KR20200041360A - Cgmmv 저항성 시트룰루스 식물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 시트룰루스 콜로신티스 종의 CGMMV 저항성 공여자로부터의 QTL의 유전자이입으로 인한 CGMMV 저항성을 포함하는 재배된 수박 식물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 CGMMV (오이 녹색 반점 모자이크 바이러스 (Cucumber Green Mottle Mosaic Virus))에 대해 저항성인 시트룰루스 (Citrullus) 식물 세포 및 시트룰루스 식물, 시트룰루스 콜로신티스 (Citrullus colocynthis) 식물 세포 및 시트룰루스 콜로신티스 식물, CGMMV에 대해 저항성인 시트룰루스 접지 (scion) 또는 근경을 포함하는 접목된 식물, 뿐만 아니라 상기 식물의 제조를 위한 방법 및 상기 식물 세포 및 식물의 용도에 관한 것이다. CGMMV 유도된 수율 손실을 방지하는 방법 및 CGMMV 저항성 종자의 제조를 위한 방법이 또한 포함된다.
CGMMV (오이 녹색 반점 모자이크 바이러스)는 아인스워트 (Ainswoth)에 의해 1953년에 영국으로부터 오이 (쿠쿠미스 사티부스 (Cucumis sativus))에서 최초로 보고되었다. 이어서, 바이러스는 또한 아시아 및 유럽의 몇몇 국가들, 예를 들어, 중국, 이스라엘, 그리스, 일본, 인도, 대한민국, 네덜란드, 파키스탄, 폴란드, 러시아, 사우디 아라비아, 스페인, 타이완 및 우크라이나로부터 보고되었다. CGMMV는 남극대륙에서 보고된 소수의 식물 바이러스 중 하나이다 (Mandal et al., 2008, Plant Viruses 2(1), 25-34).
CGMMV는 최근 2014년에 미국에서 멜론 종자 생산 분야에서 (ASTA education pamphlet, 2014, A Seed Production and Commercial Growers Guide), 상업적 수박 농장에서 2013년에 오스트레일리아에서 (Australian Government, 2016, Draft Pest risk analysis for Cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV)), 및 캐나다에서 오이 재배자에 의해 온실에서 성장한 미니-오이에서 (Ling & Li, 2014, apsjournals.apsnet.org-doi-abs-10.1094-PDIS-09-13-0996-PDN) 기재되었다.
CGMMV는 다른 박류 감염 토바모바이러스 종으로부터 분리되는 별개의 진화적 분기군을 형성하는 토바모바이러스 (Tobamovirus) 속 하의 플러스-가닥 RNA 바이러스 종이다. CGMMV의 가장 가까운 근연족은 다른 박류-감염 토바모바이러스, 즉, KGMMV, CFMMV 및 ZGMMV이다. 완전한 게놈 서열에서, CGMMV는 다른 박류-감염 토바모바이러스와 59.1 내지 60.4％ 유사성을 공유하며, 토바모바이러스 종의 나머지와는 단지 46.0 내지 49.3％를 공유한다. (Mandal et al., 2008, Plant Viruses 2(1), 25-34).
CGMMV의 숙주 범위는 좁으며, 주로 쿠쿠르비타세아에 (Cucurbitaceae) 및 케노포디아세아에 (Chenopodiaceae)에 제한된다. 그러나, 일부 단리체는 솔라나세아에 (Solanaceae)의 소수의 종을 감염시킨다. CGMMV의 천연 숙주 범위는 쿠쿠미스 사티부스, 쿠쿠미스 안구리아 (Cucumis anguria), 쿠쿠미스 멜로 (Cucumis melo), 시트룰루스 라나투스 (Citrullus lanatus) 및 라게나리아 시케라리아 (Lagenaria siceraria)를 포함한다. 남극대륙에서, CGMMV는 흔치 않은 숙주, 즉, 이끼 (바르빌로포지아 (Barbilophozia) 및 폴리트르쿰 (Polytrchum)) 및 남극 좀새풀 (데스캄프시아 안타르크티카 (Deschampsia antarctica))에서 검출되었다. CGMMV의 실험적 숙주 범위는 하기 식물 종을 포함한다: 케노포디움 아마란티콜로르 (Chenopodium amaranticolor), 시트룰루스 라나투스, 쿠쿠미스 사티부스, 쿠쿠미스 멜로, 쿠쿠미스 멜로 변종 우틸리시마 (Cucumis melo var. utilissima), 쿠쿠르비타 페포 (Cucurbita pepo), 쿠쿠미스 모스카타 (Cucumis moschata), 다투라 스트라모니움 (Datura stramonium), 라게나리아 시케라리아, 루파 아쿠탄굴라 (Luffa acutangula), 니코티아나 벤타미아나 (Nicotiana benthamiana), 니코티아나 데브네이 (Nicotiana debneyii) 및 트리코산테스 안구이나 (Trichosanthes anguina). 모모르디카 카란티아 (Momordica charantia) 및 니코티아나 타바쿰 (Nicotiana tabacum)은 무증상 숙주이다. 대다수의 숙주 종은 전신적 증상을 생성하며, 소수 (씨. 아마란티콜로르 (C. amaranticolor) 및 다투라 스트라모니움)는 국소적 병변 증상을 생성한다. (Mandal et al., 2008, Plant Viruses 2(1), 25-34).
CGMMV에 의해 유발되는 전형적인 질환 증상은 잎 상의 전신적 녹색 반점 모자이크이지만, 증상학은 단리체/균주 및 영향을 받은 식물 종에 기초하여 다양하다. 접목된 수박 식물에서, CGMMV는 대한민국에서 '피 과육' 질환 (Lee et al. 1990), 일본에서 '콘냐쿠 (Konnyaku)' 질환 및 그리스에서 유사한 질환을 유발한다. (Mandal et al., 2008, Plant Viruses 2(1), 25-34). CGMMV로 감염된 수박 (시트룰루스 라나투스 아종 불가리스 (Citrullus lanatus ssp vulgaris))은 외부적으로 건강하게 보이는 과실을 생산할 수 있지만, 이는 내부적으로 과육의 악화를 나타내며, 따라서 먹을 수 없고, 따라서 시장화가능하지 않다 (Hongyun et al., 2008, J. Virological Methods 149, 326-329).
감염된 숙주 식물에서 전신적 이동은 바이러스 발병기전의 핵심적 프로세스 중 하나이다. 식물에서의 바이러스의 이동은 2가지 주요 단계, 즉, 원형질연락사를 통한 세포에서 세포로의 단거리 이동, 및 맥관 조직을 통한 장거리 이동을 통해 일어난다. CGMMV의 장거리 이동은 광동화물 공급원으로부터 체관부 수송 메커니즘을 지지하는 싱크 (sink)로이다. 전신적으로 감염된 싱크 잎에서, CGMMV는 물관부 및 체관부에서 동시에 검출된다. CGMMV는 어린 잎의 분화하는 헛물관에서 높은 수준으로 축적된다. (Mandal et al., 2008, Plant Viruses 2(1), 25-34).
CGMMV 자연 확산은 대체로 감염된 식물 물질의 접촉을 통해서이다. CGMMV로의 식물의 감염은 감염된 식물 데브리스로 오염된 토양 및 관개용수를 통해 전파함으로써 일어난다. 질환에 걸린 식물의 데브리스는 가능하게는 제한된 수의 식물에 대한 감염의 1차 공급원으로서 기여하며, 연속적으로 바이러스는 식물-대-식물 접촉을 통해 확산된다. 수박에서 CGMMV는 종자 및 접목 물질 (근경 또는 접지)에 의해 전파되는 중요한 바이러스이다. CGMMV의 종자 전파는 또한 호리병박 및 오이에서 기재되었다. 곤충에 의한 CGMMV의 전파는 조사되었지만, 특이적 바이러스-곤충 벡터 관계는 확립될 수 없었다. 그러나, 인도에서, 오이 잎 딱정벌레, 파리도팔파 파에베이콜리스 (Raphidopalpa faeveicollis)에 의한 CGMMV의 전파는 입증되었다. 최근, 꿀벌 (아피스 멜리페라 (Apis mellifera))은 수분 동안 CGMMV를 전달하는 것으로 입증되었다 (Darzi et al., 2017, Plant Pathology, 1365-3059, doi: 10.1111/ppa.12702). 질환에 걸린 식물로부터 과실을 수확하기 위해 재배자에 의해 사용되는 커팅 칼은 잠재적으로 작물의 결과 단계 동안 CGMMV의 필드-확산의 추가의 수단에 기여할 수 있다. (Mandal et al., 2008, Plant Viruses 2(1), 25-34).
CGMMV는 전세계적으로 박류에서 몇몇 질환을 유발한다. 수박에서, 잎 반점형성 및 모자이크는 온실에서 성장한 식물에서 기재되었다. 식물의 화경 상의 괴사 반점은 CGMMV 감염과 동시에 일어나는 것으로 기재되었다. 수박 과실에서의 증상으로는 외과피 악화 및 통상적으로 수확 후에만 측정가능한 과육 중과피의 썩음 및 황화를 들 수 있다. (Reingold et al., 2013, New Disease Reports 28).
CGMMV는 특히 쿠쿠르비타세아에 및 솔라나세아에에서 전세계적으로 심각한 경제적 손실에 대한 사유가 된다. 이스라엘에서 수박 분야에서, CGMMV 질환은 일부 지역에서 총 수율 손실을 유발하였다. (Reingold et al., 2016, Annals of Applied Biology 168, 29-40).
문헌 [Park et al. (2005, Plant Cell Rep 24, 350)]은 CGMMV 외피 단백질을 코딩하는 cDNA의 도입에 의해 CGMMV에 대해 저항성으로 된 트랜스제닉 시트룰루스 라나투스 아종 공다에 (Citrullus lanatus subspecies gongdae) (야생 수박) 식물을 개시하고 있다. 시트룰루스 라나투스 아종 공다에는 상업적 수박에 대한 육종 물질로서 사용되지 않지만, 이는 때때로 상업적 수박의 접목에서 근경으로서 사용된다. CGMMV 저항성 트랜스제닉 공다에 수박은 상업적 수박의 접지를 트랜스제닉 공다에 근경에 접목함으로써 비-트랜스제닉 상업적 수박을 제조하기 위한 근경으로서 사용될 수 있음이 제안되어 있다.
문헌 [Lin et al. (2012, Transgenic Res 21, 983-993)]은 3가지 상이한 바이러스, 즉, 오이 모자이크 바이러스 (Cucumber mosaic virus) (CMV), 오이 녹색 반점 모자이크 바이러스 (CGMMV) 및 수박 모자이크 바이러스 (Watermelon mosaic virus) (WMV)의 외피 단백질을 표적화하는 단일 유전자 침묵화 구축물로 형질전환된 트랜스제닉 수박 식물 (잡종 품종 필링 (Feeling))을 개시하고 있다. 모든 3가지 바이러스에 대해 저항성인 형질전환된 식물은 트랜스제닉 계통 (R0)의 제1 세대에서 확인되었다. 그러나, CGMMV에 대한 저항성은 R0 계통의 자가-수분에 의해 수득된 R1 계통에서 소실되었지만, 다른 2가지 바이러스에 대한 저항성은 유지되었다. 시트룰루스 콜로신티스 식물은 CGMMV에 대해 감수성인 것으로 관련 기술분야에 기재되었다 (Horvath, 1985, Acta Phytopathologica Academiae Scientiarum Hungaricae 20(3-4), 225-251).
CGMMV의 방제는 모든 상업적 품종이 감수성이기 때문에 어렵다. CGMMV 저항성 품종을 사용하는 것은 바이러스의 관리를 위한 가장 좋은 선택안일 것이다. 그러나, 고전적인 육종을 통한 상이한 박류에서의 CGMMV에 대한 저항성의 발달은 숙주 저항성의 공급원이 단지 멜론 및 야생 쿠쿠미스 종에서만 공지되어 있기 때문에 제한을 갖는다. (Mandal et al., 2008, Plant Viruses 2(1), 25-34).
본 발명에 의해 해결되는 문제는 CGMMV 저항성에 대한 공급원의 제공 및 CGMMV에 대해 저항성인 상업적 시트룰루스 식물의 제공이다. 한 측면에서 CGMMV 저항성 시트룰루스 식물은 시트룰루스 라나투스 아종 불가리스 종의 수박 식물이다. 본 발명의 제1 측면은 CGMMV에 대해 저항성인 비-유전자 조작된 시트룰루스 식물 세포 또는 비-유전자 조작된 시트룰루스 식물 또는 식물 부분에 관한 것이다. 바람직하게는 시트룰루스 식물 세포 또는 시트룰루스 식물은 CGMMV에 대해 저항성인 비-유전자 조작된 시트룰루스 작물 식물 세포 또는 비-유전자 조작된 작물 식물이다.
CGMMV에 대한 저항성을 부여하는 시트룰루스 공급원은 기재되지 않았다. 다양한 시트룰루스 수탁물의 생식질의 큰 세트의 스크리닝 동안, CGMMV에 대해 저항성인 시트룰루스 콜로신티스 수탁물이 놀랍게도 검출되었다. 이는 백색 과육 (flesh) 또는 과육 (pulp) 및 낮은 브릭스 (약 2.0의 브릭스)를 갖는 작은 둥근 과실 (약 4 cm 폭 및 4 cm 길이)을 생산하였다. 저항성 식물 (이는 증상을 나타내지 않았음, 본원에 기재된 시험에서 점수 4)은 이형접합성 및/또는 이질성 종자 샘플 (미국 국립 식물 생식질 콜렉션 (US National Plant Germplasm collection), ars-grin.gov로부터 수득됨)로부터 선택되었으며, 저항성은 몇몇 세대 동안 자가-수정된 자가수정 자손에서 선택되고 안정화되었다. CGMMV 저항성을 함유하는 선택되고 안정화된 씨. 콜로신티스 (C. colocynthis) 식물의 종자의 대표적인 샘플은 넌헴스 비.브이. (Nunhems B.V.)에 의해 부다페스트 조약 하에 수탁 번호 NCIMB 42624 하에 기탁되었다.
지금까지 이는 시트룰루스 속에서 기재된 CGMMV 저항성을 갖는 최초의 물질이다. 시트룰루스 콜로신티스는 예를 들어 시트룰루스 라나투스와 같은 다른 시트룰루스 종과 교배될 수 있다. 따라서, 각각의 CGMMV 저항성 식물은 이제 처음으로 저항성 "공여자" 식물로부터 다른 시트룰루스 식물 ("수용자" 식물로도 지칭됨)로 CGMMV 저항성-부여 염색체 단편 또는 단편들 (CGMMV 저항성 좌위를 포함함)을 전달하는 것을 가능하게 한다. 따라서, 본원에 개시된 CGMMV 저항성 시트룰루스 콜로신티스 식물은 처음으로 CGMMV에 대해 저항성인 시트룰루스 작물 식물, 예컨대 재배된 수박 (씨. 라나투스 아종 불가리스)의 생산을 가능하게 한다. 이는 감수성 작물 식물에서 CGMMV에 의해 유발되는 상당한 수율 감소가 이제 CGMMV 저항성 시트룰루스 작물 종을 재배함으로써 감소되거나 회피될 수 있기 때문에 농부에게 큰 이익이 될 것이다.
CGMMV는, 다른 가능성 외에도, 또한 오염된 종자에 의해 전파됨이 널리 확립되어 있다. 따라서, 본 발명의 또다른 이점은 CGMMV 감염된 식물이 나타난 필드로부터 생산된 종자를 버리는 것을 회피할 수 있을 종자 생산자에 대한 것이다. 오이에서 일부 CGMMV 저항성 변종은 여전히 바이러스를 운반하며, 식물, 예를 들어 리지크 즈완 (Rijk Zwaan)의 변종 봉봉 (Bonbon)에서 상당한 바이러스 증식을 가능하게 한다 (즉, 이들은 무증상 운반자이며, 따라서 다른 식물로 바이러스를 확산시킬 수 있음). 본 저항성은 실시예에서 나타난 바와 같이, 식물에서 바이러스 증식을 예방하거나, 적어도 바이러스 수준을 매우 낮은 수준으로 감소시키는 것으로 보인다 (예를 들어 CGMMV로의 기계적 잎 접종 후 15dpi, 35dpi 및 60dpi에, 잎은 바이러스 RNA를 함유하지 않거나 극도로 낮은 수준을 함유하는 반면, 양성 대조군은 상당한 양의 바이러스 RNA를 함유하는 것을 나타내는 표 2 참조). 바이러스 수준은 본 발명의 한 실시양태에서 너무 낮으며, 이는 인근의 감수성 수박 변종의 CGMMV 감염을 유발하지 않고/거나, 이러한 식물의 과실에서 생산된 종자에의 바이러스의 전파를 초래하지 않는다. 이는 또한 실시예에 나타내어진다.
더욱이, CGMMV 저항성 시트룰루스 식물을 성장시키기 위해 예를 들어 필드 처리 및 식물 손질을 위한 도구의 소독과 같은 다수의 예방적 수단이 불필요하게 되기 때문에 종자 생산자 및 농부에 의한 작업의 소모가 감소될 수 있다. 특히, CGMMV는 토양에서 장시간 생존할 수 있기 때문에, CGMMV 저항성 시트룰루스 식물의 제공은, 심지어 CGMMV가 전에 각각의 지역에서 검출되었을 경우에도, 시트룰루스 식물 (예를 들어 본 발명에 따른 CGMMV 저항성 식물의 접지 및/또는 근경을 포함하는 접목된 식물을 포함함)의 추가의 세대를 동일한 지역 또는 필드에서 재성장시키는 것을 가능하게 할 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 "유전자 조작된"은 유기체 외부에서 제조된 핵산을 숙주 내로 직접적으로 도입하거나, 유기체 외부에서 제조된 핵산을 세포 내로 도입한 후, 세포를 최종 숙주와 융합시키거나, 교배시키거나, 잡종화시키는 기법에 의해 유기체의 유전자 구성을 변경시킴으로써, 생명공학을 사용한 유기체의 게놈의 직접적 변형을 의미한다. 유전자 조작은 벡터 시스템에 의해서와 같이 간접적으로 또는 입자 포격, 미세-주사, 거대-주사 및 미세-캡슐화 기법에 의해서와 같이 직접적으로 재조합 핵산의 혼입이 이어지는 재조합 핵산 (DNA 또는 RNA) 기법을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "비-유전자 조작된"은 유기체의 외부에서 제조된 핵산의 유기체 내로의 도입을 포함하지 않는 기법을 사용한 유기체의 게놈의 변형 및/또는 유기체의 유전자 구성의 변경을 의미한다.
"CGMMV"는 본원에서 오이 녹색 반점 모자이크 바이러스에 대한 약어로서 사용된다.
본원에 사용된 바와 같은 "CGMMV에 대해 저항성"은 CGMMV로 접종되는 경우 계통 또는 변종의 식물 또는 식물 부분이 잎 상에 가시적 CGMMV 증상을 나타내지 않거나 (규모 4) (및 바람직하게는 또한 과실 내부에서 증상이 없음); 한 측면에서 식물이 잎 상에 경도 증상 (매우 경도의 모자이크 및 소수의 클리어링 반점)을 나타내는 반면 (규모 3) (및 바람직하게는 그들 식물의 과실이 내부에서 임의의 증상을 나타내지 않고, 여전히 시장화가능함), 감수성 대조군 계통 또는 변종 (예를 들어 슈가 베이비 (Sugar Baby) 또는 다른 CGMMV 감수성 변종)은 동일한 조건 하에서 시험되는 경우 잎 상에 중증 증상 (규모 1) 및 과실 내부의 증상을 나타내는 것을 의미한다. 바람직하게는 식물 계통 또는 변종은 계통의 식물의 적어도 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％가 상기 언급된 규모에 따르는 경우 저항성인 것으로 간주된다 (바람직하게는 계통의 적어도 10, 15, 20, 25, 30개 이상의 식물이 적절한 대조군 계통과 함께 시험됨). 과실 내부의 증상은 성숙한 과실을 인간 소비에 적합하지 않게 만드는 증상, 예를 들어 과육의 악화 및/또는 과육의 수침이다. 가시적 CGMMV 증상을 평가하기 위한 적합한 시험은 예를 들어 실시예에서 일반적 방법 항목 1 내지 3 및 하기에 기재된 기계적 잎 접종 방법이다.
잎 상의 "가시적으로 CGMMV 증상"은 본원에서 하기에 따라 분류된다:
규모 1: 중증 증상: 잎 기형, 수포형성 및 명백한 모자이크
규모 2: 중간 증상: 경도 잎 기형, 그러나 명백한 모자이크
규모 3: 경도 증상: 매우 경도 모자이크 및 소수의 클리어링 반점
규모 4: 잎 상의 증상 없음
한 측면에서, "CGMMV에 대해 저항성"은 잎 상에 증상을 나타내지 않고 (규모 4), 바람직하게는 또한 과실 내부에서 증상을 나타내지 않는, 임의로 잎 상에 경도 증상을 나타내고 (규모 3), 바람직하게는 과실 내부에서 증상을 나타내지 않는 식물 및 식물 부분이 감수성 대조군 계통 또는 변종보다 15 dpi, 30 dpi, 35 dpi, 60dpi 및/또는 90 dpi에서 (또는 나중에) 잎에서 (및 임의로 또한 과실에서) 유의하게 더 낮은 평균 바이러스 수준 (또는 바이러스 역가)을 함유하는 것을 포괄한다. "유의하게 더 낮은"은 본원에서 감수성 대조군 조직에서보다 적어도 100배 더 낮은, 바람직하게는 적어도 1000배 더 낮은, 보다 바람직하게는 적어도 5000배, 또는 적어도 10000배, 또는 적어도 50000배, 또는 적어도 100000배 더 낮은, 예를 들어 RT-qPCR에 의해 검출가능한 평균 바이러스 수준을 지칭한다. 한 측면에서 RT-qPCR에 의해 검출가능한 CGMMV 바이러스 수준은 저항성 식물의 잎에서, 및 바람직하게는 또한 과실에서 15 dpi, 30 dpi, 35 dpi, 60dpi 및/또는 90 dpi에서 1.5 x 10-4 ng/μl의 평균 농도 미만, 또는 1.3 x 10-4 ng/μl 미만이고; 한 측면에서 평균 바이러스 수준은 훨씬 더 낮고, 예를 들어 5 x 10-5 ng/μl 미만, 또는 4 x 10-5 ng/μl 미만, 또는 3 x 10-5 ng/μl 미만, 또는 2 x 10-5 ng/μl 미만이다. 특히 한 측면에서 평균 바이러스 역가는 15 dpi에서 5 x 10-5 ng/μl 미만 및/또는 35 dpi에서 3 x 10-5 ng/μl 미만 및/또는 60 dpi 이후에서 2 x 10-5 ng/μl 미만, 또는 심지어 RT-qPCR (또는 택맨 (TaqMan) 검정)을 사용하여 검출불가능한 반면, 감수성 대조군은 동일한 조건 하에서 및 동일한 시점에서 중증 증상을 나타내고, 유의하게 더 높은 바이러스 수준 (예를 들어 적어도 100배 더 높은, 바람직하게는 적어도 1000배 더 높은)을 함유한다. 한 측면에서 평균 바이러스 역가는 저항성 조직에서 시간 경과에 따라 감소하며, 즉, 역가는 15dpi에서보다 35dpi에서 더 낮고, 35 dpi에서보다 60dpi에서 더 낮다.
한 측면에서 또한 본 발명의 CGMMV 저항성 식물로부터 다른 수박 식물, 예를 들어 감수성 수박 식물로의 바이러스 전파는 1％ 미만, 바람직하게는 0.5％ 미만, 보다 바람직하게는 0％이다. 바이러스 전파는 예를 들어 접종물로서 CGMMV로 접종된 CGMMV 저항성 식물의 잎을 사용하여 다른 식물을 접종하고, 감염된 다른 식물의 백분율을 측정함으로써, 실시예에 기재된 바와 같이 시험될 수 있다. 추가의 측면에서 본 발명의 CGMMV 저항성 식물의 과실에서 생산된 종자는 CGMMV 바이러스가 없다. 다시, 이는 실시예에 기재된 바와 같이 시험될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "시트룰루스" 또는 "시트룰루스 식물"은 시트룰루스 속에 속하는 쿠쿠르비타세아에 과의 식물을 의미한다.
시트룰루스 속은 4 또는 5가지의 종을 포함한다: 시트룰루스 라나투스 (아종 라나투스, 불가리스 및 무코소프페르무스 (mucosospermus)를 포함함), 시트룰루스 콜로신티스 및 야생 종 시트룰루스 에키르호수스 (Citrullus ecirrhosus) 및 시트룰루스 레미 (Citrullus rehmii) (Levi et al., 2001, Genetic Resources and Crop Evolution 48, 559-566). 다섯번째 시트룰루스 종인 시트룰루스 나우디니아누스 (Citrullus naudinianus)는 육안 형태에서 다른 시트룰르스 종과는 매우 상이하여 일부 기술자는 이를 아칸토시키오스 (Acanthosicyos) 속 (에이. 나우디니아누스 (A. naudinianus)) 내로 두기도 한다. 본 발명과 관련하여 시트룰루스 나우디니아누스는 시트룰루스 종을 나타내는 것으로 이해될 것이다. 시트룰루스 라나투스 아종 불가리스는 통상적으로 재배된 수박으로서 관련 기술분야에서 지칭되며, 이는 가장 폭넓게 재배된 수박 작물 식물을 나타낸다. 따라서, 본원에서 '재배된 수박'에 대한 언급은 시트룰루스 라나투스 아종 불가리스 작물 식물, 예를 들어 계통 또는 변종을 지칭한다. 5가지 시트룰루스 종의 각각은 22의 이배체 (2n) 염색체 수를 갖는다. 5가지 언급된 상이한 시트룰루스 종은 서로와 교배가능하며, 따라서, CGMMV 저항성은 예를 들어 육종 프로세스에 의해 이들 종 사이에 전달될 수 있다. (Kun-Peng Li et al., 2016, BMC Evolutionary Biology 16, 85).
"시트룰루스 식물 세포"는 시트룰루스 식물 또는 그의 임의의 부분으로부터 기원하거나, 그에 의해 수득가능하거나, 그로부터 수득되거나, 유래되거나, 유래가능한 식물 세포를 의미한다. 세포는 전체 식물로 재생되는 데 적격일 수 있거나 (재생가능한 식물 세포), 이는 전체 식물로 재생되는 데 적격이 아닌 세포 (비-재생가능한 식물 세포)일 수 있다. 마찬가지로, "시트룰루스 라나투스 아종 불가리스 식물 세포"는 시트룰루스 라나투스 아종 불가리스 식물 또는 그의 임의의 부분으로부터 기원하거나, 그에 의해 수득가능하거나, 그로부터 수득되거나, 유래되거나, 유래가능한 식물 세포를 의미한다. 세포는 전체 식물로 재생되는 데 적격일 수 있거나 (재생가능한 식물 세포), 이는 전체 식물로 재생되는 데 적격이 아닌 세포 (비-재생가능한 식물 세포)일 수 있다.
본 발명과 관련하여 용어 "작물 식물"은 통상적인 의미를 가지며, 수익 또는 자급을 위한 규모에서 성장되거나 재배되도록 의도되고, 성장 후에 인간에 의해 식품, 의류, 가축, 사료, 생물연료, 의약, 또는 다른 용도를 위해 수확되는 임의의 특이적 식물 또는 변종인 것으로 이해되어야 한다. 특히 용어 "작물 식물"은 본원에서 수익을 위한 규모로 군으로 성장되거나 재배되는 것으로 의도되고, 성장 후에 식품을 제공하기 위해 수확되는 임의의 특이적 식물인 의미를 갖는다. 현재 정의에서 사용되는 성장되는 것으로 의도되는 용어에 의해, 또한 수익을 위한 규모로 군으로 성장되거나 재배되는 것으로 의도되고, 성장 후에 식품을 제공하기 위해 수확되는 임의의 특이적 식물을 생산하는 데 적격인 임의의 육종 물질은 본원에 사용된 바와 같은 용어 "작물 식물"에 의해 포함됨이 분명하게 명백하게 될 것이다.
본원에서 "시트룰루스 작물 식물"은 시트룰루스 라나투스 (아종 불가리스, 무코소프페르무스 또는 라나투스를 포함함), 시트룰루스 콜로신티스 및 시트룰루스 나우디니아누스 종의 식물을 포함한다.
작물 식물은 용어 재배된 식물을 포함한다. 수박 식물에 관하여 용어 "재배된 식물"은 관련 기술분야에서 통상적으로 사용되며, 본원에서 시트룰루스 라나투스 아종 불가리스의 식물을 나타내는 것으로 이해되어야 한다 (Kun-Peng Li et al., 2016, BMC Evolutionary Biology 16, 85).
용어 "식품"은 본원에서 통상적인 의미를 가지며, 먹거나, 마시거나, 다르게는 인간 신체 내로 취해지는 임의의 영양분있는 물질인 것으로 이해되어야 한다.
시트룰루스 작물 식물 종 시트룰루스 라나투스, 시트룰루스 콜로신티스 또는 시트룰루스 나우디니아누스는 서로와 교배가능하며, 이는 그들 종의 하나로부터 그들 종의 또다른 것 내로 CGMMV 저항성의 전달 또는 유전자이입을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명에 의해 제공되는 시트룰루스 콜로신티스 식물, 예를 들어 수탁 번호 NCIMB 42624 하에 기탁된 종자로부터 수득되거나, 유래되거나, 유래가능하거나, 그에 의해 수득가능하거나, 그로부터 기원한 식물의 CGMMV 저항성은 다른 시트룰루스 콜로신티스 식물 (예를 들어 CGMMV에 대해 감수성) 내로, 시트룰루스 라나투스 종 내로 (예를 들어 재배된 수박 내로) 또는 시트룰루스 나우디니아누스 종 내로 유전자이입될 수 있다.
따라서, 본 발명의 바람직한 실시양태는 본 발명에 따른 식물 세포 또는 식물이 시트룰루스 라나투스, 시트룰루스 콜로신티스 또는 시트룰루스 나우디니아누스로 이루어진 종의 군으로부터 선택되는 것인 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 시트룰루스 식물 세포 또는 식물에 관한 것이다. 본 발명의 보다 바람직한 실시양태에서 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 시트룰루스 식물 세포 또는 식물은 시트룰루스 라나투스 식물 세포 또는 시트룰루스 라나투스 식물, 가장 바람직하게는 시트룰루스 라나투스 아종 불가리스 식물 세포 또는 시트룰루스 라나투스 아종 불가리스 식물이다.
그로부터 시트룰루스 콜로신티스 식물 세포, 및 1종 이상의 CGMMV 저항성 QTL이 수득될 수 있는 CGMMV 저항성 시트룰루스 콜로신티스 식물의 종자는 수탁 번호 NCIMB 42624 하에 기탁되었거나, 그의 자손, 특히 그의 자가수정물이다. 이들 기탁된 종자로부터, 그로부터 시트룰루스 콜로신티스 식물 세포가 수득될 수 있는 CGMMV 저항성 시트룰루스 콜로신티스 식물이 성장될 수 있다. 마찬가지로 CGMMV 저항성을 부여하는 1종 이상의 씨. 콜로신티스 QTL (양적 형질 좌위 (Quantitative Trait Loci))은 이들 종자 또는 그의 자손으로부터 수득가능하며, 그에 의해 자손은 QTL 중 1종 이상 또는 전부를 보유한다.
본 발명자들은 CGMMV 저항성을 부여하고, 씨. 콜로신티스 공여자 (예를 들어 NCIMB 42624 또는 그의 자손 또는 임의로 QTL 또는 QTL들을 포함하는 또다른 CGMMV 저항성 씨. 콜로신티스 식물)로부터 다른 식물로, 예를 들어 재배된 수박 내로 개별적으로 또는 상이한 조합으로 전달될 수 있는 씨. 콜로신티스의 5종의 QTL을 발견하였다. 5종의 QTL은 본원에 상세히 기재된다. 미세 지도화는 QTL이 발견되는 염색체 영역을 좁히기 위해 수행될 것이다. 이는 보다 짧은 유전자이입 단편이 사용되는 것을 가능하게 함으로써, 공여자로부터 연관 끌림 (QTL에 연결된 바람직하지 않은 형질의 유전자이입)을 제거한다.
한 구체적인 실시양태에서 본 발명은 따라서 수탁 번호 NCIMB 42624 하에 기탁된 시트룰루스 콜로신티스 종자 또는 수탁 번호 NCIMB 42624 하에 기탁된 종자로부터 성장된 식물 또는 이러한 식물의 자손 (후손), 특히 예를 들어 4의 CGMMV 저항성 점수 (증상 없음)를 포함하는 자가수정 자손에 관한 것이다. 수탁 번호 NCIMB 42624 하에 기탁된 종자로부터 수득되거나, 유래되거나, 유래가능하거나, 그에 의해 수득가능하거나, 그로부터 기원한 시트룰루스 콜로신티스 식물 세포 또는 시트룰루스 콜로신티스 식물 또는 수탁 번호 NCIMB 42624 하에 기탁된 종자로부터 성장된 식물로부터 수득되거나, 유래되거나, 유래가능하거나, 그에 의해 수득가능하거나, 그로부터 기원한 시트룰루스 콜로신티스 식물 세포는 따라서 본 발명의 한 구체적인 실시양태이다.
또다른 구체적인 실시양태에서 본 발명은 수탁 번호 NCIMB 42624 하에 기탁된 시트룰루스 콜로신티스 종자 또는 수탁 번호 NCIMB 42624 하에 기탁된 종자로부터 성장된 식물 또는 이러한 식물의 자손 (후손)으로부터 기원한 / 그로부터 유래가능한 / 그에서 발견된 바와 같은 / 그로부터 수득된 / 그로부터 유래된 1종 이상의 CGMMV 저항성 QTL (본원에 기재된 바와 같음)을 포함하는 시트룰루스 식물, 특히 재배된 수박 식물에 관한 것이다.
추가의 또다른 구체적인 실시양태에서 본 발명은 CGMMV 저항성 시트룰루스 콜로신티스 식물 또는 종자로부터 기원한 / 그로부터 유래가능한 / 그에서 발견된 바와 같은 / 그로부터 수득된 / 그로부터 유래된 1종 이상의 CGMMV 저항성 QTL (본원에 기재된 바와 같음)을 포함하는 시트룰루스 식물, 특히 재배된 수박 식물에 관한 것이며, 여기서, 식물 또는 종자는 수탁 번호 NCIMB 42624 하에 기탁된 종자 또는 수탁 번호 NCIMB 42624 하에 기탁된 종자로부터 성장된 식물 또는 이러한 식물의 자손 (후손)에 존재하는 것과 동일한 QTL 또는 QTL들을 포함한다. 이러한 시트룰루스 콜로신티스 식물은 4의 CGMMV 저항성 점수를 포함하고, QTL 또는 QTL들에 연결된 SNP 마커 중 1종 이상 또는 전부를 포함한다. 따라서, 예를 들어, 씨. 콜로신티스 식물은 하기에 및 예를 들어 표 1 및 표 6에 추가로 기재된 바와 같이, QTL7.1 및 따라서 또한 QTL7.1에 연결된 SNP 마커 중 1종 이상 또는 전부를 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 한 측면에서 시트룰루스 콜로신티스 식물은 QTL7.1 및/또는 QTL9.1을 포함하고, 바람직하게는 이는 QTL7.1에 연결된 SNP13, SNP14 및/또는 SNP15에 대한 저항성 공여자 뉴클레오티드 및/또는 QTL9.1에 연결된 SNP22, SNP23 및/또는 SNP24에 대한 저항성 공여자 뉴클레오티드를 포함한다. 또다른 측면에서 QTL1.1, QTL4.1, QTL5.2, QTL7.1 및/또는 QTL9.1을 포함하는 시트룰루스 콜로신티스 식물은 바람직하게는 QTL1.1에 연결된 SNP4, SNP5 및/또는 SNP6에 대한 저항성 공여자 뉴클레오티드, 및/또는 QTL4.1에 연결된 SNP7, SNP8 및/또는 SNP9에 대한 저항성 공여자 뉴클레오티드, 및/또는 QTL5.1에 연결된 SNP10, SNP11 및/또는 SNP12에 대한 저항성 공여자 뉴클레오티드, 및/또는 QTL7.1에 연결된 SNP13, SNP14 및/또는 SNP15에 대한 저항성 공여자 뉴클레오티드 및/또는 QTL9.1에 연결된 SNP22, SNP23 및/또는 SNP24에 대한 저항성 공여자 뉴클레오티드를 포함한다.
바람직하게는 본 발명은 CGMMV에 대한 유전자이입된 저항성을 포함하는 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 시트룰루스 식물 세포 또는 식물에 관한 것이고, 바람직하게는 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 시트룰루스 식물 세포 또는 식물은 그들의 게놈 내로 유전자이입된 CGMMV에 대한 저항성을 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서 본 발명은 CGMMV에 대한 유전자이입된 저항성이 시트룰루스 식물 또는 시트룰루스 식물 세포로부터 수득되거나, 유래되거나, 유래가능하거나, 그에 의해 수득가능하거나, 그로부터 기원한, 보다 바람직하게는 CGMMV에 대한 저항성이 시트룰루스 콜로신티스 식물 세포 또는 시트룰루스 콜로신티스 식물로부터, 특히 그의 종자의 대표적인 샘플이 수탁 번호 NCIMB 42624 하에 기탁된 시트룰루스 콜로신티스 식물, 또는 그의 CGMMV 저항성 후손 (예를 들어 자가수정에 의해 수득됨)으로부터 수득되거나, 유래되거나, 유래가능하거나, 그에 의해 수득가능하거나, 그로부터 기원한 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 시트룰루스 식물 세포 또는 식물에 관한 것이다. QTL 또는 QTL들을 포함하는 염색체 영역의 SNP 마커 분석 또는 시퀀싱은 CGMMV 저항성이 기탁된 종자'에서와 같거나' 그로부터 수득가능한 바와 같은 지를 측정하는 데 사용될 수 있다.
보다 더 바람직하게는 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 시트룰루스 식물 세포 또는 식물은 그의 게놈 내로 유전자이입된 CGMMV에 대한 저항성을 포함하는 시트룰루스 라나투스 아종 불가리스 식물 세포이거나, 시트룰루스 라나투스 아종 불가리스 식물이며, 여기서, CGMMV에 대한 유전자이입된 저항성은 각각 시트룰루스 콜로신티스 식물 세포 또는 시트룰루스 콜로신티스 식물'에 존재하는 바와 같거나', 그로부터 수득되거나, 유래되거나, 유래가능하거나, 그에 의해 수득가능하거나, 그로부터, 특히 그의 종자의 대표적인 샘플이 수탁 번호 NCIMB 42624 하에 기탁된 시트룰루스 콜로신티스 식물 또는 세포, 또는 그의 CGMMV 저항성 후손 (예를 들어 자가수정에 의해 수득됨)으로부터 기원한다.
한 측면에서, 그로부터 CGMMV 저항성이 수득될 수 있는 시트룰루스 콜로신티스 공여자는 실시예에 기재된 바와 같이 CGMMV로 기계적으로 접종된 경우 증상을 생성하지 않는 (규모 4) 및/또는 접종 후의 다양한 시점에서 바이러스 역가가 감수성 대조군에 비해 유의하게 감소되는, 예를 들어, 역가가 RT-qPCR (택맨) 검정을 사용하여 5 x 10-5 ng/μl 미만인 및/또는 QTL1.1, QTL4.1, QTL5.2, QTL7.1 및/또는 QTL9.1 중 1종 이상 또는 전부 및 따라서 각각의 QTL에 연결된 SNP 마커의 저항성 공여자 뉴클레오티드 중 1종 이상을 포함하는 공여자 수탁물이다. 한 측면에서 공여자는 NCIMB 42624 또는 이 식물의 조상 또는 자손이다.
보다 더 바람직한 실시양태에서 본 발명은 CGMMV에 대한 유전자이입된 저항성이 수탁 번호 NCIMB 42624 하에 기탁된 종자 또는 종자의 세포, 또는 그의 CGMMV 저항성 후손 (예를 들어 자가수정에 의해 수득됨)'에 존재하는 바와 같거나', 그로부터 수득되거나, 그로부터 유래되거나, 그로부터 수득되거나, 유래되거나, 유래가능하거나, 그에 의해 수득가능하거나, 그로부터 기원하거나, 상기 기탁된 종자 또는 그의 후손으로부터 성장된 식물로부터 수득되거나, 유래하거나, 유래가능하거나, 그에 의해 수득가능하거나, 그로부터 기원하거나, 상기 기탁된 종자 또는 그의 후손으로부터 성장된 식물로부터 수득되거나, 유래되거나, 유래가능하거나, 그에 의해 수득가능하거나, 그로부터 기원한 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 시트룰루스 식물 세포 또는 식물에 관한 것이다. 따라서, 한 측면에서 식물 세포 또는 식물은 CGMMV 저항성 공여자 식물로부터의, 예를 들어 그의 종자의 대표적인 샘플이 수탁 번호 NCIMB 42624 하에 기탁된 시트룰루스 콜로신티스 식물, 또는 그의 CGMMV 저항성 후손 (예를 들어 자가수정에 의해 수득됨)으로부터의 1종 이상의 CGMMV 저항성 부여 유전자이입 단편을 포함한다.
보다 더욱 더 바람직한 실시양태에서 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 시트룰루스 식물 세포 또는 식물은 CGMMV에 대한 유전자이입된 저항성을 포함하는 시트룰루스 라나투스 아종 불가리스 식물 세포 또는 시트룰루스 라나투스 아종 불가리스 식물이며, 여기서, CGMMV에 대한 유전자이입된 저항성은 수탁 번호 NCIMB 42624 하에 기탁된 종자 또는 종자의 세포, 또는 그의 CGMMV 저항성 후손 (예를 들어 자가수정에 의해 수득됨)으로부터 수득되거나, 유래되거나, 유래가능하거나, 그에 의해 수득가능하거나, 그로부터 기원하거나, 상기 기탁된 종자로부터 성장된 또는 기탁된 종자의 CGMMV 저항성 후손 (예를 들어 자가수정에 의해 수득됨)으로부터 성장된 식물로부터 수득되거나, 유래하거나, 유래가능하거나, 그에 의해 수득가능하거나, 그로부터 기원하거나, 상기 기탁된 종자로부터 성장된 또는 기탁된 종자의 CGMMV 저항성 후손 (예를 들어 자가수정에 의해 수득됨)으로부터 성장된 식물로부터 수득되거나 그에 의해 수득가능한 식물 세포로부터 수득되거나, 그에 의해 수득가능하거나, 그로부터 기원한다. 따라서, 한 측면에서 식물 세포 또는 식물은 CGMMV 저항성 공여자 식물로부터의, 예를 들어 그의 종자의 대표적인 샘플이 수탁 번호 NCIMB 42624 하에 기탁된 시트룰루스 콜로신티스 식물, 또는 그의 CGMMV 저항성 후손 (예를 들어 자가수정에 의해 수득됨)으로부터의 1종 이상의 저항성 부여 유전자이입 단편 (여기서, 상기 단편 또는 단편들은 CGMMV 저항성 좌위, 특히 1종 이상의 QTL을 포함함)을 그의 게놈에 포함하는 재배된 수박 식물 세포 또는 식물이다.
수용자 식물 또는 식물 세포에서의 1종 이상의 저항성-부여 유전자이입 단편의 존재는 통상의 기술자에게 공지된 방법, 예를 들어 전체 게놈 시퀀싱, 분자 마커 분석, 저항성 좌위의 QTL 지도화, 및/또는 다른 방법, 예컨대 표현형 분석, 대립성 시험 등에 의해 검출될 수 있다. 마찬가지로, 수용자 식물 또는 식물 세포에서의 1종 이상의 저항성 부여 유전자이입 단편의 존재는 본원에서 씨. 콜로신티스 공여자에서 확인된 QTL에 물리적으로 연결된 마커에 의해 검출될 수 있다.
