ES2968531T3 - Plantas de espinacas resistentes al menos a las razas 8, 9, 11, 13 y 16 de Peronospora farinosa - Google Patents
Plantas de espinacas resistentes al menos a las razas 8, 9, 11, 13 y 16 de Peronospora farinosa Download PDFInfo
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Abstract
La invención se refiere a una planta de espinaca cultivada que tiene una nueva resistencia contra al menos Peronospora farinosa razas 8, 9, 11, 13 y 16, semillas, cultivos celulares y progenie de dicha planta, uso de la planta con la resistencia y métodos para generar e identificar dicha planta. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Plantas de espinacas resistentes al menos a las razas 8, 9, 11, 13 y 16 dePeronospora farinosa
Campo de la invención
La invención se refiere a un procedimiento para identificar o seleccionar una planta de espinaca cultivada que tenga una nueva resistencia contra razas dePeronospora farinosa.Se describen también, pero no de acuerdo con la invención, semillas, cultivos celulares y progenie de dicha planta, el uso de la planta con la resistencia y procedimientos para generar dicha planta.
Antecedentes de la invención
La espinaca(Spinacia oleracea)es una de las plantas comestibles de la familiaAmaranthaceae,géneroSpinacia.Es originaria de Asia occidental y central. En esa región del mundo se encuentran los parientes silvestres de la espinaca,Spinacia turkestanicaySpinacia tetrandra.
Las espinacas se han convertido en un cultivo hortícola importante en muchas partes del mundo, siendo China el principal país productor de espinacas (con una producción de 19500000 Mt en 2012), seguido de EE. UU., Japón y Turquía (FAOSTAT). En todo el mundo se cultiva alrededor de 1 millón de hectáreas de espinacas en Asia y aproximadamente 35000 hectáreas en la UE, EE. UU. y Japón (véase Correllet al.,2011, Eur. J. Plant. Pathol., 129: 193-205). Es probable que parte del aumento de la demanda de espinacas se deba a una mayor preocupación por la salud por parte de los consumidores y al conocimiento de sus propiedades beneficiosas. Las hojas de espinaca son ricas en betacaroteno, luteína, ácido fólico, vitamina C, calcio, hierro y antioxidantes (United States Department of Agriculture National Nutrient Database). La demanda de espinacas frescas ha aumentado considerablemente en los últimos años.
Debido a este aumento de la producción en las últimas décadas, la incidencia y la gravedad de uno de los patógenos más dañinos de la espinaca, el mildiú velloso de la espinaca, causado por razas del oomicetoPeronospora farinosaf. sp.spinaciae(Pfs; sinónimoP effusa)ha aumentado concomitantemente. En 1990 sólo se conocían tres razas de Pfs, sin embargo, entre 1990 y 2017 se identificaron trece nuevas razas. La aparición de nuevas razas de Pfs convierte a este patógeno en una importante amenaza para la producción de espinacas a nivel mundial, por lo que es necesario identificar nuevas fuentes de resistencia.
Históricamente, la raza 1 de Pfs (Pfs:01 o Pfs1) se notificó por primera vez en 1824 y la resistencia a la raza 1 se identificó posteriormente en dos muestras registradas iraníes (PI140467 y PI140464) y se incorporó a variedades híbridas comerciales, tales como Califlay (Smith y Zahara, California Agriculture, julio de 1956). En 1958 apareció la raza 2 de Pfs y unos años más tarde se identificó un único gen dominante que confería resistencia contra las razas 1 y 2 (Smithet al.,1961 y 1962). En 1976 apareció la raza 3, la raza 4 se identificó en 1990, y rápidamente se encontraron resistencias contra ambas cepas. La rápida aparición de nuevas razas a partir de entonces condujo a la identificación de nuevos genes de resistencia y su incorporación en las variedades comerciales, así como el desarrollo de pruebas normalizadas, tales como la prueba diferencial de plántulas (véase International Seed Federation -Guidelines for Spinach Downy Mildew, diciembre de 2015 y "Differential Sets - Peronospora farinosa f. sp. spinaciae", agosto de 2016; página web worldseed punto org/isf/differential_hosts punto html). Algunas de estas variedades también se utilizan como hospedadores diferenciales para determinar la raza de los aislados de Pfs, como se indica en la tabla 1 que figura a continuación.
Tabla 1: Reacciones de la enfermedad de las espinacas diferenciales para determinar la identificación de la raza de los aislados del patógeno del mildiú velloso de la espinaca,Peronospora farinosaf. sp.spinaciaea diciembre de 2015 y agosto de 2016
En 2016 se identificó una nueva raza de mildiú velloso (comunicado de prensa de Plantum, 15 de marzo de 2016). Se identificó por primera vez un aislado en Salinas (California, EE. UU.) en marzo de 2015 y se denominó inicialmente UA201519B (también denominado UA1519B). Se evaluó el desarrollo de la enfermedad del aislado en un ensayo contra un conjunto convencional de variedades diferenciales, y el International Working Group onPeronospora(IWGP, Grupo Internacional de Trabajo sobrePeronospora)determinó que el aislado era una nueva raza. El IWGP lo denominó Pfs: 16 una vez fue evidente que los aislados con el mismo patrón de reacción aparecían en muchos lugares. Se ha añadido a la tabla diferencial convencional que figura en esta solicitud como tabla 1.
En 2018, el IWGP denominó otra nueva raza, Pfs17 (UA1014 o US1602). Asimismo, la International Seed Federation (ISF, Federación Internacional de Semillas) ha publicado un nuevo conjunto de diferenciales de hospedador para diferenciar los aislados Pfs 1 a Pfs 17. Véase la página web worldseed.org/our-work/plant-health/differential-hosts/, documento en el enlace 'Downy Mildew", denominado "Spinach-downy-mildew_April2018.pdf".
Las variedades comerciales de espinacas son en su mayoría híbridos, producidos por el cruce de una línea endogámica femenina y otra masculina, aunque también existen algunas variedades de polinización abierta. La línea progenitora masculina y femenina suelen llevar genes de resistencia diferentes cada una. Por ejemplo, la variedad híbrida Andromeda (creada por Nunhems; véase la solicitud de patente US8563807) es resistente a Pfs 1-12 y Pfs14. En esta variedad, la resistencia contra Pfs 1, 3, 5, 8, 9, 11, 12 y 14 es conferida por un gen de resistencia procedente de una línea progenitora endogámica, mientras que la resistencia contra Pfs 1-10 es conferida por un gen de resistencia procedente de la otra línea progenitora endogámica. Ambas líneas progenitoras son homocigóticas para el gen de la resistencia. La combinación óptima de resistencias es un rompecabezas difícil, sobre todo porque algunos genes de resistencia no son dominantes y/o se asignan al mismo locus, lo que hace imposible apilar todos los genes de resistencia conocidos en un híbrido. Así pues, en el campo del fitomejoramiento de las espinacas se buscan constantemente más genes de resistencia.
El documento WO2015054339 describe una "planta de espinacaSpinacia oleráceaque comprende en su genoma un locus introgresado deSpinacia tetrandraque confiere resistencia de amplio espectro aPeronospora farinosaf. sp.spinaciae",comprendiendo dicha resistencia de amplio espectro "resistencia a las razas 7, 10, 11, 12, 13 y 14 dePeronospora farinosaf. sp.spinaciae(Pfs), o a las razas 1-14 y UA4712 dePeronospora farinosaf. sp.spinaciae(Pfs)" (el aislado UA4712 fue denominado posteriormentePeronospora farinosaf. sp.spinaciae(Pfs) raza 15 por el IWGP), en el que "el locus introgresado se define como flanqueado en el genoma deSpinacia tetrandrapor secuencias al menos un 95 % idénticas a SEQ ID NO: 1 o 2" y también que "la resistencia a la DM de S.tetrandrase encontraba entre los marcadores E33/M62-231 en 0,0 cM y E39/M47-203 en 10,3 cM, en el cromosoma 6 del mapa público" (Khattaket al.,Euphytica, 148:311-318, 2006). Las SEQ ID NO: 1 y 2 del documento WO2015054339 que flanquean el locus que confiere resistencia se añadieron a esta solicitud como SEQ ID NO: 4 y 5, respectivamente.
El documento WO2013064436 (EP2586294) describe "un nuevo gen de resistencia, denominado R6, que confiere resistencia a las plantas de espinaca frente a las razas de mildiú velloso Pfs 1, Pfs 2, Pfs 3, Pfs 4, Pfs 5, Pfs 6, Pfs 9, Pfs 11, Pfs 12, Pfs 13 y UA4410" (véase también la tabla 1 en la página 19 del documento WO2013/064436; la cepa tipo UA4410 ha sido denominada Pfs14 por el IWGP desde 2011). No se proporcionaron marcadores. No se ha describió que R6 confería resistencia a las razas Pfs 7, 8 y 10.
El documento EP2912940 (US2015240256) describe plantas resistentes aPeronospora farinosa,resistencia conferida por "una combinación de alelos que se selecciona del grupo que consiste en el alelo A, el alelo Vt, y el alelo C" ... "la combinación de alelos comprende los alelos A y C y la planta es resistente, como mínimo, aPeronospora farinosaf. sp.spinaciaede las razas 7, 8, 10, 11, 12, 14 y al aislado UA4712; la combinación de alelos comprende los alelos A y Vt, y la planta es resistente, como mínimo, aPeronospora farinosaf. sp.spinaciaede las razas 7, 8, 10, 11, 12, 13 y 14; o la combinación de alelos comprende los alelos C y Vt, y la planta es resistente al menos aPeronospora farinosaf. sp.spinaciaede las razas 7, 8, 10, 11, 12, 13 y al aislado UA4712" (subrayado añadido). El aislado UA4712 se conoce actualmente como Pfs 15. Por lo tanto, la resistencia divulgada en el documento EP2912940 se dirige a combinaciones de alelos.
El documento US9402363 describe un "procedimiento de identificación de una planta de espinaca que comprende un alelo R15, en la que dicho alelo confiere resistencia al menos aPeronospora farinosaf. sp.spinaciaede las razas Pfs:1, Pfs:2, Pfs:3, Pfs:4, Pfs:5, Pfs:6, Pfs:9, Pfs:11, Pfs:12, Pfs:13, Pfs:14, Pfs:15 y al aislado UA1014 y no confiere resistencia aPeronospora farinosaf. sp.spinaciaede la raza Pfs:7, y en la que dicho alelo se encuentra en una planta cultivada a partir de una semilla de la que se depositó una muestra representativa en el NCIMB con el número de registro NCIMB 42466" y cuatro secuencias de marcadores dentro de 20 cM (centiMorgan) para hacerlo. Además, "en estado homocigótico, el alelo R15, tal como se ha encontrado..., también confiere resistencia aPeronospora farinosaf. sp.spinaciaede la raza Pfs:8 y al menos resistencia intermedia a Pfs:10". El aislado UA1014 no es actualmente una raza Pfs numerada reconocida por el IWGP. El documento US9402363 divulga "al menos resistencia intermedia a las razas Pfs:8, Pfs:10 y no confiere resistencia aPeronospora farinosaf. sp.spinaciaede la raza Pfs:7". Se describe además que la resistencia a Pfs:8, Pfs:10 actúa de la siguiente manera: "la presencia homocigótica o heterocigótica del alelo que confiere resistencia R15 influye en la expresión del rasgo de la invención para las razas Pfs:8 y Pfs:10 dePeronospora farinosaf. sp.spinaciae".
El documento US20170127641 describe "una planta de espinaca que comprende resistencia contra las razas 1-9, 11 15 dePeronospora farinosay el aislado UA1014APLP" El aislado UA1014APLP no es actualmente una raza Pfs numerada reconocida por el IWGP. El documento US20170127641 no divulga la resistencia a la raza Pfs 10. El documento US20170127641 sí divulga la resistencia a las razas Pfs 3-5. No se divulgaron marcadores del gen o genes de resistencia.
El documento US20170127642 describe "una planta de espinaca que comprende resistencia contra las razas 1-9, 11 15 dePeronospora farinosay el aislado UA1014APLP". El aislado UA1014APLP no es actualmente una raza Pfs numerada reconocida por el IWGP. El documento US20170127642 no divulga la resistencia a la raza Pfs 10. El documento US20170127642 sí divulga la resistencia a las razas Pfs 3-5. No se divulgaron marcadores del gen o genes de resistencia.
El documento WO2017194073 describe una "resistencia de amplio espectro no mediada por genes R al menos a las razas oficialmente reconocidas dePeronospora farinosaf. sp.spinaciaePfs: 1, Pfs:2, Pfs:3, Pfs:4, Pfs:5, Pfs:6, Pfs:7, Pfs:8, Pfs:9, Pfs: 10, Pfs: 11, Pfs: 12, Pfs: 13, Pfs: 14, Pfs: 15 y Pfs: 16, en la que la resistencia está causada por un nuevo locus denominado p10 y en la que la resistencia causada por el locus p10 es al menos de un nivel intermedio" y "En contraste con una resistencia mediada por un gen R dominante, el locus p10 de la invención sólo proporciona resistencia cuando está en forma homocigótica".
Correllet al.,2013, describen las variedades Coati y Meerkat, que son resistentes a Pfs 1-15 y a varios otros aislados deP farinosa,incluidos UA1414, UA1012 y UA1312. Coati y Meerkat son híbridos F1. Más tarde se demostró que Meerkat era susceptible a la raza Pfs 16 (comunicado de prensa de Plantum, 15 de marzo de 2016).
La variedad Callisto F1 es una variedad de espinaca obtenida por Nunhems y es resistente a las razas Pfs 1-14 y Pfs 16, descrita como HR o de alta resistencia ("high resistance"). Es un híbrido y las resistencias a Pfs se obtienen del apilamiento de diversos genes dominantes. Rpf3 (también conocido como R3), un gen descrito en a.o. Correlet al.,2011, confiere la resistencia contra Pfs 16.
La variedad Novico F1 es una espinaca de tipo industrial criada por Nunhems y es resistente a las razas Pfs 1-12 y 14-16 descritas como HR (alta resistencia). Es un híbrido y las resistencias a Pfs se obtienen del apilamiento de diversos genes dominantes. Rpf3, un gen descrito en a.o. Correlet al.,2011, confiere la resistencia contra Pfs 16.
La variedad Palco F1 es una espinaca de tipo industrial criada por Nunhems y es resistente a las razas Pfs 1-5, 8, 9, 11, 12, 14 y 16 descritas como HR. Es un híbrido y las resistencias a Pfs se obtienen del apilamiento de diversos genes dominantes. Rpf3 confiere la resistencia contra Pfs 16.
La variedad Scorpius F1 es una espinaca de mercado fresca producida por Nunhems y es resistente a las razas 1-14 y 16 de Pfs descritas como HR. Es un híbrido y las resistencias a Pfs se obtienen del apilamiento de diversos genes dominantes. Rpf3 confiere la resistencia contra Pfs 16.
La variedad Andrómeda F1 mencionada anteriormente es una espinaca de mercado fresca criada por Nunhems y contiene resistencia contra la raza Pfs 1-12 y 14-16 descrita como HR. Es un híbrido y las resistencias a Pfs se obtienen del apilamiento de diversos genes dominantes. Rpf3 confiere la resistencia contra Pfs 16.
Diversas otras empresas también venden variedades de espinacas, que contienen apilamientos de genes de resistencia. Las variedades nuevas introducidas de espinacas son casi exclusivamente híbridas.
El documento WO2015036378 divulga "un nuevo gen de resistencia dominante, denominado RPF13". El gen proporciona "resistencia contra al menos las razas 7-14 dePeronospora farinosa,... conferida por un único gen. El gen ... confiere además opcionalmente resistencia contra una o más o todas las razas 1-6 dePeronospora farinosa,o al menos contra Pfs 1-2 y Pfs 4-6 ...". El aislado UA4712 se conoce en la actualidad como Pfs 15. RPF13 no confiere resistencia a Pfs16, como también se demuestra en los ejemplos de esta solicitud.
El documento WO2015036469 divulga "un nuevo gen de resistencia dominante, denominado RPF12". La planta proporciona "resistencia contra al menos las razas 7-14 dePeronospora farinosa,... conferida por un único gen....RPF12 ... además confiere opcionalmente resistencia contra una o más o todas las razas 1-6 dePeronospora farinosa,o al menos contra Pfs 1-2 y Pfs 4-6". RPF12 no confiere resistencia a Pfs16, como también se demuestra en los ejemplos de esta solicitud. También la variedad Pegasum contiene RPF12 y se describe que es susceptible a la raza Pfs 16, véase la tabla 3 de Correll y Koike, Race diversity and the biology of spinach downy mildew pathogen, Informe anual del CLGRB, 1 de abril de 2016 a 31 de marzo de 2017.
El documento EP2848114 divulga "La invención proporciona una planta de espinaca que comprende resistencia contra al menos las razas 7-14 dePeronospora farinosa,en la que dicha resistencia es conferida por un único gen.... RPF11... que confiere además opcionalmente resistencia contra una o más de las razas 1-6 dePeronospora farinosa.En un aspecto, el gen RPF11, por lo tanto, confiere resistencia contra todas las razas patógenas de Pfs conocidas en la actualidad, las razas 1-14, cuando está en forma homocigótica o heterocigótica en la planta...". RPF11 no confiere resistencia a Pfs16, como también se demuestra en los ejemplos de esta solicitud. También las variedades Virgo, Volans y Antalia contienen RPF11 y se describe que son susceptibles a Pfs16, véase la tabla 3 de Correll y Koike, Race diversity and the biology of spinach downy mildew pathogen, Informe anual del CLGRB, 1 de abril de 2016 a 31 de marzo de 2017.
Xu, C.et al.(2017, Nat. Commun., 8, 15275 doi: 10.1038/ncomms15275), "Draft genome of spinach and transcriptome diversity of 120 Spinacia accessions" (2017) publicaron la secuencia del genoma de un cultivar chino de espinaca, Sp75. La secuencia puede analizarse en la base de datos en línea "SpinachBase" que se encuentra en la red mundial en spinachbase.org. En este caso, se pueden consultar los seis cromosomas de la espinaca, por ejemplo, mediante el análisis Blast.
Si un obtentor desea crear una variedad de espinaca que comprenda la resistencia a todas las razas dePeronospora farinosareconocidas por el IWGP, es decir, las razas Pfs 1 a 16, o una variedad que tenga resistencia al menos a las razas Pfs 8, 9, 11, 13 y 16, el obtentor debe combinar varios de los genes de resistencia conocidos. No se conoce ningún gen individual que confiera resistencia a todas las razas conocidas dePeronospora farinosa,o a las razas Pfs 8, 9, 11, 13 y 16 o, en especial, un gen individual que confiera resistencia dominante al menos a las razas Pfs 8, 9, 11, 13 y 16. Además, no es posible combinar todos los genes de resistencia (un apilamiento completo), ya que algunos genes de resistencia Pfs son alélicos. Esto limita las posibles combinaciones de genes de resistencia, por lo que se buscan nuevos genes que permitan nuevas combinaciones.
Basándose en la bibliografía, tal como Correll y Koike(supra)y Fenget al.(2014), Plant Disease, vol. 96, n.° 1, págs.
145-152, la resistencia frente a las razas de Pfs proporcionada por los diferentes genes de resistencia RPF puede resumirse como sigue (- = resistente, = susceptible):
Existe la necesidad de proporcionar nuevos genes de resistencia, EN especial contra las nuevas razas, tales como Pfs16 y Pfs 17.
Sumario de la invención
En el presente documento se proporciona un procedimiento, tal como se establece en las reivindicaciones adjuntas, para identificar o seleccionar una planta de espinaca cultivada que comprende un fragmento de introgresión procedente de un pariente silvestre de la espinaca, conteniendo dicho fragmento un único gen que confiere resistencia dominante al menos a las razas 8, 9, 11, 13 y 16 dePeronospora farinosa,preferentemente al menos a las razas 8, 9, 11, 13, 16 y 17. Además, el gen confiere resistencia, al menos cuando el gen está en forma homocigótica, a las razas Pfs 1 a 7 y resistencia a las razas Pfs 12 y 14. En otro aspecto, el gen confiere resistencia contra el aislado Pfs UA0514 y/u otros aislados Pfs, en especial también contra la nueva raza Pfs 17. La resistencia contra la nueva raza Pfs 17 también parece ser dominante. Así, en forma homocigótica, el gen confiere resistencia a las razas Pfs 1-9, 11-14 y 16 y 17, mientras que la resistencia contra al menos las razas 8, 9, 11, 13, 16 (y probablemente también contra Pfs17) también se confiere cuando el gen está en forma heterocigótica. La dominancia para las otras razas puede ser fácilmente comprobada por la persona experta en la materia, tal como en el presente documento se describe.
El gen no confiere resistencia a las razas Pfs 10 y 15, tanto si está en forma homocigótica como heterocigótica.
El fragmento de introgresión que comprende el gen procede de un pariente silvestre de la espinaca. En un aspecto preferido, el pariente silvestre de la espinaca esSpinacia turkestanica.
El gen de resistencia se denominaRPF15.
En forma homocigótica (dos copias), RPF15 confiere resistencia contra las razas Pfs 1 a Pfs9, Pfs 11 a Pfs14 y a Pfs 16 y Pfs 17, es decir, contra un total de 15 de las 17 razas oficiales conocidas. Es importante destacar que la resistencia es dominante con respecto a las razas Pfs 8, 9, 11, 13 y 16 (es decir, una copia del gen RPF15, o del fragmento de introgresión que comprende el gen RPF15, es suficiente para conferir resistencia contra una raza concreta), y probablemente también contra Pfs17. Para probar o confirmar la dominancia, es necesario que el gen RPF15 esté presente en forma heterocigótica en una planta de espinaca susceptible, y entonces se puede probar la resistencia contra diferentes razas de Pfs, tal como la Pfs17. Si el gen RPF15 sigue confiriendo resistencia contra una raza concreta cuando sólo una copia del fragmento de introgresión está presente en el genoma de la espinaca, entonces la resistencia contra esa raza es dominante.
Cuando el gen RPF15 está en forma homocigótica, la resistencia contra las razas Pfs 12 y 14 se clasifica como resistencia intermedia, lo que significa que las plantas inoculadas con la raza Pfs12 o Pfs14 pueden mostrar a veces algunos síntomas leves de clorosis y/o esporulación, pero en un estadio más tardío y en un grado mucho menor que una planta susceptible. En condiciones normales de campo, las plantas serán resistentes a estas razas, a menos que haya una presión muy alta de la enfermedad de esas razas en el campo, lo que podría dar como resultado el desarrollo de algunos síntomas de la enfermedad (aunque en un estadio tardío). Por lo tanto, a lo largo de este documento, se hará referencia a la "resistencia" a Pfs 12 y Pfs 14 conferida por el gen RPF15 y se entenderá que la resistencia es una resistencia intermedia como se conoce en la técnica y como se designa habitualmente utilizando el símbolo (-).
En un aspecto descrito en el presente documento,RPF15confiere resistencia dominante al menos a las razas Pfs 8, 9, 11, 13 y 16, preferentemente a las razas 8, 9, 11, 13, 16 y 17, y además confiere resistencia, al menos cuando RPF15 está en forma homocigótica, a las razas Pfs 1 a 7, a las razas Pfs 12 y 14, y al aislado Pfs UA0514 y posiblemente también a otros aislados de Pfs. Así pues, en el presente documento se divulga un único gen que confiere resistencia dominante al menos a las razas Pfs 8, 9, 11, 13 y 16, preferentemente a las razas 8, 9, 11, 13, 16 y 17, y que confiere resistencia, cuando el gen está en forma homocigótica, al menos a 15 de las 17 razas oficialmente denominadas (a saber, Pfs 1-9, Pfs11-14 y Pfs 16 y 17).
Un aspecto descrito en el presente documento es el genRPF15,que confiere resistencia dominante al menos a las razas Pfs 8, 9, 11, 13 y 16, preferentemente al menos a las razas Pfs 8, 9, 11, 13, 16 y 17, y además confiere resistencia a las razas Pfs 1,2, 3, 4, 5, 6 y 7 al menos cuando el gen (o fragmento de introgresión que comprende el gen) está en forma homocigótica y a las razas Pfs 12 y 14 al menos cuando el gen (o fragmento de introgresión que comprende el gen) está en forma homocigótica.
