JP7341121B2 - Cgmmv耐性スイカ属植物 - Google Patents
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Description
スケール1:重度の病徴:葉の変形、水ぶくれ、および明らかなモザイク
スケール2:中等度の病徴:葉の変形は軽度であるが明らかなモザイク
スケール3:軽度の病徴:非常に軽度のモザイクとわずかな透化斑点
スケール4:葉に病徴なし
a)それぞれがキトルルス・コロキンシス種のCGMMV耐性ドナー植物の7番染色体由来の遺伝子移入断片を有する2つの7番染色体を含んでなる第1のCGMMV耐性近交系二倍体スイカ植物であって、遺伝子移入断片が、QTL7.1、およびSNP14(配列番号14)、もしくはSNP13とSNP18との間、もしくはSNP13とSNP15との間についてのドナー植物の配列を含んでなるか、または遺伝子移入断片が、QTL7.1、ならびにSNP13、SNP14、SNP15、SNP16、SNP17、およびSNP18の1つもしくは複数もしくはすべてについての耐性ドナーヌクレオチドを含んでなるCGMMV耐性近交系二倍体スイカ植物を準備すること、
b)それぞれがキトルルス・コロキンシス種のCGMMV耐性ドナー植物の7番染色体由来の遺伝子移入断片を有する4つの7番染色体を含んでなる第2のCGMMV耐性近交系四倍体スイカ植物であって、遺伝子移入断片が、QTL7.1、およびSNP14(配列番号14)、もしくはSNP13とSNP18との間、もしくはSNP13とSNP15との間についてのドナー植物の配列を含んでなるか、または遺伝子移入断片が、QTL7.1、ならびにSNP13、SNP14、SNP15、SNP16、SNP17、およびSNP18の1つまたは複数またはすべてについての耐性ドナー遺伝子型を含んでなるCGMMV耐性近交系四倍体スイカ植物を準備すること、
c)工程b)でもたらされた四倍体スイカ植物と、工程a)でもたらされた二倍体スイカ植物の花粉を受粉させること、ならびに
d)工程c)で生産された果実から種子を集めること。
a)それぞれがキトルルス・コロキンシス種のCGMMV耐性ドナー植物の9番染色体由来の遺伝子移入断片を有する2つの9番染色体を含んでなる第1のCGMMV耐性近交系二倍体スイカ植物であって、遺伝子移入断片が、QTL9.1、およびSNP22(配列番号22)、もしくはSNP19とSNP24との間、もしくはSNP21とSNP23との間についてのドナー植物の配列を含んでなるか、または遺伝子移入断片が、QTL9.1、ならびにSNP19、SNP20、SNP21、SNP22、SNP23、およびSNP24の1つまたは複数またはすべてについての耐性ドナー遺伝子型を含んでなるCGMMV耐性近交系二倍体スイカ植物を準備すること、
b)それぞれがキトルルス・コロキンシス種のCGMMV耐性ドナー植物の9番染色体由来の遺伝子移入断片を有する4つの9番染色体を含んでなる第2のCGMMV耐性近交系四倍体スイカ植物であって、遺伝子移入断片が、QTL9.1、およびSNP22(配列番号22)、もしくはSNP19とSNP24との間、もしくはSNP21とSNP23との間についてのドナー植物の配列を含んでなるか、または遺伝子移入断片が、QTL9.1、ならびにSNP19、SNP20、SNP21、SNP22、SNP23、およびSNP24の1つまたは複数またはすべてについての耐性ドナー遺伝子型を含んでなるCGMMV耐性近交系四倍体スイカ植物を準備すること、
c)工程b)でもたらされた四倍体スイカ植物と、工程a)でもたらされた二倍体スイカ植物の花粉を受粉させること、ならびに
d)工程c)で生産された果実から種子を集めること。