야생, 사막 식물 종 씨. 콜로신티스는 이배체이고, 2n = 22개의 염색체를 가지며, 이는 그에 의해 씨. 콜로신티스 염색체의 단편으로부터 상응하는 씨. 라나투스 (C. lanatus) 아종 불가리스 염색체로의 유전자이입이 실행가능한 재배된 수박의 것들에 상응한다. 씨. 콜로신티스 수탁 번호 NCIMB 42624에서 예를 들어 CGMMV에 대해 감수성인 재배된 수박 내로 유전자이입되는 경우, CGMMV에 대한 저항성을 부여하는 5종의 QTL이 발견되었다. 게놈에서의 이들 QTL의 위치가 측정되었으며, QTL에 연결된 SNP 마커가 발견되었다. 씨. 콜로신티스 공여자는 이배체 공여자의 SNP 유전자형으로부터 볼 수 있는 바와 같이, SNP 뉴클레오티드의 전부에 대해 동형접합성이었다. 5종의 QTL은 시퀀싱된 재배된 수박 게놈의 염색체 1 상에 존재하는 QTL1.1, 염색체 4 상에 존재하는 QTL4.1, 염색체 5 상에 존재하는 QTL5.2, 염색체 7 상에 존재하는 QTL7.1 및 염색체 9 상에 존재하는 QTL9.1로 명명된다. QTL의 각각이 발견되는 영역은 하기 표 1에 열거된 SNP (단일 뉴클레오티드 다형성 (Single Nucleotide Polymorphism)) 마커에 의해 범위가 정해진다. 서열이 월드 와이드 웹 상에서 cucurbitgenomics.org에서 발견되는 "수박 (찰스톤 그레이 (Charleston Gray)) 게놈"에 대한 BLAST 분석에 사용되는 경우, 수박 게놈에서 단일 다형성의 뉴클레오티드 위치가 발견된다. QTL에 가장 가깝게 연결된 SNP 마커는 표에서 지시된다. SNP 마커에 의해 범위가 정해지는 영역은 매우 크기 때문에, 자명하게 각각의 QTL의 범위를 정하는 전체 영역이 재배된 수박 내로 유전자이입될 필요는 없지만, 단지 QTL을 포함하고 CGMMV 저항성을 부여하는 하위-영역은 다른 시트룰루스 식물 내로, 특히 재배된 수박 내로 유전자이입될 수 있다.
<표 1>
이배체 CGMMV 저항성 공여자 (예를 들어 NCIMB42624)의 SNP 유전자형은 우측 열에 제공된다. 각각의 SNP의 저항성 공여자 뉴클레오티드는 따라서 열에서 언급된 뉴클레오티드이고, 따라서 예를 들어 SNP1에 대한 SNP 공여자 뉴클레오티드는 서열식별번호 (SEQ ID NO): 1에서의 뉴클레오티드 51에서 뉴클레오티드 'C' (시토신)를 지칭하는 등이다.
QTL7.1 및 QTL9.1은 우성이며, 따라서 좌위가 이형접합성 또는 동형접합성 형태인 경우 저항성을 부여한다. 이들 2가지 QTL은 CGMMV 증상이 3 (경도 증상) 또는 4 (증상 없음)의 규모로 감소될 뿐만 아니라, 바이러스 역가 (수준)가 극도로 낮은 수준 (예를 들어 접종 후 1개 이상의 시점에서 5 x 10-5 ng/μl 미만) 또는 심지어 검출가능하지 않은 수준으로 유의하게 감소되기 때문에, CGMMV 저항성을 부여하는 데 있어서 가장 중요하다. 다른 3가지 QTL, 즉, QTL1.1, QTL4.1 및 QTL5.2는 열성 좌위이며, (본 발명의 범위를 제한하지 않고) 식물에서 바이러스 역가에 영향을 미치는 데 있어서 역할을 하는 것으로 보인다.
한 측면에서 식물 또는 식물 세포가 QTL1.1, QTL4.1, QTL5.2, QTL7.1 및 QTL9.1로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 또는 3종 또는 4종 또는 5종의 QTL (씨. 콜로신티스 공여자로부터의, 예를 들어 NCIMB 42624 또는 예를 들어 4의 점수를 갖고, QTL을 포함하는 다른 CGMMV 저항성 씨. 콜로신티스 공여자로부터의 유전자이입 단편)을 포함하는 것인 시트룰루스 식물, 바람직하게는 재배된 수박 식물이 제공된다.
또다른 측면에서 식물 또는 식물 세포가 QTL1.1, QTL4.1, QTL7.1 및 QTL9.1로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 또는 3종 또는 4종의 QTL (씨. 콜로신티스 공여자로부터의, 예를 들어 NCIMB 42624 또는 예를 들어 4의 점수를 갖고, QTL을 포함하는 다른 CGMMV 저항성 씨. 콜로신티스 공여자로부터의 유전자이입 단편)을 포함하는 것인 시트룰루스 식물, 바람직하게는 재배된 수박 식물이 제공된다.
추가의 또다른 측면에서 식물 또는 식물 세포가 QTL7.1 및/또는 QTL9.1로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종 또는 2종의 QTL (씨. 콜로신티스 공여자로부터의, 예를 들어 NCIMB 42624 또는 예를 들어 4의 점수를 갖고, QTL을 포함하는 다른 CGMMV 저항성 씨. 콜로신티스 공여자로부터의 유전자이입 단편)을 포함하는 것인 시트룰루스 식물, 바람직하게는 재배된 수박 식물이 제공된다. 한 측면에서 임의로 QTL1.1, QTL4.1 및 QTL5.2로부터 선택되는 열성 QTL 중 1종 이상은 QTL7.1 및/또는 QTL9.1과 조합될 수 있다.
한 측면에서 식물 또는 식물 세포는 재배된 수박이고, 임의로 둘 다 동형접합성 형태인 적어도 QTL7.1 및/또는 QTL9.1을 포함한다.
QTL의 존재는 예를 들어 QTL에 연결된 SNP 마커 중 1종 이상 또는 전부의 공여자 SNP 뉴클레오티드의 존재에 의해, 또는 염색체 영역을 시퀀싱하여 유전자이입 단편의 뉴클레오티드 서열을 검출하고, 예를 들어 이를 공여자의 뉴클레오티드 서열과 비교함으로써 측정될 수 있다.
수박 식물, 식물 부분 또는 식물 세포는 QTL을 포함하는 염색체 서열이 재배된 수박의 상응하는 염색체 상으로 유전자이입되어 재조합 염색체를 생성한 경우, 씨. 콜로신티스 공여자로부터 "QTL을 포함"하거나 "QTL을 포함하는 유전자이입 단편을 포함"하는 것으로 언급된다. 이는 예를 들어 염색체 영역을 시퀀싱함으로써 및/또는 QTL에 연결된 공여자 SNP 마커 중 1종 이상 또는 전부를 포함하는 유전자이입 단편에 의해 검출가능하다. 또한, CGMMV 저항성은 유전자이입 단편과 함께 전달되어야 하며, 즉, CGMMV 저항성 표현형을 수박 계통에 부여해야 하며, 그에 의해 유전자이입 단편이 결여된 수박 계통은 CGMMV에 대해 감수성이어야 한다.
유전자이입된 CGMMV 저항성의 기원에 관하여 이는 CGMMV에 대한 저항성이 시트룰루스, 바람직하게는 시트룰루스 콜로신티스 식물 세포 또는 식물로부터 본 발명에 따른 식물 세포 또는 식물의 게놈 내로, 바람직하게는 시트룰루스 라나투스 아종 불가리스 식물 세포 내로 또는 시트룰루스 라나투스 아종 불가리스 식물 내로 직접적으로 유전자이입되는 경우 결정적이지 않다. 결정적인 것은 모두 CGMMV에 대한 유전자이입된 저항성이 시트룰루스, 바람직하게는 시트룰루스 콜로신티스 식물 세포 또는 식물, 예를 들어 기탁된 공여자 또는 4의 저항성 점수 (증상 없음)를 갖는 또다른 공여자로부터 수득되거나, 유래되거나, 유래가능하거나, 그에 의해 수득가능하거나, 그로부터 기원한다는 것이다. CGMMV에 대한 저항성은 그것이 본 발명에 따른 식물 세포 또는 식물 내로 유전자이입되기 전에, 예를 들어 먼저 시트룰루스, 바람직하게는 시트룰루스 콜로신티스로부터 예를 들어 시트룰루스 라나투스 (아종 라나투스 및 무코소프페르무스를 포함함), 시트룰루스 에키르호수스, 시트룰루스 레미, 시트룰루스 나우디니아누스와 같은 또다른 종 또는 아종, 또는 또다른 비-CGMMV 저항성 시트룰루스 콜로신티스 식물 세포 또는 식물 내로 유전자이입될 수 있다. 이는 또한, CGMMV 저항성이 그것이 본 발명에 따른 식물 또는 작물 식물 세포 (예를 들어 시트룰루스 라나투스 아종 불가리스 식물 세포 또는 식물) 내로 유전자이입되기 전에, 다양한 상이한 종 또는 식물 내로 유전자이입되는 경우, 결정적이지 않다. 결정적인 것은 모두 본 발명에 따른 식물 세포 또는 식물 (예를 들어 시트룰루스 라나투스 아종 불가리스 식물 세포 또는 식물) 내로 유전자이입된 CGMMV 저항성이 원래 시트룰루스, 바람직하게는 시트룰루스 콜로신티스 식물 세포 또는 식물로부터 원래 수득되거나, 유래되거나, 유래가능하거나, 그에 의해 수득가능하다는 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 작물 식물 또는 작물 식물 세포 (예를 들어 시트룰루스 라나투스 아종 불가리스 식물 세포 또는 식물) 내로 유전자이입된 염색체 단편의 기원은 중요한 것이지만, 유전자이입 프로세스 또는 임의의 다른 육종 프로세스에 사용되는 단계 및/또는 단계의 수는 중요하지 않다.
본원에 사용된 용어 "유전자이입"은 관련 기술분야에서 통상적인 의미를 가지며, 한 식물 (공여자)로부터 동일하거나 상이한 종의 또다른 식물 (수용자 식물, 때때로 반복 식물 또는 반복친으로 지칭됨)의 유전자 풀 내로의 염색체 단편 또는 단편들의 이동 또는 도입인 것으로 이해되어야 한다. "CGMMV에 대한 유전자이입된 저항성" 또는 "유전자이입 단편"은 따라서 CGMMV에 대한 저항성을 부여하는, 즉, CGMMV 저항성 좌위 (QTL)를 포함하는 염색체 단편 또는 단편들이 한 CGMMV 저항성 식물 세포 또는 식물로부터 CGMMV에 대해 저항성이 아닌 또다른 식물 세포 내로 또는 CGMMV에 대해 저항성이 아닌 또다른 식물 내로 도입되었음을 의미한다. 식물 내로의 CGMMV 저항성의 유전자이입은 역교배를 비롯한 교배 또는 전통적인 육종 기법에 의해 실행될 수 있으며, 즉, 유전자이입된 CGMMV 저항성은 육종 방법의 결과일 수 있다. 수용자 식물 내로의 CGMMV 저항성의 유전자이입은 인간에 의해 지정되는 기술적 프로세스이다. 특히 본원에서 유전자이입은 인간이 만든 육종 프로세스 또는 방법을 지칭한다. 본원에서 제공된 분자 마커, 예를 들어 SNP 마커 중 1종 이상 또는 전부는 그 프로세스에 사용될 수 있다. 생성된 식물, 즉, 공여자로부터의 1개 이상의 유전자이입 단편을 포함하는 재배된 계통 또는 변종은 또한 인간이 만든 것이며, 자연에 존재하지 않는다.
QTL을 포함하는 씨. 콜로신티스로부터의 유전자이입 단편은 크며, 예를 들어 염색체의 심지어 반일 수 있지만, 바람직하게는 보다 작으며, 예컨대 약 20 Mb (메가베이스), 18 Mb, 15 Mb 이하, 예컨대 약 10 Mb 이하, 약 9 Mb 이하, 약 8 Mb 이하, 약 7 Mb 이하, 약 6 Mb 이하, 약 5 Mb 이하, 약 4 Mb 이하, 약 3.5 또는 3 Mb 이하, 약 2 Mb 이하, 약 1 Mb (1 ,000,000 염기 이하와 동등함), 또는 약 0.9 Mb (900,000 염기 쌍과 동등함) 이하, 예컨대 0.8 Mb, 0.7Mb, 0.6Mb, 0.5Mb 이하이다. 한 측면에서 유전자이입 단편은 SNP 마커 중 1종 이상을 포함하는 본원의 다른 곳 (예를 들어 표 1 및 6 참조)에 지시된 물리적 영역, 또는 각각의 QTL을 보유하는 그의 하위-영역을 포함한다.
"CGMMV 저항성 좌위" 또는 "CGMMV 저항성 QTL"은 CGMMV 저항성을 부여하는 유전자, 및 유전자의 대립유전자가 위치하는 염색체 상의 영역을 의미한다. 따라서, CGMMV에 대한 유전자이입된 저항성을 언급하는 경우, 이는 CGMMV 저항성 좌위가 유전자이입된, 즉, 유전자이입 단편 상에 존재하는 것으로 이해된다. CGMMV 저항성 좌위/좌위들은 본원에서 또한 QTL (양적 형질 좌위/좌위들)로 지칭된다.
용어 "육종"은 본원에서 예를 들어, 재조합 염색체 1, 4, 5, 7 또는 9가 수득, 확인, 생산 및/또는 전달될 수 있는, 육종가에게 공지된 바와 같은 교배, 역교배, 자가수정, 선택, 이중 반수체 생산, 배아 구제, 원형질체 융합, 마커 보조 선택, 돌연변이 육종, 배아 구제 등 (즉, 유전자 변형/형질전환/ 트랜스제닉 방법 이외의 방법)을 포괄한다. 재조합 염색체는 공여자로부터의 및 유전자이입 단편을 포함하는 수용자 염색체이다. 따라서, 본원에서 "재조합 염색체 1 또는 4 또는 5 또는 7 또는 9"는 염색체가 CGMMV 저항성 공여자로부터의 QTL1.1 (염색체 1), QTL4.1 (염색체 4), QTL5.2 (염색체 5), QTL7.1 (염색체 7) 또는 QTL9.1 (염색체 9)을 포함하는 유전자이입 단편을 포함함을 의미한다.
"마커 보조 선택" 또는 "MAS"는 특정 좌위에 또는 특정 염색체 영역에 유전자적으로 및 물리적으로 연결되어 특이적 좌위 또는 영역의 존재에 대해 식물을 선택하는 분자 마커 (예컨대 SNP 마커)의 존재를 사용하는 프로세스이다. 예를 들어, QTL1.1, QTL4.1, QTL5.2, QTL7.1 또는 QTL9.1에 유전자적으로 및 물리적으로 연결된 분자 마커 (예컨대 표 1 및 표 6의 SNP 마커)는 QTL을 포함하는 수박 식물, 또는 식물 부분을 검출하고/거나 선택하는 데 사용될 수 있다. 좌위에의 분자 마커의 연결이 보다 가까울수록, 마커가 감수분열 재조합을 통해 좌위로부터 해리될 가능성이 더 적다. 마찬가지로, 2개의 마커가 서로에 더 가깝게 연결될수록, 2개의 마커가 서로로부터 분리될 가능성이 더 적다 (및 이들이 단위로서 공동-분리될 가능성이 더 많다). 용어 "유전자형분석"은 특히 1종 이상의 뉴클레오티드, 예컨대 1종 이상의 SNP 마커에 대해 식물 또는 식물 세포 또는 식물 부분의 유전자형이 측정되는 방법을 지칭한다. SNP 마커의 유전자형은 이배체 식물 또는 식물 세포에서 2개의 뉴클레오티드로, 삼배체에서 3개의 뉴클레오티드로, 및 사배체 식물 또는 세포에서 4개의 뉴클레오티드로 이루어진다.
"식물 변종"은 (식물 육종가의 권리의 인식에 대한 조건이 충족되는지 그렇지 않은지 여부와 무관하게) 특정 유전자형 또는 유전자형의 조합으로부터 초래되는 특징의 발현에 기초하여 정의될 수 있고, 그들 특징 중 적어도 하나의 발현에 의해 식물의 임의의 다른 군으로부터 구별될 수 있으며, 그것이 임의의 변화 없이 증식될 수 있기 때문에 실체로서 간주될 수 있는, 공지된 가장 낮은 등급의 동일한 식물학적 분류군 내의 식물의 군이다. 따라서, 용어 "식물 변종"은 이들이 동일한 종류의 것인 경우에도, 이들이 모두 1개 또는 2개의 좌위 또는 유전자 (또는 이들 특이적 좌위 또는 유전자로 인한 표현형적 특징)의 존재를 특징으로 하지만, 그렇지 않다면 다른 좌위 또는 유전자와 관련하여 서로로부터 대단히 상이할 수 있는 경우, 식물의 군을 나타내는 데 사용될 수 없다.
"F1, F2, F3 등"은 2개의 모체 식물 또는 모체 계통 사이의 교배 후의 연속적인 관련된 세대를 지칭한다. 2개의 식물 또는 계통을 교배시킴으로써 생산된 종자로부터 성장된 식물은 F1 세대로 지칭된다. F1 식물을 자가수정하는 것은 F2 세대를 초래하는 등이다.
"F1 잡종" 식물 (또는 F1 잡종 종자)은 2개의 순계 모체 계통을 교배시키는 것으로부터 수득된 세대이다. 따라서, F1 잡종 종자는 그로부터 F1 잡종 식물이 성장하는 종자이다. F1 잡종은 잡종강세로 인해 보다 강건하고, 보다 고 수율성이다. 순계 계통은 본질적으로 게놈에서의 대부분의 좌위에서 동형접합성이다.
"식물 계통" 또는 "육종 계통"은 식물 및 그의 자손을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "순계 계통"은 반복적으로 자가수정되었고, 거의 동형접합성인 식물 계통을 지칭한다. 따라서, "순계 계통" 또는 "모체 계통"은 높은 균일성을 갖는 식물 계통을 초래하는, 근교배의 몇몇 세대 (예를 들어 적어도 5, 6, 7회 이상)를 겪은 식물을 지칭한다.
표현형적 수준에서 CGMMV 저항성이 유전자이입된 시트룰루스 작물 식물 세포 또는 시트룰루스 작물 식물은 이들이 본원에 기재된 바와 같이 CGMMV 감염에 대해 저항성을 나타낸다는, 즉, 유전자이입 단편 또는 단편들을 포함하는 식물이 CGMMV에 대해 저항성이라는 점에서 상응하는 시트룰루스 식물 세포 또는 상응하는 시트룰루스 식물로부터 구별될 수 있다. 유전자 수준에서 CGMMV 저항성이 유전자이입된 시트룰루스 작물 식물 세포 또는 시트룰루스 작물 식물은 그들의 게놈이 또다른 식물로부터 기원한 1개 이상의 CGMMV 저항성 부여 염색체 단편을 포함한다는 점에서 상응하는 시트룰루스 식물 세포 또는 상응하는 시트룰루스 식물로부터 구별될 수 있다. 서로에 비해 식물 세포 또는 식물과 관련하여 용어 "상응하는"은 서로에 비해 식물 세포 또는 식물이, CGMMV 저항성이 유전자이입된 식물 세포 또는 식물이 CGMMV에 대해 저항성이고/거나, 그의 게놈에 CGMMV에 대한 저항성을 부여하는 1개 이상의 염색체 단편을 포함하는 것을 제외하고는, 유사하거나 동일한 표현형적 외관 또는 유전자형을 가짐을 의미한다. 염색체 단편 (유전자이입 단편)은 본원에 기재된 저항성 좌위, 또는 QTL을 포함한다. 본원에 개시된 식물은 예를 들어 시트룰루스 라나투스 아종 불가리스 게놈을 갖지만, 시트룰루스 콜로신티스로부터, 예를 들어 NCIMB 42624로부터 1개 이상의 염색체 단편이 그들의 게놈 내로 유전자이입되고, 그에 의해 유전자이입된 염색체 단편 또는 단편들은 CGMMV에 대한 저항성을 부여한다. 유전자이입된 단편(들)은 공여자로부터의 것인 반면, 나머지 게놈은 수용자로부터의 것이다.
"염색체 단편" 또는 "유전자이입 단편" 또는 "유전자이입된 단편"은 본원에서 게놈에 존재하거나 부재하는 경우 기능을 부여하고/거나 식물의 표현형을 결정하는 게놈에서의 연속적 DNA 서열로 구성된 임의의 단편을 의미한다. 본 발명에 관하여 본 발명에 따른 식물 세포 또는 식물 내로 유전자이입되고, 따라서 본 발명에 따른 식물 세포 또는 식물의 게놈에 존재하는 염색체 단편은 CGMMV 저항성의 표현형을 부여한다 (임의로 표현형은 단지 단편이 동형접합성 형태인 경우 발현될 수 있음). 따라서, 한 측면에서 염색체 단편(들)이 결여된 식물, 예를 들어 그의 게놈에 씨. 콜로신티스 단편이 결여된 재배된 수박 식물은 CGMMV 감수성일 것인 반면, 염색체 단편 중 1개 이상을 포함하는 식물은 CGMMV 저항성일 것이다.
염색체 단편은 특이적 분자 마커 (RFLP, AFLP, RADP, SNP 등)에 의해, 염색체의 물리적 영역에 의해, 존재하거나 부재하는 유전자 또는 그의 특이적 대립유전자에 의해, cDNA 또는 게놈 DNA의 특이적 서열, 존재하거나 부재하는 DNA에 의해 코딩되는 단백질의 서열에 의해 등에 의해 기재되거나 정의될 수 있다. 한 측면에서 염색체 단편은 본원에서 CGMMV 저항성-부여 QTL에 연결된 단일 뉴클레오티드 다형성 마커 (SNP 마커)에 의해 기재되거나 정의되며, 그에 의해 씨. 콜로신티스 (C. colcynthis) 공여자의 단일 뉴클레오티드는 SNP 마커 위치에서 수용자의 단일 뉴클레오티드와는 상이한 뉴클레오티드를 갖는다. 따라서, QTL을 포함하는 염색체 단편은 물리적 영역에 의해 및/또는 SNP 마커 및 사이에 유전자이입된 단편이 위치하는 SNP 마커를 포함하는 서열에 의해 및/또는 유전자이입된 단편 상에 존재하는 (및 유전자이입된 단편이 결여된 감수성 수용자에 부재하는) SNP 마커 뉴클레오티드 (공여자 SNP 뉴클레오티드)에 의해 정의될 수 있다.
본 발명의 맥락에서 "SNP (= 단일 뉴클레오티드 다형성)"는 게놈에서의 특이적 위치에서 발생하는 단일 뉴클레오티드의 변이로서 이해되어야 한다. SNP는 2개의 식물 사이의 게놈에서 주어진 위치에서의 단일 뉴클레오티드의 변이이다. CGMMV 저항성 좌위를 갖는 공여자 식물 (예를 들어 씨. 콜로신티스 식물)이 특이적 단일 위치에서의 그의 상응하는 서열에서 수용자 식물 (예를 들어 CGMMV에 대해 감수성인 재배된 수박)의 동일한 위치에서의 상응하는 뉴클레오티드와는 상이한 뉴클레오티드를 나타내는 경우, 위치는 공여자 및 수용자 사이의 SNP를 정의한다. 공여자 식물이 특이적 위치에 4개의 가능한 뉴클레오티드 (A, C, T 또는 G) 중 하나를 갖는 경우, SNP는 수용자 식물이 동일한 상응하는 서열 위치에 나머지 3개의 가능한 뉴클레오티드 중 어느 하나를 갖는 경우 발생한다. 공여자로부터의 유전자이입 단편을 포함하는 재배된 수박 식물에서, 따라서 SNP의 단일 뉴클레오티드가 공여자로부터의 것인지 (공여자 SNP 뉴클레오티드), 재배된 수박으로부터의 것인지 (수용자 SNP 뉴클레오티드 또는 감수성 SNP 뉴클레오티드)는 용이하게 측정될 수 있다. 재배된 수박 염색체는 예를 들어 cucurbitgenomics.org 상에서 발견되는 것들이며, 공여자 SNP를 포함하는 서열 중 임의의 것 (즉, 서열식별번호: 1 내지 서열식별번호: 24 중 임의의 것)을 사용하여 '수박 (찰스톤 그레이) 게놈'에 대해 BLAST 분석을 수행하는 것은 재배된 수박 게놈에서 SNP의 염색체 위치를 나타낼 것이다.
따라서, 추가의 실시양태에서 CGMMV에 대한 유전자이입된 저항성을 포함하는 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 시트룰루스 식물 세포 또는 식물은 그들의 게놈 내로 통합된 또다른 식물 세포 또는 식물로부터의 염색체 단편을 포함하며, 여기서, 상기 염색체 단편은 CGMMV 저항성을 부여한다. 따라서, CGMMV에 대한 유전자이입된 저항성을 포함하는 본 발명에 따른 식물 세포 및 본 발명에 따른 식물의 게놈은 상응하는 비-CGMMV 저항성 식물 세포 또는 상응하는 비-CGMMV 저항성 식물로부터의 CGMMV 저항성 좌위를 포함하는 특이적 CGMMV 저항성 좌위 또는 게놈 영역에서 상이하다.
CGMMV 저항성 식물 세포 또는 식물이 상응하는 비-CGMMV 저항성 식물 세포 또는 식물로부터의 좌위를 포함하는 특이적 CGMMV 저항성 좌위 또는 영역에서 상이한지 여부는 통상의 기술자에 의해 관련 기술분야에 공지된 1종 이상의 기법, 예컨대 표현형적 검정, 전체 게놈 시퀀싱, 분자 마커 분석, 형질 지도화, 염색체 페인팅, 대립성 시험 등, 또는 기법의 조합을 사용하여 측정될 수 있다. 마찬가지로, 표 1 및 표 6에 기재된 QTL에 연결된 SNP 마커는 기재될 것인 바와 같이 사용될 수 있다.
CGMMV에 대해 저항성인 시트룰루스 식물은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 통상적으로 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 가능한 것은 예를 들어 수탁 번호 NCIMB 42624 하에 기탁된 종자 또는 그의 저항성 자손의 사용이다. 이들 기탁된 종자의 특정 이점은 종자로부터 성장된 식물이 CGMMV에 대해 저항성이며, 식물이 QTL 및 SNP 마커에 대해 동형접합성이라는 것이다. 따라서, CGMMV에 대한 저항성을 부여하는 염색체 단편은 예를 들어 다른 시트룰루스 작물 식물과 같은 다른 시트룰루스 식물, 특히 시트룰루스 라나투스 식물, 특히 시트룰루스 라나투스 아종 불가리스 (재배된 수박) 식물을 수정시키기 위한 CGMMV 저항성 시트룰루스 식물의 화분을 사용함으로써 다른 시트룰루스 식물 내로 도입되거나 유전자이입될 수 있다. 염색체 7 (QTL7.1) 및 염색체 9 (QTL9.1) 상의 CGMMV 저항성 부여 염색체 단편은 적어도 이배체 정도의 배수성을 갖는 식물에서 우성이다. 따라서, CGMMV 저항성 시트룰루스 식물, 예를 들어 수탁 번호 NCIMB 42624 하에 기탁된 종자 (또는 그의 저항성 자손)로부터 성장된 식물을 또다른 시트룰루스 식물과 교배시킨 후에, CGMMV 저항성은 이미 F1 세대에서 수득된다. 그 후, 식물은 공여자 게놈의 CGMMV 저항성 유전자이입 단편을 보유하면서, 공여자 게놈을 감소시키기 위해 감수성 모체 (수용자)와 역교배될 수 있다.
다른 CGMMV 저항성 시트룰루스 콜로신티스 수탁물은 또한 바람직하게는 수탁 번호 NCIMB 42624 하에 기탁된 종자 (또는 그의 저항성 자손)로부터 성장된 식물 및 감수성 대조군, 예를 들어 변종 슈가 베이비에 비해, 이러한 수탁물의 CGMVV 저항성을 시험함으로써 확인될 수 있다. 예를 들어 실시예에 기재된 바와 같은 기계적 잎 접종 및/또는 SNP 마커 분석 (유전자형분석) 및/또는 RT-qPCR은 수탁 번호 NCIMB 42624 하에 기탁된 종자 (또는 그의 저항성 자손)로부터 성장된 식물과 동일한 수준의 저항성 및/또는 동일하거나 매우 유사한 수준의 바이러스 RNA를 갖는 시트룰루스 콜로신티스 수탁물을 확인하는 데 사용될 수 있다. 또한, CGMMV 저항성 시트룰루스 콜로신티스 수탁물은 또한 표 1 및 표 6의 SNP 마커 중 1종 이상에 대한 SNP 마커 유전자형을 분석함으로써 확인될 수 있다. SNP13, SNP14, SNP15, SNP16, SNP17 및/또는 SNP18 중 1종 이상 또는 전부에 대한 씨. 콜로신티스 공여자 NCIMB 42624와 동일한 뉴클레오티드 (즉, 공여자 뉴클레오티드)를 포함하는 시트룰루스 콜로신티스 수탁물은 따라서 그의 게놈에 QTL7.1을 포함할 가능성이 가장 클 것이다. 마찬가지로, SNP19, SNP20, SNP21, SNP22, SNP23 및/또는 SNP24 중 1종 이상 또는 전부에 대한 씨. 콜로신티스 공여자 NCIMB 42624와 동일한 뉴클레오티드를 포함하는 시트룰루스 콜로신티스 수탁물은 따라서 그의 게놈에 QTL9.1을 포함할 가능성이 가장 클 것이다. QTL1.1, QTL4.1 및 QTL5.2 및 이들 QTL에 연결된 각각의 SNP 마커에 대해 동일한 것이 적용된다 (예를 들어 표 1 및 6 참조).
한 측면에서 본 발명에 따른 시트룰루스 식물 세포 또는 시트룰루스 식물은 짝수의 정도의 배수성 (2n, 4n, 6n, 8n 등)을 갖는 식물 및 홀수의 정도의 배수성 (3n, 5n 등)을 갖는 식물을 비롯한, 임의의 정도의 배수성을 갖는 시트룰루스 식물을 포함한다. QTL7.1 및 QTL9.1에 의해 부여되는 저항성은 우성이기 때문에, 식물 세포 및 식물은 유전자이입 단편이 짝수의 다배수체에서 이형접합성 상태 (2n에서 1 카피, 4n에서 2 카피, 8n에서 4 카피 등)인 경우에도 CGMMV 저항성이다.
다배체화는 식물에서 널리 퍼져 있다. 이는 유전자 다양성을 증가시키고, 왕성함, 크기, 활기 및 질환 저항성의 증가를 나타내는 종을 생산하는 것을 담당한다. 다배수체 식물에 대한 자명한 이점은 잡종강세 및 유전자 중복성이다.
다수의 오늘날 재배된 넓은 에이커 및 농장 작물은 1개 이상의 게놈 중복을 겪었다. 예는 면화, 감자, 빵밀, 오일 종자, 옥수수, 대두, 해바라기, 바나나, 사과 및 커피이다 (Renny-Byfield 7 Wendel, 2014, American J. Botany, 101(10), 1711-1725).
특히 채소 육종에서, 다양한 식물에서의 다배수성은 콜키신, 콜카민, 오리잘린, 콜세미드, 트리플루랄린 또는 아미프로포스메틸을 비롯한 화학물질의 사용에 의해 유도되었다. 화학물질의 사용에 의해 생산된 채소에서 게놈 중복에 대한 예는 반수체 식물로부터의 이배체 방울다다기 양배추, 사배체 완두콩, 사배체 수박, 사배체 머스크멜론, 사배체 양파, 팔배체 코코얌, 사배체 뱀오이, 삼배체 및 사배체 세로홈 호박, 사배체 오이 및 사배체 강낭콩이다 (Kazi, 2015, J. 전체적 Biosciences 4(3), 1774-1779).
본 발명은 한 측면에서 임의의 정도의 배수성을 갖는 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 시트룰루스 식물 세포 또는 식물에 관한 것이며, 여기서, 배수성의 정도는 짝수 또는 홀수일 수 있고, 바람직하게는 배수성의 정도는 2n, 3n 또는 4n이다.
홀수의 배수성의 정도에 관하여 본 발명의 바람직한 실시양태는 삼배체 (3n)인 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 시트룰루스 식물 세포 또는 식물에 관한 것이다. 한 측면에서 식물 세포 또는 식물은 씨. 라나투스 아종 불가리스 종의 것이고, 삼배체이며, 3개의 상동성 염색체 중 적어도 1개 상에, 또는 3개의 염색체 중 2개 상에, 또는 바람직하게는 3개의 상동성 염색체 중 모든 3개 상에 유전자이입 단편을 포함한다 (즉, 식물 세포 또는 식물은 CGMMV 저항성을 부여하는 유전자이입 단편에 대해 동형접합성임). 이러한 삼배체 식물, 또는 그로부터 이러한 삼배체 식물이 성장될 수 있는 종자는 예를 들어 동형접합성 형태의 유전자이입 단편을 포함하는 이배체 수박을 예를 들어 동형접합성 형태의 유전자이입 단편을 포함하는 사배체 수박 (예를 들어 동형접합성 이배체의 염색체 배가에 의해 생산된 4개의 카피)과 교배시킴으로써 용이하게 생성될 수 있다. 생산된 종자는 삼배체 종자이며, 그로부터 삼배체 수박 식물이 성장될 수 있다. 이러한 삼배체 종자 및 삼배체 식물은 CGMMV에 대해 저항성이며, 본 발명의 한 측면이다.
한 측면에서 삼배체 식물은 바람직하게는 동형접합성 형태의 (즉, 3개의 카피) QTL7.1 및/또는 QTL9.1을 포함하는 재배된 수박 식물, 식물 부분 또는 세포이다. 임의로 재배된 수박 식물, 식물 부분 또는 세포는 동형접합성 형태 (3개의 카피)의 QTL1.1, QTL4.1 및 QTL5.2로부터 선택되는 QTL을 더 포함한다. 따라서, 각각의 QTL의 유전자이입 단편은 삼배체 식물 세포 또는 식물에서 3개의 카피 (재조합 염색체, 예를 들어 3개의 재조합 염색체 7 및/또는 9를 포함함)로 존재하고, QTL에 연결된 1종 이상의 SNP 마커는 3개의 카피로 존재하고, 3개의 카피로 공여자 뉴클레오티드를 포함한다.
한 측면에서 삼배체 식물은 동형접합성 형태 (즉, 3개의 카피)의 QTL1.1, QTL4.1, QTL5.2, QTL7.1 및 QTL9.1로부터 선택되는 1종 이상 또는 전부의 QTL을 포함하는 재배된 수박 식물이다. 그러면, 각각의 QTL에 연결된 SNP 마커 중 1종 이상의 공여자 뉴클레오티드는 바람직하게는 삼배체 식물 또는 식물 세포에서 3개의 카피로 존재한다.
짝수의 배수성의 정도에 관하여 본 발명이 바람직한 실시양태는 이배체 (2n) 또는 사배체 (4n)인 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 시트룰루스 식물 세포 또는 식물에 관한 것이다. 한 측면에서 식물 세포 또는 식물은 씨. 라나투스 아종 불가리스 종의 것이고, 이배체이며, 이형접합성 또는 동형접합성 형태의 유전자이입 단편(들)을 포함하고; 또다른 측면에서 식물 세포 또는 식물은 씨. 라나투스 아종 불가리스 종의 것이고, 사배체이며, 이형접합성 (2개의 카피) 또는 동형접합성 (4개의 카피) 형태의 유전자이입 단편(들)을 포함한다. 이러한 이배체 및 사배체 종자 및 이배체 및 사배체 식물은 CGMMV에 대해 저항성이며, 본 발명의 한 측면이다. 이들은 삼배체 CGMMV 저항성 종자 및 식물을 제조하기 위한 모체로서 사용될 수 있다.
따라서, 한 측면에서 이배체 식물은 동형접합성 형태의 또는 이형접합성 형태의 QTL7.1 및/또는 QTL9.1을 포함하는 재배된 수박 식물이다. 임의로 재배된 수박 식물, 식물 부분 또는 세포는 동형접합성 형태 (2개의 카피)의 QTL1.1, QTL4.1 및 QTL5.2로부터 선택되는 QTL을 더 포함한다. 따라서, QTL이 예를 들어 순계 계통에서 동형접합성 형태인 경우, 각각의 QTL의 유전자이입 단편은 이배체 식물 세포 또는 식물에서 2개의 카피 (2개의 재조합 염색체, 예를 들어 2개의 재조합 염색체 7 및/또는 9를 포함함)로 존재하고, QTL에 연결된 1종 이상의 SNP 마커는 2개의 카피로 존재하며, 2개의 카피로 공여자 뉴클레오티드를 포함한다.
또다른 측면에서 이배체 식물은 동형접합성 형태의 또는 이형접합성 형태의 QTL1.1, QTL4.1, QTL5.2, QTL7.1 및 QTL9.1로부터 선택되는 QTL 중 1종 이상 또는 전부를 포함하는 재배된 수박 식물이다.
한 추가의 측면에서 사배체 식물은 동형접합성 형태 (QTL7.1 및/또는 QTL9.1의 4개의 카피)의 또는 이형접합성 형태 (QTL7.1 및/또는 QTL9.1의 2개의 카피)의 QTL7.1 및/또는 QTL9.1을 포함하는 재배된 수박 식물이다. 임의로 재배된 수박 식물, 식물 부분 또는 세포는 이형접합성 또는 동형접합성 형태 (각각 2개의 카피 또는 4개의 카피)의 QTL1.1, QTL4.1 및 QTL5.2로부터 선택되는 QTL을 더 포함한다.
또다른 측면에서 사배체 식물은 동형접합성 형태의 또는 이형접합성 형태의 QTL1.1, QTL4.1, QTL5.2, QTL7.1 및 QTL9.1로부터 선택되는 QTL 중 1종 이상 또는 전부를 포함하는 재배된 수박 식물이다.
본 발명의 맥락에서 "짝수의 배수성의 정도"는 2에 의해 나누어지는 경우 세포 또는 유기체에 존재하는 상동성 염색체 세트의 수가 정수를 초래함을 의미한다. 따라서, 세포 또는 유기체는 이배체 (2n), 사배체 (4n), 육배체 (6n), 팔배체 (8n) 등이다.
본 발명의 맥락에서 "홀수의 배수성의 정도"는 2에 의해 나누어지는 경우 세포 또는 유기체에 존재하는 상동성 염색체 세트의 수가 정수를 초래하지 않음을 의미한다. 따라서, 세포 또는 유기체는 반수체 (1n), 삼배체 (3n) 등이다.
본 발명의 맥락에서 "이배체 식물 세포 또는 식물"은 본원에서 2n으로 지칭되는, 상응하는 염색체의 2개의 세트를 갖는 식물, 증식형 식물 부분, 과실, 종자 또는 식물 세포를 의미한다.
본 발명의 맥락에서 "사배체 식물 세포 또는 식물"은 본원에서 4n으로 지칭되는, 상응하는 염색체의 4개의 세트를 갖는 식물, 증식형 식물 부분(들), 과실, 종자 또는 식물 세포를 의미한다.
본 발명의 맥락에서 "삼배체 식물 세포 또는 식물"은 본원에서 3n으로 지칭되는, 상응하는 염색체의 3개의 세트를 갖는 식물, 증식형 식물 부분(들), 과실, 종자 또는 식물 세포를 의미한다.
식물의 유성 생식 세포 (화분 및 배주)는 상기 식물의 나머지 세포의 세트의 반인 염색체의 세트를 포함하는 것으로 관련 기술분야에 통상적으로 이해되어 있다. 식물 화분 및 배주는 전체 식물로 재생될 수 있다. 짝수의 배수성의 정도를 갖는 식물의 경우, 따라서 일반적으로 화분 또는 배주의 재생 시 배수성의 정도를 반만큼 감소시키는 것이 가능하다. 짝수의 배수성의 정도 (예를 들어 2n, 4n, 6n, 8n 등)를 갖는 본 발명의 식물로부터 염색체의 이등분된 세트 (예를 들어 각각 1n, 2n, 3n, 4n 등)를 갖는 식물이 화분 또는 배주 재생에 의해 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 이배체 (2n) 식물은 예를 들어 CGMMV 저항성을 포함하는 화분 또는 배주 세포로부터 재생될 수 있으며, 화분 또는 배주 세포는 CGMMV 저항성을 포함하는 사배체 식물로부터 수득된다. 바람직하게는, 화분 또는 배주 세포는 동형접합성 상태의 CGMMV 저항성을 포함하는 사배체 식물로부터 수득된다. 그 후, 유도된 이배체 식물은 CGMMV 저항성을 갖는 식물을 추가로 육종하고, 생성하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 한 측면에서 식물은 이배체 (2n), 사배체 (4n) 또는 삼배체 (3n)인 재배된 수박이며, 기재된 바와 같은 CGMMV 저항성 부여 유전자이입 단편을 포함하는 상동성 염색체 중 적어도 1개의 염색체를 포함한다. 한 측면에서 상동성 염색체 중 적어도 2개, 3개 또는 심지어 모든 4개는 유전자이입 단편을 포함한다.
삼배체 (3n) 식물, 특히 삼배체 재배된 수박 식물은 이배체 (2n) 식물을 사배체 (4n) 식물과 교배시킴으로써 생산될 수 있다. 상기 교배로부터 기원한 잡종 식물 종자는 삼배체 (3n)일 것이다.
서로와 교배된 이배체 (2n) 및 사배체 (4n) 식물 중 적어도 하나는 CGMMV에 대해 저항성이다. 바람직하게는 서로와 교배된 본 발명에 따른 이배체 (2n) 및 사배체 (4n) 식물은 둘 다 CGMMV에 대해 저항성이다. 한 측면에서 이배체 및 사배체 식물, 특히 재배된 수박 식물 둘 다는 유전자이입 단편에 대해 동형접합성이며 (즉, 이배체는 유전자이입 단편의 2개의 카피를 포함하고, 사배체는 4개의 카피를 포함함), 생성된 삼배체는 유전자이입 단편의 3개의 카피를 포함한다.
홀수의 배수성의 정도를 갖는 식물, 예를 들어 삼배체 (3n) 식물은, 감수분열 동안 염색체가 딸 세포로 동등하게 나누어질 수 없기 때문에, 통상적으로 웅성 및 자성 불임이다. 따라서, 홀수의 배수성의 정도를 갖는 종자, 예를 들어 삼배체 식물은 무종자 과실을 생산하기 위해 재배될 수 있다.
한 측면에서, 이배체 식물은 단편이 재배된 수박 식물 상으로 CGMMV 저항성을 부여하는, CGMMV 저항성 씨. 콜로신티스 공여자로부터의, 예를 들어 NCIMB 42624로부터의 또는 그의 CGMMV 저항성 자손으로부터의 유전자이입 단편을 포함하는 재배된 수박 식물이다. NCIMB 42624에서 5종의 QTL이 있기 때문에, 이배체 식물은 한 측면에서 QTL1.1, QTL4.1, QTL5.2, QTL7.1 및 QTL9.1로부터 선택되는 QTL 중 1종 이상 또는 전부를 포함하는 재배된 수박 식물이다.
언급된 바와 같이, 이러한 재배된 수박 식물은 공여자 (예를 들어 NCIMB 42624 또는 그의 CGMMV 저항성 자손)로부터의 CGMMV 저항성 좌위의, 재배된 수박의 우량 계통 또는 변종 내로의 역교배 (1회 이상의 역교배)에 의해 생산될 수 있다. 역교배된 식물을 1회 이상 자가수정시킴으로써, 유전자이입 단편(들)은 동형접합성이 될 것이고, 식물은 공여자, 예를 들어 NCIMB 42624에서 발견되는 바와 같은, 또는 그로부터 수득가능한 바와 같은 CGMMV 저항성 좌위를 포함할 것이다.