El genRPF15está ligado al nucleótido donante resistente para SNP_01, que comprende una adenina (A) en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 o que comprende una adenina en la posición equivalente en una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y está ligado al nucleótido donante resistente para SNP_02, que comprende una citosina (C) en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3, o comprende una citosina en la posición equivalente en una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3 (cuando se alinean por pares utilizando, por ejemplo, el programa Needle de Emboss). Así, la planta de espinaca, o una parte de dicha planta de espinaca, o una semilla, o una célula, o un cultivo celular de células de la planta de espinaca descritos en el presente documento, pero que no están de acuerdo con la invención, comprende en su genoma un cromosoma recombinante que comprende un fragmento de introgresión procedente de una planta donante, comprendiendo dicho fragmento de introgresión el genRPF15que está ligado a SNP_01, que comprende una adenina en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 o a una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 que conserva el nucleótido donante resistente SNP_01 y/o ligado al SNP_02, que comprende una citosina en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3 o a una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3 que conserva el nucleótido donante resistente SNP_02. Dado que la espinaca es diploide, si el fragmento de introgresión que comprende SNP_01 y SNP_02 está presente en forma homocigótica, el genotipo de la planta en SNP_01, es decir, el nucleótido 106 de<s>E<q>ID NO: 1, es AA y el genotipo de la planta en SNP_02, es decir, el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3, es CC. Si el fragmento de introgresión que comprende el SNP_01 está presente en forma heterocigótica, el genotipo de la planta en el SNP_01, es decir, el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1, es AC, AG o AT, y si el fragmento de introgresión que comprende el SNP_02 está presente en forma heterocigótica, el genotipo de la planta en SNP_02, es decir, el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 1, es CA, CG o CT
En un aspecto descrito en el presente documento, el fragmento de introgresión que comprende RPF15 comprende SEQ ID NO: 1, o una secuencia que comprende al menos un 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, con una adenina en el nucleótido 106 de s Eq ID NO: 1, o en el nucleótido equivalente cuando se alinean por pares utilizando, por ejemplo, el programa Needle de Emboss y/o el fragmento de introgresión comprende SEQ ID NO: 3, o una secuencia que comprende al menos un 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3, con una citosina en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3, o en el nucleótido equivalente cuando se alinean por pares utilizando, por ejemplo, el programa Needle de Emboss.
Cuando se hace referencia en el presente documento a un genotipo SNP en una posición específica, por ejemplo, en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1, o en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3, o "de una secuencia que comprende al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO", esto significa que el genotipo SNP está presente en una secuencia variante en un nucleótido equivalente al mismo nucleótido (correspondiente al mismo) (por ejemplo, equivalente al nucleótido 106 del SEQ ID NO: 1 o al nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3) en la secuencia variante, es decir, en una secuencia que comprende al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con la mencionada SEQ ID NO. Puede ocurrir, por ejemplo, que la secuencia variante sea uno o unos pocos nucleótidos más corta, pero cuando se alinea por pares la secuencia variante con la mencionada SEQ ID NO, se puede ver qué nucleótido de la secuencia variante equivale (corresponde) al mismo nucleótido. En la secuencia variante para<s>N<p>_01 esto puede ser, por ejemplo, el nucleótido número 105 o 107 de esa secuencia variante que es equivalente al nucleótido 106 de la secuencia mencionada. En la secuencia variante para SNP_02 esto puede ser, por ejemplo, el número de nucleótido 183 o 185 o 190 de esa secuencia variante que es equivalente al nucleótido 184 de la secuencia mencionada.
También se describe en el presente documento, pero no de acuerdo con la invención, una planta de espinaca cultivada, o una parte de dicha planta, o una semilla de la misma, que comprende un fragmento de introgresión procedente de un donante que es un pariente silvestre de la espinaca, comprendiendo dicho fragmento el nuevo gen de resistenciaRPF15,cuyas plantas tienen así resistencia dominante al menos a las razas Pfs 8, 9, 11, 13 y 16, preferentemente al menos a las razas Pfs 8, 9, 11, 13, 16 y 17. La planta de espinaca cultivada, o una parte de dicha planta, o una semilla de la misma, son resistentes, al menos cuando el gen RPF15 está presente en forma homocigótica, a una o más de las razas Pfs 1 a 9, a las razas Pfs 11 a 14, 16-17 y al aislado Pfs UA0514. Dicho fragmento introgresado en la planta de espinaca cultivada comprende el nucleótido donante resistente para SNP_01, que es una adenina (A) en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 o una adenina en la posición equivalente de una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y/o el nucleótido donante resistente para SNP_02, que es una citosina en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3 o una citosina en la posición equivalente de una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3.
Así, en el presente documento se describe una planta de espinaca, pero no de acuerdo con la invención, que comprende un fragmento de introgresión procedente de un donante que es un pariente silvestre de la espinaca, en especial S.turkestanica,en el que dicho fragmento de introgresión comprende un gen, que confiere resistencia contra al menos las razas 1 a 9, 11 a 14 y 16 y 17 dePeronospora farinosacuando el gen está en forma homocigótica y el fragmento de introgresión comprende una adenina en el nucleótido 106 (SNP_01) de SEQ ID NO: 1, por lo que una planta de espinaca homocigótica para el fragmento de introgresión comprende el genotipo "AA" para SNP_01 y/o el fragmento de introgresión comprende una citosina en el nucleótido 184 (SNP_02) de SEQ ID NO: 3, por lo que una planta de espinaca homocigótica para el fragmento de introgresión comprende el genotipo "CC" para SNP_02.
También se describe en el presente documento, pero no de acuerdo con la invención, una planta de espinaca cultivada, o una parte de dicha planta, o una semilla que puede convertirse en dicha planta, o una célula, o un cultivo celular de células de espinaca, en los que dicha parte o dichas células pueden regenerarse en una planta, que comprende el gen de resistenciaRPF15,en los que dicha planta cultivada o planta regenerada tiene resistencia dominante al menos a las razas Pfs 8, 9, 11, 13 y 16, preferentemente a las razas 8, 9, 11, 13, 16 y 17, y preferentemente comprende el nucleótido donante resistente para SNP_01, que es una adenina (A) en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 o una adenina en la posición equivalente de una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y/o el nucleótido donante resistente para SNP_02, que es una citosina en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3 o citosina en la posición equivalente de una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3 (cuando se alinean por pares utilizando, por ejemplo, el programa Needle de Emboss, con los parámetros por defecto). La planta de espinaca cultivada, la parte de planta de la misma o dicha semilla son además resistentes a las razas de Pfs 1 a 7, 12 y 14, o en otra opción, al aislado de Pfs UA0514 y/o a otros aislados de Pfs al menos cuando el gen RPF15 (o el fragmento de introgresión que comprende el gen) está en forma homocigótica.
También se describe en el presente documento, pero no de acuerdo con la invención, un procedimiento para generar una planta de espinaca cultivada que comprende resistencia al menos a las razas Pfs 8, 9, 11, 13 y 16 y 17 y resistencia adicional a las razas Pfs 1 a 7, 12 y 14, al menos cuando el gen RPF15 está en forma homocigótica, y al aislado de Pfs UA0514 y/o a otros aislados de Pfs, en la que la planta comprende el nucleótido donante resistente para SNP_01, que es una adenina (A) en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1, o una adenina en la posición equivalente de una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y/o el nucleótido donante resistente para SNP_02, que es una citosina en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3 o una citosina en la posición equivalente de una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3 (cuando se alinean por pares utilizando, por ejemplo, el programa Needle de Emboss, con los parámetros por defecto).
Un aspecto describe una planta de espinaca cultivada que comprende un fragmento de introgresión procedente de un donante que es un pariente silvestre de la espinaca, en el que dicho fragmento de introgresión comprende un único gen, que confiere resistencia en forma heterocigótica y homocigótica, contra al menos las razas 8, 9, 11, 13 y 16 y 17 dePeronospora farinosa,y dicho gen está ligado a SEQ ID NO: 1 que comprende una adenina en el nucleótido 106 (SNP_01), o a una secuencia que comprende al menos un 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y que comprende una adenina en la posición nucleotídica equivalente al nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 y/o ligado a SEQ ID NO: 3 que comprende citosina en el nucleótido 184 (SNP_02), o a una secuencia que comprende al menos un 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3 y que comprende una citosina en la posición nucleotídica equivalente al nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3.
En el presente documento se proporciona un procedimiento para identificar o seleccionar una planta de espinaca como se establece en las reivindicaciones adjuntas que comprende un fragmento de introgresión procedente de un donante que es un pariente silvestre de la espinaca, en el que dicho fragmento de introgresión comprende un único gen, que confiere resistencia en forma heterocigótica y homocigótica, contra al menos las razas 8, 9, 11, 13 y 16 dePeronospora farinosa,preferentemente las razas 8, 9, 11, 13, 16 y 17, y dicho procedimiento comprende: determinar la presencia de una adenina en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 (SNP_01), o de una adenina en la posición nucleotídica equivalente al nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 en una secuencia que comprende al menos al menos un 90%, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, y determinar la presencia de una citosina en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3 (SNP_02), o de una citosina en la posición nucleotídica equivalente al nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3 en una secuencia que comprende al menos al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3.
El procedimiento puede comprender además ensayar el fenotipo de resistencia contra una o más de las razas Pfs mencionadas en el presente documento como conferidas por el gen RPF15.
La presencia de una adenina en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 o en el nucleótido equivalente de una secuencia variante, y la presencia de una citosina en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3 o en el nucleótido equivalente de una secuencia variante (por ejemplo, la posición 190) puede determinarse mediante diversos procedimientos conocidos en la técnica, tales como los procedimientos de genotipado de SNP, secuenciación, etc.
También se describe en el presente documento, pero no de acuerdo con la invención, una planta de espinaca cultivada, una parte de la misma, o una semilla que puede convertirse en tal planta, así como una célula o un cultivo celular, que comprende el gen de resistenciaRPF15,en los que dicho gen es el gen presente en semillas de espinaca cultivadas depositadas bajo el número de registro NCIMB 42608, o puede obtenerse a partir de ellas o puede derivarse de las mismas, o la progenie derivada de dicha semilla.
Así, en el presente documento se describe, pero no de acuerdo con la invención, una planta de espinaca que comprende un fragmento de introgresión procedente de un donante que es un pariente silvestre de la espinaca, en especial S.turkestanica,en la que dicho fragmento de introgresión comprende un gen que confiere resistencia contra al menos las razas 8, 9, 11, 13, 16 dePeronospora farinosa,preferentemente las razas 8, 9, 11, 13, 16 y 17, cuando el gen está en forma heterocigótica, y contra las razas 1 a 9, 11 a 14, 16 y 17 cuando el gen está en forma homocigótica, y el fragmento de introgresión comprende una adenina en el nucleótido 106 (SNP_01) de SEQ ID NO: 1 y/o una citosina en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3, en la que dicho gen es el gen presente en plantas cultivadas a partir de semillas, una muestra representativa de las cuales se ha depositado con el número de registro NCIMB 42608.
En el presente documento se describe, pero no de acuerdo con la invención, una planta de espinaca de la especieSpinacia oleraceaque comprende resistencia contra las razas 8, 9, 11, 13, 16 dePeronospora farinosa,preferentemente las razas 8, 9, 11, 13, 16 y 17, en la que dicha resistencia es conferida por un fragmento de introgresión que comprende un único gen, comprendiendo dicho fragmento de introgresión una adenina para SNP_01 en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 y/o una citosina en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3, en la que dicho gen es el gen presente en plantas cultivadas a partir de semillas, una muestra representativa de las cuales se ha depositado con el número de registro NCIMB 42608.
En el presente documento también se describe, pero no de acuerdo con la invención, una planta de progenie de dicha planta de espinaca, en la que dicha planta de progenie conserva el fragmento de introgresión que comprende el gen de resistencia y comprende una adenina para SNP_01 en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 y/o una citosina para SNP_02 en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3, y dicho gen confiere resistencia contra las razas 8, 9, 11, 13, 16 dePeronospora farinosa,preferentemente las razas 8, 9, 11, 13, 16 y 17, cuando el gen está en forma heterocigótica.
Además, en el presente documento se describe, pero no de acuerdo con la invención, una planta de espinaca cultivada, una parte de la misma o una semilla que puede convertirse en tal planta, así como una célula o un cultivo celular, que comprende un fragmento de introgresión procedente de un donante que es un pariente silvestre de la espinaca, comprendiendo dicho fragmento el gen de resistenciaRPF15,en los que dicho fragmento de introgresión es el fragmento presente en las semillas de espinaca cultivadas depositadas con el número de registro NCIMB 42608, o puede obtenerse a partir de ellas o puede derivarse de las mismas, o que comprende un subfragmento de dicho fragmento de introgresión que conservaRPF15.En un aspecto, en el presente documento se describe que dicho fragmento o subfragmento de introgresión comprende el nucleótido donante resistente para SNP_01, que comprende una adenina (A) en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1, o comprende una adenina en la posición equivalente de una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y/o dicho fragmento o subfragmento de introgresión comprende el nucleótido donante resistente SNP_02, que comprende una citosina (C) en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3 o comprende una citosina en la posición equivalente de una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3 (cuando se alinean por pares utilizando, por ejemplo, el programa Needle de Emboss).
La invención proporciona un procedimiento, tal como se establece en las reivindicaciones adjuntas, para identificar una planta de espinaca cultivada, o una semilla, una parte de la planta o una célula o un cultivo celular de la misma, que comprende resistencia al menos a las razas Pfs 8, 9, 11, 13 y 16, preferentemente al menos a las razas 8, 9, 11, 13, 16 y 17, y resistencia adicional a una o más de las razas Pfs 1 a 7, 12 y 14, y al aislado Pfs UA0514, al menos cuando el gen de resistencia está en forma homocigótica. La invención proporciona además un procedimiento tal como el establecido en las reivindicaciones adjuntas para la identificación, la selección o la detección del genRPF15o del fragmento de introgresión que comprende el gen RPF15, utilizando el nucleótido donante resistente para SNP_01, que comprende una adenina (A) en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 o que comprende una adenina en la posición equivalente en una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y/o utilizando el nucleótido donante resistente para SNP_02, que comprende una citosina (C) en el nucleótido 184 de s Eq ID NO: 3 o que comprende citosina en la posición equivalente en una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3 (cuando se alinean por pares utilizando, por ejemplo, el programa Needle de Emboss).
En un aspecto descrito en el presente documento, el gen de resistenciaRPF15está ligado al nucleótido donante resistente del SNP_01, que comprende una adenina (A) en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 o una adenina en la posición equivalente en una secuencia que tiene al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y/o está ligado al nucleótido donante resistente para SNP_02, que comprende una citosina (C) en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3 o citosina en la posición equivalente en una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3.
En un aspecto descrito en el presente documento, el gen de resistenciaRPF15se ubica en un fragmento de introgresión, o en una parte de dicho fragmento, en un cromosoma recombinante. En un aspecto descrito en el presente documento, el fragmento de introgresión se encuentra en el cromosoma 3 del genoma de la espinaca, en el que el cromosoma 3 es el cromosoma que se encuentra en la base de datos SpinachBase y se describe en Xuet al.(2017,supra).El SNP_01 se ubica en el nucleótido 1090954 del cromosoma 3 en la base de datos. El SNP_02 se ubica en el nucleótido 607751 del cromosoma 3 en la base de datos. En esta secuencia de una variedad de espinaca cultivada en China, que no comprende un fragmento de introgresión que comprendeRPF15,SNP_01 tiene una adenina en el nucleótido 1090954 del cromosoma 3 y SNP_02 tiene una citosina en el nucleótido 607751 del cromosoma 3. En un aspecto descrito en el presente documento, el gen RPF15 se ubica en el cromosoma 3 entre el SNP_02, en el nucleótido 607751 (0,6 Mb), y el nucleótido 1219930 (1,2 Mb) del cromosoma 3. Así pues, la región del cromosoma 3 en la que se encuentra el gen RPF15 es relativamente pequeña (región de 0,6Mb). La secuenciación o la cartografía fina pueden delimitar aún más la región y la edición genética Crispr/Cas de los genes que se encuentran en la región puede utilizarse para demostrar cuál de los genes introgresados del donante silvestre presente en la región es responsable del fenotipo de resistencia. En otro aspecto descrito en el presente documento, el gen RPF15 está situado entre SNP_01 y SNP_02, lo que significa que los marcadores de SNP están situados en lados diferentes del gen. Cabe señalar que la referencia en el presente documento a un "único gen" significa que se descubrió que la segregación de la resistencia tenía la proporción de segregación de un solo gen o locus (véanse los ejemplos). No excluye que pueda haber varios genes estrechamente ligados en el fragmento de introgresión que se segregan como un "único gen" o locus.
Así pues, en un aspecto descrito en el presente documento, pero que no está de acuerdo con la invención, la planta de espinaca cultivada o la semilla que puede convertirse en dicha planta o parte de planta o la célula/cultivo celular de espinaca cultivada comprende un fragmento de introgresión procedente de un pariente silvestre de espinaca, en los que dicho fragmento comprendeRPF15,y preferentemente comprende el nucleótido SNP donante silvestre para SNP_01 y/o para SNP_3. El fragmento de<a>D<n>que comprendeRPF15se introgresa a partir de un pariente silvestre de la espinaca (donante del gen de resistencia) y, en un aspecto preferido, el pariente silvestre de la espinaca esSpinacia turkestanica.El gen se ha introgresado en la espinaca cultivada (el progenitor recurrente). Así, en el presente documento se describe una planta de espinaca cultivada, o una semilla a partir de la cual puede crecer dicha planta, una parte de la planta o un cultivo celular de la misma, que comprende un fragmento de introgresión de dicho pariente silvestre de la espinaca, en los que el fragmento de introgresión comprende el genRPF15y opcionalmente el nucleótido donante resistente SNP_01, que comprende adenina (A) en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1, o una adenina en la posición equivalente de una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y/o el nucleótido donante resistente SNP_02, que comprende citosina (C) en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3, o una citosina en la posición equivalente de una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3.
También se describe en el presente documento, pero no de acuerdo con la invención, una planta como la descrita, que es heterocigótica para el fragmento de introgresión y comprende un cromosoma que tiene el nucleótido A en la posición 106 de SEQ ID NO: 1, o en la posición equivalente de una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y/o el nucleótido C en la posición 184 de SEQ ID NO: 3, o en la posición equivalente de una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3. En otro aspecto, una planta como la descrita en el presente documento es homocigótica para el fragmento de introgresión y comprende dos cromosomas que tienen el nucleótido A en la posición 106 de SEQ ID NO: 1, o en la posición equivalente de una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y/o el nucleótido C en la posición 184 de SEQ ID NO: 3, o en la posición equivalente de una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3. Preferentemente, los dos cromosomas tienen el mismo fragmento de introgresión, es decir, la secuencia de nucleótidos del fragmento de introgresión y el tamaño y la ubicación del fragmento son los mismos.
En el presente documento se describen además uno o más marcadores de ADN que pueden utilizarse en la selección de plantas o partes de plantas o células que comprenden el gen de resistenciaRPF15.Un marcador proporcionado en el presente documento es el nucleótido donante resistente SNP_01, que comprende adenina (A) en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1, o A en la posición equivalente de una secuencia que comprende al menos un 90%, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y/o el nucleótido donante resistente SNP_02, que comprende citosina (C) en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3, o C en la posición equivalente de una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3. La persona experta puede desarrollar otros marcadores de ADN ligados al genRPF15y/o al fragmento de introgresión, por ejemplo, secuenciando la región del cromosoma 3 que comprende el fragmento de introgresión, tal como, por ejemplo, el presente en NCIMB 42608, con el fin de identificar el fragmento de S.turkestanicadel donante. Cualquier polimorfismo entre el fragmento de S.turkestanicay S.oleráceapuede utilizarse, por ejemplo, como marcador para seleccionar o identificar el fragmento de introgresión que comprendeRPF15.
Mediante la secuenciación del genoma de la semilla depositada, la persona experta puede identificar el fragmento de introgresión de la planta donante/muestra registrada de S.turkestanicaúnica y específica (que tiene una secuencia de nucleótidos específica, que es polimórfica y diferente de la secuencia de S.oleraceaa la que sustituye en el cromosoma 3 y que también es diferente de otras plantas/muestras registradas de S.turkestanica).Asimismo, el fragmento de introgresión puede utilizarse para distinguir una planta descrita en el presente documento de cualquier otra planta de espinaca, incluso si la planta de espinaca tiene el mismo fenotipo de resistencia. Por ejemplo, la planta donante única y específica utilizada en el presente documento, que comprende RPF15 y tiene la secuencia de nucleótidos como en las semillas depositadas NCIMB42608, es una planta donante diferente de la planta donante utilizada para generar NCIMB 42607 (que comprende RPF14), NCIMB 42159 (que comprende RPF12), NCIMB 42158 (que comprende RPF11). Así pues, no sólo los genes de resistencia son diferentes, sino que cada fragmento de introgresión también es único en cuanto a su tamaño, la región del cromosoma y la secuencia de nucleótidos.
También se proporcionan procedimientos para identificar plantas o partes de plantas o células que comprenden dicho gen de resistencia. En algunos aspectos, se proporcionan procedimientos para seleccionar, identificar y/o detectar el gen de resistencia, denominadoRPF15,o un marcador de ADN ligado al gen, tal como SNP_01 o SEQ ID NO: 1 o SNP_02 o SEQ ID NO:3, comprenden, por ejemplo, la hibridación de una o más sondas de ácido nucleico (por ejemplo, la hibridación con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:3, o con una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y que comprende una adenina en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 o una posición equivalente, o con una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3 y que comprende una citosina en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 1 o una posición equivalente) con un ácido nucleico de una planta sospechosa de comprender RPF15, o la amplificación de un ácido nucleico de una planta sospechosa de comprenderRPF15utilizando uno o más cebadores de ácido nucleico. Se pueden preparar cebadores, por ejemplo, para detectar SNP_01 o SNP_02 y para determinar el genotipo SNP de SNP_01 o de SNP_02.
ElRPF15se introgresa a partir de un pariente silvestre de la espinaca (el donante o donante del gen de resistencia) en la espinaca cultivada (también denominada progenitor recurrente o receptor), preferentemente de S.turkestanica.Un aspecto descrito en el presente documento, pero no de acuerdo con la invención, es una planta o una parte de una planta de espinaca cultivada que comprende un fragmento de introgresión procedente de un pariente silvestre de la espinaca, en la que el fragmento de introgresión comprende el genRPF15y, opcionalmente, en la que el genRPF15está ligado al nucleótido donante resistente de SNP_01, que comprende una adenina (A) en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 o una adenina en la posición equivalente en una secuencia que tiene al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y/o está ligado al nucleótido donante resistente para SNP_02, que comprende una citosina (C) en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3 o C en la posición equivalente en una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3.
También se proporciona en el presente documento, tal como se establece en las reivindicaciones adjuntas, el uso de marcadores moleculares de SNP_01, que comprende una adenina (A) en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 o A en la posición equivalente de una secuencia que tiene al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y/o SNP_02, que comprende una citosina (C) en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3 o C en la posición equivalente en una secuencia que tiene al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3) ligados físicamente al gen para la identificación de una planta o una parte de una planta o una semilla o una célula, o un cultivo celular que comprendeRPF15,y procedimientos para utilizar dichos marcadores en la identificación de una planta o una parte de una planta o una semilla o una célula, o un cultivo celular que comprendeRPF15.
En un aspecto, la espinaca cultivada descrita en el presente documento, pero que no está de acuerdo con la invención, comprende un cromosoma recombinante, en especial un cromosoma recombinante 3 (tal como se menciona en Xuet al.,2017,supra),comprendiendo dicho cromosoma el fragmento de introgresión que, a su vez, comprendeRPF15y opcionalmente, en un aspecto, el fragmento de introgresión comprende el nucleótido donante resistente para SNP_01 (es decir, una adenina en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1, o A en la posición equivalente de una secuencia que tiene al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1) y/o comprende el nucleótido donante resistente para SNP_02 (es decir, una citosina en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3, o C en la posición equivalente en una secuencia que tiene al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3). En otro aspecto, los cromosomas restantes de dicha planta son cromosomas de espinacas cultivadas. En un aspecto descrito, el cromosoma recombinante es el cromosoma 3 (tal como se menciona en Xuet al.,2017,supra).