a)SNP13、SNP14、SNP15、SNP16、SNP17、およびSNP18の1つもしくは複数もしくはすべてのSNP遺伝子型、および/またはSNP19、SNP20、SNP21、SNP22、SNP23、およびSNP24の1つもしくは複数についてのSNP遺伝子型について、ゲノムDNAをスクリーニングすること、ならびに所望により(optionally)
b)SNP13、SNP14、SNP15、SNP16、SNP17、およびSNP18の1つもしくは複数もしくはすべて、および/またはSNP19、SNP20、SNP21、SNP22、SNP23、およびSNP24の1つもしくは複数もしくはすべてについての耐性ドナーヌクレオチドを含んでなる植物または植物部分を選抜すること。
a)SNP1、SNP2、SNP3、SNP4、SNP5、およびSNP6の1つもしくは複数もしくはすべてのSNP遺伝子型、および/またはSNP7、SNP8、およびSNP9の1つもしくは複数についてのSNP遺伝子型、および/またはSNP10、SNP11、およびSNP12の1つもしくは複数についてのSNP遺伝子型について、ゲノムDNAをスクリーニングすること、ならびに所望により
b)SNP1、SNP2、SNP3、SNP4、SNP5、およびSNP6の1つもしくは複数もしくはすべて、および/またはSNP7、SNP8、およびSNP9の1つもしくは複数、および/またはSNP10、SNP11、およびSNP12の1つもしくは複数についての耐性ドナーヌクレオチドを含んでなる植物または植物部分を選抜すること。
a)(例えばCGMMV感受性)スイカ植物と、NCIMB42624の植物、またはその子孫(例えば自家受粉によって得られる)、またはCGMMV耐性C.コロキンシス植物由来の遺伝子移入断片の1つもしくは複数を含んでなる(例えばQTL7.1および/もしくはQTL9.1を含んでなる)系統もしくは品種などのCGMMV耐性スイカ植物などのCGMMV耐性C.コロキンシス植物との間の交配に由来するスイカ植物の集団を準備すること、
b)C.コロキンシスドナー由来の遺伝子移入断片の1つまたは複数を含んでなり、その遺伝子移入断片が、本明細書に記載のQTL1.1、QTL4.1、QTL5.2、QTL7.1、および/またはQTL9.1から選択されるQTLを含んでなる集団から植物を選抜すること。
a)CGMMV耐性スイカ属植物(ドナー)を、別のスイカ属植物(レシピエント)、例えばCGMMV感受性植物と交配させること、またはそのような交配の子孫を準備すること、および
b)工程a)による交配植物から種子を得ること、またはCGMMV耐性を含んでなる種子/植物を選抜すること。
a)スイカ属、カボチャ属(Curcubita)、ユウガオ属、アレチウリ属、もしくはトウガン属の群の植物またはこれらの属にいずれかの2つの種の交配によって生産される雑種から選択される台木を準備すること、
b)本発明による穂木を準備すること、
c)工程b)による穂木を工程a)による台木に接ぎ木すること。
a)本発明による台木を準備すること、
b)スイカ属植物の穂木を準備すること、
c)工程b)による実生を工程a)による台木に接ぎ木すること。
本発明の種子の播種すること、または本発明による接木植物を移植すること、または本発明による接木実生を移植すること、
工程a)に従って播種された植物を育てること、または接木植物もしくは接木実生を育てること。
CGMMV耐性植物の二倍体キトルルス・コロキンシス種子は、2016年1月27日にNCIMB Ltd.、バックスバーン(Bucksburn)アバディーン(Aberdeen) AB21 9YA、スコットランドにおいて、ブダペスト条約に基づきヌンヘムスB.V.によって受託番号NCIMB42624で寄託された。
配列番号1~配列番号6は、それぞれ、SNP1~SNP6のドナーヌクレオチドを含んでなるC.コロキンシス由来のQTL1.1に連鎖する1番染色体の配列を指す。