이러한 이배체의 염색체를 배가시키는 것은 유전자이입 단편(들)에 대해 동형접합성인 사배체를 초래할 것이고, 식물은 공여자, 예를 들어 NCIMB 42624에서 발견되는 바와 같은, 또는 그로부터 수득가능한 바와 같은 CGMMV 저항성 좌위를 포함할 것이다. 동형접합성 이배체와 동형접합성 사배체의 후속의 교배는 공여자, 예를 들어 NCIMB 42624에서 발견되는 바와 같은, 또는 그로부터 수득가능한 바와 같은 CGMMV 저항성 좌위의 3개의 카피를 포함하는 삼배체의 생산을 가능하게 한다.
이러한 방식으로, 5종의 QTL 중 단지 1종을 포함하는 이배체 수박 식물이 제조될 수 있지만, 또한 QTL의 상이한 조합을 포함하는 식물이 제조될 수 있다. 마찬가지로, QTL 중 단지 1종 또는 QTL의 상이한 조합을 포함하는 사배체 및 삼배체가 제조될 수 있다.
우성 QTL, 즉, QTL7.1 및/또는 QTL9.1 중 적어도 1종을 포함하는 재배된 수박 식물은 본원에서 특정 실시양태이다. 임의로 이들 식물은 그들의 게놈에 열성 QTL, 즉, QTL1.1, QTL4.1 및/또는 QTL5.2 중 1종 이상을 바람직하게는 동형접합성 형태로 포함할 수 있다.
본원에서 제공된 SNP는 다양한 목적을 위해 사용될 수 있다. 이들은 QTL 함유 영역을 한정하거나, QTL(들)을 포함하는 유전자이입 단편(들)을 검출하는 (예를 들어 진단 검정에서, 예를 들어 공여자 물질에서 또는 재배된 물질에서) 데 사용될 수 있거나, 이들은 QTL(들)을 공여자로부터 수용자 식물로 또는 한 육종 계통 또는 변종으로부터 또다른 것 내로 전달하는 마커 보조 육종 방법에 사용될 수 있다.
QTL에 연결된 SNP 마커는, 수박 게놈에서의, 즉, 재배된 수박의 각각의 염색체 상의 위치가 있는 바와 같이, 상기 표 1에 지시된다. 또한, 저항성 공여자의 SNP 유전자형이 지시되며, 그에 의해 공여자는 SNP에 대해 및 서열에 대해 동형접합성이다 (예를 들어 공여자 SNP 또는 SNP1에 대한 공여자 서열은 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 51에서 '시토신' ('C')이다. 이배체 공여자의 유전자형은 따라서 'CC' ('시토신/시토신')이며, 이는 서열식별번호: 1의 2개의 카피 및 SNP1의 공여자 뉴클레오티드의 2개의 카피를 포함한다.
다른 씨. 콜로신티스 공여자에서 QTL의 변이체가 있을 수 있기 때문에, 공여자 SNP는 약간 다양한 뉴클레오티드 서열에 존재할 수 있으며, 예를 들어 서열식별번호: 1의 1, 2 또는 3개의 뉴클레오티드는, 서열의 쌍별 정렬을 수행하는 경우 등가의 위치에 씨. 콜로신티스 공여자 SNP 뉴클레오티드 (SNP1에 대해 이는 시토신임)를 여전히 가지면서, 서열식별번호: 1의 그것들과 상이할 수 있다.
따라서, "SNP1" 또는 "SNP1 마커"는 본원에서 서열식별번호: 1의, 또는 서열식별번호: 1과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51을 지칭한다. 본원에서 SNP1에 대한 씨. 콜로신티스 공여자 뉴클레오티드, 즉, 서열식별번호: 1의 또는 서열식별번호: 1과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 시토신 ('C')을 언급하는 경우, 서열식별번호: 1이 뉴클레오티드 51에서 공여자 뉴클레오티드 (즉, 시토신)를 포함하기 때문에, 서열식별번호: 1 자체 (서열식별번호: 1의 위치 51에서 뉴클레오티드를 언급하지 않고), 또는 서열식별번호: 1과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 시토신을 포함하는 서열을 동등하게 지칭할 수 있다. 따라서, CGMMV 저항성 씨. 콜로신티스 공여자로부터의 것인 유전자이입 단편을 포함하는 식물 또는 식물 세포는 SNP1에 대한 공여자 뉴클레오티드 (즉, 뉴클레오티드 51에서 시토신)를 포함하거나, "서열식별번호: 1을 포함"하거나, "서열식별번호: 1과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서, 또는 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치에서 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 서열"을 포함할 수 있다. 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치는 예를 들어 뉴클레오티드 삽입 또는 결실로 인해 약간 상이한 위치일 수 있으며, 예를 들어 이는 뉴클레오티드 49, 50 또는 52 또는 53일 수 있다. 서열 동일성은 바람직하게는 예를 들어 엠보스 (Emboss) 프로그램 '니들 (Needle)"을 사용하여 쌍별 정렬에 의해 측정된다. 동형접합성 형태의 SNP1에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우, 이배체 세포는 서열식별번호: 1의 (또는 서열식별번호: 1과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 2개의 카피, 즉, "CC" 유전자형을 포함한다. 삼배체 식물 또는 세포는 3개의 카피를 포함하고, 사배체 식물 또는 세포는 4개의 카피를 포함할 것이다. 마찬가지로, 이형접합성 형태의 SNP1에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우 (상동성 염색체의 쌍의 단지 1개의 염색체가 유전자이입을 가짐), 이배체 세포는 서열식별번호: 1의 (또는 서열식별번호: 1과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 1개의 카피를 포함한다. 유전자이입 단편이 결여된 다른 염색체는 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 51 (SNP1), 즉, 감수성 반복친의 서열에서 다른 뉴클레오티드, 즉, 아데닌, 구아닌 또는 티민 중 임의의 것을 포함한다. 이는 어느 반복친이 사용되었는 지에 의존한다. 한 측면에서, 이는 표 1에 지시된 바와 같이 SNP1에 대해 티민인데, 이는 이것이 본원에서 역교배에 사용된 반복친이었기 때문이다.
"서열 동일성" 및 "서열 유사성"은 전체적 또는 국소적 정렬 알고리듬을 사용한 2개의 펩티드 또는 2개의 뉴클레오티드 서열의 정렬에 의해 측정될 수 있다. 그 후, 서열은 이들이 예를 들어 프로그램 GAP 또는 BESTFIT 또는 엠보스 프로그램 "니들" (디폴트 파라미터를 사용함, 하기 참조)에 의해 최적으로 정렬되는 경우 하기에 추가로 정의되는 서열 동일성의 적어도 특정 최소 백분율을 공유하는 경우 "실질적으로 동일한" 것으로 지칭될 수 있다). 이들 프로그램은 2개의 서열을 그들의 전체 길이에 걸쳐 정렬하여, 매치의 수를 최대화하고, 갭의 수를 최소화하는 니들맨 및 운쉬 (Needleman and Wunsch) 전체적 정렬 알고리듬을 사용한다. 일반적으로, 디폴트 파라미터가 사용되며, 갭 생성 페널티 = 10 및 갭 연장 페널티 = 0.5 (둘 다 뉴클레오티드 및 단백질 정렬에 대해)이다. 뉴클레오티드에 대해 사용되는 디폴트 점수화 행렬은 DNAFULL이고, 단백질에 대해 디폴트 점수화 행렬은 블로섬 (Blosum)62이다 (Henikoff & Henikoff, l 992, PNAS 89, 1 09 1 5-1 09 1 9). 서열 정렬 및 백분율 서열 동일성에 대한 점수는 예를 들어 컴퓨터 프로그램, 예컨대 ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/ 하에 월드 와이드 웹 상에서 이용가능한 EMBOSS를 사용하여 측정될 수 있다. 대안적으로 서열 유사성 또는 동일성은 데이터베이스, 예컨대 FASTA, BLAST 등에 대해 검색함으로써 측정될 수 있지만, 히트를 바람직하게는 검색하고, 쌍별로 정렬하여 서열 동일성을 비교한다. 2개의 단백질 또는 2개의 단백질 도메인, 또는 2개의 핵산 서열은 백분율 서열 동일성이 적어도 95％, 98％ 또는 99％ (디폴트 파라미터를 사용하여 엠보스 "니들"에 의해 측정되는 바와 같이, 즉, 핵산에 대해 점수화 행렬 DNAFULL, 단백질에 대해 블로섬62를 사용하여, 갭 생성 페널티 = 10, 갭 연장 페널티 = 0.5)인 경우, "실질적 서열 동일성"을 갖는다. 참조 서열"과 실질적 서열 동일성"을 갖거나, 참조 서열과 적어도 80％, 예를 들어 적어도 95％, 98％ 또는 99％ 핵산 서열 동일성의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열 (예를 들어 DNA 또는 게놈 DNA)에 대해 언급하는 경우, 한 실시양태에서 상기 뉴클레오티드 서열은 주어진 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 동일한 것으로 간주되며, 엄격한 혼성화 조건을 사용하여 확인될 수 있다.
"엄격한 혼성화 조건"은 주어진 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 확인하는 데 사용될 수 있다. 엄격한 조건은 서열 의존적이며, 상이한 상황에서 상이할 것이다. 일반적으로, 엄격한 조건은 한정된 이온 강도 및 pH에서 특이적 서열에 대해 열 융점 (Tm)보다 약 5℃ 더 낮도록 선택된다. Tm은 표적 서열의 50％가 완벽하게 매칭된 프로브에 혼성화하는 온도 (한정된 이온 강도 및 pH 하에서)이다. 전형적으로 염 농도가 pH 7에서 약 0.02 몰이고, 온도가 적어도 60℃인 엄격한 조건이 선택될 것이다. 염 농도를 저하시키고/거나 온도를 증가시키는 것은 엄격성을 증가시킨다. RNA-DNA 혼성화 (예를 들어 100nt의 프로브를 사용한 노던 블롯)에 대한 엄격한 조건은 예를 들어 63℃에서 20분 동안 0.2X SSC에서 적어도 1회의 세척, 또는 등가의 조건을 포함하는 것들이다. DNA-DNA 혼성화 (예를 들어 100nt의 프로브를 사용한 서던 블롯)에 대한 엄격한 조건은 예를 들어 적어도 50℃, 통상적으로 약 55℃의 온도에서 20분 동안 0.2X SSC에서 적어도 1회의 세척 (통상적으로 2회), 또는 등가의 조건을 포함하는 것들이다. 또한, 문헌 [Sambrook et al. (1989)] 및 [Sambrook and Russell (2001)]을 참조한다.
따라서, "SNP2" 또는 "SNP2 마커"는 본원에서 서열식별번호: 2의, 또는 서열식별번호: 2와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51을 지칭한다. 본원에서 SNP2에 대한 씨. 콜로신티스 공여자 뉴클레오티드, 즉, 서열식별번호: 2의 또는 서열식별번호: 2와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 구아닌 ('G')을 언급하는 경우, 서열식별번호: 2가 뉴클레오티드 51에서 공여자 뉴클레오티드 (즉, 구아닌)를 포함하기 때문에, 서열식별번호: 2 자체 (서열식별번호: 2의 위치 51에서 뉴클레오티드를 언급하지 않고), 또는 서열식별번호: 2와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 구아닌을 포함하는 서열을 동등하게 지칭할 수 있다. 따라서, CGMMV 저항성 씨. 콜로신티스 공여자로부터의 것인 유전자이입 단편을 포함하는 식물 또는 식물 세포는 SNP2에 대한 공여자 뉴클레오티드 (즉, 뉴클레오티드 51에서 구아닌)를 포함하거나, "서열식별번호: 2를 포함"하거나, "서열식별번호: 2와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서, 또는 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치에서 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 서열"을 포함할 수 있다. 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치는 예를 들어 뉴클레오티드 삽입 또는 결실로 인해 약간 상이한 위치일 수 있으며, 예를 들어 이는 뉴클레오티드 49, 50 또는 52 또는 53일 수 있다. 서열 동일성은 바람직하게는 예를 들어 엠보스 프로그램 '니들"을 사용하여 쌍별 정렬에 의해 측정된다. 동형접합성 형태의 SNP2에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우, 이배체 세포는 서열식별번호: 2의 (또는 서열식별번호: 2와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 2개의 카피, 즉, "GG" 유전자형을 포함한다. 삼배체 식물 또는 세포는 3개의 카피를 포함하고, 사배체 식물 또는 세포는 4개의 카피를 포함할 것이다. 마찬가지로, 이형접합성 형태의 SNP2에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우 (상동성 염색체의 쌍의 단지 1개의 염색체가 유전자이입을 가짐), 이배체 세포는 서열식별번호: 2의 (또는 서열식별번호: 2와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 1개의 카피를 포함한다. 유전자이입 단편이 결여된 다른 염색체는 서열식별번호: 2의 뉴클레오티드 51 (SNP2), 즉, 감수성 반복친의 서열에서 다른 뉴클레오티드, 즉, 아데닌, 시토신 또는 티민 중 임의의 것을 포함한다. 이는 어느 반복친이 사용되었는 지에 의존한다. 한 측면에서, 이는 표 1에 지시된 바와 같이 SNP2에 대해 아데닌인데, 이는 이것이 본원에서 역교배에 사용된 반복친이었기 때문이다.
따라서, "SNP3" 또는 "SNP3 마커"는 본원에서 서열식별번호: 3의, 또는 서열식별번호: 3과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51을 지칭한다. 본원에서 SNP3에 대한 씨. 콜로신티스 공여자 뉴클레오티드, 즉, 서열식별번호: 3의 또는 서열식별번호: 3과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 시토신 ('C')을 언급하는 경우, 서열식별번호: 3이 뉴클레오티드 51에서 공여자 뉴클레오티드 (즉, 시토신)를 포함하기 때문에, 서열식별번호: 3 자체 (서열식별번호: 3의 위치 51에서 뉴클레오티드를 언급하지 않고), 또는 서열식별번호: 3과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 시토신을 포함하는 서열을 동등하게 지칭할 수 있다. 따라서, CGMMV 저항성 씨. 콜로신티스 공여자로부터의 것인 유전자이입 단편을 포함하는 식물 또는 식물 세포는 SNP3에 대한 공여자 뉴클레오티드 (즉, 뉴클레오티드 51에서 시토신)를 포함하거나, "서열식별번호: 3을 포함"하거나, "서열식별번호: 3과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서, 또는 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치에서 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 서열"을 포함할 수 있다. 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치는 예를 들어 뉴클레오티드 삽입 또는 결실로 인해 약간 상이한 위치일 수 있으며, 예를 들어 이는 뉴클레오티드 49, 50 또는 52 또는 53일 수 있다. 서열 동일성은 바람직하게는 예를 들어 엠보스 프로그램 '니들"을 사용하여 쌍별 정렬에 의해 측정된다. 동형접합성 형태의 SNP3에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우, 이배체 세포는 서열식별번호: 3의 (또는 서열식별번호: 3과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 2개의 카피, 즉, "CC" 유전자형을 포함한다. 삼배체 식물 또는 세포는 3개의 카피를 포함하고, 사배체 식물 또는 세포는 4개의 카피를 포함할 것이다. 마찬가지로, 이형접합성 형태의 SNP3에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우 (상동성 염색체의 쌍의 단지 1개의 염색체가 유전자이입을 가짐), 이배체 세포는 서열식별번호: 3의 (또는 서열식별번호: 3과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 1개의 카피를 포함한다. 유전자이입 단편이 결여된 다른 염색체는 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 51 (SNP3), 즉, 감수성 반복친의 서열에서 다른 뉴클레오티드, 즉, 아데닌, 구아닌 또는 티민 중 임의의 것을 포함한다. 이는 어느 반복친이 사용되었는 지에 의존한다. 한 측면에서, 이는 표 1에 지시된 바와 같이 SNP3에 대해 티민인데, 이는 이것이 본원에서 역교배에 사용된 반복친이었기 때문이다.
따라서, "SNP4" 또는 "SNP4 마커"는 본원에서 서열식별번호: 4의, 또는 서열식별번호: 4와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51을 지칭한다. 본원에서 SNP4에 대한 씨. 콜로신티스 공여자 뉴클레오티드, 즉, 서열식별번호: 4의 또는 서열식별번호: 4와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 시토신 ('C')을 언급하는 경우, 서열식별번호: 4가 뉴클레오티드 51에서 공여자 뉴클레오티드 (즉, 시토신)를 포함하기 때문에, 서열식별번호: 4 자체 (서열식별번호: 4의 위치 51에서 뉴클레오티드를 언급하지 않고), 또는 서열식별번호: 4와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 시토신을 포함하는 서열을 동등하게 지칭할 수 있다. 따라서, CGMMV 저항성 씨. 콜로신티스 공여자로부터의 것인 유전자이입 단편을 포함하는 식물 또는 식물 세포는 SNP4에 대한 공여자 뉴클레오티드 (즉, 뉴클레오티드 51에서 시토신)를 포함하거나, "서열식별번호: 4를 포함"하거나, "서열식별번호: 4와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서, 또는 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치에서 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 서열"을 포함할 수 있다. 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치는 예를 들어 뉴클레오티드 삽입 또는 결실로 인해 약간 상이한 위치일 수 있으며, 예를 들어 이는 뉴클레오티드 49, 50 또는 52 또는 53일 수 있다. 서열 동일성은 바람직하게는 예를 들어 엠보스 프로그램 '니들"을 사용하여 쌍별 정렬에 의해 측정된다. 동형접합성 형태의 SNP4에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우, 이배체 세포는 서열식별번호: 4의 (또는 서열식별번호: 4와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 2개의 카피, 즉, "CC" 유전자형을 포함한다. 삼배체 식물 또는 세포는 3개의 카피를 포함하고, 사배체 식물 또는 세포는 4개의 카피를 포함할 것이다. 마찬가지로, 이형접합성 형태의 SNP4에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우 (상동성 염색체의 쌍의 단지 1개의 염색체가 유전자이입을 가짐), 이배체 세포는 서열식별번호: 4의 (또는 서열식별번호: 4와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 1개의 카피를 포함한다. 유전자이입 단편이 결여된 다른 염색체는 서열식별번호: 4의 뉴클레오티드 51 (SNP4), 즉, 감수성 반복친의 서열에서 다른 뉴클레오티드, 즉, 아데닌, 구아닌 또는 티민 중 임의의 것을 포함한다. 이는 어느 반복친이 사용되었는 지에 의존한다. 한 측면에서, 이는 표 1에 지시된 바와 같이 SNP4에 대해 티민인데, 이는 이것이 본원에서 역교배에 사용된 반복친이었기 때문이다.
따라서, "SNP5" 또는 "SNP5 마커"는 본원에서 서열식별번호: 5의, 또는 서열식별번호: 5와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51을 지칭한다. 본원에서 SNP5에 대한 씨. 콜로신티스 공여자 뉴클레오티드, 즉, 서열식별번호: 5의 또는 서열식별번호: 5와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 구아닌 ('G')을 언급하는 경우, 서열식별번호: 5가 뉴클레오티드 51에서 공여자 뉴클레오티드 (즉, 구아닌)를 포함하기 때문에, 서열식별번호: 5 자체 (서열식별번호: 5의 위치 51에서 뉴클레오티드를 언급하지 않고), 또는 서열식별번호: 5와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 구아닌을 포함하는 서열을 동등하게 지칭할 수 있다. 따라서, CGMMV 저항성 씨. 콜로신티스 공여자로부터의 것인 유전자이입 단편을 포함하는 식물 또는 식물 세포는 SNP5에 대한 공여자 뉴클레오티드 (즉, 뉴클레오티드 51에서 구아닌)를 포함하거나, "서열식별번호: 5를 포함"하거나, "서열식별번호: 5와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서, 또는 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치에서 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 서열"을 포함할 수 있다. 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치는 예를 들어 뉴클레오티드 삽입 또는 결실로 인해 약간 상이한 위치일 수 있으며, 예를 들어 이는 뉴클레오티드 49, 50 또는 52 또는 53일 수 있다. 서열 동일성은 바람직하게는 예를 들어 엠보스 프로그램 '니들"을 사용하여 쌍별 정렬에 의해 측정된다. 동형접합성 형태의 SNP5에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우, 이배체 세포는 서열식별번호: 5의 (또는 서열식별번호: 5와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 2개의 카피, 즉, "GG" 유전자형을 포함한다. 삼배체 식물 또는 세포는 3개의 카피를 포함하고, 사배체 식물 또는 세포는 4개의 카피를 포함할 것이다. 마찬가지로, 이형접합성 형태의 SNP5에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우 (상동성 염색체의 쌍의 단지 1개의 염색체가 유전자이입을 가짐), 이배체 세포는 서열식별번호: 5의 (또는 서열식별번호: 5와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 1개의 카피를 포함한다. 유전자이입 단편이 결여된 다른 염색체는 서열식별번호: 5의 뉴클레오티드 51 (SNP5), 즉, 감수성 반복친의 서열에서 다른 뉴클레오티드, 즉, 아데닌, 시토신 또는 티민 중 임의의 것을 포함한다. 이는 어느 반복친이 사용되었는 지에 의존한다. 한 측면에서, 이는 표 1에 지시된 바와 같이 SNP5에 대해 아데닌인데, 이는 이것이 본원에서 역교배에 사용된 반복친이었기 때문이다.
따라서, "SNP6" 또는 "SNP6 마커"는 본원에서 서열식별번호: 6의, 또는 서열식별번호: 6과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51을 지칭한다. 본원에서 SNP6에 대한 씨. 콜로신티스 공여자 뉴클레오티드, 즉, 서열식별번호: 6의 또는 서열식별번호: 6과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 티민 ('T')을 언급하는 경우, 서열식별번호: 6이 뉴클레오티드 51에서 공여자 뉴클레오티드 (즉, 티민)를 포함하기 때문에, 서열식별번호: 6 자체 (서열식별번호: 6의 위치 51에서 뉴클레오티드를 언급하지 않고), 또는 서열식별번호: 6과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 티민을 포함하는 서열을 동등하게 지칭할 수 있다. 따라서, CGMMV 저항성 씨. 콜로신티스 공여자로부터의 것인 유전자이입 단편을 포함하는 식물 또는 식물 세포는 SNP6에 대한 공여자 뉴클레오티드 (즉, 뉴클레오티드 51에서 티민)를 포함하거나, "서열식별번호: 6을 포함"하거나, "서열식별번호: 6과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서, 또는 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치에서 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 서열"을 포함할 수 있다. 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치는 예를 들어 뉴클레오티드 삽입 또는 결실로 인해 약간 상이한 위치일 수 있으며, 예를 들어 이는 뉴클레오티드 49, 50 또는 52 또는 53일 수 있다. 서열 동일성은 바람직하게는 예를 들어 엠보스 프로그램 '니들"을 사용하여 쌍별 정렬에 의해 측정된다. 동형접합성 형태의 SNP6에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우, 이배체 세포는 서열식별번호: 6의 (또는 서열식별번호: 6과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 2개의 카피, 즉, "TT" 유전자형을 포함한다. 삼배체 식물 또는 세포는 3개의 카피를 포함하고, 사배체 식물 또는 세포는 4개의 카피를 포함할 것이다. 마찬가지로, 이형접합성 형태의 SNP6에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우 (상동성 염색체의 쌍의 단지 1개의 염색체가 유전자이입을 가짐), 이배체 세포는 서열식별번호: 6의 (또는 서열식별번호: 6과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 1개의 카피를 포함한다. 유전자이입 단편이 결여된 다른 염색체는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 51 (SNP6), 즉, 감수성 반복친의 서열에서 다른 뉴클레오티드, 즉, 아데닌, 시토신 또는 구아닌 중 임의의 것을 포함한다. 이는 어느 반복친이 사용되었는 지에 의존한다. 한 측면에서, 이는 표 1에 지시된 바와 같이 SNP6에 대해 시토신인데, 이는 이것이 본원에서 역교배에 사용된 반복친이었기 때문이다.
서열식별번호: 1 (SNP1을 포함함), 서열식별번호: 2 (SNP2를 포함함), 서열식별번호: 3 (SNP3을 포함함), 서열식별번호: 4 (SNP4를 포함함), 서열식별번호: 5 (SNP5를 포함함) 및 서열식별번호: 6 (SNP6을 포함함)은 공여자의 염색체 1 상의 CGMMV 저항성 QTL1.1에 물리적으로 연결된다. 마커 SNP5는 가장 가깝게 연결된다. 따라서, 씨. 콜로신티스로부터의 CGMMV 저항성을 포함하는 유전자이입 단편은 SNP1, SNP2, SNP3, SNP4, SNP5 및 SNP6의 군의 SNP 마커 중 1종 이상 또는 전부에 대한 저항성 공여자 뉴클레오티드 (및 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 서열 또는 그와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 서열)를 포함하고, 보다 바람직하게는 이는 SNP4, SNP5 및 SNP6의 군으로부터 선택되는 SNP 마커 중 1종 이상 또는 전부에 대한 저항성 공여자 뉴클레오티드를 포함하고, 보다 바람직하게는 이는 SNP4 및/또는 SNP5에 대한 또는 SNP5 및/또는 SNP6에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하고, 보다 더 바람직하게는 이는 적어도 SNP5에 대한 저항성 공여자 뉴클레오티드 (및 따라서 서열식별번호: 5 또는 서열식별번호: 5와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 서열)를 포함한다. 바람직하게는 동형접합성 형태의 이러한 유전자이입 단편을 포함하는 재배된 수박 식물, 식물 세포 및 식물 부분은 본 발명의 측면이다.
따라서, "SNP7" 또는 "SNP7 마커"는 본원에서 서열식별번호: 7의, 또는 서열식별번호: 7과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51을 지칭한다. 본원에서 SNP7에 대한 씨. 콜로신티스 공여자 뉴클레오티드, 즉, 서열식별번호: 7의 또는 서열식별번호: 7과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 티민 ('T')을 언급하는 경우, 서열식별번호: 7이 뉴클레오티드 51에서 공여자 뉴클레오티드 (즉, 티민)를 포함하기 때문에, 서열식별번호: 7 자체 (서열식별번호: 7의 위치 51에서 뉴클레오티드를 언급하지 않고), 또는 서열식별번호: 7과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 티민을 포함하는 서열을 동등하게 지칭할 수 있다. 따라서, CGMMV 저항성 씨. 콜로신티스 공여자로부터의 것인 유전자이입 단편을 포함하는 식물 또는 식물 세포는 SNP7에 대한 공여자 뉴클레오티드 (즉, 뉴클레오티드 51에서 티민)를 포함하거나, "서열식별번호: 7을 포함"하거나, "서열식별번호: 7과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서, 또는 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치에서 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 서열"을 포함할 수 있다. 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치는 예를 들어 뉴클레오티드 삽입 또는 결실로 인해 약간 상이한 위치일 수 있으며, 예를 들어 이는 뉴클레오티드 49, 50 또는 52 또는 53일 수 있다. 서열 동일성은 바람직하게는 예를 들어 엠보스 프로그램 '니들"을 사용하여 쌍별 정렬에 의해 측정된다. 동형접합성 형태의 SNP7에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우, 이배체 세포는 서열식별번호: 7의 (또는 서열식별번호: 7과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 2개의 카피, 즉, "TT" 유전자형을 포함한다. 삼배체 식물 또는 세포는 3개의 카피를 포함하고, 사배체 식물 또는 세포는 4개의 카피를 포함할 것이다. 마찬가지로, 이형접합성 형태의 SNP7에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우 (상동성 염색체의 쌍의 단지 1개의 염색체가 유전자이입을 가짐), 이배체 세포는 서열식별번호: 7의 (또는 서열식별번호: 7과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 1개의 카피를 포함한다. 유전자이입 단편이 결여된 다른 염색체는 서열식별번호: 7의 뉴클레오티드 51 (SNP7), 즉, 감수성 반복친의 서열에서 다른 뉴클레오티드, 즉, 아데닌, 시토신 또는 구아닌 중 임의의 것을 포함한다. 이는 어느 반복친이 사용되었는 지에 의존한다. 한 측면에서, 이는 표 1에 지시된 바와 같이 SNP7에 대해 아데닌인데, 이는 이것이 본원에서 역교배에 사용된 반복친이었기 때문이다.
따라서, "SNP8" 또는 "SNP8 마커"는 본원에서 서열식별번호: 8의, 또는 서열식별번호: 8과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51을 지칭한다. 본원에서 SNP8에 대한 씨. 콜로신티스 공여자 뉴클레오티드, 즉, 서열식별번호: 8의 또는 서열식별번호: 8과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 시토신 ('C')을 언급하는 경우, 서열식별번호: 8이 뉴클레오티드 51에서 공여자 뉴클레오티드 (즉, 시토신)를 포함하기 때문에, 서열식별번호: 8 자체 (서열식별번호: 8의 위치 51에서 뉴클레오티드를 언급하지 않고), 또는 서열식별번호: 8과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 시토신을 포함하는 서열을 동등하게 지칭할 수 있다. 따라서, CGMMV 저항성 씨. 콜로신티스 공여자로부터의 것인 유전자이입 단편을 포함하는 식물 또는 식물 세포는 SNP8에 대한 공여자 뉴클레오티드 (즉, 뉴클레오티드 51에서 시토신)를 포함하거나, "서열식별번호: 8을 포함"하거나, "서열식별번호: 8과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서, 또는 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치에서 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 서열"을 포함한다. 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치는 예를 들어 뉴클레오티드 삽입 또는 결실로 인해 약간 상이한 위치일 수 있으며, 예를 들어 이는 뉴클레오티드 49, 50 또는 52 또는 53일 수 있다. 서열 동일성은 바람직하게는 예를 들어 엠보스 프로그램 '니들"을 사용하여 쌍별 정렬에 의해 측정된다. 동형접합성 형태의 SNP8에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우, 이배체 세포는 서열식별번호: 8의 (또는 서열식별번호: 8과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 2개의 카피, 즉, "CC" 유전자형을 포함한다. 삼배체 식물 또는 세포는 3개의 카피를 포함하고, 사배체 식물 또는 세포는 4개의 카피를 포함할 것이다. 마찬가지로, 이형접합성 형태의 SNP8에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우 (상동성 염색체의 쌍의 단지 1개의 염색체가 유전자이입을 가짐), 이배체 세포는 서열식별번호: 8의 (또는 서열식별번호: 8과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 1개의 카피를 포함한다. 유전자이입 단편이 결여된 다른 염색체는 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 51 (SNP8), 즉, 감수성 반복친의 서열에서 다른 뉴클레오티드, 즉, 아데닌, 구아닌 또는 티민 중 임의의 것을 포함한다. 이는 어느 반복친이 사용되었는 지에 의존한다. 한 측면에서, 이는 표 1에 지시된 바와 같이 SNP8에 대해 아데닌인데, 이는 이것이 본원에서 역교배에 사용된 반복친이었기 때문이다.
따라서, "SNP9" 또는 "SNP9 마커"는 본원에서 서열식별번호: 9의, 또는 서열식별번호: 9와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51을 지칭한다. 본원에서 SNP9에 대한 씨. 콜로신티스 공여자 뉴클레오티드, 즉, 서열식별번호: 9의 또는 서열식별번호: 9와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 아데닌 ('A')을 언급하는 경우, 서열식별번호: 9가 뉴클레오티드 51에서 공여자 뉴클레오티드 (즉, 아데닌)를 포함하기 때문에, 서열식별번호: 9 자체 (서열식별번호: 9의 위치 51에서 뉴클레오티드를 언급하지 않고), 또는 서열식별번호: 9와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 아데닌을 포함하는 서열을 동등하게 지칭할 수 있다. 따라서, CGMMV 저항성 씨. 콜로신티스 공여자로부터의 것인 유전자이입 단편을 포함하는 식물 또는 식물 세포는 SNP9에 대한 공여자 뉴클레오티드 (즉, 뉴클레오티드 51에서 아데닌)를 포함하거나, "서열식별번호: 9를 포함"하거나, "서열식별번호: 9와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서, 또는 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치에서 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 서열"을 포함할 수 있다. 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치는 예를 들어 뉴클레오티드 삽입 또는 결실로 인해 약간 상이한 위치일 수 있으며, 예를 들어 이는 뉴클레오티드 49, 50 또는 52 또는 53일 수 있다. 서열 동일성은 바람직하게는 예를 들어 엠보스 프로그램 '니들"을 사용하여 쌍별 정렬에 의해 측정된다. 동형접합성 형태의 SNP9에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우, 이배체 세포는 서열식별번호: 9의 (또는 서열식별번호: 9와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 2개의 카피, 즉, "AA" 유전자형을 포함한다. 삼배체 식물 또는 세포는 3개의 카피를 포함하고, 사배체 식물 또는 세포는 4개의 카피를 포함할 것이다. 마찬가지로, 이형접합성 형태의 SNP9에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우 (상동성 염색체의 쌍의 단지 1개의 염색체가 유전자이입을 가짐), 이배체 세포는 서열식별번호: 9의 (또는 서열식별번호: 9와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 1개의 카피를 포함한다. 유전자이입 단편이 결여된 다른 염색체는 서열식별번호: 9의 뉴클레오티드 51 (SNP9), 즉, 감수성 반복친의 서열에서 다른 뉴클레오티드, 즉, 시토신, 구아닌 또는 티민 중 임의의 것을 포함한다. 이는 어느 반복친이 사용되었는 지에 의존한다. 한 측면에서, 이는 표 1에 지시된 바와 같이 SNP9에 대해 구아닌인데, 이는 이것이 본원에서 역교배에 사용된 반복친이었기 때문이다.
서열식별번호: 7 (SNP7을 포함함), 서열식별번호: 8 (SNP8을 포함함) 및 서열식별번호: 9 (SNP9를 포함함)는 공여자의 염색체 4 상의 CGMMV 저항성 QTL4.1에 물리적으로 연결된다. 마커 SNP8은 가장 가깝게 연결된다. 따라서, 씨. 콜로신티스로부터의 CGMMV 저항성을 포함하는 유전자이입 단편은 한 측면에서 군 SNP7, SNP8 및 SNP9의 SNP 마커 중 1종 이상 또는 전부에 대한 저항성 공여자 뉴클레오티드 (및 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 서열 또는 그와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 서열)를 포함하고, 가장 바람직하게는 이는 SNP 마커 SNP7 및/또는 SNP8에 대한 또는 SNP8 및/또는 SNP9에 대한 저항성 공여자 뉴클레오티드를 포함하고, 심지어 가장 바람직하게는 이는 적어도 SNP8에 대한 저항성 공여자 뉴클레오티드 (및 따라서 서열식별번호: 8 또는 서열식별번호: 8과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 서열)를 포함한다. 바람직하게는 동형접합성 형태의 이러한 유전자이입 단편을 포함하는 재배된 수박 식물, 식물 세포 및 식물 부분은 본 발명의 측면이다.
따라서, "SNP10" 또는 "SNP10 마커"는 본원에서 서열식별번호: 10의, 또는 서열식별번호: 10과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51을 지칭한다. 본원에서 SNP10에 대한 씨. 콜로신티스 공여자 뉴클레오티드, 즉, 서열식별번호: 10의 또는 서열식별번호: 10과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 티민 ('T')을 언급하는 경우, 서열식별번호: 10이 뉴클레오티드 51에서 공여자 뉴클레오티드 (즉, 티민)를 포함하기 때문에, 서열식별번호: 10 자체 (서열식별번호: 10의 위치 51에서 뉴클레오티드를 언급하지 않고), 또는 서열식별번호: 10과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 티민을 포함하는 서열을 동등하게 지칭할 수 있다. 따라서, CGMMV 저항성 씨. 콜로신티스 공여자로부터의 것인 유전자이입 단편을 포함하는 식물 또는 식물 세포는 SNP10에 대한 공여자 뉴클레오티드 (즉, 뉴클레오티드 51에서 티민)를 포함하거나, "서열식별번호: 10을 포함"하거나, "서열식별번호: 10과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서, 또는 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치에서 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 서열"을 포함할 수 있다. 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치는 예를 들어 뉴클레오티드 삽입 또는 결실로 인해 약간 상이한 위치일 수 있으며, 예를 들어 이는 뉴클레오티드 49, 50 또는 52 또는 53일 수 있다. 서열 동일성은 바람직하게는 예를 들어 엠보스 프로그램 '니들"을 사용하여 쌍별 정렬에 의해 측정된다. 동형접합성 형태의 SNP10에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우, 이배체 세포는 서열식별번호: 10의 (또는 서열식별번호: 10과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 2개의 카피, 즉, "TT" 유전자형을 포함한다. 삼배체 식물 또는 세포는 3개의 카피를 포함하고, 사배체 식물 또는 세포는 4개의 카피를 포함할 것이다. 마찬가지로, 이형접합성 형태의 SNP10에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우 (상동성 염색체의 쌍의 단지 1개의 염색체가 유전자이입을 가짐), 이배체 세포는 서열식별번호: 10의 (또는 서열식별번호: 10과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 1개의 카피를 포함한다. 유전자이입 단편이 결여된 다른 염색체는 서열식별번호: 10의 뉴클레오티드 51 (SNP10), 즉, 감수성 반복친의 서열에서 다른 뉴클레오티드, 즉, 아데닌, 시토신 또는 구아닌 중 임의의 것을 포함한다. 이는 어느 반복친이 사용되었는 지에 의존한다. 한 측면에서, 이는 표 1에 지시된 바와 같이 SNP10에 대해 시토신인데, 이는 이것이 본원에서 역교배에 사용된 반복친이었기 때문이다.
따라서, "SNP11" 또는 "SNP11 마커"는 본원에서 서열식별번호: 11의, 또는 서열식별번호: 11과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51을 지칭한다. 본원에서 SNP11에 대한 씨. 콜로신티스 공여자 뉴클레오티드, 즉, 서열식별번호: 11의 또는 서열식별번호: 11과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 아데닌 ('A')을 언급하는 경우, 서열식별번호: 11이 뉴클레오티드 51에서 공여자 뉴클레오티드 (즉, 아데닌)를 포함하기 때문에, 서열식별번호: 11 자체 (서열식별번호: 11의 위치 51에서 뉴클레오티드를 언급하지 않고), 또는 서열식별번호: 11과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 아데닌을 포함하는 서열을 동등하게 지칭할 수 있다. 따라서, CGMMV 저항성 씨. 콜로신티스 공여자로부터의 것인 유전자이입 단편을 포함하는 식물 또는 식물 세포는 SNP11에 대한 공여자 뉴클레오티드 (즉, 뉴클레오티드 51에서 아데닌)를 포함하거나, "서열식별번호: 11을 포함"하거나, "서열식별번호: 11과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서, 또는 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치에서 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 서열"을 포함할 수 있다. 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치는 예를 들어 뉴클레오티드 삽입 또는 결실로 인해 약간 상이한 위치일 수 있으며, 예를 들어 이는 뉴클레오티드 49, 50 또는 52 또는 53일 수 있다. 서열 동일성은 바람직하게는 예를 들어 엠보스 프로그램 '니들"을 사용하여 쌍별 정렬에 의해 측정된다. 동형접합성 형태의 SNP11에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우, 이배체 세포는 서열식별번호: 11의 (또는 서열식별번호: 11과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 2개의 카피, 즉, "AA" 유전자형을 포함한다. 삼배체 식물 또는 세포는 3개의 카피를 포함하고, 사배체 식물 또는 세포는 4개의 카피를 포함할 것이다. 마찬가지로, 이형접합성 형태의 SNP11에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우 (상동성 염색체의 쌍의 단지 1개의 염색체가 유전자이입을 가짐), 이배체 세포는 서열식별번호: 11의 (또는 서열식별번호: 11과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 1개의 카피를 포함한다. 유전자이입 단편이 결여된 다른 염색체는 서열식별번호: 11의 뉴클레오티드 51 (SNP11), 즉, 감수성 반복친의 서열에서 다른 뉴클레오티드, 즉, 시토신, 구아닌 또는 티민 중 임의의 것을 포함한다. 이는 어느 반복친이 사용되었는 지에 의존한다. 한 측면에서, 이는 표 1에 지시된 바와 같이 SNP11에 대해 구아닌인데, 이는 이것이 본원에서 역교배에 사용된 반복친이었기 때문이다.
따라서, "SNP12" 또는 "SNP12 마커"는 본원에서 서열식별번호: 12의, 또는 서열식별번호: 12와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51을 지칭한다. 본원에서 SNP12에 대한 씨. 콜로신티스 공여자 뉴클레오티드, 즉, 서열식별번호: 12의 또는 서열식별번호: 12와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 티민 ('T')을 언급하는 경우, 서열식별번호: 12가 뉴클레오티드 51에서 공여자 뉴클레오티드 (즉, 티민)를 포함하기 때문에, 서열식별번호: 12 자체 (서열식별번호: 12의 위치 51에서 뉴클레오티드를 언급하지 않고), 또는 서열식별번호: 12와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 티민을 포함하는 서열을 동등하게 지칭할 수 있다. 따라서, CGMMV 저항성 씨. 콜로신티스 공여자로부터의 것인 유전자이입 단편을 포함하는 식물 또는 식물 세포는 SNP12에 대한 공여자 뉴클레오티드 (즉, 뉴클레오티드 51에서 티민)를 포함하거나, "서열식별번호: 12를 포함"하거나, "서열식별번호: 12와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서, 또는 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치에서 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 서열"을 포함할 수 있다. 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치는 예를 들어 뉴클레오티드 삽입 또는 결실로 인해 약간 상이한 위치일 수 있으며, 예를 들어 이는 뉴클레오티드 49, 50 또는 52 또는 53일 수 있다. 서열 동일성은 바람직하게는 예를 들어 엠보스 프로그램 '니들"을 사용하여 쌍별 정렬에 의해 측정된다. 동형접합성 형태의 SNP12에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우, 이배체 세포는 서열식별번호: 12의 (또는 서열식별번호: 12와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 2개의 카피, 즉, "TT" 유전자형을 포함한다. 삼배체 식물 또는 세포는 3개의 카피를 포함하고, 사배체 식물 또는 세포는 4개의 카피를 포함할 것이다. 마찬가지로, 이형접합성 형태의 SNP12에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우 (상동성 염색체의 쌍의 단지 1개의 염색체가 유전자이입을 가짐), 이배체 세포는 서열식별번호: 12의 (또는 서열식별번호: 12와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 1개의 카피를 포함한다. 유전자이입 단편이 결여된 다른 염색체는 서열식별번호: 12의 뉴클레오티드 51 (SNP12), 즉, 감수성 반복친의 서열에서 다른 뉴클레오티드, 즉, 아데닌, 시토신 또는 구아닌 중 임의의 것을 포함한다. 이는 어느 반복친이 사용되었는 지에 의존한다. 한 측면에서, 이는 표 1에 지시된 바와 같이 SNP12에 대해 시토신인데, 이는 이것이 본원에서 역교배에 사용된 반복친이었기 때문이다.
서열식별번호: 10 (SNP10을 포함함), 서열식별번호: 11 (SNP11을 포함함) 및 서열식별번호: 12 (SNP12를 포함함)는 공여자의 염색체 5 상의 CGMMV 저항성 QTL5.2에 연결된다. 마커 SNP11은 가장 가깝게 연결된다. 따라서, 씨. 콜로신티스로부터의 CGMMV 저항성을 포함하는 유전자이입 단편은 한 측면에서 군 SNP10, SNP11 및 SNP12의 SNP 마커 중 1종 이상 또는 전부에 대한 저항성 공여자 뉴클레오티드 (및 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 서열 또는 그와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 서열)를 포함하고, 가장 바람직하게는 이는 SNP 마커 SNP10 및/또는 SNP11에 대한 또는 SNP11 및/또는 SNP12에 대한 저항성 공여자 뉴클레오티드를 포함하고, 심지어 가장 바람직하게는 이는 적어도 SNP11에 대한 저항성 공여자 뉴클레오티드 (및 따라서 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 11과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 서열)를 포함한다. 바람직하게는 동형접합성 형태의 이러한 유전자이입 단편을 포함하는 재배된 수박 식물, 식물 세포 및 식물 부분은 본 발명의 측면이다.