En un aspecto descrito en el presente documento, el fragmento de introgresión (que comprende RPF15) está presente en la parte superior del cromosoma 3 (tal como está presente en SpinachBase), en el que la parte superior es de 0 Mb a 2,0 Mb del cromosoma 3. En un aspecto descrito en el presente documento, RPF15 se ubica en una región que comienza en 0,4 Mb y termina en 1,5 Mb del cromosoma 3. En un aspecto descrito en el presente documento, el fragmento de introgresión tiene un tamaño igual o inferior a 2 Mb y comprende el gen RPF15. En un aspecto descrito en el presente documento, el fragmento de introgresión tiene la misma secuencia de nucleótidos y el mismo tamaño que el fragmento presente en las semillas depositadas con el número de registro NCIMB 42608 y comprende el gen RPF15 (que confiere el fenotipo de resistencia descrito en el presente documento). En un aspecto descrito en el presente documento, el fragmento de introgresión tiene la misma secuencia de nucleótidos que el fragmento presente en las semillas depositadas con el número de registro NCIMB 42608 y comprende el gen RPF15 (que confiere el fenotipo de resistencia descrito en el presente documento), pero tiene un tamaño menor que el fragmento que se encuentra en las semillas depositadas. Así, por ejemplo, una parte del fragmento de tamaño completo puede haber sido eliminada por recombinación, por ejemplo, a ambos lados del gen RPF15. En un aspecto, el fragmento de introgresión comprende RPF15 y también SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 3.
En un aspecto descrito en el presente documento, el genRPF15y/o el fragmento de introgresión y/o el cromosoma recombinante es el gen y/o fragmento de introgresión y/o cromosoma recombinante presente en la semilla depositada con el número de registro NCIMB 42608, o en una planta cultivada a partir de dicha semilla, o en la progenie de la misma que conserve el genRPF15en su genoma, como la progenie que conserve el genRPF15,opcionalmente ligado al nucleótido donante resistente del SNP_01, que comprende una adenina (A) en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 o una adenina en la posición equivalente en una secuencia que tiene al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y/o ligado al nucleótido donante resistente SNP_02, que comprende una citosina (C) en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3 o C en la posición equivalente en una secuencia que comprende al menos un 90%, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3. En un aspecto descrito en el presente documento, pero no de acuerdo con la invención, la progenie conserva el nucleótido SNP_01 del donante y/o el nucleótido SNP_02 del donante, aunque la persona experta también puede seleccionar una planta que conserve el genRPF15,pero que carezca del SNP_01 del donante o del SNP_02 del donante o de ambos y, por tanto, comprende un fragmento de introgresión más corto. Así, en un aspecto descrito en el presente documento, el nucleótido SNP de SNP_01 y/o SNP_02 también puede ser el nucleótido del progenitor recurrente, mientras que el genRPF15sigue presente. La persona experta puede secuenciar el fragmento de introgresión presente en las semillas depositadas y/o presente en la progenie para determinar si el fenotipo de resistencia de una planta es conferido por el genRPF15descrito en el presente documento. El fragmento de introgresión (y cualquier subfragmento del mismo generado por recombinación) es una secuencia genómica específica derivada de un donante específico y, por lo tanto, es única.
Definiciones
El artículo indefinido "un" o "una" no excluye la posibilidad de que esté presente más de uno de los elementos, a menos que el contexto requiera claramente que haya uno y sólo uno de los elementos. Así pues, el artículo indefinido "un" o "una" suele significar "al menos uno".
La "variedad vegetal" es un grupo de plantas dentro del mismo taxón botánico del grado más bajo conocido, que (independientemente de si se cumplen o no las condiciones para el reconocimiento de los derechos de obtentor) puede definirse basándose en la expresión de características que son el resultado de un determinado genotipo o de una combinación de genotipos, que puede distinguirse de cualquier otro grupo de plantas por la expresión de al menos una de esas características, y que puede considerarse como una entidad, porque puede multiplicarse sin ningún cambio. Por lo tanto, la expresión "variedad vegetal" no puede utilizarse para designar un grupo de plantas, aunque sean del mismo tipo, si todas ellas se caracterizan por la presencia de uno o dos loci o genes (o características fenotípicas debidas a estos loci o genes específicos), pero que, por lo demás, pueden diferir enormemente entre sí en lo que respecta a los demás loci o genes.
"Espinaca" o "espinaca cultivada" o"Spinacia oleráceacultivada" se refiere en el presente documento a plantas de la especieSpinacia oleracea(o semillas a partir de las cuales se pueden cultivar las plantas) y partes de dichas plantas, criadas por seres humanos para la alimentación y que tienen buenas características agronómicas. Esto incluye cualquier espinaca cultivada, tal como líneas de fitomejoramiento (por ejemplo, líneas retrocruzadas, líneas endógamas), cultivares y variedades (de polinización abierta o híbridos). Esto incluye cualquier tipo de espinacas, como las espinacas de hoja rizada, plana o lisa o los tipos de hoja semirrizada. Las espinacas silvestres (es decir, no cultivadas) o las parientes silvestres de las espinacas, tales comoSpinacia tetrandraySpinacia turkestanica,no se incluyen en esta definición.
Los "parientes silvestres de las espinacas" comprenden plantas no cultivadas de la familiaSpinacia,en concretoSpinacia tetrandraySpinacia turkestanica.Estas especies también se denominan plantas donantes del genRPF15y tiene opcionalmente marcadores de ADN ligados al gen RPF15, tal como el nucleótido donante resistente SNP_01, que comprende una adenina (A) en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 o una adenina en la posición equivalente en una secuencia que tiene al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y/o el nucleótido donante resistente SNP_02, que comprende una citosina (C) en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3 o C en la posición equivalente en una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3; es decir, se obtiene o puede obtenerse del fragmento que comprende el genRPF15,y, opcionalmente, SNP_01 y/o SNP_02, de dicha planta donante."Spinacia turkestanica"es un pariente silvestre de las espinacas, descrito en a.o. Acta Inst. Bot. Acad. Sc. URSS, Ser. I. Fasc., 2, 123 (1936). En un aspecto descrito, la planta donante del genRPF15es una planta deSpinacia turkestanica;en un aspecto, el fragmento de introgresión es el fragmento de la muestra registrada donante de S.turkestanicatal como se introgresó en NCIMB 42608, o un subfragmento (un fragmento más pequeño generado, por ejemplo, por recombinación meiótica) de ese fragmento de introgresión, cuyo subfragmento confiere el fenotipo de resistencia RPF15 y comprende preferentemente el nucleótido donante resistente para SNP_01 y/o SNP_02.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "planta" incluye la semilla (a partir de la cual se puede cultivar la planta), la planta entera o cualquier parte de la misma, tal como un órgano de la planta (por ejemplo, una hoja cosechada o no cosechada, etc.), una célula vegetal, un protoplasto vegetal, un cultivo de células o tejidos vegetales a partir del cual pueda regenerarse una planta entera, una célula vegetal propagadora o no propagadora, una célula vegetal que no se encuentre en un cultivo de tejidos (pero que se encuentre, por ejemplo,in vivoen una planta o una parte de una planta), una célula vegetal aislada, un callo vegetal, un protoplasto, una microspora, una agrupación de células vegetales, un trasplante de planta, una plántula, una célula vegetal intacta en una planta, un clon vegetal o una micropropagación, o una parte de una planta (por ejemplo, un tejido u órgano cosechado), tal como un esqueje de una planta, una propagación vegetativa, una planta propagada clonalmente, un cotiledón, un hipocótilo, una hoja, una hoja procesada, un tallo, un pedúnculo, un brote, una yema, una raíz, un ápice de raíz, un peciolo, una flor, un pétalo, un estambre, una antera, un estigma, un estilo, un ovario, un grano de polen, un óvulo, un embrión, un saco embrionario, un fruto, meristemo, cámbium, una semilla (producida en la planta tras autofecundación o fecundación cruzada), una parte de una semilla que sea un tejido materno, un injerto, una púa, un portainjerto, una parte de cualquiera de ellos y similares, o un derivado de los mismos, preferentemente que tenga la misma composición genética (o una composición genética muy similar) que la planta de la que se obtiene. También se incluye cualquier estadio de desarrollo, tal como una plántula, un esqueje antes o después del enraizamiento, una planta madura y/o inmadura o una hoja madura y/o inmadura. Cuando se menciona "una semilla de una planta", esto significa las semillas a partir de las cuales se puede cultivar la planta o las semillas producidas en la planta, tras autofecundación o fecundación cruzada.
"Cultivo de tejidos" o "cultivo celular" se refiere a una composiciónin vitroque comprende una célula aislada del mismo tipo o de un tipo diferente o una colección de tales células organizadas en un tejido vegetal. Los cultivos de tejido y los cultivos celulares de espinacas, así como la regeneración de plantas de espinacas a partir de ellos, son bien conocidos y han sido ampliamente publicados (véase, por ejemplo, Nguyenet al.,2013, Plant Biotechnology Reports, vol. 7, n.° 1, pág. 99).
Un "material vegetal cosechado" en el presente documento se refiere a una parte de la planta (por ejemplo, una hoja separada de la planta entera) que ha sido recolectada para su posterior almacenamiento y/o uso posterior. Una "hoja cosechada", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una hoja de espinaca, es decir, la planta sin el sistema radicular, por ejemplo, sustancialmente todas las hojas (cosechadas). Una hoja cosechada se puede procesar. "Una semilla cosechada" se refiere a una semilla cosechada de una línea o variedad, por ejemplo, producida tras autofecundación o fecundación cruzada y recolectada.
Una "progenie" o "progenies" o "un descendiente", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una descendencia, o la primera y/o todas las descendencias posteriores obtenidas (o que pueden obtenerse) de una planta descrita en el presente documento que comprende (conserva) el gen de resistenciaRPF15en forma homocigótica o heterocigótica y/o comprende el fenotipo de resistenciaRPF15descrito en el presente documento. La progenie puede obtenerse por regeneración de un cultivo celular o un cultivo de tejido, o de una parte de una planta, o por autofecundación de una planta, o mediante la producción de semillas de una planta. En otro aspecto descrito en el presente documento, pero no de acuerdo con la invención, la progenie también puede abarcar una planta de espinaca obtenida del cruce de al menos una planta de espinaca con otra planta de espinaca de la misma variedad o de otra variedad o línea (de fitomejoramiento) y/o retrocruzamiento y/o inserción de un locus en una planta y/o mutación. Una progenie es, por ejemplo, una progenie de primera generación, es decir, la progenie se deriva directamente, se obtiene, puede obtenerse o puede derivarse de la planta progenitora, por ejemplo, mediante procedimientos tradicionales de fitomejoramiento (autofecundación y/o cruzamiento) o regeneración. No obstante, el término "progenie" engloba en general generaciones posteriores, tales como la segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima o más generaciones, es decir, generaciones de plantas derivadas, obtenidas, que puede obtenerse o derivarse de la generación anterior, por ejemplo, mediante procedimientos tradicionales de fitomejoramiento, regeneración o técnicas de transformación genética. Por ejemplo, se puede producir una progenie de segunda generación a partir de una progenie de primera generación por cualquiera de los procedimientos mencionados anteriormente. También las plantas dobles haploides son progenie.
Una "línea vegetal" es, por ejemplo, una línea de fitomejoramiento que puede utilizarse para desarrollar una o más variedades. Una "línea endogámica" o "progenitor endogámico" es una línea vegetal desarrollada mediante la autofecundación de una planta durante varias generaciones y que puede utilizarse como progenitor de un "híbrido F1" (o híbrido simple producido mediante el cruce de una línea progenitora masculina con una línea progenitora femenina). Una "línea de fitomejoramiento masculina" o "progenitor masculino" o "línea progenitora masculina" es el progenitor masculino, es decir, el donante de polen. Una "línea de fitomejoramiento femenina" o "progenitor femenino" o "línea progenitora femenina" es el progenitor femenino, es decir, el donante de óvulos. En el fitomejoramiento de la espinaca, el progenitor femenino suele producir flores femeninas al menos 3 semanas antes que las masculinas. Esto evita o reduce en gran medida la presencia de líneas progenitoras femeninas autofecundadas en la producción de semillas híbridas F1.
Una "planta élite de espinaca" es una planta, generalmente un híbrido que tiene un genotipo que produce rasgos agronómicos deseables que permiten a un cultivador cosechar un producto deseable desde el punto de vista comercial. Una "línea élite progenitora" es un progenitor endogámico, cuyo genotipo produce rasgos agronómicos deseables en su progenie híbrida. Un "progenitor élite femenino" es además un buen productor de semillas.
"F1, F2, F3, etc." se refiere a las generaciones emparentadas consecutivas tras un cruce entre dos plantas progenitoras o líneas progenitoras. Las plantas cultivadas a partir de las semillas producidas por el cruce de dos plantas o líneas se denomina generación F1. La autofecundación de las plantas F1 da lugar a la generación F2, etc.
"Híbrido" se refiere a las semillas cosechadas del cruce de una línea o variedad de plantas con otra línea de plantas, y a las plantas o partes de plantas cultivadas a partir de dichas semillas.
"Cruce" se refiere al apareamiento de dos plantas progenitoras. Igualmente, la "polinización cruzada" se refiere a la fecundación por la unión de dos gametos de plantas diferentes.
La "autofecundación" se refiere a la autopolinización de una planta, es decir, a la unión de gametos de la misma planta.
La expresión "técnicas tradicionales de fitomejoramiento" engloba en el presente documento el cruzamiento, retrocruzamiento, autofecundación, selección, duplicación cromosómica, producción de dobles haploides, rescate de embriones, uso de especies puente, fusión de protoplastos, selección asistida por marcadores, fitomejoramiento por mutación, etc., tal como los conoce el obtentor (es decir, procedimientos distintos de la modificación genética/transformación/procedimientos transgénicos), mediante los cuales, por ejemplo, puede obtenerse, identificarse, seleccionarse y/o transferirse el gen de resistenciaRPF15.
"Retrocruzamiento" se refiere a un procedimiento de fitomejoramiento por el cual un rasgo (único), tal como la resistencia a Pfs conferida por el gen de resistenciaRPF15,puede transferirse desde un trasfondo genético (también denominado "donante"; en general, pero no necesariamente, se trata de un trasfondo genético inferior) a otro trasfondo genético (también denominado "progenitor recurrente" o "receptor"; en general, pero no necesariamente, se trata de un trasfondo genético superior). Una descendencia de un cruce (por ejemplo, una planta F1 obtenida cruzando un donante, por ejemplo, un pariente silvestre de la espinaca, con un receptor, por ejemplo, una línea cultivada de espinacas; o una planta F2 o F3, etc., obtenida de la autofecundación de la F1) se "retrocruzará" con el progenitor con el trasfondo genético superior (o receptor), por ejemplo, con el progenitor cultivado. Tras repetidos retrocruzamientos, el rasgo del trasfondo genético donante, por ejemplo, el genRPF15,se habrá incorporado al trasfondo genético recurrente. Las expresiones "conversión genética" o "planta de conversión" o "conversión de locus único" en este contexto se refieren a plantas que se desarrollan por retrocruzamiento en las que se recuperan prácticamente todas las características morfológicas y/o fisiológicas deseadas del progenitor recurrente, además de uno o más genes (por ejemplo, el gen de resistenciaRPF15)transferidos del progenitor donante.
"Regeneración" se refiere al desarrollo de una planta a partir de un cultivo celular o de tejidosin vitroo de una propagación vegetativa.
La "propagación vegetativa", "reproducción vegetativa" o "propagación clonal" se utilizan indistintamente en el presente documento y significan el procedimiento de tomar parte de una planta y permitir que esa parte de la planta forme al menos raíces, en las que la parte de la planta, por ejemplo, se define o se deriva (por ejemplo, se corta) una hoja, una parte de una hoja, un tallo, una parte de un tallo, un pedúnculo, una parte de un pedúnculo, un brote, una parte de un brote, una yema o una parte de una yema, un esqueje, una raíz, una parte de una raíz, un ápice de una raíz, un peciolo, una parte de un peciolo, un cotiledón, una parte de un cotiledón, una flor, una parte de una flor, un pétalo, una parte de un pétalo, un estambre, una parte de un estambre, una antera, una parte de una antera, polen, un estigma, una parte de un estigma, un estilo, una parte de un estilo, un ovario, una parte de un ovario, un óvulo, una parte de un óvulo, una semilla, una parte de una semilla, una cubierta de semilla, un embrión, una parte de un embrión, un hipocótilo, un saco embrionario, un fruto, una parte de un fruto, una célula, un protoplasto, un callo, una microspora, meristemo, cámbium. Cuando una planta entera se regenera por multiplicación vegetativa, también se denomina "propagación vegetativa" o "planta de propagación vegetativa".
Una "planta de locus único convertido (conversión)" se refiere a plantas desarrolladas mediante técnicas de fitomejoramiento que comprenden o consisten en retrocruzamiento, en las que se recuperan prácticamente todas las características morfológicas y/o fisiológicas deseadas de una planta de espinaca, además de las características del locus único (por ejemplo, el locus que comprende el genRPF15del donante), que se han transferido a la planta mediante la técnica de retrocruzamiento y/o mediante transformación genética.
Un "transgén" o "gen quimérico" se refiere a un locus genético que comprende una secuencia de ADN que se ha introducido en el genoma de una planta de espinaca por transformación. Una planta que comprende un transgén integrado de forma estable en su genoma se denomina "planta transgénica".
"Pfs" o"Peronospora farinosa"o"P. effusa" o "mildiú velloso" se refiere a razas del oomicetoPeronospora farinosaf. sp.spinaciae.La definición comprende al menos las razas y los aislados oficialmente reconocidos. Pfs1-Pfs17 se refieren a las razas oficialmente reconocidas, que pueden diferenciarse en los hospedadores diferenciales de espinacas que pueden obtenerse en el Naktuinbouw, P.O. Box 40, 2370 AA Roelofarendsveen, Países Bajos, o a través de las referencias facilitadas por la ISF (International Seed Federation, Federación Internacional de Semillas). Las razas patógenas oficialmente reconocidas están muy extendidas. "Hospedadores diferenciales" o "diferenciales" se refiere a los hospedadores diferenciales de espinacas para distinguir las razas Pfs 1-17, que pueden obtenerse de a.o. Naktuinbouw, PO. Box 40, 2370 AA Roelofarendsveen, Países Bajos, o a través de las referencias facilitadas por la ISF (International Seed Federation, Federación Internacional de Semillas). La raza 16 dePeronospora farinosaf. sp.spinaciaese identificó por primera vez en Salinas, CA, EE. UU. (marzo de 2015), y más tarde se descubrió que estaba muy extendida. Su denominación original fue UA201519B, y fue "caracterizada basándose en el desarrollo de la enfermedad en un conjunto convencional de variedades diferenciales". "La raza Pfs: 16 es capaz de infectar los diferenciales Viroflay, Resistoflay, Clermont, Lazio, Pigeon y Meerkat, pero no es capaz de infectar Califlay, Campania, Boeing (Avenger), Lion, Whale y Caladonia" Existen muchos otros aislados que pueden convertirse en razas oficialmente reconocidas. Un aislado importante dePeronospora farinosaf. sp.spinaciaees UA0514.
Una "planta resistente a Pfs" o "planta resistente al mildiú velloso" o una planta que tiene "resistencia a Pfs" o un "fenotipo resistente a Pfs" se refiere a una planta de espinaca que es resistente contra una o más razas patógenas (y aislados patógenos) de Pfs, tal como, por ejemplo, se determina en un ensayo de resistencia cualitativa en condiciones ambientales controladas. En dicho ensayo de resistencia, una pluralidad de plantas (por ejemplo, al menos 2 réplicas de al menos 10 plantas) de un genotipo se inoculan con una suspensión esporangial de la raza o el aislado y se incuban en condiciones adecuadas. Tras un período de incubación adecuado (por ejemplo, 7, 8, 9, 10, 11 o más días después de la inoculación), se evalúan las plantas para detectar síntomas. Los controles susceptibles deben mostrar esporulación en el momento de la evaluación de los síntomas. Una planta que muestra esporulación en los cotiledones (y/o en la hoja/hojas verdaderas) se considera "susceptible", mientras que una planta que no muestra esporulación en los cotiledones (y/o en la hoja/hojas verdaderas) se considera "resistente". Un genotipo de planta con más del 85 % de las plantas inoculadas (preferentemente más del 90 % o 95 %) clasificadas como planta "resistente" se considera resistente contra la raza o el aislado. En la prueba, más del 85 % de las plantas inoculadas (preferentemente más del 90 % o 95 % de las plantas) de la planta de control susceptible, tal como el cultivar Viroflay, deben mostrar esporulación. Las pruebas adecuadas se describen en los ejemplos, o en Irishet al.,2007 (Plant Disease, vol. 91, n.° 11, en Materials and Methods en las páginas 1392-1394), o en Correllet al.,2010, "Guidelines for Spinach Downy Mildew: Peronospora farinosa f. sp. spinaciae (Pfs)" en el sitio web de la ISF (Federación Internacional de Semillas). Tal como se ha mencionado, la resistencia frente a algunas razas puede subclasificarse además como "resistencia intermedia", lo que indica que el nivel de resistencia es algo diferente, ya que algunas plantas pueden desarrollar algunos síntomas secundarios. En la técnica, esto se indica añadiendo paréntesis alrededor del símbolo de resistencia, es decir, "(-)".
"RPF15"se refiere en el presente documento a un único gen de un pariente silvestre de la espinaca, que confiere resistencia (tal como se define anteriormente) al menos a las razas 8, 9, 11, 13 y 16 de Pfs, preferentemente a las razas 8, 9, 11, 13, 16 y 17 (cuando el gen está en forma homocigótica o heterocigótica), y además confiere resistencia a las razas 1 a 7 de Pfs, resistencia (intermedia) a las razas 12 y 14 y además al aislado UA0514 y/u otros aislados patógenos de Pfs (al menos cuando el gen está en forma homocigótica, pero potencialmente también cuando el gen está en forma heterocigótica). En un aspecto de la invención, la resistencia conferida por RPF15 en forma homocigótica es a las razas 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 16 y 17 de Pfs. El fenotipo de resistencia también se denomina en el presente documento "fenotipo de resistencia a Pfs conferido por el genRPF15".En otro aspecto de la invención,RPF15se ubica en un fragmento de introgresión procedente de un donante que es un pariente silvestre de la espinaca, o en una parte de un fragmento de introgresión. En otro aspecto de la invención,RPF15se introgresa a partir de un pariente silvestre de espinaca y, en un aspecto, el pariente silvestre de espinaca es S.turkestanica.En otro aspecto de la invención,el RPF15está situado entre un primer marcador de ADN y un segundo marcador de ADN. En otro aspecto,RPF15está físicamente ligado al nucleótido donante resistente de SNP_01, que es una adenina (A) en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 o una adenina en la posición equivalente en una secuencia que tiene al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y/o al nucleótido donante resistente SNP_02, que es una citosina (C) en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3 o C en la posición equivalente en una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98%o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3.
El término "locus" (loci en plural) significa un lugar o lugares específicos o un sitio en un cromosoma donde, por ejemplo, se encuentra un gen (por ejemplo, el genRPF15)o un marcador genético. En las espinacas descritas en el presente documento, el locus de resistencia que comprende el genRPF15se introgresa a partir de un pariente silvestre de la espinaca, por ejemplo, a partir de una muestra registrada resistente de S.turkestanica(es decir, la planta donante) en la espinaca cultivada. El locus donde se encuentra el genRPF15está física y genéticamente ligado al nucleótido donante resistente del SNP_01, que es una adenina (A) en el nucleótido 106 del SEQ ID NO: 1 o una adenina en la posición equivalente en una secuencia que tiene al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y/o del SNP_02, que es una citosina (C) en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3 o C en la posición equivalente en una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3.