配列番号7~配列番号9は、それぞれ、SNP7~SNP9のドナーヌクレオチドを含んでなるC.コロキンシス由来のQTL4.1に連鎖する4番染色体の配列を指す。
配列番号10~配列番号12は、それぞれ、SNP10~SNP12のドナーヌクレオチドを含んでなるC.コロキンシス由来のQTL5.2に連鎖する5番染色体の配列を指す。
配列番号13~配列番号18は、それぞれ、SNP13~SNP18のドナーヌクレオチドを含んでなるC.コロキンシス由来のQTL7.1に連鎖する7番染色体の配列を指す。
配列番号19~配列番号24は、それぞれ、SNP19~SNP24のドナーヌクレオチドを含んでなるC.コロキンシス由来のQTL9.1に連鎖する9番染色体の配列を指す。
配列番号25:植物組織中のCGMMV RNAを検出するためのRT PCRに使用されるリバースプライマー
配列番号26:植物組織中のCGMMV RNAを検出するためのRT PCRに使用されるフォワードプライマー
配列番号27:植物組織中のCGMMV RNAを定量するための定量的RT PCRに使用されるセンスプライマー
配列番号28:植物組織中のCGMMV RNAを定量するための定量的RT PCRに使用されるアンチセンスプライマー
配列番号29:植物組織中のCGMMV RNAを定量するための定量的RT PCRに使用されるプローブオリゴヌクレオチド
実施例:CGMMV耐性を評価するための機械的葉接種
項目1:植物感染のためのCGMMV接種材料の調製
ヨーロッパ型株Ve459(CNR、トリノ)に感染したCGMMV感受性キュウリ植物(例えば、品種シーラ(Sheila)、ヌンヘムスB.V.)からスイカ属植物の感染用接種材料を作出した。CGMMV感染の明らかな病徴を示す新鮮な若い葉(有病徴葉)をキュウリから取り除いた。有症キュウリの葉1グラム当たり5mlの冷蔵(5℃)0.03Mリン酸緩衝液を加え、キュウリの葉1グラム当たり0.05グラムの活性炭および0.1グラムの珪藻土を加えた。葉材は粉砕中と粉砕後に、氷冷した乳鉢中で乳棒を用いて粉砕した。
葉接種は、若い実生の最初の本葉に接種材料を擦ることによって行った。したがって、最初の本葉を広げたとき(播種後約15~20日)に、(スイカ属)植物の実生に、一般的方法の項目1に記載のように調製した接種材料を接種した。最初の接種の4~5日後に、実生に2回目の接種を行った。対照実生にはバッファーのみを接種する(模擬接種)。接種した植物は間接太陽光に保持し、直接太陽光は2回目の接種まで避けた。接種した実生を維持するための温度条件(regime)は、夜間18℃および昼間12~14時間の昼光を伴って25℃であった。1つの遺伝子型(例えばCGMMV耐性遺伝子型、感受性対照遺伝子型)当たり少なくとも10個の植物を、少なくとも2反復(replicates)で接種することが好ましい。くわえて、模擬接種された多数の植物を含む。
接種された植物を、最初の接種後の次の時点(dpi、接種後の日数)でCGMMVウイルスの病徴および/または存在について分析した。
15dpi
30dpi
45dpi
60dpi
所望の場合、約140dpiまたはそれ以降でも、病徴やCGMMVの存在について果実を試験することができる。
一連の試験すべてに、対照を含める必要がある。CGMMVでの感染の効率を確認するための陽性対照として、CGMMVに感受性があることが知られている(スイカ属)植物(例えばキトルルス・ラナツス商業品種)を含めることが重要である。好ましくは陽性対照植物の少なくとも95%が20dpiの葉で重度の病徴(スケール1)を示すべきであり、好ましくはこれらの植物によって生産される果実が重度の病徴を示すべきである。さらに、模擬接種としてリン酸バッファーのみを接種したCGMMV感受性植物に代表される陰性対照植物が含まれるべきである。くわえて、接種されていない植物を一連の試験シリーズに含めることができる。陰性対照は、葉または果実でCGMMV感染の病徴を示してはならず、CGMMVタンパク質および/またはRNAは模擬接種植物では検出可能であるべきではない。
