27 | Affymetrix, Inc. | Multiplex locus specific amplification |
| CL2008001682A1 (es) | 2007-06-08 | 2008-12-12 | Monsanto Technology Llc | Metodos para el mejoramiento de plantas mediante el uso de informacion directa de secuencias de acidos nucleicos. |
| CN101688220B (zh) | 2007-07-09 | 2017-04-05 | 拜尔作物科学公司 | 包含突变酰基‑acp硫酯酶等位基因的芸苔属植物 |
| US9388457B2 (en) | 2007-09-14 | 2016-07-12 | Affymetrix, Inc. | Locus specific amplification using array probes |
| WO2009052214A2 (en) * | 2007-10-15 | 2009-04-23 | Complete Genomics, Inc. | Sequence analysis using decorated nucleic acids |
| US8518640B2 (en) * | 2007-10-29 | 2013-08-27 | Complete Genomics, Inc. | Nucleic acid sequencing and process |
| US8298768B2 (en) | 2007-11-29 | 2012-10-30 | Complete Genomics, Inc. | Efficient shotgun sequencing methods |
| US20090263872A1 (en) * | 2008-01-23 | 2009-10-22 | Complete Genomics Inc. | Methods and compositions for preventing bias in amplification and sequencing reactions |
| US8415099B2 (en) | 2007-11-05 | 2013-04-09 | Complete Genomics, Inc. | Efficient base determination in sequencing reactions |
| US7897344B2 (en) * | 2007-11-06 | 2011-03-01 | Complete Genomics, Inc. | Methods and oligonucleotide designs for insertion of multiple adaptors into library constructs |
| WO2009059176A2 (en) | 2007-11-02 | 2009-05-07 | Ceres, Inc. | Materials and methods for use in biomass processing |
| WO2009061840A1 (en) * | 2007-11-05 | 2009-05-14 | Complete Genomics, Inc. | Methods and oligonucleotide designs for insertion of multiple adaptors employing selective methylation |
| NL2000992C2 (nl) | 2007-11-09 | 2009-05-12 | Nunhems Bv | Nieuwe komkommerplanten met compacte groeiwijze. |
| CN103898042B (zh) | 2007-11-28 | 2018-05-01 | 拜尔作物科学公司 | 包含突变indehiscent等位基因的芸苔属植物 |
| US8592150B2 (en) | 2007-12-05 | 2013-11-26 | Complete Genomics, Inc. | Methods and compositions for long fragment read sequencing |
| WO2009097368A2 (en) | 2008-01-28 | 2009-08-06 | Complete Genomics, Inc. | Methods and compositions for efficient base calling in sequencing reactions |
| CA2713208C (en) | 2008-02-15 | 2021-02-16 | Ceres, Inc. | Drought and heat tolerance in plants |
| US12060554B2 (en) | 2008-03-10 | 2024-08-13 | Illumina, Inc. | Method for selecting and amplifying polynucleotides |
| US9074244B2 (en) | 2008-03-11 | 2015-07-07 | Affymetrix, Inc. | Array-based translocation and rearrangement assays |
| WO2009132028A1 (en) * | 2008-04-21 | 2009-10-29 | Complete Genomics, Inc. | Array structures for nucleic acid detection |
| MX349774B (es) | 2008-05-26 | 2017-08-10 | Bayer Cropscience Nv | Metodos y medios para modificar la resistencia de las fibras en plantas que producen fibras. |
| EP2304038B1 (en) | 2008-07-17 | 2016-08-31 | Bayer CropScience NV | Brassica plant comprising a mutant indehiscent allelle |
| EP2172565A1 (en) * | 2008-09-24 | 2010-04-07 | Cyano Biotech GmbH | Method of identifying and/or differentiating cyanophyta |
| EP2367937B1 (en) * | 2008-12-04 | 2013-04-17 | Keygene N.V. | Method for the reduction of repetitive sequences in adapter-ligated restriction fragments |
| JP2012514977A (ja) | 2009-01-13 | 2012-07-05 | キージーン・エン・フェー | 新規ゲノム配列決定戦略 |