따라서, "SNP13" 또는 "SNP13 마커"는 본원에서 서열식별번호: 13의, 또는 서열식별번호: 13과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51을 지칭한다. 본원에서 SNP13에 대한 씨. 콜로신티스 공여자 뉴클레오티드, 즉, 서열식별번호: 13의 또는 서열식별번호: 13과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 아데닌 ('A')을 언급하는 경우, 서열식별번호: 13이 뉴클레오티드 51에서 공여자 뉴클레오티드 (즉, 아데닌)를 포함하기 때문에, 서열식별번호: 13 자체 (서열식별번호: 13의 위치 51에서 뉴클레오티드를 언급하지 않고), 또는 서열식별번호: 13과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 아데닌을 포함하는 서열을 동등하게 지칭할 수 있다. 따라서, CGMMV 저항성 씨. 콜로신티스 공여자로부터의 것인 유전자이입 단편을 포함하는 식물 또는 식물 세포는 SNP13에 대한 공여자 뉴클레오티드 (즉, 뉴클레오티드 51에서 아데닌)를 포함하거나, "서열식별번호: 13을 포함"하거나, "서열식별번호: 13과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서, 또는 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치에서 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 서열"을 포함할 수 있다. 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치는 예를 들어 뉴클레오티드 삽입 또는 결실로 인해 약간 상이한 위치일 수 있으며, 예를 들어 이는 뉴클레오티드 49, 50 또는 52 또는 53일 수 있다. 서열 동일성은 바람직하게는 예를 들어 엠보스 프로그램 '니들"을 사용하여 쌍별 정렬에 의해 측정된다. 동형접합성 형태의 SNP13에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우, 이배체 세포는 서열식별번호: 13의 (또는 서열식별번호: 13과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 2개의 카피, 즉, "AA" 유전자형을 포함한다. 삼배체 식물 또는 세포는 3개의 카피를 포함하고, 사배체 식물 또는 세포는 4개의 카피를 포함할 것이다. 마찬가지로, 이형접합성 형태의 SNP13에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우 (상동성 염색체의 쌍의 단지 1개의 염색체가 유전자이입을 가짐), 이배체 세포는 서열식별번호: 13의 (또는 서열식별번호: 13과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 1개의 카피를 포함한다. 유전자이입 단편이 결여된 다른 염색체는 서열식별번호: 13의 뉴클레오티드 51 (SNP13), 즉, 감수성 반복친의 서열에서 다른 뉴클레오티드, 즉, 시토신, 구아닌 또는 티민 중 임의의 것을 포함한다. 이는 어느 반복친이 사용되었는 지에 의존한다. 한 측면에서, 이는 표 1에 지시된 바와 같이 SNP13에 대해 구아닌인데, 이는 이것이 본원에서 역교배에 사용된 반복친이었기 때문이다.
따라서, "SNP14" 또는 "SNP14 마커"는 본원에서 서열식별번호: 14의, 또는 서열식별번호: 14와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51을 지칭한다. 본원에서 SNP14에 대한 씨. 콜로신티스 공여자 뉴클레오티드, 즉, 서열식별번호: 14의 또는 서열식별번호: 14와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 아데닌 ('A')을 언급하는 경우, 서열식별번호: 14가 뉴클레오티드 51에서 공여자 뉴클레오티드 (즉, 아데닌)를 포함하기 때문에, 서열식별번호: 14 자체 (서열식별번호: 14의 위치 51에서 뉴클레오티드를 언급하지 않고), 또는 서열식별번호: 14와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 아데닌을 포함하는 서열을 동등하게 지칭할 수 있다. 따라서, CGMMV 저항성 씨. 콜로신티스 공여자로부터의 것인 유전자이입 단편을 포함하는 식물 또는 식물 세포는 SNP14에 대한 공여자 뉴클레오티드 (즉, 뉴클레오티드 51에서 아데닌)를 포함하거나, "서열식별번호: 14를 포함"하거나, "서열식별번호: 14와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서, 또는 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치에서 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 서열"을 포함할 수 있다. 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치는 예를 들어 뉴클레오티드 삽입 또는 결실로 인해 약간 상이한 위치일 수 있으며, 예를 들어 이는 뉴클레오티드 49, 50 또는 52 또는 53일 수 있다. 서열 동일성은 바람직하게는 예를 들어 엠보스 프로그램 '니들"을 사용하여 쌍별 정렬에 의해 측정된다. 동형접합성 형태의 SNP14에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우, 이배체 세포는 서열식별번호: 14의 (또는 서열식별번호: 14와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 2개의 카피, 즉, "AA" 유전자형을 포함한다. 삼배체 식물 또는 세포는 3개의 카피를 포함하고, 사배체 식물 또는 세포는 4개의 카피를 포함할 것이다. 마찬가지로, 이형접합성 형태의 SNP14에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우 (상동성 염색체의 쌍의 단지 1개의 염색체가 유전자이입을 가짐), 이배체 세포는 서열식별번호: 14의 (또는 서열식별번호: 14와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 1개의 카피를 포함한다. 유전자이입 단편이 결여된 다른 염색체는 서열식별번호: 14의 뉴클레오티드 51 (SNP14), 즉, 감수성 반복친의 서열에서 다른 뉴클레오티드, 즉, 시토신, 구아닌 또는 티민 중 임의의 것을 포함한다. 이는 어느 반복친이 사용되었는 지에 의존한다. 한 측면에서, 이는 표 1에 지시된 바와 같이 SNP14에 대해 구아닌인데, 이는 이것이 본원에서 역교배에 사용된 반복친이었기 때문이다.
따라서, "SNP15" 또는 "SNP15 마커"는 본원에서 서열식별번호: 15의, 또는 서열식별번호: 15와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51을 지칭한다. 본원에서 SNP15에 대한 씨. 콜로신티스 공여자 뉴클레오티드, 즉, 서열식별번호: 15의 또는 서열식별번호: 15와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 구아닌 ('G')을 언급하는 경우, 서열식별번호: 15가 뉴클레오티드 51에서 공여자 뉴클레오티드 (즉, 구아닌)를 포함하기 때문에, 서열식별번호: 15 자체 (서열식별번호: 15의 위치 51에서 뉴클레오티드를 언급하지 않고), 또는 서열식별번호: 15와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 구아닌을 포함하는 서열을 동등하게 지칭할 수 있다. 따라서, CGMMV 저항성 씨. 콜로신티스 공여자로부터의 것인 유전자이입 단편을 포함하는 식물 또는 식물 세포는 SNP15에 대한 공여자 뉴클레오티드 (즉, 뉴클레오티드 51에서 구아닌)를 포함하거나, "서열식별번호: 15를 포함"하거나, "서열식별번호: 15와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서, 또는 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치에서 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 서열"을 포함할 수 있다. 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치는 예를 들어 뉴클레오티드 삽입 또는 결실로 인해 약간 상이한 위치일 수 있으며, 예를 들어 이는 뉴클레오티드 49, 50 또는 52 또는 53일 수 있다. 서열 동일성은 바람직하게는 예를 들어 엠보스 프로그램 '니들"을 사용하여 쌍별 정렬에 의해 측정된다. 동형접합성 형태의 SNP15에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우, 이배체 세포는 서열식별번호: 15의 (또는 서열식별번호: 15와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 2개의 카피, 즉, "GG" 유전자형을 포함한다. 삼배체 식물 또는 세포는 3개의 카피를 포함하고, 사배체 식물 또는 세포는 4개의 카피를 포함할 것이다. 마찬가지로, 이형접합성 형태의 SNP15에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우 (상동성 염색체의 쌍의 단지 1개의 염색체가 유전자이입을 가짐), 이배체 세포는 서열식별번호: 15의 (또는 서열식별번호: 15와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 1개의 카피를 포함한다. 유전자이입 단편이 결여된 다른 염색체는 서열식별번호: 15의 뉴클레오티드 51 (SNP15), 즉, 감수성 반복친의 서열에서 다른 뉴클레오티드, 즉, 아데닌, 시토신 또는 티민 중 임의의 것을 포함한다. 이는 어느 반복친이 사용되었는 지에 의존한다. 한 측면에서, 이는 표 1에 지시된 바와 같이 SNP15에 대해 아데닌인데, 이는 이것이 본원에서 역교배에 사용된 반복친이었기 때문이다.
따라서, "SNP16" 또는 "SNP16 마커"는 본원에서 서열식별번호: 16의, 또는 서열식별번호: 16과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51을 지칭한다. 본원에서 SNP16에 대한 씨. 콜로신티스 공여자 뉴클레오티드, 즉, 서열식별번호: 16의 또는 서열식별번호: 16과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 구아닌 ('G')을 언급하는 경우, 서열식별번호: 16이 뉴클레오티드 51에서 공여자 뉴클레오티드 (즉, 구아닌)를 포함하기 때문에, 서열식별번호: 16 자체 (서열식별번호: 16의 위치 51에서 뉴클레오티드를 언급하지 않고), 또는 서열식별번호: 16과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 구아닌을 포함하는 서열을 동등하게 지칭할 수 있다. 따라서, CGMMV 저항성 씨. 콜로신티스 공여자로부터의 것인 유전자이입 단편을 포함하는 식물 또는 식물 세포는 SNP16에 대한 공여자 뉴클레오티드 (즉, 뉴클레오티드 51에서 구아닌)를 포함하거나, "서열식별번호: 16을 포함"하거나, "서열식별번호: 16과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서, 또는 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치에서 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 서열"을 포함할 수 있다. 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치는 예를 들어 뉴클레오티드 삽입 또는 결실로 인해 약간 상이한 위치일 수 있으며, 예를 들어 이는 뉴클레오티드 49, 50 또는 52 또는 53일 수 있다. 서열 동일성은 바람직하게는 예를 들어 엠보스 프로그램 '니들"을 사용하여 쌍별 정렬에 의해 측정된다. 동형접합성 형태의 SNP16에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우, 이배체 세포는 서열식별번호: 16의 (또는 서열식별번호: 16과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 2개의 카피, 즉, "GG" 유전자형을 포함한다. 삼배체 식물 또는 세포는 3개의 카피를 포함하고, 사배체 식물 또는 세포는 4개의 카피를 포함할 것이다. 마찬가지로, 이형접합성 형태의 SNP16에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우 (상동성 염색체의 쌍의 단지 1개의 염색체가 유전자이입을 가짐), 이배체 세포는 서열식별번호: 16의 (또는 서열식별번호: 16과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 1개의 카피를 포함한다. 유전자이입 단편이 결여된 다른 염색체는 서열식별번호: 16의 뉴클레오티드 51 (SNP16), 즉, 감수성 반복친의 서열에서 다른 뉴클레오티드, 즉, 아데닌, 시토신 또는 티민 중 임의의 것을 포함한다. 이는 어느 반복친이 사용되었는 지에 의존한다. 한 측면에서, 이는 표 1에 지시된 바와 같이 SNP16에 대해 티민인데, 이는 이것이 본원에서 역교배에 사용된 반복친이었기 때문이다.
따라서, "SNP17" 또는 "SNP17 마커"는 본원에서 서열식별번호: 17의, 또는 서열식별번호: 17과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51을 지칭한다. 본원에서 SNP17에 대한 씨. 콜로신티스 공여자 뉴클레오티드, 즉, 서열식별번호: 17의 또는 서열식별번호: 17과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 티민 ('T')을 언급하는 경우, 서열식별번호: 17이 뉴클레오티드 51에서 공여자 뉴클레오티드 (즉, 티민)를 포함하기 때문에, 서열식별번호: 17 자체 (서열식별번호: 17의 위치 51에서 뉴클레오티드를 언급하지 않고), 또는 서열식별번호: 17과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 티민을 포함하는 서열을 동등하게 지칭할 수 있다. 따라서, CGMMV 저항성 씨. 콜로신티스 공여자로부터의 것인 유전자이입 단편을 포함하는 식물 또는 식물 세포는 SNP17에 대한 공여자 뉴클레오티드 (즉, 뉴클레오티드 51에서 티민)를 포함하거나, "서열식별번호: 17을 포함"하거나, "서열식별번호: 17과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서, 또는 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치에서 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 서열"을 포함할 수 있다. 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치는 예를 들어 뉴클레오티드 삽입 또는 결실로 인해 약간 상이한 위치일 수 있으며, 예를 들어 이는 뉴클레오티드 49, 50 또는 52 또는 53일 수 있다. 서열 동일성은 바람직하게는 예를 들어 엠보스 프로그램 '니들"을 사용하여 쌍별 정렬에 의해 측정된다. 동형접합성 형태의 SNP17에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우, 이배체 세포는 서열식별번호: 17의 (또는 서열식별번호: 17과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 2개의 카피, 즉, "TT" 유전자형을 포함한다. 삼배체 식물 또는 세포는 3개의 카피를 포함하고, 사배체 식물 또는 세포는 4개의 카피를 포함할 것이다. 마찬가지로, 이형접합성 형태의 SNP17에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우 (상동성 염색체의 쌍의 단지 1개의 염색체가 유전자이입을 가짐), 이배체 세포는 서열식별번호: 17의 (또는 서열식별번호: 17과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 1개의 카피를 포함한다. 유전자이입 단편이 결여된 다른 염색체는 서열식별번호: 17의 뉴클레오티드 51 (SNP17), 즉, 감수성 반복친의 서열에서 다른 뉴클레오티드, 즉, 아데닌, 시토신 또는 구아닌 중 임의의 것을 포함한다. 이는 어느 반복친이 사용되었는 지에 의존한다. 한 측면에서, 이는 표 1에 지시된 바와 같이 SNP17에 대해 시토신인데, 이는 이것이 본원에서 역교배에 사용된 반복친이었기 때문이다.
따라서, "SNP18" 또는 "SNP18 마커"는 본원에서 서열식별번호: 18의, 또는 서열식별번호: 18과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51을 지칭한다. 본원에서 SNP18에 대한 씨. 콜로신티스 공여자 뉴클레오티드, 즉, 서열식별번호: 18의 또는 서열식별번호: 18과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 아데닌 ('A')을 언급하는 경우, 서열식별번호: 18이 뉴클레오티드 51에서 공여자 뉴클레오티드 (즉, 아데닌)를 포함하기 때문에, 서열식별번호: 18 자체 (서열식별번호: 18의 위치 51에서 뉴클레오티드를 언급하지 않고), 또는 서열식별번호: 18과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 아데닌을 포함하는 서열을 동등하게 지칭할 수 있다. 따라서, CGMMV 저항성 씨. 콜로신티스 공여자로부터의 것인 유전자이입 단편을 포함하는 식물 또는 식물 세포는 SNP18에 대한 공여자 뉴클레오티드 (즉, 뉴클레오티드 51에서 아데닌)를 포함하거나, "서열식별번호: 18을 포함"하거나, "서열식별번호: 18과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서, 또는 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치에서 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 서열"을 포함할 수 있다. 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치는 예를 들어 뉴클레오티드 삽입 또는 결실로 인해 약간 상이한 위치일 수 있으며, 예를 들어 이는 뉴클레오티드 49, 50 또는 52 또는 53일 수 있다. 서열 동일성은 바람직하게는 예를 들어 엠보스 프로그램 '니들"을 사용하여 쌍별 정렬에 의해 측정된다. 동형접합성 형태의 SNP18에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우, 이배체 세포는 서열식별번호: 18의 (또는 서열식별번호: 18과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 2개의 카피, 즉, "AA" 유전자형을 포함한다. 삼배체 식물 또는 세포는 3개의 카피를 포함하고, 사배체 식물 또는 세포는 4개의 카피를 포함할 것이다. 마찬가지로, 이형접합성 형태의 SNP18에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우 (상동성 염색체의 쌍의 단지 1개의 염색체가 유전자이입을 가짐), 이배체 세포는 서열식별번호: 18의 (또는 서열식별번호: 18과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 1개의 카피를 포함한다. 유전자이입 단편이 결여된 다른 염색체는 서열식별번호: 18의 뉴클레오티드 51 (SNP18), 즉, 감수성 반복친의 서열에서 다른 뉴클레오티드, 즉, 시토신, 구아닌 또는 티민 중 임의의 것을 포함한다. 이는 어느 반복친이 사용되었는 지에 의존한다. 한 측면에서, 이는 표 1에 지시된 바와 같이 SNP18에 대해 구아닌인데, 이는 이것이 본원에서 역교배에 사용된 반복친이었기 때문이다.
서열식별번호: 13 (SNP13을 포함함), 서열식별번호: 14 (SNP14를 포함함), 서열식별번호: 15 (SNP15를 포함함), 서열식별번호: 16 (SNP16을 포함함), 서열식별번호: 17 (SNP17을 포함함) 및 서열식별번호: 18 (SNP18을 포함함)은 공여자의 염색체 7 상의 CGMMV 저항성 QTL7.1에 물리적으로 연결된다. 마커 SNP14는 가장 가깝게 연결된다. 따라서, 씨. 콜로신티스로부터의 CGMMV 저항성을 포함하는 유전자이입 단편은 SNP13, SNP14, SNP15, SNP16, SNP17 및 SNP18의 군의 SNP 마커 중 1종 이상 또는 전부에 대한 저항성 공여자 뉴클레오티드 (및 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 서열 또는 그와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 서열)를 포함하고, 보다 바람직하게는 이는 SNP13, SNP14 및 SNP15의 군으로부터 선택되는 SNP 마커 중 1종 이상 또는 전부에 대한 저항성 공여자 뉴클레오티드를 포함하고, 보다 바람직하게는 이는 SNP13 및/또는 SNP14에 대한 또는 SNP14 및/또는 SNP15에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하고, 보다 더 바람직하게는 이는 적어도 SNP14에 대한 저항성 공여자 뉴클레오티드 (및 따라서 서열식별번호: 14 또는 서열식별번호: 14와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 서열)를 포함한다. 이형접합성 또는 동형접합성 형태의 이러한 유전자이입 단편을 포함하는 재배된 수박 식물, 식물 세포 및 식물 부분은 본 발명의 측면이다.
또한, "SNP19" 또는 "SNP19 마커"는 본원에서 서열식별번호: 19의, 또는 서열식별번호: 19와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51을 지칭한다. 본원에서 SNP19에 대한 씨. 콜로신티스 공여자 뉴클레오티드, 즉, 서열식별번호: 19의 또는 서열식별번호: 19와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 시토신 ('C')을 언급하는 경우, 서열식별번호: 19가 뉴클레오티드 51에서 공여자 뉴클레오티드 (즉, 시토신)를 포함하기 때문에, 서열식별번호: 19 자체 (서열식별번호: 19의 위치 51에서 뉴클레오티드를 언급하지 않고), 또는 서열식별번호: 19와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 시토신을 포함하는 서열을 동등하게 지칭할 수 있다. 따라서, CGMMV 저항성 씨. 콜로신티스 공여자로부터의 것인 유전자이입 단편을 포함하는 식물 또는 식물 세포는 SNP19에 대한 공여자 뉴클레오티드 (즉, 뉴클레오티드 51에서 시토신)를 포함하거나, "서열식별번호: 19를 포함"하거나, "서열식별번호: 19와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서, 또는 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치에서 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 서열"을 포함할 수 있다. 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치는 예를 들어 뉴클레오티드 삽입 또는 결실로 인해 약간 상이한 위치일 수 있으며, 예를 들어 이는 뉴클레오티드 49, 50 또는 52 또는 53일 수 있다. 서열 동일성은 바람직하게는 예를 들어 엠보스 프로그램 '니들"을 사용하여 쌍별 정렬에 의해 측정된다. 동형접합성 형태의 SNP19에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우, 이배체 세포는 서열식별번호: 19의 (또는 서열식별번호: 19와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 2개의 카피, 즉, "CC" 유전자형을 포함한다. 삼배체 식물 또는 세포는 3개의 카피를 포함하고, 사배체 식물 또는 세포는 4개의 카피를 포함할 것이다. 마찬가지로, 이형접합성 형태의 SNP19에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우 (상동성 염색체의 쌍의 단지 1개의 염색체가 유전자이입을 가짐), 이배체 세포는 서열식별번호: 19의 (또는 서열식별번호: 19와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 1개의 카피를 포함한다. 유전자이입 단편이 결여된 다른 염색체는 서열식별번호: 19의 뉴클레오티드 51 (SNP19), 즉, 감수성 반복친의 서열에서 다른 뉴클레오티드, 즉, 아데닌, 구아닌 또는 티민 중 임의의 것을 포함한다. 이는 어느 반복친이 사용되었는 지에 의존한다. 한 측면에서, 이는 표 1에 지시된 바와 같이 SNP19에 대해 티민인데, 이는 이것이 본원에서 역교배에 사용된 반복친이었기 때문이다.
따라서, "SNP20" 또는 "SNP20 마커"는 본원에서 서열식별번호: 20의, 또는 서열식별번호: 20과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51을 지칭한다. 본원에서 SNP20에 대한 씨. 콜로신티스 공여자 뉴클레오티드, 즉, 서열식별번호: 20의 또는 서열식별번호: 20과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 구아닌 ('G')을 언급하는 경우, 서열식별번호: 20이 뉴클레오티드 51에서 공여자 뉴클레오티드 (즉, 구아닌)를 포함하기 때문에, 서열식별번호: 20 자체 (서열식별번호: 20의 위치 51에서 뉴클레오티드를 언급하지 않고), 또는 서열식별번호: 20과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 구아닌을 포함하는 서열을 동등하게 지칭할 수 있다. 따라서, CGMMV 저항성 씨. 콜로신티스 공여자로부터의 것인 유전자이입 단편을 포함하는 식물 또는 식물 세포는 SNP20에 대한 공여자 뉴클레오티드 (즉, 뉴클레오티드 51에서 구아닌)를 포함하거나, "서열식별번호: 20을 포함"하거나, "서열식별번호: 20과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서, 또는 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치에서 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 서열"을 포함할 수 있다. 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치는 예를 들어 뉴클레오티드 삽입 또는 결실로 인해 약간 상이한 위치일 수 있으며, 예를 들어 이는 뉴클레오티드 49, 50 또는 52 또는 53일 수 있다. 서열 동일성은 바람직하게는 예를 들어 엠보스 프로그램 '니들"을 사용하여 쌍별 정렬에 의해 측정된다. 동형접합성 형태의 SNP20에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우, 이배체 세포는 서열식별번호: 20의 (또는 서열식별번호: 20과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 2개의 카피, 즉, "GG" 유전자형을 포함한다. 삼배체 식물 또는 세포는 3개의 카피를 포함하고, 사배체 식물 또는 세포는 4개의 카피를 포함할 것이다. 마찬가지로, 이형접합성 형태의 SNP20에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우 (상동성 염색체의 쌍의 단지 1개의 염색체가 유전자이입을 가짐), 이배체 세포는 서열식별번호: 20의 (또는 서열식별번호: 20과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 1개의 카피를 포함한다. 유전자이입 단편이 결여된 다른 염색체는 서열식별번호: 20의 뉴클레오티드 51 (SNP20), 즉, 감수성 반복친의 서열에서 다른 뉴클레오티드, 즉, 아데닌, 시토신 또는 티민 중 임의의 것을 포함한다. 이는 어느 반복친이 사용되었는 지에 의존한다. 한 측면에서, 이는 표 1에 지시된 바와 같이 SNP20에 대해 시토신인데, 이는 이것이 본원에서 역교배에 사용된 반복친이었기 때문이다.
따라서, "SNP21" 또는 "SNP21 마커"는 본원에서 서열식별번호: 21의, 또는 서열식별번호: 21과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51을 지칭한다. 본원에서 SNP21에 대한 씨. 콜로신티스 공여자 뉴클레오티드, 즉, 서열식별번호: 21의 또는 서열식별번호: 21과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 구아닌 ('G')을 언급하는 경우, 서열식별번호: 21이 뉴클레오티드 51에서 공여자 뉴클레오티드 (즉, 구아닌)를 포함하기 때문에, 서열식별번호: 21 자체 (서열식별번호: 21의 위치 51에서 뉴클레오티드를 언급하지 않고), 또는 서열식별번호: 21과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 구아닌을 포함하는 서열을 동등하게 지칭할 수 있다. 따라서, CGMMV 저항성 씨. 콜로신티스 공여자로부터의 것인 유전자이입 단편을 포함하는 식물 또는 식물 세포는 SNP21에 대한 공여자 뉴클레오티드 (즉, 뉴클레오티드 51에서 구아닌)를 포함하거나, "서열식별번호: 21을 포함"하거나, "서열식별번호: 21과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서, 또는 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치에서 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 서열"을 포함할 수 있다. 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치는 예를 들어 뉴클레오티드 삽입 또는 결실로 인해 약간 상이한 위치일 수 있으며, 예를 들어 이는 뉴클레오티드 49, 50 또는 52 또는 53일 수 있다. 서열 동일성은 바람직하게는 예를 들어 엠보스 프로그램 '니들"을 사용하여 쌍별 정렬에 의해 측정된다. 동형접합성 형태의 SNP21에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우, 이배체 세포는 서열식별번호: 21의 (또는 서열식별번호: 21과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 2개의 카피, 즉, "GG" 유전자형을 포함한다. 삼배체 식물 또는 세포는 3개의 카피를 포함하고, 사배체 식물 또는 세포는 4개의 카피를 포함할 것이다. 마찬가지로, 이형접합성 형태의 SNP21에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우 (상동성 염색체의 쌍의 단지 1개의 염색체가 유전자이입을 가짐), 이배체 세포는 서열식별번호: 21의 (또는 서열식별번호: 21과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 1개의 카피를 포함한다. 유전자이입 단편이 결여된 다른 염색체는 서열식별번호: 21의 뉴클레오티드 51 (SNP21), 즉, 감수성 반복친의 서열에서 다른 뉴클레오티드, 즉, 아데닌, 시토신 또는 티민 중 임의의 것을 포함한다. 이는 어느 반복친이 사용되었는 지에 의존한다. 한 측면에서, 이는 표 1에 지시된 바와 같이 SNP21에 대해 아데닌인데, 이는 이것이 본원에서 역교배에 사용된 반복친이었기 때문이다.
따라서, "SNP22" 또는 "SNP22 마커"는 본원에서 서열식별번호: 22의, 또는 서열식별번호: 22와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51을 지칭한다. 본원에서 SNP22에 대한 씨. 콜로신티스 공여자 뉴클레오티드, 즉, 서열식별번호: 22의 또는 서열식별번호: 22와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 시토신 ('C')을 언급하는 경우, 서열식별번호: 22가 뉴클레오티드 51에서 공여자 뉴클레오티드 (즉, 시토신)를 포함하기 때문에, 서열식별번호: 22 자체 (서열식별번호: 22의 위치 51에서 뉴클레오티드를 언급하지 않고), 또는 서열식별번호: 22와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 시토신을 포함하는 서열을 동등하게 지칭할 수 있다. 따라서, CGMMV 저항성 씨. 콜로신티스 공여자로부터의 것인 유전자이입 단편을 포함하는 식물 또는 식물 세포는 SNP22에 대한 공여자 뉴클레오티드 (즉, 뉴클레오티드 51에서 시토신)를 포함하거나, "서열식별번호: 22를 포함"하거나, "서열식별번호: 22와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서, 또는 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치에서 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 서열"을 포함할 수 있다. 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치는 예를 들어 뉴클레오티드 삽입 또는 결실로 인해 약간 상이한 위치일 수 있으며, 예를 들어 이는 뉴클레오티드 49, 50 또는 52 또는 53일 수 있다. 서열 동일성은 바람직하게는 예를 들어 엠보스 프로그램 '니들"을 사용하여 쌍별 정렬에 의해 측정된다. 동형접합성 형태의 SNP22에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우, 이배체 세포는 서열식별번호: 22의 (또는 서열식별번호: 22와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 2개의 카피, 즉, "CC" 유전자형을 포함한다. 삼배체 식물 또는 세포는 3개의 카피를 포함하고, 사배체 식물 또는 세포는 4개의 카피를 포함할 것이다. 마찬가지로, 이형접합성 형태의 SNP22에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우 (상동성 염색체의 쌍의 단지 1개의 염색체가 유전자이입을 가짐), 이배체 세포는 서열식별번호: 22의 (또는 서열식별번호: 22와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 1개의 카피를 포함한다. 유전자이입 단편이 결여된 다른 염색체는 서열식별번호: 22의 뉴클레오티드 51 (SNP22), 즉, 감수성 반복친의 서열에서 다른 뉴클레오티드, 즉, 아데닌, 구아닌 또는 티민 중 임의의 것을 포함한다. 이는 어느 반복친이 사용되었는 지에 의존한다. 한 측면에서, 이는 표 1에 지시된 바와 같이 SNP22에 대해 티민인데, 이는 이것이 본원에서 역교배에 사용된 반복친이었기 때문이다.
따라서, "SNP23" 또는 "SNP23 마커"는 본원에서 서열식별번호: 23의, 또는 서열식별번호: 23과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51을 지칭한다. 본원에서 SNP23에 대한 씨. 콜로신티스 공여자 뉴클레오티드, 즉, 서열식별번호: 23의 또는 서열식별번호: 23과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 시토신 ('C')을 언급하는 경우, 서열식별번호: 23이 뉴클레오티드 51에서 공여자 뉴클레오티드 (즉, 시토신)를 포함하기 때문에, 서열식별번호: 23 자체 (서열식별번호: 23의 위치 51에서 뉴클레오티드를 언급하지 않고), 또는 서열식별번호: 23과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 시토신을 포함하는 서열을 동등하게 지칭할 수 있다. 따라서, CGMMV 저항성 씨. 콜로신티스 공여자로부터의 것인 유전자이입 단편을 포함하는 식물 또는 식물 세포는 SNP23에 대한 공여자 뉴클레오티드 (즉, 뉴클레오티드 51에서 시토신)를 포함하거나, "서열식별번호: 23을 포함"하거나, "서열식별번호: 23과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서, 또는 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치에서 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 서열"을 포함할 수 있다. 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치는 예를 들어 뉴클레오티드 삽입 또는 결실로 인해 약간 상이한 위치일 수 있으며, 예를 들어 이는 뉴클레오티드 49, 50 또는 52 또는 53일 수 있다. 서열 동일성은 바람직하게는 예를 들어 엠보스 프로그램 '니들"을 사용하여 쌍별 정렬에 의해 측정된다. 동형접합성 형태의 SNP23에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우, 이배체 세포는 서열식별번호: 23의 (또는 서열식별번호: 23과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 2개의 카피, 즉, "CC" 유전자형을 포함한다. 삼배체 식물 또는 세포는 3개의 카피를 포함하고, 사배체 식물 또는 세포는 4개의 카피를 포함할 것이다. 마찬가지로, 이형접합성 형태의 SNP23에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우 (상동성 염색체의 쌍의 단지 1개의 염색체가 유전자이입을 가짐), 이배체 세포는 서열식별번호: 23의 (또는 서열식별번호: 23과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 1개의 카피를 포함한다. 유전자이입 단편이 결여된 다른 염색체는 서열식별번호: 23의 뉴클레오티드 51 (SNP23), 즉, 감수성 반복친의 서열에서 다른 뉴클레오티드, 즉, 아데닌, 구아닌 또는 티민 중 임의의 것을 포함한다. 이는 어느 반복친이 사용되었는 지에 의존한다. 한 측면에서, 이는 표 1에 지시된 바와 같이 SNP23에 대해 티민인데, 이는 이것이 본원에서 역교배에 사용된 반복친이었기 때문이다.
따라서, "SNP24" 또는 "SNP24 마커"는 본원에서 서열식별번호: 24의, 또는 서열식별번호: 24와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51을 지칭한다. 본원에서 SNP24에 대한 씨. 콜로신티스 공여자 뉴클레오티드, 즉, 서열식별번호: 24의 또는 서열식별번호: 24와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 구아닌 ('G')을 언급하는 경우, 서열식별번호: 24가 뉴클레오티드 51에서 공여자 뉴클레오티드 (즉, 구아닌)를 포함하기 때문에, 서열식별번호: 24 자체 (서열식별번호: 24의 위치 51에서 뉴클레오티드를 언급하지 않고), 또는 서열식별번호: 24와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 구아닌을 포함하는 서열을 동등하게 지칭할 수 있다. 따라서, CGMMV 저항성 씨. 콜로신티스 공여자로부터의 것인 유전자이입 단편을 포함하는 식물 또는 식물 세포는 SNP24에 대한 공여자 뉴클레오티드 (즉, 뉴클레오티드 51에서 구아닌)를 포함하거나, "서열식별번호: 24를 포함"하거나, "서열식별번호: 24와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서, 또는 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치에서 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 서열"을 포함할 수 있다. 쌍별로 정렬되는 경우 등가의 위치는 예를 들어 뉴클레오티드 삽입 또는 결실로 인해 약간 상이한 위치일 수 있으며, 예를 들어 이는 뉴클레오티드 49, 50 또는 52 또는 53일 수 있다. 서열 동일성은 바람직하게는 예를 들어 엠보스 프로그램 '니들"을 사용하여 쌍별 정렬에 의해 측정된다. 동형접합성 형태의 SNP24에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우, 이배체 세포는 서열식별번호: 24의 (또는 서열식별번호: 24와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 2개의 카피, 즉, "GG" 유전자형을 포함한다. 삼배체 식물 또는 세포는 3개의 카피를 포함하고, 사배체 식물 또는 세포는 4개의 카피를 포함할 것이다. 마찬가지로, 이형접합성 형태의 SNP24에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 경우 (상동성 염색체의 쌍의 단지 1개의 염색체가 유전자이입을 가짐), 이배체 세포는 서열식별번호: 24의 (또는 서열식별번호: 24와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의) 1개의 카피를 포함한다. 유전자이입 단편이 결여된 다른 염색체는 서열식별번호: 24의 뉴클레오티드 51 (SNP24), 즉, 감수성 반복친의 서열에서 다른 뉴클레오티드, 즉, 아데닌, 시토신 또는 티민 중 임의의 것을 포함한다. 이는 어느 반복친이 사용되었는 지에 의존한다. 한 측면에서, 이는 표 1에 지시된 바와 같이 SNP24에 대해 티민인데, 이는 이것이 본원에서 역교배에 사용된 반복친이었기 때문이다.
서열식별번호: 19 (SNP19를 포함함), 서열식별번호: 20 (SNP20을 포함함), 서열식별번호: 21 (SNP21을 포함함), 서열식별번호: 22 (SNP22를 포함함), 서열식별번호: 23 (SNP23을 포함함) 및 서열식별번호: 24 (SNP24를 포함함)는 공여자의 염색체 9 상의 CGMMV 저항성 QTL9.1에 물리적으로 연결된다. 마커 SNP22는 가장 가깝게 연결된다. 따라서, 씨. 콜로신티스로부터의 CGMMV 저항성을 포함하는 유전자이입 단편은 SNP19, SNP20, SNP21, SNP22, SNP23 및 SNP24의 군의 SNP 마커 중 1종 이상 또는 전부에 대한 저항성 공여자 뉴클레오티드 (및 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 서열 또는 그와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 서열)를 포함하고, 보다 바람직하게는 이는 SNP21, SNP22, SNP23의 군으로부터 선택되는 SNP 마커 중 1종 이상 또는 전부에 대한 저항성 공여자 뉴클레오티드를 포함하고, 보다 바람직하게는 이는 SNP21 및/또는 SNP22에 대한 또는 SNP22 및/또는 SNP23에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하고, 보다 더 바람직하게는 이는 적어도 SNP22에 대한 저항성 공여자 뉴클레오티드 (및 따라서 서열식별번호: 22 또는 서열식별번호: 22와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 서열)를 포함한다. 이형접합성 또는 동형접합성 형태의 이러한 유전자이입 단편을 포함하는 재배된 수박 식물, 식물 세포 및 식물 부분은 본 발명의 측면이다.
한 측면에서 시트룰루스 콜로신티스 종의 CGMMV 저항성 공여자 식물의 염색체 7로부터의 및/또는 염색체 9 상의 유전자이입 단편을 포함하며, 염색체 7 상의 유전자이입 단편이 공여자로부터의 QTL7.1 및 SNP13과 SNP18 사이, 또는 SNP13과 SNP17 사이, 또는 SNP13과 SNP16 사이, 또는 SNP13과 SNP15 사이, 또는 SNP13과 SNP14 사이, 또는 SNP14와 SNP15 사이, 또는 SNP14와 SNP16 사이, 또는 SNP14와 SNP17 사이 또는 SNP14와 SNP18 사이의 CGMMV 저항성 공여자 식물의 서열을 포함하고; 바람직하게는 유전자이입 단편이 SNP13과 SNP15 사이, 또는 SNP13과 SNP14 사이, 또는 SNP14와 SNP15 사이의 CGMMV 저항성 공여자의 서열을 포함하고/거나; 염색체 9 상의 유전자이입 단편이 공여자로부터의 QTL9.1 및 SNP19와 SNP24 사이, 또는 SNP19와 SNP23 사이, 또는 SNP19와 SNP22 사이, 또는 SNP20과 SNP24 사이, 또는 SNP20과 SNP23 사이, 또는 SNP20과 SNP22 사이, 또는 SNP21과 SNP24 사이, 또는 SNP21과 SNP23 사이, 또는 SNP21과 SNP22 사이, 또는 SNP22와 SNP24 사이, 또는 SNP22와 SNP23 사이의 CGMMV 저항성 공여자 식물의 서열을 포함하고; 바람직하게는 유전자이입 단편이 SNP21과 SNP23 사이, 또는 SNP21과 SNP22 사이 또는 SNP22와 SNP23 사이의 CGMMV 저항성 공여자의 서열을 포함하는 것인 재배된 수박 식물, 식물 부분 또는 식물 세포가 제공된다.
본원에서 2개의 SNP (단일 뉴클레오티드 다형성) "사이의" 공여자 염색체 서열 또는 공여자 서열 (및 QTL)을 포함하는 유전자이입 단편에 대해 언급하는 경우, 이는 한 측면에서 2개의 SNP 중 하나 또는 둘 다 자체가 또한 저항성 공여자로부터의 것이고, 즉, 공여자 뉴클레오티드를 가짐을 포괄하지만, 그러나, 또한 2개의 SNP 중 어느 것도 저항성 공여자로부터의 것이 아니지만, 단지 2개의 SNP 사이의 염색체 서열만이 공여자로부터의 것이고, QTL을 포함함이 포괄된다. QTL을 포함하는 유전자이입 단편에 "플랭킹된" SNP 마커 뉴클레오티드는 따라서, 한 측면에서 유전자이입 단편의 일부일 수 있거나 (공여자로부터의), 수용자 염색체의 일부일 수 있다 (수용자로부터의).
따라서, 예를 들어 공여자로부터의 유전자이입 단편이 "SNP13과 SNP18 사이"인 경우, SNP13 및/또는 SNP18은 공여자 뉴클레오티드를 포함할 수 있지만, 유전자이입 단편은 또한 보다 짧고, 예를 들어 SNP13 및/또는 SNP18에 대한 반복친의 감수성 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 단지 SNP13과 SNP18 사이의 서열 및 SNP는 공여자로부터의 것일 수 있으며, 따라서, 예를 들어 SNP14, SNP15, SNP16 및 SNP17이 공여자로부터의 것일 수 있거나, 단지 SNP14, SNP15 및 SNP16은 공여자로부터의 것일 수 있거나, SNP 마커 중 단지 1종 또는 2종, 예를 들어 SNP14, SNP15 및 SNP16 중 단지 1종 또는 2종이 공여자로부터의 것일 수 있다. 따라서, QTL을 포함하는 유전자이입 단편은 군 SNP13 내지 SNP18의 SNP에 대한 공여자 뉴클레오티드의 전부를 포함하지 않을 수 있다.
한 측면에서 유전자이입 단편은 SNP13, SNP14 및/또는 SNP15의 공여자 뉴클레오티드 중 적어도 1종, 임의로 적어도 2종 또는 모든 3종을 포함하며, 즉, 유전자이입 단편은 서열 서열식별번호: 13 (또는 서열식별번호: 13과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 또는 등가의 위치에서 아데닌을 포함하는 서열), 서열식별번호: 14 (또는 서열식별번호: 14와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 또는 등가의 위치에서 아데닌을 포함하는 서열) 및/또는 서열식별번호: 15 (또는 서열식별번호: 15와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 또는 등가의 위치에서 구아닌을 포함하는 서열) 중 적어도 1종, 임의로 적어도 2종 또는 3종을 포함한다. 유전자이입 단편은 자명하게 공여자로부터의 QTL7.1을 포함하며, 이는 그렇지 않다면 감수성 수박 식물에 대한 CGMMV 저항성을 부여한다.
마찬가지로, 예를 들어 공여자로부터의 유전자이입 단편이 "SNP19와 SNP24 사이"인 경우, SNP19 및/또는 SNP24는 공여자 뉴클레오티드를 포함할 수 있지만, 유전자이입 단편은 또한 보다 짧고, 예를 들어 SNP19 및/또는 SNP24에 대한 반복친의 감수성 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 단지 SNP19와 SNP24 사이의 서열 및 SNP는 공여자로부터의 것일 수 있고, 따라서, 예를 들어 SNP20, SNP21, SNP22 및 SNP23은 공여자로부터의 것일 수 있거나, 단지 SNP21, SNP22 및 SNP23은 공여자로부터의 것일 수 있거나, SNP 마커 중 단지 1종 또는 2종, 예를 들어 SNP21, SNP22 및 SNP23 중 1종 또는 2종은 공여자로부터의 것일 수 있다. 따라서, QTL을 포함하는 유전자이입 단편은 군 SNP19 내지 SNP24의 SNP에 대한 공여자 뉴클레오티드의 전부를 포함하지 않을 수 있다. 한 측면에서 유전자이입 단편은 SNP21, SNP22 및/또는 SNP23의 공여자 뉴클레오티드 중 적어도 1종, 임의로 적어도 2종 또는 모든 3종을 포함하며, 즉, 유전자이입 단편은 서열 서열식별번호: 21 (또는 서열식별번호: 21과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 또는 등가의 위치에서 구아닌을 포함하는 서열), 서열식별번호: 22 (또는 서열식별번호: 22와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 또는 등가의 위치에서 시토신을 포함하는 서열), 및/또는 서열식별번호: 23 (또는 서열식별번호: 23과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 또는 등가의 위치에서 시토신을 포함하는 서열) 중 적어도 1종, 임의로 적어도 2종 또는 3종을 포함한다. 유전자이입 단편은 자명하게 공여자로부터의 QTL9.1을 포함하며, 이는 그렇지 않다면 감수성 수박 식물에 대한 CGMMV 저항성을 부여한다.
한 측면에서 시트룰루스 콜로신티스 종의 CGMMV 저항성 공여자 식물의 염색체 7로부터의 및/또는 염색체 9 상의 유전자이입 단편을 포함하며, 염색체 7 상의 유전자이입 단편이 SNP14 (서열식별번호: 14에서 뉴클레오티드 51에서 아데닌)에 대한 CGMMV 저항성 공여자 식물의 서열을 포함하거나, 서열식별번호: 14 또는 서열식별번호: 14와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 아데닌을 포함하고/거나, 염색체 9 상의 유전자이입 단편이 SNP22 (서열식별번호: 22에서 뉴클레오티드 51에서 시토신)에 대한 CGMMV 저항성 공여자 식물의 서열을 포함하거나, 서열식별번호: 22 또는 서열식별번호: 22와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 시토신을 포함하는 것인 재배된 수박 식물, 식물 부분 또는 식물 세포가 제공된다.