Los términos "alelo" y "alelos" significan cualquiera de una o más formas alternativas de un gen en un locus concreto, y todos estos alelos se relacionan con un rasgo o característica en un locus específico. En una célula diploide de un organismo, los alelos de un gen determinado se encuentran en una ubicación específica o locus (loci en plural) de un cromosoma. Un alelo está presente en cada cromosoma del par de cromosomas homólogos. Una especie vegetal diploide puede comprender un gran número de alelos diferentes en un locus concreto. Puede tratarse de alelos idénticos del gen (homocigóticos) o de dos alelos diferentes (heterocigóticos).
El término "gen" designa una secuencia de ADN (genómico) que comprende una región (región transcrita), que se transcribe en una molécula de ARN mensajero (ARNm) en una célula, y una región reguladora ligada operativamente (por ejemplo, un promotor). Los diferentes alelos de un gen son, por tanto, diferentes formas alternativas del gen, que pueden presentarse, por ejemplo, en forma de diferencias en uno o más nucleótidos de la secuencia de ADN genómico (por ejemplo, en la secuencia del promotor, las secuencias de exones, las secuencias de intrones, etc.), ARNm y/o una secuencia de aminoácidos de la proteína codificada.
Por "prueba de alelismo" se entiende una prueba genética que permite comprobar si dos fenotipos, observados en dos plantas, están determinados por el mismo gen o por genes diferentes. Por ejemplo, las plantas que se van a analizar se cruzan entre sí, la F1 se autofecunda y se determina la segregación de los fenotipos entre la progenie F2. La proporción de segregación indica si los genes son alélicos o no. Véase, por ejemplo, el documento EP1816908B1, en el que se utilizó una prueba de alelismo para demostrar que el alelo HMBN no es alélico de los alelos dw-1 y dw-2 y se encuentra en un locus diferente.
Un "fragmento de introgresión" o "segmento de introgresión" o "región de introgresión" se refiere a un fragmento cromosómico (o parte o región cromosómica) que se ha introducido en otra planta de la misma especie o de una especie afín mediante cruzamiento o técnicas tradicionales de fitomejoramiento, tales como el retrocruzamiento, es decir, el fragmento introgresado es el resultado de los procedimientos de fitomejoramiento a los que se refiere el verbo "introgresar" (tales como el retrocruzamiento). En el caso de la espinaca, se pueden utilizar parientes silvestres de la espinaca, tales comoSpinacia turkestanica,para introducir fragmentos del genoma silvestre en el genoma de la espinaca cultivada. Así pues, dicha planta de espinaca tiene un "genoma deSpinacia oleracea",pero comprende en el genoma un fragmento de un pariente silvestre de la espinaca, es decir, un fragmento de introgresión de una planta donante. Se entiende que el término "fragmento de introgresión" nunca incluye un cromosoma entero, sino sólo una parte de un cromosoma. El fragmento de introgresión puede ser grande, por ejemplo, incluso la mitad de un cromosoma, pero preferentemente es más pequeño, tal como aproximadamente 15 Mb o menos, tal como aproximadamente 10 Mb o menos, aproximadamente 9 Mb o menos, aproximadamente 8 Mb o menos, aproximadamente 7 Mb o menos, aproximadamente 6 Mb o menos, aproximadamente 5 Mb o menos, aproximadamente 4 Mb o menos, aproximadamente 3 Mb o menos, aproximadamente 2 Mb o menos, aproximadamente 1 Mb (equivale a 1000000 pares de bases) o menos, o aproximadamente 0,7 Mb, 0,6 Mb, 0,5 Mb (equivale a 500000 pares de bases) o menos, tal como aproximadamente 200000 pb (equivale a 200000 pares de bases) o menos, aproximadamente 100000 pb (100 kb) o menos, aproximadamente 50000 pb (50 kb) o menos, aproximadamente 25000 pb (25 kb) o menos. La persona experta puede introgresar dicho fragmento que conserva un gen que confiere un rasgo deseado desde una planta donante a una planta receptora. La secuenciación del genoma completo de una planta que comprende un fragmento de introgresión identificará dicho fragmento de introgresión como derivado de una especie donante concreta y permitirá identificar al donante específico, ya que la secuencia es exclusiva de un donante concreto.
Un "fragmento de introgresión que comprende el gen de resistenciaRPF15" o un "fragmento de introgresiónRPF15" se refiere a una parte de un cromosoma que se deriva del donante y que comprende el genRPF15.En un aspecto, el fragmento de introgresión comprende además uno o más marcadores que son polimórficos entre la planta donante y la planta de espinaca cultivada, que permiten la identificación del fragmento de introgresión, tal como SNP_01 o SNP_02. Así, en un aspecto, el gen RPF15 está ligado al nucleótido donante resistente del SNP_01, que es una adenina (A) en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 o una adenina en la posición equivalente en una secuencia que tiene al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y/o al nucleótido donante resistente de SNP_02, que es una citosina (C) en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3 o C en la posición equivalente en una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3.
Un "nucleótido donante de SNP_01" se refiere al nucleótido adenina que se encuentra en la primera ubicación de SNP, es decir, en la posición nucleotídica 106 de SEQ ID NO: 1 o adenina en la posición equivalente de una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1.
Un "nucleótido donante de SNP_02" se refiere al nucleótido citosina que se encuentra en la segunda ubicación de SNP, es decir, en la posición nucleotídica 184 de SEQ ID NO: 3 o citosina en la posición equivalente de una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3.
La "identidad de secuencia" puede determinarse mediante la alineación de dos secuencias de nucleótidos utilizando algoritmos de alineación global o local. Las secuencias pueden entonces denominarse "sustancialmente idénticas" o "fundamentalmente similares" cuando se alinean de forma óptima, por ejemplo, mediante los programas GAP o BESTFIT o el programa "Needle" de Emboss (utilizando parámetros por defecto, véase más adelante) y comparten al menos un determinado porcentaje mínimo de identidad de secuencia (definido más adelante). Estos programas utilizan el algoritmo de alineación global de Needleman y Wunsch para alinear dos secuencias en toda su longitud, maximizando el número de coincidencias y minimizando el número de huecos. En general, se utilizan los parámetros por defecto, con una penalización de creación de hueco = 10 y una penalización de extensión de hueco = 0,5 (tanto para alineaciones de nucleótidos como de proteínas). Para los nucleótidos, la matriz de puntuación utilizada por defecto es DNAFULL. Las alineaciones de secuencias y las puntuaciones de los porcentajes de identidad de secuencias pueden determinarse, por ejemplo, utilizando programas informáticos, tales como EMBOSS, disponible en la web ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/). Como alternativa, la similitud o identidad de secuencias puede determinarse mediante búsquedas en bases de datos, tales como FASTA, BLAST, etc., pero las coincidencias deben recuperarse y alinearse por pares para comparar la identidad de secuencias. Dos secuencias de ácidos nucleicos tienen una "identidad de secuencia sustancial" si el porcentaje de identidad de secuencia es al menos del 90 %, del 91 %, del 92 %, del 93 %, del 94 %, del 95 %, del 96 %, del 97 %, del 98 %, del 99 % o más (determinado por "Needle" de Emboss utilizando parámetros por defecto, es decir, penalización por creación de hueco = 10, penalización por extensión de hueco = 0,5, utilizando la matriz de puntuación DNAFULL para ácidos nucleicos).
La "distancia física" entre loci (por ejemplo, entre marcadores moleculares y/o entre marcadores fenotípicos) en el mismo cromosoma es la distancia física real expresada en pares de bases (pb), kilopares de bases (kb) o megapares de bases (Mb).
La "distancia genética" entre loci (por ejemplo, entre marcadores moleculares y/o entre marcadores fenotípicos) en el mismo cromosoma se mide por la frecuencia de entrecruzamiento, o frecuencia de recombinación ("recombination frequency", RF) y se indica en centimorgans (cM). Un cM corresponde a una frecuencia de recombinación del 1 %. Si no se encuentran recombinantes, el RF es cero y los loci están muy próximos físicamente o son idénticos. Cuanto más alejados estén dos loci, mayor será la RF.
Un "marcador molecular" es un fragmento de ADN asociado a una determinada ubicación genómica o cromosómica o a un polimorfismo de un solo nucleótido ("single nucleotide polymorphism", SNP), que se encuentra en el cromosoma cerca del gen de interés, preferentemente cerca delRPF15.Los marcadores moleculares pueden utilizarse para identificar una secuencia concreta de ADN, o una ubicación determinada en un genoma o en un cromosoma, o para identificar un fragmento de introgresión. Cuando en el presente documento se hace referencia a que uno o más marcadores moleculares pueden "detectarse" mediante un ensayo de marcadores moleculares, esto significa, por supuesto, que la planta o parte de la planta comprende dicho uno o más marcadores en su genoma, ya que, de otro modo, el marcador no podría detectarse. En un aspecto, el marcador es un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP), pero también pueden utilizarse otros marcadores moleculares, tales como RFLP, AFLP, RAPD, INDEL, secuenciación de ADN, etc. En un aspecto, una adenina en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 (el nucleótido donante de resistencia para SNP_01), o una adenina en una posición equivalente de una secuencia que comprende al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, está ligado al genRPF15y al fragmento de introgresión que comprende el genRPF15,en el que dicho nucleótido donante resistente puede utilizarse para seleccionar plantas, tejidos de plantas o partes de plantas que comprendan el fragmento de introgresión (que comprendan el genRPF15)y así seleccionar y/o generar plantas o partes de plantas resistentes (como se ha definido anteriormente). En otro aspecto, una citosina en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3 (el nucleótido donante de resistencia para SNP_01), o una adenina en una posición equivalente de una secuencia que comprende al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98% o un 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3, está ligado al genRPF15y al fragmento de introgresión que comprende el genRPF15,en el que dicho nucleótido donante resistente puede utilizarse para seleccionar plantas, tejidos de plantas o partes de plantas que comprendan el fragmento de introgresión (que comprendan el genRPF15)y así seleccionar y/o generar plantas o partes de plantas resistentes (como se ha definido anteriormente). La persona experta puede desarrollar otros SNP polimórficos entre el fragmento de introgresión y la espinaca cultivada mediante, por ejemplo, secuenciación o la cartografía fina.
Los "marcadores flanqueantes" son marcadores moleculares situados en el cromosoma a ambos lados del gen RPF15. La cartografía fina o la secuenciación pueden utilizarse para identificar marcadores flanqueantes. Por ejemplo, SNP_01 y/o SNP_02 pueden combinarse con otro marcador situado al otro lado del gen RPF15 para formar un conjunto de marcadores flanqueantes.
Pueden desarrollarse otros marcadores moleculares que estén ligados aRPF15y/o que se encuentren en el fragmento de introgresión que comprende el gen RPF15, por ejemplo, que se encuentren entre SNP_01 o SNP_02 y RPF15 o que flanqueen el locus RPF15 o estén físicamente ligados a dicho locus. Esto puede hacerse, por ejemplo, mediante la cartografía fina del gen RPF15 o la secuenciación del cromosoma o de la región cromosómica. Cualquiera de estos marcadores puede entonces utilizarse para la identificación y/o selección del fragmento de introgresión que comprende el genRPF15,que confiere resistencia a Pfs (como se ha definido anteriormente) contra al menos las razas 8, 9, 11, 13 y 16 de Pfs (preferentemente al menos las razas 8, 9, 11, 13, 16 y 17) cuando el gen está en forma homocigótica o heterocigótica. Por ejemplo, puede llevarse a cabo una cartografía fina para encontrar marcadores que estén ligados aún más estrechamente al genRPF15en el fragmento de introgresión. La cartografía fina consiste en crear una población de plantas recombinantes (derivadas, por ejemplo, del cruce de semillas depositadas con el número de registro NCIMb 42608, con una planta susceptible, por ejemplo, una línea o variedad susceptible), que comprenda diferentes acontecimientos de recombinación del cromosoma en el que se encuentra el genRPF15y analizar estas plantas recombinantes (que comprenden, por ejemplo, subfragmentos de diferente tamaño del fragmento de introgresión) para el fenotipo de resistencia conferido por el genRPF15y los marcadores de ADN. De este modo, se puede definir con mayor precisión la ubicación del genRPF15e identificar los marcadores más estrechamente ligados al gen. Del mismo modo, pueden generarse plantas que comprendan un fragmento de introgresión más pequeño (es decir, un subfragmento) que el fragmento que se encuentra en las semillas depositadas con el número de registro 42608 del NCIMB. Como alternativa, se puede llevar a cabo la secuenciación para identificar marcadores estrechamente ligados al genRPF15o incluso dentro del gen.
La expresión "ensayo de marcadores" o "ensayo de genotipado" se refiere a un ensayo que puede utilizarse para determinar el genotipo del marcador, por ejemplo, el genotipo del SNP. Por ejemplo, los marcadores de SNP pueden detectarse mediante un ensayo KASP (véase la página web kpbioscience.co.uk) u otros ensayos conocidos por la persona experta.
La "selección asistida por marcadores" o "MAS" ("marker assisted selection") o "fitomejoramiento asistido por marcadores" o "MAB" ("marker assisted breeding") es un proceso que utiliza la presencia de marcadores moleculares, que están genética y físicamente ligados a un locus concreto o a una región cromosómica concreta (por ejemplo, un fragmento de introgresión), para seleccionar plantas (por ejemplo, la progenie) por la presencia del locus o región específicos (por ejemplo, el fragmento de introgresión). Por ejemplo, el nucleótido donante resistente de SNP_01, que es una adenina (A) en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 o A en la posición equivalente de una secuencia que tiene al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, o el nucleótido donante resistente de SNP_02, que es una citosina (C) en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3 o C en la posición equivalente de una secuencia que tiene al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3, o cualquier marcador cercano al genRPF15,puede utilizarse en MAS para seleccionar plantas de espinaca o partes de plantas que contengan el genRPF15.
Cuando se hace referencia a una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ADN genómico) que tiene una "identidad de secuencia sustancial con" una secuencia de referencia o que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80 %, por ejemplo, al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia de ácido nucleico con una secuencia de referencia, en una realización, dicha secuencia de nucleótidos se considera sustancialmente idéntica a la secuencia de nucleótidos dada y puede identificarse utilizando condiciones de hibridación rigurosas. En otra realización, la secuencia de ácido nucleico comprende uno o más nucleótidos sustituidos, insertados o delecionados en comparación con la secuencia de nucleótidos dada, pero aun así puede identificarse utilizando condiciones de hibridación rigurosas.
Las "condiciones de hibridación rigurosas" pueden utilizarse para identificar secuencias de nucleótidos que son sustancialmente idénticas a una secuencia de nucleótidos dada. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán distintas en circunstancias diferentes. Por lo general, las condiciones rigurosas se seleccionan para que sean aproximadamente 5 °C inferiores al punto de fusión térmica (Tf) para las secuencias específicas a una fuerza iónica y un pH definidos. La Tf es la temperatura (con una fuerza iónica y un pH definidos) a la que el 50 % de la secuencia diana se hibrida con una sonda perfectamente adaptada. Generalmente, se elegirán condiciones rigurosas en las que la concentración de sal sea de aproximadamente 0,02 molar a pH 7 y la temperatura sea de al menos 60 °C. La reducción de la concentración de sal y/o el aumento de la temperatura aumentan la rigurosidad. Las condiciones rigurosas para las hibridaciones de ARN-ADN (transferencias Northern utilizando una sonda, por ejemplo, de 100 nt) son, por ejemplo, las que incluyen al menos un lavado en 0,2X SSC a 63 °C durante 20 minutos o condiciones equivalentes. Las condiciones rigurosas para la hibridación de ADN-ADN (transferencias Southern utilizando una sonda, por ejemplo, de 100 nt) son, por ejemplo, las que incluyen al menos un lavado (normalmente 2) en 0,2X SSC a una temperatura de al menos 50 °C, de modo habitual aproximadamente 55 °C, durante 20 min o condiciones equivalentes. Véase también Sambrooket al.(1989) y Sambrook y Russell (2001).
Breve descripción de las secuencias
La SEQ ID NO: 1 representa la secuencia de S.turkestanicaque comprende una adenina (A) para SNP_01 en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1. La SEQ ID NO: 1 está presente en semillas depositadas con el número de registro NCIMB 42608.
La SEQ ID NO: 2 representa la secuencia de S.olerácea(progenitor recurrente) para SNP_01, que comprende una guanina (G) en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 2.
La SEQ ID NO: 3 representa la secuencia de S.turkestanicaque comprende una citosina (C) para SNP_02 en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3. La SEQ ID NO: 3 está presente en semillas depositadas con el número de registro NCIMB 42608.
La SEQ ID NO: 4 representa la secuencia de S.oleracea(progenitor recurrente) para SNP_01, que comprende una guanina (G) en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 4.
La SEQ ID NO: 5 representa una de las secuencias flanqueantes de S.tetrandra,que flanquea el QTL de mildiú velloso descrito en el documento WO2015054339 (correspondiente a SEQ ID NO: 1 en el documento WO2015054339).
La SEQ ID NO: 6 representa las otras secuencias flanqueantes procedentes de S.tetrandra,que flanquean el QTL de mildiú velloso descrito en el documento WO2015054339 (correspondiente a SEQ iD NO: 2 en el documento WO2015054339).
La SEQ ID NO: 7 representa la secuencia de S.oleraceaen la región correspondiente a SEQ ID NO: 5, como semilla presente, habiéndose depositado una muestra representativa con el número NCIMB 42608.
La SEQ ID NO: 8 representa la secuencia de S.oleraceaen la región correspondiente a SEQ ID NO: 6, como semilla presente, habiéndose depositado una muestra representativa con el número NCIMB 42608.
La SEQ ID NO: 9 representa la secuencia de Spinachbase de la figura 1.
La SEQ ID NO: 10 representa la secuencia de Spinachbase de la figura 2.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 muestra la alineación de la secuencia genómica de referencia de SpinachBase con SEQ ID NO: 1 (inferior). La adenina del nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 (SNP_01) y la adenina en la posición equivalente del genoma de referencia están en negrita. Se observa que el SNP_01 no es polimórfico con la secuencia de la línea china de SpinachBase, pero es polimórfico en comparación con el progenitor recurrente susceptible utilizado por los inventores.
La figura 2 muestra la alineación de la secuencia genómica de referencia de SpinachBase con SEQ ID NO: 3 (inferior). La citosina en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3 (SNP_02) y la guanina en la posición equivalente del genoma de referencia están en negrita.
La figura 3 muestra la alineación de SEQ ID NO: 5 (superior) con SEQ ID NO: 7 (inferior).
La figura 4 muestra la alineación de SEQ ID NO: 6 (superior) con SEQ ID NO: 8 (inferior).
Descripción detallada de la invención
Plantas y procedimientos de la invención
En una realización, la invención proporciona un procedimiento para identificar o seleccionar una planta de espinaca cultivada que tiene resistencia contra al menos las razas 8, 9, 11, 13 y 16 dePeronospora farinosa,preferentemente contra al menos las razas 8, 9, 11, 13, 16 y 17, en el que la resistencia es conferida por un único gen dominante. El único gen se denominaRPF15,por "Resistance toPeronospora farinosagene 15" (resistencia al gen 15 dePeronospora farinosa).En el presente documento se describe elRPF15que confiere resistencia dominante contra las razas 8, 9, 11, 13 y 16 dePeronospora farinosa,preferentemente contra las razas 8, 9, 11, 13, 16 y 17. ElRPF15confiere además resistencia contra las razas 1 a 7 dePeronospora farinosa,al menos cuando el gen RPF15 está en forma homocigótica, y resistencia al menos intermedia contra las razas 12 y 14, al menos cuando el gen RPF15 está en forma homocigótica. En otro aspecto de la invención,RPF15confiere resistencia al aislado UA0514 y/o potencialmente a otros aislados patógenos dePeronospora farinosa.Estos otros aislados comprenden potencialmente futuros aislados que se desarrollarán en el campo. El gen no confiere resistencia a las razas 10 y 15. El genRPF15se identificó enSpinacia turkestanicay se introdujo mediante retrocruzamiento enSpinacia oleracea,preferentemente espinaca cultivada. El genRPF15es un único gen. El gen se hereda de forma dominante para al menos la resistencia a las razas Pfs 8, 9, 11, 13 y 16, preferentemente a las razas 8, 9, 11, 13, 16 y 17; es decir, cuando una planta que comprendeRPF15en forma homocigótica se cruza con una planta susceptible, tal como la variedad Viroflay, la progenie F1 mostrará resistencia al menos a las razas Pfs 8, 9, 11, 13 y 16, preferentemente a las razas 8, 9, 11, 13, 16 y 17 y, en la progenie F2, dicha resistencia se segregará en un proporción 3 (resistente):1 (susceptible). El genRPF15está presente en forma homocigótica en la semilla depositada con el número de registro NCIMB 42608, es decir, el fragmento de introgresión que comprendeRPF15está presente en forma homocigótica. El genRPF15está ligado al nucleótido donante resistente SNP_01, que comprende una adenina en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 o adenina en la posición equivalente en una secuencia que tiene al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y/o el nucleótido donante resistente SNP_02, que comprende una citosina en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3 o adenina en la posición equivalente en una secuencia que tiene al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3. Así, el fragmento de introgresión presente en las semillas depositadas comprende SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO: 3, es decir, comprende una adenina en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1, así como una citosina en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3, y tanto la adenina (y la SEQ ID NO:1) como la citosina (y la SEQ ID NO:3) están presentes en forma homocigótica en las semillas depositadas (el genotipo SNP_01 de las semillas depositadas es "Aa " y el genotipo SNP_02 de las semillas depositadas es "CC").
En un aspecto descrito en el presente documento, el genRPF15de S.turkestanicaconfiere resistencia contra al menos las razas Pfs 8, 9, 11, 13 y 16, preferentemente a las razas 8, 9, 11, 13, 16 y 17, cuando el gen está en forma homocigótica o heterocigótica en el genoma de una planta cultivada de espinaca de la especie S.olerácea.
El genRPF15de S.turkestanicano confiere resistencia contra las razas 10 y 15 de Pfs.
En otro aspecto descrito en el presente documento, el genRPF15de S.turkestanicaconfiere resistencia contra al menos las razas Pfs 7, 8, 9, 11, 13 y 16 y 17, o al menos las razas 6, 7, 8, 9, 11, 13 y 16 y 17, o al menos las razas 1 a 9, 11, 13 y 16 y 17, y también resistencia (al menos resistencia intermedia) contra las razas 12 y 14, al menos cuando el gen está en forma homocigótica, y a varias de esas razas también en forma heterocigótica, en el genoma de una planta de espinaca cultivada de la especie S.oleracea.
En otro aspecto descrito en el presente documento,RPF15confiere resistencia al menos a las razas 8, 9, 11, 13, 16 y 17 y además a las razas 1 a 7, 12 y 14, al menos cuandoRPF15(o el fragmento de introgresión que comprendeRPF15)está en forma homocigótica, y a varias de esas razas también cuando el gen (o el fragmento de introgresión que comprende el gen) está en forma heterocigótica, en el genoma de una planta de espinaca cultivada.
En otros aspectos descritos en el presente documento,RPF15confiere resistencia al menos a las razas 8, 9, 11, 13 y 16, preferentemente a las razas 8, 9, 11, 13, 16 y 17 (cuando está en forma homocigótica o heterocigótica) y además a la raza Pfs 1 cuando RPF15 (o el fragmento de introgresión que comprende RPF15) está en forma homocigótica o heterocigótica y/o a la raza Pfs 2 cuandoRPF15(o el fragmento de introgresión que comprende RPF15) está en forma homocigótica o heterocigótica y/o a la raza Pfs 3 cuandoRPF15(o el fragmento de introgresión que comprende RPF15) está en forma homocigótica o heterocigótica y/o a la raza Pfs 4 cuandoRPF15(o el fragmento de introgresión que comprende RPF15) está en forma homocigótica o heterocigótica y/o a la raza Pfs 5 cuandoRPF15(o el fragmento de introgresión que comprende RPF15) está en forma homocigótica o heterocigótica y/o a la raza Pfs 6 cuandoRPF15(o el fragmento de introgresión que comprende RPF15) está en forma homocigótica o heterocigótica y/o a la raza Pfs 7 cuandoRPF15(o el fragmento de introgresión que comprende RPF15) está en forma homocigótica o heterocigótica en el genoma de una planta de espinaca cultivada. En otro aspecto de la invención,RPF15confiere resistencia a la raza 12 y/o 14 y/o al aislado UA0514 y/o a otro aislado patógeno de Pfs cuandoRPF15(o el fragmento de introgresión que comprende RPF15) está en forma homocigótica o heterocigótica en el genoma de una planta de espinaca cultivada.