目視で評価した葉の病徴を次のスケールに従って分類する。
スケール1:重度の病徴:葉の変形、水ぶくれ、および明らかなモザイク(図2に例示)
スケール2:中等度の病徴:葉の変形は軽度であるが明らかなモザイク(図3に例示)
スケール3:軽度の病徴:非常に軽度のモザイクとわずかな透化斑点(図4に例示)
スケール4:葉に病徴なし(図1Bに例示)
接種した植物組織におけるウイルス検出:ELISA
植物のCGMMVの有無を示すために、病徴の目視評価によってスケール4に分類されたすべての植物について、2回目の評価(30dpi)の後にELISAアッセイを行った。ELISAアッセイによって得られた結果に応じて、試験した植物を以下のスケールに従って分類した。
吸光度が<0.5の場合、低い陽性
吸光度が>0.5の場合、ELISAで陽性
植物材料中のCGMMVの有無はまた、RT-PCRによって評価する、またはRT-qPCR検出によって(一般的方法の項目4を参照)かつ/もしくはティッシュプリントもしくはドットブロット(一般的方法の項目5)によって定量することができる。
植物材料中のCGMMVの存在を逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)によって検出し、植物材料中のCGMMVの定量には逆転写酵素定量ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR、TaqMan)を用いた。参照により組み込まれるHongyun et al., 2008, J Virological Methods 149, 326-329も参照されたい。
葉組織(200mg)を液体窒素中で、乳棒を用いて乳鉢内で細かく粉砕し、滅菌済みの微量遠心管に移した。製造者の指示に従って、Trizol試薬(インビトロジェン)で全RNAを抽出した。得られたRNAペレットを30μlのDEPC処理水に再懸濁し、-80℃で保存した。RNA濃度をND-1000分光光度計(NanoDrop Technologies)で測定した。
RT-PCRに使用したオリゴヌクレオチドは、EMBLデータベースから入手可能なCGMMVコートタンパク質遺伝子および3’非コード領域(NCR)のヌクレオチド配列に基づいて設計した。最初のcDNA鎖は、リバースプライマー:5′-TTG CAT GCT GGG CCC CTA CCC GGG GAA AG-3′(SphI;配列番号25)でプライミングしたSuperScriptII逆転写酵素(インビトロジェン)によって合成した。PCRで使用されるフォワードプライマーの配列は、5′-CCG AAT TCA TGG CTT ACA ATC CGA TCA C-3′(EcoRI;配列番号26)である。温度サイクルスキームは、94℃で3分、35サイクルの94℃で30秒、53℃で45秒、72℃で1分、その後に続く72℃で7分の最終インキュベーションであった。
TaqManアッセイのプライマーとプローブは、製造元によって提供された説明書に記載されている手順に従って、Primer Expressソフトウェア(アプライドバイオシステムズ、バージョン2.0)を使用して設計した。CGMMV特異的プライマーは、5′-GCA TAG TGC TTT CCC GTT CAC-3′(センス;配列番号27)および5′-TGC AGA ATT ACT GCC CAT AGA AAC-3′(アンチセンス;配列番号28)であった。プローブは5′-CGG TTT GCT CAT TGG TTT GCG GA-3′(配列番号29)であり、6-カルボキシフルオレセイン(FAM)で標識し、3’末端をN、N、N’、N’-テトラメチル-6-カルボキシローダミン(TAMRA)で標識した。