한 측면에서 본 발명은 시트룰루스 콜로신티스 종의 CGMMV 저항성 공여자 식물의 염색체 7로부터의 및/또는 염색체 9 상의 유전자이입 단편을 포함하며, 염색체 7 상의 유전자이입 단편이 공여자로부터의 QTL7.1을 포함하고, 서열식별번호: 13의 또는 서열식별번호: 13과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 아데닌, 및/또는 서열식별번호: 14의 또는 서열식별번호: 14와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 아데닌, 및/또는 서열식별번호: 15의 또는 서열식별번호: 15와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 구아닌, 및/또는 서열식별번호: 16의 또는 서열식별번호: 16과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 구아닌, 및/또는 서열식별번호: 17의 또는 서열식별번호: 17과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 티민, 및/또는 서열식별번호: 18의 또는 서열식별번호: 18과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 아데닌을 포함하고; 바람직하게는 염색체 7 상의 유전자이입 단편이 서열식별번호: 13의 또는 서열식별번호: 13과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 아데닌, 및/또는 서열식별번호: 14의 또는 서열식별번호: 14와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 아데닌, 및/또는 서열식별번호: 15의 또는 서열식별번호: 15와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 구아닌을 포함하고/거나; 염색체 9 상의 유전자이입 단편이 공여자로부터의 QTL9.1을 포함하고, 서열식별번호: 19의 또는 서열식별번호: 19와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 시토신, 및/또는 서열식별번호: 20의 또는 서열식별번호: 20과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 구아닌, 및/또는 서열식별번호: 21의 또는 서열식별번호: 21과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 구아닌, 및/또는 서열식별번호: 22의 또는 서열식별번호: 22와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 시토신, 및/또는 서열식별번호: 23의 또는 서열식별번호: 23과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 시토신, 및/또는 서열식별번호: 24의 또는 서열식별번호: 24와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 구아닌을 포함하고; 바람직하게는 염색체 9 상의 유전자이입 단편이 서열식별번호: 21의 또는 서열식별번호: 21과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 구아닌, 및/또는 서열식별번호: 22의 또는 서열식별번호: 22와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 시토신, 및/또는 서열식별번호: 23의 또는 서열식별번호: 23과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 시토신을 포함하는 것인 재배된 수박 식물, 식물 부분 또는 식물 세포를 제공한다.
QTL7.1에 가장 가깝게 연결된 마커는 SNP14이기 때문에, 유전자이입 단편은 바람직하게는 QTL7.1 및 SNP13, SNP14 및 SNP15, 즉, 서열식별번호: 13의 또는 서열식별번호: 13과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 아데닌, 및/또는 서열식별번호: 14의 또는 서열식별번호: 14와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 아데닌, 및/또는 서열식별번호: 15의 또는 서열식별번호: 15와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 구아닌으로부터 선택되는 적어도 1종, 2종 또는 모든 3종의 공여자 마커를 포함한다.
QTL9.1에 가장 가깝게 연결된 마커는 SNP22이기 때문에, 유전자이입 단편은 바람직하게는 QTL9.1 및 SNP21, SNP22 및 SNP23, 즉, 서열식별번호: 21의 또는 서열식별번호: 21과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 구아닌, 및/또는 서열식별번호: 22의 또는 서열식별번호: 22와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 시토신, 및/또는 서열식별번호: 23의 또는 서열식별번호: 23과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 시토신으로부터 선택되는 적어도 1종, 2종 또는 모든 3종의 공여자 마커를 포함한다.
QTL이 유전자이입 단편 상에 존재하는지 여부는 본원에 및 실시예에 기재된 바와 같은 CGMMV 시험을 사용하여 표현형적으로 측정될 수 있다. 따라서, 예를 들어 기재된 SNP 중 임의의 것에 대한 공여자 뉴클레오티드 중 1종 이상을 포함하는 식물은 감수성 식물과 교배될 수 있으며, 자손 (예를 들어 F1)은 CGMMV 저항성에 대해 분석될 수 있다. QTL7.1 및 QTL9.1은 둘 다 우성이므로, 표현형은 F1 자손에서 이미 나타난다. QTL7.1 또는 QTL9.1 단독을 포함하는 식물 및 식물 세포, 뿐만 아니라 그들의 게놈에 둘 다의 QTL을 포함하는, 즉, 2개의 재조합 염색체, 즉, CGMMV 저항성 씨. 콜로신티스 공여자로부터의 유전자이입 단편을 포함하는 1개의 재조합 염색체 7, 및 바람직하게는 동일한 씨. 콜로신티스 공여자로부터의 (이는 요구되지는 않지만, 이들은 또한 상이한 공여자로부터의 것일 수 있음) CGMMV 저항성 씨. 콜로신티스 공여자로부터의 유전자이입 단편을 포함하는 1개의 재조합 염색체 9를 포함하는 식물은 본 발명의 실시양태이다.
QTL7.1 및/또는 QTL9.1을 포함하는 재배된 수박 식물은 CGMMV 저항성이고, 바람직하게는 기재된 바와 같이 시험되는 경우, 3의, 또는 보다 바람직하게는 4의 (증상 없음) CGMMV 점수를 갖는다. 바람직하게는 식물 또는 식물로부터 유래된 접지는 동일한 방식으로 처리된 감수성 대조군보다 유의하게 더 낮은, 잎에 및 임의로 과실에 극도로 낮은 수준의 CGMMV 바이러스를 포함한다. 한 측면에서 이러한 식물의 과실에서 생산된 종자는 CGMMV 바이러스가 없는 채로 잔류한다.
본 발명에 따른 재배된 수박 식물 또는 식물 세포는 동형접합성 또는 이형접합성 형태의 염색체 7 상의 유전자이입 단편을 포함하고/거나, 동형접합성 형태의 또는 이형접합성 형태의 염색체 9 상의 유전자이입 단편을 포함한다. 유전자이입 단편 또는 단편들이 순계 모체 계통에서 동형접합성 형태인 F1 잡종 변종을 제조하는 것이 가장 쉽다. 2개의 동형접합성 순계 계통을 교배시킴으로써 제조된 F1 잡종은 그러면 또한 동형접합성 형태의 QTL(들)을 포함한다.
한 측면에서 본 발명은 CGMMV 저항성 공여자 식물의 염색체 1 (공여자로부터의 QTL1.1을 포함함), 4 (QTL4.1을 포함함), 5 (QTL5.2를 포함함), 7 (QTL7.1을 포함함) 및/또는 9 (QTL9.1을 포함함)로부터의 유전자이입 단편을 포함하며, 유전자이입 단편이 CGMMV 저항성을 부여하고, 유전자이입 단편이 하기 SNP 중 1종 이상 (또는 전부)에 대한 공여자 식물의 SNP 유전자형에 의해 검출가능한 (이를 포함하는) 것인 재배된 수박 식물 세포 또는 수박 식물 (또는 식물 부분)에 관한 것이다: 염색체 1 상의 단편에 대해 SNP1, SNP2, SNP3, SNP4, SNP5 및/또는 SNP6; 및/또는 염색체 4 상의 단편에 대해 SNP7, SNP8 및/또는 SNP9 중 1종 이상; 및/또는 염색체 5 상의 단편에 대해 SNP10, SNP11 및/또는 SNP12 중 1종 이상; 및/또는 염색체 7 상의 단편에 대해 SNP13, SNP14, SNP15, SNP16, SNP17 및/또는 SNP18 중 1종 이상; 및/또는 염색체 9 상의 단편에 대해 SNP19, SNP20, SNP21, SNP22, SNP23 및/또는 SNP24 중 1종 이상. CGMMV 저항성 부여 QTL은 예를 들어 실시예에 기재된 바와 같은 CGMMV 저항성 검정에 의해 측정될 수 있는 바와 같이 유전자이입 단편 상에 존재한다.
상기 추가로 기재된, 염색체 7 (QTL7.1을 포함함)로부터의 및/또는 염색체 9 (QTL9.1을 포함함)로부터의 유전자이입 단편을 포함하는 재배된 수박 식물은 임의로 또한 QTL1.1, QTL4.1 및/또는 QTL5.2로부터 선택되는 QTL 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
따라서, 한 측면에서 시트룰루스 콜로신티스 종의 CGMMV 저항성 공여자 식물의 염색체 1로부터의 및/또는 염색체 4 및/또는 염색체 5 상의 유전자이입 단편을 더 포함하며, 염색체 1 상의 유전자이입 단편이 공여자로부터의 QTL1.1 및 SNP1과 SNP6 사이, 또는 SNP1과 SNP5 사이, 또는 SNP1과 SNP4 사이, 또는 SNP2와 SNP6 사이, 또는 SNP2와 SNP5 사이, 또는 SNP2와 SNP4 사이, 또는 SNP3과 SNP6 사이, 또는 SNP3과 SNP5 사이 또는 SNP3과 SNP4 사이, 또는 SNP4와 SNP6 사이, 또는 SNP4와 SNP5 사이 또는 SNP5와 SNP6 사이의 CGMMV 저항성 공여자 식물의 서열을 포함하고; 바람직하게는 유전자이입 단편이 SNP4와 SNP6 사이, 또는 SNP4와 SNP5 사이 또는 SNP5와 SNP6 사이의 CGMMV 저항성 공여자의 서열을 포함하고/거나; 염색체 4 상의 유전자이입 단편이 공여자로부터의 QTL4.1 및 SNP7과 SNP9 사이, 또는 SNP8과 SNP8 사이, 또는 SNP7과 SNP8 사이의 CGMMV 저항성 공여자 식물의 서열을 포함하고/거나; 염색체 5 상의 유전자이입 단편이 공여자로부터의 QTL5.2 및 SNP10과 SNP12 사이, 또는 SNP10과 SNP11 사이, 또는 SNP11과 SNP12 사이의 CGMMV 저항성 공여자 식물의 서열을 포함하는 것인 재배된 수박 식물, 식물 부분 또는 식물 세포가 제공된다.
바람직하게는 QTL1.1, QTL4.1 또는 QTL5.2를 포함하는 이들 유전자이입 단편은 식물에서 동형접합성 형태로 존재한다. 이들은 또한 재배된 수박 식물에 개별적으로 또는 조합되어, 예를 들어 QTL1.1 및 QTL4.1 또는 QTL1.1 및 QTL5.2 또는 QTL4.1 및 QTL5.2, 또는 모든 3종이 조합되어 존재할 수 있다. 언급된 바와 같이, 임의로 또한 QTL7.1 및 QTL9.1 중 하나 또는 둘 다는 한 식물에서 이들 열성 QTL 중 1종 이상과 함께 조합될 수 있다.
공여자로부터의 유전자이입 단편이 "SNP1과 SNP6 사이"로 언급되는 경우, 예를 들어, SNP1 및/또는 SNP6은 공여자 뉴클레오티드를 포함할 수 있지만, 유전자이입 단편은 또한 보다 짧고, 예를 들어 SNP1 및/또는 SNP6에 대한 반복친의 감수성 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 단지 SNP1과 SNP6 사이의 서열 및 SNP는 공여자로부터의 것일 수 있고, 따라서, 예를 들어 SNP2, SNP3, SNP4 및 SNP5는 공여자로부터의 것일 수 있거나, 단지 SNP3, SNP4 및 SNP5는 공여자로부터의 것일 수 있거나, SNP 마커 중 단지 1종 또는 2종, 예를 들어 SNP3, SNP4 및 SNP5 중 단지 1종 또는 2종은 공여자로부터의 것일 수 있다. 따라서, QTL을 포함하는 유전자이입 단편은 군 SNP1 내지 SNP6의 SNP에 대한 공여자 뉴클레오티드의 전부를 포함하지 않을 수 있다.
한 측면에서 QTL1.1을 포함하는 유전자이입 단편은 SNP4, SNP5 및/또는 SNP6의 공여자 뉴클레오티드 중 적어도 1종, 임의로 적어도 2종 또는 모든 3종을 포함하며, 즉, 유전자이입 단편은 서열 서열식별번호: 4 (또는 서열식별번호: 4와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 또는 등가의 위치에서 시토신을 포함하는 서열), 서열식별번호: 5 (또는 서열식별번호: 5와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 또는 등가의 위치에서 구아닌을 포함하는 서열) 및/또는 서열식별번호: 6 (또는 서열식별번호: 6과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 또는 등가의 위치에서 티민을 포함하는 서열) 중 적어도 1종, 임의로 적어도 2종 또는 3종을 포함한다. 유전자이입 단편은 자명하게 공여자로부터의 QTL1.1을 포함하며, 이는 그렇지 않다면 감수성 수박 식물에 대한 CGMMV 저항성을 부여한다.
마찬가지로, 예를 들어 공여자로부터의 QTL4.1을 포함하는 유전자이입 단편이 "SNP7과 SNP9 사이"인 경우, SNP7 및/또는 SNP9는 공여자 뉴클레오티드를 포함할 수 있지만, 유전자이입 단편은 또한 보다 짧고, 예를 들어 SNP7 및/또는 SNP9에 대한 반복친의 감수성 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 단지 SNP7과 SNP9 사이의 서열 및 SNP는 공여자로부터의 것일 수 있고, 따라서, 예를 들어 SNP8은 공여자로부터의 것일 수 있다. 따라서, QTL4.1을 포함하는 유전자이입 단편은 군 SNP7 내지 SNP9의 SNP에 대한 공여자 뉴클레오티드의 전부를 포함하지 않을 수 있다. 한 측면에서 유전자이입 단편은 SNP7, SNP8 및/또는 SNP9의 공여자 뉴클레오티드 중 적어도 1종, 임의로 적어도 2종 또는 모든 3종을 포함하며, 즉, 유전자이입 단편은 서열 서열식별번호: 7 (또는 서열식별번호: 7과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 또는 등가의 위치에서 티민을 포함하는 서열), 서열식별번호: 8 (또는 서열식별번호: 8과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 또는 등가의 위치에서 시토신을 포함하는 서열) 및/또는 서열식별번호: 9 (또는 서열식별번호: 9와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 또는 등가의 위치에서 아데닌을 포함하는 서열) 중 적어도 1종, 임의로 적어도 2종 또는 3종을 포함한다. 유전자이입 단편은 자명하게 공여자로부터의 QTL4.1을 포함하며, 이는 그렇지 않다면 감수성 수박 식물에 대한 CGMMV 저항성을 부여한다.
마찬가지로, 예를 들어 공여자로부터의 QTL5.2를 포함하는 유전자이입 단편이 "SNP10과 SNP12 사이"인 경우, SNP10 및/또는 SNP12는 공여자 뉴클레오티드를 포함할 수 있지만, 유전자이입 단편은 또한 보다 짧고, 예를 들어 SNP10 및/또는 SNP12에 대한 반복친의 감수성 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 단지 SNP10과 SNP12 사이의 서열 및 SNP는 공여자로부터의 것일 수 있고, 따라서, 예를 들어 SNP11은 공여자로부터의 것일 수 있다. 따라서, QTL5.2를 포함하는 유전자이입 단편은 군 SNP10 내지 SNP12의 SNP에 대한 공여자 뉴클레오티드의 전부를 포함하지 않을 수 있다. 한 측면에서 유전자이입 단편은 SNP10, SNP11 및/또는 SNP12의 공여자 뉴클레오티드 중 적어도 1종, 임의로 적어도 2종 또는 모든 3종을 포함하며, 즉, 유전자이입 단편은 서열 서열식별번호: 10 (또는 서열식별번호: 10과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 또는 등가의 위치에서 티민을 포함하는 서열), 서열식별번호: 11 (또는 서열식별번호: 11과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 또는 등가의 위치에서 아데닌을 포함하는 서열) 및/또는 서열식별번호: 12 (또는 서열식별번호: 12와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 또는 등가의 위치에서 티민을 포함하는 서열) 중 적어도 1종, 임의로 적어도 2종 또는 3종을 포함한다. 유전자이입 단편은 자명하게 공여자로부터의 QTL5.2를 포함하며, 이는 그렇지 않다면 감수성 수박 식물에 대한 CGMMV 저항성을 부여한다.
한 측면에서 시트룰루스 콜로신티스 종의 CGMMV 저항성 공여자 식물의 염색체 1 (QTL1.1을 포함함)로부터의 및/또는 염색체 4 (QTL4.1을 포함함) 상의 및/또는 염색체 5 (QTL5.2를 포함함)로부터의 유전자이입 단편을 포함하며, 염색체 1 상의 유전자이입 단편이 SNP5 (서열식별번호: 5에서 뉴클레오티드 51에서 구아닌)에 대한 CGMMV 저항성 공여자 식물의 서열을 포함하거나, 서열식별번호: 5 또는 서열식별번호: 5와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 구아닌을 포함하고/거나; 염색체 4 상의 유전자이입 단편이 SNP8 (서열식별번호: 22에서 뉴클레오티드 51에서 시토신)에 대한 CGMMV 저항성 공여자 식물의 서열을 포함하거나, 서열식별번호: 8 또는 서열식별번호: 8과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 시토신을 포함하고/거나; 염색체 5 상의 유전자이입 단편이 SNP11 (서열식별번호: 11에서 뉴클레오티드 51에서 아데닌)에 대한 CGMMV 저항성 공여자 식물의 서열을 포함하거나, 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 11과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함하고, 뉴클레오티드 51에서 아데닌을 포함하는 것인 재배된 수박 식물, 식물 부분 또는 식물 세포가 제공된다.
한 측면에서 본 발명은 시트룰루스 콜로신티스 종의 CGMMV 저항성 공여자 식물의 염색체 1로부터의 및/또는 염색체 4 상의 및/또는 염색체 5 상의 유전자이입 단편을 포함하며, 염색체 1 상의 유전자이입 단편이 공여자로부터의 QTL1.1을 포함하고, 서열식별번호: 1의 또는 서열식별번호: 1과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 시토신, 및/또는 서열식별번호: 2의 또는 서열식별번호: 2와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 구아닌, 및/또는 서열식별번호: 3의 또는 서열식별번호: 3과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 시토신, 및/또는 서열식별번호: 4의 또는 서열식별번호: 4와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 시토신, 및/또는 서열식별번호: 5의 또는 서열식별번호: 5와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 구아닌, 및/또는 서열식별번호: 6의 또는 서열식별번호: 6과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 티민을 포함하고; 바람직하게는 염색체 1 상의 유전자이입 단편이 서열식별번호: 4의 또는 서열식별번호: 4와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 시토신, 및/또는 서열식별번호: 5의 또는 서열식별번호: 5와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 구아닌, 및/또는 서열식별번호: 6의 또는 서열식별번호: 6과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 티민을 포함하고/거나; 염색체 4 상의 유전자이입 단편이 공여자로부터의 QTL4.1을 포함하고, 서열식별번호: 7의 또는 서열식별번호: 7과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 티민, 및/또는 서열식별번호: 8의 또는 서열식별번호: 8과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 시토신, 및/또는 서열식별번호: 9의 또는 서열식별번호: 9와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 아데닌을 포함하고/거나; 염색체 5 상의 유전자이입 단편이 공여자로부터의 QTL5.1을 포함하고, 서열식별번호: 10의 또는 서열식별번호: 10과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 티민, 및/또는 서열식별번호: 11의 또는 서열식별번호: 11과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 아데닌, 서열식별번호: 12의 또는 서열식별번호: 12와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 티민을 포함하는 것인 재배된 수박 식물, 식물 부분 또는 식물 세포를 제공한다.
QTL1.1에 가장 가깝게 연결된 마커는 SNP5이기 때문에, 유전자이입 단편은 바람직하게는 QTL1.1 및 SNP4, SNP5 및 SNP6, 즉, 서열식별번호: 4의 또는 서열식별번호: 4와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 시토신, 및/또는 서열식별번호: 5의 또는 서열식별번호: 5와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 구아닌, 및/또는 서열식별번호: 6의 또는 서열식별번호: 6과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 티민으로부터 선택되는 적어도 1종, 2종 또는 모든 3종의 공여자 마커를 포함한다.
QTL4.1에 가장 가깝게 연결된 마커는 SNP8이기 때문에, 유전자이입 단편은 바람직하게는 QTL4.1 및 SNP7, SNP8 및 SNP9, 즉, 서열식별번호: 7의 또는 서열식별번호: 7과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 티민, 및/또는 서열식별번호: 8의 또는 서열식별번호: 8과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 시토신, 및/또는 서열식별번호: 9의 또는 서열식별번호: 9와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 아데닌으로부터 선택되는 적어도 1종, 2종 또는 모든 3종의 공여자 마커를 포함한다.
QTL5.2에 가장 가깝게 연결된 마커는 SNP11이기 때문에, 유전자이입 단편은 바람직하게는 QTL5.2 및 SNP10, SNP11 및 SNP12, 즉, 서열식별번호: 10의 또는 서열식별번호: 10과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 티민, 및/또는 서열식별번호: 11의 또는 서열식별번호: 11과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 아데닌, 및/또는 서열식별번호: 12의 또는 서열식별번호: 12와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 티민으로부터 선택되는 적어도 1종, 2종 또는 모든 3종의 공여자 마커를 포함한다.
언급된 바와 같이, 한 측면에서 재배된 수박 식물 또는 식물 세포는 시트룰루스 콜로신티스 수탁물로부터의 유전자이입 단편(들)을 포함한다. 이는 임의의 CGMMV 저항성 씨. 콜로신티스 수탁물, 특히 기재된 바와 같이 CGMMV로 접종되는 경우 4의 CGMMV 점수 (증상 없음)를 갖는 수탁물일 수 있다. 한 측면에서 유전자이입 단편은 NCIMB 42624에 존재하고, 그로부터 유래가능하지만, 씨. 콜로신티스 공여자는 반드시 수탁 번호 NCIMB 42624 (또는 그의 자손) 하에 기탁된 수탁물일 필요는 없다. 통상의 기술자는 예를 들어 4의 CGMMV 점수 (증상 없음)를 갖고/거나, 동일한 QTL 또는 QTL들 (QTL1.1, QTL4.1, QTL5.2, QTL7.1 및 QTL9.1로부터 선택됨)이 그 공여자에 존재함을 의미할 것인, QTL 중 임의의 것에 대한 NCIMB 42624의 그것과 동일하거나 매우 유사한 SNP 마커 프로파일을 포함하는 임의의 다른 씨. 콜로신티스 수탁물을 확인할 수 있다. 이러한 씨. 콜로신티스 수탁물은 NCIMB 42624와 정확하게 동일한 SNP 유전자형을 가질 필요는 없다. 이는 예를 들어 일부 SNP 마커에 대해 이형접합성일 수 있으며, QTL(들) 중 1종 이상 또는 전부에 대해 동형접합성인 자손을 선택하기 위해 1회 이상 자가수정될 필요가 있을 것이다. 또한, 공여자는 SNP 유전자형에서 다소 다양할 수 있으며, 예를 들어 QTL7.1 또는 QTL9.1에 관하여 이는 단지 SNP13 내지 SNP18 (QTL7.1에 연결됨)의 또는 SNP19 내지 SNP24 (QTL9.1에 연결됨)의 공여자 SNP 마커 중 5종, 4종 또는 3종을 포함할 수 있다.
CGMMV 저항성 (즉, QTL1.1, QTL4.1, QTL5.2, QTL7.1 및 QTL9.1 중 1종 이상을 포함할 수 있는 씨. 콜로신티스 수탁물의 예는 4의 점수 (증상 없음)를 갖는 식물을 함유하는 수탁물이다. 이러한 수탁물, 또는 4의 점수를 갖는 선택된 개별적 식물의 자가수정 자손은 본원에서 표 1 및 표 6에서 제공된 SNP 마커의 유전자형에 대해 시험될 수 있다. 이러한 수탁물 자체는 물론 이들이 일반적으로 낮은 브릭스 (2 또는 3 °브릭스)를 갖는 작은 백색 과육의 과실을 생산하고, 농경적으로 유용하지 않기 때문에 본 발명의 일부가 아니지만, 양호한 농경적 특성 (높은 브릭스, 양호한 품질 과실 및 양호한 과실 수율)을 갖는 재배된 수박 식물에 대한 CGMMV 저항성을 부여하기 위해, 단지 작물 식물, 예컨대 재배된 수박 내로 개별적으로 또는 조합으로 전달된 (유전자이입된) QTL은 본원에 포함됨이 주목된다.
한 측면에서 유전자이입 단편(들)은 그의 종자의 또는 그의 후손의 대표적인 샘플이 수탁 번호 NCIMB 42624 하에 기탁된 씨. 콜로신티스 공여자로부터 유래된다.
본 발명에서 확인된 5종의 QTL 중 임의의 것은 단독으로 또는 상이한 조합으로 씨. 콜로신티스 공여자로부터 재배된 수박 식물로 전달될 수 있다. 적어도 1종의 우성 QTL, 즉, QTL7.1 및/또는 QTL9.1을 포함하는 것이 바람직하다. 그러나, 소수의 열성 QTL, 즉, QTL1.1, QTL4.1 및/또는 QTL5.2는 또한 예를 들어 접종된 식물에서 바이러스 역가를 훨씬 더 저하시키거나, CGMMV 바이러스를 RT-qPCR에 의해 비검출가능하게 만들고/거나, 식물 및 식물 부분을 비-감염성으로 만들고/거나 바이러스를 비-종자 전파가능하게 만들고/거나 면역성을 부여하는 데 유용할 수 있다. 따라서, 한 측면에서, QTL7.1 및/또는 QTL9.1을 포함하고, 바람직하게는 이들이 열성이기 때문에 동형접합성 형태의 QTL1.1, QTL4.1 및 QTL5.2 중 1종 이상을 더 포함하는 재배된 수박 식물이 제공된다.
한 측면에서 재배된 수박 식물은 이배체 식물이다. 또다른 측면에서 이들은 사배체 식물이다. 추가의 측면에서 이들은 특히 사배체 순계 모체 계통 (바람직하게는 유전자이입 단편(들)의 4개의 카피 및 유전자이입 단편 상에 SNP 마커, 예를 들어 QTL7.1 및/또는 QTL9.1의 4개의 카피를 포함함)을 이배체 순계 모체 계통 (바람직하게는 유전자이입 단편(들)의 2개의 카피, 예를 들어 QTL7.1 및/또는 QTL9.1의 2개의 카피를 포함함)의 화분으로 수분시켜, 유전자이입 단편(들)의 3개의 카피, 예를 들어 QTL7.1 및/또는 QTL9.1의 3개의 카피를 포함하는 F1 삼배체 잡종 식물을 제조함으로써 제조된 삼배체 식물이다.
SNP 마커 뉴클레오티드, 예를 들어 공여자 뉴클레오티드가 이배체, 삼배체 또는 사배체 형태인 경우, 이는 유전자형분석 검정, 예를 들어 KASP 검정에서 검출될 수 있다. 따라서, 예를 들어 SNP14에 대한 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 유전자이입 단편의 2개의 카피를 포함하는 식물, 식물 부분 또는 식물 세포 (또는 그로부터 수득된 DNA)는 유전자형 'AA'를 가질 것인 반면, 3개의 카피를 포함하는 식물, 식물 부분 또는 세포는 유전자형 'AAA'를 가질 것이고, 4개의 카피를 포함하는 식물, 식물 부분 또는 세포는 유전자형 'AAAA'를 가질 것이다. 본원에서 제공된 SNP 마커 중 1종 이상을 사용한, 식물, 식물 부분 또는 식물 세포가 본 발명의 CGMMV 저항성 QTL 중 1종 이상을 포함하는지 여부를 검출하기 위한 이러한 SNP 유전자형분석 검정은 또한 본 발명의 측면이다.
본 발명에 따른 재배된 수박 식물, 식물 부분 또는 식물 세포는 바람직하게는 규모 3 (경도 증상) 또는 규모 4 (증상 없음)의 평균 CGMMV 저항성을 포함한다.
한 측면에서 본 발명에 따른 재배된 수박 식물 또는 식물 세포는 순계 식물 또는 식물 세포, 또는 F1 잡종 식물 또는 식물 세포, 또는 이배체 또는 사배체 또는 삼배체 식물 또는 식물 세포이다.
또한, 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 식물로 성장하는 종자는 본원에 포괄된다.
마찬가지로, 본 발명에 따른 식물 세포를 포함하는 재배된 수박 과실 또는 과실 부분은 본원에 포괄된다.
또한, 본 발명에 따른 재배된 수박 식물 세포를 포함하는 재배된 수박 식물 번식 물질은 실시양태이다.
본 발명에 따른 식물의 식물 부분은 또한 자른 가지, 접지, 근경, 접목된 묘목 또는 본 발명에 따른 식물의 접지 및/또는 근경을 포함하는 식물, 잎, 과실, 과실의 부분, 종자, 종자의 부분, 세포, 조직 배양물, 꽃, 화분, 배아, 뿌리 등이다.
한 측면에서 a) 각각 시트룰루스 콜로신티스 종의 CGMMV 저항성 공여자 식물의 염색체 7로부터의 유전자이입 단편을 갖는 2개의 염색체 7을 포함하며, 유전자이입 단편이 QTL7.1 및 SNP14 (서열식별번호: 14)에 대한, 또는 SNP13과 SNP18 사이, 또는 SNP13과 SNP15 사이의 공여자 식물의 서열을 포함하거나; 또는 유전자이입 단편이 QTL7.1 및 SNP13, SNP14, SNP15, SNP16, SNP17, 및 SNP18 중 1종 이상 또는 전부에 대한 저항성 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 것인 제1 CGMMV 저항성 순계 이배체 수박 식물을 제공하는 단계;
b) 각각 시트룰루스 콜로신티스 종의 CGMMV 저항성 공여자 식물의 염색체 7로부터의 유전자이입 단편을 갖는 4개의 염색체 7을 포함하며, 유전자이입 단편이 QTL7.1 및 SNP14 (서열식별번호: 14)에 대한, 또는 SNP13과 SNP18 사이, 또는 SNP13과 SNP15 사이의 공여자 식물의 서열의 서열을 포함하거나; 또는 유전자이입 단편이 QTL7.1 및 SNP13, SNP14, SNP15, SNP16, SNP17, 및 SNP18 중 1종 이상 또는 전부에 대한 저항성 공여자 유전자형을 포함하는 것인 제2 CGMMV 저항성 순계 사배체 수박 식물을 제공하는 단계;
c) 단계 a)에서 제공된 이배체 수박 식물의 화분으로 단계 b)에서 제공된 사배체 수박 식물을 수분하는 단계; 및
d) 단계 c)에서 생산된 과실로부터 종자를 수집하는 단계
를 포함하는, 삼배체 잡종 재배된 수박 종자를 제조하는 방법이 제공된다.
마찬가지로 a) 각각 시트룰루스 콜로신티스 종의 CGMMV 저항성 공여자 식물의 염색체 9로부터의 유전자이입 단편을 갖는 2개의 염색체 9를 포함하며, 유전자이입 단편이 QTL9.1 및 SNP22 (서열식별번호: 22)에 대한, 또는 SNP19와 SNP24 사이, 또는 SNP21과 SNP23 사이의 공여자 식물의 서열을 포함하거나; 또는 유전자이입 단편이 QTL9.1 및 SNP19, SNP20, SNP21, SNP22, SNP23 및 SNP24 중 1종 이상 또는 전부에 대한 저항성 공여자 유전자형을 포함하는 것인 제1 CGMMV 저항성 순계 이배체 수박 식물을 제공하는 단계;
b) 각각 시트룰루스 콜로신티스 종의 CGMMV 저항성 공여자 식물의 염색체 9로부터의 유전자이입 단편을 갖는 4개의 염색체 9를 포함하며, 유전자이입 단편이 QTL9.1 및 SNP22 (서열식별번호: 22)에 대한, 또는 SNP19와 SNP24 사이, 또는 SNP21과 SNP23 사이의 공여자 식물의 서열의 서열을 포함하거나; 또는 유전자이입 단편이 QTL9.1 및 SNP19, SNP20, SNP21, SNP22, SNP23 및 SNP24 중 1종 이상 또는 전부에 대한 저항성 공여자 유전자형을 포함하는 것인 제2 CGMMV 저항성 순계 사배체 수박 식물을 제공하는 단계;
c) 단계 a)에서 제공된 이배체 수박 식물의 화분으로 단계 b)에서 제공된 사배체 수박 식물을 수분하는 단계; 및
d) 단계 c)에서 생산된 과실로부터 종자를 수집하는 단계
를 포함하는, 삼배체 잡종 재배된 수박 종자를 제조하는 방법이 제공된다.
상기 2가지 방법은 또한 QTL7.1의 3개의 카피 및 QTL9.1의 3개의 카피를 포함하는 삼배체 수박 식물 (및 그로부터 이러한 식물이 성장할 수 있는 종자)을 생성하는 데 사용될 수 있다. 그러면 a) 하의 식물은 QTL7.1의 및 QTL9.1의 2개의 카피를 포함하고, b) 하의 식물은 QTL7.1의 및 QTL9.1의 4개의 카피를 포함한다.
단계 d)에서 수집된 종자는 또한 본 발명의 측면이며, 이들 종자로부터 성장된 식물 및 그들 식물의 식물 부분 및 세포도 마찬가지이다. 예를 들어, 삼배체 과실이 QTL7.1의 및/또는 QTL9.1의 3개의 카피를 포함한다.
한 측면에서 본 발명은 CGMMV 저항성 수박 식물 또는 식물 부분 또는 식물 세포의 확인을 위한 마커 SNP13, SNP14, SNP15, SNP16, SNP17, 및 SNP18 중 1종 이상 및/또는 마커 SNP19, SNP20, SNP21, SNP22, SNP23 및 SNP24 중 1종 이상의 용도를 제공한다.
또다른 측면에서 본 발명은 CGMMV 감수성 재배된 수박 식물 내로의 CGMMV 저항성의 유전자이입을 위한 마커 SNP13, SNP14, SNP15, SNP16, SNP17, 및 SNP18 중 1종 이상 및/또는 마커 SNP19, SNP20, SNP21, SNP22, SNP23 및 SNP24 중 1종 이상의 용도를 제공한다.
추가의 측면에서 본 발명은 CGMMV 저항성 수박 식물 또는 식물 부분 또는 식물 세포의 확인을 위한 마커 SNP1, SNP2, SNP3, SNP4, SNP5, 및 SNP6 중 1종 이상 및/또는 마커 SNP7, SNP8 및 SNP9 중 1종 이상 및/또는 마커 SNP10, SNP11 및 SNP12 중 1종 이상의 용도를 제공한다.
또다른 측면에서 본 발명은 CGMMV 감수성 재배된 수박 식물 내로의 CGMMV 저항성의 유전자이입을 위한 마커 SNP1, SNP2, SNP3, SNP4, SNP5, 및 SNP6 중 1종 이상 및/또는 마커 SNP7, SNP8 및 SNP9 중 1종 이상 및/또는 마커 SNP10, SNP11 및 SNP12 중 1종 이상의 용도를 제공한다.
또한, a) 게놈 DNA를 SNP13, SNP14, SNP15, SNP16, SNP17, 및 SNP18 중 1종 이상 또는 전부의 및/또는 SNP19, SNP20, SNP21, SNP22, SNP23 및 SNP24 중 1종 이상에 대한 SNP 유전자형에 대해 스크리닝하는 단계; 및 임의로
b) SNP13, SNP14, SNP15, SNP16, SNP17 및 SNP18 중 1종 이상 또는 전부에 대한 및/또는 SNP19, SNP20, SNP21, SNP22, SNP23 및 SNP24 중 1종 이상 또는 전부에 대한 저항성 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 식물 또는 식물 부분을 선택하는 단계
를 포함하는, 1종 이상의 시트룰루스 식물 또는 식물 부분, 또는 그로부터 유래된 DNA를 염색체 7 및/또는 9 상의 CGMMV 저항성 부여 단편의 존재에 대해 스크리닝하는 방법이 본원에 포괄된다.
또한, a) 게놈 DNA를 SNP1, SNP2, SNP3, SNP4, SNP5, 및 SNP6 중 1종 이상 또는 전부의 및/또는 SNP7, SNP8, 및 SNP9 중 1종 이상에 대해 및/또는 SNP10, SNP11 및 SNP12 중 1종 이상에 대한 SNP 유전자형에 대해 스크리닝하는 단계; 및 임의로
b) SNP1, SNP2, SNP3, SNP4, SNP5, 및 SNP6 중 1종 이상 또는 전부에 대한 및/또는 SNP7, SNP8, 및 SNP9 중 1종 이상에 대한 및/또는 SNP10, SNP11 및 SNP12 중 1종 이상에 대한 저항성 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 식물 또는 식물 부분을 선택하는 단계
를 포함하는, 1종 이상의 시트룰루스 식물 또는 식물 부분, 또는 그로부터 유래된 DNA를 염색체 1 및/또는 4 및/또는 5 상의 CGMMV 저항성 부여 단편의 존재에 대해 스크리닝하는 방법이 본원에 포괄된다.
자명하게, 스크리닝 방법은 염색체 1, 4, 5, 7 및/또는 9 상의 CGMMV 저항성 부여 단편의 존재에 대해 스크리닝하는 하나의 스크리닝 방법으로 조합될 수 있다.
한 측면에서 시트룰루스 식물 또는 식물 부분 또는 DNA는 잠재적으로 본원에 기재된 바와 같은 QTL 중 1종 이상을 포함하는 시트룰루스 콜로신티스 식물 또는 식물 부분 또는 DNA, 예컨대 종자은행의 PI 수탁물이다. 예를 들어 예를 들어 상기 언급된 USDA GRIN 종자은행의 PI 수탁물은 이 방식으로 스크리닝될 수 있다. 임의로 식물은 예를 들어 본원의 다른 곳에 및 실시예에 기재된 바와 같이, CGMMV 저항성에 대해 시험될 수 있다. 이는 SNP 마커 스크리닝 전에 (예를 들어 CGMMV 검정에서 단지 3 또는 4의 점수를 갖는 식물로 시작하기 위해), 및/또는 선택된 식물 또는 식물 부분이 CGMMV 저항성을 가짐을 확인하기 위해, 마커 스크리닝 후에, 예를 들어 단계 b) 후에 수행될 수 있다.
또다른 측면에서 시트룰루스 식물, 식물 부분 또는 DNA는 이들이 1개 이상의 유전자이입 단편을 포함하는지 여부 및/또는 이형접합성 또는 동형접합성 또는 유전자이입 단편(들)을 포함하는 재조합 염색체의 수를 점검하기 위해 스크리닝되는 시트룰루스 라나투스 아종 불가리스, 예를 들어 변종, 순계 계통, 육종 계통, 이배체, 삼배체, 사배체 등이다.
식물 부분은 식물의 세포 (또는 그로부터 유래된 DNA)를 포함하는 임의의 부분, 예를 들어 잎 또는 잎의 부분, 종자, 종자 외피, 배아, 화분, 꽃, 배주, 뿌리, 줄기, 과실, 과실의 부분, 세포 등일 수 있다. SNP 마커 유전자형에 대해 스크리닝되는 식물 부분은 또한 종자 외피일 수 있는데, 이는 종자 외피가 모체 DNA이기 때문이다. 따라서, F1 잡종의 종자 외피가 스크리닝되고, F1 잡종 자체의 유전자형과 비교되는 경우, 웅성 모체 계통의 유전자형이 추론될 수 있다. 따라서, 잡종의 모체 계통에서 본 발명에 따른 1개 이상의 유전자이입 단편의 존재가 측정될 수 있다. 마커 스크리닝은 다양한 방법, 예컨대 SNP 유전자형분석 검정 (예를 들어 KASP 검정, 택맨 검정, 고해상도 용융 (High Resolution Melting) (HRM) 검정, SNP-유전자형분석 어레이, 예컨대 예를 들어 플루이다임 (Fluidigm), 일루미나 (Illumina) 등을 사용하여 수행될 수 있거나, DNA 시퀀싱이 동등하게 사용될 수 있다.
예를 들어 SNP 마커는 KASP-검정 (\Vww.kpbioscience.co.uk 참조) 또는 다른 검정을 사용하여 검출될 수 있다. KASP-검정은 본원에 기재된 SNP에 대해 개발될 수 있다. SNP에 대한 KASP-검정을 개발하기 위해 2개의 대립유전자 특이적 전방향 프라이머 및 1개의 대립유전자 특이적 역방향 프라이머가 통상적인 일반적 지식에 따라 설계되었다 (예를 들어 문헌 [Allen et al. 2011, Plant Biotechnology J. 9, 1 0 86-1 099], 특히 KASP 검정 방법에 대해 p097-098 참조).
또한, CGMMV가 발생하는 지역에서 본 발명의 재배된 수박 식물 중 임의의 것을 성장시키는 방법이 제공된다.
또한, a) (예를 들어 CGMMV 감수성) 수박 식물 및 CGMMV 저항성 씨. 콜로신티스 식물, 예컨대 NCIMB 42624의 식물 또는 그의 자손 (예를 들어 자가수정에 의해 수득됨) 또는 CGMMV 저항성 수박 식물, 예컨대 CGMMV 저항성 씨. 콜로신티스 식물로부터의 1개 이상의 유전자이입 단편 (예를 들어 QTL7.1 및/또는 QTL9.1을 포함함)을 포함하는 계통 또는 변종 사이의 교배로부터 유래된 수박 식물의 집단을 제공하는 단계,
b) 씨. 콜로신티스 공여자로부터의 1개 이상의 유전자이입 단편을 포함하는 그 집단으로부터 식물을 선택하는 단계 (여기서, 유전자이입 단편은 본원에 기재된 바와 같은 QTL1.1, QTL4.1, QTL5.2, QTL7.1 및/또는 QTL9.1로부터 선택되는 QTL을 포함함)
를 포함하는, 기재된 바와 같은 씨. 콜로신티스 공여자로부터의 유전자이입 단편 (예를 들어 QTL7 및 또는 QTL9를 포함함)을 포함하는 재배된 수박 식물을 선택하는 방법이 제공된다.
식물의 집단은 예를 들어 F2 또는 F3 집단 또는 역교배 집단, 순계 집단 (예를 들어 재조합 순계 계통), 또는 1개 이상의 재조합 염색체, 즉, 씨. 콜로신티스 공여자의 단편을 포함하는 염색체, 특히 QTL1.1을 포함하는 1을 포함하는 재조합 염색체, 및/또는 QTL4.1을 포함하는 재조합 염색체 4, 및/또는 QTL5.2를 포함하는 재조합 염색체 5, 및/또는 QTL7.1을 포함하는 재조합 염색체 7 및/또는 QTL9.1을 포함하는 재조합 염색체 9를 포함하는 임의의 다른 집단일 수 있다.
선택은 본원에 기재된 임의의 방법, 예를 들어 QTL에 연결된 SNP 마커 중 1종 이상에 대한 SNP 유전자형분석, 시퀀싱, CGMMV 저항성 시험 등에 의해 수행될 수 있다.
선택된 식물은 본 발명의 QTL 중 적어도 1종을 포함하며, 또한 본 발명의 실시양태이다.
상기 기재된 방법 중 임의의 것에 의해 수득가능하거나, 수득되거나, 유래가능하거나, 유래되거나, 확인되거나 선택되는 비-유전자 조작된 시트룰루스 식물 세포 또는 식물 (예를 들어 이배체, 삼배체 또는 사배체, 또는 또다른 배수성), 및 그로부터 본원에 기재된 식물 중 임의의 것이 성장될 수 있는 종자는 또한 본 발명의 실시양태이다.
또한, 본 발명에 따른 식물에 의해 수득가능하거나 그로부터 수득되거나, 유래가능하거나 유래된 식물 부분, 예컨대 접지, 싹, 잎, 꽃, 자른 가지, 뿌리, 과실, 과실 부분, 화분, 배주 및 종자는 본 발명의 실시양태이다.