| WO2010105275A2 (en) | 2009-03-13 | 2010-09-16 | Cornell University | Method to assess human allograft status from microrna expression levels |
| US8071865B2 (en) | 2009-04-15 | 2011-12-06 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of corn variety CV589782 |
| US8362332B2 (en) | 2009-04-15 | 2013-01-29 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of corn variety CV165560 |
| US8071864B2 (en) | 2009-04-15 | 2011-12-06 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of corn variety CV897903 |
| EP2248914A1 (en) * | 2009-05-05 | 2010-11-10 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | The use of class IIB restriction endonucleases in 2nd generation sequencing applications |
| US9524369B2 (en) | 2009-06-15 | 2016-12-20 | Complete Genomics, Inc. | Processing and analysis of complex nucleic acid sequence data |
| AU2009349358A1 (en) | 2009-07-07 | 2012-02-09 | Enza Zaden Beheer B.V. | Cucumber vein yellowing virus (CVYV) resistant cucumber plants (Cucumis sativus L.) |
| PL2659771T3 (pl) | 2009-07-20 | 2019-05-31 | Ceres Inc | Rośliny transgeniczne o zwiększonej biomasie |
| US20110059453A1 (en) * | 2009-08-23 | 2011-03-10 | Affymetrix, Inc. | Poly(A) Tail Length Measurement by PCR |
| SI2669387T1 (sl) | 2009-08-25 | 2017-01-31 | Illumina, Inc. | Metode za izbiro in pomnoževanje polinukleotidov |
| WO2011071382A1 (en) | 2009-12-10 | 2011-06-16 | Keygene N.V. | Polymorfphic whole genome profiling |
| EP2333104A1 (en) | 2009-12-11 | 2011-06-15 | Lexogen GmbH | RNA analytics method |
| US8835358B2 (en) | 2009-12-15 | 2014-09-16 | Cellular Research, Inc. | Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels |
| AU2010330936B2 (en) | 2009-12-17 | 2014-05-22 | Keygene N.V. | Restriction enzyme based whole genome sequencing |
| EP2354243A1 (en) | 2010-02-03 | 2011-08-10 | Lexogen GmbH | Complexity reduction method |
| WO2011112719A1 (en) | 2010-03-09 | 2011-09-15 | Cornell University | Methods and compositions to predict and detect acute rejection |
| NL2004412C2 (en) | 2010-03-16 | 2011-09-20 | Nickerson Zwaan B V | Male sterile leek plants. |
| MA34237B1 (fr) | 2010-04-20 | 2013-05-02 | Seminis Vegetables Seeds Inc | Plantes contenant un caractere tige blanche |
| WO2011140329A1 (en) | 2010-05-06 | 2011-11-10 | Ceres, Inc. | Transgenic plants having increased biomass |
| ES2960184T3 (es) | 2010-06-09 | 2024-03-01 | Keygene Nv | Códigos de barras de secuencias combinatorias para el cribado de alto rendimiento |
| BR112013010278B1 (pt) | 2010-10-27 | 2020-12-29 | Ceres, Inc | método para produzir uma planta, método para modular a composição de biomassa em uma planta, ácido nucleico isolado e método para alterar a composição de biomassa em uma planta |
| US8766054B2 (en) | 2010-12-08 | 2014-07-01 | Hm.Clause | Phytophthora resistance in sweet peppers |
| US10480004B2 (en) | 2010-12-24 | 2019-11-19 | Basf Agricultural Solutions Seed, Us Llc | Brassica plant comprising a mutant ALCATRAZ allele |
| CN103476946A (zh) | 2011-01-14 | 2013-12-25 | 关键基因股份有限公司 | 基于配对末端随机序列的基因分型 |
| TWI465572B (zh) * | 2011-05-19 | 2014-12-21 | Univ Chang Gung | Method, composition and system of amplification and detection of target microbial DNA |
| EP2729580B1 (en) | 2011-07-08 | 2015-09-16 | Keygene N.V. | Sequence based genotyping based on oligonucleotide ligation assays |