ティッシュプリント用メンブレンの準備
手袋を着用し、滅菌ハサミで必要なサイズに切断することによってナイロンメンブレンを準備し、マイクロプレートグリッドテンプレートを上に置く(実際のサイズは使用するサンプルのタイプによる)。清潔で滅菌されたメスで葉柄を横断して切り込み、樹液がすべて吸収されるまでグリッドの1つに軽く押し込む。後に続くプリントごとに新鮮なカットを作成する。精製されたDNAまたはRNA試料では、1μlの試料で十分である。
試料組織を重量測定し、適切な希釈率で適切な抽出バッファーで粉砕する。マイクロピペットで10~20μlの抽出物を取り、チップを慎重に取り外して、内部の液体が上昇してエアロックされないように努める。マイクロプレートグリッドをガイドとして使用して、ピペットチップをメンブレンに軽く(すばやく)触れさせ、抽出物をメンブレンに塗る(プリンティング)。結果として得られるドットの体積は約250nlで、各グリッド位置に4個配置することができる。メンブレンの目的とハイブリダイゼーションプローブの品質に応じて、1つの試料につき2~4ドットを使用する。
組織プリントまたはドットブロットのために上記のように調製したメンブレンを、フラットピンセットを使用してハイブリダイゼーションチューブに入れる。プレハイブリダイゼーション溶液(DIG Easyおよび1%ブロッキング剤)を室温で追加する(メンブレンを覆うのに十分に、例えば8×12cmのメンブレンで20ml、8×6cmで10ml)。ハイブリダイゼーションオーブンで回転させながら54℃で約2時間インキュベートする。これ以降メンブレンが乾かないようにする。
8×12cmのメンブレン1枚あたり80~120ngのプローブを得るように凍結ストックプローブ溶液を使用して新鮮なハイブリダイゼーション溶液(DIG Easy溶液および1%ブロッキング剤)を準備する。ハイブリダイゼーション溶液を100℃(DNAプローブの場合)またはRNAプローブの場合65℃で10分間予め加熱する。メンブレンからプレハイブリダイゼーション溶液を捨て、希釈したプローブ溶液をメンブレンに加える。ハイブリダイゼーションオーブンで回転させながら54℃で一晩インキュベートする。
メンブレンからハイブリダイゼーション溶液を捨て、ハイブリダイゼーションオーブンで回転させながら、ハイブリダイゼーションチューブで次の工程を実施する。
1.ハイブリダイゼーション温度にて40分間、6×SSC+1%SDSで2倍量のハイブリダイゼーション量を用いて洗浄する。
2.液体を捨て、洗浄を繰り返す。
3.メンブレンを検出トレイ+溶液1に移す(メンブレンの乾燥を避ける)。
メンブレンをメンブレンより少し大きいトレイに移す。これ以降、処理は室温で、穏やかに攪拌を伴う。溶液の量をトレイおよびメンブレンのサイズに調整する(例えば600μl/cm2または8×12cmのメンブレンの場合は50ml)。次の工程の間、メンブレンが乾燥しないことが重要である。
1.溶液I、1分
2.洗浄溶液、5分
3.溶液I、1分
4.溶液II、30分(メスシリンダーに2倍体積を調製)
5.溶液II(前の工程から)+抗DIG(1:20000)、30分
6.洗浄溶液、15分
7.洗浄溶液、15分
8.溶液I、1分
9.溶液III、短くて5分
アルカリIIIホスファターゼ化学発光基質(CDP-Star(1:100))を600μlの溶液IIIに希釈する。
試薬
ブロッキング剤(ロシュ)
マレイン酸
NaCl
Tris-HCL
ツイン20
抗Dig(ロシュ)
CDP-Star(ロシュ)
溶液I:0.1Mマレイン酸、0.15M NaCl、pH7.5
溶液II:溶液Iの1%ブロッキング剤
溶液III:0.1M Tris-HCl pH9.5、0.1M NaCl