무종자 수박 식물의 생산 및 재배는 대중적이 되었으며, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 정상적인 수박 식물은 이배체 (2n)이다. 무종자 과실 생산 수박은 웅성 이배체 (2n) 수박 식물을 자성 사배체 (4n) 수박 식물과 교배시킴으로써 제조된다. 생성된 F1 종자는 삼배체 (3n)이며, 삼배체 (3n) F1 식물로 성장될 수 있다. F1 식물에서 결과의 유도는 수분을 요구한다. 삼배체 (3n) F1 식물은 가임성 화분을 생산하지 않기 때문에, 소위 수분수 식물은 동일한 필드에 식재되어야 한다. 수분수 식물은 이배체 (2n)이다. 일반적으로 약 1 대 3의 수분수 대 삼배체 (3n) 식물의 비가 수분을 위한 충분한 화분을 제공하기 위해 주어진 계획에서 식재되어야 한다. 이배체 (2n) 수분수 및 자성 삼배체 (3n) 식물의 꽃 사이의 교차-수분은 결과를 유도하며, 삼배체 F1 식물 상에 무종자 삼배체 (3n) 과실의 생산을 초래한다. F1 식물의 이배체 (2n) 및 사배체 (4n) 모체는 각각 종자 함유 과실을 생산하며, 둘 다 자가-수분에 의해 서로로부터 독립적으로 번식될 수 있다.
수확 동안 삼배체 (3n) 과실로부터 용이하게 구별될 수 있는 껍질 패턴을 갖는 작은 식용 불가능한 및/또는 시장화 불가능한 과실을 생산하는 통상적으로 소형 식물인 특수화된 수분수가 제조되었다 (삼배체와 경쟁하지 않기 위해). 식용가능한 및/또는 시장화가능한 이중 목적 수분수 또는 식용 불가능한 및/또는 시장화 불가능한 특수화된 수분수를 사용하는 것의 선택은 재배자가 각각의 수분수에 의해 생산된 종자화된 과실에 대한 시장 또는 사용을 갖는지 여부에 의존한다. 수분수의 선택은 수율에 영향을 미친다. (McGregor & Waters, 2014, HortScience 49(6), 714-721).
일부 수분수는 시장화가능한 이배체 과실을 생산하는 반면, 다른 것들은 소비 및/또는 시장화에 적합하지 않은 과실을 생산한다. 시장화가능한 과실을 생산하는 수분수는 "이중 목적 수분수"로 지칭된다. 무종자 과실로부터 용이하게 구별가능한 식용 불가능한 및 시장화 불가능한 과실을 생산하는 수분수는 "특수화된 수분수"로 지칭된다.
본 발명의 추가의 실시양태에서, 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 시트룰루스 식물은 수분수 식물이거나, 본 발명에 따른 시트룰루스 식물은 필드에서 성장되는 수분수 식물로서 사용된다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 수분수 식물은 이배체 (2n)이다. 본 발명에 따른 수분수 식물은 특수화된 수분수 식물 또는 이중 목적 수분수 식물일 수 있다.
용어 "수분수 식물"은 본원에서 그것만으로는 충분한 생존가능한 화분을 생산하지 않고, 또다른 식물의 수정을 위한 화분을 제공하는 식물에 대해 사용된다.
본 발명에 따른 비-유전자 조작된 시트룰루스 식물 세포를 포함하는 비-유전자 조작된 시트룰루스 식물은 본 발명의 또다른 실시양태이다.
한 측면에서 CGMMV 저항성 식물은 2개의 순계 모체 계통을 서로와 교배시킴으로써 생산된 잡종, 예를 들어 단일 교배 잡종 (F1 잡종)이다. 잡종, 예를 들어 F1 잡종은 CGMMV 저항성 QTL 또는 QTL들에 대해 동형접합성 또는 이형접합성일 수 있다. 추가의 측면에서 CGMMV 저항성 QTL 또는 QTL들을 포함하는 식물은 순계 계통이다.
또한, 그로부터 기재된 식물 중 임의의 것이 성장될 수 있는 종자는 본 발명의 실시양태이다.
더욱이, 본 발명은 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 시트룰루스 식물에 의해 수득가능하거나, 그에 의해 유래가능하거나, 그로부터 수득되거나, 유래되거나, 기원한 식물 부분에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 식물 부분은 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 시트룰루스 식물 세포를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "식물 부분"은 과실, 과실 부분, 근경, 접지, 자른 가지, 화분, 꽃밥, 배주, 배아, 뿌리, 줄기, 잎, 자엽, 배축, 꽃, 캘러스, 식물 물질을 포함하는 시험관내 세포 또는 조직 배양물, 식물 시험관내 번식 물질 등을 비롯한 식물의 임의의 조각 또는 섹션을 의미할 것이다. 식물 부분은 전체 식물로 재생되는 데 적격일 수 있거나 (재생가능한 식물 부분), 이는 전체 식물로 재생되는 데 적격이 아닌 부분일 수 있다 (비-재생가능한 식물 부분). 이러한 비-재생가능한 식물 부분은 전체 식물의 부분 또는 그로부터 식물이 성장될 수 있는 종자의 부분일 수 있다. CGMMV 저항성 QTL 또는 QTL들 및/또는 저항성 QTL(들)을 포함하는 유전자이입 단편(들)은 이러한 식물 부분에 존재하고, 예를 들어 마커 분석 (예를 들어 본원에 기재된 SNP 마커 중 1종 이상을 사용하여), 서열 분석, 염색체 페인팅 등에 의해 검출가능하다.
본 발명에 따른 바람직한 식물 부분은 종자 또는 과실이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 종자 또는 과실은 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 시트룰루스 식물 세포를 포함한다.
또다른 실시양태는 무종자 과실인 본 발명에 따른 과실에 관한 것이다. 마찬가지로, 무종자 과실을 생산하는 본 발명에 따른 시트룰루스 식물은 본 발명의 실시양태이다.
그의 식물학적 의미에서 용어 "과실"은 통상적으로 속씨식물 꽃의 씨방으로부터 발달된 종자 함유 구조인 것으로 이해된다.
관련 기술분야에서 및 특히 육종에서 통상적으로 사용되는 바와 같은 "무종자 과실"은, "과실"의 식물학적 의미에 왠지 모순될 수 있지만, 본 발명의 맥락에서 성숙하거나 생존가능한 종자가 없는 과실인 것으로 이해되어야 한다. 성숙하거나 생존가능한 종자는 각각의 식물에 대해 적절한 조건 하에서 토양에서 발아하고, 식물로 성장될 수 있다. 이 시험은 식물이 무종자 과실을 생산하는 지를 측정하는 데 사용될 수 있다. 무종자 과실은 각각의 식물에 대해 적절한 조건 하에서 발아하고 식물로 성장할 종자를 생산하지 않을 것이다.
본 발명에 따른 추가의 구체적인 실시양태는 본원에 기재된 식물의 식물 번식 물질에 관한 것이거나, 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 식물 세포를 포함하는 번식 물질, 또는 CGMMV 저항성 시트룰루스 식물의 제조를 위한 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능한/수득된 식물의 번식 물질에 관한 것이다. 본 발명의 한 실시양태는 본원에 기재된 바와 같은 QTL 중 1종 이상을 포함하는 식물의 번식 물질이다. 또한, 본 발명에 의해 포함되는 것은 기탁 수탁 번호 NCIMB 42624의 종자로부터 수득된 식물과 또다른 식물을 교배시킴으로써 기원한 식물로부터 수득된/수득가능한 CGMMV 저항성 식물의 번식 물질이다. 바람직하게는 기탁 수탁 번호 NCIMB 42624의 종자로부터 수득된 식물과의 교배로부터 수득된/수득가능한 번식 물질은 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 식물 세포를 포함한다. 한 측면에서 본 발명은 CGMMV 저항성 식물의 번식 물질에 관한 것이며, 상기 식물은 기탁 수탁 번호 NCIMB 42624의 종자 또는 그의 CGMMV 저항성 자손으로부터 수득된/수득가능한, 또는 그에 존재하는 바와 같은 CGMMV 저항성 QTL 또는 QTL들을 포함한다.
여기서, 용어 "번식 물질"은 증식형 (무성생식) 또는 생식형 (유성생식, 생식적) 경로를 통해 자손을 생성하는 데 적합한 식물의 성분을 포함한다. 증식형 번식에 적합한 것은 예를 들어, 자른 가지, 시험관내 조직, 세포, 원형질체, 배아 또는 캘러스 배양물 또는 미세번식 방법이다. 다른 번식 물질로는 예를 들어, CGMMV에 저항성인 과실, 종자, 묘목 등을 들 수 있다. 번식 물질은 한 측면에서 또다른 근경 또는 시험관내 조직 배양 물질, 특히 배아 배양물로 접목시킴으로써 번식되는 자른 가지의 형태를 취한다. 특히 바람직한 것은 시험관내 조직 배양 물질, 특히 시험관내 배아 배양물의 형태의 번식 물질이다. 번식 물질은 기재된 바와 같은 CGMMV 저항성 QTL 또는 QTL들을 포함하는 것으로 이해된다.
접목은 이식 후 농부에 의해 성장되는 묘목의 생산을 위해 식물 산업에서 더욱 더 많이 사용된다. 사실, 이 기법은 근경의 특색, 예컨대 비생물적 스트레스 저항성, 질환 저항성 및 활력을 고 품질 과실을 생산하는 접지의 특색과 조합함으로써 최종 식물의 품질을 개선시킨다.
수박을 접목시키는 것은 문헌 [Davis et al. (2008, Critical Reviews in Plant Sciences Vol. 27, "Cucurbit Grafting", page 50-74)]에서 설명된 바와 같이 다수의 이점을 갖는다. 진균 및 바이러스에 대한 저항성을 제공하는 것 외에도, 접목의 사용은 또한 상이한 비생물적 스트레스, 예컨대 차가운/낮은 온도, 가뭄, 염도, 홍수/물에 대한 내성을 증가시킬 수 있으며, 예를 들어 성장, 수율, 영양분 흡수, 식물 활력, 과실 크기 및 과실 품질에 대한 유익한 효과를 가질 수 있다.
본 발명에 관하여 접목의 주요한 이점은 특히, 현재 수박에서 CGMMV에 의한 감염으로의 경우와 같이, 질환 관리에 대한 유전적 또는 화학적 접근법이 이용가능하지 않거나 충분하지 않은 경우, 토양에서 생긴 질환에 대한 저항성을 제공하거나 향상시키는 근경 또는 접지가 사용될 수 있다는 것이다. 따라서, CGMMV 저항성 근경 또는 접지는 이식 전에 예를 들어 CGMMV 감수성 접지 또는 근경으로의 접목에 사용될 수 있다. CGMMV 감수성 수박 접지는 예를 들어 수박 생산을 위해 CGMMV 저항성 근경 상으로 접목될 수 있거나, CGMMV 저항성 접지는 CGMMV 감수성 근경 상으로 접목될 수 있다. CGMMV 저항성 접지는, CGMMV 바이러스 감염된 감수성 근경 상으로 접목되는 경우, CGMMV 증상이 없는 채 잔류하며 (접지는 4의 CGMMV 점수를 가짐), 즉, 표현형에서 CGMMV 저항성을 갖도록 유지되는 것으로 밝혀졌다.
문헌 [Park et al. (2005, Plant Cell Rep 24, 350)]은 트랜스제닉 식물에서 CGMMV 외피 단백질의 발현을 부여하는 재조합 핵산을 도입함으로써 야생 품종 시트룰루스 라나투스 아종 공다에로부터의 트랜스제닉 CGMMV 저항성 수박 식물의 제조를 개시하고 있다. 박 (Park)은 CGMMV 유도된 수율 손실을 방지하기 위한 시트룰루스 작물 식물로부터의 접지가 접목될 수 있는 근경을 제조하기 위한 트랜스제닉 식물의 용도를 제안한다.
본 발명에서, 놀랍게도, CGMMV 저항성 시트룰루스 접지를 CGMMV로 감염되고 그에 대해 감수성인 시트룰루스 근경 상으로 접목하는 것은 CGMMV 유발된 증상이 없는 시트룰루스 식물의 성장을 가능하게 함이 밝혀졌다. 본 출원의 이점은 CGMMV에 대해 저항성인 근경 및/또는 접지를 포함하는 접목된 시트룰루스 묘목이 증상 없는 식물로 성장될 수 있다는 것이다. 따라서, 이러한 식물을 심지어 토양이 CGMMV로 오염된 지역에서도 과실의 품질 및 수율의 손실 없이 성장시키는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명에 따른 CGMMV 저항성 접지, 특히 CGMMV 감수성 근경일 수 있는 근경과 조합된 본원에 기재된 QTL 중 1종 이상을 포함하는 재배된 수박 접지를 사용하는 것은 접지가 CGMMV 증상이 없는 채 잔류하도록 하는 것을 가능하게 한다.
따라서, 본 발명에 따른 추가의 바람직한 식물 부분은 근경 및/또는 접지이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 근경 및/또는 접지는 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 시트룰루스 식물 세포를 포함한다. 근경 및/또는 접지는 예를 들어 QTL에 연결된 SNP 마커에 의해 검출가능한, 본원에 기재된 QTL 중 1종 이상 (또는 전부)을 포함한다.
한 측면에서 근경 및/또는 접지는 CGMMV 저항성 시트룰루스 근경 또는 접지, 특히 본원에 기재된 QTL 중 1종 이상을 포함하는 본 발명에 따른 씨. 콜로신티스 근경 또는 접지, 예를 들어 NCIMB 42624 또는 그의 후손이다. 문헌 [Bigdelo et al. 2017 (Australian Journal of Crop Science, AJCS, 11(06):727-732)]은 재배된 수박 접지를 갖는 씨. 콜로신티스 근경을 사용하는 것의 이점을 기재하고 있다.
또다른 측면에서 근경 및/또는 접지는 예를 들어 이러한 식물 또는 후손을 재배된 수박과 (역)교배시키고, CGMMV 저항성 씨. 콜로신티스 공여자로부터의 1종 이상의 QTL을 포함하는 자손을 선택함으로써, 예를 들어 수탁 번호 NCIMB 42624 하에 기탁된 종자 또는 그의 후손으로부터 수득가능한, 본원에 기재된 QTL 중 1종 이상을 포함하는 본 발명에 따른 CGMMV 저항성 재배된 수박 근경이다.
식물 접목의 기술 분야에서 사용되는 것과 관련하여 "근경"은 본원에서 그 상으로 접목이 수행되는 떨어진 식물 부분 또는 줄기를 지칭한다. 전형적으로 근경은 접목된 식물의 뿌리 및 하부 줄기 부분을 비롯한 바닥 부분을 나타낸다. 접목 시 또는 직후, 뿌리가 근경에 존재하는 것은 어떤 경우에도 필요하지 않은데, 이는 각각의 경우 뿌리가 이들이 전에 제거된 경우 근경 줄기로부터 재성장할 것이기 때문이다.
"접지"는 단지 공중 부분을 접목된 식물에 지지하는 식물의 떨어진 살아있는 부분 (예컨대 싹 또는 가지)을 지칭한다.
단일 접목 및 이중 접목 둘 다, 수박 접목 방법에 대해서는 또한 본원에 참조로 포함되는 US 2013/0298273 A1을 참조한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서 본 발명에 따른 근경 및/또는 본 발명에 따른 접지는 각각 CGMMV 저항성 시트룰루스 콜로신티스 식물, 예를 들어 QTL(들) 중 1종 이상, 예를 들어 QTL7.1 및/또는 QTL9.1을 포함하는 유전자이입 단편(들)의 공여자로서, 수탁 번호 NCIMB 42624 하에 기탁된 종자 또는 그의 자손으로부터 성장된 식물로부터 기원하거나, 그로부터 수득되거나, 이를 사용함으로써 수득가능한 1종 이상의 QTL을 포함하는 재배된 수박 식물의 근경 또는 접지이다.
또다른 측면에서 본 발명에 따른 근경 및/또는 본 발명에 따른 접지는 각각 수탁 번호 NCIMB 42624 하에 기탁된 종자 또는 그의 자손으로부터 성장된 식물에 의해 수득가능하거나, 그로부터 수득되거나, 유래되거나, 유래가능하거나, 기원한 근경 또는 접지이다.
본 발명의 추가의 실시양태는 적어도 1개의 근경 및 적어도 1개의 접지를 포함하며, 접목된 식물의 적어도 1개의 근경이 본 발명에 따른 근경이거나, 접목된 식물의 적어도 1개의 접지가 본 발명에 따른 접지이고/거나, 접목된 식물의 적어도 1개의 근경이 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 시트룰루스 식물 세포를 포함하거나, 접목된 식물의 적어도 1개의 접지가 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 시트룰루스 식물 세포를 포함하는 것인 접목된 식물에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 실시양태는 접목된 식물의 적어도 1개의 접지가 본 발명에 따른 접지이고/거나, 접목된 식물의 적어도 1개의 접지가 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 시트룰루스 식물 세포를 포함하는 것인 본 발명에 따른 접목된 식물에 관한 것이다. 따라서, 한 측면에서 접지는 본 발명의 CGMMV 저항성 식물의 것이며, 특히 QTL 중 1종 이상을 포함하는 재배된 수박 접지이다. 근경은 CGMMV 감수성 근경일 수 있으며, 예를 들어 이는 또한 CGMMV 저항성 근경일 수 있다. 마찬가지로 이는 임의의 통상적으로 공지된 근경, 예컨대 라게나리아 (Lagenaria) 또는 쿠쿠르비타 (Cucurbita) 근경 또는 본원에 기재된 및 관련 기술분야에 공지된 다른 것들일 수 있다.
대안적으로 2개의 접지는 단일 근경 상으로 접목될 수 있으며, 따라서 한 측면에서 2개의 접지 중 적어도 하나, 임의로 둘 다의 접지는 본 발명의 CGMMV 저항성 식물, 특히 재배된 수박의 접지이다.
또다른 실시양태에서 본 발명에 따른 접목된 식물은 본 발명에 따른 근경인 적어도 1개의 근경을 포함하고/거나, 접목된 식물의 적어도 1개의 근경은 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 시트룰루스 식물 세포를 포함한다.
추가의 실시양태에서, 본 발명에 따른 접목된 식물은 묘목 또는 접목된 묘목이다.
본 발명과 관련하여 용어 "접목된 식물"은 단일 식물로서 성장하는 것으로 보이거나 성장하고 있는 식물을 지칭하지만, 식물은 상이한 식물 부분으로 구성되며, 여기서, 식물 부분은 상이한 유전자형을 갖는 식물로부터 기원한다. 통상적으로 상이한 식물 부분은 지정된 근경 및 접지이다.
"접목"은 그들 상이한 식물 부분이 단일 식물로서 성장하는 것으로 보이거나 성장하도록 상이한 유전자형을 갖는 상이한 식물 부분을 함께 연결하는 방법을 지칭한다.
본원에서 "묘목"은 어린 식물, 특히 종자의 배아로부터 발달하는 것을 지칭한다.
본원에서 "접목된 묘목"은 상이한 유전자형을 갖는 상이한 묘목의 부분으로 이루어진 어린 식물을 지칭한다. 통상적으로 상이한 부분은 지정된 근경 및 접지이다.
접목된 식물 또는 묘목은 상이한 식물의 2개 초과의 부분으로 이루어질 수 있음은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 접목된 식물은 예를 들어 단일 초과의 근경으로 구성될 수 있다. 이러한 종류의 식물을 제조하는 데 사용되는 방법은 관련 기술분야에 통상적으로 공지되어 있으며, 단일 근경-접목과 대조적으로 "다중-근경 접목"으로 지칭된다. 1개 ("단일-근경 접목"), 2개 ("이중-근경 접목") 또는 3개 ("삼중-근경 접목") 근경을 갖는 접목된 수박 식물 또는 접목된 수박 식물을 제조하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 (Qin et al., 2014, Not Bot Agrobo 42(2), 495-500)에 기재되었다.
따라서, 본 발명의 추가의 실시양태는 1개, 2개 또는 3개의 근경을 포함하는 본 발명에 따른 접목된 식물 또는 본 발명에 따른 접목된 묘목에 관한 것이다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 접목된 식물 또는 본 발명에 따른 접목된 묘목은 2개의 근경, 보다 더 바람직하게는 1개의 근경을 포함한다.
시트룰루스 접지를 시트룰루스 근경에 접목시키는 것은 통상적이다. 수박 접목의 대다수의 경우에, 다른 박류 식물, 특히 언급하면 라게나리아, 쿠쿠르비타 속 및 종간 쿠쿠르비타 잡종으로부터의 근경이 사용된다. 수박 식물은 예를 들어 푸사리움 윌트 (Fusarium wilt)를 방제하기 위해, 저온 내성을 증가시키기 위해 및 물 및 식물 영양분 흡수를 향상시킴으로써 수율을 증가시키기 위해 다른 박류 식물로부터의 근경 상으로 접목된다. 수박을 접목시키는 데 통상적으로 사용되는 근경은 쿠쿠르비타 모스카타 (Cucurbita moschata) (호박 (pumpkin)), 쿠쿠르비타 막시마 (Cucurbita maxima) (호박 (squash)), 베닌카사 히스피다 (Benincasa hispida) (겨울 멜론), 라게나리아 시케라리아 (보톨 박 (bottole gourd)) 뿐만 아니라 상기 언급된 종의 잡종, 예를 들어 쿠쿠르비타 막시마 × 쿠쿠르비타 모스카타이다 (Yetisir & Sari, 2003, Austarlian J. Experimental Agriculture 43, 1269-1274).
접목된 수박 식물에서 라게나리아 시케라리아, 베닌카사 히스피다, 쿠쿠르비타 모스카타, 쿠쿠르비타 페포 및 쿠쿠르비타 막시마 × 쿠쿠르비타 모스카타의 잡종으로부터의 근경은 예를 들어 푸사리움 윌트 방제에 사용되고, 시시오스 안굴라투스 (Sicyos angulatus) 근경은 예를 들어 선충 방제에 사용된다. 쿠쿠르비타 막시마 × 쿠쿠르비타 모스카타의 잡종, 쿠쿠르비타 모스카타 또는 쿠쿠르비타 페포 근경은 또한 저온에 대한 저항성을 증가시키기 위해 수박 접목에 사용된다 (Singh & Rao, 2014, Agri. Reviews 35(1), 24-33).
각각의 근경에 접목된 본 발명에 따른 접지를 사용하는 것은 이제 다른 생물적 스트레스 또는 비생물적 스트레스 외에도 시트룰루스 작물 식물에서 CGMMV 감염의 제어를 가능하게 한다. 이는 본 발명에 따른 접지를 특이적 생물적 (예를 들어 푸사리움 또는 선충 감염) 및/또는 비생물적 (예를 들어 저온) 스트레스를 제어하는 것과 같은, 재배 지역에서 각각의 필요에 따라 선택될 수 있는 각각의 근경에 접목시킴으로써 달성될 수 있다.
따라서, 본 발명의 추가의 실시양태는 적어도 1개의 근경이 시트룰루스 식물로부터 또는 상이한 속의 식물로부터의 것이고, 바람직하게는 상이한 속의 식물로부터의 근경이 쿠쿠르비타, 라게나리아, 시시오스 (Sicyos) 또는 베닌카사 (Benincasa)의 식물 또는 이들 속으로부터의 식물 사이의 잡종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 본 발명에 따른 접목된 식물 또는 본 발명에 따른 접목된 묘목에 관한 것이다. 보다 바람직한 실시양태에서 본 발명에 따른 접목된 식물 또는 본 발명에 따른 접목된 묘목은 시트룰루스 라나투스 식물, 쿠쿠르비타 모스카타 식물, 쿠쿠르비타 막시마 식물, 쿠쿠르비타 페포 식물, 베닌카사 히스피다 식물, 라게나리아 시케라리아 식물, 시시오스 안굴라투스 식물 또는 쿠쿠르비타 막시마 × 쿠쿠르비타 모스카타의 잡종 식물로부터의 적어도 1개의 근경을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 접목된 식물 또는 본 발명에 따른 접목된 묘목은 본 발명에 따른 접지를 포함하고, 라게나리아 식물, 시트룰루스 라나투스 식물, 쿠쿠르비타 모스카타 식물, 쿠쿠르비타 막시마 식물 또는 쿠쿠르비타 막시마 × 쿠쿠르비타 모스카타의 잡종 식물로 이루어진 군으로부터 선택되는 식물로부터 수득된 근경을 포함하고, 보다 더 바람직하게는 근경은 시트룰루스 라나투스 또는 쿠쿠르비타 막시마 × 쿠쿠르비타 모스카타의 잡종 식물로부터 선택되는 식물로부터 수득된다.
본 발명과 관련하여 바람직한 쿠쿠르비타 막시마 × 쿠쿠르비타 모스카타 잡종은 쿠쿠르비타 막시마 × 쿠쿠르비타 모스카타 품종 에르콜 (Cucurbita moschata cultivar Ercole) (넌헴스; 시판됨)이다. 다른 바람직한 근경은 신토사 (Shintosa), 예를 들어 신토사 카멜포르세 (Shintosa Camelforce) (넌헴스; 시판됨) 또는 라게나리아 근경, 예를 들어 라게나리아 잡종 근경 콜로소 (Colosso) (넌헴스; 시판됨)이다.
근경에 대해서와 같이, 접목된 식물은 1개 초과의 접지를 가질 수 있음이 또한 관련 기술분야에 확립되어 있다. 근경에 접목된 2개의 접지를 포함하는 이중 접목된 또는 "이중-접지 접목된" 수박 식물은 예를 들어 WO2012062672 A1 및 US 20130298273에 기재되었다. US 20130298273은 접지가 유전적으로 동일한 식물로부터의 또는 유전적으로 상이한 식물로부터의 것일 수 있는 근경에 접목된 2개의 접지를 갖는 수박 식물을 개시하고 있다. 접지는 이배체 (2n) 또는 삼배체 (3n)일 수 있다. 유전적으로 상이한 식물로부터 수득된 접지에 관하여, 근경에 접목된 1개의 접지는 이배체 (2n)일 수 있고, 동일한 근경에 접목된 다른 접지는 삼배체 (3n)일 수 있다. 동일한 근경에 접목된 이배체 (2n) 및 삼배체 (3n) 접지의 이러한 조합은 무종자 과실을 생산하는 데 사용될 수 있으며 (본원에서 상기 참조), 이들 상황 하에서의 이배체 접지는 특수화된 수분수 또는 이중 목적 수분수일 수 있다.
따라서, 본 발명의 추가의 실시양태는 접목된 식물 또는 묘목이 적어도 2개의 접지를 포함하고, 적어도 1개의 접지가 본 발명에 따른 접지이고/거나, 적어도 1개의 접지가 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 시트룰루스 식물 세포를 포함하는 것인 본 발명에 따른 접목된 식물 또는 본 발명에 따른 접목된 묘목에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서 본 발명에 따른 접목된 식물 또는 본 발명에 따른 접목된 묘목은 본 발명에 따른 2개의 접지를 포함하고/거나, 2개의 접지의 각각은 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 시트룰루스 식물 세포를 포함한다. 한 추가의 실시양태에서 본 발명에 따른 2개의 접지는 동일한 (identical) (동일한 (same)) 유전자형을 갖고/거나, 2개의 접지는 동일한 (동일한) 유전자형을 갖는 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 시트룰루스 식물 세포를 포함한다. 또다른 실시양태에서 본 발명에 따른 2개의 접지는 상이한 유전자형을 갖고/거나, 2개의 접지는 서로와 상이한 유전자형을 갖는 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 시트룰루스 식물 세포를 포함하고, 바람직하게는 1개의 접지는 이배체 (2n)이고, 다른 접지는 삼배체 (3n)이다. 1개의 접지는 이배체 (2n)이고, 다른 접지는 삼배체 (3n)인 본 발명에 따른 접목된 식물 또는 본 발명에 따른 접목된 묘목에 관하여, 이배체 (2n) 접지는 특수화된 수분수 또는 이중 목적 수분수일 수 있다.
한 구체적인 실시양태에서 본 발명에 따른 접목된 식물은 본 발명에 따른 적어도 1개의 근경 및 본 발명에 따른 적어도 1개의 접지를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 접목된 식물은 본 발명에 따른 1개의 근경 및 본 발명에 따른 적어도 1개의 접지를 포함하거나, 본 발명에 따른 접목된 식물은 본 발명에 따른 적어도 1개의 근경 및 본 발명에 따른 1개의 접지를 포함한다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 접목된 식물은 본 발명에 따른 1개의 근경 및 본 발명에 따른 1개의 접지를 포함한다.
수박을 비롯한 접목된 식물의 제조를 위한 방법은 관련 기술분야에서 통상적이다. 수동 (수작업) 접목 및 기계 (로봇식) 접목 방법이 확립되었다. "혀 접근 접목", "구멍 삽입 접목", "1자엽 접목" 및 "사이드 접목"을 비롯한 다양한 접목 기법은 수박에 대해 공지되어 있다. (Hassell et al., 2008, HortScience 43(6), 1677).
수박을 비롯한 채소에서의 접목 방법은 또한 문헌 [Singh & Rao (2014, Agri. Reviews 35(1), 24-33)]에 검토되어 있다.
상기 본원에서 논의된 바와 같이, CGMMV 저항성 시트룰루스 식물의 제공은 이제 CGMMV에 대해 저항성인 추가의 시트룰루스 작물 식물의 제조를 가능하게 한다.
따라서, 본 발명의 추가의 측면은
a) CGMMV 저항성 시트룰루스 식물 (공여자)을 또다른 시트룰루스 식물 (수용자), 예를 들어 CGMMV 감수성 식물과 교배시키거나, 이러한 교배의 자손을 제공하는 단계, 및
b) 단계 a)에 따라 교배된 식물로부터 종자를 수득하거나, CGMMV 저항성을 포함하는 종자/식물을 선택하는 단계
를 포함하는, CGMMV 저항성 시트룰루스 식물의 제조를 위한 방법에 관한 것이다.
방법은 임의로 단계 b)에서의 종자로부터 성장된 식물을 1회 이상 자가수정 및/또는 역교배 (예를 들어 단계 a)에서의 다른 시트룰루스 식물에 대해, 예를 들어 감수성 재배된 수박 계통 또는 변종에 대해)시키고, CGMMV 저항성 (예를 들어 QTL 중 1종 이상)을 포함하는 자가수정 후손 및/또는 역교배 후손을 선택하는 것을 더 포함할 수 있다.
CGMMV 저항성 공여자 식물은 본원에 기재된 QTL에 연결된 SNP 마커 중 1종 이상을 사용하여 표현형적으로 및/또는 유전자형적으로 선택될 수 있다. 따라서, 예를 들어 공여자는 QTL1.1, QTL4.1, QTL5.2, QTL7.1 및 QTL9.1 중 1종 이상 또는 전부를 포함할 수 있다. 공여자는 예를 들어 이미 QTL 중 1종 이상이 유전자이입되었고, 이 방법으로 또다른 CGMMV 감수성 식물 내로 전달되는 씨. 콜로신티스 공여자 (임의로 1회 이상 자가수정됨) 또는 시트룰루스 라나투스 아종 불가리스 공여자일 수 있다.
공여자로부터 유래된 CGMMV 저항성을 포함하는 공여자의 및/또는 후손의 선택은 본원에 기재된 바와 같이, 예를 들어 표현형적으로, 예를 들어 기계적 잎 접종을 사용하여 저항성 표현형을 측정하고/거나, RT-qPCR, 및/또는 CGMMV 바이러스를 검출하기 위한 다른 검정, 예컨대 ELISA 또는 도트-블롯, 및/또는 CGMMV 증상을 검출하기 위한 퀵 검정, 예컨대 뿌리를 바이러스 용액 내로 디핑하거나, 종자를 바이러스 용액에 흡인하는 것 등을 사용하여 CGMMV 바이러스 수준을 검출하고/거나, 본원에 기재된 바와 같은 QTL에 연결된 1종 이상의 분자 마커를 사용하여 유전자형적으로 수행될 수 있다. 따라서, 예를 들어 공여자는 CGMMV 저항성에 대해 및/또는 예를 들어 모두 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이, QTL1.1에 연결된 SNP1, SNP2, SNP3, SNP4, SNP5 및/또는 SNP6 중 1종 이상; 및/또는 QTL4.1에 연결된 SNP7, SNP8 및/또는 SNP9 중 1종 이상; 및/또는 QTL5.2에 연결된 SNP10, SNP11 및/또는 SNP12 중 1종 이상; 및/또는 QTL7.1에 연결된 SNP13, SNP14, SNP15, SNP16, SNP17 및/또는 SNP18 중 1종 이상; 및/또는 QTL9.1에 연결된 SNP19, SNP20, SNP21, SNP22, SNP23 및/또는 SNP24 중 1종 이상에 대한 CGMMV 저항성 공여자 유전자형에 대해 시험될 수 있다.
시트룰루스 식물의 제조를 위한 본 발명에 따른 방법에서 단계 a)에서의 CGMMV 저항성 식물은 그것이 CGMMV에 대해 저항성인 한, 임의의 시트룰루스 식물일 수 있다. 바람직하게는 단계 a)에서 제공되는 시트룰루스 식물은 22의 이배체 (2n) 염색체 수를 갖는 시트룰루스 식물이고/거나, 시트룰루스 작물 식물과 교배가능하다. 보다 바람직하게는, 단계 a)에서의 CGMMV 저항성 식물은 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 식물이고, 보다 바람직하게는 이는 시트룰루스 콜로신티스 종의 식물이고, 보다 더 바람직한 것은 이는 수탁 번호 NCIMB 42624 하에 기탁된 종자로부터 성장된 식물이다. 또다른 측면에서 이는 예를 들어 씨. 콜로신티스 공여자로부터 유전자이입된 CGMMV 저항성 QTL 중 1종 이상 또는 전부, 예를 들어 NCIMB 42624 하에 기탁된 종자 또는 그의 CGMMV 저항성 자손으로부터 수득된/수득가능한 바와 같은 QTL 중 1종 이상을 포함하는 기재된 바와 같은 재배된 수박 식물이다.
따라서, 상기 방법은 QTL 중 1종 이상을 포함하는 공여자 및/또는 후속을 선택하기 위해, DNA를 QTL 중 임의의 1종 이상에 연결된 1종 이상의 마커에 대해 분석하는 단계를 임의로 포함할 수 있다. 한 측면에서 QTL7.1 및/또는 QTL9.1은 공여자에 존재하며, 교배의 후손에게 전달된다. 공여자가 유전자이입 단편 (QTL을 포함함)을 이미 포함하는 재배된 수박의 우량 계통 또는 변종인 경우, 이는 단순히 유전자이입 단편을 포함하는 재조합 염색체를 보유하는 자손을 선택하는 문제이다. 이는 표현형적 시험 및/또는 예를 들어 KASP 검정 또는 다른 유전자형분석 검정에서 SNP 마커 중 1종 이상을 사용하여 유전자형분석에 의해 간단히 수행될 수 있다. 자명하게 또한 다른 방법, 예컨대 시퀀싱은 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 서열이 존재하는 지를 측정하는 데 사용될 수 있다.
교배는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 대해 통상적인 프로세스이다. 시트룰루스 식물의 제조를 위한 본 발명에 따른 방법에서 단계 a)에서의 다른 시트룰루스 식물은 바람직하게는 시트룰루스 라나투스, 시트룰루스 콜로신티스 또는 시트룰루스 나우디니아누스 식물이고, 보다 바람직하게는 식물은 시트룰루스 라나투스 식물이고, 가장 바람직한 것은 이는 시트룰루스 라나투스 아종 불가리스 식물이다. 한 측면에서 이는 CGMMV 감수성 재배된 수박 계통 또는 변종이다.
식물 조직에서 CGMMV 코딩된 단백질의 검출을 위한 검정은 시판되며, 예를 들어 CGMMV 검출용 ELISA 시약 세트 (Reagent Set) 또는 CGMMV 이뮤노스트립 (ImmunoStrip) 시험 둘 다는 미국 46514 인디아나주 엘크하르트 카운티 로드 1 52642 아그디아, 인크. (Agdia, Inc.)에 의해 판매 중이다. 그들 시험은 감염된 식물에서 CGMMV 단백질을 검출하는 데 적합하며, 따라서 또한 이전에 접종된 식물에서 바이러스 단백질의 부재를 나타내기 위해 사용될 수 있다.
CGMMV RNA는 다양한 방법에 의해, 예를 들어 본원에서 일반적 방법 하에 기재된 바와 같은 PCR 기재 분석에 의해 식물 물질에서 검출될 수 있다. CGMMV에 대한 고도로 민감성 실시간 역전사 PCR 시험은 문헌 [Hongyun et al. (2008, J Virological Methods 149, 326-329)]에 의해 기재되었다.
CGMMV 저항성 식물을 확인하기 위한 바람직한 표현형적 시험은 본원에서 일반적 방법 하에 기재된 육안으로 평가되는 증상에 기초한 시험이지만, 명백하게 다른 시험, 예컨대 적절한 감수성 대조군을 포함하는 필드 시험이 존재한다.
또다른 실시양태에서, 시트룰루스 식물의 제조를 위한 본 발명에 따른 방법은 확인된 CGMMV 저항성 시트룰루스 식물을 사용함으로써 추가의 시트룰루스 식물을 제공하는 추가의 단계를 포함한다. 주어진 식물로부터의 추가의 식물의 제조는 관련 기술분야에 널리 확립되어 있다. 제조된 추가의 식물은 이들이 CGMMV에 대해 저항성이라는 점을 특징으로 한다. 이들 추가의 식물은 증식형 (무성생식) 또는 생식형 (유성생식, 생식적) 생식에 의해, 또는 다른 시트룰루스 식물과 교배시킴으로써 제조될 수 있다. 증식형 번식에 적합한 것은 예를 들어, 자른 가지, 시험관내 조직, 세포, 원형질체, 배아 또는 캘러스 배양물, 미세번식, 구근 또는 괴경이다. 다른 번식 물질로는 예를 들어, CGMMV에 대한 저항성을 부여하는 염색체 단편에 대해 이형접합성 또는 동형접합성인 과실, 종자, 묘목을 들 수 있다.
식물의 미세번식을 비롯한 증식형 (무성생식) 번식을 위한 기법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 바나나, 감귤류, 망고, 파파야, 아보카도 (스위트) 멜론에 대해 기재되어 있으며, 문헌 [Pua and Davey (2007, Springer Science & Business Media, ISBN: 3540491619, 9783540491613)]에 기재되었다. 문헌 [Sultana and Rhaman (2012, LAP Lambert Academic Publishing, ISBN-13: 978-3-8484-3937-9)]은 예를 들어 수박에 대한 다양한 조직 배양물 및 미세번식 방법을 개시하고 있다.
한 실시양태에서, 시트룰루스 식물의 제조를 위한 본 발명에 따른 방법은 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 시트룰루스 식물의 제조를 위한 방법이다.
시트룰루스 식물의 제조를 위한 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능한/수득된 식물은 또한 본 발명의 실시양태이다.
상기 본원에서 논의된 바와 같이, 본원에서 논의된 CGMMV 저항성 식물은 또한 CGMMV 저항성 접목된 식물을 생산하는 데 적합하다.
따라서, 본 발명의 추가의 실시양태는
a) 시트룰루스, 쿠쿠르비타, 라게나리아, 시시오스 또는 베닌카사 속 또는 이들 속 중 임의의 것의 2개의 종의 교배에 의해 생산된 잡종의 군의 식물로부터 선택되는 근경을 제공하는 단계,
b) 본 발명에 따른 접지를 제공하는 단계,
c) 단계 b)에 따른 접지를 단계 a)에 따른 근경에 접목시키는 단계
를 포함하는, 접목된 식물 또는 접목된 묘목을 제조하는 제1 방법에 관한 것이다.
시트룰루스 식물의 접목을 위한 다양한 속으로부터의 근경을 사용하는 것은 관련 기술분야에 통상적임은 상기 본원에서 기재되었다. 접목된 식물 또는 접목된 묘목을 제조하기 위한 본 발명에 따른 제1 방법의 단계 a)에 관하여, 근경은 따라서 단계 a)에서 지시된 속으로부터 수득될 수 있다. 접목된 식물 또는 접목된 묘목을 제조하기 위한 본 발명에 따른 제1 방법의 단계 a)에서 언급된 잡종은 지시된 속으로부터 선택되는 2개의 상이한 종의 교배에 의해 수득되는 임의의 잡종일 수 있다. 따라서, 잡종은 동일한 속의 2개의 상이한 종을 교배시킴으로써, 또는 상이한 속으로부터의 2개의 상이한 종의 교배에 의해 수득될 수 있다.
바람직하게는 단계 a)에 따른 근경은 시트룰루스 라나투스, 쿠쿠르비타 모스카타, 쿠쿠르비타 막시마, 쿠쿠르비타 페포, 베닌카사 히스피다, 라게나리아 시케라리아, 시시오스 안굴라투스 또는 2개의 쿠쿠르비타 종의 교배에 의해 생산된 잡종 식물로 이루어진 종의 군으로부터 선택된다.
구체적인 근경에 대한 예는 넌헴스 근경 변종 마시스 (Macis) F1 (라게나리아 시케라리아 종), Nun 3001 RT F1 (라게나리아 시케라리아 종), 신토사 카멜포르세 F1 (종간 쿠쿠르비타 잡종), 에르콜 F1 (종간 쿠쿠르비타 잡종); 또는 시겐타 (Syngenta)의 근경 변종 엠파시스 (Emphasis) (라게나리아 유형 근경) 및 스트롱 토사 (Strong Tosa) (종간 호박 잡종)로부터; 또는 다른 수박 혼화성 근경으로부터의 것이다.
한 구체적인 실시양태에서, 접목된 식물 또는 접목된 묘목을 제조하는 본 발명에 따른 방법의 단계 a)에 관하여, 근경은 본 발명에 따른 근경이고/거나, 근경은 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 시트룰루스 식물 세포를 포함한다.
접목된 식물 또는 접목된 묘목을 제조하는 본 발명에 따른 제1 방법의 단계 b)에 따른 접지는 본 발명에 따른 접지의 실시양태로서 본원에 기재된 임의의 접지일 수 있다. 바람직하게는 단계 b)에 따른 접지는 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 시트룰루스 식물로부터 수득되고, 보다 바람직하게는 접지는 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 시트룰루스 라나투스 식물로부터, 가장 바람직하게는 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 시트룰루스 라나투스 아종 불가리스 식물로부터 수득된다.
본 발명의 추가의 실시양태는
a) 본 발명에 따른 근경을 제공하는 단계,
b) 시트룰루스 식물의 접지를 제공하는 단계,
c) 단계 b)에 따른 묘목을 단계 a)에 따른 근경에 접목시키는 단계
를 포함하는, 접목된 식물 또는 접목된 묘목을 제조하는 제2 방법에 관한 것이다.
접목된 식물 또는 접목된 묘목을 제조하는 본 발명에 따른 제2 방법의 단계 a)에 따른 근경은 본 발명에 따른 근경의 실시양태로서 본원에 기재된 임의의 근경일 수 있다. 바람직하게는 단계 a)에 따른 근경은 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 시트룰루스 식물로부터 수득되고, 보다 바람직하게는 근경은 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 시트룰루스 콜로신티스 또는 시트룰루스 라나투스 (시트룰루스 라나투스 아종 불가리스를 포함함) 식물로부터 수득된다. 한 측면에서 NUN 42624 또는 그의 CGMMV 저항성 후손은 단계 a)에서 근경으로서 사용된다.
접목된 식물 또는 접목된 묘목을 제조하는 본 발명에 따른 제2 방법의 단계 b)에 따른 접지는 시트룰루스 라나투스, 시트룰루스 콜로신티스 또는 시트룰루스 나우디니아누스로부터 선택되는 임의의 종의 접지일 수 있다. 바람직하게는 접지는 시트룰루스 라나투스 식물의 접지이고, 보다 더 바람직하게는 접지는 시트룰루스 라나투스 아종 불가리스 식물의 접지이다. 한 측면에서 접지는 기재된 QTL 중 1종 이상을 포함하는 본 발명에 따른 CGMMV 저항성 식물의 재배된 수박 접지이다.