| WO2013036929A1 (en) | 2011-09-09 | 2013-03-14 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior | Methods for obtaining a sequence |
| BR122020026845B1 (pt) | 2011-11-02 | 2021-04-13 | Ceres, Inc | Método de aumento do rendimento de planta em solo contendo níveis elevados de al3+, método de aumento da tolerância de uma planta |
| US10323256B2 (en) | 2011-12-09 | 2019-06-18 | Ceres, Inc. | Transgenic plants having altered biomass composition |
| CN104334739A (zh) | 2012-01-13 | 2015-02-04 | Data生物有限公司 | 通过新一代测序进行基因分型 |
| LT3363901T (lt) * | 2012-02-17 | 2021-04-12 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Kompozicijos ir būdai, skirti tiksliam mutacijų nustatymui |
| WO2013130512A2 (en) | 2012-02-27 | 2013-09-06 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods and uses for molecular tags |
| CA2878287A1 (en) | 2012-07-06 | 2014-01-09 | Bayer Cropscience Nv | Soybean rod1 gene sequences and uses thereof |
| US9873886B2 (en) | 2012-07-06 | 2018-01-23 | Bayer Cropscience Nv | Brassica ROD1 gene sequences and uses thereof |
| AU2013285460A1 (en) | 2012-07-06 | 2015-01-22 | Bayer Cropscience Nv | Brassica plants with modified seed oil composition |
| EP2728013A1 (en) * | 2012-10-31 | 2014-05-07 | Universitätsspital Basel | Method for the simultaneous amplification of a plurality of different nucleic acid target sequences |
| US9758828B2 (en) | 2013-01-31 | 2017-09-12 | Cornell University | Methods to detect, treat and prevent acute cellular rejection in kidney allografts |
| EA036298B1 (ru) | 2013-04-19 | 2020-10-23 | Басф Агрикалчерал Солюшнс Сид Юс Ллк | Гибридные растения brassica и способы их получения |
| RU2549453C2 (ru) * | 2013-04-26 | 2015-04-27 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Алтайский государственный университет" | НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ВЕРЕСКА ОБЫКНОВЕННОГО (Calluna vulgaris (L.) Hull.) |
| CN103233072B (zh) * | 2013-05-06 | 2014-07-02 | 中国海洋大学 | 一种高通量全基因组dna甲基化检测技术 |
| RU2535063C1 (ru) * | 2013-05-30 | 2014-12-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Алтайский государственный университет" | НАБОР СИНТЕТИЧЕCКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ СУШЕНИЦЫ БОЛОТНОЙ (Filaginella uliginosa (L.) Opiz) |
| RU2535064C1 (ru) * | 2013-05-30 | 2014-12-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Алтайский государственный университет" | НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ СВОБОДНОЯГОДНИКА КОЛЮЧЕГО, ЭЛЕУТЕРОКОККА (Eleutherococcus senticocus (Rupr. et Maxim.) Maxim.) |
| RU2535060C1 (ru) * | 2013-05-30 | 2014-12-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Алтайский государственный университет" | НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ АРАЛИИ ВЫСОКОЙ (Aralia elata (Miq.) Seem.) |
| US9982301B2 (en) | 2014-01-07 | 2018-05-29 | Cornell University | Urine mRNA profile and acute dysfunction of kidney allograft |
| KR20160113177A (ko) | 2014-01-22 | 2016-09-28 | 라이프 테크놀로지스 코포레이션 | 고온 핵산 합성에서 이용하기 위한 신규한 역전사효소 |
| US20140245471A1 (en) | 2014-05-02 | 2014-08-28 | Nunhems B.V. | Carrot plants with a high anthocyanin level |
| US9107356B2 (en) | 2014-05-02 | 2015-08-18 | Nunhems B.V. | Hybrid carrot variety NUN 85931 |