洗浄溶液:溶液I中の0.3%ツイン20
メンブレンをデジタルイメージングチャンバーに入れ、周囲照明で写真を1枚撮影する(Nikon Control Pro2、50mm 対物レンズ、リモートシューティングを有効にした手動制御、ISO 0.3 工程オーバー6400、長時間露光ノイズリダクションボックスがチェックされ、カメラは最短30分間、事前に<10℃に冷却)。
台木は、15日齢のCGMMVを接種したキトルルス・ラナツス栽培品種シュガーベイビー植物または栽培品種エルコール(ヌンヘムスB.V.)から調製した。穂木は20日齢のNCIMB42624植物から調製した。台木の茎および穂木の芽に斜めの切り込みを入れ、これらを維管束系が接合されるようにつなぎ合わせることによって穂木を台木に接ぎ木した。高湿度において修復させた後、接木植物を温室に移した。
結果項目1:CGMMV耐性スイカ属植物の同定
一般的方法に記載の方法に従ってCGMMVに感染させたさまざまな異なるスイカ属種系統の群を、温室または気候室で栽培した。CGMMV感染用の接種材料を一般的方法の項目1に従って作製し、接種した植物を一般的方法項目3に記載のように病徴について目視で評価した。CGMMV誘発病徴のない1つの単一のキトルルス・コロキンシス植物(スケール4)を確認した。植物を何度も自家受粉させ、選抜したCGMMV耐性植物を繁殖させて、ブダペスト条約の下で受託番号NCIMB42624を有する指定された種子寄託用の種子を得た。
キトルルス・ラナツスの植物
NCIMB42624の花粉を使用して、キトルルス・ラナツス亜種ウルガリスの有望系統を授粉した。F1植物を、CGMMV耐性に関する更なる分析のために、交配によって作られた種子から成長させた。
NCIMB42624由来の穂木を、一般的方法で本明細書に記載の方法に従って、商用のキトルルス・ラナツス亜種ウルガリス植物(栽培品種シュガーベイビー)またはククルビタ(Curcubita)・マクシマ×ククルビタ(Curcubita)・モスカータ栽培品種エルコール雑種(ヌンヘムスB.V.)から調製したCGMMV感染台木に接ぎ木した。
温室栽培F1植物(NCIMB42624×亜種ウルガリス有望系統)、NCIMB42624由来の穂木とキトルルス・ラナツス亜種ウルガリス栽培品種シュガーベイビー(由来の感染台木で構成される接木植物「NCIMB42624-シュガーベイビー」)、およびNCIMB42624由来の穂木とククルビタ(Curcubita)・マクシマ×ククルビタ(Curcubita)・モスカータ栽培品種エルコール雑種由来の感染台木で構成される接木植物(「NCIMB42624-エルコール」)を分析した。機械的葉接種を用いて、非接木植物(NCIMB42624、F1、シュガーベイビー)にGMMVを接種した。一般的方法に記載のように、CGMMVに感染したシュガーベイビー植物またはエルコール植物の台木を使用して、接木植物を作った。
3つのマッピング集団を、NCIMB42624とCGMMV感受性であるエリートスイカ系統との交配によって作り出した。1つのBC1集団(戻し交配)と2つのF2集団を作った。上記のように植物にCGMMVを機械的に接種し、病徴を、記載の目視スケールを用いて評価し、さらにELISA検定を用いてウイルス力価を評価した。マッピングは、主に30dpi以降で評価した病徴を用いて行った。
(上記のように)CGMMVウイルス欧州型VE459を機械的に接種したが、病徴なし(スケール4)を示したNCIMB42624の植物の葉を使用して接種材料を作り、この接種材料を使用してキュウリ品種シーラ(Sheila)の215個の植物およびスイカ品種シュガーベイビーの193個の植物を機械的に接種した。約30dpiの後、植物のCGMMV病徴について目視で評価し、ウイルスを検出するためにPCRアッセイを実施した。