한 구체적인 실시양태에서, 접목된 식물 또는 접목된 묘목을 제조하는 본 발명에 따른 제2 방법의 단계 b)에 관하여, 접지는 본 발명에 따른 접지이고/거나, 접지는 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 시트룰루스 식물 세포를 포함한다.
널리 공지된 접목 방법은 본원에서 논의되었으며, 접목된 식물 또는 접목된 묘목을 제조하는 본 발명에 따른 제1 및 제2 방법의 단계 c)에 관하여 그에 따라 여기서 적용가능하다. 임의로, 사용되는 접목 방법에 따라, 접목물이 마르는 것을 예방하고 치유를 지지하기 위해 근경 및 접지를 융합한 후, 근경 및 접지 사이의 융합된 영역을 밀봉제 (예를 들어 알루미늄)로 덮을 수 있고/거나, 접목 클립 또는 실리콘 슬리브를 근경 및 접지를 함께 유지하기 위해 사용할 수 있다.
임의로, 접목된 식물 또는 접목된 묘목을 제조하는 본 발명에 따른 제1 또는 제2 방법은 단계 c)에서 수득된 접목물이 치유실 또는 항습 챔버에 정치되는 추가의 단계 d)를 포함한다. 바람직하게는 접목물은 치유 프로세스가 완결될 때까지 치유실 또는 항습 챔버에서 유지된다. 치유 프로세스가 완결된 후, 식물은 이들이 이식되기 전에 기후순화를 위해 온실 내로 놓인다.
본 발명의 한 구체적인 실시양태에서, 접목된 식물 또는 접목된 묘목을 제조하는 본 발명에 따른 제1 또는 제2 방법의 단계 a)에 따른 근경 및 단계 b)에 따른 접지는 각각 본 발명에 따른 근경 또는 접지의 실시양태로서 본원에 기재된 임의의 근경 또는 임의의 접지일 수 있다. 바람직하게는 단계 b)에 따른 접지는 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 시트룰루스 식물로부터 수득되고, 보다 바람직하게는 단계 a)에 따른 근경은 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 시트룰루스 콜로신티스 또는 시트룰루스 라나투스 식물로부터의, 가장 바람직하게는 본 발명에 따른 시트룰루스 라나투스 아종 불가리스 식물로부터의 근경이다. 바람직하게는 단계 b)에 따른 접지는 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 시트룰루스 식물로부터 수득되고, 보다 바람직하게는 접지는 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 시트룰루스 라나투스 식물로부터, 가장 바람직하게는 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 시트룰루스 라나투스 아종 불가리스 식물로부터 수득된다.
한 실시양태에서 접목된 식물 또는 접목된 묘목을 제조하는 본 발명에 따른 제1 또는 제2 방법은 본 발명에 따른 접목된 식물 또는 접목된 묘목을 제조하는 데 사용된다. 따라서, 또한 적어도 2개의 상이한 근경 및/또는 적어도 2개의 상이한 접지를 갖는 접목된 식물 또는 접목된 묘목은 접목된 식물 또는 접목된 묘목을 제조하는 본 발명에 따른 제1 또는 제2 방법에 의해 제조될 수 있음이 이해된다.
접목된 식물 또는 접목된 묘목의 제조를 위한 본 발명에 따른 제1 또는 제2 방법에 의해 수득가능하거나 수득된 CGMMV 저항성 접목된 식물 또는 묘목은 또한 본 발명의 실시양태이다.
본 발명에 따른 식물의 제공은 이제 시트룰루스 식물의 CGMMV 감염을 방지하거나, 시트룰루스 과실의 CGMMV 유도된 수율 손실을 방지하거나, 감소시키거나, 예방하거나, 시트룰루스 식물로부터 CGMMV 저항성 종자를 생산하는 것을 허용한다.
따라서, 본 발명의 추가의 실시양태는 본 발명에 따른 종자를 심거나, 본 발명에 따른 접목된 식물을 이식하거나, 본 발명에 따른 접목된 묘목을 이식하는 단계,
단계 a)에 따라 심겨진 식물을 성장시키거나, 접목된 식물 또는 접목된 묘목을 성장시키는 단계
를 포함하는, 시트룰루스 식물에서 CGMMV 감염을 방지하는 방법에 관한 것이다.
"이식"은 본원에서 수작업 또는 기계에 의한 묘목 또는 접목된 묘목의 재배 또는 성장 영역 내로의 전달을 기재하기 위해 사용된다.
시트룰루스 식물의 CGMMV 감염을 방지하는 본 발명에 따른 방법의 단계 a)에서, 종자는 바람직하게는 필드, 화분 또는 트레이와 같은 시트룰루스 식물을 성장시키는 데 적합한 임의의 영역일 수 있는 재배 영역 내로 심겨지며, 여기서, 화분 또는 트레이는 개방된 공간 내로 또는 온실 내로 정치될 수 있고, 성장 영역은 예를 들어 호일 또는 게이즈 터널 (gaze tunnel)로 덮이거나, 그렇지 않을 수 있다.
바람직하게는 CGMMV를 방지하는 본 발명에 따른 방법의 단계 b)에 따라 성장된 시트룰루스 식물은 단계 a)에 따른 종자 또는 접목된 이식묘에 의해 포함되는 CGMMV에 대한 저항성으로 인해, CGMMV로의 감염 시 CGMMV에 의해 유발되는 증상을 나타내지 않거나 (규모 4), 경도 증상 (규모 3)을 나타낸다.
한 구체적인 실시양태에서 CGMMV 감염을 방지하는 본 발명에 따른 방법은 시트룰루스 식물의 과실의 CGMMV 유도된 수율 손실을 방지하거나, 감소시키거나, 예방하기 위한 방법이며, 여기서, 방법은 단계 b)에 따라 성장된 식물로부터 과실을 수확하는 추가의 단계 c)를 포함한다.
시트룰루스 식물, 특히 재배된 수박 식물의 과실의 CGMMV 유도된 수율 손실을 방지하거나, 감소시키거나, 예방하는 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능하거나 수득된 CGMMV 저항성 식물의 과실은 또한 본 발명의 실시양태이다. 과실은 QTL에 연결된 SNP 마커에 의해 검출가능한 QTL 중 1종 이상의 존재로 인해 다른 과실로부터 구별될 수 있다. 다시 말해서, 과실은 씨. 콜로신티스 공여자로부터의 유전자이입 단편을 포함하는 적어도 1개의 재조합 염색체를 포함하며, 유전자이입 단편은 QTL에 연결된 서열 및 SNP 마커에 의해 검출가능하다. 과실은 바람직하게는 양호한 농경적 품질의 것이며, 높은 브릭스, 양호한 과실 텍스처를 갖고, CGMMV 감염의 내부 증상이 없다. 바람직하게는 CGMMV 바이러스는 예를 들어 RT-qPCR을 사용하여 과실에서 검출가능하지 않다. 과실은 배수성에 따라 1, 2, 3, 또는 4개의 재조합 염색체를 포함한다. 한 측면에서 과실은 삼배체 및 무종자이고, 재조합 염색체의 3개의 카피 및 따라서 유전자이입 단편의 3개의 카피 및 공여자 SNP 뉴클레오티드의 3개의 카피를 포함하며, 예를 들어 QTL7.1에 연결된 SNP14에 대해 SNP 유전자형은 저항성 식물 및 식물 부분에 대해 'AAA' (서열식별번호: 14의 3개의 카피)일 것이다. QTL7.1에 대해 동형접합성인 이배체 수박 식물에서, SNP 유전자형은 SNP14에 대해 'AA'일 것이고, QTL7.1에 대해 동형접합성인 사배체 수박 식물에서, SNP 유전자형은 SNP14에 대해 'AAAA'일 것이다. 표 1 및 표 6의 다른 SNP 마커에 대해서도 동일한 것이 적용된다. SNP 유전자형분석은 다양한 방법에 의해 수행될 수 있으며, 예를 들어 KASP 검정 또는 다른 방법, 예컨대 시퀀싱 등이 사용될 수 있다.
"브릭스" 또는 "도 브릭스" 또는 "° 브릭스"는 굴절계를 사용하여 몇몇 성숙한 과실에 대해 측정된 바와 같은 평균 총 가용성 고체 함량을 지칭한다. 바람직하게는 각각 커팅되어 개방된 과실의 중심 및 껍질 사이에서 측정된 적어도 3개의 과실의 평균이 계산된다.
한 측면에서 기재된 바와 같은 1종 이상의 QTL을 포함하는 본 발명의 재배된 수박 식물의 과실은 적어도 9.0, 바람직하게는 적어도 10.0 또는 11.0 이상의 브릭스를 갖는다.
한 측면에서 기재된 바와 같은 1종 이상의 QTL을 포함하는 본 발명의 재배된 수박 식물의 과실은 시장화가능한 과실이다. 과실 품질에 관하여 "시장화가능한"은 수박 과실이 신선한 소비를 위해 판매되기에 적합하고, CGMMV 감염의 외부 또는 내부 증상을 갖지 않고, 양호한 풍미를 갖고 (풍미 상실이 없음), 적어도 9.0, 바람직하게는 적어도 10.0 또는 적어도 11.0 도 브릭스를 갖고, 바람직하게는 또한 예를 들어 백색 (예를 들어 변종 서스캐처원의 크림 (Cream of Saskatchewan)), 황색 (예를 들어 변종 야먀토 크림 (Yamato Cream) 1), 오렌지색 (예를 들어 변종 텐더스위트 (Tendersweet)), 분홍색 (예를 들어 변종 새덜 (Sadul)), 분홍빛 적색 (예를 들어 변종 크림슨 스위트 (Crimson Sweet)), 적색 (예를 들어 변종 슈가 베이비) 또는 암적색 (예를 들어 변종 딕시 리 (Dixie Lee))인 균일한 과실 과육 색상을 가짐을 의미한다.
"균일한 과실 과육 색상"은 중간 (중간부)을 통해 커팅되어 개방된 경우, 성숙한 과실 전반에 걸친 색상이 과실 과육 전반에 걸쳐 고르게 분포됨, 즉, 패치가 아님을 의미한다. 따라서, 적색 과실은 과실 과육 전반에 걸쳐 적색이며, 백색 패치를 함유하지 않는다. 균일한 적색 색상을 갖는 과실의 예는 이배체 변종 프리미엄 (Premium) F1 (넌헴스)이다.
본 발명의 이점은 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 시트룰루스 식물 또는 접목된 식물의 과실 또는 본원에 기재된 본 발명에 따른 방법 중 하나에 사용되는 식물에 의해 생산된 과실이 CGMMV 유도된 증상을 나타내지 않는다는 것이다. 따라서, 필드에서 성장된 본 발명에 따른 식물 또는 접지가 CGMMV에 의해 낮은 수준으로 감염된 경우에도, 그들 식물은 CGMMV 증상이 없는 과실을 생산할 것이다. 이들 과실은 시장화가능할 것이며, 따라서 수율 손실은 감소되거나 예방될 수 있다.
또다른 구체적인 실시양태에서 CGMMV 감염을 방지하는 본 발명에 따른 방법은, 과실의 CGMMV 유도된 수율 손실을 방지하거나, 감소시키거나, 예방하는 방법 외에도 방법이 단계 c)에 따라 수확된 식물의 과실로부터 종자를 수득하고 있는 추가의 단계 d)를 포함하는 것인, CGMMV 저항성 종자를 제조하는 방법이다. 임의로, CGMMV 저항성 종자를 제조하는 본 발명에 따른 방법은 단계 d)에서 수득된 종자를 식물로 성장시키고, 상기 식물을 CGMMV에 대한 저항성에 대해 시험하고, CGMMV에 대한 저항성을 바람직하게는 예를 들어 증상의 육안 평가에 의해 표현형적으로, 및/또는 예를 들어 SNP 마커 유전자형분석에 의해 유전자형적으로 분석하는 추가의 단계 e)를 포함한다. 종자는 본 발명에 따른 이배체 또는 사배체 재배된 수박의 꽃이 예를 들어 자신의 화분 (자가-수정) 또는 다른 화분 (교차-수정)에 의해 수정되는 경우 수득될 것이다. 이배체 또는 사배체 재배된 수박 식물이 유전자이입 단편(들)에 대해 동형접합성인 경우, S1 종자 (자가-수정 후에 생산됨)는 또한 동형접합성일 것이고, F1 종자 (교차-수정 후에 생산됨)는 화분이 또한 유전자이입 단편(들)을 포함하는 또는 유전자이입 단편(들)이 결여된 식물로부터의 것인지 여부에 따라, 동형접합성 또는 이형접합성일 것이다.
CGMMV 저항성 종자를 제조하는 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능하거나 수득된 CGMMV 저항성 종자는 또한 본 발명의 실시양태이다. 종자는 기재된 바와 같은 적어도 1개의 재조합 염색체를 포함한다. 바람직하게는, 종자로부터 성장된 식물은 또한 QTL(들)을 포함하는 유전자이입 단편으로 인해 CGMMV 저항성 (예를 들어 CGMMV 검정에서 규모 4 또는 규모 3)이다. 이는 우성 QTL, 즉, QTL7.1 및/또는 QTL9.1에 대한 경우일 것이다. 열성 QTL은 CGMMV 저항성 표현형을 발현하기 위해 동형접합성 형태일 필요가 있다.
한 측면에서, 본 발명의 식물 상에서 생산된 CGMMV 저항성 종자는 CGMMV 바이러스가 없으며, 즉, CGMMV 바이러스는 예를 들어 RT-qPCR에 의해 그들 종자에서 검출가능하지 않다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명의 1종 이상의 QTL은 이러한 식물 상에서 생산된 종자에 전파가능하지 않은 CGMMV 바이러스를 초래한다. 한 측면에서 QTL7.1 및/또는 QTL9.1을 포함하는 재배된 수박 식물은 그의 과실에서 CGMMV 무함유 종자를 생산할 것이다.
본 발명의 식물 및 식물 부분은 다양한 용도를 갖는다.
CGMMV 저항성 시트룰루스 식물 또는 식물 부분 또는 식물 세포, 바람직하게는 CGMMV 저항성 시트룰루스 콜로신티스 식물 또는 식물 부분 또는 식물 세포 또는 CGMMV 저항성 시트룰루스 라나투스 아종 불가리스 식물 또는 식물 부분 또는 식물 세포의 확인을 위한 SNP1, SNP1, SNP3, SNP4, SNP5, 및 SNP6으로부터 선택되는 마커 중 1종 이상의 용도; 및/또는 SNP7, SNP8 및 SNP9로부터 선택되는 마커 중 1종 이상의 용도; 및/또는 SNP10, SNP11 및 SNP12로부터 선택되는 마커 중 1종 이상의 용도; 및/또는 SNP13, SNP14, SNP15, SNP16, SNP17 및 SNP18로부터 선택되는 마커 중 1종 이상의 용도; 및/또는 SNP19, SNP20, SNP21, SNP22, SNP23 및 SNP24로부터 선택되는 마커 중 1종 이상의 용도.
시트룰루스 식물 또는 식물 부분 또는 식물 세포, 바람직하게는 CGMMV 저항성 시트룰루스 콜로신티스 식물 또는 식물 부분 또는 식물 세포 또는 CGMMV 저항성 시트룰루스 라나투스 아종 불가리스 식물 또는 식물 부분 또는 식물 세포에서 CGMMV 저항성 부여 QTL 또는 CGMMV 저항성 부여 QTL을 포함하는 유전자이입 단편의 확인 또는 검출을 위한 SNP1, SNP1, SNP3, SNP4, SNP5, 및 SNP6으로부터 선택되는 마커 중 1종 이상의 용도; 및/또는 SNP7, SNP8 및 SNP9로부터 선택되는 마커 중 1종 이상의 용도; 및/또는 SNP10, SNP11 및 SNP12로부터 선택되는 마커 중 1종 이상의 용도; 및/또는 SNP13, SNP14, SNP15, SNP16, SNP17 및 SNP18로부터 선택되는 마커 중 1종 이상의 용도; 및/또는 SNP19, SNP20, SNP21, SNP22, SNP23 및 SNP24로부터 선택되는 마커 중 1종 이상의 용도.
식물 또는 식물 부분 또는 식물 세포가 시트룰루스 식물 또는 식물 부분 또는 식물 세포, 바람직하게는 시트룰루스 콜로신티스 식물 또는 식물 부분 또는 식물 세포 또는 시트룰루스 라나투스 아종 불가리스 식물 또는 식물 부분 또는 식물 세포인, CGMMV 저항성 부여 QTL 또는 CGMMV 저항성 부여 QTL을 포함하는 유전자이입 단편을 포함하는 식물 또는 식물 부분 또는 식물 세포의 확인 또는 검출을 위한 SNP1, SNP1, SNP3, SNP4, SNP5, 및 SNP6으로부터 선택되는 마커 중 1종 이상의 용도; 및/또는 SNP7, SNP8 및 SNP9로부터 선택되는 마커 중 1종 이상의 용도; 및/또는 SNP10, SNP11 및 SNP12로부터 선택되는 마커 중 1종 이상의 용도; 및/또는 SNP13, SNP14, SNP15, SNP16, SNP17 및 SNP18로부터 선택되는 마커 중 1종 이상의 용도; 및/또는 SNP19, SNP20, SNP21, SNP22, SNP23 및 SNP24로부터 선택되는 마커 중 1종 이상의 용도.
CGMMV 감수성 재배된 수박 식물 내로의 CGMMV 저항성 (또는 CGMMV 저항성 부여 QTL)의 유전자이입을 위한 SNP1, SNP1, SNP3, SNP4, SNP5, 및 SNP6으로부터 선택되는 마커 중 1종 이상의 용도; 및/또는 SNP7, SNP8 및 SNP9로부터 선택되는 마커 중 1종 이상의 용도; 및/또는 SNP10, SNP11 및 SNP12로부터 선택되는 마커 중 1종 이상의 용도; 및/또는 SNP13, SNP14, SNP15, SNP16, SNP17 및 SNP18로부터 선택되는 마커 중 1종 이상의 용도; 및/또는 SNP19, SNP20, SNP21, SNP22, SNP23 및 SNP24로부터 선택되는 마커 중 1종 이상의 용도.
CGMMV 저항성 시트룰루스 라나투스 식물의 생산을 위한, 바람직하게는 시트룰루스 라나투스 아종 불가리스 식물의 생산을 위한 또는 시트룰루스 라나투스 식물 세포, 바람직하게는 시트룰루스 라나투스 아종 불가리스 식물 세포의 생산을 위한 본 발명에 따른 시트룰루스 콜로신티스 식물 또는 시트룰루스 콜로신티스 식물 세포의 용도는 본 발명의 또다른 실시양태이다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 시트룰루스 콜로신티스 식물 또는 시트룰루스 콜로신티스 식물 세포는 본 발명에 따른 CGMMV 저항성 시트룰루스 라나투스 식물을 제조하는 데 사용된다.
시트룰루스 라나투스 식물, 바람직하게는 시트룰루스 라나투스 아종 불가리스 식물을 수분시키기 위한 본 발명에 따른 시트룰루스 콜로신티스 식물의 화분의 용도는 또한 본 발명의 실시양태이다.
접목된 식물, 바람직하게는 본 발명에 따른 접목된 식물의 생산을 위한 본 발명에 따른 시트룰루스 식물 또는 시트룰루스 식물 세포의 용도는 본 발명의 또다른 실시양태이다.
CGMMV 저항성 종자의 생산을 위한 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 시트룰루스 식물 또는 시트룰루스 식물 세포의 용도는 본 발명의 또다른 실시양태이다.
CGMMV 저항성 시트룰루스 식물, 바람직하게는 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 CGMMV 저항성 시트룰루스 식물의 생산을 위한 수탁 번호 NCIMB 42624 하에 기탁된 종자의 용도는 또한 본 발명의 실시양태이다.
과실, 바람직하게는 본 발명에 따른 과실의 생산을 위한 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 시트룰루스 식물 또는 시트룰루스 식물 세포의 용도는 본 발명의 또다른 실시양태이다.
무종자 과실, 바람직하게는 본 발명에 따른 무종자 과실의 생산을 위한 본 발명에 따른 비-유전자 조작된 시트룰루스 식물 또는 시트룰루스 식물 세포의 용도는 본 발명의 또다른 실시양태이다.
동사 "포함하다" 및 그의 활용형은 그 단어에 따르는 항목이 포함되지만, 구체적으로 언급되지 않은 항목이 배재되지 않음을 의미하기 위한 그의 비-제한적 의미로 사용된다. 또한, 단수형태의 요소의 언급은 맥락이 하나 및 단지 하나의 요소가 있음을 명백하게 요구하지 않는다면, 1개 초과의 요소가 존재할 가능성을 배제하지 않는다. 따라서, 단수형태는 통상적으로 "적어도 하나"를 의미하며, 예를 들어 "식물 세포"는 또한 몇몇 식물 세포를 지칭하는 등이다. 유사하게, "과실" 또는 "식물"은 복수의 과실 및 식물을 지칭한다.
한 측면에서 본 발명에 따른 식물, 식물 부분 및 식물 세포는 규칙 28 (2) EPC (유럽 특허 협약 (European Patent Convention))에 의해 정의된 바와 같이 본질적으로 생물학적 프로세스에 의해 배타적으로 수득되지 않는다. 예를 들어 씨. 콜로신티스 QTL, 예를 들어 QTL7.1 또는 QTL9.1의 원인적 유전자는 예를 들어 QTL이 발견되는 염색체 7 또는 염색체 9 영역의 미세 지도화 및/또는 시퀀싱에 의해 측정될 수 있고, 재배된 수박의 이종상동성 유전자는 측정될 수 있고, 재배된 수박 이종상동성 유전자는 예를 들어 UV 돌연변이유발, EMS 돌연변이유발, CRISPR-Cas 게놈 변형 등에 의해 돌연변이될 수 있다. 그에 의해 예를 들어 QTL7.1 또는 QTL9.1 기저의 변형된 유전자를 포함하는 CGMMV 저항성 수박 식물이 생성될 수 있다. 이 측면에서, 본원에서 씨. 콜로신티스 유전자이입 단편에 대한 언급은 이들이 'QTL7.1 좌위 또는 QTL9.1 좌위 (또는 다른 좌위 중 임의의 것)에 존재하는 씨. 콜로신티스 유전자의 이종상동성 수박 유전자의 (인간 유도된) 돌연변이된 유전자를 포함하기' 때문에, CGMMV 저항성인 수박 식물에 의해 대체된다.
한 측면에서 본원에 기재된 CGMMV 저항성 부여 QTL은 USDA 코어 콜렉션의 씨. 콜로신티스 수탁물 PI386015, PI388770, PI525082 및 PI537300으로부터 수득되지 않는다/그로부터 수득가능하지 않다.
종자 기탁
CGMMV 저항성 식물의 이배체 시트룰루스 콜로신티스 종자는 2016년 8월 10일에 넌헴스 비.브이.에 의해 부다페스트 조약 하에 수탁 번호 NCIMB 42624 하에 스코틀랜드 벅스번 애버딘 AB21 9YA의 NCIMB 엘티디. (NCIMB Ltd.)에 기탁되었다.
기탁물에 대한 접근은 요청 시 그에 대한 자격이 주어진 특허 상표 국장에 의해 결정된 사람에게 이 출원의 계류 동안 이용가능할 것이다.
본 출원인은 특허의 허여의 언급까지, 또는 본 출원이 거절되거나, 포기되거나, 철회되거나, 철회된 것으로 간주되는 경우 출원일로부터 20년 동안, 생물학적 물질의 샘플 및 상기 샘플로부터 유래된 임의의 물질이 단지 규칙 32(1) EPC 또는 유사한 규칙 및 규정을 갖는 국가 또는 조약국의 관련된 제정법에 따라 지정된 전문가에게 공개되는 것을 요청한다.
37 C.F.R. § 1.808(b)를 조건으로, 하나 이상의 기탁물의 대중에의 이용가능성에 대한 기탁자에 의해 부과된 모든 제한은 기탁물에 대한 접근을 제공함으로써 특허의 허여 시 변경불가능하게 제거될 것이다. 기탁물은 30년의 기간, 또는 가장 최근 요청 후 5년 동안, 또는 특허의 집행가능한 기간 동안 어느 것이든 더 긴 것 동안 유지될 것이며, 그것이 그 기간 동안 비-생존가능하게 되는 경우 대체될 것이다. 출원인은 이 출원에 대해 이 특허 하에 또는 식물 변종 보호법 (Plant Variety Protection Act) (7 USC 2321 이하 참조) 하에 허여된 임의의 권리를 포기하지 않는다.
도 1: 접지의 생산에 사용된 NCIMB 42624 식물 및 근경의 생산에 사용된 CGMMV 감염된 시트룰루스 라나투스 품종 슈가 베이비 식물 (사진은 25 dpi에서 찍음) (A); 사진을 140 dpi 후에 찍은 CGMMV 감염된 시트룰루스 라나투스 품종 슈가 베이비 근경 상으로 접목된 NCIMB 42624 접지는 접지에 대해 증상을 나타내지 않는다 (규모 4) (B); 사진을 140 dpi 후에 찍은 CGMMV 감염된 시트룰루스 라나투스 품종 슈가 베이비 식물은 중증 증상을 나타낸다 (C);
도 2: 일반적 방법 하에 기재된 증상의 육안 평가에 따른 규모 1을 나타내는 CGMMV로의 접종 후 중증 증상, 잎 기형, 수포형성 및 명백한 모자이크를 나타내는 시트룰루스 식물의 예.
도 3: 일반적 방법 하에 기재된 증상의 육안 평가에 따른 규모 2를 나타내는 CGMMV로의 접종 후 중간 증상, 경도 잎 기형, 그러나 명백한 모자이크를 나타내는 시트룰루스 식물의 예.
도 4: 일반적 방법 하에 기재된 증상의 육안 평가에 따른 규모 3을 나타내는 CGMMV로의 접종 후 경도 증상, 매우 경도 모자이크 및 소수의 클리어링 반점을 나타내는 시트룰루스 식물의 예.
도 5: CGMMV로 접종된 CGMMV 감수성 시트룰루스 식물에 의해 생산된, 중증 CGMMV 증상을 나타내는 과실의 예.
도 6: CGMMV로 접종된 CGMMV 저항성 시트룰루스 식물에 의해 생산된, 증상을 나타내지 않는 과실의 예.
도 2: 일반적 방법 하에 기재된 증상의 육안 평가에 따른 규모 1을 나타내는 CGMMV로의 접종 후 중증 증상, 잎 기형, 수포형성 및 명백한 모자이크를 나타내는 시트룰루스 식물의 예.
도 3: 일반적 방법 하에 기재된 증상의 육안 평가에 따른 규모 2를 나타내는 CGMMV로의 접종 후 중간 증상, 경도 잎 기형, 그러나 명백한 모자이크를 나타내는 시트룰루스 식물의 예.
도 4: 일반적 방법 하에 기재된 증상의 육안 평가에 따른 규모 3을 나타내는 CGMMV로의 접종 후 경도 증상, 매우 경도 모자이크 및 소수의 클리어링 반점을 나타내는 시트룰루스 식물의 예.
도 5: CGMMV로 접종된 CGMMV 감수성 시트룰루스 식물에 의해 생산된, 중증 CGMMV 증상을 나타내는 과실의 예.
도 6: CGMMV로 접종된 CGMMV 저항성 시트룰루스 식물에 의해 생산된, 증상을 나타내지 않는 과실의 예.
서열의 설명
서열식별번호: 1 내지 서열식별번호: 6은 각각 SNP1 내지 SNP6의 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 씨. 콜로신티스로부터의 QTL1.1에 연결된 염색체 1의 서열을 지칭한다;
서열식별번호: 7 내지 서열식별번호: 9는 각각 SNP7 내지 SNP9의 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 씨. 콜로신티스로부터의 QTL4.1에 연결된 염색체 4의 서열을 지칭한다;
서열식별번호: 10 내지 서열식별번호: 12는 각각 SNP10 내지 SNP12의 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 씨. 콜로신티스로부터의 QTL5.2에 연결된 염색체 5의 서열을 지칭한다;
서열식별번호: 13 내지 서열식별번호: 18은 각각 SNP13 내지 SNP18의 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 씨. 콜로신티스로부터의 QTL7.1에 연결된 염색체 7의 서열을 지칭한다;
서열식별번호: 19 내지 서열식별번호: 24는 각각 SNP19 내지 SNP24의 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 씨. 콜로신티스로부터의 QTL9.1에 연결된 염색체 9의 서열을 지칭한다;
서열식별번호 25: 식물 조직에서 CGMMV RNA의 검출을 위한 RT PCR에 사용된 역방향 프라이머.
서열식별번호 26: 식물 조직에서 CGMMV RNA의 검출을 위한 RT PCR에 사용된 전방향 프라이머.
서열식별번호 27: 식물 조직에서 CGMMV RNA의 정량화를 위한 정량적 RT PCR에 사용된 센스 프라이머.
서열식별번호 28: 식물 조직에서 CGMMV RNA의 정량화를 위한 정량적 RT PCR에 사용된 안티센스 프라이머.
서열식별번호 29: 식물 조직에서 CGMMV RNA의 정량화를 위한 정량적 RT PCR에 사용된 프로브 올리고뉴클레오티드.
실시예
일반적 방법
실시예: CGMMV 저항성을 평가하기 위한 기계적 잎 접종
항목 1: 식물 감염을 위한 CGMMV 접종물의 제조
시트룰루스 식물의 감염을 위한 접종물을 유럽 유형 균주 Ve459 (CNR, 투린 (Turin))로 감염된 CGMMV 감수성 오이 식물 (예를 들어 변종 세일라 (Sheila), 넌헴스 비.브이.)로부터 제조하였다. CGMMV 감염의 명백한 증상을 나타내는 신선한 어린 잎 (증상성 잎)을 오이 식물로부터 취하였다. 1 그램의 증상성 오이 잎 당 5 ml의 냉장된 (5℃) 0.03M 포스페이트 완충제를 첨가하고, 1 그램의 오이 잎 당 0.05 그램 활성탄 및 0.1 그램 규조토를 첨가하였다. 잎 물질을 분쇄 동안 및 후에 빙냉으로 유지된 막자사발에서 막자로 분쇄하였다.
시트룰루스 식물이 CGMMV에 대해 저항성인 지를 시험하기 위해, 신선하게 증식된 물질로부터의 신선하게 제조된 접종물을 사용하는 것이 바람직하다.
항목 2: CGMMV로의 (시트룰루스) 식물의 감염
잎 접종을 접종물을 어린 묘목의 제1 본엽 상으로 러빙함으로써 수행하였다. 따라서, (시트룰루스) 식물의 묘목을, 제1 본엽이 확대된 경우 (파종 후 대략 15 내지 20일), 일반적 방법 항목 1 하에 기재된 바와 같이 제조된 접종물로 접종하였다. 묘목을 제1 접종 후 4 내지 5일에 두번째로 접종하였다. 대조군 묘목을 단지 완충제로 접종하였다 (모의 접종). 접종된 식물을 간접 태양광에서 유지하고, 직접 태양광을 제2 접종까지 피하였다. 접종된 묘목을 유지하기 위한 온도 처방은 12 내지 14시간의 일광으로, 밤 시간에 18℃ 및 낮 시간에 25℃였다. 바람직하게는 유전자형 (예를 들어 CGMMV 저항성 유전자형, 감수성 대조군 유전자형) 당 적어도 10개의 식물을 적어도 2회의 반복실험으로 접종한다. 또한 모의 접종된 다수의 식물을 포함한다.
항목 3: 질환 증상의 평가
접종된 식물을 제1 접종 후 시간에 있어서 하기 시점 (dpi, 접종 후 일)에서 증상에 대해 및/또는 CGMMV 바이러스의 존재에 대해 분석하였다:
15 dpi
30 dpi
45 dpi
60 dpi
바람직할 경우, 과실은 예를 들어 약 140 dpi 후에 또는 심지어 더 나중에 증상에 대해 및/또는 CGMMV의 존재에 대해 시험될 수 있다.
대조군 식물
대조군은 모든 시험 계열 내로 포함되어야 한다. CGMMV로의 감염의 효율에 대해 점검하기 위한 양성 대조군으로서 CGMMV에 대해 감수성인 것으로 공지된 (시트룰루스) 식물 (예를 들어 시트룰루스 라나투스 상업적 변종 슈가 베이비)을 포함하는 것이 중요하다. 바람직하게는 양성 대조군 식물의 적어도 95％는 20 dpi 후에 잎 상에 중증 증상 (규모 1)을 나타내야 하고, 바람직하게는 이들 식물에 의해 생산된 과실은 중증 증상을 나타내야 한다. 또한, 모의 접종으로서 단지 포스페이트 완충제로 접종된 CGMMV 감수성 식물에 의해 나타내어지는 음성 대조군 식물이 포함되어야 한다. 또한, 비-접종된 식물은 시험 계열 내로 포함될 수 있다. 음성 대조군은 잎 또는 과실에서 어느 때에도 CGMMV 감염의 증상을 나타내지 않아야 하고, CGMMV 단백질 및/또는 RNA는 모의 접종된 식물에서 검출가능하지 않아야 한다.
잎 상의 CGMMV 증상의 육안 평가
잎 상의 육안으로 평가된 증상은 하기 규모에 따라 분류된다:
규모 1: 중증 증상: 잎 기형, 수포형성 및 명백한 모자이크 (도 2에 예시됨)
규모 2: 중간 증상: 경도 잎 기형, 그러나 명백한 모자이크 (도 3에 예시됨)
규모 3: 경도 증상: 매우 경도 모자이크 및 소수의 클리어링 반점 (도 4에 예시됨)
규모 4: 증상 없음 (도 1B에 예시됨)
접종된 식물 조직에서의 바이러스 검출: ELISA
식물에서 CGMMV의 존재 또는 부재를 입증하기 위해, ELISA 검정을 증상의 육안 평가에 의해 규모 4로서 분류된 모든 식물에 대해 제2 평가 후에 (30 dpi) 수행하였다. ELISA 검정에 의해 수득된 결과에 따라, 시험된 식물을 하기 규모에 따라 분류하였다:
ELISA에 의해 음성
흡광도가 < 0.5인 경우 낮은 양성
흡광도가 > 0.5인 경우 ELISA에 의해 양성
식물 물질에서 CGMMV의 존재 또는 부재는 또한 RT-PCR에 의해 평가되거나, RT-qPCR 검출 (일반적 방법 항목 4 참조)에 의해 및/또는 티슈 프린트 (Tissue print) 또는 도트블롯 (DotBlot) (일반적 항목 5)에 의해 정량화될 수 있다.
항목 4: 접종된 식물 조직에서의 바이러스 검출: 식물 조직에서의 CGMMV의 PCR 검출
식물 물질에서의 CGMMV의 존재를 역전사효소 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)에 의해 검출하고, 식물 물질에서의 CGMMV의 정량화를 위해 역전사효소 정량적 중합효소 연쇄 반응 (RT-qPCR, 택맨)을 사용하였다. 또한 참조로 포함되는 문헌 [Hongyun et al., 2008, J Virological Methods 149, 326-329]을 참조한다.
a) 식물 물질로부터의 RNA의 추출
잎 조직 (200 mg)을 막자사발에서 막자로 액체 질소에서 미세 분말로 분쇄하고, 멸균 미세원심분리 튜브 내로 옮겼다. 총 RNA를 트리졸 (Trizol) 시약 (인비트로젠 (Invitrogen))으로 제조자의 지시서에 따라 추출하였다. 생성된 RNA 펠릿을 30 μl DEPC-처리된 물에 재현탁시키고, -80℃에서 저장하였다. RNA 농도를 ND-1000 분광광도계 (나노드롭 테크놀로지즈 (NanoDrop Technologies))에 의해 측정하였다.
b) 역전사효소 PCR (RT-PCR)
RT-PCR에 사용되는 올리고뉴클레오티드를 CGMMV 외피 단백질 유전자 및 EMBL 데이터베이스로부터 이용가능한 3' 비코딩 영역 (NCR) 뉴클레오티드 서열에 기초하여 설계하였다. cDNA의 제1 가닥을 역방향 프라이머: 5'-TTG CAT GCT GGG CCC CTA CCC GGG GAA AG-3' (SphI; 서열식별번호 25)로 프라이밍된 수퍼스크립트 (SuperScript) II 역전사효소 (인비트로젠)에 의해 합성하였다. PCR에 사용된 전방향 프라이머의 서열은 5'-CCG AAT TCA TGG CTT ACA ATC CGA TCA C-3' (EcoRI; 서열식별번호 26)이다. 열 사이클링 계획은 94℃에서 3분, 94℃에서 30초의 35 사이클, 53℃에서 45초, 72℃에서 1분, 이어서 72℃에서 7분의 최종 인큐베이션이었다.
700 염기 쌍의 예상되는 PCR 생성물을 pGEM-3Zf 플라스미드 내로 클로닝하고, 양성 클론을 양 방향에서 자동화 ABI 3730 DNA 시퀀서로 시퀀싱하여 증폭된 서열이 CGMMV 바이러스 RNA로부터 수득됨을 확인하였다.
c) RT-qPCR
택맨 검정을 위한 프라이머 및 프로브를 프라이머 익스프레스 (Primer Express) 소프트웨어 (어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems), 버전 2.0)로, 제조자에 의해 공급된 지시서에 기재된 바와 같은 절차에 따라 설계하였다. CGMMV 특이적 프라이머는 5'-GCA TAG TGC TTT CCC GTT CAC-3' (센스; 서열식별번호 27) 및 5'-TGC AGA ATT ACT GCC CAT AGA AAC-3' (안티센스; 서열식별번호 28)이었다. 프로브는 6-카르복시플루오레세인 (FAM)으로 표지된 5'-CGG TTT GCT CAT TGG TTT GCG GA-3' (서열식별번호 29)이고, 3' 말단은 N,N,N'N'-테트라메틸-6-카르복시로다민 (TAMRA)으로 표지되었다.
모든 반응은 UNG를 갖지 않는 25 μl 2× 마스터 믹스 (Master Mix), 1.25 μl 40× 멀티스크라이브 (MultiScribe) 및 RN아제 인히비터 믹스 (RNase Inhibitor Mix), 1 μl 전방향 프라이머 (20 μM), 2 μl 역방향 프라이머 (20 μM), 0.5 μl 프로브 (20 μM), 1 μl 총 RNA 또는 5 μl RNA 전사체를 함유하는 50 μl의 최종 부피에서 수행하였으며, DEPC-물의 부피는 주형으로 조정하였다. 열-사이클링을 라이트사이클러 (LightCycler)® 96 (로슈 라이프사이언스 (Roche LifeScience)) 상에서 하기와 같이 실행하였다: 48℃에서 30분, 95℃에서 10분, 95℃에서 15초의 40 사이클, 60℃에서 1°분.
단일 가닥 RNA의 마이크로그램의 피코몰 및 RNA 분자의 수로의 전환을 문헌 [Olmos et al. (2005, J Virol Methods 128(1-2), 151-155)]에 의해 기재된 바와 같이 수행하였다. 전사체의 10배 계열 희석액을 5 μl 당 5 × 1012 내지 50 카피로 제조하고, 분취하고, -80℃에서 저장하였다. 5 × 108 내지 5 × 100의 희석액을 실시간 RT-PCR 검정에 의해 증폭시켰다. 검정의 3회 반복실험을 착수한 RNA 전사체의 50 카피만큼 낮은 안정한 증폭이 관찰될 수 있었다.
항목 5: 혼성화에 의한 CGMMV의 검출 (티슈 프린트 또는 도트블롯)
티슈 프린트를 위한 막 제조
장갑을 끼고, 나일론 막을 멸균된 가위로 요구되는 크기로 커팅함으로써 제조하고, 마이크로-플레이트 그리드 주형을 상부 상에 정치한다 (실제 크기는 사용되는 샘플의 유형에 의존함). 깨끗한 멸균 스캘펄로 엽병을 가로질러 횡단 커팅하고, 모든 수액이 흡수될 때까지 그리드 중 하나 내로 가볍게 누른다. 각각의 후속 프린트에 대해 새롭게 커팅한다. 정제된 DNA 또는 RNA 샘플에 대해, 1 μl의 샘플은 충분하다.
각각의 동일한 식물 종의 건강한 음성 대조군 및 공지된 감염된 양성 대조군을 포함한다. 정제된 바이러스 또는 그의 증폭된 PCR 생성물은 또한 양성 대조군으로서 포함되어야 한다. 막이 전체적으로 건조될 때까지 기다리고, 핵산을 0.120 J cm-2에서 UV 광을 사용하여 막에 고정시킨다 (가교). 건조 막을 실온에서 저장하고, 플라스틱 백에서 밀봉한다.
도트블롯을 위한 막 제조
샘플 조직을 칭량하고, 적절한 희석에서의 적절한 추출 완충제에서 분쇄한다. 10 내지 20 μl의 추출물을 마이크로피펫으로 취하고, 팁을 주의깊게 제거하여, 내부의 액체가 올라오지 않고, 공기-잠금되는 것을 보장한다. 피펫 팁을 가이드로서 마이크로-플레이트 그리드를 사용하여 막에 대해 가볍게 터치하고 (신속히), 추출물을 막 상으로 적용한다 (프린팅). 생성된 도트는 부피로 약 250 nl이고, 4개는 각각의 그리드 위치에 정치될 수 있다. 막의 목적 및 혼성화 프로브의 품질에 따라 샘플 당 2 내지 4개의 도트를 사용한다.
티슈 프린트 막에 대해 상기 기재된 바와 같이 대조군을 프린트하고, 가교시키고, 저장한다.
프로세싱 동안 문제가 발생할 경우 이중 막을 백-업으로서 프린트할 수 있다.
막의 사전혼성화
티슈 프린트 또는 도트블롯에 대해 상기 기재된 바와 같이 제조된 막을 평평한 핀셋을 사용하여 혼성화 튜브 내로 정치한다. 사전-혼성화 용액 (DIG 이지 (DIG Easy) 더하기 1％ 차단제)을 실온에서 첨가한다 (막을 덮기에 충분함; 예를 들어 8 x 12 cm 막에 대해 20 ml, 8 x 6 cm에 대해 10 ml). 혼성화 오븐에서 회전시키면서 54℃에서 대략 2시간 동안 인큐베이션한다. 막이 이제부터 건조되지 않음을 보장한다.
막의 혼성화
신선한 혼성화 용액 (DIG 이지 용액 더하기 1％ 차단제)을 동결된 스톡 프로브 용액을 사용하여 제조하여 8 x 12 cm 막 당 80 내지 120 ng 프로브를 수득한다. 혼성화 용액을 100℃ (DNA 프로브에 대해) 또는 RNA 프로브에 대해 65℃에서 10분 동안 사전-가열한다. 사전-혼성화 용액을 막으로부터 버리고, 희석된 프로브 용액을 막에 첨가한다. 혼성화 오븐에서 회전시키면서 54℃에서 밤새 인큐베이션한다.
막의 세척
혼성화 용액을 막으로부터 버리고, 혼성화 오븐에서 회전시키면서 혼성화 튜브에서 하기 단계를 수행한다:
1. 혼성화 온도에서 40분 동안 6x SSC + 1％ SDS에서 2x 혼성화 부피로 세척한다.
2. 액체를 버리고, 세척을 반복한다.
3. 막을 검출 트레이 + 용액 1에 옮긴다 (막의 건조를 회피함).