| AU2015289691B2 (en) | 2014-07-15 | 2020-12-24 | Ceres, Inc. | Methods of increasing crop yield under abiotic stress |
| RU2573937C1 (ru) * | 2014-10-20 | 2016-01-27 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Алтайский государственный университет" | НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ВОЛОДУШКИ МНОГОЖИЛЬЧАТОЙ (Bupleurum multinerve DC.) |
| JP6797794B2 (ja) | 2014-10-30 | 2020-12-09 | ヌンヘムス、ベスローテン、フェンノートシャップＮｕｎｈｅｍｓ Ｂ．Ｖ． | レタスヒゲナガアブラムシ（Ｎａｓｏｎｏｖｉａ ｒｉｂｉｓｎｉｇｒｉ）バイオタイプ１に対する抵抗性を含んでなるレタス植物 |
| CA2983893A1 (en) | 2015-04-28 | 2016-11-03 | Bayer Cropscience Nv | Brassica plants with modified seed oil composition |
| JP6978152B2 (ja) | 2015-09-04 | 2021-12-08 | キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ | 複相胞子生殖遺伝子 |
| US11277983B2 (en) | 2015-11-10 | 2022-03-22 | Pop Vriend Seeds Bv | Peronospora resistance in spinacia sp |
| US10226015B2 (en) | 2015-11-10 | 2019-03-12 | Pop Vriend Research B.V. | Peronospora resistance in Spinacia sp |
| WO2018091438A1 (en) | 2016-11-17 | 2018-05-24 | Nunhems B.V. | Multibranching artichoke plant |
| WO2018183942A1 (en) | 2017-03-31 | 2018-10-04 | Grail, Inc. | Improved library preparation and use thereof for sequencing-based error correction and/or variant identification |
| WO2019068647A1 (en) | 2017-10-04 | 2019-04-11 | Hild Samen Gmbh | TOTAL RESISTANCE TO THE MILDIOU IN THE BASIL |
| CN111566121A (zh) | 2018-01-12 | 2020-08-21 | 巴斯夫欧洲公司 | 小麦7a染色体上决定每穗小穗数QTL的基因 |
| ES2968531T3 (es) | 2018-01-26 | 2024-05-10 | Nunhems Bv | Plantas de espinacas resistentes al menos a las razas 8, 9, 11, 13 y 16 de Peronospora farinosa |
| AU2019390691A1 (en) | 2018-11-28 | 2021-05-13 | Keygene N.V. | Targeted enrichment by endonuclease protection |
| CA3121350A1 (en) | 2018-12-13 | 2020-06-18 | Nunhems B.V. | Solanaceous plant capable of stenospermocarpic fruit formation |
| WO2020169830A1 (en) | 2019-02-21 | 2020-08-27 | Keygene N.V. | Genotyping of polyploids |
| BR112021023769A2 (pt) | 2019-05-29 | 2022-01-11 | Keygene Nv | Gene para partenogênese |
| AU2020291144A1 (en) | 2019-06-13 | 2022-02-10 | Nunhems B.V. | Tomato plant producing fruit having improved ripening characteristics |
| US20230340620A1 (en) | 2019-11-26 | 2023-10-26 | Nunhems B.V. | Molecular markers for reduced pyruvate level trait in allium cepa |
| WO2021116371A1 (en) | 2019-12-12 | 2021-06-17 | Keygene N.V. | Semi-solid state nucleic acid manipulation |
| JP2023506631A (ja) | 2019-12-20 | 2023-02-17 | キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ | 共有結合で閉端された核酸分子末端を使用したｎｇｓライブラリー調製 |
| CA3176023A1 (en) | 2020-04-23 | 2021-10-28 | Nunhems B.V. | Solanum lycopersicum plants having improved tobamovirus resistance |
| CA3178083A1 (en) | 2020-05-13 | 2021-11-18 | Wim VRIEZEN | Tomato plants having suppressed meiotic recombination |
| AU2021286811A1 (en) | 2020-06-10 | 2023-02-09 | Nunhems B.V. | Capsicum annuum plants having improved thrips resistance |
| WO2022074058A1 (en) | 2020-10-06 | 2022-04-14 | Keygene N.V. | Targeted sequence addition |
| AU2021363100A1 (en) | 2020-10-13 | 2023-05-25 | Keygene N.V. | Modified promoter of a parthenogenesis gene |
| WO2022112316A1 (en) | 2020-11-24 | 2022-06-02 | Keygene N.V. | Targeted enrichment using nanopore selective sequencing |