En otro aspecto descrito en el presente documento, la introgresión deRPF15confiere resistencia dominante al menos a las razas Pfs 8, 9, 11, 13 y 16, preferentemente a las razas 8, 9, 11, 13, 16 y 17, en una planta de espinaca cultivada, en la que el genRPF15(o el fragmento de introgresión que comprende el gen) está ligado (comprende) al nucleótido donante resistente de SNP_01, que es una adenina (A) en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 o A en la posición equivalente de una secuencia que tiene al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y/o al nucleótido donante resistente de SNP_02, que es una citosina (C) en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3 o C en la posición equivalente en una secuencia que tiene al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3. La resistencia contra estas razas se confiere cuando el fragmento de introgresión está en forma homocigótica o en forma heterocigótica, ya que la resistencia es dominante. Para la resistencia contra las otras razas, es decir, las razas 1 a 7, 12 y 14, y UA0514, no está claro si la resistencia sólo se observa cuando el gen RPF15 está en forma homocigótica o si también se observa (para una o más de estas razas) cuando el gen RPF15 está en forma heterocigótica; esto depende de si la resistencia contra una raza es dominante o recesiva. Si la resistencia contra una raza es dominante o recesiva puede comprobarse en un ensayo de resistencia, por ejemplo, en plantas heterocigóticas para RPF15 y/o segregantes para RPF15.
En otro aspecto más descrito en el presente documento, el fragmento de introgresiónRPF15confiere resistencia al menos a las razas Pfs 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 16 y 17 en una planta de espinaca cultivada, en la que el genRPF15(o el fragmento de introgresión que comprende el gen) está ligado (comprende) al nucleótido donante resistente del SNP_01, que es una adenina (A) en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 o A en la posición equivalente de una secuencia que tiene al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y/o al nucleótido donante resistente de SNP_02, que es una citosina (C) en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3 o C en la posición equivalente en una secuencia que tiene al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3. La resistencia contra estas razas se confiere al menos cuando el fragmento de introgresión está en forma homocigótica, opcionalmente también cuando el fragmento de introgresión está en forma heterocigótica, en función de si la resistencia contra una raza es dominante o recesiva. Se observó que la resistencia contra las razas Pfs 8, 9, 11, 13 y 16 se confería de forma dominante. La resistencia contra la raza 17 también es probablemente dominante. Queda por determinar si RPF15 confiere resistencia contra las razas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 12, 14 y/o el aislado UA0514 de forma dominante o recesiva. Como ya se ha dicho, la persona experta puede determinarlo con facilidad. Lo que se sabe es que, cuando RPF15 (o el fragmento de introgresión que comprende RPF15) está presente en forma homocigótica, la planta de espinaca cultivada es resistente contra estas razas. En las semillas depositadas, el fragmento de introgresión está presente en forma homocigótica. Así, las plantas cultivadas a partir de dichas semillas pueden cruzarse con una planta que carezca del gen RPF15 para generar plantas F1, y la población F1 y/o F2 y/o F3 puede someterse a pruebas de resistencia a cada una de las razas Pfs, con el fin de determinar si la resistencia conferida se observa cuando RPF15 está en forma heterocigótica (dominante) o sólo cuando RPF15 está en forma homocigótica (recesiva). Como ya se ha mencionado, el gen no confiere resistencia contra las razas 10 y 15.
Una muestra representativa de semillas de una línea cultivada de espinacas que comprende el genRPF15(es decir, el fragmento de introgresión que comprende el gen RPF15) en forma homocigótica ha sido depositada en virtud del Tratado de Budapest con el número de registro 42608 por Nunhems B.V. el 12 de julio de 2016, en NCIMB Ltd. Así pues, en un aspecto descrito en el presente documento, el gen de resistenciaRPF15(o el fragmento de introgresión que comprende el gen) es el gen (o el fragmento de introgresión) tal como se encuentra en la semilla depositada con el número de registro NCIMB 42608, o procede de una planta o una parte de la misma cultivada a partir de la semilla depositada con el número de registro NCIMB 42608, o procede de un cultivo celular derivado de dicha semilla o dicha planta o dicha parte de la misma. Evidentemente, también en el presente documento se describe la progenie de NCIMB 42608, y dicha progenie comprende el gen RPF15 (o el fragmento de introgresión que comprende el gen) en su genoma nuclear.
Cuando en el presente documento se menciona una planta o a una parte de una planta de espinaca cultivada "que comprende el gen RPF15", se entiende que la planta o la parte de la planta de espinaca comprende el fragmento de introgresión, que comprende el gen RPF15 procedente de un donante silvestre de S.turkestanicaen el locus RPF15 del cromosoma. En un aspecto, el donante silvestre de S.turkestanicaes el mismo donante que en las semillas depositadas, es decir, la secuencia de S.turkestanicadel gen RPF15 y del fragmento que comprende el gen RPF15 tiene la misma secuencia de nucleótidos que en las semillas depositadas. Esto puede determinarse, por ejemplo, mediante la secuenciación del genoma completo. Como alternativa, el donante silvestre de S.turkestanicapuede ser una muestra registrada diferente, que comprenda el gen RPF15 (que confiere, por ejemplo, la misma resistencia a Pfs), pero que tenga una secuencia de nucleótidos que comprenda al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con el gen RPF15 de las semillas depositadas o con el fragmento de introgresión que comprende el gen RPF15 de las semillas depositadas.
La línea de espinaca cultivada de la que se depositó una muestra representativa de semillas como NCIMB 42608, que comprende el fragmento de introgresión de S.turkestanicaportador de RPF15 en forma homocigótica, es resistente contra las razas Pfs 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 16, 17 y UA0514.
El genRPF15se ubica en un fragmento de introgresión procedente de un pariente silvestre de la espinaca. En un aspecto descrito en el presente documento, el fragmento de introgresión procede deSpinacia turkestanicay comprende, además del gen RPF15, un marcador molecular ligado al gen RPF15 y que puede utilizarse para seleccionar un fragmento que comprenda RPF15. Se descubrió que una adenina en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 (el nucleótido donante resistente para SNP_01) estaba ligada al gen RPF15 en el fragmento de introgresión. Se descubrió que una citosina en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3 (el nucleótido donante resistente para SNP_02) también estaba ligada al gen RPF15 en el fragmento de introgresión. Se observó que las líneas susceptibles que carecían del fragmento de introgresión contenían una guanina en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 (tal como se muestra en SEQ ID NO: 2), así como una guanina en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3 (tal como se muestra en SEQ ID NO: 4) o una guanina en el nucleótido 607751 del cromosoma 3, tal como se publica en Spinachbase, y dicho nucleótido es el equivalente al nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3 o 4 (que también se muestra en la posición 190 de la secuencia superior de la figura 2), como puede verse en la alineación por pares (utilizando el programa Needle de Emboss). Así pues, la secuencia de las líneas de plantas susceptibles de S.oleraceapuede mostrar variaciones en la región del marcador de SNP. Así, en un aspecto, el gen RPF15 está ligado a una adenina en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 o a A en la posición equivalente de una secuencia que comprende al menos un 90%, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y/o está ligado a una citosina en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3 o a C en la posición equivalente en una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3. En un aspecto descrito en el presente documento, el gen de resistencia, RPF15, se obtiene o puede obtenerse de una muestra registrada de S.turkestanica,y dicha muestra registrada tiene el mismo fenotipo de resistencia a Pfs conferido por RPF15 (por ejemplo, como las semillas depositadas) y comprende una adenina en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 (el nucleótido donante resistente para SNP_01) o una adenina en la posición equivalente en una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, así como comprende una citosina en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3 (el nucleótido donante resistente para SNP_02) o citosina en la posición equivalente en una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3.
En otro aspecto descrito en el presente documento, el fragmento de introgresión que comprende RPF15 es la introgresión como está presente (y puede obtenerse; o se obtiene; o puede derivarse; o se deriva) en una semilla de espinaca depositada con el número de registro NCIMB 42608 o un subfragmento de la misma (que conserva RPF15), en el que dicho fragmento de introgresión (o subfragmento) comprende el genRPF15que confiere resistencia al menos a las razas Pfs 8, 9, 11, 13 y 16. En un aspecto, el fragmento de introgresión comprende también SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 3.
El fragmento de introgresión presente en las semillas depositadas procede de una muestra registrada donante específica y, por tanto, tiene una secuencia de nucleótidos distintiva. El fragmento completo puede transferirse con facilidad a otras líneas o variedades de espinacas, cruzando una planta cultivada a partir de las semillas depositadas con otra planta de espinacas y seleccionando un descendiente que comprenda el fragmento de introgresión. La selección puede realizarse por diversos procedimientos, por el fenotipo de resistencia a Pfs y/o seleccionando la progenie que comprenda s Eq ID NO: 1 y/o por secuenciación, genotipado de SNP (selección de la progenie que comprenda una adenina para SNP_01, etc.).
El fragmento también puede identificarse mediante uno o más marcadores moleculares (por ejemplo, marcadores de SNP, marcadores de AFLP, marcadores de RFLP, etc.), en especial marcadores moleculares que sean polimórficos entre la espinaca cultivada y el fragmento de introgresión del donante silvestre. Normalmente, se utiliza una población de cartografía para generar marcadores. Por ejemplo, pueden generarse marcadores específicos para el fragmento de introgresión que se encuentren dentro de 6 cM, 5 cM, 4 cM, 3 cM, 2 cM, 1 cM del gen RPF15 y/o dentro de 1 Mb, 0,9 Mb, 0,8 Mb, 0,7 Mb, 0,6 Mb, 0,5 Mb, 0,4 Mb, 0,3 Mb, 0,2 Mb, 0,1 Mb o menos del gen R<p>F15. En un aspecto especialmente preferido descrito en el presente documento, el fragmento de introgresión que comprende el genRPF15se obtiene mediante un procedimiento que comprende la etapa de cultivar una semilla de NCIMB 42608 en una planta.
Otro aspecto descrito en el presente documento, pero no de acuerdo con la invención, es una planta de espinaca cultivada que comprende el gen RPF15 en un subfragmento del fragmento de introgresión presente en la semilla de NCIMB 42608. Dichas plantas pueden generarse mediante autofecundación o cruzamiento de una planta cultivada a partir de semillas de NCIMB 42608 con otra planta de espinaca y seleccionando los descendientes que tengan un fragmento de introgresión más corto, es decir, cuando se haya producido un acontecimiento de recombinación entre cromosomas homólogos dentro del fragmento de introgresión, de modo que parte del fragmento se haya recombinado. Por ejemplo, se pueden generar líneas endogámicas recombinantes que tengan diferentes subfragmentos del fragmento de introgresión original de tamaño completo presente en las semillas de NCIMB 42608. Se estima que el fragmento de introgresión original del donante de S.turkestanicatendrá un tamaño igual o inferior a 3,0 Mb, en especial igual o inferior a 2,0 Mb. Por lo tanto, los subfragmentos que comprenden RPF15 pueden tener menos de 3,0 Mb, menos de 2,0 Mb, por ejemplo, menos de 1,0 Mb, 0,7 Mb, 0,6 Mb, 0,5 Mb, 0,4 Mb, 0,3 Mb, 0,2 Mb, 0,1 Mb o menos y aún pueden comprender el gen RPF15. Opcionalmente, los subfragmentos también conservan SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 3.
Tal como se ha mencionado anteriormente, en la población de cartografía paraRPF15,el nucleótido SNP del SNP_01 del donante S.turkestanicaes una adenina en la posición 106 de SEQ ID NO: 1, en lugar de guanina, que es el nucleótido SNP del progenitor recurrente (S.oleracea,carente de la introgresión), tal como se muestra en la posición 106 de SEQ ID NO: 2, y el nucleótido SNP del SNP_02 de dicho donante es una citosina en la posición 184 de SEQ ID NO: 3, en lugar de guanina, que es el nucleótido SNP de dicho progenitor recurrente, tal como se muestra en la posición 184 de SEQ ID NO: 4. La SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 4 se encuentran en líneas susceptibles. Por lo tanto, una planta diploide de espinaca homocigótica para el fragmento de introgresión que comprende RPF15 tiene una adenina en la posición SNP_01 de cada uno de los cromosomas homólogos (es decir, genotipo "AA") y una citosina en la posición SNP_02 de cada uno de los cromosomas homólogos (es decir, genotipo "CC"). Una planta de espinaca heterocigótica para el fragmento de introgresión tiene una adenina en la posición SNP_01 de un cromosoma, y una guanina, una citosina o una timina en la posición equivalente del otro cromosoma, en función del trasfondo del progenitor recurrente (es decir, genotipo "AG" o "AC" o "AT" y una citosina en la posición SNP_02 de un cromosoma, y una guanina, una adenina o una timina en la posición equivalente del otro cromosoma, en función del trasfondo del progenitor recurrente (es decir, genotipo "CG" o "CA" o "CT").
En el presente documento se describen fragmentos de introgresión del donante S.turkestanicapresentes en las semillas depositadas (que comprenden RPF15 y opcionalmente SEQ ID NO: 1; y una adenina en el nucleótido 106 de SEQ ID n O: 1 y/o comprenden SEQ ID NO: 3; y una adenina en el nucleótido 184 de SEQ ID NO:3) y también de otros donantes de S.turkestanicaque comprenden RPF15 en el mismo locus cromosómico en el cromosoma 3 del genoma de la espinaca, pero en los que el fragmento de introgresión tiene una secuencia de nucleótidos que no es idéntica al 100 % a la secuencia del fragmento de introgresión presente en las semillas depositadas (por ejemplo, que tiene sólo al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 97 %, un 98 % de identidad de secuencia con el fragmento de introgresión presente en las semillas depositadas). Dicho fragmento de introgresión, en un aspecto, puede comprender SNP_01 y/o SNP_02 (en el que SNP_01 tiene una adenina en el nucleótido 106 o la posición equivalente de una secuencia que comprende al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 97 %, un 98 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO:1 y SNP_02 tiene una citosina en el nucleótido 184 o la posición equivalente de una secuencia que comprende al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 97 %, un 98 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO:3). Así, la secuencia del marcador de SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 3 tampoco puede ser idéntica al 100% en dicho donante de S.turkestanicadiferente. Además se describen subfragmentos de dicho fragmento de introgresión procedente de otros donantes de S.turkestanica,que comprenden RPF15 y opcionalmente comprenden una adenina en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 o A en la posición equivalente de una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y/o una citosina en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3 o C en la posición equivalente en una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3.
Por lo tanto, también se describe un subfragmento del fragmento de introgresión antes mencionado que comprende el genRPF15,en el que dicho subfragmento comprende el genRPF15que confiere resistencia al menos a las razas Pfs 8, 9, 11, 13 y 16, preferentemente 8, 9, 11, 13, 16 y 17, y es una parte del fragmento de introgresión tal como está presente en la semilla depositada con el número de registro NCIMB 42608 o es una parte de un fragmento de introgresión de un donante deS.turkestanicadiferente que tiene una identidad de secuencia sustancial con el fragmento de introgresión presente en las semillas depositadas. Se describe dicho subfragmento que comprende el genRPF15y que comprende el nucleótido donante resistente para SNP_01, que es una adenina en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 o una adenina en la posición equivalente en una secuencia que tiene al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y/o que comprende el nucleótido donante resistente para SNP_02, que es una citosina en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3 o citosina en la posición equivalente en una secuencia que comprende al menos un 90%, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3. Así, el subfragmento de introgresión descrito en el presente documento, en un aspecto, se obtiene (y puede obtenerse; o puede derivarse; o se deriva) del fragmento tal como se encuentra en las semillas de espinacas cultivadas depositadas con el número de registro NCIMB 42608, y el subfragmento conserva el genRPF15(y el fenotipo de resistencia a Pfs conferido por el gen y, opcionalmente, SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 3), y el fragmento de introgresión, en otro aspecto, se obtiene de otro donante deS.turkestanicaque comprende un gen RPF15 en el mismo locus del cromosoma 3. Las plantas de espinaca que comprenden dicho fragmento de introgresión más corto pueden generarse cruzando una planta descrita en el presente documento con otra planta de espinaca y seleccionando una progenie recombinante que conserva el fenotipo de resistencia conferido por el genRPF15,pero comprende un fragmento de introgresión más corto. La persona experta, por ejemplo, puede cruzar una planta cultivada a partir de las semillas depositadas con otra planta de espinaca cultivada (por ejemplo, una planta susceptible a una o más de las razas Pfs 8, 9, 11, 13, 16, 17), y luego autofecundar la progenie F1 para producir una población F2 e identificar los recombinantes (acontecimientos de cruzamiento) que hayan aparecido en el fragmento de introgresión.
Tal como se ha mencionado anteriormente, el documento WO2015054339 describe un QTL en el cromosoma 6. El locus fue introgresado a partir de S.tetrandray confiere resistencia de amplio espectro a Pfs, en concreto "resistencia a las razas 7, 10, 11, 12, 13 y 14 dePeronospora farinosaf. sp.spinaciae(Pfs) o a las razas 1-14 y UA4712 dePeronospora farinosaf. sp.spinaciae(Pfs)" (UA4712 es la raza 15 de Pfs). El cromosoma 6 corresponde en realidad al cromosoma 3 en SpinachBase. Las dos secuencias deS.tetrandraque flanquean al QTL, proporcionadas en el presente documento como SEQ ID NO: 5 y 6, se ubican en 1,4 Mb (SEQ ID NO: 5) y 0,7 Mb (S<e>Q ID NO: 6), por lo que este QTL de S.tetrandradebe estar ubicado en el fragmento que abarca de 0,7 a 1,4 Mb del cromosoma 3. Los inventores también han comprobado si las secuencias que flanquean el QTL enS.tetrandraestán presentes en las semillas depositadas con el número de registro NCIMB 42608. Las secuencias flanqueantes izquierda y derecha (es decir, SEQ ID NO: 5 y 6) no estaban presentes en las semillas depositadas, tal como se describe con más detalle en los ejemplos. En cambio, el ADN de S.oleraceaestaba presente en las semillas depositadas en la región cromosómica correspondiente (proporcionado como SEQ ID NO: 7 y 8).
Así, en un aspecto, una planta cultivada de espinaca descrita en el presente documento, pero no de acuerdo con la invención, comprende una introgresión que comprende RPF15, y no comprende el locus de resistencia de amplio espectro descrito en el documento WO2015054339.
El fragmento de introgresión que comprende el genRPF15,tal como está presente en la semilla depositada como NCIMB 42608, no comprende SEQ ID NO: 5 ni SEQ ID NO: 6. La SEQ ID n O: 5 y la SEQ ID NO: 6 están ligadas a la introgresión de S.tetrandraque confiere resistencia descrita en el documento WO2015054339. La SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 6 no están presentes en el fragmento de introgresión descrito en el presente documento, ni en la semilla descrita en el presente documento depositada como NCIMB 42608. La semilla depositada como NCIMB 42608, que comprende el genRPF15,comprende SEQ ID NO: 7 en la región equivalente a SEQ ID NO: 5. La semilla depositada como NCIMB 42608, que comprende el genRPF15,comprende S<e>Q ID NO: 8 en la región equivalente a S<e>Q ID NO: 6.
El genRPF15es útil porque es un único gen que confiere resistencia dominante a varias razas patógenas dePeronospora farinosa,es decir, al menos a las razas Pfs 8, 9, 11, 13 y 16, preferentemente 8, 9, 11, 13, 16 y 17. ElRPF15puede utilizarse para generar variedades resistentes de espinacas. En la técnica, los genes de resistencia se suelen apilar (combinados con otros genes de resistencia complementarios) para proporcionar resistencia contra un gran número de razas dePeronospora farinosa.Para apilar genes de resistencia en una variedad híbrida, el gen debe conferir resistencia dominante. Esto es especialmente importante para conferir resistencia aPeronospora farinosaen la espinaca diploide, porque algunos genes de resistencia son alélicos, lo que limita el número de combinaciones posibles. Por lo tanto, los productos descritos en el presente documento, pero que no están de acuerdo con la invención (por ejemplo, plantas, partes de plantas, plantas progenitoras, etc.), suponen una mejora significativa con respecto a la técnica anterior.
En un aspecto, en el presente documento se describe una planta híbrida F1 de espinaca y partes de la planta, pero no están de acuerdo con la invención (y semillas a partir de las cuales se puede cultivar un híbrido F1), en la que un progenitor es una línea endogámica que comprende el gen RPF15 de la invención en forma homocigótica. El otro progenitor puede ser susceptible o puede ser una línea progenitora endogámica que comprenda un gen de resistencia a Pfarinosaseleccionado del grupo RPF1, RPF2, RPF3, RPF4, RPF5, RPF6, RPF7, RPF8, RPF9, RPF11, RPF12, RPF14, el gen R6 (del documento WO2013/064436), el gen p10 (del documento WO2017/194073), el gen R15 (del documento WO2017/084724) o el gen descrito en el documento US20170127641 o US20170127642.
También en el presente documento se describe un procedimiento para producir una semilla híbrida de espinaca, pero que no está de acuerdo con la invención, que comprende cruzar una primera planta progenitora de espinaca con una segunda planta progenitora de espinaca y cosechar la semilla híbrida de espinaca resultante, en la que la primera planta progenitora de espinaca comprende el gen RPF15 que confiere resistencia dominante al menos a las razas Pfs 8, 9, 11, 13 y 16, preferentemente a 8, 9, 11, 13, 16 y 17, y que requiere apilamiento con otro gen de resistencia al mildiú velloso para tener resistencia contra las razas 10 y 15; y/o para tener resistencia contra las razas 1-7, 12 y 14. Así, en un aspecto descrito en el presente documento, el otro progenitor es una línea progenitora endogámica que comprende un gen de resistencia a Pfarinosaseleccionado del grupo RPF1, RPF2, RPF3, RPF4, RPF5, RPF6, RPF7, RPF8, RPF9, RPF11, RPF12, el gen R6 (del documento WO2013/064436), el gen p10 (del documento WO2017/194073), el gen R15 (del documento WO2017/084724) o el gen descrito en el documento US20170127641 o US20170127642. En el presente documento también se describe, pero no está de acuerdo con la invención, una semilla de espinaca híbrida F1, y una planta de espinaca híbrida o una parte de la planta cultivada a partir de dicha semilla, producida por este procedimiento.
Para proporcionar resistencia adicional contra las razas 10 y/o 15, los genes siguientes son los más adecuados: RPF2, RPF11, RPF12 para la raza 10, RPF1, RPF2, RPF4, RPF6, RPF7, RPF8, RPF11, RPF12, R15 o el gen descrito en el documento US20170127641 o US20170127642 para la raza 15.
En un aspecto, en el presente documento se describe, pero no está de acuerdo con la invención, una planta de espinaca que comprende el gen de resistenciaRPF15que puede obtenerse (o se obtiene, o puede derivarse, o se deriva) por el cruzamiento de una planta de espinaca cultivada a partir de semillas depositadas con el número de registro NCIMB 42608, con otra planta de espinaca, por ejemplo, con una planta de espinaca que carece de genes de resistencia Pfs (una planta susceptible) o con una planta de espinaca que comprende uno o más genes de resistencia a Pfs diferentes. Un ejemplo de planta susceptible adecuada es la variedad Viroflay.
La planta de espinaca descrita en el presente documento, pero que no está de acuerdo con la invención, puede ser, por ejemplo, una línea endogámica, que comprende RPF15 en forma homocigótica, o un híbrido F1 que comprende el gen RPF15 en forma homocigótica o heterocigótica.