검출
막을 막보다 약간 더 큰 트레이에 옮긴다. 여기서부터, 프로세스는 실온에서 및 부드럽게 교반하면서이다. 용액 부피를 트레이 및 막 크기 (예를 들어 8 x 12 cm 막에 대해 600 μl/cm2 또는 50ml)로 조정한다. 막이 하기 단계 동안 마르지 않는 것이 중요하다:
막을 하기 용액으로 세척한다:
1. 용액 I, 1분
2. 세척 용액, 5분
3. 용액 I, 1분
4. 용액 II, 30분 (측정 실린더에서 2x 부피를 제조함)
5. 용액 II (이전 단계로부터) + 안티-DIG (Anti-DIG) (1:20000), 30분
6. 세척 용액, 15분
7. 세척 용액, 15분
8. 용액 I, 1분
9. 용액 III, 최소 5분
알칼리성-포스파타제 화학발광 기질 (CDP-스타 (CDP-Star) (1:100)를 600 μl의 용액 III에 희석한다.
막을 아세테이트의 2개의 쉬트 사이에 정치하고, 기질을 마이크로피펫을 사용하여 막 상으로 고르게 분포시킨다 (1 방울 = 4 작은 사분면). 상부 아세테이트를, 공기 버블을 도입하지 않도록 주의하면서 수 회 올리고 내림으로써 혼합한다. 어둠 (예를 들어 알루미늄 호일로 덮음)에서 5분 동안 인큐베이션한다. 과량의 기질을 필터 페이퍼로 누름으로써 제거하고, 아세테이트의 엣지를 열-밀봉한다.
하기 시약은 본원에 언급된 용액을 제조하는 데 필요하다:
시약:
차단제 (로슈)
말레산.
NaCl
트리스 (Tris)-HCL
트윈 (Tween) 20
안티-Dig (로슈).
CDP-스타 (로슈).
용액:
용액 I: 0.1 M 말레산, 0.15 M NaCl, pH 7.5
용액 II: 용액 I 중 1％ 차단제.
용액 III: 0.1 M 트리스-HCl pH 9.5, 0.1 M NaCl
세척 용액: 용액 I 중 0.3％ 트윈 20
디지털 화상화
막을 디지털 이미징 (Digital Imaging) 챔버에 정치하고, 주위 광으로 하나의 사진을 찍는다 (니콘 콘트롤 프로 (Nikon Control Pro)2, 50 mm 대물렌즈, 원격 슈팅으로 수동 제어 가능함, 상으로 ISO 0.3 스텝 오버 6400, 장기-노출 노이즈 감소 박스가 체크됨, 카메라 최소 30분 사전-냉각됨, <10℃).
챔버를 닫고, 셔터 속도를 벌브 (Bulb) 및 조리개 (Aperture)에 대해 1.4로 변화시켰다. DSLR_Bot, 장기 노출 (Long Exposure) 기능을 사용하여, 노출 시간을 5분 03초로 설정한다. 적외선 케이블이 완전히 삽입되고, 출력 수준이 최대인 것을 보장하고, 시작 (Start)을 누른다 ("클릭"은 들을 수 있어야 함). 카메라는 조리개를 열고 하나의 화상을 찍고, 노이즈 감소에 대해 닫힌 조리개로 두번째를 찍는다 - 각각 5분 03초 사진에 대해 10분 06초의 총 시간.
5분 노출의 하나의 사진은 2 내지 4시간 노출의 통상적인 화상과 대략 등가이다. 보다 강한 신호가 요구되는 경우, 10분 디지털 노출 (밤샘 통상적인 화상과 등가임)이 수행될 수 있다. 외부 진단 또는 낮은 신호에 대해, 통상적인 밤샘 노출이 권고된다.
항목 6: 시트룰루스 식물의 접목
근경을 15일령 CGMMV 접종된 시트룰루스 라나투스 품종 슈가 베이비 식물 또는 품종 에르콜 (넌헴스 비.브이.)로부터 제조하였다. 접지를 20일령 NCIMB 42624 식물로부터 제조하였다. 근경의 줄기 상에 및 접지의 싹 상에 비스듬하게 커팅하고, 관다발계가 연결되도록 이들을 연결함으로써 접지를 근경 상으로 접목시켰다. 높은 습도에서 치유한 후, 접목된 식물을 온실로 옮겼다.
실시예 - 결과
결과 항목 1: CGMMV 저항성 시트룰루스 식물의 확인
다양한 상이한 시트룰루스 종 수탁물의 군을 일반적 방법 하에 본원에 기재된 방법에 따라 CGMMV로 감염된 온실 또는 기후 챔버에서 성장시켰다. CGMMV 감염을 위한 접종물을 일반적 방법 항목 1에 따라 제조하고, 접종된 식물을 일반적 방법 항목 3 하에 기재된 바와 같이 증상에 대해 육안으로 평가하였다. CGMMV 유도된 증상이 없는 하나의 단일 시트룰루스 콜로신티스 식물 (규모 4)을 확인하였다. 식물을 다수 회 자가수정시키고, 선택된 CGMMV 저항성 식물을 증식시켜 수탁 번호 NCIMB 42624를 갖는 것으로서 지정된 부다페스트 조약 하의 종자 기탁을 위한 종자를 수득하였다.
결과 항목 2: CGMMV 저항성 식물의 제조 및 그의 분석
시트룰루스 라나투스 식물
NCIMB 42624로부터의 화분을 사용하여 시트룰루스 라나투스 아종 불가리스의 우량 계통을 수분시켰다. F1 식물을 CGMMV 저항성에 관한 추가의 분석을 위해 교배에 의해 생산된 종자로부터 성장시켰다.
또한 F2 식물을 F1 식물을 자가수정시킴으로써 제조하였다. F2 종자를 얻고, F1 식물로부터 역교배시키는 것은 복잡하였음이 주목되어야 한다 (NCIMB 42624 x 시트룰루스 라나투스 아종 불가리스의 우량 계통). 단지 소수의 과실이 발달하였으며, 그들 과실에서 종자의 대부분은 비어 있었다.
F1 식물을 일반적 방법 항목 1 내지 3에 기재된 기계적 잎 접종 방법 및 일반적 방법 항목 4에 기재된 RT-qPCR을 사용하여 CGMMV 저항성 및 CGMMV 바이러스의 존재에 대해 시험하였다.
결과는 하기와 같았다. 모의 접종된 식물은 증상을 나타내지 않았다. 양성 대조군, 슈가 베이비, 식물은 규모 1의 CGMMV 증상을 나타내었다. F1 식물은 CGMMV 저항성이고, 증상을 나타내지 않았다 (규모 4).
<표 2>
식물에서 CGMMV RNA의 정량적 분석을 식물의 각각의 세트에 대해 15 dpi, 30 dpi 및 60 dpi에 수행하였다:
상기 RT-qPCR의 결과는 식물 물질에서 CGMMV RNA의 양을 나타낸다. "모의"는 완충제로, 그러나 CGMMV 없이 접종된 식물을 지시한다. "접종됨"은 일반적 방법 항목 1 내지 3에서 기계적 잎 접종 시험에 기재된 바와 같이 CGMMV로 접종된 식물을 지시한다. "슈가"는 감수성 시트룰루스 라나투스 품종 슈가 베이비 식물을 지시한다. "F1"은 NCIMB 42624 x 시트룰루스 라나투스 아종 불가리스 우량 계통 사이의 교배로부터 수득된 식물을 지시한다. "rep"는 상이한 식물을 지시하며, 여기서, 각각의 rep는 6개의 식물의 군으로 이루어진다.
RT-qPCR은 식물 샘플에서 CGMMV RNA 분자를 검출하는 고도로 민감성 방법이다 (Hongyun et al., 2008, J Virological Methods 149, 326-329). 상기 표 2로부터 볼 수 있는 바와 같이, 고도로 민감성 RT-qPCR 방법을 사용하여 CGMMV RNA는 거의 모든 시점 (15 dpi, 30 dpi 에서 60 dpi)에서 분석된 모든 식물에서 검출될 수 있다. 표 2로부터 NCIMB 42624 x 시트룰루스 라나투스 아종 불가리스 우량 계통 사이의 교배로부터 수득된 F1 식물에서 CGMMV RNA의 양은 CGMMV 감수성 시트룰루스 라나투스 품종 슈가 베이비에서의 CGMMV RNA의 양보다 몇 자릿수 더 낮음이 명백하게 유도가능하다. 양은 모든 시점에서 4회의 반복실험의 평균 5.0 x 10 내지 5 ng/μl 미만이었으며, 보다 늦은 시점에서 점차적으로 더 낮았다. 감수성 대조군은 적어도 0.02 ng/μl의 평균 (35 dpi에서)을 가졌지만, 15 dpi 및 60 dpi에서는 각각 1.7 ng/μl 초과 및 0.8 ng/μl 초과로 훨씬 더 높은 수준을 가졌다.
증상의 육안 평가로부터, F1 식물은 이들이 CGMMV로의 접종 후 증상을 생성하지 않기 때문에 (규모 4) CGMMV에 대해 저항성임이 명백하다. 시트룰루스 라나투스 품종 슈가 베이비는 CGMMV에 대해 감수성인 것으로 공지되어 있으며, CGMMV로의 접종 후 중증 증상 (규모 1)을 나타낸다. 따라서, 상기 표에서 나타난 F1 식물에서의 CGMMV의 매우 낮은 양은 CGMMV 저항성이 각각의 식물 물질에서 CGMMV RNA의 유의한 감소와 상관됨을 명백하게 지시한다. F2 식물은 또한 일반적 방법 항목 1 내지 3에 기재된 기계적 잎 접종 방법에서 시험된 경우 CGMMV 증상이 없었다 (규모 4). 또한, F2 식물 상에서 생산된 과실은 외부 또는 내부 상에 증상을 나타내지 않았다. 증상이 없었던 (규모 4) F2 식물은 또한 감수성 대조군에 비해 유의하게 감소된, 잎에서 극도로 낮은 양의 바이러스 역가를 가졌다 (RT-qPCR 데이터는 나타내지 않음).
접목된 식물
NCIMB 42624로부터의 접지를 일반적 방법 하에 본원에 기재된 방법에 따라 상업적 시트룰루스 라나투스 아종 불가리스 식물 (품종 슈가 베이비)로부터 또는 쿠쿠르비타 막시마 x 쿠쿠르비타 모사타 품종 에르콜 잡종 (넌헴스 비.브이.)으로부터 제조된 CGMMV 감염된 근경 상으로 접목시켰다.
식물의 분석
온실 성장된 F1 식물 (NCIMB 42624 x 시트룰루스 라나투스 아종 불가리스 우량 계통), NCIMB 42624로부터의 접지 및 시트룰루스 라나투스 아종 불가리스 품종 슈가 베이비로부터의 감염된 근경으로 구성된 접목된 식물 ("NCIMB42624 - 슈가 베이비") 및 NCIMB 42624로부터의 접지 및 쿠쿠르비타 막시마 x 쿠쿠르비타 모사타 품종 에르콜 잡종으로부터의 감염된 근경으로 구성된 접목된 식물 ("NCIMB42624 - 에르콜")을 분석하였다. 비-접목된 식물 (NCIMB42624, F1, 슈가 베이비)을 기계적 잎 접종을 사용하여 CGMMV로 접종하였다. 접목된 식물을 일반적 방법에 기재된 바와 같이 CGMMV 감염된 슈가 베이비 식물 또는 에르콜 식물의 근경을 사용하여 제조하였다.
식물 중 어느 것에서도 CGMMV에 의해 유발된 잎 상의 증상은 육안 분석에 의해 검출될 수 없었다. 모든 식물은 일반적 방법 항목 3 하에 본원에 기재된 바와 같은 증상의 육안 평가에 의해 규모 4인 것으로 측정되었다.
더욱이, 모든 식물은 외부로부터 정상으로 보이고, 내부 상에서 악화되거나 물에 젖은 과육의 증상을 나타내지 않는 과실을 생산하였다. 이러한 식물에 의해 생산된 과실의 대표적인 사진은 도 6에 주어진다.
CGMMV로 접종된 거의 모든 비-접목된 시트룰루스 라나투스 아종 불가리스 품종 슈가 베이비 식물은 명백한 증상을 나타내었으며, 일반적 방법 항목 3 하에 본원에 기재된 바와 같은 증상의 육안 평가에 의해 규모 1 또는 2인 것으로 측정되었다. 이들 식물에 의해 생산된 과실은 중증 과육 악화를 나타내었다. 이러한 식물에 의해 생산된 과실의 대표적인 사진은 도 5에 주어진다.
시트룰루스 라나투스 F1 식물 및 접목된 식물 ("NCIMB42624 - 슈가 베이비" 및 "NCIMB42624 - 에르콜")을 일반적 방법 항목 5 하에 본원에 기재된 바와 같은 도트-블롯 혼성화 분석 (*) 및 일반적 방법 항목 4 b) 하에 기재된 바와 같은 RT-PCR 분석(**)에 의해 잎에서의 CGMMV 바이러스 RNA의 존재에 대해 추가로 분석하였다. 얻어진 결과는 하기 표에 주어진다.
<표 3>
상기 표 3은 잎의 기계적 접종에 의해 또는 비-감염된 접지를 감염된 근경에 접목시킴으로써 CGMMV로의 감염 후의 CGMMV 저항성 시트룰루스 콜로신티스 식물 (NCIMB 42624), NCIMB 42624 x 시트룰루스 라나투스 아종 불가리스를 교배시킴으로부터 수득된 F1 식물, 및 접목된 식물 ("NCIMB 42624 - 에르콜" 및 "NCIMB 42624 - 슈가 베이비")의 잎에서의 CGMMV RNA의 검출의 결과를 나타낸다. CGMMV 감수성 상업적 변종 슈가 베이비로부터의 식물을 양성 대조군으로서 사용하였다. +/-는 매우 약한 신호를 지시하고, -는 신호 없음을 지시하고, +는 강한 양성 신호를 지시하고; dpi: 감염 후 일이다. (*) 도트 블롯 방법, (**) RT-PCR 방법.
CGMMV 감수성 대조군 식물에 대해, 바이러스가 초기 (dpi 14) 내지 후기 단계 (dpi 90)에 식물의 발달 전반에 걸쳐 검출되었다. CGMMV RNA에 대한 매우 약한 신호가 초기 단계 (dpi 14 및 30)에서 NCIMB42624에서 검출되었지만, 그들 신호는 나중의 단계에서 (dpi 40부터) 사라졌다. 유사한 결과가 F1 식물 (NCIMB 42624 x 우량 계통)에 대해 얻어졌다. 접목된 식물에 대해 CGMMV RNA는, 약한 신호가 "NCIMB 42624 - 슈가 베이비" 접목물에 대해 dpi 60에서 검출된 것을 제외하고는, 발달의 어느 단계에서도 (dpi 14 내지 dpi 90) 잎에서 검출되지 않았다. 하기 표 4로부터 볼 수 있는 바와 같이, "NCIMB 42624 - 슈가 베이비" 접목물의 추가의 분석은 적은 양의 CGMMV RNA의 존재를 지시하는 약한 신호가 단지 초기 단계 (dpi 14)에서 8개의 식물 중에서 하나의 식물에서 발견된 바이러스로 인한 것이었음을 나타내었다. 나중의 단계 (dpi 60)에서 동일한 식물에서의 신호는 도트-블롯에 의해서도 PCR에 의해서도 더이상 검출가능하지 않았다.
<표 4>
상기 표 4는 CGMMV 감염된 근경에의 접목 후의 접목된 식물 ("NCIMB 42624 - 슈가 베이비")에서의 CGMMV RNA의 검출의 결과를 나타낸다. +/-는 약한 신호를 지시하고, -는 신호 없음을 지시한다.
표 3 및 4의 상기 비-정량적이지만, 단지 정성적인 결과는, 저항성 식물의 초기 단계에서의 바이러스의 매우 낮은 수준이 나중의 단계에서 점차적으로 더 낮아지고, 그 후 단지 정량적 방법을 사용하여 검출가능함, 즉, 단지 극도로 낮은 바이러스 역가가 40 dpi에서 또는 나중에 60 dpi에서 또는 그 후에 발견된다는 점에서, 표 2에서의 먼저의 정량적 결과와 일치한다. 또한, 저항성 접지에서 CGMMV 바이러스는 이들 정성적 방법을 사용하여 검출될 수 없었다.
추가로, 또한 RT-qPCT를 근경이 일반적 방법 항목 6에 기재된 바와 같이 CGMMV로 감염된 접지-근경 조합으로부터 수득된 잎에 대해 수행하였다. 사용된 근경은 슈가 베이비였다.
잎 샘플의 140 내지 150 dpi에서의 평균 Ct-값은 하기와 같은 것으로 밝혀졌다. 각각의 반복실험은 6개의 식물로 이루어진다. 낮은 Ct-값은 높은 바이러스 역가를 지시하는 반면, 높은 Ct-값은 적은 양의 바이러스를 지시함을 주목한다.
<표 5>
상기는 NCIMB 42624 식물 및 NCIMB 42624 x 시트룰루스 라나투스 아종 불가리스 우량 계통 사이의 교배의 식물이 CGMMV 감염의 어떠한 증상도 나타내지 않았으며, 상부 잎에서 매우 낮은 거의 비검출가능한 수준의 바이러스를 함유하였고; CGMMV 감염된 근경 상으로 접목된 NCIMB42624 접지를 포함하는 접목된 식물 ("NCIMB42624 - 슈가 베이비" 및 "NCIMB42624 - 에르콜")은 접지 상에 CGMMV 감염의 어떠한 증상도 나타내지 않음을 명백하게 입증하였다. 따라서, NCIMB 42624 식물은 CGMMV에 대해 저항성이고, CGMMV에 대한 저항성은 시투룰루스 라나투스 (Citullus lanatus) 아종 불가리스 우량 계통을 비롯한 다른 시트룰루스 종으로 전달가능하며, 저항성은 CGMMV 저항성 접지가 CGMMV 감염된 근경 상으로 접목되는 경우 유지된다.
결과 항목 3 - NCIMB 42624에서 발견된 CGMMV 저항성의 QTL 지도화 및 마커 개발
3가지 지도화 집단을 NCIMB 42624를 CGMMV에 대해 감수성인 우량 수박 계통과 교배시킴으로써 생성하였다. 1개의 BC1 집단 (역교배) 및 2개의 F2 집단을 제조하였다. 식물을 기재된 바와 같이 CGMMV로 기계적으로 접종하고, 증상을 기재된 가시적 규모를 사용하여 평가하고, 또한 ELISA 시험을 사용하여 바이러스 역가를 평가하였다. 지도화를 주로 30 dpi 이후에서 평가된 증상을 사용하여 수행하였다.
총 7종의 QTL을 지도화하였으며 (염색체 1 상에 2종, 염색체 4 상에 1종, 염색체 5 상에 2종 및 염색체 7 상에 1종 및 염색체 9 상에 1종), 이들 중 5종의 QTL (염색체 1 상의 QTL.1.1, 염색체 4 상의 QTL4.1, 염색체 5 상의 QTL5.2, 염색체 7 상의 QTL7.1 및 염색체 9 상의 QTL9.1, 하기 표 6 참조를 추가의 역교배에 사용하고, 이들 5종의 QTL에 대해 이들 QTL에 연결된 SNP 마커를 하기에 제공한다.
2종의 QTL, 즉, QTL7.1 및 QTL9.1은 우성이며, 규모 3 또는 규모 4의 증상 수준을 갖는 식물을 초래하였다. 이들은 또한 바이러스 역가에 대해 유의한 효과를 가졌으며, 이는 그 내로 이들 QTL이 역교배된 재배된 수박에서 유의하게 감소되었다.
하기 표 (표 6)에서, 5종의 QTL의 각각의 염색체가 지시되며, 재배된 수박의 게놈 (cucurbitgenomics.org 참조, "수박 (찰스톤 그레이) 게놈")에서 SNP의 염기 쌍 (bp) 위치도 마찬가지이다. SNP의 유전자형은 저항성 모체 (즉, NCIMB 42624) 및 감수성 모체 (우량 수박 계통)에 대해 지시된다. 종자 기탁물 NCIMB 42625는 SNP 유전자형에 대해 동형접합성이며, 모든 5종의 QTL을 동형접합성 형태로 함유한다.
<표 6>
각각의 SNP에 대해 서열은 서열 목록에서 및 본원에서 제공되며, 서열은 SNP와 동일한 수를 갖는다. 서열은 저항성 공여자의 SNP 뉴클레오티드를 함유한다. 따라서, SNP1에 대해 저항성 모체 SNP (위치 51에서 'C')를 포함하는 서열은 서열식별번호: 1로서 제공되는 등이다. 또한 표 1을 참조한다.
QTL의 상이한 조합 및 단일 QTL을 함유하는 BC3 및 F2 계통이 생성되었다. 이들은 접종 후 그들의 CGMMV 저항성 및 바이러스 역가에 대해 평가될 것이다.
또한, 바이러스 역가, 및 매우 낮은 바이러스 역가가 감수성 수박 식물에의 또는 다른 숙주, 예컨대 오이에의 전파가능성을 초래하는지 여부가 평가될 것이다. 마찬가지로, CGMMV 저항성 식물 상에서 생산된 종자에의 바이러스의 전파가능성이 연구될 것이다.
또한, 미세 지도화가 수행될 것이다. "미세-지도화"는 그에 의해 QTL의 위치가 좁혀질 수 있는 방법을 지칭한다. 예를 들어 형질에 대해 분리하는 큰 집단은 형질의 분리에 대해 분석될 수 있으며, 마커 사이의 영역에 재조합 사건을 포함하는 SNP 마커 및 식물은 SNP 마커의 어느 쌍 사이에 QTL이 위치하는 지를 측정하기 위해 선택될 수 있다. 또한, QTL이 위치하는 간격을 좁히기 위해 대부분의 연결된 마커 부근의 또는 그에 플랭킹된 추가의 마커에 대해 검색할 수 있다.
실시예: NCIMB42624 식물 (씨. 콜로신티스 수탁물)로부터 오이 및 감수성 수박 식물로의 바이러스 전파
CGMMV 바이러스 유럽 유형 VE459 (상기 기재된 바와 같음)로 기계적으로 접종되었지만, 증상을 나타내지 않은 (규모 4) NCIMB42624의 식물의 잎을 사용하여 접종물을 제조하고, 접종물을 사용하여 오이 변종 세일라의 215개의 식물 및 수박 변종 슈가 베이비의 193개의 식물을 기계적으로 접종하였다. 약 30 dpi 후 식물을 CGMMV 증상에 대해 육안으로 평가하고, 또한 PCR 검정을 수행하여 잎에서 바이러스를 검출하였다.
결과를 하기 표 7에 나타낸다:
<표 7>
결과는 단지 단일 오이 식물이 접종물에 의해 감염된 반면 (단일 식물은 증상을 나타내었으며, PCR 시험에서 양성이었음), 수박 식물 중 어느 것도 접종물에 의해 감염되지 않았음을 나타내었다. 이는 NCIMB 42624 하에 기탁된 저항성 씨. 콜로신티스 수탁물이 수박 식물에의 CGMMV 전파를 허용하지 않으며, 오이 식물에의 단지 매우 낮은 수준의 전파 (식물의 1％ 미만이 감염됨)를 허용함을 의미한다.
실시예: 씨. 콜로신티스 공여자 (NCIMB 42624)로부터의 QTL의 다양한 조합을 함유하는 수박 계통에서의 CGMMV의 종자 전파가능성
씨. 콜로신티스 공여자로부터의 1종 이상의 QTL을 함유하고, 기계적 CGMMV 접종에서 생존한 다양한 F3 족을 과실을 맺도록 하고, 이들 과실에서 생산된 종자를 상기 기재된 바와 같이 정량적 PCR (RT-qPCR)을 사용하여 CGMMV 바이러스에 대해 분석하였다. 목표는 QTL이 종자 감염, 따라서 바이러스의 종자 전파가능성을 예방할 수 있는지 여부를 측정하는 것이었다. qPCR을 210 dpi에서 수행하였다. 낮은 Ct 값은 높은 바이러스 역가를 지시하고, 높은 Ct 값 (30 초과)은 낮은 바이러스 역가를 지시한다.
결과를 표 8에 나타낸다:
<표 8>
결과는 적어도 QTL 9.1 및/또는 QTL 7.1을 함유한 모든 계통이 종자에의 CGMMV 바이러스 전파에 대해 음성이었음을 나타내었다. 특히 적어도 QTL9.1의 존재는 바이러스의 종자 전파를 예방하는 것으로 보였다.
실시예: CGMMV 저항성에 대한 씨. 콜로신티스 수탁물의 비교
CGMMV 저항성을 NCIMB 42624 하에 기탁된 수특물의 저항성과 비교하기 위해, 다양한 씨. 콜로신티스 수탁물의 10개의 종자를 발아시키고, 식물을 상기 기재된 바와 같이 기계적으로 접종하였다. 각각의 식물을 규모 1 (중증 증상), 2 (중간 증상), 3 (경도 증상) 및 4 (증상 없음)를 사용하여 표현형분석하였다. PI 수탁물은 이종인 것으로 공지되어 있음이 주목된다.
많은 PI 수탁물은 발아하지 않았으며, 따라서 평가될 수 없었다.
하기 PI 수탁물이 평가될 수 있었다: PI537300, PI542616, PI549161, GRIF14201, PI220778, PI386015, PI432337, PI388770 및 PI386018. 이들 수탁물 중 3종 (PI537300, PI386015, PI388770)은 USDA 코어 콜렉션의 일부였으며, 잠재적 CGMMV 내성을 갖는 것으로 기재되었다 (CucCAP, Second Annual CucCAP Team Meeting, March 27-28 2017, Chareleston, page 26 and 27, '오이 녹색 반점 모자이크 바이러스 CGMMM에 대한 저항성에 대한 수박 PI 콜렉션의 평가 및 CGMMV 저항성과 연관된 SNP를 확인하기 위한 게놈-범위 연관 지도화의 수행', 단지 4종의 씨. 콜로신티스 수탁물이 '코어 하위세트'의 일부인 GRIN 콜렉션에 지시된 바와 같이 USDA 코어 콜렉션의 씨. 콜로신티스 수탁물과 조합으로; 4종의 코어 하위세트 중 3종은 이 시험에 포함되었지만, PI525082는 불행하게도 이 시험에 포함될 수 없었음).
그러나, 본 발명자들의 시험에서 USDA 코어 콜렉션의 3종의 수탁물을 비롯한 모든 시험된 수탁물은 본 발명의 NCIMB 42624 (그의 식물의 모두는 4의 점수를 가졌음)를 제외하고는, 3 이하의 평균 증상 점수 (개별적 식물의 평균)를 가졌으며, 전체 시험에서 하나의 식물도 4의 점수 (증상 없음)를 갖지 않았다. 모든 다른 씨. 콜로신티스 수탁물 중에서 PI386015는 가장 양호한 CGMMV 내성을 가졌으며, 모든 식물은 3의 점수 (경도 증상)를 가졌다. PI537300은 3의 점수 (경도 증상)를 갖는 6개의 식물 및 2의 점수 (중간 증상)를 갖는 4개의 식물을 가졌다. PI388770은 1의 점수 (중증 증상)를 갖는 6개의 식물, 2의 점수 (중간 증상)를 갖는 3개의 식물, 및 3의 점수 (경도 증상)를 갖는 1개의 식물을 가졌다.
시험은 NCIMB42624 하에 기탁된 선택된 씨. 콜로신티스에서 CGMMV 저항성이 기껏해야 내성을 갖는 (점수 3, 경도 증상) 시험된 다른 씨. 콜로신티스 수탁물 중 임의의 것보다 더 높은 저항성 수준의 것임을 확인하였다.
SEQUENCE LISTING
<110> Nunhems B.V.
<120> CGMMV resistant Citrullus plants
<130> BCS16-8028 PCT
<150> EP17186574.4
<151> 2017-08-17
<160> 29
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 101
<212> DNA
<213> Citrullus colocynthis
<400> 1
aagtacagtt gcaaatataa taatcaggtt taaaatattt gcaaatatag caaaatttag 60
attctgcttt taaagtctaa cagtgataga ccatatcagt g 101
<210> 2
<211> 101
<212> DNA
<213> Citrullus colocynthis
<400> 2
ggaaaaagaa attacatgga atgcatcgtt attgtttcat ttatatcccc gtatagatca 60
atgtaaactt gaagttcgga aaataattca tttgcaaaat a 101
<210> 3
<211> 101
<212> DNA
<213> Citrullus colocynthis
<400> 3
ttgttagtgc aacaaatgtg tagacatgca taaaacactt gttagtgcaa cgaatgtgtt 60
agacatatat gacaataata aaaaaatttg aatatgaaaa t 101
<210> 4
<211> 101
<212> DNA
<213> Citrullus colocynthis
<400> 4
ggcggaacgc cgaccggaag gtttagcaac ggcaaaatcc ccaccgattt cgtaggtggg 60
gctcctaata attcatttta tctctcctct aataacattt t 101
<210> 5
<211> 101
<212> DNA
<213> Citrullus colocynthis
<400> 5
ctctacatta gagaggactt tgaagttgtt gacaggaaaa catggctgca ggcaagttac 60
ttttagcccc aagtttttag tggttgatgt ctcttttaaa t 101
<210> 6
<211> 101
<212> DNA
<213> Citrullus colocynthis
<400> 6
tctattttgc gttccactct tcgcattctc tcttctacaa gaaaatagcc tctattctat 60
cttcatttag gggctttctt tcttataact ttcatctagg g 101
<210> 7
<211> 101
<212> DNA
<213> Citrullus colocynthis
<400> 7
aattttgaac ctgatataaa ctcaacatca ttgattagat cgcaaacttc tgtttgttct 60
caagcttctt tcattgaatc caaatattga gtaaaataca c 101
<210> 8
<211> 101
<212> DNA
<213> Citrullus colocynthis
<400> 8
ttggcgtggg cttgtaccat atagtgtttg ccttcaagtg attgcaattt ctagtttcaa 60
tcttgagttt ggtattcaat actgaaagcc tcattgccat t 101
<210> 9
<211> 101
<212> DNA
<213> Citrullus colocynthis
<400> 9
tttatttgtc aatttcatca gcaaaattgt cttgaaaatt gatgcttagc ataccttttc 60
tttctagaaa tgcttcaaaa cctccgggtt caatggcgca g 101
<210> 10
<211> 101
<212> DNA
<213> Citrullus colocynthis
<400> 10
agatcagatg catttacgtc cggcttcact tcattttgag tagagttcac tgttattttg 60
ttgatggatt cgcccgagat aacaccagac ttttctggag a 101
<210> 11
<211> 101
<212> DNA
<213> Citrullus colocynthis
<400> 11
gaaggggcaa ttgaacccct tgtccaaatg ttccgtactg aaaagcttga agctaaatta 60
tcggcattaa gcgcattgca aagcctctca ggcttgaagg a 101
<210> 12
<211> 101
<212> DNA
<213> Citrullus colocynthis
<400> 12
taatgtgccg aactccaaat attaaggcac aaggttatgg tgtggtgtgg tgctgaatgt 60
accacattct acgccatgct attcctaact taaaccagcc t 101
<210> 13
<211> 101
<212> DNA
<213> Citrullus colocynthis
<400> 13
gagtttttca agtgatgatt tgagttggga gatctgagag ccttggacat aagtgtttct 60
cctgtacatt ttttgttgtt ggttcactag attgttgttc t 101
<210> 14
<211> 101
<212> DNA
<213> Citrullus colocynthis
<400> 14
tttcgagaag acttatctca tacaatagta tatgagctga actactagag aaacatcaat 60
cacaaacttt catctgttaa atcttagaag aactggtttg g 101
<210> 15
<211> 101
<212> DNA
<213> Citrullus colocynthis
<400> 15
tgaccaccca aatattttcc aaatttgcag attttttcaa aaaatgaaag gtagcgcaac 60
tgcgctctaa aagagcatag ctacactttg ggaatttttt c 101
<210> 16
<211> 101
<212> DNA
<213> Citrullus colocynthis
<400> 16
actttgtttt tcttcaattc tctctaaatt tatcattcta gatcacctat gatctttaat 60
gccctggaac tgtaaaaata aattgtaatt taaaggagtc a 101
<210> 17
<211> 101
<212> DNA
<213> Citrullus colocynthis
<400> 17
ggtggtgctg gtgatgttgt tgatgttaag attaaaggct cttctactgg ttggcttcaa 60
atgtcaagga attggggtca aaattggcag gttggtacct t 101
<210> 18
<211> 101
<212> DNA
<213> Citrullus colocynthis
<400> 18
ataaaattaa atgaaaacgc cttagaaaca tcagagaatt catttctcca aaaggaagaa 60
gaattctgca atagaatcct agagttggag aacagactgg a 101
<210> 19
<211> 101
<212> DNA
<213> Citrullus colocynthis
<400> 19
cgtcggagtt gggccttaag gcgaatgtta gtgttggttg acagatggtt ctcattggag 60
ttgatcatcc aaggtggtcg ttggagcatg aagttgttcg g 101
<210> 20
<211> 101
<212> DNA
<213> Citrullus colocynthis
<400> 20
aaagatggag aggatctttg taggttgcac gaccaacgct tccattggga ggcatgtctc 60
tctggttcat ggtaagctga atgacattgt tggaagggta t 101
<210> 21
<211> 101
<212> DNA
<213> Citrullus colocynthis
<400> 21
gcctcaactt cgtttctttt ttctctttct tttatagttc ctctactatt gctccttctg 60
tatctcctgc tgagttcttt tgctctaaca accaattttc t 101
<210> 22
<211> 101
<212> DNA
<213> Citrullus colocynthis
<400> 22
ttatcaagag atccatataa gtatgttgtc tacatccata agatgcatgt ccagattttc 60
attcacagtc agactaatta aatatcttaa tgtaattgca t 101
<210> 23
<211> 101
<212> DNA
<213> Citrullus colocynthis
<400> 23
aataaatagt acaaatatca atttataccc taaacgattt aaaccccaaa ctaatagttg 60
tatcaattaa aaccataaat tttcattagt gtatcaattt a 101
<210> 24
<211> 101
<212> DNA
<213> Citrullus colocynthis
<400> 24
aaggtagggt ttggccttca ggatagtgac gacattgatg cgttgtttgt gaaatctgtg 60
gaggaggttc cgtataatat ctctgtgatt cagatcagta a 101
<210> 25
<211> 29
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> reverse primer
<400> 25
ttgcatgctg ggcccctacc cggggaaag 29
<210> 26
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> forward primer
<400> 26
ccgaattcat ggcttacaat ccgatcac 28
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> sense primer
<400> 27
gcatagtgct ttcccgttca c 21
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> antisense primer
<400> 28
tgcagaatta ctgcccatag aaac 24
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> probe
<400> 29
cggtttgctc attggtttgc gga 23
Claims (16)
- 시트룰루스 콜로신티스 (Citrullus colocynthis) 종의 CGMMV 저항성 공여자 식물의 염색체 9 상의 및/또는 염색체 7 상의 유전자이입 단편을 포함하며, 염색체 9 상의 유전자이입 단편이 서열식별번호 (SEQ ID NO): 19의 뉴클레오티드 51에서 SNP19와 서열식별번호: 24의 뉴클레오티드 51에서 SNP24 사이의 CGMMV 저항성 공여자 식물의 서열을 포함하고, 염색체 7 상의 유전자이입 단편이 서열식별번호: 13의 뉴클레오티드 51에서 SNP13과 서열식별번호: 18의 뉴클레오티드 51에서 SNP18 사이의 CGMMV 저항성 공여자 식물의 서열을 포함하는 것인 재배된 수박 식물 또는 식물 세포.
- 제1항에 있어서, 염색체 7 상의 유전자이입 단편이 SNP14 (서열식별번호: 14에서 뉴클레오티드 51)에 대한 CGMMV 저항성 공여자 식물의 서열을 포함하고, 염색체 9 상의 유전자이입 단편이 SNP22 (서열식별번호: 22에서 뉴클레오티드 51)에 대한 CGMMV 저항성 공여자 식물의 서열을 포함하는 것인 재배된 수박 식물 또는 식물 세포.
- 시트룰루스 콜로신티스 종의 CGMMV 저항성 공여자 식물의 염색체 7로부터의 및/또는 염색체 9 상의 유전자이입 단편을 포함하며, 염색체 7 상의 유전자이입 단편이 서열식별번호: 13의 또는 서열식별번호: 13과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 아데닌, 및/또는 서열식별번호: 14의 또는 서열식별번호: 14와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 아데닌, 및/또는 서열식별번호: 15의 또는 서열식별번호: 15와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 구아닌, 및/또는 서열식별번호: 16의 또는 서열식별번호: 16과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 구아닌, 및/또는 서열식별번호: 17의 또는 서열식별번호: 17과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 티민, 및/또는 서열식별번호: 18의 또는 서열식별번호: 18과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 아데닌을 포함하고; 염색체 9 상의 유전자이입 단편이 서열식별번호: 19의 또는 서열식별번호: 19와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 시토신, 및/또는 서열식별번호: 20의 또는 서열식별번호: 20과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 구아닌, 및/또는 서열식별번호: 21의 또는 서열식별번호: 21과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 구아닌, 및/또는 서열식별번호: 22의 또는 서열식별번호: 22와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 시토신, 및/또는 서열식별번호: 23의 또는 서열식별번호: 23과 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 시토신, 및/또는 서열식별번호: 24의 또는 서열식별번호: 24와 적어도 95％ 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 51에서 구아닌을 포함하는 것인 재배된 수박 식물 또는 식물 세포.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 염색체 7 상의 유전자이입 단편이 동형접합성 또는 이형접합성 형태이고/거나, 염색체 9 상의 유전자이입 단편이 동형접합성 형태 또는 이형접합성 형태인 재배된 수박 식물 또는 식물 세포.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자이입 단편이 시트룰루스 콜로신티스 수탁물로부터의 것이고, 수탁물의 종자의 대표적인 샘플이 수탁 번호 NCIMB 42624 하에 기탁된 것인 재배된 수박 식물 또는 식물 세포.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 식물이 규모 3 (경도 증상) 또는 규모 4 (증상 없음)의 CGMMV 저항성을 포함하는 것인 재배된 수박 식물 또는 식물 세포.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 식물 또는 식물 세포가 순계 식물 또는 식물 세포, 또는 F1 잡종 식물 또는 식물 세포, 또는 이배체 또는 사배체 또는 삼배체 식물 또는 식물 세포인 재배된 수박 식물 또는 식물 세포.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 식물로 성장하는 종자.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 식물 세포를 포함하는 재배된 수박 과실 또는 과실 부분.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 재배된 수박 식물 세포를 포함하는 재배된 수박 식물 번식 물질.
- 삼배체 잡종 종자 생산에서의 모체로서의 제7항에 따른 이배체 및 사배체 계통의 용도.
- a) 각각 시트룰루스 콜로신티스 종의 CGMMV 저항성 공여자 식물의 염색체 7로부터의 유전자이입 단편을 갖는 2개의 염색체 7을 포함하며, 유전자이입 단편이 QTL7.1 및 SNP14 (서열식별번호: 14)에 대한, 또는 SNP13과 SNP18 사이, 또는 SNP13과 SNP15 사이의 공여자 식물의 서열을 포함하거나; 또는 유전자이입 단편이 QTL7.1 및 SNP13, SNP14, SNP15, SNP16, SNP17, 및 SNP18 중 1종 이상 또는 전부에 대한 저항성 공여자 유전자형을 포함하는 것인 제1 CGMMV 저항성 순계 이배체 수박 식물을 제공하는 단계;
b) 각각 시트룰루스 콜로신티스 종의 CGMMV 저항성 공여자 식물의 염색체 7로부터의 유전자이입 단편을 갖는 4개의 염색체 7을 포함하며, 유전자이입 단편이 QTL7.1 및 SNP14 (서열식별번호: 14)에 대한, 또는 SNP13과 SNP18 사이, 또는 SNP13과 SNP15 사이의 공여자 식물의 서열의 서열을 포함하거나; 또는 유전자이입 단편이 QTL7.1 및 SNP13, SNP14, SNP15, SNP16, SNP17, 및 SNP18 중 1종 이상 또는 전부에 대한 저항성 공여자 유전자형을 포함하는 것인 제2 CGMMV 저항성 순계 사배체 수박 식물을 제공하는 단계;
c) 단계 a)에서 제공된 이배체 수박 식물의 화분으로 단계 b)에서 제공된 사배체 수박 식물을 수분하는 단계; 및
d) 단계 c)에서 생산된 과실로부터 종자를 수집하는 단계
를 포함하는, 삼배체 잡종 재배된 수박 종자를 제조하는 방법. - a) 각각 시트룰루스 콜로신티스 종의 CGMMV 저항성 공여자 식물의 염색체 9로부터의 유전자이입 단편을 갖는 2개의 염색체 9를 포함하며, 유전자이입 단편이 QTL9.1 및 SNP22 (서열식별번호: 22)에 대한, 또는 SNP19와 SNP24 사이, 또는 SNP21과 SNP123 사이의 공여자 식물의 서열을 포함하거나; 또는 유전자이입 단편이 QTL9.1 및 SNP19, SNP20, SNP21, SNP22, SNP23 및 SNP24 중 1종 이상 또는 전부에 대한 저항성 공여자 유전자형을 포함하는 것인 제1 CGMMV 저항성 순계 이배체 수박 식물을 제공하는 단계;
b) 각각 시트룰루스 콜로신티스 종의 CGMMV 저항성 공여자 식물의 염색체 9로부터의 유전자이입 단편을 갖는 4개의 염색체 9를 포함하며, 유전자이입 단편이 QTL9.1 및 SNP22 (서열식별번호: 22)에 대한, 또는 SNP19와 SNP24 사이, 또는 SNP21과 SNP23 사이의 공여자 식물의 서열의 서열을 포함하거나; 또는 유전자이입 단편이 QTL9.1 및 SNP19, SNP20, SNP21, SNP22, SNP23 및 SNP24 중 1종 이상 또는 전부에 대한 저항성 공여자 유전자형을 포함하는 것인 제2 CGMMV 저항성 순계 사배체 수박 식물을 제공하는 단계;
c) 단계 a)에서 제공된 이배체 수박 식물의 화분으로 단계 b)에서 제공된 사배체 수박 식물을 수분하는 단계; 및
d) 단계 c)에서 생산된 과실로부터 종자를 수집하는 단계
를 포함하는, 삼배체 잡종 재배된 수박 종자를 제조하는 방법. - CGMMV 저항성 수박 식물 또는 식물 부분 또는 식물 세포의 확인을 위한 마커 SNP13, SNP14, SNP15, SNP16, SNP17, 및 SNP18 중 1종 이상 및/또는 마커 SNP19, SNP20, SNP21, SNP22, SNP23 및 SNP24 중 1종 이상의 용도.
- CGMMV 감수성 재배된 수박 식물 내로의 CGMMV 저항성의 유전자이입을 위한 마커 SNP13, SNP14, SNP15, SNP16, SNP17, 및 SNP18 중 1종 이상 및/또는 마커 SNP19, SNP20, SNP21, SNP22, SNP23 및 SNP24 중 1종 이상의 용도.
- a) 게놈 DNA를 SNP13, SNP14, SNP15, SNP16, SNP17, 및 SNP18 중 1종 이상 또는 전부의 및/또는 SNP19, SNP20, SNP21, SNP22, SNP23 및 SNP24 중 1종 이상에 대한 SNP 유전자형에 대해 스크리닝하는 단계;
b) 및 임의로 SNP13, SNP14, SNP15, SNP16, SNP17 및 SNP18 중 1종 이상 또는 전부의 및/또는 SNP19, SNP20, SNP21, SNP22, SNP23 및 SNP24 중 1종 이상 또는 전부에 대한 저항성 공여자 유전자형을 포함하는 식물 또는 식물 부분을 선택하는 단계
를 포함하는, 식물 또는 식물 부분, 또는 그로부터 유래된 DNA를 CGMMV 저항성을 부여하는 염색체 7 및/또는 9 상의 단편의 존재에 대해 스크리닝하는 방법.
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