| CA3201992A1 (en) | 2020-12-21 | 2022-06-30 | Thi Ninh Thuan NGUYEN | Brassica napus plants comprising an improved fertility restorer |
| CN116888276A (zh) * | 2020-12-31 | 2023-10-13 | 北京美康基因科学股份有限公司 | 一种用于高通量靶向测序的多重pcr文库构建方法 |
| WO2022265965A1 (en) | 2021-06-14 | 2022-12-22 | 10X Genomics, Inc. | Reverse transcriptase variants for improved performance |
| CN117794357A (zh) | 2021-07-23 | 2024-03-29 | 巴斯夫农业种子解决方案美国有限责任公司 | 抗黑胫病植物及用于鉴定抗黑胫病植物的方法 |
| US12004476B2 (en) | 2022-01-26 | 2024-06-11 | Monsanto Technology Llc. | Cotton variety 20R750B3XF |
| WO2024121354A1 (en) | 2022-12-08 | 2024-06-13 | Keygene N.V. | Duplex sequencing with covalently closed dna ends |
| WO2024146898A1 (en) | 2023-01-03 | 2024-07-11 | Keygene N.V. | Nal1 in rice |
| WO2024209000A1 (en) | 2023-04-04 | 2024-10-10 | Keygene N.V. | Linkers for duplex sequencing |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990008821A1 (en) * | 1989-01-31 | 1990-08-09 | University Of Miami | Microdissection and amplification of chromosomal dna |
| WO1990011372A1 (en) * | 1989-03-21 | 1990-10-04 | Collaborative Research, Inc. | Multiplex dna diagnostic test |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4321365A (en) * | 1977-10-19 | 1982-03-23 | Research Corporation | Oligonucleotides useful as adaptors in DNA cloning, adapted DNA molecules, and methods of preparing adaptors and adapted molecules |
| US5093245A (en) * | 1988-01-26 | 1992-03-03 | Applied Biosystems | Labeling by simultaneous ligation and restriction |
| CA2067363A1 (en) * | 1989-10-16 | 1991-04-17 | Michael Lovett | Non-specific dna amplification |
| WO1991014003A2 (en) * | 1990-03-09 | 1991-09-19 | Ig Laboratories, Inc. | Characterization and analysis of polymorphic vntr loci |
| US5126239A (en) * | 1990-03-14 | 1992-06-30 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Process for detecting polymorphisms on the basis of nucleotide differences |
| WO1992007095A1 (en) * | 1990-10-15 | 1992-04-30 | Stratagene | Arbitrarily primed polymerase chain reaction method for fingerprinting genomes |
| AU1426392A (en) * | 1991-01-22 | 1992-08-27 | Board Of Regents, The University Of Texas System | 5' and 3' polymerase chain reaction walking from known dna sequences |
-
1992
- 1992-09-24 JP JP50580793A patent/JP3236295B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-24 ES ES99115309T patent/ES2299229T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-24 HU HU9400809A patent/HU223760B1/hu active IP Right Grant
- 1992-09-24 AT AT99115309T patent/ATE382094T1/de active
- 1992-09-24 RU RU94033149/13A patent/RU2182176C2/ru active
- 1992-09-24 KR KR1019940700959A patent/KR100321510B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1992-09-24 ES ES92402629T patent/ES2147550T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-24 DK DK99115309T patent/DK0969102T3/da active
- 1992-09-24 ZA ZA927323A patent/ZA927323B/xx unknown
- 1992-09-24 AU AU26629/92A patent/AU672760B2/en not_active Expired
- 1992-09-24 IL IL10326792A patent/IL103267A/xx not_active IP Right Cessation
- 1992-09-24 PT PT99115309T patent/PT969102E/pt unknown
- 1992-09-24 DE DE69230873T patent/DE69230873T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-24 DK DK92402629T patent/DK0534858T4/da active