El gen de resistenciaRPF15puede combinarse con otros genes de resistencia o loci de resistencia dePeronospora farinosa(por ejemplo,RPF1-RPF9, RPF11 o RPF12, R6, R15,o las resistencias divulgadas en los documentos WO2015054339, WO2017194073 y EP2912940 etc.) o con otros rasgos, tales como resistencia frente a bacterias (por ejemplo,Pseudomonas syringaepv.spinacea; Erwinia carotovora),hongos (por ejemplo,Albugo occidentalis; Colletotrichum dematiumf. sp.spinaciae; Stemphylium botryosumf. sp.spinacia),virus (por ejemplo un virus causante de la enfermedad del ápice rizado, o del punteado, o del tizón de la espinaca, o del mosaico de la espinaca) o nematodos (por ejemplo, el nematodo del quiste del trébol(Heterodera trifolii),el nematodo de lesiones radicales(Pratylenchusspp.), el nematodo de nódulos radicales(Meloidogynespp.) o el nematodo del quiste de la remolacha azucarera(Heterodera schachtii)).La combinación puede realizarse, por ejemplo, mediante técnicas de fitomejoramiento tradicionales, por ejemplo, mediante retrocruzamiento, con el fin de introducir uno o más rasgos en una planta descrita en el presente documento, pero que no está de acuerdo con la invención, o con el fin de introducir el genRPF15de una planta descrita en el presente documento, pero que no está de acuerdo con la invención, en otra planta de espinaca que comprenda dichos uno o más rasgos adicionales o mediante otras técnicas, incluida la edición o transformación de genes. En un aspecto descrito en el presente documento, una planta como la descrita se utiliza como donante del genRPF15,mientras que, en otro aspecto descrito en el presente documento, una planta como la descrita se utiliza como receptora de uno o más rasgos. Una persona experta puede obtener una planta híbrida resistente a todas las razas de Pfs conocidas en la actualidad, a saber, Pfs 1 a 17, combinando el genRPF15con otros genes de resistencia adecuados. Por ejemplo,RPF15puede combinarse conRPF11oRPF12para obtener resistencia a todas las razas de Pfs conocidas en la actualidad.
El gen de resistenciaRPF15,o el fragmento de introgresión en el que está ubicado, o un subfragmento del fragmento que comprendeRPF15,puede transferirse desde una planta descrita en el presente documento (pero no de acuerdo con la invención) a otra planta de espinaca mediante diversos procedimientos conocidos por la persona experta. Así, un donante del gen de resistencia RPF15 puede ser, por ejemplo, una planta cultivada a partir de las semillas depositadas, o una planta de la progenie de las mismas.
Así, un donante del gen de resistenciaRPF15puede ser NCIMB 42608 o una progenie de una planta cultivada a partir de dicho depósito, una progenie de dicha planta, o una planta cultivada a partir de un cultivo celular derivado de dicha planta. El gen RPF15 transferido puede conferir resistencia al menos a las razas Pfs 8, 9, 11, 13 y 16, preferentemente a las razas 8, 9, 11, 13, 16 y 17, y también resistencia a una o más (o todas) de las razas Pfs 1 a 7, 12 y 14, y resistencia al aislado Pfs UA0514 en la planta receptora.
El gen de resistenciaRPF15,o el fragmento de introgresión en el que se encuentra, o un subfragmento del mismo que comprenda el gen, puede utilizarse para conseguir una planta híbrida (por ejemplo, un híbrido F1), o una planta endogámica o una planta homocigótica, opcionalmente una planta doble haploide. En otro aspecto descrito en el presente documento, pero no de acuerdo con la invención, la planta endogámica u homocigótica es una línea progenitora masculina, preferentemente un progenitor élite masculino. En otro aspecto descrito en el presente documento, pero no de acuerdo con la invención, la planta endogámica u homocigótica es una línea progenitora femenina, preferentemente una línea progenitora élite femenina. Una línea progenitora masculina puede cruzarse con una línea progenitora femenina para obtener semillas híbridas F1, que comprenden RPF15 (o el fragmento de introgresión que comprende RPF15 y, opcionalmente, que comprende SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 3) en forma homocigótica.
En un aspecto descrito ene l presente documento, pero no de acuerdo con la invención, la línea progenitora actúa como donante del gen de resistenciaRPF15.Dicha planta donante puede cruzarse con otra planta de espinaca y puede obtenerse la progenie, incluidas F1, F2, F3, o una generación posterior de progenie autofecundada, la progenie de retrocruzamiento (por ejemplo, BC1, BC2, BC1S1, BC2S1, BC1S2, etc.), etc. Entre la progenie pueden identificarse y seleccionarse plantas que tengan el mismo fenotipo de resistencia a Pfs que la planta inicial descrita en el presente documento. Asimismo, el fragmento de introgresión puede detectarse en la progenie, por ejemplo, mediante la detección de marcadores indicativos del fragmento de introgresión (por ejemplo, SNP_01) o secuenciación, etc.
En un aspecto descrito en el presente documento, pero no de acuerdo con la invención, la línea endogámica es una planta cultivada de la especieSpinacia oleráceaque comprende resistencia contra al menos las razas 8, 9, 11, 13 y 16 dePeronospora farinosa,preferentemente a las razas 8, 9, 11, 13, 16 y 17, en la que dicha resistencia es conferida por un único gen introgresado a partir deSpinacia turkestanica (RPF15),estando dicho gen ligado al nucleótido donante resistente para SNP_01, que es una adenina (A) en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 o una adenina en la posición equivalente de una secuencia que comprende al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, preferentemente al menos un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y/o al nucleótido donante resistente para SNP_02, que es una citosina (C) en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3 o C en la posición equivalente de una secuencia que comprende al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, preferentemente al menos un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3.
El gen de resistenciaRPF15,o el fragmento de introgresión en el que está ubicado, o un subfragmento del mismo, también puede transferirse en diversos tipos de espinaca, tales como las espinacas de hoja rizada, semirrizada, plana o lisa o la espinaca oriental. Preferentemente, la planta de espinaca de hoja rizada, semirrizada, plana o lisa o de espinaca oriental cultivada es una planta híbrida.
En un aspecto, en el presente documento se describe, pero no está de acuerdo con la invención, una planta de espinaca cultivada que comprende resistencia contra las razas 8, 9, 11, 13 y 16 de Pfs, preferentemente contra las razas 8, 9, 11, 13, 16 y 17, en la que dicha resistencia es conferida por un único gen dominanteRPF15introgresado a partir de un pariente silvestre de la espinaca, preferentemente S.turkestanica,estando dicho gen ligado a SEQ ID NO: 1 o a una secuencia que comprende al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, preferentemente al menos un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 que conserva la adenina en SNP_01 y/o SEQ ID NO: 3 o a una secuencia que comprende al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, preferentemente al menos un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3 que conserva la citosina en SNP_02. El genRPF15puede identificarse en diferentes muestras registradas de parientes silvestres de la espinaca, en especial en muestras registradas de la especieS.turkestanica,y puede introgresarse en la espinaca cultivada. Para ello, la persona experta, por ejemplo, puede cribar dicha muestra registrada para detectar la presencia del nucleótido donante resistente del SNP_01, que es una adenina (A) en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 o una adenina en la posición equivalente de una secuencia que comprende al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, preferentemente al menos un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y/o ligado al nucleótido donante resistente para SNP_02, que comprende una citosina (C) en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3, o comprende una citosina en la posición equivalente en una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3 y/o probar el fenotipo de resistencia a Pfs y opcionalmente la herencia (como único gen) para determinar si esa muestra registrada contieneRPF15.Opcionalmente también se puede realizar una secuenciación, cartografía fina, pruebas de alelismo, etc., para determinar si el gen de la muestra registrada es, en efecto, el gen RPF15.
En un aspecto específico descrito en el presente documento, la resistencia contraPeronospora farinosaen una planta cultivada es conferida por un fragmento de introgresión procedente deSpinacia turkestanica.La planta de espinaca cultivada descrita en el presente documento, pero no de acuerdo con la invención, comprende por tanto el genRPF15derivado de S.turkestanica,y está opcionalmente ligado al nucleótido donante resistente para SNP_01, que es una adenina (A) en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 o A en la posición equivalente de una secuencia que comprende al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, preferentemente al menos un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y/o ligado al nucleótido donante resistente para SNP_02, que comprende una citosina (C) en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3, o comprende C en la posición equivalente en una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3.
La presencia del gen de resistenciaRPF15puede determinarse mediante pruebas de resistencia para al menos las razas Pfs 8, 9, 11, 13 y 16 (preferentemente a las razas 8, 9, 11, 13, 16 y 17), opcionalmente también resistencia a una o más de las razas Pfs 1 a 7, 12 y 14 y/o resistencia al aislado UA0514 y/o a otros aislados de Pfs. Además, la susceptibilidad a las razas 10 y 15 también puede confirmar la presencia de RPF15. En un aspecto alternativo descrito en el presente documento, pero no de acuerdo con la invención, la resistencia contra una raza Pfs o una selección de razas Pfs se puede utilizar para indicar que el gen se transfiere desde un donante a una planta receptora. Así, por ejemplo, si el progenitor receptor en el cruce carece de resistencia contra una raza Pfs concreta, entonces la selección de una planta de la progenie que sea resistente contra esa raza indica la transferencia del genRPF15.
Las pruebas de la presencia del gen de resistencia en una planta de espinaca cultivada (es decir, una línea o variedad de espinaca) comprenden, por ejemplo, ensayos cualitativos de resistencia a enfermedades en condiciones ambientales controladas. La persona experta está familiarizada con la aplicación de diferentes protocolos para tales ensayos. En resumen, se inoculan plántulas de una pluralidad de plantas del genotipo de la planta que se va a examinar (por ejemplo, al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más plantas) con el inóculo de la raza Pfs que se va a ensayar y se incuban las plántulas en condiciones favorables al patógeno. Varios días después de la incubación, se evalúan las plantas para detectar síntomas de infección, en especial esporulación sobre los cotiledones y/o las hojas (por ejemplo, la primera hoja verdadera), y cada planta se clasifica como "resistente" (no muestra signos de esporulación) o "susceptible" (muestra esporulación). Si un determinado porcentaje de todas las plantas de un genotipo se clasifican como "resistentes", por ejemplo, más de aproximadamente el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 98 %, el 99 % (o incluso el 100 %), entonces el genotipo de la planta de espinaca es resistente a la raza analizada. Evidentemente, también deben incluirse en el ensayo una o más plantas de control (por ejemplo, una línea o variedad susceptible, una línea o variedad resistente) utilizando el mismo tratamiento o tratamientos y las mismas condiciones ambientales, para garantizar que el ensayo funciona como se espera.
Dicho ensayo de la presencia deRPF15puede realizarse en plantas homocigóticas o heterocigóticas para el gen, utilizando cualquier aislado o raza de Pfs. Si la planta se clasifica como resistente según el ensayo, cuando el gen está presente en forma heterocigótica, la resistencia es dominante. Un ensayo sencillo puede consistir en cruzar una planta que contenga el gen de resistencia con una planta susceptible al menos a una raza de Pfs (es decir, que no tenga resistencia en su trasfondo) y analizar la progenie F1 para comprobar si es resistente a esa raza de Pfs. Si esa progenie F1 es resistente a esa raza Pfs, se puede concluir que la resistencia es dominante. Dicho ensayo ha permitido concluir queRPF15confiere una resistencia dominante a las razas Pfs 8, 9, 11, 13 y 16, y preferentemente a 17. Otro ensayo adecuado para la herencia monogénica dominante comprende cruzar una planta que contenga el gen de resistencia con una planta susceptible a todas las razas de Pfs, autofecundar la progenie de ese cruzamiento para generar una generación F2 y observar la segregación de la resistencia a las razas de Pfs. Si la segregación es de 3:1 de plantas resistentes a susceptibles, la resistencia es monogénica dominante. Si la planta se clasifica como resistente según el ensayo, sólo cuando el gen está presente en forma homocigótica, la resistencia se hereda de forma recesiva.
La presencia del gen de resistencia RPF15 (o de un fragmento de introgresión que comprende el gen) en una planta de espinaca o una parte de una planta (por ejemplo, una célula) también puede determinarse directamente. La persona experta sabe que los procedimientos para cribar, seleccionar o identificar una planta de espinaca cultivada (por ejemplo, una planta de progenie) o una parte de una planta de espinaca, o una célula o un cultivo celular que comprendaRPF15pueden lograrse detectando uno o más marcadores moleculares ligados al gen o locusRPF15,tal como SNP_01. Así, en un aspecto, el fragmento de introgresión que comprende el gen RPF15 puede detectarse por la presencia del nucleótido donante resistente del SNP_01, que es una adenina (A) en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 o adenina en la posición equivalente de una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98%o un 99%de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y/o del nucleótido donante resistente para SNP_02, que comprende una citosina (C) en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3, o comprende C en la posición equivalente en una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3 y/o cualquier otro marcador molecular ligado alRPF15y/o al fragmento de introgresión de S.turkestanicaque comprenda el gen RPF15. Así, la persona experta puede distinguir el genoma, en especial el cromosoma 3 del genoma, que comprende el fragmento de introgresión del resto del genoma, en especial el cromosoma 3 del genoma que carece del fragmento de introgresión y que comprende en cambio la secuencia genómica de S.olerácea.
El gen RPF15 se ubica al principio del cromosoma 3, en la región que comienza en 0 Mb a 2,0 Mb del cromosoma 3 (tal como se encuentra en el genoma SpinachBase), en especial en la región que comienza en 0,4 Mb y termina en 1,5 Mb. Así, si se secuencia esta región y comprende la secuencia de S.turkestanica,opcionalmente también el marcador SNP_01 (SEQ ID NO: 1) y/o el marcador SNP_02 (SEQ ID NO: 3) ligado al gen, y la planta comprende el fenotipo de resistencia conferido por el gen RPF15, entonces la planta o una parte de la planta (por ejemplo, una célula) comprende el gen RPF15 divulgado en el presente documento.
En otro aspecto, en el presente documento se describe, pero no está de acuerdo con la invención, una semilla de espinaca cultivada que comprendeRPF15como parte del fragmento de introgresión o un subfragmento del fragmento de introgresión, tal como está presente en el depósito con el número de registro NCIMB 42608. También se divulga una pluralidad de semillas de espinacas cultivadas que comprendenRPF15,preferentemente en un recipiente.
La divulgación describe además una planta de espinaca cultivada que comprende un fragmento de introgresión procedente de un donante que es un pariente silvestre de la espinaca que confiere resistencia dominante a las razas 8, 9, 11, 13 y 16 dePeronospora farinosa,preferentemente a las razas 8, 9, 11, 13, 16 y 17, y resistencia (potencialmente sólo cuando el fragmento está en forma homocigótica) a las razas 1 a 7 de Pfs y al aislado UA0514, opcionalmente también a las razas 12 y 14 y/u otros aislados de Pfs. En un aspecto descrito en el presente documento, el fragmento es introgresado a partir de S.turkestanica.En otro aspecto descrito en el presente documento, el fragmento de introgresión es la introgresión tal como está presente en la semilla depositada con el número de registro NCIMB 42608, o un fragmento corto de ese fragmento. También se describe una planta de espinaca cultivada que comprende un subfragmento del fragmento de introgresión antes mencionado, en la que dicho subfragmento confiere resistencia dominante a las razas 8, 9, 11, 13 y 16 de Pfs, preferentemente a las razas 8, 9, 11, 13, 16 y 17, y resistencia (potencialmente sólo cuando el fragmento está en forma homocigótica) a las razas 1 a 7, 12 y 14 de Pfs y al aislado UA0514 y/u otros aislados de Pfs. En el presente documento se describe además, pero no está de acuerdo con la invención, una planta cultivada de espinaca que comprende dicho subfragmento, en la que dicho subfragmento es una parte del fragmento de introgresión tal como está presente en la semilla depositada como NCIMB 42608. El subfragmento más corto conserva el gen RPF15.
La planta de espinaca cultivada descrita en el presente documento, pero no de acuerdo la invención, puede ser una planta híbrida, en especial un híbrido F1, o una planta endogámica, por ejemplo, una línea endogámica que puede utilizarse como progenitor para la producción de semillas híbridas F1 o una planta homocigótica, opcionalmente una planta doble haploide.
El genRPF15puede transferirse a cualquier línea o variedad de espinaca.
En otras palabras, el genRPF15puede introducirse en cualquier otra planta de espinaca por introgresión a partir de una planta cultivada a partir de semillas de las que se ha depositado una muestra representativa como NCIMB 42608, o cualquier planta de espinaca derivada de las mismas y que conserve el genRPF15.Por lo tanto, las semillas depositadas son una fuente del gen de resistenciaRPF15,al igual que una planta de espinaca no obtenida directamente del depósito, sino indirectamente (por ejemplo, a través de una variedad comercial lanzada posteriormente) y que comprende el genRPF15.
Pueden identificarse otras fuentes del genRPF15,por ejemplo, en parientes silvestres de la espinaca (en especial, de otras muestras registradas deS.turkestanicaque tienen el mismo fenotipo de resistencia a Pfs y/o comprenden uno 0 ambos de los marcadores ligados a RPF15 proporcionados en el presente documento (SNP_01 y/o SNP_02) y, por ejemplo, puede utilizarse una prueba de alelismo para determinar si otro gen, que confiere el mismo fenotipo de resistencia a Pfs, es el mismo gen o un gen diferente. Asimismo, la secuenciación puede utilizarse para confirmar la presencia del gen RPF15. Otros procedimientos alternativos para determinar si otro gen es el mismo gen incluyen el desarrollo de al menos un marcador molecular ligado al genRPF15y el análisis para determinar si dicho marcador aparece en plantas que comprenden el otro gen. Algunos ejemplos de marcadores adecuados son el nucleótido donante resistente de SNP_01, que tiene una adenina (A) en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 o una adenina en la posición equivalente de una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y/o el nucleótido donante resistente para SNP_02, que tiene una citosina (C) en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3, o C en la posición equivalente en una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3.
En un aspecto, en el presente documento se describe un procedimiento, pero no de acuerdo con la invención, para generar una planta de espinaca cultivada que comprende el gen RPF15, que comprende las siguientes etapas:
a) Cruzar una planta de espinaca que comprende el gen RPF15 descrito en el presente documento con otra planta de espinaca para producir una planta progenitora;
b) Opcionalmente, autofecundar la planta progenitora de la etapa a) una o más veces para producir una generación posterior de progenie autofecundada y, opcionalmente, producir semillas.
En un aspecto descrito, la otra planta de espinaca de la etapa a) es susceptible al menos a una de las razas Pfs 8, 9, 11, 13 y 16 o 17. En otro aspecto descrito, la otra planta de espinaca del paso a) es una planta endogámica o una planta homocigótica o una línea progenitora masculina o una línea progenitora femenina, o preferentemente una línea progenitora élite masculina o una línea progenitora élite femenina.
En otro aspecto descrito en el presente documento se proporciona el procedimiento que comprende las etapas a) y, opcionalmente, b), seguidas de lo siguiente:
c) Identificar la planta de progenie de la etapa a) o b) que comprende el gen de resistencia RPF15 determinando si la planta de progenie comprende resistencia contra al menos las razas Pfs 8, 9, 11, 13 y 16, preferentemente contra las razas 8, 9, 11, 13, 16 y 17 y/o comprende una adenina en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 o una adenina en la posición equivalente de una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1; y/o comprende una citosina (C) en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3, o una citosina en la posición equivalente en una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3; y/o comprende un fragmento de introgresión de S.turkestanicaque comprende el gen RPF15;
d) Opcionalmente, cruzar la planta de progenie identificada en la etapa c) con otra planta de espinaca para producir una planta de progenie o una semilla de progenie.
En otro aspecto descrito en el presente documento, pero no de acuerdo con la invención, se divulga un procedimiento para generar una planta de espinaca que comprende el gen RPF15 (que confiere resistencia al menos a las razas Pfs 8, 9, 11, 13 y 16, preferentemente a las razas 8, 9, 11, 13, 16 y 17), opcionalmente resistencia adicional a una o más de las razas Pfs 1 a 7, 12 y 14 y/o al aislado UA0514 y/u otros aislados de Pfs), que comprende las siguientes etapas:
a) Cruzar una planta de espinaca que comprende un fragmento de introgresión que puede obtenerse a partir de semillas (o presente en las mismas) depositadas como NCIMB 42608, comprendiendo dicho fragmento de introgresión SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 3, con otra planta de espinaca;
b) Opcionalmente, autofecundar la planta de progenie de la etapa a) una o más veces para producir una generación posterior de progenie autofecundada y, opcionalmente, recolectar las semillas producidas en la planta;
En un aspecto descrito, la otra planta de espinaca de la etapa a) es susceptible al menos a una de las razas Pfs 8, 9, 11, 13 y 16 o 17. En otro aspecto descrito, la otra planta de espinaca del paso a) es una planta endogámica o una planta homocigótica o una línea progenitora masculina o una línea progenitora femenina, o preferentemente una línea progenitora élite masculina o una línea progenitora élite femenina.
En otro aspecto, en el presente documento se describe el procedimiento que comprende las etapas a) y, opcionalmente, b), seguidas de lo siguiente:
c) Identificar la planta de progenie de la etapa a) o b) que comprende el gen de resistencia RPF15 determinando si la planta de progenie comprende resistencia contra al menos las razas Pfs 8, 9, 11, 13 y 16 y/o comprende Se Q ID NO: 1 y/o SEQ ID No : 3;
d) Opcionalmente, cruzar la planta de progenie identificada de la etapa c) con otra planta de espinaca para producir una planta de progenie o semilla.
Con respecto a ambos procedimientos, en el presente documento se describe lo siguiente, pero no de acuerdo con la invención: En un aspecto, la planta de la etapa a) comprende el genRPF15tal como se encuentra en las semillas depositadas con el número de registro NCIMB 42608. La planta de espinaca puede ser la planta cultivada a partir de las semillas del depósito o cualquier planta de espinaca obtenida utilizando, o habiendo utilizado, el depósito de semillas y que conserve el fenotipo de resistencia a Pfs (y el gen RPF15 que lo confiere) y, opcionalmente, que conserve SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 3. Esto incluye las variedades comerciales de espinacas que se generaron utilizando el depósito de semillas. Así, la planta de espinaca de a) comprende el genRPF15descrito en el presente documento, por ejemplo, tal como se encuentra (o puede obtenerse; se obtiene; puede derivarse; se deriva) en NCIMB 42608.
Las selecciones (o identificación) en la etapa c) pueden realizarse basándose en el fenotipo (es decir, utilizando un ensayo de resistencia a Pfs) y/o basándose en procedimientos moleculares, tales como la detección de marcadores moleculares ligados al gen o locusRPF15,por ejemplo, del nucleótido donante resistente de SNP_01, que es adenina (A) en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 o adenina en la posición equivalente de una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y/o el nucleótido donante resistente para SNP_02, que es una citosina (C) en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3, o una citosina en la posición equivalente en una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3, u otros procedimientos como la secuenciación.
En los procedimientos anteriores, la planta de espinaca de la etapa (a) comprende preferentemente el genRPF15(es decir, el fragmento de introgresión o un subfragmento del mismo que comprende el genRPF15)en forma homocigótica. En la etapa a), la planta de espinaca que comprende la resistencia, en un aspecto, se cruza con otra planta de espinaca que es susceptible al menos a una de las razas Pfs para las que la planta de a) es resistente. Si el segundo progenitor en b) es una planta de espinaca que es susceptible al menos a una de las razas de Pfs para las que la planta de a) es resistente, entonces la selección en la etapa d) y/o f) puede basarse en la selección de plantas que ahora tienen resistencia contra esa raza.
En los procedimientos anteriores también pueden seleccionarse y/o identificarse plantas que conserven el fenotipo de resistencia a Pfs conferido por el genRPF15,pero que tengan un fragmento de introgresión más pequeño que el presente en las semillas depositadas. Esto puede tener ventajas, ya que así se pueden eliminar los rasgos negativos de S.turkestanicaacoplados al fragmento de introgresión. Por lo tanto, es preferible reducir el tamaño del fragmento de introgresión mediante recombinación y seleccionar plantas que comprendan fragmentos de introgresión más pequeños, pero que conserven el gen que confiere resistencia. Así pues, en un aspecto, en el presente documento se describen espinacas con fragmentos de introgresión de todos los tamaños procedentes (o derivados; o que pueden derivarse; u obtenidos; o que pueden obtenerse) de semillas depositadas con el número de registro NCIMB 42608, siempre que la parte que confiere resistencia a Pfs (es decir, el genRPF15)se conserve en la planta de espinaca. Tal como se ha mencionado, la presencia puede probarse/seleccionarse a través del fenotipo y/o utilizando procedimientos moleculares conocidos en la técnica.