C.コロキンシスドナー由来の1つまたは複数のQTLを含み、機械的CGMMV接種で生き残ったさまざまなF3ファミリーは結実が可能であり、これらの果実で生産された種子を、上記のように定量的PCR(RT-qPCR)を用いてCGMMVウイルスについて分析した。その目的は、QTLが種子感染を防ぐことができるかどうか、つまりウイルスの種子伝染性を判定することであった。qPCRは210dpiで実施した。低いCt値は高いウイルス力価を示し、高いCt値(30を超える)は低いウイルス力価を示す。
CGMMV耐性をNCIMB42624で寄託された系統の耐性と比較するために、さまざまなC.コロキンシス系統の10個の種子を発芽させ、植物に上記のように機械的に接種した。各植物を、スケール1(重度の病徴)、2(中等度の病徴)、3(軽度の病徴)、および4(病徴なし)を用いて表現型を判定した。なお、PI系統はヘテロ接合であることが知られていることに留意されたい。
Claims (13)
- 9番染色体上および/または7番染色体上に遺伝子移入断片を含んでなるキトルルス・ラナツス(Citrullus lanatus)種の栽培スイカ植物またはその植物細胞であって、前記9番染色体上の遺伝子移入断片が、受託番号NCIMB42624で寄託されたキトルルス・コロキンシス(Citrullus colocynthis)のドナーに由来するCGMMV耐性QTLを含んでなり、前記9番染色体上のQTLが34,607,108番目のヌクレオチド(SNP21)と36,923,004番目のヌクレオチド(SNP23)との間にあり、9番染色体における35,343,850番目のヌクレオチド(SNP22)にシトシンを含んでなり、かつ前記7番染色体上の遺伝子移入断片が、前記受託番号NCIMB42624で寄託されたキトルルス・コロキンシスのドナーに由来するCGMMV耐性QTLを含んでなり、前記7番染色体上のQTLが4,784,519(SNP13)と11,166,694(SNP16)との間にあり、7番染色体における7,848,633番目のヌクレオチド(SNP14)にアデニンを含んでなる、キトルルス・ラナツス種の栽培スイカ植物またはその植物細胞。
- 請求項1に記載のキトルルス・ラナツス種の栽培スイカ植物またはその植物細胞であって、前記7番染色体上の遺伝子移入断片が、7,848,633番目のヌクレオチド(SNP14)にアデニンを、かつ8,334,624番目のヌクレオチド(SNP15)にグアニンを含んでなり、かつ前記9番染色体上の遺伝子移入断片が、35,343,850番目のヌクレオチド(SNP22)にシトシンを、かつ36,923,004番目のヌクレオチド(SNP23)にシトシンを含んでなる、キトルルス・ラナツス種の栽培スイカ植物またはその植物細胞。
- 7番染色体上の前記遺伝子移入断片がホモ接合もしくはヘテロ接合型であり、かつ/または9番染色体上の前記遺伝子移入断片がホモ接合型もしくはヘテロ接合型である、請求項1または2に記載のキトルルス・ラナツス種の栽培スイカ植物またはその植物細胞。
- 前記植物が、スケール3(軽度の病徴)またはスケール4(病徴なし)のCGMMV耐性を含んでなる、請求項1~3のいずれか一項に記載のキトルルス・ラナツス種の栽培スイカ植物またはその植物細胞。
- 前記植物または植物細胞が、近交系植物もしくは植物細胞、またはF1雑種植物もしくは植物細胞、または二倍体もしくは四倍体もしくは三倍体植物もしくは植物細胞である、請求項1~4のいずれか一項に記載のキトルルス・ラナツス種の栽培スイカ植物またはその植物細胞。
- 請求項1~5のいずれか一項に記載のキトルルス・ラナツス種の植物に成長する、種子。
- 請求項1~5のいずれか一項に記載の植物細胞を含んでなる、キトルルス・ラナツス種の栽培スイカ果実または果実部分。