- 1992-09-24 CA CA002119557A patent/CA2119557C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-24 EP EP92402629A patent/EP0534858B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-24 CZ CZ1994669A patent/CZ291877B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1992-09-24 EP EP99115309A patent/EP0969102B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-24 WO PCT/EP1992/002216 patent/WO1993006239A1/en active IP Right Grant
- 1992-09-24 PT PT92402629T patent/PT534858E/pt unknown
- 1992-09-24 CZ CZ0321397A patent/CZ298187B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1992-09-24 DE DE69233719T patent/DE69233719T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-24 AT AT92402629T patent/ATE191510T1/de active
-
1994
- 1994-01-12 US US08/180,470 patent/US6045994A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-03-23 NO NO19941064A patent/NO318016B1/no not_active IP Right Cessation
- 1994-03-24 FI FI941360A patent/FI113184B/fi not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-07-05 GR GR20000401580T patent/GR3033895T3/el unknown
- 2000-07-25 JP JP2000224187A patent/JP4088403B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-10-17 FI FI20031526A patent/FI115402B/fi not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-12-21 JP JP2007329833A patent/JP4385072B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990008821A1 (en) * | 1989-01-31 | 1990-08-09 | University Of Miami | Microdissection and amplification of chromosomal dna |
| WO1990011372A1 (en) * | 1989-03-21 | 1990-10-04 | Collaborative Research, Inc. | Multiplex dna diagnostic test |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Rosenthal, A, et al.: " Genomic walking and sequencing by oligo-cassette mediated polymerase chain reaction", Nuclei acids Research, Vol.18(20), 3095-3096, 1990 * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ298187B6 (cs) | Oligonukleotidový primer schopný párování s nukleotidovou sekvencí a pouzití tohoto oligonukleotidového primeru | |
| US7935488B2 (en) | Selective restriction fragment amplification: fingerprinting | |
| US6238866B1 (en) | Detector for nucleic acid typing and methods of using the same | |
| JP5220597B2 (ja) | １つ又は複数の多型性を同定する方法およびその使用方法 | |
| KR102592367B1 (ko) | 게놈 및 치료학적 적용을 위한 핵산 분자의 클론 복제 및 증폭을 위한 시스템 및 방법 | |
| JPH08505535A (ja) | 一本鎖ｄｎａ分子の生成方法 | |
| JP2000509241A (ja) | グリコシラーゼによる候補座位のヌクレオチド配列の検出 | |
| JPH10509594A (ja) | 遺伝的多型の検出のための複合ミクロサテライトプライマー | |
| IL145141A (en) | Method for the identification, isolation, or separation of identical nucleic acid fragments from a mixture of at least two nucleic acid populations | |
| JP2000511767A (ja) | 遺伝標識および大腸菌血清型―０１５７：ｈ７の検出方法 | |
| US7572583B2 (en) | Selective restriction fragment amplification: fingerprinting | |
| US6773889B2 (en) | Method for detecting genomic destabilization arising during tissue culture of plant cells | |
| JP4755973B2 (ja) | Ｄｎａ断片を製造する方法およびその適用 | |
| US20030044785A1 (en) | Method for identifying and genotyping microorganisms | |
| JP2004154024A (ja) | ブタの品種識別法及びブタの品種識別用ｄｎａチップ | |
| CN113853440A (zh) | 用于检测细胞内一个或多个dna分子内相互作用的方案 | |
| JPH05244995A (ja) | 新規プライマー |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20120924 |