En el presente documento también se describe, pero no está de acuerdo con la invención, un procedimiento para generar una planta de espinaca que comprende resistencia dominante contra al menos las razas Pfs 8, 9, 11, 13 y 16 (preferentemente las razas 8, 9, 11, 13, 16 y 17) que comprende las siguientes etapas:
a) cruzar una primera planta de espinaca de la especieSpinacia oleráceacon una segunda planta de espinaca, siendo dicha segunda planta de espinaca susceptible a una o más de las razas 8, 9, 11, 13 y 16 o 17 de Pfs, en el que la primera planta de espinaca comprende resistencia contra las razas 8, 9, 11, 13 y 16 de Pfs (preferentemente contra las razas 8, 9, 11, 13, 16 y 17), y dicha resistencia es conferida por un único gen introgresado a partir de S.turkestanica,estando dicho gen ligado al nucleótido donante resistente para SNP_01, que tiene una adenina (A) en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 o una adenina en la posición equivalente de una secuencia que comprende al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y/o ligado al nucleótido donante resistente para SNP_02, que comprende una citosina (C) en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3, o comprende una citosina en la posición equivalente en una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3;
b) autofecundar una planta cultivada a partir de la progenie de dicho cruzamiento una o más veces para producir una generación posterior de progenie autofecundada y/o retrocruzar una planta cultivada a partir de la progenie de dicho cruzamiento o cultivada a partir de la generación posterior de progenie autofecundada, con una planta de espinaca susceptible a una o más de las razas Pfs 8, 9, 11, 13, 16 o 17; y
c) identificar una planta espinaca entre las plantas progenitoras de la etapa b) que comprende un único gen de la primera planta progenitora de la etapa a).
En un aspecto descrito en el presente documento, el genotipo de SNP_01 (que está ligado al gen RPF15) se utiliza para identificar una planta en la etapa c). El nucleótido de SNP_01 es adenina, es decir, el nucleótido donante. Por lo tanto, en un aspecto, la planta comprende un fragmento de introgresión que comprende el nucleótido SNP_01 donante.
En otro aspecto descrito en el presente documento, el genotipo de SNP_02 (que está ligado al gen RPF15) se utiliza para identificar una planta en la etapa c). El nucleótido del SNP_02 es citosina, es decir, el nucleótido donante. Por lo tanto, en un aspecto descrito en el presente documento, la planta comprende un fragmento de introgresión que comprende el nucleótido SNP_02 donante.
Una planta producida por el procedimiento anterior también se describe en el presente documento, pero no está de acuerdo con la invención.
Además, se proporciona un procedimiento para cribar, identificar o detectar la presencia del gen RPF15, como se describe en el presente documento, en una planta o una parte de una planta de espinaca, que comprende:
a) cribar una planta o una parte de una planta de espinaca cultivada o el ADN de dicha planta o parte de la planta mediante un ensayo de marcadores moleculares que detecte al menos un marcador de SNP seleccionado del grupo que consiste en
i) el nucleótido donante resistente de SNP_01, que tiene una adenina (A) en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 o una adenina en la posición equivalente de una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1;
ii) el nucleótido donante resistente de SNP_02, que tiene una citosina (C) en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3, o una citosina en la posición equivalente en una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3 y, opcionalmente,
b) identificar o seleccionar una planta o una parte de una planta que comprende el nucleótido SNP donante resistente para SNP_01, que es una adenina (A) en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 o una adenina en la posición equivalente de una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y el nucleótido donante resistente para SNP_02, que es citosina (C) en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3, o citosina en la posición equivalente en una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3.
También se describe en el presente documento una planta cultivada de espinaca o una parte de una planta derivada, obtenida, que puede obtenerse o derivarse de la misma o identificada o detectada en cualquiera de los procedimientos anteriores, comprendiendo dicha planta resistencia al menos a las razas Pfs 8, 9, 11, 13 y 16 (preferentemente al menos a las razas 8, 9, 11, 13, 16 y 17) conferida porRPF15o comprendiendo dicha parte de la planta el gen RPF15 (o un fragmento de introgresión que comprende el gen y, opcionalmente, el marcador ligado al gen).
Una planta descrita en el presente documento, pero que no está de acuerdo con la invención, puede utilizarse para generar una progenie que tenga o conserve el gen de resistencia a Pfs tal como se puede obtener (está presente; puede derivarse; se obtiene o se deriva) de semillas depositadas como NCIMB 42608. Para generar la progenie, una espinaca descrita en el presente documento puede autofecundarse y/o cruzarse una o más veces con otra planta de espinaca y pueden recogerse semillas. La presencia del genRPF15en las plantas progenitoras puede determinarse (es decir, las plantas progenitoras que comprenden el genRPF15pueden identificarse/seleccionarse) mediante el fenotipo de resistencia a Pfs y/o mediante procedimientos moleculares, tal como mediante marcadores moleculares (por ejemplo, marcadores de SNP) ligados al gen o locusRPF15.
La invención describe además el uso del genRPF15(y el uso de un fragmento de introgresión que comprende el gen) para conferir resistencia contra al menos las razas Pfs 8, 9, 11, 13 y 16 (preferentemente contra al menos las razas 8, 9, 11, 13, 16 y 17), opcionalmente además contra las razas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 12, 14 y el aislado UA0514. Al mismo tiempo, el gen (fragmento de introgresión) no confiere resistencia contra las razas 10 y 15 de Pfs.
Se divulga un aspecto descrito en el presente documento, pero no de acuerdo con la invención, es el uso de una planta de espinaca, o la progenie de dicha planta (por ejemplo, obtenida por autofecundación), o de una célula o un cultivo celular regenerable, o una parte de una planta que pueda propagarse vegetativamente, para generar una planta de espinaca cultivada que comprende resistencia al menos a las razas Pfs 8, 9, 11, 13 y 16 (preferentemente al menos a las razas 8, 9, 11, 13, 16 y 17), opcionalmente además a una o más de las razas Pfs 1 a 7, 12, 14 y/u opcionalmente al aislado UA0514 y/u otros de aislados Pfs, habiéndose depositado semillas representativas de dicha planta con el número de registro NCIMB 42608.
Otro aspecto descrito en el presente documento, pero no de acuerdo con la invención, es el uso de una planta de espinaca que comprende resistencia al menos a las razas Pfs 8, 9, 11, 13 y 16 (preferentemente al menos a las razas 8, 9, 11, 13, 16 y 17) conferida por un fragmento de introgresión que puede obtenerse a partir de una semilla depositada con el número de registro NCIMB 42608, o a partir de su progenie (por ejemplo, obtenida por autofecundación) para generar una planta de espinaca cultivada que comprende resistencia al menos a las razas Pfs 8, 9, 11, 13, 16 y 16 (preferentemente al menos a las razas 8, 9, 11, 13, 16 y 17), opcionalmente además a una o más de las razas 1 a 7, 12, 14 de Pfs y/o opcionalmente al aislado UA0514 y/o a otros aislados de Pfs.
Semillas
También se describe en el presente documento, pero no de acuerdo con la invención, una semilla a partir de la cual puede cultivarse cualquier planta descrita en el presente documento. Además, en el presente documento se describen una pluralidad de tales semillas. Una semilla como la descrita puede distinguirse de otras semillas debido a la presencia del gen de resistenciaRPF15, yasea a través del fenotípico (basándose en plantas que tengan el fenotipo de resistenciaRPF15)y/o utilizando procedimientos moleculares.
En un aspecto descrito en el presente documento, una pluralidad de semillas se envasa en un recipiente (por ejemplo, una bolsa, una caja de cartón, una lata, etc.). Los recipientes pueden ser de cualquier tamaño. Las semillas pueden granularse antes del envasado (para formar píldoras o gránulos) y/o tratarse con diversos compuestos, incluidos los recubrimientos de semillas.
En un aspecto descrito en el presente documento, pero no de acuerdo con la invención, la semilla de espinaca se ceba. El cebado es un proceso a base de agua que se realiza en las semillas para aumentar la uniformidad de la germinación y la emergencia del suelo, y mejorar así el establecimiento del rodal de hortalizas. El cebado reduce el lapso de tiempo entre la emergencia de la primera y la última plántula. Los procedimientos para cebar las semillas de espinaca son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Chenet al.,2010, Seed Sci. & Technol., 38: 45-57). En otro aspecto descrito en el presente documento, la semilla de espinaca se trata con productos fitosanitarios, se recubre con una película o se conforma en gránulos. El recubrimiento con película y el tratamiento con productos fitosanitarios suelen combinarse, véase, por ejemplo, el documento US20170127670.
Partes de plantas y reproducciones vegetativas
En otro aspecto descrito en el presente documento, pero no de acuerdo con la invención, se divulga una parte de una planta, obtenida (que puede obtenerse) de una planta como se describe en el presente documento, y un recipiente o envase que comprende dicha parte de una planta.
En un aspecto preferido descrito en el presente documento, la parte de la planta es una hoja de una planta de espinaca o una pluralidad de hojas, o parte de una hoja, preferentemente una hoja cosechada. Dicha hoja puede estar suelta, en manojos, fresca (por ejemplo, en un recipiente, por ejemplo, una bolsa), congelada, escaldada o hervida. Dichas hojas pueden ser frescas o procesadas, y pueden formar parte de productos alimentarios o piensos. Una hoja puede cosecharse en cualquier estadio de su desarrollo; los estadios preferidos son la hoja tierna y la hoja madura.
Otras partes de la planta, de una planta descrita en el presente documento, pero no de acuerdo con la invención, incluyen una hoja, una parte de una hoja, un tallo, una parte de un tallo, un pedúnculo, una parte de un pedúnculo, un brote, una parte de un brote, una yema o una parte de una yema, un esqueje, una raíz, una parte de una raíz, un ápice de raíz, un peciolo, una parte de un peciolo, un cotiledón, una parte de un cotiledón, una flor, una parte de una flor, un pétalo, una parte de un pétalo, un estambre, una parte de un estambre, una antera, una parte de una antera, polen, un estigma, una parte de un estigma, un estilo, una parte de un estilo, un ovario, una parte de un ovario, un óvulo, una parte de un óvulo, una semilla, una parte de una semilla, una cubierta de semilla, un embrión, una parte de un embrión, un hipocótilo, un saco embrionario, un fruto, una parte de un fruto, una célula, un protoplasto, un callo, una microspora, meristemo, cámbium, etc. También se describen los distintos estadios de desarrollo de las partes de la planta mencionadas.
Las semillas incluyen, por ejemplo, semillas producidas en la planta descrita en el presente documento, pero no de acuerdo con la invención, tras la autopolinización o a partir de semillas producidas tras polinización cruzada, por ejemplo, polinización de una planta con polen de otra planta de espinaca o polinización de otra planta de espinaca con polen de una planta descrita en el presente documento.
En un aspecto, las partes de plantas o semillas descritas en el presente documento, pero no de acuerdo con la invención, pueden identificarse por la presencia del nucleótido SNP donante para el nucleótido donante resistente de SNP_01, que tiene adenina (A) en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 o una adenina en la posición equivalente de una secuencia que comprende al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y/o para el nucleótido donante resistente para SNP_02, que tiene una citosina (C) en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3, o una citosina en la posición equivalente en una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3.
En otro aspecto descrito en el presente documento, pero no de acuerdo con la invención, la parte de la planta es una célula vegetal. En otro aspecto descrito en el presente documento, la parte de la planta es una célula no regenerable o una célula regenerable. En otro aspecto descrito en el presente documento, la célula de la planta es una célula somática. En un aspecto descrito en el presente documento, la célula se aísla de su ubicación natural.
Una célula no regenerable es una célula que no puede regenerarse en una planta completa mediante cultivoin vitro.La célula no regenerable puede estar en una planta o en una parte de una planta (por ejemplo, una hoja) descrita en el presente documento. La célula no regenerable puede ser una célula de una semilla o de la cubierta de dicha semilla. Los órganos vegetales maduros, incluidos una hoja madura, un tallo maduro o una raíz madura, comprenden al menos una célula no regenerable. Los órganos vegetales en maduración, tal como las hojas tiernas de espinaca, también comprenden al menos una célula no regenerable.
Además, también se describe en el presente documento un cultivo celularin vitroo un cultivo de tejido de plantas de espinaca, en el que el cultivo celular o de tejido se deriva de una parte de la planta descrita anteriormente, tal como, por ejemplo, entre otras, una hoja, una parte de una hoja, un tallo, una parte de un tallo, un pedúnculo, una parte de un pedúnculo, un brote, una parte de un brote, una yema o una parte de una yema, un esqueje, una raíz, una parte de una raíz, un ápice de raíz, un peciolo, una parte de un peciolo, un cotiledón, una parte de un cotiledón, una flor, una parte de una flor, un pétalo, una parte de un pétalo, un estambre, una parte de un estambre, una antera, una parte de una antera, polen, un estigma, una parte de un estigma, un estilo, una parte de un estilo, un ovario, una parte de un ovario, un óvulo, una parte de un óvulo, una semilla, una parte de una semilla, una cubierta de semilla, un embrión, una parte de un embrión, un hipocótilo, un saco embrionario, un fruto, una parte de un fruto, una célula, un protoplasto, un callo, una microspora, meristemo, cámbium, una célula somática, una célula no reproductora o una célula reproductora.
Por lo tanto, un aspecto describe un cultivo celular o un cultivo de tejido que comprende células o tejidos derivados de una parte a de una planta de espinaca de la especieSpinacia oleráceaque comprende resistencia a las razas 8, 9, 11, 13 y 16 de Pfs (preferentemente al menos a las razas 8, 9, 11, 13, 16 y 17), en el que dicha resistencia es conferida por un único gen introgresado a partir deSpinacia turkestanica,que está ligado al nucleótido donante resistente de SNP_01, que tiene una adenina (A) en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 o una adenina en la posición equivalente de una secuencia que comprende al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y/o ligado al nucleótido donante resistente de SNP_02, que tiene una citosina (C) en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3, o una citosina en la posición equivalente en una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3.
En un aspecto descrito en el presente documento, las células o tejidos pueden identificarse por la presencia del genotipo donante para SNP_01, que comprende adenina (A) en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 o adenina en la posición equivalente de una secuencia que comprende al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y/o el genotipo donante para SNP_02, que comprende citosina (C) en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3, o citosina en la posición equivalente en una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3.
También se describe en el presente documento, pero no de acuerdo con la invención, una planta de espinaca regenerada a partir de cualquiera de las partes de la planta descritas anteriormente, o regenerada a partir de los cultivos celulares o de tejidos descritos anteriormente, teniendo dicha planta regenerada un fenotipo de resistencia a Pfs (conferido por el genRPF15),es decir, conserva el genRPF15(o el fragmento de introgresión que comprende el genRPF15).Esta planta también puede indicarse como una propagación vegetativa de las plantas descritas en el presente documento.
También se describe en el presente documento, pero no de acuerdo con la invención, una hoja cosechada de una planta de la invención y un envase que comprende una pluralidad de hojas de una o más plantas descritas en el presente documento. Así pues, estas hojas comprenden el genRPF15,que puede detectarse, por ejemplo, mediante marcadores moleculares ligados o a través del fenotípico (para la planta entera utilizada originariamente y/o la planta regenerada). Una hoja puede cosecharse en cualquier estadio de desarrollo. Los estadios de desarrollo preferidos para cosechar una hoja son el estadio maduro y el estadio de hoja tierna.
También se describe en el presente documento, pero no de acuerdo con la invención, un producto alimentario o pienso que comprende o que consiste en una parte de una planta descrita en el presente documento. El producto alimentario o pienso puede ser fresco o estar transformado, por ejemplo, enlatado, cocido al vapor, hervido, frito, escaldado y/o congelado, etc. Algunos ejemplos son las ensaladas o mezclas de ensaladas que comprenden una hoja o una parte de una hoja de una planta descrita en el presente documento, o las espinacas congeladas envasadas.
Una planta de espinaca descrita en el presente documento, pero no de acuerdo con la invención, o una progenie de la misma que conserva el fenotipo de resistencia a Pfs conferido por el genRPF15,y está opcionalmente ligado al nucleótido donante resistente de SNP_01, que comprende adenina (A) en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 o una adenina en la posición equivalente de una secuencia que comprende al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y/o al nucleótido donante resistente para SNP_02, que comprende citosina (C) en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3, o una citosina en la posición equivalente en una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3 y/o que conserva el fragmento o subfragmento de introgresión que comprende el genRPF15,y opcionalmente, dicho SNP_01 y/o SNP_02 (o SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 3), como la presente en NCIMB 42608, y una parte de la mencionada planta, pueden envasarse adecuadamente para el transporte y/o comercializarse frescas. Dichas partes abarcan cualesquiera células, tejidos y órganos que pueden obtenerse de las plántulas o plantas, tales como, por ejemplo, entre otros, una hoja, un esqueje, polen, una parte de una hoja y similares.
Las hojas pueden cosecharse inmaduras, tales como espinacas de hojas tiernas o recién brotadas, o maduras. Una planta, plantas o partes de las mismas pueden envasarse en un recipiente (por ejemplo, bolsas, cajas de cartón, latas, etc.) solas o junto con otras plantas o materiales. Las partes pueden almacenarse y/o seguir procesándose. Por lo tanto, también se incluyen los productos alimentarios o piensos que comprenden una o más de estas partes, estas hojas o partes de las mismas que pueden obtenerse de una planta descrita en el presente documento, su descendencia y partes de las plantas antes mencionadas. Por ejemplo, también se divulgan envases, tales como latas, cajas, cajones, bolsas, cajas de cartón, envases de atmósfera modificada, películas (por ejemplo, películas biodegradables), etc., que comprenden partes vegetales de plantas (frescas y/o procesadas) como las descritas en el presente documento.
Plantas y progenie
En otro aspecto, en el presente documento se describen, pero no de acuerdo con la invención, plantas y partes de plantas de espinaca, y la progenie de plantas de espinaca divulgadas en el presente documento, por ejemplo, cultivadas a partir de semillas, producidas por reproducción sexual o vegetativa, regeneradas a partir de las partes de plantas descritas anteriormente, o regeneradas a partir de un cultivo de células o de tejido, en las que la planta reproducida (propagada por semillas o regenerada o propagada vegetativamente) comprende resistencia al menos a las razas Pfs 8, 9, 11, 13 y 16 (preferentemente al menos a las razas 8, 9, 11, 13, 16 y 17) (opcionalmente además a una o más de las razas Pfs 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 12 y 14 y/u opcionalmente al aislado UA0514 y/u otros aislados de Pfs (resistencia conferida por el genRPF15,opcionalmente ligado al nucleótido donante resistente del SNP_01, que comprende adenina (A) en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 o una adenina en la posición equivalente de una secuencia que comprende al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y/o al nucleótido donante resistente para SNP_02, que comprende una citosina (C) en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3, o una citosina en la posición equivalente en una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3.
En un aspecto descrito en el presente documento, una planta de progenie de una planta de espinaca es una planta de progenie que conserva el gen de resistenciaRPF15ligado al nucleótido donante resistente de SNP_01, que tiene una adenina (A) en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 o una adenina en la posición equivalente de una secuencia que comprende al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y/o al nucleótido donante resistente para SNP_02, que tiene una citosina (C) en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3, o una citosina en la posición equivalente en una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3.
En otro aspecto, la planta de progenie descrita en el presente documento, pero no de acuerdo con la invención, es una planta de espinaca de la especieSpinacia oleráceaque comprende resistencia a las razas 8, 9, 11, 13 y 16 de Pfs (preferentemente al menos a las razas 8, 9, 11, 13, 16 y 17), en la que dicha resistencia es conferida por un único genRPF15introgresado a partir deSpinacia turkestanica,que, en un aspecto, está ligado al nucleótido donante resistente de SNP_01, que es adenina (A) en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 o una adenina en la posición equivalente de una secuencia que comprende al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y/o al nucleótido donante resistente para SNP_02, que es citosina (C) en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3, o una citosina en la posición equivalente en una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3. Preferentemente, la presencia deRPF15puede identificarse mediante el nucleótido donante antes mencionado para SNP_01 y/o SNP_02 y/u otro marcador ligado aRPF15o al fragmento de introgresión.
Tal como se ha mencionado anteriormente, el hecho de que una planta, progenie o propagación vegetativa comprenda o no el fenotipo de resistencia a Pfs conferido por el genRPF15puede comprobarse a través del fenotipo utilizando, por ejemplo, los ensayos de resistencia a la enfermedad de Pfs descritos anteriormente o en los ejemplos; y/o utilizando técnicas moleculares, tales como el análisis de marcadores moleculares, la secuenciación del ADN (por ejemplo, la secuenciación del genoma completo para identificar la introgresión), el pintado de cromosomas, etc.
Además, en el presente documento se describe la progenie que comprende o conserva el fenotipo de resistencia a Pfs (conferido por el genRPF15),tal como la progenie obtenida, por ejemplo, por autofecundación una o más veces y/o polinización cruzada de una planta descrita en el presente documento con otra planta de espinaca de una variedad o línea de fitomejoramiento diferente, o con una planta de espinaca descrita en el presente documento una o más veces. En concreto, en el presente documento se describe la progenie que conserva el genRPF15(que confiere el fenotipo de resistencia a Pfs) de NCIMB 42608 (como se encuentra en el mismo). En un aspecto, en el presente documento se describe una planta progenie que comprende la resistenciaRPF15,tal como una planta de progenie que se produce a partir de una planta de espinaca que comprende la resistenciaRPF15mediante uno o más procedimientos seleccionados del grupo que consiste en autofecundación, cruzamiento, mutación, producción de dobles haploides o transformación. Las mutaciones pueden ser espontáneas o inducidas por el ser humano o somaclonales. En un aspecto descrito en el presente documento, las plantas o semillas también pueden mutarse (por ejemplo, mediante irradiación, mutagénesis química, tratamiento térmico, TILLING, etc.) y/o las semillas o plantas mutadas pueden seleccionarse (por ejemplo, variantes naturales, variantes somaclonales, etc.) para cambiar una o más características de las plantas. Del mismo modo, las plantas descritas en el presente documento pueden transformarse y regenerarse, introduciendo en ellas uno o más genes quiméricos. La transformación puede llevarse a cabo mediante procedimientos convencionales, tales como la transformación mediada porAgrobacteriumtumefaciens ola biolística, seguida de la selección de las células transformadas y la regeneración en plantas. Un rasgo deseado (por ejemplo, genes que confieren resistencia a plagas o enfermedades, tolerancia a herbicidas, fungicidas o insecticidas, etc.) puede introducirse en las plantas, o en su progenie, transformando una planta descrita en el presente documento o su progenie con un transgén que confiere el rasgo deseado, en el que la planta transformada conserva el genRPF15y el fenotipo de resistencia a Pfs conferido por él y tiene el rasgo deseado.
En un aspecto se divulgan plantas haploides y/o plantas dobles haploides de la planta descrita en el presente documento, que comprenden resistencia al menos a las razas Pfs 8, 9, 11, 13 y 16 (preferentemente al menos a las razas 8, 9, 11, 13, 16 y 17), opcionalmente además a una o más de las razas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 12 y 14 de Pfs y/u opcionalmente al aislado UA0514 y/u otros aislados de Pfs, conferida por el genRPF15o por el fragmento de introgresión que comprende el genRPF15.Las plantas haploides y dobles haploides (DH) pueden producirse, por ejemplo, mediante el cultivo de anteras o microsporas y su regeneración en una planta completa. Para la producción de DH, la duplicación cromosómica puede inducirse utilizando procedimientos conocidos, tales como el tratamiento con colchicina o similares. Así, en un aspecto, en el presente documento se describe una planta de espinaca, pero no es una planta de acuerdo con la invención, que comprende fenotipo de resistencia a Pfs como se ha descrito, en la que la planta es una planta doble haploide.