- 果実、果実部分、台木、穂木、挿し木、花粉、葯、胚珠、胚、根、茎、葉、子葉、胚軸、花、カルス、インビトロの細胞または細胞培養物を含む植物のいずれかの一部分または部分から選択される、請求項1~5のいずれか一項に記載の栽培スイカ植物細胞を含んでなる栽培スイカ植物の部分。
- 三倍体雑種種子生産における親としての請求項5に記載の二倍体および四倍体系統の使用。
- 次の工程:
a)それぞれが7番染色体上の遺伝子移入断片を有する2つの7番染色体を含んでなる第1のCGMMV耐性近交系二倍体の、請求項1に記載のキトルルス・ラナツス種のスイカ植物を準備すること、
b)それぞれが7番染色体上の遺伝子移入断片を有する4つの7番染色体を含んでなる第2のCGMMV耐性近交系四倍体の、請求項1に記載のキトルルス・ラナツス種のスイカ植物を準備すること、
c)工程b)で提供された前記四倍体スイカ植物と、工程a)で提供された二倍体スイカ植物の花粉を受粉させること、ならびに
d)工程c)で生産された果実から種子を集めること
を含んでなる、三倍体雑種栽培スイカの種子を生産する方法。 - 次の工程:
a)それぞれが9番染色体上の遺伝子移入断片を有する2つの9番染色体を含んでなる第1のCGMMV耐性近交系二倍体の、請求項1に記載のキトルルス・ラナツス種のスイカ植物を準備すること、
b)それぞれが9番染色体上の遺伝子移入断片を有する4つの9番染色体を含んでなる第2のCGMMV耐性近交系四倍体の、請求項1に記載のキトルルス・ラナツス種のスイカ植物を準備すること、
c)工程b)で提供された前記四倍体スイカ植物と、工程a)で提供された二倍体スイカ植物の花粉を受粉させること、ならびに
d)工程c)で生産された果実から種子を集めること
を含んでなる、三倍体雑種栽培スイカの種子を生産する方法。 - 受託番号NCIMB42624で寄託されているキトルルス・コロキンシス種に由来するCGMMV耐性QTLを含んでなる7番染色体上の断片、および/または受託番号NCIMB42624で寄託されているキトルルス・コロキンシス種に由来するCGMMV耐性QTLを含んでなる9番染色体上の断片の存在について、キトルルス・ラナツス種の栽培スイカ植物またはその植物部位、またはそれらに由来するDNAをスクリーニングする方法であって、次の工程:
a)前記7番染色体上のQTLに連鎖する、4,784,519番目のヌクレオチド(SNP13)におけるアデニン、7,848,633番目のヌクレオチド(SNP14)におけるアデニン、8,334,624番目のヌクレオチド(SNP15)におけるグアニン、11,166,694番目のヌクレオチド(SNP16)におけるグアニン、18,775,728番目のヌクレオチド(SNP17)におけるチミン、および21,389,410番目のヌクレオチド(SNP18)におけるアデニンの1つもしくは複数もしくはすべて、ならびに/または前記9番染色体上のQTLに連鎖する、31,394,464番目のヌクレオチド(SNP19)におけるシトシン、32,499,549番目のヌクレオチド(SNP20)におけるグアニン、34,607,108番目のヌクレオチド(SNP21)におけるグアニン、35,343,850番目のヌクレオチド(SNP22)におけるシトシン、36,923,004番目のヌクレオチド(SNP23)におけるシトシン、および38,321,162番目のヌクレオチド(SNP24)におけるグアニンの1つまたは複数のSNP遺伝子型について、ゲノムDNAをスクリーニングすること
を含んでなる、方法。 - 工程b)7,848,633番目のヌクレオチド(SNP14)におけるアデニン、および/または35,343,850番目のヌクレオチド(SNP22)におけるシトシンを含んでなる植物または植物部位を選抜することをさらに含む、請求項12に記載の方法。
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