Otro aspecto descrito en el presente documento, pero no de acuerdo con la invención, se refiere a un procedimiento para producir semillas de espinaca, que comprende cruzar una planta descrita en el presente documento consigo misma o con una planta de espinaca diferente y cosechar la semilla resultante. Otro aspecto descrito en el presente documento se refiere a las semillas producidas según este procedimiento y/o a una planta de espinaca producida mediante el cultivo de dichas semillas. Así, una planta descrita en el presente documento, pero no de acuerdo con la invención, puede utilizarse como progenitor masculino y/o femenino en la producción de semillas de espinaca, por lo que las plantas cultivadas a partir de dichas semillas comprenderán resistencia al menos a Pfs 8, 9, 11, 13 y 16 (preferentemente al menos a las razas 8, 9, 11, 13, 16 y 17), opcionalmente además a una o más de las razas Pfs 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 12 y 14 y/u opcionalmente al aislado UA0514 y/o otros aislados Pfs, debido a la presencia del genRPF15.
Así, en un aspecto, se describe la progenie de una planta de espinaca, en la que la planta de progenie se produce por autofecundación, cruzamiento, mutación, producción de dobles haploides o transformación y en la que la progenie conserva el gen de resistenciaRPF15(y el fenotipo conferido por él) descrito en el presente documento, por ejemplo, que puede obtenerse cruzando una planta de espinaca, cultivada a partir de semillas depositadas con el número de registro NCIMB 42608, con otra planta de espinaca. En otras palabras, en un aspecto, el gen o locus de resistencia (o fragmento de introgresión que comprende el gen o locus) tal como está presente/se encuentra/se deriva (o se puede derivar) del depósito de semillas NCIMB 42608 se conserva en las plantas progenitoras.
También pueden utilizarse marcadores moleculares para ayudar en la identificación de las plantas (o partes de plantas o ácidos nucleicos obtenidos de las mismas) que comprenden el gen o locus de resistenciaRPF15.Por ejemplo, se pueden desarrollar uno o más marcadores moleculares que estén estrechamente ligados física y genéticamente al gen o locus de resistenciaRPF15.Esto puede lograrse cruzando una planta de espinaca resistente (que comprendaRPF15)con una planta de espinaca susceptible y desarrollando una población segregante (por ejemplo, F2 o población retrocruzada) a partir de ese cruzamiento. A continuación, la población segregante puede fenotiparse para la resistencia a Pfs y genotiparse utilizando, por ejemplo, marcadores moleculares, tales como SNP ("Single Nucleotide Polymorphism", polimorfismo de un solo nucleótido), AFLP ("Amplified Fragment Length Polymorphism", polimorfismo de longitud de fragmento amplificado; véase, por ejemplo, el documento EP 534858) u otros, y mediante análisis con software pueden identificarse los marcadores moleculares que se cosegregan con el rasgo de resistencia a Pfs en la población segregante y su orden y distancia genética (distancia en centiMorgan, cM) al gen o locus de resistenciaRPF15.Mediante el análisis BLAST con SpinachBase se puede determinar la ubicación física en el cromosoma 3. Si se identifican marcadores flanqueantes (a ambos lados del gen RPF15), se puede identificar la región física del cromosoma 3 en la que se encuentra el gen RPF15 entre los marcadores.
Los marcadores moleculares que están estrechamente ligados al locus de resistenciaRPF15,por ejemplo, marcadores a una distancia de 5 cM o menos, pueden utilizarse entonces para detectar y/o seleccionar plantas (por ejemplo, plantas descritas en el presente documento o la progenie de una planta descrita en el presente documento) o partes de plantas que comprenden o conservan el fragmento de introgresión que comprende el gen o locus de resistenciaRPF15.Estos marcadores moleculares estrechamente ligados pueden sustituir a la selección fenotípica (o utilizarse además de ésta) en los programas de fitomejoramiento, es decir, en la selección asistida por marcadores ("Marker Assisted Selection", MAS). Preferentemente, en la MAS se utilizan marcadores ligados. Una secuencia que puede utilizarse como marcador es la secuencia que comprende el SNP_01 descrito. Más preferentemente, en la MAS se utilizan marcadores flanqueantes, es decir, un marcador a cada lado del gen o locusRPF15.
Utilizando SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 y las semillas depositadas divulgadas en el presente documento, la persona experta también puede identificar la secuencia del propio gen RPF15 utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede utilizarse la secuenciación de la región del cromosoma 3 y la comparación de la secuencia con la secuencia, por ejemplo, en SpinachBase, para identificar marcos de lectura abiertos en el fragmento de introgresión, con el fin de identificar el propio gen RPF15. La modificación del gen RPF15, por ejemplo, mediante CRISPR-Cas9, puede utilizarse para demostrar la función del gen. De este modo, la persona experta también puede generar plantas que comprendan mutaciones inducidas en el gen RPF15 (por ejemplo, en el promotor, la secuencia codificante de la proteína u otras secuencias reguladoras). Las plantas que comprenden mutaciones inducidas en el gen RPF15 se describen en el presente documento, pero no están de acuerdo con la invención.
En un aspecto, se proporciona un procedimiento para el cribado y, opcionalmente, la selección de semillas de espinaca, plantas o partes de plantas o ADN de tales semillas, plantas o partes de plantas para la presencia de uno o más marcadores ligados al genRPF15.
En otros aspectos, el genRPF15puede detectarse usando una o más sondas de ácido nucleico, cebadores de ácido nucleico o una combinación de los mismos.
Así, en un aspecto, el genRPF15puede detectarse mediante una o más sondas de ácido nucleico, que se hibridan con el ADN genómico obtenido de una planta o una parte de una planta que comprende el genRpF15utilizando condiciones de hibridación rigurosas.
Una sonda de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, una molécula de ADN que comprende SEQ ID NO: 1 (o que comprende adenina en la ubicación equivalente a 106 de una secuencia que comprende al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1) o una molécula de ADN que comprende SEQ ID NO: 3 (o que comprende citosina en la ubicación equivalente a 184 de una secuencia que comprende al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3) o la secuencia complementaria de cualquiera de ellas. En otro aspecto, el genRPF15puede detectarse mediante uno o más cebadores de ácido nucleico, que amplifican el ADN genómico ligado al genRPF15.Por ejemplo, los cebadores pueden amplificar una molécula de ácido nucleico que comprende la mencionada SEQ ID NO: 1, o una secuencia que comprende al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 con adenina en la posición equivalente a 106 o SEQ ID NO: 3, o una secuencia que comprende al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3 con citosina en la posición equivalente a 184. Los cebadores adecuados se encuentran, por ejemplo, de 70 a 100 pb cadena arriba y de 70 a 100 pb cadena abajo del marcador de SNP y pueden seleccionarse para diseñar un cebador directo y un cebador inverso, que amplifiquen el marcador. Los cebadores pueden utilizarse, por ejemplo, para el genotipado de SNP, por ejemplo, en un ensayo KASP para detectar el genotipo SNP para SNP_01 y/o SNP_02.
Cualquier otro tipo de marcador molecular y/u otro ensayo que sea capaz de identificar la presencia o ausencia relativa de un rasgo de interés (es decir, el gen o locusRPF15)en una planta o parte de una planta también puede ser útil para fines de fitomejoramiento.
Información sobre depósitos
Un número representativo de semillas deSpinacia oleráceaNCIMB 42608 fue depositado por Nunhems B.V. en virtud del Tratado de Budapest el 12 de julio de 2016, en el NCIMB Ltd., Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB21 9YA, Reino Unido (NCIMB). El acceso al depósito estará disponible durante la pendencia de esta solicitud para las personas que el Director de la Oficina de Patentes de EE. UU. determine que tienen derecho al mismo previa solicitud. Sujeto a 37 C.F.R. § 1.808(b), todas las restricciones impuestas por el depositante sobre la disponibilidad al público del material depositado se eliminarán irrevocablemente tras la concesión de la patente. El depósito se mantendrá durante un periodo de 30 años, o 5 años después de la solicitud más reciente o durante la vida ejecutiva de la patente, si ésta es más larga, y se sustituirá si alguna vez deja de ser viable durante ese periodo. El solicitante no renuncia a ningún derecho concedido en virtud de esta patente en esta solicitud o en virtud de la Ley de Protección de Variedades Vegetales (7 USC 2321et seq.).Aunque la invención se ha descrito en relación con realizaciones preferidas específicas, debe entenderse que la invención reivindicada no debe limitarse indebidamente a dichas realizaciones específicas. De hecho, diversas modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la invención que son obvias para las personas expertas en el fitomejoramiento, la química, la biología, la fitopatología o campos afines, están previstas dentro del alcance de las reivindicaciones siguientes.
La presente invención se ilustrará con más detalle en los siguientes ejemplos, que se ofrecen únicamente con fines ilustrativos y no pretenden limitar la invención en modo alguno.
Ejemplos
1 - Selección de un donante silvestre y cruzamiento del genRPF15del donante silvestre con espinacas cultivadas
Se ensayó la resistencia de varias muestras silvestres registradas a la infección conPeronospora farinosaf. sp.spinaciaede las razas 1 a 16 y el aislado UA0514. Se descubrió que una muestra registrada de S.turkestanicaera resistente al menos a las razas Pfs 8, 9, 11, 13 y 16 y se seleccionó.
La planta seleccionada (donante de resistencia) se cruzó con una planta de espinaca cultivada que no tenía ninguna resistencia conocida en su trasfondo a la Pfs. Se analizó la resistencia de las plantas de progenie a las razas 8, 9, 11, 13 y 16 de Pfs, como mínimo, que presentaba la planta seleccionada (donante), y las plantas de progenie resistentes se seleccionaron y retrocruzaron con dichas plantas cultivadas de espinaca y se autofecundaron durante varias generaciones para generar una línea que comprendiera el fragmento de introgresión en forma homocigótica. Así, la resistencia del donante S.turkestanicase introgresó en las plantas de espinaca cultivadas. Las semillas de una línea vegetal así obtenida se depositaron en el NCIMB con el número NCIMB 42608.
2 - Fenotipo de resistencia a Pfs de espinacas cultivadas que comprenden el genRPF15
La resistencia a la infección porPeronospora farinosase comprobó con la ayuda de un conjunto diferencial (que puede obtenerse en a.o. Naktuinbouw, Países Bajos).
Las plantas de espinaca cultivadas a partir de la semilla NCIMB 42608 (que comprende el genRPF15)se plantaron junto con el conjunto diferencial y las plantas de espinaca de otros genotipos que sirvieron de control en bandejas que contenían sustrato BVB (Euroveen, Grubbenvorst) y se cubrieron con Agra-vermiculita (Pull, Rhenen). En cada ensayo se analizaron al menos 10 plantas de un genotipo en una o dos repeticiones. Las bandejas se colocaron en una celda climática a 12 °C/15 °C (día/noche) con un fotoperiodo de 12 h. Las plantas se inocularon pulverizando una suspensión esporangial (2,5 * 105/ml) de una raza patógena dePeronospora farinosaf. sp.spinaciae14días después de la siembra. De esta forma se ensayaron las razas patógenas. Las plantas inoculadas se cubrieron con material plástico transparente con una humedad relativa del 100 % durante un período de 24 h, tras el cual se retiró el plástico de la parte superior para reducir la humedad relativa al 80 %.
Transcurridos 10 días, las plantas se clasificaron como "resistentes" o "susceptibles" en función de los síntomas de esporulación del patógeno sobre los cotiledones y las hojas verdaderas, según lo descrito por Irishet al.(2007; Plant Dis., 91: 1392-1396). Una línea de plantas que presentaba indicios de esporulación se consideró "susceptible". Una línea de plantas en la que al menos el 85 % de los individuos de la línea no presentaban esporulación se consideró "resistente". Las plantas resistentes se volvieron a inocular para evaluar si las plantas calificadas inicialmente como resistentes habían escapado a la infección o si eran realmente resistentes. Estas plantas se puntuaron de nuevo 10 días después de la segunda inoculación. Cualquier genotipo con <15 % de plantas clasificadas como "susceptibles" (es decir, con más del 85 % de plantas que no muestran esporulación) se consideró como genotipo resistente.
Se descubrió que el nuevo gen de resistencia,RPF15,presente en NCIMB 42608 en forma homocigótica, confería resistencia a Pfs 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14 y 16 y al aislado UA0514. La tabla 2 muestra las resistencias de las plantas de espinaca cultivadas a partir de semilla NCIMB 42608 (que comprendeRPF15homocigótico).
Se observó que las líneas homocigóticas para RPF11, RPF12 o RPF13 no eran resistentes a la raza Pfs 16.
Las variedades diferenciales susceptibles y resistentes de la tabla 1 se utilizaron como controles y se comportaron como se esperaba según la norma, tal como se indica en la tabla 1 (datos no mostrados).
Tabla 2: Resistencia a la enfermedad de RPF15
Leyenda: (- significa resistente; significa susceptible; (-) significa resistente intermedio)
3 - Introgresión del rasgo de resistenciaRPF15en otras plantas de espinaca
En otro experimento, una planta de espinaca cultivada a partir de semillas NCIMB 42608 se cruzó (como padre) con una planta de espinaca diferente susceptible a la raza que se iba a ensayar. Las plantas de la población F1 se sometieron a pruebas de resistencia a Pfs contra las razas 8, 9, 11, 13 y 16 de Pfs, como se describe en el ejemplo 2. Se observó que las plantas F1 heterocigóticas conservaban la resistencia contra las razas 8, 9, 11, 13 y 16 de Pfs, por lo que se concluyó que la resistencia a estas razas es dominante. En la población F2, la resistencia a estas razas se segregará en una proporción de 3 (resistente):1 (susceptible).
4- Desarrollo de un marcador ligado aRPF15y alineaciones
Se desarrolló una población F2 cruzando una planta de espinaca de NCIMB 42608 (que incluye el genRPF15)con una planta de espinaca que no tiene el gen de resistenciaRPF15y no tiene resistencia en su trasfondo a Pfs. Se realizó una cartografía de ligamiento y se identificaron dos marcadores de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP), SNP_01 y SNP_02, mostrados en la tabla 3, ligados al genRPF15.
Tabla 3: Un marcador de SNP ligado al gen RPF15
La SEQ ID NO: 1 comprende adenina en el nucleótido 106 y SEQ ID NO: 2 comprende una guanina en el nucleótido 106. La SEQ ID NO: 3 comprende citosina en el nucleótido 184 y SEQ ID NO: 4 comprende una guanina en el nucleótido 184. La SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2 son 204 pb. La SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4 son 299 pb. Tal como ya se ha mencionado, el progenitor recurrente es susceptible.
La SEQ ID NO: 1 y 2 también se utilizaron en un análisis BLAST frente a la secuencia genómica de SpinachBase (de la línea china de espinaca SP75). Este análisis demostró que SEQ ID NO: 1 y 2 se ubican en el cromosoma 3, comenzando en el nucleótido 1091059 y terminando en el nucleótido 1090856, estando el SNP_01 en el nucleótido 1090954 (que comprende una A en este nucleótido) en SP75.
En una alineación por pares de la secuencia genómica de SpinachBase con SEQ ID NO: 1, las dos secuencias tienen una identidad de secuencia del 97 % (alineación por pares utilizando el programa "Needle" de Emboss, parámetros por defecto) (véase la figura 1, SNP_01 en negrita). Por lo tanto, ambos tienen adenina en la posición SNP_01.
Además, las SEQ ID NO: 3 y 4 se utilizaron en un análisis BLAST frente a la secuencia genómica de SpinachBase (de la línea china de espinacas SP75). Este análisis demostró que SEQ ID NO: 3 y 4 se ubican en el cromosoma 3, comenzando en el nucleótido 607940 y terminando en el nucleótido 607636, estando el SNP_02 en el nucleótido 607751 (que comprende una G en este nucleótido) en SP75.
En una alineación por pares de la secuencia genómica de SpinachBase con SEQ ID NO: 3, las dos secuencias tienen una identidad de secuencia del 96 % (alineación por pares utilizando el programa "Needle" de Emboss, parámetros por defecto) (véase la figura 2, SNP_02 en negrita). Mientras que<s>E<q>ID NO: 3 tiene citosina en la posición nucleotídica 184 (SNP_02), y SEQ ID NO: 4 tiene guanina en la posición nucleotídica 184 (SNP_02), el genoma de referencia también tiene guanina en la posición equivalente a la posición nucleotídica 184 (SNP_02) de SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.
Las figuras 1 y 2 muestran que tanto SNP_01 como SNP_02, es decir, la adenina en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 y la citosina en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3 (ambas presentes en el fragmento de introgresión procedente de S.turkestanica)pueden identificarse en secuencias que no son idénticas al 100 % a SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, por alineación de secuencias por pares de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 con otras secuencias, por ejemplo, secuencias que comprenden al menos un 95 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3. La posición nucleotídica de dichas secuencias se denomina en el presente documento posición nucleotídica "equivalente" a la posición 106 de SEQ ID NO: 1 o a la posición 184 de SEQ ID NO: 3.
La adenina en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 (SNP_01) y la citosina en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3 (SNP_02) o en el nucleótido equivalente en una secuencia que comprende al menos un 95 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 puede utilizarse para seleccionar plantas y partes de plantas que comprendan el fragmento de introgresión en el que se encuentra RPF15.
5 - Pruebas de marcadores de otros genes de resistencia
El documento WO2015054339 es una solicitud de patente que describe una introgresión a partir de S.tetrandraque comprende un locus de rasgo cuantitativo ("Quantitative Trait Locus", QTL) que confiere resistencia al menos a las razas Pfs 7, 10, 11, 12, 13, y 14. La solicitud también divulga las secuencias flanqueantes de S.tetrandra,SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2, que flanquean el QTL en el donante de S.tetrandradescrito en el documento WO2015054339, es decir, que flanquean dicho gen de S.tetrandraque confiere resistencia al menos a las razas Pfs 7, 10, 11, 12, 13 y 14. SEQ ID NO:1 del documento WO2015054339, en lo sucesivo "marcador flanqueante izquierdo de S.tetrandra",se añadió a esta solicitud como SEQ ID NO: 5, y SEQ ID NO:2 del documento WO2015054339, en lo sucesivo denominado "marcador flanqueante derecho de S.tetrandra", se añadió a la presente solicitud como SEQ ID NO:6.
La línea de plantas depositada por los presentes inventores se sometió a pruebas para detectar la presencia de dichos marcadores flanqueantes izquierdo y derecho de S.tetrandra.Para cada una de las dos regiones de secuencias flanqueantes descritas en la patente se diseñaron dos pares de cebadores que amplificaban la región correspondiente en el ADN de la planta de espinaca cultivada a partir del NCIMB 42608. En total, se encargaron 8 cebadores de PCR y se comprobó por medios informáticos utilizando JCeasar si daban lugar a un fragmento PCR dentro de la región.
Se realizó una PCR con el ADN de la planta de espinaca cultivada a partir de la semilla NCIMB 42608, utilizando la combinación de pares de cebadores para el marcador flanqueante izquierdo de S.tetrandra.Los productos de PCR resultantes se verificaron en gel de agarosa para comprobar la longitud esperada del fragmento. Los fragmentos tenían el tamaño esperado y fueron secuenciados. Los fragmentos secuenciados del material se alinearon en cóntigos para cada una de las dos regiones de secuencias flanqueantes en Sequencher. Basándose en estos cóntigos, la planta de espinaca cultivada a partir de la semilla NCIMB 42608 no comprendía el marcador flanqueante izquierdo deS.tetrandra. En cambio, se descubrió que la semilla NCIMB 42608 y las plantas cultivadas a partir de ella tenían otra secuencia (secuencia de S.oleracea),añadida a esta solicitud como s Eq ID NO: 7 (S.oleracea).La alineación entre las dos secuencias se muestra en la figura 3. Es evidente que la secuencia flanqueante izquierda deS.tetrandrano está presente en las semillas depositadas.
Se realizó una segunda PCR con el ADN de la planta de espinaca cultivada a partir de la semilla NCIMB 42608, utilizando la combinación de pares de cebadores para el marcador flanqueante derecho de S.tetrandra.Los productos de PCR resultantes se verificaron en gel de agarosa para comprobar la longitud esperada del fragmento. Los fragmentos tenían el tamaño esperado y fueron secuenciados. Los fragmentos secuenciados del material se alinearon en cóntigos para cada una de las dos regiones de secuencias flanqueantes en Sequencher. Basándose en estos cóntigos, la planta de espinaca cultivada a partir de la semilla NCIMB 42608 no contenía el marcador flanqueante de S.tetrandracorrecto. En cambio, en la semilla de NCIMB 42608 y en las plantas cultivadas a partir de ella se descubrió de nuevo otra secuencia, añadida a esta solicitud como SEQ ID NO: 8 (S.oleracea).La alineación entre las dos secuencias se muestra en la figura 4. Es evidente que la secuencia flanqueante derecha de S.tetrandrano está presente en las semillas depositadas. Por favor, muéstreme lo que se alineó y cómo.
Por lo tanto, ni el marcador flanqueante izquierdo ni el derecho de S.tetrandraestán presentes en NCIMB 42608. NCIMB 42608 comprende las secuencias de S.oleraceaSEQ ID NO: 7 y 8 en la región del cromosoma.
Evidentemente, otras líneas o variedades de espinacas cultivadas según la invención pueden comprender SEQ ID NO: 7 y/o SEQ ID NO: 8 en su genoma, o una secuencia que comprende al menos un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 7 y 8.
Curiosamente, al realizar un análisis BLAST en SpinachBase utilizando estas secuencias, éstas aparecen ubicadas en el cromosoma 3 y no en el cromosoma 6 como se menciona en la solicitud de patente WO2015054339.
Por lo tanto, el QTL de S.tetrandraparece encontrarse entre 0.7 Mb y 1.41 Mb del cromosoma 3.
6 - Cartografía fina deRPF15
Se desarrollará otra población segregante cruzando plantas de espinaca cultivadas a partir de semillas de NCIMB 42608 (que comprenden el genRPF15)con una planta de espinaca que no comprende el gen de resistenciaRPF15y no comprende resistencia en su trasfondo a Pfs. También se añadirán más SNP a la región cromosómica donde se encuentra el RPF15. Se llevará a cabo una cartografía adicional, generando más marcadores de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) ligados al genRPF15.
Referencias bibliográficas
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Claims (4)
1. Un procedimiento para identificar o seleccionar una planta de espinaca que comprende un fragmento de introgresión procedente de un donante que es un pariente silvestre de la espinaca, en el que dicho fragmento de introgresión comprende un único gen denominado gen RPF15, que confiere resistencia en forma heterocigótica y homocigótica contra al menos las razas 8, 9, 11, 13 y 16 dePeronospora farinosa,comprendiendo dicho procedimiento: determinar la presencia de una adenina en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 (SNP_01), o de una adenina en la posición nucleotídica equivalente al nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 en una secuencia que comprende al menos un 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y la presencia de una citosina en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3 (SNP_02), o de una citosina en la posición nucleotídica equivalente al nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3 en una secuencia que comprende al menos un 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3.
2. El procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además ensayar el fenotipo de resistencia contra una o más de las razas dePeronospora farinosapara determinar que ha sido conferido por el gen RPF15.
3. El uso de SNP_01 que comprende una adenina en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 o que comprende una adenina en la posición equivalente en una secuencia que comprende al menos un 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 o el uso de SNP_02 que comprende una citosina en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3 o que comprende una citosina en la posición equivalente en una secuencia que comprende al menos un 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3 en la identificación de una planta o de una parte de una planta o de una semilla o de una célula o de un cultivo celular de espinaca que comprenda el gen RPF15.
4. Un procedimiento para cribar, identificar o detectar la presencia del gen RPF15 en una planta o una parte de una planta de espinaca, que comprende:
a) cribar una planta o una parte de una planta de espinaca cultivada o del ADN de dicha planta o parte de planta mediante un ensayo de marcadores moleculares que detecta al menos un marcador de SNP seleccionado del grupo que consiste en:
i) el nucleótido donante resistente de SNP_01, que tiene una adenina (A) en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 o una adenina en la posición equivalente de una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1;
ii) el nucleótido donante resistente de SNP_02, que tiene una citosina (C) en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3, o una citosina en la posición equivalente en una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3 y, opcionalmente,
b) identificar o seleccionar una planta o una parte de una planta que comprende el nucleótido SNP donante resistente para SNP_01, que es una adenina (A) en el nucleótido 106 de SEQ ID NO: 1 o una adenina en la posición equivalente de una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y el nucleótido donante resistente para SNP_02, que es citosina (C) en el nucleótido 184 de SEQ ID NO: 3, o citosina en la posición equivalente en una secuencia que comprende al menos un 90 %, preferentemente al menos un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3.
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